JPH0586100A - 蛋白質を共有結合により固定するための変更された固体支持体及びその製法 - Google Patents
蛋白質を共有結合により固定するための変更された固体支持体及びその製法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は公知のマトリックス物質をベースと
する蛋白質を共有結合により固定するための変更された
固体支持体に関し、この変更された固体支持体Ｔは共有
結合による固定化に適した式Ｉ： 【化１】 ［式中Ａはスペーサ基を表し、ＸはＯ、Ｓ又はＮＨを表
し、ｎは０又は１を表す］の官能基を多数有し、これら
の基はマトリックス物質に共有結合的に連結している。 【効果】 反応条件下に安定性を低下させたり、感応性
を増大させることなく、支持体系への生物学的に有用な
蛋白質の結合速度を高めることができる。
する蛋白質を共有結合により固定するための変更された
固体支持体に関し、この変更された固体支持体Ｔは共有
結合による固定化に適した式Ｉ： 【化１】 ［式中Ａはスペーサ基を表し、ＸはＯ、Ｓ又はＮＨを表
し、ｎは０又は１を表す］の官能基を多数有し、これら
の基はマトリックス物質に共有結合的に連結している。 【効果】 反応条件下に安定性を低下させたり、感応性
を増大させることなく、支持体系への生物学的に有用な
蛋白質の結合速度を高めることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は蛋白質を固定するための
変更された固体支持体及び蛋白質を結合する方法に関す
る。
変更された固体支持体及び蛋白質を結合する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】生物学的に有用な蛋白質を支持体に固定
する処理は、生化学的研究においてまたバイオテクノロ
ジーにおいて重要な手段である（“Ｕｌｌｍａｎｎ′ｓ
Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、第５版、第１４Ａ巻、２
〜４２頁、ＶＣＨ１９８９参照）。
する処理は、生化学的研究においてまたバイオテクノロ
ジーにおいて重要な手段である（“Ｕｌｌｍａｎｎ′ｓ
Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、第５版、第１４Ａ巻、２
〜４２頁、ＶＣＨ１９８９参照）。
【０００３】固体の有機マトリックス物質としてはこれ
まで特に天然産の（変更された）多糖類、蛋白質及び活
性炭、並びに合成重合体例えばポリスチロール、ポリ
（メタ）アクリレート、ポリアクリルアミド、無水マレ
イン酸−重合体、ビニル−及びアリル重合体及びポリア
ミドが使用されてきた。無機支持体としては鉱物、特に
粘度物質、ケイソウ土及び滑石、並びに合成物質例えば
ガラス、金属酸化物及び金属が使用される。この固定処
理の可能な様式のうち共有結合による固定は、固定すべ
き生物学的に活性の物質（主として蛋白質）の活性決定
構造に最も早く作用する。支持体物質は通常それ自体
は、これを蛋白質の活性基（特にアミノ基、ヒドロキシ
基又はフェノール基、アミド基、チオール基、カルボキ
シル基）に連結させる反応基を有さず、従って活性化し
なければならない。支持体物質を活性化するには、生物
学的に活性な蛋白質の遊離アミノ基、フェノール基及び
／又はチオール基をアルキル化又はアリール化させる多
くの反応基が使用される（前記の“Ｕｌｌｍａｎｎ′ｓ
Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｅ”、米国特許（ＵＳ−Ａ）
第４８２９１０１号明細書、カナダ国特許（ＣＡ−Ａ）
第１２１２０５８号明細書参照）。これらの一連の基に
は例えば重合体結合クロル−ｓ−トリアジニル基が所属
し、これは特にセルロースに結合された状態で蛋白質を
直接連結するのに利用される（Ｂ．Ｐ．Ｓｕｒｉｎｅｖ
その他、“Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ”３１、３８７（１９
６６）；Ｇ．Ｋａｙその他“Ｎａｔｕｒｅ”、２１６
（１９６７）、５１４；“Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ”、１９８（１９７０）、２７６参
照）。
まで特に天然産の（変更された）多糖類、蛋白質及び活
性炭、並びに合成重合体例えばポリスチロール、ポリ
（メタ）アクリレート、ポリアクリルアミド、無水マレ
イン酸−重合体、ビニル−及びアリル重合体及びポリア
ミドが使用されてきた。無機支持体としては鉱物、特に
粘度物質、ケイソウ土及び滑石、並びに合成物質例えば
ガラス、金属酸化物及び金属が使用される。この固定処
理の可能な様式のうち共有結合による固定は、固定すべ
き生物学的に活性の物質（主として蛋白質）の活性決定
構造に最も早く作用する。支持体物質は通常それ自体
は、これを蛋白質の活性基（特にアミノ基、ヒドロキシ
基又はフェノール基、アミド基、チオール基、カルボキ
シル基）に連結させる反応基を有さず、従って活性化し
なければならない。支持体物質を活性化するには、生物
学的に活性な蛋白質の遊離アミノ基、フェノール基及び
／又はチオール基をアルキル化又はアリール化させる多
くの反応基が使用される（前記の“Ｕｌｌｍａｎｎ′ｓ
Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｅ”、米国特許（ＵＳ−Ａ）
第４８２９１０１号明細書、カナダ国特許（ＣＡ−Ａ）
第１２１２０５８号明細書参照）。これらの一連の基に
は例えば重合体結合クロル−ｓ−トリアジニル基が所属
し、これは特にセルロースに結合された状態で蛋白質を
直接連結するのに利用される（Ｂ．Ｐ．Ｓｕｒｉｎｅｖ
その他、“Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ”３１、３８７（１９
６６）；Ｇ．Ｋａｙその他“Ｎａｔｕｒｅ”、２１６
（１９６７）、５１４；“Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ”、１９８（１９７０）、２７６参
照）。
【０００４】市販されてもいる支持体系は、アクリルア
ミド又はメタクリルアミド及びグリシジルアクリレート
又は−メタクリレート及び／又はアリルグリシジルエー
テルからなる網状化共重合体（これは有利にはパール状
の顆粒からなる）である。この種のマトリックス重合体
は西ドイツ国特許（ＤＥ−Ｃ）第２７２２７５１号明細
書、米国特許（ＵＳ−Ａ）第４１９０７１３号及び同第
４５１１６９４号明細書に記載されている。この支持体
系のエポキシ官能基は蛋白質表面の求核基と直接縮合し
得るが、二官能性試薬としてのジカルボン酸ビスヒドラ
ジドによっても結合することができる（英国特許（ＧＢ
−Ａ）第２２１２５００号明細書）。
ミド又はメタクリルアミド及びグリシジルアクリレート
又は−メタクリレート及び／又はアリルグリシジルエー
テルからなる網状化共重合体（これは有利にはパール状
の顆粒からなる）である。この種のマトリックス重合体
は西ドイツ国特許（ＤＥ−Ｃ）第２７２２７５１号明細
書、米国特許（ＵＳ−Ａ）第４１９０７１３号及び同第
４５１１６９４号明細書に記載されている。この支持体
系のエポキシ官能基は蛋白質表面の求核基と直接縮合し
得るが、二官能性試薬としてのジカルボン酸ビスヒドラ
ジドによっても結合することができる（英国特許（ＧＢ
−Ａ）第２２１２５００号明細書）。
【０００５】更に半透膜−マトリックス物質は生物学的
に有用な蛋白質、特に免疫的に重要な蛋白質又は酵素の
支持体として実地において極めて有用である。
に有用な蛋白質、特に免疫的に重要な蛋白質又は酵素の
支持体として実地において極めて有用である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は固体支持体物
質、特に先に記載したタイプのものの使用特性を改良す
ることを根本課題とする。従って基本的に新規の支持体
を使用することではなく、現存する構造を変更すること
によってその結合能及び結合特性を改良することにあ
る。
質、特に先に記載したタイプのものの使用特性を改良す
ることを根本課題とする。従って基本的に新規の支持体
を使用することではなく、現存する構造を変更すること
によってその結合能及び結合特性を改良することにあ
る。
【０００７】この課題は（メタ）アクリルアミド及びグ
リシジル（メタ）アクリレートからなる支持体重合体並
びに半透膜−マトリックス重合体の例で詳述することが
できる。（メタ）アクリルアミド及びジグリシジル（メ
タ）アクリレート又はアリルグリシジルエーテルからな
る上記網状化共重合体は、生化学での種々の分離−及び
精製操作用の有用な支持体系であることが指摘されてい
る（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ａｎｇａｌ共
著、“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ”、２６１〜２６９頁、Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒ
ｅｓｓ、１９８９参照）。
リシジル（メタ）アクリレートからなる支持体重合体並
びに半透膜−マトリックス重合体の例で詳述することが
できる。（メタ）アクリルアミド及びジグリシジル（メ
タ）アクリレート又はアリルグリシジルエーテルからな
る上記網状化共重合体は、生化学での種々の分離−及び
精製操作用の有用な支持体系であることが指摘されてい
る（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ａｎｇａｌ共
著、“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ”、２６１〜２６９頁、Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒ
ｅｓｓ、１９８９参照）。
【０００８】この支持体の優れた使用特性に関しては、
その支持体骨格に基づくその効率を更に改良することが
望まれる。このことから例えば上記改良の代りに反応条
件下における安定性の低下又は感応性の増大という他の
欠点を甘受することなく、支持体系への生物学的に有用
な蛋白質の結合速度を高めるという課題が生じた。
その支持体骨格に基づくその効率を更に改良することが
望まれる。このことから例えば上記改良の代りに反応条
件下における安定性の低下又は感応性の増大という他の
欠点を甘受することなく、支持体系への生物学的に有用
な蛋白質の結合速度を高めるという課題が生じた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】ところでこの設定課題は
本発明により変更された固体支持体によって有利な方法
で解決し得ることが判明した。本発明は生物学的に有用
な物質、特に蛋白質を固定するのに少なくとも十分な数
の、式Ｉ：
本発明により変更された固体支持体によって有利な方法
で解決し得ることが判明した。本発明は生物学的に有用
な物質、特に蛋白質を固定するのに少なくとも十分な数
の、式Ｉ：
【００１０】
【化７】
【００１１】［式中Ａはスペーサ基を表し、ＸはＯ、Ｓ
又は−ＮＨを表し、ｎは０又は１を表す］で示される官
能基を、支持体物質に共有結合的に結合された状態で含
む、変更された固体支持体Ｔに関する。Ａがスペーサ基
として式Ｉ中に含まれる場合、これは少なくとも２員環
〜６員環のアルキレン基又はアリーレン基であり、固体
支持体それ自体の成分であるか又は後に固体支持体に結
合されたものであってもよい。この結合は例えばアルキ
ル化、エステル化、アミド形成又はエーテル化によって
行うことができる（Ｈ．Ｊ．Ｒｅｈｍ及びＧ．Ｒｅｅｄ
著、“Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、第７ａ
巻、第７章、３４７〜３８４頁、ＶＣＨ１９８７参
照）。
又は−ＮＨを表し、ｎは０又は１を表す］で示される官
能基を、支持体物質に共有結合的に結合された状態で含
む、変更された固体支持体Ｔに関する。Ａがスペーサ基
として式Ｉ中に含まれる場合、これは少なくとも２員環
〜６員環のアルキレン基又はアリーレン基であり、固体
支持体それ自体の成分であるか又は後に固体支持体に結
合されたものであってもよい。この結合は例えばアルキ
ル化、エステル化、アミド形成又はエーテル化によって
行うことができる（Ｈ．Ｊ．Ｒｅｈｍ及びＧ．Ｒｅｅｄ
著、“Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、第７ａ
巻、第７章、３４７〜３８４頁、ＶＣＨ１９８７参
照）。
【００１２】Ａは、
【００１３】
【化８】
【００１４】を表しまたＸはＮＨを表すことが特に有利
である。
である。
【００１５】変更された固体支持体は一般に、求核反応
基−ＸＭ（Ｘは式Ｉで記載したものを表し、Ｍは水素を
表すか又はＸがＯ又はＳである場合には金属カチオン、
特にアルカリカチオン、有利にはナトリウム又はカリウ
ムをも表す）を十分に含む公知の支持体物質Ｔ′から出
発して、十分量の２，４，６−トリクロル−ｓ−トリア
ジンと反応させ、次いでトリアジンの塩素基をアミノ基
によって置換し、こうして得られた２個所でアミン置換
されたトリアジン基を２，４，６−トリクロル−ｓ−ト
リアジンと新たに反応させることよりなる少なくとも３
工程の反応で製造される。更に本発明により変更された
固体支持体Ｔはグリシジル基を含む支持体物質Ｔ′から
製造することもできる。この特に有利な実施形式は、官
能基として式ＩＩ：
基−ＸＭ（Ｘは式Ｉで記載したものを表し、Ｍは水素を
表すか又はＸがＯ又はＳである場合には金属カチオン、
特にアルカリカチオン、有利にはナトリウム又はカリウ
ムをも表す）を十分に含む公知の支持体物質Ｔ′から出
発して、十分量の２，４，６−トリクロル−ｓ−トリア
ジンと反応させ、次いでトリアジンの塩素基をアミノ基
によって置換し、こうして得られた２個所でアミン置換
されたトリアジン基を２，４，６−トリクロル−ｓ−ト
リアジンと新たに反応させることよりなる少なくとも３
工程の反応で製造される。更に本発明により変更された
固体支持体Ｔはグリシジル基を含む支持体物質Ｔ′から
製造することもできる。この特に有利な実施形式は、官
能基として式ＩＩ：
【００１６】
【化９】
【００１７】のグリシジル基を多数有する支持体物質
Ｔ′から出発して、第１工程でこの支持体物質Ｔ′をア
ンモニアと反応させて、式ＩＩのグリシジル基を式ＩＩ
Ｉ：
Ｔ′から出発して、第１工程でこの支持体物質Ｔ′をア
ンモニアと反応させて、式ＩＩのグリシジル基を式ＩＩ
Ｉ：
【００１８】
【化１０】
【００１９】のα−ヒドロキシ−β−アミノ基に変え
（化合物Ｔ′−ＩＩＩ）、第２工程で式ＩＩＩのα−ヒ
ドロキシ−β−アミノ基をＨＣｌの脱離下に２，４，６
−トリクロル−ｓ−トリアジンと反応させて、式ＩＶ：
（化合物Ｔ′−ＩＩＩ）、第２工程で式ＩＩＩのα−ヒ
ドロキシ−β−アミノ基をＨＣｌの脱離下に２，４，６
−トリクロル−ｓ−トリアジンと反応させて、式ＩＶ：
【００２０】
【化１１】
【００２１】のＮ−トリアジニル置換基にし（化合物
Ｔ′−ＩＶ）、これを第３工程でアンモニアで処理する
ことによって式Ｖ：
Ｔ′−ＩＶ）、これを第３工程でアンモニアで処理する
ことによって式Ｖ：
【００２２】
【化１２】
【００２３】のアミン置換基にし（化合物Ｔ′−Ｖ）、
これを２，４，６−トリクロル−ｓ−トリアジンの少な
くとも２当量と反応させて式Ｉの基に変えることよりな
る、官能基含有固体支持体Ｔの製法である。
これを２，４，６−トリクロル−ｓ−トリアジンの少な
くとも２当量と反応させて式Ｉの基に変えることよりな
る、官能基含有固体支持体Ｔの製法である。
【００２４】特に有利なのは前記の方法工程により得ら
れかつその製造に際してマトリックス重合体として有利
にはパール状の、メタクリルアミド／アクリルアミド及
びグリシジルアクリレート／−メタクリレートからなる
上記網状化共重合体から出発した、変更された固体支持
体Ｔ−（Ｉ）である。この場合網状化可能のモノマーと
してはＮ，Ｎ−メチレン−ビス−メタクリルアミドを使
用するのが有利である。 マトリックス重合体の構造は
次の式Ｔ′−（ＩＩ）によって略示することができる
（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ａｎｇａｌの前記
文献、２６１〜２６２頁参照）。
れかつその製造に際してマトリックス重合体として有利
にはパール状の、メタクリルアミド／アクリルアミド及
びグリシジルアクリレート／−メタクリレートからなる
上記網状化共重合体から出発した、変更された固体支持
体Ｔ−（Ｉ）である。この場合網状化可能のモノマーと
してはＮ，Ｎ−メチレン−ビス−メタクリルアミドを使
用するのが有利である。 マトリックス重合体の構造は
次の式Ｔ′−（ＩＩ）によって略示することができる
（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ａｎｇａｌの前記
文献、２６１〜２６２頁参照）。
【００２５】
【化１３】
【００２６】この種のマトリックス重合体は西ドイツ国
特許（ＤＥ−Ｃ）第２７２２７５１号明細書又は米国特
許（ＵＳ−Ａ）第４１９０７１３号並びに同第４５１１
６９４号明細書に記載されている。これらのパール状物
は一般に直径５〜１０００μｍ、特に３０〜１０００μ
ｍであり、内径（中空パール）を有する。アンモニアと
反応可能の、マトリックス重合体中のグリシジル基の含
有量は、無水の支持体物質１ｍｇ当り０．８〜２．５μ
モルである。上記タイプのマトリックス重合体の代表的
な、市販マトリックス重合体［オイペルギットＣ（ＥＵ
ＰＥＲＧＩＴＣ）登録商標、以後省略）、Ｒｏｅｈｍ
ＧｍｂＨ社製］の他の特性データは次表から読み取るこ
とができる： 特性データ 特性値 平均粒径 １４０〜１８０μｍ 間隙直径 ４０ｎｍ 排除限界＝ＭLIM ２．１０5ドルトン 結合活性表面 １８０ｍ2／ｇ（乾燥） エポキシ含有量 ８００〜１０００μモル（乾燥） 吸水量 ２．３ｍｌ／ｇ（乾燥） 密度＝ｄ4 20 １．２０ かさ密度 ０．３４ｇ／ｍｌ 結合力（通常の条件で）：ヒトアルブミン ４８ｍｇ／ｇ（湿気） ヒトＩｇＧ ３４ｍｇ／ｇ（湿気） 水に対する膨張特性 １：１．４ １ｍｌ（乾燥）は１．４ｍｌ（湿気）になる 溶解性（水、緩衝液及び有機溶剤への） 不溶性 耐圧性 ３００バール 電子顕微鏡で、直径０．１〜２．５μｍ（１０００〜２
５０００Å）の、溝及び中空室を有するパール状物の多
孔質組織が認められ、これは１０〜１００Åの大きさの
酵素−又は基質分子がこの多孔質マトリックスの全内部
に達し得る大きさである。
特許（ＤＥ−Ｃ）第２７２２７５１号明細書又は米国特
許（ＵＳ−Ａ）第４１９０７１３号並びに同第４５１１
６９４号明細書に記載されている。これらのパール状物
は一般に直径５〜１０００μｍ、特に３０〜１０００μ
ｍであり、内径（中空パール）を有する。アンモニアと
反応可能の、マトリックス重合体中のグリシジル基の含
有量は、無水の支持体物質１ｍｇ当り０．８〜２．５μ
モルである。上記タイプのマトリックス重合体の代表的
な、市販マトリックス重合体［オイペルギットＣ（ＥＵ
ＰＥＲＧＩＴＣ）登録商標、以後省略）、Ｒｏｅｈｍ
ＧｍｂＨ社製］の他の特性データは次表から読み取るこ
とができる： 特性データ 特性値 平均粒径 １４０〜１８０μｍ 間隙直径 ４０ｎｍ 排除限界＝ＭLIM ２．１０5ドルトン 結合活性表面 １８０ｍ2／ｇ（乾燥） エポキシ含有量 ８００〜１０００μモル（乾燥） 吸水量 ２．３ｍｌ／ｇ（乾燥） 密度＝ｄ4 20 １．２０ かさ密度 ０．３４ｇ／ｍｌ 結合力（通常の条件で）：ヒトアルブミン ４８ｍｇ／ｇ（湿気） ヒトＩｇＧ ３４ｍｇ／ｇ（湿気） 水に対する膨張特性 １：１．４ １ｍｌ（乾燥）は１．４ｍｌ（湿気）になる 溶解性（水、緩衝液及び有機溶剤への） 不溶性 耐圧性 ３００バール 電子顕微鏡で、直径０．１〜２．５μｍ（１０００〜２
５０００Å）の、溝及び中空室を有するパール状物の多
孔質組織が認められ、これは１０〜１００Åの大きさの
酵素−又は基質分子がこの多孔質マトリックスの全内部
に達し得る大きさである。
【００２７】上記の特異化マトリックス重合体の代り
に、基本的には式Ｔ′−（ＩＩ）におけると同じ化学構
造で間隙の大きさの平均が３０〜８０μｍのものを使用
することもできる。この生成物は商品名オイペルギット
Ｃ３０Ｎで市販されている。更に基本的に同じ化学構造
を有するが、間隙の大きさが２００〜２５０μｍのマト
リックス重合体（これは商品名オイペルギットＣ２５０
Ｌで市販されている）も適当である。他の使用可能のマ
トリックス重合体は基本的には式Ｔ′−（ＩＩ）におけ
ると同じ化学組成を有するが、緊密性である。すなわち
実際に間隙を有さない。平均粒径が約０．６〜１．４μ
ｍの生成物は商品名オイペルギットＣ１Ｚで市販されて
いる。上記の市販生成物に対する他の特性等は文献に示
されている。更に大表面系（カナダ国特許（ＣＡ−Ａ）
第１２１２０５８号明細書）及び核電子殻−ラテックス
（米国特許（ＵＳ−Ａ）第４８２９１０１号明細書）も
出発物質として使用することができる。
に、基本的には式Ｔ′−（ＩＩ）におけると同じ化学構
造で間隙の大きさの平均が３０〜８０μｍのものを使用
することもできる。この生成物は商品名オイペルギット
Ｃ３０Ｎで市販されている。更に基本的に同じ化学構造
を有するが、間隙の大きさが２００〜２５０μｍのマト
リックス重合体（これは商品名オイペルギットＣ２５０
Ｌで市販されている）も適当である。他の使用可能のマ
トリックス重合体は基本的には式Ｔ′−（ＩＩ）におけ
ると同じ化学組成を有するが、緊密性である。すなわち
実際に間隙を有さない。平均粒径が約０．６〜１．４μ
ｍの生成物は商品名オイペルギットＣ１Ｚで市販されて
いる。上記の市販生成物に対する他の特性等は文献に示
されている。更に大表面系（カナダ国特許（ＣＡ−Ａ）
第１２１２０５８号明細書）及び核電子殻−ラテックス
（米国特許（ＵＳ−Ａ）第４８２９１０１号明細書）も
出発物質として使用することができる。
【００２８】すでに記載したように他のタイプのマトリ
ックス物質も、特に出発物質中に式ＩＩのグリシジル基
が存在するとう前提を満たす限り、変更された固体支持
体Ｔを製造するための出発物質として適している。これ
には例えばセルロース、アガロース、セファロースのよ
うな多糖類が属する。
ックス物質も、特に出発物質中に式ＩＩのグリシジル基
が存在するとう前提を満たす限り、変更された固体支持
体Ｔを製造するための出発物質として適している。これ
には例えばセルロース、アガロース、セファロースのよ
うな多糖類が属する。
【００２９】グリシジル−（＝エポキシ）−基ＩＩは例
えば１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタ
ンとの反応を介して多糖類中に導入することもできる
（“Ｄｅｃｈｅｍａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ”、Ｎｏ．
１７２４〜１７３１、Ｖｏｌ．８４、“Ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＢ
ｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ”、Ｋ．Ｂｕｃｈｈｏｌｚ編
集、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ．１９７９、Ｐ．Ｖｒ
ｅｔｂｌａｄ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、４７（１９７４）
８６参照）。
えば１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタ
ンとの反応を介して多糖類中に導入することもできる
（“Ｄｅｃｈｅｍａ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ”、Ｎｏ．
１７２４〜１７３１、Ｖｏｌ．８４、“Ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＢ
ｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ”、Ｋ．Ｂｕｃｈｈｏｌｚ編
集、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ．１９７９、Ｐ．Ｖｒ
ｅｔｂｌａｄ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、４７（１９７４）
８６参照）。
【００３０】更にすでに記載したように、アミノ基を有
する半透膜を構成する支持体物質Ｔは特に有用である。
この種の半透膜は例えばアミノ基及びカルボキシル基を
同様に含んでいてよい。すなわち両性的に構成されてい
る。例えばこの種の半透膜−マトリックス物質はナイロ
ンＰＡ６６の形でヘキサンジアミン及びアジピン酸から
なる重縮合生成物であってよい。この重合体は式ＶＩ： ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）4−ＣＯ−［ＮＨ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−ＣＯ− （ＣＨ2）4−ＣＯ］m−ＮＨ−（ＣＨ2）6−ＮＨ2 （ＶＩ） で表され、この場合ｍは８０〜１００である。これをベ
ースとする適当な半透膜物質は例えばバイオダインＡ
（ＢＩＯＤＹＮＥ Ａ登録商標、以後省略、Ｆａ．ＰＡ
ＬＬ社製、Ｂｉｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＵＫ在）（両性ナイロン６
６）の名で市販されている。
する半透膜を構成する支持体物質Ｔは特に有用である。
この種の半透膜は例えばアミノ基及びカルボキシル基を
同様に含んでいてよい。すなわち両性的に構成されてい
る。例えばこの種の半透膜−マトリックス物質はナイロ
ンＰＡ６６の形でヘキサンジアミン及びアジピン酸から
なる重縮合生成物であってよい。この重合体は式ＶＩ： ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）4−ＣＯ−［ＮＨ−（ＣＨ2）6−ＮＨ−ＣＯ− （ＣＨ2）4−ＣＯ］m−ＮＨ−（ＣＨ2）6−ＮＨ2 （ＶＩ） で表され、この場合ｍは８０〜１００である。これをベ
ースとする適当な半透膜物質は例えばバイオダインＡ
（ＢＩＯＤＹＮＥ Ａ登録商標、以後省略、Ｆａ．ＰＡ
ＬＬ社製、Ｂｉｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＵＫ在）（両性ナイロン６
６）の名で市販されている。
【００３１】生物学的に有用な蛋白質 これを共有結合的に固定するために本発明による固体支
持体Ｔを使用する生物学的に重要な蛋白質は、一般形で
すでに記載したように特徴づけられる（従来の技術の項
参照）。
持体Ｔを使用する生物学的に重要な蛋白質は、一般形で
すでに記載したように特徴づけられる（従来の技術の項
参照）。
【００３２】これは一般にＯＨ−及びＳＨ−基の他に求
核基、特に支持体Ｔの官能基（式Ｉ参照）と生物学的に
許容可能の条件下に反応するアミノ基を有する。酵素、
細胞、オルガネラ及び、免疫活性物質及び組織、特に抗
体のような生体触媒で挙げることができる。固定化生体
触媒は例えばアミノ酸、ペプチド及び酵素のような極め
て多種多様の基質、砂糖、有機酸、抗生物質、ステロイ
ド、ヌクレオシド及びヌクレオチド、脂質、テルペノイ
ド及び有機の基礎化学製品を生成又は変換するのに使用
することができる（前記文献“Ｕｌｌｍａｎｎ”、第５
版、第９Ａ巻、３８９〜３９０頁参照）。
核基、特に支持体Ｔの官能基（式Ｉ参照）と生物学的に
許容可能の条件下に反応するアミノ基を有する。酵素、
細胞、オルガネラ及び、免疫活性物質及び組織、特に抗
体のような生体触媒で挙げることができる。固定化生体
触媒は例えばアミノ酸、ペプチド及び酵素のような極め
て多種多様の基質、砂糖、有機酸、抗生物質、ステロイ
ド、ヌクレオシド及びヌクレオチド、脂質、テルペノイ
ド及び有機の基礎化学製品を生成又は変換するのに使用
することができる（前記文献“Ｕｌｌｍａｎｎ”、第５
版、第９Ａ巻、３８９〜３９０頁参照）。
【００３３】免疫活性組織としては例えば微生物例えば
グラム陽性菌及びグラム陰性菌、スピロヘータ、ミコプ
ラズマ、ミコバクテリア、ビブリオ、放線菌、原生動物
例えば腸原生動物、アメーバ、鞭毛藻類、胞子虫類、腸
線虫及び組織線虫（蠕虫）、吸虫類（住血吸虫、ヒ
ル）、条虫、トキソプラズマ、並びに真菌類例えばスポ
ロトリカム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、キプトコカ
ス（Ｃｙｐｔｏｃｏｅｃｕｓ）、分芽菌（Ｂｌａｓｔｏ
ｍｙｃｅｓ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍ
ａ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅ
ｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ウイルス及びリケ
ッチア、例えばイヌウイルス性肝炎（ＨｕｎｄｅＨｅｐ
ａｔｉｔｉｓ）、ショープ乳頭腫（Ｓｈｏｐｅ−Ｐａｐ
ｉｌｌｏｍｅ）、インフルエンザＡ＋Ｂ、鶏黒死病（Ｈ
ｕｅｈｎｅｒ−ｐｅｓｔ）、単純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ−
Ｓｉｍｐｌｅｘ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒ
ｅｎ）、ポリアン（Ｐｏｌｙａｎｅ）、ラウス家鶏肉腫
（Ｒｏｕｓ−Ｓａｒｋｏｍ）、接種痘（Ｉｍｐｔｐｏｃ
ｋｅｎ）、灰白炎ウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、
麻疹（Ｍａｓｅｒｎ）、ジステンパー、白血病、流行性
耳下腺炎、ニューキャッスル病、センダイ（Ｓｅｎｄａ
ｉ）、ＥＣＨＯ、口蹄病、鸚鵡病、狂犬病、エクストロ
メリア（Ｅｘｔｒｏｍｅｌｉａ）、バウムウイルス（Ｂ
ａｕｍｖｉｒｅｎ）、他の組織抗原、酵素、例えば膵臓
−キモトリプシノゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、
ブドウ糖酸化酵素、乳酸脱水素酵素、尿酸分解酵素、ア
ミノ酸酸化酵素、ウレアーゼ、アスパラギナーゼ、プロ
テアーゼ、血球−抗原、血液型物質及び他の同種抗原、
例えば血小板、白血球、血漿−蛋白質、抗体、自己抗体
が挙げられる。細菌又はウイルス性の抗原、自己免疫抗
原、腫瘍抗原、組織抗原及びその他に向けられたモノク
ローナル抗体を特に挙げることができる。例えば“蛋白
質Ａ”の共有結合固定は特に重要である。
グラム陽性菌及びグラム陰性菌、スピロヘータ、ミコプ
ラズマ、ミコバクテリア、ビブリオ、放線菌、原生動物
例えば腸原生動物、アメーバ、鞭毛藻類、胞子虫類、腸
線虫及び組織線虫（蠕虫）、吸虫類（住血吸虫、ヒ
ル）、条虫、トキソプラズマ、並びに真菌類例えばスポ
ロトリカム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、キプトコカ
ス（Ｃｙｐｔｏｃｏｅｃｕｓ）、分芽菌（Ｂｌａｓｔｏ
ｍｙｃｅｓ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍ
ａ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅ
ｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ウイルス及びリケ
ッチア、例えばイヌウイルス性肝炎（ＨｕｎｄｅＨｅｐ
ａｔｉｔｉｓ）、ショープ乳頭腫（Ｓｈｏｐｅ−Ｐａｐ
ｉｌｌｏｍｅ）、インフルエンザＡ＋Ｂ、鶏黒死病（Ｈ
ｕｅｈｎｅｒ−ｐｅｓｔ）、単純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ−
Ｓｉｍｐｌｅｘ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒ
ｅｎ）、ポリアン（Ｐｏｌｙａｎｅ）、ラウス家鶏肉腫
（Ｒｏｕｓ−Ｓａｒｋｏｍ）、接種痘（Ｉｍｐｔｐｏｃ
ｋｅｎ）、灰白炎ウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、
麻疹（Ｍａｓｅｒｎ）、ジステンパー、白血病、流行性
耳下腺炎、ニューキャッスル病、センダイ（Ｓｅｎｄａ
ｉ）、ＥＣＨＯ、口蹄病、鸚鵡病、狂犬病、エクストロ
メリア（Ｅｘｔｒｏｍｅｌｉａ）、バウムウイルス（Ｂ
ａｕｍｖｉｒｅｎ）、他の組織抗原、酵素、例えば膵臓
−キモトリプシノゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、
ブドウ糖酸化酵素、乳酸脱水素酵素、尿酸分解酵素、ア
ミノ酸酸化酵素、ウレアーゼ、アスパラギナーゼ、プロ
テアーゼ、血球−抗原、血液型物質及び他の同種抗原、
例えば血小板、白血球、血漿−蛋白質、抗体、自己抗体
が挙げられる。細菌又はウイルス性の抗原、自己免疫抗
原、腫瘍抗原、組織抗原及びその他に向けられたモノク
ローナル抗体を特に挙げることができる。例えば“蛋白
質Ａ”の共有結合固定は特に重要である。
【００３４】“蛋白質Ａ”とは例えば黄色ブドウ球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から
生じた、免疫グロブリンＧを結合させる細胞壁蛋白質を
意味する（“ＰｒｏｔｅｉｎＡ ｆｒｏｍ Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ．Ｉｔｓ ｉｓｏｌａ
ｔｉｏｎ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ａｓ ａ ｉ
ｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”、Ｈｊｅ
ｌｍ Ｈ．その他の論文、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８、
７３−７６（１９７２）参照）。
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から
生じた、免疫グロブリンＧを結合させる細胞壁蛋白質を
意味する（“ＰｒｏｔｅｉｎＡ ｆｒｏｍ Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ．Ｉｔｓ ｉｓｏｌａ
ｔｉｏｎ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ａｓ ａ ｉ
ｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”、Ｈｊｅ
ｌｍ Ｈ．その他の論文、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８、
７３−７６（１９７２）参照）。
【００３５】更に被固定化蛋白質として特に蛋白質Ｇ、
蛋白質Ａ／Ｇ、トリプシン−障害剤、抗ＩｇＧ、モノク
ローナル及びポリクローナル抗体、並びに酵素ペプシン
及びパパインが挙げられる。
蛋白質Ａ／Ｇ、トリプシン−障害剤、抗ＩｇＧ、モノク
ローナル及びポリクローナル抗体、並びに酵素ペプシン
及びパパインが挙げられる。
【００３６】変更された支持体Ｔの製造 変更された固体支持体Ｔの製造を支持体Ｔ′−（Ｉ）の
例で詳述する：官能基として先に記載した式ＩＩのグリ
シジル基を多数有する固体支持体物質Ｔ′、特にタイプ
Ｔ′−（ＩＩ）のもの（オイペルギットＣ）を適当な容
器に配置する。これに室温でアンモニア、例えば１モル
の水性アンモニアを例えば、乾燥マトリックス物質Ｔ′
−（ＩＩ）１ｇに対し水性アンモニア４ｍｌであるよう
な量で加える。有利には１日を越える日時にわたって、
基準としては約７２時間、有利には軽く振動させながら
作用させ、ゲルを蒸溜水で洗浄する。残りのエポキシ基
を飽和するためメルカプトエタノールで処理することは
有利な手段である。数時間、有利には１夜（約１２時
間）にわたって軽く振動させながら室温で定温保持す
る。その後ゲルを蒸溜水で洗浄し、フリット上で例えば
アセトンを用いて洗浄しながら乾燥する。ゲルを乾燥棚
中で有利には３５〜４５℃で完全に乾燥させる［官能基
は式ＩＩＩに相当する＝式Ｔ′−（ＩＩＩ）の化合
物］。適当な容器内で、こうして得られた乾燥マトリッ
クス重合体に不活性アルカリ緩衝液例えばｐＨ１０．８
の炭酸ナトリウム緩衝液（“ＮＣ−緩衝液”）を、マト
リックス重合体１ｇ当り緩衝液約１０ｍｌの量で加え、
これに緩かに撹拌させながら室温で適当な乾燥不活性溶
剤例えばアセトン中の２，４，６−トリクロル−ｓ−ト
リアジン（“トリクロルトリアジン”）を、有利にはア
ミン置換マトリックス重合体［＝式Ｔ′−（ＩＩＩ）］
１ｇに対し溶剤約２ｍｌ中のトリクロルトリアジン約
０．１５ｇに該当する量で滴下する。数分間、例えば約
１０分間室温で有利には軽く振動させながら定温保持
し、ｐＨ値を０．１ＭのＮＣ−緩衝液でｐＨ１０．８に
調整する。次いで生成物をガラス柱（フリットを有す
る）上で不活性溶剤例えば５０％水性アセトンを用いて
洗浄し、有利には乾燥吸収する［＝生成物Ｔ′−（Ｉ
Ｖ）］。この生成物に適当な容器内で２５％水性アンモ
ニアを、有利には乾燥したアミン置換マトリックス重合
体１ｇに対して水性アンモニア１０ｍｌに相当する量で
加え、一定時間例えば３０分間高めた温度例えば５５〜
６５℃、有利には約６０℃で軽く振動させながら定温保
持する。その後水で、有利には数回に分けて合計１００
ｍｌの水で、引続きアセトン（約５ｍｌ）で洗浄し、生
じたゲル（その官能基は式Ｖに相当する）を乾燥吸収す
る。乾燥したゲルに０．１ＭのＮＣ−緩衝液を例えば１
０ｍｌ加え、引続きトリクロルトリアジンをアセトン溶
液として、元のアミン置換マトリックス重合体［＝式
Ｔ′−（ＩＩＩ）］１ｇ当り有利にはアセトン約２ｍｌ
中のトリクロルトリアジン０．３ｇに相当する量で徐々
に（約２分間）滴下する。短時間有利には約８分間室温
で軽く振動させながら定温保持し、引続きｐＨ値をＮＣ
−緩衝液を用いてｐＨ１０．８に調整する。生じたゲル
を５０％（容量）水性アセトン有利には約１００ｍｌで
洗浄し、乾燥吸収し、凍結乾燥する。式Ｉの官能基を有
する、こうして得られたマトリックス重合体［＝マトリ
ックス重合体Ｔ′−（Ｉ）］をそのまま乾燥貯蔵、場合
によっては更に冷却下に保存するか又は直接使用するこ
とができる。
例で詳述する：官能基として先に記載した式ＩＩのグリ
シジル基を多数有する固体支持体物質Ｔ′、特にタイプ
Ｔ′−（ＩＩ）のもの（オイペルギットＣ）を適当な容
器に配置する。これに室温でアンモニア、例えば１モル
の水性アンモニアを例えば、乾燥マトリックス物質Ｔ′
−（ＩＩ）１ｇに対し水性アンモニア４ｍｌであるよう
な量で加える。有利には１日を越える日時にわたって、
基準としては約７２時間、有利には軽く振動させながら
作用させ、ゲルを蒸溜水で洗浄する。残りのエポキシ基
を飽和するためメルカプトエタノールで処理することは
有利な手段である。数時間、有利には１夜（約１２時
間）にわたって軽く振動させながら室温で定温保持す
る。その後ゲルを蒸溜水で洗浄し、フリット上で例えば
アセトンを用いて洗浄しながら乾燥する。ゲルを乾燥棚
中で有利には３５〜４５℃で完全に乾燥させる［官能基
は式ＩＩＩに相当する＝式Ｔ′−（ＩＩＩ）の化合
物］。適当な容器内で、こうして得られた乾燥マトリッ
クス重合体に不活性アルカリ緩衝液例えばｐＨ１０．８
の炭酸ナトリウム緩衝液（“ＮＣ−緩衝液”）を、マト
リックス重合体１ｇ当り緩衝液約１０ｍｌの量で加え、
これに緩かに撹拌させながら室温で適当な乾燥不活性溶
剤例えばアセトン中の２，４，６−トリクロル−ｓ−ト
リアジン（“トリクロルトリアジン”）を、有利にはア
ミン置換マトリックス重合体［＝式Ｔ′−（ＩＩＩ）］
１ｇに対し溶剤約２ｍｌ中のトリクロルトリアジン約
０．１５ｇに該当する量で滴下する。数分間、例えば約
１０分間室温で有利には軽く振動させながら定温保持
し、ｐＨ値を０．１ＭのＮＣ−緩衝液でｐＨ１０．８に
調整する。次いで生成物をガラス柱（フリットを有す
る）上で不活性溶剤例えば５０％水性アセトンを用いて
洗浄し、有利には乾燥吸収する［＝生成物Ｔ′−（Ｉ
Ｖ）］。この生成物に適当な容器内で２５％水性アンモ
ニアを、有利には乾燥したアミン置換マトリックス重合
体１ｇに対して水性アンモニア１０ｍｌに相当する量で
加え、一定時間例えば３０分間高めた温度例えば５５〜
６５℃、有利には約６０℃で軽く振動させながら定温保
持する。その後水で、有利には数回に分けて合計１００
ｍｌの水で、引続きアセトン（約５ｍｌ）で洗浄し、生
じたゲル（その官能基は式Ｖに相当する）を乾燥吸収す
る。乾燥したゲルに０．１ＭのＮＣ−緩衝液を例えば１
０ｍｌ加え、引続きトリクロルトリアジンをアセトン溶
液として、元のアミン置換マトリックス重合体［＝式
Ｔ′−（ＩＩＩ）］１ｇ当り有利にはアセトン約２ｍｌ
中のトリクロルトリアジン０．３ｇに相当する量で徐々
に（約２分間）滴下する。短時間有利には約８分間室温
で軽く振動させながら定温保持し、引続きｐＨ値をＮＣ
−緩衝液を用いてｐＨ１０．８に調整する。生じたゲル
を５０％（容量）水性アセトン有利には約１００ｍｌで
洗浄し、乾燥吸収し、凍結乾燥する。式Ｉの官能基を有
する、こうして得られたマトリックス重合体［＝マトリ
ックス重合体Ｔ′−（Ｉ）］をそのまま乾燥貯蔵、場合
によっては更に冷却下に保存するか又は直接使用するこ
とができる。
【００３７】基−ＸＭ（前記の定義参照）、特にアミノ
基を有する半透膜物質を支持体物質Ｔ′として使用した
場合、例えば次のように処置することができる。半透膜
物質を準備し、２，４，６−トリクロル−ｓ−トリアジ
ンを有利には適当な不活性溶剤例えばニトロメタンに溶
解させて滴下する。次いで有利には比較的短い時間、約
１０分間室温で、軽く振動させながら定温保持する。そ
の後例えばニトロメタンのような溶剤で洗浄し、半透膜
物質を例えば空気中で乾燥する。乾燥した反応生成物に
アンモニアを例えば２５％水性アンモニアの形で加え、
有利には高めた温度例えば６０℃で３０分間、軽く振動
させながら定温保持する。引続き水で洗浄し、新たに乾
燥する。次いで新たに十分な量の２，４，６−トリクロ
ル−ｓ−トリアジンを有利には溶剤に溶かした状態で、
徐々に滴下することによって加える。更に短時間例えば
８分間にわたって室温で軽く振動させながら定温保持す
る。次いで溶剤で後洗浄する。有利には引続きこの変更
支持体物質を空気中で乾燥し、その後凍結乾燥する。
基を有する半透膜物質を支持体物質Ｔ′として使用した
場合、例えば次のように処置することができる。半透膜
物質を準備し、２，４，６−トリクロル−ｓ−トリアジ
ンを有利には適当な不活性溶剤例えばニトロメタンに溶
解させて滴下する。次いで有利には比較的短い時間、約
１０分間室温で、軽く振動させながら定温保持する。そ
の後例えばニトロメタンのような溶剤で洗浄し、半透膜
物質を例えば空気中で乾燥する。乾燥した反応生成物に
アンモニアを例えば２５％水性アンモニアの形で加え、
有利には高めた温度例えば６０℃で３０分間、軽く振動
させながら定温保持する。引続き水で洗浄し、新たに乾
燥する。次いで新たに十分な量の２，４，６−トリクロ
ル−ｓ−トリアジンを有利には溶剤に溶かした状態で、
徐々に滴下することによって加える。更に短時間例えば
８分間にわたって室温で軽く振動させながら定温保持す
る。次いで溶剤で後洗浄する。有利には引続きこの変更
支持体物質を空気中で乾燥し、その後凍結乾燥する。
【００３８】蛋白質の固定化 変更された固定支持体物質Ｔ、有利にはマトリックス重
合体Ｔ′−（Ｉ）を準備する。Ｔ′−（ＩＩ）タイプの
出発物質の式ＩＩ官能基の含有量（一般に公知）から、
最初のアプローチとして最終生成物Ｔ′−（Ｉ）におけ
る式Ｉの結合可能の単位の含有量を推測することができ
る。付加すべき量の基準として被固定化蛋白質５〜１０
ｍｇに対してＴ′−（Ｉ）０．２５ｇの割合が示され
る。支持体物質に適当な緩衝液を、有利には標準−燐酸
塩−緩衝液として燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を支持体ゲル
の容量の約半分の量で加える（ＰＢＳに関しては“Ｓｉ
ｇｍａ−Ｋａｔａｌｏｇ”を参照）。引続き被固定化蛋
白質を溶液又は懸濁液に加え、数時間例えば一夜、有利
には軽く振動させながら定温保持する。その後有利には
適当な緩衝液例えばＰＢＳで洗浄し、引続きｐＨ値８．
０のＰＢＳ−緩衝液に取ったエタノールアミン１０容量
％で飽和させ、軽く振動させながら数時間例えば４時間
室温で保持する。次いでエタノールアミンを完全に除去
するためゲルをＰＢＳで洗浄する。固定化蛋白質は４℃
でＰＢＳ中に、有利には適当な防腐剤例えばチメロザー
ル（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）（例えば０．０２重量％）
と共に保存することができる。
合体Ｔ′−（Ｉ）を準備する。Ｔ′−（ＩＩ）タイプの
出発物質の式ＩＩ官能基の含有量（一般に公知）から、
最初のアプローチとして最終生成物Ｔ′−（Ｉ）におけ
る式Ｉの結合可能の単位の含有量を推測することができ
る。付加すべき量の基準として被固定化蛋白質５〜１０
ｍｇに対してＴ′−（Ｉ）０．２５ｇの割合が示され
る。支持体物質に適当な緩衝液を、有利には標準−燐酸
塩−緩衝液として燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を支持体ゲル
の容量の約半分の量で加える（ＰＢＳに関しては“Ｓｉ
ｇｍａ−Ｋａｔａｌｏｇ”を参照）。引続き被固定化蛋
白質を溶液又は懸濁液に加え、数時間例えば一夜、有利
には軽く振動させながら定温保持する。その後有利には
適当な緩衝液例えばＰＢＳで洗浄し、引続きｐＨ値８．
０のＰＢＳ−緩衝液に取ったエタノールアミン１０容量
％で飽和させ、軽く振動させながら数時間例えば４時間
室温で保持する。次いでエタノールアミンを完全に除去
するためゲルをＰＢＳで洗浄する。固定化蛋白質は４℃
でＰＢＳ中に、有利には適当な防腐剤例えばチメロザー
ル（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）（例えば０．０２重量％）
と共に保存することができる。
【００３９】基本的には同様にして先に記載した変更さ
れた半透膜物質を蛋白質で負荷することできる。この場
合半透膜物質に標準−燐酸塩−緩衝液（ＰＢＳ）を加
え、蛋白質を付加する。有利には数時間例えば一夜室温
で軽く振動させながら定温保持する。次いでＰＢＳで洗
浄し、１０％エタノールアミン溶液（ｐＨ８．０）で飽
和させる。軽く振動させながら一定時間例えば４時間保
持した後、負荷された半透膜物質をＰＢＳで洗浄し、以
後の使用に供する。
れた半透膜物質を蛋白質で負荷することできる。この場
合半透膜物質に標準−燐酸塩−緩衝液（ＰＢＳ）を加
え、蛋白質を付加する。有利には数時間例えば一夜室温
で軽く振動させながら定温保持する。次いでＰＢＳで洗
浄し、１０％エタノールアミン溶液（ｐＨ８．０）で飽
和させる。軽く振動させながら一定時間例えば４時間保
持した後、負荷された半透膜物質をＰＢＳで洗浄し、以
後の使用に供する。
【００４０】優れた作用効果 式Ｉの官能基を含む変更された固体支持体Ｔ、特にＴ′
−（Ｉ）−１及びＴ′−（Ｉ）−２の優れた作用効果
は、当該支持体物質の共有結合可能の官能基例えば支持
体物質Ｔ′のエポキシ基の代りに、４個の反応性塩素原
子が使用される（これは常にすべての塩素原子が結合に
関与することを意味しない）という事実によって生じ
る。蛋白質に対する結合能はこれにより飛躍的に上昇
し、これは比較（第１表参照）により明らかである。出
発物質としては、基−ＸＭ又はこれに変換可能の基を含
む多くの支持体物質Ｔ′を使用することができる。
−（Ｉ）−１及びＴ′−（Ｉ）−２の優れた作用効果
は、当該支持体物質の共有結合可能の官能基例えば支持
体物質Ｔ′のエポキシ基の代りに、４個の反応性塩素原
子が使用される（これは常にすべての塩素原子が結合に
関与することを意味しない）という事実によって生じ
る。蛋白質に対する結合能はこれにより飛躍的に上昇
し、これは比較（第１表参照）により明らかである。出
発物質としては、基−ＸＭ又はこれに変換可能の基を含
む多くの支持体物質Ｔ′を使用することができる。
【００４１】
【実施例】次に各実施例により本発明を詳述する。
【００４２】例 １．エポキシ基含有支持体物質Ｔ′から出発 Ａ−１ 支持体物質Ｔ′−（ＩＩ）のアンモニアによる
Ｔ′−（ＩＩＩ）への変換 支持体物質Ｔ′−（ＩＩ）（オイペルギットＣ）１ｇを
準備し、１ＭのＮＨ4ＯＨ ４ｍｌを加え、室温で軽く
振動させながら７２時間定温保持し、ゲルを蒸溜水で洗
浄する。ゲルをｐＨ８．０の５％メルカプトエタノール
で飽和し、室温で軽く振動させながら一夜定温保持し、
ゲルバッチを蒸溜水で洗浄する。ゲルをフリット上でア
セトンを用いて乾燥し、ゲルを真空棚中で約４０℃で一
夜にわたり完全に乾燥する。
Ｔ′−（ＩＩＩ）への変換 支持体物質Ｔ′−（ＩＩ）（オイペルギットＣ）１ｇを
準備し、１ＭのＮＨ4ＯＨ ４ｍｌを加え、室温で軽く
振動させながら７２時間定温保持し、ゲルを蒸溜水で洗
浄する。ゲルをｐＨ８．０の５％メルカプトエタノール
で飽和し、室温で軽く振動させながら一夜定温保持し、
ゲルバッチを蒸溜水で洗浄する。ゲルをフリット上でア
セトンを用いて乾燥し、ゲルを真空棚中で約４０℃で一
夜にわたり完全に乾燥する。
【００４３】Ｂ 支持体物質Ｔ′−（ＩＩＩ）のＴ′−
（Ｉ）への変換 Ａ−１からの支持体物質Ｔ′−（ＩＩＩ）１ｇに、ｐＨ
１０．８の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ＮＣ）１０
ｍｌを加え、トリクロルトリアジン０．１５ｇをアセト
ン２ｍｌに溶かし、オイペルギット−ＮＨ2に滴下し、
室温で軽く振動させながら１０分間定温保持する。ＮＣ
−緩衝液でｐＨ−値をｐＨ１０．８に調整し、バイオラ
ド・カラム（Ｂｉｏ Ｒａｄ−Ｓａｅｕｌｅ）（ガラ
ス）内で５０％アセトンで洗浄し、乾燥吸収し（＝支持
体物質Ｔ′−（ＩＶ）−１）、２５％アンモニア１０ｍ
ｌを加え、６０℃で軽く振動させながら３０分間定温保
持し、水で洗浄する。アセトンで洗浄し、ゲルを乾燥吸
収し、ｐＨ１０．８の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液１
０ｍｌを加え、トリクロルトリアジン０．３ｇをアセト
ンに溶かし、徐々に滴下する。室温で軽く振動させなが
ら８分間定温保持し、ＮＣ−緩衝液でｐＨ−値をｐＨ１
０．８に調整し、ゲルを５０％水性アセトンで洗浄し、
乾燥吸収し、凍結乾燥する（＝支持体物質Ｔ′−（Ｉ）
−１）。
（Ｉ）への変換 Ａ−１からの支持体物質Ｔ′−（ＩＩＩ）１ｇに、ｐＨ
１０．８の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ＮＣ）１０
ｍｌを加え、トリクロルトリアジン０．１５ｇをアセト
ン２ｍｌに溶かし、オイペルギット−ＮＨ2に滴下し、
室温で軽く振動させながら１０分間定温保持する。ＮＣ
−緩衝液でｐＨ−値をｐＨ１０．８に調整し、バイオラ
ド・カラム（Ｂｉｏ Ｒａｄ−Ｓａｅｕｌｅ）（ガラ
ス）内で５０％アセトンで洗浄し、乾燥吸収し（＝支持
体物質Ｔ′−（ＩＶ）−１）、２５％アンモニア１０ｍ
ｌを加え、６０℃で軽く振動させながら３０分間定温保
持し、水で洗浄する。アセトンで洗浄し、ゲルを乾燥吸
収し、ｐＨ１０．８の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液１
０ｍｌを加え、トリクロルトリアジン０．３ｇをアセト
ンに溶かし、徐々に滴下する。室温で軽く振動させなが
ら８分間定温保持し、ＮＣ−緩衝液でｐＨ−値をｐＨ１
０．８に調整し、ゲルを５０％水性アセトンで洗浄し、
乾燥吸収し、凍結乾燥する（＝支持体物質Ｔ′−（Ｉ）
−１）。
【００４４】Ｃ−１ 支持体物質Ｔ′−（Ｉ）への蛋白
質Ａの結合 Ｂからの支持体物質Ｔ′−（Ｉ）０．２５ｇ（＝ゲル１
ｍｌ）にＰＢＳ５００μｌを加える。蛋白質Ａ１ｍｌ
（５ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で軽く振動させながら一
夜定温保持し、ＰＢＳで洗浄し、ｐＨ８．０の１０％エ
タノールアミン／ＰＢＳで飽和する。室温で４時間軽い
振動下に保ち、ゲルをＰＢＳ中で洗浄する。２．支持体
物質Ｔ′としての半透膜物質から出発 Ｂ−２ ＮＨ2含有半透膜物質と２，４，６−トリクロ
ル−ｓ−トリアジンとの反応 半透膜物質（バイオダインＡ）２ｃｍ2を準備し、これ
にニトロメタン２ｍｌに溶解したトリクロルトリアジン
０．１５ｇを滴下する。室温で軽く振動させながら１０
分間定温保持する。ニトロメタンで洗浄し、空気中で乾
燥させる（＝支持体物質Ｔ′−ＩＶ−２）。２５％アン
モニア１０ｍｌを加え、６０℃で軽く振動させながら３
０分間定温保持する。水で洗浄し、半透膜物質を空気中
で乾燥させ、ニトロメタン４ｍｌに溶解したトリクロル
トリアジン０．１５ｇを徐々に滴下する。室温で軽く振
動させながら８分間定温保持する。半透膜をニトロメタ
ンで洗浄し、空気中で乾燥させ、引続き凍結乾燥する
（＝支持体物質Ｔ′−（Ｉ）−２）。
質Ａの結合 Ｂからの支持体物質Ｔ′−（Ｉ）０．２５ｇ（＝ゲル１
ｍｌ）にＰＢＳ５００μｌを加える。蛋白質Ａ１ｍｌ
（５ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で軽く振動させながら一
夜定温保持し、ＰＢＳで洗浄し、ｐＨ８．０の１０％エ
タノールアミン／ＰＢＳで飽和する。室温で４時間軽い
振動下に保ち、ゲルをＰＢＳ中で洗浄する。２．支持体
物質Ｔ′としての半透膜物質から出発 Ｂ−２ ＮＨ2含有半透膜物質と２，４，６−トリクロ
ル−ｓ−トリアジンとの反応 半透膜物質（バイオダインＡ）２ｃｍ2を準備し、これ
にニトロメタン２ｍｌに溶解したトリクロルトリアジン
０．１５ｇを滴下する。室温で軽く振動させながら１０
分間定温保持する。ニトロメタンで洗浄し、空気中で乾
燥させる（＝支持体物質Ｔ′−ＩＶ−２）。２５％アン
モニア１０ｍｌを加え、６０℃で軽く振動させながら３
０分間定温保持する。水で洗浄し、半透膜物質を空気中
で乾燥させ、ニトロメタン４ｍｌに溶解したトリクロル
トリアジン０．１５ｇを徐々に滴下する。室温で軽く振
動させながら８分間定温保持する。半透膜をニトロメタ
ンで洗浄し、空気中で乾燥させ、引続き凍結乾燥する
（＝支持体物質Ｔ′−（Ｉ）−２）。
【００４５】Ｃ−２ Ｂ−２からの支持体物質への蛋白
質Ａの結合 Ｂ−２からの変更された半透膜物質２ｃｍ2にＰＢＳ５
００μｌを加え、次いで蛋白質Ａ１ｍｌ（１５０μｇ／
ｍｌ）を加える。室温で軽く振動させながら一夜定温保
存し、ＰＢＳで洗浄する。ｐＨ８．０の１０％エタノー
ルアミン／ＰＢＳで飽和し、室温で４時間軽い振動下に
保ち、半透膜をＰＢＳ中で洗浄する。
質Ａの結合 Ｂ−２からの変更された半透膜物質２ｃｍ2にＰＢＳ５
００μｌを加え、次いで蛋白質Ａ１ｍｌ（１５０μｇ／
ｍｌ）を加える。室温で軽く振動させながら一夜定温保
存し、ＰＢＳで洗浄する。ｐＨ８．０の１０％エタノー
ルアミン／ＰＢＳで飽和し、室温で４時間軽い振動下に
保ち、半透膜をＰＢＳ中で洗浄する。
【００４６】蛋白質を支持体Ｔに結合することによって
得ることのできる利点を、例１に関しては第１表により
また例２に関しては第２表により示す。
得ることのできる利点を、例１に関しては第１表により
また例２に関しては第２表により示す。
【００４７】 第１表 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する結合能 蛋白質Ａの固定化 ＩｇＧの結合 結合法 ゲル（湿性）１ｇ当り（ｍｇ） ゲル（湿性）１ｇ当り（ｍｇ） 先行技術 オイペルギットＣ未変更 １０ ７ 例 １ 支持体物質Ｔ′−（ＩＶ）−１ ５ １２ 例 １ 支持体物質Ｔ′−（Ｉ）−１ ５ ２０ 第２表 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する結合能 蛋白質Ａの固定化 ＩｇＧの結合 結合法 半透膜２ｃｍ2当り 半透膜２ｃｍ2当り エポキシ基含有半透膜物質／ 直接結合 １５０μｇ １００μｇ 例 ２ 支持体物質Ｔ′−（ＩＶ）−２ １５０μｇ ３７５μｇ 例 ２ 支持体物質Ｔ′−（Ｉ）−２ １００μｇ ６００μｇ
Claims (5)
- 【請求項１】 変更された固体支持体Ｔが、共有結合に
より固定するにの適した式Ｉ： 【化１】 ［式中Ａはスペーサ基を表わし、ＸはＯ、Ｓ、ＮＨを表
わし、ｎは０又は１を表す］で示される官能基を多数有
し、これらの基がマトリックス物質に共有結合的に連結
していることを特徴とする、公知のマトリックス物質を
ベースとする蛋白質を共有結合により固定するための変
更された固体支持体。 - 【請求項２】 マトリックス物質が、メタクリルアミド
及びアクリルアミドの網状化共重合体又はセルロース、
アガロース、セファロース型の変更された多糖からなる
群から選択される、請求項１記載の変更された固体支持
体。 - 【請求項３】 式Ｉ中のＡが基： 【化２】 を表し、Ｘが−ＮＨを表す請求項１又は２記載の変更さ
れた固体支持体。 - 【請求項４】 マトリックス物質が半透膜物質である、
請求項１から３までのいずれか１項記載の変更された固
体支持体。 - 【請求項５】 官能基として式ＩＩ： 【化３】 の共有結合的に連結されたグリシジル基を多数有する支
持体物質Ｔ′から出発し、第１工程での支持体物質Ｔ′
をアンモニアと反応させて、式ＩＩのグリシジル基を式
ＩＩＩ： 【化４】 のα−ヒドロキシ−β−アミノ基に変え、第２工程で式
ＩＩＩのα−ヒドロキシ−β−アミノ基をＨＣｌの脱離
下に２，４，６−トリクロル−ｓ−トリアジンと反応さ
せて、式ＩＶ： 【化５】 のＮ−トリアジニル置換基にし、これを第３工程でアン
モニアで処理することによって式Ｖ： 【化６】 のアミン置換基にし、これを最後の工程で２，４，６−
トリクロル−ｓ−トリアジンの少なくとも２当量と反応
させて式Ｉの基に変えることを特徴とする、請求項１か
ら３までのいずれか１項に記載の、式Ｉで示される官能
基を含有する変更された固体支持体Ｔの製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4005927A DE4005927A1 (de) | 1990-02-25 | 1990-02-25 | Immobilisierung von proteinen an traegern |
| DE4005927.8 | 1990-02-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0586100A true JPH0586100A (ja) | 1993-04-06 |
Family
ID=6400934
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3027282A Pending JPH0586100A (ja) | 1990-02-25 | 1991-02-21 | 蛋白質を共有結合により固定するための変更された固体支持体及びその製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5266471A (ja) |
| EP (1) | EP0444514A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0586100A (ja) |
| DE (1) | DE4005927A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102730169A (zh) * | 2012-07-12 | 2012-10-17 | 中船桂江造船有限公司 | 船舶下水横移辅助装置 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0649100A (ja) * | 1992-05-06 | 1994-02-22 | Eastman Kodak Co | カルボキシル化基体への化合物の結合方法 |
| MY114026A (en) * | 1995-09-01 | 2002-07-31 | Asahi Chemical Ind | Polyacetal resin molded article and process for producing the same |
| SE9503925D0 (sv) * | 1995-11-07 | 1995-11-07 | Pharmacia Biotech Ab | Separationsmedium för IgG |
| US6413722B1 (en) * | 2000-03-22 | 2002-07-02 | Incyte Genomics, Inc. | Polymer coated surfaces for microarray applications |
| EP1852443A1 (en) * | 2006-05-05 | 2007-11-07 | Leukocare AG | Biocompatible three dimensional matrix for the immobilization of biological substances |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3674767A (en) * | 1967-07-14 | 1972-07-04 | Nat Res Dev | Novel polymeric materials containing triazinyl groups |
| US3824150A (en) * | 1967-07-14 | 1974-07-16 | Nat Res Dev | Enzyme bound to polymeric sheet with a triazine bridging group |
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| DE2722751C2 (de) * | 1977-05-20 | 1990-06-21 | Röhm GmbH, 6100 Darmstadt | Perlpolymerisat mit einem Teilchendurchmesser von 5 bis 1000 μm und innerem Hohlraum |
| US4229537A (en) * | 1978-02-09 | 1980-10-21 | New York University | Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands |
| US4357311A (en) * | 1980-10-03 | 1982-11-02 | Warner-Lambert Company | Substrate for immunoassay and means of preparing same |
| DE3106456A1 (de) * | 1981-02-21 | 1982-10-07 | Röhm GmbH, 6100 Darmstadt | Verfahren zur herstellung von perlfoermigen, hydrophilen, gegenueber proteinen bindungsaktiven traegerpolymeren |
| DE3130924A1 (de) * | 1981-08-05 | 1983-02-17 | Röhm GmbH, 6100 Darmstadt | Oberflaechenreiche systeme zur fixierung von nucleophile gruppen enthaltenden substraten |
| US4814098A (en) * | 1986-09-06 | 1989-03-21 | Bellex Corporation | Magnetic material-physiologically active substance conjugate |
| DE3738721C2 (de) * | 1987-11-14 | 1995-10-05 | Roehm Gmbh | Immobilisierte Antikörper |
| GB2221466A (en) * | 1988-03-09 | 1990-02-07 | Aluminum Co Of America | Biologically reactive particles with biological, therapeutic and chromatographic applications |
-
1990
- 1990-02-25 DE DE4005927A patent/DE4005927A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-02-20 EP EP19910102444 patent/EP0444514A3/de not_active Withdrawn
- 1991-02-21 JP JP3027282A patent/JPH0586100A/ja active Pending
- 1991-02-25 US US07/660,052 patent/US5266471A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102730169A (zh) * | 2012-07-12 | 2012-10-17 | 中船桂江造船有限公司 | 船舶下水横移辅助装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0444514A3 (en) | 1992-04-22 |
| DE4005927A1 (de) | 1991-08-29 |
| US5266471A (en) | 1993-11-30 |
| EP0444514A2 (de) | 1991-09-04 |
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