CN108136366A - 分子印迹聚合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于结合聚糖的分子印迹聚合物，其中分子印迹聚合物通过以下是可获得的：提供糖模板，例如聚糖；提供至少两种官能单体，所述官能单体能够协作地与模板相互作用；提供交联单体；在糖模板的存在下，使任选地溶解在溶剂中的单体聚合；以及从所形成的聚合物中除去模板。本发明还涉及用于分子印迹聚合物的产生的方法和分子印迹聚合物的用途。

Description

分子印迹聚合物
发明的技术领域
本发明描述了用于结合聚糖的新的分子印迹聚合物(molecularly imprintedpolymer)、其产生方法和聚糖结合聚合物的用途。
背景技术
细胞表面聚糖指的是被附接至质膜结合的蛋白或脂类的多种聚糖基序。这些构成了细胞的最外表面，并且参与细胞通讯以及如宿主-病原体识别、感染、细胞分化、增殖和迁移的过程。需要约700种蛋白来产生哺乳动物聚糖的完全多样性(full diversity)，所述哺乳动物聚糖仅由十种单糖来装配：岩藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸(iduronicacid)(IdoA)、甘露糖(Man)、唾液酸(SA)以及木糖(Xyl)。最广泛存在的癌症相关的糖基化变化是唾液酸化(sialylation)、岩藻糖基化、O-聚糖截短(O-glycan truncation)以及N-和O-连接的聚糖支化(图1)。
SA是糖脂和糖蛋白的聚糖链上的最外面的单糖单元，并且通常是其中病原体附接的识别位点。已经证明SA的存在与若干疾病状态例如心血管疾病和神经疾病以及癌症相关(B.Adamczyk,T.Tharmalingam和P.M.Rudd,Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects,2012,1820,1347-1353)。临床上，增加的唾液酸化通常与侵袭性和癌症患者的不良预后相关。不完全的合成过程导致截断的结构的生物合成，如在胃肠癌和乳腺癌中与STn(图1)表达一起看到的。STn(Neu5Acα2-6GalNAcα-O-R)和Tn(GalNAcα-O-R)作为诊断靶以及治疗靶已经吸引了广泛的注意，因为STn和Tn在80％的人类癌症中表达，并且在正常组织中不存在或仅微弱地表达。然而，一直难以产生抗Tn和抗STn的IgG抗体，并且抗STn的IgG抗体具有低亲和力并且在捕获策略(capture strategy)中表现不佳。可用于SA(SNA和MAA)的几种凝集素具有宽特异性和低亲和力，并且在捕获测定中表现不佳。
相反地，通常在癌症的后期中观察到的新合成(neo-synthesis)指的是参与碳水化合物决定簇的表达的某些基因的癌症相关的诱导，如在许多癌症中某些抗原例如唾液酸化Lewis a(SLea)(sialyl Lewis a)和唾液酸化Lewis X(SLex)的从头表达(de novoexpression)中看到的。聚唾液酸是与若干类型的癌症相关的增加的唾液酸化，并且经常在高级肿瘤(high-grade tumour)中表达。
存在两种主要的哺乳动物SA：Neu5Ac(N-乙酰基神经氨酸)和Neu5Gc(N-羟乙酰基神经氨酸)(见图1)，它们仅相差一个氧原子，并且通过在细胞溶质中的酶胞苷一磷酸N-乙酰基神经氨酸羟化酶(cytidine monophosphate N-acetylneuraminic acidhydroxylase)(CMAH)来添加。由于CMAH基因的失活突变，人类缺乏此酶活性。由于SA的此可选择的形式通常不存在，所以免疫耐受性未能形成。因此，当从膳食来源摄取之后发生Neu5Gc掺入到糖缀合物中时，产生此糖的“自身抗体”，并且这些已经被提议以增强与癌症引发相关的炎症途径。高度地需要用于辨别这些形式以及键特异性的动物和人类糖基化2-3相对于2-6连接的唾液酸的新颖的亲和力试剂。
因此，分析和确定这些糖基化基序是重要的诊断目的，但是由于凝集素和聚糖特异性抗体的有限的可用性，该任务已经被证明是有挑战性的(N.Fujitani,J.-i.Furukawa,K.Araki,T.Fujioka,Y.Takegawa,J.Piao,T.Nishioka,T.Tamura,T.Nikaido,M.Ito,Y.Nakamura和Y.Shinohara,Proceedings of the National Academy of Sciences,2013,110,2105-2110)。
然而，已经公布了测量总唾液酸含量或不同的唾液酸类型的许多灵敏的方法。这些方法是昂贵的、费力的且耗时的，并且通常需要复杂的仪器作为熟练的操作者用于其实施。因此，它们未良好地适合于常规应用。存在基于凝集素的测定法用于若干类型的唾液酸，但是测定法发展常常受其低的灵敏度和差的特异性所阻碍。唾液酸糖蛋白中的唾液酸或作为游离部分的唾液酸的检测包括使用高效液相色谱(HPLC)、气相色谱联合质谱(GC-MS)、核磁共振光谱(NMR)以及毛细管电泳(CE)。对样品制备、专用设备、靶蛋白的纯化以及用于监测唾液酸化模式的冗长且复杂的数据分析的重要要求使这些方法复杂化。
这保证了开发可选择的聚糖特异性受体，所述聚糖特异性受体可以被用于例如细胞或组织成像、细胞分选、靶向糖组学和细胞糖基化生物标志物分析或用于医学中的应用，例如用于靶向药物递送或选择性抑制细胞表面相互作用。许多低分子主体(low molecularhost)已经被系统地设计和缀合至例如用于成像应用的荧光报告基团(fluorescentreporter group)或量子点。唾液酸的最强有力的主体以两个或更多个正交结合基团(orthogonal binding group)、针对二醇官能团的硼酸以及针对羧酸酯/盐官能的带电荷阴离子受体或中性阴离子受体为特征。其他的强结合剂(binder)是多官能的，掺入两个或更多个硼酸基团。后者参与与二醇的pH依赖性的可逆酯化，产生五元或六元环状结构。
早已知道的是，单糖选择性受体可以通过分子印迹的技术来制备。Wulff等人报告了使用缀合至两个分子的乙烯基苯硼酸(1)的单糖模板制备的用于甘露糖、果糖和半乳糖的高度区别的基于硼酸酯的受体。其他研究者后来采用此程序用于合成唾液酸印迹的本体聚合物或传感器涂层。当在碱性缓冲剂/乙腈混合物(pH 8)中探测时，这些含硼酸的MIP具有强的模板亲和力的特征。一种更简单的一锅方案(one-pot protocol)随后被用于合成糖蛋白选择性MIP(X.Bi和Z.Liu,Analytical Chemistry,2013,86,959-966)。此处，在碱催化下，硼酸酯单体被原位缀合至含SA的糖蛋白，并且随后与交联单体共聚合以形成印迹聚合物。当在水中并且特别是在生理条件下被探测时，迄今为止报告的SA印迹的受体仅显示对于糖靶的弱结合(K<103M-1)。这与其中结合是足够强的(>105M-1)以允许基于细胞的成像或甚至细胞分选应用的最强有力的设计的主体(见上)形成对比。然而，后者受体对于设计成用于靶向更复杂的聚糖例如二糖和更高级的糖是复杂的。这通常需要大量的合成努力并且测试许多的类似物以便确定强结合剂。
除了细胞或组织成像应用之外，此类受体还可以被用于替代靶向糖组学中、聚糖传感器中的凝集素或抗体，用于富集特定的聚糖基序、用于细胞分选或用于医学，例如用于靶向药物递送或选择性抑制细胞表面相互作用。
一种应用涉及识别和分子表征癌症患者中的循环肿瘤细胞(CTC)。表征这些细胞对于理解转移过程和可能的治疗策略从而指导预后和治疗是重要的。本领域的进展一直是缓慢的，这部分地是由于低的，如“大海捞针(needle in a haystack)”般的CTC丰度。虽然CTC可以在具有转移性疾病的患者中被可靠地检测到，但对于检测具有低CTC数目的早期的、可治疗的癌症仍然存在挑战。当前检测CTC的主要技术是细胞计数测定法，其中在初始富集步骤之后，细胞保持完整以优化稀少细胞检测的可能性。主要的富集技术基于通常依赖于上皮蛋白标志物(EpCam)的免疫磁性分离(immunomagnetic separation)。然而，从癌细胞脱落的细胞表面聚糖或循环O-糖蛋白也代表用于诊断目的和预后目的的重要的血清生物标志物。选择性检测循环O-糖蛋白生物标志物的癌症相关的异常糖型可以增加癌症生物标志物测定的特异性。
将药物靶向递送至肿瘤代表癌症诊断和疗法的重大进展。因此，开发新颖的肿瘤特异性配体或药物纳米载体是高度合意的。这些纳米载体将负载药物并且靶向其中存在单独患病组织的身体的特定的部分，从而避免与健康组织相互作用。通过内吞递送媒介物(纳米载体)靶向递送至特定的细胞器提供更特异性的靶向，特别适合于大分子药物。将此类纳米载体选择性靶向至表达癌症相关的聚糖的细胞是重要的目的。
发明概述
本发明公开了以对于聚糖的中等亲和力(103M-1-105M-1)至高亲和力(>108M-1)为特征的聚糖特异性分子印迹聚合物(MIP)，其中已经使用选自以下的模板来制备所述MIP：包含一种或更多种单糖、二糖或更高级的糖的聚糖或含聚糖的分子或物质，包括糖蛋白、糖脂、寡糖或蛋白聚糖。
在一个实施方案中，模板对应于聚糖的最外面的末端部分，所述聚糖包含一个至五个糖，通常包含唾液酸作为末端糖。
在另一个实施方案中，聚糖包括一种或更多种糖酸、优选地唾液酸或葡萄糖醛酸。
在另一个实施方案中，聚糖包括一种或更多种硫酸酯基团或磷酸酯基团。
MIP的特征在于，其使用至少一种单体来制备，所述单体选自交联单体和/或官能单体，在模板和任选地溶剂的存在下，使单体聚合—将模板从产生的聚合物中除去，以给出分子印迹聚合物(MIP)。
在一个实施方案中，使用包含正交结合基团例如硼酸和/或阳离子基团和/或氢键键合基团的至少两种官能单体来制备MIP。
在第二实施方案中，MIP呈现客体响应性荧光(guest responsivefluorescence)，包括响应于与荧光的变化结合的荧光部分。
在第三实施方案中，MIP以具有核壳形态(core shell morphology)的颗粒的形式被制备，所述核壳形态包括印迹的壳(imprinted shell)和官能核或非官能核。
此外，受体是强健的且稳定的，具有长的保存期限(shelf life)，并且可以使用简单的程序以低成本来制备。因此，这些特征规避了上文提及的缺点。使用新颖的印迹方法来制备受体，产生对于聚糖靶的明显增强的结合亲和力。这允许设计聚糖特异性受体用于二糖和包含更高级的糖和支化结构的更复杂的靶，如在例如肿瘤特异性糖例如Lewis X四糖中发现的那些。
在第四实施方案中，MIP被用于细胞或组织成像、细胞分选、糖组学和细胞糖基化生物标志物分析或用于医学中的应用，例如用于靶向药物递送或选择性抑制细胞表面相互作用。
在第五实施方案中，MIP被用于识别和分子表征癌症患者中的循环肿瘤细胞(CTC)。
在第六实施方案中，MIP通过内吞发挥治疗作用，或在治疗上被用于通过内吞进行细胞内靶向递送药物。
附图简述
图1.通过糖印迹聚合物靶向的聚糖的实例。模板可以对应于聚糖的片段或全部聚糖结构。
图2.使用正交地结合至模板的不同的亚基的至少两个并且优选地三个官能单体使糖印迹的原理。图2公开通过糖印迹聚合物靶向的聚糖的实例。模板可以对应于聚糖的片段或全部聚糖结构。
图3.(A)碱性官能单体、阳离子官能单体、酸性官能单体或阴离子官能单体的实例。含胺单体具有通式NR1R2R3，所有基团R直接连接至N，其中R1、R2、R3中的至少一个是可聚合的基团。含胺单体的实例是2-乙烯基吡啶(2-VPY)、4-乙烯基吡啶(4-VPY)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAEMA)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯(AEMA)、2-氨基乙基甲基丙烯酰胺(2-aminoethyl methacrylamide)(AEMAM)、N-乙烯基咪唑(VIM)、甲基丙烯酸N-(二甲基)-2-乙酯(DMAEMA)、烯丙胺(ALAM)、对乙烯基-N,N'-二乙基-苯甲脒(VDEAB)或对乙烯基苄基胺(VBA)。阳离子单体具有通式NR1R2R3R4 +X-，所有基团R直接连接至N，其中R1、R2、R3、R4中的至少一个是可聚合的基团，并且X-是抗衡阴离子(counteranion)。阳离子单体的实例是甲基丙烯酸N-(三甲基)-2-乙酯-氯化铵(TMAEMA)、N-(三甲基)-对乙烯基苄基-氯化铵(TMVBA)、N-乙烯基-N'-苄基-咪唑鎓氯化物(N-vinyl-N’-benzyl-imidazolium chloride)(VBI)、N-乙烯基吡啶鎓氯化物(N-vinylpyridinium chloride)(N-VPY)。酸性单体的实例是甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、三氟甲基丙烯酸(TFM)、衣康酸(ITA)、对乙烯基苯甲酸(PVB)、2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)。
(B)与糖模板相互作用的中性单体和氢键键合单体的实例。中性单体的实例是：N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、苯乙烯(S)、甲基丙烯酸2-羟基乙酯(HEMA)、丙烯腈(AN)、氰基苯乙烯(CS)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酰胺(AAM)、甲基丙烯酰胺(MAAM)、N-叔丁基丙烯酰胺(TBAM)。基于脲的官能单体的实例为R1-NHCONH-R2类型的1,3二取代的脲单体，其中取代基R1和取代基R2中的至少一个是可聚合的基团。基于脲的单体的实例是：1-(4-苯乙烯基)-3-(3,5-三氟甲基-苯基)-脲(TFU)。
(C)交联剂的实例：乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、二乙烯基苯(DVB)、三甲基丙烯酸三甲基丙酯(trimethylpropanetrimethacrylate)(TRIM)、季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)、乙基-二丙烯酰胺(EBA)、哌嗪-二丙烯酰胺(PBA)、亚甲基双丙烯酰胺(MBA)。
(D)如指示的具有取代基R的荧光的基于脲的官能单体的实例。
(E)共价结合糖模板的单体的实例，其中R是可聚合的基团。实例是R-B(OH)2类型或R-B(OH)OR2类型(其中R2是烷基取代基或芳基取代基)的硼酸、肼类R-NH-NH2、胺类例如苄基胺类R-Bzl-NH2或多胺类、磺酰肼类R-PhSO2NHNH2。
(F)用于在糖印迹中使用的硼酸单体的实例。
图4.用于基于协作印迹(cooperative imprinting)制备聚糖印迹聚合物的典型的程序。这包括通过混合的共价方法和非共价方法，使在二氧化硅核颗粒上的SA印迹的壳进行RAFT介导的接枝，所述混合的共价方法和非共价方法包括可逆硼酸酯酯化(1)、氢键稳定和客体响应性荧光报告基团(2)以及胺催化和静电稳定(3)。
图5.SA(A,B)印迹的核壳纳米颗粒或GA(C,D)印迹的核壳纳米颗粒的TEM图像。比例尺＝0.5μm(A,C)或50nm(B,D)。
图6.SA-MIP(上方红色迹线)、GA-MIP(中间蓝色迹线)和RAFT改性的核颗粒(下方黑色迹线)的透射FTIR光谱(KBr)。
图7.在包含A)2％水，B)50％水，C)98％水的甲醇和水的混合物中，被添加至SA-MIP的SA(实心圆)或GA(空心三角形)以及被添加至GA-MIP的SA(空心圆)和GA(实心三角形)的结合曲线。将对应于结合至SA-MIP的SA和GA的结合曲线拟合至Langmuir单位点模型(Langmuir mono-site model)，产生在各自的图旁列出的结合参数。对应于GA-MIP的数据通过Langmuir等式被不佳地拟合，并且没有进一步评估。
图8.用SA-MIP 27μg/ml(A)或80μg/ml(B)以及用GA-MIP 27μg/ml(C)或80μg/ml(D)温育的DU145细胞的荧光显微图像。透射模式图像证实在A-D中细胞数是类似的。比例尺代表2μm。
图9.在使用DAPI核染色之后，在水(2％甲醇)中用SA-MIP(20μg/mL)(A)和用FITC-凝集素(1μg/mL)(B)温育的DU145细胞的荧光显微图像(λ激发＝359nm；λ发射＝461nm)。比例尺＝10μm。
图10.用FITC-凝集素(1μg/mL)温育的DU145细胞(A,C)和PC3细胞(B,D)的荧光显微图像。C和D是在不存在FITC-凝集素下记录的对照。比例尺代表10μm。
图11.以阳性细胞百分数表示的作为添加的SA-MIP探针(A)或FITC-凝集素(B)的函数的DU145细胞的细胞荧光的基于流式细胞术的定量。
图12.以阳性细胞百分数表示的作为添加的SA-MIP探针(A,B)或FITC-凝集素(C,D)的函数的DU145细胞以及PC3细胞(A,C)和Jurkat细胞(B,D)的细胞荧光的基于流式细胞术的定量。
图13.用SA-MIP 20μg/ml(A)温育或用唾液酸酶5U/ml(B)或10U/ml(C)预处理，并且其后用SA-MIP 20μg/ml温育的DU145细胞的荧光显微图像。D是不存在唾液酸酶和SA-MIP两者下的对照。比例尺代表10μm。
图14.以结合位点浓度(N≈10μmol/g)表示的作为添加的SA-MIP探针的函数的DU145细胞系(圆形)、PC3细胞系(正方形)和Jurkat细胞系(三角形)的细胞荧光的基于流式细胞术的定量。非线性曲线拟合产生结合常数(K)，对于Jurkat：3.6(±1.8)×106M-1；对于DU145：4.8(±0.4)×106M-1；对于PC3：4.5(±0.6)×106M-1。
图15.(A)在水中分别用Neu5Ac-MIP或Neu5Gc-MIP温育之后，Neu5Gc和Neu5Ac的结合分数(％结合)。(B)在消耗来自Neu5Ac-MIP或Neu5Gc-MIP的悬浮液中的转铁蛋白(牛形式或人类形式)之后的上清液级分的PAGE。
图16.使用SA-MIP的活细胞的染色。
图17.使用Neu5Ac MIP和Neu5Gc MIP的人类细胞系和动物细胞系的染色。
图18.用SAMIP温育1h(A)、5h(B)、24h(C，D)，并且其后用荧光显微法分析的有生活力的RAW小鼠巨噬细胞。
图19.使用SA-MIP的已知恶性肿瘤的人类乳腺癌细胞系的染色。MB-231是更具侵略性的人类乳腺癌细胞，而CCD1095Sk是更良性的。
定义
“可聚合的基团”是形成能够与其自身或与其它单体反应以形成聚合物的单体的部分的原子的组。
MIP的“特异性结合”意指MIP呈现对于靶或靶的小基团或优选的表位的可评估的亲和力，并且优选地不呈现明显的交叉反应性。
“纳米颗粒”指的是具有小于1μm(粒径)的平均尺寸的无机颗粒或有机颗粒。
“抗原”(免疫生物学)是引起抗体的产生的物质。
“测定”是用于定性检测和定量检测分析物的标准化反应程序(制药学，分子生物学)。
“受控制的自由基聚合(CRP)”是其中决定反应(determination reaction)是可逆的，从而允许在宽范围的单体内实现预先确定的分子量和窄的分子量分布的聚合方法。
“配体”与生物分子形成络合物，通常用于生物学目的。
“分子印迹聚合物(MIP)”为使用分子印迹技术加工的聚合物，所述分子印迹技术在对于所选择的“模板”分子具有亲和力的聚合物基质中留下空腔。
“纳米凝胶/微凝胶”为分别包含亲水性聚合物网络的纳米颗粒或微颗粒。
“分配系数”是在处于平衡的两种不混溶相的混合物中的化合物(例如结合至MIP的模板和在溶液中的游离的模板)的浓度比。
“固定相”是在色谱程序中被固定在合适位置的物质。
在MIP的上下文中的“靶”是应当被MIP结合的分子。这不必与模板相同(表位方法)。
唾液酸(SA)或唾液酸化(sialyl)(Sia)可以指唾液酸的人类形式N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac)和动物形式N-羟乙酰基神经氨酸(Neu5Gc)两者。
发明详述
根据本发明，提供了分子印迹聚合物，其特征在于所述分子印迹聚合物通过以下是可获得的：
1)提供糖模板；
2)提供至少两种官能单体，所述官能单体能够协作地与模板相互作用；
3)提供交联单体；
4)在糖模板的存在下，使任选地溶解在溶剂中的单体聚合；
5)从所形成的聚合物中除去模板。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中模板是糖，所述糖是至少部分地对应于细胞表面聚糖的表位。
在一个实施方案中，模板是由图2中描绘的聚糖例示的肿瘤特异性细胞表面聚糖。
在一个实施方案中，模板是由图2中描绘的聚糖例示的病毒特异性聚糖。
在一个实施方案中，模板是Siaα2-6GalNAc(唾液酸化Tn)。
在一个实施方案中，模板是Siaα2-3Galβ1-3GalNAc(唾液酸化T)。
在一个实施方案中，模板是Siaα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc(唾液酸化LewisX)。
在一个实施方案中，模板是Siaα2,3Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc(唾液酸化Lewis A)
在一个实施方案中，模板是Siaα2,3-Galβ。
在一个实施方案中，模板是Siaα2,6-Galβ。
在一个实施方案中，模板是Siaα2,3-N-乙酰基乳糖胺。
在一个实施方案中，模板是Siaα2,6-N-乙酰基乳糖胺。
在一个实施方案中，模板是N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac，唾液酸(SA)的人类形式)。
在一个实施方案中，模板是N-羟乙酰基神经氨酸(Neu5Gc，唾液酸(SA)的动物形式)。
在一个实施方案中，模板是GlcA2SO3β1,4-Glc2NSO3或GlcA2SO3β1,4-Glc2NSO36SO3。
在一个实施方案中，模板是唾液酸或包含一种或更多种唾液酸的聚糖
在一个实施方案中，模板是单糖。
在一个实施方案中，模板是二糖。
在一个实施方案中，模板是三糖。
在一个实施方案中，模板是四糖。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中官能单体中的一种是能够与模板形成离子对的单体。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中官能单体中的一种是图3A中的能够与模板形成离子对的任何类型的单体。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中官能单体中的一种是甲基丙烯酸-2-氨基乙酯。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中官能单体中的一种是能够与模板氢键键合的中性单体。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中官能单体中的一种是图3B中的能够与模板氢键键合的任何类型的中性单体。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中官能单体中的一种是甲基丙烯酸2-(3-(4-硝基苯并[c][1,2,5]噁二唑-7-基)脲基)乙酯。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中交联单体是图3B中的任何类型。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中官能单体中的一种是能够与模板共价地相互作用的单体。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中官能单体中的一种是图3C中示出的能够与模板共价地相互作用的任何类型的单体。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中官能单体中的一种是4-乙烯基苯硼酸。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中官能单体是代表图3中描绘的单体的所有三种类型的至少三种。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中一种官能单体是胺，一种官能单体是脲并且一种官能单体是硼酸。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中根据图3和图4中描绘的任何结构，一种官能单体是胺，一种官能单体是脲并且一种官能单体是硼酸。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中一种官能单体是甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐，一种官能单体是甲基丙烯酸2-(3-(4-硝基苯并[c][1,2,5]噁二唑-7-基)脲基)乙酯并且一种官能单体是4-乙烯基苯硼酸。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中一种官能单体是荧光报告单体。
在一个实施方案中，荧光单体是图21中示出的任何结构。
在一个实施方案中，本发明涉及分子印迹聚合物，其中一种官能单体是荧光报告单体，例如图3中的1和图4中的2。
在一个实施方案中，本发明涉及表面印迹聚合物。
在一个实施方案中，本发明涉及通过表面引发的聚合产生的表面印迹聚合物。
在一个实施方案中，本发明涉及表面印迹聚合物，所述表面印迹聚合物通过被称为沉淀聚合、细乳液聚合或从聚合接枝(grafting from polymerization)的程序中的任一种来制备。
在一个实施方案中，本发明涉及表面印迹聚合物，所述表面印迹聚合物通过可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)的技术来制备。
在一个实施方案中，本发明涉及表面印迹聚合物，所述表面印迹聚合物通过可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)的技术来制备，其中在合成印迹聚合物之后，RAFT基团通过氨解反应或自由基反应被转化。
本发明还提供用于制备分子印迹聚合物的方法，其特征在于所述分子印迹聚合物通过以下是可获得的：
1)提供糖模板；
2)提供至少两种官能单体，所述官能单体能够协作地与模板相互作用；
3)提供交联单体；
4)在糖模板的存在下，使任选地溶解在溶剂中的单体聚合；
5)从所形成的聚合物中除去模板。
本发明还提供聚糖结合聚合物用于以下的用途：
-分离，所述分离包括细胞分离
-细胞的糖基化状态的研究
-血型分型和细胞凝集
-组织化学染色
-测定酶
-根据身份和浓度的用于分子靶的传感器
-聚糖决定簇的测定(例如ELISA)
-流式细胞术测定
-体内或体外生物标志物成像或作为造影剂
-作为电泳中的检测工具
-作为治疗剂(例如作为药物)
-用于靶向药物递送
-用于抑制细胞表面相互作用
-作为催化剂。
在一个实施方案中，MIP被用于细胞或组织成像、细胞分选、糖组学和细胞糖基化生物标志物分析或用于医学中的应用，例如用于靶向药物递送或选择性抑制细胞表面相互作用。因此，在一个实施方案中，提供了分子印迹聚合物在体外细胞或组织成像、体外细胞分选、体外糖组学和细胞糖基化生物标志物分析中的用途或在医学中例如在体外选择性抑制细胞表面相互作用中的用途。
在一个实施方案中，MIP被用于识别和分子表征癌症患者中的循环肿瘤细胞(CTC)。在本发明的一个实施方案中，提供MIP用于治疗癌症。在一个实施方案中，提供了如本文公开的分子印迹聚合物用于在体外识别和分子表征来自癌症患者的循环肿瘤细胞(CTC)的用途。
在一个实施方案中，MIP通过内吞发挥治疗作用，或在治疗上被用于通过内吞进行细胞内靶向递送药物。在一个实施方案中，提供了分子印迹聚合物用作通过内吞的治疗剂或用于通过内吞进行细胞内靶向递送药物或用于选择性抑制细胞表面相互作用。
实施例：
材料
原硅酸四乙酯(TEOS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、4-氰基-4-(硫代苯甲酰基硫代)戊酸(CPDB)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、三乙胺(TEA)和氯甲酸乙酯从SigmaAldrich(Steinheim,Germany)获得。
甲醇(MeOH)来自Acros Organics(Geel,Belgium)。乙腈(ACN)从Merck(Darmstadt,Germany)获得。使EGDMA通过活化的碱性氧化铝的柱以除去抑制剂，并且在聚合之前储存在-20℃。模板唾液酸(N-乙酰基神经氨酸，SA)和D-葡萄糖醛酸(GA)分别从Calbiochem和Fluka接收。单体4-乙烯基苯硼酸(1)和甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(3)分别购自Sigma Aldrich和Polyscience。甲基丙烯酸2-(3-(4-硝基苯并[c][1,2,5]噁二唑-7-基)脲基)乙酯(2)根据我们先前公布的方案来合成。人类前列腺癌细胞系DU145和PC-3以及T细胞白血病细胞系Jurkat从LGC Standards,Teddington,Middlesex获得。胎牛血清(FBS)来自Life Technologies,Paisley,UK。SA特异性小麦寻常凝集素(triticum vulganslectin)和来自产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)的神经氨酸酶(唾液酸酶)购自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA。核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自Molecular probe,USA。聚赖氨酸载玻片从WVR,Radnor,PA,USA获得。
设备和方法
HPLC：HPLC测量在装配有UV-DAD检测器和自动取样器的Waters Alliance 2795分离模块上进行。
NMR：NMR测量在Agilent(Varian)Mercury 400MHz仪器上。
元素分析：碳含量和氮含量通过在Department of Organic Chemistry,JohannesGuttenbergMainz使用Heraeus CHN-快速分析仪(Hanau,Germany)的元素分析来确定。
搅拌单元：聚合期间的搅拌使用装配有干燥块加热器(dry block heater)的KS130基础IKA-仪器(IKA Stauffen，Germany)进行。
FT-IR光谱：这使用来自Bruker的Equinox 55分光计进行。
TEM：使用Tecnai透射电子显微镜记录透射电子显微照片。
用于紫外-可见光谱和荧光光谱的仪器：使用来自Analytik Jena的Specord 210测量紫外-可见光。使用来自Horiba的FluoroMax 4光谱仪记录荧光光谱。
用于荧光显微法和流式细胞术的仪器：使用Olympus AX 70显微镜以×20的放大率观察样本。流式细胞术在Accuri C6流式细胞仪(BD Accuri C6Flow Cytometer,NJ,US)上进行。激发波长是495nm，并且检测波长是519nm。
实施例1.RAFT改性的二氧化硅核颗粒的合成
单分散SiO2纳米颗粒(SiNP)的合成
单分散SiO2纳米颗粒(SiNP：直径200nm)通过使用略微修改的工艺来制备。在典型的合成操作中，将具有相同体积的两种溶液迅速混合以给出～250mL的总体积：一种溶液包含乙醇(114mL)和TEOS(11.4mL)，而另一种溶液包含乙醇(50mL)、水(76.5mL)以及氢氧化铵(25wt％在水中，7.6mL)。在～10min之后，当SiO2颗粒形成时，反应混合物通常变成浑浊的白色。允许反应在室温继续持续6h，温和搅拌以充分完成(产量3.5g)。然后，颗粒通过离心(5000rpm，10min)来收集，并且通过在纯的乙醇中重复再分散至少三次来洗涤。
氨基改性的二氧化硅纳米颗粒(SiNP-NH2)的合成
将二氧化硅纳米颗粒(SiNP)在甲苯中的悬浮液(7.00g，100mL)添加至三颈圆底烧瓶，在氮气下搅拌持续15min。基于在二氧化硅表面上的硅烷醇基团的理论数目(8μmol/m2)，然后添加过量的APTES(1.26g，5.71mmol)，并且将混合物在氮气保护下在130℃回流过夜。然后，将混合物冷却至室温并且添加至大量的己烷(500mL)。颗粒通过在5000rpm离心持续10min来回收，并且再分散在40mL的丙酮中，随后在300mL己烷中再沉淀。将氨基官能化的颗粒直接分散到70mL的THF中用于随后的RAFT剂的偶联。
RAFT改性的二氧化硅核颗粒(SiNP-RAFT)的合成
将CPDB(0.385g，1.38mmol)、氯甲酸乙酯(132μL，1.38mmol)和TEA(192μL，1.38mmol)在THF(50mL)中的溶液添加至装配有置顶式搅拌器(overhead stirrer)的三颈圆底烧瓶(250mL)。溶液用氮气吹扫，并且在-70℃在乙醇-液氮浴中冷却持续40分钟。在那之后，在-10℃添加7.00g(70mL储备溶液(stock solution))的氨基改性的二氧化硅(SINP-NH2，1.38mmol的氨基基团)，并且允许反应进行过夜。在那之后，添加己烷(500mL)并且颗粒通过离心(5000rpm，10min)收集。然后，将它们再分散在丙酮(80mL)中，再次在300mL的己烷中沉淀，在10分钟期间在5000rpm离心。将产生的纳米颗粒(SiNP-RAFT)在室温在真空下干燥(6.5g，93％收率)。
实施例2.使用唾液酸(SA：Neu5Ac或Neu5Gc)或葡萄糖醛酸(GA)作为模板合成核壳分子印迹聚合物。
将SiNP-RAFT(400mg)悬浮在放置在20mL螺旋盖闪烁小瓶(screw cappedscintillation vial)中的包含溶解在12mL的甲醇中的Neu5Ac(5.3mg，17.1μmol)或Neu5Gc(5.5mg，17.1μmol)或GA(3.3mg，17.1μmol)、1(2.5mg，17.1μmol)、23μl的在水中的25％w/v的3(5.6mg，34.1μmol)、2(5.7mg，17.1μmol)和EGDMA(128μL，678μmol)的溶液中。使预聚合混合物经历声处理持续30min，随后在20min期间用氮气吹扫。在那之后，添加引发剂ABDV(2.31mg，9.3μmol)，并且悬浮液再次用氮气吹扫持续5min。小瓶用硅酮绝缘带密封，并且然后通过使用480rpm的搅拌速度将小瓶保持在50℃的预加热的加热器块上来引发聚合。允许反应进行持续23h。然后，将颗粒在5mL的甲醇(80.9％)、甲酸(14.3％)、水(4.8％)的溶液中温育4×1小时，随后用甲醇(15mL)温育1×30分钟，通过在5000rpm离心中间分离颗粒。最后，将颗粒在真空下在50℃干燥，分别产生约0.4g的SA-MIP和GA-MIP。收集上清液并且通过反相HPLC分析模板的存在。这证实最终的洗涤物没有模板。Neu5Ac印迹的颗粒通过透射电子显微镜和透射FTIR来表征，并且结果在图5和图6中被示出。
实施例3.使用Siaα2-3Galβ1-3GalNAc(唾液酸化T)作为模板合成核壳分子印迹聚合物
将SiNP-RAFT(400mg)悬浮在放置在20mL螺旋盖闪烁小瓶中的包含溶解在12mL的甲醇中的Siaα2-3Galβ1-3GalNAc(唾液酸化T)(15mg,17μmol)、1(2.5mg，17μmol)、23μl的在水中的25％w/v的3(5.6mg，34.1μmol)、2(5.7mg，17.1μmol)和EGDMA(128μL，678μmol)的溶液中。使预聚合混合物经历声处理持续30min，随后在20min期间用氮气吹扫。在那之后，添加引发剂ABDV(2.31mg，9.3μmol)，并且悬浮液再次用氮气吹扫持续5min。小瓶用硅酮绝缘带密封，并且然后通过使用480rpm的搅拌速度将小瓶保持在50℃的预加热的加热器块上来引发聚合。允许反应进行持续23h。然后，将颗粒在5mL的甲醇(80.9％)、甲酸(14.3％)、水(4.8％)的溶液中温育4×1小时，随后用甲醇(15mL)温育1×30分钟，通过在5000rpm离心中间分离颗粒。最后，将颗粒在真空下在50℃干燥，产生约0.4g的MIP。收集上清液并且通过反相HPLC分析模板的存在。这证实最终的洗涤物没有模板。
实施例4.使用Siaα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc(唾液酸化Lewis X)作为模板合成核壳分子印迹聚合物
将SiNP-RAFT(400mg)悬浮在放置在20mL螺旋盖闪烁小瓶中的包含溶解在12mL的甲醇中的Siaα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc(唾液酸化Lewis X)(20mg,17μmol)、1(2.5mg，17μmol)、23μl的在水中的25％w/v的3(5.6mg，34.1μmol)、2(5.7mg，17.1μmol)和EGDMA(128μL，678μmol)的溶液中。使预聚合混合物经历声处理持续30min，随后在20min期间用氮气吹扫。在那之后，添加引发剂ABDV(2.31mg，9.3μmol)，并且悬浮液再次用氮气吹扫持续5min。小瓶用硅酮绝缘带密封，并且然后通过使用480rpm的搅拌速度将小瓶保持在50℃的预加热的加热器块上来引发聚合。允许反应进行持续23h。然后，将颗粒在5mL的甲醇(80.9％)、甲酸(14.3％)、水(4.8％)的溶液中温育4×1小时，随后用甲醇(15mL)温育1×30分钟，通过在5000rpm离心中间分离颗粒。最后，将颗粒在真空下在50℃干燥，产生约0.4g的MIP。收集上清液并且通过反相HPLC分析模板的存在。这证实最终的洗涤物没有模板。
实施例5.使用Sia2,3Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc(唾液酸化Lewis A)作为模板合成核壳分子印迹聚合物
将SiNP-RAFT(400mg)悬浮在放置在20mL螺旋盖闪烁小瓶中的包含溶解在12mL的甲醇中的Sia2,3Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc(唾液酸化Lewis A)(20mg,17μmol)、1(2.5mg，17μmol)、23μl的在水中的25％w/v的3(5.6mg，34.1μmol)、2(5.7mg，17.1μmol)和EGDMA(128μL，678μmol)的溶液中。使预聚合混合物经历声处理持续30min，随后在20min期间用氮气吹扫。在那之后，添加引发剂ABDV(2.31mg，9.3μmol)，并且悬浮液再次用氮气吹扫持续5min。小瓶用硅酮绝缘带密封，并且然后通过使用480rpm的搅拌速度将小瓶保持在50℃的预加热的加热器块上来引发聚合。允许反应进行持续23h。然后，将颗粒在5mL的甲醇(80.9％)、甲酸(14.3％)、水(4.8％)的溶液中温育4×1小时，随后用甲醇(15mL)温育1×30分钟，通过在5000rpm离心中间分离颗粒。最后，将颗粒在真空下在50℃干燥，产生约0.4g的MIP。收集上清液并且通过反相HPLC分析模板的存在。这证实最终的洗涤物没有模板。
实施例6.使用Siaα2-6GalNAc(唾液酸化Tn)作为模板合成核壳分子印迹聚合物
将SiNP-RAFT(400mg)悬浮在放置在20mL螺旋盖闪烁小瓶中的包含溶解在12mL的甲醇中的Siaα2-6GalNAc(10mg,17μmol)、1(2.5mg，17μmol)、23μl的在水中的25％w/v的3(5.6mg，34.1μmol)、2(5.7mg，17.1μmol)和EGDMA(128μL，678μmol)的溶液中。使预聚合混合物经历声处理持续30min，随后在20min期间用氮气吹扫。在那之后，添加引发剂ABDV(2.31mg，9.3μmol)，并且悬浮液再次用氮气吹扫持续5min。小瓶用硅酮绝缘带密封，并且然后通过使用480rpm的搅拌速度将小瓶保持在50℃的预加热的加热器块上来引发聚合。允许反应进行持续23h。然后，将颗粒在5mL的甲醇(80.9％)、甲酸(14.3％)、水(4.8％)的溶液中温育4×1小时，随后用甲醇(15mL)温育1×30分钟，通过在5000rpm离心中间分离颗粒。最后，将颗粒在真空下在50℃干燥，产生约0.4g的MIP。收集上清液并且通过反相HPLC分析模板的存在。这证实最终的洗涤物没有模板。
实施例7.使用Siaα2,3-Galβ或Siaα2,6-Galβ作为模板合成核壳分子印迹聚合物
将SiNP-RAFT(400mg)悬浮在放置在20mL螺旋盖闪烁小瓶中的包含溶解在12mL的甲醇中的Siaα2,3-Galβ或Siaα2,6-Galβ_(10mg,17μmol)、1(2.5mg，17μmol)、23μl的在水中的25％w/v的3(5.6mg，34.1μmol)、2(5.7mg，17.1μmol)和EGDMA(128μL，678μmol)的溶液中。使预聚合混合物经历声处理持续30min，随后在20min期间用氮气吹扫。在那之后，添加引发剂ABDV(2.31mg，9.3μmol)，并且悬浮液再次用氮气吹扫持续5min。小瓶用硅酮绝缘带密封，并且然后通过使用480rpm的搅拌速度将小瓶保持在50℃的预加热的加热器块上来引发聚合。允许反应进行持续23h。然后，将颗粒在5mL的甲醇(80.9％)、甲酸(14.3％)、水(4.8％)的溶液中温育4×1小时，随后用甲醇(15mL)温育1×30分钟，通过在5000rpm离心中间分离颗粒。最后，将颗粒在真空下在50℃干燥，产生约0.4g的MIP。收集上清液并且通过反相HPLC分析模板的存在。这证实最终的洗涤物没有模板。
实施例8.使用Siaα2,3-N-乙酰基乳糖胺或Siaα2,6-N-乙酰基乳糖胺作为模板合成核壳分子印迹聚合物
将SiNP-RAFT(400mg)悬浮在放置在20mL螺旋盖闪烁小瓶中的包含溶解在12mL的甲醇中的Siaα2,3-N-乙酰基乳糖胺或Siaα2,6-N-乙酰基乳糖胺(15mg)、1(2.5mg，17μmol)、23μl的在水中的25％w/v的3(5.6mg，34.1μmol)、2(5.7mg，17.1μmol)和EGDMA(128μL，678μmol)的溶液中。使预聚合混合物经历声处理持续30min，随后在20min期间用氮气吹扫。在那之后，添加引发剂ABDV(2.31mg，9.3μmol)，并且悬浮液再次用氮气吹扫持续5min。小瓶用硅酮绝缘带密封，并且然后通过使用480rpm的搅拌速度将小瓶保持在50℃的预加热的加热器块上来引发聚合。允许反应进行持续23h。然后，将颗粒在5mL的甲醇(80.9％)、甲酸(14.3％)、水(4.8％)的溶液中温育4×1小时，随后用甲醇(15mL)温育1×30分钟，通过在5000rpm离心中间分离颗粒。最后，将颗粒在真空下在50℃干燥，产生约0.4g的MIP。收集上清液并且通过反相HPLC分析模板的存在。这证实最终的洗涤物没有模板。
实施例9.使用如在图3D中示出的荧光的基于脲的任何单体合成分子印迹聚合物。
实施例10.批量结合测试(batch binding test)和吸附等温线
进行结合测试以便探测颗粒对糖模板的亲和力。将干燥的无模板的颗粒(20mg)悬浮在1.5mL微量离心管中的1mL的包含在不同浓度(1μM-20μM)的模板的甲醇和水(2％、50％或98％水)的混合物中。在室温通过轻轻地振摇温育2h之后，将溶液在10000rpm离心持续15min。将上清液转移至HPLC小瓶，用于通过反相HPLC分析来测量游离溶质浓度(F)，该反相HPLC分析使用20mM NaH2PO4(pH 2.0)作为流动相、C-18反相柱(Phenomenex Luna C-18,250×4.6mm)、0.7mL min-1的流量、20μl的注射体积，并且检测通过在215nm的紫外吸收测量来进行。由聚合物颗粒(B)结合的溶质的具体的量由下式确定：
(1)其中C0是初始溶质浓度，F是上清液中的最终溶质浓度，v(mL)是吸附混合物的总体积，并且m是每个小瓶中的聚合物的质量。使用Prism 6曲线拟合软件(Graphpad Inc.)通过非线性回归，将结合曲线拟合至Langmuir单位点模型。结合曲线见图7，并且结合参数见表1。
实施例11.细胞培养
将人前列腺癌细胞系DU145和PC-3培养在具有含有10％FBS的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco`s Modified Eagle Medium)(DMEM)的烧瓶中，并且在37℃、5％CO2以100％湿度温育。将T细胞白血病细胞系Jurkat培养在具有10％FBS和庆大霉素(50μg/ml)的RPMI 1640中，并且在37℃、5％CO2以100％湿度温育。将小鼠巨噬细胞系RAW 264.7培养在具有10％FBS和青霉素-链霉素的RPMI1640中，并且将人类巨噬细胞系THP-1培养在具有10％FBS和庆大霉素(50ug/ml)的RPMI1640中，并且在37℃、5％CO2以100％湿度温育。将小鼠成纤维细胞系L929在具有10％FBS和谷氨酰胺的DMEM中培养，并且在37℃、5％CO2以100％湿度温育。将乳腺癌细胞系CCD1095-Sk培养在具有10％FBS的Eagle最低基础培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)(MEM)中，将MDA-MB231培养在具有10％FBS的DMEM中，并且将MCF-7在具有10％FBS和青霉素-链霉素的RPMI中培养，并且在37℃、5％CO2以100％湿度温育。
当粘附细胞达到融合(confluency)时，通过用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗涤并且然后用胰蛋白酶/EDTA处理来使粘附细胞传代。对于显微镜研究，将细胞培养在装配有圆形玻璃盖玻片(直径12mm)的12孔细胞培养板中。在100μL的细胞悬液中分别制备10,000个DU145细胞和20,000个PC-3细胞，并且用移液管吸取到每个盖玻片上。在3h之后，添加1mL的细胞培养基并且将细胞留下以在37℃、5％CO2以100％湿度生长持续至少48小时以达到融合。对于Jurkat细胞的显微镜研究，将包含50,000个细胞的100μl的细胞悬液在37℃粘附至聚赖氨酸载玻片持续2小时。其后，细胞用100μl PBS小心地洗涤2×。
实施例12.用于荧光显微法的细胞固定、唾液酸酶处理和MIP染色
细胞固定通过用2mL PBS洗涤包含融合细胞的盖玻片2×，随后在室温(RT)在1mL4％甲醛中温育持续10min来进行。然后，固定通过从每个孔中吸出甲醛，随后用2mL PBS洗涤3×来中断。
对于SA-MIP染色和GA-MIP染色，通过用VWR超声清洁器声处理持续4+4分钟来将干燥的MIP颗粒悬浮在水(3％甲醇)中。在使用之前，将储备悬浮液进一步稀释并且声处理。在用2mL水(3％甲醇)洗涤细胞2×之后，将500μL的稀释的声处理的颗粒悬浮液(20μg mL-1或80μg mL-1)添加至每个孔。此外，还制备了没有颗粒的一个阴性对照。细胞用MIP在37℃温育持续60分钟。在温育之后，将孔用2mL水(3％甲醇)洗涤3×，并且然后制备盖玻片用于荧光显微法。这通过使用一滴的封固介质(mounting medium)Gold防褪色封固剂或具有DAPI(分子探针)的Gold防褪色剂，将细胞倒置地安装在显微镜载玻片上来进行。对于根据实施例2-6的用MIP颗粒染色的细胞的典型的图像见图8和图9。
对于用唾液酸酶(来自产气荚膜梭状芽孢杆菌的神经氨酸酶)处理，将DU145细胞用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)洗涤，并且将200μL的5U/ml和10U/ml的酶在37℃分别添加至细胞持续60分钟。一个阴性对照仅具有200μL的DMEM。其后，细胞用DMEM洗涤3×。然后，细胞用2mL水(3％甲醇)洗涤2×，并且用20μg mL-1的浓度的SA-MIP染色。对于比较处理的细胞和未处理的细胞的典型的图像见图10。
实施例13.用于荧光显微法的凝集素-FITC染色
如上文描述的在盖玻片上生长的融合的DU145细胞或PC-3细胞用2mL PBS洗涤2×，并且在RT在1mL 4％甲醛中固定持续10min。将甲醛从每个孔中吸出并且用2mL PBS洗涤3×，以停止固定。细胞用500μl的0.5μg/ml-1μg/ml FITC标记的SA-特异性凝集素在RT染色持续60min，并且然后用PBS洗涤3×。使用一滴封固介质Gold防褪色封固剂或具有DAPI(分子探针)的Gold防褪色剂安装每个圆形盖玻片，用于在显微镜载玻片(倒置地)上荧光显微法成像。对于典型的图像见图9和图11。
实施例14.MIP和凝集素-FITC的流式细胞术分析
DU145、PC-3、Jurkat或C-I的5x105个细胞分别用2mL PBS洗涤2×，并且在RT在1mL4％甲醛中固定持续20分钟。在吸出并且用PBS洗涤3×之后，细胞用2mL的温育溶剂(水(3％甲醇)，双蒸水或PBS缓冲液)洗涤2×，并且其后用在所指示浓度(5μg mL-1-80μg mL-1)的500μL声处理的SA-MIP悬浮液染色，随后在37℃温育持续60分钟。在温育之后，细胞用2mL的温育溶剂洗涤3×，并重悬在300μL的相同的溶剂中并且通过流式细胞术分析。
对于SA特异性凝集素的流式细胞术分析，DU145、PC3或Jurkat的5×105个细胞分别用2mL PBS洗涤2×，并且用不同浓度(5ng/mL-50ng/mL)的凝集素-FITC溶液染色，并且在冰上在暗处温育持续20min。在温育之后，细胞用PBS洗涤2×，并且重悬在300μL PBS中并且通过流式细胞术分析。
对于％阳性细胞对添加的探针的依赖性见图12和图13。对于MIP探针结合至DU145的结合常数的估算见图14。
实施例15.使用印迹有Neu5Ac或Neu5Gc的MIP识别转铁蛋白的动物形式和人类形式。
将2.5μg的人类转铁蛋白或牛转铁蛋白溶解在100μL水中，并且将4mg Neu5Ac或Neu5Gc印迹的颗粒(分别为Neu5Ac-MIP和Neu5GcMIP)悬浮在此溶液中。将悬浮液在室温搅拌持续3小时。在离心之后，取30μL的上清液用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。结果在表15中示出。
实施例16.使用SA-MIP的活细胞的染色
对于结合至活力细胞的SA-MIP的流式细胞术分析，5×105个细胞用2mL PBS洗涤2×，并且用以不同浓度(0.4mg/mL-0.8mg/mL)溶解在PBS中的SA-MIPS染色，并且在37℃温育持续60分钟。在温育之后，细胞用PBS洗涤2×，并且重悬在300μL PBS中并且通过流式细胞术、并且其后通过荧光显微法分析(见图16)。
实施例17.使用Neu5Ac MIP和Neu5Gc MIP的人类细胞系和动物细胞系的染色。
人类DU145细胞和小鼠L929细胞用2mL PBS洗涤2×，并且在RT在1mL 4％甲醛中固定持续20分钟。在吸出并且用PBS洗涤3×之后，细胞用2mL水(3％甲醇)洗涤2×，并且其后分别用在浓度20μg mL-1-80μg mL-1的100μL声处理的Neu5Ac MIP和Neu5Gc MIP染色，并且在37℃温育持续60分钟。在温育之后，细胞用2mL水(3％甲醇)洗涤3×，重悬在300μL甲醇/水中并且通过流式细胞术分析。对于荧光显微法实验，细胞用DAPI(分子探针)复染，并且其后分析(见图17)。
实施例18.内吞实验。
对于结合至活力的RAW264.7细胞的SA-MIP的流式细胞术分析，将1×106个细胞在12孔板中的500μl的培养基中温育。在温育过夜之后，添加以不同浓度(0.4mg/mL-0.8mg/mL)溶解在PBS中的SA-MIP，并且将细胞在37℃温育持续60分钟-24h。在温育之后，细胞用PBS洗涤2×，用溶酶体标志物Lysotracker染色持续60分钟，洗涤并重悬在300μL PBS中，并且通过荧光显微法分析颗粒的摄取和溶酶体活性(见图18)。
实施例19.使用SA-MIP的已知恶性肿瘤的人类乳腺癌细胞系的染色
人类乳腺癌细胞系CCD1095-Sk(良性)、MDA-MB231(恶性)和MCF-7(恶性)用2mLPBS将洗涤2×，并且在RT在1mL 4％甲醛中固定持续20分钟。在吸出并且用PBS洗涤3×之后，细胞用2mL水(3％甲醇)洗涤2×，并且其后用在浓度20μg mL-1-80μg mL-1的100μL声处理的SA-MIP染色，并且在37℃温育持续60分钟。在温育之后，细胞用2mL水(3％甲醇)洗涤3×，重悬在300μL甲醇/水中并且通过流式细胞术分析。对于荧光显微法实验，细胞用DAPI(分子探针)复染色，并且其后分析(见图19)。
实施例20.使用SA-MIP的人类脑肿瘤癌细胞系和皮肤癌(黑素瘤)细胞系的染色
九种不同的人类脑肿瘤癌细胞系和两种不同的黑素瘤细胞系用2mL PBS洗涤2×，并且在RT在1mL 4％甲醛中固定持续20分钟。在吸出并且用PBS洗涤3×之后，细胞用2mL水(3％甲醇)洗涤2×，并且其后用在浓度20μg mL-1-80μg mL-1的100μL声处理的SA-MIP染色，并且在37℃温育持续60分钟。在温育之后，细胞用2mL水(3％甲醇)洗涤3×，重悬在300μL甲醇/水中并且通过流式细胞术分析。

Claims (35)

1.一种分子印迹聚合物，其特征在于所述分子印迹聚合物通过以下是可获得的：
a)提供糖模板；
b)提供至少两种官能单体，所述官能单体能够协作地与所述模板相互作用；
c)提供交联单体；
d)在所述糖模板的存在下，使任选地溶解在溶剂中的所述单体聚合；
e)从所形成的聚合物中除去所述模板。
2.根据权利要求1所述的分子印迹聚合物，其中所述模板是糖，所述糖是至少部分地对应于细胞表面聚糖的表位。
3.根据权利要求1所述的分子印迹聚合物，其中所述模板是由图2中描绘的所述聚糖例示的肿瘤特异性细胞表面聚糖。
4.根据权利要求1所述的分子印迹聚合物，其中所述模板是由图2中描绘的所述聚糖例示的病毒特异性聚糖。
5.根据权利要求1所述的分子印迹聚合物，其中所述模板是Siaα2-6GalNAc(唾液酸化Tn)、Siaα2-3Galβ1-3GalNAc(唾液酸化T)、Siaα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc(唾液酸化Lewis X)或Sia2,3Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc(唾液酸化Lewis A)、Siaα2,3-Galβ、Siaα2,6-Galβ、Siaα2,3-N-乙酰基乳糖胺、Siaα2,6-N-乙酰基乳糖胺、N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac，唾液酸(SA)的人类形式)、N-羟乙酰基神经氨酸(Neu5Gc，唾液酸的动物形式)、GlcA2SO3β1,4-Glc2NSO3或GlcA2SO3β1,4-Glc2NSO36SO3。
6.根据权利要求1所述的分子印迹聚合物，其中所述模板是唾液酸或包含一种或更多种唾液酸的聚糖。
7.根据权利要求1所述的分子印迹聚合物，其中所述模板是单糖、二糖、三糖或四糖。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体中的一种是能够与所述模板形成离子对的单体。
9.根据权利要求8所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体中的一种是图3A中的能够与所述模板形成离子对的任何类型的单体，例如来自2-乙烯基吡啶(2-VPY)、4-乙烯基吡啶(4-VPY)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAEMA)、甲基丙烯酸2-氨基乙酯(AEMA)、2-氨基乙基甲基丙烯酰胺(AEMAM)、N-乙烯基咪唑(VIM)、甲基丙烯酸N-(二甲基)-2-乙酯(DMAEMA)、烯丙胺(ALAM)、对乙烯基-N,N'-二乙基-苯甲脒(VDEAB)或对乙烯基苄基胺(VBA)，阳离子单体具有通式NR1R2R3R4 +X-，所有基团R直接连接至N，其中R1、R2、R3、R4中的至少一个是可聚合的基团，并且X-是抗衡阴离子，阳离子单体的实例是甲基丙烯酸N-(三甲基)-2-乙酯-氯化铵(TMAEMA)、N-(三甲基)-对乙烯基苄基-氯化铵(TMVBA)、N-乙烯基-N'-苄基-咪唑鎓氯化物(VBI)、N-乙烯基吡啶鎓氯化物(N-VPY)，酸性单体的实例是甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、三氟甲基丙烯酸(TFM)、衣康酸(ITA)、对乙烯基苯甲酸(PVB)、2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)。
10.根据权利要求9所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体中的一种是甲基丙烯酸2-氨基乙酯。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体中的一种是中性单体，所述中性单体能够与所述模板氢键键合。
12.根据权利要求11所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体中的一种是图3B中的能够与所述模板氢键键合的任何类型的中性单体，例如来自N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、苯乙烯(S)、甲基丙烯酸2-羟基乙酯(HEMA)、丙烯腈(AN)、氰基苯乙烯(CS)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酰胺(AAM)、甲基丙烯酰胺(MAAM)、N-叔丁基丙烯酰胺(TBAM)。
13.根据权利要求11所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体中的一种是R1-NHCONH-R2类型的1,3二取代的脲单体，其中取代基R1和R2中的至少一个是可聚合的基团。
14.根据权利要求12所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体中的一种是甲基丙烯酸2-(3-(4-硝基苯并[c][1,2,5]噁二唑-7-基)脲基)乙酯或1-(4-苯乙烯基)-3-(3,5-三氟甲基-苯基)-脲(TFU)或图3D中的任何类型。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的分子印迹聚合物，其中所述交联单体是图3C中的任何类型，例如来自乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、二乙烯基苯(DVB)、三甲基丙烯酸三甲基丙酯(TRIM)、季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)、乙基-二丙烯酰胺(EBA)、哌嗪-二丙烯酰胺(PBA)、亚甲基双丙烯酰胺(MBA)。
16.根据权利要求1-7中任一项所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体中的一种是能够与所述模板共价地相互作用的单体。
17.根据权利要求16所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体中的一种是图3E或图3F中示出的能够与所述模板共价地相互作用的任何类型的单体，例如来自R-B(OH)2或R-B(OH)OR2(其中R2是烷基取代基或芳基取代基)、肼类R-NH-NH2、胺类例如苄基胺类R-Bzl-NH2或多胺类、磺酰肼类R-PhSO2NHNH2。
18.根据权利要求17所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体中的一种是4-乙烯基苯硼酸。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体是代表图3中描绘的单体的所有三种类型的至少三种。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的分子印迹聚合物，其中一种官能单体是胺，一种官能单体是脲并且一种官能单体是硼酸。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的分子印迹聚合物，其中根据图3和图4中描绘的任何结构，一种官能单体是胺，一种官能单体是脲，且一种官能单体是硼酸。
22.根据权利要求1-18中任一项所述的分子印迹聚合物，其中一种官能单体是甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐，一种官能单体是甲基丙烯酸2-(3-(4-硝基苯并[c][1,2,5]噁二唑-7-基)脲基)乙酯，且一种官能单体是4-乙烯基苯硼酸。
23.根据权利要求1-7中任一项所述的分子印迹聚合物，其中一种官能单体是荧光报告单体。
24.根据权利要求23所述的分子印迹聚合物，其中所述官能单体是荧光报告单体，例如图3中的1和图4中的2。
25.根据权利要求23所述的分子印迹聚合物，其中所述荧光单体是图3D中示出的任何结构。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的分子印迹聚合物，其中所述聚合物指的是表面印迹聚合物。
27.根据权利要求26所述的分子印迹聚合物，其中所述聚合物是通过表面引发的聚合产生的表面印迹聚合物。
28.根据权利要求26所述的分子印迹聚合物，其中所述表面印迹聚合物通过被称为沉淀聚合、细乳液聚合或从聚合接枝的程序中的任一种来制备。
29.根据权利要求26所述的分子印迹聚合物，其中所述表面印迹聚合物通过可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)的技术来制备。
30.根据权利要求26所述的分子印迹聚合物，其中所述表面印迹聚合物通过可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)的技术来制备，其中在合成所述印迹聚合物之后，RAFT基团通过氨解反应或自由基反应被转化。
31.一种用于制备分子印迹聚合物的方法，其特征在于所述分子印迹聚合物通过以下是可获得的：
a)提供糖模板；
b)提供至少两种官能单体，所述官能单体能够协作地与所述模板相互作用；
c)提供交联单体；
d)在所述糖模板的存在下，使任选地溶解在溶剂中的所述单体聚合；
e)从所形成的聚合物中除去所述模板。
32.根据权利要求1-30中任一项所述的分子印迹聚合物用于在体外进行以下的用途：
-分离，所述分离包括细胞分离
-细胞的糖基化状态的研究
-血型分型和细胞凝集
-组织化学染色
-测定酶
-根据身份和浓度的用于分子靶的传感器
-聚糖决定簇的测定(例如ELISA)
-流式细胞术测定
-体内或体外生物标志物成像或作为造影剂
-作为电泳中的检测工具
-作为治疗剂(例如作为药物)
-作为催化剂。
33.根据权利要求1-30中任一项所述的分子印迹聚合物在体外细胞或组织成像、体外细胞分选、体外糖组学和细胞糖基化生物标志物分析中的用途或在医学中例如在体外选择性抑制细胞表面相互作用中的用途。
34.根据权利要求1-30中任一项所述的分子印迹聚合物用于在体外识别和分子表征来自癌症患者的循环肿瘤细胞(CTC)的用途。
35.根据权利要求1-30中任一项所述的分子印迹聚合物用作通过内吞的治疗剂的用途或用于通过内吞进行细胞内靶向递送药物或用于选择性抑制细胞表面相互作用。
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