CZ9903657A3

CZ9903657A3 - Modifikované molekuly TNFalfa, DNA kódující takové modifikované molekuly TNFalfa a vakcíny obsahující uvedené modifikované molekuly TNFalfa

Info

Publication number: CZ9903657A3
Application number: CZ19993657A
Authority: CZ
Inventors: Martin Roland Jensen; Soren Mouritsen; Henrik Elsner; Iben Dalum
Original assignee: Farmaceutisk Laboratorium Ferring A/S
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2001-09-12
Also published as: TW510921B; US7118750B1; DE69834556T2; ES2264569T3; SK140999A3; ATE326481T1; BR9811462A; WO1998046642A1; AU7030398A; EP0975668B1; CN1252809A; AR012427A1; EP0975668A1; JP2001521386A; IL132281A0; KR100522289B1; SK285639B6; NO995002L; HUP0001930A2; SI0975668T1

Description

Modifikované molekuly TNFa, molekuly TNFa a vakcíny molekuly TNFa.

modifikované modifikované

Oblast techniky

Vynález se týká molekul lidského cytokinového nádor nekrotizujícího faktoru a (TNFa), které se modifikovaly tak, že po jejich aplikaci lidskému hostiteli jsou schopny vyvolat tvorbu neutralizačních protilátek proti lidskému TNFa divokého typu. Vynález se dále vztahuje na vakcínu lidských TNFa založenou na uvedených modifikovaných molekulách TNFa.

Dosavadní stav techniky

Fyziologicky imunitní systém obratlovců slouží jako obranný mechanizmus proti invazi objektů infekce, jako jsou mikroorganizmy. Cizorodé proteiny je možno účinně odstranit prostřednictvím retikuloendoteliálního systému vysoce specifickými cirkulujícími protilátkami. Viry a bakterie jsou napadeny komplexní baterií buněčného a humorálního mechanizmu, který zahrnuje také protilátky, cytotoxické T lymfocyty (CTL), přirozené buňky K (NK), komplement, atd.. Vedoucím agens tohoto souboru jsou pomocné T lymfocyty (T_H) , které spolupracují s buňkami prezentujícími antigen (APC) a regulují imunitní obranu prostřednictvím komplexní sítě cytokinů.

T_H lymfocyty rozeznávají proteinové antigeny, které jsou přítomny na povrchu APC. Nerozeznávají však přirozený antigen sám o sobě. Je zřejmé, že rozeznávají komplexní ligand, který obsahuje dva komponenty a to „zpracovaný (dělený) proteinový antigen (tzv. epitop T-buněk) a molekulu hlavního histokompatibilního komplexu třídy II (0. Werdelin et al., Imm. Rev. 106, 181 (1988)). Toto rozpoznání umožňuje T_Hlymfocytům, specificky pomocným B lymfocytům, produkovat • · · · · • · · • · · · ► · · » · · ·· » · · I * 9 · 4

99 specifické protilátky proti intaktnímu proteinovému antigenu (0. Werdelin et al., Imm. Rev. 106, 181 (1988)). Daná T-buňka rozeznává pouze jisté kombinace antigen-MHC a bude rozeznávat stejný nebo jiný antigen prezentovaný genovým produktem a jiné alely MHC. Tento jev se nazývá restrikce MHC.

Fragmenty samotných proteinů se také prezentují pomocí

APC, ale v normálním případě je T pomocné lymfocyty ignorují nebo je nerozeznávají. To je hlavní důvod proč jednotlivci obecně ve vlastním séru ne nesou autoprotilátky, které by případně napadaly vlastní proteiny jednotlivce (tzv. autoproteiny). V řídkých případech dojde k poruše a imunitní systém se postaví proti vlastním komponentům jedince, což může vést k autoimunitnímu onemocnění.

Přítomnost některých vlastních proteinů je nevýhodná v situacích, kde ve zvýšené míře vyvolávají příznaky onemocnění. Tak je známo, že nádor nekrotizující faktor TNFa je schopen způsobit kachexii při rakovině a při jiných chronických onemocnění (H.N. Langstein et al. Cancer Res. 51, 2302-2306, 1991). TNFa má také důležitou úlohu v protizánětlivém procesu (W.P. Arend et al , Arthritis Rheum. TNFa. Použitím

1990'

305-315,

33, a neutralizaci monoklonálních protilátek se pak demonstrovalo, že je výhodný pro pacienty trpícími chronickým zánětlivým onemocněním, jako je revmatická artritida (Elliot, et al., Lancet 1994, 3441105-10) a Crohnova nemoc (van Dullemen et al.,

Gastroenterology 109(1): 129-135(1995). Proto existuje potřeba vytvořit způsob vhodný pro vyvolání neutralizujících protilátek proti uvedeným proteinům TNFa a vynález zahrnuje vakcínu proti TNFa, která má tyto vlastnosti.

Nádor nekrotizující faktor

1. Obecný přehled • · • ·

Nádor nekrotizující faktor (TNF) je člen cytokinové rodiny regulačních proteinů (popisuje se v publikaci Walsh, G. and Headon, D. E., Protein Biotechnology, 1994, John Wiley and Sons Ltd. England, p. 257-267), která také zahrnuje interferony a interleukiny. Nyní se rozeznávají dvě formy TNF, jsou to TNFa a ΤΝΓβ. Ačkoli proteiny se váží na stejný receptor a vyvolávají velmi podobnou biologickou odezvu, jsou to však odlišné molekuly a vykazují méně než 30 % homologii. Původní protein, který se nazývá nádor nekrotizující faktor, označuje se jako TNF, správněji TNFa, je také znám jako kachektin. TNFP nebo jako lymfotoxin.

TNFa je produkován mozkovými buňkami a buňkami ledvin a řadou dalších buněčných typů. Za zmínku stojí aktivované makrofágy, monocyty, jisté T-lymfocyty a buňky NK. Komplexní biomolekula nazývané lipopolysacharid (LPS) je nejsilnějším známým induktorem syntézy TNFa. Tato molekula obsahuje jak lipidové tak polysacharidové komponenty a také se nazývá endotoxin. Samotný lipopolysacharid nevykazuje žádnou protinádorovou aktivitu. Zjistilo se, že sérum zvířat, kterým se aplikuje lipopolysacharid obsahuje faktor toxický pro buňky zhoubného bujení a tento faktor produkovaný specifickými buňkami, jako odezva na uvedený lipopolysacharid, se nazývá nádor nekrotizující faktor. Různá jiná činidla, jako jsou některé viry, houby a paraziti, také stimulují syntézu a uvolnění tohoto cytokinu. Dále TNFa může působit autokrinním způsobem tak, že stimuluje svou vlastní produkci.

Přirozený lidský TNFa je homotrimér, který obsahuje tři shodné polypeptidové podjednotky těsně spojené podél trojrozměrné osy symetrie, jak se uvádí dále v textu. Toto uspořádání charakterizuje uspořádání proteinových podjednotek v řadě virových kapsidových proteinů. Jednotlivé polypeptidové podjednotky lidského TNFa nejsou glykosylované a obsahují 157 aminokyselin. Molekula vykazuje molekulovou hmotnost 17 300 a • Φ ·· · ·· ·· φ· • φφ · · · · · · · · •ΦΦΦΦ φ · ···· • φφ φφ · · φ ······ • φφφ φφ φ · •Φ φφ ······· φ· φφ obsahuje jeden intrachainový disulfidový můstek. Z počátku se lidský TNFa syntetizuje jako molekula prekurzoru obsahující 233 aminokyselin. Proteolytické pre-sekvence -76 až -1 zahrnuje signální sekvenci uvolňující přirozený TNFcc. TNFa může také existovat ve formě vázané na membráně s molekulovou hmotností 26 000. Tři monomérní podjednotky TNFa spojené nekovalentně tvoří trimér, který se popisuje dále v textu.

TNFa vyvolává své biologické účinky tím, že se váže na specifické receptory přítomné na povrchu vhodných buněk. Identifikovaly se dva odlišné receptory TNFa. Jeden receptor (TNF-R55) má molekulovou hmotnost 55 000, zatímco druhý receptor (TNF-R75) má molekulovou hmotnost přibližně 75 000.

Tyto dva odlišné typy receptorů vykazují ne více jak 25 % homologie. TNF-R55 se nachází ve velkém množství buněk, zatímco výskyt receptoru TNF-R75 je více omezen. Oba receptory jsou transmembránové glykoproteiny s extrabuněčnou vazebnou oblastí, hydrofóbní transmembránovou oblastí a vnitrobuněčnou efektorovou oblastí.

Skutečný molekulární mechanizmus, kterým TNFa vyvolává své biologické účinky zůstává neznámý. Navázání TNFa na receptor se zdá být vedle aktivace adenylátcyklázy, fosfolipázy A a proteinové kinázy důležité pro různé pochody zprostředkované G-proteiny. Skutečné biologické působení vyvolané TNFa se může lišit podle typu buněk. Na působení TNFa na citlivé buňky se podílejí také jiné faktory, jako je přítomnost dalších cytokinů.

Gen TNFa se klonoval a začlenil do řady bakteriálních a eukaryontních expresívních rekombinantních systémů. Výsledná schopnost produkovat velké množství čištěného biologicky aktivního TNFa umožňuje klinicky hodnotit řadu onemocnění, například zhoubné bujení. Hodnotila se řada takových studií, kde se použil samotný TNFa nebo v kombinaci s interferony, avšak dosáhlo se málo uspokojivých výsledků. Pacientům nelze

9 9 99

9 9 · 9

9 9 9

9

9 9

9

9 9 aplikovat velké množství TNFa vzhledem k jeho toxickým jestli ne letálním vedlejším účinkům.

Jak se uvádí shora v textu prodloužená produkce nevhodně zvýšeného množství TNFa může také vést k vývoji kachexie, což je doprovodný symptom často spojený s chronickými parazitickými a jinými infekcemi a se zhoubným bujením. TNFa se také podílí na tvorbě metastáz a na růstu některých nádorů, stejně jako na vyvolání anemie. Dále TNFa se přímo podílí na vývoji jistých chronických zánětlivých poruch u lidí, které zahrnují revmatickou artritidu a Crohnovu nemoc. V těchto případech je výhodné podávat monoklonální protilátky proti TNFa. TNFa se také podílí na osteoporéze a lupénce. Navíc se na zvířecích modelech prokázalo, že aplikace protilátek proti TNFa může snížit nebo předejít odmítnutí štěpů nebo transplantované tkáně.

2. Struktura TNFa

I. Úvod

Určila se třírozměrná struktura lidského nádor nekrotizujícího faktoru (TNFa) (popisuje se v publikaci „Tumor Necrosis Factors,, Structure, Function and Mechanism of Action ed. Bharat B. Aggarwal and Jan Vilcek, 1992 Marcel Dekker, Ind., New York, Chapter 5 „Crystal structure of TNFa, „ Jones, Ε. Y. Stuart, D.I. and Walker N. P. C.). Biologické působení TNFa je závislé na jeho interakci s jeho receptorem. Tyto interakce jsou určeny přesným uspořádáním správně balené terciální struktury. Pak aby se porozumělo mechanizmu, jak molekula TNFa uskutečňuje svou biologickou funkci na úrovni aminokyselinových interakcí, je nutné znát ne jenom aminokyselinovou sekvenci, ale také tří rozměrnou strukturu.

II. Třírozměrná struktura ·· ·Φ Φ ΦΦ 99 99

9 9 99 9 9 9 9 9 9

9 9 999 9 9 9 9 9 9 • 99 99 9 9 9 999999

9 9 9 9 9 9 9 ·· 9 9 99 9 9 99 9 9 9 99

Za použití analytické ultracentrifugace, rozptylu X-záření s malým úhlem rozptylu a elektroforézy na gelu se ukázalo, že biologicky aktivní TNFa se v roztoku vyskytuje v trimérovém uspořádání a studie řetězení ukázala, že jde o aktivní formu proteinu (Smith and Baglioni , 1987, J. Biol. Chemistry 252,

6951-6954). Testy navázání ukázaly, že trimér je alespoň 8krát více aktivní, než monomer. Experimentální důkaz ukázal, že přirozený a rekombinantní TNFa existuje za fyziologických podmínek převážně jako trimér. Analýza spektra cirkulárního dichroizmu zařadila TNFa do tzv. „all-sheet třídy proteinů (Davis et al., Biochemistry 1987, 26, 1322-1326, kde se popisují výsledky strukturní analýzy čištěného rekombinantního TNFa sulfhydrylovou titrací, gelovou filtrací a metodou cirkulárního dichroizmu). V případě lidského rekombinantního TNFa existuje několik různých krystalových forem. Všechny uvedené krystalové formy vykazují krystalografickou a/nebo nekrystalografíckou třírozměrnou symetrii indikující přítomnost TNFa jako triméru v podobě krystalu. Triméry TNFa se nacházejí ve velmi těsně zabaleném uspořádání perforovaném rozpouštěcími kanálky s průměrem 100 Á. Na kontaktech při balení krystalu se podílí jen velmi malá část povrchu molekuly. Takové kontakty mohou snadno porušit několik vedlejších řetězců a možná dokonce i krátké části inherentně flexibilního krátkého řetězce při jejich preferovaném uspořádání v roztoku.

A. Svinutí hlavního řetězce monoméru TNFa

Tvar jedné podjednotky triméru TNFa se 157 aminokyselinami je podobné klínu s výškou přibližně 55 Á a s maximální šířkou 35 S, která se měří při základně. Topologie hlavního řetězce je zobrazena na obrázku č. la až c. Jde v podstatě o βsendvičovou strukturu tvořenou dvěma antiparalelními βskládanými listy. Svinutí hlavního řetězce tvoří klasický • 1 9 9 99 • 1 19

1 1 9 1

9 9 9 9

9 111 919 • 119 9 1 « · ·· ·· 111 1191 91 11 „jellyroll motiv (obrázek č. 1c) (který je běžný u proteinů virového kapsidu). Názvosloví na obrázku č. 1 upravené pro účely označení jednotek sekundární struktury je v souladu s úmluvou platnou pro virové struktury. Je přítomno všech 8 standardních β-řetězců (B až I), ale mezi B a C je inzerce, která začleňuje mezi hrany obou β-listů krátký řetězec a zkracuje N-terminální část řetězce tak, že každý β-skládaný list obsahuje pět antiparalelních β-řetězců, přičemž zadní βlist obsahuje β-řetězce Β', Β, I, D a G a přední list obsahuje β-řetězce C', C, Η, E a F.

N-konec je vysoce flexibilní. Tato oblast stejně jako zbytek 10 (zobrazeno na obrázku č. Ib) je spíše nezávislý na zbytku molekuly. Naopak C-konec se ukládá na základnu zadního β-listu a tvoří integrální část relativně ploché sekundární strukturní jednotky. Stupňování délek β-řetězců a inzerce mezi β-řetězci B a C působí proti produkci předního povrchu, který je tvořen skoro celý smyčkami. Tvoří „maskovanou stranu βsendviče, která je v rozpouštědle přítomna jako trimér. Výsledek krystalografických dat je mírou relativní flexibility různých částí struktury, β-řetězce tvoří značně neflexibilní svinutí. Zvláště zadní β-list se nachází v jádru triméru a v podstatě je nehybný. Jak se očekávalo tvoří smyčku, která zdobí vnější povrch molekuly přístupný rozpouštědlu, který vykazuje vysoký stupeň pružnosti/pohyblivosti. Obecně zde dochází ke snížení nehybnosti, protože jádro je těsněji zabaleno v horní části molekuly.

B. Obecná topologie triméru TNFa

Tři monomérní podjednotky TNFa nekovalentně spojené tvoří kompaktní, konikální trimér, jehož délka je přibližně 55 Á a maximální šířka je 50 R. β-řetězce tří jednotlivých β-sendvičů leží přibližně paralelně (náklon je přibližně 30°) ·· • ·

999 9 9 9 9

9 9

9 9 9 9

s trojrozměrnou osou triméru. Interakce mezi podjednotkami vztažená k třírozměrné ose probíhá prostřednictvím jednoduchého pakování β-sendviče hrana k ploše. Hrana βsendviče obsahující řetězce F a G z jedné podjednotky křižuje zadní β-list (GDIBB') trojrozměrných příbuzných podjednotek (zobrazeno na obrázku č. 2) . C-konec leží blízko třírozměrné osy. Mód balení hrana na plochu dává vzniku extrémně těsnému spojení mezi jednotkami. Tak se rozpouštědlo nemůže dostat k jádru triméru.

C. Distribuce typů aminokyselin

Distribuce typů zbytků ve třírozměrné struktuře TNFa odráží obecné pravidlo v případě proteinů: Hydrofobní zbytky se nachází v jádru molekuly, zatímco nabité zbytky jsou na povrchu. Jádro sendviče TNFa je naplněno podle očekávání vloženými velkými nepolárními zbytky.

Rozložení energie systému nepodporuje existenci TNFa v monomérním stádiu. V případě velké plochy rozhraní složené z komplementárních zbytků (například polární zbytky uspořádané proti polárním zbytkům) při ztrátě oblasti povrchu přístupné pro rozpouštědlo dochází k uspořádání energie, které je výhodné pro tvorbu oligoméru (to znamená triméru).

B. Místně řízená mutageneze.

Úloha různých specifických zbytků a oblastí molekuly TNFa s ohledem na její biologickou (cytotoxickou) aktivitu a schopnost vázat se na receptor se zkoumala tak, že se zbytky nahradily odlišnými aminokyselinami nebo se odstranila část sekvence za použití metody místně řízené mutageneze („Tumor Necrosis Factors, , Structure, Function and Mechanism of Action ed. Bharat B. Aggarwal and Jan Vilcek, 1992 Marcel Dekker, Ind., New York, Chapter 5 „Crystal structure of TNFa, „ Jones, Ε. Y. Stuart, D.I. and Walker Ν. P. C., p. 113 -119).

• 0 ·· 0 00 00 00 •00 · · 0 0 00««

000 0« 0 0 0000 •000· 0 00 000 000

0000 00 0 0 ·· 000 0000 ·· 00

Delece až osmi zbytků z N-konce, aniž dojde k nějaké nežádoucí změně v biologické aktivitě slouží ke zdůraznění nepodstatnosti této oblasti ve stabilitě molekuly. Nterminální zbytky uplatňují nepřímý účinek druhého stupně na biologickou účinnost triméru TNFa.

Nekonzervativní substituce v normálním případě vysoce konzervativních zbytků, které tvoří těsně zabalené jádro βsendviče, deformuje strukturu a proto poruší biologickou aktivitu TNFa (Yamagishi et al., Protein Engineering, Vol. 3,

No. 8, p. 713-719 (1989)). Řada takových mutovaných proteinů (muteinů) netvoří stabilní, správně svinuté molekuly.

V hydrofobní oblasti u paty třírozměrné osy jsou dovoleny některé konzervativní substituce. Zdá se však, že blízko vrcholu triméru v těsněji zabalené oblasti existuje daleko větší tolerance. Zvláště Cys 69 a Cys 101, které tvoří disulfidový můstek mezi dvěma spojujícími smyčkami na těsně zabaleném vrcholu molekuly, jsou relativně necitlivé na změny (zobrazeno na obrázku č. la) . V obecném případě za účelem zachování nějaké biologické aktivity TNFa, mutace blízko centrální osy TNFa musí být vysoce konzervativní, při čemž se zachová tvar TNFa.

Zbytky na povrchu molekuly mají podstatně větší volnost mutovat, aniž se poruší struktura. Taková drastická redukce biologické aktivity TNFa v této oblasti ukazuje přímý vliv uvedených zbytků na funkční interakce triméru TNFa s jeho receptorem. Zbytky obsahující Arg 31, Arg 32 a Ala 33, které se nachází ve spojovací smyčce mezi řetězcem B a B'zadního βlístu, Ser 86 a Tyr 87, které se nachází ve spojovací smyčce mezi řetězci E a F na předním β-listu, a Glu 146, který se nachází na spojovací smyčce mezi H řetězcem předního β-listu a I-řetězcem zadního β-listu, se jeví být uvedenými aminokyselinovými zbytky (zobrazeno na obrázku č. 3) . Spadají do dvou odlišných velmi důležitých oblastí na přední a zadní «· « 44 ·4 99 • 99 44 44 4 4·· • 4444 4 4 4··· • 4· ·4 4 4 4 444444 • 444 44 4 4

44 444 4444 44 44 straně monoméru TNFa. Distribuce všech delečních mutantů bez ohledu na strukturní kategorii dále podporuje tento obrázek. Existenci těchto důležitých bodů v případě citlivosti biologické funkce na mutaci se popisuje v publikaci Yamagishi et al., Protein Engineering, Vol. 3, No. 8, p. 713-719 (1989); goh et al., Protein Engeneering, Vol. 4., No. 4, p. 385-389 (1991)).

Studie mutací polypeptidu lidského TNFa se popisuje v řadě patentových přihlášek.

Yamagishi et al. (publikace EP 251 037) popisuje řadu místně-specifikovaných mutovaných molekul TNFa, které jsou rozpustné a vykazují cytotoxickou a protinádorovou aktivitu, která je charakteristická pro lidské TNFa in vitro a/nebo in vivo.

Jiné muteiny, které vykazují aktivitu, se popisují v publikaci WO 90/07579. Muteiny s větší vazebnou afinitou ku lidskému receptoru p75-TNF a p55-TNF se popisují v publikaci EP-A-619 372.

Žádná z uvedených citací nepopisuje úpravu molekuly TNFa za účelem zrušení biologické aktivity TNFa a poskytnutí schopnosti indukovat protilátky proti lidskému TNFa divokého typu.

Tyto publikace však poskytují obecné informace s ohledem na TNFa a jeho biologické účinky. Také produkce a exprese analogů TNFa a jejich tvoření se popisují jako testy navázání na receptor.

4. Shrnutí

Získalo se velké množství dat, které slouží ke zkoumání specifického vztahu struktury a funkce TNFa. Všechny dostupné důkazy podtrhují důležitost triméru jako stabilní přirozené jednotky. Je zřejmé, že uvedené dvě důležité oblasti, které se nacházejí na oddělených stranách monoméru TNFa jsou těsně

99 « * · · * 9 9 9

999 99 9 • · ·« ·♦ • 9

99 • · · • · · ·· • 9 · * 9 · 9

9 9 9 vedle sebe a považují se za sousedící podjednotky v triméru. Oblast, která je důležitá pro funkčnost molekuly, obsahuje zbytky 31 až 35, 84 až 87 a 143 až 148 a nachází se na rozhraní mezi dvěmi podjednotkami na spodní polovině triméru.

V publikaci Yamagishi et al., Protein Engineering, Vol. 3, No. 8, p. 713-719 (1989) se popisuje ztráta schopnosti vázat se na receptor, stejně jako cytotoxicita mutace Asp 143 až Tyr.

V publikaci Tsujimoto et al., J. Biochem. 101, p. 919-925 (1987) se popisuje podobný účinek v případě Arg 31 a Arg 32 až

Asn a Thr. Toto místo může být spojeno přímo s vazbou na receptor stejně jako s cytotoxicitou. Je zajímavé, že oblast vazby na receptor TNFa leží pravděpodobně na rozhraní dvou podjednotek.

Detailní třírozměrná struktura TNFa slouží k vysvětlení celé řady pozorování v oblasti vazeb protilátek, oligomerizace a místně řízené mutageneze. Jestliže se zvažuje struktura v kombinaci s jistými rozsáhlými místně řízenými mutanty, pak oblast biologické důležitosti s ohledem na vazbu na receptor se nachází v podjednotkách ve spodní polovině triméru.

V publikaci WO 95/05849 se popisuje způsob úpravy samotných proteinů tak, aby vyvolaly protilátkovou odezvu proti samotnému neupravenému proteinu, přičemž analog samotného proteinu se připravuje molekulárním biologickým způsobem. Jeden nebo více fragmentů samotného proteinu se substituují jedním nebo více peptidových fragmentů, které obsahují imunodomínantní cizorodé epitopy T-buňky.

Dříve než se podala přihláška WO 95/05849 byla známa konjugace peptidů nebo proteinů zahrnujících vlastní proteiny s nosičovým proteinem obsahujícím epitop T-buněk. Dokument WO 92/19746 popisuje rekombinantní polypeptid obsahující sekvenci LHRH, jeden nebo více epitopů T-buněk a místo purifikace, které se využívá u zvířecích imunokastračních vakcín.

• ·

99 • · ··· • · • 9999 99 ·· ·· » « · ► 9 9 ·· ► · · 9 ► 9 9 9

99

V dokumentu WO 95/05849 se uvádí, že imunodominantní epitop T-buněk se začlení tak, že lemující oblasti původního proteinu obsahující alespoň 4 aminokyseliny jsou zachovány na libovolné straně začleněného epitopu. Jinými slovy epitop by neměl byt v konjugaci s vlastním proteinem jako fúzní protein. Upřednostňuj e se, aby se provedla substituce tak, aby se podstatně zachovala terciální struktura původního proteinu. Nezávisle na tom neexistuje žádný specifický návod, který například určuje optimální vnitromolekulovou polohu začleněného epitopu za účelem vzniku silné protilátkové odezvy proti neupravovanému vlastnímu proteinu. Správná poloha se bude lišit pro každý určitý vlastní protein , ale na základě obecného pravidla specifikace lze nejvhodnější polohu(y) stanovit aniž je nutné provádět experimenty vybíráním peptidů, které obsahují vhodné imunodominantní epitopy, měnit v různých částech molekuly vlastního proteinu peptidové sekvence v podstatě stejné délky a vhodnými testovacími metodami stanovovat vyvolanou protilátkovou odezvu.

Je pravděpodobně velmi obtížné za použití současných modelujících nástrojů předpovědět, zda substituce jednoho nebo více peptidových fragmentů v proteinu vede ke změně v terciální struktuře původního proteinu. Proto v programech pro vývoj léčiv, kde hlavní snahou je vyhledávání vedoucí látky, se musí tento postup vést jako standardní skreening na začátku fáze vývoje, aby se vyhodnotilo, které upravené vlastní proteiny si zachovávají terciální strukturu původního proteinu. To se může provést za použití několika experimentálních metod, které se popisují v řadě učebnic o charakterizaci proteinu. Používají se například fluorescenční spektroskopie, cirkulární dichroizmus UV záření, Fourierova transformovaná infračervená spektroskopie a vícedimenziální metody NMR („Physical Methods to Characterize Pharmaceutical Proteins, Pharamaceutical Biotechnology Vol. 7. Eds. J.N.

Herron, W. Jiskoot and D. J. A. Crommelin, Plenům Press, New ·· toto ··· · • ···· • · · · · • ·· · toto·· · •to ·· ·· • to · · · • ···· • · ··· ··· • ·· ·♦· ·· ··

York (1995)). V ideálním případě se ve skreeningovém procesu, kdy se hledá vedoucí sekvence, používají jedna nebo více experimentálních metod, jenž se zmiňují shora v textu. Tyto metody se mohou kombinovat za účelem hodnocení, zda dojde ke změně terciální struktury nebo ne.

Podstata vynálezu

Účelem uvedeného vynálezu je návod, jak lze upravit určitý vlastní protein, který spadá do rozsahu patentu WO 95/05849, lidský TNFa, aby byl biologicky neaktivní a jak umožnit vyvolání silné odezvy neutralizujících protilátek proti biologicky aktivnímu TNFa divokého typu. „Biologicky neaktivní se zde porovnává s aktivitou TNFa divokého typu, hlavně s jeho cytotoxickou aktivitou.

Z diskuse o terciální struktuře TNFa uvedené shora v textu vyplývá, že biologicky aktivní TNFa je trimér skládající se ze tří podjednotek. „Zadní β-list reprezentuje „skrytou plochu kontaktu mezi podjednotkami, ke kterým se rozpouštědlo způsobuje způsob balení v této oblasti molekulu TNFa aktivit. Naopak „přední β-list a spojovací oblasti poskytují přístupnou povrchovou plochu, která zahrnuje oblasti reagující s receptory TNFa. Protilátky proti těmto oblastem budou proto pravděpodobně schopny interferovat s vázáním receptoru a proto budou neutralizovat TNFa.

Odborník, který chce zkonstruovat detoxifikovaný a stále imunogenní TNFa podle publikace WO 95/05849 proto jako první volbu začlení imunodominantní epitop T buněk do zadního β-listu monomeru TNFa. Úprava této oblasti pak s největší pravděpodobností poruší biologickou aktivitu TNFa a přední βlist dostupný pro receptor zůstane volný za účelem interakce „hrana k ploše, budou většinou jejích biologických coz nedostane,

Podstatné substituce nevyhnutelně zbavovat • 9 99 · 9 9

9 9 9

999 999

9

99 • ·«♦· ·· »· * * · · • · ··· • · · • · · · ·* tt 9 s protilátkami. To je také v souladu s diskusí o místně řízené mutagenezi v těsně zabaleném jádru β-sendviče, která je uvedena shora v textu.

Překvapivě tomu tak není. Jak je zřejmé z výsledků testů uvedených dále v textu, výsledek je trochu rozporný, protože substituce zahrnující B a G řetězce zadního β-listu překvapivě poskytuje analogy TNFa, které jsou schopny vyvolat neutralizační protilátky proti TNFa.

Vynález popisuje získání upravené molekuly lidského TNFa schopné vyvolat neutralizační protilátky proti lidskému TNFa divokého typu po aplikaci uvedené upravené molekuly TNFa lidskému hostiteli, přičemž alespoň jeden fragment peptidu molekuly lidského TNFa se substituuje alespoň jedním peptidem, o kterém se ví, že obsahuje imunodominantní epitop T buňky nebo zkrácenou formu uvedené molekuly obsahující imunodominantní epitop a jednu nebo obě lemující oblasti molekuly lidského TNFa obsahující alespoň jeden TNFa epitop B buňky. Substituce podstatně změní aminokyselinové sekvence předního β-listu, libovolnou ze spojovacích smyček a/nebo libovolný řetězec z Β', I nebo D zadního β-listu. Dedukcí se vyvozuje, že by se mělo zabránit substituci v řetězcích B a G zadního β-listu.

Termín „podstatná změna znamená změnu, která je více než pouhá konzervativní substituce jednotlivých aminokyselin a více jak bodová mutace, která nemění sekundární a/nebo terciální strukturu TNFa divokého typu. Jinými slovy epitop T buňky zavedený do sekvence TNFa by měl přednostně začlenit sekvenci, která vykazuje velmi nízkou homologii se sekvencí TNFa divokého typu.

Vynález dále popisuje získání upravené molekuly lidského TNFa, která je schopna vyvolat po aplikaci lidskému hostiteli neutralizační protilátky proti lidskému TNFa divokého typu,

44

4 4 4

4

4444

44

4 4

4 4 44

4 9 4 * 4 4 4

44 přičemž alespoň jeden peptidový fragment molekuly lidského TNFa se substituoval alespoň jedním peptidem, který je znám, že obsahuje imunodominantní epitop T buňky nebo zkrácenou formu uvedené molekuly obsahující imunodominantní epitop a jednu nebo více lemujících oblastí molekuly lidského TNFa, která obsahuje alespoň jeden TNFa epitop buňky B, kdy uvedená upravená molekula TNFa v podstatě nevykazuje aktivitu TNFa.

Termín „v podstatě nevykazuje aktivitu TNFa znamená, že v případě aplikace takové upravené molekuly člověku, výsledkem nejsou podstatné škodlivé účinky, které jsou způsobeny známými účinky cytokinů, které se uplatňovaly v případě přirozeného TNFa. Jinými slovy upravené molekuly TNFa podle vynálezu jsou farmaceuticky přijatelné látky.

Za účelem testování skutečnosti, zda upravená molekula lidského TNFa podle vynálezu v podstatě nevykazuje aktivitu TNFa, se může aplikovat zde definovaný biotest L929. Dále za účelem potvrdit imunogenní charakter upravených molekul TNFa, protilátky vyvolané proti upravené molekule TNFa ve vhodném hostiteli budou podstatně inhibovat aktivitu TNFa divokého typu v biotestu L929, který se popisuje shora v textu, a/nebo uvedené protilátky budou podstatně inhibovat navázání TNFa divokého typu na TNFa receptor 1 (TNFa-R55) o molekulové hmotnosti 55 000 nebo na TNFa receptor s molekulovou hmotností 75 000 (TNFa-R75).

Těmito vhodnými hostiteli mohou být primáti, jako je například opice rhesus nebo cynomuleus, hlodavci, jako jsou například krysy nebo myši nebo morčata nebo králík.

Testy vhodné pro zhodnocení potenciálu upravených molekul podle vynálezu se provádějí za použití protilátek nebo antiséra v koncentraci vztaženou k uspořádání testu a odráží fyziologické podmínky s ohledem na použitá činidla nebo umožňují extrapolovat fyziologické podmínky z výsledků • · · · • 9 9 9

999 999

9

99 ·· ·* » · · » · » « » 1 ► · · «

99 získaných z testu. Jinými slovy výsledky testu musí ukazovat, že fyziologická koncentrace protilátek proti TNFa in vivo je schopna snížit aktivitu TNFa v rozsahu alespoň 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % nebo stanovení takových podmínek.

Rozumí se, že termín „podstatná inhibice TNFa divokého typu znamená takovou inhibici, jejímž výsledkem je redukce nebo eliminace škodlivých účinků TNFa divokého typu. Je vhodné, aby taková inhibice byla alespoň 10 %, alespoň 15

7é

Odborník zná způsob alespoň 25 alespoň 45 alespoň 65

o.

o r

Q,

Ό f alespoň 30 alespoň 50 alespoň 70 •6 t

O.

Z

O, '0 f alespoň 35 alespoň 55 alespoň 75 %, alespoň 40 %, alespoň 60 %, alespoň 80 alespoň 85 %, alespoň 90 %, alespoň 95 % nebo dokonce 100 %.

Upravené molekuly lidského TNFa podle vynálezu se charakterizuji tím, že substituce se provede v oblastech molekuly TNFa, které zahrnují řetězce předních β-listů a/nebo spojovací smyčky tak, že se v podstatě zachová struktura βlistu libovolného z řetězců zadního'β-listu.

Ačkoli se to ještě experimentálně plně neověřilo, předpokládá se, že tato vlastnost je běžná pro řetězce, které tvoří zadní β-list tak, že se s výhodou provedou substituce v oblastech molekuly TNFa, která neobsahuje žádný úplný řetězec zadního β-listu. Ze shora uvedené diskuse vyplývá důležitost zbytků 31 až 35. Předpokládá se, že by se také mělo zabránit spojení smyček mezi jednotlivými řetězci zadního βlistu.

Připouští se však, aby se substituce provedla v oblastech molekuly TNFa, která zahrnuje pouze segment řetězce D zadního β-listu.

Podle preferovaného provedení vynálezu substituce obsahuje alespoň segment řetězce H předního β-listu a segment spojovací

·· • · · • · ·

• ···· smyčky řetězce I zadního β-listu, upřednostňují se aminokyseliny 132 až 146. Podle jiného provedení vynálezu substituce obsahuje segment řetězců Hala celou spojovací smyčku, upřednostňují se aminokyselinové sekvence 132 až 152. Podle dalšího preferovaného provedeni vynálezu substituce zahrnuje segment řetězce D zadního β-listu, alespoň segment řetězce E předního β-listu a celou spojovací smyčku, upřednostňují se aminokyseliny 65 až 79 nebo 64 až 84.

Podle dalšího provedení vynálezu substituce obsahuje celé řetězce C' a C předního β-listu a segment řetězce D zadního βlistu, upřednostňují se aminokyseliny 40 až 60.

V dalším preferovaném provedení vynálezu substituce zahrnuje alespoň segment řetězce E předního β-listu a jednu nebo obě spojovací smyčky, upřednostňují se aminokyseliny 76 až 90.

Začleněný epitop T buňky by měl být s výhodou různorodý a měl by být imunogenní pro většinu lidských HLA třídy II. Aplikovatelné epitopy je možné získat například z Tetanus toxoid, upřednostňuje se epitop P2 a/nebo P30 (popisuje se v publikaci Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol. 19: 2237-42, 1989. Také se mohou použít epitopy získané z organizmu Diphtherie toxoid.

Preferované upravené molekuly lidského TNFa (analogy TNFa) s odkazem na polohu substituce jsou uvedeny v přiložených sekvencích SEQ ID NO:8 a SEQ ID NO: 16.

Jiné aplikovatelné analogy TNFa jsou uvedeny na seznamu sekvencí jako SEQ ID NO: 4, 10, 14 a 16.

Vynález dále popisuje zkrácené analogy shora uvedených upravených analogů TNFa podle vynálezu. Zkrácené analogy molekul TNFa obsahující různorodý a imunodominantní epitop T buňky a jednu nebo obě lemující oblasti obsahující alespoň jeden TNFa epitop B buňky, s výhodou obsahuje alespoň pět aminokyselin, budou také ve vakcíně TNFa podle vynálezu • · · zahrnovat aktivní složku. Epitop T buňky bude vyvolávat proliferaci T buněk, když se prezentuje molekulám MHC třídy II prostřednictvím APC, zatímco epitop B buňky bude .rozeznán receptory imunoglobulinu na B buňkách a bude v podstatě prezentován prostřednictvím molekul MHC třídy I na těchto buňkách. To zahrnuje základ pro vyvolání imunitní odezvy proti TNFa divokého typu, který nese epitop B buňky podle publikace WO 95/05849 a podle vynálezu.

Epitopy B buňky se mohou v molekule TNFa identifikovat jak teoreticky tak i experimentálně. Publikovaly se algoritmy identifikace potencionálních lineárních epitopů B buňky a to tvoří základ experimentálně založenému zkoumání podstaty těchto potencionálních epitopů. U protilátek vyvolaných v heterogenním systému (například králík) jako odezva na injekce zkrácených molekul TNFa obsahujících epitopy T buňky se může analyzovat schopnost vázat přirozený lidský TNFa. S výhodou ho mohou vázat neutralizačním způsobem. U panelu monoklonálních protilátek s neutralizačními vlastnostmi se může testovat in vitro schopnost vázat potencionální epitopy buňky T molekuly TNFa. Uvedené strategie se používají při identifikaci možných a nej lepších epitopů buňky B.

Věří se, že shora uvedené analogy TNFa zůstávají ve formě monoméru, protože jejich úprava pravděpodobně poškodila inherentní trimerizační tendenci molekuly TNFa divokého typu.

Vynález dále popisuje diméry, oligoméry, zvláště triméry a multiméry nárokovaných upravených molekul TNFa, které se připravují tak, že se odstraní aktivita TNFa a také izolované molekuly DNA, které kódují nárokované upravené molekuly TNFa.

Izolované molekuly DNA kódující preferované analogy TNFa mají sekvence uvedené jako SEQ ID NO: 7 a 15 a molekuly DNA kódující jiné aplikovatelné analogy jsou uvedeny jako SEQ ID NO: 3, 9, 13 a 15.

• · • ·

• · · · • · · • ····

Vynález dále zahrnuje vektory obsahující izolované molekuly DNA kódující analogy a expresivní vektory obsahující uvedené molekuly DNA operativně spojené s vhodnou sekvencí, která řídí expresi.

Vynález dále popisuje hostitele transformovaného expresivním vektorem za účelem získání uvedeného analogu.

Uvedeným hostitelem může být libovolný hostitel, který se běžně používá pro expresi. Je to například kmen bakterie, kvasinky nebo houby nebo hmyz, savčí nebo ptačí buněčná linie.

Vynález dále popisuje způsob produkce nárokovaných analogů TNFa , přičemž hostitelské buňky transformované expresivním vektorem se kultivují za vhodných podmínek, které umožňují produkci analogu a produkovaný analog se z nich získává.

Jestliže je to nutné upravené molekuly TNFa podle vynálezu se mohou exprimovat jako fúzní protein nebo tvořit jeho část spolu s molekulou vhodného adjuvans. Upřednostňuje se imunologicky aktivní adjuvans, jako je GM-SCF, HSP-70 nebo interleukin, například interleukin 2.

Upravené molekuly TNFa se produkují substitucí vhodných segmentů genu kódujícího peptid, který obsahuje nebo zahrnuje imunodominantní epitopy T buňky, do genu kódujícího molekulu přirozeného lidského TNFa. Pak se upravený gen TNFa exprimuje ve vhodném eukaryontním nebo prokaryontním expresivním vektoru. Exprimované upravené molekuly TNFa se čistí a znovu zavinují, jak se popisuje dále v textu.

Ačkoli může být výhodné začlenit celý epitop T buňky, v některých případech je výhodné začlenit peptidovou sekvenci obsahující epitop i lemující oblasti z proteinu, ze kterého se získal epitop.

Vynález dále ukazuje, že upravené molekuly lidského TNFa se mohou také použít jako vakcíny proti TNFa. Sytrategie při vývoji vakcín založených na čištěných proteinech, jako je modulovaný vlastní protein, obecně odpovídá strategiím * · 0 · ·

9 000 000 • 0 •· 00 90 přípravy libovolných jiných terapeutických produktů založených na proteinu. Potencionální problémy a návody, které jsou nutné, aby se tyto problémy obešly, jako je například zachování terciální struktury, se popisuje v mnoha učebnicích , jako je například „Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Proccesing and Delivery Systems Ed. A. K. Banga; Technomic Publishing AG, Basel 1995. Odborníkům je zřejmé použití adjuvans, jako je například hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý (Adju-Phos) , fosforečnan vápenatý, muramyldipeptidový analog nebo současný vývoj vakcinačních adjuvans, jako jsou biologicky rozložitelné mikročástice.

Příprava vakcín podle vynálezu, které zahrnují jako aktivní složky peptidové sekvence jsou v oboru obecně známy. Popisují se například v publikacích US patenty 4,608,251, 4,601,903, 4,599,231, 4,599, 230, 4,596,792 a 4,578,770. V typickém případě se takové vakcíny připravují jako aplikovatelné injekcí a to buď jako kapalné roztoky nebo suspenze; jako pevné formy, které jsou vhodné pro přípravu roztoků nebo suspenzí. Přípravek může být také ve formě emulze. Aktivní imunogenní složka se často smíchá s ekcipienty, které jsou farmaceuticky přijatelné a jsou kompatibilní s aktivní složkou. Vhodnými ekcipienty jsou například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, etanol nebo jejich kombinace. Navíc, je-li to nutné, vakcína může obsahovat malé množství auxiliárních substancí , jako jsou zvlhčovači nebo emulgační činidla, pufry pro úpravu pH nebo adjuvans, které zvyšují účinnost vakcín.

Vakcíny se běžně aplikují parenterálně, injekcí, například podkožně nebo do svalu. Další formulace, ketré jsou vhodné pro jiné způsoby aplikace, zahrnují čípky a v některých případech se aplikují orální formulace. V případě čípků jsou tradičními nosiči například polyalkylenglykoly nebo triglyceridy. Takové čípky se tvoří ze směsí, které obsahují aktivní složku v rozmezí 0,5 až 10 %, upřednostňuje se 1 až 2 %. Orální formulace obsahují normálně používané ekcipienty. Jsou to například manitol, laktóza, uhličitan hořečnatý a podobně, které vykazují stupeň čistoty vhodný pro použití ve farmaceutickém průmyslu. Tyto kompozice jsou ve formě čípků, tablet, pilulek, kapsulí, formulací, které nepřerušovaně uvolňují aktivní složku, nebo ve formě prášku.' Obsahují 10 až 95 % aktivní složky, upřednostňuje se 25 až 70 %.

Peptidy se mohou začlenit do vakcíny v neutrální formě nebo ve formě solí. Farmaceuticky přijatelné sole zahrnují adiční sole kyselin (tvořených s volnými aminokyselinami peptidů) a nebo sole tvořené anorganickými kyselinami, jako je například kyselina chlorovodíková nebo fosforečná, nebo sole organických kyselin, jako je například kyselina octová, šťavelová, vinná, mandlová a podobně. Sole, které vznikají s volnými karboxylovými skupinami se mohou získat také z anorganických bází jako je například hydroxid sodný, draselný, amonný, vápenatý nebo železitý nebo z organických bází, jako je například izopropylamin, trimetylamin, 2-ety.laminoetanol, histidin, prokain a podobně.

Vakcíny se aplikují způsobem, který je kompatibilní s dávkováním formulace a v takovém množství, aby byla terapeuticky účinná a imunogenní. Aplikované množství závisí na subjektu, který se léčí. Aby došlo k imunitní odpovědi bere se do úvahy kapacita imunního systému jedince a stupeň požadované ochrany závisí na množství TNFa, které se u pacienta vyskytuje. Vhodná rozmezí dávky jsou několik stovek mikrogramů aktivní složky na vakcínu. Preferuje se rozmezí přibližně od 0,1 pg do 1 000 pg, jako je rozmezí od 1 pg do 300 pg a zvláště se preferuje rozmezí okolo 10 pg až 50 pg. Vhodné režimy pro počáteční aplikaci a pro opakovanou vakcinaci jsou různé , ale typují se na základě počáteční aplikace, po které následuje inokulace a další aplikace.

Způsob aplikace může být velmi různorodý. K aplikaci vakcíny se může použít libovolný z běžně používaných způsobů.

• ·· ·· ·· ·· · 4 ·*·· • 4 4 4 4 4 • ·4 444 444 • · 4 · •••••44 · 4 · «

Může se použít aplikace na pevné fyziologicky přijatelné bázi nebo ve fyziologicky přijatelné disperzi, parenterálně, injekcí a podobně. Dávka vakcíny závisí na způsobu její aplikace a bude kolísat v závislosti na věku vakcinované osoby a v menší míře na hmotnosti vakcinované osoby.

Některé upravené molekuly TNFa podle vynálezu jsou ve vakcíně dostatečně imunogenní, ale v případě některých dalších molekul je nutné jejich imunitní odezvu posílit tak, že vakcína obsahuje další adjuvans.

Různé způsoby dosažení účinku adjuvans zahrnují použití činidel, jako je hydroxid hlinitý nebo fosforečnan hlinitý (alum), které se běžně používají jako 0,05 až 0,1 % roztoky ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem. Dále zahrnují smíchání se syntetickými polyméry cukrů (Carbopol), které se používají jako 0,25 % roztok, pak dochází k agregaci proteinu ve vakcíně tepelným ošetřením při teplotě v rozmezí 70 až 101 °C po dobu 30 vteřin až 2 minuty. Při blokování substituce je možné také použít způsob zahrnující agregaci reaktivací s pepsinem, který je ošetřen (Fab) protilátkami proti albuminu. Dále se vytvoří směs s bakteriálními buňkami, jako jsou C. parvum, nebo s endotoxinem nebo s komponenty lipopolysacharidů gram-negativních bakterií nebo emulze ve fyziologicky akceptovatelném olejovém vehiklu, jako je manidmonooleát (Aracel A) nebo emulze s 20 % roztokem perfluorovaného uhlovodíku (Fluosol-DA) . Zajímavým kandidátem pro adjuvans v souladu s vynálezem je DDA (dimetyldioktadecylamoniumbromid) , ale zajímavá možnost je také QuilA a RIBI, monofosforyllipid A (MPL) a muramyldipeptid (MPD) . Dalšími vhodnými adjuvans jsou hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý (Adju.Phos), fosforečnan vápenatý, analog muramyldipeptidu. Pro uvedené použití jsou také vhodné v současné době vyvinutá adjuvans, jako je biologicky rozložitelné mikropartikule a Iscom's.

• 0 00 • · « • « 4 > 00

0

0 ¹ 0 · ¹ 0 0

0 0

Další vysoce zajímavou možností (a tudíž i preferovanou) dosažení účinku adjuvans je použití způsobu popsaného v publikaci Gosselin et al., (1992). Prezentace relevantního antigenu, jako je upravená molekula TNFa podle vynálezu, se může zesílit konjugaci antigenu s protilátkami (nebo s fragmenty protilátek, které se váží na uvedený antigen) proti receptorům Fcy na monocytech/makrofágách. Za účelem zvýšení imunogenicity vakcíny se zvláště prezentují konjugáty mezi antigenem a anti-FcyRI.

Jiné možnosti zahrnují použití látek modulujících imunitu, jako jsou lymfokiny (např. IFN-y, IL-2 a IL-12) nebo syntetické indukátory, jako je póly I:C v kombinaci s adjuvans, které se popisuje shora v textu.

V mnoha případech je nezbytné provést vícenásobnou aplikaci vakcíny, obvykle jich není více jak šest, s výhodou ne více jak čtyři. Preferují se alespoň tři vakcinace. Vakcinace se v normálním případě provádí v intervalech dvou až dvanácti týdnů, obvyklejší jsou intervaly tří až pěti týdnů. Opakující se vakcinace v intervalu jednoho až pěti letech, obvykle v intervalu tří let, jsou nutné pro zachování požadovaného stupně ochranné imunity.

Jedním z důvodů pro smíchání polypeptidu podle vynálezu s adjuvans je účinně aktivovat buněčnou imunitní odezvu. Tohoto účinku je možné dosáhnout také jinými způsoby, například expresí účinného antigenu ve vakcíně v nepatogenním mikroorganizmu. Dobře známým příkladem uvedeného organizmu je Mycobacterium bovis BCG.

Preferuje se, aby nepatogenním mikroorganizmem byla bakterie, například vybraná ze skupiny zahrnující rody Mycobacterium, Salmonella, Pseudomonas a Escherichía. Zvláště se preferuje, že nepatogenní mikroorganizmus je Mycobacterium bovis.

Imunogenní účinek kmene BCG se zvýší, jestliže se do kmene M. bovis BCG začlení jedna nebo více kopií nukleotidové • · 0 ♦· » · · » 0 0 00 ► · 0 · * · · · ·· 00 ·· · • 0 sekvence kódující molekulu podle vynálezu. Imunogenní odezva se dokonce více zesílí, jestliže se do mikroorganizmu začlení více jak jedna kopie nukleotidové sekvence. Předmětem vynálezu je vakcína, kde jsou v genomu mikroorganizmu začleněny alespoň 2 kopie sekvence DNA kódující uvedenou molekulu. Preferuje se alespoň pět kopií. Kopie DNA mohou být buď identické, což znamená, že kódují stejnou molekulu, nebo jsou varianty stejné sekvence DNA, což znamená, že kódují stejný polypeptid nebo jeho homology. V jiném provedení vynálezu různé sekvence DNA kódují různé polypeptidy, přičemž alespoň jeden polypeptid je v souladu s vynálezem.

Kultivací transformovaných buněk je možné připravit živou vakcínu podle vynálezu. Transformované nepatogenní buňky podle vynálezu se pak přenesou do média, které je vhodné pro vakcinaci, a přidá se nosič, vehikl a/nebo adjuvans.

Nezávisle na použití jako počáteční bod syntézy molekuly podle vynálezu a jako hybridizační sondy (jsou použitelné při přímých testech hybridizace nebo jako primery například při PCR nebo při jiných molekulárních amplifikačních metodách) fragmenty nukleových kyselin se mohou použít při zvýšení účinnosti in vivo exprese antigenů. To znamená, že se fragmenty nukleových kyselin mohou použít jako tzv. DNA vakcíny. Současný výzkum odhalil, že fragment DNA klonovaný do vektoru, který se nereplikuje v eukaryontních buňkách se může zavést do zvířete (i do člověka) prostřednictvím vnitrosvalové injekce nebo podkožní aplikace (tzv. „gene gun). DNA je pohlcena svalovými buňkami a gen se exprimuje pod kontrolou promotorové sekvence, která je funkční v eukaryontech, například virový promotor. Produkt genu stimuluje imunitní systém. Tyto nové objevené způsoby se popisují v publikaci Ulmer et. al., 1993.

„DNA vakcín je možné pravděpodobně kódujícího expresi produktu spolu

Účinnost uvedených zvýšit aplikací genu s fragmentem DNA, který kóduje polypeptid, jenž má schopnost · 4 modulovat imunitní odezvu. Gen kódující lymfokinové prekurzory nebo lymfokiny (např. IFN-γ, IL-2 nebo IL-12) se může například aplikovat spolu s genem kódujícím imunogenní protein a to buď aplikací dvou oddělených fragmentů DNA nebo aplikací vektoru, které zahrnuje oba fragmenty. Vakcíny se mohou použít při prevenci/léčbě libovolného ze shora popsaných onemocnění, jejichž patofyziologie se charakterizuje uvolněním TNFa, zvláště chronických zánětlivých onemocnění. Jako příklady se mohou uvést revmatická artritida a zánětlivé onemocnění střev (IBD). Zánětlivé onemocnění střev zahrnuje vředovou kolitidu a Crohnovu nemoc, zvláště Crohnovu kolitidu. Dalšími příklady je zhoubné bujení a kachexie, která se často vztahuje ke zhoubnému bujení, roztroušená skleróza, cukrovka, lupénka, osteorporéza a astma. Zhoubné bujení, které se léčí nebo se mu předchází způsobem podle vynálezu, může být histogeneticky klasifikováno jako maligní epiteliální nádor zahrnující karcinomy a adenokarcinomy a jako maligní neepiteliální nádory zahrnující liposarkomy, fibrosarkomy, chondrosarkomy, osteosarkomy, leiomyosarkomy, rabdomyosarkomy, gliomy, neuroblastomy, meduloblastomy, maligní melanom, maligní meningiom, různé leukémie, různé myeloproliferační poruchy, různé lymfomy (Hodgkinsův lymfom a jiný než Hodgkinsův lymfom), hemangiosarkom, Kaposiho sarkom, lymfangiosarkom, maligní teratom, dysgerminom, seminom a choricarcinom.

Nej častěji se vyskytují karcinomy a adenokarcinomy (způsobují přibližně 90 % úmrtí, jejichž důvodem je zhoubné bujení) a jsou proto zajímavým cílovým onemocněním pro léčbu/prevenci podle vynálezu. Nejdůležítější karcinomy a adenokarcinomy jsou zhoubná bujení dýchacích cest zvláště bronchiálního původu, prsu, kolorektum a žaludku. Podstatný počet úmrtí způsobují také karcinomy a adenokarcinomy prostaty, vaječníků, lymfoidní tkáně a kostní dřeně, dělohy, pankreasu, jícnu, močového měchýře a ledvin.

• · ·· • ♦ 9 9 •9 99 • · 999 • · • 999· ·· » 9

999

Upřednostňuje se, aby se vakclna aplikovala jako prevence, ale z pohledu chronické podstaty těchto onemocnění a jejich tendence remisi a rekurvence se může vakcína aplikovat pacientům, kde se diagnostikovala jedna nebo více shora v textu uvedených onemocnění, a může sloužit k udržení pacienta ve stádiu remise.

Na základě dřívějších studií provedených na myších se věří, že upravené analogy TNFa podle vynálezu se mohou aplikovat jako část léčby shora v textu uvedených onemocnění v jejich akutním stádiu nebo alespoň za účelem přivést pacienta do stádia remise a udržet ho v tomto stádiu.

V současné době nelze stanovit rozmezí specifické účinné dávky, protože vakcíny se zatím ještě netestovaly na lidech, kteří trpí libovolným z onemocnění.

Aplikační dávku v každém případě určí odpovědný lékař.

Podle libovolného provedení vynálezu vakcína obsahuje směs dvou odlišně upravených molekul TNFa, které obsahují dva odlišné epitopy T buňky. Jsou to například P2 a P30, které se získaly z tetanus toxoid. Tato směs obsahuje vhodné množství farmaceuticky přijatelného adjuvans.

Vakcíny podle vynálezu neobsahují upravené molekuly lidského TNFa jako takové, ale spíše konstrukce obsahující neinfekční neintegrující se sekvence DNA kódující uvedené molekuly operativně spojené s promotorovou sekvencí, která může řídit expresi uvedené sekvence DNA u lidí v množství, které je dostatečné, aby došlo k pohlcení uvedené DNA a k dostatečné expresi, aby se indukovaly neutralizační látková odezva proti TNFa.

Využitelnost tohoto typu vakcín, tzv. DNA vakcíny, zvláště ve vztahu k aplikaci, se popisuje v publikaci US patent č. 5.589.466 a 5.580.859.

Vakcíny DNA mohou obsahovat virový expresivní vektor, jako je retrovirový expresivní vektor.

• · · · • · · • ···· ·· ·· ·· • · · ·· · · · · ♦ ·

99

V obecném případě se mohou vakcíny podle vynálezu upravit pro orální nebo parenterální, zvláště pak podkožní, intramuskulární nebo intradermální aplikaci.

Vynález dále obsahuje použití protilátek vyvolaných aplikací vakcíny podle vynálezu. Zvláště pro diagnostické účely se upřednostňují monoklonální protilátky.

Vynález dále popisuje způsob testování přítomnosti TNFa v tělních tekutinách, které zahrnují kontaktování kompozice obsahující TNFa podle vynálezu se vzorkem lidských tělních tekutin a stanovení, zda uvedené protilátky se v uvedeném vzorku váží na TNFa.

Vynález dále popisuje diagnostický způsob onemocnění spojených s TNFa, který se používá při imunotestech za účelem detekce TNFa v lidských tělních tekutinách.

Uvedené metody mohou zahrnovat sendvičové testy, test ELISA nebo ekvivalentní test, který je amplifikován nebo není amplifikován za použití avidin/biotin technologie.

Vakcíny/rekombínantní proteiny se mohou charakterizovat za použití následujících testů, které jsou dobře známy v oboru:

Gely SDS-PAGE obarvené podle Coomassie nebo stříbrem (získají se informace o velikosti molekula čistotě);

IEF (izoelektrícké fokusování) (získají se informace o izoelektrickém bodě);

Hmotnostní spektroskopie (získají se informace o molekulové hmotnosti);

SE-HPLC s UV detekčním profilem (získají se informace o rozložení molekulových hmotností);

N-terminální sekvence (získají se informace o identitě);

Cirkulární dichroizmus (získají se informace i terciální struktuře);

SE-HPLC s detekcí „malls (získají se informace o terciální struktuře pomocí rozptylu světla);

Složení aminokyselin (získají se informace o identitě);

·· • · · • · · ·· • · · · ·

• · * 494 999 ·

·· ··

Imunogenicita v heterogenních speciích (myši, krysy nebo králík);

Reaktivita s protilátkami v testu westernův blot;

NMR spektroskopie,

Krystalová struktura

Stanovení celé aminokyselinové sekvence.

Experimentální část s popisem preferovaného provedení

1. Úvod

V předchozím dokumentu WO 95/05849 se popisuje, že epitop T buňky upravených molekul myšího TNFa může vyvolat vysoký titr protilátek, které zkříženě reagují s přirozeným myším TNFa (divokého typu). Tyto protilátky jsou schopny interferovat s TNFa a s jejich receptory in vitro stejně jako in vivo. Pozitivní účinky imunizace proti TNFa se prokázaly v několika zvířecích modelech onemocnění, které je vyvolané TNFa, jako je experimentální kachexie, kolagenová artritida a experimentální alergická encefalomyelitida (EAE). Tyto výsledky z experimentů na zvířatech se získaly navzdory skutečnosti, že dvě používané upravené molekuly myšího TNFa (MR 103 a MR 106) se nebyly optimalizovány, aby byly imunogenní v haplotypech MHC třídy II myší DBA/1 a SJL. Tyto myši se používaly v experimentech v případě kolagenové artritidy a EAE. V jiném experimentu se ukázalo, že odlišně upravená molekula myšího TNFa(MR 105) produkuje silnější imunitní odezvu než rekombinantní myší TNFa konjugovaný s proteiny E. coli za použití formaldehydu.

MR 103, MR 105 a MR 106 jsou myší molekuly a na základě předchozí publikace WO 95/05849 nelze udělat závěr s ohledem na imunogenicitu molekul lidského TNFa substituovaných T buňkou ani potenciální schopnosti takových molekul indukovat φφ φφ ·· • φ φ · φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ φφ ♦

Φ · • ·ΦΦ· ·· • φ φ ··· φ · φφ φφ

TNFa neutralizační jsou aktivní.	autoprotilátky ,	protože všechny	molekuly
2. Vývoj konstrukcí	lidského TNFa
Vakcína TNFa	pro použití na	lidech by měla	splňovat

následující požadavky:

a. měla by být imunogenní pro velkou část populace

b. měla by být schopna optimálně indukovat TNFa neutralizační protilátky

c. neměla by vykazovat žádnou zbytkovou biologickou aktivitu TNFa.

Dále by se při výběru měly zvažovat další praktické parametry, jako je síla rekombinantní exprese, obtížnost čištění, rozpustnost atd..

2.1. Imunologická různorodost upravených molekul TNFa

Cílem vývoje vakcíny lidského TNFa je produkce upravených molekul lidského TNFa, který bude imunogenní k co možná největší části lidské populace, která samozřejmě reprezentuje velké množství různých typů HLA třídy II. Proto místo epitopů specifických pro MHC, které se používaly v experimentech na zvířatech, se používají různorodé epitopy T buňky. Z předchozí publikace WO 95/05849 je známo, že takové epitopy mohou ovlivnit schopnost molekul indukovat neutralizační protilátky.

Vybraly se dva epitopy T buňky získané z tetanus toxoid P2 a P30, které jsou dobře charakterizovány ve vědecké literatuře. Je známo, že tyto epitopy jsou imunodomínantní v TT a jsou schopny se vázat na alespoň 80 % molekul HLA třídy II v lidské populaci.

Dále se při použití těchto epitopů TT očekávalo, že je možné testovat imunogenicitu uvedených konstrukcí TNFa in vitro na periferních krevních jednojaderných buňkách (PBMC) a T buněčných liniích vytvořených z TT imunních krevních donorů.

• · ·· • · · • to to · · • · · ·

• to to ·· · to · · • · ·· ··

Aminokyselinová sekvence epitopu P2 je QYIKANSKFIGITEL a odpovídá TT aminokyselinám 830 až 844 a sekvence epitopu P30 je FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE a odpovídá TT aminokyselinám 947 až 967. Substitucí P2 a P30 do dvou různých molekul lidského TNFa se změní přibližně 10 % respektive 15 % sekvence přirozeného TNFa. V případě, že se do jediné molekuly TNFa zavedou oba epitopy, změní se přibližně 25 % sekvence a je možné se obávat, že to bude příliš interferovat se zbývajícími přirozenými částmi molekuly TNFa. Proto se udělalo rozhodnutí vyvinout dvě molekuly TNFa, kdy každá obsahuje buď P2 nebo P3. Očekává se, že dohromady takové molekuly budou imunogenní alespoň pro 80 % lidské populace. Navíc je velmi pravděpodobné, že zkrácené molekuly, které částečně obsahují P2 nebo P30 epitop a částečně lemující oblasti TNFa, se budou také podílet na imunogenicitě, výsledkem čehož je, že konstrukce jsou imunogenní pro skoro 100 % populace.

Ačkoli je možné indukovat protilátky se všemi konstrukcemi myšího TNFa ve všech dosud testovaných myších kmenech (jde o molekuly MR 103, 105 a 106), bude se a priori očekávat, že inzerce cizorodého epitopu T buňky do jisté polohy TNFa bude výhodnější než inzerce do jiné polohy s ohledem na prezentaci epitopu T buněk molekulami MHC třídy II. Proto se vytvořily soubor odlišně upravených molekul lidského TNFas epitopem P2 a P30 začleněným do různých poloh v molekule, jak je zobrazeno na obrázku č. 4. Pak se všechny molekuly testovaly in vitro v T buněčných testech za ložených na periferních krevních jednojaderných buňkách (PBMC) nebo P2/P30 specifických T buněčných liniích izolovaných z řady zdravých TT imunních krevních donoru.

Navzdory očekávané situace se ukázalo, že ačkoli je možné vidět minoritní rozdíly v množství, intramolekulární poloha epitopu P2 a P30 není podstatná pro schopnost být zpracován buňkami prezentujícími antigen a následně se prezentovat na TT

• · ·· • * · • · · ·« * ♦ · · · • · · » • 1 ·· • · · · ♦ · · · ··· ··· • · ·· specifických T buňkách. P2 začleněný do poloh 132 až 146, 65 až 79 a 76 až 90 a P30 začleněný do poloh 40 až 60 a 132 až 152 (TNF2-5, 2-3, 2-7, 30-2, 30-5) je také upraven a prezentován na T buňkách. Ze shora uvedené diskuse vyplývá, že je velmi pravděpodobné, že tyto molekuly v lidské populaci univerzálně imunogenní.

2.2 Schopnost upravených molekul lidského TNFa indukovat neutralizační protilátky

Jak se uvádí shora v textu není možné na základě výsledků předchozí studie, která se popisuje v publikaci WO 95/05849 předpovědět, která poloha bude pro indukci TNFa neutralizačních protilátek nejvhodnější, protože všechny tři analogy MR 103, MR 105 a MR 106 byly schopny indukovat protilátky navzdory odlišné oblasti substituce. Vytvořil se soubor různých molekul lidského TNFa , které mají epitopy P2 a P30 začleněny v různých polohách. Substituce byly náhodně rozděleny podél celé molekuly. V biochemických a biologických testech in vitro se dále testovala schopnost protilátek indukovaných v králících po injekci s uvedenými molekulami interferovat s biologickou aktivitou TNFa.

V nepublikovaných pozorováních se zjistilo, že v závislosti na intramolekulové poloze začleněného epitopu, indukované autoprotilátky vykazují odlišnou specifitu. V rozporu toho, co se očekávalo na základě strukturálních dat o molekule TNFa , se pozorovalo, že substituce na předním βlistu provedená buď s epitopem P2 nebo P30 úplně odstranila biologickou aktivitu molekul TNFa, ale současně zachovala schopnost upravených molekul indukovat TNFa neutralizační protilátky.

2.3 Biologická aktivita různých konstrukcí TNFa • · 9 9 9 ♦ · *φ » · « * · · 99 * · 9 9 9 » · · 9

99

9

99

Je jasné, že ve vakcíně není možné použít molekulu, která je toxická, jako je TNFa. Upravené molekuly TNFa proto nesmí být toxické, to znamená, že nesmí vykazovat zbytkovou aktivitu TNFa.

Proto se všechny mutantní proteiny TNFa testovaly in vitro v biotestu závislém na TNFa s v testu schopnosti vázat se na receptory za účelem zjistit, zda tyto proteiny nejsou toxické. Bylo jasně možné vidět, že upravené molekuly lidského TNFa (TNF2-5, 2-3, 2-7, 30-2 a 30-5) nevykazují žádnou biologickou aktivitu TNFa. Tak jsou splněny všechny nezbytné požadavky kladené na tyto molekuly. Měly by být součástí univerzální, netoxické vakcíny schopné indukovat neutralizační protilátky proti lidskému TNFa.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 (a) se zobrazuje krystalová struktura přirozeného monoméru TNFa. Obrázek je diagramatická skica svinutí podjednotky. β-řetězec je zobrazen jako silné šipky ve směru od N-konce k C-konci a spojovací smyčky jsou znázorněny jako tenké čáry. Disulfidový můstek je označen jako blesk a oblast vysoké flexibility je šrafováná. Trimérová třírozměrná osa bude pro tutu orientaci vertikální.

Obrázek č. 1(b) znázorňuje Ca řetězec krystalové struktury monoméru TNFa. Tato detailní prezentace se má používat spolu s obrázkem č. l(a), aby se vytvořil přesný obraz aminokyselinové sekvence s jasnou ale stylizovanou prezentací svinutí podjednotky.

Obrázek l(c) ukazuje strukturu TNFajako „jelly roli motiv. Inzerce mezi β-řetězci B a C je zobrazena čárkovanou čarou. Spojení mezi B a C přímo kříží vrchol molekuly.

Obrázek č. 2 zobrazuje pakování hrana na plochu β-sendvičů v triméru TNF. Pohled dolů ukazuje úzkou destičku triméru s βřetězci, které jsou reprezentovány fáborky vstupujícími a vystupujícími z plochy.

Obrázek č. 3 (a) zobrazuje sekvenci DNA kódující nádor nekrotizující faktor TNFa, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena na obrázku č. 3(b).

Sekvence DNA je dostupná v Genové bance pod číslem M10988, SEQ ID NO: 339737.

Sekvence se popisuje v publikaci Wang et al., Science 228, 149-154 (1985). Sekvence zahrnuje kodony kódující pre-sekvence lidského TNFa -76 až -1.

Celá genová sekvence zahrnující introny se popisuje v publikaci Nedwin et al., Nucleic Acids, Res. 13(17) 63616373 (1985), Shirai et al., Nátuře 313(6005), 803-806 (1985) a Dennica et al., Nátuře 312 (5996), 724-729 (1984).

Obrázek č. 3B zobrazuje aminokyselinovou sekvenci lidského TNFa zahrnující pre-sekvenci -76 až -1.

Obrázek č. 4(a) ilustruje substituce imunodominantních epotopů P2 a P30 u TNFa divokého typu (WT) za vzniku analogů TNFa TNF2-1 až 2-7 a TNF30-1 až 30-5.

Obrázek č. 4 (b) ukazuje skutečné polohy substitucí v sekvenci WT v případě jednotlivých analogů TNFa.

Obrázek č. 5 (a) a 5(b) zobrazuje strukturu analogů založených na obrázku č. 1 (a), kde jednotlivé substituce P2 a P30 v řetězcích β-listů a spojovací smyčky jsou označeny černě.

Obrázek č. 6 zobrazuje biologickou aktivitu analogů TNFa v testu L929 (popisuje se v publikaci Meager, A., Leung, H., and Woolley, J., Assays for Tumor Necrosis Factor and related cytokines., J. Immunol. Meth. 116, 1-17 (1987), která se porovnává s rekombinantním TNFa.

Obrázek č. 7 zobrazuje protilátkovou odezvu proti lidskému TNFa u králíků na vakcinaci upravenými molekulami TNFa.

• * ·♦ «· • · · « · ··· • · · • · · · ·· ·4 ·· ♦ · • ·

9999 •9 99 • · · 9 • 9 9 9 •99 999

9

99

Obrázek č. 8 ukazuje schopnost P2/P30 upravených molekul lidského TNFa indukovat neutralizační protilátky, což se měří v testu L929.

Obrázek č. 9 ukazuje schopnost P2/P30 upravených molekul lidského TNFa po jejich aplikaci králíkům indukovat neutralizační protilátky, což se měří v receptorovém testu.

Obrázek č. 10 zobrazuje odezvu periferních krevních jednojaderných buněk ve třech donorech proti peptidům TT a P2 a P30.

Obrázek č. 11 zobrazuje polyklonální proliferační odezvu ve dvou donorech za použití různých P2 a P30 upravených molekul TNFa.

Obrázek č. 12 zobrazuje proliferační indexy (Pí) vypočítané z 34 experimentů pro upravené molekuly TNFa P2 a P30.

Obrázek č. 13 zobrazuje odezvu PBMC proti upraveným proteinům TNFa u responderů specifických pro P2 a P30.

Obrázek č. 14 ukazuje podobnou odezvu PBMC ve dvou donorech.

Obrázek č. 15 ukazuje jak lemující aminokyseliny ovlivňují skutečnost, jak T buňky rozeznávají P2 a P30.

Obrázek č. 16 zobrazuje strategii mutace používanou při přípravě upravených molekul TNFa.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Práce na genetické konstrukci

Vytvořilo se deset různých upravených molekul lidského

TNFa, pět z nich obsahuje epitop P2 a pět z nich epitop P30. Epitopy byly rozmístěny v různých polohách molekuly. Genetické konstrukce se připravily za použití různých standardních restrikčních enzymů a metod mutageneze založených na PCR. Genetické konstrukce jsou zobrazeny schématicky na obrázcích

Φ · ··« ·· ·· • 9 9 * · ··♦ « 9 9 «· •

999

9

9999 • 9 • 9 9 • ♦ · «· 9

99

4a a 4b. Sekvence DNA kódující upravené molekuly TNFa a odpovídající aminokyselinovým sekvencím jsou začleněny jako SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO: 20. Konstrukce mutantního genu lidského TNF2-5, strategie klonování a mutací a následná exprese, izolace a čistění analogu TNF2-5 jsou vysvětleny cestou příkladů.

Konstrukce a produkce TNF2-5:

Genetická konstrukce mutantního genu lidského TNF2-5, strategie klonování a mutace.

Genetická konstrukce genu kódujícího mutantní analog lidského TNF2-5 je založena na tradičních metodách mutageneze opírajících se PCR, stejně jako jiné konstrukce.

Přirozená sekvence DNA lidského TNFa kódující rozpustnou část této molekuly se získala tradičním PCR klonováním za použití synteticky syntetizovaných primerů I a II /tabulka 1 a SEQ ID NO: 21 a 22), které se získaly z lidské běžně dostupné knihovny cDNA CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA, USA (obrázek č. 16,1). Přirozený gen se začlenil do běžného expresivního vektoru E. coli pET28c, který je dostupný u firmy Novagen, Madison, WI 53711, USA, takovým způsobem, že se může přepisovat v rámci z promotoru, jenž lze indukovat IPTG.

Genetická konstrukce TNFa mutantního analogu TNF2-5 se uskutečnila metodou mutageneze PCR, která se aplikovala na přirozenou sekvenci DNA. Sekvence nukleotídové kyseliny kódující epitop T buňky se začlenil do synteticky syntetizovaného 75-mérového oligonukleotidu (primer „mut2-5, tabulka č. 1 a SEQ ID NO: 27) mezi dva 3' a 5' proužky TNF homologní DNA pro teplotní hybridizaci. Primer „mut je tak schopen teplotně hybridizovat se sekvencí nativního genu lidského TNFa na definovaném místě vybraném pro TNF2-5 (zobrazeno na obrázku č. 16, 2a). V oligonukleotidu „mut počet kodonů kódujících epitop T buňky se skutečně páruje ·· · ··· s počtem TNF kodonů vynechaných mezi dvěma 3' a 5' hybridizačních proužků TNF homologní DNA. Za účelem přípravy PCR produktu, který obsahuje DNA kódující epitop T buňky a sekvenci TNFa pod (nebo 3') začleněným epitopem (obrázek č. 16), se použil primer pro mutagenezi. Proužek TNFa DNA nad (nebo 5') bodem inzerce epitopů se připravil druhou PCR za použití primerů I a II (Tabulka č. 1, SEQ ID NO: 23) (Obrázek č. 16, 2b) . Dva produkty PCR jsou spojeny dohromady v konečné

PCR reakci (obrázek č. 16, 3) za použití dvou nejvíce vzdálených primerů (I a II) ze dvou reakcí. Celá mutantní sekvence DNA TNF2-5 expresivního vektoru se pak zavedla do běžně používaného E. coli jako analogie expresivního klonování přirozeného genu takovým způsobem, že gen se může přepisovat v transformovaných buňkách z promotoru indukovatelného IPTG.

Primery „mut, které se používají ke konstrukci jiných analogů (TNF2-1, 2-3, 2-4, 2-7, 30-1, 30-2, 30-3, 30-4 a 30-5) se identifikovaly jako SEQ ID NO: 23 až 26.

Tabulka č. 1

Primer I: lidský TNF-alfa FW, 24-mér Ncol

5'-GAC AAG CCC ATG GTC AGA TCA TCT-3'

Primer II: lidský TNF-alfa Rev., 30-mér Xbal

5'-TCT CTA GAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC-3'

Primer „mut2-5: mutentní oligoP2-5 (ŤŤ830-44) , 75-mér 5'-G AAG GGT GAC CGA CAG TAC ATT AAG GCC AAT TCG AAG TTC ATT GGC ATC ACT GAG CTG TCT GGG CAG GTC TAC TT-3'

Primer III: lidský TNF-alfaRev 2'nd, 21-mér 5'-CCC AAA GTA GAC CTG CCC AGA-3'

Kultivace rekombinantní bakterie, shromáždění bakterií a rozpustná inkluze

Proteinové čištění analogu TNF2-5

Produkce proteinu TNF2-5 je analogické jako při produkci jiných rekombinantních molekul TNF.

1. 20 ml TB kultivačního média, které obsahuje 50 gg/ml karbenicilinu, se inokuluje transformovaným kmenem E. coli, který zahrnuje plazmidový vektor indukovatelný IPTG nesoucí gen TNF kódující rekombinantní protein. Buňky se kultivují přes noc za stálého míchání při teplotě 37 °C.

2. Přes noc kultivovaná kultura se zředí v poměru 1:25 do 250 ml kultivačního média TB, které obsahuje 50 pg/ml karbenicilinu a kultivuje se až OD při vlnové délce 450 nm je 1. Exprese rekombinantního proteinu se indukuje přidáním IPTG tak, aby konečná koncentrace byla 1 mM. Kultivace probíhá přes noc za stálého míchání při teplotě 37 °C.

3. Rekombinantí buňky z kultivačního média se shromáždí centrifugací při 3 500 x g. Pelet se promyje jednou pufrem BSB. Použije se 150 ml BSB na 50 g vlhké hmotnosti bakterií.

4. Bakteriální suspenze se 4 krát sonikuje po dobu 30 vteřin při maximální amplitudě, až je suspenze zcela homogenní. Sonikace se uskutečnila za použití přístroje MSE Soniprep 150, který je vybaven 9,5 mm standardní sondou (Soniprep 05 38 121-1154).

5. Na 1 gram buněčného peletu se přidalo 8 μΐ PMSF (o koncentraci 50 mM) a 80 μΐ roztoku lysozymu (o koncentraci 10

mg/ml) . Vše místnosti.	se inkubovalo po	dobu	30 minut při	teplotě
6. Na	jeden gram peletu	se	přidaly 4 mg	kyseliny
deoxycholové,	směs se zamíchala a	uchovávala se při teplotě 37

°C.

7. Když se roztok stal viskózním přidalo se na jeden gram peletu 20 μΐDNázy (v koncentraci lmg/ml) a MgC12, aby jeho konečná koncentrace byla 5 mM, vše se zamíchalo a uchovávalo se při teplotě místnosti po dobu 30 minut.

8. Směs se 5 krát sonikovala na ledu v 30 vteřinových intervalech s maximální amplitudou, až roztok přestal být viskózní.

9. Pak proběhla centrifugace při 20 000 x g po dobu jedné hodiny. Supernatant se uschoval za účelem pozdější kontroly postupu promývání, zda se vysrážely všechny inkluze.

10. Pelet se resuspendoval v MiliQ vodě (1 ml vody na gram E. coli), suspenze se míchala po dobu jedné hodiny.

11. Pak proběhla centrifugace při 20 000 x g po dobu jedné hodiny. Supernatant se uschoval za účelem pozdější kontroly postupu promývání, zda se vysrážely všechny inkluze.

12. Pelet se resuspendoval v 1 M roztoku močoviny v množství 1 ml na gram bakterií E. coli a suspenze se míchala po dobu 1 hodiny.

13. Proběhla centrifugace při 20 000 x g po dobu jedné hodiny, supernatant se uschoval pro pozdější kontrolu, zda se všechny inkluze vysrážely.

14. Pelet se resuspendoval v 1 M guanidinu . Použil se 1 ml roztoku na jeden gram E. coli a vše se míchalo po dobu jedné minuty.

15. Proběhla centrifugace při 20 000 x g po dobu jedné hodiny. Supernatant se uschoval pro pozdější kontrolu, zda se všechny inkluze vysrážely.

16. Pelet se resuspendoval v 25 ml roztoku 6 M guanidinu a 20 MM Trís pH 8,0, suspenze se míchala přes noc.

17. Suspenze se centrifugovala při 20 000 x g po dobu jedné hodiny. Supernatant se uschoval pro pozdější kontrolu, zda se všechny inkluze vysrážely. Uchoval se supernatant obsahující inkluzní tělíska rekombinantního proteinu a pelet • · · » ·· · · · · za účelem kontroly, zda se rozpustila všechna inkluzní těliska.

18. Roztok proteinů se dializuje proti vodě MilliQ a roztok se pak suší mrazením.

19. Vymrazený materiál se rozpouští v roztoku 1 mM Tris, mM guanidin, 30 % 2-propanol (pH 8,0) při koncentraci 20 mg/ml. Materiál se rozpustí za mírného míchání přes noc. Přítomnost monomérů se testuje na koloně superdex 200 (XK 16, Pharmacia, průměr 1,6 cm, výška 750 mm). Pufr probíhá kolonou rychlostí 1 ml/min.. Výsledky se srovnávají se standardy ve stejném pufru.

20. Čištění proteinů probíhá gelovou filtrací na koloně superdex 200 (XK26, Pharmacia; s výškou 100 cm, průměrem 2,6 cm), která se uvede do rovnováhy ekvilibračním pufrem. Kolona pracuje s rovnovážným pufrem. Aplikuje se objem vzorku, který odpovídá 1 % celkového objemu vzorku.

21. Opětné svinutí rekombinantního proteinu se uskuteční dialýzou. Protein se ředí v 0,1 mg/ml ekvilibračního pufru a tento roztok se umístí do vyvařeného dialyzačního střívka a dialyzuje se proti 20 mM Tris, 4 M močovině (pH 8,5) se třemi výměnami pufru, přes jednu noc při teplotě místnosti. Dialyzační střívko se přenese do pufru Tris (20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8,0)). Pufr se mění třikrát, přičemž první kolo dialýzy se provádí při teplotě místnosti a další probíhají přes noc v chladničce.

22. Opětné svinutí se hodnotí na koloně Superose 12 uvedené do rovnováhy pufrem Tris (20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH8,0)). Výsledky se porovnávají se standardy.

Uchovávání:

Rekombinatní proteiny se uchovávají vysušené mrazením.

Produkce upravených molekul TNFa ve velkém měřítku se provádí následujícím způsobem:

• * ·· · • · ·

Počáteční materiál:

500 1 fermentované kultury E. coli, diafiltrované proti voděna objem přibližně 50 1.

1) promývání buněk

A) rozmrazí se zmrazená buněčná kaše

B) Buňky se centrifugují při 4 000 x g po dobu 10 minut

C) Pelet se resupenduje v 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0 Krok B) a C) se opakuje třikrát.

2) Homogenizace buněk

A) Buňky se homogenizují Rannieovým homogenizátorem, v pěti cyklech při tlaku 700 barů.

B) Inkluzní tělíska se centrifugují při 16 500 x g po dobu 30 minut

C) Inkluzní tělíska se promyjí třikrát 3M guanidinem, ÍM NaCl, 5 mM EDTA, 20 sacharózou, 50 mM Tris, pH8, pak následuje centrifugace po dobu 30 minut při 16 500 x g.

3) Rozpuštění inkluzních tělísek

Pelet se resuspenzuje v 6 M guanidinu, 10 mM DTT, 150 mM

NaCl, 5 % etanolu, 50 mM Tris, pH 8. Použije se přibližně 1 ml pufru na 100 mg peletu.

4) Ultrafiltrace inkluzních tělísek

A) Na filtru o velikosti pórů 0,45 μ se odstraní hrubé nečistoty

B) na filtru, který zachycuje molekuly o velikosti 30 000 se odstraní vysokomolekulární komponenty

C) inkluzní tělíska se zakoncentruji na filtru, který zachycuje molekuly o velikosti 5 000

5) výměna pufru • » • · ·*· · · · · · · ·· ·· ··· ···· ·· .·

Připraví se vzorek pro iontoměničovou chromatografií. Diafiltrací se molekuly převedou do pufru 6 M močovina, 1 mM DTT v 50 mM Tris, pH 8.

6) Čištění na SP-sefaróze

Protein se nanese na SP-sefarózu. Kolona se promyje čtyřmi objemy pufru A a protein se eluuje 100 % pufrem B a shromáždí se všechny frakce obsahující TNFa.

Pufr A: 6 M močovina, 1 mM DTT, 50 mM Tris/Cl, pH 8.

Pufr B: 6 M močovina, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 50 mM Tris/Cl, pH 8.

7) Opětovné svinutí lidského TNFa

Souhrn proteinů se naředí na přibližnou koncentraci 0,1 mg TNFa na 1 ml v β M močovině, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 5% EtOH v 20 mM Tris/HCl pH 8,8 a diafiltrací se postupně odstraní močovina.

A) 2 M močovina, 1 mM DTT, 150 mM NaCl ve 20 mM Tris/Cl, pH 8,8, přes noc při teplotě 5 °C.

Β) 1 M močovina, 1 mM DTT, 150 mM NaCl v 20 mM Tris/Cl pH 8,8, po dobu 8 hodin při teplotě 5 °C.

C) 1 mM DTT, 150 mM NaCl v 20 mM Tris/Cl pH 8,8, přes noc při teplotě 5 °C.

D) 150 mM NaCl v 20 mM Tris/Cl pH 8,8, přes noc při teplotě 5 °C.

8) Uchovávání analogů lidského TNFa

Koncentrace proteinu se upraví na hodnotu 1,0 mg/ml a vzorek se uskladní při teplotě -20 °C.

TB kultivační médium

Rozpuštěná kultivační půda „Terrific Broth (GIBCO BRL 22711-22) se rozpustí ve vodě MiliQ podle návodu výrobce. Autoklávuje se při teplotě 121 °C po dobu 20 minut.

·· ·· • · · • · ·tt • 9 9 ·· ·

9 9 • ·

Příprava 100 x koncentrovaného roztoku karbenicilinu (50 mg/ml)

Disodná sůl karbenicilinu (Sigma C1389) se rozpustí ve vodě MiliQ v koncentraci 50 mg/ml. Roztok sterilizuje filtrací v koncentraci 50 mg/ml. Roztok se sterilizuje filtrací průchodem filtru o velikosti pórů 0,2 μιη (Sterifix 0409 9206).

Příprava 100 x koncentrovaného roztoku IPTG o koncentraci 100 mM

1,19 g izopropyl-beta-D-tiogalactopzranoyidázy (IPTG, USB 17884) se rozpustilo ve vodě MiliQ o objemu 50 ml. Roytok se filtroval přes filtr o velikosti pórů 0,2 μη (Sterifix 0409 9206).

Pufr BSB

Pufr bakteriální suspenze mM Tris (Trisma báze, Sigma T1503)

0,5 M NaCl (ridel-de. Haen 31434) mM DTT (DL-dithiotreitol, Sigma D-0632) pH 8,0

PMSF mM fenylmetylsulfonylflurid, SIGMA # P-7626 rozpuštěný v 2-propanolu roztok lysozymu mg/ml lysozymu stupně III pocházející z kuřecích vajec (EC 3.2.1.17) SIGMA # L-7001 kyselina deoxycholová (7-deoxycholová kyselina) Sigma # D-6750

DNáza

• · · · 4 • · 4* • · ♦ 4 • 4 4 4 4 • · 4 4 4 • 4 4 4

4 44 _β mg/ml Dnáza I, Deoxyribonuklázal, (EC.3.1.21.1) Boehringer Cat. # 1284932 močovina

Použije se močovina (Gibco BRL 15716-020)

Guanidin

Použije se guanidinhydrochlorid (Sigma G4505)

2-propanol

Pracovní pufr mM Tris (Trisma báze, Sigma T1503)

M močovina (Gibco 15716-020)

0,1 % β-merkaptoetanol pH 8, 0 rovnovážný pufr mM TRIS (Trisma báze, Sigma T1503)

8M močovina GibcoBRL 15716-020)

0,1% β-merkaptoetanol

Příklad 2: Exprese, čištění a opětné svinutí molekul TNFa upravených s P2 a P30

Je známo, že během exprese, čištění a opětného svinutí se rekombinantní proteiny chovají odlišným způsobem. Všechny proteiny se exprimují v bakteriích E. coli a síla exprese leží v rozmezí 2 až 20 %. Všechny proteiny se rozeznávají v experimentech westernového přenosu za použití obecně dostupných polyklonálních králičích protilátek proti lidskému TNFa.

Konstrukce TNFa se následně exprimovaly ve 250 ml kultury o velikosti vsádky 3 až 4 1. Všechny modifikované proteiny « * • *

TNFa se exprimovaly jako inkluzní tělíska a vzniklo více jak 85 % čistého a opětně svinutého proteinu.

Obsah proteinu se stanovil standardní BCA analýzou. Všechna proteinová čištění se uskutečnila alespoň ve třech separovaných cyklech pro každou molekulu. Ve všech případech se testovaly proteinové vsádky a zjistilo se, že jsou podobné. Proteiny se skladovaly v koncentraci 0,2 až 1,0 mg/ml v PBS při teplotě -20 °C.

Analýza kontroly kvality jednotlivých proteinových přípravků zahrnuje SDS gelovou elektroforézu barvenou Coomassieovou modří a stříbrem. Ve všech případech se zjistilo, že proteiny mají očekávanou velikost a vykazují více jak 85 % čistotu.

Exprese molekul s epitopy začleněnými v poloze 4 (TNF2-4 a TNF30-4) byla relativně slabá (přibližně 2 %). Tyto molekuly se dále velmi obtížně čistí a další problémy jsou spojeny s jejich opětným svinutím. Molekuly zvláště pak TNF30-4 jsou dobře rozpustný v PBS a mají tendence srážet se během skladování.

Příklad 3: Biologická aktivita různých konstrukcí TNFa

Přímá biologická aktivita čištěných molekul TNFa se testovala v biologickém testu L929, což je standardní test in vitro, kterým je možné stanovit biologickou aktivitu TNFa. Jak je možné vidět na obrázku č. 6 ani P2 nebo P30 upravené molekuly nebyly schopny usmrtit buňky L929 v testovaném koncentračním rozmezí (až 60 mg/ml). Běžně dostupné molekuly rekombinantního TNFa byly plně aktivní při koncentraci 0,6 ng/ml. Přípravek TNFa divokého typu byl také plně aktivní v celém testovaném koncentračním rozmezí.

Příklad 4: Schopnost upravených molekul TNFa indukovat neutralizační protilátky.

4· 44 • 4 4 4

4 4 4 • 444 444

4 •4 44 • · • ♦ 4 4 · 4 4

Králíci se imunizovaly s každou konstrukcí, aby se objasnilo, zda tyto konstrukce indukují protilátky schopné neutralizovat biologicky aktivní lidské TNFa in vitro. Použily se skupiny tří králíků a každý králík dostal 100 mg TNFa ve Freundově úplném adjuvans a následně ve třítýdenních intervalech dalších 100 mg.

Během celé periody imunizace, což je 18 týdnů se sbíraly v regulérních intervalech krevní vzorky a testovala se antiTNFa aktivita v běžném testu ELISA. Jako antigen se použily upravené molekuly lidského TNFa.

Všichni králíci vytvořily během imunizace protilátky proti molekulám TNFa a v každé skupině se maximální množství protilátek nebo titr protilátek lišil v desetinásobcích. Průměrný titr protilátek je zobrazený na obrázku č. 7. TNF2-5, TNF2-7, TNF2-1 a WT-TNFa indukovaly ve 2 až 4 týdnech titr rovnající se hodnotě 100, zatímco TNF2-4 dává znatelně nižší odezvu. Podobné kinetiky se pozorovaly v případě proteinů TNF30, v případě TNF30-4 se získala slabší odezva.

Testovala se schopnost těchto sér interferovat s lidským TNFa a s jejich receptory v testu 1929, stejně jako v testu navázání na receptor na pevné fázi.

Při testu L929 se před přidáním směsí k buňkám L929 k běžně dostupnému lidskému přidalo neimunní kontrolní sérum a ředěné imunní sérum TNFa. Séra získaná ze všech tří králíků v každé skupině se testovala v duplikátech a vypočítaly se průměrné hodnoty. Protože normální sérum má tendenci zvýšit hodnoty pozadí barevného detekčního sytému, odečetly se od všech hodnot a vypočítala se relativní inhibice v procentech. Výsledky kapacitu inhibice ve 14 týdnech se imunizačního rozvrhu u všech králíků jsou uvedeny na obrázku č. 8.

TNF2-5, který neobsahuje substituce v žádném segmentu řetězců zadního β-listu, je jasně nejsilnější ve srovnání s jinými konstrukcemi a tato molekula je srovnatelná se silně *· toxickou molekulou WT-TNFa s ohledem na její schopnost vyvolat neutralizační protilátky (data nejsou uvedena). TNF2-3, který obsahují malý substituovaný segment v D β-listu, a TNF2-7, který neobsahuje žádný substituovaný segment řetězce zadního βlistu, byly také schopny indukovat inhibiční protilátky. Titr neutralizačních protilátek proti TNF2-7 se během následujících tří týdnů podstatně zvyšuje (data nejsou uvedeny). TNF2-4 a TNF2-1, které obsahují G a B β-řetězců zadního β-listu jsou schopny v testu L929 indukovat neutralizační protilátky.

Výsledky s ohledem na proteiny TNF30 byly více heterogenní ačkoli TNF30-3 se zdá být nej lepší v týdnu 14. TNF30-1 a TNF30-4, které obsahují substituce v G a B β-řetězcích zadního β-listu nevyvolávají v testu L929 neutralizační protilátky.

Při testu vázání se na receptor na pevné fázi se receptor I rekombinantního lidského TNFa o velikosti 55 000 (TNF-R55) imobilizoval na mikrotitračních destičkách a přidal se běžně dostupný biotinylovaný lidský TNFa ve vhodném ředění. Specifické navázání na receptor se následně detekuje křenovou peroxidázou značenou streptividinem a chromogenním substrátem. Testovací séra pocházející z imunizovaných králíků se přidala k roztoku biotinem označeného lidského TNFa a pak se uvedená směs přidala na mikrotitrační destičku potaženou TNF-R55. Testovala se séra ze všech tří králíků každé skupiny a vypočítaly se průměrné hodnoty. Jako negativní kontrola se použilo sérum neimunizovaného králíka. Hodnoty pozadí byly velmi nízké a test je velmi citlivý. Výsledky jsou zobrazeny na obrázku č. 9.

Je možné vidět, že výsledky získané v testu L929 a v testu navázání na receptor na pevné fází jsou s ohledem na konstrukce TNFa 2 skoro stejné. V testu na pevné fázi rozdíly mezi TNF30-2, 30-3 a 30-5 nejsou tak velké jako se pozorovalo v testu L929. Test na pevné fázi je však více reprodukovatelný, což způsobuje jeho biochemický spíše než • · « » · buněčný charakter. Normální hodnoty séra se v tomto testu neodečítáj í.

Pro TNF2-3, TNF2-5, TNF2-7, TNF30-3, TNF30-5 a WT-TNFa každého odpovídajícího antiséra se vypočítaly relativní množství séra (v procentech), kterým se dosáhla polovina maximální inhibice navázání TNFa (hodnoty IC₅o) · Předpokládá se, že podobný tvar křivky se objeví v případě antiséra vytvořeného proti TNF2-1, TNF30-1 a TNF30-4. Provedly se extrapolace a vypočítaly se hodnoty IC50. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. II.

>υ

Tabulka

Ή

Ν 'fti

Ψ4 'φ b

ί>

φ a

(ΰ b

b

4-) to φ

4-) >

'Φ b

fO

A4 to

Ή

Ν a

iL &

Η b

g 'Φ

Λ4

TO

Ό

H b

4-J

O b

a <o b

'Φ

TO

O

4b

Ή >υ

Ή r~4 'TO b

.Μ

O

LO υ

H >1

4-J

O b

Ό

O

K

LT)	% 6
1	co
o	*s
co	v—1
1	0\o
o	I>
PO	A
co	o\O CO
1	CO
o
n	o
CM	2 %
1	CO
o
co	o
t—i	% 0
1	o
o	i—1
co	Λ
EH	o\° co
!S	o
r~	38 %
1	«k
CM	—1
ΙΌ	53 %
1
CM	o
KT	00 %
1	5—1
CM	Λ
CO	02 %
1	•k.
. CM	CM
i—1	% 00
1	i—1
CM	Λ

• to to * to · • ·· • · toto* ·«*· *· ·· • ·· • ···· • ·· · · • ·· ♦ •» ·· • · · to •toto to··

Je možné vidět, že TNF2-5 je s ohledem na schopnost vyvolat u králíků neutralizační protilátky proti myšímu TNFa ekvivalentní jako myší TNFa divokého typu (WT) . TNF2-1, TNF24, TNF30-1 a TNF30-4, které všechny obsahují substituce v řetězci B nebo G zadního β-listu nejsou schopny vyvolat takové protilátky nebo tato schopnost je velmi malá. To překvapivě naznačuje, že ačkoli řetězce B a G zadního β-listu se nepodílejí na navázání ne receptor, mutace reprezentované v této oblasti vedou nějakým způsobem k poruše oblastí lidského TNFa, které se podílejí na navázání na receptor. Zdá se, že TNF30-2 a TNF30-3 vyvolávají stejné neutralizační protilátky.

Příklad 5: Schopnost upravených molekul TNFa stimulovat T buňky získané od P2 a P30 imunních zdravých krevních dárců.

Protože se očekávalo, že poloha P2 a P30 epitopu v upravených molekulách TNFa bude také ovlivňovat zpracování antigenu a prezentaci začleněného epitopů a tak i jejich imunogenicitu, všech deset molekul se testovalo v různých T buněčných testech. Použil se test na polyklonálních periferních krevních jednojaderných buněk (PBMC) a vytvořila se řada P2 a P30 specifických T buněčných linií za použití konvenčních imunologických metod, za účelem testovat peptidy TNFa a rekombinantní proteiny se začleněnými P2 a P30 epitopy.

V běžném PBMC proliferačním testu se testovala schopnost 28 zdravých dobrovolníků (dárců) odpovídat na TT a na P2 a P30 peptidy. Na základě těchto výsledků se vybralo 19 jedinců schopných odpovídat na peptidy TT, P2 a P30, kteří se použily v dalších experimentech. Ačkoli úroveň odezvy velmi kolísá, jasně to potvrzuje, že P2 a P30 nejsou rozlišeny stejně jako imunodominantní epitopy T buněk.

0

0 • ··· • 0 * · ·

000 0000

00 «· ·

0

Vedle 28 donorů se vybralo sedm. dalších donorů. Z dále v textu vysvětlených důvodů se někteří vybraly na základě jejich schopnosti odpovídat buď na P30 nebo P2. Několik z nich se dále imunizovalo TT za účelem umožnit silnou odezvu T buněk. Někteří ze druhé skupiny dárců se také použily za účelem vytvořit P2 a P30 specifické buněčné linie. Ty se pak použily při studiu přítomnosti antigenu P2 a P30 upravených syntetických peptidů TNFa a upravených molekul. Na obrázku č. 10 jsou zobrazeny reprezentativní příklady polyklonální PBMC proliferativní odezvy u tří donorů k TT a peptidům P2 a P30.

Testovalo se všech 10 rekombinantních proteinů ve třech provedeních alespoň v šesti různých koncentracích, které začínají u koncentrace 100 mg/ml a všechny PBMC experimenty pro každý protein se opakovaly 2 až 3 krát. Intracelulámí začlenění ³H tymidinu značeného ³H se použilo pro odhad proliferace T buněk a experimenty se sklízely a vyhodnocovaly ve formátu 96-ti prohlubní. Pro každou titrační křivku se vypočítaly se maximální proliferační indexy (Pí), jako vztah mezi průměrným číslem CPM v experimentálních prohlubních děleno průměrným počtem CPM získaných v prohlubních bez antigenu (pouze s PBS) . Proliferační data týkající se T buněk se získala ve třech provedeních a Con A stejně jako P2 a P30 se používají jako negativní a pozitivní kontroly. Na obrázku č. 11 jsou zobrazeny tři příklady experimentů se dvěma různými donory za použití různých P2 a P30 upravených molekul TNFa.

JH odpovídá pouze P2 a SR odpovídá epitopů P2 a P30. To také odráží proliferativní odezvy na P2 a P30 upravené proteiny TNFa, které v různém rozsahu jsou schopny skoro všechny stimulovat PBMC.

Na obrázku č. 12 jsou zobrazeny proliferační indexy (PI) vypočítané pro 34 experimentů. Ačkoli je velmi obtížné kvalitativně porovnat PI mezi různými experimenty, což je způsobeno kolísavým pozadím PBS, zdá se být zřejmé, že skoro

• φ • φφ φ φ ♦ φφφ φφφ φ φ ·· φφ všechny konstrukce více či méně jsou schopny vyvolat proliferační odezvu.

Ve druhé skupině donorů se 1 až 2 měsíce před experimenty vakcinovali někteří jedinci proti TT. PI, které se získaly u těchto osob (HB, MR, KG a MW), patří mezi nejvyšší PI pozorovaná u všech upravených konstrukcí TNFa a hodnocení těchto dat bylo jednoduché. Tři další jedinci (DL, ID a LS) se vakcinovali více než před pěti lety a všichni vykazují hodnoty PI nižší než průměr. To podporuje názor, že pozorovaná PI jsou antigenně specifická. V případě první skupiny donorů nejsou dostupná žádná data týkající se poslední TT vakcinace, ale jejich status imunizace je jasně velmi různorodý.

Není možné vybrat preferované proteiny TNFa 2 nebo TNFa 30 založené pouze na velikosti hodnoty PI. To může být způsobeno statusem heterogenní vakcinace jedince a variabilní podstatou testů PBMC získaných od jedinců s kolísavým statutem odezvy. Velké překvapení bylo, že P2 a P30 ve všech polohách začlenění v molekulách TNFa je možné zpracovat a prezentovat je v T buňkách. Za, účelem vyloučení možnosti, že navzdory opakované afínitní chromatografii, gelové filtraci a dialýze, antigenni přípravek může stále obsahovat podstatnou koncentraci nespecifických mitogenů, se provedly další experimenty.

V testu PBMC se testovali donoři ze druhé skupiny známí tím, že nevykazují odezvu na P2 a P30 stejně jako donoři s opačným paternem odezvy. Na obrázku č. 13 jsou zobrazeny pro DL a ID odezvy na P2, P30 stejně jako na proteiny TNFa 2 a

TNFa 30.

Je možné vidět, že se získala specifická odezva na epitopy T buněk a upravené molekuly TNFa. Nepozorovala se však podstatná proliferativní odezva DL proti proteinům TNFa 30 (horní panel) ani ID proti TNFa 2 (nižší panel) , což podporuje, že nespecifické mitogeny nejsou v čištěných přípravcích TNFa přítomny.

Tato možnost se dokonce testovala za použití P2 a P30 specifických T buněčných linií izolovaných z druhé skupiny donorů, které se kultivovaly alespoň po dobu šesti týdnů alespoň ve třech kolech stimulace se syntetickými P2 a P30 peptidy. Na obrázku č. 14 jsou zobrazeny výsledky dvou takových experimentů.

Je možné vidět, že T buněčné linie specifické pro P2 a P30 se stimulovaly pouze jejich odpovídajícími proteiny P2 a P30. Dále je opět možné vidět, že všechny konstrukce jsou schopny indukovat proliferaci T buněk, což ukazuje, že ačkoli zpracování antigenů může být kvantitativně důležité pro přítomnost P2 a P30, nezdá se být podstatné pro přítomnost antigenů.

V literatuře se uvádí, že lemující oblasti epitopů T buňky mohou ovlivnit navázání antigenních peptidů na molekuly MHC třídy II. Protože žádná z poloh TNFa, která se vybrala pro začlenění epitopů P2 a P30, se nezdá, že negativně ovlivňuje prezentaci antigenů. Dále se zkoumalo, zda různé lemující oblasti sekvencí TNFa začleněných epitopů mohou ovlivnit odezvu T buněk na epitopy P2 a P30, jako výsledek odlišného navázání na molekuly lidských HLA třídy II. Z toho důvodu se syntetizovaly peptidy zobrazené v tabulce III, které reprezentují začleněné epitopy, stejně jako lemující aminokyseliny lidského TNFa. Označují se jako PP2-5, PP30-3 atd. Aminokyselinové sekvence jsou uvedeny v sekvencích SEQ ID NO: 34 až SEQ ID NO: 42, označují se jako Pep2-1 až Pep30-5.

Tabulka č. III

Syntetické peptidy reprezentující P2 a P30 a jejich lemující oblasti TNFa


2-1	SRTPSQYIKANSKFIGITELQLQWL	30-1	SP.7RSFNNFTV5FWLRVPKVSASHLERRANA

• 0 •0 09 ♦ 0 0 · 0 • 9 ··· 0000 ·· ·0

0 0 • 0 9 •00 900 • 9 ·* 90

> _ o	SQVLFQYIKANSKFIGITELISRIA	30-2	ALLANENNFTVSFWLRVPKVSASHLEQVLFK
2-4	AEAKPQYIKAMSKFÍGITELGDRLS	30-3	YSQVLFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVSYQT
2-5	E KG D P.Q Y í K? -MS KFIGIT E LS C-QVY	30-4	QPETPFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEKGDRL
2· 7	MD	30-5	ekgdp.fmnftvsfwlrvpkvsashlegiial

Tyto peptidy se používají pro stimulaci P2 a P30 specifických linií T buněk. Výsledky stimulace linií P30 se zobrazují na obrázku č. 15. Je možné vidět, že P2 specifické linie T buněk pro jedince MR a KG vykazují paralelní paterny stimulace, když se stimulace provádí buď peptidem nebo odpovídajícím proteinem TNFa 2. Je zřejmé, že TNF2-5 je dobrý potencionální antigen a tato data dále podporují jev, že pozorovaný proliferace T buněk je antigenně specifická. V případě, že P30 specifické linie T buněk z MR a KG se stimulovaly buď peptidy nebo proteiny (data nejsou uvedena) neexistují zde obecně žádné kvantitativní rozdíly ve stimulačních paternech. P30 specifická linie T buněk z HC se přednostně rozeznává TNF30-3 a reaguje v malém rozsahu s TNF30-2.

Závěr

Připravilo se a charakterizovalo se deset odlišně upravených proteinů lidského TNFa. Konstruovaly se tak, aby obsahovaly dobře známé neodlišené epitopy T buňky P2 a P30, proto, aby byly potencionálně imunogenní pro 85 % populace.

Všechny proteiny se mohly exprimovat a čistit. Exprese proteinů TNF2-4 a TNF30-4 byla slabá. Zdá se, že mutace v těchto polohách v molekulách TNFa interferují s opětným svinutím, což vede ke vzniku proteinu, který je málo rozpustný.V žádné z upravených molekul TNFa nelze detekovat žádnou biologickou aktivitu molekuly TNFa.

• »

4 4»

4 4

4 4·· • · 4 • · 4 ·

44

Králíci se imunizovaly všemi třemi proteiny a přirozenou molekulou TNFa. Po 2 až 3 měsících imunizace je možné ve všech sérech detekovat vysoké titry silně křížově reagujících protilátek k lidskému, neupravenému TNFa.

Ve dvou odlišných testech in vitro, v biotestu L929 a v testu navázání na receptor na pevné fázi se testovala schopnost těchto protilátek interferovat s biologickou aktivitou přirozeného TNFa. Oba testy vykazují, že TNF2-1, TNF2-4, TNF30-1 a TNF30-4 nejsou schopny v podstatě indukovat neutralizační protilátky, zatímco TNF2-5 se porovnával s ostatními konstrukcemi. TNF30-2 a TNF30-3 jsou stejně účinné při vyvolání neutralizačních protilátek a jsou dvakrát účinnější ve srovnání s TNF30-5, který je vyhovující.

Překvapivě nebylo možné zjistit podstatné rozdíly mezi schopnostmi molekul stimulovat proliferaci PBHC. Mohlo by se demonstrovat, že to není způsobeno přítomností mitogenů v přípravcích antigenů na základě těchto dat se došlo k závěru, že všechny vybrané polohy pro P2 a P30 umožňují prezentaci epitopů. Specifita odpovědí se dále dokumentovala testováním upravených proteinů TNFaza použití linií T buněk specifických pro epitop . a syntetických peptidů, které reprezentují začleněné epitopy a lemující sekvence TNFa. Tyto experimenty jasně ukazují, že TNF2-5, TNF30-2 a TNF30-3 (mezi jinými konstrukcemi) jsou nej silnější potenciální imunogeny.

4

4 4 4 • 4» 4 »· 44 • * · • · ·*· • · · 4 • ♦ · 4 ♦* 44

4

4 4

Sekvenční protokol (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 477 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetě
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne

(iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..477 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

počátek kodonu =1 funkce = antigen produkt = analog TNF-alfa důkaz = experimetální gen = tnfP2-l standardní název = TNF2-1 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

ATG Met 1

GTC AGA

TCA Ser

TCT TCT

CGA Arg

ACC Thr

CCG AGT

CAG Gin

TAC ATT AAA GCC AAT

48

Val

Arg

Ser 5

Ser

Pro

Ser 10

Tyr

Ile

Lys

Ala 15

Asn

TCT

AAA

TTC

ATC

GGV

ATA

ACT

GAG

CTG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

96

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn

Arg

20

25

30

• ·

♦ φ · ♦ φ φ

• · • φ φφφ

CGG Arg

GCC Ala

AAT Asn 35

GCC Ala

CTC Leu

CTG Leu

GCC Ala

AAT Asn 40

GGC Gly

GTG Val

GAG Glu

CTG Leu

AGA GAT AAC

CAG Gin

144

Arg 45

Asp

Asn

CTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

192

Leu

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

50

55

60

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

ACC

CAC

ACC

240

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu

Th r

His

Thr

65

70

75

80

ATC

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

TCT

288

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Ser

85

90

95

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

336

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

100

105

110

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

38 4

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

115

120

12 5

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

432

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

130

135

140

TTT

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

477

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ala

Leu

4-

145

150

155

2) Informace ο SEQ ID ΝΟ: 2:

	(i)		CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(ii) (Xi)	(A) DÉLKA: 159 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární DRUH MOLEKULY: protein Popis sekvence: SEQ ID NO: 2
Met 1	Val	Arg	Ser Ser Ser Arg Thr 5	Pro Ser Gin 10	Tyr	Ile	Lys	Ala 15	Asn
Ser	Lys	Phe	Ile Gly Ile Thr Glu 20	Leu Gin Leu 25	Gin	Trp	Leu 30	Asn	Arg
Arg	Ala	Asn 35	Ala Leu Leu Ala Asn 40	Gly Val Glu	Leu	Arg 45	Asp	Asn	Gin
Leu	Val 50	Val	Pro Ser Glu Gly Leu 55	Tyr Leu Ile	Tyr 60	Ser	Gin	Val	Leu
Phe 65	Lys	Gly	Gin Gly Cys Pro Ser 70	Thr His Val 75	Leu	Leu	Thr	His	Thr 80
Ile	Ser	Arg	Ile Ala Val Ser Tyr 85	Gin Thr Lys 90	Val	Asn	Leu	Leu 95	Ser

• 9

44 • 4 4 • 4 44» • · 4 4 • * · 4 ·· 44 ·· 4» • · · 4

4« · •44 ·»· •444 ·« _φ«

Ala

Ile

Lys

Ser 100

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu 105

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala 110

Glu

Ala

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

115

120

125

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

130

135

140

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ala

Leu

145

150

155

2)

Informace

o :

SEQ

ID

NO:

3:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 477 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..477 (D) Jiné informace:

počátek kodonu =1 funkce = antigen produkt = analog TNF-alfa gen = tnfP2-3 standardní název = TNF2-3 (xii) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

*« ·· > · · ► ♦ ··· » · · « • · · ·· ·· ··

Β · · « » · * · ··· ··· • β ·· ««

ATG	GTC	AGA TCA	TCT	TCT	CGA	ACC	CCG	AGT
Met	Val	Arg Ser	Ser	Ser	Arg	Thr	Pro	Ser
160				165
GTT	GTA	GCA AAC	CCT	CAA	GCT	GAG	GGG	CAG
Val	Val	Ala Asn	Pro	Gin	Ala	Glu	Gly	Gin
			180					185
CGG	GCC	AAT GCC	CTC	CTG	GCC	AAT	GGC	GTG
Arg	Ala	Asn Ala	Leu	Leu	Ala	As n	Gly	Val
		195					200
CTG	GTG	GTG CCA	TCA	GAG	GGC	CTG	TAC	CTC
Leu	Val	Val Pro	Ser	Glu	Gly	Leu	Tyr	Leu
		210				215
TTC	CAG	TAC ATA	AAG	GCC	AAC	TCC	A*\G	TTT
Phe	Gin	Tyr Ile	Lys	Ala	Asn	Ser	Lys	Phe
	225				230
ATC	AGC	CGC ATC	GCC	GTC	TCC	TAC	CAG	ACC
Ile	Ser	Arg Ile	Ala	Val	Ser	Tyr	Gin	Thr
240			24 5
GCC	ATC	AAG AGC	CCC	TGC	CAG	AGG	GAG	ACC
Ala	Ile	Lys Ser	Pro	Cys	Gin	Arg	Glu	Thr
			260					265
AAG	CCC	TGG TAT	GAG	CCC	ATC	TAT	CTG	GGA
Lys	Pro	Trp Tyr	Glu	Pro	Ile	Tyr	Leu	Gly
	275					280
AAG	GGT	GAC CGA	CTC	AGC	GCT	GAG	ATC	AAT
Lys	Gly	Asp Arg	Leu	Ser	Ala	Glu	Ile	Asn
	290				295
TTT	GCC	GAG TCT	GGG	CAG	GTC	TAC	TTT	GGG
Phe	Ala	Glu Ser	Gly	Gin	Val	Tyr	Phe	Gly
	305				310

GAC Asp 170	AAG Lys	CCT Pro	GTA Val	GCC Ala	CAT His 175	48
CTC	CAG	TGG	CTG	AAC	CGC	96
Leu	Gin	Trp	Leu	Asn 190	Arg
GAG	CTG	AGA	GAT	AAC	CAG	144
Glu	Leu	Arg	Asp 205	Asn	Gin
ATC	TAC	TCC	CAG	GTC	CTC	192
Ile	Tyr	Ser 220	Gin	Val	Leu
ATC	GGC	ATC	ACC	GAG	CTC	240
Ile	Gly 235	Ile	Thr	Glu	Leu
AAG	GTC	AAC	CTC	CTC	TCT	288
Lys 250	Val	Asn	Leu	Leu	Ser 255
CCA	GAG	GGG	GCT	GAG	GCC	336
Pro	Glu	Gly	Ala	Glu 270	Ala
GGG	GTC	TTC	CAG	CTG	GAG	38-4
Gly	Val	Phe	Gin 285	Leu	Glu
CGG	CCC	GAC	TAT	CTC	GAC	432

Arg Pro Asp Tyr Leu Asp 300

ATC ATT GCC CTC TAG Ile Ile Ala Leu *

315

477

	59	• •	• · • 9 ··	• · • ·«	• · · ··· ··· • · · · ··» ···· ·· ·«
	(2) Informace o SEQ ID NO: 4: (i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 159 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
-	Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro 1 5	Ser Asp Lys Pro 10	Val	Al a 15	His
	Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly 20 25	Gin Leu Gin Trp	Leu 30	Asn	Arg
	Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly 35 40	Val Glu Leu Arg 45	Asp	Asn	Gin
	Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr 50 55	Leu Ile Tyr Ser 60	Gin	Val	Leu
	Phe Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys 65 7 0	Phe Ile Gly Ile 75	Thr	Glu	Leu 80
	Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin 85	Thr Lys Val Asn 90	Leu	Leu 95	Ser
	Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu 100 1C5	Thr Pro Glu Gly	Ala 110	Glu	Ala
	Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu 115 120	Gly Gly Val Phe 125	Gin	Leu	Glu
	Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile 130 135	Asn Arg Pro Asp 140	Tyr	Leu	Asp
»	Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Pne 145 150	Gly Ile Ile Ala 155	Leu	*·

» · · · » · · · ··· ··· • · ·· ·· • · ·

Informace o SEQ ID NO: 5:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 477 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetě (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: cDNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč; CDS (B) Pozice: 1 . . 477 (D) Jiné informace:

počátek kodonu =1 funkce = antigen produkt = analog TNF-alfa gen = tnfP2-4 standardní název - TNF2-4 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

» · · 4 ·· · ··4

ATG Met 160

GTC AGA TCA TCT

TCT Ser 165

CGA ACC

CCG Pro

AGT Ser

GAC PAG

CCT Pro

GTA Val

GCC Ala

CAT His 175

48

Val

Arg

Ser

Arg

Thr

Asp 17 0

Lys

GTT

GTA

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

PAC

CGC

96

Val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn

Arg

180

185

190

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

14 4

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Ala

Asn

Gly

Val

Glu

Leu

Arg

Asp

Asn

Gin

—

195

200.

205

CTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

192

Leu

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

lle

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

210

215

220

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

ACC

CAC

ACC

240

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu

Thr

His

Thr

225

230

235

ATC

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

PAC

CTC

TCT

O O O z.·_·

lle

Ser

Arg

lle

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Ser

240

245

250

255

GCC

ATC

PAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

3 36

Ala

lle

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

260

265

270

AAG

CCC

CAG

TAT

ATC

AAG

GCC

AAT

TCG

AAA

TTC

ATC

GGC

ATC

ACG

GAG

384

Lys

Pro

Gin

Tyr

lle

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

lle

Gly

lle

Thr

Glu

275

280

28 5

CTC

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

4 32

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

lle

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

290

295

300

TTT GCC GAG '

TCT <

3GG ‘

CAG

GTC '

TAC ¹

ΤΨΤ ¹

SGG ATC ATT

GCC '

CTC '

TAG

477

Phe Ala Glu

Ser i

Gly '

Gin '

Val '

Tyr

Phe i

Gly

lle

lle .

Ala

Leu

•k

305

310

315

(2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 159 aminokyselin (B) TYP: nukleová kyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6

Met 1

Val

Arg

Ser

Ser 5

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser 10

Asp

Lys

Pro

Val

Ala 15

His

Val

Ala

As n 20

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly 25

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu, 30

Asn

Arg

• · ·

Arg Ala Asn

Ala

Leu

Leu Ala

Asn 40

Gly

Val

Glu

Leu Arg 45

Asp

As n

Gin

35

Leu

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

50

55

60

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu

Thr

His

Thr

65

70

75

80

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Ser

85

90

95

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

100

105

110

Lys

Pro

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

115

120

125

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

130

135

140

Phe

Ala

Glu

Ser

cly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ala

Leu

145

150

155

(2)

Informace

o :

3EQ

ID

NO:

7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(iv) POZITIVNÍ: ne (vii) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..477 (D) Jiné informace:

funkce = antigen produkt = analog TNF-alfa gen = tnfP2-5 standardní název = TNF2-5 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

63

• · · · ·

• · • · • · ·· · ····

• « * · • ··· • • ·

• · · • · · • ·

• · • • ·

ATG

GTC

AGA

TCA

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

GAC

AAG

CCT

GTA

GCC

CAT

. 48

Met

Val

Arg

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys

Pro

Val

Ala

His

160

165

170

175

GTT

GTA

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

96

Val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn

Arg

180

185

190

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

144

Arg

Al a

Asn

Ala

Leu

Ala

Asn

Gly

Val

Glu

Leu

Arg

Asp

Asn

Gin

195

200

205

CTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

192

Leu

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser

Gin.

Val

Leu

210

215

220

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

ACC

CAC

ACC

240

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu

Thr

His

Thr

225

230

235

ATC

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

TCT

288

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Ser

240

245

250

255

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

336

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly- -Ala

Glu

Ala

260

265

270

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

384

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

275

280

285

AAG

GGT

GAC

CGA

CAG

TAC

ATT

AAG

GCC

AAT

TCG

AAG

TTC

ATT

GGC

ATC

432

Lys

Gly Asp

Arg

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

290

295

300

ACT

GAG

CTG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

4 77

Thr

Glu

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ala

Leu

305

310

315

• · • ·

(2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 159 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein

(xi)

Popis

sekvence: SEQ

ID

NO:

8

Met

Val

Arg

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys

Pro

Val

Ala

His

1

5

10

15

Val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu

As n

Arg

20

25

30

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Ala

Asn

Gly

Val

Glu

Leu

Arg

Asp

Asn

Gin

35

40

45

Leu

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

50

55

60

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu

Thr

His

Thr

65

70

75

80

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Ser

85

90

95

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

100

105

110

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

115

120

125

Lys

Gly

Asp

Arg

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

130

135

140

Thr

Glu

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ala

Leu

4

145

150

155

• · · φ φ ·Φ· • · · · · • · · · · · · ··· · · ·· · • · Φ Φ 9 β • · · ······ • · · ·

9999999 99 99 (2) Informace ο SEQ ID ΝΟ: 9:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 477 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..477 (D) Jiné informace:

počátek kodonu =1 funkce = antigen produkt = analog TNF-alfa gen = tnfP2-7 standardní název = TNF2-7 (xi)

Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

* · ·· »· • · · ·

ATG

GTC

AGA

TCA

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

GAC

AAG

CCT

GTA

GCC

CAT

Met 160

Val

Arg

Ser

Ser 165

Arg

Thr

Pro

Ser

Asp 170

Lys

Pro

Val

Ala

His 17 5

GTT

GTA

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

Val

Ala

Asn

Pro 180

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin 185

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn 190

Arg

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

Arg

Ala

Asn

Ala 195

Leu

AI a

Asn

Gly 200

Val

Glu

Leu

Arg

Asp 205

Asn

Gin

CTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

Leu

Val

Val 210

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu 215

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser 220

Gin

Val

Leu

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

CAG

TAC

ATC

AAA

Phe

Lys 225

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro 230

Ser

Thr

His

Val

Leu 235

Gin

Tyr

Ile

Lys

GCT

AAC

TCC

ΆΑΆ

TTC

ATC

GGC

ATC

ACC

GAA

CTG

GTT

AAC

CTC

TCT

Ala 240

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile 245

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu 250

Val

Asn

Leu

Ser 255

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro 260

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr 265

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu 270

Ala

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

Lys

Pro

Trp

Tyr 275

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu 280

Gly

Val

Phe

Gin 285

Leu

Glu

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

Lys

Gly

Asp. 290

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu 295

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp 300

Tyr

Leu

Asp

TTT

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

Phe

Ala 305

Glu

Ser

Gly

Gin

Val 310

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile 315

Ala

Leu

*

144

192

240

88

336

384

432

477 • · to · * • · • to • to ·· · · • · «to · · • · · · · · * *·>· ♦ · · · « · · * • ·· ·«··· · · · · (2) Údaje k SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 159 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 10:

Met 1

Val

Arg

Ser

Ser 5

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser 10

Asp

Lys

Pro

Val

Ala 15

His

Val

Ala

Asn 20

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly 25

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu 30

Asn

Arg

Ala

Asn 35

Ala

Leu

Ala

Asn 40

Gly

Val

Glu

Leu

Arg 45

.Asp

Asn

Gin

Leu

Val 50

Val

Pro

Ser

Glu

Gly 55

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr 60

Ser

Gin

Val

Leu

Phe 65

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys 70

Pro

Ser

Thr

His

Val 75

Leu

Gin

Tyr

Ile

Lys 80

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe 85

I le

Gly

Ile

Thr

Glu 90

Leu

Val

Asn

Leu

Leu 95

Ser

Ala

Ile

Lys

Ser 100

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu 105

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala 110

Glu

Ala

Lys

Pro

Trp 115

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr 120

Leu

Gly

Val

Phe 125

Gin

Leu

Glu

Lys

Gly 130

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala 135

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro 140

Asp

Tyr

Leu

Asp

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ala

Leu

•fe

145 150 '155 ·· · · ’ « ♦ a » · · a aaa aaa • · • « • · ·· • · 4 • · « (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 477 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetěz
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..477 (D) Jiné informace:

počátek kodonu =1 funkce = antigen produkt = analog TNF-alfa gen = tnfP30-l standardní název = TNF30-1 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

·· ·· > * · · ( · · · ·· · · · · • · ·♦ ·· ·♦ ·« » · · , * · · * > * · « > * · «

ATG

GTC

AGA

TCA

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

TTC

AAC

AAT

Met

Val

Arg

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Phe

Asn

As n

160

165

170

AGC

TTT

TGG

CTC

CGT

GTA

CCT

AAG

GTG

TCG

GCC

TCG

CAC

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

180

185

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Ala

Asn

Gly

Val

Glu

Leu

Arg

195

200

CTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

Leu

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

lle

Tyr

Ser

210

215

220

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu

225

230

235

ATC

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

lle

Ser

Arg

lle

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

240

24 5

250

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

Ala

lle

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

260

265

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

lle

Tyr

Leu

Gly

Val

Phe

275

280

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

lle

Asn

Arg

Pro

Asp

290

295

300

TTT

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

lle

Ala

305

310

315

205

285

ACC GTA Thr Val

175

GAG CGC Glu Arg 190

AAC CAG Asn Gin

GTC CTC Val Leu

255

270

144

19Í

240

336

384

43477

ΊΟ (2) Informace ο SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 159 aminokyselin (B) TYP: nukleová kyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12

100

115

Lys Gly Asp Arg 130

Phe Ala Glu Ser 145

150

135

120

1C5

140

155

125

·· 44 ♦ · 4 4

4 4 4

444 444 ··· (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 477 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne
(V)	PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANIZMUS: Homo sapiens

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..477 (D) Jiné informace:

počátek kodonu =1 funkce - antigen produkt = analog TNF-alfa gen = tnfP30-2 standardní název = TNF30-2 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

72

• • 4 4 4 4

• ·« • · * ··* • · • « • ·»

• » •

4 4 4 4 4 4 · 4 4 • 4 4 4 444 4444

·« ·· • · · · • · * · • ·»» ··» » · ·« «·

ATG

GTC

AGA

TCA

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

GAC

AAG

CCT

GTA

GCC

CAT

48

Met

Val

Arg

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys

Pro

Va J.

Ala

His

160

165

170

175

GTT

GTA

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

96

Val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn

Arg

180

185

190

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

TTC

AAC

TTG

ACA

GTT

AGC

TTC

144

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Ala

Asn

Phe

Asn

As n

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

195

200

205

TGG

TTG

AGG

GTA

CCA

AAG

GTC

TCG

GCC

AGC

CAC

CTC

GAG

CAG

GTC

CTC

192

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Gin

Val

Leu

210

215

220

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

ACC

CAC

ACC

24 0

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu

Thr

His

Thr

225

230

235

ATC

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

TCT

288

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

As n

Leu

Ser

240

245

250

255

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

336

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

260

265

270

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

384

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

275

280

285

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

432

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

290

295

300

TTT

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

477

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ala

Leu

*

305

310

315

• 9 9 • · · ·· • 9 9 9 9 * · 9 9

99

99 ·· • 9 · · · • 9 9 9 9

9 999 999 ► · · ř·· ·· 99 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i)

CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(Xi

)

Popis

sekvence:

SEQ

ID

NO:

14:

Met

Val

Arg

Ser Ser

Ser Arg Thr

Pro

Ser

Asp

Lys

Pro

Val

Ala

His

1

5

10

15

Val

Ala

Asn Pro

Gin Ala Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn

Arg

20

25

30

Arg

Ala

Asn

Ala Leu

Leu Ala Asn

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

35

40

45

Trp

Leu

Arg

Val Pro

Lys Val Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Gin

Val

Leu

50

55

60

Phe

Lys

Gly

Gin Gly

Cys Pro Ser

Thr

His

Val

Leu

Thr

His

Thr

65

70

75

80

Ile

Ser

Arg

Ile Ala

Val Ser Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Ser

85

90

95

Ala

Ile

Lys

Ser Pro

Cys Gin Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

100

105

110

Lys

Pro

Trp

Tyr Glu

Pro Ile Tyr

Leu

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

115

120

125

Lys

Gly

Asp

Arg Leu

Ser Ala Glu

Ile

As n

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

130

135

140

Phe

Ala

Glu

Ser Gly

Gin Val Tyr

Phe

Gly

Ile

Ala

Leu

-

145

150

155

(2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 477 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetěz,
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne

(VÍ) PŮVODNÍ ZDROJ:

* ·

	74	·· ·· ♦ ·» ·· ·· • · · ···· · · · · • · ··· · · ♦ ί ί Ϊ Ϊ i · · · · » » ··· ··· ···· ·♦ · · ·· ·· ··»··»« «·
	(A) ORGANIZMUS: Homo	sapiens
(ix)	ZNAKY: (A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..477 (D) Jiné informace: počátek kodonu =1 funkce = antigen produkt = analog gen = tnfP30-3 standardní název	TNF-alfa = TNF30-3
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID	NO: 15:

ATG Met 160

GTC Val

AGA Arg

TCA Ser

TCT Ser

TCT Ser 165

CGA ACC

CGG Pro

AGT Ser

GAC A.sp 17 0

AAG Lys

CCT Pro

GTA Val

GCC Ala

CAT His 175

48

Arg

Thr

GTT

GTA

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

96

Val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn

Arg

180

185

190

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

144

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Ala

Asn

Gly

Val

Glu

Leu

Arg

Asp

Asn

Gin

195

200

205

CTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

192

Leu

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

210

215

220

TTC

AAC

TTT

ACC

GTC

TCC

TTC

TGG

CTT

CGG

GTA

CCC

AAG

GTC

AGC

24 0

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

P ro

Lys

Val

Ser

225

230

235

GCT

AGC

CAC

CTC

GAG

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

TCT

2 8 8

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

I,eu

Leu

Ser

240

245

250

255

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

336

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Al a

Glu

Ala

260

265

270

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

384

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

275

280

285

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

432

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

290

295

300

TTT

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

477

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ala

Leu

4-

305 310 315 ·· ·· • · · • · ···

9 9 19 • 11 1

11

11 · • · 1 1

111 111 1 · ·· ·* (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(xi)	Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	16
Met Val Arg 1	Ser Ser 5	Ser Arg Thr	Pro	Ser 10	Asp	Lys Pro Val Ala His 15
Val Val Ala	Asn Pro 20	Gin Ala Glu	Gly 25	Gin	Leu	Gin Trp Leu Asn Arg 30
Arg Ala Asn 35	Ala Leu	Leu Ala Asn 40	Gly	Val	Glu	Leu Arg Asp Asn Gin 45
Leu Val Val 50	Pro Ser	Glu Gly Leu 55	Tyr	Leu	Ile	Tyr Ser Gin Val Leu 60
Phe Asn Asn 65	Phe Thr	Val Ser Phe 70	Trp	Leu	Arg 7 5	Val Pro Lys Val Ser 80
Ala Ser His	Leu Glu 85	Val Ser Tyr	Gin	Thr 90	Lys	Val Asn Leu Leu Ser 95
Ala Ile Lys	Ser Pro 100	Cys Gin Arg	Glu 105	Thr	Pro	Glu Gly Ala Glu Ala 110
Lys Pro 'Trp 115	Tyr Glu	Pro Ile Tyr 120	Leu	Gly	Gly	Val Phe Gin Leu Glu 12 5
Lys Gly Asp 130	Arg Leu	Ser Ala Glu 135	Ile	Asn	Arg	Pro Asp Tyr Leu Asp 140
Phe Ala Glu 145	Ser Gly	Gin Val Tyr 150	Phe	Gly	Ile 155	Ile Ala Leu

(2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 477 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens ·

9 999

9 9 9 9 • 9 9 9

99

9 9

9

9 9

9

999 9999

99 « 9 9 9

9 9 9

999 999 • · ·· ··

(ix) ZNAKY:
(A)	Název/klíč: CDS
(B)	Pozice: 1 ..477
(D)	Jiné informace:

funkce = antigen produkt = analog TNF-alfa gen = tnfP30-4 standardní název = TNF30-4 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

ATG

GTC

AGA

TCA

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

GAC

AAG

CCT

GTA

GCC

CAT

Met 160

Val

Arg

Ser

Ser 165

Arg

Thr

Pro

Ser

Asp 17 0

Lys

Pro

Val

Ala

His 175

GTT

GTA

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

Val,

Val·

Ala

Asn

Pro 180

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin 185

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn 190

Arg

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

Arg

Ala

Asn

Ala 195

Leu

Ala

Asn

Gly 200

Val

Glu

Leu

Arg

Asp 205

Asn

Gin

CTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

Leu

Val

Val 210

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu 215

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser 220

Gin

Val

Leu

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

ACC

CAC

ACC

Phe

Lys 225

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro 230

Ser

Thr

His

Val

Leu 235

Leu

Thr

His

Thr

ATC

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

TCT

Ile 240

Ser

Arg

Ile

Ala

Val 245

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys 25 0

Val

Asn

Leu

Ser 255

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

TTT

AAT

TTC

ACC

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro 260

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr 265

Pro

Phe

As n

Asn

Phe 270

Thr

GTG

TCC

TTC

TGG

TTG

CGC

GTC

CCT

AAG

GTA

AGC

GCT

TCC

CAC

CTG

GAG

Val

Ser

Phe

Trp 275

Leu

Arg

Val

Pro

Lys 280

Val

Ser

Ala

Ser

His 285

Leu

Glu

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

Lys

Gly

Asp 290

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu 295

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp 300

Tyr

Leu

Asp

TTT

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

Phe

Ala 305

Glu

Ser

Gly

Gin

Val 310

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile 315

Al a

Leu

4

192

0

OOO Ze u

336

384

432

477 ·· » · > · ·· · • · • · · • ····

(2) Údaje	k SEQ	ID NO: 18:
(í)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 159 aminokyselin
	(B)	TYP: protein
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 18

Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His 15 10 15

Val

Ala

Asn 20

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly 25

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu 3 0

Asn

Arg

Ala

Asn 35

Ala

Leu

Ala

Asn 40

Gly

Val

Glu

Leu

Arg 45

Asp

Asn

Gin

Leu

Val 50

Val

Pro

Ser

Glu

Gly 55

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr 60

Ser

Gin

Val

Leu

Phe 65

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys 70

Pro

Ser

Thr

His

Val 75

Leu

Thr

His

Thr 80

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala 85

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr 90

Lys

Val

Asn

Leu

Leu 95

Ser

Ala

Ile

Lys

Ser 100

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu 105

Thr

Pro

Phe

Asn

Asn 110

Phe

Thr

Val

Ser

Phe 115

Trp

Leu

Arg

Val

Pro 120

Lys

Val

Ser

Ala

Ser 125

His

Leu

Glu

Lys

Gly 130

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala 135

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro 140

Asp

Tyr

Leu

Asp

Phe 145

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin 150

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile 155

Ile

Ala

Leu

•k

(2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA.: 477 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens ·»φ > Φ ♦ 4 » φ Φ 4 • Φ ΦΦ •Φ »· • · Φ Φ • Φ Φ Φ ·· · Φ·« • ·

Φ· ΦΦ

(ix) ZNAKY:
(A)	Název/klíč: CDS
(B)	Pozice: 1 ..477
(D)	Jiné informace:

počátek kodonu =1 funkce = antigen produkt = analog TNF-alfa

	gen =	tnfP30-5
	standardní název = TNF30-5
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
ATG GTC AGA TCA	TCT TCT	CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT 48
Met Val Arg Ser	Ser Ser	Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His
160	165	170 US
GTT GTA GCA AAC	CCT CAA	. GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC 96
Val Val Ala Asii	Pro Gin	Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg
	180	185 * 190
CGG GCC AAT GCC	CTC CTG	GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG 14.4
Arg Ala Asn Ala	Leu Leu	Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
19 5		200 205
CTG GTG GTG CCA	TCA GAG	GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC 192
Leu Val Val Pro	Ser Glu	Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu
210		215 220
TTC AAG GGC CAA	GGC TGC	CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC 240
Phe Lys Gly Gin	Gly Cys	Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
225		230 235
ATC AGC CGC ATC	GCC GTC	TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT 288
Ile Ser Arg Ile	Ala Val	Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
240	245	250 255
GCC ATC AAG AGC	CCC TGC	CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC 336
Ala Ile Lys Ser	Pro Cys	Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
	260	265 270
AAG CCC TGG TAT	GAG CCC	ATC TAT CTG GGA C-GG GTC TTC CAG CTG GAG 3 84
Lys Pro Trp Tyr	Glu Pro	Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu
275		280 285
AAG GGT GAC CGA	TTC AAC	AAT TTC ACC GTA AGC TTC TGG GTT CGC GTC 432
Lys Gly Asp Arg	Phe Asn	Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val
290		295 300
CCT AAG GTG TCT	GCG TCG	CAC CTC GAA GGG ATC ATT GCC CTC TAG 477
Pro Lys Val Ser	Ala Ser	His Leu Glu Gly Ile Ile Ala Leu ⁺

305 310 315 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

Met 1

(xi)

Popis Ser Ser 5

sekvence:

SEQ ID NO: 20:

His

Val

Arg

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser 10

Asp

Lys Pro

Va 1

Ala 15

Val

Ala

Asn Pro

Gin

Ala

Glu

G.l y

Gin

Leu

Gin Trp

Leu

Asn

Arg

20

25

30

Arg

Ala

Asn

Ala Leu

Leu

Ala

Asn

GJ. y

Val

Glu

Leu Arg

Asp

Asn

Gin

35

40

45

Leu

Val

Pro Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr Ser

Gin

Val

Leu

50

55

60

Phe

Lys

Gl y

Gin Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu Leu

Tl; t:

His

Thr

65

70

75

80

Ile

Ser

Arg

Ile Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val Asn

Leu

Ser

85

90

95

Ala

Ile

Lys

Ser Pro 100

Cys

Gin

Arg

Glu 105

Thr

Pro

Glu Gly

Ala 110

Glu

Ala

Lys

Pro

Trp 115

Tyr Glu

Pro

Ile

Tyr 120

Leu

Gly

Val Phe 12 5

Gin

Leu

Glu

Lys

Gly 130

Asp

Arg Phe

Asn

Asn 135

Phe

Thr

Val

Ser

Phe Trp 140

Leu

Arg

Val

Pro 145

Lys

Val

Ser Ala

Ser 150

His

Leu

Glu

Gly

Ile 155

Ile Ala

Leu

*

(2)

Informace o

SEQ

ID

NO:

21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 24 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature ···· ·· · · ·· ·· ··· ··»· ·· ¢9 (B) Pozice: 1 .. 24 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa produkt = primer vázající se k genu TNF-alfa důkaz = experimetální standardní název - TNF-alfa Primer I označení = Primerl (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

GACAAGCCCA TGGTCAGATC ATCT 2 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 30 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 1 ..30 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa produkt = primer vázající se k genu TNF-alfa důkaz = experimetální standardní název = TNF-alfa Primer II označení = Primer2 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

TCTCTAGAGG GCAATGATCC CAAAGTAGAC (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 21 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: misc_feature (B) Pozice: 1 ..21 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa produkt = primer vázající se k genu TNF-alfa důkaz = experimetální standardní název = TNF-alfa Primer III označení = Primer3 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

CCCAAAGTAG ACCTGCCCAG A (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 69 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetě
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(v)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(vi)	HYPOTETICKÁ: ne

• · • · ·· • · · ·

(ví i	) POZITIVNÍ: ne
(Vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A) organizmus: Homo	sapiens
(ix)	ZNAKY:
(A)	Název/klíč: insertior	l seq
(B)	Pozice: 7 ..51
(C)	Způsob identifikace:	experimentální
(D)	Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kóduj ící TNF-alfa důkaz - experimetální organizmus = Homo sapiens standardní název = Primer mut2-l označení = mut2-l poznámka= primer mut2-l je synteticky syntetizovaný 69-mérový oligonukieotid obsahující DNA kódující epitop P2 lidské T buňky mezi proužky DNA, která je homologní s proužky lidského genu TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

ACCCCGAGTC AGTACATTAA AGCCAATTCT AAATTCATCG GTATAACTGA GCTGCAGCTC . 60

CAGTGGCTG ⁶⁹ (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 73 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetěz
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: insertion_seq (B) Pozice :15..59 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa důkaz = experimetální organizmus - Homo sapiens standardní název = Primer mut2-3 označení = mut2-3 poznámka= primer mut2-3 je synteticky syntetizovaný 73-mérový oligonukleotid obsahující DNA kódující epitop P2 lidské T buňky mezi proužky DNA, která je homologní s proužky lidského genu TNF-alfa (v) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

CCCAGGTCCT CTTCCAGTAC ATAAAGGCCA ACTCCAAGTT TATCGGCATC ACCGAGCTCA 60

TCAGCCGCAT CGC 73 (2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 75 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: insertion_seq • ·

(Β) (C) (D)

Pozice: 12 ..56

Způsob identifikace: experimentální Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa důkaz = experimetální organizmus = Homo sapiens standardní název = Primer mut2-4 označení = mut2-4 poznámka= primer mut2-4 je synteticky syntetizovaný 75-mérový oligonukleotid obsahující DNA kódující epitop P2 lidské T buňky mezi proužky DNA, která je homologní s proužky lidského genu TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

AGTCGGTCAC CGAGCTCCGT GATGCCGATG AATTTCGAAT TGGCCTTGAT ATACTGGGGC 60

TTGGCCTCAG CCCCC ⁷⁵ (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 75 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetě
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(vi)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(vii)	HYPOTETICKÁ: ne
(viii)	POZITIVNÍ: ne

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: insertion_seq (B) Pozice: 8 ..52 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

• * ····· · ····· ····» · · · ··· ··· ······ ·· ·· »· ··· ···· ·· ·· funkce = primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa důkaz = experimetální organizmus = Homo sapiens standardní název = Primer mut2-5 označení = mut2-5 poznámka= primer mut2-5 je synteticky syntetizovaný 75-mérový oligonukleotid obsahující DNA kódující epitop P2 lidské T buňky mezi proužky DNA, která je homologní s proužky lidského genu TNF-alfa (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:

GAAGGGTGAC CGACAGTACA TTAAGGCCAA TTCGAAGTTC ATTGGCATCA CTGAGCTGTC 60

TGGGCAGGTC TACTT ^{7 5} (2) Informace o SEQ ID NO: 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 80 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii	) HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne
(Vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	organizmus: Homo sapiens
ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: insertion_seq
	(B)	Pozice: 14 ..58
	(C)	Způsob identifikace: experimentální
	(D)	Jiné informace:

funkce - primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa důkaz = experimetální

• · ·· • · · · • e · · · organizmus = Homo sapiens standardní název = Primer mut2-7 označení = mut2-7 poznámka= primer mut2-7 je synteticky syntetizovaný 80-mérový oligonukleotid obsahující DNA kódující epitop P2 lidské T buňky mezi proužky DNA, která je homologní s proužky lidského genu TNF-alfa (x) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:

CACCCATGTG CTCCAGTACA TCAAAGCTAA CTCCAAATTC ATCGGCATCA CCGAACTGGT 60

TAACCTCCTC TCTGCCATCA ⁸⁰ (2) Informace o SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 96 párů	baží
	(B)	TYP: nukleová	kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:	j ednořetě
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA	(genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: insertion__seq (B) Pozice: 10 ..72 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa důkaz = experimetální organizmus = Homo sapiens standardní název = Primer mut30-l označení = mut30-l

• 4 4 • »4 • 4 4 44 poznámka= primer mut30-l je synteticky syntetizovaný 96-mérový oligonukleotid obsahující DNA kódující epitop P30 lidské T buňky mezi proužky DNA, která je homologní s proužky lidského genu TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

ACCCCGAGTT TCAACAATTT TACCGTAAGC TTTTGGCTCC GTGTACCTAA GGTGTCGGCC

TCGCACCTGG AGCGCCGGGC CAATGCCCTC CTGGCC (2) Informace o SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 100 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: insertion^seq (B) Pozice: 12 ..74 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kóduj ící TNF-alfa důkaz - experimentální organizmus = Homo sapiens standardní název - Primer mut30-2 označení = mut30-2 poznámka^ primer mut30-2 je synteticky syntetizovaný 100-mérový oligonukleotid ·· ·· · «· ·· ·· • · · ·· · · 9 9 9 9

99999 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 9 9

99 999 9999 99 99 obsahující DNA kódující epitop P30 lidské T buňky mezi proužky DNA, která je homologní S proužky lidského genu TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:

TCCTGGCCAA TTTCAACAAC TTCACAGTTA GCTTCTGGTT GAGGGTACCA AAGGTCTCGG

CCAGCCACCT CGAGCAGGTC CTCTTCAAGG GCCAAGGCTG (2) Informace o SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

100

	(A)	DÉLKA: 100 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: insertion_seq (B) Pozice: 12 . . 74 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa důkaz = experimentální organizmus = Homo sapiens standardní název = Primer mut30-3 označení = mut30-3 poznámka= primer mut30-3 je synteticky syntetizovaný 100-mérový oligonukleotid obsahující DNA kódující epitop P30 lidské T

0 0 0

00

0 0

00· 00·

0

00 ♦ 00·· buňky mezi proužky DNA, která je homologní s proužky lidského genu TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:

CCCAGGTCCT CTTCAACAAC TTTACCGTCT CCTTCTGGCT TCGGGTACCC AAGGTCAGCG 60

CTAGCCACCT CGAGGTCTCC TACCAGACCA AGGTCAACCT 100

2) Informace o SEQ ID NO: 32:

(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 100	párů baží
	(B) TYP: nukleová kyselina
	(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetěz
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A) organizmus:	Homo sapiens

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: insertion_seq (B) Pozice: 15 ..77 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa důkaz = experimentální organizmus - Homo sapiens standardní název = Primer mut30-4 označení = mut30-4 poznámka= primer mgt30-4 je synteticky syntetizovaný 100-mérový oligonukleotid obsahující DNA kódující epitop P30 lidské T buňky mezi proužky DNA, která je homologní s proužky lidského genu TNF-alfa ♦ 99 • * · ♦» · · * ···»··

9 9 9 9 9 9 9

1· 119 9919 19 «« (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 32:

AGTCGGTCAC CCTTCTCCAG GTGGGAAGCG CTTACCTTAG GGACGCGCAA CCAGAAGGAC 60

ACGGTGAAAT TATTAAATGG GGTCTCCCTC TGGCAGGGGC 100 (2) Informace o SEQ ID NO: 33:

(i) CHARAKTERI ŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 100 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	DRUH MOLEKULY:	DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	POZITIVNÍ: ne
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A) organizmus:	Homo sapiens

(ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: insertion_seq (B) Pozice: 14 ..76 (C) Způsob identifikace: experimentální (D) Jiné informace:

funkce = primer pro PCR klonování DNA kódující TNF-alfa důkaz - experimentální organizmus = Homo sapiens standardní název = Primer mut30-5 označení = mut30-5 poznámka= primer mut30-5 je synteticky syntetizovaný 100-mérový oligonukleotid obsahující DNA kódující epitop P30 lidské T buňky mezi proužky DNA, která je homologní s proužky lidského genu TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 33:

GAAGGGTGAC CGATTCAACA ATTTCACCGT AAGCTTvTGG ďTCGCGTCC CTAAGGTGT TGCGTCGCAC CTCGAAGGGA TCATTGCCCT CTAGAGTCGA

44 44 44

444 « · » « *

4 4 4 4 4

4 4 444 444

4 4 4

4444444 44 44 ·· • 4 4 • 4 4 ♦·· • 4 4 • · 4 (2)

Informace o SEQ ID NO: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 25	aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY:	DNA (genomová)
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(v)	DRUH	FRAGMENTU:	vnitřní

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: peptid (B) Pozice: 1 .. 25 (D) Jiné informace: označení = Pep2-1 poznámka= Pep2-1 je synteticky připravená zkrácená forma analogu TNF-alfa obsahující epitop P2 lidské T buňky a lemující oblasti lidského TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 34:

ser Arg Thr Pro 1

Ile Thr Glu Leu 20

Ser Gin Tyr Ile 5

Gin Leu Gin Trp

Lys Ala Asn Ser

Leu /s Phe Ile Gly 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 35:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 25 aminokysel
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne

·* ·· 99 * · · » · 9 9 9

9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 9 9

99 999 9999 99 99 (v) DRUH FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: peptid (B) Pozice: 1 .. 25 (D) Jiné informace:

označení = pep2-3 poznámka= pep2-3 je synteticky připravená zkrácená forma analogu TNF-alfa obsahující epitop P2 lidské T buňky a lemující oblasti lidského TNF-alfa.

(xi)	' Po	piš	sekvence:	SEQ	ID	NO:	: 35:
Ser	Gin	Val	Leu	Phe Gin	Tyr	Ile	Lys	Ala Asn Ser Lys	Phe Ile Gly
1			5				10	15
Ile	Thr	Glu	Leu	Ile Ser	Arg	Ile	Ala
	20				25

2) Informace o SEQ ID NO: 36:

(i)	CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE (A) DÉLKA: 25 aminokyse (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne

(v) DRUH FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: peptid (B) Pozice: 1 .. 25 (D) Jiné informace:

označení = pep2-4 poznámka= pep2-4 je synteticky připravená zkrácená forma analogu TNF-alfa obsahující lemuj ící :

4 4 4

4 «4 epitop P2 lidské T buňky mezi a oblasti lidského TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 36:

Ala Glu Ala Lys Pro Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser l.ys Phe 1 5 10

Ile Thr Glu Leu Gly Asp Arg Leu Ser 20 25 (2) Informace o SEQ ID NO: 37:

Ile Gly 15 »· ·« * 4 9 4 • 4 4 4

4 444

4

44

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE
	(A)	DÉLKA: 25 aminokyse
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne

(v) DRUH FRAGMENTU: vnitřní (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: peptid (B) Pozice: 1 .. 25 (D) Jiné informace:

označení = pep2-5 poznámka^ pep2-5 je synteticky připravená zkrácená forma analogu TNF-alfa obsahující epitop P2 lidské T buňky mezi a lemující oblasti lidského TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 37:

Glu Lys Gly Asp Arg Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Pise Ile Gly 2 5 10 15

Ile Thr Glu Leu Ser Gly 20 (2) Informace o SEQ ID NO:

(i) CHARAKTERISTIKA

Gin Val Tyr 25

38:

SEKVENCE:

• · ·· · ·· ·· ·« «·♦ «· · ♦ · » · « 9 9 99· 9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 9 9

99 999 9·99 99 99 (A) DÉLKA: 31 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: peptid (B) Pozice :1..31 (D) Jiné informace:

označení = pep30-l poznámka^ pep30-l je synteticky připravená zkrácená forma analogu TNF-alfa obsahující epitop P30 lidské T buňky mezi a lemující oblasti lidského TNF-alfa (xii) Popis

Ser Arg Thr Pro 1

Val Pro Lys Val 20 sekvence: SEQ

Ser Phe Asn Asn 5

Ser Ala Ser His

ID	NO:	38 :
Phe	Thr 10	Val	Ser
Leu	Glu	Arg	Arg

Phe Trp Leu Arg 15

Ala Asn Ala 30

2) Informace o SEQ ID NO: 39:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 31 aminokyse
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(iv)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(V)	HYPOTETICKÁ: ne

(v) DRUH FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens • · 4 • · ··♦ t · · • ·· to· ·· ·· ·· i to· « ► to · . · ··· ··· • to ·· (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: peptid (B) Pozice: 1 .. 31 (D) Jiné informace:

označení = pep30-2 poznámka= pep30-2 je synteticky připravená zkrácená forma analogu TNF-alfa obsahující epitop P30 lidské T buňky mezi a lemující oblasti lidského TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 39:

Ala Leu Leu Ala Asn Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg ¹⁵ 10 15

Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gin Val Leu Phe Lys

Λ r· ^J

2) Informace o SEQ ID NO: 40:

(i)	CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE
	(A)	DÉLKA: 31 aminokyše
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne

(v) DRUH FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: peptid (B) Pozice: 1 .. 31 (D) Jiné informace:

označení = pep30-3 poznámka= pep30-3 je synteticky připravená zkrácená forma analogu TNF-alfa obsahující epitop P30 lidské T buňky mezi a lemující oblasti lidského TNF-alfa aa a 9 a a a a a aaa •

aa aa a

a aaa a

aa «

··· ·* ·· • · · • · ··· • · · · · • · · · ·· ·· aa a

a a

aaaa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 40:

Tyr Ser Gin 1

Val

Leu 5

Phe

Asn

Phe

Thr 10

Val

Ser

Phe

Trp

Leu Arg 15

Val Pro Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

20

25

30

Informace o

SEQ

ID

NO:

41

(i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 31 aminokysel
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(Vi)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(vii)	HYPOTETICKÁ: ne

(v) DRUH FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: peptid (B) Pozice: 1 .. 31 (D) Jiné informace:

označení = pep30-4 poznámka= pep30-4 je synteticky připravená zkrácená forma analogu TNF-alfa obsahující epitop P30 lidské T buňky mezi a lemující oblasti lidského TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 41:

G1 n 1

Arg

Glu

Thr

Pro 5

Phe

Asn

Phe

Thr 10

Val

Ser

Phe

Trp

Leu Arg 15

Val

Pro

Lys

Val 20

Ser

Ala

Ser

His

Leu 25

Glu

Lys

Gly

Asp

Arg 30

Leu

Informace o SEQ ID NO: 42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 aminokyselin (2) φφ φ * φ φ φφφ φ

ΦΦ ·· • φ φ • φ φφφ • φ · · • φ φ · φφ «φ • ·♦ φφφ φ φ φ φ « • φ φφφ φφφφ φφ φ φ φ φ φφφ φ φφ

	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne

(v) DRUH FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) organizmus: Homo sapiens (ix) ZNAKY:

(A) Název/klič: peptid (B) Pozice: 1 .. 31 (D) Jiné informace:

označení = pep30-5 poznámka^ pep30-5 je synteticky připravená zkrácená forma analogu TNF-alfa obsahující epitop P30 lidské T buňky mezi a lemující oblasti lidského TNF-alfa (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 42:

Glu Lys Gly Asp 1

Val Pro Lys Val 20

Arg Phe Asn Asn Phe 5

Ser Ala Ser His Leu 25

Thr Val Ser 10

Glu Gly Ile

Phe Trp Leu Arg

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY ··

P!/ JWP- Péé? ťzszj·

1. Upravená molekula lidského TNFa schopná vyvolat po aplikaci uvedené upravené molekuly TNFa lidskému hostiteli neutralizační protilátky proti lidskému TNFa divokého typu, přičemž alespoň jeden peptidový fragment molekuly lidského TNFa se substituoval alespoň jedním peptidem, o kterém je známo, že obsahuje imunodominantní epitop T buňky nebo zkrácenou formu uvedené molekuly obsahující imunodominantní epitop T buňky a jednu nebo dvě lemující oblasti molekuly lidského TNFa obsahující alespoň jeden TNFa epitop B buňky, přičemž substituce zavede podstatnou změnu do aminokyselinové sekvence jednoho libovolného z řetězců předního β-listu, do jedné libovolné ze spojovacích smyček a/nebo jednoho libovolného z řetězců Β', I nebo D zadního β-listu.
2. Upravená molekula lidského TNFa podle nároku 1, která v podstatě nevykazuje aktivitu TNFa.
3. Upravená molekula lidského TNFa podle nároku 2, která, když se testuje v biotestu L929, v podstatě nevykazuje aktivitu TNFa, přičemž protilátky vzniklé proti upravené molekule TNFa ve vhodném hostiteli podstatně inhibují aktivitu přirozeného TNFa v biotestu L929 a /nebo uvedené protilátky podstatně inhibují navázání lidského TNFa divokého typu na TNFa receptor 1 o molekulové hmotnosti 55 000 (TNFa-R55) nebo na TNFa receptor o molekulové hmotnosti 75 000 (TNFa-R75).
4. Upravená molekula lidského TNFa podle libovolného z nároků 1 až 3, kde se substituce provedla ·· ·· · ·· ·· ·· ··· ··♦· · · 9 9

9 9 999 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9

99 ·· ···9999 99 99 v oblastech molekuly TNFa tak, aby. se v podstatě zachovala struktura β-listu řetězců B a G.
5. Upravená molekula lidského TNFa podle libovolného z nároků 1 až 4, kde se substituce provedla v oblastech molekuly TNFa, která zahrnuje řetězce předního β-listů a/nebo spojovacích smyček tak, že se v podstatě zachovala struktura libovolného z řetězců zadního β-listu.
6. Upravená molekula lidského TNFa podle libovolného z nároků 1 až 4, kde se substituce provedla v oblastech molekuly TNFa, které zahrnují segment řetězce D zadního β-listu.
7. Upravená molekula lidského TNFa podle nároků 1 až 4, kde substituce obsahuje alespoň segment řetězce H předního β-listu a spojovací smyčky s řetězcem I, přičemž se upřednostňují aminokyseliny 132 až 146.
8. Upravená molekula lidského TNFa podle nároků 1 až 4, kde substituce obsahuje segmenty řetězců Hala celou spojovací smyčku, přičemž se upřednostňují aminokyseliny 132 až 152.
9. Upravená molekula lidského TNFa podle nároků 1 až 4, kde substituce obsahuje segment řetězce D, alespoň segment řetězce E a celou spojovací smyčky, přičemž se upřednostňují aminokyseliny 65 až 79 nebo 64 až 84.
10. Upravená molekula lidského TNFa podle nároků 1 až 4, kde substituce obsahuje celé řetězce C'a C a segment řetězce D, přičemž se upřednostňují aminokyseliny 40 až 60.
11. Upravená molekula lidského TNFa podle nároků 1 až 4, kde substituce obsahuje alespoň segment řetězce E a předního β-listu jedné nebo obou spojovacích smyček, přičemž se upřednostňují aminokyseliny 76 až 90.

100 • · · • · φ#· • · · · • · · φ φφ φφ • φφ φφ φφ φφ · φ φφφφ φ φ φφφφ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ φφφ φφφφ ·· φφ

Upravená molekula lidského TNFa podle nároků 1 až 4, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 8.

Upravená molekula lidského TNFa podle nároků 1 až 4, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 10.

Upravená molekula lidského TNFa podle nároků 1 až 4, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 16.

Upravená molekula lidského TNFa podle nároků 1 až 4, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 20.

Upravená molekula lidského TNFa podle nároků 1 až 4, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 14.

Upravená molekula lidského TNFa podle libovolného z nároků 1 až 11, kde začleněný epitop T buňky je všeobecný a je znám tím, že je pro většinu typů lidských HLA třídy II imunogenní.

Upravená molekula lidského TNFa podle nároku 17, kde epitop se získal z Tetanus toxoid, přičemž se upřednostňuje epitop P2 a/nebo P30.

Diméry, oligoméry nebo multiméry upravené molekuly lidského TNFa podle libovolného z nároků 1 až 18. Molekula izolované DNA, která kóduje upravenou molekulu TNFa podle libovolného z nároků 1 až 18. Vektor, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu izolované DNA podle nároku 20. Expresívní vektor, vyznačující se tím, ž e obsahuje molekulu izolované DNA podle nároku 20 operativně spojenou se sekvencí, která řídí expresi. Hostitel, vyznačující se tím, že se transformuje expresívním vektorem podle nároku 22.

101

44 *4 4 44 44 44 ••4 444* 4444 • 4 4 44 · 4 4444 • 4 4 4 4 4 44 444 444 • 444 44 44

44 44 4*4 4444 44 44

24. Hostitel podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e se vybral z kmenů bakterií, kvasinek nebo jiných hub a hmyzu, ze savčích a ptačích buněčných linií.

25. Způsob produkce upravené molekuly lidského TNFa podle libovolného z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle nároku 23 nebo 24 za vhodných podmínek, které umožňují produkci upraveného TNFa a získání produkovaného upraveného TNFa.

26. Upravená molekula lidského TNFa podle libovolného z nároků 1 až 18 ve formě fúzního proteinu s molekulou adjuvans, přičemž se upřednostňuje imunologicky aktivní adjuvans, jako je GM-CSF, HSP70 nebo interleukin.

27. Vakcína proti TNFa, vyznačující se tím, ž e obsahuje imunogenní množství jedné nebo více upravených molekul lidského TNFa podle libovolného z nároků 1 až 18 nebo 26 a může dále zahrnovat farmaceuticky přijatelné adjuvans, jako je fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý, fosforečnan vápenatý, muramyldipeptid nebo iscom.

28. Vakcína podle nároku 27, vyznačující se tím, že je vhodná pro prevenci nebo léčbu onemocnění, které je vyvoláno uvolněním nebo aktivitou TNFa, jako jsou chronická zánětlivá onemocnění, jako například revmatická artritida a zánětlivé onemocnění, střev zahrnující Crohnovu nemoc a colitis ulcerosa, a zhoubné bujení, roztroušená skleróza, diabetes, psorióza, osteoporóza a astma.

29. Vakcína proti TNFa, vyznačující se tím, že obsahuje izolovanou DNA, která kóduje upravenou molekulu lidského TNFa podle libovolného

Φ ΦΦ Φ ·« *

Φ Φ

ΦΦ ΦΦ • · φφ • · ·

102 • Φ ΦΦΦ • Φ » · ♦ • · « «

Φ· ·· z nároků 1 až 18 nebo 26, přičemž je začleněna do vhodného expresívního vektoru.

30. Vakcína podle nároku 29, vyznačující se tím, že obsahuje konstrukci obsahující neinfekční, neintegrující sekvenci DNA kódující upravenou molekulu TNFa podle libovolného z nároků 1 až 18 a 26 operativně spojenou s promotorovou sekvencí, která může řídit expresi uvedené sekvence DNA u lidí, v množství dostatečném pro pojmutí uvedené konstrukce a její expresi, přičemž se vyvolá neutralizační protilátková odezva proti TNFa.

31. Vakcína podle nároku 29, vyznačující se tím, že obsahuje virový expresívní vektor, jako je retrovirový expresívní vektor.

32. Vakcína podle libovolného z nároků 27 až 31, vyznačující se tím, že je vhodná pro orální nebo parenterální, například subkutánní, intramuskulární nebo intradermální aplikaci.

33. Použití protilátek vytvořených proti upravené molekule TNFa podle libovolného z nároků 1 až 18 nebo 26 aplikací vakcíny podle libovolného z nároků 27 až 32 v diagnostickém testu vhodném pro TNFa.

34. Použití podle nároku 33, kde protilátky jsou monoklonální protilátky.

35. Způsob testování výskytu TNFa v lidských tělních tekutinách, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt kompozice obsahující protilátky proti upravenému TNFa podle libovolného z nároků 1 až 18 nebo 26 se vzorkem lidské tělní tekutiny a stanovení, zda uvedené protilátky váží TNFa v uvedeném vzorku.

36. Způsob diagnostikování onemocnění spojených s TNFa, vyznačující se tím, že používá imunologický test in vitro, přičemž se detekuje TNFa

44 44 • · • ·

4 4

444 44··

103 • · • 444 4 4 · ·« 4

44 4 4 • 4 4

4 · ·

444 •

9«

444 v lidských tělních tekutinách použitím protilátek proti upravené molekule TNFa podle libovolného

z nároků 1 až 18 nebo 26. 37. Způsob podle nároku 35 nebo 36, vyzná č u j ící se ti m, že zahrnuje použití sendvičového testu, testu ELISA nebo ekvivalentního testu, který může nebo nemusí být doplněn například použitím postupu s

avidinem/biotinem.

38. Způsob léčby nebo prevence onemocnění u lidí, jehož patologie je alespoň částečně způsobena uvolněním nebo aktivitou TNFa, vyznačující se tím, ž e zahrnuje aplikaci člověku účinného množství alespoň jedné upravené molekuly TNFa podle libovolného z nároků 1 až 18 nebo 2 6 nebo vakcíny podle libovolného z nároků 27 až 32, přičemž se může aplikovat v kombinaci s vhodnou molekulou adjuvans nebo nosiče.

39. Použití upravené molekuly TNFa podle libovolného z nároků 1 až 18 nebo 2 6 pro přípravu .léčiva, vhodného pro léčbu nebo prevenci onemocnění, jehož patofyziologie je alespoň částečně způsobena uvolněním nebo aktivitou TNFa.