CN103347536A - 强灭活且仍高免疫原性的疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含与KLH偶联的TNFα的免疫原性产品，其中所述TNFα是强灭活的，这表示在测试A条件下所述产品显示小于30%的细胞溶解活性和/或大于15000的灭活指数；包含其的乳液和疫苗及制备所述免疫原性产品的方法。

Description

强灭活且仍高免疫原性的疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及预防或治疗寻求针对内源性TNFα的抗体反应的疾病的领域。本发明涉及当给予哺乳动物宿主时在所述哺乳动物宿主中诱导免疫应答产生抗TNFα抗体的新的免疫原性产品。

背景技术

肿瘤坏死因子α(TNFα)由同源三聚体多效性细胞因子组成，在疾病例如类风湿性关节炎、炎症性肠病和银屑病中应答炎性刺激物而分泌。

TNFα的病理活性备受关注。虽然TNFα导致一些类型的肿瘤坏死，但是该细胞因子促进其它类型的肿瘤细胞的生长。一般而言，高水平的TNFα与死亡风险增加相关。TNFα参与炎症性和非炎症性源两者的炎症性病症。在败血症中，大量的TNFα释放导致多种机体器官的严重衰竭，具有高死亡风险。在各种慢性和急性疾病中遇到异常TNFα生产。已知高水平的内源性TNFα的产生，即使TNFα产生是短暂的，也导致休克和组织损伤、分解代谢激素释放、血管渗漏综合征、成人呼吸窘迫症、胃肠道坏死、急性肾小管坏死、肾上腺出血、降低的肌肉膜电位、弥散性血管内凝血和发烧。已知TNFα弱但慢性(过量)产生导致体重减低、食欲减退、蛋白质分解代谢、脂质耗竭、肝脾肿大、心内膜炎症、胰岛素抵抗、急性相蛋白释放和内皮活化。

TNFα是各种疾病，包含败血症性休克、癌症、AIDS、移植排斥、多发性硬化症、糖尿病、类风湿性关节炎、外伤、疟疾、脑膜炎、缺血再灌注损伤以及成人呼吸窘迫综合征中的介质。这解释了为什么进行大量的研究用于设计抗TNFα疗法。

一种抗TNFα疗法，也可称为被动免疫疗法，包括向需要其的患者给予抗TNFα单克隆抗体。多种抗TNFα单克隆抗体在临床试验中测试，或已经在实际中用于抗TNFα相关疾病的医学治疗。可引用以下的抗TNFα单克隆抗体：阿非莫单抗(Afelimomab，目前授予临床试验)、塞妥珠单抗(Certolizumab，授予用于类风湿性关节炎和克罗恩氏病)、戈利木单抗(Golimumab，授予用于类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和强直性脊柱炎)、英夫利昔单抗(Infliximab，授予用于类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、斑块型银屑病、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、阿达木单抗(Adalimumab，授予用于类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、强直性脊柱炎、斑块型银屑病、银屑病性关节炎、克罗恩氏病)。

已经证明以上引用的抗TNFα单克隆抗体在TNFα相关疾病中的治疗活性。不过，这些单克隆抗体具有治疗性抗体多种已知的通常缺点，其包括诱导宿主针对单克隆抗体的抗体反应，这快速导致治疗性抗TNFα单克隆抗体的疗效降低。

作为对单克隆抗体的替代性医学抗TNFα策略，一些作者建议基于诱导患者中抗TNFα抗体产生设计主动免疫治疗。例示性地，PCT申请WO98/46642中描述了含有修饰的TNFα分子的疫苗。该PCT申请中描述的免疫原性化合物由修饰的TNFα蛋白组成，其中天然氨基酸序列的一部分被一个或多个含有T细胞表位的多肽替代。在一些实施方案中，所述修饰的TNFα分子可以与抗FcγRI抗体片段缀合。

WO02/11759描述了针对细胞因子的疫苗，其包括细胞因子如VEGF与活化的载体分子例如活化的KLH的偶联。在该专利申请中，KLH与戊二醛接触，然后加入VEGF溶液中。在所得的产品中，VEGF细胞因子的生物学活性不是灭活的。

然后理解，基于两个原因细胞因子的生物学活性必须被中和。首先，一些细胞因子如TNFα在其内源性状态下驱动炎症和器官改变，第二，在细胞因子过量产生条件的情况下在体内不应该认为疫苗是细胞因子的额外来源。

PCT申请WO2004/024189公开了免疫原性产品，其包含(i)目标抗原蛋白和(ii)载体蛋白之间的分子连接，且其中(i)和(ii)部分地以共价键结合在一起和部分地以非共价键结合在一起。在该PCT申请中，公开了主要通过非共价键与载体蛋白连接的大量目标抗原分子是具有高免疫原性的终产品的条件。

本申请人的PCT申请WO2007/022813公开了免疫原性产品，其包含TNFα分子和KLH分子之间的杂络物，其中与以上讨论的PCT申请WO2004/24189中公开的相应免疫原性化合物中存在的TNFα灭活水平相比改善了TNFα灭活。更精确地，实施例表明，当在96小时至192小时的时间范围期间内用甲醛进行预成形的杂络物的化学处理步骤时达到了TNFα细胞毒活性的最佳灭活。需注意的是，其指出以66mM的浓度进行甲醛处理步骤大于192小时的时间导致这样的终产品，其是高稳定的但是具有显著降低的诱导针对内源性TNFα具有高中和活性的抗体的能力。事实上，在该专利申请中，评价了进一步灭活将必然导致所获得的产品的抗原/免疫原性能的显著丧失。

本申请人现在认为，尽管现有技术产品包含灭活的细胞因子，但是所述灭活没有完全优化，以及现在可能克服阻止本领域技术人员进一步灭活细胞因子-载体蛋白疫苗中的细胞因子的技术偏见。

本发明的产品是包含与载体蛋白偶联的细胞因子的免疫原性产品，其中细胞因子已经失去其大部分生物活性，但仍保留其天然免疫原性。因此，本发明的产品显示高度的安全性、TNFα生物活性的强灭活处理以及仍具有非常好的抗TNFα免疫原性能。

发明内容

因此，本发明的一个目的包括免疫原性产品，其包含与KLH偶联的TNFα，其中所述TNFα是强灭活的，这表示在下文引用的测试A条件下该产品显示小于30%的细胞溶解活性和/或大于15000的灭活指数；包含所述产品和油及表面活性剂组合的乳液；以及包含所述产品或乳液的疫苗。在一个实施方案中，在下文引用的测试A条件下所述产品显示小于30%的细胞溶解活性和/或大于15000的灭活指数，其中所述产品的浓度为100ng/ml。

在本发明中，术语“与KLH偶联的TNFα”指共价和/或非共价键连接TNFα与KLH。

根据一个实施方案，本发明的产品可以包含游离TNFα均聚物；优选大于300kDa的游离TNFα均聚物的百分比小于总TNFα的30%w/w。优选地，根据测试C计算所述游离TNFα均聚物的百分比。

本发明更进一步灭活，并确保本发明的疫苗在人体温度的条件下，即在体内的温度条件下，通常在37℃下，在必要的时间内，即在免疫必须有效的时间内，将保持灭活。在这方面，设计符合欧洲和美国药典的测试B。在本发明的含义中，术语“保持灭活”或“长期灭活”，指在测试B条件下所述产品显示小于80%的细胞溶解活性和/或具有大于500灭活指数。

根据一个实施方案以及用于贮存的目的，本发明的产品或疫苗组合物可以被冻干。

本发明还涉及本发明的产品的制剂，其中所述产品在乳液内。所述乳液包含本发明的产品、油和表面活性剂或至少一种油和至少一种表面活性剂的混合物。

本发明还涉及疫苗组合物，所述组合物包含如本文说明书中所述的产品和一种或多种免疫佐剂的组合。免疫佐剂可以是增强与其结合或混合的本发明的产品或疫苗组合物的免疫反应的任何物质。

本发明还涉及试剂盒，其包括至少一个含有本发明的冻干产品的小瓶、至少一个含有注射用水的小瓶和至少一个含有佐剂的小瓶，以及用于混合所述产品和水以获得含水溶液和用于使所述溶液与佐剂接触和用于乳化所述含水溶液与佐剂的混合物的装置。根据一个实施方案，所述装置是注射器。所述试剂盒还包括至少一个针头。优选地，所述试剂盒包含两个针头。

本发明还涉及医疗装置，其包括本发明的产品或本发明的疫苗组合物。

本发明还涉及用于制备包含与KLH偶联的TNFα的产品的方法，其中所述TNFα是强灭活的，这表示在测试A条件下所述产品显示小于30%的细胞溶解活性，所述方法包括以下步骤：

a)将(i)纯化的TNFα、(ii)纯化的匙孔血蓝蛋白和(iii)戊二醛混合在一起

b)去除分子量小于10kDa或小于8kDa的化合物

特征在于在步骤b)之后进行以下步骤：

c)以在至少60mM至少10天(240小时)到至少120mM至少6天(144小时)范围的浓度/反应时间的条件添加甲醛；在一个实施方案中，以在至少10天(240小时)的期间至少200mM的浓度施加甲醛；在优选的实施方案中，加入甲醛以达到在大于300小时的期间在所述介质中220mM至270mM的浓度；

d)通过添加淬灭化合物阻断与甲醛的反应，所述淬灭化合物选自(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组的氨基酸，

e)收集所述免疫原性产品。

有利地，在步骤a)中以至少20mM大于120分钟，优选大于240分钟的浓度/反应时间的条件施加戊二醛。根据一个实施方案，在去除分子量小于10kDa的化合物(步骤b)之前通过添加淬灭化合物停止与戊二醛的反应(步骤a)，优选淬灭化合物选自(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组的氨基酸。

根据本发明的优选实施方案，在步骤f)收集开始之前，使用截断值至少100kDa(优选300kDa)的滤膜进行切向流过滤，使得分子量小于100kDa(优选300kDa)的物质从所述产品中去除。

在本发明的一个变式中，用于制备包含与KLH偶联的TNFα的产品的方法，其中所述TNFα是强灭活的，这表示在测试A条件下所述产品显示小于30%的细胞溶解活性，包括以下步骤：

a)将(i)纯化的TNFα、(ii)纯化的匙孔血蓝蛋白和(iii)戊二醛混合在一起

b)去除分子量小于10kDa的化合物

c)任选添加甲醛。

特征在于在步骤a)中以至少20mM，优选25mM的浓度在大于18小时的期间施加戊二醛，通过添加淬灭化合物停止与戊二醛的反应，优选淬灭化合物选自(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组的氨基酸，然后收集所述产品。

在一个实施方案中，在步骤b)之后以及在收集所述产品之前，以在至少60至240mM至少4天范围的浓度/反应时间的条件施加甲醛，然后通过添加淬灭化合物阻止与甲醛的反应，所述淬灭化合物选自(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组的氨基酸。

根据本发明的优选实施方案，在收集产品开始之前，使用截断值至少100kDa(优选300kDa)的滤膜进行切向流过滤，使得分子量小于100kDa(优选300kDa)的物质从所述产品中去除。

本发明还涉及用于制备免疫原性产品的方法，所述免疫原性产品可用于诱导所述免疫原性产品给予的宿主中的抗TNFα抗体反应。所产生的免疫原性产品主要用于预防或治疗与TNFα过度产生相关的疾病的疫苗组合物。更具体地，本发明涉及用于预防或治疗与TNFα过度产生相关的疾病的方法，所述方法包括给予动物，包括人，本发明的产品、乳液或疫苗的步骤。与TNFα过度产生相关的疾病可以选自强直性脊柱炎、银屑病、类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、炎症性肠病、克罗恩氏病、恶病质和癌症。

具体实施方式

因此，第一方面，本发明包括免疫原性产品，其包含与KLH偶联的TNFα，其中所述TNFα是强灭活的，这表示该产品在下文引用的测试A条件下显示小于30%，优选25%，更优选20%，更优选15%，甚至更优选10%的细胞溶解活性；包含所述产品和油及表面活性剂的组合的乳液；以及包含所述乳液或所述产品的疫苗组合物。

在一个实施方案中，在下文引用的测试A条件下测定本发明的免疫原性产品的细胞溶解活性，其中所述免疫原性产品的浓度为100ng/ml。

如本文所用，“TNFα”包括源自哺乳动物生物体的任何TNFα。哺乳动物TNFα包括本领域技术人员周知的人TNFα、马TNFα、猫TNFα、狗TNFα、牛TNFα、绵羊TNFα以及山羊TNFα，相应的氨基酸序列和编码其的核苷酸序列长期以来为公众可获得的，包括各种核酸和氨基酸序列数据库。例示性地，各种哺乳动物的TNFα的氨基酸序列指在GenBank数据库中以及在NCBI(National Center forBiology Information)数据库中，包括：人TNFα(Genbank＃CAA26669)、小鼠TNFα(Genbank CAA68530)、狗TNFα(Genbank#ABJ51909)、马TNFα(NCBI＃NP-001075288)、猫TNFα(NCBI＃NP-001009835)、公牛TNFα(NCBI＃NP-776391)、猪TNFα(NCBI＃NP-001166496)、山羊TNFα(NCBI＃AAF87741)、大鼠TNFα(NCBI＃NP036807)、绵羊TNFα(NCBI＃NP-001020031)。

根据一个实施方案，TNFα是人TNFα分子。人TNFα由三个约17kDa(17.35kDa)的TNFα分子结合形成的同源三聚体TNFα分子组成。

根据本发明，测试A用于确定本发明的产品中的人TNFα生物活性灭活的百分比。所述测试基于在放线菌素D存在下人TNFα诱导的鼠L929细胞的细胞溶解。该测试在T0下进行，即所述产品为液体形式且生产后贮存在4℃下少于10天。

根据以下方法进行测试A：

L929小鼠成纤维细胞(Sigma n85011425)以1.5×10⁴/cm²平板接种在培养基(DMEM(Cambrex BE12604F)中，所述培养基补充有10%胎牛血清（FBS）(SigmaF7524)、2mM谷氨酰胺(Sigma G7513)、100U/ml青霉素/链霉素(Sigma P0781)和1mM丙酮酸钠(Sigma S8636))中，并在37℃、5%CO₂下培养2天，以获得亚汇合的单层。

然后收获L929细胞，并以在100μl平板培养基(DMEM F12(CambrexBE12719F)，补充有2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠)中的2×10⁴个细胞/孔平板接种在96孔平底培养板中，并在37℃、5%CO₂下培养21+/-1小时。

从稀释在60μl测定培养基(HL1(Cambrex US77201)，补充有2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠)中的120μl的本发明的产品(6400ng/ml TNFα当量)制备一系列的10次两倍稀释的本发明产品。

所用的浓度单位可以是TNFα当量浓度(实施例3)或使用BCA测试(实施例13)确定的总蛋白。

在一个实施方案中，1μg TNFα当量浓度相应于使用BCA测试确定的1至5μg的总蛋白，优选相应于使用BCA测试确定的1.5至2.4μg的总蛋白。在一个实施方案中，1μg TNFα当量浓度相应于使用BCA测试确定的1.5μg的总蛋白。在另一个实施方案中，1μg TNFα当量浓度相应于使用BCA测试确定的2.4μg的总蛋白。

在一个实施方案中，当在制备所述产品的方法中使用滤膜的切向流过滤的第一步骤具有10kDa的截断值且使用滤膜的切向流过滤的第二步骤具有10kDa的截断值时，1μg TNFα当量浓度相应于使用BCA测试确定的1.5μg的总蛋白。在另一个实施方案中，在制备所述产品的方法中使用滤膜的切向流过滤的第一步骤具有10kDa的截断值且使用滤膜的切向流过滤的第二步骤具有300kDa的截断值时，1μg TNFα当量浓度相应于当使用BCA测试确定的2.4μg的总蛋白。

BCA蛋白测定是用于总蛋白比色检测和定量的基于二辛可宁酸(BCA)的与洗涤剂相容的制剂。该方法将众所周知的通过在碱性介质(双缩脲反应)中的蛋白使Cu²⁺还原为Cu¹⁺与使用含有二辛可宁酸的独特试剂的高灵敏度和选择性比色检测亚铜阳离子(Cu¹⁺)相结合。通过两分子的BCA与一个亚铜离子螯合形成该测定法的紫色显色反应产品。该水溶性复合物在562nm处表现出强的吸光率，其在20-2000μg/ml的宽工作范围内与增加的蛋白质浓度成线性关系。

TNFα当量浓度单位使得能够在细胞生物测定和体内TNFα休克模型中以相同的TNF含量比较不同的批次。TNFα当量的浓度如下确定：

[TNFα当量浓度]=(在该方法开始时TNFα的量)-10%。

如果在用于制备本发明的产品的方法中已经进行截断值300kDa过滤的最后一步，则去除75%的TNFα(如其中TNFα被放射标记的放射性测试所证实)，以TNFα当量计的浓度如下确定：[TNFα当量浓度]=[(开始时TNFα的量-10%)-75%]。值得注意的是，在生产过程中产率是一致的。从在60μl测定培养基中的8ng/ml的120μl人TNFα制备一系列10次三倍稀释的标准品(人TNFα6.24mg/ml，Boehringer ingelheim03030R1)。来自Boehringer的TNF的EC50在10至500pg/ml范围内。

在L929细胞的培养时间结束时，细胞应是亚汇合的。然后清空平底培养板的孔中的培养基，并将50μl的各稀释液转移到平底培养板的孔中。

将补充有2μg/ml的放线菌素D(Sigma A9415)的50μl测定培养基加入各孔中。

然后，将L929细胞在37℃、5%CO₂下培养20+/-1小时。

在培养结束时，使用本领域熟知的方法评估L929细胞的存活。所述方法的一个例子如下：将20μl/孔的MTS/PMS溶液(100μl MTS/5μl PMS;PromegaG5430)加入孔中，并将培养板在37℃、5%CO₂下孵育另外4小时。然后在490nm处用分光光度计读取培养板。

存活百分比如下计算：

%=1-[(OD_产品-OD_TNF标准品/(OD_细胞-OD_TNF标准品)]

OD_产品代表使用本发明的产品的孔的光密度。

OD_TNF标准品代表使用200ng/ml TNFα的标准品的孔的光密度。

OD_细胞代表无标准品、无本发明的产品的对照孔的光密度。

因此，本领域技术人员能够从测试A确定100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml和800ng/ml TNFα当量的测试产品的细胞溶解活性百分比。

如下所示进行实施例3和13中的测试A。

在本发明的一个实施方案中，浓度为100ng/ml TNFα当量，优选200ng/mlTNFα当量，更优选400ng/ml TNFα当量，甚至更优选800ng/mlTNFα当量的所述产品杀死小于30%的L929细胞(表示大于70%的L929细胞是有活力的)，优选小于25%(表示大于75%的L929细胞是有活力的)，更优选小于20%(表示大于80%的L929细胞是有活力的)，更优选小于15%的L929细胞(表示大于85%的L929细胞是有活力的)，甚至更优选小于10%的L929细胞(表示大于90%的L929细胞是有活力的)(参见图1B)。

在本发明的一个实施方案中，浓度为100ng/ml TNFα的所述产品杀死小于30%的L929细胞(表示大于70%的L929细胞是有活力的)，优选小于25%(表示大于75%的L929细胞是有活力的)，更优选小于20%(表示大于80%的L929细胞是有活力的)，更优选小于15%的L929细胞(表示大于85%的L929细胞是有活力的)，甚至更优选小于10%的L929细胞(表示大于90%的L929细胞是有活力的)。

还可以使用如上所述的测试A用于确定所述产品的EC50和所述产品的灭活指数。EC50相应于必需杀死50%的L929细胞的所述产品的浓度。可以如下计算灭活指数：EC50_产品/EC50_TNFα。

在本发明的一个实施方案中，所述产品表现大于500，优选大于1000，优选大于2000，更优选大于3000，甚至更优选大于5000ng/ml的EC50。

在本发明的另一个实施方案中，所述产品表现大于15000，优选大于30000，甚至更优选大于50000的灭活指数。在本发明的一个实施方案中，所述产品的灭活指数大于100000。

本发明更进一步灭活，并确保本发明的疫苗在人体温度的条件下，即在体内的温度条件下，通常在37℃下，在必要的时间内，即在免疫必须是有效的时间内，将保持灭活。在这方面，设计符合欧洲和美国药典的测试B。在本发明的含义中，术语“保持灭活”或“长期灭活”，指在测试B条件下所述产品显示小于80%的细胞溶解活性。

在一个实施方案中，在以下引用的测试B的条件下测定本发明的免疫原性产品的细胞溶解活性，其中所述免疫原性产品的浓度为100ng/ml。

根据本发明，使用测试B确定当置于人体的温度条件下时本发明的产品中的人TNFα的灭活百分比。该测试基于在放线菌素D存在下人TNFα诱导的鼠L929细胞的细胞溶解，并在T6下，即所述产品为液体形式并在37℃下保存6周进行。

根据以下方法进行测试B：

L929小鼠成纤维细胞(Sigma n°85011425)以1.5×10⁴/cm²平板接种在培养基(DMEM(Cambrex BE12604F)，补充有10%胎牛血清(Sigma F7524)、2mM谷氨酰胺(Sigma G7513)、100U/ml青霉素/链霉素(Sigma P0781)和1mM丙酮酸钠(Sigma S8636))中，并在37℃、5%CO₂下培养2天，以获得亚汇合的单层。

然后收获L929细胞，并以在100μl平板培养基(DMEM F12(CambrexBE12719F)，补充有2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠)中的2×10⁴个细胞/孔平板接种在96孔平底培养板中，并在37℃、5%CO₂下培养21+/-1小时。

从稀释在60μl测定培养基(HL1(Cambrex US77201)，补充有2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠)中的120μl6400ng/ml本发明的产品制备一系列5次三倍稀释的本发明产品。

所用的浓度单位可以是TNFα当量浓度(实施例4)或使用BCA测试(实施例13)确定的总蛋白。

在一个实施方案中，1μg TNFα当量浓度相应于使用BCA测试确定的1至5μg的总蛋白，优选相应于使用BCA测试确定的1.5至2.4μg的总蛋白。在一个实施方案中，1μg TNFα当量浓度相应于使用BCA测试确定的1.5μg的总蛋白。在另一个实施方案中，1μg TNFα当量浓度相应于使用BCA测试确定的2.4μg的总蛋白。

在一个实施方案中，当在制备所述产品的方法中使用滤膜的切向流过滤的第一步骤具有10kDa的截断值且使用滤膜的切向流过滤的第二步骤具有10kDa的截断值时，1μg TNFα当量浓度相应于使用BCA测试确定的1.5μg的总蛋白。在另一个实施方案中，当在制备所述产品的方法中使用滤膜的切向流过滤的第一步骤具有10kDa的截断值且使用滤膜的切向流过滤的第二步骤具有300kDa的截断值时，1μg TNFα当量浓度相应于使用BCA测试确定的2.4μg的总蛋白。

BCA蛋白测定是用于总蛋白比色检测和定量的基于二辛可宁酸(BCA)的与洗涤剂相容的制剂。该方法将众所周知的通过在碱性介质(双缩脲反应)中的蛋白使Cu²⁺还原为Cu¹⁺与使用含有二辛可宁酸的独特试剂的高灵敏度和选择性比色检测亚铜阳离子(Cu¹⁺)相结合。通过两分子的BCA与一个亚铜离子螯合形成该测定法的紫色显色反应产品。该水溶性复合物在562nm处表现出强的吸光率，其在20-2000μg/ml的宽工作范围内与增加的蛋白质浓度成线性关系。

TNFα当量浓度使得能够在细胞生物测定和体内TNF休克模型中以相同的TNFα含量比较不同的批次。以TNFα当量计的浓度如下确定：

[TNFα当量浓度]=(在该方法开始时TNFα的量)-10%。

如果在用于制备本发明的产品的方法中已经进行截断值300kDa过滤的最后一步，则去除75%的TNFα(如其中TNFα被放射标记的放射性测试所证实)，以TNFα当量计的浓度如下确定：[TNFα当量浓度]=[(开始时TNFα的量-10%)-75%]。值得注意的是，在生产过程中产率是一致的。从在60μl测定培养基中的8ng/ml120μl人TNFα制备一系列10次三倍稀释的标准品(人TNFα6.24mg/ml，Boehringer ingelheim03030R1)。来自Boehringer的TNF的EC50在10至500pg/ml范围内。

在L929细胞的培养时间结束时，细胞是亚汇合的。然后清空平底培养板的孔中的培养基，并将50μl的各稀释液转移到平底培养板的孔中。

将补充有2μg/ml的放线菌素D(Sigma A9415)的50μl测定培养基加入各孔中。

然后，将L929细胞在37℃、5%CO₂下培养20+/-1小时。

在培养结束时，使用本领域熟知的方法评估L929细胞的存活。所述方法的一个例子如下：将20μl/孔的MTS/PMS溶液(100μl MTS/5μl PMS;PromegaG5430)加入孔中，并将培养板在37℃、5%CO₂下孵育另外4小时。然后在490nm处用分光光度计读取培养板。

存活百分比如下计算：

%=1-[(OD_产品-OD_TNF标准品/(OD_细胞-OD_TNF标准品)]

OD_产品代表使用本发明的产品的孔的光密度。

OD_TNF标准品代表使用200ng/ml TNFα的标准品的孔的光密度。

OD_细胞代表无标准品、无本发明的产品的对照孔的光密度。

因此，本领域技术人员能够从测试B确定在37℃下保持6周后的测试产品的细胞溶解活性百分比。如下所示在实施例4和实施例13中进行测试B。

在本发明的一个实施方案中，浓度为100ng/ml的所述产品杀死小于80%的L929细胞(表示大于20%的L929细胞是有活力的)，优选小于70%(表示大于30%的L929细胞是有活力的)，更优选小于60%(表示大于40%的L929细胞是有活力的)，甚至更优选小于50%的L929细胞(表示大于50%的L929细胞是有活力的)。

在本发明的一个实施方案中，浓度为100ng/ml TNFα当量的所述产品杀死小于80%的L929细胞(表示大于20%的L929细胞是有活力的)，优选小于70%(表示大于30%的L929细胞是有活力的)，更优选小于60%(表示大于40%的L929细胞是有活力的)，甚至更优选小于50%的L929细胞(表示大于50%的L929细胞是有活力的)。

在本发明的一个实施方案中，浓度为350ng/ml TNFα当量的所述产品杀死小于90%的L929细胞(表示大于10%的L929细胞是有活力的)，优选小于80%(表示大于20%的L929细胞是有活力的)，更优选小于70%(表示大于30%的L929细胞是有活力的)，更优选小于60%(表示大于40%的L929细胞是有活力的)，甚至更优选小于50%(表示大于50%的L929细胞是有活力的)。

在本发明的一个实施方案中，浓度为1000ng/ml TNFα当量的所述产品杀死小于90%的L929细胞(表示大于10%的L929细胞是有活性的)，优选小于80%(表示大于20%的L929细胞是有活性的)，更优选小于70%(表示大于30%的L929细胞是有活性的)。

还可以使用如上所述的测试B用于确定所述产品的EC50和所述产品的灭活指数。EC50相应于37℃下贮存6周后必需杀死50%的L929细胞的所述产品的浓度。可以如下计算灭活指数：EC50_产品/EC50_TNFα。

在本发明的一个实施方案中，所述产品当在37℃下放置6周时表现大于100，优选大于250，更优选大于500ng/ml的EC50。

在本发明的另一个实施方案中，所述产品当在37℃下放置6周时表现大于500，优选大于2000，更优选大于5000，甚至更优选大于10000的灭活指数。

根据一个实施方案，本发明的产品可以包含游离TNFα均聚物。在一个优选的实施方案中，所述TNFα均聚物具有大于100kDa，优选大于300kDa的分子量。在一个实施方案中，大于100kDa，优选大于300kDa的游离TNFα均聚物的百分比小于总TNFα的30%w/w。

可以根据测试C确定游离TNFα均聚物的百分比。

测试C基于(1)使用分别包被有抗TNFα单克隆抗体或抗KLH多克隆抗体的磁珠的免疫捕获步骤进行的游离TNFα或KLH均聚物的纯化以及(2)特异性ELISA进行的游离TNFα或KLH均聚物的定量分析。

根据测试C，制备包被有抗KLH或抗TNFα抗体的珠(该制剂的实例在实施例5中说明)。将包被和未包被珠与所述产品混合，并在4℃下孵育12-16小时。然后使用磁铁收获上清液并通过ELISA分析。

然后进行三个ELISA：

-KLH-KLH ELISA，其中捕获抗体和第一抗体是抗KLH抗体，

-TNF-TNF ELISA，其中捕获抗体和第一抗体是抗TNFα抗体，

-KLH-TNF ELISA，其中捕获抗体是抗KLH抗体而第一抗体是抗TNFα抗体或相反。

通过本领域已知的任何比色方法显色ELISA，例如使用生物素标记的检测抗体、聚链霉抗生物素HRP扩增体系和邻苯二胺二盐酸盐底物溶液。

ELISA结果的分析使得可以通过与如实施例5中所示的本发明的产品中的总TNFα比较确定游离TNFα均聚物的百分比。

在更优选的实施方案中，所述产品不含分子量小于100kDa(同源三聚体TNFα分子的二聚体的表观分子量)的TNFα均聚物。在更优选的实施方案中，所述产品不含分子量小于300kDa(同源三聚体TNFα分子的六聚体的表观分子量)的TNFα低聚物。不愿意受任何理论的连接，本申请人提出，去除小于100kDa的TNFα低聚物，在一个实施方案中去除小于300kDa的TNFα低聚物，可增加用于人和非人哺乳动物使用的产品的安全性以及改善终免疫原性产品的免疫原性能。

[乳液和含有所述乳液的疫苗组合物]

本发明还涉及本发明的产品的制剂。在一个实施方案中，该制剂是包含本发明的产品的液体制剂。合适的液体制剂的实例包含溶液，例如无菌溶液；分散体，例如无菌分散体；或乳液。在另一个实施方案中，该制剂是包含本发明的产品的固体制剂。合适的固体制剂的实例包括，但不限于粉末，例如用于临时配制成含有本发明的产品的无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。

有利地，本发明的疫苗组合物包括所述制剂或由所述制剂组成。

在一个实施方案中，在本发明的制剂中的本发明的免疫原性产品的量以所述制剂的总重量计大于0.01%(w/w)且小于1%(w/w)。

本发明还涉及本发明的产品的制剂，其中所述产品在乳液内。有利地，本发明的疫苗组合物包含或由所述乳液组成。所述乳液包含本发明的免疫原性产品、油和表面活性剂或至少一种油和至少一种表面活性剂的混合物。优选地，所述油或所述油/表面活性剂的混合物是药学上可接受的赋形剂。更优选地，油和表面活性剂的混合物是佐剂，甚至更优选是免疫佐剂。优选的佐剂是ISA51。可使用的免疫佐剂的另一个实例是SWE(基于角鲨烯的水包油型乳液)。可使用的免疫佐剂的另一个实例是SWE-a(基于角鲨烷的水包油型乳液)。本发明的乳液可以是油包水型乳液或水包油型乳液。

在另一个实施方案中，所述乳液中的本发明的免疫原性产品的量以所述乳液的总重量计大于0.01%(w/w)且小于1%(w/w)。

[佐剂]

本发明的的乳液或疫苗组合物可以包含佐剂，特别是免疫佐剂。在一个实施方案中，佐剂的量以疫苗组合物的总重量计在0.00001%(w/w)至1%，优选0.0001至0.1%，更优选0.001至0.01%(w/w)的范围。

在上述疫苗组合物中可以使用本领域技术人员已知的任何合适的佐剂，包括油基佐剂，例如弗氏不完全佐剂；霉菌酸酯(mycolate)基佐剂(例如海藻糖二霉菌酸酯)；细菌脂多糖(LPS)；肽聚糖(即胞壁质(mureins)、粘肽或糖蛋白如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]或MDP类似物)；MPL(单磷酰脂质A)；蛋白聚糖(例如从肺炎克雷伯菌中提取的)；链球菌制剂(例如OK432)；必思添（Biostim）.TM.(例如01K2)；EP109 942、EP180 564和EP231 039的"Iscoms（免疫刺激复合物）"；氢氧化铝；皂甙；DEAE-葡聚糖；中性油(如miglyol（二辛酸/癸酸丙二醇）)；植物油(如花生油(arachid oil))；脂质体；普流尼克（Pluronic）.RTM；多元醇；Ribi佐剂系统(参见例如GB-A-2 189 141)或白细胞介素，特别是刺激细胞介导的免疫的那些。美国专利号4,877,612已描述了由放线菌目中的细菌属无枝酸菌属(Amycolata)的提取物组成的另一种佐剂。此外，专有佐剂混合物可商购获得。所用的佐剂将部分取决于受体生物体。所给予的佐剂的量将取决于动物的类型和大小。最佳的剂量可由常规方法容易地确定。

适合用于油包水型乳剂的油佐剂可包括矿物油和/或可代谢油。矿物油可选自

和Drakeol，包括

6VR(SEPPIC,France)

可代谢油可选自SP油(下文描述)、Emulsigen(MPV实验室，罗尔斯顿，NZ)、蒙太得(Montanide)264,266,26(Seppic SA，巴黎，法国)，以及植物油如花生油和大豆油、动物油如鱼油角鲨烷和角鲨烯以及生育酚及其衍生物。

此外，所述佐剂可以包括以佐剂体积计量为约0.1%至25%，更优选约1至10%，甚至更优选约1至3%的一种或多种润湿剂或分散剂。特别优选的湿润剂或分散剂是非离子型表面活性剂。有用的非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物，特别是以商标

市售以及从BASF公司(Mt.Olive,N.J.)可获得的那些。其他有用的非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯酯，如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯，以商标

获得。可期望在佐剂中包括多于一种，例如至少两种，润湿剂或分散剂作为本发明的疫苗组合物的一部分。

在本文中使用时，在数字前的术语“约”指所述数字的值加或减10%。

合适的佐剂可以包括，但不限于本领域技术人员已知的表面活性剂，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、双十八烷基二甲基溴化铵、N,N-双十八烷基-N'-N-双(2-羟乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六烷基甘油和普朗尼克多元醇；polanions（多聚阴离子），如吡喃、硫酸葡聚糖、多聚IC、聚丙烯酸、卡波姆；肽类，例如胞壁酰二肽、aimethylglycine（二甲基甘氨酸）、促吞噬素(tuftsin)、油乳液、明矾以及它们的混合物。其他可能的佐剂包括大肠杆菌(E.coli)热不稳定毒素或霍乱毒素的B肽亚单位(McGhee,J.R.等,"On vaccine development,"Sem.Hematol.,30:3-15(1993))。

在一个实施方案中，本发明的乳液或疫苗组合物包含免疫佐剂。合适的免疫佐剂的实例包括ISA51(SEPPIC)、SWE或SWE-a(洛桑大学的疫苗制剂实验室(VFL)所提供)。

[进一步的表面活性剂]

在本发明的包含乳液的疫苗组合物的实施方案中，除免疫原性产品和一种或多种油性免疫佐剂物质的组合外，所述疫苗组合物优选还包含一种或多种表面活性剂。表面活性剂的示例性实施方案中包括二缩甘露醇单油酸酯，如以Arlacel(SEPPIC,法国)市售的蒙太得

80。

在一个实施方案中，表面活性剂的量以疫苗组合物的总重量计在0.00001%(w/w)至1%，优选0.0001至0.1%，更优选0.001至0.01%(w/w)的范围。

[冻干产品]

根据一个实施方案以及贮存的目的，本发明的产品或疫苗组合物可以被冻干。因此，疫苗组合物可以以冷冻干燥(冻干)形式提供。在所述实施方案中，根据本发明的免疫原性产品与一种或多种冻干辅剂组合。本领域技术人员周知各种冻干辅剂。辅剂的冻干包括糖类如乳糖和甘露糖醇。

在其中疫苗组合物由用作乳液的包含表面活性剂的冻干组合物组成的此类实施方案中，以所述疫苗组合物的总重量计，所述疫苗组合物优选包含大于0.1%(w/w)且小于10%(w/w)的本发明的免疫原性产品。

[稳定剂]

在一些实施方案中，所述疫苗可与稳定剂混合，以例如保护易降解的蛋白质避免被降解，提高疫苗的保存期，或提高冻干效率。有用的稳定剂是SPGA(Bovarnik等;J.Bacteriology59:509(1950))，碳水化合物例如山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖，蛋白质如白蛋白或酪蛋白或其降解产品，以及缓冲液如碱金属磷酸盐例如磷酸钾或磷酸二钠。

[给药途径]

可以通过任何常规的方法将本发明的疫苗组合物给予要免疫的受试者，所述方法包括注射例如皮内、肌内、腹腔内或皮下注射，或局部例如经皮递送。治疗可由一段时间内单一剂量或多个剂量组成。

[剂型]

适于注射使用的形式可包括无菌溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。可通过在疫苗组合物中添加各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠等来进行防止微生物的污染。在许多情况下，可优选包含等渗剂例如糖或氯化钠或氯化钾。可通过在组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶来进行可注射组合物的延长吸收。

根据一个实施方案，将本发明的冻干疫苗组合物溶解在注射用水中并轻轻混合；然后加入免疫佐剂，优选ISA51；将混合物轻轻混合进行乳化并装入合适的注射器中。可以使用的免疫佐剂的另一个例子是SWE或SWE-a。因此，本发明还涉及医疗装置，其包括填充或预填充本发明的疫苗组合物的注射器。理想地，乳液临时制备。不过，含有乳液的注射器可以在2-8℃下贮存小于10小时。在这种情况下，在注射前应通过手间摩擦以加温乳液。

[单位剂量范围]

优选地，当寻求人使用或非人哺乳动物使用时，根据本发明的疫苗组合物的剂量单位优选包含当设计用于动物时0.1至1000μg范围量的免疫原性产品，而当设计用于人时20至1000μg范围量的的免疫原性产品。

优选地，当寻求人使用时，根据本发明的疫苗组合物的典型剂量单位优选包含20μg至1000μg范围量，最优选25μg至600μg范围量的免疫原性产品。

[作用机理]

本发明还涉及用于制备免疫原性产品的方法，该产品可用于在所述免疫原性产品给予的哺乳动物中诱导免疫应答，包括体液免疫应答，其中中和内源性细胞因子的免疫抑制、细胞凋亡或血管生成性能的抗体被诱导。

在一个实施方案中，免疫原性产品在其给予的哺乳动物中诱导免疫应答的能力可通过其诱导中和内源性TNFα的抗体的能力来测量。

在一个实施方案中，诱导中和内源性TNFα的抗体的能力可根据中和测试(测试D)来确定。

根据以下方案进行中和测试(测试D)：

用本发明的疫苗、本发明的乳液或包含本发明的免疫原性产品的组合物肌内注射Hayward等(2007,BMC Physiology,Vol.7:13-29)描述的hTNFα转基因小鼠。小鼠肌内注射至少一次，优选两次，更优选三次，例如在第0天(D0)、第7天(D7)和第28天(D28)。在免疫后数天，如在第D61、D119和D191天收集血清。

使用L929生物测定评估来自用本发明的免疫原性产品免疫的hTNFα小鼠的血清的中和能力。

L929小鼠成纤维细胞(Sigma n°85011425)以1.5×10⁴/cm²平板接种在培养基(DMEM(Cambrex BE12604F)，补充有10%胎牛血清(Sigma F7524)、2mM谷氨酰胺(Sigma G7513)、100U/ml青霉素/链霉素(Sigma P0781)和1mM丙酮酸钠(Sigma S8636))中，并在37℃、5%CO₂下培养2天，以获得亚汇合的单层。

然后收获L929细胞，并以在100μl平板培养基(DMEM F12(CambrexBE12719F)，补充有2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠)中的2×10⁴个细胞/孔平板接种在96孔平底培养板中，并在37℃、5%CO₂下培养21+/-1小时。

血清一式两份测试：每孔加入工作稀释度(1/100)上4倍稀释的60μL血清或30μL测定培养基(HL1(Cambrex US77201)，补充有2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠)。测试血清和对照以一系列6次两倍稀释度进行稀释。

将稀释在测定培养基中的30μL/孔的人TNFα细胞因子以工作浓度2.5ng/mL上4倍稀释加入血清稀释培养板中，并在37℃下孵育90分钟，在4℃下30分钟，以及在室温下15分钟。

将50μL样品转移到其中细胞必须是亚汇合的96孔平底培养板中。然后，加入50μL的补充有2μg/mL放线菌素D的测定培养基，并将培养板在加湿培养箱中在37℃、5%CO₂下培养20h±1h。

然后，每孔加入20μL的MTS/PMS(100mL MTS和5mL PMS，PromegaG5430)，并将培养板在加湿培养箱中在37℃、5%CO₂下培养另外4小时。

在培养结束时，使用本领域已知的方法评估L929细胞的存活。一个实例如下：将20μl/孔的MTS/PMS溶液(100μl MTS/5μl PMS，Promega G5430)加入孔中，并将培养板在加湿培养箱中在37℃、5%CO₂下培养另外4小时。然后将培养板用分光光度计在490nm处读数。

如下计算相对细胞存活：

中和%=(OD_测试-OD_TNF标准品)/(OD_血清-OD_TNF标准品)

OD_测试代表使用血清和hTNFα的孔的光密度。

OD_TNF标准品代表仅使用2.5ng/ml TNFα的孔的光密度。

OD_血清代表仅使用血清的对照孔的光密度。

中和滴度表示为中和50%hTNFα活性的血清稀释度的倒数(即NC50)。

在实施例15中对本发明的产品进行中和测试，并显示本发明的产品诱导针对hTNFα具有高中和活性的抗体。

本发明还涉及用于在需要其的哺乳动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物如上文所述的免疫原性产品。在一个实施方案中，所述免疫反应包括体液免疫应答，其中诱导了中和内源性细胞因子的免疫抑制、细胞凋亡或血管生成性能的抗体。

所产生的免疫原性产品主要用于预防或治疗与TNFα过度产生相关的疾病的疫苗组合物。更具体而言，本发明涉及用于预防或治疗与TNFα过度产生相关的疾病的方法，包括给予动物，包括人，治疗有效量的本发明的产品、乳液或疫苗的步骤。与TNFα过度产生相关的疾病可以选自强直性脊柱炎、银屑病、类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、炎症性肠病、克罗恩氏病、恶病质和癌症。本发明的一个目的是用于预防或治疗与TNFα过度产生相关的疾病的本文如上所述的本发明的产品、乳液或疫苗。

因此，本发明的再一方面涉及如上所定义的免疫原性产品或疫苗组合物的应用。本发明的再一个目的由用于诱导中和哺乳动物中内源性TNFα活性的抗体的产生的方法组成，所述方法包括给予所述哺乳动物(ⅰ)以上公开的疫苗组合物或(ii)以上描述的免疫原性产品以及一种或多种免疫佐剂的步骤。

[试剂盒和医疗设备]

本发明还涉及试剂盒，包括：

-1个小瓶(1号瓶)，含有本发明的冻干产品，通常3ml；

-1个小瓶(2号瓶)，含有注射用水，通常2mL；

-1个小瓶(3号瓶)，含有佐剂，优选ISA51、SWE或SWE-a；这个小瓶能含有3mL佐剂并可是8mL的容器；

-1个注射器，通常为1mL的

-1个针头(1号针头)，用于乳液制备；该针头优选为20G针头；

-1个针头(2号针头)，用于注射，优选肌内注射；该针头优选为23G针头。

本发明还涉及制备来自试剂盒的疫苗的方法，包括：

(1)通过使用与1号针头相连的注射器将2号瓶的注射用水注射入1号瓶中；

(2)在1-5分钟内轻轻旋转1号瓶，直到制备物完全溶解；

(3)使用同一注射器和针头，从3号瓶吸取佐剂。将该注射器内容物放入1号瓶中；

(4)上下抽动整个瓶内容物足够数量的次数以乳化内容物，通常30次，最后吸取全部乳液。

注射前，优选将针头号1切换成针头号2，并将空气从注射器中清除。

本发明还涉及医疗装置，其是用本发明的疫苗组合物填充或预填充的注射器。

本发明还涉及医疗装置，其包含预填充有本发明的产品或本发明的疫苗组合物的小瓶或卡普尔瓶(carpule)。

[用于制备本发明的产品的方法]

本发明还涉及用于制备产品的两种方法(以下简称“主要方法”和“变式方法”)，所述产品包含与KLH偶联的TNFα，其中所述TNFα是强灭活的，这表示在测试A的条件下所述产品显示小于30%，优选25%，更优选20%，更优选15%，甚至更优选10%的细胞溶解活性或表现大于15000的灭活指数。优选地，本发明的产品的细胞溶解活性以100ng/ml浓度测量。

在该两种方法中，优选地，所述TNFα起始产品由可通过本领域中描述的各种方法获得的重组人TNFα组成。例示性地，TNFα由大肠杆菌细胞产生的重组人TNFα组成，所述大肠杆菌细胞已由其中已插入编码人TNFα的表达盒的质粒转化。最优选地，TNFα起始产品不含有可检测量的内毒素。用于本发明的方法中，TNFα优选在液体溶液中，优选在具有pH范围为6.5至7.5的缓冲溶液中。在一些实施方案中，含有TNFα的液体溶液还含有DMSO(二甲基亚砜)，优选终浓度范围为0.1%(w/w)至5%(w/w)，最优选0.5%(w/w)至3%(w/w)的DMSO(二甲基亚砜)。在一个实施方案中，含有TNFα的液体溶液还含有以液体溶液的总重量计终浓度范围为0.1%(w/w)至2%(w/w)，优选终浓度为1%(w/w)重量的DMSO。在一个实施方案中，所述含有TNFα的液体溶液不包含，即包含0%(w/w)DMSO。DMSO是众所周知的抗氧化剂，能增加TNFα分子中存在的戊二醛活性基团的利用性。在一些实施方案中，所述含有TNFα的液体溶液还含有终浓度范围为1mM至20mM，优选为3mM至10mM的EDTA。

优选地，所述KLH起始产品由从海洋腹足软体动物大锁孔帽贝（Megathuracremulata）的淋巴中提取的高度纯化的KLH组成，且所述KLH起始产品优选不含有可检测量的内毒素。天然产生的KLH通常由双十聚体（di-decamer）结构(20个亚单位的非共价管状组装)组成，每个十聚体单位由亚单位KLH1或KLH2的均聚物组成。优选地，所述KLH双十聚体的分子量(MW)为约8.10⁶Da，考虑KLH1亚单位的分子量为约350kDa，而KLH2亚单位的分子量为约390kDa。

[反应TNFα+KLH+戊二醛]

在第一实施方案中，本发明的方法包括：

·将(i)纯化的TNFα、(ⅱ)纯化的匙孔血蓝蛋白(KLH)和(iii)戊二醛混合在一起的第一步骤(步骤a)。

由于戊二醛与KLH和TNFα两者含有的游离氨基基团反应，在步骤a)结束时获得的产品包含与TNFα分子结合的KLH的单体和低聚物，其中TNFα分子包含(i)TNFα单体和(ii)TNFα低聚物。

在步骤a)的优选实施方案中，首先将TNFα和KLH以适当的量混合在一起，然后再加入戊二醛。

在一些实施方案中，步骤a)中的TNFα和KLH以范围为10:1至40:1的TNFα:KLH摩尔比混合。在一些优选的实施方案中，步骤a)中的TNFα和KLH以范围为30:1至40:1的TNFα:KLH摩尔比混合。

在一些优选的实施方案中，步骤a)中的TNFα和KLH以范围为35:1至40:1的TNFα:KLH摩尔比混合。

在步骤a)的一些实施方案，以下称为步骤a1)中，戊二醛以在反应混合物中范围为1mM至50mM，优选为20mM至30mM，更优选为25mM的终浓度使用。在步骤a)的一些实施方案中，戊二醛与TNFα和KLH一起孵育范围为大于110min至小于400min，优选约120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230和240分钟的一段时间。在一个实施方案中，戊二醛在约120分钟期间以25mM加入。在另一个实施方案中，戊二醛在约240分钟期间以25mM加入。

有利地，与戊二醛孵育的步骤a)在范围为18℃至37℃，优选为18℃至27℃的温度下进行。

戊二醛反应后淬灭

根据一个实施方案，可以通过添加淬灭化合物，优选选自(i)还原剂和(ii)氨基酸的淬灭化合物停止与戊二醛的反应，其中所述氨基酸选自赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组。

所述还原剂可以由本领域中已知的还原剂中的任何一个组成，所述还原剂由于其还原性而具有还原没有与TNFα或KLH游离氨基基团反应的戊二醛的剩余的游离醛基的能力。所述还原剂可以选自硼氢化钠、氰基硼氢化钠组成的组。

根据一个实施方案，在其中所述淬灭化合物是氨基酸的实施方案中，所述氨基酸由甘氨酸组成。在其中使用甘氨酸和/或赖氨酸用于阻断与戊二醛反应的步骤b)的一些实施方案中，所选择的氨基酸以在反应混合物中范围为0.01M至1M，优选为0.05M至0.5M，最优选为0.08M至0.2M，例如如在本文实施例中所示的0.1M的终浓度使用。在一个实施方案中，与淬灭化合物的孵育进行范围为1分钟至120分钟，优选为5分钟至60分钟，例如如本文实施例中所示的15分钟的一段时间。在另一个实施方案中，该步骤在范围为20℃至30℃，优选为23℃至27℃的温度下进行。

方法的步骤b)

在该第一实施方案中，本发明的方法包括：进行步骤a)之后，任选如下进行上述的淬灭反应，步骤b：

b)去除分子量小于10kDa的化合物

在步骤b)中，去除反应混合物中存在的小于10kDa的小化合物。这些小化合物主要包括过量的戊二醛和没与TNFα也没与KLH反应的过量的淬灭化合物分子，以及大小小于内源性TNFα或天然KLH的最终蛋白降解产物。

可根据允许去除小于10kDa的化合物的任何已知技术进行步骤b)，所述技术包括用截断值为10kDa的透析膜的透析或使用截断值为10kDa的滤膜的过滤。例示性地，步骤b)可由如本文实施例所示的使用截断值为10kDa的滤膜的切向流过滤的步骤组成。在步骤b)结束时，收集没有不希望的小分子化合物的过滤截留物。

如果需要，步骤b)可包括去除在步骤b)结束时得到的反应混合物中存在的最终化合物聚集体的初步步骤。所述初步步骤可以由传统的用于去除液体溶液中最终以悬浮体存在的固体聚集体的过滤步骤组成，例如使用适当的滤膜，如孔径为0.2μm的滤膜的过滤步骤。

方法的步骤c)

在该第一实施方案中，本发明的方法包括：进行步骤b)之后，以下步骤c)：

c)以在至少60mM至少240小时到至少120mM至少144小时范围的浓度/反应时间的条件的添加甲醛。

步骤c)由在指定的浓度和指定的时间段添加甲醛组成。对在步骤c)结束时得到的中间产品以在反应混合物中至少60mM，优选60至500mM，更优选100至300mM的浓度进行甲醛处理至少10天，优选240至500小时，更优选288至336小时。在一个实施方案中，对在步骤c)结束时得到的中间产品以在反应混合物中至少120mM，优选120至270mM的浓度进行甲醛处理至少6天(144小时)，优选144至500小时，更优选144至360小时。

在一个实施方案中，在步骤c)中，以在该混合物中220mM至270mM的浓度进行甲醛处理大于300小时的时间。在一个实施方案中，时间为大于310、320和330小时，例如如本文实施例中所示的336小时(14天)的时间。

优选地，用甲醛处理的时间优选不大于500小时，其包括小于490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370和360小时的时间期间。

在步骤c)中，在反应混合物中的甲醛的浓度优选大于200mM。大于200mM的甲醛的浓度特别包括大于220、230、240和250mM的浓度。在一个实施方案中，甲醛的浓度为小于270mM。在优选的实施方案中，在至少240小时的期间以终浓度至少200mM施加甲醛，优选220mM至270mM，优选250mM至少300小时。

在步骤c)中，优选在30℃至42℃范围的温度下，例如如本文实施例中所示的37℃的温度下进行与甲醛的孵育。

如从现有技术预期，所述甲醛处理引起产品显著的结构变化。因此，更令人惊奇的是，尽管该处理，但是根据本发明的方法获得的免疫原性产品具有期望的抗TNFα免疫原性。

方法的步骤d)

在所述方法的步骤d)中，通过添加淬灭化合物，优选选自(ⅰ)还原剂和(ii)氨基酸的淬灭化合物停止与甲醛的反应，所述氨基酸选自赖氨酸和甘氨酸组成的组。

所述还原剂可以由本领域中已知的还原剂中的任何一个组成，所述还原剂由于其还原性而还原没有与TNFα或KLH游离氨基基团反应的甲醛的剩余的游离醛基。

所述还原剂可以选自硼氢化钠、氰基硼氢化钠组成的组。

根据一个实施方案，在其中所述淬灭化合物是氨基酸的实施方案中，所述氨基酸由甘氨酸组成。在使用甘氨酸和/或赖氨酸用于阻断与甲醛反应的步骤b)的一些实施方案中，以在反应混合物中范围为0.01M至1.5M，优选为0.05M至1M，最优选为0.2M至0.8M，例如如本文实施例中所示的0.38M的终浓度使用所选择的氨基酸。在一个实施方案中，与淬灭化合物的孵育进行范围为5分钟至120分钟，优选10分钟至80分钟，例如如本文实施例中所示的60分钟的一段时间。在另一个实施方案中，该步骤在范围为18℃至30℃的温度下，优选在19℃至27℃的温度下进行。

去除小于100kDa，优选小于300kDa的物质

步骤d)之后，可以进行本发明的产品的收集。

不过，根据一个非常优选的实施方案，步骤d)之后和收集产品之前，进行进一步的步骤。该步骤由去除分子量小于100，优选小于300kDa的物质组成。可以由本领域技术人员通过本领域已知的用于从液体溶液中去除分子量小于300kDa的物质的任何技术去除分子量小于300kDa的物质。在第一个实施方案中，所使用的技术是通过使用截断值为至少100kDa（或者在一个实施方案中至少300kDa）的滤膜进行过滤步骤，包括超滤步骤或切向过滤步骤。在第二个实施方案中，所使用的技术由使用截断值为至少100kDa，包括截断值为至少300kDa的滤膜的切向过滤步骤组成。

不愿意与任何理论相关，本申请人发现，令人惊奇地，进行该步骤有利于所述产品。特别地，该步骤去除没有与KLH反应的TNFα均聚物。观察到，在所述方法的该步骤中大于50%的初始TNFα可以被去除，且意料不到地，就免疫原性而言剩余的产物甚至是更好的。

冻干

任选地，可进一步处理根据本发明的最终免疫原性产品以用于在使用前长期贮存。本发明的发明人已证明冻干本发明的产品可提高其长期贮存时的稳定性，并可改善TNFα生物灭活的不可逆性。根据本发明的冻干免疫原性产品可在无菌和无热源的封闭容器中在约2℃至约25℃的温度下不变地贮存数月，包括至少6个月直到其使用。

替代方法

在本发明的变体中，制备产品的方法包括以下步骤，所述产品包含与KLH偶联的TNFα，其中所述TNFα是强灭活的，这表示在测试A条件下，优选当测试浓度为100ng/ml时所述产品显示小于30%，优选25%，更优选20%，甚至更优选15%的细胞溶解活性：

a)将(i)纯化的TNFα、(ii)纯化的匙孔血蓝蛋白和(iii)戊二醛混合在一起

b)去除分子量小于10kDa的化合物

并且特征在于步骤a)的特定实施方案，以下称为步骤a2)，其中以至少20mM的浓度在大于18小时或大于20小时，或大于24小时的期间施加戊二醛，通过添加淬灭化合物，优选选自(ⅰ)还原剂和(ii)氨基酸的淬灭化合物停止与戊二醛的反应，所述氨基酸选自赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组。

在第一实施方案中，然后收集所述产品。

在步骤a2)的优选实施方案中，TNFα和KLH以在适当的量首先混合在一起，然后再加入戊二醛。

有利地，在步骤a2)中TNFα和KLH以范围为10:1至40:1的TNFα:KLH摩尔比混合。在一些优选的实施方案中，在步骤a)中TNFα和KLH以范围为30:1至40:1的TNFα:KLH摩尔比混合。优选地，在步骤a2)中TNFα和KLH以范围在35:1至40:1的TNFα:KLH摩尔比混合。

在该变体方法中，比照适用（apply mutatis mutandis）与以上主要方法中所描述的“戊二醛后淬灭反应”的相关特征。

在该变体方法中，进行步骤b)，且比照适用与步骤b)相关的特征，即以上主要方法中所描述的去除分子量小于10kDa的化合物。

在第二个实施方案中，在步骤b)之后以及收集产品之前，以在范围为至少60mM至少4天的浓度/反应时间的条件施加甲醛，然后通过添加选自(ⅰ)还原剂和(ii)氨基酸的淬灭化合物停止与甲醛的反应，所述氨基酸选自赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组。在该变体方法中，比照适用与以上主要方法中所描述的步骤d)：“甲醛后淬灭反应”相关的特征。

根据本发明的优选实施方案，在收集产品开始之前，使用截断值至少100kDa(优选300kDa)的滤膜进行切向流过滤的步骤，使得分子量小于100kDa(优选为300kDa)的物质从产品中去除。在该变体方法中，比照适用与以上主要方法中所描述的“去除小于100kDa，优选小于300kDa的物质”相关的特征。

任选地，可进一步处理根据本发明的最终免疫原性产品用于在使用前长期贮存。在该变体方法中，比照适用与以上主要方法中所描述的冻干相关的特征。

在本发明的另一变体中，用于制备产品的方法包括以下步骤，所述产品包含与KLH偶联的TNFα，其中所述TNFα是强灭活的，这表示在测试A条件下，优选当在100ng/ml的浓度下测试时，所述产品显示小于30%，优选25%，更优选20%，甚至更优选15%的细胞溶解活性：

a)将(i)纯化的TNFα、(ii)纯化的匙孔血蓝蛋白和(iii)戊二醛混合在一起

b)去除分子量小于10kDa的化合物

c)以至少66mM至少144小时到至少250mM至少96小时范围的浓度/反应时间的条件施加甲醛，

并且特征在于步骤a)的特定实施方案，以下称为步骤a2)，其中以至少20mM的浓度施加戊二醛大于18小时，大于20小时，大于24小时，大于36小时，大于48小时，大于72小时，大于96小时的时间，通过添加淬灭化合物，优选选自(ⅰ)还原剂和(ii)氨基酸的淬灭化合物停止与戊二醛的反应，所述氨基酸选自赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组。

在第一个实施方案中，然后收集所述产品。

在步骤a2)的优选的实施方案中，TNFα和KLH以适当的量首先混合在一起，然后再加入戊二醛。

有利地，在步骤a2)中TNFα和KLH以范围为10:1到40:1的TNFα:KLH摩尔比混合。在一些优选的实施方案中，步骤a)中的TNFα和KLH以范围为30:1至40:1的TNFα:KLH摩尔比混合。优选地，步骤a2)中TNFα和KLH以范围为35:1至40:1的TNFα:KLH摩尔比混合。

在该变体方法中，比照适用与以上主要方法中所描述的“戊二醛后淬灭反应”相关的特征。

在该变体方法中，进行步骤b)，且比照适用与步骤b)即以上主要方法中所描述的去除分子量小于10kDa的化合物相关的特征。

步骤b)之后和收集产品之前，以至少60mM、100mM、120mM、140mM、160mM至少6天到至少250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM至少4天范围的浓度反应/时间的条件施加甲醛。

然后，通过添加选自(ⅰ)还原剂和(ii)氨基酸的淬灭化合物阻止与甲醛的反应，所述氨基酸选自赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组。在该变体方法中，比照适用与以上主要方法中所描述的步骤d)：“甲醛后淬灭反应”相关的特征。

根据本发明的优选实施方案，在收集产品即将开始之前，进行使用截断值为至少100kDa(优先300kDa)的滤膜的切向流过滤步骤，使得分子量小于100kDa(优选300kDa)的物质从产品中去除。在该变体方法中，比照适用与以上主要方法中所描述的“去除小于100kDa，优选小于300kDa的物质”相关的特征。

任选地，可进一步处理根据本发明的最终免疫原性产品用于在使用前长期贮存。在该变体方法中，比照适用与以上主要方法中所描述的冻干相关的特征。

附图简述

图1：(A)根据测试A的产品浓度的函数的细胞存活百分比。(B)根据测试A的产品浓度的函数的细胞溶解活性的百分比。

图2：(A)根据测试A测定的测试产品的EC50的比较。(B)根据测试A测定的测试产品的灭活指数的比较。

图3：(A)根据测试B的产品浓度的函数的细胞存活百分比。(B)根据测试B的产品浓度的函数的细胞溶解活性的百分比。

图4：(A)根据测试B测定的测试产品的EC50的比较。(B)根据测试B测定的测试产品的灭活指数的比较。

图5：在用本发明的产品免疫的小鼠中抗TNF抗体的效价。

图6：小鼠中的毒性评估(致死性休克模型)。

图7：(A)最终过滤后本发明的产品的SE-HPLC图谱。(B)过滤后得到的不同级分的本发明的产品存在的评价。

图8：(A)本发明的滤过和非滤过产品的免疫原性。(B)过滤产品的截留物(R)比过滤物(F)的免疫原性。

图9：给予本发明的疫苗后小鼠中关节炎的发展。

图10：用本发明的疫苗免疫的患者中抗TNF抗体反应。

图11：用本发明的疫苗免疫的患者中临床缓解状态。

图12：用本发明的疫苗免疫的血清反应阳性和血清反应阴性患者中的临床缓解状态。

图13：(A)根据测试A的产品浓度的函数的细胞存活百分比。(B)根据测试B的产品浓度的函数的细胞存活百分比。

图14：(A)根据测试B测定的测试产品的EC50的比较。(B)根据测试B测定的测试产品的灭活指数的比较。

图15：作为时间的函数，本发明的疫苗免疫的小鼠血清的中和能力。

图16：给予在ISA51或SWE中乳化的产品后在第35天的抗人TNFa抗体产生。

图17：用在ISA51或SWE中乳化的本发明的产品免疫的小鼠的血清在第35天的中和能力。

图18：(A)根据测试A的产品浓度的函数的细胞存活百分比。(A)根据测试B的产品浓度的函数的细胞存活百分比。

实施例

实施例1：本发明的产品的制备

天然形式的KLH是双十聚体结构(20个亚单位的非共价管状组装)，相应于亚单位KLH1或KLH2(KLH1:KLH2≌0.9:1)的均聚物；分子量(MW)≌8×10⁶Da。天然KLH还包含一致比例的较高分子量的多聚体和较低分子量的十聚体。匙孔血蓝蛋白(KLH)从海洋腹足软体动物大锁孔帽贝（Megathura crenulata）的淋巴提取，然后在GMP条件下纯化。在贮存条件下2-8℃的温度下进行的稳定性试验结果表明，在2-8℃下纯化的KLH的保存期为36个月。

在GMP条件下在大肠杆菌中生产重组人TNF-α。

使用下面的制备方法生产370mg TNF规模的批量本发明的产品。

a)与戊二醛的缀合

将TNFα在缓冲液(130mM磷酸氢二钠、133mM氯化钠和6.6mM EDTA，pH7.8)中稀释，得到1.05mg/ml的溶液，并加入1%DMSO。在22±3℃下孵育30分钟后，加入工作缓冲液(100mM磷酸氢二钠、150mM氯化钠和5mMEDTA，pH7.8)以稀释TNF混合物至0.51mg/mL。

基于UV浓度以1:0.58的TNFα:KLH比(相应于1单体的KLH比37单体的TNFα的摩尔比)将过滤后的KLH加入TNF溶液中。

进行与戊二醛(加入以在反应介质中达到25mM)的缀合，戊二醛用蠕动泵从2.5%w/v储备液加入，并将溶液在23±2℃下在确定的时间期间混合。

b)用甘氨酸淬灭

在15分钟期间用甘氨酸0.1M淬灭反应。

c)第一切向流过滤(TFF1)

使用Pall Minim II TFF系统以及用0.5M NaOH消毒且用工作缓冲液平衡的截断分子量10kDa的0.02m²聚醚砜膜进行第一TFF。

然后通过0.22μm过滤澄清淬灭的溶液。该中间体在工作缓冲液中稀释两倍，然后通过切向流过滤(TFF)和12体积的工作缓冲液渗滤。收获截留物并贮存小于20小时。

d)用甲醛灭活

使用蠕动泵将甲醛加入截留物中，以达到确定的终浓度。在设定为37±2℃的培养箱中在确定的时间期间通过每日用磁力搅拌器混合溶液进行灭活反应。

e)用甘氨酸淬灭

然后在1小时的时间期间用0.38M的甘氨酸淬灭反应。

f)第二切向过滤(TFF2)

使用Pall Minim II TFF系统以及用0.5M NaOH消毒且用配方缓冲液平衡的截断分子量300kDa的0.02m²聚醚砜膜进行第二TFF。

通过0.2μm过滤澄清淬灭的溶液。浓缩中间体以使起始切向体积为≈900ml，并通过TFF用12体积的配方缓冲液(1.47mM KH2PO4,8.1mM Na2HPO4,2.68mM KCl,136.9mM NaCl,pH7.3)进行接下来的过滤以去除低分子量TNF均聚物和非反应性试剂。收获截留物，然后稀释至基于BCA浓度测定的300μg/mL的理论浓度，然后进行0.2μm过滤，得到本发明的产品。

实施例2：本发明的一些产品的制备条件的说明和与WO2007/022813中描 述的产品的比较

表1

B1相应于WO2007/022813中描述的产品。

GTP0902通过实施例1中所述的方法在表1中提及的条件下获得，且其中在步骤f)中用截断值300kDa进行第二切向过滤。GTP0902为GMP临床批次。

实施例3：如测试A所示本发明的产品是强灭活的

本测试用于确定本发明的产品中人TNFα生物活性灭活的百分比。

该测试基于在放线菌素D存在下人TNFα诱导的小鼠L929细胞的细胞溶解。该测试在T0，即产品为液体形式并在4℃下贮存下进行。

材料和方法

将L929小鼠成纤维细胞(Sigma n85011425)以1.5×10⁴/cm²平板接种在培养基(DMEM(Cambrex BE12604F)，补充有10%胎牛血清(Sigma F7524)、2mM谷氨酰胺(Sigma G7513)、100U/ml青霉素/链霉素(Sigma P0781)和1mM丙酮酸钠(Sigma S8636))中，并在37℃、5%CO₂下培养2天以获得亚汇合的单层。

然后收获L929细胞，并以2×10⁴个细胞/孔在100μL的平板培养基(DMEMF12(Cambrex BE12719F)，补充有2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素/孔和1mM丙酮酸钠)中平板接种于96孔平底培养板中，并在37℃、5%CO₂下培养21+/-1小时。

从稀释在60μL的测定培养基(HL1(Cambrex US77201)，补充有2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠)中的6400ng/ml(TNFα当量)的120μl本发明的产品制备一系列10次两倍稀释的本发明的产品。

使用的浓度单位是TNFα当量浓度。TNFα当量浓度使得能够在细胞生物测定和体内TNF休克模型中以相同的TNF含量比较不同的批次。以TNFα当量计浓度如下确定：

[TNFα当量浓度]=(在该方法开始时TNFα的量)-10%。如果在用于制备本发明的产品的过程中已经进行截断值300kDa过滤的最后一步，则去除75%的TNFα(如其中TNFα被放射标记的放射性测试所证实)，以TNFα当量计的浓度如下确定：[TNFα当量浓度]=[(开始时TNFα的量-10%)-75%]。值得注意的是，在生产过程中产率是一致的。

从在60μl测定培养基中的8ng/ml120μl人TNFα制备一系列10次三倍稀释的标准品(人TNFα6.24mg/ml，Boehringer ingelheim03030R1)。Boehringer的TNF的EC50范围为10至500pg/ml。

在L929细胞的培养时间结束时，细胞是亚汇合的。然后清空平底培养板的孔中的培养基，并将50μl的各稀释液转移到平底培养板的孔中。

将补充有2μg/ml的放线菌素D(Sigma A9415)的50μl测定培养基加入各孔中。

然后，将L929细胞在37℃、5%CO₂下培养20+/-1小时。

在培养结束时，加入20μl/孔的MTS/PMS(100μl MTS/5μl PMS，PromegaG5430)，并将板在37℃、5%CO₂下孵育另外4小时。

然后将板在DYNEX分光光度计MRXII上在490nm处读数。

存活百分比如下计算：

%=1-[(OD_产品-OD_TNF标准品/(OD_细胞-OD_TNF标准品)]

OD_产品代表使用本发明的产品的孔的光密度。

OD_TNF标准品代表使用200ng/ml标准品TNFα的孔的光密度。

OD_细胞代表无标准品、无本发明的产品的对照孔的光密度。

结果

根据表1中所述的条件制备产品B1、B2、B3、B5、B80、B11、B14、B140和GTP0902，并在进行测试A前在4℃下以液体形式贮存小于10天。

如材料和方法中所述在L929生物测定(测试A)中测试它们。

测定L929细胞存活百分比，结果显示在图1A和表2中。

表2：细胞存活百分比(测试A)

图1A显示以增加的产品的浓度为函数的细胞存活百分比。以100ng/ml的浓度，B1(WO2007/022813的产品)杀死31%的细胞，而本发明的产品杀死小于10%的细胞。特别地，以100ng/ml的浓度，B14和GTP0902杀死小于5%的细胞。

图1B显示浓度为100ng/ml的产品，在B1(WO2007/022813的产品)存在下，小于40%的细胞存活，而在本发明的产品存在下大于60%的细胞存活。特别地，在100ng/ml的B14和GTP0902存在下，几乎90%的细胞存活。

结论，如测试A所示，本发明的产品是强灭活的。

结果还以EC50进行分析，EC50是需要降低细胞生长50%的产品的浓度。

图2A和表3显示与本发明的产品的EC50相比，B1(WO2007/022813的产品)的EC50是非常低的(小于200ng/ml)。

表3

各产品的灭活指数如下计算：EC50_产品/EC50_TNFα。

图2B和表4显示与本发明的产品的灭活指数(大于10000)相比，B1(WO2007/022813的产品)的灭活指数非常低(小于4000)。

这些结果表明，本发明的产品比B1(WO2007/022813的产品)至少2.5倍地更无活性。特别地，B14和GTP0902比B1大于10000倍地更无活性。

表4

实施例4：如测试B所示本发明的产品保持为灭活的

如对灭活疫苗所经典进行的，该测试用于测量当所述产品生产后在37℃下以液体形式贮存6周后的逆转(TNFα活性再生)程度。进行该测试以确定本发明的产品的灭活在给予期间或给予之后保持稳定。

材料与方法

将L929小鼠成纤维细胞(Sigma n85011425)以1.5×10⁴/cm²平板接种在培养基(DMEM(Cambrex BE12604F)，补充有10%胎牛血清(Sigma F7524)、2mM谷氨酰胺(Sigma G7513)、100U/ml青霉素/链霉素(Sigma P0781)和1mM丙酮酸钠(Sigma S8636))中，并在37℃、5%CO₂下培养2天以获得亚汇合的单层。

然后收获L929细胞，并以2×10⁴个细胞/孔在100μL的平板培养基(DMEMF12(Cambrex BE12719F)，补充有2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠)中平板接种于96孔平底培养板中，并在37℃、5%CO₂下培养21+/-1小时。

从稀释在60μL的测定培养基(HL1(Cambrex US77201)，补充有2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠)中的6400ng/ml(TNFα当量)的120μl本发明的产品制备一系列5次三倍稀释的本发明的产品。

使用的浓度单位是TNFα当量浓度(实施例4)或使用BCA测试确定的总蛋白(实施例13)。TNFα当量浓度使得能够在细胞生物测定和体内TNF休克模型中以相同的TNF含量比较不同的批次。以TNFα当量计的浓度如下确定：

[TNFα当量浓度]=(在该方法开始时TNFα的量)-10%。

如果在用于制备本发明的产品的过程中已经进行截断值300kDa过滤的最后一步，则去除75%的TNFα(如其中TNFα被放射标记的放射性测试所证实)，以TNFα当量计的浓度如下确定：[TNFα当量浓度]=[(开始时TNFα的量-10%)-75%]。值得注意地，在生产方法中产率是一致的。

从在60μl测定培养基中的8ng/ml120μl人TNFα制备一系列10次三倍稀释的标准品(人TNFα6.24mg/ml，Boehringer ingelheim03030R1)。Boehringer的TNF的EC50范围为10至500pg/ml。

在L929细胞的培养时间结束时，细胞是亚汇合的。然后清空平底培养板的孔中的培养基，并将50μl的各稀释液转移到平底培养板的孔中。

将补充有2μg/ml的放线菌素D(Sigma A9415)的50μl测定培养基加入各孔中。

然后，将L929细胞在37℃、5%CO₂下培养20+/-1小时。

在培养结束时，加入20μl/孔的MTS/PMS(100μl MTS/5μl PMS，PromegaG5430)，并将板在37℃、5%CO₂下孵育另外4小时。

然后将板在DYNEX分光光度计MRXII上在490nm处读数。

存活百分比如实施例3中所述计算。

结果

根据表1中所述的条件制备产品B1、B2、B3、B5、B80、B11、B14、B140和GTP0902，并在进行测试B前在37℃下以液体形式贮存6周。

如材料和方法中所述在L929生物测定(测试B)中测试它们。

测定L929细胞存活百分比，结果显示在图3A中。

图3A和表5显示以增加的产品的浓度为函数的细胞存活百分比。在100ng/ml浓度时，B1(WO2007/022813的产品)杀死大于90%的细胞，而本发明的产品杀死小于65%的细胞。特别地，在100ng/ml时，B14和GTP0902杀死大约20%的细胞。

表5：细胞存活百分比(测试B)

图3B显示浓度为100ng/ml的产品，在B1(WO2007/022813产品)存在下小于10%的细胞存活，而在本发明的产品存在下大于35%的细胞存活。特别地，在100ng/ml的B14和GTP0902存在下，大于80%的细胞存活。

结论，如测试B所示，本发明的产品保持强灭活的。

结果还以EC50进行分析，EC50是需要降低细胞生长50%的产品的浓度。

图4A和表6显示与本发明的产品的EC50相比，B1(WO2007/022813的产品)的EC50是非常低的(小于50ng/ml)。

表6

B1

B2

B3

B5

B80

B11

B14

B140

GTP0902

hTNFα

EC50

<39.5

<39.5

113

77

433

344

1604

>3200

559

0,109

各产品的灭活指数如下计算：EC50_产品/EC50_TNF。

图4B和表7显示与本发明的产品的灭活指数相比，B1(WO2007/022813的产品)具有极低的灭活指数(小于500)。

这些结果表明，本发明的产品比B1(WO2007/022813的产品)至少3倍地保持更无活性。特别地，B14和GTP0902比B1保持大于30倍地更无活性。

表7

实施例5：在本发明的产品中游离TNFα均聚物存在的测定(测试C)

通过免疫捕获步骤使用抗TNFα单克隆抗体(步骤1)或抗KLH多克隆抗体(步骤1)包被的磁珠选择性耗尽后纯化TNFα和KLH均聚物。通过使用抗TNFα抗体包被的磁珠，将游离TNFα均聚物和本发明的产品从上清液中耗尽，使得可以通过特定ELISA定量游离KLH均聚物(步骤2)。以相同的方式，通过使用抗KLH抗体包被的磁珠，将游离KLH均聚物和本发明的产品从上清液耗尽，使得可以通过特定ELISA(步骤2)定量游离TNFα均聚物。

使用基于特定ELISA方法的测试(分别为TNF-TNF和KLH-KLH ELISA)进行本发明的产品中游离TNFα均聚物和游离KLH均聚物的定量测定。另外，对上清液进行KLH-TNF ELISA以控制从测试样品中完全耗尽本发明的产品。

用抗KLH抗体包被的磁珠的免疫捕获的原理。

通过使用抗KLH抗体包被的珠进行的免疫捕获，可使用“TNF-TNF”ELISA定量上清液中TNFα的均聚物。通过使用“KLH-KLH”和“KLH-TNF”ELISA，缺乏信号显示上清液中修饰的TNFα的杂聚物和均聚物的完全耗尽。

材料与方法

与抗KLH或抗TNFα抗体偶联的珠的制备

1.3×10⁹珠(

M270Epoxy,Invitrogen14302D)在PBS中稀释以达到20mg/ml终浓度，并保温10分钟。

通过使用磁铁洗涤后，将珠重悬于486μl硼酸盐缓冲液100mM pH9中。

加入333μl硫酸铵3M以达到1M终浓度。

然后加入182μl单克隆抗体抗TNFα(3B2/1H4/2E5-SO8038b2.2mg/ml)或235μl多克隆抗KLH(S030.07122.11.7mg/ml)，并将混合物在37℃下孵育12-16小时。然后使用磁铁收获珠。

使用1ml PBS2%BSA重悬珠以阻断反应和非特异位点，然后在4℃下孵育该混合物12-16小时期间。然后使用磁铁收获珠。

与测试样品孵育

包被和未包被的珠(20mg/ml)与待测试样品混合(产品以1μg/ml稀释在PBS1%BSA中)，然后在4℃下孵育12-16小时期间。然后使用磁铁收获上清液，并通过ELISA分析。

KLH-KLH ELISA

如本领域公知的那样进行夹心KLH-KLH ELISA。将捕获抗体(兔多克隆抗体抗KLH亲和纯化的(600-401-466，Rockland,1mg/ml)以100ng/孔包被。第一抗体(生物素化的兔多克隆抗KLH抗体亲和纯化的(600-406-466，Rockland,1mg/ml)以25ng/ml使用。

使用修饰的KLH作为标准品确定样品中KLH均聚物的定量。通过系列两倍稀释在稀释缓冲液中制备标准品浓度(从400至15.625ng/ml)。

使用聚链霉亲和素-HRP(1/5000)检测反应，并通过邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物溶液进行复合物显色。停止酶反应后，通过分光光度法在490nm处测定所产生的颜色的强度(参考滤波器，在650nm处)。

TNF-TNF ELISA

如本领域公知的那样进行夹心TNF-TNF ELISA。将捕获抗体(山羊多克隆抗人TNFα亲和纯化的(R&D system,AF210NA,1mg/ml))以100ng/孔包被。第一抗体(生物素化的山羊多克隆抗人TNFα亲和纯化的(R&D system,BAF210,0.5mg/ml))以75ng/ml使用。使用修饰的TNF作为标准品确定样品中TNF均聚物的定量。通过系列两倍稀释制备(从100至0.391ng/ml)标准品浓度。

使用聚链霉亲和素-HRP(1/5000)检测反应，并通过邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物溶液进行复合物显色。停止酶反应后，通过分光光度法在490nm处测定所产生的颜色的强度(参考滤波器，在650nm处)。

KLH-TNF ELISA

如本领域公知的那样进行夹心KLH-TNF ELISA。将捕获抗体(兔多克隆抗体抗KLH亲和纯化的(600-401-466,Rockland,1mg/ml))以100ng/孔包被。第一抗体(生物素化的山羊多克隆抗人TNFα亲和纯化的(R&D system,BAF210,0.5mg/ml))以75ng/ml使用。

使用聚链霉亲和素-HRP(1/5000)检测反应，并通过邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物溶液进行复合物显色。停止酶反应后，通过分光光度法在490nm处测定所产生的颜色的强度(参考滤波器，在650nm处)。

确定游离TNFα或KLH均聚物百分比的方法

通过将所述光密度与在同一板上进行的TNFα系列稀释物的光密度进行比较来测定TNFα浓度A、C、E。

通过将所述光密度与在同一板上进行的KLH系列稀释物的光密度进行比较来测定KLH浓度B、D、F。

通过将没有免疫捕获(I)的光密度和用抗TNFα抗体免疫捕获后的光密度(G)以及用抗KLH抗体免疫捕获后的光密度比较来确定对照(G、H、I)。

E相应于游离TNFα均聚物。

F相应于游离KLH均聚物。

A相应于TNFα-KLH聚合物+游离TNFα均聚物

B相应于TNFα-KLH聚合物+游离KLH均聚物。C和G用作耗尽对照以使用用抗TNFα抗体的免疫捕获确认TNFα-KLH聚合物+游离TNFα均聚物的完全耗尽。D和H用作耗尽对照以使用用抗KLH抗体的免疫捕获确认TNFα-KLH聚合物+游离KLH均聚物的完全耗尽。

结果

测定产品GTP0902和其他临床批次中游离TNFα均聚物的存在。

对从与抗TNFα包被磁珠混合的待测试样品获得的上清液进行的KLH-KLHELISA表明在产品GTP0902中没有游离KLH均聚物。

因此，游离TNFα均聚物的百分比计算作E/A*100。

结果显示在表8中。

表8

因此，所述结果表明根据用截断值300kDa进行的最后过滤步骤的方法已获得的本发明的产品不包含游离KLH均聚物和小于30%的游离TNFα均聚物。

实施例6：本发明的产品的免疫原性

材料与方法

用在ISA-51中乳化的1μg(TNFα当量)B2、B3、B5、B80、B14、B140或B1(WO2007/022813的产品)免疫两组Balb/c。在0和21天进行免疫接种，两组之间延迟1周。在第28天，收集血清，并通过ELISA测试抗人TNFα抗体的存在。

结果

如图5所示，所有产品导致高水平的抗TNFα滴度。

结论，本发明的产品与产品B1具有相同的免疫原性特性。

实施例7：本发明的产品的毒性

用TNFα介导的休克测定法评价产品毒性。

材料与方法

该测定法在Lehmann等，JEM1987,165:657-663中描述。

简而言之，小鼠腹腔内注射100μl在37℃下以液体形式已贮存6周的含有20mg D-半乳糖胺和11μg TNFα(对照-在4℃下贮存)或11μg(TNFα当量)产品B1、B80、B14、B140的溶液。24小时后评估死亡率。

结果

如图6所示，产品B1(WO2007/022813的产品)与TNFα一样的致死性。

与此相反，本发明的产品是没有毒性的。

根据

EPAR提供的信息，最大耐受剂量(MTD)为150-200μg/m²。基于1.9m²的平均体表面积，TNF的MTD相应于285μg。

本发明的产品的给药剂量代表180μg蛋白质。对于不同生产批次的质量控制和稳定性结果，与内源性TNF相比，逆转后灭活水平总是10000倍以上(4log)。因此，以临床剂量(180μg)给药的TNF活性小于18ng，这比TNF的MTD小15000倍，提供了重要的安全边际(15833)。以临床剂量(360μg)给药的TNF活性小于36ng，这比TNF的MTD小7,500倍，提供了重要的安全边际。

实施例8：当在过程结束时进行过滤步骤时本发明的产品的免疫原性

在GTP0902条件下根据实施例1中描述的方法生产本发明的产品，只是所使用的TNFα用I*125标记。

在本发明的产品的生产方法结束时(步骤f)用不同截断值进行切向流过滤。

图7显示10kDa、100kDa、300kDa或500kDa的最终过滤后I*125标记的产品的SE-HPLC图谱。

根据实施例5中描述的方法对过滤后获得的不同级分进行TNF-KLHELISA。

图8A显示本发明的产品在过滤物100kDa中不存在，而在过滤物300kDa中开始是可检测的。

根据实施例6中描述的方法通过用过滤或不过滤的0.2μg或0.5μg的产品免疫小鼠来评价用300kDa截断值过滤或没有用300kDa截断值过滤的产品的免疫原性。

图8A显示过滤的产品(两批D1和D2)导致较高水平的抗TNFα滴度。

图8B相应于截留物对过滤物的免疫原性评估，表明300kDa过滤物没有免疫原性。

实施例9：包含本发明的产品的组合物的实例

两个示例性组合物在表9和10中描述。

表9

表10

实施例10：包含本发明的产品的疫苗的实例

根据本发明的疫苗的实例在表11中描述。

表11

实施例11：hTNFα转基因小鼠中关节炎的治疗

实施例11公开本发明的产品用于治疗非人哺乳动物中与TNFα过度产生相关的疾病的效力。

简而言之，第一组10个Hayward等(2007,BMC Physiology,Vol.7:13-29)描述的hTNFα转基因小鼠肌内注射由根据实施例10中描述的方法制备的由在ISA51中的人TNFαkinoid乳液组成的疫苗组合物乳液。分别在第0天(D0)、第7天(D7)和第28天(D28)肌内注射给予含有4μg人TNFαkinoid的疫苗组合物的量。第二组10个转基因小鼠肌内注射一定体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，该体积与注射给第一组转基因小鼠的疫苗组合物的体积相同。

测量两组小鼠的平均关节炎得分，结果显示在图9中。如Lee等(2009,JPharmacol Sci,Vol.109:211-221)所述测量平均关节炎得分。

所述结果表明，在用PBS给药的小鼠中关节炎快速形成，而在接受本发明的疫苗组合物的动物中关节炎被完全阻断。

实施例12：克罗恩氏病的治疗

实施例12公开本发明的产品在克罗恩氏病患者中I/II期、开放标签、剂量升级、“最佳两阶段”的免疫研究方案。

A.临床研究方案

1.适应症/研究人群

年龄在18至65岁之间的克罗恩氏病患者用三种剂量的根据实施例10的本发明的疫苗免疫。

2.原理

该研究设计用于评估与ISA-51佐剂结合的本发明的候选产品在克罗恩氏病患者中的安全性、反应原性和免疫原性。以在第0、7和28天给药的三种剂量(60、180和360μg)评价该三种剂量的这些候选kinoid的安全性和免疫反应。

3.研究设计

三组I/II期、“最佳两阶段”、多中心、国际、非随机研究：

-A组：3个接受与佐剂ISA51结合的本发明的疫苗(60μg本发明的产品)的受试者，

-B组：9个接受与佐剂ISA51结合的本发明的疫苗(180μg本发明的产品)的受试者，

-C组：9个接受与佐剂ISA51结合的本发明的疫苗(360μg本发明的产品)的受试者。

4.研究期间

所有阳性抗TNFα抗体反应(定义为相对于基线增加3倍)的受试者将跟踪安全性，直至抗体滴度正常化或至少直到第140天。无抗体反应的受试者将跟踪直到第140天。

B.临床研究结果

首先，临床研究结果已表明，用本发明的疫苗治疗的患者没有一个经历严重的不良反应，该结果充分证实TNFα生物活性是稳定和不可逆灭活的。

其次，要强调的是，最初所选的患者在临床研究过程中没有一个撤出。值得注意地，最初所选的患者没有一个患意料不到的感染(报道有1例鼻窦炎病例)。

此外，如在图10中所显示，抗TNFα抗体反应已在几乎所有的患者中测得：33%的患者在60μg，89%的患者在180μg和360μg两者。

如在图10中所示，本发明的疫苗在克罗恩氏病患者中是快速治疗有效的，因为在60μg的较低剂量时，大于65%的患者在免疫后第4周表现出CDAI得分减少大于70%(如Naber等,The Journal of Medicine,Vol.61(n4):105-110所述测量CDAI——克罗恩氏病活动指数——得分值)。

此外，图11中所示的结果表明，将本发明的疫苗给予克罗恩氏病患者在大多数患者中引起临床缓解状态。更确切地，图11显示，对于60μg的最低剂量，大于30%的患者在注射后第4周和第8周表现出小于150CDAI得分。此外，图11显示，在180μg剂量时，在注射后第8周，67%的患者表现出小于150的CDAI得分值。

图12还显示，大于85%的抗TNFα血清阳性患者经历治疗益处，CDAI得分值减少多于70个点。还需强调的是，在大于55%的抗TNFα血清阳性患者中观察到缓解(CDAI得分值等于或小于150)，而仅在约10%的抗TNFα血清阴性患者中看到缓解。

如下表12中所示，通过与众所周知的治疗性抗TNFα单克隆抗体英夫利昔单抗、阿达木单抗和塞妥珠单抗相比高百分比的经历克罗恩氏病缓解的患者，例证了本发明的疫苗的高治疗有效性。

表12

Targan1997,NEJM,340:1029-35

Rutgeerts2004,Gastroenterology（胃肠病学）126:402

Hanauer2006,Gastroenterology（胃肠病学）130(6):1929-30

Colombe2007,Am Journ Gastroenterol（美国胃肠病学杂志）.102(sup2):5496-7

Schreiber2007,NEJM357(13)1357

实施例13：本发明的产品如测试A所示是强灭活的且如测试B所示是保持 灭活的

通过实施例1描述的方法获得3批(808、901、903)，其中步骤a)在25mM终浓度的戊二醛下进行240分钟，步骤c)在250mM终浓度的甲醛下进行14天，以及在步骤f)中进行300kDa截断值的过滤。

所述产品以液体形式贮存在4℃下或在37℃下6周。

根据实施例3进行测试A。

以下的结果以总蛋白浓度表示，如BCA蛋白测定所确定。

BCA蛋白测定是用于总蛋白比色检测和定量的基于二辛可宁酸(BCA)的与洗涤剂相容的制剂。该方法将众所周知的通过在碱性介质(双缩脲反应)中的蛋白使Cu²⁺还原为Cu¹⁺与使用含有二辛可宁酸的独特试剂的高灵敏度和选择性比色检测亚铜阳离子(Cu¹⁺)相结合。通过两分子的BCA与一个亚铜离子螯合形成该测定法的紫色显色反应产品。该水溶性复合物在562nm处表现出强的吸光率，其在20-2000μg/ml的宽工作范围内与增加的蛋白质浓度成线性关系。

然后测定60μg总蛋白相应于25μg TNFα当量。

结果显示在图13A和表13中。

表13：细胞存活百分比(测试A)

*所示的用于hTNFα的百分比相应于三个测定中得到的值的平均值。

当产品在测试A条件下在4℃下贮存时，大于80%的L929细胞是有活性的，这表示产品显示小于20%的细胞溶解活性。

计算各产品的EC50值，大于100000。

计算各产品的灭活指数，测定为大于100000。

根据实施例4进行测试B。

以下的结果以总蛋白浓度表示，如BCA蛋白测定所确定。

结果显示在图13B和表14中。

结果表明，在37℃下6周后，产品保持灭活的，因在小于1000ng/ml的浓度时大于50%的L929细胞是有活性的，这表示所述产品显示小于50%的细胞溶解活性。

表14：细胞存活百分比(测试B)

**所示的用于hTNFα的百分比相应于三个测定中得到的值的平均值。

图14和表15和表16显示计算的各产品的EC50值和灭活指数。

当在37℃下贮存6周后，所述产品提供大于500的EC50以及大于10000的灭活指数。

表15

	808	901	903
				EC50(ng/ml)	2668	3705	4310

表16

使用批内测定TNF值计算EC50_TNF

实施例14：类风湿性关节炎的治疗

实施例14公开了本发明的产品在类风湿性关节炎患者中II期、双盲、安慰剂对照、剂量升级的免疫研究方案。

A.临床研究方案(EudraCT2009-012041-35)

1.适应症/研究人群

年龄在18至70岁之间的已发展为对至少一种抗TNFα单克隆抗体继发性抵抗的类风湿性关节炎患者用三种剂量的根据实施例10的本发明的疫苗免疫。

2.原理

该研究设计用于评估与ISA-51佐剂结合的本发明的候选产品在已发展为对至少一种抗TNFα单克隆抗体继发性抵抗的类风湿性关节炎患者中的安全性和和临床疗效。以在第0、7和28天或在第0和28天肌内给药的三种剂量(90、180和360μg)评价该三种剂量的这些候选kinoid的安全性和免疫反应。

3.研究设计

四组II期、随机、双盲、对照、多中心、国际研究：

-A组：6个接受与佐剂ISA51结合的本发明的疫苗(90μg本发明的产品)的受试者，

-B组：12个接受与佐剂ISA51结合的本发明的疫苗(180μg本发明的产品)的受试者，

-C组：12个接受与佐剂ISA51结合的本发明的疫苗(360μg本发明的产品)的受试者，

-D组：10个接受与佐剂ISA51结合的安慰剂(30mg甘露醇)的受试者。

4.研究期间

所有阳性抗TNFα抗体反应(定义为相对于基线增加2倍)的受试者将跟踪安全性，直至抗体滴度正常化或至少直到第140天。无抗体反应的受试者将跟踪直到第140天。

B.临床研究结果

没有相关的严重不良事件报告。免疫后很少有轻微的短暂的局部和全身反应记录。

以下显示临床研究的初步数据，对于360μg剂量没有数据获得：

1.抗TNFα抗体

在A组的50%患者(剂量90μg)和B组的80%患者(剂量180μg)中诱导抗TNFα抗体。

该结果表明，将本发明的产品给予类风湿性关节炎患者在所述患者中诱导抗TNFα抗体反应。

对于C组，还没有分析抗TNFα抗体。如所预期的，在D组中没有检测到抗TNFα抗体。

2.CRP水平

CRP(C反应蛋白)是类风湿性关节炎的炎症标记物。在84天时对CRP水平进行滴定。结果表示为从基线的绝对变化的均值(见表17)。

表17

如表17所示，在接受本发明的产品的患者组中CRP水平降低，而在安慰剂接受组中增加。

该结果表明，本发明的产品对类风湿性关节炎患者中的炎症有效果。

3.ACR20

ACR标准(ACR代表美国风湿病学会)是评价类风湿性关节炎治疗有效性的常规标准。ACR20标准允许量化显示疼痛或肿胀关节数以及以下五个参数中的三个有20%改善的患者的百分比：急性期反应物(例如沉降速率或CRP水平)、患者疾病活动评估、医师疾病活动评估、患者疼痛评估和致残（disability）/功能问卷。在第84天评估ACR20。

结果表示为ACR20反应的患者的数量及百分比(见表18)。

表18

如表18所示，具有ACR20反应的患者的百分比在接受本发明的产品的患者中比在安慰剂接受组中高。

该结果表明，本发明的产品对类风湿性关节炎是治疗有效的。

实施例15：用本发明的产品免疫的小鼠的血清中和能力

实施例15公开了体外细胞测试，其测定通过本发明的免疫原性产品的中和内源性TNFα活性的抗体产生的诱导。

用如实施例10中所述制备的由在ISA51中的人TNFαkinoid乳液组成的疫苗组合物肌内注射Hayward等(2007,BMC Physiology,Vol.7:13-29)描述的四种hTNFα转基因小鼠。分别在第0天(D0)、第7天(D7)和第28天(D28)，肌内注射给予含有4μg人TNFαkinoid的疫苗组合物的量。在免疫后第61天、第119天和第191天收集血清。

通过使用L929生物测定评价用本发明的免疫原性产品免疫的hTNFα小鼠的血清中和能力。

L929小鼠成纤维细胞(Sigma n85011425)以1.5×10⁴/cm²平板接种在培养基(DMEM(Cambrex BE12604F)，补充有10%胎牛血清(Sigma F7524)、2mM谷氨酰胺(Sigma G7513)、100U/ml青霉素/链霉素(Sigma P0781)和1mM丙酮酸钠(Sigma S8636))中，并在37℃、5%CO₂下培养2天，以获得亚汇合的单层。

然后收获L929细胞，并以2×10⁴个细胞/孔在100μl平板培养基(DMEMF12(Cambrex BE12719F)，补充有2%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠)中平板接种在96孔平底培养板中，并在加湿培养箱中在37℃、5%CO₂下培养21+/-1小时。

血清一式两份测试：每孔加入工作稀释度(1/100)上4倍稀释的60μL血清或30μL测定培养基(HL1(Cambrex US77201)，补充有2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠)。测试血清和对照以一系列6次两倍稀释度进行稀释。

将稀释在测定培养基中的30μL/孔的人TNFα细胞因子以工作浓度2.5ng/mL上4倍稀释加入血清稀释培养板中，并将培养板在37℃下孵育90分钟，在4℃下30分钟，以及在室温下15分钟。

将50μL样品转移到其中细胞必须是亚汇合的96孔平底培养板中。然后，加入50μL的补充有2μg/mL放线菌素D的测定培养基，并将培养板在加湿培养箱中在37℃、5%CO₂下培养20h±1h。

然后，每孔加入20μL的MTS/PMS(100mL MTS和5mL PMS，PromegaG5430)，并将培养板在加湿培养箱中在37℃、5%CO₂下培养另外4小时。

然后将板在DYNEX分光光度计MRXII上在490nm处读数。

如下计算相对细胞存活：

中和%=(OD_测试-OD_TNF标准品)/(OD_血清-OD_TNF标准品)

OD_测试代表使用血清和hTNFα的孔的光密度。

OD_TNF标准品代表仅使用2.5ng/ml TNFα的孔的光密度。

OD_血清代表仅使用血清的对照孔的光密度。

中和滴度表示为中和50%hTNFα活性的血清稀释度的倒数(即NC50)。

结果显示在图15中。

图15显示本发明的产品能够诱导中和hTNFα的抗体。在第119天时中和滴度是最大的，NC50超过3000。本发明的免疫原性产品的中和能力高于产品B1的(Le Buanec等,PNAS,2006,103(51):19442-7)。

实施例16：当本发明的免疫原性产品作为具有ISA51或SWE的乳液注射时产生的抗hTNFa抗体滴度和中和能力

实施例16公开了当ISA51或SWE用作免疫佐剂时本发明的免疫原性产品的免疫原性(图16)和中和能力(图17)的比较。

ISA-51vg是油基佐剂蒙太得

ISA-51。ISA-51vg是由在高度纯化的矿物油

6VR中的蒙太得80vg(植物来源的非离子型表面活性剂)组成的无菌澄清液体。ISA-51vg由Seppic(Air Liquide)生产。

SWE是角鲨烯基水包油型乳液(组成：在柠檬酸盐缓冲液中的角鲨烯3.9%、斯盘(span)0.47%、吐温800.47%)。SWE由洛桑大学(UNIL)的疫苗制剂实验室(the Vaccine Formulation Laboratory，VFL)提供。

通过在第0天(D0)和第21天(D21)注射本发明的疫苗组合物来免疫Balb/C小鼠两次，所述疫苗组合物含有乳化在ISA51中或在SWE中的2μg本发明的免疫原性产品(μg总蛋白)。

在第35天(D35)如实施例6中所述测量乳化在ISA51中或在SWE中的本发明的产品产生的抗hTNFa抗体滴度。结果显示在图16中。

图16显示本发明的免疫原性产品的抗hTNFα抗体滴度与当使用ISA51或SWE作为免疫佐剂时没有显著差异(使用Wilcoxon检验测得的p值：0.018)

在第35天(D35)如实施例15所述测量在ISA51或SWE中乳化的本发明的产品的中和活性。结果显示在图17中。图17显示本发明的免疫原性产品诱导中和TNFα的抗体的能力当使用ISA51或SWE作为免疫佐剂时没有显著差异(Wilcoxon检验测得的p值：0.089)。

实施例17：使用“变体方法”制备本发明的产品

如下制备Kinoids。先用1%DMSO将1mg hTNFα在工作缓冲液中孵育30分钟，并通过25mM(0.25%)戊二醛处理24小时(KT94)或72小时(KT100)以与0.58mg KLH缀合。通过甘氨酸淬灭(0.1M，15分钟)停止反应。中间产物用10KD膜在工作缓冲液中渗滤，然后通过250mM甲醛处理4天使之灭活。用甘氨酸(0.37M1h)淬灭后，将Kinoids以300KD在PBS中过滤。终产品通过0.2μm过滤灭菌，并在4℃下贮存。

对KT94和KT100产品进行如上所述的测试A和测试B(图18和表19和20)。

结果表明，浓度为100ng/ml的产品，在测试A中KT94和KT100杀死4%的细胞：因此，KT94和KT100是强灭活的。

结果表明，浓度为100ng/ml的KT94和KT100，在测试B中大于80%的细胞存活(小于20%的细胞溶解活性)：因此，KT94和KT100是保持强灭活的。

表19

表20

Claims (19)

1.免疫原性产品，其包含与KLH偶联的TNFα，其中所述TNFα是强灭活的，这表示所述产品在测试A条件下在浓度为100ng/ml时显示小于30%的细胞溶解活性和/或大于15000的灭活指数。

2.根据权利要求1的免疫原性产品，其中所述产品保持长期灭活，这表示所述产品在测试B条件下在浓度为100ng/ml时显示小于80%的细胞溶解活性和/或大于500的灭活指数。

3.根据权利要求1或权利要求2的免疫原性产品，其中所述产品可以包含大于300kDa的游离TNFα均聚物，且当所述产品包含大于300kDa的游离TNFα均聚物时，按照测试C中所计算，大于300kDa的游离TNFα均聚物的百分比小于总TNFα的30%w/w。

4.根据权利要求1至3之任一项的免疫原性产品，其中所述产品是冻干的。

5.免疫原性乳液，其包含根据权利要求1至4之任一项的产品，以及油和表面活性剂或其混合物；其中所述乳液为油包水型乳液或水包油型乳液，且其中所述油、表面活性剂和/或油和表面活性剂的混合物是药学上可接受的赋形剂。

6.根据权利要求5的免疫原性乳液，其包含油和表面活性剂的混合物，该混合物是佐剂，优选为ISA51。

7.一种疫苗组合物，其包含根据权利要求1至4之任一项的免疫原性产品或根据权利要求5或6之任一项的乳液。

8.用于制备包含与KLH偶联的TNFα的产品的方法，其中TNFα是强灭活的，这表示在测试A条件下在浓度为100ng/ml时所述产品显示小于30%的细胞溶解活性，所述方法包括以下步骤：

a)将(i)纯化的TNFα、(ii)纯化的匙孔血蓝蛋白和(iii)戊二醛混合在一起

b)去除分子量小于10kDa的化合物

特征在于在步骤b)之后进行以下步骤：

c)以从至少60mM至少240小时到至少120mM至少144小时范围的浓度/反应时间条件添加甲醛

d)通过添加淬灭化合物阻断与甲醛的反应，所述淬灭化合物选自(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组的氨基酸，

e)收集所述免疫原性产品。

9.根据权利要求8的方法，其中在步骤a)中以浓度为1至50mM大于110至小于400分钟，优选25mM240分钟施加戊二醛。

10.根据权利要求8或权利要求9的方法，其中在步骤c)中以至少200mM的浓度在至少240小时的期间，优选220至270mM的浓度至少300小时的期间施加甲醛。

11.根据权利要求8至10之任一项的方法，其中通过添加淬灭化合物停止与戊二醛的反应，优选所述淬灭化合物选自(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组的氨基酸。

12.根据权利要求8至11之任一项的方法，其中在步骤f)收集之前，去除分子量小于300kDa的物质。

13.用于制备包含与KLH偶联的TNFα的产品的方法，其中所述TNFα是强灭活的，这表示在测试A条件下在浓度为100ng/ml时所述产品显示小于30%的细胞溶解活性，所述方法包括以下步骤：

a)将(i)纯化的TNFα、(ii)纯化的匙孔血蓝蛋白和(iii)戊二醛混合在一起

b)去除分子量小于10kDa的化合物

c)以从至少60mM至少144小时到至少250mM至少96小时范围的浓度/反应时间条件添加甲醛

特征在于：

在步骤a)中以至少20mM的浓度在大于18小时的期间施加戊二醛，通过添加淬灭化合物停止与戊二醛的反应，优选所述淬灭化合物选自(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组的氨基酸，然后收集所述产品。

14.根据权利要求13的方法，其中在步骤b)之后以及在收集产品之前，以至少250mM至少4天范围的浓度/反应时间条件施加甲醛，然后通过添加淬灭化合物阻止与甲醛的反应，所述淬灭化合物选自(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物组成的组的氨基酸。

15.根据权利要求13或权利要求14的方法，其中在收集所述产品之前，进行使用截断值至少100kDa(优选300kDa)的滤膜进行切向流过滤的步骤。

16.根据权利要求7的疫苗组合物，其用于预防或治疗与TNFα的过度产生相关的疾病，包括给予需要其的包括人在内的动物的步骤。

17.根据权利要求16的疫苗组合物，其中所述与TNFα的过度产生相关的疾病选自强直性脊柱炎、银屑病，类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、炎症性肠病、克罗恩氏病、恶病质和癌症。

18.一种试剂盒，其包括至少一个含有根据权利要求1至4的免疫原性产品的小瓶、至少一个含有注射用水的小瓶和至少一个含有佐剂的小瓶，以及用于混合所述免疫原性产品和水以获得含水溶液和用于使所述溶液与佐剂接触和用于乳化所述含水溶液与佐剂的混合物的装置，所述试剂盒还包括至少一个针头。

19.一种医疗装置，其包含根据权利要求1至4的免疫原性产品，或根据权利要求5或6之任一项的乳液，或根据权利要求7的疫苗组合物。

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