CN117957305A - 细胞剥离剂和细胞分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞剥离剂等，其为用于从与被分离细胞结合的分离载体剥离被分离细胞的细胞剥离剂，所述细胞剥离剂具有下述式(1)所示的侧链结构，包含在其侧链或末端具有可与上述分离载体结合的分离载体结合部位的含有结合性脲基的聚合物；上述含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度(UCST)在4～40℃的范围。‑NH‑(C＝O)‑NH2···(1)。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于在使用了被分离细胞的表面抗原的细胞分离方法中使用的细胞剥离剂等。
背景技术
在再生医疗领域中，多使用从患有疾病的患者中提取出正常细胞，在体外培养后，再度移植至患者的手法。但是，难以从患者体内、血液、体液中仅取出特定的细胞。因此需要一种分离特定细胞的技术。
该细胞分离方法也普及于病理诊断或临床检查的领域中。作为细胞分离方法，已知密度梯度离心法、使用磁性粒子的分离法、使用基材的分离方法或组合流式细胞仪和细胞分选仪的方法。其中，使用磁性粒子的分离法是一种可处理的细胞数较多、分离后的细胞纯度也较高的手法。
在使用通常的磁性粒子的细胞分离方法中，利用脱硫生物素-链霉亲和素(streptavidin)的相互作用的方法为通常方法。首先，将被分离细胞的特异性抗体进行脱硫生物素化。在使该脱硫生物素化抗体和被分离细胞的表面抗原进行反应后，使用表面上具有链霉亲和素的磁性粒子进行捕捉。其为一种在通过磁力收集磁性粒子，从含有多种细胞的细胞群中分离被分离细胞后，作为细胞剥离剂，添加大量的生物素，通过使其与脱硫生物素-链霉亲和素之间的相互作用进行竞合，将被分离细胞和磁性粒子进行脱离的手法。然而，由于需要使用大量的生物素使细胞从分离载体(carrier)脱离，因此，需要多次清洗分离后的细胞，存在需要长时间作业的问题。
作为不使用生物素的细胞分离方法，专利文献1中公开了一种凭借右旋糖酐(dextran)的酶分解性的连接子(linker)使分离载体-细胞间结合，通过使用酶切断连接子从而使细胞从分离载体脱离的方法。然而，由于即使在该细胞分离方法中也存在依靠分解连接子来使用的酶会对分离后的细胞造成伤害的担忧，因此需要多次清洗分离后的细胞，存在需要长时间作业的问题。
作为不使用大量的生物素、酶的细胞分离方法，专利文献2中作为特异性分离T细胞的方法公开了使用Strep-tag化的MHC多聚体的细胞分离方法。是一种使与T细胞的表面抗原结合的Strep-tag化MHC多聚体和具有strep-tactin的磁性粒子结合后，进行被分离细胞的分类，之后，作为细胞剥离剂，通过少量的生物素将被分离细胞脱离的方法。该细胞分离方法对细胞的伤害较少，但使用的Strep-tag化MHC多聚体可能仅对应于T细胞，不适用于其他种类的细胞，存在通用性较低的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2016-136937号公报
专利文献2：日本特开2017-514481号公报
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，在使用被分离细胞的表面抗原的细胞分离方法中，还未知晓一种能适用于种类广泛的细胞、且进一步地无需在分离后清洗被分离细胞的细胞剥离剂。
本发明的问题是提供一种在使用被分离细胞的表面抗原的细胞分离方法中，能适用于种类广泛的细胞、且进一步地无需在分离后清洗被分离细胞的细胞剥离剂以及使用该细胞剥离剂的细胞分离方法。
用以解决问题的手段
本发明人为了达成上述目的进行了多次深入研究，结果发现：作为使被分离细胞从分离载体脱离的驱动力，可利用温度应答引起的聚合物链的伸缩、含有对分离后的细胞不造成影响的聚合物的细胞剥离剂能够解决上述问题。
即，本发明至少提供下述的[1]～[22]。
[1]一种细胞剥离剂，
其为用于从与被分离细胞结合的分离载体剥离被分离细胞的细胞剥离剂，
所述细胞剥离剂包含含有结合性脲基的聚合物，所述含有结合性脲基的聚合物具有下述式(1)所示的侧链结构，在其侧链或末端具有可与上述分离载体结合的分离载体结合部位；
所述含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度(UCST)在4～40℃的范围。
[化1]
-NH-(C＝O)-NH2…(1)
[2]根据[1]所述的细胞剥离剂，所述分离载体结合部位为生物素残基、链霉亲和素残基、氨基、羧基、巯基、环糊精残基、金刚烷基或苯硼酸残基。
[3]根据[1]或[2]所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的主链为乙烯性不饱和聚合物、聚烯丙基胺或多肽。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列A，所述含有脲基的重复序列A为下述式(2)所示的含有脲基结构的重复。
[化2]
(所述式(2)中，R1表示氢原子或甲基，A1表示O或NH，a表示1～6的整数。)
[5]根据[4]所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物进一步含有亲水性重复序列B，所述亲水性重复序列B为下述式(3)所示的亲水性结构的重复。
[化3]
(所述式(3)中，R2表示氢原子或甲基，A2表示O或NH，b表示1～6的整数，X从下述式(4)～(9)中进行选择。)
[化4]
(所述式(9)中，m表示0～20的整数。)
[6]根据[5]所述的细胞剥离剂，在所述含有脲基的重复序列A中，A1为O，a为2；在所述亲水性重复序列B中，A2为O，b为2，X为上述式(4)所示。
[7]根据[5]或[6]所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列A与上述亲水性重复序列B的摩尔比具有0.5≦A/(A+B)的关系。
[8]根据[4]～[7]中任一项所述的细胞剥离剂，所述含有结合性脲基的聚合物在所述含有脲基的聚合物的末端具有作为所述分离载体结合部位的生物素残基。
[9]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列C和亲水性重复序列D，所述含有脲基的重复序列C为下述式(10)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列D为下述式(11)所示的亲水性结构的重复。
[化5]
[10]根据[9]所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列C和所述亲水性重复序列D的摩尔比具有0.5≦C/(C+D)的关系。
[11]根据[9]或[10]所述的细胞剥离剂，包含在所述含有脲基的聚合物的侧链上具有生物素残基作为所述分离载体结合部位的所述含有结合性脲基的聚合物。
[12]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列E和亲水性重复序列F，所述含有脲基的重复序列E为下述式(12)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列F为下述式(13)所示的亲水性结构的重复。
[化6]
(所述式(12)中，c表示0～6的整数，d表示0～6的整数；所述式(13)中，e表示0～6的整数，f表示0～6的整数。)
[13]根据[12]所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的重复序列E中，c为0，d为3；所述亲水性重复序列F中，e为0，f为3。
[14]根据[12]或[13]所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列E和所述亲水性重复序列F的摩尔比具有0.5≦E/(E+F)的关系。
[15]根据[12]～[14]中任一项所述的细胞剥离剂，作为所述分离载体结合部位，包含在所述含有脲基的聚合物的侧链上具有生物素残基作为所述分离载体结合部位的所述含有结合性脲基的聚合物。
[16]根据[12]～[15]中任一项所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的数均分子量为20,000～1,000,000。
[17]一种细胞分离方法，其特征在于，
其为用于从包含被分离细胞的细胞群中分离被分离细胞的方法，
包括下述的〔工序A〕、〔工序B〕、〔工序C〕和〔工序D〕，
〔工序A〕
通过向包含被分离细胞的细胞群添加具有分离载体结合部位的被分离细胞的表面抗原识别物质，使其与被分离细胞的表面抗原进行反应，得到被分离细胞-抗原识别物质复合体的工序；
〔工序B〕
通过介由分离载体结合部位，使由〔工序A〕得到的被分离细胞-抗原识别物质复合体与分离载体相互作用，得到被分离细胞-分离载体复合体的工序；
〔工序C〕
从包含被分离细胞的细胞群中仅分离出由〔工序B〕得到的被分离细胞-分离载体复合体的工序；
〔工序D〕
向由〔工序C〕获得的被分离细胞-分离载体复合体添加所述[1]～[16]中任一项所述的细胞剥离剂，通过温度变化分离被分离细胞的工序。
[18]根据[17]所述的细胞分离方法，所述〔工序A〕中，分离载体结合部位为生物素残基、链霉亲和素残基、氨基、羧基、巯基、环糊精残基、金刚烷基或苯硼酸残基。
[19]根据[17]或[18]所述的细胞分离方法，所述〔工序A〕中，抗原识别物质为抗体、抗体片段、肽、核酸适配体、蛋白质A或凝集素。
[20]根据[17]～[19]中任一项所述的细胞分离方法，所述〔工序B〕中，分离载体为磁性粒子。
[21]根据[20]所述的细胞分离方法，所述〔工序C〕中，通过磁力从包含被分离细胞的细胞群中仅分离出被分离细胞-分离载体复合体。
[22]根据[17]～[21]中任一项所述的细胞分离方法，所述〔工序D〕中，温度变化为在从含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度(UCST)以下的温度加温至上限临界溶液温度(UCST)以上的温度。
发明的效果
根据本发明，能够提供一种在使用被分离细胞的表面抗原的细胞分离方法中可适用于种类广泛的细胞、且进一步地无需在分离后清洗被分离细胞的细胞剥离剂以及使用该细胞剥离剂的细胞分离方法。
具体实施方式
以下，针对本发明的优选实施方式进行详细说明。
<含有脲基的聚合物>
上述含有脲基的聚合物是指侧链具有下述式(1)所示的脲基(以下称为脲基)的聚合物。
[化7]
—NH-(C＝O)-NH2…(1)
上述含有脲基的聚合物的上限临界溶液温度(UCST)，基本如后所述，与在其侧链或末端具有可与分离载体结合的分离载体结合部位的含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度(UCST)几乎相同，优选为4～40℃的范围。
作为上述含有脲基的聚合物的主链没有特别限定，但可举出：乙烯性不饱和聚合物、聚烯丙基胺、多肽、聚酯、多糖等。其中，从合成的容易度出发，优选为乙烯性不饱和聚合物、聚烯丙基胺或多肽。
上述含有脲基的聚合物的主链为乙烯性不饱和聚合物时，可优选举出具有含有脲基的重复序列A的结构，所述含有脲基的重复序列A为下述式(2)所示的含有脲基结构的重复。
[化8]
(上述式(2)中，R1表示氢原子或甲基，A1表示O或NH，a表示1～6的整数。)
此外，本说明书所称的“结构的重复”，除了作为该结构的重复的情况之外，也指间隔性的重复。
上述式(2)中，a表示1～6的整数，但优选为1～4的整数，最优选为2～3的整数。
此外，上述含有脲基的重复序列A中的各自的式(2)所示的含有脲基结构中的R1、A1和a，各自可以相同，也可以不同。
作为上述含有脲基的重复序列A，例如，虽可举出：R1为甲基、A1为O、a为2的含有脲基的重复序列A；R1为甲基、A1为NH、a为2的含有脲基的重复序列A；R1为氢原子、A1为O、a为2的含有脲基的重复序列A；R1为氢原子、A1为NH、a为2的含有脲基的重复序列A，但从与后述的其他单体的共聚性的观点出发，优选为R1为甲基、A1为O、a为2的含有脲基的重复序列A；R1为氢原子、A1为O、a为2的含有脲基的重复序列A或R1为氢原子、A1为NH、a为2的含有脲基的重复序列A，更优选为R1为甲基、A1为O、a为2的含有脲基的重复序列A。
上述含有脲基的聚合物的主链为乙烯性不饱和聚合物的情况时，上述含有脲基的聚合物可以是具有如上述式(2)所示的含有脲基结构等含有脲基结构的单体与例如下述其他单体的共聚物，上述上限临界溶液温度(UCST)的调节能够通过与其他单体的共聚来进行。为了降低上限临界溶液温度(UCST)，作为其他单体，例如可选择亲水性的单体，例如可举出：(甲基)丙烯酸甘油酯、(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酸酯、N-甲基羧基甜菜碱(甲基)丙烯酸酯、N-甲基磺基甜菜碱(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸氨基乙酯、N,N’-二甲基丙烯酰胺、S-甲基锍羧酸(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸乙二醇酯等，但至少在使用上述主链为乙烯性不饱和聚合物的含有脲基聚合物作为细胞剥离剂的原料时，从水中的溶解性的观点、抑制非特异性吸附的观点出发，优选为(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酸酯、N-甲基羧基甜菜碱(甲基)丙烯酸酯、N-甲基磺基甜菜碱(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸氨基乙酯、S-甲基锍羧酸(甲基)丙烯酸酯或(甲基)丙烯酸乙二醇酯。更具体地，除上述含有脲基的重复序列A之外，还优选举出具有亲水性重复序列B的结构，所述亲水性重复序列B为下述式(3)所示的亲水性结构的重复。
[化9]
(上述式(3)中，R2表示氢原子或甲基，A2表示O或NH，b表示1～6的整数，X从下述式(4)～(9)中进行选择。)
[化10]
(上述式(9)中，m表示0～20的整数。)
上述式(3)中，b表示1～6的整数，但优选为1～4的整数，最优选为2～3的整数。
此外，上述亲水性重复序列B中的各自的式(3)所示的亲水性结构中的R2、A2和b各自可以相同，也可以不同。
作为上述亲水性重复序列B，例如可举出：R2为甲基、A2为O、b为2、X从上述式(4)～(9)中进行选择的含有脲基的重复序列B；R2为甲基、A2为NH、b为2、X从上述式(4)～(9)中进行选择的含有脲基的重复序列B；R2为氢原子、A2为O、b为2、X从上述式(4)～(9)中进行选择的含有脲基的重复序列B；R2为氢原子、A2为NH、b为2、X从上述式(4)～(9)中进行选择的含有脲基的重复序列B，但从与具有上述式(2)所示的含有脲基结构的单体等的共聚性的观点出发，优选为R2为甲基、A2为O、b为2、X从上述式(4)～(9)中进行选择的含有脲基的重复序列B；R2为氢原子、A2为O、b为2、X从上述式(4)～(9)中进行选择的含有脲基的重复序列B或R2为氢原子、A2为NH、b为2、X从上述式(4)～(9)中进行选择的含有脲基的重复序列B，最优选为R2为甲基、A2为O、b为2、X从上述式(4)～(9)中进行选择的含有脲基的重复序列B。
在主链为乙烯性不饱和聚合物的上述含有脲基的聚合物与上述其他单体的共聚物时，可以在能发挥所需功能地适当确定上述其他单体的摩尔比，但为了使上述含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度在4～40℃的范围，优选混合的上述其他单体在总单体中为70摩尔％以下，更优选为60摩尔％以下，进一步优选为50摩尔％以下，更进一步优选为40摩尔％以下，特别优选为30摩尔％以下，更特别优选为20摩尔％以下。即，上述含有脲基的重复序列A等含有脲基的重复序列优选为总序列的30摩尔％以上，更优选为40摩尔％以上，进一步优选为50摩尔％以上，更进一步优选为60摩尔％以上，特别优选为70摩尔％以上，更特别优选为80摩尔％以上。此外，在上述含有脲基的聚合物为具有上述含有脲基的重复序列A和上述亲水性重复序列B的结构时，上述含有脲基的重复序列A和上述亲水性重复序列B的摩尔比(摩尔数)优选在0.3≦A/(A+B)的范围。更优选满足在0.4≦A/(A+B)的范围内的关系，更优选满足在0.5≦A/(A+B)的范围内的关系，更进一步优选满足在0.6≦A/(A+B)的范围内的关系，特别优选满足在0.7≦A/(A+B)的范围内的关系，更特别优选满足在0.8≦A/(A+B)的范围内的关系。
主链为乙烯性不饱和聚合物的上述含有脲基的聚合物只要具有脲基且上限临界溶液温度(UCST)为4～40℃的范围，就没有特别限定，但能够根据主链的种类、其他单体的种类、分子量的组合等而调整上限临界溶液温度(UCST)。
上述含有脲基的聚合物的主链为聚烯丙基胺时，可优选举出具有含有脲基的重复序列C和亲水性重复序列D的结构，所述含有脲基的重复序列C为下述式(10)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列D为下述式(11)所示的亲水性结构的重复。
[化11]
为了使主链为聚烯丙基胺的上述含有脲基的聚合物的上限临界溶液温度在4～40℃的范围，上述含有脲基的重复序列C等含有脲基的重复序列优选为总序列的30摩尔％以上，更优选为40摩尔％以上，进一步优选为50摩尔％以上。
在上述含有脲基的聚合物为具有上述含有脲基的重复序列C和上述亲水性重复序列D的结构时，上述含有脲基的重复序列C和上述亲水性重复序列D的摩尔比(摩尔数)优选在0.3≦C/(C+D)的范围。更优选为满足在0.4≦C/(C+D)的范围内的关系，特别优选为满足在0.5≦C/(C+D)的范围内的关系。
上述含有脲基的聚合物的主链为多肽时，可优选举出具有含有脲基的重复序列E和亲水性重复序列F的结构，所述含有脲基的重复序列E为下述式(12)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列F为下述式(13)所示的亲水性结构的重复。
[化12]
(上述式(12)中，c表示0～6的整数，d表示0～6的整数；上述式(13)中，e表示0～6的整数，f表示0～6的整数。)
上述式(12)中，c表示0～6的整数，但优选为0～4，最优选为0或4。c为0时，在上述式(12)中，表示不存在(CH2)c，表示(CH2)c两侧的CH和NH直接单独成键。
在上述式(12)中，d表示0～6的整数，但优选为0～5，最优选为0～4。d为0时，在上述式(12)中，表示不存在(CH2)d，表示(CH2)d上下的CH和NH直接单独成键。
此外，上述含有脲基的重复序列E中的各自的式(12)所示的含有脲基结构中的c和d各自可以相同，也可以不同。
作为上述式(12)所示的含有脲基的重复序列E，例如可举出：c为0、d为4的含有脲基的重复序列E(α-聚赖氨酸)；c为0、d为3的含有脲基的重复序列E(聚鸟氨酸)；c为4、d为0的含有脲基的重复序列E(ε-聚赖氨酸)；c为3、d为0的含有脲基的重复序列E等，但从获得容易度出发，优选为c为0、d为4的含有脲基的重复序列E；c为0、d为3的含有脲基的重复序列E或c为4、d为0的含有脲基的重复序列E。
在上述式(13)所示的亲水性重复序列F中，e表示0～6的整数，但优选为0～4，最优选为0或4。e为0时，在上述式(13)中，表示不存在(CH2)e，表示(CH2)e两侧的CH和NH直接单独成键。
在上述式(13)所示的亲水性重复序列F中，f表示0～6的整数，但优选为0～5，最优选为0～4。f为0时，在上述式(13)中，表示不存在(CH2)f，表示(CH2)f上下的CH和NH直接单独成键。
此外，上述亲水性重复序列F中的各自的式(13)所示的亲水性结构中的e和f各自可以相同，也可以不同。
作为上述式(13)所示的亲水性重复序列F，例如可举出：e为0、f为4的亲水性重复序列F(α-聚赖氨酸)；e为0、f为3的亲水性重复序列F(聚鸟氨酸)；e为4、f为0的亲水性重复序列F(ε-聚赖氨酸)；e为3、f为0的亲水性重复序列F等，但从获得容易度出发，优选为e为0、f为4的亲水性重复序列F；e为0、f为3的亲水性重复序列F或e为4、f为0的亲水性重复序列F。
为了使主链为多肽的上述含有脲基的聚合物的上限临界溶液温度在4～40℃的范围，上述含有脲基的重复序列E等含有脲基的重复序列优选为总序列的30摩尔％以上，更优选为40摩尔％以上，进一步优选为50摩尔％以上。
在上述含有脲基的聚合物为具有上述含有脲基的重复序列E和上述亲水性重复序列F的结构的情况下时，上述含有脲基的重复序列E和上述亲水性重复序列F的摩尔比(摩尔数)优选为在0.3≦E/(E+F)的范围。更优选为满足在0.4≦E/(E+F)的范围内的关系，特别优选为满足在0.5≦E/(E+F)的范围内的关系。
作为上述含有脲基的聚合物的分子量，能够调整聚合条件等至可发挥所需性能来进行适当确定，但通常数均分子量为1,000～5,000,000左右，为了提升本发明的细胞剥离剂的细胞分离效率，优选为10,000～2,000,000，更优选为20,000～1,000,000。上述含有脲基的聚合物的分子量在5,000,000以下时，从细胞剥离剂在水中的溶解性进一步增加、作为细胞剥离剂更易于使用的观点考虑而优选。
<含有脲基的聚合物的制造方法1>
上述含有脲基的聚合物的制造方法早已公知，例如可以使用日本专利第5800323号公报记载的方法。具体地，可以使用使含有伯胺的聚合物溶于溶剂而与氰酸盐(MCNO)进行反应的方法。
上述含有伯胺的聚合物是指侧链上具有伯氨基的聚合物。
作为上述含有伯胺的聚合物的主链，没有特别限定，但可举出与在所述含有脲基的聚合物的主链的例示中举出的相同的主链。
作为上述含有伯胺的聚合物的分子量，能够调整聚合条件等至可发挥所需性能来进行适当确定，但通常数均分子量为1,000～5,000,000左右，为了提升本发明的细胞剥离剂的细胞分离效率，优选为10,000～2,000,000，更优选为20,000～1,000,000。上述含有伯胺的聚合物的分子量为5,000,000以下时，从细胞剥离剂在水中的溶解性进一步增加、作为细胞剥离剂更易于使用的观点考虑而优选。
作为用于溶解上述含有伯胺的聚合物的溶剂，例如可举出：水、咪唑缓冲液等缓冲液、有机溶剂或它们的混合液。作为有机溶剂，只要溶解含有伯胺的聚合物，就没有特别限定，但例如可举出：甲醇、乙醇(EtOH)、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇等醇类；乙腈、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、1,4-二恶烷等。作为用于反应的含有伯胺的聚合物溶液中的含有伯胺的聚合物的浓度，虽没有限制，但可举出通常为1～80重量％，优选为2～50重量％，更优选为5～40重量％。上述含有伯胺的聚合物的浓度为80重量％以下时，溶液粘度不会过于增加，易于维持与上述氰酸盐的反应性，因而优选。
作为与上述含有伯胺的聚合物进行反应的氰酸盐(MCNO)，可以适当例示：氰酸钾、氰酸钠等氰酸的碱金属盐。优选为氰酸钾。作为氰酸盐的使用比例，没有特别限定，但相对于上述含有伯胺的聚合物中的伯氨基的1摩尔，优选为0.4摩尔以上。氰酸盐的使用比例为0.4摩尔以上时，能够更充分地导入脲基，更易于达到上限临界溶液温度。
上述含有伯胺的聚合物与氰酸盐(MCNO)的反应，优选一边搅拌一边进行。反应温度没有特别限制，但理想的是优选维持在0～100℃，更优选维持在30～60℃。反应温度为0℃以上时，反应易于更充分地进行，在100℃以下时，产生原料的分解、进一步地产生不期望的副反应的担忧将更少。反应时间也虽没有特别限制，但通常为1～48小时，优选为1～25小时，能够获得上述含有脲基的聚合物的溶液。反应时间为1小时以上时，反应易于更充分地进行，在48小时以下时，产生原料的分解、进一步地产生不期望的副反应的担忧将更少。
获得的上述含有脲基的聚合物除了以原样未精制地用于下个工序之外，也可以优选通过再沉淀，凝胶过滤色谱柱法、透析等处理来进行分离、精制。
<上述含有脲基的聚合物的制造方法2>
上述含有脲基的聚合物可通过例如将下述式(14)所示的脲单体等乙烯性不饱和脲单体进行自由基聚合的方式进行制造。
[化13]
上述乙烯性不饱和脲单体的自由基聚合也可以为与其他单体的共聚。
上述乙烯性不饱和脲单体(以及上述其他单体)的自由基聚合，可以为批量(Bulk)聚合，但也可以添加溶剂以供聚合。此外，作为溶剂，只要可溶解上述乙烯性不饱和脲单体(以及上述其他单体)就没有特别限定，可使用通常的溶剂。例如，可以从丙酮、二恶烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃等极性非质子性溶剂、甲醇、乙醇、水等极性质子性溶剂、它们的混合液中进行选择。
上述乙烯性不饱和脲单体(以及上述其他单体)的自由基聚合，可以通过热聚合或光聚合来进行。上述热聚合例如可使用热聚合引发剂来进行。作为热聚合引发剂，例如，可使用：过氧化物系自由基引发剂(过氧化苯甲酰、过硫酸铵等)、或偶氮系自由基引发剂(偶氮二异丁腈(AIBN)、2,2’-偶氮双(二甲基戊腈)(ADVN)等)、2,2’-偶氮双氰基戊酸(ACVA)、偶氮二[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(VA-044)、水溶性或油溶性的氧化还原系自由基引发剂(由二甲基苯胺和过氧化苯甲酰构成)等。相对于上述乙烯性不饱和脲单体(以及上述其他单体)的合计100质量份，自由基引发剂的使用量通常优选为0.01至10质量份。聚合温度以及聚合时间可根据自由基引发剂的种类、有无其他单体、其他单体的种类等进行适当选择来确定。例如，在使用AIBN进行上述乙烯性不饱和脲单体(以及上述其他单体)的自由基聚合等时，聚合温度为40～90℃，聚合时间为2～48小时左右较合适。
上述光聚合，例如可通过波长254nm的紫外线(UV)或加速电压150～300kV的电子射线(EB)照射等进行实施。此时，虽然光聚合引发剂的使用是任意的，但从反应时间的观点出发，优选使用光聚合引发剂。作为光聚合引发剂，可举出：2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、1-羟基-环己基苯酮等，但从溶解性等观点出发，可优选举出2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮。
在上述乙烯性不饱和脲单体(以及上述其他单体)的自由基聚合中，也可以使用链转移剂。作为上述链转移剂，可举出：2-巯基乙醇、1-巯基-2-丙醇、3-巯基-1-丙醇、对巯基苯酚、巯基醋酸、2-巯基丙酸、3-巯基丙酸、2-巯基烟酸等。
上述乙烯性不饱和脲单体(以及上述其他单体)的自由基聚合也可通过活性自由基聚合法进行，具体地可使用原子转移自由基聚合法(ATRP法)、可逆加成-断裂链转移聚合法(RAFT聚合法)以及介由氮氧化物的聚合法(NMP法)等。特别在本发明的细胞剥离剂的原料用途中，基于不使用金属、不降低酶活性的理由，优选可逆加成-断裂链转移聚合法(RAFT聚合法)。
作为上述RAFT聚合法，可利用公知的方法，例如被记载于WO99/31144、WO98/01478以及美国专利第6,153,705号等的方法是有效的。使用RAFT聚合进行上述乙烯性不饱和脲单体(以及上述其他单体)的自由基聚合时，可通过向通常的自由基聚合添加RAFT剂来进行。作为上述RAFT剂，可以从4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯、2-氰基-2-丙基苯并二硫、二硫代苯甲酸苄酯、2-苯基-2-丙基苯并二硫、2-苯基-2-(苯基-硫代羰基硫基)乙酸甲酯、4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊酸、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊醇、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯、2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊酸聚乙二醇甲基醚酯、2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸-3-叠氮基-1-丙醇酯、1H-吡咯-1-二硫代甲酸苄酯(benzyl 1H-pyrrol-1-carbodithioate)、2-氰基丙烷-2-基-N-甲基-N-吡啶-4-基-二硫代甲酸酯(2-c yanopropane-2-yl-N-methyl-N-pyridine4-yl carbodithioate)、丙酸乙基-2-乙基黄原酸酯等中进行选择，但从控制上述脲单体(以及上述其他单体)的聚合的观点出发，优选为4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯、4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊酸、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊醇或2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸-3-叠氮基-1-丙醇酯。进一步地，上述乙烯性不饱和脲单体可与上述其他单体形成无规共聚物或嵌段共聚物，但为了激发上述含有脲基的聚合物的性能，优选为无规共聚物。
<含有结合性脲基的聚合物>
上述含有结合性脲基的聚合物是指在上述含有脲基的聚合物上加成了上述分离载体结合部位的聚合物。
上述分离载体结合部位是指可与上述分离载体结合的部位，通常只要为在该领域内使用的就没有特别限定，但例如可举出：疏水性取代基、生物素残基、脱硫生物素残基、亲和素残基、链霉亲和素残基、氨基、羧基、巯基、谷胱甘肽残基、谷胱甘肽转移酶残基、凝集素残基、环糊精残基等多糖类残基、金刚烷基、苯硼酸残基等，优选为生物素残基、链霉亲和素残基、氨基、羧基、巯基、环糊精残基、金刚烷基或苯硼酸残基等。
上述分离载体结合部位可以在上述含有脲基的聚合物的末端或重复序列内(侧链等)含有。作为使上述含有脲基的聚合物含有上述分离载体结合部位的方法，可举出：添加、点击反应、酰胺化、酯化、硫酯化、碳酸酯化、席夫碱形成反应、还原氨化、介由自由基的偶联反应、狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder reaction)、二硫化物化、迈克尔加成反应、巯基-烯(thiol-ene)反应、介由芳香族硼化合物的偶联反应、叔锍形成反应、季铵形成反应等，但从通用性的高度出发，优选为点击反应、酰胺化或酯化。
作为上述分离载体结合部位的含量，只要上述含有结合性脲基的聚合物可与上述分离载体结合，就没有特别限定，但在上述含有脲基的聚合物的末端中含有时，每1分子中，含有0.2分子至10分子的上述分离载体结合部位即可，优选为0.2分子至4分子，进一步优选为0.2分子至2分子。10分子以下时，更加难以产生分离载体间的交联。此外，在上述含有脲基的聚合物的重复配列内含有上述分离载体结合部位时，每100个重复单元，含有0.01至20个单元的上述分离载体结合部位即可，优选为0.01至10个单元，更优选为0.1至5个单元。含有20个单元以下时，更加难以产生分离载体间的交联。
<末端上含有分离载体结合部位的含有结合性脲基的聚合物的制造方法>
在上述含有脲基的聚合物的末端上导入分离载体结合部位时，含有脲基的聚合物的合成可通过活性自由基聚合法进行，具体地可使用原子转移自由基聚合法(ATRP法)、可逆加成-断裂链转移聚合法(RAFT聚合法)以及介由氮氧化物的聚合法(NMP法)等。特别在本发明的细胞剥离剂的原料用途中，基于不使用金属、不降低酶活性的理由，优选可逆加成-断裂链转移聚合法(RAFT聚合法)。
作为上述RAFT聚合法，可利用公知的方法，例如被记载于WO99/31144、WO98/01478以及美国专利第6，153，705号等的方法是有效的。使用RAFT聚合，进行上述含有酰基的聚合物的自由基聚合时，可通过向通常的自由基聚合添加RAFT剂来进行。作为上述RAFT剂，可以从4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯、2-氰基-2-丙基苯并二硫、二硫代苯甲酸苄酯、2-苯基-2-丙基苯并二硫、2-苯基-2-(苯基-硫代羰基硫基)乙酸甲酯、4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊酸、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊醇、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯、2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊酸聚乙二醇甲基醚酯、2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸3-叠氮基-1-丙醇酯(N3-DTPA)、1H-吡咯-1-二硫代甲酸苄酯(benzyl1H-pyrrol-1-carbodithioate)、2-氰基丙烷-2-基-N-甲基-N-吡啶-4-基二硫代甲酸酯(2-c yanopropane-2-yl-N-methyl-N-pyridine4-ylcarbodithioate)、丙酸乙基-2-乙基黄原酸酯等中进行选择，但从在上述含有脲基的聚合物的末端上导入分离载体结合部位的容易度出发，优选为4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯、4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊酸、4-氰基-4-(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基戊醇或2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸-3-叠氮基-1-丙醇酯。
在上述含有脲基的聚合物的末端上导入分离载体结合部位时，含有脲基的聚合物的合成也可通过活性阴离子聚合进行。例如是使用保护了鸟氨酸、赖氨酸的氨基的α-氨基酸-N-酸酐(NCA)、N-二苯基碳酸酯氨基酸(DPC)等聚合引发剂进行开环聚合的方法。
作为上述含有结合性脲基的聚合物，例如可举出如下述式(15)所示的上述含有脲基的聚合物的主链为乙烯性不饱和聚合物、且作为分离载体结合部位在上述含有脲基的聚合物的末端上具有生物素残基的上述含有结合性脲基的聚合物。
[化14]
作为上述含有结合性脲基的聚合物，例如可举出如下述式(16)所示的上述含有脲基的聚合物的主链为聚烯丙基胺、且作为分离载体结合部位在上述含有脲基的聚合物的侧链上具有生物素残基的上述含有结合性脲基的聚合物。
[化15]
作为上述含有结合性脲基的聚合物，例如可举出如下述式(17)所示的上述含有脲基的聚合物的主链为聚烯丙基胺、且作为分离载体结合部位在上述含有脲基的聚合物的侧链具有氨基的上述含有结合性脲基的聚合物。
[化16]
作为上述含有结合性脲基的聚合物，例如，可举出如下述式(18)所示的上述含有脲基的聚合物的主链为多肽的，且作为分离载体结合部位在上述含有脲基的聚合物的侧链上具有生物素残基的上述含有结合性脲基的聚合物。
[化17]
<含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度(UCST)>
上述上限临界溶液温度(UCST)是指上述含有结合性脲基的聚合物不溶于水、培养基并形成不溶相的温度与上述含有结合性脲基的聚合物溶于水、培养基并形成溶解相的温度的界限温度。上限临界溶液温度(UCST)没有特别限定，但由于必须是适于细胞培养的温度，因此为2～60℃的范围，优选为4～50℃的范围，更优选为4～40℃的范围。
此外，如前所述，上述含有脲基的聚合物的上限临界溶液温度(UCST)与上述含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度(UCST)几乎相同。
上述上限临界溶液温度(UCST)
至少以1mM的浓度溶解上述(结合性)含有脲基的聚合物于水、培养基，一边降温，一边在石英比色皿中测定500nm的可见光透过率，在设该化合物完全溶解时的澄清溶液的可见光透过率为100％时，作为将其降温时该透过率开始减少的温度求取。
<细胞剥离剂>
本发明中的细胞剥离剂是用于使被分离细胞从分离载体中脱离的材料，至少含有上述含有结合性脲基的聚合物。进一步地通常除含有结合性脲基的聚合物之外，可以含有水、培养基，或为更高效地进行细胞分离而含有螯合剂、蛋白质等添加剂。
作为上述水，优选精制水、纯水、离子交换水等，此外也可以为含有水的各种缓冲液。作为各种缓冲液，只要不丧失蛋白质的酶活性、抗原性等生理活性，就可以使用通常在该领域内使用的缓冲液。例如可举出：磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液等，也可以将它们混合使用。
上述培养基只要为适于分离的细胞的培养基，就没有特别限定，可以利用通常的细胞培养用培养基。例如可举出：Dulbecco改良的Eagle的MEM培养基(Dulbecco’smodification ofEagle’s MEM medium)(DMEM)、α-MEM培养基、洛斯维·帕克纪念研究所(RPMI)培养基、F12培养基、TC199培养基、GMEM培养基等，也可以将它们混合，或根据需要添加胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺、牛血清白蛋白、人血清白蛋白，进一步地添加抗生素等补充剂。
作为上述添加剂，以提升细胞的分离效率为目的，可举出通常为在该领域内使用的其他试剂种类等，例如螯合剂、糖类、多糖类、蛋白质、盐类、维生素类、表面活性剂等。
作为上述螯合剂，例如可举出：乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-双(O-氨基苯氧基)乙烷-N,N，N’,N’-四乙酸(BAPTA)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N’,N’-四乙酸(CyDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二乙酸、三乙烯四胺六乙酸等。
作为上述糖类，是指单糖类、二糖类、寡糖等，例如，作为单糖类，可举出：阿洛糖、葡萄糖(glucose)、阿卓糖、甘露糖、半乳糖、阿洛酮糖、果糖(fructose)、山梨糖、核糖、木糖、阿拉伯糖等，作为二糖类，可举出：木酮糖、海藻糖、异海藻糖、麦芽糖(maltose)、纤维二糖、异麦芽糖等，作为寡糖，可举出：果寡糖、半乳寡糖、低聚乳果糖、脱氧核糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖木糖醇、山梨糖醇、抗坏血酸(维生素C)、葡萄糖醛酸内酯、葡萄糖酸内酯等。
作为上述多糖类，例如可举出：甲壳胺、右旋糖酐、环糊精、透明质酸、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基淀粉、淀粉、普鲁兰多糖等。
作为上述蛋白质，例如可举出：胎牛血清(FBS)、抗冻肽、牛血清白蛋白、胶原、明胶、酪蛋白等。
作为上述盐类，例如可举出：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、组氨酸等氨基酸以及氨基酸盐、双甘氨肽等肽类、磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐、Tris盐等无机盐类、黄素类、醋酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、葡萄糖酸等有机酸以及有机酸的盐等。
作为上述维生素类，例如可举出：维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12、维生素C、类维生素物质等。
作为上述表面活性剂，例如可举出：Triton、聚氧乙烯烷基醚、Tween20、Pluronic等。
作为包含于本发明的细胞剥离剂中的上述含有结合性脲基的聚合物的含量，只要可用于细胞分离，就没有特别限定，但优选在细胞剥离剂中为0.01质量％以上，更优选为0.05质量％以上。
包含于本发明的细胞剥离剂中的上述添加剂，只要可用于细胞分离，就没有特别限定，但相对于上述含有结合性脲基的聚合物，优选为0.01质量％以上，更优选为0.05质量％以上。
<分离载体>
作为上述分离载体的材质，没有特别限定，但可使用塑料、多糖类、金属、具有磁性的金属、陶瓷等，也可以使用多个这些材料。作为塑料，例如可举出：聚甲基丙烯酸甲酯等丙烯系聚合物、聚二甲基硅氧烷等各种硅橡胶、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯等。
此外，分离载体的形状，例如，除容器状、板状、粒子状和纤维状的形状之外，也可以为设置有穴、槽的多孔状的形状。其中，从细胞分离时的操作容易度出发，优选为容器状、板状、粒子状、纤维状或具有磁性的粒子状(磁性粒子)，特别优选为磁性粒子。
上述分离载体为磁性粒子时，没有特别限制，但平均粒径优选为0.9nm以上且低于5000nm，为了提高目的物的识别性，平均粒径特别优选为2.9nm以上且低于4000nm。磁性粒子的素材例如可举出：磁铁矿、氧化镍、铁氧体、钴铁氧化物、钡铁氧体、碳钢、钨钢、KS钢、稀土类钴磁石以及赤铁矿等。
此外，上述分离载体的表面，可以具有各种官能团，例如羟基、甲苯磺酰基、羧基、氨基、环氧基、巯基、硫醚基、多元醇残基等，此外，在表面也可以具有各种化合物的残基，例如链霉亲和素、明胶、胶原、纤连蛋白等蛋白质残基、右旋糖酐、普鲁兰多糖、甲壳胺、环糊精等多糖类残基、乙二胺之类的螯合剂的残基、聚山梨醇酯之类的表面活性剂的残基。
上述分离载体的表面与上述分离载体结合部位的组合，只要可结合，就没有特别限定，可举出：链霉亲和素残基和生物素残基的组合、链霉亲和素残基和脱硫生物素残基的组合、甲苯磺酰基和氨基的组合、环氧基和氨基的组合、羧基和氨基的组合、环糊精残基和金刚烷基的组合、多元醇残基和苯硼酸残基的组合等，但从获得的容易度出发，优选为链霉亲和素残基和生物素残基的组合、链霉亲和素残基和脱硫生物素残基的组合、甲苯磺酰基和氨基的组合、环氧基和氨基的组合或羧基和氨基的组合，最优选为链霉亲和素残基和生物素残基的组合、链霉亲和素残基和脱硫生物素残基的组合或甲苯磺酰基和氨基的组合。
<细胞分离方法>
通过使用本发明的细胞剥离剂从包含被分离细胞的细胞群分离被分离细胞，其可通过包括下述的〔工序A〕、〔工序B〕、〔工序C〕以及〔工序D〕的细胞分离方法进行。
〔工序A〕
通过向包含被分离细胞的细胞群添加具有分离载体结合部位的被分离细胞的表面抗原识别物质，使其与被分离细胞的表面抗原进行反应，得到被分离细胞-抗原识别物质复合体的工序。
作为上述细胞，可举出：培养用树立细胞、包括人的动物的受精卵以及卵细胞等。此外，还可举出精细胞、ES细胞、iPS细胞、间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、脐带血细胞等干细胞、肝细胞、神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血细胞等包括人的动物细胞或植物细胞等。
上述被分离细胞是指使用本发明的细胞剥离剂进行细胞分离而作为结果获得的细胞群，可以为单一的种类，也可以为由多种细胞构成的细胞群。
包含上述被分离细胞的细胞群是指优选含有0.1％以上的被分离细胞的细胞群，所含细胞的种类没有限制。
所谓上述表面抗原可以存在于血液、体液、组织切片、细胞集合体、悬浮细胞、粘附细胞等任意1种，这些细胞可以为活细胞，也可以为死细胞。
作为上述表面抗原识别物质，可举出：针对细胞内或细胞外体现的抗原的任意抗体、抗体衍生物、片段化抗体、或片段化抗体衍生物、以肽/MHC复合体为靶的TCR分子、细胞粘附受体分子、用于共刺激分子的受体、人工合成的结合分子、蛋白质A、凝集素、以细胞表面分子为靶的肽、核酸适配体(Aptamer)等。
作为具有上述分离载体结合部位的被分离细胞的抗原识别物质，也可以使用市售的试剂，但也可根据使用的抗原识别物质另外制作。作为使上述表面抗原识别物质含有上述分离载体结合部位的方法，可举出：添加、点击反应、酰胺化、酯化、硫酯化、碳酸酯化、席夫碱形成反应、还原氨化、介由自由基的偶联反应、狄尔斯-阿尔德反应、二硫化物化、迈克尔加成反应、巯基-烯反应、介由芳香族硼化合物的偶联反应、叔锍形成反应、季铵形成反应等，但从通用性的高度出发，优选为点击反应、酰胺化或酯化。
具有上述分离载体结合部位的被分离细胞的表面抗原识别物质与上述被分离细胞的表面抗原的反应，只要是对被分离细胞不造成负面影响的范围，就没有特别限制，但反应温度通常为2℃至25℃的范围，优选为2℃至20℃的范围，更优选为2℃至10℃的范围。此外，针对反应时间也没有特别限制，但通常为10分钟至2小时的范围，优选为10分钟至1小时的范围，更优选为10分钟至30分钟的范围。
具有上述分离载体结合部位的被分离细胞的表面抗原识别物质与上述被分离细胞的表面抗原的反应，例如可以在细胞分离用缓冲液中进行，只要对被分离细胞不造成负面影响的范围，就没有特别限定，通常可以使用在该领域内使用的缓冲液、培养基。例如可举出磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液等，也可以将它们混合使用。优选为磷酸缓冲液。此外，可举出Dulbecco改良的Eagle的MEM培养基(DMEM)、α-MEM培养基、洛斯维·帕克纪念研究所(RPMI)培养基、F12培养基、TC199培养基、GMEM培养基等，也可以将它们混合，或根据需要添加胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺、抗生素等这样的补充剂，但为了不损害抗原识别物质的反应性，优选无血清的培养基。此外，为防止细胞的凝集，也可以使用各种螯合剂。作为螯合剂，可举出与在作为上述细胞剥离剂中的添加剂的螯合剂的举例中举出的示例相同的试剂，优选为乙二胺四乙酸(EDTA)。作为细胞分离用缓冲液中的螯合剂的浓度，为0.1mM至20mM的范围，优选为0.5mM至10mM的范围，更优选为1mM至5mM的范围。螯合剂的浓度为0.1mM以上时，更易于体现细胞的凝集抑制效果，另一方面，为20mM以下时，更难以表现出细胞毒性等。
进一步地，为了促进具有上述分离载体结合部位的被分离细胞的表面抗原识别物质与上述被分离细胞的表面抗原的反应，可以添加多糖类、蛋白质、表面活性剂等。作为上述多糖类，可举出与在上述细胞剥离剂中作为添加剂的多糖类的举例中举出的示例相同的多糖；作为上述蛋白质，可举出与在上述细胞剥离剂中作为添加剂的蛋白质的举例中举出的示例相同的蛋白质；作为上述表面活性剂，可举出与在上述细胞剥离剂中作为添加剂的表面活性剂的举例中举出的示例相同的表面活性剂，但优选为右旋糖酐、牛血清白蛋白或Tween20，更优选为牛血清白蛋白。细胞分离用缓冲液中的多糖类、蛋白质、表面活性剂等，只要可用于细胞分离，就没有特别限制，但优选为0.01质量％以上，更优选为0.05质量％以上。细胞分离用缓冲液中的多糖类、蛋白质、表面活性剂等在上述范围内时，上述添加剂更易于发挥充分的效果。
通过进行以上〔工序A〕能够获得被分离细胞-抗原识别物质复合体。作为〔工序A〕中的具体例，即为一种使被分离细胞的表面抗原与生物素化抗体进行反应的工序。
〔工序B〕
通过介由分离载体结合部位，使由〔工序A〕得到的被分离细胞-抗原识别物质复合体与分离载体相互作用，得到被分离细胞-分离载体复合体的工序。
上述被分离细胞-抗原识别物质复合体与分离载体的反应，只要是对被分离细胞不造成负面影响的范围，就没有特别限制，但例如可使用上述细胞分离用缓冲液进行。此外，反应温度通常为2℃至25℃的范围，优选为2℃至20℃的范围，更优选为2℃至10℃的范围。通过设为在25℃以下进行的反应，细胞捕获了表面的抗原和抗体，作为结果能更容易避免与分离载体结合的细胞数变少。此外，针对反应时间也没有特别限制，但通常为10分钟至2小时的范围，优选为10分钟至1小时的范围，更优选为10分钟至30分钟的范围。
通过进行以上〔工序B〕，可以获得被分离细胞-分离载体复合体。作为〔工序B〕中的具体例，即为一种介由生物素化抗体使被分离细胞与分离载体结合的工序。
〔工序C〕
从包含被分离细胞的细胞群中仅分离出由〔工序B〕得到的被分离细胞-分离载体复合体的工序。
作为从包含被分离细胞的细胞群中仅分离出被分离细胞-分离载体复合体的方法，虽根据分离载体的不同而不同，但例如在分离载体为磁性粒子时，通常是利用磁力进行收集磁性粒子的方法。此外，在分离载体为胶乳粒子之类的粒子时，可进行基于时间变化引起的沉淀、基于离心分离的的沉降。进一步地，在分离载体为平板时，只要从上述细胞分离用缓冲液中取出即可。
在上述分离后，优选进行清洗，在清洗时，只要为对被分离细胞不造成负面影响的物质就没有特别限定，例如可以使用上述细胞分离用缓冲液。
通过进行以上〔工序C〕，可以分离被分离细胞-分离载体复合体。作为〔工序C〕中的具体例，即为一种通过磁性、离心分离等从包含被分离细胞的细胞群中提取出被分离细胞-分离载体复合体的工序。
〔工序D〕
向由〔工序C〕获得的被分离细胞-分离载体复合体添加上述细胞剥离剂，通过温度变化分离被分离细胞的工序。
虽然能向上述被分离细胞-分离载体复合体直接添加上述细胞剥离剂，但也可与上述细胞分离用缓冲液混合后添加。此外，作为添加时的温度，只要在作为使用的细胞剥离剂构成成分的含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度(UCST)以下，就没有特别限定，但作为对细胞不造成负面影响的温度，更优选为4～10℃的范围。此外，针对反应时间也没有特别限定，通常为10分钟至2小时的范围，但优选为10分钟至1小时，更优选为10分钟至30分钟的范围。
上述〔工序D〕中的温度变化是指在从作为细胞剥离剂构成成分的含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度(UCST)以下的温度至上限临界溶液温度(UCST)以上的温度进行加热。作为加热后的温度，可设定为对细胞不造成负面影响的温度，更优选为25～40℃的范围。
通过进行以上〔工序D〕，可以从被分离细胞-分离载体复合体分离被分离细胞。作为〔工序D〕中的具体例，即为一种使被分离细胞-分离载体复合体与细胞剥离剂进行反应，通过使温度变化，切断分离载体与被分离细胞之间的相互作用，提取出被分离细胞的工序。
[实施例]
以下，基于实施例等具体地说明本发明，但本发明不限于以下的实施例等。
(合成例1：脲单体(1)的合成)
[化18]
向茄形瓶中添加甲基丙烯酸氨基乙酯盐酸盐(20.0g，120mmol)，使其溶于90mL离子交换水。室温下添加氰酸钾(10.7g，132mmol)并搅拌。搅拌2小时后，冷冻干燥反应溶液，再次悬浮于200mL丙酮。之后，进行不溶成分的过滤，从获得的混合溶液中减压蒸馏除去溶剂。之后使用乙酸乙酯/甲醇9/1(v/v)通过硅胶色谱法进行精制，得到脲单体(1)。
产量：12g
1H-NMR(DMSO-d6、400MHz)
6.2ppm(CONH2 )，5.7ppm(CH2 ＝C)，5.5ppm(CH2 ＝C，NHCO)，4.0ppm(OCH2 )，3.2ppm(CH2 NH)，2.0ppm(CH3 )
(合成例2-1：含有脲基的聚合物A的合成)
[化19]
(式中，co表示为化学式中的两个单体单元的共聚物结构。)
向试验管添加脲单体(1)(380mg)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(2)(MPC、32.8mg)、2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸-3-叠氮基-1-丙醇酯(0.90mg)、偶氮二异丁腈(0.164mg)，使其溶于二甲基亚砜(2.4mL)、乙醇(0.6mL)。在氮气下起泡后，将反应液升温至65℃反应20小时。通过用丙酮将聚合溶液再沉淀，得到含有脲基的聚合物A。
产量：350mg
组成比(摩尔比)x:y＝95:5(从1HNMR计算得出)
1H-NMR(CD3OD+D2O、400MHz)
4.1ppm(Ureido：COO-CH2 )，3.8-4，6ppm(MPC：COO-CH2 ，CH2-CH2 ，PO-CH2 )，3.6ppm(MPC：CH2 -N)，3.4ppm(Ureido：CH2-CH2 )，3.2ppm(N(CH3 )3)，1.0-2.4ppm(聚合物主链)
通过检测器使用了WYATT公司制造的多角度光散乱检测器的凝胶浸透色谱测定来求出所得的含有脲基的聚合物A的数均分子量。使用岛津制作所公司制造的LC-720AD泵、岛津制作所公司制造的RID10A检测器(差示折光仪)、SPD-20A检测器(UV)。对于色谱柱而言，使用东曹株式会社制造的TSKGel G3000PWXL和TSKGel G5000PWXL(柱尺寸4.6mm×25cm)2根连接的色谱柱。使用溶解了100mM的硝酸钠的蒸馏水/乙腈(5/5；v/v)用作展开剂。测定条件为流速0.6ml/min、柱温40℃、样品浓度2mg/mL、注入量100μL。作为凝胶浸透色谱测定的结果，含有脲基的聚合物A的数均分子量为308,000。
通过紫外可见分光光度计测定获得的含有脲基的聚合物A的相转变温度。以成为2.5mg/mL的浓度地将含有脲基的聚合物A溶解于细胞分离用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水(PBS)+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+2mMEDTA)。将溶液放入石英比色皿，在70℃～5℃的范围内改变溶液温度，通过紫外可见分光光度计测定这期间的溶液透过率(％)。此外，溶液透过率(％)由下述式计算得出。其结果，含有脲基的聚合物A的相转变温度为20℃。
[数学式1]
透过率(％)＝10(-吸光度)
(合成例2-2：含有结合性脲基的聚合物A’的合成)
[化20]
(式中，co表示化学式中的2个单体单元的共聚物结构。)
向试验管中添加含有脲基的聚合物A(300mg)、生物素-2-炔烃(2)(34.1mg)、溴化铜(I)(13.2mg)，将其溶于二甲基亚砜(4mL)、离子交换水(1mL)。添加五甲基二乙烯三胺(PMDTA)(16.0mg)的二甲基亚砜溶液(1mL)，开始反应。在室温下经一晚反应后，通过透析进行精制，得到含有结合性脲基的聚合物A’。
产量：300mg
(配制例2-3：细胞剥离剂A”的制备)
以成为0.8mg/mL的浓度地将含有结合性脲基的聚合物A’溶解于细胞分离用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水(PBS)+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+2mM EDTA)，配制细胞剥离剂A”。
(合成例3-1：含有脲基的聚合物B的合成)
[化21]
(式中，co表示化学式中的2个单体单元的共聚物结构。)
向四口烧瓶中添加从Merck公司购入的数均分子量为30,000左右的聚烯丙基胺(500mg)，将其溶解于离子交换水10mL，加热至50℃，再向其添加氰酸钾(611mg，7.54mmol)(聚烯丙基胺中，相对于1摩尔的氨基，为0.86摩尔氰酸钾)，进行反应24小时。反应结束后，相同温度下通过透析进行精制，得到含有脲基的聚合物B。
产量：579mg
组成比(摩尔比)：x:y＝85:15(通过1HNMR计算得出)
按照与合成例2-1相同方式，求出获得的含有脲基的聚合物B的数均分子量。凝胶浸透色谱测定的结果，含有脲基的聚合物B的数均分子量为36,000。
按照与合成例2-1相同方式，求出获得的含有脲基的聚合物B的相转变温度。通过紫外可见分光光度计测定的结果，相转变温度为30℃。
(合成例3-2：含有结合性脲基的聚合物B’的合成)
[化22]
(式中，co表示化学式中的2个或3个单体单元的共聚物结构。)
向试验管添加含有脲基的聚合物B(300mg)、生物素-2-NHS(3)(50mg，0.10mmol)(在含有脲基的聚合物B中，相对于1摩尔的氨基，为0.1摩尔的生物素-2-NHS)，使其溶解于二甲基亚砜(1mL)。在室温下经一晚反应后，通过透析进行精制，得到含有结合性脲基的聚合物B’。
产量：326mg
(配制例3-3：细胞剥离剂B”的制备)
以成为0.8mg/mL的浓度地将含有结合性脲基的聚合物B’溶解于细胞分离用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水(PBS)+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+2mM EDTA)，配制细胞剥离剂B”。
(合成例4-1：含有脲基的聚合物C的合成)
[化23]
(式中，co表示化学式中的2个单体单元的共聚物结构。)
向试验管中加入数均分子量为150,000～300,000左右的聚-L-鸟氨酸500mg，将其溶解于1M咪唑缓冲液(pH7)1ml，加热至50℃，再向其添加氰酸钾(263mg，3.25mmol)(相对于1摩尔的鸟氨酸残基，为0.86摩尔)，进行24小时反应。反应结束后，在相同温度下通过透析进行精制，得到含有脲基的聚合物C。
产量：540mg
组成比(摩尔比)x:y＝84:16(通过1HNMR计算得出)
按照与合成例2-1相同方式，求出获得的含有脲基的聚合物C的数均分子量。凝胶浸透色谱测定的结果，含有脲基的聚合物C的数均分子量为260,000。
按照与合成例2-1相同方式，求出获得的含有脲基的聚合物C的相转变温度。通过紫外可见分光光度计测定的结果，相转变温度为20℃。
(合成例4-2：含有结合性脲基的聚合物C’的合成)
[化24]
(式中，co表示化学式中的2个或3个单体单元的共聚物结构。)
在试验管中，将含有脲基的聚合物C(300mg)、生物素-2-NHS(3)(30mg，0.06mmol)(在含有脲基的聚合物C中，相对于1摩尔的氨基，为0.1摩尔)溶解于二甲基亚砜(1mL)。在室温下经一晚反应后，通过透析进行精制，得到含有结合性脲基的聚合物C’。
产量：298mg
(配制例4-3：细胞剥离剂C”的制备)
以成为0.8mg/mL的浓度地将含有结合性脲基的聚合物C’溶解于细胞分离用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水(PBS)+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+2mM EDTA)，配制细胞剥离剂C”。
(配制例5：细胞剥离剂D”的制备)
以成为0.8mg/mL的浓度地将含有结合性脲基的聚合物B溶解于细胞分离用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水(PBS)+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+2mM EDTA)，配制细胞剥离剂D”。
<实施例1-1>
(使用单一细胞种类的细胞分离试验)
将悬浮于无血清RPMI1640培养基的人源白血病细胞株HL-60(5×106cells/mL，200μL)分注至离心管(Eppendorftube)，制备细胞悬浮液。将制备的细胞悬浮液的细胞数进行计数(计数A)。向细胞悬浮液加入生物素化抗CD45抗体(4μL)，4℃下振荡10分钟。之后，加入300μL细胞分离用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水(PBS)+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+2mMEDTA)，350g加速度下离心10分钟。离心后去除上清，使用细胞分离用缓冲液(200μL)使其再次悬浮。添加INVITROGEN公司制造的Dynabeads(注册商标)M-280Streptavidin(6×108beads/mL，16μL)作为分离载体，搅拌后在4℃下振荡15分钟。在4℃下收集磁珠，去除上清，通过细胞分离用缓冲液进行清洗后，添加细胞剥离剂A”，之后在4℃下使其反应15分钟。之后在37℃下加热15分钟，再次进行收集磁粒，回收上清(测定样品X)，并计数该细胞数(计数B)。用台盼蓝(trypan blue)处理后，使用Thermo Fisher公司制造的细胞计数器(Countess 2)进行细胞数的计数。针对测定样品X的存活率，在分离后，不进行清洗，在37℃培养6小时后进行台盼蓝处理，使用Thermo Fisher公司制造的细胞计数器(Countess 2)求出存活率。
按照下述式(5)，计算得出细胞分离后的HL-60细胞的回收率。按照下述式(6)，计算得出存活率。评价结果如表1所示。
[数学式2]
回收率＝(计数A/计数B)×100...(5)
存活率＝(测定样品X中的HL-60活细胞数/测定样品X中的HL-60总细胞数)×100...(6)
<实施例1-2～1-4>
除使用表1所示的分离载体和细胞剥离剂之外，按照与实施例1-1相同方式，进行使用单一细胞种类的细胞分离试验。评价结果如表1所示。
<实施例2-1>
(使用多细胞种类的细胞分离试验)
离心管中，以细胞数成为33:67地将事先用Hoechest33342染色的HeLa细胞和HL-60细胞混合，制备多细胞混合液(总细胞数5×106cells/mL，200μL)(测定样品A)。向其加入生物素化抗CD45抗体(4μL)，在4℃下振荡10分钟。之后，加入300μL细胞分离用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水(PBS)+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+2mM EDTA)，在350g加速度下离心10分钟。离心后去除上清，使用细胞分离用缓冲液(200μL)使其再次悬浮。添加INVITROGEN公司制造的Dynabeads(注册商标)M-280Streptavidin(6×108beads/mL，16μL)作为分离载体，搅拌后，在4℃下振荡15分钟。在4℃下收集磁珠，4℃下去除上清，使用细胞分离用缓冲液进行清洗。之后，添加细胞剥离剂A”，在4℃下使其反应15分钟。之后在37℃下加热15分钟，再度进行磁珠收集，回收上清(测定样品B)。使用异硫氰酸荧光素(FITC)-标记二次抗体，对测定样品A和B进行CD45阳性细胞的染色。之后，加入至BD公司制造的Truecount Tube，通过LSRFortessa X-20流式细胞仪进行分析。针对测定样品B的存活率，在分离后，不进行清洗，在37℃培养6小时后进行台盼蓝处理，使用Thermo Fisher公司制造的细胞计数器(Countess 2)求出存活率。
按照下述式(7)，计算得出细胞分离后的HL-60细胞的回收率。接着按照下述式(8)，计算得出纯度。按照下述式(9)，计算得出存活率。评价结果如表2所示。
[数学式3]
回收率＝(测定样品B中的HL-60总细胞数/测定样品A中的HL-60总细胞数)×100...(7)
纯度＝100-(测定样品B中的HeLa细胞数/测定样品B中的总细胞数)×100...(8)
存活率＝(测定样品B中的HL-60活细胞数/测定样品B中的HL-60总细胞数)×100...(9)
<实施例2-2～2-4>
除使用表2所示的分离载体和细胞剥离剂之外，按照与实施例2-1相同方式，进行使用多种细胞的细胞分离试验。评价结果如表2所示。
<比较例1>
将悬浮于无血清RPMI1640培养基的人源白血病细胞株HL-60(5×106cells/mL，200μL)分注至离心管，制备细胞悬浮液。对制备的细胞悬浮液的细胞数进行计数(计数A)。向细胞悬浮液加入脱硫生物素化抗CD45抗体(4μL)，在4℃下振荡10分钟。之后添加300μL细胞分离用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水(PBS)+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+2mM EDTA)，在350g加速度下离心10分钟。离心后去除上清，使用细胞分离用缓冲液(200μL)使其再次悬浮。添加INVITROGEN公司制造的Dynabeads(注册商标)M-280Streptavidin(6×108beads/mL，16μL)作为分离载体，搅拌后，在4℃下振荡15分钟。在4℃下收集磁珠，4℃下去除上清，使用细胞分离用缓冲液进行清洗，之后，添加含有生物素的细胞分离缓冲液后，在4℃下使其反应15分钟。再度进行磁珠收集，回收上清(测定样品X)，计数该细胞数(计数B)。用台盼蓝处理后，使用Thermo Fisher公司制造的细胞计数器(Countess 2)测定细胞数的数量。针对测定样品X的存活率，在分离后，不进行清洗，在37℃培养6小时后进行台盼蓝处理，使用ThermoFisher公司制造的细胞计数器(Countess 2)求出存活率。
按照上述式(5)，计算得出细胞分离后的HL-60细胞的回收率。按照上述式(6)，计算得出存活率。评价结果如表1所示。
<比较例2>
离心管中，以细胞数成为33:67的方式，将事先用Hoechest33342染色的HeLa细胞和HL-60细胞混合，制备多细胞混合液(总细胞数5×106cells/mL，200μL)(测定样品A)。向其加入脱硫生物素化抗CD45抗体(4μL)，在4℃下振荡10分钟。之后，加入300μL细胞分离用缓冲液(磷酸缓冲生理盐水(PBS)+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+2mM EDTA)，在350g加速度下离心10分钟。离心后去除上清，使用细胞分离用缓冲液(200μL)使其再次悬浮。添加INVITROGEN公司制造的Dynabeads(注册商标)M-280Streptavidin(6×108beads/mL，16μL)作为分离载体，搅拌后，在4℃下振荡15分钟。在4℃下收集磁珠，4℃下去除上清，使用细胞分离用缓冲液进行清洗。之后，添加含有生物素的细胞分离缓冲液，在4℃下使其反应15分钟。再度进行磁珠收集，回收上清(测定样品B)。使用异硫氰酸荧光素(FITC)-标记二次抗体，对测定样品A和B进行CD45阳性细胞的染色。之后，加入至BD公司制造的TruecountTube，通过LSRFortessa X-20流式细胞仪进行分析。针对测定样品B的存活率，在分离后，不进行清洗，在37℃培养6小时后进行台盼蓝处理，使用Thermo Fisher公司制造的细胞计数器(Countess 2)求出存活率。
按照上述式(7)，计算得出细胞分离后的HL-60细胞的回收率。接着按照上述式(8)，计算得出纯度。按照上述式(9)，计算得出存活率。评价结果如表2所示。
如表1、2所示，使用实施例的聚合物时，相较于单独制备脱硫生物素化抗体，进行使用了含有生物素的细胞分离缓冲液的细胞分离的情况，回收率上升。此外，还可看出使用本发明的细胞剥离剂而分离的细胞的存活率非常高。
由以上可知，作为从分离载体上脱离被分离细胞的驱动力，已知可以利用温度应答引起的聚合物链的伸缩，含有对分离后的细胞不造成影响的聚合物的细胞剥离剂有用，所述聚合物例如为在使用了被分离细胞表面抗原的细胞分离方法中，具有可与分离载体结合的分离载体结合部位的含有结合性脲基的聚合物。进一步地，也很明显，在使用该细胞剥离剂的细胞分离方法中可以使用通用性较高的生物素化抗体。
[表1]
[表2]
[产业上的可利用性]
根据本发明，提供一种在使用了被分离细胞表面抗原的细胞分离方法中可适用于种类广泛的细胞的、进一步地无需在分离后清洗被分离细胞的细胞剥离剂以及使用了该细胞剥离剂的细胞分离方法。
本申请以在日本提出的专利特愿2021-109278(申请日：2021年6月30日)为基础，其内容全部包含于本说明书中。
Claims (22)
1.一种细胞剥离剂，
其为用于从与被分离细胞结合的分离载体剥离被分离细胞的细胞剥离剂，
所述细胞剥离剂包含含有结合性脲基的聚合物，所述含有结合性脲基的聚合物具有下述式(1)所示的侧链结构，在其侧链或末端具有可与所述分离载体结合的分离载体结合部位，
-NH-(C＝O)-NH2…(1)
所述含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度在4～40℃的范围。
2.根据权利要求1所述的细胞剥离剂，所述分离载体结合部位为生物素残基、链霉亲和素残基、氨基、羧基、巯基、环糊精残基、金刚烷基或苯硼酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的主链为乙烯性不饱和聚合物、聚烯丙基胺或多肽。
4.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列A，所述含有脲基的重复序列A为下述式(2)所示含有脲基结构的重复，
所述式(2)中，R1表示氢原子或甲基，A1表示O或NH，a表示1～6的整数。
5.根据权利要求4所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物进一步含有亲水性重复序列B，所述亲水性重复序列B为下述式(3)所示亲水性结构的重复，
所述式(3)中，R2表示氢原子或甲基，A2表示O或NH，b表示1～6的整数，X从下述式(4)～(9)中进行选择；
所述式(9)中，m表示0～20的整数。
6.根据权利要求5所述的细胞剥离剂，在所述含有脲基的重复序列A中，A1为O，a为2；在所述亲水性重复序列B中，A2为O，b为2，X为所述式(4)所示。
7.根据权利要求5所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列A与所述亲水性重复序列B的摩尔比具有0.5≦A/(A+B)的关系。
8.根据权利要求4所述的细胞剥离剂，所述含有结合性脲基的聚合物在所述含有脲基的聚合物的末端具有作为所述分离载体结合部位的生物素残基。
9.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列C和亲水性重复序列D，所述含有脲基的重复序列C为下述式(10)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列D为下述式(11)所示的亲水性结构的重复。
10.根据权利要求9所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列C和所述亲水性重复序列D的摩尔比具有0.5≦C/(C+D)的关系。
11.根据权利要求9所述的细胞剥离剂，包含在所述含有脲基的聚合物的侧链上具有生物素残基作为所述分离载体结合部位的所述含有结合性脲基的聚合物。
12.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列E和亲水性重复序列F，所述含有脲基的重复序列E为下述式(12)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列F为下述式(13)所示的亲水性结构的重复，
所述式(12)中，c表示0～6的整数，d表示0～6的整数；所述式(13)中，e表示0～6的整数，f表示0～6的整数。
13.根据权利要求12所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的重复序列E中，c为0，d为3；所述亲水性重复序列F中，e为0，f为3。
14.根据权利要求12所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列E和所述亲水性重复序列F的摩尔比具有0.5≦E/(E+F)的关系。
15.根据权利要求12所述的细胞剥离剂，包含在所述含有脲基的聚合物的侧链上具有生物素残基作为所述分离载体结合部位的所述含有结合性脲基的聚合物。
16.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的数均分子量为20,000～1,000,000。
17.一种细胞分离方法，其特征在于，
其为用于从包含被分离细胞的细胞群中分离被分离细胞的方法，
包括下述的工序A、工序B、工序C和工序D，
工序A：通过向包含被分离细胞的细胞群添加具有分离载体结合部位的被分离细胞的表面抗原识别物质，使其与被分离细胞的表面抗原进行反应，得到被分离细胞-抗原识别物质复合体的工序；
工序B：通过介由分离载体结合部位，使由工序A得到的被分离细胞-抗原识别物质复合体与分离载体相互作用，得到被分离细胞-分离载体复合体的工序；
工序C：从包含被分离细胞的细胞群中仅分离出由工序B得到的被分离细胞-分离载体复合体的工序；
工序D：向由工序C获得的被分离细胞-分离载体复合体添加权利要求1或2所述的细胞剥离剂，通过温度变化分离被分离细胞的工序。
18.根据权利要求17所述的细胞分离方法，所述工序A中，分离载体结合部位为生物素残基、链霉亲和素残基、氨基、羧基、巯基、环糊精残基、金刚烷基或苯硼酸残基。
19.根据权利要求17所述的细胞分离方法，所述工序A中，抗原识别物质为抗体、抗体片段、肽、核酸适配体、蛋白质A或凝集素。
20.根据权利要求17所述的细胞分离方法，所述工序B中，分离载体为磁性粒子。
21.根据权利要求20所述的细胞分离方法，所述工序C中，通过磁力从包含被分离细胞的细胞群中仅分离出被分离细胞-分离载体复合体。
22.根据权利要求17所述的细胞分离方法，所述工序D中，温度变化为在从含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度以下的温度加温至上限临界溶液温度以上的温度。
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