NL9000125A - Werkwijze ter bereiding van geimmobiliseerde antilichamen. - Google Patents

Description

Werkwijze ter bereiding van geïmmobiliseerde antilichamen

De onderhavige uitvinding betreft een verbeterde werkwijze ter bereiding van geïmmobiliseerde antilichamen, waarbij regio-specifieke conjun-gaten van antilichamen die oligosaccharide bevatten door middel van oxidatieve modificatie van het koolhydraatgebied van de antilichamen worden gevormd.

De (niet vóórgepubliceerde) Duitse octrooiaanvrage P 37 38 721.9 beschrijft geïmmobiliseerde antilichamen, die op covalente wijze zijn gebonden aan een matrixpolymeer en wel met behulp van een modificatie in het koolhydraatgebied van de antilichamen. Het eraan binden van de antilichamen wordt bewerkstelligd door een condensatiereactie tussen ten minste een aldehydgroep in het door oxidatie gemodificeerde koolhydraatgebied en ten minste een epoxidefunctie van een matrixpolymeer dat epoxygroepen bevat, door middel van een bifunctioneel reactiemiddel, dat bestaat uit een afstandhouder (spacer) met ten minste drie leden en een groep, die geschikt is voor condensatie met de aldehydgroep in de ene eindpositie en een groep, die met de epoxygroep covalent reageert in de andere eindpositie. Hoewel de techniek, die in de bovengenoemde Duitse octrooiaanvrage wordt beschreven, tot produkten leidt die zeer goed bruikbaar zijn, bestaat evenals daarvoor aanzienlijke belangstelling voor een verbetering van de werkwijze die wordt uitgevoerd. Zo is onmiddellijk in te zien dat de verkorting van de duur van de werkwijze en de vereenvoudiging van de werkwijze zelf een gunstige invloed moeten hebben op het totale resultaat, wanneer men de algemeen bekende gevoeligheid van antilichamen in het algemeen in aanmerking neemt. De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding moet derhalve worden gezien als een verbeterde werkwijze gebaseerd op de leer van de Duitse octrooiaanvrage P 37 38 721. De nieuwe, verbeterde werkwijze berust op de oxidatieve binding van antilichamen die oligosaccharide bevatten, die door middel van perjodaat zijn geoxideerd aan een door middel van adipinezuurdihy-drazide gemodificeerde polymere drager ADH-PC in één reactie in een vat. In tegenstelling tot de uit verscheidene stappen bestaande werkwijze, die bij de bovengenoemde octrooiaanvrage de voorkeur krijgt, waarbij eerst de antilichamen door middel van perjodaat worden geoxideerd, dan overmaat reactiemiddel door behandeling met bijvoorbeeld ethyleenglycol wordt verwijderd, daarna de reagentia door gelfiltratie worden verwijderd en wordt geconcentreerd en tenslotte door antilichamen tot omzetting worden gebracht met de door hydrazide gemodificeerde polymere drager, oxideert men bij de onderhavige nieuwe werkwijze de antilichamen tot bet aldehydproduct en incubeert men met de door adipinezuurdihydra-zide gemodificeerde polymere drager ADH-PC in één werkwijze.

De onderhavige uitvinding betreft derhalve een werkwijze ter bereiding van geïmmobiliseerde antilichamen die oligosaccharide bevatten, door • condensatie van de in geoxideerde vorm aanwezige antilichamen met een door adipinezuurdihydrazide gemodificeerde drager ADH-PC, waarbij de antilichamen in een in één vat uitgevoerde werkwijze in een waterig melieu, dat tegelijkertijd perjodaat (in hoeveelheden die voldoende zijn voor de oxidatie tot het aldehyd in het koolhydraatgebied van de antilichamen) en het door middel van adipinezuurdihydrazide gemodificeerde polymere dragermateriaal bevat, worden geïncubeerd en derhalve tot omzetting worden gebracht met een daaropvolgende op zichzelf bekende opwerking.

Op deze wijze bereikt men een oxidatieve covalentie fixering, daar de aldehydgroepen, wanneer deze eenmaal door oxidatie zijn ontstaan, onmiddellijk reageren met de adipinezuurdihydrazidegroepen (ADH) van de drager ADH-PC.

Het polymeer dragermateriaal ADH-PC

Als voorbehoud geldt, dat voor de onderhavige "in één vat uitgevoerde" werkwijze primaire die polymere dragers in aanmerking komen, die geen geminale hydroxygroepen bezitten. Bij aanwezigheid van een matrixmateri-aal op basis van koolhydraat zoals in agarose of sefarose aanwezig is, kan het polymeer eveneens de plaats van perjodaatoxidatie zijn. Bij de matrixpolymeren (MP) volgens de onderhavige uitvinding gaat het derhalve bij voorkeur om een verknoopt copolymeer van acrylamide resp. methacrylamide en glycidylacrylaat resp. -methacrylaat, dat bij voorkeur uit parelvormige deeltjes bestaat. Dergelijke matrixpolymeren worden in DE-C-2.722.75i resp. US-A-4.I9O.713 alsmede 4.511-69^ beschreven. De parels bezitten in de regel een doorsnede van 5~1000 micrometer, in het bijzonder 30-1000 micrometer en bezitten een inwendige holle ruimte (holle pareltjes). Als maatstaf voor het gehalte aan glycidylgroepen in het matrixpolymeer MP, die tot reactie gebracht kunnen worden, wordt een waarde van 0,8-2,5 micromol per mg droog dragermateriaal genoemd. Verdere kenmerkende gegevens voor een in de handel gebruikelijk matrixpolymeer (EUPERGIT C van Röhm GmbH) dat representatief is voor matrixpolymeren MP van het aangegeven type, kunnen aan de volgende tabel worden ontleend.

Kenmerkende gegevens Dimensie - gemiddelde korrelgrootte l40 - 180 μπι - porie diameter 40 nm - slectiegrens = M LIM: 2.105 Dalton - bindingsactief oppervlak 180 m2/g (droog) - epoxidegehalte: 800 - 1000 mmol/g (droog) - wateropname: 2,3 ml/g (droog) - dichtheid = d^,2 1,20 - stortdichtheid: 0,34 g/ml - bindingscapaciteit: (bij gebruikelijke omstandigheden) albvunine van de mens: 48 mg/g (vochtig)

IgG van de mens: 34 mg/g (vochtig) - zwelgedrag t.o.v. water: 1 : 1,4 1 ml (droog) geeft 1,4 ml (vochtig) - oplosbaarheid (in water, buffers en organische oplosmiddelen): onoplosbaar - drukstabiliteit: 300 bar

Onder de electronenmicroscoop herkent men de macroporeuze structuur van de bolletjes (parels) met kanalen en holle ruimten, die een doorsnede van 0,1-2,5 mm (1000 tot 25.000 A) bezitten, zodat de enzym- resp. substraatmoleculen met een grootte van 10-100 A de totale holte van de macroporeuze matrix kunnen bereiken.

Bereiding van polymeer dragermateriaal ADH-PC Het uit (meth)acrylamide en glycidyl(meth)acrylaat opgebouwde matrix-polymeer (MP), dat bij voorkeur uit parelvormige deeltjes bestaat (zie boven), in het bijzonder het produkt ® EUPERGIT C van Rohm GmbH, Darmstadt, wordt doelmatig in een geschikte bufferoplossing in het alkalische gebied, bijvoorbeeld in een fosfaatbuffer en bij pH 8,8 gedurende een bepaalde tijdsduur, bijvoorbeeld 16 ± 3 uur bij kamertemperatuur behandeld met het bifunctionele reactiemiddel, in het bijzonder adipinezuurdihydrazide. Bij voorkeur past men het bifunctionele reactiemiddel toe in hoeveelheden van 0,1 - 10 mol per gram polymere drager MP, speciaal^1 EUPERGIT C, droog gewicht, in het bijzonder 1 mmol bifunctio-neel reactiemiddel per gram droog gewicht. Doelmatig wast men het gemodificeerde matrixpolymeer ADH-PC met een standaard fosfaatbuffer (PBS).

Het kan bij voorkeur met buffer (bijvoorbeeld 0,1 M acetaatbuffer) op pH 5,5 worden ingesteld en bij een lagere temperatuur, bijvoorbeeld bij 4°C worden bewaard.

Plaats-specifieke modificatie van de antilichamen

In principe zijn in het kader van de onderhavige uitvinding alle antilichamen geschikt die zoals bekend is, een gehalte aan koolhydraat-groepen bezitten en, die voldoende stabiel zijn ten opzichte van de chemische modificatie d.w.z. de perjodaatoxidatie en toegankelijk zijn voor de daarop volgende fixering. Als maatstaf kan bij de antilichamen worden uitgegaan van een gehalte van circa 3% koolhydraat. Monoklonale antilichamen staan in het middelpunt van de belangstelling. Werkwijzen voor bereiding van monoklonale antilichamen zijn voldoende bekend, [vgl. Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, derde uitg. vol. 23, J.Wiley (1983)* blz.637"643; D.Baron, U.Hartlaub, Humane Molekulare Antikörper, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York 1987]·

Daarbij kan in het bijzonder als volgt te werk worden gegaan: de monoklonale antilichamen, die bijvoorbeeld door diverse reinigingswerk-wijzen zoals precipitatie met ammoniumsulfaat, ionenuitwisselingchroma-tografie en/of affiniteitschromatografie zijn gezuiverd, worden bij voorkeur voor de oxidatie gedialyseerd, en verder met een geschikte verdraagbare buffer in het pH-gebied rond 5,5·· Anticarboxypeptidase-an-tilichamen (CPA9) zijn zeer geschikt gebleken voor de toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding. Doelmatig wordt de oplossing van ascites gedeeltelijk door een precipitatiestap met ammoniumsulfaat gezuiverd (50% verzadigde oplossing, 16 uur bij 4°C). Vervolgens wordt opgenomen in een tienvoudige volume hoeveelheid standaardfosfaatbuffer (PBS) met een pH-waarde 7,4 en 16 uur bij 4°C gedialyseerd tegen PBS. Bij enkele proeven werden de antilichamen, die door middel van de behandeling met ammoniumsulfaat waren gezuiverd, verder gezuiverd op een EUPERGIT-C-ko-lom met geïmmobiliseerd antigeen.

De in één vat uitgevoerde werkwijze.

De in één vat uitgevoerde werkwijze ter fixering van antilichamen laat zich in de regel uitvoeren onder toepassing van de polymere dragers ADH-PC en de antilichamen, die hiervoor zijn beschreven. Evenals in de stand van de techniek wordt bij het werken bij relatief lage pH, bij voorkeur in het gebied van gebied rond 5,5, het gevaar van interne verknoping van antilichamen verminderd of uitgesloten. De wijze van werken die de voorkeur verdient, bestaat uit de toepassing van natrium- perjodaat, (als maatstaf: 0,1 molair) in een geschikte inerte bufferop-lossing, doelmatig in het pH-gebied rond 5,5, bijvoorbeeld in 0,1 M acetaatbuffer. Bij voorkeur vindt de omzetting plaats bij een relatief lage temperatuur, iets boven 0-5, bij voorkeur bij 4*0 en in het donker. De oxidatie kan bijvoorbeeld worden gestopt, door toevoeging van relatief kleine hoeveelheden ethyleenglycol.

De werkwijze wordt bij wijze van voorbeeld aan de hand van de toepassing van het anticarboxypeptidase-antilichaam (CPA9) verder toegelicht. Het binden van de CPA9-antilichamen aan de ADH-PC dragers werd onderzocht met diverse perjodaatconcentraties en onder variatie van de reactietijden onderzocht. In een kenmerkend experiment worden 5mg met ADH gemodificeerd EUPERGIT-C als drager ADH-PC gemengd met 25 pg van het monoklonale antilichaam en 1-10 mmol natriumperjodaat (eindconcentratie) gemengd in een 0,1 molair natriumbuffer met pH 5,5· Het mengsel wordt gedurende 10-120 min. bij 4°C in het donker geroerd. Na beëindiging van de reactie wordt de bovenste laag afgescheiden en het gehalte aan anti-lichamen ervan wordt bepaald door a) ELISA Morcote en b) proteïnebepa-üng.

Na uitgebreid wassen van het dragermateriaal met standaard fosfaatbuf-fer PBS wordt de activiteit van de gebonden antilichamen met behulp van de enzymatische bepalingsmethode vastgesteld.

Enzymatische bepalingsmethode van antigeen-bindingsactiviteit van de antilichamen, die zijn gefixeerd op drager ADH-PC.

De antilichamen, die zijn geïmmobiliseerd op dragermateriaal ADH-PC, bijvoorbeeld op EUPERGIT C dat met ADH is gemodificeerd, bijv. in hoeveelheden van 1-5 mg dragermateriaal, dat 5-25 microgram antilichamen draagt, worden met een overmaat antigeen, zoals bijvoorbeeld anti-car-boxypeptidase (CPA) antilichamen of antimierikswortel-peroxidase (HRP)-antilichamen (>2 mol antigeen per mol gebonden antilichaam) gedurende een uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Niet gebonden antigeen wordt dan door uitgebreid wassen met PBS verwijderd. De hoeveelheid gebonden antigeen wordt door middel van enzymatische bepalingsmethoden op de volgende wijze vastgesteld.

Bepaling van CPA-activiteit

Een EUPERGIT C-antilichaam-antigeen-complex (1-5 ml; 4-20 μΐ) wordt gemengd met hippuryl-L-fenylalanine (50μ1 van een 10 mmol oplossing in PBS, die 0,5 mol NaCl bevat) en het volume wordt tot 100 μΐ aangevuld met PBS met een gehalte van 0,5 molair NaCl. Dit mengsel wordt gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder schudden geïncubeerd. Aan het eind van de incubatieperiode wordt een monster (10-50 μΐ) van de bovenste laag uit het reactiemengsel in een putje van een ELISA-microtiterplaat gebracht en als volgt met ninhydrine reagensmiddel (3 gew.X ninhydrine i in methylcellosolve) omgezet.

Men voegt aan ieder monster 100 μΐ vers bereid ninhydrine reactiemid-del en 50 μΐ van een vers bereide oplossing toe van 0,2 M natriumcyanide in 3ιθ molair natriumacetaatbuffer, pH 5.3· Dit mengsel wordt gedurende 20 minuten bij 95°C verhit. Dan voert men met een ELISA-reader een kleurbepaling uit van de blauwe kleuring bij 500 nm.

De correlatie tussen de kleurontwikkeling en het enzymgehalte vindt plaats met behulp van twee soorten calibreringscurves: i) onder toepassing van de ninhydrine bepalingswaarde van een van te voren bepaalde hoeveelheid fenylalanine ii) uit activiteitsmetingen van bekende hoeveelheden van het enzym carboxypeptidase.

Bepaling van mierikswortelperoxidase

Het EUPERGIT C-antilichaam-antigeen-complex (0,1-2,0 ng) wordt gemengd met 1 ml van o-fenyleendiamine-reagensmiddel (2 mg o-fenyleendïamine in een ml van een 50 millimolair natriumcitraat-buffer met pH 5.0, die 0,08 gew.% waterstofperioxide bevat). Na een minuut stopt men de reactie door toevoeging van 0,5 nil 5 norm. HC1. 200μ1 van de bovenste laag van het reactiemengsel worden overgebracht in een ELISA microtiterplaat. Daarna wordt door middel van een ELISA-reader de intensiteit bepaald van de ontwikkelde kleuring bij 402 nm door een referentiemeting van de absorptie bij 405 nm.

Met een standaard-curve, die was bepaald met bekende hoeveelheden mierikswortelperoxidase, kan de correlatie tussen kleurontwikkeling in het monster en het enzymgehalte ervan worden vastgesteld.

Bepaling van immunocapaciteit van de antilichamen, die zijn gefixeerd volgens de uitvinding.

De bindingscapaciteit van de antilichamen, die volgens de uitvinding zijn geïmmobiliseerd, wordt bepaald door meting van de antigenen, in het bijzonder van enzymen zoals bijvoorbeeld het anticarboxypeptidase (CPA), die zich aan antilichamen binden. Met dit doel wordt bijvoorbeeld CPA in gelijk blijvende hoeveelheden in PBS in reageerbuizen gebracht, die ieder 100 mg van het polymere dragermateriaal ADH-PC, dat echter verschillend beladen is met geïmmobiliseerde monoklonale antilichamen dragen. De hoeveelheid CPA, dat gebonden is aan de antilichamen van het matrixpolymeer, werd als volgt bepaald: a) door bepaling van het verschil van de afzonderlijke proteïnegehal-tes door middel van de Bradford-test en de enzymatische activiteit die in de uitgangsoplossing en tenslotte in de overblijvende oplossing aanwezig was, β) door bepaling van de enzymatische activiteit van het enzym, dat geïmmobiliseerd is op de ADH-PC-dragerbolletjes, bij CPA bijvoorbeeld met behulp van de ninhydrinemethode. De hoeveelheid enzym, die gebonden is aan de drager, werd na incubatie met natriumcarbonaatbuffer met pH 10,5 geëlueerd. Na het uitvoeren van het neutraliseren van de pH wordt de activiteit van het geëlueerde enzym, bijvoorbeeld van CPA bepaald.

De bepaling via de enzymactiviteit is in al die gevallen uitgevoerd, waar antilichamen aanwezig zijn die de enzymactiviteit niet nadelig beïnvloeden. Het blijkt dat de door oxidatie gemodificeerde antilichamen, die gefixeerd zijn op ADH-PC-drager-bolletjes, hun volledige immunologische activiteit voor binding van het enzym, bijvoorbeeld CPA, behouden.

Als maatstaf voor de waargenomen molaire verhouding van de monoklonale antilichamen tot CPA kan de waarde 2:1 worden genoemd.

Zoals reeds is vermeld, strekt de leer volgens de uitvinding zich in de meest algemene zin uit tot specifieke conjugaten van antilichamen die oligosaccharide bevatten. In het bijzonder kunnen monoklonale antilichamen worden genoemd, die gericht zijn tegen antigenen van bijvoorbeeld het volgende type:

Antigeen-klasse_ Antigeen bakterieel tetanus-toxoide H. influenza type b polysaccharide difterie-toxine Chlamydia trachomitis M. leprae lipopolysaccharide/endotoxine pneumokokken LPS van P. aeruginosa exotoxine van P. aeruginosa streptokokken groep A koolhydraat viraal X31 influenza-virus-nucleoproteine

mazelen-virus HSV glycoproteine D mazelen-virus-nucleocapside cytomegalie-virus influenza A-virussen rode hond-virus-antigenen HTLV I

Varicella-zoster HVsAg

autoimmuun dubbelstrengs DNA

eilandcellen (Diabetes mellitus)

Myasthenia gravis, antiidiotypen

Thyreotropine-receptor rheuma-faktor acetylcholine-receptor

Sshildklier sperma tumor mamma-Ca prostaat-Ca long-Ca maag-Ca melanoom GD2 (melanoom bij mensen) glioom rectum-Ca leukemie cervix-Ca

Antigeen-klasse_Antigeen

weefsel/bloed rhesus D

bloedgroepantigeen A HLA-A, B, C, DR intermediaire filamenten Andere malaria

Forssman-antigeen schape-erythrocyten nitrofenol dinitrofenol trinitrofenol keyhole limpet hemocyanine (KLH) rheumafaktor insuline

De fixering volgens de uitvinding biedt een reeks van voordelen ten opzichte van de stand van de techniek.

De vergelijking met parallel experimenten, die zijn uitgevoerd met dezelfde antilichamen onder de omstandigheden van de werkwijze, die uit verscheidene stappen bestaat, leverde daar ongeveer 70% fixering van antilichamen, waarbij de antilichamen van hun kant een antigeen bin-dingscapaciteit van 1 mol/mol bezitten.

De nieuwe verbeterde "één vat uitgevoerde" werkwijze biedt een reeks van voordelen ten opzichte van de werkwijze van de stand van de techniek, die uit verscheidene stappen bestaat: 1) de noodzaak de antilichamen te scheiden van de aanwezige overmaat perjodaat van de oplossing na de oxidatiestap vervalt; er gaan derhalve geen antilichamen verloren tengevolge van de zuiveringsstap.

2) De noodzaak tot vernietiging van de overmaat perjodaat door inwerking van chemicaliën vervalt.

3) De totale reactie verloopt wezenlijk sneller; tot en met het eind zijn nu slechts 30-60 minuten nodig, vergeleken met de k tot 5 uren volgens de werkwijze van de techniek.

k) Ten gevolge van de kortere reactieduur vermindert het gevaar dat de antilichamen schade ondervinden door relatief lange inwerking van perjodaat.

5) De reactie kan worden uitgevoerd met minimale hoeveelheden antilichamen alsmede dragermateriaal.

Claims (2)

1. Werkwijze tér bereiding van geïmmobiliseerde antilichamen door middel van de condensatiereactié tussen de antilichamen in geoxideerde vorm en polymere dragermateriaal, dat gemodificeerd is met adipinezuur-dihydrazide, met het kenmerk, dat men in een in één vat uitgevoerde reactie de antilichamen in een waterig melieu, dat tegelijkertijd perjo-daat en het polymere dragermateriaal, dat gemodificeerd is met adipine-zuurdihydrazide, bevat, oxideert en condenseert en vervolgens op op zichzelf bekende wijze opwerkt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men voor de oxidatie en condensatie ongeveer 30-60 minuten incubeert.