PL196790B1

PL196790B1 - Zastosowanie zwierzęcego polipeptydu OPGL lub jego podsekwencji, lub analogu OPGL, zastosowanie fragmentu kwasu nukleinowego, zastosowanie wektora przenoszącego fragment kwasu nukleinowego, zastosowanie niepatogennej transformowanej komórki, zastosowanie kompozycji zawierającej taki fragment lub wektor, sposób identyfikacji zmodyfikowanego polipeptydu OPGL, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej

Info

Publication number: PL196790B1
Application number: PL346698A
Authority: PL
Inventors: Torben Halkier; Jesper Haaning
Original assignee: Pharmexa As
Priority date: 1998-09-15
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2008-01-31
Also published as: PL346698A1; HK1040261A1; HUP0103578A3; AU754971B2; EP1114166B1; DE69924392D1; US20040115199A1; DE69924392T2; IL141588A; ES2239457T3; KR20010085807A; PT1114166E; AU5617399A; CZ2001789A3; SK3062001A3; EP1114166A1; IL141588A0; ID28386A; NO20011304D0; ATE291628T1

Abstract

1. Zastosowanie zwierz ecego polipeptydu OPGL lub jego podsekwencji, lub analogu OPGL, który pochodzi od zwierz ecego polipeptydu OPGL, do którego wprowadzono modyfikacje, w wyniku których immunizacja zwierz ecia analogiem wywo luje produkcj e przeciwcia l przeciw zwierz ecemu poli- peptydowi OPGL, do wytwarzania farmaceutycznej kompozycji zawierajacej polipeptyd OPGL, podse- kwencj e lub analog, obni zaj acych poziom OPGL u zwierz ecia, przy czym polipeptyd OPGL jest bia l- kiem w lasnym, do leczenia, zapobiegania lub lagodzenia osteoporozy lub innych stanów charaktery- zuj acych si e nadmiern a resorpcj a ko sci. 2. Zastosowanie wed lug zastrz. 1, znamienne tym, ze w wyniku modyfikacji zasadnicza frakcja epitopów OPGL dla limfocytów B zostaje zachowana oraz ze - wprowadzony jest co najmniej jeden obcy epitop dla pomocniczych limfocytów T (epitop T H ), i/lub - wprowadzona jest co najmniej jedna pierwsza reszta, która wp lywa na kierowanie zmodyfiko- wanej cz asteczki do komórki prezentuj acej antygen (APC) lub limfocytu B, i/lub - wprowadzana jest co najmniej jedna druga reszta, która stymuluje uk lad immunologiczny, i/lub - wprowadzana jest co najmniej jedna trzecia reszta, która optymalizuje prezentacj e zmodyfiko- wanego polipeptydu OPGL uk ladowi immunologicznemu. 3. Zastosowanie wed lug zastrz. 2, znamienne tym, ze modyfikacja obejmuje wprowadzenie ja- ko grup bocznych obcego epitopu dla komórek T H i/lub pierwszej i/lub drugiej i/lub trzeciej reszty po- przez kowalencyjne albo niekowalencyjne wi azanie z odpowiednimi grupami chemicznymi w OPGL albo jego podsekwencji. PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 196790 (21) Numer zgłoszenia: 346698 (¹³) ^B1 (22) Data zgłoszenia: 13.09.1999 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

13.09.1999, PCT/DK99/00481 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

23.03.2000, WO00/15807 PCT Gazette nr 12/00 (51) Int.Cl.

C12N 15/62 (2006.01) C12N 15/12 (2006.01) C07K 14/705 (2006.01) A61K 31/713 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01)

Zastosowanie zwierzęcego polipeptydu OPGL lub jego podsekwencji, lub analogu OPGL, zastosowanie fragmentu kwasu nukleinowego, zastosowanie wektora przenoszącego fragment kwasu nukleinowego, zastosowanie niepatogennej transformowanej komórki, zastosowanie kompozycji zawierającej taki fragment lub wektor, sposób identyfikacji zmodyfikowanego polipeptydu OPGL, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej

(30) Pierwszeństwo: 15.09.1998,DK,PA199801164 02.10.1998,US,60/102,896	(73) Uprawniony z patentu: PHARMEXA A/S,Horsholm,DK
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 25.02.2002 BUP 05/02	(72) Twórca(y) wynalazku: Torben Halkier,Solrod Strand,DK Jesper Haaning,Birkerod,DK
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.01.2008 WUP 01/08	(74) Pełnomocnik: Janina Kossowka, PATPOL Sp.z o.o.

(57) 1 . Zastosowanie zwieręceego oolie^ePtddu OPGL lub jego oodsekwencji , Ibb analogu OPGL, który pochodzi od zwierzęcego polipeptydu OPGL, do którego wprowadzono modyfikacje, w wyniku których immunizacja zwierzęcia analogiem wywołuje produkcję przeciwciał przeciw zwierzęcemu polipeptydowi OPGL, do wytwarzania farmaceutycznej kompozycji zawierającej polipeptyd OPGL, podsekwencję lub analog, obniżających poziom OPGL u zwierzęcia, przy czym polipeptyd OPGL jest białkiem własnym, do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia osteoporozy lub innych stanów charakteryzujących się nadmierną resorpcją kości.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w wyniku modyfikacji zasadnicza frakcja epitopów OPGL dla limfocytów B zostaje zachowana oraz że

- wprowadzony jest co najmniej jeden obcy epitop dla pomocniczych limfocytów T (epitop Th), i/lub

- wprowadzona jest co najmniej jedna pierwsza reszta, która wpływa na kierowanie zmodyfikowanej cząsteczki do komórki prezentującej antygen (APC) lub limfocytu B, i/lub

- wprowadzana jest co najmniej jedna druga reszta, która stymuluje układ immunologiczny, i/lub

- wprowadzana jest co najmniej jedna trzecia reszta, która optymalizuje prezentację zmodyfikowanego polipeptydu OPGL układowi immunologicznemu.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że modyfikacja obejmuje wprowadzenie jako grup bocznych obcego epitopu dla komórek Th i/lub pierwszej i/lub drugiej i/lub trzeciej reszty poprzez kowalencyjne albo niekowalencyjne wiązanie z odpowiednimi grupami chemicznymi w OPGL albo jego podsekwencji.

PL 196 790 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zwierzęcego polipeptydu OPGL lub jego podsekwencji, lub analogu OPGL, zastosowanie fragmentu kwasu nukleinowego, zastosowanie wektora przenoszącego fragment kwasu nukleinowego, zastosowanie niepatogennej transformowanej komórki, zastosowanie kompozycji zawierającej taki fragment lub wektor, sposób identyfikacji zmodyfikowanego polipeptydu OPGL, sposób wytwarzania kompozycji immunogennej.

Niniejszy wynalazek umożliwia poprawę leczenia i zapobiegania osteoporozie i innym chorobom charakteryzującym się stałą utratą tkanki kostnej. Bardziej konkretnie, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu obniżania aktywności ligandu osteoprotegeryny (OPGL) przez umożliwienie wytwarzania przeciwciał przeciw OPGL u osób cierpiących na osteoporozę albo zagrożonych osteoporozą. Osteoporoza jest głównym i rosnącym problemem zdrowotnym na całym świecie. W Stanach Zjednoczonych Ameryki, Europie i Japonii dotyka łącznie około 75 milionów ludzi. A zatem jest najpowszechniejszą układową chorobą kości w uprzemysłowionej części świata.

Osteoporoza atakuje jedną na cztery kobiety w okresie pomenopauzalnym i większości starszych ludzi, w tym znacznej liczby mężczyzn. Koszty leczenia osteoporozy w Stanach Zjednoczonych Ameryki z 15 milionami chorych oszacowano w 1984 r. na 3,8 miliardów USD rocznie. To przekłada się poprzez ekstrapolację na koszty w skali światowej rzędu co najmniej około 20 miliardów USD.

Osteoporoza jest chorobą układu kostnego charakteryzującą się niską masą kości i degradacją mikroarchitektury tkanki kostnej, co w konsekwencji zwiększa kruchość i podatność na złamania. Jakkolwiek dotyczy to wszystkich kości, typowe i najczęstsze są złamania kręgosłupa, nadgarstka i biodra. Ryzyko rozwoju osteoporozy wzrasta z wiekiem i jest wyższe u kobiet niż u mężczyzn. Jej etiologia wydaje się wywodzić z mechanizmu powodującego wzmożenie normalnej utraty masy kostnej, która następuje po menopauzie u kobiet i ma miejsce u wszystkich osób w zaawansowanym wieku.

Szczyt masy kostnej jest osiągany w wieku około 35 lat. Po osiągnięciu tego szczytu, masa kostna zmniejsza się w ciągu życia na skutek nierównowagi w przebudowie. Kości tracą zarówno minerały, jak i substancję organiczną, ale utrzymują swoją podstawową organizację.

Kości składają się ze zmineralizowanej substancji pozakomórkowej złożonej z rozmaitych białek i proteoglikanów; głównym składnikiem jest kolagen typu I. Minerałem inkrustującym substancję pozakomórkową jest hydroksyapatyt Ca3(PO4)2Ca(OH)2. Kość podlega stałej budowie w czasie wzrostu i rozwoju oraz przebudowie przez całe życie w odpowiedzi na sygnały fizyczne i chemiczne.

Wzrost, rozwój i utrzymanie kości stanowią wysoce regulowane procesy, w których na poziomie komórkowym bierze udział skoordynowana regulacja komórek tworzących kości (osteoblastów) i komórek resorbujących kości (osteoklastów). Poziom masy kostnej odzwierciedla równowagę pomiędzy tworzeniem się i resorpcją kości.

Osteoblasty powstają z mezenchymalnych komórek macierzystych i wytwarzają macierz kostną w czasie rozwoju, po uszkodzeniu kości i w czasie normalnej przebudowy kości, która ma miejsce przez całe życie. Osteoklasty różnicują się z prekursorowych komórek krwiotwórczych z linii monocyty-makrofagi i resorbują macierz kostną.

Brak równowagi funkcji osteoblastów i osteoklastów może prowadzić do nieprawidłowości układu szkieletowego charakteryzujących się wzrostem masy kostnej (osteopetroza) albo zmniejszeniem masy kostnej (osteoporoza).

Badania osteopetrozy u mutantów myszy pokazały, że defekty genetyczne w rozwoju, dojrzewaniu i/lub aktywacji osteoklastów prowadziły do zmniejszenia resorpcji kości i w rezultacie niezmiennie do ciężkiej osteopetrozy (Marks, 1989). Pomimo tego, stosunkowo niewiele jak dotąd wiadomo o czynnikach rozpuszczalnych, które działają fizjologicznie regulując rozwój osteoklastów.

Jednakże ostatnio opisano i scharakteryzowano dwa białka, które biorą udział w tej regulacji (Simonet i wsp., 1997; Lacey i wsp., 1998). Tymi dwoma białkami są osteoprotegeryna i ligand osteoprotegeryny.

Osteoprotegeryna jest nowym, wydzielniczym przedstawicielem rodziny receptora czynnika martwicy nowotworu. In vitro, osteoprotegeryna blokuje osteoklastogenezę w sposób zależny od dawki. Myszy transgeniczne wyrażające osteoprotegerynę wykazują ogólne zwiększenie gęstości kości (osteopetrozę) związane ze zmniejszeniem poziomu osteoklastów. Podawanie zrekombinowanej osteoprotegeryny prowadzi do podobnych efektów u normalnych myszy i chroni przed utratą kości towarzyszącą wycięciu jajników u szczurów (Simonet i wsp., 1997). Ponadto, u myszy z brakiem osteoprotegeryny (myszy „znokautowane”), jakkolwiek normalnych w chwili urodzenia, rozwijała się wczePL 196 790 B1 sna postać osteoporozy i zwapnienie tętnic (Bucay i wsp., 1998). Obserwacje te mocno wskazują na możliwość, że osteoprotegeryna blokuje różnicowanie osteoklastów, głównego, jeżeli nie jedynego typu komórek resorbujących kości, sugerując, że może ona działać jako humoralny regulator resorpcji kości. Osteoprotegeryna jest przedmiotem WO/97/23614.

Postawiono hipotezę, że osteoprotegeryna może wywierać wpływ przez wiązanie i neutralizację czynnika, który stymuluje rozwój osteoklastów, hamując zatem dojrzewanie osteoklastów (Simonet i wsp., 1997).

Ligand osteoprotegeryny (OPGL) jest nowym przedstawicielem czynnika martwicy nowotworu z rodziny cytokin, który istnieje zarówno w postaci związanej z błoną, jak i rozpuszczalnej. OPGL wiąże się z osteoprotegeryną z powinowactwem wiązania 4 nM. In vitro, OPGL aktywuje dojrzałe osteoklasty i moduluje wytwarzanie osteoklastów z prekursorów szpiku kostnego w obecności CSF-1. Wykazano również, że OPGL wiąże się z powierzchnią prekursorów osteoklastów w szpiku kostnym traktowanym CSF-1. Receptor dla OPGL na tych prekurserowych komórkach krwiotwórczych jest jednakże nieznany. Zrekombinowany rozpuszczalny OPGL jest silnym induktorem resorpcji kości in vivo (Lacey i wsp., 1998).

Opis OPGL

OPGL jest syntetyzowany jako białko transbłonowe typu II składające się z 317 reszt aminokwasowych (ludzki, Id. Sekw. Nr: 2) albo 316 reszt aminokwasowych (mysi, Id. Sekw. Nr: 4 i 6). Porównanie tych dwóch sekwencji aminokwasowych pokazało, że identyczne reszty aminokwasowe znajdują się w 87% homologicznych pozycji.

Sekwencja aminokwasowa OPGL obejmuje krótką domenę cytoplazmatyczną na końcu N, po której następuje przypuszczalny region transbłonowy pomiędzy resztami aminokwasowymi 49 i 69. W oparciu o homologię z czynnikiem martwicy nowotworu alfa, wysunięto sugestię, że pozakomórkowa część OPGL składa się z dwóch domen: regionu „szypułki” rozciągającego się od aminokwasu 70 do 157 i aktywnej części ligandu rozciągającej się od aminokwasu 158 do końca C.

Białkiem najbardziej spokrewnionym z OPGL wydaje się być indukująca apoptozę cytokina TRAIL, z mniej niż 25% identycznych reszt aminokwasowych. OPGL został bardzo niedawno sklonowany w innym kontekście i został nazwany TRANCE (Wong i wsp., 1997, J. Biol. Chem. 272: 25190-25194) i RANKL, odpowiednio (Anderson i wsp., 1997, Nature 390: 175-179). Białko jest znane również jako osteoklastyczny czynnik różnicujący (ODF).

Kilka N-końcowych wariantów delecyjnych mysiego OPGL wyrażono w E. coli i oczyszczono. Warianty te składają się z reszt aminokwasowych 75-316, 128-316, 137-316 oraz 158-316, odpowiednio. Trzy najkrótsze warianty miały podobną strukturę harmonijki β w oparciu o badania dichroizmu kołowego i wszystkie miały zdolność wiązania osteoprotegeryny. Co ważniejsze jednak, to fakt, że te trzy warianty były aktywne w testach in vitro (Lacey i wsp., 1998).

Najkrótszy wariant poddano dalszym badaniom. Podobnie jak czynnik martwicy nowotworu alfa, ten wariant OPGL występuje jako trimer w roztworze i tworzy kompleks 3:3, kiedy inkubuje się go z osteoprotegeryną. Stwierdzono, że powinowactwo wiązania wynosi 4 nM. Wariant ten indukuje znaczący wzrost poziomu jonów wapnia we krwi (hiperkalcemia) u myszy in vivo. Jednoczesne podawanie osteoprotegryny znacząco zmniejsza ten hiperkalcemiczny efekt OPGL.

Najdłuższy wariant (reszty aminokwasowe 75-316) OPGL nie wiąże osteoprotegryny i nie ma żadnej aktywności biologicznej.

W czasie konstruowania wariantów z N-końcowymi delecjami, naturalne miejsce cięcia OPGL nie było znane. Ekspresja OPGL pełnej długości w ludzkich fibroblastach 293 doprowadziła do powstania rozpuszczalnego OPGL rozpoczynającego się od reszty aminokwasowej 139 w białku mysim albo od homologicznej reszty aminokwasowej 140 w białku ludzkim. Badania ekspresji pokazały również, że rozpuszczalny OPGL będący rezultatem ekspresji w komórkach ludzkich jest glikozylowany. Nie jest to zaskoczeniem, ponieważ zarówno mysi, jak i ludzki OPGL zawiera trzy potencjalne miejsca N-glikozylacji w C-końcowej domenie ligandu.

Stężenia osteoprotegeryny we krwi i tkankach są nieznane, ale białko ma znaczącą aktywność biologiczną przy stężeniu l ng/ml.

Aktywność biologiczna OPGL

OPGL jest silnym czynnikiem różnicowania osteoklastów w połączeniu z CSF-1. Żaden z tych składników sam nie ma zdolności do indukowania różnicowania osteoklastów z komórek prekursorowych.

PL 196 790 B1

OPGL jest silnym aktywatorem dojrzałych osteoklastów. OPGL samodzielnie aktywuje dojrzałe osteoklasty do resorpcji kości. W tych doświadczeniach nie obserwowano działania OPGL jako czynnika wzrostowego osteoklastów albo czynnika przeżywalności osteoklastów.

Działanie OPGL nie wydaje się być ograniczone gatunkowo, ponieważ mysi OPGL indukuje tworzenie się osteoklastów także w hodowlach ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej.

Stwierdzamy, że przytoczone powyżej dane sugerują patofizjologiczną rolę OPGL. Dowód in vivo jest po części oparty na szczegółach lub wynika pośrednio, ale w naszej opinii jest przekonujący, szczególnie w połączeniu z danymi bezpośrednimi.

Obserwacje, że wstrzyknięcie myszom zrekombinowanej C-końcowej domeny OPGL prowadzi do ciężkiej hiperkalcemii wskazuje, naszym zdaniem, bezpośrednio na rolę patofizjologiczną.

Pośrednie dane pochodzą od myszy z brakiem osteoprotegeryny (myszy znokautowane), które są wprawdzie zdrowe przy narodzeniu, ale rozwija się u nich wczesna postać osteoporozy. To pokazuje, że usunięcie białka, które wiąże OPGL i neutralizuje jego efekty, prowadzi do osteoporozy. Wyciągamy stąd wniosek, że najbardziej prawdopodobną tego przyczyną jest zwiększenie procesu dojrzewania i aktywacji osteoklastów powodowane przez OPGL.

Dwa inne pośrednie dowody są takie, że zarówno u myszy transgenicznych pod względem osteoprotegeryny, jak i myszy, którym wstrzyknięto zrekombinowaną osteoprotegerynę, rozwija się osteopetroza. To pokazuje, że nienaturalnie wysoki poziom białka, które wiąże OPGL i neutralizuje jego efekty prowadzi do osteopetrozy. Wniosek, który tu wyciągamy jest taki, że przyczyną tego jest zmniejszenie dojrzewania i aktywacji osteoklastów powodowane przez neutralizację OPGL.

Sugerujemy zatem model, w którym OPGL i osteoprotegeryna działają jako dodatnie i ujemne regulatory rozwoju osteoklastów, odpowiednio. Innymi słowy, OPGL promuje resorpcję kości, podczas gdy osteoprotegeryna hamuje resorpcję kości.

A zatem w odniesieniu do osteoporozy OPGL mógłby być uważany za „czynnik patogenny”, który promuje resorpcję kości, co w końcu prowadzi do osteoporozy. Analogicznie, osteoprotegerynę można postrzegać jako „czynnik leczniczy”, który przeciwdziała „czynnikowi patogennemu” poprzez neutralizację jego efektów.

Proponujemy zatem obniżenie poziomu różnicowania/dojrzewania/tworzenia osteoklastów i aktywacji osteoklastów poprzez wytwarzanie in vivo przeciwciał zdolnych do neutralizacji OPGL, dostarczając bezpiecznych i skutecznych sposobów leczenia/łagodzenia i/lub zapobiegania osteoporozie i innym chorobom charakteryzującym się nadmierną resorpcją kości w porównaniu z szybkością tworzenia się kości.

Zatem przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie zwierzęcego polipeptydu OPGL lub jego podsekwencji, lub analogu OPGL, który pochodzi od zwierzęcego polipeptydu OPGL, do którego wprowadzono modyfikacje, w wyniku których immunizacja zwierzęcia analogiem wywołuje produkcję przeciwciał przeciw zwierzęcemu polipeptydowi OPGL do wytwarzania farmaceutycznej kompozycji zawierającej polipeptyd OPGL, podsekwencję lub analog, obniżających poziom OPGL u zwierzęcia, przy czym polipeptyd OPGL jest białkiem własnym, do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia osteoporozy lub innych stanów charakteryzujących się nadmierną resorpcją kości.

Najbardziej atrakcyjnym aspektem tego podejścia jest to, że np. osteoporoza może być kontrolowana poprzez okresowe, ale nie bardzo częste immunizacje, w przeciwieństwie do podejścia terapeutycznego, które obejmuje częste (np. codzienne podawanie osteoprotegeryny albo cząsteczek mających analogiczne do niej powinowactwo wiązania się z OPGL. Spodziewane jest, że 1-4 iniekcji rocznie immunogennej kompozycji będzie wystarczało do otrzymania pożądanego efektu, podczas gdy podawanie osteoprotegeryny lub innych inhibitorów aktywności OPGL wymagałoby podawania codziennego.

Wynalazek dotyczy też zastosowania fragmentu kwasu nukleinowego, który koduje OPGL, podsekwencję OPGL lub analog OPGL pochodzący od zwierzęcego polipeptydu OPGL, do którego wprowadzono modyfikacje, w wyniku których immunizacja zwierzęcia analogiem wywołuje produkcję przeciwciał przeciw zwierzęcemu polipeptydowi OPGL, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej fragment kwasu nukleinowego obniżającej poziom OPGL u zwierzęcia do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia osteoporopzy lub innych stanów charakteryzujących się nadmierną resorpcją kości.

Ponadto, wynalazek dotyczy zastosowania wektora przenoszącego fragment kwasu nukleinowego, który koduje OPGL, podsekwencję OPGL lub analog OPGL pochodzący od zwierzęcego polipeptydu OPGL, do którego wprowadzono modyfikacje w wyniku których immunizacja zwierzęcia analogiem wywołuje produkcję przeciwciał przeciw zwierzęcemu polipeptydowi OPGL, do wytwarzania

PL 196 790 B1 kompozycji farmaceutycznej zawierającej wektor obniżającej poziomu OPGL u zwierzęcia do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia osteoporozy lub innych stanów charakteryzujących się nadmierną resorpcją kości.

W korzystnym wykonaniu wektor jest zdolny do autonomicznej replikacji.

Korzystnie wektor jest wybrany z grupy składającej się z plazmidu lub wirusa.

W korzystnym zastosowaniu wektor zawiera w kierunku od 5' —>3' i w funkcjonalnym połączeniu: promotor do kierowania ekspresją fragmentu kwasu nukleinowego, który koduje OPGL, podsekwencję OPGL lub analog OPGL pochodzący od zwierzęcego polipeptydu OPGL, do którego wprowadzono modyfikacje, w wyniku których immunizacja zwierzęcia analogiem wywołuje produkcję przeciwciał przeciw zwierzęcemu polipeptydowi OPGL, ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą peptyd liderowy umożliwiający sekrecję albo włączenie do błony fragmentu polipeptydowego, fragment kwasu nukleinowego, który koduje analog OPGL, podsekwencję OPGL lub analog OPGL określony w zastrz. 1 i ewentualnie terminator.

W innym korzystnym zastosowaniu wektor po wprowadzeniu do komórki gospodarza jest zdolny albo niezdolny do włączania się do genomu komórki gospodarza.

Korzystnie promotor w wektorze kieruje ekspresją w komórce eukariotycznej i/lub komórce prokariotycznej.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie nie patogennej transformowanej komórki przenoszącej wektor ekspresyjny określony powyżej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej transformowaną komórkę do obniżania poziomu OPGL u zwierzęcia, do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia osteoporozy lub innych stanów charakteryzujących się nadmierną resorpcją kości.

Korzystnie transformowana komórka ma zdolność do replikowania fragmentu kwasu nukleinowego określonego powyżej.

Korzystnie transformowana komórka jest komórką bakterii.

Bardziej korzystnie bakteria jest wybrana z grupy składającej się z Mycobacterium bovis, BCG., Streptococcus spp., E coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae i Shigella.

Korzystnie transformowana komórka wydziela lub niesie na swojej powierzchni OPGL, podsekwencję OPGL lub analog OPGL określony powyżej.

Wynalazek dotyczy też zastosowania kompozycji zawierającej

- fragment kwasu nukleinowego określonego powyżej albo wektora określonego powyżej oraz

- farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/lub podłoże i/lub adiuwant do wytwarzania leku zawierającego tę kompozycję, do wywoływania produkcji przeciwciał, do obniżania OPGL u zwierzęcia, do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia osteoporozy lub innych stanów charakteryzujących się nadmierną resorpcją kości.

Wynalazek dotyczy też sposobu identyfikacji zmodyfikowanego polipeptydu OPGL, który ma zdolność do indukowania przeciwciał przeciw niemodyfikowanemu OPGL w gatunku zwierzęcia, jak również sposobu wytwarzania kompozycji immunogennej zawierającej analogi OPGL.

W dalszej części podane są definicje wielu terminów stosowanych w niniejszym opisie i zastrzeżeniach w celu jasnego określenia przedmiotu i zakresu wynalazku.

Termin „limfocyt T” i „komórka T” będzie stosowany wymiennie dla limfocytów pochodzenia grasiczego, które są odpowiedzialne za różne komórkowe odpowiedzi immunologiczne, jak również za aktywność pomocniczą w humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Analogicznie, termin „limfocyt B” i „komórka B” będzie stosowany wymiennie dla limfocytów wytwarzających przeciwciała.

„Polipeptyd OPGL” ma tu oznaczać polipeptydy o sekwencji aminokwasowej omówionych powyżej białek OPGL pochodzących od ludzi i myszy (albo ich skróconych postaci, w których znajduje się znacząca liczba epitopów dla komórek B, wspólnych z nienaruszoną OPGL), ale termin ten obejmuje również polipeptydy o sekwencji aminokwasowej identycznej z analogami tych dwóch białek wyizolowanych z innych gatunków. W zakres znaczenia tego terminu wchodzą również nieglikozylowane postaci OPGL, które są wytwarzane w systemie prokariotycznym, jak również postaci o odmiennym wzorze glikozylacji na skutek zastosowania np. drożdży lub innych niessaczych eukariotycznych systemów ekspresji. Należy jednakże zaznaczyć, że stosując termin „polipeptyd OPGL” zakłada się, że polipeptyd ten jest normalnie nieimmunogenny, gdy jest prezentowany zwierzęciu, które ma być leczone. Innymi słowy, polipeptyd OPGL jest białkiem własnym lub analogiem takiego białka własnego, które normalnie nie daje odpowiedzi immunologicznej wobec OPGL w zwierzęciu będącym przedmiotem zainteresowania.

PL 196 790 B1 „Analog OPGL” jest polipeptydem OPGL, który został poddany zmianom struktury pierwszorzędowej. Taka zmiana może np. być w postaci fuzji polipeptydu OPGL z odpowiednim partnerem fuzji (tj. zmiana w pierwszorzędowej strukturze wyłącznie obejmująca C-i N-końcowe addycje reszt aminokwasowych) i/lub może być w postaci insercji albo delecji i/albo podstawień w sekwencji aminokwasowej polipeptydu OPGL. Termin obejmuje również cząsteczki pochodnych OPGL, patrz dyskusja poniżej na temat modyfikacji OPGL.

Należy zaznaczyć, że można sobie wyobrazić zastosowanie ksenoanalogów (np. analogów psich albo świńskich) ludzkiego OPGL jako szczepionki u ludzi w celu wytworzenia żądanej odpowiedzi immunologicznej przeciw OPGL. Takie zastosowanie obcych analogów do immunizacji jest również uważane za część wynalazku.

Termin „polipeptyd” w niniejszym kontekście ma oznaczać zarówno krótkie peptydy od 2 do 10 reszt aminokwasowych, oligopeptydy od 11 do 100 reszt aminokwasowych i polipeptydy powyżej 100 reszt aminokwasowych. Ponadto, termin ma również obejmować białka, tj. funkcjonalne biocząsteczki obejmujące co najmniej jeden polipeptyd; gdy zawierają co najmniej dwa polipeptydy mogą tworzyć kompleksy, mogą być połączone kowalencyjnie albo mogą być połączone niekowalencyjnie. Polipeptyd(y) w białku mogą być glikozylowane i/lub połączone z lipidami i/lub zawierać grupy prostetyczne.

Termin „podsekwencja” oznacza dowolny ciąg co najmniej trzech aminokwasów albo co najmniej 3 nukleotydów pochodzących bezpośrednio lub występujących naturalnie w sekwencji aminokwasowej lub sekwencji kwasu nukleinowego OPGL, odpowiednio.

Termin „zwierzę” w obecnym tu kontekście ma ogólnie oznaczać gatunki zwierzęce (korzystnie ssaków), takie jak Homo sapiens, Canis domesticus, itd., a nie jedynie pojedyncze zwierzę. Jednakże termin oznacza również populację takich gatunków zwierząt, ponieważ ważne jest, aby wszystkie osobniki immunizowane niosły zasadniczo taki sam OPGL umożliwiając immunizację zwierząt tym samym immunogenem (-ami). Jeżeli na przykład istnieją warianty genetyczne OPGL w różnych populacjach ludzkich, może być konieczne zastosowanie różnych immunogenów w tych różnych populacjach w celu umożliwienia przełamania autotolerancji wobec OPGL w każdej z tych populacji. Będzie jasne dla specjalisty, że zwierzę w niniejszym kontekście jest żywą istotą, która ma układ immunologiczny. Korzystne jest, jeżeli zwierzę jest kręgowcem, takim jak ssak.

Termin „obniżenie aktywności OPGL in vivo ma tu oznaczać obniżenie w żywym organizmie liczby oddziaływań między OPGL i jego (nieznanym) receptorem (albo między OPGL i innymi możliwymi ważnymi biologicznie partnerami wiążącymi dla tej cząsteczki). Obniżenie poziomu można uzyskać za pośrednictwem różnych mechanizmów: spośród nich najprostszym jest proste zablokowanie miejsca aktywnego OPGL przez związanie przeciwciała. Jednakże, w niniejszym przypadku wiązanie przeciwciała prowadzi do usuwania OPGL przez komórki oczyszczające (takie jak makrofagi i inne komórki fagocytarne).

Wyrażenie „dokonanie prezentacji układowi immunologicznemu” ma oznaczać, że układ immunologiczny zwierzęcia jest poddany prowokacji immunologicznej w sposób kontrolowany. Jak będzie to widać z przedstawionego poniżej ujawnienia, taką prowokację układu immunologicznego można przeprowadzić na wiele sposobów, z których najważniejszym jest szczepienie zawierającymi polipeptyd „szczepionkolekami” (tj. szczepionką, która jest podawana w celu leczenia albo złagodzenia trwającej już choroby) albo szczepienia „szczepionkolekiem” z kwasem nukleinowym. Ważnym rezultatem, który ma być osiągnięty jest to, aby komórki immunologicznie kompetentne u zwierzęcia zostały skonfrontowane z antygenem w sposób skuteczny immunologicznie, podczas gdy dokładny sposób uzyskania tego rezultatu jest mniej ważny dla idei wynalazczej stanowiącej podstawę niniejszego wynalazku.

Termin „ilość skuteczna immunologicznie” ma swoje zwykłe w tej dziedzinie znaczenie, tj. oznacza ilość immunogenu zdolną do zaindukowania odpowiedzi immunologicznej, która nawiązuje do odpowiedzi na czynniki patogenne mające wspólne z immunogenem właściwości immunologiczne.

Kiedy stosuje się określenie, że OPGL został zmodyfikowany, ma to oznaczać modyfikację chemiczną polipeptydu, który stanowi szkielet OPGL. Takimi modyfikacjami mogą być np. derywatyzacja (np. alkilacja) niektórych reszt aminokwasowych w sekwencji OPGL, ale będzie oczywiste z poniższego opisu, że korzystne modyfikacje obejmują zmiany w pierwszorzędowej strukturze sekwencji aminokwasowej OPGL.

Kiedy omawia się „autotolerancję wobec OPGL” jest zrozumiałe, że ponieważ OPGL jest białkiem własnym w populacji, która ma być zaszczepiona, normalne osobniki w tej populacji nie wykazują odpowiedzi immunologicznej wobec OPGL; nie można jednak wykluczyć, że w populacji zwierzęcej

PL 196 790 B1 mogą się zdarzyć pojedyncze osobniki, które będą miały zdolność wytwarzania przeciwciał przeciw natywnemu OPGL, np. jako część choroby autoimmunologicznej. W każdym razie, zwierzę normalnie będzie wykazywało autotolerancję wobec własnego OPGL, ale nie można wykluczyć, że analogi pochodzące od innych gatunków zwierząt i od populacji mających odmienny fenotyp OPGL, będą również tolerowane przez takie zwierzę.

„Obcy epitop dla komórki T” (albo: „obcy epitop dla limfocytu T”) jest peptydem, który jest zdolny do wiązania się z cząsteczką MHC i który stymuluje komórki T w danych gatunkach zwierzęcych. Korzystnymi epitopami dla komórek T są epitopy „mieszane”, tj. epitopy, które wiążą się ze znaczącą frakcją poszczególnych klas cząsteczek MHC w gatunkach lub populacjach zwierząt. Znana jest jedynie bardzo ograniczona liczba takich mieszanych epitopów dla komórek T i będą one omówione szczegółowo poniżej. Należy zauważyć, że aby immunogeny, które są stosowane według niniejszego wynalazku były skuteczne u możliwie największej frakcji zwierząt w populacji, może być konieczne

1) wstawienie kilku obcych epitopów dla komórek T do tego samego analogu OPGL albo

2) przygotowanie kiiku analogów OPGL, gdzie każdy analog ma wstawiony inny mieszany epitop. Należy zauważyć, że idea obcych epitopów dla komórek T obejmuje również zastosowanie ukrytych epitopów dla komórek T, tj. epitopów, które pochodzą z własnego białka i które zachowują się jak immunogeny, gdy występują w postaci wyodrębnionej, nie stanowiąc już części własnego białka będącego przedmiotem zainteresowania.

„Obcy epitop dla pomocniczych limfocytów T” (obcy epitop dla Th) jest obcym epitopem dla komórek T, który wiąże się z cząsteczką MHC klasy II i może być prezentowany na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC) związany z cząsteczką MHC klasy II.

„Część funkcjonalna” (bio)cząsteczki w niniejszym kontekście ma oznaczać część cząsteczki, która jest odpowiedzialna za co najmniej część efektów biochemicznych lub fizjologicznych wykazywanych przez tę cząsteczkę. Jest znane w dziedzinie, że enzymy i inne cząsteczki efektorowe mają miejsce aktywne, które jest odpowiedzialne za skutki wywoływane przez cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania. Inne części cząsteczki mogą służyć celom stabilizowania lub zwiększania rozpuszczalności i można je zatem pomijać jeżeli te cele nie mają związku z kontekstem pewnych wykonań. Przykładowo, możliwe jest zastosowanie pewnych cytokin jako reszty modyfikującej w OPGL (patrz szczegółowa dyskusja poniżej) i w takim przypadku kwestia stabilności może być nieistotna, ponieważ połączenie z OPGL dostarcza niezbędnej stabilności.

Termin „adiuwant” ma swoje zwykłe znaczenie w dziedzinie technologii szczepionek, tj., oznacza substancję lub kompozycję, która

1) sama nie ma zdolności wywoływania specyficznej odpowiedzi immunologicznej wobec immunogenu w szczepionce, ale która

2) ma pomimo tego zdolność do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej przeciw immunogenowi. Albo, innymi słowy, szczepienie samym adiuwantem nie daje odpowiedzi immunologicznej przeciw immunogenowi, szczepienie immunogenem może ale nie musi wywoływać odpowiedzi immunologicznej przeciw immunogenowi, ale połączenie szczepienia immunogenem i adiuwantem indukuje odpowiedź immunologiczną przeciw immunogenowi, która jest silniejsza niż indukowana przez sam immunogen.

„Kierowanie do celu” cząsteczki ma oznaczać sytuację, gdzie cząsteczka po wprowadzeniu do zwierzęcia będzie pojawiać się preferencyjnie w pewnej tkance(-kach) albo będzie preferencyjnie związana z pewnymi komórkami albo typami komórek. Efekt można uzyskać wieloma sposobami, włączając w to między innymi włączenie cząsteczki do kompozycji ułatwiającej kierowanie do celu albo poprzez wprowadzenie do cząsteczki grup, które ułatwiają kierowanie do celu. Te zagadnienia będą szczegółowo omówione poniżej.

„Stymulacja układu immunologicznego” oznacza, że substancja albo kompozycja będąca przedmiotem zainteresowania wykazuje ogólny, niespecyficzny efekt immunostymulacyjny. Wiele adiuwantów i przypuszczalnych adiuwantów (takich jak pewne cytokiny) ma zdolność stymulowania układu immunologicznego. Rezultatem zastosowania czynników immunostymulacyjnych jest wzrost „stanu gotowości” układu immunologicznego, co oznacza, że jednoczesna albo następująca później immunizacja immunogenem indukuje znacznie skuteczniejszą odpowiedź immunologiczną w porównaniu z zastosowaniem jedynie immunogenu.

Korzystne wykonania obniżania aktywności OPGL

Korzystnie polipeptyd OPGL stosowany jako immunogen w jest zmodyfikowaną cząsteczką, w której obecna jest co najmniej jedna zmiana w sekwencji aminokwasowej OPGL, ponieważ szansa

PL 196 790 B1 otrzymania najważniejszego - przełamania autotolerancji wobec OPGL jest znacznie w ten sposób ułatwiana. Należy zaznaczyć, że to nie wyklucza możliwości zastosowania takiego zmodyfikowanego OPGL w kompozycjach, które dodatkowo ułatwiają przełamanie autotolerancji wobec OPGL, np. kompozycjach zawierających adiuwanty.

Wykazano (w Dalum I i wsp., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804), że potencjalnie samoreaktywne limfocyty B rozpoznające własne białka są fizjologicznie obecne u osób zdrowych. Jednakże, aby te limfocyty zostały zaindukowane do wytwarzania przeciwciała reagującego z odpowiednimi białkami własnymi, konieczna jest pomoc ze strony pomocniczych limfocytów T wytwarzających cytokiny (komórek Th albo limfocytów Th). Normalnie pomoc ta nie jest dostarczana, ponieważ limfocyty T generalnie nie rozpoznają epitopów komórek T pochodzących z własnych białek, gdy są one prezentowane przez komórki prezentujące antygen (APC). Jednakże poprzez dostarczenie elementu „obcości” we własnym białku (tj. przez wprowadzenie znaczącej immunologicznie modyfikacji), komórki T rozpoznające obcy element są aktywowane po rozpoznaniu obcego epitopu na APC (takiej jak, wyjściowo, komórka jednojądrzasta). Poliklonalne limfocyty B (które są również komórkami APC) zdolne do rozpoznawania własnych epitopów w zmodyfikowanych własnych białkach, również internalizują antygen, a następnie prezentują ich obcy epitop(-y) dla komórek T, a zaktywowane limfocyty T dostarczają następnie cytokinę, aby pomóc tym samoreaktywnym poliklonalnym limfocytom B. Ponieważ przeciwciała wytwarzane przez te poliklonalne limfocyty B są aktywne wobec różnych epitopów w zmodyfikowanym polipeptydzie, włączając te, które są obecne również w polipeptydzie natywnym, indukowane jest przeciwciało reagujące krzyżowo z niezmodyfikowanym białkiem własnym. Wniosek jest taki, że limfocyty T mogą być doprowadzone do działania, tak jak gdyby populacja poliklonalnych limfocytów B rozpoznała całkowicie obcy antygen, podczas gdy w rzeczywistości jedynie wstawiony epitop(-y) jest/są obce dla gospodarza. W ten sposób indukowane są przeciwciała zdolne do reakcji krzyżowej z niezmodyfikowanymi własnymi antygenami.

Znanych jest w tej dziedzinie kilka sposobów modyfikowania własnego peptydowego antygenu w celu przełamania autotolerancji. A zatem zgodnie z zastosowaniem według wynalazku w wyniku modyfikacji zasadnicza frakcja epitopów OPGL dla limfocytów B zostaje zachowana oraz

Jednakże wszystkie te modyfikacje powinny być przeprowadzane z zachowaniem w OPGL zasadniczej frakcji wyjściowych epitopów dla limfocytów B, ponieważ rozpoznanie natywnej cząsteczki przez limfocyt B jest w ten sposób wzmacniane.

W jednym z korzystnych wykonań, modyfikacja obejmuje wprowadzenie jako grup bocznych obcego epitopu dla komórek Th i/lub pierwszej, i/lub drugiej, i/lub trzeciej reszty poprzez kowalencyjne albo niekowalencyjne wiązanie z odpowiednimi grupami chemicznymi w OPGL albo jego podsekwencji.

Oznacza to, że ciągi reszt aminokwasowych pochodzące z OPGL są przekształcane w pochodne bez zmiany pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej albo co najmniej bez wprowadzania zmian w wiązaniach peptydowych pomiędzy poszczególnymi aminokwasami w łańcuchu.

Alternatywne i korzystne wykonanie wykorzystuje modyfikację, która obejmuje podstawienie i/lub delecję, i/lub insercję, i/lub addycję aminokwasów.

Korzystna modyfikacja prowadzi do powstania fuzji poiipeptydowej

W tych korzystnych wykonaniach według wynalazku przy wprowadzeniu podstawienia i/lub delecji i/lub insercji i/lub addycji aminokwasów zasadniczo zachowana zostaje ogólna struktura trzeciorzędowa OPGL.

Jedną szczególnie korzystną wersją tego wykonania jest technika opisana w WO 95/05849, która ujawnia sposób obniżania poziomu własnych białek poprzez immunizowanie analogami własnych białek, gdzie pewna liczba sekwencji aminokwasowych została podstawiona odpowiednią liczbą sekwencji aminokwasowych, z których każda zawierała obcy immunodominujący epitop dla komórki T, zachowując jednoczenie w analogu ogólną strukturę trzeciorzędową własnego białka. Dla potrzeb niniejszego wynalazku wystarczające jest jeżeli modyfikacja (czy to jest insercja, addycja, delecja czy podstawienie) prowadzi do powstania obcego epitopu dla komórek T, a jednocześnie zachowuje

PL 196 790 B1 w OPGL znaczną liczbę epitopów dla komórek B. Jednakże w celu uzyskania maksymalnej skuteczności zaindukowanej odpowiedzi immunologicznej, korzystne jest, jeżeli w zmodyfikowanej cząsteczce zachowana zostaje ogólna struktura trzeciorzędowa.

Następujący wzór opisuje konstrukty OPGL, których zastosowanie ogólnie objęte jest wynalazkiem:

(MOD₁)s1l(OPGL_el)n1(MOD2)_a2(OPGL_e2)ni (MOD_X)_SX (OPGL_ex)_nx (0 gdzie OPGLei - OPGLe* to epitop x dla komórek B zawierający podsekwencje OPGL, które są niezależnie identyczne albo nieidentyczne i które mogą zawierać obce grupy boczne, x jest liczbą całkowitą > 3, n1-nx to x liczb całkowitych > 0 (co najmniej jedna wynosi > 1), MOD-i - MOD_X jest to x modyfikacji wprowadzonych pomiędzy zachowywane epitopy dla komórek B, a s1- sx to x liczb całkowitych > 0 (co najmniej jedna wynosi > 1, jeżeli żadna z grup bocznych nie została wprowadzona do sekwencji OPGLe). A zatem, biorąc pod uwagę jedynie immunogenność konstruktów wszystkie rodzaje permutacji wyjściowej sekwencji OPGL i wszystkie rodzaje jej modyfikacji. A zatem zastosowanie według wynalazku obejmuje zmodyfikowane OPGL otrzymane poprzez pominięcie części sekwencji OPGL, która np. może wykazywać niekorzystne efekty in vivo albo pominięcie części, które są normalnie wewnątrzkomórkowe, a zatem mogą prowadzić do niepożądanych reakcji immunologicznych.

Zachowanie zasadniczej frakcji epitopów dla komórek B albo nawet całej trzeciorzędowej struktury białka, które jest poddane modyfikacjom jak tu opisane można osiągnąć na wiele sposobów. Jednym z nich jest po prostu wytworzenie poliklonalnej antysurowicy skierowanej przeciw OPGL (np. antysurowicy wytworzonej w króliku), a następnie użycie tej antysurowicy jako odczynnika testowego (np. w teście współzawodnictwa ELISA) wobec wytworzonych zmodyfikowanych białek. Zmodyfikowane wersje (analogi), które reagują z antysurowicą w takim samym stopniu jak OPGL muszą być uważane jako mające taką samą ogólną strukturę trzeciorzędową jak OPGL, podczas gdy analogi wykazujące odgraniczoną (ale nadal znaczącą i specyficzną reaktywność z taką antysurowicą) są uważane za mające utrzymaną zasadniczą frakcję wyjściowych epitopów dla komórek B.

Alternatywnie, można dokonać selekcji przeciwciał monoklonalnych reagujących z odrębnymi epitopami w OPGL i zastosować je na płytce testowej. Zaletą tego podejścia jest umożliwienie:

1) mapowania epitopów w OPGL i

2) mapowania epitopów, które są zachowywane w wytwarzanych analogach.

Oczywiście, trzecim podejściem byłoby ustalenie 3-wymiarowej rzędowej struktury OPGL albo jego biologicznie czynnej skróconej postaci (patrz powyżej) i porównanie jej z ustaloną trójwymiarową strukturą wytworzonych analogów. Trójwymiarową strukturę można ustalić przy pomocy badań z zastosowaniem dyfrakcji promieni X i spektroskopii NMR. Dalsze dane dotyczące trzeciorzędowej struktury mogą być do pewnego stopnia uzyskane z badań dichroizmu kołowego, które mają tę zaletę, że wymagają jedynie polipeptydu w czystej postaci (podczas gdy dyfrakcja promieni X wymaga dostarczenia wykrystalizowanego polipeptydu, a NMR wymaga dostarczenia izotopowych wariantów polipeptydu) w celu uzyskania przydatnej informacji o trzeciorzędowej strukturze danej cząsteczki. Jednakże ostatecznie dyfrakcja promieni X i/lub NMR są niezbędne do uzyskania decydujących danych, ponieważ dichroizm kołowy może dostarczyć jedynie danych pośrednich odnośnie prawidłowej trójwymiarowej struktury poprzez informacje o drugorzędowej strukturze poszczególnych elementów.

Jednym z korzystnych wykonań wynalazku jest zastosowanie wielokrotnych prezentacji epitopów OPGL dla limfocytów B (tj. wzoru I, gdzie co najmniej jeden epitop dla komórek B jest obecny w dwóch pozycjach). Efekt ten można uzyskać różnymi sposobami, na przykład poprzez wytworzenie po prostu fuzji polipeptydowych zawierających strukturę (OPGL)m, gdzie m jest liczbą całkowitą > 2, a następnie wprowadzenie omówionych tu modyfikacji w co najmniej jednej z sekwencji OPGL. Korzystne jest, aby wprowadzone modyfikacje obejmowały co najmniej jedną duplikację epitopu dla limfocytu B i/lub wprowadzenie haptenu.

Jak wspomniano powyżej, wprowadzenie obcego epitopu dla komórek T można uzyskać poprzez wprowadzenie co najmniej jednej insercji, addycji, delecji albo podstawienia aminokwasowego. Oczywiście normalną sytuacją będzie wprowadzenie więcej niż jednej zmiany w sekwencji aminokwasowej (np. insercji albo podstawienie pełnego epitopu dla komórek T), ale ważnym celem do osiągnięcia jest to, aby analog OPGL, gdy ulega obróbce przez komórkę prezentującą anytygen (APC), doprowadzał do powstania takiego obcego immunodominującego epitopu dla komórek T, który jest prezentowany w kontekście cząsteczki MCH klasy II na powierzchni APC. A zatem, jeżeli sekwencja ami10

PL 196 790 B1 nokwasowa OPGL w odpowiednim położeniu zawiera pewną liczbę reszt aminokwasowych, które mogą znajdować się również w obcym epitopie Th, wówczas wprowadzenie obcego epitopu można osiągnąć poprzez dostarczenie pozostałych aminokwasów obcego epitopu przez insercję, addycję, delecję albo podstawienie. Innymi słowy, nie jest konieczne wprowadzanie kompletnego epitopu Th przez insercję albo podstawienie w celu osiągnięcia celu niniejszego wynalazku.

Korzystnie liczba insercji, delecji, podstawień albo addycji wynosi co najmniej 2, np. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 lub 25. Korzystnie ponadto liczba insercji, podstawień, addycji albo delecji nie przekracza 150, np. wynosi co najwyżej 100, co najwyżej 90, co najwyżej 80 i co najwyżej 70. Szczególnie korzystnie liczba podstawień, insercji, delecji albo addycji nie przekracza 60, a w szczególności liczba nie powinna przekraczać 50 albo nawet 40. Najkorzystniej liczba ta nie przekracza 30. Jeśli chodzi o addycje aminokwasów, należy zauważyć, że kiedy otrzymany w rezultacie konstrukt występuje w postaci fuzji polipeptydowej, są one często znacznie większe niż 150.

Korzystne zastosowanie według wynalazku obejmuje modyfikacje, w której obcy epitop dla limfocytów T jest immunodominujący u zwierzęcia.

Będzie zrozumiałe, że kwestia dominacji immunologicznej epitopu dla komórek T zależy od gatunku rozpatrywanego zwierzęcia. Stosowany tu termin „immunodominacja” odnosi się po prostu do epitopu, który w zaszczepionym osobniku/populacji prowadzi do powstania znaczącej odpowiedzi immunologicznej, ale jest znanym faktem, że epitop dla komórek T, który jest immunodominujący w jednym osobniku/populacji, nie musi być koniecznie immunodominujący w innym osobniku tego samego gatunku, jakkolwiek może być zdolny do wiązania cząsteczek MHC-II w tym drugim osobniku. A zatem, dla celów niniejszego wynalazku, immunodominującym epitopem komórek T jest epitop dla komórek T, który będzie skuteczny w dostarczaniu pomocy przez komórki T, gdy jest obecny w antygenie. Zazwyczaj, immunodominujące epitopy dla komórek T mają jako właściwą sobie cechę to, że będą prawie zawsze prezentowane w postaci związanej z cząsteczką MHC klasy II, niezależnie od polipeptydu, w którym się pojawiają.

Inny istotny punkt stanowi zagadnienie ograniczenia MHC dla epitopów dla komórek T. Na ogół, naturalnie występujące epitopy dla komórek T podlegają ograniczeniu ze względu na MHC, tj. pewne peptydy stanowiące epitop dla komórek T będą wiązać się skutecznie z podgrupą cząsteczek MHC klasy II. To z kolei ma taki efekt, że w większości przypadków zastosowanie jednego specyficznego epitopu dla komórek T będzie prowadziło do powstania składnika szczepionki, który jest skuteczny jedynie we frakcji populacji i w zależności od wielkości tej frakcji, może być niezbędne zawarcie w tej samej cząsteczce większej liczby epitopów dla komórek T, albo alternatywnie, przygotowanie szczepionki wieloskładnikowej, gdzie składnikami są warianty OPGL, które różnią się od siebie naturą wprowadzonego epitopu dla komórek T.

Jeżeli ograniczenie komórek T ze względu na MHC jest kompletnie nieznane (na przykład w sytuacji, gdy szczepione zwierzę ma słabo zdefiniowany skład MHC), frakcję populacji objętą specyficzną kompozycją szczepionki można określić stosując następujący wzór n

fpopulacja = { J/1 ^— Pi) (1) i=1 gdzie p oznacza częstość w populacji osobników odpowiadających na i-ty obcy epitop dla komórek T obecny w kompozycji szczepionki, a n jest całkowitą liczbą obcych epitopów dla komórek T w kompozycji szczepionki. A zatem w przypadku kompozycji szczepionki zawierającej 3 obce epitopy dla komórek T, o częstościach odpowiedzi w populacji 0,8, 0,7 i 0,6, odpowiednio, frakcja populacji będzie wynosiła

- 0,2 x 0,3 x 0,4 = 0,976 tj. 97,6 procent populacji będzie statystycznie wykazywało odpowiedź na szczepionkę, w której pośredniczy MHC-II.

powyższy wzór nie stosuje się do sytuacji, w których znany jest mniej lub bardziej precyzyjny wzór ograniczenia peptydów ze względu na MHC. Jeżeli, na przykład, jakiś peptyd wiąże się jedynie z cząsteczkami ludzkich MHC II kodowanymi przez allele HLA-DR: DR1, DR3, DR5 i DR7, wówczas zastosowanie tego peptydu łącznie z innym peptydem, który wiąże pozostałe cząsteczki MHC-II kodowane przez allele HLA-DR, będzie dawało 100% pokrycia w badanej populacji. Analogicznie, jeżeli

PL 196 790 B1 drugi peptyd wiąże jedynie DR3 i DR5, dodanie tego peptydu nie będzie zwiększało pokrycia wcale. Jeżeli obliczenie odpowiedzi w populacji opiera się jedynie na ograniczeniu epitopów dla komórek T w szczepionce ze względu na MHC, frakcję populacji objętą tą specyficzną kompozycją szczepionki można obliczyć przy użyciu następującego wzoru:

fpopulacja = 1~Π <¹“ ^Φ P (') j=1 gdzie Φ, jest sumą częstości w populacji haplotypów allelicznych kodujących cząsteczki MHC, które wiążą się z jednym albo większą liczbą epitopów dla komórek T w szczepionce i które należą do j-tego z 3 znanych loci HLA (DP, DR i DQ); w praktyce, najpierw określa się, która z cząsteczek MHC będzie rozpoznawała każdy z epitopów dla komórek T w szczepionce, a następnie zalicza się je do odpowiedniego typu (DP, DTR i DQ), po czym poszczególne częstości dla różnych wymienionych haplotypów allelicznych sumuje się dla każdego typu, uzyskując w ten sposób Φι, Φ2 i Φ3.

Może się zdarzyć, że wartość p, we wzorze II przewyższa odpowiadającą jej teoretyczną wartość n:

Π = 1-Π(1- Vj)2 (^|V) j=1 gdzie V jest sumą częstości w populacji haplotypów allelicznych kodujących cząsteczki MHC, które wiążą się i-tym epitopem dla komórek T w szczepionce i które należą do j-tego z 3 znanych loci HLA (DP, DR i DQ). Oznacza to, że w 1-π populacji częstość osobników odpowiadających wynosi fpozostatyc_i = (p, - π) / (1 - π). A zatem wzór II można sprowadzić do wzoru V:

n ^fpo^pulacja = ^1- | ^{|(1- Φ}Ρ + ^{(1- f |(1-} ^pozostałych _i)) ^(V) j=1 /=1 gdzie wartość 1 - f_Pozostałych_i jeżeli jest ujemna przyjmowana jest jako . Należy zauważyć, że wzór V wymaga, aby wszystkie epitopy zostały zmapowane pod względem haplotypów w stosunku do identycznego zestawu haplotypów.

A zatem przy wyborze epitopów dla komórek T, które mają być wprowadzone do analogów OPGL, ważne jest wykorzystanie całej dostępnej wiedzy o epitopach:

1) częstość w populacji osobników odpowiadających dla każdego epitopu,

2) dane o ograniczeniach ze względu na MHC oraz

3) częstość w populacji odpowiednich haplotypów.

A zatem w korzystnym wykonaniu zastosowania według wynalazku co najmniej jeden obcy epitop dla limfocytów T jest zdolny do wiązania się ze znaczną częścią cząsteczek MHC klasy II i korzystnie jest wybrany spośród naturalnego epitopu dla limfocytów T i sztucznej sekwencji peptydowej wiążącej się z MHC-II.

Bardziej korzystnie ten naturalny epitop dla limfocytów T jest wybrany spośród epitopów anatoksyny tężca, takich jak P2 lub P3, epitopu anatoksyny dyfterytu, epitopu hemaglutyniny wirusa grypy (HA) oraz epitopu CS P. falciparum.

Istnieje wiele występujących naturalnie epitopów „mieszanych” dla komórek T, które są aktywne u dużej części osobników danego gatunku zwierząt albo populacji zwierzęcej i są one korzystnie wprowadzane w szczepionce, ograniczając zatem potrzebę bardzo dużej liczby różnych analogów OPGL w tej samej szczepionce.

Na przestrzeni lat zidentyfikowano wiele innych mieszanych epitopów dla komórek T W szczególności zidentyfikowano peptydy zdolne do wiązania się z dużą frakcją cząsteczek HLA-DR kodowanych przez różne allele HLA-DR i wszystkie one są możliwymi epitopami dla komórek T, które można wprowadzić do analogów OPGL, których zastosowanie wchodzi w zakres niniejszego wynalazku. Patrz również epitopy omawianee w następujących odnośnikach, które są tu wszystkie włączone jako odniesienie WO 98/23635 (Frazer I. H. i wsp., należący do The University of Queensland); Southwood

PL 196 790 B1

S. i wsp., 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F. i wsp., 1988, Nature 336: 778-780; Chicz R. M. i wsp., 1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J. i wsp., 1993, Cell 74: 197-203; i Falk K. i wsp., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Ostatni odnośnik dotyczy również ligandów HLA-DQ i -DP. Wszystkie epitopy wymienione w tych 5 odnośnikach są odpowiednie jako kandydaci na naturalne epitopy do zastosowania w niniejszym wynalazku, podobnie jak epitopy, które mają wspólne z nimi motywy.

Alternatywnie, epitopem może być sztuczny epitop dla komórek T, który ma zdolność do wiązania się z dużą częścią cząsteczek MHC klasy II. W tym kontekście peptydy z epitopem DR o dużym zakresie („PADRE”) opisane w WO 95/07707 i w odpowiadającej mu pracy Alexander J. i wsp., 1994, Immunity 1: 751-761 (obydwa ujawnienia są tu włączone jako odniesienie) są interesującymi kandydatami na epitopy do zastosowania według niniejszego wynalazku. Należy zaznaczyć, że najbardziej skuteczne peptydy PADRE ujawnione w tych publikacjach zawierają aminokwasy D na końcach Ci N- w celu zwiększenia stabilności przy podawaniu. Jednakże w niniejszym wynalazku przede wszystkim dąży się do włączania odpowiednich epitopów jako części zmodyfikowanego OPGL, który powinien być następnie rozbity enzymatycznie wewnątrz kompartmentu lizosomalnego APC w celu umożliwienia następnie prezentacji w kontekście cząsteczki MHC-II, a zatem nie jest korzystne wstawianie aminokwasów D do epitopów stosowanych w niniejszym wynalazku.

Jednym ze szczególnie korzystnych peptydów PADRE jest taki, który ma sekwencję aminokwasową AKFYAAWTLKAAA albo immunologicznie skuteczną jej podsekwencję. Ten i inne epitopy mające taki sam brak ograniczenia MHC są korzystnymi epitopami komórek T, które powinny występować w analogach OPGL zastosowanych zgodnie z wynalazkiem. Takie supermieszane epitopy będą stanowiły najprostsze wykonanie wynalazku, gdzie tylko jeden zmodyfikowany OPGL jest prezentowany wobec systemu immunologicznego zaszczepionego zwierzęcia.

W korzystnym zastosowaniu według wynalazku modyfikacja OPGL może również obejmować wprowadzenie pierwszej reszty, a pierwszą resztą jest swoisty partner wiązania dla antygenu powierzchniowego swoistego dla limfocytów B albo antygenu powierzchniowego swoistego dla APC, taki jak hapten albo węglowodan, dla którego na limfocytach B albo APC znajduje się receptor (np. mannan albo mannoza).

Alternatywnie drugą resztą może być hapten. Również fragment przeciwciała, który swoiście rozpoznaje powierzchniową cząsteczkę na APC albo limfocytach, może być zastosowany jako pierwsza reszta (cząsteczką powierzchniową może być np. receptor FCy makrofagów i monocytów, taki jak FCyRI albo, alternatywnie, dowolny inny specyficzny marker powierzchniowy, taki jak CD40 lub CTLA-4). Należy zauważyć, że wszystkie te przykładowe cząsteczki docelowe można również zastosować jako część adiuwanta, patrz poniżej.

Jako alternatywa albo dodatek do kierowania zmodyfikowanego polipeptydu OPGL do pewnego typu komórek w celu uzyskania wzmocnionej odpowiedzi immunologicznej, możliwe jest zwiększenie poziomu odpowiedzi systemu immunologicznego przez włączenie powyżej wspomnianej drugiej reszty, która stymuluje układ immunologiczny. W korzystnym zastosowaniu druga reszta jest wybrana spośród cytokiny, hormonu oraz białka szoku cieplnego. Korzystnie cytokina jest wybrana spośród albo jest efektywną częścią interferonu γ (IFN-γ), Flt3L, interleukiny 1 (IL-1), interleukiny 2 (IL-2), interleukiny 4 (IL-4), interleukiny 6 (IL-6), interleukiny 12 (IL-12), interleukiny 13 (IL-13), interleukiny 15 (IL-15) oraz czynnika stymulującego kolonie granulocytow-makrofagów (GM-CSF), a białko szoku cieplnego jest wybrane spośród albo jest efektywną częścią HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 oraz kalretikuliny (CRT).

Takie cytokiny będą normalnie również funkcjonować jako adiuwanty w kompozycji szczepionki. Jeśli chodzi o zastosowanie takich cytokin jako substancji adiuwantowych, patrz dyskusja poniżej.

Według wynalazku, odpowiednimi białkami szoku cieplnego albo białkami opiekuńczymi stosowanymi jako druga reszta mogą być HSP70, HSP90, HSC70, GR94 (znane również jako gp96, patrz Wearsch PA i wsp. 1998, Biochemistry 37: 5709-19) oraz CRT (kalretikulina).

Alternatywnie, drugą resztą może być toksyna, taka jak listeriolicyna (LLO), lipid A i wrażliwa na wysoką temperaturę enterotoksyna. Ponadto, wiele pochodnych mykobakteryjnych, takich jak MDP (dipeptyd muramilowy, CFA (kompletny adiuwant Freunda) oraz diestry trehalozy TDM i TDE stanowią interesujące możliwości.

Ważnym wykonaniem wynalazku jest również możliwość wprowadzenia trzeciej reszty, która zwiększa prezentację zmodyfikowanej OPGL układowi immunologicznemu. W tej dziedzinie znanych jest kilka przykładów tej zasady. Przykładowo wiadomo, że kotwicę dla palmitylacji w białku OspA BorPL 196 790 B1 relia burgdorfrei można zastosować w celu dostarczenia peptydów, które same są adiuwantami (patrz np. WO 96/40718). Wydaje się, że lipidowane białka tworzą struktury przypominające micelle z rdzeniem złożonym z części stanowiącej kotwicę dla lipidacji polipeptydów, a pozostałe części cząsteczki wystają z nich, co prowadzi do wielokrotnych prezentacji determinant antygenowych. A zatem zastosowanie tych i pokrewnych podejść z zastosowaniem różnych kotwic dla dołączenia lipidu (np. grupy mirystylowej, grupy farnezylowej, grupy genarylogenarylowej, kotwicy GPI, grupy N-acetylodiglicerydowej) stanowi korzystne wykonanie wynalazku, szczególnie dlatego, że dostarczenie takiej kotwicy dla dołączenia lipidu jest dość proste i wymaga jedynie zastosowania np. naturalnie występujących sekwencji sygnałowych jako partnera fuzji dla zmodyfikowanego polipeptydu OPGL.

A zatem w dalszym korzystnym wykonaniu zastosowanie według wynalazku dotyczy analogu OPGL, w którym wprowadzona jest trzecia reszta, która ma charakter lipidowy i jest taka jak grupa palmitoilowa, grupa mirystylowa, zakotwiczenie GPI oraz grupa N-acylodiglicerolowa.

Inną możliwość stanowi zastosowanie fragmentu C3d dopełniacza C3 albo samego C3 (patrz Dempsey i wsp.1996, Science 271, 348-350 oraz Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).

Alternatywne wykonanie wynalazku, które również prowadzi w rezultacie do korzystnej prezentacji systemowi immunologicznemu wielu (co najmniej 2) kopii ważnych epitopowych rejonów OPGL jest kowalencyjne dołączenie OPGL, jego podsekwencji albo wariantów do pewnych cząsteczek. Na przykład, można zastosować polimery np. węglowodany, takie jak dekstran, patrz np. Lees A. i wsp., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A. i wsp., 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, ale przydatną alternatywę stanowią również mannoza i mannan. Białka będące integralną częścią błony, np. E. coli i innych bakterii, są również przydatnymi partnerami do sprzęgania. Tradycyjne cząsteczki nośnikowe, takie jak hemocyjanina ze skałoczepu (KHL), toksyna tężca, toksyna dyfterytu i albumina z surowicy wołowej (BSA) są również korzystne i przydatne jako partnerzy do sprzęgania.

Pewne obszary natywnego OPGL wydają się bardziej przydatne do dokonywania tam modyfikacji. Na podstawie pokrewieństwa strukturalnego OPGL z TNF-α i innymi przedstawicielami rodziny czynnika martwicy nowotworu, przewiduje się, że wprowadzenie epitopów komórek T lub innych modyfikacji w obszarach zdefiniowanych przez pozycje 170-192, 198-218, 221-246, 256-261 lub 285-316 (numeracja aminokwasów w Id. Sekw. Nr: 4, 6 i 12) będzie z największym prawdopodobieństwem dawała pożądane wyniki. Pozycje te dotyczą mysiego OPGL - odpowiadające im pozycje w cząsteczce ludzkiej to 171-193, 199-219, 222-247, 257-262 i 286-317 (numeracja aminokwasów w Id. Sekw. Nr: 2).

A zatem w dalszym zastosowaniu według wynalazku korzystne jest, gdy polipeptyd OPGL albo jego podsekwencja zostały zmodyfikowane w dowolnej pozycji z 170-192, dowolnej z pozycji 198-218, dowolnej z pozycji 221-246, dowolnej z pozycji 256-261 albo dowolnej z pozycji 285-316, przy czym numeracja aminokwasów odpowiada numeracji w dowolnej z sekwencji Id. Sekw. Nr: 4, 6 i 12 albo polipeptyd OPGL został zmodyfikowany w dowolnej z pozycji 171-193, dowolnej z pozycji 199-219, dowolnej z pozycji 222-247, dowolnej z pozycji 257-262, albo dowolnej z pozycji 286-317, przy czym numeracja aminokwasów odpowiada numeracji w sekwencji Id. Sekw. Nr: 2; z zachowaniem zasadniczej frakcji epitopów dla limfocytów B zwierzęcego OPGL.

Bardziej korzystnie, modyfikacja obejmuje podstawienie co najmniej jednej sekwencji aminokwasowej w pozycji określonej powyżej sekwencją aminokwasową o równej albo różnej długości, która zawiera obcy epitop Th i wówczas korzystnie sekwencja aminokwasową zawierająca obcy epitop Th zastępuje aminokwasy 256-261 i/lub 288-302 i/lub 221-241 znajdujące się w sekwencji Id. Sekw. Nr: 4 albo aminokwasy 257-262 i/lub 289-303 i/lub 222-243 w sekwencji w Id. Sekw. Nr: 2 albo w polipeptydzie, gdzie cysteina odpowiadająca Cys-221 została podstawiona przez Ser.

Przyczyny wyboru tych obszarów są następujące: a) zachowanie znanych i przewidywanych epitopów dla komórek B, b) zachowanie struktury trzeciorzędowej, itd. W każdym razie, jak omówiono powyżej, jest dość łatwo przeszukać zbiór zmodyfikowanych cząsteczek OPGL, do których wprowadzono epitopy dla komórek T w różnych miejscach.

Ponieważ najbardziej korzystne zastosowanie według wynalazku dotyczy wytworzenia kompozycji, która obniża poziom ludzkiego OPGL, konsekwentnie korzystne jest, aby omawiany powyżej polipeptyd OPGL był polipeptydem ludzkim.

Formulacja OPGL i zmodyfikowanych polipeptydów OPGL

Gdy dokonuje się prezentacji polipeptydu OPGL albo zmodyfikowanego polipeptydu OPGL układowi immunologicznemu zwierzęcia przez podawanie go zwierzęciu, formułowanie polipeptydu przeprowadza się zgodnie z ogólnie przyjętymi w tej dziedzinie zasadami.

PL 196 790 B1

Wytwarzanie szczepionek, które zawierają sekwencje peptydowe jako składnik aktywny jest generalnie dobrze znane w tej dziedzinie, czego przykładem są patenty USA 4 608 251; 4 601 903; 4 599 231; 4 599 230; 4 596 792 i 4 578 770, wszystkie włączone tu jako odniesienie. Typowo, takie szczepionki przygotowuje się w postaci do iniekcji, jako ciekłe roztwory, bądź jako zawiesiny; można również przygotować postaci stałe odpowiednie do rozpuszczenia albo zawieszenia w cieczy przed wstrzyknięciem. Preparat może być również zemulgowany. Immunogenny składnik aktywny często miesza się z zaróbkami, które są dopuszczalne farmaceutycznie i zgodne ze składnikiem czynnym. Odpowiednimi zaróbkami są, na przykład, woda, roztwór soli, dekstroza, glicerol, etanol i temu podobne i ich kombinacje. Ponadto, jeżeli to pożądane, szczepionka może zawierać niewielkie ilości substancji dodatkowych, takich jak czynniki zwilżające albo emulgatory, czynniki buforujące albo adiuwanty, które zwiększają skuteczność szczepionek; patrz szczegółowa dyskusja dotycząca adiuwantów poniżej.

Szczepionki konwencjonalnie podaje się pozajelitowo, poprzez wstrzyknięcie, na przykład podskórnie, śródskórnie, doskórnie albo domięśniowo. Dodatkowe preparaty, które są przydatne przy innych drogach podawania, obejmują czopki i w niektórych przypadkach kompozycje doustne, dopoliczkowe, podjęzykowe, dootrzewnowe, dopochwowe, doodbytnicze, nadtwardówkowe, dokręgosłupowe i doczaszkowe. W przypadku czopków, tradycyjne środki wiążące albo nośniki mogą obejmować na przykład glikole polietylenowe i triglicerydy takie czopki mogą być utworzone z mieszanin zawierających składnik aktywny w zakresie od 0,5% do 10%, korzystnie 1-2%. Kompozycje doustne zawierają zazwyczaj stosowane zaróbki, takie jak na przykład mannitol, galaktozę, skrobię, stearynian magnezu, sól sodową sacharyny sodową, celulozę, węglan magnezu o czystości farmaceutycznej i temu podobne. Kompozycje te przyjmują postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, kompozycji o przedłużonym uwalnianiu albo proszków i zawierają 10-95% składnika aktywnego, korzystnie 25-70%. Do kompozycji doustnych, toksyna cholery jest interesującym partnerem kompozycji (a również możliwe, że partnerem sprzęgania).

Polipeptydy można wprowadzić do szczepionki w postaci obojętnej albo jako sole. Farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują sole addycyjne z kwasami (utworzone z wolnymi grupami aminokwasowymi peptydu), które są wytwarzane z kwasami nieorganicznymi, takimi jak, na przykład, kwasy solny i fosforowy, albo takimi kwasami organicznymi jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy i temu podobne. Sole utworzone z wolnymi grupami karboksylowymi mogą również pochodzić od zasad nieorganicznych, takich jak na przykład sodowa, potasowa, amonowa, wapniowa albo wodorotlenki żelazowe oraz od takich zasady organicznych jak izopropyloamina, trimetyloamina, 2-etyloaminoetanol, histydyna, prokaina i temu podobne.

Szczepionki podaje się w sposób zgodny ze schematem dawkowania i w takiej ilości, żeby były skuteczne farmaceutycznie i immunogenne. Ilość, która ma być podawana, zależy od osobnika, który ma być leczony, w tym np. od zdolności układu immunologicznego danego osobnika do wywoływania odpowiedzi immunologicznej oraz stopnia wymaganej ochrony. Odpowiedni zakres dawek będzie rzędu kilkuset mikrogramów składnika aktywnego na szczepionkę z korzystnym zakresem około 0,1 pg do 2000 pg (chociaż brane są pod uwagę większe ilości w zakresie 1-10 mg), takim jak zakres od około 0,5 pg do 1000 pg, korzystnie zakres od 1 pg do 500 pg, a szczególnie zakres od około 10 pg do 100 pg. Odpowiednie reżimy dla początkowego podawania i iniekcji dawek wspomagających są również zmienne, ale zazwyczaj są typowane przez podanie wstępne, po którym następuje kolejne szczepienie lub w inny sposób.

Sposób podawania będzie bardzo zróżnicowany. Można zastosować dowolny spośród konwencjonalnych sposobów podawania szczepionki. Obejmuje to podawanie doustne na stałym, fizjologicznie dopuszczalnym podłożu albo w postaci fizjologicznie dopuszczalnej zawiesiny, pozajelitowo, w iniekcji itp. Dawka szczepionki będzie zależała od drogi podawania i będzie zmieniać się w zależności od wieku osoby, która ma być szczepiona i kompozycji antygenu.

Niektóre spośród polipeptydów w szczepionce są dostatecznie immunogenne w szczepionce, ale dla niektórych z nich odpowiedź immunologiczna będzie zwiększona, jeżeli szczepionka będzie zawierała dodatkowo substancję będącą adiuwantem.

Znane są różne sposoby uzyskiwania w szczepionkach efektu adiuwantowego. Ogólne zasady i sposoby są przedstawione szczegółowo w „The Theory and Practical Application of Adjuvants”, 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (wyd.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-47195170-6, a także w „Vacines: New Generation Immunological Adjuvants”, 1995, Gregoriadis G. i wsp. (wyd.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, obydwie pozycje włączone tu jako odniesienie.

PL 196 790 B1

Szczególnie korzystne jest zastosowanie adiuwanta, dla którego można wykazać, że ułatwia przełamanie autotolerancji wobec autoantygenów; faktycznie jest to istotne w przypadkach, gdzie niezmodyfikowany OPGL jest zastosowany jako składnik aktywny w autoszczepionce. Nieograniczające przykłady odpowiednich adiuwantów są wybrane z grupy składającej się z immunologicznych adiuwantów kierujących do celu, immunologicznych adiuwantów modulujących, takich jak toksyna, cytokina oraz pochodne z mykobakterii; kompozycje olejowe; polimer; adiuwant tworzący micelle; saponina; immunostymulujące podłoże złożone (podłoże ISCOM®); cząstka DDA; adiuwanty glinowe; adiuwanty DNA; γ-insulina oraz adiuwanty tworzące kapsułki. Generalnie należy zaznaczyć, że powyższe ujawnienia, które dotyczą związków i czynników przydatnych jako pierwsza, druga i trzecia reszta w analogach dotyczą również ich zastosowania w adiuwancie szczepionki wytworzonej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku.

Zastosowanie adiuwanta obejmuje zastosowanie czynników takich jak tlenek glinu, wodorotlenek glinu albo fosforan glinu zwykle stosowany jako roztwór 0,05% do 0,1% w buforowanym roztworze soli fizjologicznej, zmieszany z syntetycznymi polimerami cukrów (np. Carbopol®), stosowany jako roztwór 0,25%; agregację białka w szczepionce przez traktowanie wysokimi temperaturami w zakresie między 70°C i 101°C przez okres 30 sekund do 2 minut, odpowiednio, a także tworzenie agregatów przy zastosowaniu związków sprzęgających. Można również zastosować agregację przez zadziałanie traktowanymi pepsyną przeciwciałami (Fab) wobec albuminy, mieszanie z komórkami bakteryjnymi, takimi jak C. parvum albo endotoksynami lub składnikami lipopolisacharydu bakterii gram ujemnych, emulsje z fizjolologicznie akceptowalnym nośnikiem olejowym, takim jak monooleinianu mannitolu (Aracel A) albo emulsję z 20 procentowym roztworem perfluorowęgla (Flucosol-DA) stosowanego jako blokujący środek zastępczy. Korzystne jest również mieszanie z olejami, takimi jak skwalen i IFA.

Według wynalazku DDA (bromek dimetylodioktadecyloamoniowy) jest interesującym kandydatem na adiuwant, podobnie jak DNA i γ-insulina, ale również kompletny i niekompletny adiuwant Freunda, jak również saponiny kwilai (mydłodrzew), takie jak QuilA i QS21 są również interesujące, podobnie jak RIBI. Dalsze możliwości stanowią monofosforylolipid A (MPL), wspomniane powyżej C3 i C3d oraz dipeptyd muramylowy (MPD).

Wiadomo również, że kompozycje liposomowe mają właściwości adiuwanta, a zatem adiuwanty liposomowe są korzystne w kompozycji, której zastosowanie jest przedmiotem wynalazku.

Korzystny wybór stanowią również immunostymulujące adiuwanty o złożonym typie podłoża (podłoże ISCOM®), szczególnie odkąd wykazano, że ten typ adiuwantów ma zdolność podwyższania ^pozⁱomu e^ks^presjⁱ IMHC ldas^y N ^przez A^PC. ^Po^dło^że ^ISCOM® stta^da s^ię z (ewerTua^e ^fra^kcjonowanych) saponin (triterpenoidów) z Quillaja saponaria, cholesterolu oraz fosfolipidu. Po zmieszaniu z białkiem immunogennym otrzymuje się złożoną z cząsteczek kompozycję, która jest znana jako cząsteczka ISCOM, w której saponina stanowi 60-70% wag./wag., cholesterol i fosfolipidy 10-15% wag./wag., a białko 10-15% wag./wag. Szczegóły dotyczące kompozycji i zastosowania kompleksów immunostymulujących można znaleźć na przykład we wspomnianych powyżej podręcznikach, które dotyczą adiuwantów, ale również w Morein B. i wsp., 1995, Clin. Immunother. 3, 461-475, jak również w Barr I. G. i Mitchell G. F., 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (obydwie pozycje włączone tu jako odniesienie) dostarczają przydatnych instrukcji do przygotowania pełnych kompleksów immunostymulujących.

Inną wysoce interesującą (a zatem korzystną) możliwością uzyskania efektów adiuwantowych jest zastosowanie technik opisanych w Gosselin i wsp., 1992 (które są tu włączone jako odniesienie). Pokrótce, prezentacja odpowiedniego antygenu, takiego jak antygen stosowany zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, może być wzmocniony poprzez połączenie antygenu z przeciwciałami (albo fragmentami przeciwciał wiążącymi antygen) przeciw receptorom Foy na monocytach/makrofagach. Szczególnie dla koniugatów między antygenem i anty-Fcy wykazano wzmacnianie immunogenności dla celów szczepienia.

Inne możliwości obejmują zastosowanie wspomnianych powyżej substancji kierujących i modulujących odpowiedź immunologiczną (np. cytokin) jako kandydatów na pierwszą i drugą resztę zmodyfikowanej wersji OPGL. W związku z tym, możliwe jest zastosowanie syntetycznych induktorów cytokin, takich jak poli I:C.

Odpowiednie pochodne z mykobakterii są wybrane z grupy składającej się z dipeptydu muramylowego, kompletnego adiuwanta Freunda, RIBI oraz diestru trehalozy, takiego jak TDM i TDE.

PL 196 790 B1

Odpowiednie immunologiczne adiuwanty kierujące do celu są wybrane z grupy składającej się z ligandu CD40 i przeciwciał CD40 albo specyficznie wiążących się ich fragmentów (patrz dyskusja powyżej), mannozy, fragmentu Fab, oraz CTLA-4.

Odpowiednie adiuwanty polimerowe są wybrane z grupy składającej się z węglowodanu, takiego jak dekstran, PEG, skrobia, mannan i mannoza; polimeru jako takiego oraz lateksu, takiego jak kulki lateksowe.

Jeszcze innym interesującym sposobem modulowania odpowiedzi immunologicznej jest włączenie immunogenu OPGL (ewentualnie razem z adiuwantami i dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami) w „wirtualnym węźle limfatycznym” (VLN) (prawnie zastrzeżone urządzenie medyczne opracowane przez ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (urządzenie z cienkich przewodów) naśladuje strukturę i funkcję węzłów limfatycznych. Wstawienie VLN pod skórę wytwarza miejsce sterylnego zapalenia pod wypływem cytokin i chemokin. Komórki T i B, jak również APC, gwałtownie odpowiadają na sygnały zagrożenia, docierają do miejsca zapalenia i akumulują się wewnątrz porowatego podłoża VLN. Wykazano, że niezbędna dawka antygenu wymagana do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej wobec antygenu zmniejsza się, gdy stosuje się VLN i że ochrona immunologiczna uzyskiwana dzięki szczepieniu z zastosowaniem VLN przewyższa konwencjonalną immunizację z zastosowaniem Ribi jako adiuwanta. Technologia jest na przykład opisana krótko w Gelber C. i wsp., 1998, „Elicitatian of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Nade”, w: „From the Laboratory to the Glinie, Book of Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California”

Szczepionka powinna być podawana 1-6 razy na rok, na przykład 1, 2, 3, 4, 5 albo 6 razy do roku potrzebującym tego osobnikom. Wykazano poprzednio, że pamięć immunologiczna indukowana przez zastosowanie korzystnych autoszczepionek nie jest długotrwała, a zatem układ immunologiczny wymaga okresowego przypominania przy użyciu OPGL i zmodyfikowanych polipeptydów OPGL.

Na skutek istnienia zmienności genetycznej, odpowiedzi immunologiczne na ten sam polipeptyd u różnych osób mogą mieć różną siłę. A zatem szczepionka może zawierać kilka różnych polipeptydów w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej, patrz również dyskusja powyżej dotycząca wyboru wprowadzonych obcych epitopów dla komórek T. Szczepionka może zawierać dwa albo więcej polipeptydów zdefiniowanych powyżej.

Szczepionka może zatem zawierać 3-20 różnych zmodyfikowanych albo niezmodyfikowanych polipeptydów, np. 3-10 różnych polipeptydów.

Szczepienie kwasem nukleinowym

Jako alternatywa klasycznego podawania szczepionki opartej na peptydach, technologia szczepienia kwasem nukleinowym (znana również jako „immunizacja kwasem nukleinowym”, „immunizacja genetyczna” i „immunizacja genowa”) oferuje wiele atrakcyjnych właściwości.

Po pierwsze, w przeciwieństwie do tradycyjnego sposobu szczepienia, szczepienie kwasem nukleinowym nie wymaga materiałochłonnej produkcji na dużą skalę czynników immunogennych (np. w postaci fermentacji na skalę przemysłową mikroorganizmów wytwarzających zmodyfikowany OPGL). Ponadto, nie ma potrzeby opracowywania procedur oczyszczania i refałdowania dla immunogenu. I wreszcie, ponieważ szczepienie kwasem nukleinowym wykorzystuje aparat biochemiczny szczepionej osoby w celu wytworzenia produktu ekspresji wprowadzonego kwasu nukleinowego, można się spodziewać, że nastąpi optymalna obróbka potranslacyjna produktu ekspresji; jest to szczególnie ważne w przypadku autoszczepionki, ponieważ, jak wspomniano powyżej, znaczna frakcja wyjściowych epitopów OPGL dla komórek B powinna być zachowana w zmodyfikowanej cząsteczce i ponieważ epitopy dla komórek B w zasadzie mogą składać się z części dowolnej (bio)cząsteczki (np. węglowodanu, tłuszczu, białka itd.). A zatem, wzór natywnej glikozylacji i lipidacji immunogenu może mieć duże znaczenie dla ogólnej immunogenności, a jest to najlepiej zapewnione przez wytwarzanie immunogenu przez gospodarza.

A zatem, korzystna jest skuteczna prezentacja zmodyfikowanego OPGL systemowi immunologicznemu przez wprowadzenie kwasu(-ów) nukleinowego(-wych) kodujących zmodyfikowany OPGL do komórek zwierzęcych otrzymując w ten sposób ekspresję in vivo przez komórki z wprowadzonym(-i) kwasem(-ami) nukleinowym(-ymi).

W tym wykonaniu wprowadzonym kwasem nukleinowym jest korzystnie DNA, który może być w postaci nagiego DNA, DNA mieszanego z lipidami z ładunkiem albo pozbawionymi ładunku, DNA zawartego w liposomach, DNA włączonego do wektora wirusowego, DNA zmieszanego z białkiem

PL 196 790 B1 albo polipeptydem ułatwiającym transfekcję, DNA sformułowanego z białkiem lub polipeptydem docelowym, DNA zmieszanego z wapniowymi czynnikami precypitującymi, DNA połączonego z obojętną cząsteczką nośnikową, DNA zamkniętego w chitynowej albo chitozanowej kapsułce oraz DNA zmieszanego z adiuwantem. W tym kontekście należy zaznaczyć, że praktycznie wszystkie rozważania dotyczące zastosowania adiuwantów w tradycyjnej kompozycji szczepionki stosują się do kompozycji szczepionek DNA. A zatem, wszystkie ujawnienia, które odnoszą się do zastosowania adiuwantów w kontekście szczepionek opartych na peptydach dotyczą również ich zastosowania w technologii szczepionek opartych na kwasie nukleinowym.

Drogi podawania i schematy podawania szczepionek opartych na polipeptydach, które zostały szczegółowo przedstawione powyżej, są odpowiednie również dla szczepionek opartych na kwasie nukleinowym wytworzonych zgodnie z zastosowaniem według wynalazku. Należy dodać, że szczepionki z kwasem nukleinowym można dogodnie podawać dożylnie i dootrzewnowo. Ponadto, dobrze znane jest w tej dziedzinie, że szczepionki z kwasem nukleinowym można podawać przy zastosowaniu tak zwanej strzelby genowej. Wreszcie, są doniesienia, że również zastosowanie VLN do podawania kwasów nukleinowych daje dobre wyniki, a zatem ten konkretny sposób podawania jest szczególnie korzystny.

Ponadto, kwas(-y) nukleinowy(-e) stosowany(e) jako czynnik do immunizacji może zawierać regiony kodujące 1-szą, 2-gą i/lub 3-cią resztę, np. w postaci substancji immunomodulujących opisanych powyżej, takich jak cytokiny opisane jako przydatne adiuwanty. Korzystnie region kodujący dla analogu i region kodujący dla immunomodulatora w różnych ramkach odczytu i co najmniej pod kontrolą różnych promotorów. Unika się w ten sposób tego, że analog albo epitop jest wytwarzany jako partner fuzji dla immunomodulatora. Alternatywnie, można zastosować dwa odrębne fragmenty nukleotydowe, ale jest to mniej korzystne, ponieważ gdy obydwa regiony kodujące zawarte są w tej samej cząsteczce, zachodzi koekspresja.

Wynalazek dotyczy również zastosowania kompozycji zawierającej:

- fragment kwasu nukleinowego określony powyżej albo wektor określony powyżej oraz

- farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/lub podłoże i/lub adiuwant do wytwarzania leku do wywoływania produkcji przeciwciał do obniżania OPGL u zwierzęcia, do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia osteoporozy lub innych stanów charakteryzujących się nadmierną resorpcją kości.

W normalnych warunkach, kwas nukleinowy kodujący wariant OPGL jest wprowadzany w postaci wektora, gdzie ekspresja jest pod kontrolą promotora wirusowego. Dla bardziej szczegółowego omówienia wektorów stosowanych zgodnie z zastosowaniem według wynalazku patrz dyskusja poniżej. Dostępne są również szczegółowe ujawnienia dotyczące kompozycji i zastosowania szczepionek opartych na kwasach nukleinowych. Patrz Donnelly J. J. et al, 1997, Annu. Rev. Inununol. 15: 617-648 i Donnelly J. J. i wsp., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Obydwie pozycje są tu włączone jako odniesienie.

Żywe szczepionki

Trzecią alternatywą uzyskiwania prezentacji zmodyfikowanego OPGL systemowi immunologicznemu jest zastosowanie technologii żywej szczepionki. W żywej szczepionce prezentację układowi immunologicznemu uzyskuje się przez podawanie zwierzęciu niepatogennego organizmu, który stransformowano fragmentem kwasu nukleinowego kodującym zmodyfikowany OPGL albo wektorem zawierającym taki fragment kwasu nukleinowego. Niepatogennym mikroorganizmem może być dowolny atenuowany szczep bakteryjny (atenuacja przez pasażowanie albo przez usunięcie patogennych produktów ekspresji przy zastosowaniu technologii rekombinowanego DNA), np. Mycobacterium bovis BCG., niepatogenny Streptacoccus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, etc. Prace przeglądowe dotyczące przygotowywania znanych w tej dziedzinie żywych szczepionek można znaleźć na przykład w Saliou P., 1995, Rev. Prat. 45: 20 1492-1496 oraz Walker P. D., 1992, Vaccine 10: 977-990, obydwie pozycje są tu włączone jako odniesienie. Aby znaleźć szczegółowe dane na temat fragmentów kwasów nukleinowych i wektorów zastosowanych w takich żywych szczepionkach, patrz dyskusja poniżej.

Jako alternatywa dla bakteryjnych żywych szczepionek, omówione poniżej fragmenty kwasów nukleinowych można wstawić do niewirulentnego wirusowego wektora stosowanego w szczepionkach, takiego jak szczep wirusa krowianki i inny przydatny wirus ospy.

Normalnie, niepatogenny mikroorganizm albo wirus jest podawany zwierzęciu tylko raz, ale w niektórych przypadkach może być konieczne podawanie mikroorganizmu więcej niż raz w trakcie

PL 196 790 B1 życia w celu utrzymania ochronnej odporności. Rozważa się również to, że schematy immunizacji przedstawione szczegółowo powyżej będą przydatne przy stosowaniu żywych albo wirusowych szczepionek.

Alternatywnie, szczepionkę żywą albo wirusową łączy się z uprzednim albo następującym później szczepieniem polipeptydem i/lub kwasem nukleinowym. Przykładowo, możliwe jest przeprowadzenie najpierw immunizacji szczepionką żywą albo wirusową, a następnie immunizacji przypominających przy zastosowaniu podejścia z polipeptydem albo kwasem nukleinowym.

Mikroorganizm albo wirus możne być transformowany kwasem(-ami) nukleinowym(-i) zawierającym regiony kodujące 1-szą, 2-gą i/lub 3-cią resztę, np. w postaci opisanych powyżej substancji immunomodulujących, takich jak cytokiny wymienione jako przydatne adiuwanty.

Korzystna wersja wykonania obejmuje obecność regionu kodującego dla analogu i regionu kodującego dla immunomodulatora w różnych ramkach odczytu i co najmniej pod kontrolą różnych promotorów. Unika się w ten sposób tego, że analog albo epitop jest wytwarzany jako partner fuzji dla immunomodulatora.

Alternatywnie, jako czynniki transformujące można zastosować dwa odrębne fragmenty nukleotydowe. Oczywiście, posiadanie 1-szej i/lub 2-giej i/lub 3-ciej reszty w tej samej ramce odczytu może dostarczyć jako produktu ekspresji analog zastosowany według wynalazku i takie wykonanie jest szczególnie korzystne.

Jak widać z powyższego, zastosowanie według wynalazku umożliwia leczenie chorób charakteryzujących się nadmierną utratą masy kostnej. W tym kontekście, osteoporoza jest kluczowym celem zastosowania według wynalazku, ale również utrata kości towarzysząca skomplikowanym złamaniom kości jest realnym celem dla leczenia/łagodzenie objawów. A zatem kompozycja wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku służy do leczenia i/lub zapobiegania i/lub łagodzenia osteoporozy lub innych stanów patologicznych z udziałem nadmiernej resorpcji kości i działa tak, że obniża aktywność OPGL do takiego poziomu, że szybkość resorpcji kości jest znacząco obniżana.

W niniejszym kontekście, takie znaczące zmniejszenie w resorpcji kości wynosi co najmniej 3% w porównaniu z szybkością patologiczną, ale może być również takie, jak co najmniej 5%, co najmniej 7%, co najmniej 9%, co najmniej 11%, co najmniej 13%, co najmniej 15% i co najmniej 17%, a spodziewane są nawet wyższe wartości procentowe, takie jak co najmniej 20%, a nawet co najmniej 30%. Szczególnie korzystnie obniżenie resorpcji kości prowadzi do odwrócenia równowagi pomiędzy tworzeniem kości i resorpcją kości, tj. szybkość tworzenia kości przewyższa szybkość resorpcji kości. Oczywiście, ta nierównowaga nie powinna być utrzymywana (ponieważ prowadziłoby to do osteopetrozy), ale poprzez staranne kontrolowanie liczby immunizacji i ich skuteczności immunologicznej dla konkretnego wymagającego tego osobnika, możliwe jest uzyskanie trwałej równowagi, która prowadzi do ostatecznego zachowania masy kości.

Alternatywnie, jeżeli u danego osobnika kompozycja wytwarzana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku nie może zakończyć utraty kości, może być jednak wykorzystana do otrzymania znaczącego obniżenia utraty masy kostnej, przedłużając w ten sposób czas, w którym u danego osobnika występuje dostateczna masa kości.

Sposoby mierzenia szybkości resorpcji kości i tworzenia kości są znane w tej dziedzinie. Przy pomocy testów biochemicznych można określić szybkość resorpcji kości poprzez pomiar stężenia we krwi pewnych fragmentów kolagenu typu I (patrz WO 93/15107 i WO 94/14844). Alternatywnie, szybkość utraty masy kości można mierzyć stosując sposoby fizyczne; reprezentatywne ujawnienia znanych w tej dziedzinie metod do pomiarów masy kostnej poprzez nieinwazyjne metody fizyczne można znaleźć w WO 88/06862, WO 94/12855, WO 95/14431 i WO 97/00643.

Peptydy, polipeptydy i kompozycje stosowane według wynalazku

Jak widać z powyższego, niniejszy wynalazek jest oparty na koncepcji immunizowania osób przeciw antygenowi OPGL w celu pośredniego uzyskania zmniejszonej aktywności osteoklastów. Korzystną drogą uzyskania takiej immunizacji jest zastosowanie zmodyfikowanych wersji OPGL, dostarczając w ten sposób cząsteczek, które nie były uprzednio w tej dziedzinie ujawnione.

Należy zaznaczyć, że korzystne cząsteczki zmodyfikowanego OPGL obejmują modyfikacje, które prowadzą do powstania polipeptydu mającego co najmniej 70% identyczności z OPGL albo z jego podsekwencją o długości co najmniej 10 aminokwasów.

Korzystnie identyczność sekwencji jest wyższa, np. wynosi co najmniej 75%, a nawet co najmniej 80, 85, 90 albo 95%. Identyczność sekwencji dla białek i kwasów nukleinowych można obliczyć jako (N_ref -- N_dif) -100/N_ref, gdzie N_d,f jest liczbą całkowitą nie identycznych reszt w dwóch dopasowaPL 196 790 B1 nych sekwencjach, a N_ref jest całkowitą liczbą reszt w jednej z sekwencji. A zatem, sekwencja DNA

AGTCAGTC będzie miała identyczność sekwencji 75% z sekwencją AATCAATC (Ndif =2 i Nref = 8).

W zakres wynalazku wchodzi również sposób wytwarzania kompozycji immunogennej obejmującej przynajmniej jeden zmodyfikowany polipeptyd OPGL, który ma zdolność do indukowania przeciwciał przeciw niemodyfikowanemu OPGL w gatunku zwierzęcia, gdzie niemodyfikowany polipeptyd OPGL jest białkiem własnym, obejmującym:

- wytworzenie na drodze syntezy peptydów albo technik inżynierii genetycznej zestawu odrębnych zmodyfikowanych polipeptydów OPGL, gdzie aminokwasy zostały dodane, wstawione, usunięte lub zastąpione w obrębie sekwencji aminokwasowej polipeptydu OPGL z gatunku zwierzęcia, prowadząc w ten sposób do powstania zestawu sekwencji aminokwasowych zawierających epitopy dla limfocytów T, które są obce dla gatunku zwierzęcia,

- testowanie przedstawicieli zestawu pod kątem ich zdolności do indukowania wytwarzania przeciwciał przez gatunek zwierzęcia przeciw niemodyfikowanym OPGL oraz

- domieszanie przedstawiciela(-i) zestawu, który znacząco indukuje w gatunku zwierzęcym wytwarzanie przeciwciał, które oddziaływują z OPGL z dopuszczalnym farmaceutycznie i immunologicznie nośnikiem i/lub podłożem, ewentualnie w kombinacji z przynajmniej jednym adiuwantem dopuszczalnym farmaceutycznie i immunologicznie.

Korzystnie w sposobie według wynalazku przygotowanie przedstawicieli zestawu obejmuje wytworzenie odrębnych sekwencji kwasów nukleinowych, z których każda jest sekwencją kwasu nukleinowego określonego powyżej, insercję sekwencji kwasu nukleinowego do odpowiednich wektorów ekspresyjnych, transformację wektorami odpowiednich komórek gospodarza i ekspresję sekwencji kwasów nukleinowych, i ewentualnie izolację produktów ekspresji.

Korzystnie wytworzenie sekwencji kwasów nukleinowych i/lub wektorów uzyskuje się przy pomocy technik amplifikacji molekularnej, takich jak PGR albo przy pomocy syntezy kwasów nukleinowych.

Polipeptydy wytwarza się zgodnie z metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Dłuższe polipeptydy zwykle wytwarza się przy zastosowaniu technologii rekombinowania genów obejmującej wprowadzenie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej analog OPGL do odpowiedniego wektora, transformowanie odpowiednich komórek gospodarza wektorem, ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego, odzyskanie produktu ekspresji z komórek gospodarza albo z supernatantów z ich hodowli, a następnie oczyszczenie i ewentualnie dalsze modyfikacje, np. ponowne fałdowanie i uzyskiwanie pochodnych.

Krótsze peptydy korzystnie wytwarza się dobrze znanymi technikami syntezy peptydów w fazie stałej lub fazie ciekłej. Jednakże dzięki ostatnio poczynionym postępom w tej technologii stało się możliwe wytwarzanie tymi sposobami polipeptydów i białek pełnej długości.

Fragmenty kwasów nukleinowych i wektory stosowane według wynalazku

Zmodyfikowane polipeptydy OPGL można wytworzyć przy zastosowaniu technologii rekombinowania genów, ale również przez syntezę chemiczną albo półsyntezę; dwie ostatnie opcje są szczególnie dogodne, gdy modyfikacje polegają na połączeniu białka z nośnikami, (takimi jak KLH, toksyna dyfterytu, toksyna tężca i BSA) oraz cząsteczkami niebiałkowymi, takimi jak polimery węglowodanowe i oczywiście również wtedy, gdy modyfikacje obejmują dodanie łańcuchów bocznych albo grup bocznych do łańcucha peptydowego pochodzącego z polipeptydu OPGL.

Dla potrzeb technologii rekombinowania genów i oczywiście również dla potrzeb immunizacji kwasem nukleinowym, fragmenty kwasu nukleinowego kodujące zmodyfikowany OPGL są ważnymi produktami chemicznymi. A zatem, ważna część wynalazku dotyczy zastosowania fragmentu kwasu nukleinowego, który koduje analog OPGL, tj. polipeptyd pochodzący z OPGL, który bądź zawiera naturalną sekwencję OPGL, do której został dodany albo wstawiony partner fuzji, albo, korzystnie, polipeptyd pochodzący z OPGL, gdzie został wstawiony obcy epitop dla komórek T przez insercję i/lub addycję, korzystnie przez podstawienie i/lub delecję. Fragmenty kwasu nukleinowego stosowane według wynalazku są fragmentami bądź DNA bądź RNA.

Fragmenty kwasu nukleinowego zastosowane zgodnie z wynalazkiem zwykle będą wstawiane do odpowiednich wektorów w celu wytworzenia wektorów do klonowania lub ekspresji przenoszących fragmenty kwasu nukleinowego; zastosowanie takich nowych wektorów również stanowi część wynalazku. Szczegóły dotyczące wytwarzania tych wektorów będą omówione w kontekście transformowanych komórek i mikroorganizmów poniżej. Wektory mogą być, w zależności od potrzeb i rodzaju zastosowania, w postaci plazmidów, fagów, kosmidów, minichromosomów albo wirusów, ale ważnym wektorem jest również nagi DNA, który jest wyrażany jedynie przejściowo w niektórych komórkach.

PL 196 790 B1

Korzystne wektory do klonowania i ekspresji stosowane według wynalazku są zdolne do autonomicznej replikacji, umożliwiając w ten sposób uzyskanie dużej liczby kopii dla potrzeb wysokich poziomów ekspresji albo wysokich poziomów replikacji do dalszego klonowania.

W ogólności wektor stosowany według wynalazku zawiera następujące elementy w kierunku od 5' —>3' i w funkcjonalnym połączeniu: promotor do kierowania ekspresją fragmentu kwasu nukleinowego, ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą peptyd liderowy umożliwiający sekrecję (do fazy zewnątrzkomórkowej albo, tam gdzie to możliwe, do periplazmy) albo włączenie fragmentu polipeptydowego do błony, fragmentu kwasu nukleinowego i ewentualnie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej terminator. Gdy pracuje się z wektorami ekspresyjnymi w szczepach producentach albo liniach komórkowych, dla celów stabilności genetycznej transformowanych komórek korzystne jest, aby wektor po wprowadzeniu do komórki gospodarza został włączony do genomu komórki gospodarza. W przeciwieństwie do tego, gdy pracuje się z wektorami, które mają być zastosowane do uzyskania ekspresji in vivo w zwierzęciu (tj. gdy stosuje się wektor w szczepionce DNA) ze względów bezpieczeństwa korzystne jest, jeżeli wektor jest niezdolny do włączania się do genomu komórki gospodarza; typowo stosuje się nagi DNA albo nie włączające się do genomu wektory wirusowe, których wybór jest dobrze znany specjaliście w tej dziedzinie.

Wektory, stosowane zgodnie z wynalazkiem stosuje się też do transformowania komórek gospodarza w celu wytworzenia zmodyfikowanego polipeptydu OPGL. Takie transformowane komórki, mogą być hodowlami komórkowymi albo liniami komórkowymi używanymi do namnażania fragmentów kwasów nukleinowych i wektorów do zastosowania według wynalazku albo stosowanymi do wytwarzania przy zastosowaniu technik rekombinowania DNA zmodyfikowanych polipeptydów OPGL. Alternatywnie, transformowanymi komórkami mogą być odpowiednie żywe szczepy szczepionkowe, do których został wstawiony fragment kwasu nukleinowego (jedna albo wiele kopii) tak, aby uzyskać sekrecję albo włączenie zmodyfikowanego OPGL do błony bakteryjnej albo ściany komórkowej.

Korzystnymi transformowanymi komórkami stosowanymi według wynalazku są mikroorganizmy, takie jak bakterie (takie jak gatunki Escherichia [np. E. coli], Bacillus [np. Bacillus subtilis], Salmonella, lub Mycobacterium (szczególnie nie patogenne, np. M. bovis BCG), drożdże (takie jak Saccharomyces cerevisiae) i pierwotniaki. Alternatywnie, transformowane komórki pochodzą z organizmu wielokomórkowego, takiego jak grzyby, komórki owadzie, komórki roślinne albo komórki ssacze. Najkorzystniejsze są komórki pochodzące od człowieka, patrz dyskusja na temat linii komórkowych i wektorów poniżej. Ostatnie wyniki pokazały, że można wiązać nadzieję z zastosowaniem dostępnych w handlu linii komórkowych Drosophila melanogaster (linia komórkowa Schneider 2 (S2) i system wektorowy dostępny z Invitrogen) dla wytwarzania metodami rekombinowania DNA polipeptydów w laboratorium Zgłaszających, a zatem ten system ekspresji jest szczególnie korzystny.

Dla potrzeb klonowania i/lub optymalizacji ekspresji, korzystnie transformowane komórki są zdolne do replikowania fragmentu kwasu nukleinowego stosowanego według wynalazku. Komórki wyrażające fragment kwasu nukleinowego są korzystnymi przydatnymi wykonaniami wynalazku; mogą być one stosowane do wytwarzania na małą skalę i na dużą skalę zmodyfikowanego OPGL albo, w przypadku niepatogennych bakterii, jako składniki szczepionki w żywej szczepionce.

Gdy wytwarza się zmodyfikowany OPGL przy zastosowaniu transformowanych komórek, dogodnie, aczkolwiek niekoniecznie produkt ekspresji jest bądź eksportowany do pożywki hodowlanej, bądź przenoszony na powierzchnię transformowanych komórek.

Gdy zidentyfikowana zostanie efektywna komórka producenta, korzystne jest wyprowadzenie na jej podstawie stabilnej linii komórkowej, która przenosi wektor stosowany według wynalazku i która wyraża fragmenty kwasu nukleinowego kodujące zmodyfikowany OPGL. Korzystnie ta stabilna linia wydziela albo przenosi analog OPGL stosowany według wynalazku, ułatwiając w ten sposób jego oczyszczanie.

Generalnie, plazmidy wektorowe zawierające replikon i sekwencje kontrolne, które pochodzą z gatunków zgodnych z komórką gospodarza, są stosowane w połączeniu z gospodarzem. Wektor zazwyczaj przenosi miejsce replikacji, jak również sekwencje markerowe, które są zdolne do dostarczania sekwencji nadającej fenotyp transformowanym komórkom. Przykładowo, E. coli typowo transformuje się stosując pBR322, plazmid pochodzących z gatunków E. coli (patrz, np. Bolivar i wsp., 1977). Plazmid pBR322 zawiera geny oporności na ampicylinę i tetracyklinę, a zatem dostarcza łatwego sposobu identyfikowania stransformowanych komórek. Plazmid pBR lub inne plazmidy bakteryjne albo fagi muszą również zawierać, albo być zmodyfikowane tak, aby zawierać promotory, które mogą być użyte przez organizm prokariotyczny do ekspresji.

PL 196 790 B1

Te promotory, które są najczęściej stosowane w konstruktach rekombinowanego DNA, obejmują systemy promotorowe β-laktamazy (penicylinazy) i laktozy (Chang i wsp., 1978; Itakura i wsp., 1977; Goeddel wsp., 1979) oraz system promotora tryptofanu (trp) (Goeddel i wsp., 1979; EP-A-0 036 776). Jakkolwiek są one stosowane najczęściej, odkryto i zastosowano również inne promotory bakteryjne, a szczegóły dotyczące ich sekwencji nukleotydowej zostały opublikowane, umożliwiając specjalistom w tej dziedzinie ich funkcjonalne połączenie przez ligację z wektorami plazmidowymi (Siebwenlist i wsp., 1980). Pewne geny z organizmów prokariotycznych można wyrażać wydajnie w E. coli z ich własnych sekwencji promotorowych, zapobiegając potrzebie dodatkowego albo innego sztucznego promotora.

Poza organizmami prokariotycznymi, można również zastosować mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak hodowle drożdży i w takim przypadku promotor powinien mieć zdolność do kierowania ekspresją. Sacharomyces cerevisiae, czyli zwyczajne drożdże piekarnicze są najczęściej stosowanym organizmem eukariotycznym, jakkolwiek powszechnie dostępnych jest wiele innych szczepów. Do ekspresji w Saccharomyces, powszechnie stosowany jest na przykład plazmid YRp7 (Stinchcomb i wsp., 1979; Kingsman i wsp., 1979; Tschemper i wsp., 1980). Plazmid ten już zawiera gen trpl, który dostarcza markera selekcyjnego dla zmutowanego szczepu drożdży pozbawionego zdolności do wzrostu bez tryptofanu, na przykład ATCC nr 44076 albo PEP4-1 (Jones, 1977). Obecność uszkodzenia trpl jako cecha charakterystyczna genomu drożdżowej komórki gospodarza dostarcza skutecznych warunków dla wykrywania transformacji przez wzrost w nieobecności tryptofanu.

Odpowiednie sekwencje promotorowe w wektorach drożdżowych obejmują promotory kinazy 3-fosfoglicerynianowej (Hitzman i wsp., 1980) albo inne enzymy glikolityczne (Hess i wsp., 1968; Holland 1978), takie jak enolaza, dehydrogenaza gliceroaledydo-3-fosforanowa, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozo-6-fosforanowa, mutaza 3-fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozowa i glukokinaza. Przy konstruowaniu odpowiednich wektorów plazmidowych, sekwencje terminacyjne związane z tymi genami włącza się również do wektorów ekspresyjnych po stronie 3' sekwencji, które mają być wyrażane, w celu dostarczenia poliadenylacji mRNA i terminacji.

Inne promotory, które mają dodatkowe zalety transkrypcji kontrolowanej przez warunki wzrostu, obejmują region promotorowy dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów rozkładających związanych z metabolizmem azotu, wcześniej wspomnianej dehydrogenazy gliceroaldehydo-3-fosforanowej, enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy. Odpowiedni jest dowolny wektor plazmidowy zawierający nadający się do drożdży promotor, początek replikacji i sekwencje terminacyjne.

Poza mikroorganizmami, jako gospodarzy można zastosować hodowle komórek pochodzące z organizmów wielokomórkowych. W zasadzie do pracy nadaje się dowolna taka hodowla komórkowa, albo to hodowla komórek kręgowca, albo bezkręgowca. Jednakże większym zainteresowaniem cieszą się komórki kręgowców, namnażanie komórek kręgowca w hodowli (hodowla tkankowa) stało się w ostatnich latach rutynowa procedurą (Tissue Culture, 1973). Przykładami takich przydatnych linii komórek godspodarza są komórki VERO i HeLa, linie komórkowe jajnika chomika chińskiego (CHO) oraz W138, BHK, COS-7 293, komórki Spodoptera frugiperda (SF) (handlowo dostępne w postaci pełnego systemu ekspresyjnego) m. in. od Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, USA i od Invitragen) oraz linie komórkowe MDCK. W niniejszym wynalazku szczególnie korzystną linią jest S2 dostępna z Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Holandia.

Wektory ekspresyjne dla takich komórek zwykle obejmują (jeżeli to konieczne) początek replikacji, promotor zlokalizowany na początku genu, który ma ulegać ekspresji, łącznie z miejscami niezbędnymi dla wiązania się rybosomu, miejscami składania RNA, miejscem poliadenylacji i sekwencjami terminacj i transkrypcji.

Do zastosowania w komórkach ssaczych, funkcje kontrolne w wektorach ekspresyjnych są często dostarczane przez materiał wirusowy. Na przykład, często stosowane promotory pochodzą z polioma, adenowirusa 2, a najczęściej małpiego wirusa 40 (SV40). Wczesne i późne promotory wirusa SV40 są szczególnie przydatne, ponieważ obydwa otrzymuje się łatwo z wirusów w postaci fragmentów, które zawierają również początek replikacji z wirusa SV40 (Fiers i wsp., 1978). Można również zastosować mniejsze lub większe fragmenty SV40, zakładając, że obejmuje to około 250 bp sekwencji rozciągającej się od miejsca Hindlll w stronę miejsca BglI znajdującego się w wirusowym początku replikacji. Ponadto, możliwe jest również, a często wskazane, zastosowanie promotora albo sekwencji

PL 196 790 B1 kontrolnych normalnie powiązanych z sekwencją żądanego genu, przy założeniu, że takie sekwencje kontrolne są zgodne z systemem komórek gospodarza.

Początek replikacji można dostarczyć albo przez konstrukcje wektora tak, aby zawierał zewnętrzne początki replikacji, takie jakie można otrzymać z SV40 i innych wirusów (np. polyoma, adenowirusów, VSV, BPV) albo mogą być dostarczone przez mechanizm replikacji chromosomowej komórki gospodarza. Jeżeli wektor jest wstawiony do chromosomu komórki gospodarza, to jest często wystarczający.

Identyfikacja przydatnych analogów OPGL

Dla specjalisty w tej dziedzinie jest jasne, że nie wszystkie możliwe warianty albo modyfikacje natywnego OPGL będą miały zdolność wzbudzania przeciwciał w zwierzętach, które wykazują reakcję krzyżową z postacią natywną.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób identyfikacji zmodyfikowanego polipeptydu OPGL, który ma zdolność do indukowania przeciwciał przeciw niemodyfikowanemu OPGL w gatunku zwierzęcia, gdzie niemodyfikowany polipeptyd OPGL jest białkiem własnym, obejmujący:

- wytworzenie na drodze syntezy peptydów albo technik inżynierii genetycznej zestawu odrębnych zmodyfikowanych polipeptydów OPGL, gdzie aminokwasy zostały dodane, wstawione, usunięte lub zastąpione w obrębie sekwencji aminokwasowej polipeptydu OPGL z gatunku zwierzęcia, prowadząc w ten sposób do powstania zestawu sekwencji aminokwasowych zawierających epitopy dla limfocytów T, które są obce dla gatunku zwierzęcia, lub przygotowanie zestawu fragmentów kwasów nukleinowych kodujących zestaw odrębnych zmodyfikowanych polipeptydów OPGL,

- testowanie przedstawicieli zestawu zmodyfikowanych polipeptydów OPGL lub fragmentów kwasów nukleinowych pod kątem ich zdolności do indukowania wytwarzania przeciwciał przez gatunek zwierzęcia przeciw niemodyfikowanym OPGL oraz

- identyfikowanie i ewentualnie izolowanie przedstawiciela(-i) z zestawu zmodyfikowanych polipeptydów OPGL, które znacząco indukują wytwarzanie przeciwciał przeciw niemodyfikowanym OPGL w danym gatunku lub identyfikowanie i ewentualnie izolowanie produktów ekspresji polipeptydu kodowanych przez przedstawicieli zestawu fragmentów kwasów nukleinowych, który indukuje u gatunków zwierzęcych wytwarzanie przeciwciał przeciw niezmodyfikowanemu OPGL.

W tym kontekście, „zestaw odmiennych zmodyfikowanych polipeptydów OPGL” stanowi kolekcję nieidentycznych zmodyfikowanych polipeptydów OPGL, które np. zostały wyselekcjonowane na podstawie omówionych powyżej kryteriów (np. w kombinacji z badaniami dichroizmu kołowego, widm NMR i wzorów dyfrakcji promieni X). Zestaw może składać się jedynie z kilku przedstawicieli ale bierze się pod uwagę również zestaw, który może zawierać kilkuset członków.

Testowanie przedstawicieli danego zestawu można ostatecznie przeprowadzić in vivo, ale można zastosować wiele testów in vitro, które zawężają liczbę zmodyfikowanych cząsteczek, które służą celom tego wynalazku.

Ponieważ celem wprowadzenia obcych epitopów dla komórek T jest wspomaganie odpowiedzi komórek B, wstępnym warunkiem jest to, aby proliferację komórek T testować w wystandaryzowanych testach proliferacji in vitro. Pokrótce, próbkę wzbogaconą w komórki T otrzymuje się od danego osobnika, a następnie utrzymuje się w hodowli. Doprowadza się do kontaktu hodowanych komórek T z APC od osobnika, który pobrał uprzednio zmodyfikowaną cząsteczkę i w którym dokonała się jej obróbka w celu prezentacji epitopów dla komórek T. Monitoruje się proliferację komórek T i porównuje z odpowiednią kontrolą (np. doprowadza się do kontaktu komórek T w hodowli z APC, które mają poddany obróbce natywny OPGL). Alternatywnie, proliferację można mierzyć poprzez określenie stężenia odpowiednich cytokin uwalnianych przez komórki T w odpowiedzi na rozpoznanie przez nie obcych komórek T.

Testowanie zestawów polipeptydów przeprowadza się dogodnie poprzez wstępne przygotowanie odrębnych cząsteczek kwasów nukleinowych albo wektorów stosowanych zgodnie z wynalazkiem, transformowanie wektorami odpowiednich komórek gospodarza i uzyskanie ekspresji sekwencji kwasów nukleinowych stosowanych w wynalazku. Po etapach tych może nastąpić izolacja produktów ekspresji. Korzystnie sekwencje kwasu nukleinowego i/lub wektory uzyskuje się metodami obejmującymi zastosowanie technik amplifikacji molekularnej, takich jak PCR albo przy zastosowaniu syntezy kwasów nukleinowych.

P r z y k ł a d

Zdecydowano się sklonować albo zsyntetyzować DNA kodujący mysi i ludzki OPGL w wersji skróconej zawierającej reszty aminokwasowe 158-316 w przypadku myszy i reszty 159-317 w przyPL 196 790 B1 padku człowieka (liczby odpowiadają numeracji w Id. Sekw. Nr: 2 i 4, odpowiednio). Ponieważ te skrócone wersje wykazują aktywność biologiczną, logiczne jest kierowanie autoprzeciwciał przeciw tym częściom OPGL. Ponadto, sprawia to, że białka są mniejsze, a zatem łatwiejsze do manipulacji.

Syntetyczny DNA kodujący reszty 158-316 mysiego OPGL zsyntetyzowano usuwając z opublikowanej sekwencji suboptymalne kodony dla Escherichia coli i Pichia pastoris. Ponadto, wstawiono do otwartej ramki odczytu N-końcowy znacznik histydynowy, część miejsca cięcia sekwencji sygnałowej czynnika płciowego alfa z Saccharomyces cerevisiae i odpowiednie miejsca restrykcyjne (patrz Id. Sekw. Nr: 7).

Ten cDNA kodujący mysi OPGL typu dzikiego sklonowano w standardowym wektorze ekspresyjnym Escherichia coli (pTrc99a) przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych BspHI i Hindlll oraz standardowego wektora do klonowania (pBluescript KS+) przy użyciu enzymów restrykcyjnych SacI i KpnI (otrzymując Id. Sekw. Nr: 9).

Ekspresja w komórkach Escherichia coli prowadzi do uzyskania około 30% zrekombinowanego OPGL z całkowitej ilości białek Escherichia coli. Białka sfałdowano ponownie i oczyszczano przy zastosowaniu następującej procedury.

1. Komórki zbiera się poprzez odwirowanie.

2. Komórki zawiesza się w roztworze soli buforowanej fosforanem (PBS) i ponownie odwirowuje.

3. Supernatant odrzuca się, a komórki zawiesza w trzech objętościach (100 mM chlorowodorek Tris[hydroksymetylo]aminometanu, 5 mM ditiotreitol (DTT), 0,5 M NaCl, pH 8,0).

4. Do komórek dodaje się 8 pl 50 mM PMSF i 80 pl lizozymu (10 mg/ml) na gram komórek i inkubuje się w temperaturze pokojowej przez dalsze 20 min.

5. Do każdego grama osadu komórek dodaje się 4 mg kwasu deoksychlorowego i zawiesinę inkubuje się w 37°C, aż stanie się lepka.

6. Doodjes ię22pl DDaaz( 1 mg/ml) nagram komórek i MgCI₂ dd5 mM i inkubuje s ię w temperaturze pokojowej przez 30 min.

7. Zawiesinę sonikuje się na lodzie, aż zniknie lepkość.

8. Po odwirowaniu (20000 x g przez 30 min.) osad zawiesza się w H2O, ponownie odwirowuje i zawiesza w 3 ml 1M mocznika na gram komórek.

9. Po odwirowaniu (20000 x g przez 30 min.) osad zawiesza się w 1M chlorowodorku guanidyny, 100 mM chlorowodorku Tris[hydroksymetylo]aminometanu pH 7,5.

10. Po oowirowaniu (22000 x g przze33 min.) osaa zzmiekzzsięw 6M chloromo0drkugubnidyny, 20 mM chlorowodorku Tris[hydroksymetylo]aminometanu pH 8,0, 5% etanolu, 1% betamerkaptoetanolu i miesza się w 4°C przez noc.

11. Po odwirowaniu (40000 x g przez 1-4 godziny) supernatant filtruje się i przechowuje w -20°C.

12. Solubilizzwarjaciajninniubyjna kooZdielan ięprzzesacczkiemólekulamap prz zantosawanaJ Superdex 200 (Pharmacia).

13. Franoje zswiekającc zsekomóinawana OPGL zzieea sśę paazm i pooziekńcz dd 0,1 mó/ml w 1,5 M chlorowodorku guanidyny, 20 mM chlorowodorku Tris[hydroksymetylo]aminometanu, 1 mM DTT, pH 7,5.

14. Mgjeeaj dializsjesięprzzenao w 4°C wwobel OoOjętoSci 1,5 M chlosomwOdrkugubniddna, 20 mM chlorowodorku Tris[hydroksymetylo]aminometanu, 1 mM DTT, pH 7,5.

15. Mgjeeaj dializsjesięprzzenao w 4^::C wwobel OoOjętoSci 1,0 M chlosomwOdrkugubniddna, 20 mM chlorowodorku Tris[hydroksymetylo]aminometanu, 1 mM DTT, pH 7,5.

16. Mgjeeaj dializsjesięprzzenao w 4^::C wwobel OoOjętoSci 0,5 M chlosomwOdrkugubniddna, 20 mM chlorowodorku Tris[hydroksymetylo]aminometanu, 1 mM DTT, pH 7,5.

17. Mgjekaj dializzje się pprze nno w 4°C wwobe 10 Goję^oś 20 riM chlorowwodrkij Tris[hydroksymetylo]aminometanu, 150 mM argininy, 1 mM DTT, pH 7,5.

18. Mgjekaj dializzje się pprze nno w 44° wwobe W oOjętoSci 22 mM chlosoma0drku Tris[hydroksymetylo]aminometanu, 150 mM argininy, pH 7,5.

19. Ponownie sfałdowany materiał liofilizuje się i przechowuje w -20°C.

Wydajność ponownego fałdowania przy zastosowaniu tej procedury wynosi około 40%, a czystość przekracza 65%. Procedura oczyszczania i proces ponownego fałdowania są nadal ulepszane. Badane jest ponowne fałdowanie po unieruchomieniu, a enzymatyczne usuwanie znacznika His będzie przeprowadzone zasadniczo jak opisano przez Pedersen i wsp., 1999. Natura zrekombinowanego białka została scharakteryzowana i zweryfikowana przy zastosowaniu SDS-PAGE, N-końcowego sekwencjonowania, analizy aminokwasów i spektrometrii mas.

PL 196 790 B1

Konstruuje się mutant dzikiego mysiego OPLG z podstawieniem cysteinowym (gdzie cysteina odpowiadająca reszcie aminokwasowej w Id. Sekw. Nr: 4 jest podstawiona seryną; patrz Id. Sekw. Nr: 11 i 12), w celu wyeliminowania potencjalnych problemów ze stabilnością oczyszczanego zrekombinowanego białka. Skrócona forma tego OPGL posłuży jako podstawa dla konstruowania szczepionek, analogicznie jak opisano dla DNA o sekwencji Id. Sekw. Nr: 9. Ponadto, można również wytworzyć odpowiadającego mutanta Cys —>Ser (gdzie podstawiona jest Cys-221) ludzkiego OPGL dla tych samych celów.

Cząsteczki szczepionki wyjściowo konstruuje się poprzez wstawienie albo zastąpienie epitopem, bądź P2, bądź P30, z toksoidu tężca w wybranych pozycjach. Inne odpowiednie immunodominujące epitopy dla komórek T można zastosować na późniejszych etapach.

Wybrane pozycje dla wprowadzenia wariantów wybiera się na podstawie wiedzy o istniejących albo przewidywanych epitopach dla komórek B i przewidywanej struktury drugorzędowej elementów natywnej cząsteczki, jak również stosując porównania z istniejącymi trójwymiarowymi strukturami TNFa (1a8m.pdb) i ligandu CD40 (laly.pdb) w celu stworzenia modelu drugorzędowej i trzeciorzędowej struktury części zewnątrzkomórkowych OPGL. Wprowadzenie do cząsteczki mysiej będzie miało miejsce w obszarach odpowiadających resztom aminokwasowym 170-192, 198-218, 221-246, 256-261 oraz 285-316 (patrz numeracja aminokwasów w Id. Sekw. Nr: 4.), podczas gdy wprowadzenie do cząsteczki ludzkiej będzie miało miejsce w obszarach odpowiadających resztom aminokwasowym 171-193, 199-219, 222-247, 257-262 i 286-317. Do tej pory skonstruowano cztery warianty mysiego OPGL i wyrażono je metodami rekombinowania DNA w Escherichia coli.

DNA kodujący mOPGL[158-316]_P30[256-261] z N-końcowym znacznikiem histydynowym (Id. Sekw. Nr: 13)

Przeprowadzono reakcję PCR na Id. Sekw. Nr: 9 przy zastosowaniu jako starterów Id. Sekw. Nr: 22 i 25. Otrzymany w rezultacie fragment PGR strawiono enzymami restrykcyjnymi SacII i KpnI i oczyszczono z żelu agarozowego. Drugą reakcję PCR przeprowadzono na Id. Sekw. Nr: 9 jako matrycy przy zastosowaniu jako startera Id. Sekw. Nr: 26 i startera specyficznego dla wektora. Otrzymany w rezultacie fragment PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi KpnI i Hindlll. Obydwa fragmenty poddano następnie ligacji z Id. Sekw. Nr: 9 w pBluescript KS+ strawionym enzymami restrykcyjnymi SacII i Hindlll. W celu skorygowania pojedynczej mutacji w tym konstrukcie przeprowadzono reakcję PCR ze starterami Id. Sekw. Nr: 33 i 39. Otrzymane fragmenty PCR strawiono Pstl + EcoRI, oczyszczono z żelu, a następnie poddano ligacji z błędnym konstruktem strawionym Pstl i EcoRI. Sprawdzony konstrukt (Id. Sekw. Nr: 13) przeniesiono następnie do pTrc99a przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych BspHI i Hindlll.

DNA kodujący mOPGL[158-316]_P2[256-261] z N-końcowym znacznikiem histydynowym (Id. Sekw. Nr: 15)

Reakcję PCR przeprowadzono przy zastosowaniu starterów Id. Sekw. Nr: 27 i 28 bez matrycy. Otrzymany w rezultacie fragment PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi Pstl i EcoRI, a następnie oczyszczono z żelu agarozowego. Powstały fragment poddano następnie ligacji z Id. Sekw. Nr: 9 w pBluescript KS+ strawionym enzymami restrykcyjnymi SacII i Hindlll. Sprawdzony konstrukt (Id. Sekw. Nr: 15) przeniesiono następnie do pTrc99a przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych BspHI i Hindlll.

DNA kodujący mOPGL[158-316]_P2[288-302] z N-końcowym znacznikiem histydynowym (Id. Sekw. Nr: 17)

Przeprowadzono reakcję PGR na Id. Sekw. Nr: 9 przy zastosowaniu Id. Sekw. Nr: 22 i 29 jako starterów. Otrzymany w rezultacie fragment PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi Pstl i BstBI, a następnie oczyszczono z żelu agarozowego. Drugą reakcję PCR przeprowadzono na Id. Sekw. Nr: 9 jako matrycy przy zastosowaniu jako startera Id. Sekw. Nr: 30 i startera specyficznego dla wektora. Otrzymany w rezultacie fragment PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi BstBI i KpnI, a następnie oczyszczono z żelu. Obydwa fragmenty poddano następnie ligacji z Id. Sekw. Nr: 9 w pBluescript KS+ strawionym enzymami restrykcyjnymi Pstl i KpnI. Sprawdzony konstrukt (Id. Sekw. Nr: 17) przeniesiono następnie do pTrc99a przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych BspHI i Hindlll.

DNA kodujący mOPGL[158-316]_P30[221-241] z N-końcowym znacznikiem histydynowym (Id. Sekw. Nr: 19):

Przeprowadzono reakcję PCR na Id. Sekw. Nr: 9 przy zastosowaniu Id. Sekw. Nr: 22 i 23 jako starterów. Otrzymany w rezultacie fragment PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi SacII i KpnI,

PL 196 790 B1 a następnie oczyszczono z żelu agarozowego. Drugą reakcję PCR przeprowadzono na Id. Sekw. Nr: 9 jako matrycy przy zastosowaniu starterów Id. Sekw. Nr: 24 i 31. Fragment PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi KpnI i EcoRI, a następnie oczyszczono z żelu. Obydwa fragmenty poddano następnie ligacji z Id. Sekw. Nr: 9 w pBluescript KS+ strawionym enzymami restrykcyjnymi SacII i EcoRI. Sprawdzony konstrukt (Id. Sekw. Nr: 19) przeniesiono następnie do pTrc99a przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych BspHI i Hindlll.

Ekspresja tych skróconych wariantów OPGL miała miejsce w E. coli dając ponad 20% całkowitych białek dla wszystkich wariantów. Dalsze rozwijanie opisanych powyżej procedur oczyszczania i refałdowania dla białka typu dzikiego (Id. Sekw. Nr: 9) będzie kontynuowane. Procedura ta posłuży jako podstawa dla opracowania optymalnych procedur dla każdego z wariantów. Unieruchomione refałdowanie wariantu białek z zastosowaniem znacznika histydynowego jest innym podejściem, które jest w toku.

Alternatywnie, jeżeli żądana jest glikozylacja, warianty można przenosić bezpośrednio do wektorów ekspresyjnych Pichia pastoris przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych albo innych drożdżowych systemów ekspresyjnych stosując PGR. Należy zaznaczyć, że glikozylacja nie jest potrzebna dla aktywności biologicznej OPGL in vivo. Możliwe jest również wyrażenie skróconej OPLG w ludzkich fibroblastach 293, jak doniesiono w Lacey i wsp. Można również rozważać ekspresję w komórkach owadzich (np. linii komórkowej Schneider 2 (S2) i systemie wektorowym albo linii komórkowej Spodoptera frugiperda (SF) i systemie wektorowym, obydwa dostępne z Invitrogen).

Oczyszczone warianty będą zastosowane do wytwarzania przeciwciała u królików do dalszego zastosowania jako narzędzi do wykrywania, ponieważ nie istnieją dostępne handlowo przeciwciała. Ponadto, materiał ten będzie bardzo cennym narzędziem w testach biologicznych potrzebnych do oceny kandydatów na autoszczepionkę. Wytwarzanie przeciwciał będzie przeprowadzane standardowymi sposobami znanymi w tej dziedzinie.

Wybranie najlepszego kandydata na autoszczepionkę opiera się na założeniu aktywności hamującej w testach in vitro dla dojrzewania/aktywacji osteoklastów albo zwierzęcych modelach in vivo dla osteopoporozy. Przydatne systemy testowe i modelowe są opisane w literaturze (np. w Lacey i wsp., Fuller i wsp. oraz Simonet i wsp.).

Aktywność zrekombinowanych białek będzie analizowana poprzez dożylne wstrzykiwanie 100 μΙ samcom myszy Balb/C nie pod narkozą (0, 0,1, i 1,0 mg białka na kg myszy) i godzinę później pobieranie 125 μl krwi z głównej żyły ocznej przy zastosowaniu rurek kapilarnych opłaszczonych wysyconą wapniem heparyną. Poziomy wapnia mierzy się przy zastosowaniu ICA2 (Radiometer, Dania). Oczyszczony, refałdowany zrekombinowany mysi OPGL (Id. Sekw. Nr: 9) jest aktywny w tym teście, zwiększając poziom krążących jonów wapnia do 10%. Kandydaci na autoszczepionki będą np. oceniani przy zastosowaniu autoszczepienia, a następnie monitorowania hamowania przez nie uwalniania jonów wapnia do krwi obwodowej po wstrzyknięciu myszom zrekombinowanego mOPGL (jak opisano w Burgess i wsp. i wsp.).

Należy zaznaczyć, że jako alternatywę dla zmodyfikowanego OPGL, zmodyfikowane antyidiotopowe przeciwciało skierowane przeciw idiotypowi przeciwciała anty-OPGL może również służyć jako immunogen.

Podobnie, zastosowanie minitypowych polipeptydów, które można izolować np. w systemie prezentacji na fagach przy zastosowaniu anty-OPGL albo osteoproregeryny jako sondy wyłapującej, rozważa się również jako część immunogenów według wynalazku.

Lista odnośników

1. Bucay, N. i wsp. (1998), Genes Dev. 12, 1260-1268.

2. Lacey, D. L. i wsp. (1998), Cell 93, 165-176.

3. Marks, S. C., Jr. (1989), Am. J. Med. Genet. 34, 43-53.

4. Simonet, W. S. i wsp. (1997), Cell 89, 309-319.

5. Fuller, K. i wsp. (1998), J. Exp. Med. 188, 997-1001.

6. Burgess, T. L. i wsp. (1999), J. Cell Biol. 145, 527-538.

7. Pedersen J i wsp. (1999) Protein Expr. Purif. 15, 389-400

PL 196 790 B1

Lista Sekwencji <110> M&E Biotech A/S HALKIER, Torben HAANING, Jesper <120>

Sposób obniżania aktywności ligandu osteoprotegeryny <130> 22021 PC 1 <140>

<141>

<160> 35 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2271 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> <185}..(1138) <400> 1 aagcttggta ccgagctcgg atccactact cgacccacgc gtccgcgcgc cccaggagcc 60 aaagccgggc tccaagtcgg cgccccacgt cgaggccccg ccgcagcctc cggagttggc 120 cgcagacaag aaggggaggg agcgggagag ggaggagagc tccgaagcga gagggccgag 180 cgcc atg cgc cgc gcc agc aga gac tac acc aag tac ctg cgt ggc tcg 229

Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser

1

5

10

15

gag

atg

ggc

gg^c

ggc

ccc

gga

gcc

ccg

cac

gag

ggc

ccc

ctg

cac

277

Glu

Met

Gly

Pro

Gly

Al tł

Pro

His

Glu

Gly

Pro

Leu

His

20

25

30

gcc

ccg

cct

gcg

ccg

cac

cag

ccc

gcc

tcc

cgc

tcc

325

Ala

Pro

Ala

Pro

His

Gin

Pro

Ala

Ser

Arg

Ser

35

40

45

atg

ttc

gtg

gcc

ctc

ctg

ggg

ctg

993

ctg

ggc

cag

gtt

gtc

tgc

agc

373

Met

Phe

Val

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Gin

Val

Cys

Ser

50

55

60

PL 196 790 Β1

gtc Val

gcc Ala 65

ctg Leu

ttc Phe

tat Tyr

ttc Phe 70

aga Arg

gcg Ala

cag Gin

atg Met

gat Asp 75

cct Pro

aat Asn

aga Arg

ata Ile

421

tca

gaa

gat

ggc

act

cac

tgc

att

tat

aga

att

ttg

aga

ctc

cat

gaa

469

Ser

Glu

Asp

Gly

Thr

His

Cys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Leu

Arg

Leu

His

Glu

80

85

90

95

aat

gca

gat

ttt

caa

gac

a ca

act

ctg

gag

agt

caa

gat

aca

aaa

tta

517

Asn

Alą

Asp

Phe

Gin

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Asp

Thr

Lys

Leu

100

105

110

ata

cct

gat

tca

tgt

agg

aga

att

aaa

cag

gcc

ttt

caa

gga

gct

gtg

565

Ile

Pro

Asp

Ser

Cys

Arg

Ile

Lys

Gin

Ala

Phe

Gin

Gly

Ala

Vai

115

120

125

caa

aag

gaa

tta

caa

cat

atc

gtt

gga

tca

cag

cac

atc

aga

gca

gag

613

Gin

Lys

Glu

Leu

Gin

His

Ile

Val

Gly

Ser

Gin

His

Ile

Arg

Ala

Glu

130

135

140

aaa

gcg

atg

gat

ggc

tca

tgg

tta

gat

ctg

gcc

aag

agg

agc

aag

661

Lys

Ala

Met

Val

Asp

Gly

Ser

Trp

Leu

Asp

Leu

Ala

Lys

Arg

Ser

Lys

145

150

155

ctt

gaa

gct

cag

cct

ttt

gct

cat

ctc

act

att

aat

gcc

acc

gac

atc

709

Leu

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Thr

Asp

Ile

160

165

170

175

cca

tct

ggt

tcc

cat

aaa

gtg

agt

ctg

tcc

tct

tgg

tac

cat

gat

cgg

757

Pro

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Ser

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

180

185

190

ggt

tgg

gcc

aag

atc

tcc

aac

atg

act

ttt

agc

aat

gga

aaa

eta

ata

805

Gly

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

195

200

205

gtt

aat

cag

gat

ggc

ttt

tat

tac

ctg

tat

gcc

aac

att

tgc

ttt

ega

853

Val

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

210

215

220

cat

gaa

act

tca

gga

gac

eta

gct

aca

gag

tat

ctt

caa

eta

atg

901

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Asp

Leu

Ala

Thr

Glu

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

225

230

235

gtg

tac

gtc

act

aaa

a cc

agc

atc

aaa

atc

cca

agt

tct

cat

acc

ctg

949

Val

Tyr

Val

Thr

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Thr

Leu

240

245

250

255

atg

gga

agc

acc

aag

tat

tgg

tca

ggg

aat

tct

gaa

ttc

cat

997

Met

Lys

Gly

Ser

Thr

Lys

Tyr

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

260

2 65

270

PL 196 790 Β1

ttt Phe

tat Tyr

tcc Ser

ata Ile 275

aac Asn

gtt Val

ggt Gly

gga Gly

ttt Phe 280

ttt Phe

aag Lys

tta Leu

cgg Arg

tet Ser 285

gga Gly

gag Glu

1045

gaa

atc

agc

atc

gag

gtc

tcc

aac

ccc

tcc

tta

ctg

gat

ccg

gat

cag

1093

Glu

Ile

Ser

Ile

Glu

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

290

295

300

gat

gca

aca

tac

ttt

gag

gct

ttt

aaa

gtt

ega

gat

ata

gat

tga

1138

Asp

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Arg

Asp

Ile

Asp

305

310

315

gccccagttt ttggagtgtt atgtatttcc tggatgtttg gaaacatttt ttaaaacaag 1198 ccaagaaaga tgtatatagg tgtgtgagac tactaagagg catggcccca acggtacacg 1256 actcagtatc catgctcttg accttgtaga gaacacgcgt atttacagcc agtgggagat 1318 gttagactca tggtgtgtta cacaatggtt tttaaatttt gtaatgaatt cctagaatta 1378 aaccagattg gagcaattac gggttgacct tatgagaaac tgcatgtggg ctatgggagg 1438 ggttggtccc tggtcatgtg ccccttcgca gctgaagtgg agagggtgtc atctagcgca 1498 attgaaggat catctgaagg ggcaaattct tttgaattgt tacatcatgc tggaacctgc 1558 aaaaaatact ttttctaatg aggagagaaa atatatgtat ttttatataa tatctaaagt 1518 tatatttcag atgtaatgtt ttctttgcaa agtattgtaa attatatttg tgctatagta 1678 tttgattcaa aatatttaaa aatgtcttgc tgttgacata tttaatgttt taaatgtaca 1738 gacatattta actggtgcac tttgtaaatt ccctggggaa aacttgcagc taaggagggg 1798 aaaaaaatgt tgtttcctaa tatcaaatgc agtatatttc ttcgttcttt ttaacttaat 1858 agattttttc agacttgtca agcctgtcca aaaaaattaa aatggatgcc ttgaataata 1918 agcaggatgt tggccaccag gtgcctttca aatttagaaa ctaattgact ttagaaagct 1978 gacattgcca aaaaggatac ataatgggcc actgaaatct gtcaagagta gttatataat 2038 tgttgaacag gtgtttttcc acaagtgccg caaattgtac cttttttttt ttttcaaaat 2098 agaaaagtts ttagtggttt atcagcaaaa aagtccaatt ttaatttagt aaatgttatc 2158 ttatactgta caataaaaac attgcctttg aatgttaatt ttttggtaca aaaataaatt 2218 tatatgaaaa aaaaaaaaaa agggcggccg ctctagaggg ccctattcta tag 2271 <210> 2 <211> 317

PL 196 790 B1 <212> PRT <213> Komo sapiens

<400> 2

Ala

Ser 5

Arg

Asp

Tyr

Thr

Lys 10

Tyr

Leu

Arg

dy

Ser 15

du

Met 1

Arg

Glu

Met

Gly

Pro

Gly

Ala

Pro

His

du

Hy

Pro

Leu

His

ALa

20

25

30

Pro

Ala

Pro

His

Gin

Pro

ALa

Ala

Ser

Arg

Ser

Met

35

40

45

Phe

Val

Ala

Leu

GLy

Leu

Gly

Leu

Gly

GLn

Val

Cys

Ser

Val

50

55

60

Ala

Leu

Phe

Tyr

Phe

Arg

Aa

dn

Mee

Asp

Pro

Asn

Arg

.Ile

Ser

65

70

775

80

GLu

Asp

G1 y

Thr

His

dys

Ile

Tyr

Arg

Ile

Leu

Aacj

Leu

His

Hu

Asn

85

90

95

Ala

Asp

Phe

Gin

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

dn

Asp

Thr

Lys

Leu

Ile

100

105

110

Pro

Asp

Ser

Cys

Arg

He

Lys

dn

Ala

Phe

Gin

Gly

ALa

Val

GLn

115

120

125

Lys

Glu

Leu

Gin

His

Ile

Val

Gly

Ser

GLn

His

Ile

Arg

ALa

GLu

Lys

130

135

140

ALa

Met

Val

Asp

Gly

Ser

Trp

Leu

Asp

Leu

Ala

Lys

Arg

Ses

Lys

Leu

145

150

160

Glu

ALa

Gin

Pito

Phe

Aa

His

Leu

Th rr

Ile

Asn

Ala

Thr

Asp

He

Pro

165

170

175

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Ser

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

dy

190

185

190

Trp

ALa

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Val

195

200

205

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

210

215

220

His

Glu

Thr

Ser

dy

Asp

Leu

Aa

Thr

Hu

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

225

230

235

240

Tyr

Val

Thr

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Sers

Ser

His

Thr

Leu

Met

245

250

255

Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Hu Phe His Phe

PL 196 790 Β1

260

265

270

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

Ser

Gly

Glu

275

280

285

Ile

Ser

Ile

Glu

Val

Ser

Asn.

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

290

2 95

300

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Arg

Asp

Ile

Asp

305 310 315 <210> 3 <211> 951 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> [1)..(951) <220>

<221> misc_£eaturę <222> [142)..(213) ^<223^> _Domena śródbłonowa <220>

<221> raisc feature <222> (454)..(948) <223;

Domena przypominająca czynnik martwicy nowotworu <400> j (TNF)

atg Met 1

cgc Arg

cgg Arg

gcc Ala

agc Ser 5

ega Arg

gac Asp

tac Tyr

ggc Gly

aag Lys 10

tac Tyr

ctg Leu

cgc Arg

agc Ser

teg Ser 15

gag Glu

48

gag

atg

ggc

agc

ggc

ccc

ggc

gtc

cca

cac

gag

ggt

ccg

ctg

cac

ccc

96

Glu

Met

Gly

Ser

Gly

Pro

Gly

Val

Pro

His

Glu

Gly

Pro

Leu

His

Pro

20

25

30

gcg

cct

tct

gca

ccg

gct

ccg

gcg

ccg

cca

ccc

gcc

tcc

cgc

tcc

144

Ala

Pro

Ser

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Ser

Arg

Ser

35

40

45

atg

ttc

ctg

gcc

ctc

ctg

ggg

ctg

gga

ctg

ggc

cag

gtg

gtc

tgc

agc

192

Met

Phe

Leu

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu

Gly

Gin

Val

Cys

Ser

50

55

60

atc

gct

ctg

ttc

ctg

tac

ttt

ega

gcg

cag

atg

gat

cct

aac

aga

ata

240

Ile

Ala

Leu

Phe

Leu

Tyr

Phe

Arg

Ala

Gin

Met

Asp

Pro

Asn

Arg

Ile

65

70

75

80

PL 196 790 B1

tca Ser

gaa Glu

gac Asp

agc Ser

act Thr 85

cac His

tgc Cys

ttt Phe

tat Tyr

aga Arg 90

atc Ile

ctg Leu

aga Arg

ctc Leu

cat His 95

gaa Glu

288

aac

gca

ggt

ttg

cag

gac

tcg

act

ctg

gag

agt

gaa

gac

aca

eta

cct

336

Asn

Ala

Gly

Leu

Gin

Asp

Ser

Thr

Leu

Glu

Ser

Glu

Asp

Thr

Leu

Pro

100

105

110

gac

tcc

tgc

agg

atg

aaa

caa

gcc

ttt

cag

ggg

gcc

gtg

cag

aag

384

Asp

Ser

Cys

Arg

Met

Lys

Gin

Ala

Phe

Gin

GLy

Ala

Val

Gin

Lys

115

120

125

gaa

ctg

caa

cac

att

gtg

ggg

cca

cag

cgc

ttc

tca

gga

gct

cca

gct

432

Glu

Leu

Gin

His

Ile

Val

Gly

Pro

Gin

Arg

Phe

Ser

Gly

ALa

Pro

Ala

130

135

140

atg

gaa

ggc

tca

tgg

ttg

gat

gtg

gcc

cag

ega

ggc

aag

cct

gag

480

Met

Glu

Gly

Ser

Trp

Leu

Asp

Val

Al a

Gin

Arg

Gly

Lys

Pro

Glu

145

150

155

160

gcc

cag

cca

ttt

gca

cac

ctc

acc

atc

aat

gct

gcc

agc

atc

cca

tcg

528

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ser

Ile

Pro

Ser

165

170

175

ggt

tcc

cat

aaa

gtc

act

ctg

tcc

tct

tgg

tac

cac

gat

ega

ggc

tgg

576

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

GLy

Trp

180

135

190

gcc

aag

atc

tct

aac

atg

acg

tt a

agc

aac

gga

aaa

eta

agg

gtt

aac

624

Al a

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

Asn

195

200

205

caa

gat

ggc

ttc

tat

ta c

ctg

tac

gcc

aac

att

tgc

ttt

cgg

cat

672

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Sys

Phe

Arg

His

210

215

220

gaa

aca

tcg

gga

agc

gta

cct

aca

gac

tat

ctt

cag

ctg

atg

gtg

tat

720

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr

225

230

235

240 .

gtc

gtt

aaa

acc

agc

atc

aaa

atc

cca

agt

tct

cat

aac

ctg

atg

aaa

768

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

Lys

245

250

255

gga

ggg

agc

acg

aaa

aac

tgg

tcg

ggc

aat

tct

gaa

ttc

cac

ttt

tat

816

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

260

265

270

tcc

ata

aat

gtt

ggg

gga

ttt

ttc

aag

ctc

ega

gct

ggt

gaa

att

864

Ser

Ile

Asn

Vai

Gly

G1 y

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Ile

275

280

285

PL 196 790 Β1

agc Ser

att Ile 290

Gin

gtg Val

tcc Ser

aac Asn

cct Prc 295

tcc Ser

ctg Leu

gat Asp

ccg Pro 300

gat Asp

caa Gin

gat Asp

gcg Ala

912

acg

tac

ttt

ggg

gct

ttc

aaa

gtt

cag

gac

ata

gac

tga

951

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

305 310 315 <210> 4 <211> 315 <212> PR.T <213> Mus musculus <400> i

Met Arg 1

Arg

Ala

Ser 5

Arg

Asp

Tyr

Gly

Lys 10

Tyr

Leu

Arg

Ser

Ser 15

Glu

Met

G1 y

Ser

Gly

Pro

Gly

Val

Pro

His

Glu

Gl y

Pro

Leu

His

Pro

20

25

30

Ala

Pro

Ser

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Ser

Arg

Ser

35

40

45

Met

Phe

Leu

Ara

Leu

Gly

Leu

Gly

LeU

Gly

Gin

Val

Cys

Ser

50

55

60

Ile

Ala

Leu

Phe

Leu

Tyr

Phe

Arg

Ala

Gin

Met

Asp

Pro

Asn

Arg

Ile

55

30

75

80

Ser

Glu

Asp

Ser

Thr

His

Cys

Phe

Tyr

Arg

Ile

Leu

Arg

Leu

His

Glu

85

90

95

Asn

Ala

Gly

Leu

Gin

Asp

Ser

Thr

Leu

Glu

Ser

Glu

Asp

Thr

Leu

Pro

100

105

110

Asp

Ser

Cys

Arg

Met

Lys

Gin

Ala

Phe

Gin

Gly

Ala

Val

Gin

Lys

115

120

125

Glu

Leu

Gin

His

Ile

Val

Gly

Pro

Gin

Arg

Phe

Ser

Gly

Ala

Pro

Ala

130

135

140

Met

Glu

Gly

Ser

Trp

Leu

Asp

Val

Ala

Gin

Arg

Gly

Lys

Pro

Glu

145

150

155

160

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ser

Ile

Pro

Ser

165

no

175

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

Trp

180

185

190

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

Asn

195

200

205

PL 196 790 Β1

Gin Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His 210 215 220

Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gin Leu Met Val Tyr

225 230 235 240

Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys

245 250 255

Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr 260 265 270

Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile 275 280 285

Ser Ile Gin Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin Asp Ala 290 295 300

Thr Tyr Ehe Gly Ala Phe Lys Val Gin Asp Ile Asp

305	310	315
<21O> 5 <211> 2299 <212> DNA <213> Mus musculus
<220> <221> CDS <222> (170	) . . (1120)
<400> 5 gagctcggar	ccactactcg	acccacgcgt	ccgcccacgc	gtccggccag gacctctgtg	60
aaccggtcgg	ggcgggggcc	gcctggccgg	gagtctgctc	ggcggtgggt ggccgaggaa	120
gggagagaac	gatcęfcggaa	cagggcgccc	gaactccggg	cgccgcgcc atg cgc cgg	178

Met Arg Arg 1

gcc

agc

ega

gac

tac

ggc

aag

tac

ctg

cgc

agc

tcg

gag

atg

ggc

Ala

Ser 5

Arg

Asp

Tyr

Gly

Lys 10

Tyr

Leu

Arg

Ser

Ser 15

Glu

Met

Gly

agc

ggc

ccc

ggc

gtc

cca

cac

gag

ggt

ccg

ctg

cac

ccc

gcg

cct

tet

Ser 20

Gly

Pro

Gly

Val

Pro 25

His

Glu

Gly

Pro

Leu 30

His

P ro

Ala

Pro

Ser 35

gca

ccg

get

ccg

gcg

ccg

cca

ccc

gcc

tcc

cgc

tcc

atg

ttc

ctg

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala 40

Pro

Ero

Pro

Ala

Ala 45

Ser

Arg

Ser

Met

Phe 50

Leu

PL 196 790 B1

gcc	ctc	ctg	ggg	ctg	gga
Ala	Leu	Leu	Gly 55	Leu	Gly
ttc	ctg	tac	ttt	ega	gcg
Phe	Leu	Tyr 70	Phe	Arg	Ala
agc	act	cac	tgc	ttt	tat
Ser	Thr 85	His	Cy^s	Phe	Tyr
ttg	cag	gac	tcg	act	ctg
Leu 100	Gin	Asp	Ser	Thr	Leu 105
agg	^agg	atg	ddd	caa	gcc
Arg	Arg	Met	Lys	Gin 120	ALa
cac	att	gtg	ggg	cca	cag
His	He	Val	Gly 135	Pro	Gin
ggc	tca	tgg	ttg	gat	gtg
Gly	Ser	Trp 150	Leu	Asp	Val
ttt	gca	cac	ctc	acc	atc
Phe	Ala 165	His	Leu	Thr	Ile
353	gtc.	act	ctg	tcc	tct
Lys 180	Val	Thr	Leu	Ser	Ser 185
tct	a ac	atg	acg	tta	agc
Ser	Asn	Met	Thr	Leu 200	Ser
ttc	tat	tac	ctg	tac	gcc
Phe	Tyr	Tyr	Leu 215	Tyr	Ala
gga	agc	gta	cct	aca	gac
Gly	Ser	Val 230	Pro	Thr	Asp
a cc	agc	atc	aaa	atc	cca
Thr	Ser	Ile	Lys	Ile	Pro

245

ctg	gg^c	cag	gtg	gtc	tgc
Leu	Gly	Gin 60	Val	Val	Cys
cag	atg	gat	cct	aac	aga
Gin	Met 75	Asp	Pro	Asn	Arg
aga	atc	ctg	aga	ctc	cat
Arg 90	Ile	Leu	Arg	Leu	His 95
gag	agt	gaa	gac	aca	eta
Glu	Ser	Glu	Asp	Thr 110	Leu
ttt	cag	ggg	gcc	gtg	cag
Phe	Gin	Gly	Ala 125	Val	Gin
cgc	ttc	tca	gga	get	cca
Arg	Phe	Ser 140	Gly	ALa	Pro
gcc	cag	ega	gg^c	aag	cct
Ala	Gin 155	Arg	Gly	Lys	Pro
aat	get	gcc	agc	atc	cca
Asn 170	Ala	ALa	Ser	Ile	Pro 175
tgg	tac	cac	gat	^ega	ggc
Trp	Tyr	His	Asp	Arg 190	Gly
aac	ega	aaa	eta	agg	gtt
Asn	Gly	Lys	Leu 205	Arg	Val
aac	att	tgc	ttt	^cgg	cat
Asn	Ile	Cys 220	Phe	Arg	His
tat	ctt	cag	ctg	atg	gtg
Tyr	Leu 235	Gin	Leu	Met	Val
agt	tct	cat	aac	ctg	atg
Ser	Ser	His	Asn	Leu	Met

250 255

agc	atc	get	ctg	370
Ser	Ile 65	Ala	Leu
ata	tca	gaa	gac	418
Ile 30	Ser	Glu	Asp
gaa	aac	gca	ggt	466
Glu	Asn	Ala	Gly
cct	gac	tcc	tgc	514
Pro	Asp	Ser	Cys 115
aag	gaa	ctg	caa	562
Lys	Glu	Leu 130	Gin
get	atg	atg	gaa	610
ALa	Met 145	Met	Glu
gag	gcc	cag	cca	658
Glu 160	Ala	Gin	Pro
tcg	ggt	tcc	cat	706
Ser	Gly	Ser	His
tgg	gcc	aag	atc	754
Trp	Ala	Lys	Ile 195
aac	caa	gat	ggc	802
Asn	Gin	Asp 210	Gly
cat	gaa	aca	tcg	850
His	Glu 225	Thr	Ser
tat	gtc	gtt	aaa	898
Tyr 240	Val	Val	Lys
aaa	gga	ggg	agc	946
Lys	Gly	Gly	Ser

PL 196 790 B1

acg Thr 260

aaa Lys

aac Asn

tgg Trp

tcg Ser

ggc Gly 2 65

aat Asn

tct Ser

gaa Glu

ttc Phe

cac His 270

ttt Phe

tat Tyr

tcc Ser

ata Ile

aat Asn 275

994

gtt

ggg

gga

ttt

ttc

aag

ctc

ega

gct

ggt

gaa

att

age

att

cag

1042

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

ALa

Gly

Glu

Ile

Ser

Ile

Gin

200

285

290

gtzg

tcc

aac

cct

tcc

ctg

gat

ccg

gat

caa

gat

gcg

acg

tac

ttt

1090

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Len

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

ALa

Thr

Tyr

Phe

295

300

305

ggg

gct

ttc

aaa

gtt

cag

gac

ata

gac

tga

gactcatttc gtggaacatt

1140

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

310

315

agcatggacg	tcctagatgt	ttggaaactt	Ct tdd&dddt	ggatgacgtc	tatacatgtg	1200
taagactact	aagagacatg	gttcacggtg	tatgasactc	acagccctct	ctcttgagcc	1260
tgtacaggtt	gtgtatatgt	aaagtccata	ggtgatgtta	gattcatggt.	gattacacaa	1320
cggttttaca	attttgtaat	gatttcctag	aattgaacca	gattgggaga	ggtattccga	1380
tgcttstgaa	aaacttacac	gtgagctatg	g^aagggggt^c		ggtctaaccc	1440
ctggacatgt	gccactgaga	accttgaaat	taagaggatg	ccatgtcatt	gcaaagaaat	1500
gatagtgtga	agggttaagt	tcttttgaat	tgttacattg	cgctgggatc	tgcaaataag	1560
ttcttttttt	ctaatgagga	gagaaaaata	tatgtatttt	tatataatgt	ctaaagttat	1620
atttcaggtg	taatgttttc	tgtgcaaagt	tttgtaaatt	atatttgtgc	tatagtattt	1680
gattcaaaat	atttaaaaat	gtctcacOgt	tgacatattt	a-atgttttaa	atctacagat	1740
gtatttaact	ggtgcacttt	gtaattcccc	tgaaggtact	cgragctaiag	ggggcagaat	1300
actgtttctg	glgaccacat	gtagtttatt	tetttattet	ttttaactta	atagagtett	1360
cagacttgtc	aaaactatgc	aagcaaaata	aataaataaa	aataaaatga	ataccttgaa	1920
taataagtag	gatgttggtc	attaggtgtc	tttcaaattt	agaagctaat	tgactttagg	1930
agctgacata	gccaaaaagg	atacataata	ggctactgaa	atctgtcagg	agtatttatg	2040
caattattga	acaggtgtct	ttttttccaa	gagctacaaa	ttgtaaattt	tgtttctttt	2100
ttttcccata	gaaaatgtac	tatagtttat	cagccsaada	atόstctatt	ttttaattta	2160
gtgaaagtta	ttttattata	ctgtacaata	aaagcattgt	ctctgaatgt	taattttttg	2220

gtacaaaaaa taaatttgta cgaaaacctg aaaaaaaaaa aaaaaaaggg cggccgctct 2280

PL 196 790 B1

PL 196 790 Β1

Val

Lys

Thr

Ser 245

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser 250

Ser

His

Asn

Leu

Met 255

Lys

Gly

Ser

Thr 260

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly 2 65

Asn

Ser

Glu

Phe

His 270

Phe

Tyr

Ser

Ile

Asn 275

Val

Gly

Phe

Phe 280

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly 285

Glu

Ile

Ser

Ile 290

Gin

Val

Ser

As n

Prc 295

Ser

Leu

Asp

Pro 300

Asp

Gin

Asp

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

305 310 315 <210> 7 <211> 564 <212> DNA ^<213> Sekwencja sztuczna <22 o>

<221> CDS <222> (1)..(564i <220>

<223> - , . ·

Opis sekwencji sztucznej: syntetyczny produkt PCR z użyciem optymalnych kodonów do ekspresji w E. coli i P. pastoris <220 <221> nu.sc_bindihg <222> (43)..(84) ^<z23> Znacznik His <220 <221> misc_feature <222> (1)..(36) ^<223> Część końca C czynnika kopulacyjnego alfa Saccharomyces cerevisiae <220 <221> misc_feature <222> (85)..(561) <223>

Koduowanie OPGL typu dzikiego, reszty 158-316 <400>

gag ctc gga tcc ctc gag aaa aga gag gct gaa gct cat gtc atg aaa Glu Leu Gly Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala His Val Met Lys 15 10 15

PL 196 790 B1

cac His

caa G'in

cac His

caa Gin 20

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His 25

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys

cct Pro 30

gaa GLu

gct Ala

96

cag

cca

ttc

gct

cat

ctg

acc

atc

aac

gct

gca

tcg

atc

cct

tct

ggt

144

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

ALa

Ala

Ser

Ile

Pro

Ser

Gly

35

40

45

tct

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tct

tgg

tat

cac

gac

cgc

ggt

tgg

gct

192

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

Trp

Ala

50

55

60

caa

atc

tct

aac

atg

acc

ctg

tct

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

aac

cag

240

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

Asn

Gin

65

70

75

80

gac

ggt

ttc

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tgt

ttc

aga

cat

cac

gaa

283

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

GLu

85

90

95

acc

tct

ggt

tct

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

tac

gtt

336

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr

Val

100

105

110

gtt

aaa

acc

tct

atc

aaa

atc

cca

tct

tca

cat

aac

ctq

atg

aaa

ggt

384

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

Lys

Gly

115

120

125

ggt

tct

acc

aaa

aac

tgg

tct

ggt

aac

tct

gaa

ttc

cat

ttc

tac

tct

432

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

Ser

130

135

140

atc

aac

gct

ggt

ggC

ttc

aaa

ctg

aga

gct

ggt

gaa

atc

tct

480

Ile

Asn

Val

Giy

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Ile

Ser

145

150

155

160

atc

cag

gtt

tct

aac

cct

tct

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

gct

acc

528

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

C-in

Asp

ALa

Thr

165

170

175

tac

t.tc

gęg

gcc

ttc

aaa

gtt

cag

gac

atc

ga c

t.ag

564

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Va.l.

Gin

Asp

Ile

Asp

180 185 <210>

<211>

<212>

<213>

<223>

187

PRT

Sekwencja sztuczna

Opis sekwencji sztucznej: syntetyczny produlkt PCR z użyciem optymalnych kodonów do ekspresji w E. coli i P. pastoris

PL 196 790 B1

<400> 8

Arg

Glu

ALa 10

Glu

Ala

His

Val

Met 15

Lys

Glu 1

Leu

Gly

Ser

Leu 5

Glu

Lys

His

Gin

His

Gin

His

Gin

His

Gin

His

Gin

His

Gin

Lys

Pro

Glu

Ala

20

25

30

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ser

Ile

Pro

Ser

Gly

35

40

45

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

Trp

Ala

50

55

60

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

Asn

Gin

65

70

75

80

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

Glu

85

90

95

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

GLn

Leu

Met

Val

Tyr

Val

100

105

110

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

Lys

GLy

115

12 0

125

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

Ser

130

135

140

Ile

Asn

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Ile

Ser

145

150

155

160

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

Thr

165

170

175

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

180

185

<210> 9 <211> 519 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: DNA kodujący mysi OPGL, reszty 158 316, poddany fuzji ze znacznikiem His <220>

<221> COS <222> (1)..(519) <220>

PL 196 790 B1 <221> misc_binding <222> (1)..(42) <²²³> Znacznik His <220>

<221> msc_feature <222> {33} . . ( 519) <²²³> Mysi OPGL, reszty 158-316 <4C0> 9

atg Met 1

aaa lys

cac His

caa Gin

cac His 5

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin 10

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys 15

cet Pro

43

gaa

gct

cag

cca

ttc

gct

cat

ctg

acc

atc

aac

gct

gca

tcg

atc

cct

96

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

A.sn

Ala

ALa

Ser

Ile

Pro

20

25

30

tct

ggt

tct

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tct

tgg

tat

cac

gac

cgc

ggt

144

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

tgg

gct.

aaa

atc

tct

aac

atg

acc

ctg

tct

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Al.a

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

VaL

50

55

60

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tgt

ttc

aga

cat

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

ALa

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

cac

gaa

acc

tct

ggt

tct

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

288

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

?rc

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

tac

gtt

aaa

acc

tct

atc

aaa

atc

cca

tct

tca

cat

aac

ctg

atg

336

Tyr

Val

Lys

Thr

Ser

He

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

no

aaa

ggt

tct

acc

aaa

aac

tgg

tct

ggt

aac

tct

gaa

ttc

cat

ttc

3Θ4

Lys

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

12 0

125

tac

tct

atc

aac

gtt

ggt.

ggt;

ttc

aaa

ctg

aga

g^ct

ggt

gaa

4 32

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

G1 y

Phe

Lys

Leu

Arg

ALa

Gly

Glu

130

135

140

atc

tct

atc

cag

gtt

tct

aac

cct

tct

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

480

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145

150

155

160

gct

acc

tac

ttc

ggg

gee

ttc

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

519

ALa

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165 170

PL 196 790 Β1 <210> 10 <211> 173 <212> PRT <2ΐ3> sekwencja sztuczna <223> opi_s sekwencji sztucznej: DNA kodujący mysi OPGL, reszty 158-

316, <400> 10

poddany

fuz j i

ze His

znacznikiem His

Gin His 5

Gin

Met 1

Lys

His

Gin

Gin 10

His

Gin

His

Gin Lys 15

Pro

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

Ser

Gly

ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

Tyr

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Lys

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

Tyr

ser

Ile

Asn

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

130

135

140

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145

150

155

160

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

<210> 11 <211> 519 <212> DNA <213> , . ,

Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: fuzja DNA kodującego mysi OPGL, reszty 158-316 z mutacją C do S ze znacznikiem His

PL 196 790 Β1

<220>
<221>	CDS
<222>	il)..(519)
<220>
<22±>	inisc binding
<222>	(1) . . (42)

^<223> Znacznik His <220>

<221> rnisc_feature <222> (43) . .(228) ^<223> Mysi OPGL, reszty 158-219 <220>

<221> misc_feature <222> (232)..(519) ^<223> Mysi OPGL, reszty 221-316 <220>

< 2 21 a ion t a c 3 a <222> (229) . . (2311 <223> tgt (Cys) do tcc (Ser) <220>

<400> 11

atg Met 1

aaa Lys

cac His

caa Gin

cac His 5

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin 10

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys 15

cct Pro

48

gaa

gct

cag

cca

ttc

gct

cat

ctg

acc

atc

aac

gct

gca

tcg

atc

CCt

96

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

A... a

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

tct

ggt

tct

cat

aaa

gtt

acc

Ctg

tct

tgg

tat

cac

gac

cgc

ggt

144

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

4 5

tgg

gct

ςί ćl ćl

atc

t ct

aac

atg

acc

ctg

tct

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

50

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tcc

ttc

aga

cat

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Ser

Phe

Arg

His

55

70

75

80

cac

gaa

acc

tct

ggt

tct

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

288

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

90 95

PL 196 790 B1

tac Tyr

gtt Val

aaa Lys 100

acc Thr

tct ser

atc Ile

aaa Lys

atc Ile 105

cca Pro

tct Ser

tca Ser

cat Hi s

aac Asn 110

ctg Leu

atg Met

33S

aaa

ggt

tct

acc

aaa

aac

^tgg

tct

ggt

aac

tct

gaa

ttc

cat

ttc

384

Lys

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

tac

tct

atc

aac

gtt

ggt

ttc

aaa

^ctg

aga

gct

ggt

gaa

432

Tyr

Ser

Ile

Asn

VaL·

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

ALa

Gly

Glu

130

135

140

atc

tct

atc

cag

gtt

tct

aac

cct

tct

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

480

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145

150

155

ISO

gct

acc

tac

ttc

ggg

gcc

ttc

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

519

ALa

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

<210>

<211>

<212>

<213>

<223>

173

PRT

Sekwencja sztuczna

Opis sekwencji sztucznej: fuzja reszty 158-316 z mutacją C do S

DNA kodującego mysi ze znacznikiem His

OPGL, <400> 12

Met 1

Lys

His

Gin

His 5

Gin

His

Gin

His

Gin 10

His

Gin

His

Gin

Lys 15

Pro

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

ALa

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

ALa

Ser

Ile

Pro

20

25

30

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

Hi s

Asp

Arg

Gly

35

40

45

Trp

ALa

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Al a

Asn

Ile

Ser

Phe

Arg

His

65

70

75

80

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

Tyr

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Lys

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

PL 196 790 B1

Tyr

Ser 130

Ile

Asn

Val

Gly

Gly 135

Phe

Lys

Leu

Arg 140

Ala

Gly

Glu

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145

150

155

160

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

<210> 13 <211> 564 <212> DNA <²¹³> Sekwencja sztuczna <220>

<²²³> Opis sekwencji sztucznej: fuzja mysiego OPGL, reszty 158-316 modyfikowanego przez wprowadzenie epitopu P30 anatoksyny tężcowej ze znacznikiem His <220>

<221> CDS <222> (1)..(564) <220>

<221> msc_binding <222> (1)..(42) <223> Znacznik His <220>

<221> misc feature <222> (43).·(336) <223> py_Sj OPGL, reszty 158-255 <220>

<221> misc_feature <222> (337).. (399) <²²³> Epitop ^P30 anatoksyny tężcowej <220>

<221> misc_feature <222> (400)..(564) <223> _Mysi OPGL, reszty 262-316 <400> 13 atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa aaa cct 48

Met Lys His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin Lys Pro

10 15

PL 196 790 B1

gaa Glu

gct ALa

cag Gin

cca Pro 20

ttc Fhe

gct Ala

cat His

ctg Leu

acc Thr 25

atc Ile

aac Asn

gct Al a

gca ALa

tcg Ser 30

atc Ile

cct Pro

96

tct

ggt

tct

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tct

tgg

tat

cac

gac

ege

ggt

144

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

tgg

gct

33.9

atc

tct

aac

a tg

acc

ctg

tct

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Ala

Lys

He

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tgt

ttc

aga

cat

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

cac

gaa

acc

tct

ggt

tct

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

288

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

tac

gtt

aaa

a cc

tct

atc

aaa

atc

cca

tct

tca

cat

aac

ctg

atg

336

Tyr

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

ttc

aac

ttc

acc

gtt

tct

ttc

tgg

ctg

agg

gta

ccg

aaa

gtt

tct

384

Phe

Asn

As n

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Ero

Lys

Val

Ser

115

120

125

gct

tct

cac

ctg

gaa

aac

tgg

tct

ggt

aac

tct

gaa

ttc

cat

ttc

tac

432

ALa

Ser

His

Leu

Glu

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

130

135

140

tct

atc

aac

gtt;

ggt

ttc

aaa

ctg

aga

gct

gg^t

gaa

atc

480

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Ile

145

150

155

160

tct

atc

cag

gtt

tct

aac

cct

tct

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

gct

528

Ser

Ile

Cln

Val

Ser

As n

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

165

17 0

175

acc

tac

ttc

ggg

gee

ttc

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

564

Thr

Tyr

Phe

Gly

ALa

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

He

Asp

180

185

<210> 14 <211> 188 <212> PRT <²¹³> Sekwencja sztuczna <223> . , . . . . , ' .

Opis sekwencji sztucznej: fuzja mysiego OPGL, reszty 158-316 modyfikowanego przez wprowadzenie epitopu P2 anatoksyny tężcowej ze znacznikiem His

PL 196 790 B1 <400> 14

M5. 1

Lys

His

Gin

His 5

G1 n

His

Gin

His

Gin 10

His

Gin

His

Gin

Lys 15

Pro

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

Tyr

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Phe

Asr.

Asn

Phe

Thr

Vai

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Vai

Ser

115

120

125

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

130

135

140

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

ALa

Gly

Glu

Ile

145

150

155

160

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

ALa

165

170

175

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

180 185 <210> 15 <211> 546 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> opis sekwencji sztucznej: fuzja mysiego OPGL, reszty 158-316 modyfikowanego przez wprowadzenie epitopu P2 anatoksyny tężcowej ze znacznikiem His <220>

<221> CDS <222> (1) . . (546]

PL 196 790 Β1 <220>

<221> rciisc_binding <222> (1)..(42) ^<223> Znacznik His <220>

<221> rnisc feature <222> (43)..(33S) ^<223> Mysi OPGL, reszty 158-255 <220>

<221> itiisc_f eature <222> (3821 . . (546) <223> Mysi OPGL, reszty 262-316 <220>

<221> misc_feature <222> (337)..(381) <223> Epitop P2 anatoksyny tężcowej <400> ±o

atg Met 1

aaa Lys

cac HJ.5

caa Gin

cac His 5

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin 10

cat His

caa Gin

cat His

Cad Gin

aaa Lys 15

cct Pro

43

gaa

gct

cag

cca

ttc

gct

cat

ctg

acc

atc

aac

gct

gca

tcg

atc

cct

96

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

tct

ggt

tct

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tct

tgg

tat

cac

gac

cgc

ggt

144

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

tgg

gct

aaa

atc

tct

aac

atg

acc

ctg

tct

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Al a

Lys

Tle

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

aac

cag

gac

gat

ttc

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tgt

ttc

aga

cat

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

cac

gaa

acc

tct

ggt

tct

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

at g

gtt

288

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

tac

gtt

aaa

acc

cct

atc

aaa

atc

caa

tct

tca

ca t

aac

ctg

atg

336

Tyr

Val

Lys

Thr

Pro

Ile

Lys

Ile

Gin

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

cay

tac

atc

aaa

gct

aat

tcg

aaa

ttc

atc

ggt

atc

acc

gaa

ctg

aac

384

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

As n

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Asn

115

120

125

PL 196 790 Β1

tgg Trp

tct Ser 130

ggt Giy

aac Asn

tct Ser

gaa Glu

ttc Phe 135

ca t His

ttc Phe

tac Tyr

tct Ser

atc Ile 140

aac Asn

gtt Val

ggt Giy

ggt Gly

432

ttc

aaa

ctg

aga

gct

ggt

gaa

atc

tct

atc

cag

gtt

tct

aac

480

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

145

150

155

160

cct

tct

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

gct

acc

tac

ttc

ggg

gcc

ttc

528

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

165

170

175

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

546

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

180 <210> 16 <211> 182 <212> PRT <223> ^SekwencJa sztuczna

Opis sekwencji sztucznej: fuzja mysiego OPGL, reszty 158-316 modyfikowanego przez wprowadzenie epitopu P2 anatoksyny tężcowej ze znacznikiem His <400>

Met 1

Lys

His

Gin

His 5

Gin

His

Gin

His

Gin 10

His

Gin

His

Gin

rys 15

CIO

Glu

Ala

Gin

Pro 20

Phe

Ala

His

Leu

Thr 25

Ile

Asn

Ala

Ser 30

Ile

Pro

Ser

Gly

Ser 35

His

Lys

Val

Thr

Leu 40

Ser

Trp

Tyr

His 45

Asp

Arg

Gly

Trp

Ala 50

Lys

Ile

Ser

Asn

Met 55

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly 60

Lys

Leu

Arg

Val

Asn 65

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr 70

Tyr

Leu

Tyr

Ala

As u 75

Ile

Cys

Phe

Arg

His 80

His

Glu

Thr

Ser

Gly 85

Ser

Val

Pro

Thr

Asp 90

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met 95

Val

Tyr

Val

Lys 100

Thr

Pro

Ile

Lys

Ile 105

Gin

Ser

His

Asn 110

Leu

Met

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Asn

115 120 125

Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly 130 135 140

PL 196 790 Β1

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

145

150

155

160

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

Ala

Thr

Tyr

Fhe

Gly

Ala

Phe

165

170

175

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

180 <210> 17 <211> 519 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<221> CDS <222> (li , . (519) <220>

<221> misc_binding <222> (1) . .(42) <223> Znacznik His <220>

<221> miso_feature <222> (43)..(432) <223> Mysi OPGL, reszty 158-287 <220>

<221> inisc feature <222> (478) .. (519) <223> _My_Si OPGL, reszty 303-316 <220>

<221> misc_feature <222> (433)..(477) <223> Epitop P2 anatoksyny tężcoweń <400> ii

atg Met I

aaa Lys

cac His

caa Gin

cac His 5

caa Gin

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin 10

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys 15

cct Pro

48

gaa

gct

cag

cca

ttc

gct

cat

ctg

acc

atc

aac

gct

gca

tcg

atc

cct

96

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

PL 196 790 B1

tct Ser

ggt Gly

tct Ser 35

cat His

aaa Lys

gtt Val

acc Thr

ctg Leu 40

tct Ser

tgg Trp

tat Tyr

cac His 45

gac Asp

cgc Arg

ggt Gly

144

tgg

gct

aaa

atc

tct

aac

atg

acc

ctg

tct

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

As π

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

SC

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

^tgt

ttc

aga

cat

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

65

70

75

80

cac

gaa

acc

tct

ggt

tct

gtt

cca

acc

gac

tac

ctg

cag

ctg

atg

gtt

288

His

Glu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

85

90

95

tac

gtt

aaa

acc

tct

atc

aaa

atc

cca

tct

tca

cat

aac

ctg

atg

336

Tyr

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

ιοα

105

110

aaa

ggt

t ct

acc

aaa

aac

tgg

tct

ggt

aac

tct

gaa

ttc

cat

ttC

384

Lys

Gly

Ser

Thr

Łys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

tac

tct

atc

aac

gtt

ggt

ttc

aaa

ctg

aga

gct

ggt

gaa

432

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

130

135

140

cag

tac

atc

aaa

gct

aat

tcg

aaa

ttc

atc

ggt

atc

acc

gaa

ctg

gac

480

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Asp

145

150

155

160

gct

a cc

tac

ttc

ggg

gcc

ttc

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

519

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

<210> 18 <211> 173 <212> PRT <2i3> Sekwencja sztuczna <^223>Opis sekwencji sztucznej: fuzja mysiego OPGL, modyfikowanego przez wprowadzenie epitopu P2n tężcowej ze znacznikiem His reszty 158-316 anatoksyny

<4 00
Met	Lys	His	Gin	His	Gin	His	Gin
1				5
Glu	Ala	Gin	Pro	Phe	ALa	His	Leu
			20

His	Gin 10	His	Gin	His	Gin	Lys 15	Pro
Thr	Ile	Asn	Ala	ALa	Ser	Ile	Pro
25					30

Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly

PL 196 790 B1

35

40

45

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

50

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Len

Tyr

ALa

Asn

Ile

Cys

Phe

Arg

His

55

70

75

en

His

GLu

Thr

Ser

Gly

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Vai

85

90

95

Tyr

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Lys

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

ALa

Gly

Glu

130

135

140

Gin

Tyr

Ile

Lys

Al a

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Asp

145

150

155

150

A.ia

Thr

Tyr

Phe

Gly

ALa

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

1S5

170

<210> 19 <211> 519 <212> DNA <²¹³> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: fuzja mysiego OPGL, reszty 159-316 modyfikowanego przez wprowadzenie epitopu P30 anatoksyny tężcowej ze znacznikiem His <220>

<221> CDS <222> (1)..(519) <220>

<221> misc binding <222> (1)..(42) <223> Znacznik His <220>

<221> M.sc feature <222> (43).. (231) <223> _My_Sj opgl, reszty 158-220 <220>

PL 196 790 B1 <221> msc_feature <222> (295) . . (519) <223> Mysi OPGL, reszty 242-316 <220>

<221> misc_feature <222> (232)..(294 i <223> Epitop P30 anatoksyny tężcowej <4C0> u

atg Met 1

aaa Lys

cac His

caa Gin

cac His 5

caa Gin

cat His

caa GLn

cat His

caa Gin 10

cat His

caa Gin

cat His

caa Gin

aaa Lys 15

cct Pro

48

gaa

gct

cag

cca

ttc

gct

cat

ctg

acc

atc

aac

gct

gca

tcg

atc

cct

96

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

ALa

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

ALa

Ser

He

Pro

20

25

30

tct

ggt

tct

cat

aaa

gtt

acc

ctg

tct

tgg

tat

cac

gac

cgc

ggt

144

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

^tgg

gct

&&&

atc.

tct

aac

atg

acc

ctg

tct

aac

ggt

aaa

ctg

aga

gtt

192

Trp

ALa

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn.

Gly

Lys

Leu

Arg

Val

50

55

60

aac

cag

gac

ggt

ttc

tac

ctg

tac

gct

aac

atc

tgt

ttc

aac

240

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Asn

65

00

75

80

ttc

acc

gtt

tct

ttc

tgg

ctg

agg

gta

ccg

aaa

gtt

tct

gct

tct

cac

288

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

ALa

Ser

His

85

90

95

ctg

gaa

gtt

aaa

acc

tct

atc

aaa

atc

cca

tct

tca

cat

aac

ctg

atg

336

Leu

Glu

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

aaa

ggt

tct

acc

aaa

aac

tgg

tct

ggt

aac

tct

gaa

ttc

cat

ttc

384

Lys

Gly

GG.y

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

12 0

125

tac

tct

atc

aac

gtt

ggt

ttc

aaa

ctg

aga

gct

ggt

gaa

432

Tyr

Ser

Ile

Asn

Va 1

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

ALa

Gly

Glu

130

135

140

atc

tct

atc

cag

gtt

tct

aac

cct

tct

ctg

gac

cca

gac

cag

gac

480

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145

15 0'

155

160

gct

acc

tac

ttc

ggg

gcc

ttc

aaa

gtt

cag

gac

atc

gac

519

ALa

Thr

Tyr

Phe

Gly

ALa

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

PL 196 790 B1 <210> 20 <211> 103 <212> PRT <2i3> Sekwencja sztuczna <223> .

Opis sstw^rcji sztucznej: fuzja mysiego OPGL, reszty 158-316 modyfikowanego przez wprowadzenie epitopu P30 anatoksyny

tężcowej ze znaczni.kim His

His

Gin

Lys 15

Pro

<400: „„

His

Gin

Met 1

Lys

His

Gin

His 5

Gin

His

Gin

His

Gin 10

Glu

Ala

Gin

Pro

Phe

Ala

His

Leu

Thr

Ile

Asn

Ala

Ser

Ile

Pro

20

25

30

Ser

Gly

Ser

His

^Lys

Val

Thr

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

35

40

45

Trp

Ala

Lys

Ile

Ser

Asn

Met

Thr

Leu

Ser

Asn

Gly

^Ly^s

Leu

Arg

Val

50

55

60

Asn

Gin

Asp

Gly

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe

Asn

65

70

75

80

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

85

90

95

Leu

Glu

Val

Lys

Thr

Ser

Ile

Lys

Ile

Pro

Ser

His

Asn

Leu

Met

100

105

110

Lys

Gly

Ser

Thr

Lys

Asn

Trp

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Phe

His

Phe

115

120

125

Tyr

Ser

Ile

Asn

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

130

135

140

Ile

Ser

Ile

Gin

Val

Ser

Asn

Pro

Ser

Leu

Asp

Pro

Asp

Gin

Asp

145

150

155

160

Ala

Thr

Tyr

Phe

Gly

Ala

Phe

Lys

Val

Gin

Asp

Ile

Asp

165

170

<210> 21 <211> 68 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR

PL 196 790 Β1 <400> 21 agctgcaggt agtcggttgg aacagaacca gaggtttcgt gatgtctgaa acagatgtta 60 gcgtacag 68 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR <400> 22 ctcatctgac catcaacgct gcat 24 <210> 23 <211> 64 <212> DNA ^<213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> opis sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR <400> 23 tttcggtaec ctcagccaga aagaaacggt gaagttgttg aaacagatgt tagcgtacag 60 gtag 64 <210> 24 <211> 61 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR <400> 24 tgagggtacc gaaagtttct gcttctcacc tggaagttaa aacccctatc aaaatccaat 60 c 61 <210> 25 <211> 63 <212> DNA ^<213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR

PL 196 790 Β1 <400> 25 tttcggtacc ctcagccaga aagaaacggt gaagttgttg aacatcaggt tatgtgaaga 60 ttg 63 <210> 26 <211> 62 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> opis sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR <400> 26 tgagggtacc gaaagtttct gcttctcacc tggaaaactg gtctggtaac tctgaattcc 60 at 62 <210> 27 <211> 79 <212> DNA ^<213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> opi_s sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR <400> 27 tacctgcagc tgatggttta cgttgttaaa acccctatca aaatccaatc ttcacataac 60 ctgatgcagt acatcaaag 79 <210> 28 <211> 83 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

^<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR <400> 28 tggaattcag agttaccaga ccagttcagt tcggtgatac cgatgaattt cgaattagct 60 ttgatgtact gcatcaggtt atg 83 <210> 29 <211> 49 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna

PL 196 790 B1 <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR <400> 29 gaatttcgaa ttagctttga tgtactgttc ttcaccagct ctcagtttg 49

<210> <211> <212> <213>

30 53 DNA Sekwencja sztuczna

<220> <223>

Opis sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR

<400> 30 gctaattcga aattcatcgg tatcaccgaa ctggacgcta cctacttcgg ggc 53

<210> <211> <212> <213>	31 26 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223>	^opis sekwencji sztucznej: barter syntetyczny ^PCR
<400>	31

cttactagtc gatgtcctga actttg 26

<21C> <211> <212> <213>	32 74 DNA ^Se^kwencja sztuczna
<220> <223>	Opis sekwencji sztucznej: Starter syntetyczny PCR
<400>	32

agtggaattc agagttacca gaccagtt.tt tggtagaacc acctttcatc aggttatgtg 60 aagatgggat tttg 74

<210> <211> <212> <213>

33 65 DNA Clostridim tetani

PL 196 790 B1 <400> 33 actacctgca gctgatggtt tacgttgtta aaacctctat caaaatccca tcttcacata 60 acctg 65 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 34

Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Lei 15 10 15 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 35

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 15 10 15

Ala Ser His Leu Glu

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie zwierzęcego polipeptydu OPGL I ub j ego podsekwencji, I ub analogu OPGL, który osthdUęi sU ęwigręctgod oslioeotySu OPGL, Ss Wtórgod wordwsUędCd mdUdfiWstjg, w wdciWb których immunizacja zwierzęcia analsoiem wywołuje orsUbktjc przeciwciał przeciw zwierzęcemu pslioeotySswi OPGL, Ss wytwarzania farmaceutycznej kompozycji zawierającej oslipeotyS OPGL, osSsekwgccjc lub scsIso, dbciżających oszism OPGL u zwierzęcia, orzy czym oslioeotyS OPGL jest białkiem własnym, Ss leczenia, zaodbigoacia lub łaosSzenia dotgdOdrdzy lub innych stanów charakteryzujących się naSmierną ressrocją ksści.
2. Zastodowesie wegłub zza^z. 1, zznmieenn tym, że wy^ikk modudkksji zzsoauicczffaSkje eoitsoów OPGL Sla limfscytów B zdotajg zachswana sraz że

- worswaSzsny jest cs najmniej jeSen sbcy eoitso Sla osmscniczych limfscytów T (eoitso Th), i/lub

- worswaSzsna jest cs najmniej jeSna oierwsza reszta, która woływa na kierswanie zmsSyfikswanej cząsteczki Ss ksmórki orezentującej antygen (APC) lub limfscytu B, i/lub

- worswaSzana jest cs najmniej jeSna Sruga reszta, która stymuluje ukłaS immunslsoiczny, i/lub

- worswaSzana jest cs najmniej jeSna trzecia reszta, która sotymalizuje orezentację zmsSyfikswaneos oslioeotySu OPGL ukłaSswi immunslsoicznemu.
3. Zastodowesie wegUJb zzasz^, zznmieenn tym, że modudkksjeodejmujeweroweauzgier jks oruo bscznych sbceos eoitsou Sla ksmórek Th i/lub oierwszej, i/lub Sruoiej, i/lub trzeciej reszty osorzez kswalencyjne albs niekswalencyjne wiązanie z sSoswieSnimi oruoami chemicznymi w OPGL albs jeos osSsekwencji.
4. Zastodowesie wegUJb zzasz^, zznmieenn tym, że modufikksjeodbrmujepodutaaiegieiZiub Selecję, i/lub insercję, i/lub aSSycję aminskwasów.

PL 196 790 B1
5. Zastosowaniewedług zastrz. 4, znamienne tym, że modyfikacjaprowadzi do powstańiafuzji polipeptyZowej.
6. Zastosowanie według zastrz. 4 albo 5, znamienne tym, że przy wprowadzeniu podztansienin i/lub Zelecji, i/lub intercji, i/lub nZZycji nminokwntów zntnZniczo znchownnn zottnje ogólnn ttrukturn trzeciorzęZown OPGL.
7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że mc^c^^^fi^^ccj^ obe-mu-a dupl^accj co nnjmniej jednego epitopu OPGL Zln limfocytów B i/lub wprownZzenie hnptenu.
8. Zastosowanie według zasttz. 2, znamienne tym, że obcy epitop dla Ilmfoccfów T fest immunoZominujący u zwierzęcin.
9. Zastosowanie według zasttz. 2, znamienne tym, że co nanmnie- f eden obcy epitop dla I limfocytów T jett zZolny Zo wiąznnin tię ze znnczną częścią czątteczek MHC klnty II.
10. Zastosowanie według zasti~z. 9, znamienne tym, że co najmniee feden obcy epitop dla IlmUocytów T jett wybrnny tpośróZ nnturnlnego epitopu Zln limfocytów T i tztucznej sekwencji peptyZowej wiążącej tię z MHC-II.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, ze naturalny epiiop dla limfocytów T f est wybrnny tpośróZ epitopów nnntoktyny tężcn, tnkich jnk P2 lub P30, epitopu nnntoktyny Zyfterytu, epitopu hemnglutyniny wirutn grypy (HA) ornz epitopu CS P. falciparum.
12. Zastosowanie według zastóz. 2, tym, że pierwszą resztą fest swoisty partner wiąznnin tię Zln nntygenu powierzchniowego swoistego Zln limfocytów B nlbo nntygenu powierzchniowego swoistego Zln APC, tnki jnk hnpten nlbo węglowoZnn, Zln którego nn limUocytnch B nlbo APC znnjZuje tię receptor.
13. Zastosowaniewedług zasttz. 2, znamienne tym, że druga resz.a fest wybrana spośród cytokiny, hormonu ornz binłkn tzoku cieplnego.
14. Znstosownnie weZług zn8trz. 13, znamienne tym, że cytokinn jett wybrnnn tpośróZ nlbo jett efektywną częścią interferonu y (IFN-γ), Flt3L, interleukiny l (IL-1), interleukiny 2 (IL-2), interleukiny 4 (IL-4), interleukiny 6 (IL-6), interleukiny 12 (IL-12), interleukiny 13 (IL-13), interleukiny 15 (IL-15) ornz czynnikn ttymulującego kolonie grnnulocytów-mnkroUngów (GM-CSF), n binłko tzoku cieplnego jett wybrnne tpośróZ nlbo jett efektywną częścią HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 ornz knlretikuliny (CRT).
15. Znstosownnie weZług zn8trz. 2, znaiienne tyii, że trzecin re8ztn mn chnrnkter lipiZowy i jett tnkn jnk grupn pnlmitoilown, grupn miry8tylown, znkotwiczenie GPI ornz grupn N-ncyloZiglicerolown.
16. Znstosownnie weZług zn8trz. 1, znaiienne ty,, że polipeptyZ OPGL nlbo jego poZtekwencjn zo8tnły zmoZyfikownne w Zowolnej pozycji z 170-192, Zowolnej z pozycji 198-218, Zowolnej z pozycji 221-246, Zowolnej z pozycji 256-261 nlbo Zowolnej z pozycji 285-316, przy czym numerncjn nminokwnsów oZpowinZn numerncji w Zowolnej z tekwencji IZ. Sekw. Nr: 4, 6 i 12 nlbo polipeptyZ OPGL zottnł zmoZyfikownny w Zowolnej z pozycji 171-193, Zowolnej z pozycji 199-219, Zowolnej z pozycji 222-247, Zowolnej z pozycji 257-262 nlbo Zowolnej z pozycji 286-317, przy czym numerncjn nminokwnsów oZpowinZn numerncji w tekwencji IZ. Sekw. Nr: 2; z znchownniem znsnZniczej frnkcji epitopów Zln limfocytów B zwierzęcego OPGL.
17. Znstosownnie weZług znttrz. 16, znaiienne tyii, że moZyftkncjn obejmuje poZstnwienie co nnjmniej jeZnej tekwencji nminokwntowej w pozycji określonej w znttrz. 16 tekwencją nminokwntową o równej nlbo różnej Zługości, którn znwiern obcy epitop Th.
18. Znttotownnie weZług znttrz. 17, znaiienne tyi, że tekwencjn nminokwntown znwiernjącn obcy epitop Th znttępuje nminokwnty 256-261 i/lub 288-302, t/lub 221-241 znnjZujące tię w tekwencji IZ. Sekw. Nr: 4 nlbo nminokwnty 257-262 i/lub 289-303, i/lub 222-243 w tekwencji w IZ. Sekw. Nr: 2 nlbo w polipeptyZzie, gZzie cytteinn oZpowinZnjącn Cyt-221 zottnłn poZttnwionn przez Ser.
19. Znttotownnie frngmentu kwntu nukleinowego, który kołuje OPGL, poZtekwencję OPGL lub nnnlog OPGL pochoZzący oZ zwierzęcego polipeptyZu OPGL, Zo którego wprownZzono moZyfIkncje, w wyniku których immunizncjn zwierzęcin nnnlogiem wywołuje proZukcję przeciwcinł przeciw zwierzęcemu polipeptyZowi OPGL, Zo wytwnrznnin kompozycji fnrmnceutycznej znwiernjącej frngment kwntu nukleinowego obniżnjącej poziom OPGL u zwierzęcin Zo leczenin, znpobiegnnin lub łngoZzenin otteoporopzy lub innych ttnnów chnrnkteryzujących tię nnZmierną retorpcją kości.
20. Znttotownnie wektorn przenotzącego frngment kwntu nukleinowego, który kołuje OPGL, poZtekwencję OPGL lub nnnlog OPGL pochoZzący oZ zwierzęcego polipeptyZu OPGL, Zo którego wprownZzono moZyfikncje, w wyniku których immunizncjn zwierzęcin nnnlogiem wywołuje proZukcję

PL 196 790 B1 przeciwciał przeciw zwierzęcemu polipeptydowi OPGL, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej wektor obniżającej poziomu OPGL u zwierzęcia do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia osteoporozy lub innych stanów charakteryzujących się nadmierną resorpcją kości.
21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że wektor jest zdolny do autonomicznej replikacji.
22. Zassosowanie według 20 albo 2Ί, znamienne tt^im, że wektor jess wybrany z grupy składającej się z plazmidu lub wirusa.
23. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że wektor zawiera w kierunku od 5' —>3' i w funkcjonalnym połączeniu: promotor do kierowania ekspresją fragmentu kwasu nukleinowego, który koduje OPGL, podsekwencję OPGL lub analog OPGL pochodzący od zwierzęcego polipeptydu OPGL, do którego wprowadzono modyfikacje, w wyniku których immunizacja zwierzęcia analogiem wywołuje produkcję przeciwciał przeciw zwierzęcemu polipeptydowi OPGL, ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą peptyd liderowy umożliwiający sekrecję albo włączenie do błony fragmentu polipeptydowego, fragment kwasu nukleinowego, który koduje analog OPGL, podsekwencję OPGL lub analog OPGL określony w zastrz. 1 i ewentualnie terminator.
24. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że wektor po wprowadzeniu do komórki gospodarza jest zdolny albo niezdolny do włączania się do genomu komórki gospodarza.
25. Zastosowanie według zastrz. 23 albo 24, znamienne tym, że promotor w wektorze kieruje ekspresją w komórce eukariotycznej i/lub komórce prokariotycznej.
26. Zastosowanie niepatogennej transformowanej komórki przenoszącej wektor ekspresyjny określony w zastrz. 20 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej transformowaną komórkę do obniżania poziomu OPGL u zwierzęcia do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia osteoporozy lub innych stanów charakteryzujących się nadmierną resorpcją kości.
27. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że transformowana komórka ma zdolność do replikowania fragmentu kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 19.
28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że transformowana komórka jest komórką bakterii.
29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że bakteria jest wybrana z grupy składającej się z Mycobacterium bovis, BCG., Streptococcus spp., E coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae i Shigella.
30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że transformowana komórka wydziela lub niesie na swojej powierzchni OPGL, podsekwencję OPGL lub analog OPGL określony w zastrz. 1.
31. Zastosowanie kompozycji zawierającej:

- fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 19 albo wektor określony w zastrz. 20 oraz

- farmaceutycznie i immunologicznie dopuszczalny nośnik i/lub podłoże i/lub adiuwant do wytwarzania leku zawierającego tę kompozycję do wywoływania produkcji przeciwciał do obniżania OPGL u zwierzęcia, do leczenia, zapobiegania lub łagodzenia osteoporozy lub innych stanów charakteryzujących się nadmierną resorpcją kości.
32. Sposób identyfikacji zmodyfikowanego polipeptydu OPGL, który ma zdolność do indukowania przeciwciał przeciw niemodyfikowanemu OPGL w gatunku zwierzęcia, gdzie niemodyfikowany polipeptyd OPGL jest białkiem własnym, znamienny tym, że obejmuje:

- wytworzenie na drodze syntezy peptydów albo technik inżynierii genetycznej zestawu odrębnych zmodyfikowanych polipeptydów OPGL, gdzie aminokwasy zostały dodane, wstawione, usunięte, lub zastąpione w obrębie sekwencji aminokwasowej polipeptydu OPGL z gatunku zwierzęcia, prowadząc w ten sposób do powstania zestawu sekwencji aminokwasowych zawierających epitopy dla limfocytów T, które są obce dla gatunku zwierzęcia, lub przygotowanie zestawu fragmentów kwasów nukleinowych kodujących zestaw odrębnych zmodyfikowanych polipeptydów OPGL,

- testowanie przedstawicieli zestawu zmodyfikowanych polipeptydów OPGL lub fragmentów kwasów nukleinowych pod kątem ich zdolności do indukowania wytwarzania przeciwciał przez gatunek zwierzęcia przeciw niemodyfikowanym OPGL oraz

- identyfikowanie i ewentualnie izolowanie przedstawiciela(-i) z zestawu zmodyfikowanych polipeptydów OPGL, które znacząco indukują wytwarzanie przeciwciał przeciw niemodyfikowanym OPGL w danym gatunku lub identyfikowanie i ewentualnie izolowanie produktów ekspresji polipeptydu kodowanych przez przedstawicieli zestawu fragmentów kwasów nukleinowych, który indukuje u gatunków zwierzęcych wytwarzanie przeciwciał przeciw niezmodyfikowanemu OPGL.

PL 196 790 B1
33. Sposób wytwarzania kompozycji immunogennej obejmującej przynajmniej jeden zrmot^^^fikowany polipeptyd OPGL, który ma zdolność do indukowania przeciwciał przeciw niemodyfikowanemu OPGL w gatunku zwierzęcia, gdzie niemodyfikowany polipeptyd OPGL jest białkiem własnym, znamienny tym, że obejmuje:

- wytworzenie na drodze syntezy peptydów albo technik inżynierii genetycznej zestawu odrębnych zmodyfikowanych polipeptydów OPGL, gdzie aminokwasy zostały dodane, wstawione, usunięte lub zastąpione w obrębie sekwencji aminokwasowej polipeptydu OPGL z gatunku zwierzęcia, prowadząc w ten sposób do powstania zestawu sekwencji aminokwasowych zawierających epitopy dla limfocytów T, które są obce dla gatunku zwierzęcia,

- testowanie przedstawicieli zestawu pod kątem ich zdolności do indukowania wytwarzania przeciwciał przez gatunek zwierzęcia przeciw niemodyfikowanym OPGL oraz

- domieszanie przedstawiciela(-i) zestawu, który znacząco indukuje w gatunku zwierzęcym wytwarzanie przeciwciał, które oddziaływują z OPGL z dopuszczalnym farmaceutycznie i immunologicznie nośnikiem i/lub podłożem, ewentualnie w kombinacji z przynajmniej jednym adiuwantem dopuszczalnym farmaceutycznie i immunologicznie.
34. Sposób według zasttz. 32 albo 33, tym. że przygotowanie przedstawiciell zestawu obejmuje wytworzenie odrębnych sekwencji kwasów nukleinowych, z których każda sekwencja jest sekwencją kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 20, insercję sekwencji kwasu nukleinowego do odpowiednich wektorów ekspresyjnych, transformację wektorami odpowiednich komórek gospodarza i ekspresję sekwencji kwasów nukleinowych i ewentualnie izolację produktów ekspresji.
35. Sposób według zasSrz. 34, znamienny tym. że wyyworzenie sekwencji kwasów nukleinowych i/lub wektorów uzyskuje się przy pomocy technik amplifikacji molekularnej, takich jak PGR albo przy pomocy syntezy kwasów nukleinowych.