KR20030001365A - 아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법 - Google Patents

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Abstract

아밀로이드의 침적에 의하여 특징화되는 질병의 제거를 위한 신규한 방법에 관한 것이다. 본 방법은 일반적으로 베타 아밀로이드(Aβ)와 같은 아밀로이드생성 단백질(아밀로이드 생성에 기여하는 단백질)에 대한 면역화에 대한 것이다. 상기 면역화는 자기유래 아밀로이드생성 폴리펩타이드 유사체를 투여함으로써 수행되고, 이 때, 상기 아밀로이드유사체는 상기 자기유래 아밀로이드생성 폴리펩타이드에대한 항체 생산을 유도할 수 있는 것이 바람직하다. 면역원이 Aβ의 B-세포 에피토프의 대부분은 실질적으로 보존하면서 하나 또는 몇 개의 외래의, 면역우성이고 무차별적인 T-세포 에피토프의 도입에 의하여 변형된 자기유래 Aβ인 것이 특히 바람직하다. 또한, 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 핵산 백신와 및 생백신을 사용하는 백신화 뿐 아니라 이러한 백신화에 유용한 방법 및 수단에 관한 것이다. 아러한 방법 및 수단은 유용한 면역원성 아밀로이드생성 폴리펩타이드 유사체를 동정하는 방법, 유사체를 제조하는 방법 및 약학적 제제, 뿐 아니라 핵산 단편, 벡터, 형질전환 세포, 폴리펩타이드 및 약학적 제제를 포함한다.

Description

아밀로이드의 하향-조절을 위한 신규한 방법{NOVEL METHOD FOR DOWN-REGULATION OF AMYLOID}
아밀로이드증(Amyloidosis)은 조직 손상 및 질병을 야기하는 불용성 단백질원섬유(fibrils)가 세포외 침적(extracellular deposition)되는 것이다(Pepys, 1996 ; Tan et al., 1995 ; Kelly, 1996). 상기 원섬유는 정상적인 가용성 단백질 및 펩타이드가 비정상적인 방법으로 자가-결합(self-associate) 할 때 생성된다(Kelly, 1997).
아밀로이드(Amyloid)는 전신 아밀로이드증(systemic amyloidosis), AD, 성숙기개시당뇨병(maturity onset diabetes), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 전두측두 치매(fronto-temporal dementia) 및 프리온-관련 전달성 해면상 뇌질환(prion-related transmissible spongiform encephalopathies) (인간의 쿠루(kuru) 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob disease), 양과 소에 있어서 가각 스크라피(scrapie) 및 BSE)를 포함하는 심각한 질병과 연관되어 있으며, 예컨대, 알츠하이머병에 있어서의 아밀로이드 플라크 형성은 인간 질병의 진행과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 보인다. 동물 모델에 있어서, β-아밀로이드 단백질과 같이, 침적물(deposits)에서 발견되는 단백질의 변형된 형태의 발현 또는 과-발현이 알츠하이머-유사 증상(Alzheimer's-like symptoms)과 같은 질병의 다양한 증상을 유도하는 것으로 나타났다. 아밀로이드 침적에 대한 특별한 치료는 없으며, 이들 질병은 일반적으로 치명적이다.
아밀로이드 원섬유의 아단위(subunits)는 야생형, 변이형(variant) 또는 절단 단백질(truncated proteins)일 수 있으며, 유사한 원섬유가 올리고펩타이드 및 변성 단백질(denatured proteins)로부터 생체외(in vitro)에서 형성될 수 있다(Bradbury et al., 1960 ; Filshie et al., 1964 ; Burke & Rougvie, 1972).원섬유의 폴리펩타이드 성분의 성질이 아밀로이드증의 특징을 결정한다. 아밀로이드 단백질의 크기, 본래 구조 및 기능의 커다란 차이에도 불구하고, 모든 아밀로이드 원섬유는 정해지지 않은 길이를 갖고, 비분지형(unbranched)이며, 지름이 70 내지 120 Å이며, 콩고 레드(Congo Red)에 염색된다는 특징을 보여준다(Pepys, 1996). 이들은 폴리펩타이드 체인이 β-시트 구조로 조직화되어 있는 교차-β구조(cross-βstructure)의 특징을 갖는다(Pauling & Corey, 1951). 아밀로이드 단백질이 매우 다양한 전구 구조를 가짐에도 불구하고, 이들은 모두, 아마도 유사한 경로를 통하여, β-시트 헬릭스 프로토필라멘트(β-sheet helix protofilament)의 빌딩 블록인 변형된 형태로의 구조적 변환을 거칠 수 있다.
이러한 특수한 섬유 패턴은 β-피브릴로시스(β-fibrilloses)라 불리우는 아밀로이드증을 야기시키고(Glenner, 1980a, b), AD의 원섬유 단백질을 그 이차 구조가 알려지기 전에 β-단백질로 명명되었다(Glenner & Wong, 1984). 특징적인 교차-β 회절 패턴(cross-βdiffraction pattern)은 원섬유 모양(fibril appearance) 및 착색 특성(tinctorial properties)과 함께 현재 일반적으로 인정되는 아밀로이드의 진단상의 특징이며, 원섬유는, 비록 매우 다양한 단백질 전구체로부터 형성되지만, 어느 정도의 구조적 유사성을 공유하며, 전구체 단백질의 본성에 관계없이, 구조적 상과(superfamily)를 포함한다는 것을 제시한다(Sunde M, Serpell LC, Bartlam M, Fraser PE, Pepys MB, Blake CCFJ Mol Biol 1997 Oct 31 ; 273 (3) : 729-739).
중추신경계에 있어서의 아밀로이드의 침적이 질병의 진행에 중심적인 역할을 한다고 제안되는 가장 일반적이고 잘 알려진 질병이 알츠하이머병(AD)이다.
알츠하이머병(AD)
알츠하이머병(AD)은 점진적으로 발생하여 기억력 손상, 행동 및 성격 변화, 및 정신적 능력의 감퇴를 가져오는 비가역적인 진행성 뇌질환이다. 이러한 손상은 뇌세포의 괴사 및 이들 간 연결의 붕괴와 관련있다. 이러한 질병의 진행 정도는 감퇴 속도에 따라서 개인마다 다양하다. AD는 20년 동안까지 지속될 수 있지만, 평균적으로, AD 환자는 진단을 받은 후 8 내지 10년 동안 생존한다.
AD는 초기, 중기 건망증 단계에서부터 심각한 정신적 기능의 손상 단계로 진행한다. 이러한 손상은 치매(dementia)로 알려져 있다. 대부분의 AD 환자에 있어서, 첫 번째 증상이 60 세 이후에 나타나지만, 그 이전에 발병하는 것도 드문 것이 아니다. 최초의 증상은 최근 기억의 손상, 부적절한 판단, 및 성격의 변화를 포함한다. 종종, AD의 초기 단계의 환자는 친숙한 사람들의 이름이나 일상적인 물건의 이름을 분명하게 생각하지 못하거나 잊어버린다. 이 질환의 후기에는, 매우 간단한 작업의 수행 방법을 잊어버릴 수 있다. 결국, AD 환자는 모든 이성적 능력을 잃고, 자신을 매일 돌봐주는 다른 사람에 의존하여 살게 된다. 마침내, 상기 질환은 환자를 매우 쇠약하게 하여, 환자는 누워서 지내게 되고, 다른 질병과 감염으로 발전되는 것 같아 보인다. 가장 일반적으로, AD 환자는 폐렴(pneumonia)으로 사망한다.
비록, AD의 발전 위험은 연령에 따라서 증가하지만, AD 및 치매 증상은 정상적인 노화의 일부가 아니다. AD 및 다른 치매 질환은 뇌에 영향을 미치는 질병에 의하여 야기된다. 정상적인 노화에 있어서, 뇌의 신경 세포는 대량으로 손상되지 아니한다. 반면, AD는 다음과 같은 3 가지의 중요한 작용을 파괴시킨다: 신경 세포커뮤니케이션, 대사(metabolism), 및 회복(repair).
이러한 파괴는 마침내 많은 신경세포의 기능을 중단시키고, 다른 신경세포와의 연결을 손상시키고 괴사시키게 된다.
우선, AD는 기억을 조절하는 뇌의 부분, 특히, 해마(hippocampus)의 뉴런 및 관련 구조를 파괴한다. 해마의 신경세포가 적절한 기능을 중단하게 되면, 단기 기억이 손상되고, 종종, 쉽고 친숙한 작업을 하는 개인의 능력이 감퇴하기 시작한다. 또한, AD는 대뇌 피질, 특히 언어와 추리를 담당하는 영역을 공격한다. 결국, 뇌의 다른 영역들도 영향을 받게 되어, 모든 뇌 부위가 퇴화(shrink)되고, AD 환자는 누워서 지내게 되고(bedridden), 대소변을 못 가리게 되고(incontinent), 외부 세계에 반응을 보이지 않게 된다(source : National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
AD의 영향 (The Impact of AD)
AD는 65 세 이상인 사람들 사이에서 가장 흔한 치매의 요인이다. AD는 개인, 가족, 건강 관리 시스템 및 사회 전체적으로 커다란 영향을 미치기 때문에 주요한 건강 문제를 야기시킨다. 과학자들은 현재 약 4 백만 명이 상기 질환으로 고통을 받고 있으며, 환자수(prevalence)는 65 세 이상에서 매 5 년마다 2 배씩 증가한다고 추정하고 있다. 약 360,000 가지의 새로운 증례(incidence)가 매년 발생하고 있으며, 이러한 수치는 인구 연령에 따라 증가할 것이다(Brookmeyer et al., 1998).
AD는 사회에 무거운 경제적 부담을 안겨준다. 최근 미국의 연구에 따르면, 한 명의 AD 환자를 치료하기 위한 연비용으로 가벼운 AD 환자의 경우에는 $ 18,408, 중간 정도의 AD 환자의 경우에는 $ 30, 096, 심한 AD 환자의 경우에는 $ 36, 132 정도가 소요된다. 미국에서의 AD 환자 치료를 위한 연간 국가 비용이 10억 달러를 조금 넘는다.(Leon et al., 1998).
약 4 백만의 미국인이 85 세 이상이고. 대부분의 산업화 국가에 있어서, 이러한 연령대는 가장 급속하게 성장하는 인구 집단의 하나이다. 미국에 있어서 이러한 연령대의 인구는 2030년까지 약 8만 5 천만명에 이를 것으로 추측되고 있으며; 인구 동향을 연구하는 몇 몇 전문가들은 이러한 인구 수치는 이 보다 높을 수 있다고 주장하고 있다. 보다 많은 사람들의 수명이 길어짐에 따라, AD를 포함하여 노화에 따른 질병에 고통받는 사람들의 수가 지속적으로 증가할 것이다. 예컨대, 몇 몇 연구들은 85 세 이상의 모든 인구의 절반에 가까운 사람들이 어떠한 형태로든 치매를 증상을 가지고 있다는 것을 보여준다(National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
AD의 주요 특성 (The Main Characteristics of AD)
AD의 특징은 뇌의 두 가지의 비정상적인 구조이다: 아밀로이드 플라크(amyloid plaques)와 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangles, NFT). 플라크(plaques)는 치밀하고, 대부분이 불용성인 단백질 및 세포 물질의 뇌의 뉴런 주변 및 외부의 침적물이다. 엉킴(tangles)은 뉴런의 내부에 침적되는 불용성의 꼬여인는 섬유조직이다.
두 종류의 AD가 존재한다: 유전의 특정 패턴을 따르는 가족성 AD(familial AD, FAD) 및 어떠한 뚜렷한 유전 패턴을 보이지 않는 돌발성 AD(sporadic AD). 또한, 발병하는 연령에 있어서의 차이에 따라서, AD는 초기-발병(early-onset, 65세 미만의 사람들에게 발병) 또는 후기-발병(late-onset, 65세 이상의 사람들에게 발병)으로 설명될 수 있다. 초기-발병 AD는 드물고(약 10 %의 증례), 일반적으로 30 내지 60 세의 사람들에게 영향을 미친다.
초기-발병 AD의 어떤 유형은 유전되고 혈통에 있다. 초기-발병 AD는 또한 보다 일반적인 말기-발병 유형보다 급속하게 진행된다.
지금까지 알려진 바로는, 모든 가족성 AD(FADs)는 초기-발병 AD이고, 현재, FAD 증례의 50 %가 서로 다른 3 개의 염색체에 위치하는 3 개의 유전자의 결함에 기인하는 것으로 알려져 있다. 이들은 21 번 염색체 상의 APP 유전자에서의 돌연변이; 프리세닐린 1(presenilin 1)이라고 불리는, 14 번 염색체 상의 유전자에서의 돌연변이; 및 프리세닐린 2(presenilin 2)이라고 불리는, 1 번 염색체 상의 유전자에서의 돌연변이이다. 그러나, 아직까지 이러한 돌연변이가 보다 일반적인 후기-발병 AD의 돌발성 또는 비-가족성 유형에 있어서 주요한 역할을 한다는 증거는 없다(National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999)
아밀로이드 플라크 (Amyloid Plaques)
AD에 있어서, 아밀로이드 플라크는 기억 및 인지 작용에 사용되는 뇌 영역에 우선적으로 발달한다. 이들은 주로 소교 세포(microglia)와 성상교 세포(astrocytes)와 같은 비-신경 세포 및 뉴런과 혼합된 베타-아밀로이드(이하 'Aβ'라고 칭한다) - 아밀로이드 전구체 단백질(APP, 아미노산 서열을 SEQ ID NO : 2에 나타냄)이라 불리는 보다 큰 단백질의 단백질 단편 - 의 불용성 침적물로 구성된다. 아밀로이드 플라그 자체가 AD의 주요한 요인을 구성하는지, 또는 이들이 AD 진행 과정의 부산물인지에 대하여 알려져 있지 않다. 확실히, APP 유전자의 돌연변이에 기인하는 AD의 유전형에서 보여지는 바와 같이, APP 단백질의 변화가 AD를 야기시킬 수 있고, Aβ 플라크 형성은 인간 질병의 진행과 밀접하게 연관되어 있는 것처럼 보인다(Lippa C. F. et al. 1998).
APP
APP는 세포막과 결합된 많은 단백질 중 하나이다. 생성된 후, APP는 신경 세포막에 함입되어, 일 부분은 세포 안쪽에 일부분은 세포 바깥쪽에 위치한다. 형질전환 마우스를 이용하는 최근의 연구는 APP가 뉴런의 성장과 생존에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 예컨대, 특정 형태나 특정 양의 APP가 뉴런을 단기 및 장기 손상으로부터 보호할 수 있고, 손상된 뉴런이 보다 잘 회복할 수 있도록 하고, 뇌 손상 후 뉴런의 성장을 도와줄 수 있다.
APP가 세포막에 함입하는 동안에, 프로테아제가 APP의 특정 부위에 작용하여 APP를 단백질 단편으로 절단한다. 어떤 프로테아제는 APP를 절단하여 Aβ를 형성하고, 다른 프로테아제는 아밀로이드 단편의 중간에서 APP를 절단하여 Aβ가 형성될 수 없다. 형성된 Aβ는, 상대적으로 가용성이고 서서히 응집하는 짧은 40 (또는 41) 아미노산 Aβ, 및 급속하게 불용성 응집괴(clumps)를 형성하는 약간 긴 42 아미노산 "점착성(sticky)" Aβ와 같이, 2 가지의 서로 다른 길이를 갖는다. Aβ가 형성되는 동안에, 그것이 어떻게 신경 세포 주변 또는 신경 세포를 통과하여 움직이는지에 대하여 아직 알려지지 않았다. 이러한 과정의 마지막 단계에 있어서, "점착성" Aβ는 세포의 외부에서 긴 필라멘트로 응집되고, 죽은 및 죽어가는 뉴런의 필라멘트 및 소교 세포 및 성상교 세포를 따라서, 뇌 조직에서의 AD의 특징인 플라크를 형성한다.
APP에서의 돌연변이가 Aβ가 APP 전구체로부터 절단되어, 보다 전체적인 Aβ 또는 상대적으로 많은 "점착성" 형태의 생성을 야기하도록 한다는 몇 몇 증거가 존재한다. 또한, 프리세닐린 유전자에서의 돌연변이가 적어도 다음의 두 가지 방법에 의하여 뉴런의 퇴화에 기여하는 것으로 보인다: Aβ 생성물의 변형시킴으로써 또는 세포의 괴사을 보다 직접적으로 유발함으로써. 다른 연구자들은 변이된 프리세닐린 1 및 2가 세포소멸(apoptosis) 속도를 가속화 시키는데 수반된다고 제안한다.
상기 질환이 진행됨에 따라, 보다 많은 플라크가 형성되고, 뇌를 보다 많이 채울 것이라고 기대되어진다. Aβ는 어느 정도의 동적 평형을 이루며, 동시에 응집하고 분해할 수 있다는 것을 제안하는 연구 결과가 있다. 이는 상기 플라크가 형성된 후에도 플라크를 파괴할 가능성이 있을 수 있다는 희망이 생기게 한다(National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Aβ가 뉴런에 독성이 있다고 생각되고 있다. 조직 배양 연구에 있어서, 연구자들은, 정상 인간 APP를 과-발현시키는 뉴런에 비하여, 인간 APP의 변이형을 과-발현시키도록 처리된 해마 뉴런 세포의 괴사가 증가함을 관찰하였다.(Luo et al., 1999).
또한, 동물 모델에서, 변형된 형태의 Aβ 단백질의 발현 또는 과발현이 알츠하이머-유사 증상을 유도한다는 것을 알 수 있다(Hsiao K. et al., 1998).
Aβ 생성이 증가되면, 그것의 플라크로의 응집과 그로 인한 신경독성( neurotoxicity)이 AD를 유발할 수 있고, 플라크로의 Aβ응집 속도를 늦추거나 아예 응집이 일어나지 못하게 할 수 있는 조건을 조사하는 것인 치료적 관심사이다.
프리세닐린 (Presenilins)
프리세닐린-1(S-180)에서의 돌연변이는 초기-발병 가족성 AD(FAD)의 모든 증례의 거의 50 %의 원인이 된다. 약 30 가지의 돌연변이가 AD를 유발시키는 것으로 동정되었다. AD의 발병은 돌연변이에 따라 다양하다. 프리세닐린-2에서의 돌연변이는 FAD의 보다 작은 부분의 원인이 되지만, 여전히 중요한 인자이다. 프리세닐린이 돌발성 비-가족성 AD에 관련되어 있는지에 대하여 알려져 있지 않다. 프리세닐린의 작용은 알려져 있지 않지만, 프리세닐린 돌연변이를 갖는 AD 환자들은 Aβ-42 펩타이드의 수치가 증가되어 있는 것으로 보아, 프리세닐린은 APP의 프로세싱에 관여하여 Aβ-42(보다 길고 접착성인 펩타이드 형태, SEQ ID NO : 2, 673-714 잔기)를 생성하는 것으로 보인다. 또한, 프리세닐린이 NFT의 발생을 유발하는데 역할을 하는지 불명확하다. 또한, 프리세닐린은 뉴런의 퇴화와 뉴런 괴사에 보다 직접적인 역할을 할 수 있다는 것이 제안된다. 프리세닐린-1은 14 번 염색체에 위치하는 반면, 프리세닐린-2는 1 번 염색체와 연결되어 있다. 만약 어떤 사람이 이들 유전자 중 단지 하나의 변이된 형태를 포함하고 있다면, 그는 거의 확실히 초기-발병 AD로 발전하게 된다.
프리세닐린-1이 APP의 프로세싱에 관여하는 가설적인 감마-세크레타아제(gamma-secretase)와 동일한지는 불명확하다(Naruse et al., 1998).
아포리포단백질 E (Apolipoprotein E)
아포리포단백질은 일반적으로 콜레스테롤과 결합되어 있지만, 또한, AD 환자의 뇌의 플라크 및 엉킴에서도 발견된다. 대립유전자 1-3이 AD와 관련된 것으로 보이지 않는 반면, APOE-e4 대립유전자의 존재와 후기 AD(late AD)의 발생 사이에 중대한 상관관계가 있다(Strittmatter et al., 1993). 그러나, 그것은 하나의 위험 인자이지만, 프리세닐린 및 APP 돌연변이의 경우과 같이 직접적인 원인은 아니며, 가족성 AD에 한정되지 않는다.
ApoE-e4 단백질이 AD 발생의 가능성을 증가시키는 방법들은 확실하게 알려져 있지 않지만, 한 가지 가능한 가설은 그것이 Aβ 침적을 촉진하고 AD의 발병 연령을 감소시키는데 기여하거나, 또는 특정 APOE 대립유전자의 존재 또는 부존재가 상처에 대하여 뉴런이 반응하는 방법에 영향을 미칠 수 있다는 것이다(Buttini et al., 1999).
또한, Apo A1은 아밀로이제닉(amyloigenic)한 것으로 보여진다. 손상되지 않은 Apo A1은 그 자체로 생체 외에서 콩고 레드 양성인 아밀로이드-유사 원섬유를 형성할 수 있다(Am J Pathol 147 (2) : 238-244 (Aug 1995), Wisniewski T, Golabek AA, Kida E, Wisniewski KE, Frangione B).
APOE-e4 대립유전자가 다른 대립유전자에 비하여 정신적 손상의 증상을 감소시키는데 결정적인 효과가 있다는 것을 보여주는 몇 가지 모순된 결과가 있다(Stern, Brandt, 1997, Annals of Neurology 41).
신경원섬유엉킴 (Neurofibrillary Tangles)
AD의 두 번째 특징은 신경세포 내부에서 발견되는 꼬인 사(threads)의 비정상적인 콜렉션으로 구성된다. 엉킴의 주요한 성분은 타우(tau, t)라고 불리는 단백질의 한 가지 형태이다. 중추신경계에 있어서, 타우 단백질은 그들의 세포 내부 지지 조직 또는 골격(skeleton)의 한 성분인 미세소관(microtubules)을 안정화시키는 것을 도와주고 결합하는 능력으로 가장 잘 알려져 있다. 그러나, AD에 있어서, 타우는 화학적으로 변화되고, 이렇게 변화된 타우는 더 이상 미세소관을 안정화시키지 못하여, 이들이 분해되도록 야기한다. 이러한 전달 시스템의 붕괴는 우선 신경세포 사이의 커뮤니케이션에 있어서 기능 부전(malfunctions)을 초래하고, 그 다음으로 뉴런의 괴사를 유발한다.
AD에 있어서, 화학적으로 변화된 타우는 쌍(paired) 나선 필라멘트 - 서로의 주위를 감고있는 두 가닥의 타우 - 로 꼬인다. 이들 필라멘트는 신경원섬유엉킴에서 발견되는 주요한 물질이다. 최근의 한 연구에 있어서, 연구자는 건강한 뇌에서의 해마의 특정 부분의 뉴런의 6 퍼센트 미만에서 신경원섬유 변화를 발견하였으며, 가벼운 AD로 사망한 환자에 있어서는 이들 뉴런의 43 퍼센트 이상에서, 심한 AD로 사망한 환자에 있어서는 이들 뉴런의 71 퍼센트 이상에서 신경원섬유 변화가 발견되었다. 뉴런의 손상이 연구될 때, 유사한 과정이 발견되었다. 이러한 유형의 증거는 엉킴의 형성 및 뉴런의 손상이 AD의 경과에 대하여 함께 진행한다는 생각을 지지한다(National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
타우증 및 엉킴 (Tauopathies and Tangles)
AD가 아닌 몇 몇 신경변성(neurodegenerative) 질환은 뉴런 및 신경교(glia)에서 타우가 불용성 필라멘트로의 응집하여, 기능장애 및 괴사를 유발한다는 데 특징이 있다. 최근에는, AD 이외의 유전적 치매의 다양성을 갖는 가계를 연구하는 몇 몇 집단의 연구자들은 17 번 염색체 상의 타우 유전자에서 첫 번째 돌연변이를 발견하였다(Clark et al., 1998 ; Hutton et al., 1998 ; Poorkaj et al., 1998 ; Spillantini et al., 1998). 이들 가계에 있어서, 타우 유전자의 돌연변이는 뉴런 세포의 괴사 및 치매를 야기한다. AD와 몇몇 특징을 공유하지만 몇몇 중요한 auss에서 차이가 있는 이러한 장애를 총괄하여 "17번 염색체와 연결된 전두측두 치매 및 파킨슨증(fronto temporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17)"이라고 칭한다. 이들은, 파킨슨병, 근위축성측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 피질기저 변성(corticobasal degeneration), 진행성 핵 표면상 마비(progressive supranuclear palsy), 및 피크병(Pick's disease)과 같은 질환이고, 모두 타우 단백질의 비정상적인 응집에 특징이 있다.
다른 AD-유사 신경학적 질환 (Other AD-like neurological diseases)
AD와 프리온 질환(예컨대, 쿠루(kuru), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jacob disease) 및 소의 해면상 뇌염(bovine spongiform encephalitis)과 같은), 파킨슨병, 헌팅톤병 및 전두측두 치매를 포함하는 다른 신경학적 질환 사이에 중요한 비교점이 있다. 모두 뇌에서의 비정상적 단백질의 침적을 수반한다. AD 및 프리온 질환은 치매와 사망을 야기시키고, 둘 다 불용성 아밀로이드 원섬유의 형성과연관되어 있지만, 막 단백질에 있어서는 서로 차이가 있다.
AD 다음으로 두 번째로 가장 흔한 신경변성 질환인 파킨슨병을 연구하는 과학자들은 이 질환에 연결된 첫 번재 유전자를 발견하였다. 이 유전자는 흥미롭게도 AD 환자의 뇌의 아밀로이드 플라크에서도 발견되는 시누클레인(synuclein)이라는 단백질을 인코딩한다(Lavedan C, 1998, Genome Res. 8 (9) : 871-80). 또한, 연구자들은 헌팅톤병, 치매를 유발하는 다른 진행성 신경변성 장애에 있어서의 유전적 결함이 헌팅톤 단백질이 AD의 Aβ 원섬유 및 프리온 질환의 단백질 원섬유와 매우 유사한 불용성 원섬유를 형성하도록 한다는 것을 발견하였다(Scherzinger E, et al., 1999, PNAS U. S. A. 96 (8) : 4604-9).
또한, 과학자들은, 돌연변이 시, AD에서 보여지는 것과 유사한 진행성 치매 및 심각한 행동 장애를 야기하는 드문 유전 질환인 영국 가족성 치매(familial British dementia, FBD)를 초래하는 신규한 유전자를 발견하였다. FBD 플라크에서 발견되는 아밀로이드 원섬유의 생화학적 분해에 있어서, ABri라 불리는 특유한 펩타이드가 발견된다(Vidal et al., 1999). 이러한 유전자의 특정 지점에서의 돌연변이가 정상보다 긴 Bri 단백질(longer-than-normal Bri protein)의 생산을 초래한다. Bri 단백질로부터 절단된 ABri 펩타이드가 아밀로이드 원섬유처럼 침적된다. 이들 플라크는 뉴런의 기능장애 및 FBD의 특징을 보이는 치매를 유발하는 것으로 생각된다.
Aβ를 사용하는 면역화 (Immunization with Aβ)
면연 체계가 유기체 내에서의 외래 단백질 및 단백성 입자의 제거에 정상적으로 공헌을 하지만, 상기한 질환과 관련된 침적물은 주로 자기-단백질(self-protein)로 구성되어 있어서, 이들 질환의 조절에 있어서의 면역 체계의 역할을 보다 불명확하게 한다. 또한, 상기 침적물들은 면역 체계로부터 정상적으로 분리된 구획(CNS) 내에 위치하며, 모든 사실은 모든 백신 또는 면역치료적 접근이 성공적이지 못할 것이라고 제안한다
그럼에도 불구하고, 과학자들은 최근 이종기원의 인간 Aβ 및 면역 체계를 자극하는 것으로 알려진 물질로 구성된 백신으로 마우스를 면역화시키는 것을 시도하였다(Schenk et al., 1999 및 WO 99/27944). 마우스의 DNA 내로 삽입된 APP의 인간 변이 유전자를 사용하여 AD의 부분적 형질전환 마우스 모델에서 백신을 시험하였다. 마우스는 변형된 APP를 생산하였고, 자라면서 아밀로이드 플라크를 발달시켰다. 이러한 마우스 모델을 변형된 형질전환 인간 APP에 대한 백신화(vaccination)가 플라크의 침적에 효과를 갖는지 여부를 시험하는데 사용하였다. 첫 번째 실험에서, 형질전환 마우스의 한 그룹에 생후 6 주 째부터 시작하여 11 개월까지 매달 백신을 주입하였다. 형질전환 마우스의 두 번째 그룹은 어떠한 주입도 실시하지 않았으며, 대조군으로 사용되었다. 생 후 13 개월까지, 대조군의 마우스에서는 자신들의 뇌의 2 내지 6 퍼센트를 커버하는 플라크가 생겼다. 반면, 면역화된 마우스에서는 플라그가 거의 생기지 않았다.
두 번째 실험에 있어서, 연구자들은 수 개의 플라크가 이미 발생된 11 개월 째부터 주입하기 시작하였다. 7-달의 기간이 지나서, 대조군 형질전환 마우스는 자신의 뇌에서의 플라크 양에 있어서 17-배 증가를 보인 반면, 백신이 주입된 마우스에서는 18 개월 된 대조군 형질전환 마우스와 비교하여 99-퍼센트의 감소를 나타내었다. 몇 몇 마우스에 있어서, 이전에 존재하던 플라크 침적물이 상기 치료에 의하여 제거된 것으로 보였다. 또한, 염증 및 비정상적 신경 세포 프로세스와 같은 다른 플라크-관련 손상이 면역화의 결과로 감소한다는 것이 발견되었다.
따라서, 상기한 바는 마우스에서의 예비적인 연구이며, 예컨대, 과학자들은 백신화된 마우스가 다른 측면에서 건강한지 및 이들 백신화된 마우스의 기억이 정상적인지를 밝힐 필요가 있다. 또한, 마우스 모델이 AD의 완벽한 대표가 아니기 때문에(동물은 신경원섬유엉킴을 발달시키지 않으며, 많은 뉴런을 괴사시키지도 않는다), 인간이 마우스와 유사하거나 상이한 반응을 갖는지 여부를 결정하기 위하여 추가적인 연구가 필요할 것이다. 고려해야 할 또 다른 문제점은 방법이 아마도 아밀로이드 침적을 "치료(cure)"할 수 있지만, 치매의 발생을 중단시키는 것은 실패하였다는 것이다.
기술적 문제점은 또한 주요한 항원자극(challenges)을 제시한다. 예컨대, 이러한 기술을 이용하여, 인간이 자기 자신의 단백질에 대항하는 항체를 일으킬 수 있도록 하는 백신을 생성하는 것이 가능할 것 같지 않다. 따라서, 인간에 있어서 어떠한 시험이 고려될 수 있기 이전에, 안정성과 유효성의 수많은 문제점들이 해결될 필요가 있을 것이다.
따라서, 쉔크 등(Schenk et al.)에 의한 연구는 만약 AD에서의 플라크 형성과 같은 중추신경계의 단백성 침적물에 있어서의 자기-단백질에 대한 강력한 면역 반응의 생성이 가능하다면, 침적물의 형성의 예방 및 어쩌면 이미 생성된 플라크의제거 또한 모두 가능하다는 것을 보여준다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 AD와 같은 아밀로이드의 침적의 특징을 갖는 상태에 대한 신규한 치료법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은, AD 및 아밀로이드 침적에 관여하는 다른 병리학적 장애를 위한 신규한 치료의 달성을 위하여, 아밀로이드에 대한 자가백신(autovaccine)을 개발하는 것이다.
발명의 요약
병리학-관련 아밀로이드 침적물에 포함되는 다른 비면역원성 자기-단백질(nonimmunogenic self-proteins)에 대항하는 강력한 면역 반응의 생성을 위한 자가백신화 기술(autovaccination technology)의 이용이 본 명세서에 기술되어 있다. 그것에 의하여, 아밀로이드, 침적물에 포함되는 한 가지 이상의 성분, 또는 아밀로이드 형성에 관여하는 한 가지 이상의 단백질에 대항하는 강력한 면역 반응이 생성된다. 또한, 이러한 예방용 백신 제제, 아밀로이드 침적물과 관련된 이러한 질환의 증상의 가능한 치료 또는 완화가 기술되어 있다.
따라서, 본 발명의 가장 광범위하고 가장 일반적인 범위에 있어서, 본 발명은 인간을 포함하는 동물의 생체 내(in vivo)에서의 아밀로이드 하향-조절(down-regulation)을 위한 방법으로서, 다음의 면역학적 유효량의 동물 면역 체계에 효과적인 제시(presentation)를 포함하는 방법에 관한 것이다
- 한 가지 이상의 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 이의 서브시퀀스(subsequence): 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 이의 서브시퀀스로 면역화된 동물에서 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체의 생산을 유도하기 위하여 제조되는 한 가지 이상의 아밀로이드생성 폴리펩타이드 및 이들의 서브시퀀스, 및/또는
- 한 가지 이상의 아밀로이드 유사체: 이 유사체에 아밀로이드 생성 폴리펩타이드의 변형이 도입됨으로써, 상기 아밀로이드 유사체로 면역화된 동물에서 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체 생산이 유도되는 한 가지 이상의 아밀로이드 유사체.
따라서, 본 발명은 1) 자연 발생 항원 및 면역 반응을 유발하기 위하여 제조된 이들의 단편의 용도 뿐 아니라, 2) 이러한 자연 발생 하원의 유사체, 교차-반응성 면역 반응을 유도할 수 있는 유사체의 용도를 포함한다.
또한, 본 발명은 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 유사체 뿐 아니라 이들의 아집단(subset)을 인코딩하는 핵산 단편에 관한 것이다. 또한, 상기 유사체 또는 상기 핵산 단편을 함유하는 면역원성 조성물도 본 발명의 일부분이다.
또한, 본 발명은 면역학적으로 유효한 아밀로이드생성 펩타이드 유사체의 동정 방법 분 아니라 상기 유사체를 함유하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 및, 예컨대, 중추신경계(CNS)의 아밀로이드 침적에 의한 것과 같은 아밀로이드의 침적에 의한다는 특징을 갖는 다른 질병의 치료 및 예방에 있어서의 개선된 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 아밀로이드 침적을 수반하는 병리 상태를 갖는 질병에 걸려있거나, 또는 걸릴 위험이 있는 환자에 있어서, 관련 단백질 또는 그의 성분에 대한 항체의 생산을 가능하게 함으로써 아밀로이드의 (바람직하지 않은) 침적을 하향-조절하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 유용한 폴리펩타이드의 제조 방법 및 이와 같이 변형된 폴리펩타이드를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 변형 단백질을 인코딩하는 핵산 단편 및 이러한 핵산 단편을 포함하는 벡터와 이들에 의하여 형질전환된 숙주 세포 및 세포주를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 유용할 뿐 아니라, 변형 폴리펩타이드 또는 이러한 변형 포리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물에 사용되는 침적 폴리펩타이드의 유사체의 동정(identification) 방법을 제공한다.
도 1은 Aβ 단백질 Aβ-43(또는 C-100)에 대한 항체 반응을 발생시키려는 목적으로 아밀로이드 전구체 단백질로부터 유도된 오토백(AutuVac) 변형체의 개략도이다. APP가 도면의 상단에 개략적으로 나타나 있으며, 나머지 개략적인 구조물은 에피토프 P2 및 P30 모델이 APP의 다양한 절단체 내로 삽입되거나 치환된다는 것을 보여준다. 도면에서, 검정색 패턴은 APP 단독 서열을 나타내며, 두 방향의 비스듬한 평행선은 APP의 세포외 부분이며, 어두운 수직 평행선은 APP의 막통과 도메인이고, 밝은 수직 평행선은 APP의 세포내 도메인이고, 굵은 비스듬한 평행선은 P30 에피토프를 나타내고, 가느다란 비스듬한 평행선은 P2 에피토프를 나타낸다. 실선 상자는 Aβ-42/43를 나타내고 실선 상자와 점선상자 모두는 C-100을 나타낸다. "Abeta"는 Aβ를 나타낸다.
정의
본 발명의 경계와 범위를 명확히 하기 위하여 본 명세서와 청구범위에 사용된 다음의 많은 용어들을 상세히 정의하고 설명할 것이다.
본 명세서에서 호환성 있게 사용되는 "아밀로이드(amyloid)"와 "아밀로이드단백질(amyloid protein)"라는 용어는 길이가 정해지지 않은 단백성 비분지 원섬유의 한 종류를 의미한다. 아밀로이드 원섬유(amyloid fibrils)는 콩고 레드(Congo Red)에 염색되는 특징을 나타내고, 폴리펩타이드 사슬이 β-시트(β-sheets)로 조직화된 교차-β구조를 공유한다. 아밀로이드(amyloid)는 일반적으로 매우 상이한 전구체 구조를 갖지만 모두 β-시트 나선형 프로토필라멘트(β-sheet helix protofilament)의 빌딩 블록인 미스폴드(misfolded) 형으로의 구조적 전환을 거칠 수 있는 아밀로이드생성 단백질(amyloidogenic proteins)로부터 유래된다. 정상적으로, 아밀로이드 원섬유의 지름은 약 70 내지 약 120 Å 사이에서 다양하다.
"아밀로이드생성 단백질(amyloidogenic protein)"이란 용어는 그 자체가 침적물의 일부가 되거나, 침적물의 형성을 초래하는 생합성 경로(biosynthetic pathway)의 일부가 됨으로써, 아밀로이드 침적물의 형성에 관여하는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 아밀로이드생성 단백질의 예로서 APP 및 Aβ를 들 수 있으며, 또한, 이들의 대사에 수반되는 단백질도 아밀로이드생성 단백질일 수 있다. 많은 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 본 명세서에서 상세히 논의된다.
본 명세서에서 "아밀로이드 폴리펩타이드(amyloid polypeptide)"는 인간 또는 다른 포유동물(또는 원상태의 아밀로이드생성 단백질과 B-세포 에피토프의 상당량을 공유하는 이들의 절단물(trunvates))로부터 유래되는 상기 아밀로이드생성 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 나타낸다 - 따라서, 예컨대, 아밀로이드생성 폴리펩타이드는 아밀로이드생성 폴리펩타이드 전구체의 실질적 부분을 포함할 수 있다 (Aβ의 경우, 하나의 가능한 아밀로이드생성 폴리펩타이드는 유래된 APP일 수 있다). 또한, 원핵생물계에서 생성되는 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 비글리코실화된 형태는, 예컨대 효모 또는 다른 비-포유류 진행생물 발현 시스템의 사용에 기인하는 다양한 글리코실화 패턴을 갖는 형태와 같이, 상기 용어의 범위 내에 포함된다. 그러나, "아밀로이드생성 폴리펩타이드"라는 용어가 사용되는 경우, 본 폴리펩타이드는 처치할 동물에 주어질 때 정상적으로는 비-면역원성이라는 것을 알아야 한다. 즉, 아밀로이드생성 폴리펩타이드는 자가-단백질이거나, 또는 문제되는 동물의 아밀로이드생성에 대한 면역 반응을 정상적으로는 발생시키지 않는 이러한 자가-단백질의 유사체이다.
"아밀로이드생성 폴리펩타이드의 유사체(analogue of an amyloidogenic polypeptide)"는 자신의 일차구조가 변화된 아밀로이드생성 폴리펩타이드이다. 이러한 변화는, 예컨대 아밀로이드 폴리펩타이드가 적절한 융합 파트너와 융합된 형태(즉, 아미노산 잔기의 C 및/또는 N-말단 부가를 배타적으로 수반하는 일차구조에 있어서의 변화), 및/또는 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 있어서의 삽입 및/또는 결실 및/또는 치환의 형태일 수 있다. 또한, 상기 용어는 유도 아밀로이드생성 분자를 포함한다 - 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 변형에 관한 다음의 논의를 참고. 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 아밀로이드 또는 그의 전구체일 경우, 유사체는 아밀로이드의 정상적인 전구체 단백질(들)에 대한 항체를 잘 유도하지 못하거나 유도할 수 없도록 하기 위하여 구성될 수 있으며, 이에 의하여, 아밀로이드 단백질의 전구체인 폴리펩타이드의 (생리학적으로 정상인) 비응집 형태의 바람직하지 않은 방해를 피할 수 있다.
인간 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 이종(xeno)-유사체 (예컨대, 개(canine) 또는 돼지(porcine) 유사체)의 인간에서의 백신으로서의 사용으로 인하여 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 바람직한 면역성을 생산한다는 것을 추측할 수 있다. 면역화를 위한 이러한 이종-유사체의 사용 또한 본 발명의 일부로 고려된다.
"폴리펩타이드(polypeptide)"라는 용어는 본 명세서에서 2 내지 10 아미노산 잔기의 짧은 펩타이드, 11 내지 100 아미노산 잔기의 올리고펩타이드, 및 100 아미노산 잔기 이상의 폴리펩타이드를 모두 의미한다. 게다가, 상기 용어는 또한 단백질, 즉, 한 가지 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 기능적 생분자를 의미하며; 두 가지 이상의 폴리펩타이드를 포함할 때, 이들은 복합체를 형성하며, 공유적으로 연결되거나 비공유적으로 연결될 수 있다. 단백질 내 폴리펩타이드(들)는 글리코실화 및/또는 지질화(lipidated) 되거나, 및/또는 보결분자단(prosthetic groups)을 포함할 수 있다.
"T-림프구(T-lymphocyte)" 및 "T-세포(T-cell)"란 용어는 다양한 세포-매개 면역 반응 뿐 아니라 체액성 면역에 있어서의 헬퍼 활성(helper activity)을 담당하는 흉선 기원의 림프구를 위하여 호환성 있게 사용될 것이다. 마찬가지로, "B-림프구(B-lymphocyte)" 및 "B-세포(B-cell)"는 항체-생산 림프구를 위하여 호환성 있게 사용될 것이다.
"서브시퀀스(subsequence)"이라는 용어는, 자연 발생적 아밀로이드 아미노산 서열 또는 핵산 서열에서 각각 유래하는, 3 개 이상의 아미노산, 또는, 적절한 경우, 3 개 이상의 뉴클레오타이드의 모든 연속적인 확장을 의미한다.
"동물(animal)"은 본 명세서에서 일반적으로 인간(Homo sapiens), 개(Canis domesticus) 등과 같은 동물 종(바람직하게는 포유동물)을 나타내며, 단지 하나의 동물만을 의미하는 것은 아니다. 그러나, 본 발명의 방법에 따라 면역화되는 개체가 모두 동일한 면역원(들)으로 동물을 면역화시킬 수 있도록 하는 동일한 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 실질적으로 함유하고 있다는 것이 중요하기 때문에, 상기 용어는 상기한 동물 종의 개체군(population)을 또한 나타낸다. 만약, 예컨대, 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 유전적 변이체가 상이한 인간 개체군에 존재한다면, 각 개체군에 있어서 최적의 방식으로 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 자기관용(autotolerance)을 파괴할 수 있도록 하기 위하여, 이들 상이한 개체군에 상이한 면역원을 사용하는 것이 필요할 수 있다. 본 명세서에서 상기 동물이 면역 체계를 갖는 살아있는 존재라는 것은 통상적 전문가에게 자명할 것이다. 상기 동물은 포유 동물과 같이 척추 동물인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 "생체 내 아밀로이드의 하향-조절(in vivodown-regulation of amyloid)"는 살아있는 유기체 내에서의 관련된 종류의 침적된 아밀로이드의 총량의 감소를 의미한다. 하향-조절(down-regulation)은 몇 가지 방법에 의하여 달성될 수 있다: 이들 중에서, 잘못된 응집(misaggregation)을 막기 위한, 항체 결합에 의한 아밀로이드의 단순한 방해가 가장 간단한 것이다. 그러나, 항체가 결합하여 보족 세포[scavenger cell; 예컨대, 대식세포(macrophages) 및 다른 식세포(phagocytic cells)] 에 의하여 아밀로이드가 제거되도록 하는 것 및 항체가아밀로이드 형성을 유발하는 다른 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 방해하는 것 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다
"...면역 체계에 효과적인 제시(effecting presentation... to the immune system)"란 표현은 동물 면역 체계가 통제된 방법으로 면역원성 항원자극(immunogenic challenge)을 받게 되는 것을 의미한다. 아래의 설명에 나타난 바와 같이, 면역 체계의 항원자극은 많은 방법으로 달성될 수 있으며, 그 중에서 가장 중요한 것은 "파마신(pharmaccines; 즉 진행 중인 질환을 치료하거나 호전시키기 위하여 투여되는 백신)"을 함유하는 폴리펩타이드를 사용한 백신화, 또는 핵산 "파마신" 백신화이다. 달성되어야 할 가장 중요한 결과는 동물 내에서의 면역 성분 세포가 면역학적으로 유효한 방법으로 항원에 직면한다는 것인 반면, 이러한 결과를 달성하는 정확한 방법은 본 발명의 근원적인 발명적 사상에 있어서 보다 덜 중요하다.
"면역학적 유효량(immunogenically effective amount)"이라는 용어는 관련 분야에서 일반적인 의미, 즉, 면역원과 면역학적 특징을 공유하는 병원성 제제를 상당히 사용하는 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원의 양의 의미를 갖는다
'아밀로이드생성 폴리펩타이드가 "변형(modified)" 되었다'라는 표현을 사용할 때, 이는 본 명세서에서 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 골격(backbone)을 구성하는 폴리펩타이드의 화학적 변형을 의미한다. 이러한 변형은 예컨대 아미로이드생성 폴리펩타이드 서열에 있어서의 특정 아미노산 잔기의 유도체화(derivatization, 예컨대 알킬화)일 수 있으며, 다음의 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 바람직한 변형은 아미노산 서열의 일차구조의 변화를 포함한다.
"아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 자기관용(autotolerance towards an amyloidogenic polypeptide)"을 논할 때, 백신화될 개체군에 있어서 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 자기-단백질이기 때문에, 개체군 내의 정상적인 개체는 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 면역반응을 준비(mount)하지 않는다는 것을 알아두어야 한다; 그러나, 동물 개체군에 있어서 어떤(occasional) 개체는, 예컨대 자가면역 장애의 일부로서, 천연 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체를 생산할 수 있다는 사실을 배제시킬 수 없다. 하여튼, 동물은 자기 자신의 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대하여 정상적으로 자기관용적일 뿐이지만, 다른 동물 종 또는 다른 표현형을 갖는 개체군으로부터 유도된 유사체 또한 상기 동물에 의하여 관용될 수 있다는 것을 배제할 수 없다.
"외래 T-세포 에피토프(foreign T-cell epitope)" (또는: "외래 T-림프구 에피토프(foreign T-lymphocyte epitope)")는 MHC 분자에 결합할 수 있고, 동물 종에서 T-세포를 자극할 수 있는 펩타이드이다. 본 발명에서의 바람직한 외래 T-세포 에피토프는 "무차별(promiscuous)" 에피토프, 즉, 한 동물 종 또는 개체군 내의 MHC 분자의 특정 종류의 실질적 분획(fraction)에 결합하는 에피토프이다. 매우 제한된 수의 이러한 무차별 T-세포 에피토프만이 알려져 있고, 이들은 아래에서 상세히 논의될 것이다. 무차별 T-세포 에피토프는 또한 "보편적(universal)" 에피토프로 표현된다. 본 발명에 따라서 동물 개체군의 가능한 한 커다란 분획 내에서 효과적이도록 사용되는 면역원을 위하여, 1) 동일한 유사체 내에 몇 개의 외래 T-세포에피토프를 삽입하거나, 2) 각각의 유사체가 삽입된 상이한 무차별 에피토프를 갖는 유사체를 제조하는 것이 필요할 수 있다는 것을 알아야 한다. 또한, 외래 T-세포 에피토프의 개념이 잠재(cryptic) T-세포 에피토프, 즉, 자기-단백질로부터 유도되고, 문제의 자기-단백질의 일부가 되지 않고 고립된 형태로 존재할 때, 면역원성 거동을 나타낼 뿐인 에피토프의 사용을 또한 포함한다는 것을 알아야 한다.
"외래 T 헬퍼 림프구 에피토프(foreign T helper lymphocyte epitope)"[외래 TH 에피토프(a foreign THepitope)]는, MHC 클래스 II 분자에 결합하고 MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)의 표면 상에 나타날 수 있는, 외래 T-세포 에피토프이다.
(생)분자의 "기능적 부분(functional part)"은 본 명세서에서 분자가 나타내는 한 가지 이상의 생화학적 또는 생리학적 효과를 담당하는 분자의 부분을 의미하는 것을 의도한다. 많은 효소와 다른 효과기(effector)가 문제의 분자가 나타내는 효과를 담당하는 활성 부위를 가진다는 것이 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 분자의 다른 부분은 효과를 강화시키는 가용성 및 안정성을 제공할 수 있으며, 따라서, 이러한 효과가 본 발명의 특정 구체예에 있어서 관련성이 없다면 제외될 수 있다. 예컨대, 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 변형된 부분으로서 특정 사이토카인(cytokines)을 사용하는 것이 가능하며(아래의 상세한 설명 참조), 이러한 경우, 아밀로이드생성 폴리펩타이드와의 연결이 필요한 안정성을 제공할 수 있기 때문에 안정성의 문제점과 무관해진다.
"아쥬반트(adjuvant)"는 백신 기술 관련 분야에서 일반적인 의미, 즉, 1) 그 자체로서 백신의 면역원에 대한 특이적 면역 반응을 준비(mounting)할 수 없지만, 2) 그럼에도 불구하고, 면역원에 대한 면역 반응을 강화시킬 수 있는 물질 또는 조성물의 의미를 갖는다. 또는, 바꾸어 말하면, 아쥬반트만으로의 백신화는 면역원에 대한 면역 반응을 제공하지 않고, 면역원으로의 백신화는 면역원에 대한 면역 반응을 유발시키거나 유발시키지 않을 수 있지만, 면역원과 아쥬반트를 사용한 복합 백신화는 면역원만을 사용하여 유도되는 것보다 강력한 면역원에 대한 면역 반응을 유도한다.
분자의 "표적화(targeting)"는 본 명세서에서 동물 내의 도입과 관련된 분자가 특정 조직(들)에 있어서 우선적으로 나타나거나 또는, 특정 분자 또는 특정 분자 유형과 우선적으로 결합되는 상태를 나타내는 것으로 의도된다. 상기 효과는 표적화를 촉진하는 조성물 내 분자의 형성을 포함하는 많은 방법 또는 표적화를 촉진하는 그룹의 분자에 있어서의 도입에 의하여 성취될 수 있다. 이러한 논점들이 다음에서 상세히 논의될 것이다.
"면역 체계의 자극(Stimulation of the immune system)"은 물질 또는 성분의 조성물이 일반적이고, 비-특이적인 면역자극(immunostimulatory) 효과를 나타내는 것을 의미한다. 많은 아쥬반트 및 추정적 아쥬반트 (예컨대, 특정 사이토카인)는 면역 체계를 자극할 수 있는 능력을 공유한다. 면역자극제를 사용한 결과, 동시적인 또는 이어서 일어나는 면역원으로의 면역화가 면역원의 고립적 사용과 비교하여 상당히 보다 효과적인 면역 반응을 유도하는 것을 의미하는 면역 체계의"경계(alertness)"가 증가된다..
아밀로이드 하향-조절의 바람직한 구체예
본 발명에서 면역원으로서 사용되는 아밀로이드생성 폴리펩타이드는, 그의 아미노산 서열에 적어도 하나의 변화가 존재하는 방식으로 변형된 분자인 것이 바람직한데, 이는, 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 자기관용의 모든 중요한 파괴를 달성할 수 있는 기회가 그러한 방법으로 크게 촉진되기 때문이다 - 이는, 예컨대, 야생형 Aβ를 이용한 면역화를 Aβ 변형체 분자를 사용한 면역화와 비교한 본 명세서의 실시예 2에 제시된 결과로부터도 명백하다. 변형된 분자의 사용이, 예컨대 아쥬반트를 함유하는 제제와 같이, 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 자기관용의 파괴를 보다 더 촉진하는 제제에 있어서의 이러한 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 사용 가능성을 배지하지 않는다는 것을 알아야 한다.
자기-단백질을 인지하는 잠재적 자가-반응성 B-림프구가 정상적인 개체 내에 생리학적으로 존재한다는 것이 Dalum I et al., 1996, J. Immunol. 157 : 4796-4804에 나타나 있다. 그러나, 관련 자기-단백질과 반응하는 항체를 실제로 생산하도록 유도된 이들 B-림프구를 위하여, T-헬퍼 림프구 (TH-세포 또는 TH-림프구)를 생산하는 사이토카인으로부터 보조제(assistance)가 필요하다. 항원 제시 세포(APCs)에 의하여 제시될 때, 일반적으로 T-림프구는 자기-단백질로부터 유도되는 T-세포 에피토프를 인지하지 않기 때문에, 정상적으로, 이러한 도움은 제공되지 않는다. 그러나, 자기-단백질에서의 "이질성(foreignness)"의 요소를 제공함으로써(즉, 면역학적으로 중대한 변형을 도입함으로써), 외래 요소를 인지하는 T-세포가 APC (예컨대, 처음에는, 단핵세포) 상의 외래 에피토프를 인지하도록 활성화시킨다. 변형된 자기-단백질 상의 자기-에피토프르 인지할 수 있는 폴리클로날 B-림프구 (또한, APCs이기도 함)는 또한 항원을 흡수하고, 이어서 그들의 외래 T-세포 에피토프를 제시하며, 이어서 활성화된 T-림프구가 이들 자기-반응성 폴리클로날 B-림프구에 대한 사이토카인 보조를 제공한다. 이들 폴리클로날 B-림프구에 의하여 생산되는 항체가, 천연 폴리펩타이드 내에 또한 존재하는 것을 포함하는, 변형된 폴리펩타이드 상의 상이한 에피토프와 반응하고, 비-변형 자기단백질과 교차-반응하는 항체가 유도된다. 결과적으로, 사실, 삽입된 에피토프(들)만은 숙주에 대하여 외래(이질)적인 반면, T-림프구가 폴리클로날 B-림프구의 개체군이 완전한 외래 항원을 인지하는 것과 같은 작용을 하도록 유도될 수 있다.
자기관용을 파괴시키기 위하여 펩타이드 자기-항원을 변형시키는 몇 가지 방법이 관련 분야에 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 변형은 다음을 포함할 수 있다:
- 한 가지 이상의 외래 T-세포 에피토프의 도입, 및/또는
- 변형된 분자의 항원 제시 세포(APC)로의 표적화를 초래하는 한 가지 이상의 첫 번째 부분의 도입, 및/또는
- 면역 체계를 자극하는 한 가지 이상의 두 번째 부분의 도입, 및/또는
- 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 면역 체계로의 제시를 최적화하는 세 번째 부분의 도입.
그러나, 이러한 모든 변형은 아밀로이드생성 폴리펩타이드 내의 원래의 B-림프구 에피토프의 실질적인 분획을 유지하는 동안 수행되어야 한다. 그 이유는, 천연 분자의 B-림프구 인지가 이에 의하여 강화되기 때문이다.
하나의 바람직한 구체예에 있어서, 측면기(side group, 외래 T-세포 에피토프 또는 상기한 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 부분의 형태로)가 공유적으로 또는 비공유적으로 유도된다. 이는 아밀로이드생성 폴리펩타이드로부터 유도된 아미노산 잔기의 확장이 본래의 아미노산 서열을 변화시키지 않고 또는 적어도 체인 내 각각의 아미노산 사이의 펩티드 결합에 변화를 도입시키지 않고 유도체화된다는 것을 의미한다.
다른 바람직한 구체예는 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 부가(addition)(재조합 방법 또는 펩타이드 합성에 의하여 달성됨; 아미노산의 보다 긴 확장을 수반하는 변형이 융합 폴리펩타이드를 발생시킬 수 있다). 이러한 구체예의 특히 바람직한 하나의 형태가 국제공개 제95/05849호에 개시된 기술인데, 여기에는, 유사체 내의 자기-단백질의 전체적인 3차 구조를 유지하면서, 동시에, 많은 아미노산 서열(들)이 면역우성(immunodominant) T-세포 에피토프를 각각 포함하는 상응하는 수의 아미노산 서열(들)로 치환된 자기-단백질 유사체로 면역화시킴으로써 자기-단백질을 하향-조절하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위하여, 변형(삽입, 부가, 결실 또는 치환)이 외래 T-세포 에피토프를 발생시키고, 동시에 아밀로이드생성 폴리펩타이드 내의 B-세포 에피토프의 실질적인 수를 유지시킨다면, 그것으로 충분하다. 그러나, 유도되는 면역 반응의 최대 효능을 얻기 위하여, 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 전체적인 3차 구조가 변형된 분자 내에서 유지되는 것이 바람직하다.
다음의 일반식은 본 발명에 의하여 일반적으로 변환되는 분자 구조물을 나타낸다:
(MOD1)s1(아밀로이드e1)nl(MOD2)s2(아밀로이드e2)n2....(MODx)sx(아밀로이드ex)nx(I)
- 여기서, 아밀로이드e1- 아밀로이드ex는 독립적으로 동일하거나 또는 비-동일한고, 외래 측면기를 함유하거나 함유하지 아니할 수 있는 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 서브시퀀스를 함유하는 x B-세포 에피토프이고, x는 3 이상의 정수이고, n1 - nx는 0 이상의 x 정수이고(적어도 하나는 1 이상), MOD1-MODx은 보존된 B-세포 에피토프 사이에서 유도된 x 변형이고, s1-sx는 0 이상의 정수(아밀로이드ex서열에 측면기가 도입되지 않은 경우, 적어도 하나는 1 이상임)이다. 따라서, 구조물의 면역원성(immunogenicity)에 대한 일반적인 기능적 억제가 주어진다면, 본 발명은 아밀로이드생성 펩타이드의 본래 서열의 모든 종류의 과변이(permutations) 및 거기에서의 모든 종류의 변형을 허용한다. 따라서, 예컨대 생체 내에서 반대 효과를 나타내거나 또는 일반적으로 세포 내인 부분의 생략을 보여서 바람직하지 않은 면역학적 반응을 일으킬 수 있는 아밀로이드생성 폴리펩타이드 서열 부분의 생략에 의하여 얻어지는 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 본 발명에 포함된다.
상기한 구조물의 한 바람직한 형태에 있어서, 적용가능 한 경우, 아밀로이드단백질의 서브시퀀스를 함유하는 B-세포 에피토프가 아밀로이드가 유래된 전구체 폴리펩타이드 내에서 세포외적으로 노출되어 있지 않다. 이와 같이 아밀로이드 에피토프를 선택함으로써, 아밀로이드 전구체를 생산하는 세포와 반응하는 항체가 생성되지 않고, 그럼으로써, 발생하는 면역 반응이 바람직하지 않은 아미로이드 침적물에 대한 면역 반응으로 제한된다는 것이 확실하게 된다. 적용가능 한 경우, 아밀로이드가 아닌 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 적합하도록 유사하게 선택할 수 있다. 이들 경우에 있어서, 예컨대, 이들이 생산된 세포와의 어떠한 결합도 없을 때 세포 외 상태에 단지 노출된 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 에피토프에 대한 면역을 유도하는 것이 가능할 것이다.
B-세포 에피토프의 실질적 분획 또는 본 명세서에 개시된 바와 같이 변형된 단백질의 전체적인 3차 구조의 유지는 몇 가지 방법에 의하여 달성될 수 있다. 한 가지 방법은, 단순히, 아밀로이드 폴리펩타이드에 대하여 유도된 폴리클로날 항혈청(예컨대, 래빗에서 제조된 항혈청)을 제조한 후, 이 항혈청을 생산된 변형 단백질에 대한 시험 시약(예컨대, 경쟁적 ELISA 내에서)으로서 사용하는 것이다. 이러한 항혈청과의 제한된(그러나 여전히 중요하고 특이적인) 반응성이 본래의 B-세포 에피토프의 실질적 분획을 유지시키는 것으로 간주되어야 하는 반면, 아밀로이드생성 폴리펩타이드와 같이 항혈청과 동일한 범위로 반응하는 변형된 형태(유사체)는 아미로이드생성 폴리펩타이드와 동일한 전체적인 3차 구조를 갖는 것으로 간주되어야 한다.
선택적으로, 아밀로이드생성 폴리펩타이드 상의 구별되는 에피토프와 반응하는 모노클로날 항체의 셀렉션을 제조할 수 있고 테스트 패널로서 사용할 수 있다. 이러한 접근은 1) 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 에피토프 지도작성(mapping) 및 2) 제조되는 유사체에서 유지되는 에피토프의 지도작성을 가능하게 한다는 이점을 갖는다.
물론, 세 번째 접근은 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 생물학적으로 활성인 이들의 절단물(truncate, 상기한 바를 참조하라)의 3-차원적 구조를 분석하고 이를 제조된 유사체의 분석된 3-차원적 구조와 비교하는 것이다. 3-차원적 구조는 X-선 회절 조사 및 NMR-분광법의 도움으로 분석할 수 있다. 주어진 분자의 3차 구조에 대한 유용한 정보를 제공하기 위하여, 3차 구조와 관련된 추가적인 정보를 단지 순수한 형태의 폴리펩타이드를 요구(반면, X-선 회절은 결정화된 폴리펩타이드의 준비를 요구하고, NMR은 폴리펩타이드의 동위원소 변이체의 준비를 요구함)한다는 이점을 갖는 원편광 2 색성(circular dichroism) 연구로부터 어느 정도까지는 얻을 수 있다. 그러나, 원편광 2 색성은 2차 구조 요소들의 정보를 통하여 정확한 3-차원적 구조의 간접적인 증거만을 제시하기 때문에, 최종적으로, 결정적인 데이터를 얻기 위하여 X-선 회절 및/또는 NMR가 필요하다.
본 발명의 하나의 바람직한 구체예는 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 B-림프구 에피토프의 복합적인 제시(즉, 적어도 하나의 B-세포 에피토프가 2 개의 위치에 존재하는 일반식 I)를 사용한다. 이러한 효과는 다양한 방법으로 달성될 수 있으며, 예컨대, 단순히 m이 2 이상의 정수인 (아밀로이드생성 펩타이드)m구조를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제조한 후 본 명세서에서 논의된 변형을 하나 이상의 아미로이드 서열에 도입함으로써 달성될 수 있다. 도입되는 변형은 B-림프구 에피토프의 하나 이상의 중복(duplication) 및/또는 합텐(hapten)의 도입을 포함하는 것이 바람직하다. 선택된 에피토프의 복합적인 제시를 포함하는 이들 구체예는 단지 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 소부분만이 백신 제제에 있어서 구성 성분으로서 사용되는 상황에 있어서 특히 바람직하다.
상기한 바와 같이, 외래 T-세포 에피토프의 도입은 하나 이상의 아미노산 삽입, 부가, 결실 또는 치환의 도입에 의하여 달성될 수 있다. 물론, 정상적인 상황은 아미노산 서열에 있어서의 하나 이상의 변화(예컨대, 완전한 T-세포 에피토프의 삽입 또는 완전한 T-세포 에피토프에 의한 치환)의 도입일 것이지만, 달성해야 할 중요한 목표는, 항원제시세포(APC)에 의하여 프로세싱 되는 경우, 유사체가 APC 표면 상의 MCH 클래스 II 분자 환경에 존재하는 이러한 면역우성 T-세포 에피토프를 발생시킬 것이다. 따라서, 만약에 적절한 위치의 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 외래 TH에피토프에서도 또한 발견될 수 있는 많은 아미노산 잔기를 포함한다면, 외래 TH에피토프의 도입은 아미노산 삽입, 부가, 결실 및 치환에 의한 외래 에피토프의 잔존 아미노산을 제공함으로써 달성될 수 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 삽입 또는 치환에 의하여 완전한 TH에피토프를 도입할 필요가 없다는 것이다.
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 및 25삽입, 치환, 부가 또는 결실과 같이, 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 부가의 수는 2 이상인 것이 바람직하다. 삽입, 치환, 부가 또는 결실의 수가, 100 이하, 90 이하, 80 이하, 및 70 이하와 같이, 150을 초과하지 않는 것이 보다 더 바람직하다. 치환, 삽입, 결실 또는 부가의 수가 60을 초과하지 않는 것이 특히 바람직하며, 특히, 상기 수는 50 또는 심지어는 40을 초과하지 않아야 한다. 가장 바람직한 것은 30을 초과하지 않는 것이다. 아미노산 부가에 있어서, 얻어지는 구조물이 융합 폴리펩타이드 형태인 경우, 이들은 종종 100 보다 상당히 높다는 것을 인지하여야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 하나 이상의 외래 면역우성 T-세포 에피토프의 도입에 의한 변형을 포함한다. T-세포 에피토프의 면역우성 문제는 문제되는 동물 종에 따라 다르다는 것을 알 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "면역우성(immunodominance)"이란 용어는 백신화된 개체/개체군 내에서 현저한 면역반응을 일으키는 에피토프를 지칭하는 것이며, 한 개체/개체군에서 면역우성인 T-세포 에피토프가, 비록 그것이 동일한 종의 다른 개체 내의 MHC-II 분자와 결합할 수 있다하더라도, 그 동일한 종의 다른 개체 내에서 반드시 면역우성인 것은 아니라는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 목적을 위하여, 면역 우성 T-세포 에피토프는 항원에 존재 시에 T-세포 헬프 제공에 효과적인 T-세포 에피토프이다. 통상적으로, 면역우성 T-세포 에피토프는, 그들이 나타나는 폴리펩타이드에 관계없이, 실질적으로 언제나 MHC 클래스 II 분자와 결합되어 존재한다는 유전적 특징을 갖는다
또 다른 중요한 점은 T-세포 에피토프의 MHC 제한의 문제이다. 일반적으로,자연 발생 T-세포 에피토프는 MHC 제한되며, 즉, T-세포 에피토프를 구성하는 특정 폴리펩타이드가 단지 MHC 클래스 II 분자의 아집단에 효과적으로 결합할 것이다. 이것은 차례로, 하나의 특이적 T-세포 에피토프의 사용이 개체군의 분획에서만 상기 분획의 크기에 따라 효과적인 백신 성분을 생성하는 대부분의 경우에 있어서, 동일한 분자 내에 보다 많은 T-세포 에피토프를 포함하거나 또는, 선택적으로, 구성 성분이 유도되는 T-세포 에피토프의 성질에 의하여 서로 구별되는 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 변이체인 복합-성분 백신을 제조하는 것이 필요하다는 효과를 갖는다.
만약, 사용되는 T-세포의 MHC 제한이 완전하게 알려지지 않았다면(예컨대, 백신화된 동물이 잘 한정되지 않은 MHC 조성을 갖는 상황), 다음의 일반식에 의하여 특정 백신 조성물로써 변환된 개체군의 분률(fraction)을 결정할 수 있다.
- 여기서,p i 는 개체군에 있어서의 백신 조성물에 존재하는 외래 T-세포 에피토프에 대한 응답자(responders)의 빈도이고, n은 백신 조성물 내의 외래 T-세포 에피토프의 총 수이다. 따라서, 개체군 내에서 각각 0.8, 0.7 및 0.6의 반응 빈도를 갖는 3 개의 외래 T-세포 에피토프를 포함하는 백신 조성물은
1 - 0. 2 x 0. 3 x 0. 4 = 0. 976 과 같이 나타나며,
즉, 통계적으로 개체군 중 97.6 퍼센트가 백신에 대한 MHC-II 매개 반응을준비할 것이다.
상기의 일반식은 사용되는 펩타이드의 다소 정확한 MHC 제한 패턴이 알려져 있는 상황에는 적용되지 않는다. 예컨대, 특정 펩타이드가 HLA-DR 대립유전자, DR1, DR3, DR5, 및 DR7에 의하여 인코딩되는 인간 MHC-II 분자에 단지 결합한다면, HLA-DR 대립유전자에 의하여 인코딩되는 잔존 MHC-II에 결합하는 다른 펩타이드와 함께 하는 상기 펩타이의 사용이 문제되는 개체군에 있어서 100 % 적용범위를 성취할 것이다. 마찬가지로, 만약 두 번째 펩타이드가 DR3 및 DR5에 단지 결합한다면, 이러한 펩타이드의 부가가 적용범위를 전혀 증가시키지 않을 것이다. 만약 개체 반응의 계산을 순수하게 백신 내의 T-세포 에피토프의 MHC 제한에 기초하여 한다면, 특정 백신 조성물에 의하여 커버되는 개체군의 분률(fraction)을 다음의 일반식을 사용하여 결정할 수 있을 것이다.
-여기서, ψj는 개체군 내에서의 백신 내 T-세포 에피토프 중 어느 하나에 결합하고 3 개의 알려진 HLA 부위(DP, DR 및 DQ)의 j 번째에 속하는 MHC 분자를 인코딩하는 대립유전자 단상형의 빈도의 합이다; 실제로, 우선 어떤 MHC 분자가 백신 내의 각각의 T-세포를 인지할 것인지를 결정한 후, 이들이 유형별(DP, DR 및 DQ)로 열거하고- 그리고 나서, 상이하게 열거된 대립유전자 단상체의 개체 빈도를 각 유형별로 합산하여, ψ1, ψ2및 ψ3을 산출하였다.
일반식 II의p i 값은 이론상의p i 값을 초과하는 것이 발생할 수 있다:
- 여기서,v i 는 개체군 내에서의 백신 내 i 번째 T-세포 에피토프와 결합하고 3 개의 알려진 HLA 부위(DP, DR 및 DQ)의 j 번째에 속하는 MHC 분자를 인코딩하는 대립유전자 단상형의 빈도의 합이다. 이는 개체군의 1-p i 가 fresidual_ i = (p i -p i )/(1-p i )의 응답자 빈도라는 것을 의미한다. 따라서, 일반식 III는 일반식 V를 산출하기 위하여 조절될 수 있다:
- 여기서, 1-ψresiduai- i 는 음의 값인 경우 제로(0)이다. 일반식 V는 모든 에피토프가 동일한 단상체 세트에 대하여 지도작성된 단상체일 것을 요구한다는 것을 인지하여야 한다.
따라서, 유사체에 도입될 T-세포 에피토프를 선택할 때, 소용이 되는 모든 에피토프의 이해를 포함시키는 것이 중요하다: 1) 개체군의 각 에피토프에 대한 응답자 빈도, 2) MHC 제한 데이터, 및 3) 개체군 내의 관련된 단상체의 빈도.
동물 종 또는 동물 개체군의 개체들의 많은 개체군에서 활성이 있는 많은 자연 발생 "무차별" T-세포가 존재하며, 이들은 백신 내로 바람직하게 도입되어서,동일한 백신 내의 매우 많은 수의 상이한 유사체의 필요를 감소시킨다.
본 발명에 있어서, 무차별 에피토프는 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid, 예컨대, P2 및 P30 에피토프), 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid), 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 적혈구응집소(hemagluttinin, HA), 및 P. 팔시파룸 CS 항원(P. falciparumCS antigen)으로부터 선택되는 에피토프와 같은 자연 발생 인간 T-세포 에피토프일 수 있다.
몇 해가 지나서, 많은 다른 무차별 T-세포 에피토프가 동정되었다. 특히, 상이한 HLA-DR 대립유전자에 의하여 인코딩되는 HLA-DR 분자의 많은 부분에 결합할 수 있는 펩타이드가 동정되었고, 이들은 모두 본 발명에 따라서 사용되는 유사체 내로 도입될 가능성이 있는 T-세포 에피토프이다. 또한, 모두 본 명세서에 참조로서 관여하는 다음의 참고문헌에 논의된 에피토프를 참조하라: WO 98/23635 (Frazer IHet al., The University of Queensland로 양도) ; Southwood Set al., 1998, J. Immunol.160: 3363-3373 ; Sinigaglia Fet al., 1988, Nature336: 778-780 ; Chicz RMet al., 1993, J. Exp. Med178: 27-47 ; Hammer Jet al., 1993, Cell74: 197-203 ; and Falk Ket al., 1994, Immunogenetics39: 230-242. 또한, 후자의 참고문헌은 HLA-DQ 및 -DP 리간드를 다룬다. 이들 5 개의 참고문헌에 열거된 모든 에피토프는, 이들과 공통된 모티프를 공유하는 에피토프와 같이, 본 발명에 사용되는 후보 천연 에피토프로서 관련한다.
선택적으로, 상기 에피토프는 MHC 클래스 II의 상당한 부분에 결합할 수 있는 모든 인공 T-세포 에피토프일 수 있다. 본 명세서서에서, 국제공개 제95/07707호 및 대응 논문 Alexander Jet al., 1994, Immunity 1 : 751- 761(두 기재 모두 본 명세서에 참조로서 포함되어 있다)에 기재된 팬 DR 에피토프 펩타이드(pan DR epitope peptides, "PADRE")는 본 발명에 따라서 사용되는 에피토프를 위한 흥미로운 후보자들이다. 이들 문헌에 기재되어 있는 가장 효과적인 PADRE 펩타이드 투여시의 안정성을 향상시키기 위하여 C-말단 및 N-말단의 D-아미노산을 운반한다는 것을 인지하여야 한다. 그러나, 본 발명은 관련 에피토프를 이후에 효소적으로 파괴되어야 하는 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드 부분으로서 APCs의 리보좀 구획 내부에 포함시켜서 MHC-II 분자 환경에 서열 제시를 가능하게 하는 것을 목적으로 하며, 그러므로, D-아미노산을 본 발명에 사용되는 에피토프 내에 포함시키는 것은 유리하지 않다.
하나의 바람직한 PADRE 펩타이드는 아미노산 서열 "AKFVAAWTLKAAA"을 또는 이들의 면역학적으로 유효한 서브시퀀스를 갖는 것이다. 이 것 및 동일한 MHC 제한의 결함을 갖는 다른 에피토프는 본 발명의 방법에 사용되는 유사체내에 존재하여야 하는 바람직한 T-세포 에피토프이다. 이러한 초-무차별(super-promiscuous) 에피토프는 오직 하나의 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 백신화된 동물의 면역 체계에 제시되는 본 발명의 가장 단순한 구체예를 가능하게 한다.
상기한 바와 같이, 아미로이드생성 폴리펩타이드의 변형은 또한 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 APC 또는 B-림프구로 표적화하는 첫 번째 부분의 도입을 포함한다. 예컨대, 상기 첫 번째 부분은 B-림프구 특이적 표면 항원 또는 APC 특이적 표면 항원에 대한 특이적 결합 파트너일 수 있다. 많은 이러한 특이적 표면항원이 관련 기술 분야에 알려져 있다. 예컨대, 상기 부분은 이에 대한 B-림프구 또는 APC 상에 수용체가 존재하는 탄수화물(예컨대, 만난 또는 만노오스)일 수 있다. 선택적으로, 두 번째 부분은 합텐일 수 있다. 또한, APCs 또는 림프구 상의 표면 분자를 특이적으로 인식하는 항체 단편이 첫 번째 부분으로 사용될 수 있다(표면 분자는 예컨대 FCγRI와 같은 단핵세포 및 대식세포의 FCγ 수용체 또는, 선택적으로, CD40 또는 CTLA-4와 같은 다른 모든 특이적 표면 마커일 수 있다). 이들 모든 전형적인 표적화 분자가 아쥬반트의 부분으로서 사용될 수 있다는 것을 인지하여야 한다(아래 참조).
면역 체계를 강화시키기 위하여 변형된 아밀로이드생성 폴리펩탄이드를 특정 세포 유형으로 표적화시키기 위한 대안 또는 보완으로써, 면역 체계를 자극하는 상기의 두 번째 부분을 포함하여 면역 체계의 반응성의 수준을 증가시키는 것이 가능하다. 이러한 두 번째 부분의 전형적인 예로서 사이토카인, 및 열-쇼크 단백질(and heat-shock proteins) 또는 분자 카페론(molecular chaperones) 뿐 아니라 이들의 유효한 부분이 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 적합한 사이토카인은 또한 백신 조성물 내에서 아쥬반트로서 정상적으로 작용하는 것, 즉, 예컨대, 인터페론 γ (IFN-γ), 인터루킨 1(interleukin 1, IL-1), 인터루킨 2 (IL-2), 인터루킨 4 (IL4), 인터루킨 6 (IL-6), 인터루킨 12 (IL-12), 인터루킨 13 (IL-13), 인터루킨 15 (IL-15), 및 과립세포-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)이고; 선택적으로 사이토카인 분자의 기능적 부분이 두 번째 부분으로서 족할 수 있다. 이러한 사이토카인의 아쥬반트 물질로서의 사용에 대하여 다음의 논의를 참조하라.
본 발명에 있어서, 두 번째 부분으로서 사용되는 적합한 열-쇼크 단백질 또는 분자 카페론은 HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (gp96 라고도 알려짐, Wearsch PAet al., 1998, Biochemistry 37 : 5709-19 참조), 및 칼레티큘린(calreticulin, CRT)일 수 있다.
선택적으로, 두 번째 부분은 리스테리오라이신(listeriolycin, LLO), 지질 A 및 이열성 엔테로톡신(heat-labile enterotoxin)과 같은 독소일 수 있다. 또한, MDP (뮤라밀 디펩타이드), CFA (완전 프로인드 아쥬반트), 및 트레할로스 디에스테르 TDM 및 TDE과 같은 많은 마이코박테리아 유도체가 사용될 수 있다.
또한, 면역 체계에 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 제시하는 것을 강화하는 세 번째 부분의 도입 가능성이 본 발명에 있어서 하나의 중요한 구체예이다. 관련 기술 분야에 이러한 원리의 몇 가지 예가 알려져 있다. 예컨대, 보렐리아 부르크도르페리 단백질 OspA (Borrelia burgdorferi protein OspA) 내의 팔미토일 리피데이션 앤커(palmitoyl lipidation anchor)가 자가-아쥬반팅 폴리펩타이드(self-adjuvating polypeptides)을 제공하기 위하여 사용될 수 있다는 것이 알려져 있다(예컨대, 국제공개 제96/40718호 참조) - 지질화된 단백질은 폴리펩타이드의 리피데이션 부분 및 이들로부터 뻗어나온 분자의 잔존 부분으로 구성되는 코어와 함께 미셀-유사(micelle-like) 구조를 형성하고, 항원 결정기(antigenic determinants)의 복합 제시를 초래하는 것으로 보인다. 따라서, 상이한 리피데이션앤커[예컨대, 미리스틸기(myristyl group), 파네실기(farnesyl group), 제라닐-제라닐기(geranyl-geranyl group), GPI- 앤커(GPI-anchor), 및 N-아실 디글리세라이드기(N-acyl diglyceride group)]를 사용하는 이러한 접근 및 관련된 접근의 사용이 본 발명의 바람직한 구체예이며, 이는, 특히, 재조합적으로 생산되는 단백질 내 이러한 리피데이션 앤커의 제공이 매우 간단하고, 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 융합 파트너로서 예컨대 자연 발생적 단독 서열만을 필요로 하기 때문이다. 다른 가능성은 보조 인자 C3의 C3d 단편 또는 C3 자체의 사용이다 (Dempseyet al., 1996, Science271, 348-350 및 Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology16, 458-462 참조).
면역 체계에 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 중요한 에피토프 부위의 복합 카피(예컨대 2 이상)의 바람직한 제시하는 본 발명의 다른 구체예는 특정 분자에 아밀로이드생성 폴리펩타이드, 이들의 변이체 또는 서브시퀀스를 공유적으로 결합시키는 것이다. 예컨대, 덱스트란과 같은 탄수화물과 같은 폴리퍼가 사용될 수 있으며(예컨대 Lees Aet al., 1994, Vaccine12: 1160-1166 ; Lees Aet al., 1990, J Immunol.145: 3594-3600 참조), 또한, 만노오스 및 만난이 대체적으로 사용 가능하다. 예컨대, 대장균(E. coli) 및 다른 박테리아로부터의 내막 단백질 또한 유용한 접합 파트너이다. 파상풍 톡소이드 디프테리아 톡소이드 및 소의 혈청 알부민(BSA)과 같은 전형적인 담체 분자 또한 바람직하고 유용한 접합 파트너이다.
아밀로이드생성 폴리펩타이드를 탄수화물과 같은 폴리하이드록시폴리머에 공유적으로 결합시키는 바람직한 구체예는 개별적으로 폴리하이드록시폴리머에 결합된 한 가지 이상의 아밀로이드생성 폴리펩타이드 및 한 가지 이상의 외래 T-헬퍼 에피토프의 사용을 수반한다(즉, 외래 T-헬퍼 에피토프와 아밀로이드생성 폴리펩타이드는 서로 융합되어 있지 않고, 오히려 그 후에 담체 골격으로서 사용되는 폴리하이드록시폴리머에 결합되어 있다.). 또한, 이러한 구체예는 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 적절한 B-세포 에피토프 운반 부위가 짧은 펩타이드 확장(stretches)으로 구성될 때 가장 바람직하다 - 이는 이러한 접근이 완성 면역원성 제제 내의 선택된 에피토프의 복합적 제시를 성취하기 위한 하나의 매우 편리한 방법이기 때문이다.
외래 T-헬퍼 에피토프와 아밀로이드생성 (폴리) 펩타이드의 결합이 펩타다아제에 의하여 절단될 수 있는 아마이드 결합에 의하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 방법은 APCs가 접합체를 형성할 수 있고 동시에 접합체를 프로세싱할 수 있고 이어서 MHC 클래스 II 환경 내에 외래 T-세포 에피토프를 제시할 수 있는 효과를 갖는다.
펩타이드(아밀로이드생성 폴리펩타이드와 외래 에피토프 모두)를 결합시키기 위한 한 가지 방법은 트레실기(tresyl group)를 갖는 적절한 폴리하이드록시폴리머를 활성화시키는 것이다; 에컨대, 국제공개 제00/05316호 및 미국특허출원 제5, 874, 469호(두 문헌 모두 본 명세서에 참조로서 관계한다)에 개시된 바와 같은 트레실화된 폴리사카라이드르르 제조하고 이들을 통상적인 고상 또는 액상 펩타이드 합성 기술에 의하여 제조된 T-세포 에피토프와 아밀로이드생성 펩타이드에 결합시키는 것이 가능하다. 완성된 생성물은, 여기에 자신의 N-말단 또는 다른 사용 가능한 질소 부분에 의하여 부착된, 아밀로이드생성 폴리펩타이드 및 외래 T-세포 에피토프를 갖는 폴리하이드록시폴리머 골격으로 구성된다. 원한다면, 모든 사용가능한 아미노기를 보호하기 위하여 아미로이드생성 폴리펩타이드를 합성하는 것이 가능하지만, N-말단에 있는 것은 완성 보호된 펩타이드를 트레실화된 덱스트란 부분에 연속적으로 결합시키고, 최종적으로 완성 접합체를 탈보호시킨다. 이러한 접근의 특수한 예는 아래의 실시예에 설명되어 있다.
국제공개 제00/05316호 및 미국특허출원 제5, 874, 469호에 나타난 바와 같은 수용성 폴리사카라이드 분자를 사용하는 대신, 교차 결합된 폴리사카라이드 분자를 사용하여, 폴리펩타이드와 폴리사카라이드 간의 특정 접합체를 얻는 것이 동등하게 가능하다 - 국부적인 침적 효과를 얻는 것과 APCs에 대하여 매력적인 표적인 미립자를 얻는 다는 두 가지의 목적이 달성되기 때문에, 이는 폴리펩타이드의 면역 체계에 향상된 제시를 유발시킨다고 생각된다. 이러한 미립자 시스템을 사용하는 접근이 또한 실시예에 상사히 설명되어 있다.
아밀로이드생성 폴리펩타이드 내 변형 도입의 근본적 선택 영역의 고려는 a) 알려지고 예측된 B-세포 에피토프의 제시, b) 삼차 구조의 제시, c) "프로듀서 세포" 상에 존재하는 B-세포 에피토프의 회피(avoidance) 등이다. 여하튼, 상기한 바와 같이, 상이한 위치에 T-세포 에피토프가 도입된 한 세트의 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드 분자를 선별하는 것은 매우 용이하다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예가 인간 Aβ의 하향-조절을 수반하기 때문에, 결과적으로 상기된 아밀로이드 폴리펩타이드는 인간 Aβ 폴리펩타이드인 것이바람직하다. 이러한 구체예에 있어서, 인간 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 SEQ ID NO : 2 의 하나 이상의 아미노산 서열을 동일하거나 상이한 길이의 하나 이상의 아미노산 서열로 치환하고 외래 TH에피토프를 함유함으로써 변형되는 것이 특히 바람직하다. 변형 아밀로이드생성 APP 및 Aβ의 바람직한 구체예가 실시예로서 P2와 P30 에피토프를 사용하는 도 1에 개략적으로 나타나 있다. 이러한 구조물 배후의 이론을 실시예에서 상세히 논하였다.
보다 상세하게, SEQ ID NO : 2 내로 도입되는 TH함유(또는 완성) 아미노산 서열을 SEQ ID NO : 2 내의 모든 아미노산에 도입시킬 수 있을 것이다. 즉, 모든 아미노산 1-770에 대하여 도입하는 것이 가능하지만, SEQ ID NO : 2의 아미노산 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 및 714 중 어느 하나에 대하여 도입하는 것이 바람직하다. 이는 아미노산 1-671 중 일부 또는 이들 모두, 또는 아미노산 715-770 중 일부 또는 이들 모두의 결실과 결합될 수 있다. 게다가, 치환 기술을 사용하는 경우, SEQ ID NO : 2의 아미노산 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 및 714 중 어느 하나를 도입과 함께 결실시킬 수 있다.
아밀로이드생성 폴리펩타이드 및 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 제제
이들을 동물에 투여함으로써, 아밀로이드생성 폴리펩타이드 및 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 동물 면역 체계에의 제시를 유발할 때, 폴리펩타이드 제제는 기술분야에 일반적으로 알려진 원리를 따른다.
모두 본 명세서에 참조로서 관계하는 미국특허 제4, 608, 251호 ; 제4, 601, 903호 ; 제4, 599, 231호 ; 제4, 599, 230호 ; 제4, 596, 792호 ; 및 제4, 578, 770호에 의하여 예시된 바와 같이, 활성 성분으로서 펩타이드 서열을 함유하는 백신의 제조가 기술분야에 일반적으로 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이러한 백신은 액상 용액 또는 현탁액으로서 주입 가능하게 제조되고; 주입 전 액체 내 용액, 또는 현탁액에 적절한 고체 형태 또한 제조될 수 있다. 또한 상기 제제는 유화될 수도 있다. 활성 면역원성 성분은 종종 약학적으로 허용 가능하고 활성 성분과 양립 가능한 부형제와 혼합된다. 적절한 부형제로서, 예컨대, 물, 살린, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등과 이들의 혼합물이 있다. 추가적으로, 원한다면, 백신은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 또는 백신의 효능을 강화시키는 아쥬반트와 같은 보조 물질을 소량 포함할 수 있다; 다음의 아쥬반트의 상세한 논의를 참조.
백신은 통상적으로, 예컨대, 피하(subcutaneously), 피내(intracutaneously), 피내(intradermally), 피하(subdermally) 또는 근육내(intramuscularly) 주사에 의하여 비경구적으로 투여한다. 다른 방식의 투여에 적합한 추가적인 제제는 좌약 및, 어떤 경우에는, 경구, 구강내, 설하(sublinqual), 복강내, 질내, 항문, 경막외, 척수, 및 두개내 제제를 포함한다. 좌약의 경우, 통상적인 결합제 및 담체로서 예컨대 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있다; 이러한 좌약은 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2 %, 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 생성될 수 있다. 경구용 제제는, 예컨대 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카르보네이트 등의 약학적 그레이드와 같은 정상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 타블렛, 환약, 캡슐, 지속적 방출 제제 또는 파우더 형태이고, 10 내지 95%, 바람직하게는 25 내지 70 %, 의 활성성분을 함유한다. 경구용 제제의 경우, 콜레라 독이 유용한 제제 파트너이다(또한, 가능한 접합 파트너이다).
폴리펩타이드는 중성 또는 염 형태로서 백신 내에 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산성 부가 염(아미노산의 유리 아미노기로 형성됨) 및 예컨대, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된다
또한, 유리 카르복시기와 함께 형성된 염은 예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
백신은 투여 제제와 모순없는 방법 및 치료적으로 유효하고 면역원성인 양으로 투여한다. 투여되는 양은 예컨대, 개체의 면역 시스템이 면역 반응을 준비하는 능력, 및 원하는 보호 정도를 포함하여 치료되는 환자에 따라 달라진다. 적합한 투여량 범위는 대략 백신 당 활성성분 수 백 마이크로그램이며, 바람직한 범위는, 약0. 1 μg 내지 2, 000 μg (심지어는 1-10 mg 범위의 양보다 많아도 달성된다), 약 0.5 μg 내지 1,000 μg과 같은 범위 내, 보다 바람직하게는 약 1 μg 내지 500 μg 범위 내이고 특히 바람직하게는 약 10 μg 내지 100 μg 범위 내이다. 초기 투여 추가항원자극 샷을 위한 적절한 처방 계획(regimens) 또한 다양하지만, 초기 투여 후의 접종 또는 다른 투여에 의하여 정형화되어 있다.
적용 방법은 폭넓게 다양할 수 있다. 벡신의 투여를 위한 모든 전형적인 방법이 사용 가능하다. 이들은 생리학적으로 허용 가능한 고체 염기에 대한 경구 적용 또는 생리학적으로 허용 가능한 분산액에 있어서는 주사 등에 의하여 비경구 적으로 적용하는 것을 포함한다. 백신의 투여량은 투여 경로에 따라 달라질 것이며, 백신 접종될 환자의 연령 및 항원 제제에 따라서 다양할 것이다.
백신의 몇 몇 폴리펩타이드는 백신 내에서 충분히 면역원성이지만, 다른 몇 몇 경우에는 백신이 아쥬반트 물질을 추가적으로 포함할 때 면역 반응이 강화될 것이다.
백신에 대하여 아쥬반트 효과를 달성하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 일반적인 이론 및 방법이 "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6에 상세히 설명되어 있고, 또한 "Vaccines : New Generationn Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis Get al.(eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에도 상세히 설명되어 있으며, 두 문헌은 모두 본 명세서에 참조로서 관계한다.
자기항원에 대한 자기관용의 파괴를 촉진하는 것으로 증명될 수 있는 아쥬반트의 사용이 특히 바람직하다; 사실, 이는 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 자가백신 내의 활성 성분으로서 사용되는 경우에 필수적이다. 적절한 아쥬반트의 비-제한적인 예가 다음의 면역 표적화 아쥬반트로 구성된 군으로부터 선택된다; 독, 사이토카인 및 마이코박테이아 유도체와 같은 면역 조절 아쥬반트; 오일 제제; 폴리머; 미셀 형성 아쥬반트; 사포닌; 면역자극 복합 매트릭스(ISCOM matrix); 미립자; DDA ; 알루미늄 아쥬반트; DNA 아쥬반트; γ-인슐린 ; 및 인캡슐레이팅 아쥬반트. 일반적으로, 유사체 내에서 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 부분으로 유용한 화합물 및 제제와 관련된 상기의 기재는 또한 본 발명의 백신의 아쥬반트에의 이들의 사용를 필요한 변경을 가하여 기재하고 있다.
아쥬반트의 적용은, 통상 완충 살린 내에 0.05 내지 1 퍼센트 용액으로 사용되는 알루미늄 하이드록사이드 또는 포스페이트(alum)과 같은 제제, 0.25 퍼센트 용액으로 사용되는 당의 합성 폴리머(예컨대, Carbopol )와의 혼합물, 각각 30 초 내지 2 분 동안 70℃ 내지 101℃ 사이의 범위의 온도로 열처리하는 것에 의한 백신 내 단백질의 응집물의 사용을 포함하며, 교차-결합제에 의한 응집물도 가능하다. 항체(Fab 단편)로 처리된 펩신으로의 알부민에 대한 재활성화에 의한 응집물,C. parvum와 같은 박테리아 세포 또는 그람음성균의 내독소 또는 리포폴리사카라이드 성분과의 혼합물, 만나이드(mannide) 모노-올레산염(Aracel A)과 같은 생리학적으로 허용 가능한 오일 매개체(vehicle) 내의 에멀젼 또는 블록 성분으로 사용되는 20 퍼센트의 퍼플루오로카본(perfluorocarbon, Fluosol-DA) 용액과의 에멀젼 또한사용할 수 있다. 스쿠알렌 및 IFA와 같은 오일과의 혼합물 또한 바람직하다.
본 발명에 따르면, DDA (dimethyldioctadecylammonium bromide)은 DNA 및 γ-인슐린과 같이 아쥬반트의 유력한 후보자이며, 또한, QuilA 및 QS21과 같은 퀼라야 사포닌(quillaja saponins)과 완전 프로인드 아쥬반트 및 불완전 프로인드 아쥬반트도 RIBI와 같이 유용하다. 또한, 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 상기한 C3 및 C3d, 및 뮤라밀 디펩타이드(MDP)도 가능하다.
리포좀 제제 역시 아쥬반트 효과를 제공하는 것으로 알려져 있으며, 따라서, 본 발명에 있어서 리포좀 아쥬반트가 바람직하다.
면역 자극 복합 매트릭스형 (ISCOMO matrix) 아쥬반트 역시 본 발명에 있어서 바람직한데, 이는, 특히, 이러한 아쥬반트 형이 APCs에 의하여 MHC 클래스 II 발현을 상향-조절할 수 있는 능력을 보이기 때문이다.
ISCOMO 매트릭스는 퀼라야 사포나리아(Quillaja saponaria), 콜레스테롤, 및 포스포리피드로부터 얻은 (임의로 분획화된) 사포닌 (트리테르페노이드)으로 구성된다. 면역원성 단백질과 혼합될 때, 완성된 미립자 제제는 사포닌이 60-70% w/w를 구성하고, 콜레스테롤 및 포스포리피드가 10-15% w/w를 구성하고 단백질이 10-15% w/w를 구성하는 ISCOM 입자라고 알려진 것이다. 면역 자극 복합체의 조성 및 사용에 관한 상세한 설명을 예컨대, 아쥬반트를 다루는 상기한 텍스트북들에서 찾을 수 있으며, Morein Bet al., 1995, Clin. Immunother.3: 461-475, Barr IG 및 Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol.74: 8-25 (두 문헌 모두 본 명세서에 참조로서 관계함) 역시 완전한 면역자극 복합체를 제조하기 위한 유용한 설명을제공한다.
아쥬반트 효과를 달성하는 또 다른 매우 관심있는 (따라서, 바람직한) 가능성은 Gosselinet al., 1992 (본 명세서에 참조로서 관계함)에 개시된 기술을 사용하는 것이다. 간단히 말하면, 항원을 단핵세포/대식세포 상의 Fcγ 수용체에 대한 항체(또는 항체 단편에 결합하는 항원)과 접합시킴으로써, 본 발명의 항원과 같이 관련된 항원의 제시를 강화시킬 수 있다. 특히, 항원과 항-FcγRI 사이의 접합물은 백신화의 목적을 위한 면역원성을 강화시키는 것으로 나타났다.
다른 가능성은 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 변형 형태 내의 첫 번째 및 두 번째 부분에 대한 후보자로서 상기된 표적화 및 면역 조절 물질(즉, 사이토카인)의 사용을 수반한다. 이와 관련하여, 폴리 I:C와 같은 사이토카인의 합성 유발인자 또한 가능성이 있다.
적절한 마이코박테리아 유도체는 뮤라밀 디펩타이드, 완전 프로인드 아쥬반트, RIBI 및 TDM 및 TDE와 같은 트레할로오스의 디에스테르로 구성된 군 중에서 선택된다.
적절한 면역 표적화 아쥬반트는 CD40 리간드 및 CD40 항체 또는 특이적으로 결합하는 이들의 단편(상기의 논의 참조), 만노오스, Fab 단편 및 CTLA-4로 구성된 군 중에서 선택한다.
적절한 폴리머 아쥬반트는 텍스트란, PEG, 전분, 만난, 및 만노오스와 같은 탄수화물; 플라스틱 폴리머; 및 라텍스 비드와 같은 라텍스로 그성된 군 중에서 선택한다.
면역 반응을 조절하는 또 다른 관심있는 방법은 "가상 림프절(virtual lymph node)" (VLN) (ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501에 의하여 개발된 특허 의약 장치) 내에 면역원(임의적으로, 아쥬반트 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및 매개물과 함께)을 포함하는 것이다. VLN (가느다란 튜브형 장치)응 림프절의 구조와 기능을 흉내낸 것이다. 피부 아래에의 VLN의 삽입은 사이토카인 및 케모카인의 급증과 함께 무균 감염(sterile inflammation) 부위를 만든다. T- 및 B-세포 뿐 아니라 APCs는 위험신호에 신속하게 반응하고, 염증이 일어난 부위로 향하며, VLN의 다공성 매트릭스 내에 축적시킨다. 항원에 대한 면역반응의 준비에 필요한 항원의 투여량은 VLN 사용 시에 감소하고, 면역 보호가 아쥬반트로서 Ribi를 사용하는 VLN 억제된 전형적인 면역화를 이용하는 백신화에 의하여 제공된다는 것이 알려져 있다. 이러한 기술이 Gelber Cet al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", in :"From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th-15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California"에 개시되어 있다.
백신의 마이크로입자 제제는 많은 경우에 있어서 단백질 항원의 면역원성을 증가시키고, 따라서, 본 발명의 또 하나의 바람직한 구체예가 된다. 마이크로 입자는 폴리머, 지질, 탄수화물 또는 미립자를 만들기에 적합한 다른 분자와 항원의 공-제제(co-formulations)로서 제조되거나, 상기 마이크로입자는 항원 자체만으로 구성된 동종 미립자일 수 있다.
폴리머 기재 마이크로입자의 예로서 폴리머와 항원이 고체 미립자로 압축된 PLGA 및 PVP 기재 미립자가 있다(Gupta, R. K. et. al. 1998). 지질 기재 미립자는 미셀 내에 항원을 포함하는 지질의 미셀(소위, 리포좀)로서 제조할 수 있다(Pietrobon, P. J. 1995). 탄수화물 기재 미립자는 전형적으로 전분 또는 키토산과 같이 적절한 분해성 탄수화물로 제조한다. 폴리머 미립자에 사용되는 방법과 유사한 방법으로 탄수화물 및 항원을 혼합하고 미립자로 압축시킨다 (Kas, H. S.et. al.1997).
항원만으로 구성된 미립자는 다양한 분무 또는 동결건조 기술에 의하여 제조될 수 있다. 통제된 크기의 매우 균일한 미립자를 만들기 위하여 사용되는 초임계 유체 기술(super critical fluid technology)이 본 발명의 목적에 특히 적합하다 (York, P. 1999 & Shekunov, B. et. al. 1999).
백신은 1 년에 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 번과 같이 그것을 필요로 하는 개체에 매년 1-6 회 투여하여야 한다는 것이 요구된다. 본 발명에 따른 바람직한 자가백신의 사용에 의하여 유도된 면역기억이 영구적이지 못하고, 따라서, 면역 체계를 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드로 정기적으로 항원자극시키는 것이 필요하다.
유전적 다양성 때문에, 상이한 개체는 동일한 펩타이드에 대하여 다양한 강도의 면역 반응으로 작용할 것이다. 따라서, 면역 반응을 증가시키기 위하여, 본 발명에 따른 백신은 몇 몇 다른 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 외래 T-세포 에피토프 도입의 선택에 관한 상기의 논의를 참조하라. 백신은 두 가지 이상의펩타이드를 포함할 수 있으며, 이러한 모든 펩타이드는 상기에 정의되어 있다.
결론적으로, 백신은 3-10 개의 상이한 폴리펩타이드와 같이, 3-20 개의 상이한 변형 또는 비변형 폴리펩타이드를 포함할 수 있다..
핵산 백신
펩타이드-기재 백신의 전형적인 투여의 대안으로서, 핵산 백신 기술("핵산 면역화(nucleic acid immunisation)", "유전적 면역화(genetic immunisation)", 및 "유전자 면역화(gene immunisation)"라고 알려지기도 함)이 많은 흥미로운 특징을 제공한다.
우선, 전형적인 백신 접근과 달리, 핵산 백신은 면역원성 제제의 대-규모 생산을 소모하는 리소스(예컨대, 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 생산하는 산업적 규모의 미생물 발효의 형태)를 필요로 하지 않는다. 게다가, 면역원을 의한 정제 및 리폴딩 스킴의 고안이 필요없다. 마지막으로, 유도된 핵산의 발현 산물의 생산을 위하여 백신화된 개체의 생화학적 기관에 의존하기 때문에, 발현 산물의 최적 번역 후 프로세싱이 발생할 것으로 기대된다; 이는, 상기한 바와 같이, 본래의 B-세포 에피토프의 상당한 분획이 변형된 분자 내에 보존되고, 대체로 B-세포 에피토프가 모든 (생)분자(예컨대, 탄수화물, 지질, 단백질 등)의 부분들에 의하여 구성될 수 있기 때문에, 자가백신의 경우에 특히 중요하다. 따라서, 면역원의 천연 글리코실화 및 지질화 패턴은 전체적인 면역원성을 위하여 매우 중요할 수 있으며, 이는 면역원을 생산하는 숙주를 가짐으로써 가장 확실해질 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를인코딩하는 핵산을 동물 세포에 도입시켜서 핵산이 도입된 세포에 의하여 행체 내 발현시킴으로써 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 면역 체계에 제시하는 것을 포함한다.
이러한 구체예에 있어서, 도입된 핵산은 나출 DNA, 대전되거나 대전되지 않은 지질과 함께 제제화된 DNA, 리포좀 내에 제제화된 DNA, 바이러스 벡터에 포함된 DNA, 트렌스펙션-촉진 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 제제화된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 제제화된 DNA, 칼슘 침전제와 함께 제제화된 DNA, 불활성 담체 분자와 결합한 DNA, 예컨대 PLGA (국제공개 제98/31398호에 기재된 마이크로인캡슐레이션 기술을 참조)와 같은 폴리머 또는 키틴이나 키토산 내에 인캡슐레이션된 DNA, 및 아쥬반트와 함께 제제화된 DNA의 형태일 수 있는 DNA가 바람직하다. 여기에서, 실질적으로, 통상적인 백신 제제 내의 아쥬반트의 사용과 관련된 모든 고찰이 DNA 백신 제제에 적용된다는 것을 알 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드 기재 백신 형태에서의 아쥬반트의 사용과 관련된 본 명세서의 모든 기재는 필요한 변경을 가하여 핵산 백신화 기술에의 사용에 적용될 수 있다.
앞에서 상세히 설명된 폴리펩타이드 기재 백신의 투여 스킴 및 투여의 경로와 관련하여, 또한 이들은 본 발명의 핵산 백신에 적용할 수 있으며, 폴리펩타이드를 위한 투여 스킴 및 투여의 경로와 관련된 상기의 모든 논의는 필요한 변경을 가하여 핵산에 적용될 수 있다. 여기에 더하여, 핵산 백신을 적절하게 정맥내 및 동맥내 투여할 수 있다. 또한, 핵산 백신을 소위 유전자 건(gene gun)을 사용하여 투여하는 것이 기술분야에 잘 알려져 있으므로, 이러한 투여 방식 및 이와 등가의 투여 방식을 또한 본 발명의 일부로 간주한다. 마지막으로, 핵산의 투여에 있어서의 VLN의 사용 또한 양호한 결과를 산출하는 것으로 보고되어 있으므로, 이러한 특수한 투여 방식이 특히 바람직하다.
게다가, 면역화 제제로 사용되는 핵산은, 예컨대 유용한 아쥬반트로서 논의된 사이토카인과 같은 상기의 면역조절 물질의 형태로, 첫 번째, 두 번째 및/또는 세 번째 부분을 인코딩하는 부위를 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 바람직한 형태는 유사체의 코딩 부위와 면역조절물질의 코딩부분을 상이한 리딩 프레임으로 또는 적어도 상이한 프로모터 하에 갖는 것을 포함한다. 따라서, 유사체 또는 에피토프가 면역조절물질과의 융합 파트너로서 생산되는 것을 회피한다. 선택적으로, 구별되는 2 개의 뉴클레오타이드 단편을 사용할 수 있지만, 이는, 동일한 분자 내에 포함된 두 개의 코딩 부위를 가질 때, 확실한 공동-발현의 이점 때문에, 보다 덜 바람직하다.
따라서, 본 발며은 또한 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체의 생산을 유도하는 조성물과 관련된 것이고, 상기 조성물은,
- 본 발명의 핵산 단편 또는 벡터(다음의 백터의 논의를 참조), 및
- 상기한 바와 같은 약학적으로 및 면역학적으로 허용 가능한 매개물 및/또는 담체 및/또는 아쥬반트를 포함한다.
정상적인 환경 하에서, 변이체-인코딩 핵산을 발현이 바아러스 프로코터의 조절 하에 있는 벡터의 형태로 도입시킨다. 본 발명에 따른 벡터의 보다 상세한 논의를 위하여 아래의 논의를 참조하라. 또한, 제제와 핵산 백신의 사용에 관한 상세한 설명을 입수 가능하다(Donnelly JJet al,, 1997, Annu. Rev. Immunol.15: 617-648 및 Donnelly JJet al., 1997, Life Sciences60: 163-172 참조. 두 문헌은 모두 본 명세서에 참조로서 관계한다.)
생백신(Live vaccines)
면역 체계에 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 제시를 초래하는 세 본째 대안은 생백신 기술의 사용이다. 생백신에 있어서, 면역 체계에의 제시는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 단편 또는 이러한 핵산 단편을 포함하고 있는 벡터로 형질전환 된 비-병원성 미생물을 동물에 투여함으로써 일어난다. 상기 비-병원성 미생물은, 예컨대 마이코박테리움 보비스 BCG.(Mycobacterium bovisBCG.), 비-병원성 스트렙토코커스 spp.(non-pathogenicStreptococcusspp.), 대장균(E. coli), 살모넬라 spp.(Salmonellaspp.), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 이질균(Shigella) 등과 같은 모든 적절한 약독화(attenuated) 균주(패시징(passaging) 또는 재조합 DNA 기술에 의한 병원성 발현 산물을 제거함으로써 약??화됨)일 수 있다. 최고 기술 수준의 생백신을 다루는 관찰은 예컨대, Saliou P, 1995, Rev. Prat.45: 1492-1496 및 Walker PD, 1992, Vaccine10: 977-990 ( 두 문헌 모두 본 명세서에 참조로서 관계함)에서 찾을 수 있다. 이러한 생백신에 사용된 핵산 단편 및 벡터에 대한 상세한 설명을 위하여 다음의 논의를 참조하라.
박테리아 생백신의 대안으로서, 다음에 논의될 본 발명의 핵산 단편을 백시니아(vaccinia) 균주 또는 다른 적절한 폭스 바이러스와 같은 비-독성 바이러스 백신 백터에 포함될 수 있다.
정상적으로, 비-병원성 미생물 또는 바이러스를 단 한번 동물에게 투여하지만, 어떤 경우에는 보호 면역성을 유지시키기 위하여 일생에 한 번 이상 미생물을 투여하는 것이 필요할 수 있다. 폴리펩타이드 백신화를 위한 상기한 것들과 같은 면역화 스킴이 생백신 또는 바이러스 백신을 사용하는 경우 유용하다는 것을 예상할 수도 있다.
또한, 생백신화 또는 바이러스 백신화를 이전의 또는 이어지는 폴리펩타이드 및/또는 핵산 백신화와 결합시킬 수 있다. 예컨대, 생백신 또는 바이러스 백신으로 1차 면역화 시킨 후 폴리펩타이드 또는 핵산 접근을 사용하는 추가 면역화 시키는 것이 가능하다.
미생물 또는 바이러스는, 예컨대 유용한 아쥬반트로서 논의된 사이토카인과 같이 상기된 면역조절물질의 형태로, 첫 번째, 두 번째 및/또는 세 번째 부분을 인코딩하는 부위를 포함하는 핵산으로 형질변형시킬 수 있다. 이러한 구체예의 바람직한 형태는 유사체의 코딩 부위와 면역조절물질의 코딩부분을 상이한 리딩 프레임으로 또는 적어도 상이한 프로모터 하에 갖는 것을 포함한다. 따라서, 유사체 또는 에피토프가 면역조절물질과의 융합 파트너로서 생산되는 것을 회피한다. 선택적으로, 구별되는 2 개의 뉴클레오타이드 단편을 형질전환제로 사용할 수 있다. 물론, 동일한 리딩 프레임 내에 쳇 번째, 두 번째 및/또는 세 번째 부분을 갖는 것이 발현 산물, 본 발명의 유사체로서 제공할 수 있으며, 이러한 구체예는 본 발명에 있어서 특히 바람직하다.
질병 치료에 있어서 본 발명에 따른 방법의 사용
상기의 논의에서 인식할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법의 제공은 아밀로이드 침적에 의하여 특징화되는 질병의 통제를 가능하게 한다. 여기에서, AD는 본 발명의 방법의 중요한 표적이며 아밀로이드 침적에 의하여 특징화되는 다른 질병 또한 가능한 표적이다. 그러므로, 아밀로이드 활성을 하향-조절하는 본 발명의 방법의 중요한 구체예는 아밀로이드 침적에 의하여 특징화되는 AD 또는 다른 질병을 치료 및/또는 예방 및/또는 개선시키는 것, 본 발명의 방법에 따라서 아밀로이드를 아밀로이드의양이 상당히 감소하는 정도로 하향-조절하는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
아밀로이드의 감소가 아밀로이드 생성 및 아밀로이드 분해/제거 사이의 균형의 반전(inversion), 즉, 아밀로이드 분해/제거 비율이 아밀로이드 생성의 비율을 초과하는 것을 초래하는 것이 특히 바람직하다. 이를 필요로 하는 개체의 면역화의 면역학적 효과 및 수를 신중하게 조절함으로써, 과다한 역효과 없이 아밀로이드 침적의 순수한 감소를 초래하는 시간에 대한 균형을 얻을 수 있다.
또한, 개체에 있어서 본 발명의 방법이 존재하는 아미로이드 침적물을 제거하거나 감소시키지 못한다면, 본 발명의 방법은 새로운 아밀로이드의 생성을 임상적으로 상당히 감소시켜서 질병의 상태가 비-쇠약한 시간을 상당히 연장시키기 위하여 사용될 수 있다. 아밀로이드의 혈청 농도(침적된 물질과 균형을 이룬다고 생각됨)를 측정하거나, 또는 양전자-방출 단층촬영(positron-emission tomography, PET) 스캐닝을 이용함으로써, 아밀로이드 침적 비율을 모니터할 수 있다(Small GW,et al., 1996, Ann N Y Acad Sci 802 : 70-78 참조).
본 방법과 수단이 유사한 방법으로 치료 또는 개성에 사용되는 다른 질병 또는 상태가 상기의 "배경기술"에 기재되어 있으며(전신 아밀로이드증, 성숙기개시당뇨병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 전두측두 치매 및 프리온-관련 전달성 해면상 뇌질환), 또는 하기하는 "다른 아밀로이드 질환 및 이와 연관된 단백질"이란 제목의 단락에 열거되어 있다.
본 발명의 펩타이드, 폴리펩타이드 및 조성물
상기로부터 명백한 바와 같이, 본 발명은 병리학적-관련된 아밀로이드 침적물의 양을 감소시키기 위하여 아밀로이드생성 항원에 대하여 개체를 면역화시키는 개념에 기초를 두고 있다. 이러한 면역화를 얻기 위한 바람직한 방법은 아밀로이드생성 펩타이드의 변형된 형태를 사용하여 이전에 기술분야에 공지되지 않은 분자를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 논의된 변형 분자는 그 자체로 독창적이며, 따라서, 본 발명의 중요한 부분은 동물 아밀로이드생성 폴리펩타이드로부터 유도된 유사체와 관련되어 있으며, 여기서 유사체를 이용한 동물의 면역화가 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 항체의 생산을 유도하는 변형이 도입된다. 바람직하게, 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 사용하는 경우 본 발명의 방법의 다양한 구체예를 논의할 때, 변형의 본성은 상기된 변형의 유형을 따른다. 따라서, 변형 아밀로이드생성 분자와 관계된 본 명세서에 제시된 모든 기재는 본 발명의 아밀로이드생성 유사체를 기재할 목적으로 관계하고, 이러한 모든 기재는 필요한 변경을 가하여 이들 유사체의 설명에 적용한다.
바람직한 변형 아밀로이드생성 분자가 아밀로이드생성 단백질과 70% 이상, 또는 이들의 서브시퀀스와 길이로 10 아미노산 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 초래하는 변형을 포함한다는 것을 알아야 한다. 예컨대 75 % 또는 적어도 80, 85, 90, 또는 95% 이상과 같이 보다 높은 서열 동일성이 바람직하다. 단백질 및 핵산에 대한 서열 동일성은 (N ref -N dif )·100/N ref 로 계산할 수 있으며, 여기서 N dif 는 정렬시켰을 때 두 서열 내의 비-동일 잔기의 총수이고, N ref 는 한 서열 내의 잔기 수이다. 따라서, DNA 서열 AGTCAGTC은 서열 AATCAATC과 75%의 서열 동일성을 갖을 것이다(N dif =2 및 N ref =8).
또한, 본 발명은 본 발명의 방법의 사용에 유용한 조성물과 관련있다. 따라서, 본 발명은 또한 동물 내의 자기-단백질인 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 면역학적 유효량을 포함하는 면역원성 조성물과 관계된 것이고, 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 동물의 자기관용을 파괴하기 위하여 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드는 면역학적으로 허용 가능한 아쥬반트와 함께 제제화되고, 조성물은 약학적 및 면역학적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 매개물 및/또는 담체 및/또는 부형제를 추가적으로 포함한다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 이 부분은 본 발명의 방법의 구체예와 관련하여 기재된 자연 발생 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 제제와 관련있다.
본 발명은 또한 상기에 정의된 유사체의 면역학적 유효량을 포함하는 면역원성 조성물과 관계된 것이고, 상기 조성물은 약학적 및 면역학적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 매개물 및/또는 담체 및/또는 부형제 및 임의적으로 아쥬반트를 추가적으로 포함한다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 이 부분은, 특히 상기한 바와 같은, 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 제제와 관련있다. 따라서, 아쥬반트, 담체 및 매개체의 선택은 아밀로이드의 하향-조절을 위한 본 발명의 방법의 사용을 위한 변형 및 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 설명하는 앞에서 논의된 바에 따른다.
폴리펩타이드는 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라서 제조한다. 유사체를 인코딩하는 핵산 서열의 적절한 벡터에의 도입, 벡터를 이용한 숙주 세포의 형질변형, 숙주 세포에 의한 핵산 서열의 발현, 숙주 세포로부터의 발현 산물 또는 이들의 배양 상청액의 회수, 및 서브시퀀스 정제, 및 임의적으로, 예컨대 리폴딩 또는 유도체화화 같은 추가적 변형을 포함하는 재조합 유전자 기술에 의하여, 보다 긴 폴리펩타이드를 정상적으로 제조한다.
보다 짧은 펩타이드는 고상 또는 액상 펩타이드 합성의 잘 알려진 방법에 의하여 바람직하게 제조한다. 그러나, 이러한 기술에 있어서 최근의 진보는 이들 방법에 의하여 전장(full-length) 폴리펩타이드 및 단백질의 생산을 가능하게 하며, 그러므로, 합성 방법으로 긴 구조물을 제조하는 것 또한 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 핵산 단편 및 벡터
변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 재조합 유전자 기술 뿐 아니라 화학적 합성 또는 반합성에 의하여 제조될 수 있다는 것을 상기 기재로부터 알 수 있다;변형이 단백질 담체(KLH, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드 및 BSA와 같은) 및 물론 탄수화물 폴리머와 같은 비-단백성(non-proteinaceous) 분자에의 결합에 존재하는 경우 및 변형이 아밀로이드생성 폴리펩타이드-유래 펩타이드 체인에의 측쇄 또는 측면기의 부가를 포함하는 경우에도, 후자의 두 가지 선택이 특히 적절하다.
재조합 유전자 기술 및 또한 핵산 면역화의 목적을 위하여, 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 단편은 중요한 화학적 산물이다. 따라서, 본 발명의 한 중요한 부분은 아밀로이드생성 폴리펩타이드 유사체, 즉, 융합 파트너가 부가되거나 삽입된 본래의 서열을 포함하는 아밀로이드생성 폴리펩타이드-유래 폴리펩타이드 또는, 바람직하게는, 삽입 및/또는 부가에 의하여, 바람직하게는 치환 및/또는 결실에 의하여, 외래 T-세포 에피토프가 도입되어 있는 아밀로이드생성 폴리펩타이드-유래 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 단편과 관련있다. 본 발명의 핵산 단편은 DNA 또는 RNA 단편이다.
본 발명의 핵산 단편은 적절한 벡터에 정상적으로 삽입되어 본 발명의 핵산 단편을 운반하는 클로닝 또는 발현 벡터를 형성할 것이다; 이러한 신규한 벡터 또한 본 발명의 일부분이다. 본 발명의 이들 벡터의 구조물과 관련된 상세한 설명이 아래의 형질변형 세포 및 미생물 부분에 논의될 것이다. 적용의 목적 및 유형에 따라서, 상기 벡터는 플라스미드, 파아지, 코스미드, 미니-염색체, 또는 바이러스의 형태일 수 있으며, 특정 세포에서만 일시적으로 발현하는 나출 DNA 또한 중요한 벡터이다. 바람직한 본 발명의 클로닝 및 발현 벡터는 자율복제 가능하고, 그에 의하여, 이후의 클로닝을 위한 고도의 복제 또는 고도의 발현의 목적을 위한 높은 복제수를 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 벡터의 일반적인 개요는 5' →3' 방향 및 실시 가능한 연결에 있어서의 다음의 특징을 포함한다: 본 발명의 핵산 단편의 발현을 유발시키는 프로모터, 임의적으로 분비(세포외 상태 또는, 적용가능한 경우, 주변세포질로의) 또는 폴리펩타이드 단편의 막 내로의 삽입을 가능하게 하는 선도(leading) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 단편, 및 임의적으로 종결자(terminator)를 인코딩하는 핵산. 프로듀서 균주 또는 세포주 내에서의 발현 벡터를 사용하는 조작 시에, 형질변형 세포의 유전적 안정성의 목적을 위하여 숙주 세포 내로 도입시 벡터를 숙주 세포 게놈 내로 통합시키는 것이 바람직하다. 반면, 동물 내에서의 생체 내 발현을 발생시키기 위하여 사용되는 벡터를 사용하여 조작하는 경우 (즉, DNA 백신화에 있어서 벡터의 사용의 경우), 안정성의 이유를 위하여, 벡터가 숙주 세포 게놈 내에 통합될 수 없는 것이 바람직하다; 통상적으로, 노출 DNA 또는 비-통합 바이러스 벡터가 사용되고, 이의 선택이 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 벡터는 숙주 세포를 형질전환시켜 본 발명의 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 생산하기 위하여 사용한다. 본 발영의 일부분이기도 한 이러한 형질전환 세포는 본 발명의 핵산 단편 및 벡터의 증식, 또는 본 발명의 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 재조합적 생산을 위하여 사용되는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다. 또한, 상기 형질전환 세포는 박테리아 막 또는 변형 아밀로이드생성폴리펩타이드의 세포-벽 내로 통합 또는 분비시키 위하여 핵산 단편(하나 또는 다수의 복제물)이 삽입되어 있는 적합한 생백신 균주일 수 있다.
본 발명의 바람직한 형질전환 세포는 박테리아[예컨대, 에스케리챠 종 (예컨대,E. coli], 바실러스(예컨대,Bacillus subtilis), 살모넬라, 또는 마이코박테리아(바람직하게는 비-병원성, 예컨대, M. bovis BCG)], 효모(예컨대,Saccharomyces cerevisiae), 및 원생생물이다. 선택적으로, 상기 형질전환 세포는 진균류, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포와 같은 다세포 생물에서 유래된다. 인간에서 유래된 세포가 가장 바람직하다(아래의 세포주 및 벡터의 논의 참조). 최근의 결과는 원하는 자의 실험실 내에서의 재조합적 생산을 위한 상업적으로 구입 가능한 초파리(Drosophila melanogaster) 세포주[Invitrogen으로부터 구입한 슈나이더 2(Schneider 2, S2) 세포주 및 벡터 시스템 and vector system available from Invitrogen)의 사용에 있어서의 중대한 전망을 보여주고, 따라서 이러한 발현 시스템이 특히 바람직하다.
클로닝 및/또는 최적화된 발현을 위하여, 형질전환 세포가 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있는 것이 바람직하다. 핵산 단편을 발현시키는 세포가 본 발명의 바람직하고 유용한 구체예이다; 이들은 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 소규모 또는 대규모 제조를 위하여 사용되거나 또는, 비-병원성 박테리아의 경우, 생백신 내의 백신 성분으로서 사용될 수 있다.
형질전환 세포에 의한 변형된 분자의 생산의 경우, 발현 산물을 배양 배지로 배출시키거나 형질전환 세포의 표면상으로 운반시키는 것이, 필수적이지는 않지만, 편리하다.
효과적인 프로듀서 세포가 동정된 경우, 이에 기초하여, 본 발명의 벡터를 운반하고 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 단편을 발현시키는 안정한 세포주를 확립하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 이러한 안정한 세포주는 본 발명의 유사체를 분비하거나 운반하여, 이들의 정제를 용이하게 한다.
일반적으로, 숙주 세포와 양립 가능한 종으로부터 유래된 조절 서열 및 레플리콘이 숙주와 관련되어 사용된다. 벡터는 보통 복제 부위, 또는 형질전환 세포 내에서의 표현형 선택을 제공할 수 있는 표지 서열(marking sequences)을 운반한다. 예컨대, 대장균은 통상적으로 대장균 종으로부터 유래되는 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다(예컨대, Bolivaret al., 1977 참조). pBR322 플라스미드는 암피실린 및 테트라마이신 저항을 위한 유전자를 포함하여, 형질전환 세포를 동정하기 위한 용이한 방법을 제공한다. pBR 플라스미드 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 파아지는 발현을 위하여 원핵 미생물에 의하여 사용될 수 있는 프로모터를 포함하거나 포함하도록 변형되어야 한다.
재조합 DNA 구조물에 가장 일반적으로 사용되는 이들 프로모터는 B-락타마제[B-lactamase, 페니실리나아제(penicillinase)] 및 락토오스 프로모터 시스템 (Changet al., 1978 ; Itakura et al., 1977 ; Goeddelet al., 1979) 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel et al., 1979 ; EP-A-0 036 776)을 포함한다. 이들이 가장 일반적으로 사용되는 반면, 다른 미생물 프로모터가 발견되고 사용되었고, 이들의 뉴클레오타이드 서열과 관련된 상세한 설명이 공개되어, 숙련된기술자들이 이들을 플라스미드 벡터와 기능적으로 결합시킬 수 있도록 한다 (Siebwenlist et al., 1980). 원핵세포로부터 얻은 특정 유전자는 이들 자신의 프로모터 서열로부터 대장균 내에서 효율적으로 발현될 수 있으며, 인위적인 방법으로 다른 프로모터를 부가시킬 필요가 없다.
원핵세포에 더하여, 효모 배양물과 같은 진핵 미생물을 사용할 수 있고, 여기서 프로모터는 발현을 유도할 수 있어야 한다. 사카로마이세스 세레비시아세(Saccharomyces cerevisiase), 또는 일반적인 베이커 효모(baker 's yeast)는 진핵세포 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용되며, 다른 많은 균주도 일반적으로 이용 가능하다. 사카로마이세스 내에서의 발현을 위하여, 예컨대, 플라스미드 YRp7가 일반적으로 사용된다(Stinchcombet al., 1979 ; Kingsmanet al., 1979 ; Tschemperet al., 1980). 이러한 플라스미드는, 예컨대 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 (Jones, 1977)와 같이, 트립토판 내에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이주를 위한 선택 마커르를 제공하는 trp1 유전자를 이미 포함한다. 그래서, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp1 손상의 존재는 트립토판의 부재하에서의 성장에 의하여 형질전환을 탐지하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
효모 벡터에 있어서의 적절한 프로모팅 서열은 3-포스포글리세레이트 키나아제(3-phosphoglycerate kinase, Hitzman et al., 1980) 또는, 에놀라아제(enolase), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 헥소키나아제(hexokinase), 피루베이트 탈탄산효소(pyruvate decarboxylase),포스포프룩토키나아제(phosphofructokinase), 글루코오스-6-포스페이트 이성화효소(glucose-6-phosphate isomerase), 3-포스포글리셀이트 무타아제(3-phosphoglycerate mutase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 트리오세포스페이트 이성화효소(triosephosphate isomerase), 포스포글루코오스 이성화효소(phosphoglucose isomerase), 및 글루코카나아제와 같은 다른 해당 효소(gycolytic enzymes, Hesset al., 1968 ; Hollandet al.., 1978)를 위한 프로모터를 포함한다. 또한, 적절한 발현 플라스미드의 제작에 있어서, 이들 유전자와 결합된 종결 서열을 mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공하기 위하여 발현되는 원하는 발현 벡터의 3' 서열 내로 연결시킨다.
성장 조건에 의하여 조절되는 전사의 추가적인 이점을 갖는 다른 프로모터는 알코올 탈수소효소 2(alcohol dehydrogenase 2), 이소시토크롬 C(isocytochrome C), 산성 포스파타아제(acid phosphatase), 질소 대사와 결합된 분해효소, 및 상기한 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 및 말토오스 및 갈락토오스 이용을 담당하는 효소를 위한 프로모터 부위이다. 효모와 양립 가능한(yeast-compatible) 프로모터, 복제 원점 및 종결 서열을 포함하는 모든 플라스미드 벡터가 적절하다.
미생물에 더하여, 다세포 생물로부터 유래된 세포의 배양물을 숙주로서 사용할 수 있다. 원칙적으로, 척추동물 배양물 유래든지 또는 무척추동물 배양물 유래든지 간에, 이러한 모든 세포 배양물은 처리 가능하다. 그러나, 척추동물 세포에 가장 지대한 관심이 모아지며, 배양물(조직 배양) 내에서의 척추동물의 증식이 근년에는 일상적인 절차가 되었다(Tissue Culture, 1973). 이러한 유용한 숙주 세포주의 예로서 VERO 및 HeLa 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포주, 및 W138, BHK, COS-7 293, 스포돕테라 프루기페다(Spodoptera frugiperda, SF) 세포 (완전한 발현 시스템으로서 Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U. S. A. 및 Invitrogen로부터 상업적으로 입수 가능), 및 MDCK 세포주가 있다. 본 발명에 있어서, 특히 바람직한 세포주는 Invitrogen(PO Box 2312, 9704 CH Groningen, 네덜란드)에서 구입한 S2 이다.
이러한 세포를 위한 발현 벡터는 일반적으로 (필요하다면) 복제 원점, 발현될 유전자의 앞에 위치하는 프로모터, 필요한 리보좀 결합 부위와 함께, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열을 포함한다.
포유동물 세포에서의 사용을 위하여, 발현 벡터에 대한 조절 기능은 종종 바이러스 물질에 의하여 제공된다. 예컨대, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스(Adenovirus 2) 및, 가장 빈번하게는 원숭이 바이러스 40(Simian Virus 40, SV40)에서 유래된다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는, 두 개 모두 SV40 바이러스 복제 원점을 또한 포함하는 단편으로서 바이러스로부터 용이하게 얻을 수 있기 때문에, 특히 유용하다(Fiers et al., 1978). 바이러스 복제 원점에 위치하는HindIII 부위로부터BglI 부위 쪽으로 확장된 약 250 bp를 포함한다면, 보다 작은 또는 보다 큰 SV40 단편 또한 사용될 수 있다. 또한, 조절 서열이 숙주 세포 시스템과 양립 가능하다면, 정상적으로 원하는 유전자 서열과 결합된 조절 서열 또는 프로모터를 사용하는 것이, 가능하고, 때로는 바람직하다.
복제 원점은, SV40 바이러스 또는 다른 바이러스(예컨대, 폴리오마, 아데노, VSV, BPV)에서 유래될 수 있는 것과 같이, 외생 원점을 포함하는 구조물에 의하여 제공되거나, 또는 숙주 세포 염색체 복제 메카니즘에 의하여 제공될 수 있다. 만약 벡터가 숙주 세포 염색체 내에 통합된다면, 후자가 종종 충분하다.
유용한 유사체의 동정
자연 발생 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 모든 가능한 변이체 또는 변형이 동물 내에서 본래의 형태와 교차-반응하는 항체를 유도하는 능력을 갖는 것은 아니라는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 그러나, 본 명세서에서 논의된 면역학적 반응성을 위한 최소한의 요구를 충족시키는 변형 아밀로이드생성 분자를 위한 효과적인 표준 선별을 제공하는 것은 어렵지 않다. 따라서, 본 발명의 또 다른 부분은 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 (비-면역원성) 자기-단백질인 동물 종 내의 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함할 수 있는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 동정을 위한 방법과 관련된 것이며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 펩타이드 합성 또는 유전공학 기술에 의하여, 아미노산이 동물 종의 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 부가, 삽입되거나, 이로부터 결실되거나, 이와 치환된, 서로 구별되는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 세트를 제조함으로써, 세트 내에 동물 종에 대하여 외래인 T-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 발생시키거나, 서로 구별되는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 세트를 인코딩하는 한 세트의 핵산 단편을 제조하는 것
- 상기 변형 아밀로이드 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 핵산 단편 세트의 일부를, 동물에 의한 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체의 생산을 유도하는 이들의 능력을 위하여, 표적화시키는 것, 및
- 상기 종 내 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체의 생산을 현저하게 유도하는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 세트의 일부를 동정하고 임의적으로 분리하는 것 또는 상기 동물 종 내 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 현저하게 유도하는 핵산 단편 세트의 일부에 의하여 인코딩되는 폴리펩타이드 발현 산물의 동정 및 임의적으로 분리하는 것.
상기 문맥에서, "서로 구별되는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 세트"는, 예컨대 상기한 기준(예컨대, 원평광 2색성, NMR 스펙트럼, 및/또는 X-선 회절 패턴의 연구와 결합되어)을 기초로 하여 선택되는 비-동일 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 수집물이다. 상기 세트는 단지 몇 개의 부분으로 구성될 수 있지만, 상기 세트가 수 백 개의 부분을 포함할 수 있다고 생각될 수 있다.
상기 세트의 부분의 테스트는 생체 내에서 최종적으로 수행 될 수 있지만, 본 발병의 목적을 충족시키는 변형 분자의 수를 좁히는 많은 생체 외 테스트가 적용가능하다.
외래 T-세포 에피토프르르 도입하는 목적이 T-세포 도움에 의하여 B-세포 반응을 지지하기 위한 것이기 때문에, T-세포의 증식이 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 의하여 유도되는 것이 필요조건이다. T-세포 증식을 생체 외에서의 표준화된 증식 검정에 의하여 테스트할 수 있다. 간단히 말하면, T-세포의 수가 풍부한샘플을 시험 재료로부터 얻고 이어서 배양물 내에 유지시킨다. 배양된 T-세포는 이미 변형 분자를 포함하고 이의 T-세포 에피토프를 제시하기 위하여 이를 프로세싱하는 시험재료의 APCs와 접촉된다. T-세포의 증식을 모니터링하고 적절한 대조군(예컨대, 본래의 천연 아밀로이드생성 폴리펩타이드르르 프로세싱하는 APCs와 접촉된 배양물 내의 T-세포)과 비교한다. 선택적으로, 외래 T-세포의 이들의 인지에 반응하는 T-세포에 의하여 방출되는 적절한 사이토카인의 농도를 결정함으로써 증식을 측정할 수 있다.
어느 한 유형의 세트의 하나 이상의 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대하여 항체 생산을 유도할 수 있다는 가능성이 높게 되면, 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 자기-단백질인 동물 종 내 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체를 유도할 수 있는 하나 이상의 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 것이 가능하며, 상기 방법은, 임의적으로 하나 이상의 약학적 및 면역학적으로 허용되는 아쥬반트와 혼합하여, 약학적 및 면역학적으로 허용되는 담체 및/또는 매개물 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 갖는 아밀로이드생성 폴리펩타이드와 반응하는 동물 종 내 항체의 생산을 상당히 유도하는 세트의 부분(들)의 혼합을 포함한다.
폴리펩타이드 세트의 테스트와 관련된 본 발명의 상기 측면은, 우선, 많은 본 발명의 서로 구별되는 핵산 서열 또는 벡터를 제조하고, 이들을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터로 적절한 숙주 세포(또는 숙주 동물)을 형질전환시키고, 본 발명의 핵산 서열을 발현시킴으로써 간편하게 수행된다. 이들 단계 후에 상기발현 산물을 분리할 수 있다. 핵산 서열 및/또는 벡터를 PCR과 같은 분자 증폭 기술의 실행을 포함하는 방법에 의하여 또는 핵산 합성에 의하여 제조한다.
특이적 아밀로이드생성 표적
대부분 종종 알츠하이머 단백질, APP, ApoE4 및 타우와 결합된 단백질에 더하여, AD 환자의 뇌의 플라크 또는 엉킴에의 이들의 직접적인 존재 또는 발생중인 AD의 증가하는 위험성과 이들의 명백한 관련에 의하여, 어떠한 방법으로든 AD와 연결된 다른 많은 단백질의 리스트가 있다. 모두는 아니지만, 대부분의 이들 항원은, 상기한 Aβ, APP, 페니실린 및 ApoF4와 함께, 본 발명에 있어서 추정 표적 단백질이다.
알파1-항키모트립신(Alphal-antichymotrypsin, ACT)은 SPs의 주요 성분이고, AD 및 뇌혈관 아밀로이드증(cerebrovascular amyloidosis, CA)에 있어서의 장애들의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 제안된다(Acta neuropathol, 1998, 96 : 628-36). 이는 생체 외에서 Aβ와 상호작용하고 Aβ-42 원섬유의 형성 및 파괴를 모두 촉진시킨다(JBC, 1998, 273 : 28360-4).
알파2-매크로글로불린(Alpha2-macroglobulin)은 AD 환자 뇌 내의 플라크 코어에 있어서의 면역학적 염색에 의하여 발견되었다. 가용성 알파 단편은 플라크에서 세포외적으로 발견되는 반면, 베타소단위로부터의 막통과(transmembrane) 단편은 플라크 코어에서 발견된다(Acta neuropathol, 1998, 96 : 628-36 및 Brain Res., 1997, 777 : 223-227).
ABAD (Aβ-펩타이드 결합 알코올 탈수소효소, Aβ-peptide bindingalcohol dehydrogenase)는 세포 내부의 Aβ와 결합한다. 이는 정상 세포 내에 존재하는 뉴런 효소이지만, AD에 의하여 영향을 받은 뉴런에서는 과발현한다. Aβ는 ABAD를 과발현시키는 세포에 보다 독성이 있다. ABAD는 X-염색체와 연결되어 있다(Yan, 1997, Nature 389).
APLP1 및 -2 (아밀로이드 전구체 유사 단백질 1 및 -2, amyloid precursor like protein 1 and -2): 두 단백질은 모두 APP 상동 초과(super-family) 단백질에 속하지만, Aβ 펩타이드 부위가 결여되어 있다. 그럼에도 불구하고, 신경염성(neuritic) 플라크 내 APLP의 상당한 스테이닝(staining)이 있다(Acta Neuropathol, 1997, 94 : 519-524).
AMY117은 AD를 앓고 있는 사람들의 뇌의 플라크-유사 손상에서 새롭게 발견되는 단백질로서, 이 질환에 있어서 풍부하고, 폭넓게 분포하며, "매우 특이적"인 단백질이다. 상기 단백질 AMY117은 이러한 플라크를 형성함으로써, AD의 발생과 진행에 있어서 결정적인 역할을 할 수 있는 것으로 생각된다. 흥미롭게도, AMY117 함유 플라크는 Aβ를 함유하는 것과 함께 위치(co-localise)하지 않으며, 따라서, 잘 알려진 Aβ을 함유하는 플라크 및 타우 함유 플라크에 더하여 AD의 새로운 특징적 징후를 한정한다. AMY117-양성 플라크는 산발적 증례의 AD의 뇌 및 다운증후군 환자의 뇌에 풍부한 것으로 알려져 있지만, 대조군 또는 다른 신경변성(neurodegenerative) 질환의 뇌에는 거의 없거나 없다(Am J Pathol 1997 ; 151 : 69, 80).
Bax :모노클로날 항체는 AD 뇌의 노화한 플라크의 성분으로서 Bax를 검출한다. 이는 또한 이상행동 신경돌기(dystrophic neurites)에서 과발현한다(Acta Neuropathol. 1998, 95 : 407-412).
Bcl-2의 역할은 분명하지 않다. 플라크 주변의 신경교세포에서 과발현한다(Acta Neuropathol. 1998, 95 : 407-412).
블레오마이신 가수분해효소(Bleomycin hydrolase)는 아마도 베타-세크레타아제이다. 항 블레오마이신 가수분해효소가 AD 환자의 SP에서 발견되었다(Brain Res. 1999, 830 : 200-202). 특정 블레오마이신 가수분해효소 유전자형은 어떤 경우에 있어서 AD 발생의 위험 증가와 관련되어 있는 반면, 다른 것에서는 상관관계가 발견되지 않았다(Ann Neurol, 1998, 44 : 808-811 and Ann Neurol, 1999, 46 : 136-137).
BRI/ABRI: ABRI는 13번 염색체 상의 BRI 유전자에 의하여 인코딩되고, 영국 가족성 치매(FBD) 환자의 아밀로이드 플라크에서 발견되는, 추정 막통과 단백질의 4 kD 단편이다. 이러한 환자들은 보다 긴 개방 리딩 프레임을 발생시키는, BRI 유전자의 종결 코돈 내 돌연변이를 갖는다. 변화된 단백질의 34 카르복시 말단 아미노산의 방출이 ABRI 아밀로이드 소단위를 생성한다. ABRI에 대한 항체가 FBD 환자 뇌의 유조직 손상 및 혈관 손상 모두를 인식한다. ABri 펩타이드는 아밀로이드 원섬유와 같이 침적되고, 결과적인 플라크가 FBD의 특징인 치매와 뉴런 기능장애를 유발하는 것으로 생각된다(Vidal, R et. al., 1999, Nature 399).
크로모글라닌 A(Chromogranin A)는 몇 몇 분산 아밀로이드 침적물 및 이들 주변의 이상행동 신경돌기에서 검출된다(Brain Res, 1991, 539 : 143-50).
클루스테린/apoJ(Clusterin/apoJ): 이것은 AD 및 스크라피(scrapie)와 같은 많은 퇴행성 질환의 경우세 있어서 과발현되기 때문에, 이것은 분자생물학의 상이한 영역으로부터 구별되는 스크리닝에 의하여 실험실 내에서 종종 분리된다.(Biochem J 1997 Nov 15 ; 328 (I) : 45-50 Michel D, Chatelain G, North S, Brun G).
CRF (부신피질자극호르몬 방출 인자, corticotropin releasing factor) 결합 단백질은 뇌의 스트레스 반응에 있어서 중요한 조절 인자인 41 aa CRF 펩타이드에 결합한다. 대부분의 CRF가 CRF 결합 단백질에 의하여 결합됨에 따라, CRF 결합 단백질을 제거하는 것(면역 치료법에 의하여)이 AD에 대하여 양성 효과를 갖는 것으로 생각되는 유리 CRF의 수치를 증가시킬 수 있다(Behan, 1997, J. Neurochemistry, 68 : 2053-2060).
EDTF (내피-유래 독성 인자, endothelial-derived toxic factor): AD 환자로부터 미세혈관(microvessels)에 의하여 생산되는 단백질. 특히 뉴런 세포에 대하여 독성이 있다(국제공개 제99/24468호).
헤파란 설페이트 프로테오글리칸(Heparan sulfate proteoglycans)은 SP의 Aβ와 함께 위치하는 것으로 나타났다. 래트 실험은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸이 아밀로이드 섬유 형성에 필요하는 것을 보여준다(Neuron, 1994, 12 : 219-234 and Acta neuropathol, 1998, 96 : 628-36).
인간 콜랩신 반응 매개 단백질-2(Human collapsin response mediator protein-2)은 모노클로날 항체에 의하여 신경원섬유엉킴에서 인지되는 65 kDa 단백질이다. 엉킴 내로의 통합은 가용성 단백질을 고갈시키고 비정상적인 신경염성 진행을 초래하여, 뉴런 변성(퇴화)를 가속화시킨다(JBC, 1998, 273 : 9761-8).
헌팅틴(Huntingtin, 헌팅톤병의 단백질): HD에 있어서, 헌팅틴 단백질은 폴리글루타민으로 N-말단 확장된 것이다. 이러한 형태의 헌팅틴은 또한 피크병 및 AD 환자의 NFT's에서 발견된다.(Exp. Neurol, 1998, 150 : 213-222).
ICAM-I는 SP's에 축적된다(Acta neuropathol, 1998, 96 : 628-36 and Am. J Pathol. 1994, 144 : 104-16).
IL-6은 신경원섬유 변형과 연관되어 있고 플라크의 중심에서 발견된다. AD의 증세를 유발시키는 것으로 생각된다. Aβ의 활성 펩타이드 25-35에 의하여 성상세포에서 강력하게 증폭된다(Brain Res., 1997, 777 : 223-227 and Behav Brain Res, 1996, 78 : 37-41).
리소좀-결합 항원 CD68(Lysosome-associated antigen CD68)은 NFT's 및 SP's 내에서 항체 KP-1에 의하여 인지된다. 따라서, 리소좀은 엉킴과 플라크의 형성에 있어서 역할을 할 수 있다(Dement Geriatr Cogn Disord, 1998, 9 : 13-19).
P21 라스(P21 ras)는 AD 발생의 조기 단계에서 나카나는 마이토젠(mitogen) 및 성장 인자의 상승의 1차 단계로서 수반된다(Neuroscience, 1999, 91 : 1-5).
PLC-델타1「PLC-delta 1, 포스포리파아제 C 이소엔자임 델타 1(phospholipase C isoenzyme delta 1)은 플라크 코어 주변의 신경돌기 및 NFT's 내에 비정상적으로 축적된다. 세포내적이다(Alzheimer Dis Assoc Disord, 1995, 9 : 15-22).
혈청 아밀로이드 P 성분 (Serum amyloid P component, SAP)은 AD의 아밀로이드 침적물을 포함하는 모든 유형의 아밀로이드 침적물에 존재하는 정상적인 원형질 성분이다(JBC, 1995, 270 : 26041-4). 이것은 SP's 및 NFT's 모두에서 관찰된다. 몇 몇 연구에 있어서, 이것이 Aβ 응집을 촉진하고 원섬유의 단백질분해를 예방한다는 것으로 나타나는 반면(Biochem Biophys Res commun, 1995, 211 : 349v-53 및 PNAS, 1995, 92 : 4299-4303), 다른 연구는 SAP가 Aβ 원섬유 형성을 억제한다는 것을 보여준다(JBC, 1995, 270 : 26041-4).
시냅토피신(Synaptophysin)은 몇 몇 분산 아밀로이드 침적물 및 이들 주변의 이상행동 신경돌기에서 검출된다(BrainRes, 1991, 539 : 143-50).
시누클레인(Synuclein, 알파-시누클레인 또는 NACP): AD 아밀로이드의 비-A 베타 성분(NAC)이 AD 환자의 뇌 조직으로부터 정제된 아밀로이드 내의 두 번째 주요 성분으로서 생화학적으로 동정되었다. 140 아미노산 길이의 전구체로부터 유도된 NAC는, 비록 아미노 말단은 명확하게 결정되어 있지는 아니하지만, 35 아미노산 이상의 길이를 가진다. NAC 모노클로날 항체가 AD 환자 뇌의 SP's를 면역학적으로 염색시키지만, NACP와 반응하지는 않는다(Biochemistry 34 (32) : 10139-10145 (Aug 15 1995) Iwai A, Yoshimoto M, Masliah E, Saitoh T). NAC 자기-올리고머는 Aβ에 존재한다. 새로운 증거가 아밀로이드-유사 원섬유 형성 및 미토콘드리아 기능장애를 통하여 시냅스 손상 및 신경독성에 있어서의 상기 분자의 잠재적 역할을 나타낸다(Brain Pathol 1999 Oct ; 9 (4) : 707-20. FEBS Lett, 1998, 421 : 73-76). NACP의 일 부분은 APP의 C-말단 아밀로이드 단편 및 스크라피 프리온단백질(scrapie prion protein, PrPSc) 부위와 고도의 상동성을 갖는다. 시누클레인은 파킨슨병의 주요한 원인이 되는 인자이다(Chem Biol, 1995, 2 : 163-9).
TGF-bl (형질전환 성장 인자 b1, transforming growth factor bl): TG 마우스에서의 변이체 APP와의 TGFb1의 과발현은 Aβ의 침적을 가속화시킨다. 따라서, TGF-b1은 아밀로이드 플라크 형성을 개시하거나 촉진하는데 수반되는 것으로 생각된다(Wyss-Coray, 1997, Nature 389).
다른 아밀로이드 질환 및 이와 연관된 단백질
AD 및 AD 유사 질환(헌팅톤병, 파킨슨병, FBD 및 다른 유형의 치매)에 잠재적으로 수반되는 상기한 단백질에 더하여, AD 이외에도 아밀로이드 형성이 질환을 유발하거나 질환의 증상을 야기시키는데 수반되는 상대적으로 많은 질환들이 있다. 비록 이들 질환에 수반되는 단백질은 사실상 다양하지만, 이들은 아밀로이드의 특징이 되는 동일한 특성을 공유한다(상기 참조). 하기의 표는 많은 이들 아밀로이드 장애 및 이를 야기시키는 단백질을 열거한다.
< 아밀로이드 원섬유 단백질의 다양성 >
임상적 증후군 원섬유 소단위 전구체구조
대뇌 아밀로이드 혈관증(CAA) Aβ 모두 β
모노크로날 단백질 (AL) 전신성 아밀로이드증 IG 경쇄의 V 도메인의 전길이 또는 단편 모두 β
반응성 전신성 (AA) 아밀로이드증 아밀로이드 A 단백질의 76-길이 N-말단 단편 α/β
가족성 다발성 신경장애 트랜스타이레틴(transthyretin) 변형체의 전길이 또는 단편 모두 β
유전성 ApoA1 아밀로이드증 ApoA1 변형체의 N-말단 단편 (~90잔기) (α/β)
유전성 라이소자임 아밀로이드증 전장 라이소자임 변형체 α+ β
유형 II 당뇨병 조각(islet)-아밀로이드 폴리펩타이드의 37-잔기 단편 알려지지 않음
인슐린-관련 아밀로이드 전장 야생형 인슐린 α+ β
전달성 해면상 뇌질환 프리온 단백질의 전길이 또는 단편 α+ β
갑상선의 수양암(medullary carcinema) 칼시토닌 단편 알려지지 않음
노화 전신성 아미로이드증 트랜스타이레틴의 전길이 또는 단편 모두 β
동종투석(homodialysis)-관련 아밀로이드증 전장, 야생형 β-2 마이크로글로불린 모두 β
분리 심방성 아밀로이드증 심방성 나트륨배설증가 인자 알려지지 않음
유전성 대뇌 아밀로이드 혈관증 시스타틴 변형체의 110-잔기 단편 α+ β
핀랜드 유전성 아밀로이드증 겔졸린(gelsolin)변형체의 71-잔기 단편 α/β
유전성 피브리노겐 a-사슬 아밀로이드증 피브리노겐 a-사슬 변형체 단편 알려지지 않음
이들 단백질은, AD에 수반되는 단백질과 같이, 본 명세서에 제시된 면역화 방법을 위한 모든 잠재적인 표적이다.
아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대하여 면역화시키는 대부분의 방법은 본래의 아밀로이드생성 폴리펩타이드와 교차-반응성이 있는 항체를 발생시키는 면역화로 제한되어야 한다고 예측된다. 그럼에도 불구하고, 몇 몇 경우에는, MHC 클래스 II 에피토프를 제시하는 세포에 대한 CTL 반응의 형태로 세포 면역성을 아밀로이드생성 폴리펩타이드로부터 유도하는 것이 중요할 것이다 - 이는 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 생산하는 세포 수의 감소가 심각한 역효과를 구성하지 않는 이들 경우에 있어서 적절하다. CTL 반응이 희망되는 이러한 경우에 있어서, 출원인의PCT/DK99/00525 (USSN 제09/413, 186호의 대응 출원)의 기술을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 두 문헌의 기재는 본 명세서세 참조로서 관계한다.
다음의 비-한정적 실시예에 있어서, AD에 대한 Aβ 기재 자가백신에 초점이 맞추어진다. 그러나, 여기에 설명된 원리는 모든 아밀로이드 단백질에 동등하게 적용된다.
실시예 1
AD에 대한 면역화를 위한 자가 백신화 접근
Aβ단백질 녹 아웃(knock out) 마우스는 어떠한 이상이나 반대적 부작용을보이지 않는 다는 사실은 Aβ 양의 감소 또는 제거가 안전하다는 것을 제시한다(Zheng H., 1996).
형질전환(transgenic) 동물을 형질전환 인간 Aβ단백질에 대하여 면역화시키는 공개된 실험들은, 만약 자기관용을 파괴할 가능성이 있다면, 자가-반응 항체에 의하여 Aβ의 하향-조절을 달성할 수 있다고 제안한다. 이러한 실험들은 또한 Aβ의 이와 같은 하향-조절이 플라크의 형성을 방지하고 심지어는 뇌로부터 이미 생성된 Aβ 플라크를 제거할 것이라고 제안한다(Schenket al., 1999 참조). 그러나, 통상적으로 자기-단백질에 대한 항체를 생성하는 것은 가능하지 않다.
따라서, 공개된 데이터는 진정한 자기-단백질에 대한 진정한 자기-관용을 파괴하는 방법을 제공하지 못한다. 또한, 상기 데이터는 면역반응이 Aβ 침적물에 대하여 단독적으로 또는 우세하게 유발되지만, 필요하다고 인정되는 경우에는, 세포막 결합 Aβ전구체 단백질(APP)에 대해서는 유발되지 않는다는 것을 확증하는 방법에 대한 정보를 제공하지 못한다. 기존의 기술을 사용하여 발생되는 면역 반응은 아마도 제어되지 않은 방법으로 자기-단백질에 대한 면역방법을 발생시키고, 따라서, Aβ 단백질 부분에 대한 원치 않고 과다한 자가반응성이 발생할 수 있다. 따라서, 기존의 면역화 방법을 사용하는 것은 자기 단백질에 대한 강력한 면역반응을 발생시킬 수 없어 보이고, 게다가, CNS 내 다수의 세포 상에 존재하는 막 결합 APP에 대한 잠재적인 강력한 교차-반응성 때문에 불안정할 것이다.
본 발명은 CNS 또는 다른 신체 구획 내에 잠재적으로 플라크를 형성하고 심각한 질병을 야기하는 진정 자기 단백질에 대한 강력하게 제어된 면역반응을 효과적으로 발생시키는 방법을 제공한다. 안정하고 효율적인 인간 Aβ 단백질 치료 백신은 AD를 치료하는 이러한 기술을 이용하여 개발될 것이다.
이에 비추어, 다음 세기의 건강 관리 시스템을 무력화시킬 것으로 예견되는 질병인 AD가 치료 가능해지거나, 적어도, 기재된 이러한 백신이 이 질병의 증세와 진행을 치료하기 위한 효과적인 치료적 접근을 구성할 수 있다는 것을 예상하는 것이 가능하다.
이러한 기술은 AD 뿐 아니라 다른 신경학적 질병의 아밀로이드 침적을 방지하는 전적으로 새로운 면역학적 접근을 나타낸다.
다음의 표에, 35 가지의 상정 가능한 구조물이 나타나 있다. 표에 주어진 모든 위치는 APP의 개시 메티오닌(SEQ ID NO : 2의 첫 번쩨 아미노산)과 관련 있으며, 개시 및 종결 아미노산을 모두 포함하는데, 예컨대, 672-714 단편은 아미노산 672와 714를 모두 포함한다. P2 및 P30을 위한 개시 및 종결위치는 상기 에피토프가 표시된 위치에서 APP 단편의 일부를 치환한다는 것을 나타낸다(두 위치 모두 치환에 포함된다) - 대부분의 구조물에 있어서, 도입된 에피토프는 그 ??토프 길이의 어떤 단편을 치환한다. 표의 별표 표시는 다음의 의미를 갖는다:
*) P2 및 P30를 위하여 오직 한 위치가, 에피토프가 APP 유도체 내 표시된 위치에 삽입된다는 것을 나타낸다(에피토프가 주어진 위치에 C-말단적으로 인접한 아미노산에서 시작한다).
**) 구조물 34는 P30 및 P2로 각각 분리된 동일한 3 개의 APP 단편을 포함한다.
***) 구조물 35는 P30 에피토프와 P2 에피토프로 번갈아서 분리된 9 개의 동일한 APP 단편을 포함한다.
면역 반응의 대상인 APP의 부분 중에서 면역반응이 일어나는 가장 중요한 부분은 AD 환자 뇌의 아밀로이드 플라크의 주요 성분인 43 아미노산 Aβ코어 펩타이드(Aβ-43, SEQ ID NO : 2의 잔기 672-714에 해당)이다. 이러한 APP 단편은 상기에 열거된 모든 구조물의 일부이다
변형체 1 및 2는 에피토프 P2 및 P30 모델이 위치하고 있는 Aβ-43의 상류 APP 부분을 포함한다. 변형체 1 및 3-8은 모두 신경독성을 보이는 C-100 단편을 포함한다 - 상기 C-100 단편은 SEQ ID NO : 2의 아미노산 잔기 714-770에 해당한다. 변형체 3-7에서, 에피토프는 C-100 단편 부분을 치환하는 반면, 변형체 6-8에서는 C-100에 삽입된다.
변형체 9-35는 단지 코어 Aβ-43 단백질만을 함유한다. 변형체 9-13에서, P2 및 P30은 A-43의 양끝에 융합되어 있으며; 변형체 14-21에서, P2 및 P30은 Aβ-43 부분을 치환한다; 변형체 22-33에서, P2 및 P30은 Aβ-43 내에 삽입된다; 변이체 34는 P30 및 P2로 각각 분리된 3 개의 동일한 Aβ-43 단편을 포함한다; 변형체 35은 P2 및 P30 에피토프로 번갈아서 구분된 9 개의 Aβ-43 반복을 포함한다.
보다 상세한 설명을 위해서는 도 1 및 상기 표를 참조하라.
구조물의 또 다른 하나의 유형이 특히 바람직하다. 본 발명의 하나의 목적이 Aβ를 제거하는 것은 원하는 바이지만, APP를 생산하는 세포의 파괴는 회피하는 것이므로, APP 내에 존재하는 경우 세포외로 노출되지 않는 Aβ 부분만을 포함하는 자가백신 구조물을 제조하는 것이 가능해 보인다. 따라서, 이러한 구조물은 SEQ ID NO : 2의 아미노산 700-714에 의하여 정의되는 아미노산 단편으로부터 유도되는 B-세포 에피토프를 하나 이상 포함하는 것이 필요하다.
이러한 짧은 폴리펩타이드 단편이 약한 면역원성을 보일 것으로 예상되기 때문에, 이러한 자가백신 구조물이 몇 개의 B-세포 에피토프로, 예컨대 본 발명의 상세한 설명의 일반식 I에 나타난 구조를 갖는 구조물의 형태로 구성되는 것이 바람직하다(상기 참조). 일반식 I의 형태에서, 아미로이드el-아밀로이드ex라는 표현은 SEQ ID NO : 2의 아미노산 700-714로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하는 x B-세포 에피토프이다. 바람직한 대안은, 앞서 상세히 설명한, 아마이드 결합을 통하여 아밀로이드생성 (폴리)펩타이드 및 선택된 외래 T-헬퍼 에피토프를 폴리사카라이드 담체 분자에 결합시키는 가능성이다 - 이러한 방법에 있어서, SEQ ID NO : 2의 아미노산 700-714에 의하여 구성된 "약한" 에피토프의 복합제시가 가능해지고, B-세포 및 T-세포 에피토프 사이의 최적 비율의 선택 또한 가능해진다.
실시예 2
본 발명에 따른 변형 단백질 및 Aβ를 사용한 형질전환 마우스의 면역화
hAB43+-34 인코딩 DNA 구조물.hAB43+-34 유전자는 몇 가지 단계로 제작된다. 우선, 주형으로서 프라이머 ME#800 (SEQ ID NO : 9)를 사용하고 프라이머 ME#801 (SEQ ID NO : 10) 및 ME#802 (SEQ ID NO : 11)를 사용하여 PCR 단편을 생성시켰다. ME#800은 대장균 최적화 코돈을 사용하여 인간 abeta-43 단편을 인코딩한다. ME#801 및 ME#802는 단편에 적절한 제한 부위를 첨가한다.
PCR 단편을 정제하고,Ncol 및HindIII로 분해시키고, 한 번 더 정제하고,Ncol-HindIII 분해 및 정제된 pET28b+E. coli발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 이렇게 만들어진 야생형 인간 Aβ를 인코딩하는 플라스미드를 pABl라고 명명하였다.
다음 단계로, T-헬퍼 에피토프, P2를 분자의 C-말단에 부가하였다. 프라이머 ME#806 (SEQ ID NO : 12)은 P2 에피토프를 인코딩하는 서열을 포함하므로, PCR 반응에 의하여 P2 와 Abeta-43의 융합을 발생시킨다.
pAB1을 주형으로 하고 프라이머 ME#178 (SEQ ID NO : 8) 및 ME#806을 사용하여 PCR 단편을 제작함으로써 클로닝을 수행하였다. 상기 단편을 정제하고,Ncol 및HindIII로 분해시키고, 한 번 더 정제하고,Ncol-HindIII 분해 및 정제된 pET28b+ 벡터 내로 클로닝시켰다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pAB2라고 명명하였다.
유사한 방법으로, N-말단에 부가된 또 다른 T-헬퍼 에피토프인 P30과 함께 Aβ-43 인코딩 서열을 포함하는 또 다른 플라스미드를 제작한다. 이는 pAB1을 주형으로 하고 프라이머 ME#105 (SEQ ID NO : 7) 및 ME#807(SEQ ID NO : 13)을 사용하여 PCR 단편을 제작함으로써 수행하였다.
상기 단편을 정제하고,Ncol 및HindIII로 분해시키고, 한 번 더 정제하고,Ncol-HindIII 분해 및 정제된 pET28b+ 벡터 내로 클로닝시켰다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pAB3이라고 명명하였다.
세 번째 단계에 있어서, 두 번째 Aβ-43 반복체(repeat)를 프라이머 ME#809(SEQ ID NO : 14)에 의하여 플라스미드 pAB2의 P2 에피토프의 C-말단에 부가하였다. 동시에 ME#809는 Aβ-43 반복체 바로 다음에BamHI 부위를 만든다. pAB2를 주형으로 하고 프라이머 ME#178 및 ME#809를 사용하여 PCR 단편을 제작하였다. 상기 단편을Ncol 및HindIII로 분해시키고, 정제하고,Ncol-HindIII 분해 및 정제된 pET28b+ 벡터 내로 클로닝시켰다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pAB4라고 명명하였다.
마지막으로, pAB3으로부터 얻은 P30 에피토프-Aβ-43 반복체 서열을 pAB4 플라스미드 내로 클로닝시켰다. 이는 pAB3을 주형으로 하고 프라이머 ME#811 (SEQ ID NO : 16) 및 ME#105를 사용하여 PCR 단편을 제작함으로써 수행하였다. 상기 단편을 정제하고, pAB3을 주형으로 사용하는 이어지는 PCR에 있어서 ME#810 (SEQ ID NO : 15)와 함께 프라이머로 사용하였다. 이렇게 만들어진 단편을 정제하고,BamH1 및HindIII로 분해시키고,BamH1-HindIII 분해 및 정제된 pAB4 플라스미드 내로 클로닝시켰다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 hAB43+-34 분자라고 명명하였다.
모든 PCR 및 클로닝 절차는 본질적으로 Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. 1989 "Molecular cloning : a laboratory manual". 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.에 기재된 바와 같이 수행하였다.
모든 클로닝 절차를 위하여,E. coliK-12 세포, Top-10 F' (Stratagene, USA)균주를 사용하였다. pET28b+ 벡터는 Novagen(USA)로부터 구입하였다. 모든 프라이머는 DNA Technology(Denmark)에서 합성되었다.
hAB43+-34의 발현 및 정제.pAB5에 의하여 인코딩되는 hAB43+-34단백질을 pET28b+ 시스템 (Novagen)의 공급자가 설명하는 바에 따라서 BL21-Gold (Novagen)E. coli세포에서 발현시켰다.
봉입체를 세척해낸 후, 6 M 요소의 존재하에서 BioCad 정제워크스테이션(PerSeptive Biosystems, USA)을 사용하는 양이온교환 크로마토그래피(cationexchange chromatography)에 의하여 순도 85% 이상까지 발현된 hAB43+-34 단백질을 정제하였다. 그 다음에 감소하는 양의 요소를 포함하는 용액에 대한 순차적인 투석(stepwise dialysis)에 의하여 요소를 제거하였다. 최종적 버퍼는 pH 8.5의 10 mM Tris였다.
면역화 연구. 연구를 위하여 인간 APP(알츠하이머의 전구 단백질)에 대한 형질전환 마우스를 사용하였다. TgRND8+라고 불리는 이들 마우스는 마우스 뇌 내에 고농도의 Aβ-40 및 Aβ-42를 유발시키는 APP의 돌연변이형을 발현시킨다.(Janus, C. et. al.).
마우스(각 그룹 당 8-10 마우스)를 Abeta-42 (SEQ ID NO : 2의 잔기 673-714, 표준 Fmoc 방법에 의하여 합성됨) 또는 hAB43+-34 변형체(실시예 1의 표에 있어서 구조물 34, 재조합적으로 생산됨)를 사용하여 2 주 간격으로 4 차례 면역화시켰다. 사용분량은 Aβ100 mg 또는 hAB43+-34 50 mg이었다. 43일째(3 번의 주입 후) 및 52일째(4 번의 주입 후)에 마우스에서 채혈하였고, 직접 Aβ-42 ELISA를 사용하여 항-Aβ-42 특이적 역가를 결정하는데 혈청을 사용하였다.
다음의 표는 평균 상대적 항-Abeta-42 역가를 나타낸다.
면역원 43 일째 (3 번의 면역화 후) 52 일째 (4 번의 면역화 후)
Aβ-42 4000 3000
hAB43+-34 16000 23000
분명한 바와 같이, hAB43+-34 Aβ변형체를 사용하여 면역화시켜서 얻어지는 항체 역가는, 면역원으로서 변형되지 않은 야생형 Aβ-42를 사용하여 얻어지는 역가보다, 3 및 4 번의 면역화 후 각각 약 4 배 및 7.5 배 높았다. 면역화에 사용되는 변형체의 양이 면역화에 사용되는 야생형 서열의 양의 단지 50 % 밖에 되지 않는다는 사실을 고려할 때, 상기의 사실은 보다 전망이 있다.
실시예 3
교차결합제로서 활성화된 폴리-하이드록시폴리머를 사용하는 Aβ 펩타이드 공중합체 백신의 합성
도입. 통상적인 접합 백신은 담체 단백질에 공유적으로 결합된 (폴리)펩타이드로 구성된다. 상기 펩타이드는 B-세포 에피토프(들)을 포함하고, 담체 단백질은 T-헬퍼 에피토프를 제공한다. 그러나, 대부분의 담체 단백질은, 전체 서열 중에서 단지 소수의 부분만이 적절한 T-헬퍼 에피토프를 포함하고 있기 때문에, 일반적으로 T-헬퍼 에피토프의 소스로서 부적절하다. 이러한 에피토프는, 예컨대 12-15 아미노산의 펩타이드로 정의되고 합성될 수 있다. 만약 이들 펩타이드가, 예컨대 다가의 활성화된 폴리하이드록시폴리머를 통하여, B-세포 에피토프를 함유하는 펩타이드에 공유적으로 결합되어 있다면, 적절한 부분을 포함하는 백신 분자를 얻을 수 있다. 또한, B-세포 및 T-세포 에피토프 사이의 최적 비율을 포함하는 백신 접합체를 제공하는 것도 가능하다.
활성 폴리-하이드록시폴리머의 합성. 덱스트란, 전분, 아가로오스 등과 같은 폴리하이드록시폴리머를, N-메틸피롤리디논(N-methylpyrrolidinone, NMP)에 용해된 균질 합성(덱스트란) 또는 예컨대 아세톤 내에서의 비균질 합성(전분, 아가로오스, 교차결합된 덱스트란)에 의하여, 2,2,2-트리플루오로에탄설포닐 클로라이드(2, 2,2-trifluoroethanesulfonyl chloride, tresyl chloride)로 활성화 시킬 수 있다.
225 ml의 건조 N-메틸피롤리디논(NMP)을, 교반을 위하여 자석과 함께 제공된 둥근 바닥 플라스크 내에서 동결 건조된 수용성 덱스트란 (4.5 g, 83 mmol, 임상용 등급, Mw (avg) 78000)에 건조 조건하에서 첨가하였다. 플라스크를 자석 교반하면서 60℃ 오일 배드(bath)에 놓아두었다. 20 분이 지난 후, 온도를 92℃ 까지 상승시켰다. 덱스트란이 용해되면, 플라스크를 즉시 오일 배드에서 꺼내고 배드의 온도를 40℃로 하강시켰다. 플라스크를 계속 자석교반하면서 오일 배드에 다시 넣고, 트레실 클로라이드(2.764 ml, 25 mmol)를 적가(drop-wise addition)하였다. 15분 후, 건조 피리미딘(무수물, 2.020 ml, 25 mmol)을 적가하였다. 플라스크를 오일 배드에서 플라스크를 꺼내고 상온에서 1 시간동안 교반하였다. 생성물(트레실 활성 덱스트란, Tresyl Activated Dextran, TAD)을 차가운 에탄올(99.9%)에서 침전시켰다. 상청액을 따라내고 침전물을 2000 rpm의 원심분리기 내의 50 ml 폴리프로필렌 튜브에 취하였다. 침전물을 50 ml 0. 5%의 아세트산에 용해시키고, 5000 ml 0. 5% 아세트산에 대하여 2 번 투석시키고, 동결건조시켰다. TAD를 동경건조 분말로 -20 ℃에서 보관하였다.
아가로오스 또는 교차결합된 덱스트란과 같은 불용성 폴리-하이드록시폴리머를 예컨대 아세톤 내에서 폴리하이드록시폴리머 현탁액을 만들어 트레실 활성화시킬 수 있고, 고상 합성으로서 합성을 수행할 수 있다. 활성화된 하이드록시폴리머를 여과하여 취할 수 있다. 예컨대, Nilsson K and Mosbach K (1987), Methods in Enzymology135, p. 67, and in Hermansson GTet al.(1992), in "ImmobilizedAffinity Ligand Techniques", Academic Press, Inc., p. 87.에 적합한 방법이 보고되어 있다.
A 베타 펩타이드 공중합체 백신의 합성.TAD (10 mg)을 100 ㎕ H20에 용해시키고, 5 mg aβ-42 (SEQ ID NO : 2, 잔기 673-714), 2. 5 mg P2 (SEQ ID NO : 4) 및 2. 5 mg P30 (SEQ ID NO : 6)를 함유하는 pH 9.6의 1000 ㎕ 탄산염 버퍼를 첨가하였다. Aβ-42 및 P2와 P30 펩타이드는 모두 보호된 라이신기를 함유한다: 이들은 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸(Dde) 보호된 라이신 그룹이다. 상기 펩타이드는 통상적인 Fmoc-Lys(Boc)-OH가 Fmoc-Lys(Dde)-OH (Novabiochem에서 얻음, cat. no. 04-12-1121)로 치환된, 즉, 라이신의 ε-아미노기a가 Boc 대신에 Dde로 보호되어 있는 표준 Fmoc에 의하여 제조하는 것이 바람직하다.
pH 값을 측정하고 1 M HC1을 사용하여 9.6으로 조정하였다. 2.5 시간 후, 실온에서, 80% 용액의 히드라진(hydrazine)을 8%의 최종 히드리진 농축액에 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 30분 동안 더 인큐베이팅 한 후, 즉시 동결-건조시켰다. 동결-건조된 생성물을 H2O에 용해시키고 마지막 동결-건조 전에 H2O에 대하여 광범위하게 투석시켰다.
최종 생성물 내의 B-세포 에피토프(Aβ)와 T-헬퍼 에피토프(P2 및 P30) 사이의 비율은 합성 단계에서 이들 펩타이드를 상이한 농도로 사용함으로써 변화시킬 수 있다. 또한, 예컨대, 합성 단계에서 아미노화된(aminated) 맨노오스를 탄산염 버퍼에 첨가함으로써 맨노오스로 표지화(접합체를 APCs에 표적화시키기 위하여)시킬 수 있다.
B-세포 에피토프 및 T-헬퍼 에피토프를 함유하는 펩타이드를 결합시키기 위하여 불용성 활성 폴리-하이드록시폴리머를 사용한다면, 고상 합성으로서 폴리머에 결합시킬 수 있고, 최종 생성물을 세척 및 여과에 의하여 정제할 수 있다.
본 발명의 방법, 조성물, 벡터 및 형질전환 세포를 이용하여 알츠하이머와 같은 아밀로이드 침적에 의한 질병을 치료하거나 완화시킬 수 있다.
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Claims (58)

  1. - 한 가지 이상의 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 이의 서브시퀀스: 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 이의 서브시퀀스로 면역화된 동물에서 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체의 생산을 유도하기 위하여 제조되는 한 가지 이상의 아밀로이드생성 폴리펩타이드 및 이들의 서브시퀀스, 및/또는
    - 한 가지 이상의 아밀로이드 유사체: 이 유사체에 있어서, 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 하나 이상의 변형이 도입됨으로써, 상기 아밀로이드 유사체로 면역화된 동물에서 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체 생산이 유도되는 한 가지 이상의 아밀로이드 유사체의 면역학적 유효량의 동물 면역 체계에 제시(presentation)하는 것을 포함하는, 인간을 포함하는 동물에서의 아밀로이드 단백질의 생체내(in vivo) 하향-조절(down-regulation)을 위한 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 아밀로이드 펩타이드의 아미노산 서열의 변형을 갖는 유사체가 제시되는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 변형으로 인하여 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 B-세포의 실질적인 분획은 보존되고
    - 하나 이상의 외래 T-헬퍼 림프구 에피토프(TH에피토프)의 도입, 및/또는
    - 변형된 분자를 항원제시세포(APC) 또는 B-림프구에 표적화시키는 하나 이상의 첫 번째 부분의 도입, 및/또는
    - 면역 체계를 자극하는 하나 이상의 두 번째 부분의 도입 및/또는
    - 면역 체계에 대한 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 제시를 최적화시키는 하나 이상의 세 번째 부분의 도입되는 결과가 발생하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 변형이 아밀로이드생성 폴리펩타이드 내 적절한 화학기와의 공유적 또는 비-공유적 결합에 의하여 측면기로서 외래 TH에피토프 및/또는 첫 번째 부분 및/또는 두 번째 부분 및/또는 세 번째 부분의 도입을 포함하는 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 변형이 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 부가를 포함하는 방법.
  6. 제 6 항에 있어서, 상기 변형으로 인하여 융합 단백질이 제공되는 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 부가의 도입으로 인하여 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 전제적인 3차 구조가 실질적으로 보존되는 방법.
  8. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 하나 이상의 B-세포 에피토프의 중복 및/또는 합텐의 도입을 포함하는 방법.
  9. 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외래 T-세포 에피토프가 동물 내에서 면역우성인 방법.
  10. 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 무차별(promiscuous) T-세포 에피토프 및 인공 MHC-II 결합 펩타이드 서열 중에서 선택된 외래 T-세포 에피토프와 같이, 상기 외래 T-세포 에피토프가 무차별적인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 T-세포 에피토프가 P2 또는 P30와 같은 파상풍 톡소이드(Tetanus toxoid) 에피토프, 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid) 에피토프, 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 적혈구응집소 (hemagluttinin) 에피토프, 및 P 열대열 CS 에피토프(P. falciparum CS epitope) 중에서 선택되는 방법.
  12. 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 부분이 B-림프구 또는 APC 상에 수용체가 존재하는 합텐 또는 탄수화물과 같은 APC 특이적 표면 항원 또는 B-림프구 특이적 표면 항원에 대하여 실질적으로 특이적인 결합 파트너인 방법
  13. 제 3 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 두 번째 부분이 인터페론 γ (IFN-γ) 또는 이들의 유효 부분, Flt3L 또는 이들의 유효 부분, 인터루킨 1(interleukin 1, IL-1) 또는 이들의 유효 부분, 인터루킨 2 (IL-2)또는 이들의 유효 부분, 인터루킨 4 (IL4) 또는 이들의 유효 부분, 인터루킨 6 (IL-6) 또는 이들의 유효 부분, 인터루킨 12 (IL-12) 또는 이들의 유효 부분, 인터루킨 13 (IL-13) 또는 이들의 유효 부분, 인터루킨 15 (IL-15) 또는 이들의 유효 부분, 및 과립세포-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) 또는 이들의 유효 부분과 같은 사이토카인; 호르몬; 및 HSP70 또는 이들의 유효 부분, HSP90 또는 이들의 유효 부분, HSC70 또는 이들의 유효 부분, GRP94 또는 이들의 유효 부분, 및 칼레티큘린(calreticulin, CRT) 또는 이들의 유효 부분과 같은 열-쇼크 단백질 중에서 선택되는 방법.
  14. 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세 번째 부분이 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 파네실기(farnesyl group), 제라닐-제라닐기(geranyl-geranyl group), GPI-앤커(GPI-anchor), 및 N-아실 디글리세라이드기(N-acyl diglyceride group)과 같은 지질 종류이거나, 상기 세 번째 부분이 폴리사카라이드와 같은 폴리하이드록시폴리머인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 폴리사카라이드를 아밀로이드생성 폴리펩타이드와 외래 T-세포 에피토프가 개별적으로 결합되는 담체 골격으로서 사용하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 아미로이드생성 폴리펩타이드와 외래 T-세포 에피토프를 아마이드 결합을 통하여 폴리사카라이드에 결합시키는 방법.
  17. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 이들의 서브시퀀스가, 아미로이드생성 폴리펩타이드에 대한 전구체 폴리펩타이드의 세포-결합 형태에 존재할 때 세포외 상태에 노출되지 않는 B-세포 에피토프를 보존하기 위하여 변형되어 있는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드가, 전구체 폴리펩타이드의 세포-결합 형태에 존재할 때 세포외 상태에 노출되는 하나 이상의 B-세포 에피토프를 결여시키기 위하여 변형되어 있는 방법.
  19. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드생성 폴리펩타이드 내의 하나 이상의 아미노산 서열을 동일한 길이 또는 상이한 길이의 아미노산 서열로 치환하여 유사체 내에 외래 TH에피토프를 발생시키는 것을 포함하는 방법.
  20. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 베타-아밀로이드(beta-amyloid, Aβ), 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP), ApoE4, 프리세닐린(presenillin), 프리온 폴리펩타이드(prion polypeptide), 알파1-항키모트립신(Alphal-antichymotrypsin, ACT), 알파2-매크로글로불린(Alpha2-macroglobulin), ABAD (Aβ-펩타이드 결합 알코올 탈수소효소, Aβ-peptide binding alcohol dehydrogenase), APLP1 및 -2 (아밀로이드 전구체 유사 단백질1 및 -2, amyloid precursor like protein 1 and-2), AMY117, Bax, Bcl-2, 블레오마이신 가수분해효소 (Bleomycin hydrolase), BRI/ABRI, 크로모그라닌 A (Chromogranin A), 클러스테린/apoJ (Clusterin/apoJ), CRF (부신피질자극호르몬 방출 인자, corticotropin releasing factor) 결합 단백질, EDTF (내피-유래 독성 인자, endothelial-derived toxic factor), 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 (heparan sulfate proteoglycans), 인간 콜랩신 매개자 단백질-2 (human collapsin response mediator protein-2), 헌팅틴 (huntingtin), ICAM-I, IL-6, 리소좀-결합 항원 CD68 (lysosome-associated antigen CD68), P21 라스, PLC-델타 1 (인지질 C 이소엔자임 델타 1, phospholipase C isoenzyme delta 1), 혈청 아밀로이드 P 성분 (Serum amyloid P component, SAP), 시냅토파이신 (Synaptophysin), 시누클레인 (Synuclein, 알파-시누클레인 또는 NACP), TGF-bl (형질전환 성장 인자 b1, transforming growth factor bl), IG 경쇄의 V 도메인 전길이 또는 단편, 아밀로이드 A 단백질의 76-잔기 N-말단 단편, 트랜스타이레틴(transthyretin) 변형체의 전 길이 또는 단편, ApoAl 변형체의 V-말단 단편, 전장 리소자임 변형체,조각(islet)-아밀로이드 폴리펩타이드의 37-잔기 단편, 전장 야생형 인슐린, 프리온 단백질의 전-길이 또는 단편, 칼시토닌 단편, 트랜스타이레틴의 전길이 또는 단편, 전장 야생형 β-2 마이크로글로불린(microglobulin), 심방성 나트륨배설증가 인자 (atrial natriuretic factor), 시스타틴(cyctatin) 변형체의 110-잔기 단편, 겔졸린(gelsolin) 변형체의 71-잔기 단편, 및 핍리노겐 α-사슬 변형체 단편으로 구성된 군 중에서 선택되는 방법.
  21. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 (Aβ)인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, P2 및 P30에 대하여 도 1에 대략적으로 나타난 바와 같이, 외래 TH에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드 내에 도입시키는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 SEQ ID NO : 2의 아미노산 잔기 672-714와 같이, SEQ ID NO : 2의 아미노산 700-714에 해당하는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 SEQ ID NO : 2의아미노산 672-714에 해당하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기에 유사체 내 외래 TH에피토프를 발생시키는 아미노산 서열이 삽입되거나, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 SEQ ID NO : 2의 아미노산 672-714에 해당하는 아미노산 서열을 포함하고, 외래 TH에피토프를 발생시키기 위하여 동일한 길이 또는 상이한 길이의 아미노산 서열에 의하여 하나 이상의 아미노산 서열이 치환되는 방법.
  25. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결정 물질의 다수 복사물의 제시를 가능하게 하는 담체 분자에 공유적 또는 비공유적으로 결합된, 두 개 이상의 아밀로이드생성 폴리펩타이드, 이들의 서브시퀀스 또는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 복사물을 가짐으로써 이를 면역 체계에 제시하는 방법.
  26. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드, 이들의 서브시퀀스 또는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 자기항원에 대한 자기관용의 파괴를 촉진시키는 아쥬반트와 함께 제제화되는 방법.
  27. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 유사체를 피내(intradermal), the 피하(subdermal), 피내(intracutaneous), 피하(subcutaneous), 및 근육내 경로와 같은 비경구적 경로(parenteral route); 복막 경로(peritoneal route); 경구적 경로; 구강적 경로(buccal route); 설하 경로(sublinqual route); 경막외 경로(epidural route); 척수 경로(spinal route); 항문 경로(anal route); 및 두개내 경로(intracranial route) 중에서 선택된 경로를 통하여 동물에 투여하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드, 이들의 서브시퀀스 또는 이들의 유사체의 유효량이 0.5㎍과 2, 000㎍ 사이인 방법.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 유사체가 가상 림프절(virtual lymph node, VLN) 장치 내에 포함되어 있는 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 체계에 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 제시하는 것이 상기 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열(들)을 동물세포 내에 도입시켜서 상기 핵산이 도입된 세포에 의하여 생체 내 발현시킴으로써 수행되는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 도입된 핵산(들)이 나출 DNA, 대전되거나 대전되지 않은 지질과 함께 제제화된 DNA, 리포좀 내에 제제화된 DNA, 바이러스 벡터에 포함된 DNA, 트렌스펙션-촉진 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 제제화된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 제제화된 DNA, 칼슘 침전제와 함께 제제화된 DNA, 불활성 담체 분자와 결합된 DNA, 키틴 또는 키토산 내에 인캡슐레이션된 DNA,및 아쥬반트와 함께 제제화된 DNA 중에서 선택되는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 핵산(들)이 VLN 장치 내에 포함되어 있는 방법.
  33. 제 22항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 2회 이상, 3회 이상, 4 회 이상, 6회 이상 및 12회 이상의 투여/도입과 같이, 1 년에 한 번 이상 투여/도입하는 것을 포함하는 방법.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 의한 방법에 따라서 아밀로이드의 총량이 감소되거나 아밀로이드 생성 속도가 임상적으로 상당히 감소되는 것과 같은 정도로 아밀로이드를 하향-조절하는 것을 포함하는, 알츠하이머병 또는 아밀로이드 침적의 특징을 갖는 다른 질병 및 상태의 치료 및/또는 예방 및/또는 개선 방법.
  35. 동물 아밀로이드생성 폴리펩타이드로부터 유도된 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 유사체로서, 상기 유사체에 변형이 도입됨으로써 상기 유사체로 면역화된 동물에서 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체를 생산을 유도하는 아밀로이드생성 폴리펩타이드 유사체.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 변형이 제 1 항 내지 제 19항 및 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 정의된 것인 유사체.
  37. 다음을 포함하는 면역원성 조성물:
    - 동물에서 자기유래(autologous)인 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 면역학적 유효량, 이 때, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드는 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 동물의 자기관용을 파괴하기 위하여 면역학적으로 허용되는 아쥬반트와 함께 제제화되고, 상기 조성물은 약학적 및 면역학적으로 허용되는 담체 및/또는 매개물(vehicle)을 추가적으로 포함할 수 있으며, 또는
    - 제 35 항 또는 제 36 항에 따르는 유사체의 면역학적 유효량, 이 때, 상기 조성물은 약학적 및 면역학적으로 허용되는 담체 및/또는 매개물 및 임의적으로 아쥬반트을 추가적으로 포함할 수 있음.
  38. 제 35 항 또는 제 36 항에 따른 유사체를 인코딩하는 핵산 단편.
  39. 자율복제가 가능한 벡터와 같이, 제 38 항에 따른 핵산 단편을 운반하는 벡터.
  40. 제 39 항에 있어서, 플라스미드, 파아지, 코스미드, 미니염색체 및 바이러스로 구성된 군 중에서 선택되는 벡터.
  41. 제 39 항 또는 제 40 항에 있어서, 5'→3' 방향 및 조작 가능한 결합으로,제 38 항에 따른 핵산 단편의 발현을 유발하는 프로모터, 임의적으로 폴리펩타이드 단편의 분비 또 막 내로의 통합을 가능하게 하는 선도 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 제 38 항에 따른 핵산 단편, 및 임의적으로 종결자를 포함하는 벡터.
  42. 제 39 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 내로 도입 시, 숙주 세포 게놈에 통합되거나 통합될 수 없는 벡터.
  43. 제 41 항 또는 제 42 항에 있어서, 프로모터가 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서의 발현을 유발시키는 벡터.
  44. 제 38 항에 따른 핵산을 복제할 수 있는 형질전환 세포와 같이, 제 39 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항의 벡터를 운반하는 형질전환 세포.
  45. 제 44 항에 있어서, 박테리아, 효모, 원생동물 중에서 선택되는 미생물 또는, 진균, S2또는 SF 세포와 같은 곤충 세포, 식물세포 및 포유동물 세포 중에서 선택되는 다세포 생물에서 유도되는 세포인 형질전환 세포.
  46. 제 44 항 또는 제 45 항에 있어서, 제 35 항 또는 제 36 항에 따른 유사체를 자신의 표면에 운반하거나 분비하는 형질전환 세포와 같이, 제 38 항에 따른 핵산단편을 발현시키는 형질전환 세포.
  47. 제 1 항 내지 제 19 항 또는 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 유사체를 인코딩하고 발현시키는 핵산 단편을 운반하는 비-병원성 미생물 또는 바이러스를 투여함으로써 면역 체계에 제시하는 방법.
  48. - 제 38항에 따른 핵산 단편 또는 제 39 항 내지 제 43 항에 따른 벡터, 및
    - 약학적 및 면역학적으로 허용되는 담체 및/또는 매개물 및/또는 아쥬반트를 포함하는, 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체의 생산을 유도기 위한 조성물.
  49. 제 39 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 운반하고, 제 38 항에 따른 핵산 단편을 발현시키고, 임의적으로 제 35 항 또는 제 36 항에 따른 유사체를 자신의 표면 상에 운반하거나 분비하는, 안정한 세포주.
  50. 숙주 세포를 제 38 항에 따른 핵산 단편 또는 제 39 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환시키는 것을 포함하는, 제 44 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 따른 세포를 제조하는 방법.
  51. 동물 종 내에서 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체를 유도하는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 동정방법으로서, 상기 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 자기-단백질이고, 다음의 단계를 포함하는 방법:
    - 펩타이드 합성 또는 유전공학 기술에 의하여, 아미노산이 동물 종의 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 아미노산 서열 내에 부가, 삽입되거나 또는 상기 서열에서 결실되거나 상기 서열과 치환된 상호 구별되는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 세트를 제조하여, 상기 동물 종에 대하여 외래인 T-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 상기 세트 내에 발생시키거나, 또는 상기 상호 구별되는 아밀로이드생성 폴리펩타이드 세트를 인코딩하는 핵산 단편 세트를 제조하는 단계,
    - 동물 종에서의 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 유도하는 능력에 대하여 상기 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 핵산 단편 세트의 구성원을 테스트하는 단계, 및
    - 동물 종 내에서 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 현저하게 유도하는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 세트의 구성원(들)을 동정하고 임의적으로 분리하거나, 동물 종 내에서 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 현저하게 유발하는 상기 핵산 단편 세트의 구성원에 의하여 인코딩되는 폴리펩타이드 발현 산물을 동정하고 임의적으로 분리하는 단계.
  52. 동물 종 내에서 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체를 유도할 수 있는 하나 이상의 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물의 제조방법으로서, 상기 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드가 자기-단백질이고, 다음의 단계를 포함하는 방법:
    - 펩타이드 합성 또는 유전공학 기술에 의하여, 아미노산이 동물 종의 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 아미노산 서열 내에 부가, 삽입되거나 또는 상기 서열에서 결실되거나 상기 서열과 치환된 상호 구별되는 변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 세트를 제조하여, 상기 동물 종에 대하여 외래인 T-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 상기 세트 내에 발생시키는 단계,
    - 동물 종에서의 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 유도하는 능력에 대하여 상기 세트의 구성원을 테스트하는 단계, 및
    - 아밀로이드생성 폴리펩타이드와 반응성이 있는 동물 종 내 항체 생산을 현저하게 유도하는 세트의 구성원(들)을 약학적 및 면역학적으로 허용되는 담체 및/또는 미개체와, 임의적으로, 하나 이상의 약학적 및 면역학적으로 허용되는 아쥬반트와 함께, 혼합하는 단계.
  53. 제 51 항 또는 제 52 항에 있어서, 상기 세트 구성원의 제조가, 각 서열이 제 38 항에 다른 핵산 서열인 상호 구별되는 핵산 서열을 제조하고, 상기 핵산 서열을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 세포 또는 숙주 동물을 상기 벡터로 형질전환시키고, 그리고 나서, 임의적으로, 상기 발현 산물을 분리하는 것을 포함하는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, PCR과 같은 분자 증폭 기술 또는 핵산 합성 기술의 도움으로 상기 핵산 서열 및/또는 벡터를 제조하는 방법.
  55. 동물 내 아밀로이드를 하향-조절하기 위한 아쥬반트를 포함하는 면역원성 조성물의 제조를 위한 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 이의 서브시퀀스의 용도.
  56. 알츠하이머병 또는 아밀로이드 침적에 의하여 특징화되는 다른 상태의 치료, 예방 또는 개선을 위한 아쥬반트를 포함하는 면역원성 조성물의 제조를 위한 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 이의 서브시퀀스의 용도.
  57. 동물 내 아밀로이드를 하향-조절하기 위한, 아쥬반트를 임의적으로 포함하는 면역원성 조성물의 제조를 위한 아밀로이드생성 폴리펩타이드 유사체의 용도.
  58. 알츠하이머병 또는 아밀로이드 침적에 의하여 특징화되는 다른 상태의 치료, 예방 또는 개선을 위한, 아쥬반트를 임의적으로 포함하는 면역원성 조성물의 제조를 위한 아밀로이드생성 폴리펩타이드 유사체의 용도.
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