JP7133832B2 - 蛍光性官能基を有する分子インプリントナノ粒子 - Google Patents
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Description
(1) 蛍光性官能基を有する分子インプリント高分子からなるナノ粒子であって、測定物質が存在しない状態では自己消光し、測定物質が存在する状態では蛍光強度が増大する、ナノ粒子。
(2) ナノ粒子の平均粒径が、10nm~1000nmである、(1)に記載のナノ粒子。
(3) ナノ粒子が、機能性モノマーと架橋性モノマーと蛍光性モノマーと開始剤と測定物質とを混合して重合させることにより製造される、(1)又は(2)に記載のナノ粒子。
(4) 機能性モノマーが、メタクリル酸である、(3)に記載のナノ粒子。
(5) 架橋性モノマーが、エチレングリコールジメタクリレートである、(3)又は(4)に記載のナノ粒子。
(6) 蛍光性モノマーが、アリル基(CH2=CH-CH2-)を有する蛍光分子である、(3)から(5)の何れか一に記載のナノ粒子。
(7) 蛍光性モノマーが、アリルフルオレセインである、(3)から(6)の何れか一に記載のナノ粒子。
(8) 測定物質が、担体に固定されている測定物質である、(3)から(7)の何れか一に記載のナノ粒子。
(9) 測定物質が、ビースに固定されている測定物質である、(3)から(8)の何れか一に記載のナノ粒子。
(10) 測定物質が、ホルモン、神経伝達物質、がん細胞分泌物、抗菌剤、または抗凝固薬である、(1)から(9)の何れか一に記載のナノ粒子。
(11) 測定物質が、セロトニンである、(1)から(10)の何れか一に記載のナノ粒子。
(12) (1)から(11)の何れか一に記載のナノ粒子に、測定物質を含有する試料を接触させ、蛍光強度の変化を検出することを含む、測定物質の測定方法。
本発明のナノ粒子は、蛍光性官能基を有する分子インプリント高分子からなるナノ粒子であって、測定物質が存在しない状態では自己消光し、測定物質が存在する状態では蛍光強度が増大する。
蛍光分子としては、フルオレセイン系化合物(フルオレセイン、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、6-FAM(6-カルボキシフルオレセイン)、TET(テトラクロロ-6-カルボキシフルオレセイン)、HEX(ヘキサクロロフルオレセイン)、6-JOE(6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン))、ローダミン系化合物(ローダミン、ROX(カルボキシ-6-ローダミン)、TAMRA((6-テトラメチルローダミン-5(6)-カルボキサミド)ヘキサノエート)など)、Alexa Fluor(登録商標)化合物(例、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647)、ATTO化合物(ATTO488、ATTO532、ATTO550、ATTORho6G、ATTO647N)、テキサスレッド、シアニン系化合物(Cy5、Cy3、Cy3.5など)などが挙げられる。
既報(Gao, L., et al., Molecularly imprinted polymer microspheres for optical measurementof ultra trace nonfluorescent cyhalothrin in honey, Food Chem., 156, 1-6, 2014)の方法に準じて、臭化アリルを蛍光色素フルオレセインのカルボキシル基とアルカリ条件下で結合させ、蛍光性モノマーであるアリルフルオレセインを合成した。
既報(Poma, A. et al, Solid-Phase Synthesis of Molecularly Imprinted Polymer Nanoparticles with a Reusable Template-“Plastic Antibodies”, Advanced Functional Materials, 23, 2821-2827, 2013)に方法に準じて、粒径50μmのガラスビーズを3Mの硝酸中で煮沸して洗浄して、純水で洗浄して乾燥した。その後10%のアミノプロピルトリメトキシシラン水溶液に20分間浸漬して撹拌し、表面をアミノ化した。メタノールで洗浄した後、真空乾燥した。これを10%グルタルアルデヒド水溶液中にて撹拌し、表面にアルデヒド基を導入した。これをそしてガラスビーズを0.5mMセロトニン水溶液中(pH7.4のリン酸緩衝塩を含む)に加えてガラスビーズに鋳型物質であるセロトニンを固定した。
メタクリル酸360μL、エチレングリコールジメタクリレート1286mg及びアリルフルオレセイン0.01gをジエチルジオチルカルバメートベンジル(開始剤)0.15g、N,N-ジメチルホルムアミド6mLおよび蒸留水900μLの混合溶媒に溶かした重合溶液を調製した。上記の重合溶液に、セロトニンを固定したガラスビーズを浸した。次に重合溶液に窒素を流入し、ガラスビーズが流動した状態でキセノンランプを照射してMIP NPを合成した。そして処理したガラスビーズをジメチルホルムアミド、水で洗浄した後、60℃の1M NaCl溶液でガラスビーズからMIPを遊離させた。合成したMIP NP分散溶液を、セルロースチューブ膜の中に封入して、リン酸緩衝液中で透析し、MIP NP以外の溶質を除去した。
MIP NP分散溶液にセロトニンまたはトリプトファンを0-15μM添加し、MIP NPの平均粒径を動的光散乱分光器(DelsaMax Pro,Beckman Coulter)で測定した。
pH 7.4リン酸緩衝溶液にMIP NP分散を溶液の蛍光強度を蛍光分光器F750(日本分光)で測定した。またMIP NP分散溶液にセロトニンおよびL-トリプトファンを50μM添加した時の蛍光強度スペクトルを測定した。MIP NP分散溶液にセロトニンまたはトリプトファンを0-15μM添加し、ピーク蛍光強度と濃度の関係を観察した。
本発明の分子インプリントナノ粒子にはフルオレセイン基等の蛍光性基が高密度に存在すると考えられる。そのため蛍光性基同士で消光し合う自己消光が起こっている可能性がある。MIPナノ粒子が鋳型との特異相互作用によって膨潤することにより、フルオレセイン基等の蛍光性基の密度が低下し、蛍光性基周囲の水による消光が減じられ、蛍光強度が増大したことが考えられる。
(1)サンプルの作製
アメフラシから摘出した脳神経節を、シリコーン製のセルに固定ピンで固定した。脳神経節のニューロンを覆う神経上膜を微小ハサミで剥離し、ニューロンを露出させた。その後、MIPナノ粒子と人工海水(ASW)を1:1で混合した溶液2.5mLを、神経節固定チャンバー内に注ぎ、セル全体をアルミホイルで包んで遮光し、室温で60分間静置した。
脳神経節固定チャンバー内の溶液を、パスツールピペットを用いてASWと入れ換えた。
以上より作製した測定サンプルを、セルごと蛍光顕微鏡下に設置し、蛍光顕微鏡により観察した。
また、解剖後、MIPナノ粒子による染色を行わなかった脳神経節をBrankとして、蛍光顕微鏡で観察した。
図5に、Brankとして染色をしていない脳神経節の蛍光強度変化チャートを示し、図6にはMIPナノ粒子24時間染色後の脳神経節の蛍光強度変化を示した。
蛍光強度変化は図5では、最大0.1%見られた。細胞のみでも蛍光していることより、自家蛍光であることが考えられるが、その上蛍光強度変化が生じていることから、細胞内の蛍光物質の蛍光強度変化が測定されてしまった可能性がある。しかし、MIPナノ粒子による蛍光強度変化は理論上0.3%程度であると推測されているため、自家蛍光による強度変化が0.1%程度であるならば、判別は可能である。
図6では蛍光強度変化と見られる変化はなかった。細胞のみで蛍光強度変化が見られ、MIPナノ粒子では蛍光強度変化が見られないことから、自家蛍光による強度変化と、MIPナノ粒子による強度変化が互いに打ち消し合っている可能性が考えられる。
Claims (12)
- 蛍光性官能基を有する分子インプリント高分子からなるナノ粒子であって、測定物質が存在しない状態では自己消光し、測定物質が存在する状態では蛍光強度が増大する、ナノ粒子。
- ナノ粒子の平均粒径が、10nm~1000nmである、請求項1に記載のナノ粒子。
- 機能性モノマーと架橋性モノマーと蛍光性モノマーと開始剤と測定物質とを混合して重合させることを含む、請求項1又は2に記載のナノ粒子の製造方法。
- 機能性モノマーが、メタクリル酸である、請求項3に記載の製造方法。
- 架橋性モノマーが、エチレングリコールジメタクリレートである、請求項3又は4に記載の製造方法。
- 蛍光性モノマーが、アリル基(CH2=CH-CH2-)を有する蛍光分子である、請求項3から5の何れか一項に記載の製造方法。
- 蛍光性モノマーが、アリルフルオレセインである、請求項3から6の何れか一項に記載の製造方法。
- 請求項1又は2に記載のナノ粒子に、測定物質を含有する試料を接触させ、蛍光強度の変化を検出することを含む、測定物質の測定方法。
- 測定物質が、担体に固定されている測定物質である、請求項8に記載の測定方法。
- 測定物質が、ビースに固定されている測定物質である、請求項8又は9に記載の測定方法
- 測定物質が、ホルモン、神経伝達物質、がん細胞分泌物、抗菌剤、または抗凝固薬である、請求項8から10の何れか一項に記載の測定方法。
- 測定物質が、セロトニンである、請求項8から11の何れか一項に記載の測定方法。
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