JP7083643B2 - 分子インプリントポリマー - Google Patents

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Description

本発明は、グリカンを結合させるための新規な分子インプリントポリマーと、その製造方法と、そのグリカン結合ポリマーの利用を記述する。
細胞表面グリカンとは、血漿の膜結合タンパク質または膜結合脂質に付着する多彩なグリカンモチーフを意味する。それは細胞の最外面を構成していて、細胞コミュニケーションや、宿主－病原体認識、感染、細胞分化、細胞増殖、細胞移動などのプロセスに関与している。哺乳動物のグリカンの十分な多様性を生み出すには約７００のタンパク質が必要とされる。そのグリカンは、１０種類の単糖だけ、すなわちフコース（Ｆｕｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、イズロン酸（ＩｄｏＡ）、マンノース（Ｍａｎ）、シアル酸（ＳＡ）、キシロース（Ｘｙｌ）から組み立てられる。グリコシル化において最もよく見られるがん関連変化は、シアリル化、フコシル化、Ｏ－グリカン切断、Ｎ結合型グリカン分岐、Ｏ結合型グリカン分岐である（図１）。
ＳＡは、糖脂質と糖タンパク質のグリカン鎖の最も外側にある単糖単位であり、病原体が付着する認識部位となることがしばしばある。ＳＡの出現は、心血管疾患、神経疾患、がんなどのいくつかの疾患状態と相関していることが証明されている（Ｂ． Ａｄａｍｃｚｙｋ、Ｔ． Ｔｈａｒｍａｌｉｎｇａｍ、Ｐ． Ｍ． Ｒｕｄｄ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ） － Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ、２０１２年、第１８２０巻、１３４７～１３５３ページ）。臨床的には、シアリル化の増加は、がん患者における浸潤および悪い予後と関係していることがしばしばある。合成プロセスが不完全だと切断された構造が生合成されることになる。それを、胃腸がんと乳がんにおけるＳＴｎ（図１）の発現に見ることができる。ＳＴｎ（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６ＧａｌＮＡｃα－Ｏ－Ｒ）とＴｎ（ＧａｌＮＡｃα－Ｏ－Ｒ）は、ヒトのがんの８０％で発現していて、正常な組織では存在しないか、弱く発現するだけであるため、診断と治療の標的として広く注目を集めてきた。しかしＴｎとＳＴｎに対するＩｇＧ抗体を作製することは難しく、ＳＴｎに対するＩｇＧ抗体は親和性が小さいため捕獲戦略における性能が悪い。ＳＡが利用できる数少ないレクチン（ＳＮＡとＭＡＡ）は特異性が広くて親和性が小さいため、捕獲アッセイにおける性能が悪い。
逆に、ステージが進んだがんで一般に観察される新合成とは、多くのがんにおけるいくつかの抗原（シアリルルイスａ（ＳＬｅａ）やシアリルルイスＸ（ＳＬｅｘ））のデノボ発現に見られるように、糖質決定基の発現に関与するいくつかの遺伝子ががんに関連して誘導されることを意味する。ポリシアル酸は、いくつかのタイプのがんに関連する増加したシアル化であり、ステージの進んだ腫瘍で頻繁に発現する。
哺乳動物の主要なＳＡとして、Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ－アセチルノイラミン酸）とＮｅｕ５Ｇｃ（Ｎ－グリコリルノイラミン酸）の２つがある（図１参照）。これらは酸素原子が１個だけ異なっていて、その酸素は、細胞質の中でシチジン一リン酸Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）という酵素によって付加される。ヒトは、ＣＭＡＨ遺伝子の不活性化変異が原因でこの酵素活性を欠いている。このＳＡの代替物が通常は存在しないため、免疫寛容が起きない。その結果として、Ｎｅｕ５Ｇｃが食事源から取り込まれた後に糖共役体に組み込まれるとき、この糖に対する「自己抗体」が発達し、それが、がんの開始に関係する炎症経路を強化することが提案されている。これらの形態を識別するとともに、動物とヒトの結合特異的グリコシル化に関係する２－３結合シアル酸と２－６結合シアル酸を識別するための新規な親和性試薬が強く望まれている。
したがってこれらグリコシル化モチーフを分析して決定することが診断における重要な１つの目的だが、この仕事は、レクチンとグリカン特異的抗体の入手が限られているため困難であることがわかった（Ｎ． Ｆｕｊｉｔａｎｉ、Ｊ．－ｉ． Ｆｕｒｕｋａｗａ、Ｋ． Ａｒａｋｉ、Ｔ． Ｆｕｊｉｏｋａ、Ｙ． Ｔａｋｅｇａｗａ、Ｊ． Ｐｉａｏ、Ｔ． Ｎｉｓｈｉｏｋａ、Ｔ． Ｔａｍｕｒａ、Ｔ． Ｎｉｋａｉｄｏ、Ｍ． Ｉｔｏ、Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｙ． Ｓｈｉｎｏｈａｒａ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１３年、第１１０巻、２１０５～２１１０ページ）。
しかし多数の高感度法が公開されていて、それらの方法では、全シアル酸含量を測定するか、さまざまなタイプのシアル酸を測定する。これらの方法はコストがかかり、作業が厄介で、時間がかかるため、実施には熟練した操作者などの一般に洗練された手段が必要とされる。したがって日常的な用途にはあまり適していない。いくつかのタイプのシアル酸のためのレクチン系アッセイが存在しているが、アッセイの開発では、感度が低くて特異度が悪いという障害に遭遇することがしばしばある。シアロ糖タンパク質中のシアル酸、または遊離部分としてのシアル酸の検出には、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィと質量分析の組み合わせ（ＧＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の利用が含まれる。これらの方法は、シアル化パターンをモニタするのにサンプル調製、特別な装置、標的タンパク質の精製、長くて複雑なデータ分析が大いに必要とされるため複雑である。
これが、例えば細胞または組織のイメージング、セルソーティング、標的化グライコミクス、細胞グリコシル化バイオマーカー分析に使用したり、医学において例えば標的化薬送達や細胞表面相互作用の選択的抑制の用途に使用したりできると考えられる代わりのグリカン特異的受容体を開発する正当な理由となる。イメージングに応用するため、極めて多数の低分子量ホストが系統的に設計されて、例えば蛍光レポータ基または量子ドットに共役されている。シアル酸のための最も強力なホストは、２つ以上の直交結合基、ジオール基に向かうボロン酸、カルボキシレート基に向かう帯電した、または中性のアニオン受容体である。他の強力な結合基は、多機能性が組み込まれた２つ以上のボロン酸基である。これは、ジオールとのｐＨ依存性可逆的エステル化に関与し、５員または６員の環構造になる。
単糖選択的受容体を分子インプリントの技術によって用意できることが以前から知られている。Ｗｕｌｆｆらは、２つのビニルベンゼンボロン酸に共役した単糖鋳型を用い、マンノース、フルクトース、ガラクトースのための非常に識別性のあるボロン酸塩系受容体を報告した（１）。別の研究者は、後にこの手続きを採用してシアル酸インプリントバルクポリマーやセンサーコーティングを合成した。これらボロン酸含有ＭＩＰは、塩基性緩衝液／アセトニトリル混合物（ｐＨ ８）の中で調べたとき、強い鋳型親和性を特徴としていた。その後、より簡単なワンポットプロトコルを利用して糖タンパク質選択的ＭＩＰが合成された（Ｘ． ＢｉとＺ． Ｌｉｕ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１３年、第８６巻、９５９～９６６ページ）。ここではボロン酸塩モノマーが、塩基触媒の存在下にてその場でＳＡ含有糖タンパク質に共役され、その後、架橋モノマーと共重合されてインプリントポリマーを形成する。これまでのところ、ＳＡインプリント受容体は、水中で、特に生理学的条件下で調べたとき、糖標的に対して弱い結合（Ｋ＜１０３ Ｍ－１）しか示さないことが報告されている。これは、設計された最も強力なホスト（上記参照）とは対照的である。そのホストでは、結合が十分に強い（１０５ Ｍ－１超）ため、細胞をベースとしたイメージングが可能であり、セルソーティングの用途さえ可能だからである。しかしその受容体がより複雑なグリカン（二糖、高級糖）を標的とするように設計するのは面倒である。そのためには、強力な結合物を同定するために多数の類似体を合成する多大な努力と試験が一般に必要とされる。
そのような受容体は、細胞または組織のイメージングの用途以外に、レクチンまたは抗体の代替物として使用することが、標的化グライコミクス、グリカンセンサー、特定のグリカンモチーフの豊富化、セルソーティング、医学（例えば標的化薬送達や、細胞表面相互作用の選択的抑制）において可能であると考えられる。
１つの応用は、がん患者の体内を循環している腫瘍細胞（ＣＴＣ）の同定と分子特徴づけに関する。これらの細胞の特徴を明らかにすることは、転移プロセスと可能性のある治療戦略を理解する上で重要であり、そうすることで予後と治療のガイドとなる。この分野の進歩はゆっくりとしていた。その理由の一端は、ＣＴＣが「干し草の山の中の針」のように少ないことにある。ＣＴＣは、転移性疾患を有する患者の体内で信頼性よく検出することができるとはいえ、より少数のＣＴＣで初期段階の治療可能ながんを検出することが課題として残されている。ＣＴＣを検出するための現在優勢な技術は、稀な細胞を検出する確率を最適化するための初期豊富化工程の後に細胞が無傷なままで残る細胞測定アッセイである。優勢な豊富化技術は、典型的には、上皮タンパク質マーカー（ＥｐＣａｍ）に依存した免疫磁性分離に基づいている。しかしがん細胞から放出される細胞表面グリカンまたは循環Ｏ－糖タンパク質も、診断と予後予測のための重要な血清バイオマーカーである。循環しているＯ－糖タンパク質ががんに関連して異常な糖形態になっているものを選択的に検出できると、がんバイオマーカーアッセイの特異度を大きくすることが可能になる。
腫瘍への薬の標的化送達が、がんの診断と治療における大きな進歩を表わしている。したがって新規な腫瘍特異的リガンドまたは医薬ナノ担体が開発されることが大いに望ましい。そのナノ担体に薬を搭載し、身体の中の疾患組織だけが存在する特定の部分に送達することにより、健康な組織との相互作用を回避することができると考えられる。エンドサイトーシスを通じて送達用ビヒクル（ナノ担体）を標的とする特定の細胞器官に向けて送達することで、巨大分子薬に特に適したより特異的な標的化が提供される。がん関連グリカンを発現している細胞をそのようなナノ担体の選択的標的とすることが、１つの重要な目的である。
本発明は、グリカンに対する中程度（１０３～１０５ Ｍ－１）から大きな（１０８ Ｍ－１超）親和性を特徴とするグリカン特異的分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）を開示する。このＭＩＰは、１つ以上の単糖、二糖、高級糖（グリカン、グリカンを含有する分子または種（糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖、プロテオグリカンなど）が含まれる）から選択した鋳型を用いて調製したものである。
一実施態様では、鋳型は、１～５個の糖を含んでいて一般に末端糖としてシアル酸を有するグリカンの最外側端部に対応する。
別の一実施態様では、１つ以上の糖酸、好ましくはシアル酸またはグルクロン酸がグリカンに組み込まれている。
別の一実施態様では、１つ以上の硫酸基またはリン酸基がグリカンに組み込まれている。
ＭＩＰは、架橋モノマーおよび／または機能性モノマーから選択した少なくとも１つのモノマーを用いて調製され、鋳型と、場合によっては溶媒との存在下で重合されることを特徴とする。その鋳型が得られたポリマーから除去されることで、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）が得られる。
一実施態様では、ＭＩＰは、ボロン酸および／またはカチオン基および／または水素結合基などの直交結合基を含む少なくとも２つの機能性モノマーを用いて調製される。
第２の実施態様では、ＭＩＰは、蛍光部分を備えていて、結合に反応して蛍光が変化するゲスト反応性蛍光を示す。
第３の実施態様では、ＭＩＰは、インプリントシェルと、機能性コアまたは非機能性コアとを含むコアシェル形状を有する粒子の形態に調製される。
受容体はさらに、長い商品寿命を持つ丈夫で安定なものであり、低コストの簡単な手順を利用して調製することができる。したがってこれらの特徴により上記の欠点が回避される。受容体は、新規なインプリント法を利用して調製され、その結果としてグリカン標的に対する結合親和性が顕著に向上する。そのため、二糖や、より複雑な標的（例えばルイスＸ四糖などの腫瘍特異的な糖に見られるような高級糖や分岐構造が含まれる）のためのグリカン特異的受容体の設計が可能になる。
第４の実施態様では、ＭＩＰは、細胞または組織のイメージング、セルソーティング、グライコミクス、細胞グリコシル化バイオマーカー分析や、医学における例えば標的化薬送達や細胞表面相互作用の選択的抑制の用途に用いられる。
第５の実施態様では、ＭＩＰは、がん患者の体内を循環している腫瘍細胞（ＣＴＣ）の同定と分子特徴づけに用いられる。
第６の実施態様では、ＭＩＰは、エンドサイトーシスを通じて治療作用を及ぼすか、治療のためエンドサイトーシスを通じた細胞内標的化薬送達に用いられる。
糖インプリントポリマーが標的とするグリカンの例。鋳型は、グリカンの断片、またはグリカンの構造全体に対応することができる。
鋳型の異なるサブユニットに直交して結合する少なくとも２つの、好ましくは３つの機能性モノマーを用いた糖インプリントの原理。図２は、糖インプリントポリマーが標的とするグリカンの例を開示している。鋳型は、グリカンの断片、またはグリカンの構造全体に対応することができる。
（Ａ）塩基性、カチオン性、酸性、アニオン性の機能性モノマーの例。アミン含有モノマーは一般式がＮＲ１Ｒ２Ｒ３である（ただしすべてのＲ基がＮに直接結合していて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のうちの少なくとも１つは重合可能な基である）。アミン含有モノマーの例は、２－ビニルピリジン（２－ＶＰＹ）、４－ビニルピリジン（４－ＶＰＹ）、ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）、２－アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭＡ）、２－アミノエチルメタクリルアミド（ＡＥＭＡＭ）、Ｎ－ビニルイミダゾール（ＶＩＭ）、Ｎ－（ジメチル）－２－エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、アリルアミン（ＡＬＡＭ）、ｐ－ビニル－Ｎ，Ｎ’－ジエチル－ベンズアミジン（ＶＤＥＡＢ）、ｐ－ビニルベンジルアミン（ＶＢＡ）である。カチオン性モノマーは一般式がＮ Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４ ＋Ｘ－である（ただしすべてのＲ基がＮに直接接続されていて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうちの少なくとも１つは重合可能な基であり、Ｘ－は対アニオンである）。カチオン性モノマーの例は、Ｎ－（トリメチル）－２－エチルメタクリレート－塩化アンモニウム（ＴＭＡＥＭＡ）、Ｎ－（トリメチル）－ｐ－ビニルベンジル－塩化アンモニウム（ＴＭＶＢＡ）、Ｎ－ビニル－Ｎ’－ベンジル－塩化イミダゾリウム（ＶＢＩ）、塩化Ｎ－ビニルピリジウム（Ｎ－ＶＰＹ）である。酸性モノマーの例は、メタクリル酸（ＭＡＡ）、アクリル酸（ＡＡ）、トリフルオロメチルアクリル酸（ＴＦＭ）、イタコン酸（ＩＴＡ）、ｐ－ビニル安息香酸（ＰＶＢ）、２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＡ）である。
（Ｂ）糖鋳型と相互作用する中性モノマーと水素結合モノマーの例。中性モノマーの例は、Ｎ－ビニルピロリドン（ＮＶＰ）、スチレン（Ｓ）、２－ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、アシロニトリル（ＡＮ）、シアノスチレン（ＣＳ）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、アクリルアミド（ＡＡＭ）、メタクリルアミド（ＭＡＡＭ）、Ｎ－ｔ－ブチルアクリルアミド（ＴＢＡＭ）である。尿素系機能性モノマーの例。Ｒ１－ＮＨＣＯＮＨ－Ｒ２のタイプの１，３二置換尿素モノマー（ただし置換基Ｒ１とＲ２のうちの少なくとも１つは重合可能な基である）。尿素系モノマーの例は、１－（４－スチリル）－３－（３，５－トリフルオロメチル－フェニル）－尿素（ＴＦＵ）である。
（Ｃ）架橋剤の例：エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、トリメチルプロパントリメタクリレート（ＴＲＩＭ）、ペンタエリトリトールトリアクリレート（ＰＥＴＡ）、エチル－ジアクリルアミド（ＥＢＡ）、ピペラジン－ジアクリルアミド（ＰＢＡ）、メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）。
（Ｄ）図に示してある置換基Ｒを有する蛍光発生尿素系機能性モノマーの例。
（Ｅ）糖鋳型に共有結合するモノマーの例（ただしＲは重合可能な基である）。例は、Ｒ－Ｂ（ＯＨ）２またはＲ－Ｂ（ＯＨ）ＯＲ２のタイプのボロン酸（ただしＲ２はアルキル置換基またはアリール置換基である）、ヒドラジンＲ－ＮＨ－ＮＨ２、アミン（ベンジルアミンＲ－Ｂｚｌ－ＮＨ２、ポリアミンなど）、スルホンヒドラジドＲ－ＰｈＳＯ２ＮＨＮＨ２。
（Ｆ）糖インプリントに用いるボロン酸モノマーの例。
協同的インプリントに基づいてグリカンインプリントポリマーを調製するための典型的な手続き。これは、共有結合と非共有結合の混合アプローチ（可逆的ボロン酸塩エステル化が含まれる）（１）によって、水素結合安定化とゲスト反応性蛍光レポータ基（２）によって、アミン触媒と静電安定化（３）によって、ＲＡＦＴを媒介としてシリカコア粒子の表面にＳＡ鋳型シェルをグラフトすることからなる。
ＳＡインプリントコアシェルナノ粒子（Ａ、Ｂ）またはＧＡインプリントコアシェルナノ粒子（Ｃ、Ｄ）のＴＥＭ画像。スケール棒＝０．５μｍ（Ａ、Ｃ）または５０ ｎｍ（Ｂ、Ｄ）。
ＳＡ－ＭＩＰ（上方の赤線）、ＧＡ－ＭＩＰ（中央の青線）、ＲＡＦＴ修飾コア粒子（下方の黒線）の透過ＦＴＩＲスペクトル（ＫＢｒ）。
Ａ）２％の水、Ｂ）５０％の水、Ｃ）９８％の水を含むメタノールと水の混合物の中のＳＡ－ＭＩＰに添加されたＳＡ（黒丸）またはＧＡ（白三角）と、ＧＡ－ＭＩＰに添加されたＳＡ（白丸）またはＧＡ（黒三角）の結合曲線。ＳＡ－ＭＩＰに結合したＳＡとＧＡに対応する結合曲線は、ラングミュア単一部位モデルにフィットさせ、各グラフの横に掲載した結合パラメータを得た。ＧＡ－ＭＩＰに対応するデータはラングミュア式にうまくフィットしなかったため、それ以上評価しなかった。
２７μｇ／ｍｌのＳＡ－ＭＩＰ（Ａ）または８０μｇ／ｍｌのＳＡ－ＭＩＰ（Ｂ）とともにインキュベートしたＤＵ１４５細胞、２７μｇ／ｍｌのＧＡ－ＭＩＰ（Ｃ）または８０μｇ／ｍｌのＧＡ－ＭＩＰ（Ｄ）とともにインキュベートしたＤＵ１４５細胞の蛍光顕微鏡画像。透過モード画像から、細胞の数がＡ～Ｄで同様であることが確認された。スケール棒は２μｍを表わす。
ＤＡＰＩ（λｅｘｃ＝３５９ ｎｍ；λｅｍ＝４６１ ｎｍ）を用いて核染色した後、水（２％メタノール）中でＳＡ－ＭＩＰ（２０μｇ／ｍｌ）（Ａ）またはＦＩＴＣ－レクチン（１μｇ／ｍｌ）（Ｂ）とともにインキュベートしたＤＵ１４５細胞の蛍光顕微鏡画像。スケール棒＝１０μｍ。
ＦＩＴＣ－レクチン（１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートしたＤＵ１４５細胞（Ａ、Ｃ）とＰＣ３細胞（Ｂ、Ｄ）の蛍光顕微鏡画像。ＣとＤは、ＦＩＴＣ－レクチンなしで記録した対照である。スケール棒は１０μｍを表わす。
ＤＵ１４５細胞の細胞蛍光を添加したＳＡ－ＭＩＰプローブ（Ａ）またはＦＩＴＣ－レクチン（Ｂ）の関数としてフローサイトメトリーに基づいて定量し、陽性細胞の％として表現した図。
ＤＵ１４５細胞とＰＣ３細胞（Ａ、Ｃ）またはＪｕｒｋａｔ細胞（Ｂ、Ｄ）の細胞蛍光を添加したＳＡ－ＭＩＰプローブ（Ａ、Ｂ）またはＦＩＴＣ－レクチン（Ｃ、Ｄ）の関数としてフローサイトメトリーに基づいて定量し、陽性細胞の％として表現したグラフ。
ＳＡ－ＭＩＰ ２０μｇ／ｍｌ（Ａ）とともにインキュベートしたＤＵ１４５細胞、または５ Ｕ／ｍｌのシアリダーゼ（Ｂ）または１０ Ｕ／ｍｌのシアリダーゼ（Ｃ）であらかじめ処理した後にＳＡ－ＭＩＰ ２０μｇ／ｍｌとともにインキュベートしたＤＵ１４５細胞の蛍光顕微鏡画像。Ｄは、シアリダーゼとＳＡ－ＭＩＰの両方が存在しない対照である。スケール棒は１０μｍを表わす。
ＤＵ１４５細胞系（丸）、ＰＣ３細胞系（正方形）、Ｊｕｒｋａｔ細胞系（三角形）の細胞蛍光を、結合部位の濃度（Ｎ≒１０μモル／ｇ）として表わした添加したＳＡ－ＭＩＰプローブの関数としてフローサイトメトリーに基づいて定量した。非線形曲線フィッティングにより、結合定数（Ｋ）として、Ｊｕｒｋａｔに関しては３．６（±１．８）×１０６ Ｍ－１、ＤＵ１４５に関しては４．８（±０．４） ×１０６ Ｍ－１、ＰＣ３に関しては４．５（±０．６） ×１０６ Ｍ－１が得られた。
（Ａ）水中でそれぞれＮｅｕ５Ａｃ－ＭＩＰまたはＮｅｕ５Ｇｃ－ＭＩＰとともにインキュベーションした後のＮｅｕ５Ｇｃ とＮｅｕ５Ａｃの結合率（結合した％）。（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃ－ＭＩＰまたはＮｅｕ５Ｇｃ－ＭＩＰの懸濁液から（ウシまたはヒトの）トランスフェリンを欠乏させた後の上清分画のＰＡＧＥ。
ＳＡ－ＭＩＰを用いた生存細胞の染色。
ＳＡ－ＭＩＰを用いた生存細胞の染色。
Ｎｅｕ５Ａｃ ＭＩＰとＮｅｕ５Ｇｃ ＭＩＰを用いたヒト細胞系と動物細胞系の染色。
ＳＡＭＩＰとともに１時間（Ａ）、５時間（Ｂ）、２４時間（Ｃ、Ｄ）インキュベートした後に蛍光顕微鏡で分析した生存ＲＡＷマウスのマクロファージ細胞。
ＳＡＭＩＰとともに２４時間（Ｃ、Ｄ）インキュベートした後に蛍光顕微鏡で分析した生存ＲＡＷマウスのマクロファージ細胞。
悪性であることが知られているヒト乳がん細胞系をＳＡ－ＭＩＰを用いて染色した結果。ＭＢ－２３１はヒト乳がん細胞よりも攻撃的であるのに対し、ＣＣＤ１０９５Ｓｋはヒト乳がん細胞よりも良性である。
定義
「重合可能な基」は、モノマーの一部を形成していて、そのモノマー自身と、または他のモノマーと反応することができてポリマーを形成する一群の原子である。
ＭＩＰの「特異的結合」は、そのＭＩＰが、標的に対して、または少数の標的群に対して、または好ましいエピトープに対して大きな親和性を示し、顕著な交差反応性は示さないことを意味する。
「ナノ粒子」は、平均サイズ（粒子の直径）が１μｍ未満の無機または有機の粒子を意味する。
「抗原」（免疫生物学）は、抗体の産生を引き起こす物質である。
「アッセイ」は、分析物（薬学、分子生物学）の定性的検出と定量的検出のための標準化された反応手続きである。
「制御されたラジカル重合（ＣＲＰ）」は、決定反応が可逆的であるため広い範囲のモノマーで所定の分子量と狭い分子量分布を実現することが可能な重合法である。
「リガンド」は、生体分子と複合体を形成し、通常は生物学的な目的で利用される。
「分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）」。ポリマーマトリックス中に空洞を残す分子インプリント技術を利用して処理されて、選択された「鋳型」分子に対する親和性を有するポリマー。
「ナノゲル／マイクロゲル」。それぞれ、親水性ポリマーネットワークからなるナノ粒子または微粒子。
「分配係数」は、平衡した混和しない２つの相（例えば、ＭＩＰに結合した鋳型と、溶液中に遊離している鋳型）の混合物中の化合物の濃度比である。
「定常相」は、クロマトグラフィ法で所定の場所に固定される物質である。
ＭＩＰの文脈における「標的」は、ＭＩＰが結合するはずの分子である。これは、鋳型と同じである必要はない（エピトープ法）。
シアル酸（ＳＡ）またはシアリル（Ｓｉａ）は、シアル酸のヒトＮ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）と、動物Ｎ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）の両方を意味することができる。
発明の詳細な説明
本発明によれば、
１）糖鋳型を用意し；
２）その鋳型と協同的に相互作用することのできる少なくとも２つの機能性モノマーを用意し；
３）架橋モノマーを用意し；
４）前記糖鋳型の存在下で、前記モノマーを場合によっては溶媒の中に溶解させて重合させ；
５）前記鋳型を形成されたポリマーから除去すること
によって得られることを特徴とする分子インプリントポリマーが提供される。
一実施態様では、本発明は、鋳型が、エピトープとなる糖であり、その糖の少なくとも一部が細胞表面グリカンに対応している分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、鋳型は腫瘍特異的細胞表面グリカンであり、その例は、図２に示したグリカンである。
一実施態様では、鋳型はウイルス特異的グリカンであり、その例は、図２に示したグリカンである。
一実施態様では、鋳型は、Ｓｉａα２－６ＧａｌＮＡｃ（シアリルＴｎ）である。
一実施態様では、鋳型は、Ｓｉａα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ（シアリルＴ）である。
一実施態様では、鋳型は、Ｓｉａα ２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ（シアリルルイスＸ）である。
一実施態様では、鋳型は、Ｓｉａα２，３Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ（シアリルルイスＡ）である。
一実施態様では、鋳型は、Ｓｉａα２，３－Ｇａｌβである。
一実施態様では、鋳型は、Ｓｉａα２，６－Ｇａｌβである。
一実施態様では、鋳型は、Ｓｉａα２，３－ Ｎ－アセチルラクトサミンである。
一実施態様では、鋳型は、Ｓｉａα２，６－ Ｎ－アセチルラクトサミンである。
一実施態様では、鋳型は、Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、シアル酸（ＳＡ）のヒト形態）である。
一実施態様では、鋳型は、Ｎ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ、シアル酸の動物形態）である。
一実施態様では、鋳型は、ＧｌｃＡ２ＳＯ３β１，４－Ｇｌｃ２ＮＳＯ３またはＧｌｃＡ２ＳＯ３β１，４－Ｇｌｃ２ＮＳＯ３６ＳＯ３である。
一実施態様では、鋳型は、シアル酸であるか、１つ以上のシアル酸を含むグリカンである。
一実施態様では、鋳型は、単糖である。
一実施態様では、鋳型は、二糖である。
一実施態様では、鋳型は、三糖である。
一実施態様では、鋳型は、四糖である。
一実施態様では、本発明は、機能性モノマーの１つが、鋳型とイオン対を形成することのできるモノマーである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、機能性モノマーの１つが、図３Ａのタイプのいずれかであって鋳型とイオン対を形成することのできるモノマーである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、機能性モノマーの１つが２－アミノエチル－メタクリレートである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、機能性モノマーの１つが、鋳型と水素結合することのできる中性モノマーである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、機能性モノマーの１つが、図３Ｂのタイプのいずれかであって鋳型と水素結合することのできる中性モノマーである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、機能性モノマーの１つが、２－（３－（４－ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾ－７－イル）ウレイド）エチルメタクリレートである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、架橋モノマーが図３Ｂのタイプのいずれかである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、機能性モノマーの１つが、鋳型と共有結合性相互作用することのできるモノマーである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、機能性モノマーの１つが、図３Ｃに示したタイプのいずれかであって鋳型と共有結合性相互作用することのできるモノマーである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、機能性モノマーの１つが４－ビニルベンゼンボロン酸である分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、機能性モノマーが、図３に示した３つのタイプすべてを代表する少なくとも３つのモノマーである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、１つの機能性モノマーがアミンであり、１つの機能性モノマーが尿素であり、１つの機能性モノマーがボロン酸である分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、１つの機能性モノマーがアミンであり、１つの機能性モノマーが尿素であり、１つの機能性モノマーが、図３と図４に示した構造のいずれかに従うボロン酸である分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、１つの機能性モノマーが２－アミノエチル－メタクリレートヒドロクロリドであり、１つの機能性モノマーが２－（３－（４－ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾ－７－イル）ウレイド）エチルメタクリル酸であり、１つの機能性モノマーが４－ビニルベンゼンボロン酸である分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、１つの機能性モノマーが蛍光レポータモノマーである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、蛍光モノマーは、図２１に示したいずれかの構造である。
一実施態様では、本発明は、１つの機能性モノマーが、図３の１や図４の２のような蛍光レポータモノマーである分子インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、表面インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、表面開始重合によって製造される表面インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、沈殿重合、ミニエマルジョン重合、重合からのグラフティングと呼ばれる方法のいずれかによって調製される表面インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、可逆的付加断片化連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）の技術によって調製される表面インプリントポリマーに関する。
一実施態様では、本発明は、合成後にＲＡＦＴ基がアミノ分解またはラジカル反応によって変換される可逆的付加断片化連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）の技術によって調製される表面インプリントポリマーに関する。
本発明により、分子インプリントポリマーを調製する方法として、その分子インプリントポリマーが、
１）糖鋳型を用意し；
２）その鋳型と協同的に相互作用することのできる少なくとも２つの機能性モノマーを用意し；
３）架橋モノマーを用意し；
４）前記糖鋳型の存在下で、前記モノマーを場合によっては溶媒の中に溶解させて重合させ；
５）前記鋳型を形成されたポリマーから除去すること
によって得られることを特徴とする方法も提供される。
本発明により、グリカン結合ポリマーの利用として、
－ 細胞分離を含む分離のため
－ 細胞のグリコシル化状態を研究するため
－ 血液型分類と細胞接着のため
－ 組織化学的染色のため
－ 酵素のアッセイのため
－ 分子標的の同定と濃度のためのセンサーとして
－ グリカン決定基のアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）のため
－ フローサイトメトリーアッセイのため
－ 生体内またはインビトロでのバイオマーカーのイメージングのため、または造影剤として
－ 電気泳動における検出ツールとして
－ 治療剤（例えば薬）として
－ 標的化薬送達のため
－ 細胞表面相互作用を抑制するため
－ 触媒として
の利用も提供される。
一実施態様では、ＭＩＰは、細胞または組織のイメージング、セルソーティング、グライコミクス、細胞グリコシル化バイオマーカー分析や、医学における例えば標的化薬送達や細胞表面相互作用の選択的抑制の用途で使用される。したがって一実施態様では、インビトロでの細胞または組織のイメージング、インビトロでのセルソーティング、インビトロでのグライコミクスと細胞グリコシル化バイオマーカー分析や、医学における例えばインビトロでの細胞表面相互作用の選択的抑制での分子インプリントポリマーの利用が提供される。
一実施態様では、ＭＩＰは、がん患者の体内を循環している細胞（ＣＴＣ）の同定と分子特徴づけに使用される。本発明の一実施態様では、ＭＩＰはがんを治療するために提供される。一実施態様では、がん患者からの循環している細胞（ＣＴＣ）のインビトロでの同定と分子特徴づけのための、本明細書に開示した分子インプリントポリマーの利用が提供される。
一実施態様では、ＭＩＰは、エンドサイトーシスを通じて治療作用を及ぼすか、治療のためエンドサイトーシスを通じた細胞内標的化薬送達に用いられる。一実施態様では、エンドサイトーシスを通じて治療薬として使用するための、またはエンドサイトーシスを通じて薬を細胞内標的化送達するための、または細胞表面相互作用を選択的に抑制するための分子インプリントポリマーが提供される。
材料
オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、４－シアノ－４－（チオベンゾイルチオ）ペンタン酸（ＣＰＤＢ）、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、クロロギ酸エチルをＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社（シュタインハイム、ドイツ国）から入手した。
メタノール（ＭｅＯＨ）はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社（ギール、ベルギー国）から来た。アセトニトリル（ＡＣＮ）はＭｅｒｃｋ社（ダルムシュタット、ドイツ国）から取得した。ＥＧＤＭＡは、活性化塩基性アルミナのカラムを通過させて阻害剤を除去し、重合するまで－２０℃で保管した。鋳型シアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸、ＳＡ）とＤ－グルクロン酸（ＧＡ）は、それぞれＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社とＦｌｕｋａ社から受け取った。モノマーである４－ビニルベンゼンボロン酸（１）と２－アミノエチル－メタクリレートヒドロクロリド（３）は、それぞれＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社とＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。２－（３－（４－ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾ－７－イル）ウレイド）エチルメタクリレート（２）は、われわれが以前に公開したプロトコルに従って合成した。ヒト前立腺がん細胞系であるＤＵ１４５およびＰＣ－３と、Ｔ細胞白血病細胞系であるＪｕｒｋａｔは、ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社（テディントン、ミドルセックス州）から取得した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ペイズリー、イギリス国）から来た。ＳＡ特異的ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｎｓレクチンと、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓからのノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）から購入した。核染色用の４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社（アメリカ合衆国）から購入した。ポリリシンスライドはＷＶＲ社（ラドノー、ペンシルヴェニア州、アメリカ合衆国）から取得した。
装置と方法
ＨＰＬＣ：ＵＶ－ＤＡＤ検出器と自動サンプラーを備えたＷａｔｅｒ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２７９５分離モジュールでＨＰＬＣ測定を実施した。
ＮＭＲ：Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｖａｒｉａｎ社）Ｍｅｒｃｕｒｙ ４００ＭＨｚ装置でのＮＭＲ測定。
元素分析：ヨハネス・グーテンベルク大学（マインツ）の有機化学部でＨｅｒａｅｕｓ ＣＨＮ－高速分析装置（ハナウ、ドイツ国）を用いた元素分析によって炭素と窒素の含有量を求めた。
撹拌ユニット：重合の間の撹拌は、乾燥ブロックヒーターを備えたＫＳ１３０ベーシックＩＫＡ装置（ＩＫＡ社、シュタウフェン、ドイツ国）を用いて実行した。
ＦＴ－ＩＲ分光測定：これは、Ｂｒｕｋｅｒ社のＥｑｕｉｎｏｘ ５５分光器を用いて実施した。
ＴＥＭ：透過電子顕微鏡写真はＴｅｃｎａｉ透過電子顕微鏡を用いて記録した。
ＵＶ－ＶＩＳと蛍光の分光測定のための装置：Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ社からのＳｐｅｃｏｒｄ ２１０を用いてＵＶ－Ｖｉｓを測定した。蛍光スペクトルは、Ｈｏｒｉｂａ社からのＦｌｕｏｒｏＭａｘ ４分光計を用いて記録した。
蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーのための装置： Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＸ ７０顕微鏡を用いて試料を２０倍の倍率で眺めた。フローサイトメトリーをＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータ（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータ、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）で実施した。励起波長は４９５ ｎｍ、検出波長は５１９ ｎｍであった。
実施例１。ＲＡＦＴ修飾シリカコア粒子の合成
単分散ＳｉＯ２ナノ粒子（ＳｉＮＰ）の合成
Ｓｔｏｂｅｒ法をわずかに改変して利用して単分散ＳｉＯ２ナノ粒子（ＳｉＮＰ：直径２００ ｎｍ）を調製した。典型的な合成操作において、同体積の２つの溶液を急速に混合して全体積を約２５０ ｍｌにした。一方の溶液はエタノール（１１４ ｍｌ）とＴＥＯＳ（１１．４ ｍｌ）を含んでいたのに対し、他方は、エタノール（５０ ｍｌ）、水（７６．５ ｍｌ）、水酸化アンモニウム（水中に２５重量％、７．６ ｍｌ）を含んでいた。この反応混合物は、約１０分後にＳｉＯ２粒子が形成されると一般に白濁する。反応を完了させるため、軽く撹拌しながら室温で６時間反応を続けさせた（収量３．５ ｇ）。その後、粒子を遠心分離（５０００ ｒｐｍ、１０分間）によって回収し、純エタノールの中への再分散を繰り返すことによって少なくとも３回洗浄した。
アミノ修飾シリカナノ粒子（ＳｉＮＰ－ＮＨ２）の合成
トルエン中のシリカナノ粒子（ＳｉＮＰ）の懸濁液（７．００ ｇ、１００ ｍｌ）を、窒素下で撹拌しながら１５分間かけて三首丸底フラスコに添加した。次に、シリカ表面上のシラノール基の理論的な数（８μモル／ｍ２）に基づき、過剰なＡＰＴＥＳ（１．２６ ｇ、５．７１ミリモル）を添加し、この混合物を窒素保護下で１３０℃にて一晩環流させた。次にこの混合物を室温まで冷却し、大量のヘキサン（５００ ｍｌ）に添加した。５０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって粒子を回収し、４０ ｍｌのアセトンの中に再分散させた後、３００ ｍｌのヘキサンの中で再び沈殿させた。あとでＲＡＦＴ剤とカップリングさせるため、このアミノ機能化粒子を７０ ｍｌのＴＨＦの中に直接分散させた。
ＲＡＦＴ修飾シリカナノ粒子（ＳｉＮＰ－ＲＡＦＴ）の合成
ＣＰＤＢ（０．３８５ ｇ、１．３８ミリモル）、クロロギ酸エチル（１３２μｌ、１．３８ミリモル）、ＴＥＡ（１９２μｌ、１．３８ミリモル）をＴＨＦ（５０ ｍｌ）に溶かした溶液を、上方に撹拌装置を備えた三首丸底フラスコ（２５０ ｍｌ）に添加した。この溶液を窒素でパージし、－７０℃のエタノール－液体窒素浴の中で４０分間冷却した。その後、７．００ ｇ（７０ ｍｌの貯蔵溶液）のアミノ修飾シリカ（ＳｉＮＰ－ＮＨ２、アミノ基が１．３８ミリモル）を－１０℃で添加し、一晩反応させた。その後、ヘキサン（５００ ｍｌ）を添加し、粒子を遠心分離（５０００ ｒｐｍ、１０分間）によって回収した。次いで粒子をアセトン（８０ ｍｌ）の中に再分散させ、３００ ｍｌのヘキサンの中で再び沈殿させ、５０００ ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られたナノ粒子（ＳｉＮＰ－ＲＡＦＴ）を室温にて真空下で乾燥させた（６．５ ｇ、収率９３％）。
実施例２。シアル酸（ＳＡ：Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃ）またはグルクロン酸（ＧＡ）を鋳型として用いたコアシェル分子インプリントポリマーの合成
Ｎｅｕ５Ａｃ （５．３ ｍｇ、１７．１μモル）またはＮｅｕ５Ｇｃ（５．５ ｍｇ、１７．１μモル）またはＧＡ（３．３ ｍｇ、１７．１μモル）と、１（２．５ ｍｇ、１７．１μモル）と、２５％ｗ／ｖの３を含む２３μｌの水（５．６ ｍｇ、３４．１μモル）と、２（５．７ ｍｇ、１７．１μモル）と、ＥＧＤＭＡ（１２８μｌ、６７８μモル）を、２０ ｍｌのスクリューキャップ付きシンチレーションバイアルの中に入れた１２ ｍｌのメタノールに溶かした溶液に、ＳｉＮＰ－ＲＡＦＴ（４００ ｍｇ）を懸濁させた。この重合前混合物に対して３０分間超音波処理をした後、窒素で２０分間パージした。その後、開始剤ＡＢＤＶ（２．３１ ｍｇ、９．３μモル）を添加し、懸濁液を再び窒素で５分間パージした。バイアルをシリコーン製絶縁テープで密封した後、５０℃にあらかじめ加熱したヒーターブロックの上にバイアルを保持し、４８０ ｒｐｍの撹拌速度で重合を開始した。反応を２３時間継続させた。次に、メタノール（８０．９％）、ギ酸（１４．３％）、水（４．８％）からなる５ ｍｌの溶液の中で粒子を４×１時間インキュベートした後、メタノール（１５ ｍｌ）とともに１×３０分間インキュベートし、５０００ ｒｐｍで遠心分離することによって粒子を中間分離した。最後に粒子を５０℃にて真空下で乾燥させると、約０．４ ｇのＳＡ－ＭＩＰとＧＡ－ＭＩＰがそれぞれ得られた。上清を回収し、逆相ＨＰＬＣによって鋳型の存在を分析した。そうすることで、最終洗浄液に鋳型が存在しないことが確認された。Ｎｅｕ５Ａｃインプリント粒子を透過電子顕微鏡と透過ＦＴＩＲによって特徴づけた。その結果を図５と図６に示す。
実施例３。Ｓｉａα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ（シアリルＴ）を鋳型として用いたコアシェル分子インプリントポリマーの合成
Ｓｉａα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ（シアリルＴ）（１５ ｍｇ、１７μモル）と、１（２．５ ｍｇ、１７μモル）と、２５％ｗ／ｖの３を含む２３μｌの水（５．６ ｍｇ、３４．１μモル）と、２（５．７ ｍｇ、１７．１μモル）と、ＥＧＤＭＡ（１２８μｌ、６７８μモル）を、２０ ｍｌのスクリューキャップ付きシンチレーションバイアルの中に入れた１２ ｍｌのメタノールに溶かした溶液に、ＳｉＮＰ－ＲＡＦＴ（４００ ｍｇ）を懸濁させた。この重合前混合物に対して３０分間超音波処理をした後、窒素で２０分間パージした。その後、開始剤ＡＢＤＶ（２．３１ ｍｇ、９．３μモル）を添加し、懸濁液を再び窒素で５分間パージした。バイアルをシリコーン製絶縁テープで密封した後、バイアルを５０℃にあらかじめ加熱したヒーターブロックの上に保持し、４８０ ｒｐｍの撹拌速度で重合を開始した。反応を２３時間継続させた。次に、メタノール（８０．９％）、ギ酸（１４．３％）、水（４．８％）からなる５ ｍｌの溶液の中で粒子を４×１時間インキュベートした後、メタノール（１５ ｍｌ）とともに１×３０分間インキュベートし、５０００ ｒｐｍで遠心分離することによって粒子を中間分離した。最後に粒子を５０℃にて真空下で乾燥させると、約０．４ ｇのＭＩＰが得られた。上清を回収し、逆相ＨＰＬＣによって鋳型の存在を分析した。そうすることで、最終洗浄液に鋳型が存在しないことが確認された。
実施例４。Ｓｉａα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ（シアリルルイスＸ）を鋳型として用いたコアシェル分子インプリントポリマーの合成
Ｓｉａα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ（シアリルルイスＸ）（２０ ｍｇ、１７μモル）と、１（２．５ ｍｇ、１７μモル）と、２５％ｗ／ｖの３を含む２３μｌの水（５．６ ｍｇ、３４．１μモル）と、２（５．７ ｍｇ、１７．１μモル）と、ＥＧＤＭＡ（１２８μｌ、６７８μモル）を、２０ ｍｌのスクリューキャップ付きシンチレーションバイアルの中に入れた１２ ｍｌのメタノールに溶かした溶液に、ＳｉＮＰ－ＲＡＦＴ（４００ ｍｇ）を懸濁させた。この重合前混合物に対して３０分間超音波処理をした後、窒素で２０分間パージした。その後、開始剤ＡＢＤＶ（２．３１ ｍｇ、９．３μモル）を添加し、懸濁液を再び窒素で５分間パージした。バイアルをシリコーン製絶縁テープで密封した後、バイアルを５０℃にあらかじめ加熱したヒーターブロックの上に保持し、４８０ ｒｐｍの撹拌速度で重合を開始した。反応を２３時間継続させた。次に、メタノール（８０．９％）、ギ酸（１４．３％）、水（４．８％）からなる５ ｍｌの溶液の中で粒子を４×１時間インキュベートした後、メタノール（１５ ｍｌ）とともに１×３０分間インキュベートし、５０００ ｒｐｍで遠心分離することによって粒子を中間分離した。最後に粒子を５０℃にて真空下で乾燥させると、約０．４ ｇのＭＩＰが得られた。上清を回収し、逆相ＨＰＬＣによって鋳型の存在を分析した。そうすることで、最終洗浄液に鋳型が存在しないことが確認された。
実施例５。Ｓｉａ２，３Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ（シアリルルイスＡ）を鋳型として用いたコアシェル分子インプリントポリマーの合成
Ｓｉａ２，３Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ（シアリルルイスＡ） （２０ ｍｇ、１７μモル）と、１（２．５ ｍｇ、１７μモル）と、２５％ｗ／ｖの３を含む２３μｌの水（５．６ ｍｇ、３４．１μモル）と、２（５．７ ｍｇ、１７．１μモル）と、ＥＧＤＭＡ（１２８μｌ、６７８μモル）を、２０ ｍｌのスクリューキャップ付きシンチレーションバイアルの中に入れた１２ ｍｌのメタノールに溶かした溶液に、ＳｉＮＰ－ＲＡＦＴ（４００ ｍｇ）を懸濁させた。この重合前混合物に対して３０分間超音波処理をした後、窒素で２０分間パージした。その後、開始剤ＡＢＤＶ（２．３１ ｍｇ、９．３μモル）を添加し、懸濁液を再び窒素で５分間パージした。バイアルをシリコーン製絶縁テープで密封した後、バイアルを５０℃にあらかじめ加熱したヒーターブロックの上に保持し、４８０ ｒｐｍの撹拌速度で重合を開始した。反応を２３時間継続させた。次に、メタノール（８０．９％）、ギ酸（１４．３％）、水（４．８％）からなる５ ｍｌの溶液の中で粒子を４×１時間インキュベートした後、メタノール（１５ ｍｌ）とともに１×３０分間インキュベートし、５０００ ｒｐｍで遠心分離することによって粒子を中間分離した。最後に粒子を５０℃にて真空下で乾燥させると、約０．４ ｇのＭＩＰが得られた。上清を回収し、逆相ＨＰＬＣによって鋳型の存在を分析した。そうすることで、最終洗浄液に鋳型が存在しないことが確認された。
実施例６。Ｓｉａα２－６ＧａｌＮＡｃ（シアリルＴｎ）を鋳型として用いたコアシェル分子インプリントポリマーの合成
Ｓｉａα２－６ＧａｌＮＡｃ（１０ ｍｇ、１７μモル）と、１（２．５ ｍｇ、１７μモル）と、２５％ｗ／ｖの３を含む２３μｌの水（５．６ ｍｇ、３４．１μモル）と、２（５．７ ｍｇ、１７．１μモル）と、ＥＧＤＭＡ（１２８μｌ、６７８μモル）を、２０ ｍｌのスクリューキャップ付きシンチレーションバイアルの中に入れた１２ ｍｌのメタノールに溶かした溶液に、ＳｉＮＰ－ＲＡＦＴ（４００ ｍｇ）を懸濁させた。この重合前混合物に対して３０分間超音波処理をした後、窒素で２０分間パージした。その後、開始剤ＡＢＤＶ（２．３１ ｍｇ、９．３μモル）を添加し、懸濁液を再び窒素で５分間パージした。バイアルをシリコーン製絶縁テープで密封した後、バイアルを５０℃にあらかじめ加熱したヒーターブロックの上に保持し、４８０ ｒｐｍの撹拌速度で重合を開始した。反応を２３時間継続させた。次に、メタノール（８０．９％）、ギ酸（１４．３％）、水（４．８％）からなる５ ｍｌの溶液の中で粒子を４×１時間インキュベートした後、メタノール（１５ ｍｌ）とともに１×３０分間インキュベートし、５０００ ｒｐｍで遠心分離することによって粒子を中間分離した。最後に粒子を５０℃にて真空下で乾燥させると、約０．４ ｇのＭＩＰが得られた。上清を回収し、逆相ＨＰＬＣによって鋳型の存在を分析した。そうすることで、最終洗浄液に鋳型が存在しないことが確認された。
実施例７。Ｓｉａα２，３－ＧａｌβまたはＳｉａα２，６－Ｇａｌβを鋳型として用いたコアシェル分子インプリントポリマーの合成
Ｓｉａα２，３－ＧａｌβまたはＳｉａα２，６－Ｇａｌβ（１０ ｍｇ、１７μモル）と、１（２．５ ｍｇ、１７μモル）と、２５％ｗ／ｖの３を含む２３μｌの水（５．６ ｍｇ、３４．１μモル）と、２（５．７ ｍｇ、１７．１μモル）と、ＥＧＤＭＡ（１２８μｌ、６７８μモル）を、２０ ｍｌのスクリューキャップ付きシンチレーションバイアルの中に入れた１２ ｍｌのメタノールに溶かした溶液に、ＳｉＮＰ－ＲＡＦＴ（４００ ｍｇ）を懸濁させた。この重合前混合物に対して３０分間超音波処理をした後、窒素で２０分間パージした。その後、開始剤ＡＢＤＶ（２．３１ ｍｇ、９．３μモル）を添加し、懸濁液を再び窒素で５分間パージした。バイアルをシリコーン製絶縁テープで密封した後、バイアルを５０℃にあらかじめ加熱したヒーターブロックの上に保持し、４８０ ｒｐｍの撹拌速度で重合を開始した。反応を２３時間継続させた。次に、メタノール（８０．９％）、ギ酸（１４．３％）、水（４．８％）からなる５ ｍｌの溶液の中で粒子を４×１時間インキュベートした後、メタノール（１５ ｍｌ）とともに１×３０分間インキュベートし、５０００ ｒｐｍで遠心分離することによって粒子を中間分離した。最後に粒子を５０℃にて真空下で乾燥させると、約０．４ ｇのＭＩＰが得られた。上清を回収し、逆相ＨＰＬＣによって鋳型の存在を分析した。そうすることで、最終洗浄液に鋳型が存在しないことが確認された。
実施例８。Ｓｉａα２，３－Ｎ－アセチルラクトサミンまたはＳｉａα２，６－Ｎ－アセチルラクトサミンを鋳型として用いたコアシェル分子インプリントポリマーの合成
Ｓｉａα２，３－Ｎ－アセチルラクトサミンまたはＳｉａα２，６－Ｎ－アセチルラクトサミン（１５ ｍｇ）と、１（２．５ ｍｇ、１７μモル）と、２５％ｗ／ｖの３を含む２３μｌの水（５．６ ｍｇ、３４．１μモル）と、２（５．７ ｍｇ、１７．１μモル）と、ＥＧＤＭＡ（１２８μｌ、６７８μモル）を、２０ ｍｌのスクリューキャップ付きシンチレーションバイアルの中に入れた１２ ｍｌのメタノールに溶かした溶液に、ＳｉＮＰ－ＲＡＦＴ（４００ ｍｇ）を懸濁させた。この重合前混合物に対して３０分間超音波処理をした後、窒素で２０分間パージした。その後、開始剤ＡＢＤＶ（２．３１ ｍｇ、９．３μモル）を添加し、懸濁液を再び窒素で５分間パージした。バイアルをシリコーン製絶縁テープで密封した後、バイアルを５０℃にあらかじめ加熱したヒーターブロックの上に保持し、４８０ ｒｐｍの撹拌速度で重合を開始した。反応を２３時間継続させた。次に、メタノール（８０．９％）、ギ酸（１４．３％）、水（４．８％）からなる５ ｍｌの溶液の中で粒子を４×１時間インキュベートした後、メタノール（１５ ｍｌ）とともに１×３０分間インキュベートし、５０００ ｒｐｍで遠心分離することによって粒子を中間分離した。最後に粒子を５０℃にて真空下で乾燥させると、約０．４ ｇのＭＩＰが得られた。上清を回収し、逆相ＨＰＬＣによって鋳型の存在を分析した。そうすることで、最終洗浄液に鋳型が存在しないことが確認された。
実施例９。図３Ｄに示した任意の蛍光尿素系モノマーを用いた分子インプリントポリマーの合成
実施例１０。バッチ結合試験と等温吸着式
結合試験を実施して糖鋳型に対する粒子の親和性を調べた。メタノールと、さまざまな濃度（１～２０μＭ）の鋳型を含む水（水が２％、５０％、９８％）との混合物１ ｍｌを１．５ ｍｌのマイクロフュージ管に入れ、その中に鋳型なしの乾燥した粒子（２０ ｍｇ）を懸濁させた。軽く振盪しながら室温で２時間インキュベーションした後、溶液を１００００ ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清をＨＰＬＣ用バイアルに移し、逆相ＨＰＬＣ分析によって遊離した溶質の濃度（Ｆ）を測定した。そのとき、移動相として２０ ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４を用い、Ｃ－１８逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｃａ Ｃ－１８、２５０×４．６ ｍｍ）を使用し、流速を０．７ ｍｌ／分、注入体積２０μｌにした。検出は、２１５ ｎｍでのＵＶ吸光度測定によって実施した。ポリマー粒子が結合した溶質の具体的な量（Ｂ）は、以下の式：
（１） Ｂ＝（Ｃ０-Ｆ）ｖ／ｍ
によって求めた。ただしＣ０は溶質の初期濃度であり、Ｆは上清に含まれる溶質の最終濃度であり、ｖ（ｍｌ）は吸着混合物の全体積であり、ｍは各バイアル中のポリマーの質量である。結合曲線は、Ｐｒｉｓｍ ６曲線フィッティングソフトウエア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｃ．社）を用いてラングミュア単一部位モデルへの非線形回帰によってフィットさせた。結合曲線に関しては図７を、結合パラメータに関しては表１を参照されたい。
Figure 0007083643000001
実施例１１。細胞培養
ヒト前立腺がん細胞系であるＤＵ１４５とＰＣ－３を、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とともにフラスコの中で培養し、湿度１００％の中で５％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベートした。Ｔ細胞白血病細胞系であるＪｕｒｋａｔを、１０％ＦＢＳとガラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ １６４０の中で培養し、湿度１００％の中で５％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベートした。マウスマクロファージ細胞系であるＲＡＷ ２６４．７を、１０％ＦＢＳとペニシリン－ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０の中で培養し、ヒトマクロファージ細胞系であるＴＨＰ－１を、１０％ＦＢＳとガラマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ １６４０の中で培養し、湿度１００％の中で５％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベートした。マウス線維芽細胞系であるＬ９２９を、１０％ＦＢＳとグルタミンを含むＤＭＥＭの中で培養し、湿度１００％の中で５％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベートした。乳がん細胞系であるＣＣＤ１０９５－Ｓｋを、１０％ＦＢＳを含むイーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）の中で培養し、ＭＤＡ－ＭＢ２３１を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭの中で培養し、ＭＣＦ－７を、１０％ＦＢＳとペニシリン－ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩの中で培養し、湿度１００％の中で５％ＣＯ２とともに３７℃でインキュベートした。
接着細胞が集密状態に到達したとき、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、トリプシン／ＥＤＴで処理することにより、接着細胞を継代培養した。顕微鏡で調べるため、細胞を、丸いガラス製カバースリップ（直径１２ ｍｍ）を備えた１２ウエル細胞培養プレートの中で培養した。１０，０００個のＤＵ１４５細胞と２０，０００個のＰＣ－３細胞をそれぞれ１００μｌの細胞懸濁液の中に調製し、各カバースリップの上にピペットで移した。３時間後、１ ｍｌの細胞培地を添加し、湿度１００％の中で５％ＣＯ２とともに３７℃で細胞を少なくとも４８時間放置して増殖させることにより、集密状態に到達させた。Ｊｕｒｋａｔ細胞を顕微鏡で調べるため、５０，０００個の細胞を含む１００μｌの細胞懸濁液を３７℃で２時間ポリリシンスライドに接着させた。その後、細胞を１００μｌのＰＢＳで注意深く２回洗浄した。
実施例１２。蛍光顕微鏡検査のための細胞固定、シアリダーゼ処理、ＭＩＰ染色
集密細胞を含むカバースリップを２ ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、１ ｍｌの４％ホルムアルデヒドの中で室温（ＲＴ）にて１０分間インキュベートすることによって細胞固定を実施した。次にホルムアルデヒドを各ウエルから吸引することによって固定を中断した後、２ ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。
ＳＡ－ＭＩＰ染色とＧＡ－ＭＩＰ染色のため、ＶＷＲ超音波洗浄機を用いた４分間＋４分間の超音波処理により、乾燥させたＭＩＰ粒子を水（３％メタノール）の中に懸濁させた。この貯蔵懸濁液をさらに希釈し、超音波処理した後に使用した。細胞を２ ｍｌの水（３％メタノール）で２回洗浄した後、希釈して超音波処理した５００μｌの粒子懸濁液（２０μｇ／ｍｌまたは８０μｇ／ｍｌ）を各ウエルに添加した。それに加え、粒子を含まない１つの陰性対照も用意した。細胞をＭＩＰとともに３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、ウエルを２ ｍｌの水（３％メタノール）で３回洗浄し、次いで蛍光顕微鏡検査のためのカバースリップを用意した。これは、封入剤であるＰｒｏｌｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄアンチフェード封入剤またはＰｒｏｌｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄアンチフェード試薬の１滴をＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社）とともに用いてカバースリップを顕微鏡スライドの表面にひっくり返して取り付けることによって実施した。実施例２～６のＭＩＰ粒子で染色した細胞の典型的な画像に関しては、図８と図９を参照されたい。
シアリダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓからのノイラミニダーゼ）で処理するため、ＤＵ１４５細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で洗浄し、５ Ｕ／ｍｌと１０ Ｕ／ｍｌの酵素２００μｌをそれぞれ細胞に３７℃で６０分間かけて添加した。１つの陰性対照を、２００μｌのＤＭＥＭだけと一緒にして放置した。その後、細胞をＤＭＥＭで３回洗浄した。その後、細胞を２ ｍｌの水（３％メタノール）で２回洗浄し、濃度２０μｇ／ｍｌのＳＡ－ＭＩＰで染色した。処理した細胞と処理していない細胞を比較した典型的な画像に関しては図１０を参照されたい。
実施例１３。蛍光顕微鏡検査のためのレクチン－ＦＩＴＣ染色
上記のようにしてカバースリップの表面で増殖させた集密なＤＵ１４５細胞またはＰＣ－３細胞を２ ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１ ｍｌの４％ホルムアルデヒドの中で室温にて１０分間固定した。固定を停止させるため、ホルムアルデヒドを各ウエルから吸引し、２ ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。細胞を０．５～１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ＳＡ特異的レクチン５００μｌでＲＴにて６０分間染色した後、ＰＢＳで３回洗浄した。蛍光顕微鏡イメージングのため、１回ごとに、１滴の装着培地Ｐｒｏｌｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄアンチフェード装着剤またはＰｒｏｌｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄアンチフェード試薬をＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社）とともに用いてガラス製カバースリップを顕微鏡スライドに装着した。典型的な画像に関しては図９と図１１を参照されたい。
実施例１４。ＭＩＰとレクチン－ＦＩＴＣのフローサイトメトリー分析
５×１０５個のＤｕ１４５細胞、ＰＣ－３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｃ－１細胞のそれぞれを２ ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１ ｍｌの４％ホルムアルデヒドの中で室温にて２０分間固定した。吸引と、ＰＢＳを用いた３回の洗浄の後、細胞を２ ｍｌのインキュベーション用溶媒（水（３％メタノール）、二重蒸留水、ＰＢＳ緩衝液のいずれか）で２回洗浄し、その後に、指示された濃度（５～８０μｇ／ｍｌ）の超音波処理したＳＡ－ＭＩＰ懸濁液５００μｌで染色した後、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を２ ｍｌのインキュベーション用溶媒で３回洗浄し、同じ溶媒３００μｌ の中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。
ＳＡ特異的レクチンをフローサイトメトリーで分析するため、５×１０５個のＤｕ１４５細胞、ＰＣ－３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞のそれぞれを２ ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、さまざまな濃度（５～５０ ｎｇ／ｍｌ）のレクチン－ＦＩＴＣ溶液で染色し、暗所で氷上にて２０分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３００μｌのＰＢＳの中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。添加したプローブに依存して変化する陽性細胞の％に関しては、図１２と図１３を参照されたい。ＤＵ１４５へのＭＩＰプローブの結合の結合定数に関しては、図１４を参照されたい。
実施例１５。Ｎｅｕ５ＡｃインプリントＭＩＰまたはＮｅｕ５ＧｃインプリントＭＩＰを用いた動物形態とヒト形態のトランスフェリンの認識
２．５μｇのヒトトランスフェリンタンパク質とウシトランスフェリンタンパク質を１００μｌの水に溶かし、４ ｍｇのＮｅｕ５Ａｃインプリント粒子またはＮｅｕ５Ｇｃインプリント粒子（それぞれＮｅｕ５Ａｃ－ＭＩＰ、Ｎｅｕ５Ｇｃ－ＭＩＰ）をこの溶液に懸濁させた。この懸濁液を室温で３時間撹拌した、遠心分離の後、上清を３０μｌ採取してポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実施した。結果を図１５に示す。
実施例１６。ＳＡ－ＭＩＰを用いた生存細胞の染色
生存細胞へのＳＡ－ＭＩＰの結合をフローサイトメトリーで分析するため、５×１０５個の細胞を２ ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに溶かしたさまざまな濃度（０．４～０．８ ｍｇ／ｍｌ）のＳＡ－ＭＩＰで染色し、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３００μｌのＰＢＳの中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した後、蛍光顕微鏡検査を実施した（図１６参照）。
実施例１７。Ｎｅｕ５Ａｃ ＭＩＰとＮｅｕ５Ｇｃ ＭＩＰを用いたヒト細胞系と動物細胞系の染色
ヒトＤＵ１４５細胞とマウスＬ９２９細胞を２ ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１ ｍｌの４％ホルムアルデヒドの中でＲＴにて２０分間固定した。吸引と、ＰＢＳを用いた３回の洗浄の後、細胞を２ ｍｌの水（３％メタノール）で２回洗浄し、その後に、超音波処理した１００μｌのＮｅｕ５Ａｃ ＭＩＰとＮｅｕ５Ｇｃ ＭＩＰ（濃度が２０～８０μｇ／ｍｌ）でそれぞれ染色した後、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を２ ｍｌの水（３％メタノール）で３回洗浄し、３００μｌ のメタノール／水の中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。蛍光顕微鏡実験のため、細胞をＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社）で対比染色した後、分析した（図１７参照）。
実施例１８。エンドサイトーシス実験。
生きているＲＡＷ ２６４．７細胞へのＳＡ－ＭＩＰの結合をフローサイトメトリーで分析するため、１２ウエルプレート中の５００μｌの培地の中で１×１０６個の細胞をインキュベートした。一晩インキュベートした後、ＰＢＳに溶かしたさまざまな濃度（０．４～０．８ ｍｇ／ｍｌ）のＳＡ－ＭＩＰを添加し、細胞を３７℃で６０分間～２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、リソソームマーカーＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒで６０分間染色し、洗浄し、３００μｌのＰＢＳの中に再懸濁させ、蛍光顕微鏡検査によって分析して粒子の取り込みとリソソーム活性を調べた（図１８参照）。
実施例１９。悪性であることが知られているヒト乳がん細胞系のＳＡ－ＭＩＰを用いた染色
ヒト乳がん細胞系であるＣＣＤ１０９５－Ｓｋ（良性）、ＭＤＡ－ＭＢ２３１（悪性）、ＭＣＦ－７（悪性）を２ ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、１ ｍｌの４％ホルムアルデヒドの中でＲＴにて２０分間固定した。吸引と、ＰＢＳを用いた３回の洗浄の後、細胞を２ ｍｌの水（３％メタノール）で２回洗浄し、その後、超音波処理した１００μｌのＳＡ－ＭＩＰ（濃度２０～８０μｇ／ｍｌ）で染色し、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を２ ｍｌの水（３％メタノール）で３回洗浄し、３００μｌのメタノール／水の中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。蛍光顕微鏡実験のため、細胞をＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社）で対比染色した後、分析した（図１９参照）。
実施例２０。ＳＡ－ＭＩＰを用いたヒト脳腫瘍細胞系と皮膚がん（メラノーマ）細胞系の染色
９種類の異なるヒト脳腫瘍細胞系と２種類の異なるメラノーマ細胞系を２ ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１ ｍｌの４％ホルムアルデヒドの中でＲＴにて２０分間固定した。吸引と、ＰＢＳを用いた３回の洗浄の後、細胞を２ ｍｌの水（３％メタノール）で２回洗浄し、その後に、超音波処理した１００μｌのＳＡ－ＭＩＰ（濃度２０～８０μｇ／ｍｌ）でそれぞれ染色した後、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を２ ｍｌの水（３％メタノール）で３回洗浄し、３００μｌ のメタノール／水の中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。

Claims (27)

  1. ａ）糖鋳型を用意し；
    ｂ）その鋳型と協同的に相互作用することのできる少なくとも２つの機能性モノマーを用意し；
    ｃ）架橋モノマーを用意し；
    ｄ）前記糖鋳型の存在下で、前記モノマーを場合によっては溶媒の中に溶解させて重合させ；
    ｅ）前記鋳型を形成されたポリマーから除去すること
    によって得られることを特徴とし、前記糖鋳型が、下記
    Figure 0007083643000002
     に記載の腫瘍特異的細胞表面グリカン若しくはウイルス特異的グリカンである、又はＳｉａα２－６ＧａｌＮＡｃ（シアリルＴｎ）、Ｓｉａα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ（シアリルＴ）、Ｓｉａα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ（シアリルルイスＸ）、Ｓｉａ２，３Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ（シアリルルイスＡ） 、Ｓｉａα２，３－Ｇａｌβ、Ｓｉａα２，６－Ｇａｌβ、Ｓｉａα２，３－Ｎ－アセチルラクトサミン、Ｓｉａα２，６－Ｎ－アセチルラクトサミン、Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、ヒト形態のシアル酸（ＳＡ））、Ｎ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ、動物形態のシアル酸）、ＧｌｃＡ２ＳＯ３β１，４－Ｇｌｃ２ＮＳＯ３、及びＧｌｃＡ２ＳＯ３β１，４－Ｇｌｃ２ＮＳＯ３６ＳＯ３から選択される、分子インプリントポリマー。
  2. 前記機能性モノマーの１つが、前記鋳型とイオン対を形成することのできるモノマーである、請求項１に記載の分子インプリントポリマー。
  3. 請求項２に記載の分子インプリントポリマーであって、前記機能性モノマーの１つが、前記鋳型とイオン対を形成することのできる、アミノ基含有モノマー、カチオン性モノマー又は酸性モノマーであり、
    当該アミノ基含有モノマーは、２－ビニルピリジン（２－ＶＰＹ）、４－ビニルピリジン（４－ＶＰＹ）、ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）、２－アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭＡ）、２－アミノエチルメタクリルアミド（ＡＥＭＡＭ）、Ｎ－ビニルイミダゾール（ＶＩＭ）、Ｎ，Ｎ－（ジメチルアミノ）－２－エチル－メタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、アリルアミン（ＡＬＡＭ）、ｐ－ビニル－Ｎ，Ｎ’－ジエチル－ベンズアミジン（ＶＤＥＡＢ）、ｐ－ビニルベンジルアミン（ＶＢＡ）から選択され；
    当該カチオン性モノマーは、Ｎ－（トリメチル）－２－エチルメタクリレート－塩化アンモニウム（ＴＭＡＥＭＡ）、Ｎ－（トリメチル）－ｐ－ビニルベンジル－塩化アンモニウム（ＴＭＶＢＡ）、Ｎ－ビニル－Ｎ’－ベンジル－塩化イミダゾリウム（ＶＢＩ）、塩化Ｎ－ビニルピリジウム（Ｎ－ＶＰＹ）から選択され；そして
    酸性モノマーは、メタクリル酸（ＭＡＡ）、アクリル酸（ＡＡ）、トリフルオロメチルアクリル酸（ＴＦＭ）、イタコン酸（ＩＴＡ）、ｐ－ビニル安息香酸（ＰＶＢ）、２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＡ）から選択される；
    分子インプリントポリマー。
  4. 前記機能性モノマーの１つが、前記鋳型と水素結合することのできる機能性モノマーである、請求項１～３のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマー。
  5. 前記機能性モノマーが、以下：
    Figure 0007083643000003
     に示したいずれかの、前記鋳型と水素結合することのできる機能性モノマーである、請求項４に記載の分子インプリントポリマー。
  6. 前記機能性モノマーの１つが、Ｒ１－ＮＨＣＯＮＨ－Ｒ２の１，３二置換尿素モノマーである（ただし置換基Ｒ１とＲ２の少なくとも１つは重合可能な基である）、請求項４に記載の分子インプリントポリマー。
  7. 前記機能性モノマーの１つが、２－（３－（４－ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾ－７－イル）ウレイド）エチルメタクリレートまたは１－（４－スチリル）－３－（３，５－トリフルオロメチル－フェニル）－尿素（ＴＦＵ）であるか、以下：
    Figure 0007083643000004
     に示したいずれかのものである、請求項５に記載の分子インプリントポリマー。
  8. １つの機能性モノマーがアミンであり、１つの機能性モノマーが尿素であり、１つの機能性モノマーがボロン酸である、請求項１～７のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマー。
  9. 前記機能性モノマーが、以下：
    Figure 0007083643000005
    Figure 0007083643000006
    Figure 0007083643000007
    Figure 0007083643000008
    Figure 0007083643000009
     に示した構造のいずれかにより表される、請求項１～７のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマー。
  10. １つの機能性モノマーが、２－アミノエチル－メタクリレートヒドロクロリドであり、１つの機能性モノマーが、２－（３－（４－ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾ－７－イル）ウレイド）エチルメタクリレートであり、１つの機能性モノマーが、４－ビニルベンゼンボロン酸である、請求項１～７のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマー。
  11. １つの機能性モノマーが蛍光レポータモノマーである、請求項１に記載の分子インプリントポリマー。
  12. 表面開始重合によって製造される表面インプリントポリマーである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマー。
  13. 前記表面インプリントポリマーが、沈殿重合、ミニエマルジョン重合、重合からのグラフティングと呼ばれる方法のいずれかによって調製される、請求項１２に記載の分子インプリントポリマー。
  14. 前記表面インプリントポリマーが、可逆的付加断片化連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）の技術によって調製される、請求項１２に記載の分子インプリントポリマー。
  15. 前記表面インプリントポリマーが、そのインプリントポリマーの合成後にＲＡＦＴ基がアミノ分解またはラジカル反応によって変換される可逆的付加断片化連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）の技術によって調製される、請求項１２に記載の分子インプリントポリマー。
  16. インビトロでの、細胞分離を含む分離またはセルソーティングのための親和性試薬としての、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーの利用。
  17. がん患者から採取された循環している腫瘍細胞（ＣＴＣ）のインビトロでの同定と分子特徴づけのための親和性試薬としての、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーの利用。
  18. インビトロでの、細胞のグリコシル化状態を研究するため、またはグライコミクスと細胞グリコシル化バイオマーカー分析のための親和性試薬としての、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーの利用。
  19. インビトロでの、血液型分類と細胞接着のための親和性試薬としての、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーの利用。
  20. インビトロでの、組織化学的染色のための親和性試薬としての、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーの利用。
  21. インビトロでの、酵素のアッセイのための親和性試薬としての、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーの利用。
  22. インビトロでの、分子標的の同定と濃度のためのセンサーとしての、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーの利用。
  23. インビトロでの、グリカン決定基のアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）のための親和性試薬としての、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーの利用。
  24. インビトロでの、フローサイトメトリーアッセイのための親和性試薬としての、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーの利用。
  25. インビトロまたは生体内でのバイオマーカーのイメージングのため、または造影剤としての、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーを含有する診断用組成物。
  26. インビトロでの電気泳動における検出ツールとしての請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマー。
  27. 細胞表面相互作用の選択的抑制のための、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分子インプリントポリマーを含有する治療用組成物。
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