ES2264569T3 - Moleculas de tnf-alfa modificadas, adn que codifica dichas moleculas de tnf-alfa modificadas y vacunas que comprenden dichas moleculas de tnf-alfa y adn. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una molécula TNF{al( humana modificada capaz de producir la formación de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la molécula TNF{al( humana del tipo salvaje, tras la administración de estas moléculas TNF{al(modificadas en un anfitrión humano. En la que al menos un fragmento peptídico de la molécula TNF{al( humana ha sido sustituida por al menos un péptido conocido que contiene la célula T inmunodominante que contiene un epítopo del linfocito B inmunodominante y uno o varios flancos de las regiones de la molécula humana TNF{al( que incluye al menos un epítopo de la célula TNF{al(B, en el que la sustitución introduce un cambio sustancial en la secuencia de aminoácidos del frente de la hoja {be( , y cualquiera de los lazos de conexión y/o en cualquiera de los cordones B'', I o D de la parte trasera de la hoja {be(. Las moléculas TNF{al( humanas modificadas o el ADN que las codifica se pueden formular como vacunas que modifican la TNF{al( opcionalmente con coadyuvantes farmacéuticamente aceptables, para la prevención o el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, tales como la artritis reumatoide y las enfermedades intestinales inflamatorias, cáncer, esclerosis diseminada, diabetes, psoriasis, osteoporosis o asma. Se pueden analizar los fluidos del cuerpo humano para detectar la presencia de TNF{al( mediante contacto con una composición que contenga TNF{al( modificada.

Description

Moléculas de TNF-\alpha modificadas, ADN que codifica dichas moléculas de TNF-\alpha modificadas y vacunas que comprenden dichas moléculas de TNF-\alpha y ADN.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con moléculas del Factor de Necrosis Tumoral a de la citosina (TNF\alpha) humana, las cuales han sido modificadas de manera tal que sean capaces de originar anticuerpos neutralizantes hacia el TNF\alpha humano del tipo silvestre luego de la administración de la molécula del TNF\alpha modificada al huésped humano. La invención también se relaciona con vacunas de TNF\alpha humanas basadas en dichas moléculas del TNF\alpha modificadas. Otros aspectos adicionales de la invención resultaran evidentes a partir de la discusión que aparece a continuación.

Antecedentes de la invención

Fisiológicamente, el sistema inmune que los vertebrados sirve como un mecanismo de defensa contra la invasión al cuerpo por parte de objetos infecciosos, tales como los microorganismos. Las proteínas extrañas se eliminan efectivamente a través del sistema reticulo-endotelial, a través de anticuerpos circulantes altamente específicos, y los virus y bacterias son atacados por una compleja batería de mecanismos celulares y humorales que incluyen anticuerpos, linfocitos T citotóxicos (CTL), células asesinas naturales (NK), complemento, etc. El líder de esta batalla es el linfocito "helper" (colaborador) T (TH), el cual, en colaboración con las Células Presentadoras de Antígenos (APC), regulan la defensa inmunitaria a través de una red compleja de citoquinas.

Los linfocitos T_{H} reconocen los antígenos de las proteínas presentes en la superficie de las APC. Sin embargo, no reconocen el antígeno nativo en sí. En cambio, parecen reconocer un ligando complejo que consiste de dos componentes: un antígeno de proteínas procesado (fragmentado) (el denominado epitope de células T) y una molécula de la clase II del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) (O.Werdelin et al., Imm. Rev. 106, 181 (1988). Este reconocimiento permite eventualmente que el linfocito TH ayude específicamente a los linfocitos B para producir anticuerpos específicos hacia el antígeno de proteína intacto (Werdelin et al., supra). Una célula T dada sólo reconoce una cierta combinación de antígeno -MHC y no reconocerá al mismo ni a otro antígeno presentado por un producto de genes de otro “allele” del MHC. Este fenómeno se conoce como restricción del MHC.

Los fragmentos de las auto-proteínas también se presentan a través de las APC, pero normalmente tales fragmentos son ignorados o no reconocidos por los linfocitos T colaboradores. Esta es la razón principal por la cual los individuos por lo general no alojan auto-anticuerpos en su suero, lo cual eventualmente lleva a un ataque sobre las propias proteínas del individuo (las denominadas auto proteínas). No obstante, en casos aislados, el proceso da un mal resultado y el sistema inmune se vuelve hacia los propios componentes del individuo, lo cual puede llevar a una enfermedad autoinmune.

La presencia de algunas auto-proteínas es inoportuna en situaciones en las cuales, a niveles elevados, inducen síntomas de enfermedad. De este modo, se sabe que el factor de necrosis tumoral a (TNF\alpha) puede causar caquexia en los pacientes con cáncer y en los pacientes que padecen de otras enfermedades crónicas (H. N. Langstein et al., Cancer Res. 51.2302-2306, 1991) El TNF\alpha también desempeña funciones importantes en el proceso inflamatorio (W. P. Arend et al., Arthritis Rheum. 33,305-315, 1990) y, de este modo, se ha demostrado que la neutralización del TNF\alpha mediante el uso de anticuerpos monoclonales es beneficiosa en los pacientes que padecen de enfermedades inflamatorias crónicas, tales corno artritis reumatoide, Elliot et al., Lancet 1994, 344:1105-10 y en los que adolecen de la enfermedad de Crohn, van Dullemen et al., Gastroenterology 109 (1): 129-135 (1995). Por consiguiente, existe la necesidad de hallar un método para la inducción de anticuerpos neutralizantes contra dichas proteínas del TNF\alpha y la presente invención comprende una vacuna contra el TNF\alpha, la cual proporciona esta propiedad.

Factor de necrosis tumoral 1. Antecedentes Generales

El factor de necrosis tumoral (TNF) es un miembro de la familia de las citosinas de proteínas reguladoras (ver Walsh, G y Headon, D.E., protein Biotechnology, 1994, John Wiley & sons Ltd. England, p. 257-267), que también incluyen a los interferones y las interleucinas. Actualmente se reconocen dos formas de TNF, TNF\alpha u TNF\beta, respectivamente. Aunque ambas proteínas se ligan a los mismos receptores y provocan en un sentido amplias respuestas biológicas similares, son moléculas distintas y comparten menos del 30% de homología. La proteína original denominada factor de necrosis tumoral, a la que se denomina TNF, se designa en forma más apropiada como TNF\alpha también se la conoce como caquectina. El TNF\beta, también se denomina linfotoxina.

El TNF\alpha se produce por una amplia variedad de tipos celulares, principalmente, monocitos, ciertos linfocitos T, células NK y macrófagos activados, además de las células cerebrales y hepáticas. El inductor más potente que se conoce de la síntesis del TNF\alpha es una biomolécula compleja denominada lipolisacárido (LPS). La misma contiene ambos componentes lípidos y polisacáridos y también se la denomina endotoxina. El lipopolisacárido por si mismo está desprovisto de toda actividad anti-tumoral. Se descubrió que el suero de los animales inyectados con liposacárido contiene un factor tóxico para las células cancerosas y este factor-producido pro células específicas como respuesta al lipolisacárido se denominó factor de necrosis tumoral. Otros agentes diversos, tales como algunos virus, hongos y parásitos, también estimulan la síntesis y la liberación de esta citosina. Además el TNF\alpha puede actuar en un modo autócrino, estimulando su propia producción.

El TNF\alpha humano nativo es un homotrímero, que consiste de tres subunidades de polipéptidos idénticas, estrechamente asociadas alrededor de un eje de tres partes, con una simetría que será explicada más adelante. Esta disposición se asemeja al ensamble de las subunidades de las proteínas en muchas proteínas de cápsidas virales. Las subunidades de polipéptidos individuales del TNF\alpha humano son no glicosiladas y consisten de 157 aminoácidos. La molécula tiene un peso molecular de 17300 Da y contiene un solo enlace de disulfuro entre cadenas. El TNF\alpha humano se sintetiza inicialmente como una molécula precursora de 233 aminoácidos. La escisión proteolitica de la pre-secuencia -76 a -1, incluyendo una secuencia de señales, libera al TNF\alpha nativo. El TNF\alpha también puede existir en una forma ligada por membrana de 26000 Da. Tres subunidades monoméricas de TNF\alpha se asocian no covalentemente para formar un trímero, según se explicará más detalladamente a continuación.

El TNF\alpha induce sus efectos biológicos ligando receptores específicos presentes sobre la superficie de las células susceptibles. Se han identificado dos receptores de TNF\alpha diferentes. Un receptor (TNF-R55) tiene un peso moléculas de 55000 Da, mientras que el segundo receptor (TNF-R75) tiene un peso molecular de aproximadamente 75000 Da. Estos dos tipos de receptores diferentes no muestran más que una homología de secuencia del 25%. El TNF-R55 está presente en un amplio rango de células, mientras que la distribución del receptor TNF-R75 es más limitada. Ambos son glicoproteínas transmembranales con un dominio de unión extracelular, un dominio trasmembranal hidrofóbico y un dominio efector intracelular.

Aun quedan por determinar los mecanismos moleculares exactos por los cuales el TNF\alpha induce sus efectos biológicos. El enlace del TNF\alpha a su receptor parece suscitar una variedad de efectos mediados por las proteínas G, además de la activación de adenilato-ciclasa, fosfolipasa A2 y quinasas proteicas. Las acciones biológicas exactas inducidas por el TNF\alpha pueden variar de tipo de célula a tipo de célula. Otros factores, tales como la presencia de citoquinas adicionales, modulan aun más los efectos moleculares observados atribuidos a la acción del TNF\alpha sobre las células sensibles.

El gen del TNF\alpha ha sido clonado y se ha insertado en una variedad de sistemas de expresión recombinantes tanto bacterianos como eucarióticos. La disponibilidad resultante de grandes cantidades de TNF\alpha biológicamente activo y purificado ha facilitado la evaluación clínica de una cantidad de enfermedades principalmente del cáncer. No obstante muchas de tales pruebas que usan TNF\alpha ya sea solo o en combinación con interferones proporcionan resultados muy desalentadores. No pueden administrarse grandes cantidades de TNF\alpha a los pacientes debido a sus efectos colaterales tóxicos si no letales.

Tal como se ha mencionado con anterioridad la producción prolongada de niveles indebidamente elevados de TNF\alpha también se ha implicado con el desarrollo de la caquexia el síndrome de emaciación con frecuencia asociado con infecciones parasitarias crónicas o de otra naturaleza y con el cáncer. El TNF\alpha también esta implicado en la metástasis y el desarrollo de ciertos tumores así como también en la inducción de la anemia. Adicionalmente el TNF\alpha también esta directamente implicado con el desarrollo de ciertos desórdenes inflamatorios crónicos en humanos incluyendo la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn donde la administración de anticuerpos anti TNF\alpha monoclonales ha demostrado ser beneficiosa. El TNF\alpha también esta implicado en la osteoporosis y la Psoriasis. Además, se ha demostrado en modelos animales que la administración de anticuerpos anti TNF\alpha puede reducir o evitar el rechazo de tejidos transplantados o injertados.

2. Estructura del TNF\alpha I. Introducción

La estructura tridimensional del factor de necrosis tumoral (TNF\alpha) humano ha sido solucionada (véase a "Tumor Necrosis Factors, Structure, Function and Mechanism o Action", editado por Bharat B. Aggarwal y Jan Vilcek 1992 Marcel Dekker, Ind., Nueva York, Capítulo 5 "Crystal structure of TNF\alpha" de Jones, E. Y. Stuart, D.I. y Walker N.P.C.). La acción biológica del TNF\alpha depende de su interacción con sus receptores. Estas interacciones se rigen mediante la disposición precisa de la estructura terciaria correctamente plegada. De este modo, para los efectos de comprender cómo realiza la molécula de TNF\alpha si función biológica a nivel de las interacciones de aminoácidos, uno debe conocer no sólo la secuencia de aminoácidos sino también la estructura tridimensional.

II. Estructura Tridimensional

Mediante ultracentrifugación analítica, difusión por rayos x de ángulo pequeño y electroforesis con gel, se ha demostrado que el TNF\alpha biológicamente activo se encuentra en una conformación de trímero en solución y los estudios de reticulación han indicado que esta es la forma activa de la proteína (Smith y Baglioni, 1987, J. Biol. Chemistry 252, 6951-6954). Los ensayos de enlace han demostrado que el trímero es por lo menos 8 veces más activo que el monómero. La evidencia experimental indica que el TNF\alpha tanto el recombinante como el natural se encuentran predominantemente como un trímero, bajo condiciones fisiológicas. El análisis de los espectros con dicroismo circular ubica al TNF\alpha en la clase de proteínas que incluyen todas las láminas (Davis et al., Biochemistry 1987, 26, 1322-1326, quienes reportan resultados de los análisis estructurales del TNF\alpha recombinante purificado, mediante la titulación de sulfhidrilo, filtración con gel y dicroismo circular). Varias formas de cristales diferentes han sido dadas a conocer para el TNF\alpha recombinante humano. Todas las formas de cristales reportadas exhiben una simetría de tres partes cristalográficas y/o no cristalográficas, lo cual indica la presencia de TNF\alpha como un trímero dentro del cristal. Los trímeros de TNF\alpha se encuentran en conjuntos compactados en forma holgada, perforadas por canales de solventes con un diámetro de 100 \ring{A}. Sólo una pequeña proporción de la superficie molecular está implicada en los contactos de compactación de los cristales. Dichos contactos podrían perturbar ligeramente a unas pocas cadenas laterales y, tal vez, incluso a unas porciones cortas de la cadena principal inherentemente flexible, desde sus conformaciones en solución preferidas.

A. Doblez de la Cadena Principal del Monómero de TNF\alpha

La forma general de una subunidad de 157 aminoácidos individual del trímero de TNF\alpha es del tipo de una cuna, con una altura de aproximadamente 55\ring{A} y un ancho máximo de 35\ring{A}, cerca de la base. La topología de la cadena principal se ilustra en la Figura 1a-c; ésta es esencialmente, una estructura en sándwich \beta, formada por dos láminas plegadas \beta antiparalelas. El doblez de cadena principal está de acuerdo con la del motivo clásico de rollo de jalea (Figura 1c) (comun en la proteína de cápsida viral. La nomenclatura adoptada en la Figura 1 para los rótulos de unidades estructurales secundarias sigue la convención establecida para las estructuras virales. Todos las cadenas \beta estándar (B a I) -los ocho- están presentes, pero con una inserción entre B y C, que incorpora un filamento corto sobre el borde de ambas láminas \beta y trunca la mitad con terminal N de C, de modo tal que cada lámina plegada \beta contiene cinclo cadenas \beta antiparalelas, comprendiendo la lámina \beta posterior las cadenas \beta B', B, 1, D y G y comprendiendo la lámina frontal a cadenas \beta C', C, H, E y F.

La terminación N es altamente flexible. Esta región, hasta el residuo 10 (Ver Figura 1b), es más bien independiente del resto de la molécula, con los primeros pocos residuos libres para muestrear una variedad de conformaciones en el solvente. En contrates, la terminación C está insertada en la base de la lámina \beta posterior y forma una parte integral de esta unidad estructural secundaria relativamente plana. La gradación en las longitudes de las cadenas \beta y la inserción entre las cadenas \beta -B y C conspiran para producir una superficie frontal formada casi completamente por bucles y es este el lado enmascarado de la estructura en emparedado /3 la que en el trímero se presenta al solvente. Los datos cristalográficos proporcionan una medida de la flexibilidad relativa de las diversas partes de la estructura. Las cadenas /3 forman un andamio bastante inflexible; en particular, la lámina /3 posterior está situada en el núcleo del trímero y, en consecuencia, es particularmente rígida. Tal como sería de esperar, son los bucles los que adornan la superficie exterior de la molécula la cual tiene acceso el solvente, que exhibe altos niveles de flexibilidad/movilidad. Por sobre todas las cosas hay una reducción generalizada en la rigidez, a medida que el núcleo se compacta con mayor holgura en la mitad superior de la molécula.

B. Topología General del Trímero de TNF\alpha

Tres subunidades monoméricas del TNF \alpha se asocian de un modo no covalente para formar un trímero compacto y cónico, cuya longitud es de aproximadamente 55 A y cuyo ancho máximo es de 50 a. Las cadenas \beta de las tres estructuras en sándwich \beta individuales se ubican aproximadamente paralelos (la inclinación es aproximadamente de 30º) con respecto al eje de tres partes del trímero. La interacción entre las subunidades relacionadas por el eje de tres partes se realiza a través de una compactación simple de borde a cara de la estructura en sándwich \beta; el borde de la estructura en el sándwich \beta, que consiste de las cadenas F y G de una subunidad, se extiende a través de la lámina \beta posterior [GDIBB'] de una subunidad de tres partes relacionadas (ver la Figura 2). Las terminaciones carboxi se encuentran cerca del eje de tres partes. El modo borde a cara de la compactación produce una asociación extremada-
mente apretada entre las subunidades. De esta manera, el núcleo del trímero es completamente inaccesible al solvente.

C. Distribución Tipo Aminoácidos

La distribución total de los tipos de residuos en la estructura tridimensional del TNF\alpha constituye una repetición de la regla general para las proteínas, a saber, que los residuos hidrofóbicos se acumulan en el núcleo de la molécula, mientras los residuos cargados decoran la superficie. De este modo, el núcleo de la estructura en emparedado de TNF\alpha tiene el relleno esperado de residuos apolares grandes, de intercalación compacta.

La energética del sistema no favorece la existencia del TNF\alpha en un estado monomérico. Para un área grande de interfase compuesta por residuos complementarios (por ejemplo, residuos polares compatibilizados contra residuos polares), la pérdida del área de superficie accesible al solvente confiere una considerable ventaja energética para la formación del oligómero (es decir, el trímero). La exposición al solvente del gran fragmento de residuos fuertemente hidrofóbicos normalmente inmersos en la porción inferior de la interfase trimérica, también actuaría para desestabilizar al monómero de TNF\alpha.

3. Sondas de función de estructura A. Interacciones TNF\alpha/Anticuerpo

Se ha observado que los anticuerpos originados contra el TNF\alpha proveniente de una especie (por ejemplo, humana) no producen una reacción cruzada con el TNF\alpha proveniente de otra especie (por ejemplo, de ratón), a pesar de una identidad de secuencia mayor que el 80% y la capacidad del TNF\alpha de ligarse con los receptores de TNF\alpha de otras especies. Si el grado de variación de secuencia se mapea sobre la estructura tridimensional, resulta inmediatamente evidente que las regiones de la moléculas con las secuencias más variables, corresponden a los bucles con superficies accesibles a los anticuerpos. Las regiones de residuos altamente conservados dentro de la estructura en emparedado o en la interfase trimérica son efectivamente invisibles a los anticuerpos. De este modo, el epitope para un anticuerpo contra el TNF\alpha siempre contendrá algunos residuos que varían entre las especies, anulando así los enlaces de los anticuerpos. Esto implica que las características de la interacción entre el TNF\alpha y su receptor deben diferir de alguna manera de aquéllas requeridas para la unión de un anticuerpo a un TNF\alpha.

B. Mutagénesis Dirigida en el Sitio

La función de diversas regiones y residuos específicos de la molécula del TNF\alpha con respecto a su actividad biológica (citotóxica) y al enlace de receptores ha sido investigada mediante el reemplazo de aquellos residuos por diferentes aminoácidos o por la eliminación de parte de la secuencia, usando las técnicas de mutagénesis dirigida en el sitio (Jones et al., en la obra citada, p. 113-119).

La eliminación de hasta ocho residuos de la terminación N sin ningún efecto dañino sobre la actividad biológica sirve para enfatizar la naturaleza no esencial de esta región para la estabilidad molecular general. Los residuos con terminaciones N parecen ejercer un efecto indirecto, de segundo orden sobre la eficacia biológica del trímero de TNF\alpha.

Las sustituciones no conservadoras de los residuos que normalmente tienen una alta conservación, que forman el núcleo estrechamente compactado de la estructura en sándwich \beta, distorsionan la estructura y por lo tanto, anulan la actividad biológica del TNF\alpha (Yamagishi et al., Protein Engineering, vol. 3 Numero 8, paginas 713-719 (1989)). Muchas de tales proteínas mutadas (muteinas) no logran formar una molécula estable, correctamente plegada. Se permiten algunas sustituciones conservadoras dentro del fragmento hidrofóbico en la parte inferior del eje de tres partes i no obstante, parece haber mucho más margen en la región compactada con mayor holgura, cerca de la parte superior del trímero. En particular, Cis 69 y Cis 101, que forman el puente de disulfuro entre dos bucles conectores en la parte superior de la molécula que está holgadamente compactada, son relativamente insensibles a los cambios (ver la figura la). No obstante, por lo general, con el fin de retener parte de la actividad biológica del TNF\alpha, las mutaciones cercanas al eje central del TNF\alpha deben ser altamente conservadoras, manteniendo la forma general del TNF\alpha.

Los residuos sobre la superficie de la molécula tienen una libertad considerablemente mayor para mutar sin incurrir en las desastrosas penalidades estructurales que han sido presenciadas por la proliferación de variaciones de residuos en esta categoría entre las especies. De esta forma estas reducciones drásticas en la actividad biológica del TNF\alpha debidas a las sustituciones en esta área, indican la participación directa de tales residuos en la interacción funcional del trímero del TNF\alpha con su receptor. Los residuos que comprenden: Arg 31, Arg 32 y Ala 33, situados en el bucle conector entre la cadena B y B' de la lámina \beta posterior; Ser 86 y Tir 87, situados en el bucle conector entre las cadenas E y F de la lámina \beta frontal; y Glu 146, situada en el bucle conector entre la cadena H de la lámina P frontal y la cadena 1 en la lámina P posterior, parecen ser tales residuos de aminoácidos (ver la Figura 3). Los mismos parecen quedar comprendidos en dos regiones diferentes de "puntos calientes" para la sensibilidad de la función biológica a la mutación ha sido revisada por Yamagishi et al., en la obra citada, y Goh et al., protein Engineering, Vol. 4 No. 4 páginas 385-389 (1991).

Los estudios sobre la mutación de polipéptidos de TNF\alpha humano se han dado a conocer en una serie de solicitudes de patente.

De este modo, Yamagishi et al., (EP 251.037) describe numerosas moléculas de TNF\alpha mutadas en sitios específicos que son solubles y tienen una actividad citotóxica y antitumoral característica para el TNF\alpha humano in vitro y/o in vivo.

Otras muteínas con actividad de TNF\alpha se describen en la WO 90/07579, Las muteínas que tienen una mayor ligante para el receptor p75-TNF humano que para el receptor p55-TNF se describen en la EP-A-619372.

Ninguna de estas referencias, describen una modificación de la molécula del TNF\alpha con el fin de anular la actividad biológica del TNF\alpha y proporcionar la capacidad de inducir anticuerpos contra el TNF\alpha humano del tipo silvestre.

No obstante, proporcionan una información de fondo útil con respecto al TNF\alpha y a su efecto biológico. Además, se describen la producción y expresión de los análogos del TNF\alpha y su formulación, al igual que los ensayos de enlaces de receptores.

4. Sumario

Actualmente, puede aplicarse una rica variedad de datos con respecto a la relación específica de estructura a funcionamiento para el TNF\alpha. Toda la evidencia disponible apunta a la importancia del trímero como la unidad natural estable. Es evidente que las dos regiones de punto calientes situadas sobre lados separados del monómero de TNF\alpha se acercan una con relación a la otra, en términos de subunidades colindantes en el trímero. De este modo, una región de importancia funcional que consiste en los residuos 31 a 35, 84 a 87 y 143 a 148 parece estar situada en la interfase entre dos subunidades sobre la mitad inferior del trimer. Yamagishi et al., en la obra citada, dan a conocer la pérdida de la capacidad de enlace de los receptores así como también, la citotoxicidad para la mutación de Asp 143 a Tir, y Tsujimoto et al., J. Biochem. 101, paginas 919-925 (1987) reportan un efecto similar para Arg 31 y Arg 32 a Asn y Tre. De este modo, el sitio puede estar asociado directamente con el enlace de receptores, así como también, con la citotoxicidad. Resulta de interés que la región de enlace de receptores del TNF\alpha, parece encontrarse en la interfase entre dos subunidades.

En resumen, la estructura tridimensional detallada para el TNF\alpha sirve para explicar un amplio rango de observaciones sobre el enlace de anticuerpos, la oligomerización y la mutagénesis dirigida en el sitio. Cuando la estructura se considera en combinación con mutantes recientes, extensivos, dirigidos en el sitio, una región de importancia biológica con respecto al enlace de receptores esta aparentemente en las subunidades sobre la mitad inferior del trímero.

Descripción de la técnica anterior

En el documento WO 95/05849, algunos de los presentes inventores describen un método para la modificación de autoproteínas, con el propósito de inducir una respuesta de los anticuerpos contra la auto-proteína no modificada, donde se proporciona un análogo de auto-proteína por un medio biológico molecular. Más específicamente, uno o más fragmentos de péptidos de la auto-proteína se sustituyen con uno o más fragmentos de péptidos que contienen epitopes de células T extraños inmuno-dominantes.

Antes de la invención que condujo al documento WO 95/05849, era común conjugar péptidos o proteínas incluyendo las autoproteínas con proteínas portadoras que comprenden un epitope de células T. El documento WO 92/19746 describe un polipéptido recombinante que comprende la secuencia LHRH, uno o más epitopes de células T y un sitio de purificación, el cual es útil en las vacunas de inmuno-castración de animales.

Se menciona como preferible en la WO 95/05849 que el epitope de células T inmuno-dominante se inserte de modo tal que las regiones flanqueadoras de la proteína original que comprenden por lo menos 4 aminoácidos se conserven sobre cualquiera de los lados del epitope insertado. En otras palabras el epitope no debe conjugarse con la auto-proteína como una proteína de fusión. Preferentemente la sustitución debe realizarse de modo tal que se conserve esencialmente la estructura terciaria de la proteína original. Además de eso no se proporciona una guía específica respecto de la posición intramolecular óptima del epitope insertado con el fin de crear la respuesta más poderosa de los anticuerpos contra la auto-proteína sin modificar. Presumiblemente esto variará de auto-proteína en auto-proteína pero en base a los lineamientos generales que se encuentran en la especificación, la o las posiciones más apropiadas pueden determinarse sin la experimentación indebida, mediante la selección de péptidos que comprenden epitopes inmunodominantes apropiados, intercambiando secuencias de péptidos que tengan esencialmente la misma longitud en varias partes de la molécula de la autoproteína y determinando la respuesta de anticuerpos originados por las técnicas de los ensayos adecuados.

Probablemente es muy difícil mediante el uso de las herramientas modelo actuales predecir si la sustitución de uno o más fragmentos de péptidos en una proteína resulta en un cambio en la estructura terciaria de la proteína original. Por lo tanto, en una investigación del programa de desarrollo de fármacos para compuestos líderes, debe considerarse como un procedimiento de selección estándar a principios de la fase del desarrollo, evaluar que auto-proteínas modificadas han conservado la estructura terciaria de la proteína original. Esto puede realizarse usando varias técnicas experimentales, como se ha descrito en numerosos libros de textos sobre la caracterización de las proteínas, por ejemplo, espectroscopia por fluorescencia, dicroísmo circular de proximidad UV, espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier y técnicas de RMN multidimensional (Physical Methods to Characterize Pharmaceutical Proteins, Pharmaceutical Biotechnology Vol. 7. Eds. J. N. Herron, W. Jiskoot & D. J. A. Crommelin, Plenum Press, Nueva York (1995)). Idealmente I en un procedimiento de selección para compuestos lideres, deben combinarse dos o más de las técnicas experimentales mencionadas anteriormente con el propósito de evaluar si ha habido o no un cambio en la estructura terciara.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1(a) ilustra la estructura de cristales del monómero de TNF\alpha nativo. La figura es un esquema diagramático del doblez de la subunidad las cadenas \beta se muestran como flechas gruesas en la dirección amino a carboxi y los bucles conectores se ilustran como líneas finas. El puente de disulfuro se denota con un rayo y una región de alta flexibilidad está sombreada con líneas cruzadas. El eje de tres partes del trímero sería vertical para esta orientación.

La Figura 1(b) es un elemento traza de cadena C\alpha de la estructura de cristal del monómero del TNF\alpha. Esta representación detallada debe usarse conjuntamente con la Figura 1(a) para proporcionar la alineación precisa de la secuencia de aminoácidos con la representación más clara pero estilizada del doblez de la subunidad.

La Figura 1(c) muestra la estructura del TNF\alpha como un motivo de rollo de jalea. La inserción entre las cadenas \beta B y C se muestra en líneas punteadas la conexión entre B y C cruzaría en linea recta, a través de la parte superior de la molécula.

La Figura 2 muestra la compactación borde con cara de las estructuras en sándwich \beta P en el trímero de TNF. La vista, hacia abajo por el eje de tres partes, muestra una plancha angosta del trímero, donde las cadenas \beta están representadas por cintas que entran y salen de la página.

La Figura 3(a) ilustra la secuencia de ADN que codifica el factor de necrosis tumoral (TNF\alpha), que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la Figura 3(b). La secuencia de ADN se comercializa a través de Gen Bank, bajo el número de acceso MI0988, SEQ ID NO: 339737.

La secuencia ha sido descrita por Wang et al., Science 228, 149-154 (1985). La secuencia incluye codones que codifican la presecuencia 76-1 del TNF\alpha humano.

La secuencia completa de genes que incluyen intrones ha sido descrita por Nedwin et al., Nucleic Acids, Res 12(17) 6361-6373 (1985), Shirai et al., Nature 313 (6005), 803-806 (1985) y Dennica et al., 312 (5996), 724-729 (1984).

La Figura 3(b) muestra la secuencia de aminoácidos del TNF\alpha humano, que incluye la pre-secuencia -76-1.

La Figura 4(a) ilustra en forma esquemática las sustituciones de los epitopes inmuno-dominantes P2 y P30, en un tipo de TNF\alpha silvestre (WT) para formar los análogos de TNF\alpha, TNF2-1 a 2-7 y TNF 30-1 a 30-5.

La figura 4(b) muestra las ubicaciones exactas de las sustituciones en la secuencia de WT para los análogos de TNF\alpha individuales.

Las Figuras 5(a) y 5(b) muestran la estructura de los análogos en base a la Figura 1(a), donde las sustituciones individuales por P2 y P30 en los filamentos en las cadenas de las láminas \beta y los bucles conectores, respectivamente, están marcadas en negro.

La Figura 6 muestra la actividad biológica de los análogos del TNF\alpha en el ensayo L929 (Meager, A., Leung, H., & Woolley, J. Assays for Tumor Necrosis Factor and related cytokines, J. Immunol. Meth. 116, 1-17 (1989)), en comparación con el TNF\alpha recombinante.

La Figura 7 muestra la respuesta de los anticuerpos del TNF\alpha anti-humano en conejos, para la vacunación con las moléculas de TNF\alpha modificadas en conejos.

La Figura 8 muestra la capacidad de las moléculas de TNF\alpha humano modificadas P2/P30 para inducir anticuerpos neutralizantes, como se mide en el ensayo de células L929.

La figura 9 muestra la capacidad -cuando se administra a conejos de las moléculas de TNF\alpha humano modificadas P2/P30 para inducir anticuerpos neutralizantes, como se mide en el ensayo de receptores.

La Figura 10 muestra la respuesta de las Células Mononucleares Sanguíneas Periféricas (PBMC) en tres donantes, hacia TT y los péptidos P2 y P30.

La Figura 11 muestra la respuesta de proliferaoión policlonal en dos donantes, usando diferentes moléculas de TNF\alpha modificadas P2 y P30.

La figura 12 muestra los índices de Proliferación (Pls) calculados a partir de 34 experimentos para las moléculas de TNF\alpha modificadas P2 y P30.

La Figura 13 muestra la respuesta de la PBMC contra las proteínas de TNF\alpha modificadas P2 y P30 en los compuestos de respuesta específicos P2 y P30 respectivamente.

La Figura 14 muestra una respuesta PBMC similar en otros dos donantes.

La Figura 15 muestra la influencia de los aminoácidos flanqueadores sobre el reconocimiento de células T de P2 y P30.

La Figura 16 muestra la estrategia de mutación usada para la preparación de las moléculas TNF\alpha modificadas.

Sumario de la invención

El propósito de la presente invención es proporcionar los lineamientos con respecto a cómo una autoproteína en particular, comprendida en los alcances generales del documento WO 95/05849 antes mencionada a saber, el TNF\alpha humano debe modificarse para que sea biológicamente inactivo, así como también, para poder inducir una fuerte respuesta de anticuerpos neutralizantes hacia el TNF\alpha, biológicamente activo, del tipo silvestre. En el presente contexto, respuesta "biológicamente inactiva" se refiere a las actividades del TNF\alpha del tipo silvestre, principalmente su actividad citotóxica.

A partir de la discusión de la estructura terciaria del TNF\alpha proporcionada con anterioridad, se recuerda que el TNF\alpha biológicamente activo es un trímero de tres subunidades. Debido a la compactación de "borde con cara", la "lámina \beta posterior" representa el área "oculta" de contacto entre las subunidades, que es completamente inaccesible para el solvente. Las sustituciones significativas en esta área casi inevitablemente privarán a la molécula del TNF\alpha de toda actividad biológica. Por el contrario, la "lámina P frontal" y las regiones de conexión proveen el área de superficie accesible, que incluye las áreas que interactúan con los receptores del TNF\alpha. Los anticuerpos hacia estas áreas, por lo tanto,
podrían interferir probablemente con el enlace de receptores y entonces, poseerían propiedades neutralizantes de TNF\alpha.

Un experto en el arte que quiera construir una molécula de TNF\alpha destoxificada pero a la vez, inmunogénica de acuerdo con el documento WO 95/05849, insertará por lo tanto, como primera opción, el epitope de células T inmunodominate en la lámina P posterior del monómero TNF\alpha. Lo más probable sería que las modificaciones de esta área interrumpan la actividad biológica del TNF\alpha y dejen libre la lámina \beta frontal accesible al receptor libre para la interacción con los anticuerpos. Esto también es consistente con la discusión de la mutagénesis dirigida en el sitio en el núcleo de estrecha compactación de la estructura en sándwich \beta que se ha discutido con anterioridad.

No obstante, asombrosamente, esto no es así. Según resultará evidente a partir de los resultados de las pruebas que se exponen más adelante, el resultado fue más bien el opuesto, dado que las sustituciones que comprenden las cadenas B y G de la lámina \beta posterior asombrosamente proporciona análogos del TNF\alpha que son incapaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra el TNF\alpha.

De este modo, la presente invención pretende proporcionar una molécula de TNF\alpha humano modificada, capaz de originar anticuerpos neutralizantes hacia el TNF\alpha humano del tipo silvestre, luego de la administración de la molécula de TNF\alpha modificada a un huésped humano, donde por lo menos un fragmento la molécula del TNF\alpha humano ha sido sustituida por al menos un péptido, que como se sabe, contiene un epitope de células T inmuno-dominate o una forma truncada de dicha molécula que contiene un epitope inmunodominante de células T, y una o ambas regiones flanqueadoras de la molécula de TNF\alpha humano que comprende por lo menos un epitope de células B de TNF\alpha, donde las sustitución se introduce en cualquiera de los bucles conectores y/o en cualquiera de las cadenas B', 1 ó D de la lámina \beta posterior, donde la sustitución se ha hecho en regiones de la molécula de TNF\alpha de manera que preserve la estructura de la lámina \beta de las cadenas B y G, y donde la sustitución conduce a la inactivación de la actividad biológica de TNF\alpha humano cuando se ensaya en el bioensayo L929.

De este modo, la sustitución supera una simple sustitución conservadora de los aminoácidos individuales y supera las mutaciones puntuales que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria del TNF\alpha del tipo silvestre. En otras palabras, el epitope de las células T introducido en la secuencia del TNF\alpha preferentemente debe introducir una secuencia que sea de muy baja homología con la secuencia del TNF\alpha del tipo silvestre.

Por lo tanto la presente invención provee una molécula de TNF\alpha humano modificada, capaz de originar anticuerpos neutralizantes hacia el TNF\alpha humano del tipo silvestre, luego de la administración de dicha molécula de TNF\alpha modificada a un huésped humano, donde por lo menos un fragmento péptido de la molécula de TNF\alpha humano ha sido sustituido por al menos un péptido, que como se sabe, contiene un epitope de células T inmuno-dominante o una forma truncada de la molécula que contiene un epitope inmunodominante y una o ambas regiones flanqueadoras de la molécula de TNF humano que comprende por lo menos un epitope de células B del TNF\alpha, donde la molécula de TNF\alpha modificada está sustancialmente libre de la actividad del TNF\alpha.

El término "sustancialmente libre de actividad TNF\alpha" significa en el presente contexto que la administración a un ser humano de tal molécula de TNF\alpha modificada no resultará en efectos adversos significativos debido a los efectos conocidos de la citoquinas ejercidos por el TNF\alpha nativo. En otras palabras, las moléculas de TNF\alpha modificadas de la invención son sustancias farmacéuticamente aceptables.

Con el fin de comprobar si la molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la invención está sustancialmente libre de la actividad del TNF\alpha, puede aplicarse el bioensayo L929 como se define en la presente. Además, con el fin de confirmar el carácter inmunogénico de las moléculas de TNF\alpha modificadas, los anticuerpos originados contra la molécula de TNF\alpha modificada en un huésped adecuado, inhibirá significativamente la actividad del TNF\alpha del tipo silvestre en el bioensayo L929, según se define en la presente y/o los anticuerpos inhibirán significativamente el enlace del TNF\alpha del tipo silvestre al receptor 1 del TNF\alpha 55kD (TNF\alpha-R55) o al receptor TNF\alpha a 75 kD (TNF\alpha-R75).

Estos huéspedes adecuados pueden ser, por ejemplo, un primate, tal como un mono Cynomuleusus o Rhesus, un roedor, tal como una rata o un ratón o un conejillo de Indias, o un lagomorfo, tal como un conejo.

Los ensayos adecuados para evaluar el potencial de las moléculas modificadas de acuerdo con la invención se llevan a cabo usando un anticuerpo o antisuero en una concentración relativa a la configuración del ensayo y debe reflejar las condiciones fisiológicas con respecto a los reactivos involucrados o debe ser posible la extrapolación a condiciones fisiológicas, a partir de los resultados obtenidos del ensayo. En otras palabras, los resultados del ensayo deben indicar que una concentración fisiológica de anticuerpos contra el TNF\alpha in vivo es capaz de reducir la actividad de TNF\alpha a un grado de por lo menos: 10%, 15%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%. El experto en la técnica sabrá fácilmente como determinar dichas condicio-
nes.

Debe entenderse que una inhibición significativa del TNF\alpha del tipo silvestre puede convenientemente ser tal que resulte en una reducción o eliminación de los efectos adversos del TNF\alpha del tipo silvestre. Tal inhibición puede ser convenientemente de: por lo menos del 10%, por lo menos del 15%, por lo menos el 25%, por lo menos del 30%, por lo menos del 35%, por lo menos del 40%, por lo menos del 45%, por lo menos del 50%, por lo menos del 5%, por lo menos del 60%, por lo menos del 65%, por lo menos del 70%, por lo menos del 75%, por lo menos del 80%, por lo menos del 85%, por lo menos del 90%, por o menos del 95% o incluso del 100%.

Sobre esta base, las moléculas de TNF\alpha humano modificadas de acuerdo con la presente invención se caracterizan porque la sustitución se ha hecho en regiones de la molécula del TNF\alpha, que comprenden las cadenas de las láminas frontales y/o bucles conectores para conservar esencialmente la estructura de la lámina \beta de cualesquiera de los filamentos de la lámina posterior.

Aunque todavía no se ha verificado completamente por la vía experimental, debe asumirse que esta propiedad es común a las cadenas que forman la lámina \beta posterior, de modo que preferentemente, las sustituciones deben realizarse en las regiones de la molécula del TNF\alpha que no comprenden una cadena completa de la lámina \beta posterior. En vista de la discusión anterior sobre la importancia funcional de los residuos 31-35, puede asumirse que los bucles conectores entre los filamentos individuales de la lámina \beta posterior, preferentemente, también deben evitarse.

No obstante, se permite que la sustitución se haga en las regiones de la molécula del TNF\alpha que sólo involucran un segmento de la cadena D de la lámina \beta posterior.

De acuerdo con una forma de realización preferida de la invención, la sustitución comprende por lo menos un segmento del filamento H de la lámina \beta frontal y del bucle conector a la cadena 1 de la lámina \beta posterior, preferentemente los aminoácidos 132 a 146. De acuerdo con otra forma de realización de la invención, la sustitución comprende segmentos de las cadenas He 1 y el bucle conector completo, preferentemente los aminoácidos 132 a 152. De acuerdo con otra forma de realización preferida actualmente de la invención, la sustitución comprende un segmento de la cadena D de la lámina P posterior, por lo menos un segmento de la cadena E de la lámina P frontal y todo el bucle conector, preferentemente los aminoácidos 65 a 79 ó 64 a 84.

De acuerdo con otra forma de realización de la invención, la sustitución comprende la totalidad de las cadenas C' y C de la lámina \beta frontal y un segmento de la cadena D de la lámina \beta posterior, preferentemente los aminoácidos 40 a 60.

De acuerdo con otra forma más de realización de la invención, la sustitución comprende por lo menos un segmento de la cadena E de la lámina \beta frontal y de uno o ambos bucles conectores, preferentemente los aminoácidos 76 a
90.

El epitope de células T insertado preferentemente debe ser promiscuo y debe saberse que es inmunogénico en una mayoría de los tipos de la clase 11 de HLA humano. Los epitopes aplicables pueden derivar, por ejemplo, del toxoide tetánico, preferentemente el epitope P2 y/o P30, Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol. 19:2237-42, 1989. También pueden usarse los epitopes derivados del toxoide de la difteria.

Las moléculas del TNF\alpha humano modificadas preferidas (análogos de TNF\alpha), tal como se las ha designado con anterioridad, con referencia a la ubicación de la sustitución, se muestran en el listado de secuencias adjunto como SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:16. Otros análogos de TNF\alpha aplicable se listan como SEQ ID NO:4, 10, 14 y 16.

La invención se relaciona asimismo con análogos truncados de los análogos de TNF\alpha modificados antes citados, de acuerdo con la presente invención. De esta manera, los análogos truncados de las moléculas de TNF\alpha que contiene un epitope de células T promiscuo e inmunodominante y una o ambas regiones flanqueadoras que comprenden por lo menos un epitope de células B del TNF\alpha, que preferentemente comprenden 5 aminoácidos como mínimo, también constituirían una posible ingrediente activo en una vacuna de TNF\alpha de acuerdo con la invención. El epitope de células T induciría la proliferación de células T cuando se presenta ante las moléculas de la clase 11 de MHC por la APC, mientras que el epitope de células potencialmente sería reconocido por los receptores de inmunoglobulina sobre las células By, posteriormente, sería presentado por las moléculas de la clase 1 del MHC sobre estas células. Esto constituye la base para incitar una respuesta inmunitaria hacia el TNF\alpha del tipo silvestre, que aloja al epitope de células B, de acuerdo con el documento WO 95/05849 y con la presente invención.

Los epitopes de células B serían identificados en el TNF, tanto teórica como experimentalmente. Los algoritmos para la identificación de epitopes de células B lineales potenciales han sido publicados y esto formaría la base de una investigación basada en experimentos sobre la naturaleza de estos epitopes potenciales han sido publicados y esto formaría la base de una investigación basada en experimentos sobre la naturaleza de estos epitopes potenciales. Los anticuerpos incitados en un sistema heterólogo (por ejemplo, conejos) en respuesta a la inyecciones de tales moléculas de TNF\alpha truncadas que comprenden epitopes de células T, podrían analizarse para determinar la capacidad in vitro de ligarse con el TNF\alpha humano nativo, preferencialmente de un modo neutralizante. Podrían seleccionarse in vitro paneles de anticuerpos monoclonales que según se sepa, sean neutralizantes, para determinar la capacidad de ligarse con los epitopes de las células B potenciales del TNF\alpha. Estas son las dos estrategias para identificar los posibles y mejores epitopes de las células B.

Se cree que los análogos del TNF\alpha antes mencionados permanecen en forma de monómero, ya que la modificación probablemente destruye la tendencia inherente a la trimerización del TNF\alpha del tipo silvestre.

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No obstante, la invención se relaciona asimismo con dímeros, oligómeros, especialmente trímeros o multímeros de las moléculas de TNF\alpha modificadas reivindicadas, siempre y cuando estén desprovistas de la actividad del TNF\alpha y, también moléculas de ADN aisladas, que se codifican para las moléculas de TNF\alpha modificadas reivindicadas.

Las moléculas de ADN aisladas que codifican los análogos del TNF\alpha preferidos tienen secuencias listadas como SEQ ID NO: 7 y 15 y las moléculas de ADN que codifican los otros análogos aplicables se listan como SEQ ID NO: 3, 9, 13 y 15.

La invención abarca además vectores que comprenden las moléculas de ADN aisladas, las cuales codifican los análogos y vectores de expresión que comprenden tales moléculas de ADN, operativamente ligadas a una secuencia de control de expresión adecuada.

Otro aspecto de la invención es un huésped transformado con un vector de expresión para tal análogo.

Tal huésped puede ser cualquiera de los huéspedes comúnmente usados para la expresión, por ejemplo, una cepa de bacterias, levadura u hongos o líneas celulares de insectos, mamíferos o aves.

La invención se relaciona asimismo con un método para producir los análogos de TNF\alpha reivindicados, por los cuales las células del huésped transformadas con un vector de expresión para el análogo se cultivan en condiciones adecuadas que permiten la producción del análogo y el análogo producido se recupera.

Si se desea, las moléculas de TNF\alpha modificadas de acuerdo con la invención pueden ser expresadas como o forman parten de una proteína de fusión con una molécula adyuvante adecuada, preferentemente un adyuvante inmunológicamente activo, tal como GM-CSF, HSP70 ó una interleucina, por ejemplo, la interleucina 2.

Más específicamente, las moléculas de TNF\alpha modificadas se producen por la sustitución de los segmentos de genes apropiados que codifican péptidos que contienen o constituyen los epitopes de células T inmuno-dominantes en el gen que codifica la molécula de TNF\alpha humano nativa. Posteriormente, el gen de TNF\alpha modificado se expresa en un vector de expresión eucariótico o procariótico. Las moléculas de TNF\alpha modificadas expresadas se purifican y repliegan tal como se describirá más adelante.

Aunque puede preferirse insertar la totalidad del epitope de células T, en algunos casos puede resultar ventajoso insertar una secuencia de péptidos que comprenda tanto al epitope así como las regiones flanqueadoras provenientes de la proteína de la cual deriva el epitope.

De acuerdo con la invención, las moléculas de TNF\alpha humano modificadas pueden ser usadas en vacunas contra el TNF\alpha. Las estrategias en el desarrollo de la formulación de vacunas basadas en proteínas purificadas, tales como las auto-proteínas moduladas, generalmente corresponden a las estrategias de formulación para cualquier otro producto farmacológico basado en proteínas. Los problemas potenciales y los lineamientos requeridos para solucionar estos problemas como por ejemplo, la conservación de la estructura terciaria se discuten en varios libros de textos, por ejemplo Therapeutic Peptides and Protein Formulation, processing and Delivering Systems Ed. A. K. Banga Technomic Publishing AG, Basel 1995. El uso de un adyuvante, por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio (Adja-Phos), fosfato de calcio, análogo de dipéptido de muramilo o algunos de los desarrollos más recientes en adyuvantes de vacunas, tales como micropartículas biodegradables e Iscoms (Complejos Inmunoestimulatorios) es un desafío de formulación familiar para un científico farmacéutico que se desempeña en esta área.

La preparación de vacunas de acuerdo con la invención, las cuales contienen secuencias de péptidos como ingredientes activos, por lo general se comprende sin dificultades en la técnica como se ejemplifica mediante las Patentes de los Estados Unidos: 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792 y 4.578.770. Típicamente, tales vacunas se preparan como inyectables, ya sea como suspensiones o soluciones liquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución -o la suspensión- en el liquido antes de la inyección. La preparación también puede ser emulsionada. El ingrediente inmunogénico activo se mezcla con frecuencia con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo: agua, solución, salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH o adyuvantes, los cuales potencian la efectividad de las vacunas.

Convencionalmente, las vacunas se administran parenteralmente, mediante una inyección, por ejemplo, ya sea por la vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen los supositorios y, en algunos casos, las formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contengan el ingrediente activo, comprendido en un rango de 0.5% a 10%, preferentemente de 1-2%. Las formulaciones orales incluyen tales excipientes normalmente empleados, tales como, por ejemplo: grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos o formulaciones de liberación sostenida y contienen de 10 a 95% del ingrediente activo, preferentemente del 25 al 70%.

Los polipéptidos pueden ser formulados en la vacuna como formas neutrales o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácidas (formadas con los grupos amino libres del péptido) y las cuales se forman con ácidos inorgánico, tales como, por ejemplo: ácidos clorhídrico o fosfórico, tales ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo: hidróxidos férricos, sódicos, potásicos, de amonio o de calcio y tales base orgánicas tales como: isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.

Las vacunas se administran en una forma compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva e inmunogénica. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para producir una respuesta inmune y el grado de protección deseado, que a su vez, depende del nivel de TNF\alpha en el paciente. Los rangos de dosificación adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de ingrediente activo por vacunación, con un rango preferido comprendido entre aproximadamente 0,1 \mug a 1000 \mug, tal como, en el rango de aproximadamente 1 \mug y 300 \mug, y especialmente, en el rango de aproximadamente 10 \mug y 50 \mug. Los regímenes adecuados para la administración inicial y aplicaciones de refuerzo también son variables, pero se tipifican por una administración inicial seguida por las inoculaciones posteriores u otras administraciones.

El modo de aplicación puede variarse ampliamente. Son aplicables cualesquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna. Se cree que éstos incluyen la aplicación oral sobre una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, en forma parenteral, por una inyección o similar. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará de acuerdo con la edad de la persona a vacunar y -en menor grado, con la contextura física de la persona a vacunar.

Algunas de las moléculas de TNF\alpha modificadas de acuerdo con la presente invención son suficientemente inmunogénicas en una vacuna, pero para algunas de las demás, la respuesta inmunitaria se potenciará si la vacuna comprende, además, una sustancia adyuvante.

Los diversos métodos para lograr un efecto adyuvante para la vacuna incluyen: el uso de agentes tales como fosfato o hidróxido de aluminio (alum), comúnmente usado como una solución salina amortiguada con buffer de fosfato, la mezcla con polímeros sintéticos de azúcar (Carbopol), usada como una solución al 0,25% el agregado de la proteína en la vacuna, mediante tratamiento con calor, con temperaturas que varíen entre 70 o y 1010 durante períodos comprendidos entre 30 segundos a dos minutos, respectivamente. El agregado mediante la reactivación con anticuerpos tratados con pepsina (Fab) ala albumina, la mezcla con células bacterianas tales como C, parvum o endotoxinas o componentes de lipopolisacáridos de bacterias gram-negativas, la emulsión en vehículos aceitosos fisiológicamente aceptables, tales como mono-oleato de "manuro" (Aracel A) o la emulsión con una solución al 20% de un perfluocarbono (Fluosol-DA) usado como un sustituto en bloques, también pueden ser empleados. De acuerdo con la invención el DDA (bromuro de dimetil-dioctadecilamonio) es un candidato interesante como adyuvante, pero también el QuilA y RIBI constituyen posibilidades interesantes. Otras posibilidades son el lípido de monofosforilo A (MPL) y el dipéptido de muramilo (MDP). Otros adyuvantes adecudos son: hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio (Adju-Phos), fosfato de calcio, análogo de dipéptido de muramilo. Algunos de los desarrollos más recientes en adyuvantes para vacunas, tales como las micropartículas biodegradables e Iscoms (Complejos Inmunoestimulatorios) también pueden usarse adecuadamente.

Otra posibilidad altamente interesante (y, por lo tanto, preferida) para lograr el efecto adyuvante logrado consisten en el uso de una técnica descrita en Gosselin et al., 1992. Para resumir, la presentación del antígeno relevante, tal como una molécula de TNF\alpha modificada de la presente invención, puede mejorarse mediante la conjugación de tal antígeno con anticuerpos (o fragmentos de anticuerpos que se liguen a antígenos) contra los receptores Fc\gamma sobre los monocitos/macrófagos. Se ha demostrado que los conjugados especialmente entre el antígeno y anti Fc\gammaRI mejoran la inumogenicidad para los propósitos de la vacunación.

Otras posibilidades implican el uso de sustancias inmunomoduladoras, tales como las linfosinas (por ejemplo, IFN-g, IL-2 e IL-12) o inductores del IFN-\gamma sintéticos, tales como poli I:C, en combinación con los adyuvantes antes mencionados.

En muchos casos, será necesario realizar administraciones múltiples de la vacuna, por lo general, que no excedan de seis vacunaciones, más usualmente, que no excedan de cuatro vacunaciones y, preferentemente, una o mas, usualmente por lo menos, aproximadamente tres vacunaciones. Las vacunaciones se realizaran normalmente a intervalos comprendidos entre dos a doce semanas, más usualmente, a intervalos comprendidos entre tres a cinco semanas. Los refuerzos periódicos a intervalos de 1-5 años, usualmente, tres años, serán convenientes para mantener los niveles deseados de inmunidad protectora.

Una razón para mezclar los polipéptidos de la invención con un adyuvante reside en la activación efectiva de una respuesta inmune celular. No obstante, este efecto puede lograrse también por otros medios, por ejemplo, expresando el antígeno efectivo en una vacuna en un microorganismo no patogénico. Un ejemplo ampliamente conocido de tal microorganismo es el Mycobacterium bovis BCG.

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Se prefiere que el microorganismo no patogénico sea una bacteria, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en los géneros: Mycobacterium, Salmonella, Pseudomas y Eschericia. Se prefiere especialmente que el microorganismo no patogénico sea Mycobacterium bovis.

La incorporación de una o más copias de una secuencia de nucleotidos que codifiquen la molécula de acuerdo con la invención en una microbacteria proveniente de una cepa de M. Bovis BCG potenciara el efecto inmunogénico de la cepa BCG. Se contempla la incorporación de más de una copia de una secuencia de nucleótidos de la invención para potenciar la respuesta inmunitaria aún más y, en consecuencia, un aspecto de la invención, radica en una vacuna en la cual, por lo menos, dos copia de una secuencia de ADN que codifica una molécula se incorpora en el genoma del microorganismo, tal como por ejemplo, 5 copias. Las copias de la secuencia de ADN pueden ser ya sea idénticas que codifiquen moléculas idénticas o pueden ser variantes de la misma secuencia de ADN que codifiquen polipéptidos idénticos u homólogos o, en otra modalidad de realización, pueden ser secuencias de ADN diferentes que codifiquen polipéptidos diferentes, donde por lo menos uno de los polipéptidos esta de acuerdo con la presente
invención.

La vacuna viva de la invención puede ser preparada por cultivo de una célula no patogénica transformada de acuerdo con la invención y la transferencia de estas células a un medio para una vacuna y, opcionalmente, agregando un portador, vehículo y/o sustancia adyuvante.

Además de su uso como puntos de inicio para la síntesis de la molécula de la invención y para las investigaciones de hibridización (útiles para los ensayos de hibridización directa o como cebadores en, por ejemplo, PCR u otros métodos de amplificación molecular), los fragmentos de ácido nucleico de la invención pueden usarse para efectuar la expresión in vivo de los antígenos, es decir, los fragmentos de ácido nucleico pueden ser usados en las denominadas vacunas de ADN. Las recientes investigaciones han revelado que el fragmento de ADN clonado en un vector que no es replicativo en células eucarióticas, puede ser introducido en un animal (incluyendo un ser humano), por ejemplo, mediante una inyección intramuscular o la administración percutánea (el denominado enfoque "disparo de genes"). El ADN se absorbe mediante, por ejemplo, las células musculares y el gen de interés se expresa por un promotor que está funcionando en los eucariotes, por ejemplo, un promotor viral y posteriormente, el producto de genes estimula al sistema inmune. Estos métodos recientemente descubiertos se revisan en Ulmer et al., 1993, la cual se incorpora en la presente a modo de referencia.

La eficacia de tal "vacuna de ADN" puede mejorarse posiblemente mediante la administración de un gen que codifique el producto de expresión junto con un fragmento de ADN que codifique un polipéptido que tenga la capacidad de modular una respuesta inmune. Por ejemplo, un gen que codifique precursores de linfosinas o linfosinas (por ejemplo, IFN-y, IL-2 e IL-12) podrían administrarse junto con el gen que codifica la proteína inmunogénica, ya sea mediante la administración de dos fragmentos de ADN separados o mediante la administración de ambos fragmentos de ADN incluidos en el mismo vector.

Las vacunas pueden usarse para prevenir/tratar cualesquiera de las enfermedades que se han descrito con anterioridad, cuya patofisiología se caracteriza por la liberación de TNF\alpha, en particular, las enfermedades inflamatorias crónicas. Como ejemplos pueden mencionarse la artritis reumatoide y las enfermedades inflamatorias intestinales (IBD). Las últimas incluyen la colitis ulcerante y la enfermedad de Crohn, en particular, la colitis de Crohn. Otros ejemplos son: cáncer, caquexia -con frecuencia relacionada con el cáncer-, esclerosis diseminada, diabetes, psoriasis, osteoporosis y asma. Los cánceres, que preferentemente pueden ser tratados o prevenidos de acuerdo con la invención, pueden clasificarse histogenéticamente como tumores epiteliales malignos -incluyendo los carcinomas y adenocarcinomas, y como tumores epiteliales no malignos, incluyendo los liposarcomas, fibrosarcomas, condrosarcomas, osteosarcomas, leiomiosarcomas. rabdomiosarcomas, gliomas, neuroblastomas, meduloblastomas, melanoma maligno, meningioma maligno, diversas leucemias, diversos desórdenes mieloproliferantes, diversos linfomas (linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin), haemangiosarcoma, sarcoma de Kaposi, linfangiosarcoma, teratoma maligno, disgerminoma, seminoma y coricarcinoma.

Los carcinomas y adenocarcinomas son los más abundantes (que representan aproximadamente el 90%- de las muertes causadas por cáncer) y por lo tanto, son enfermedades-objetivo interesantes para tratar/prevenir de acuerdo con la invención. Los adenocarcinomas y carcinomas más importantes son aquéllos de las vías respiratorias (especialmente de origen bronquial), del pecho, colorrectales y del estómago. No obstante, también los carcinomas y adenocarcinomas prostáticos, ováricos, del tejido linfoide y de la médula ósea, del útero, del páncreas, del esófago, de la vejiga urinaria y del riñón causan un número significativo de muertes y, en consecuencia, resultan de interés.

Preferentemente, las vacunas serán suministradas como un tratamiento preventivo, pero en vista de la naturaleza crónica de estas enfermedades y su tendencia a la remisión y recurrencia, también pueden ser administradas a pacientes en los cuales se ha diagnosticado una o más de las enfermedades antes mencionadas y pueden servir para mantener al paciente en un estado de remisión.

En base a estudios anteriores realizados con ratones, se cree que los análogos de TNF\alpha modificados de acuerdo con la invención también pueden ser administrados como parte de un tratamiento curativo de las enfermedades antes citadas en un estado agudo o por lo menos, con perspectivas de llevar al paciente a la remisión y mantener una condición de estado constante.

En la actualidad, no puede establecerse un intervalo efectivo de dosificación, ya que las vacunas todavía no han sido todavía probadas en seres humano susceptibles a cualquiera de las enfermedades.

En cualquier caso, la dosis administrada será prescrita por el médico responsable.

De acuerdo con una modalidad de la invención, la vacuna comprende una mezcla de dos moléculas de TNF\alpha modificadas en forma diferente, que contienen dos epitopes de células T diferentes, por ejemplo P2 y P30, que derivan del toxoide tetánico. Opcionalmente, esta mezcla contiene cantidades apropiadas de un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, las vacunas no comprenden las moléculas de TNF\alpha humano modificadas en sí, sino más bien una construcción que comprende una secuencia de ADN no integradora, no infecciosa que codifica las moléculas, operativamente ligada a una secuencia promotora que puede controlar la expresión de la secuencia de ADN en humanos, en una cantidad suficiente como para que se produzca la absorción de la construcción y que tenga lugar la expresión suficiente como para inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes contra el TNF\alpha.

La utilidad de este tipo de vacunas, las denominadas vacunas de ADN, se ilustra, por ejemplo, en la patentes de los Estados Unidos Números: 5.589.466 y 5.580.859, con relación a los métodos de administración.

Las vacunas de ADN pueden comprender un vector de expresión viral, tal como un vector de expresión retroviral.

Generalmente, las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser adaptadas para la administración oral o parenteral, en particular, la administración subcutánea, intramuscular o intradérmica.

Las proteínas recombinantes/vacunas pueden caracterizarse a través del empleo de los siguientes ensayos, los cuales son familiares para una persona con experiencia en la técnica:

Geles SDS-Page teñidos con azul de Coomassie o plata (información sobre tamaño y pureza).

IEF (Concentración isoeléctrica) (información sobre el punto isoelectrico),

Ensayo LAL de endotoxina (información sobre pureza),

Espectroscopía de masa (información sobre la masa molecular),

SE-HPLC con perfil de detección UV (información sobre la distribución del peso de la molécula),

Secuencia con terminal N (información sobre identidad),

Dicroísmo circular (información sobre la estructura terciaria),

SE-HPLC con detección de franjas ("malls") (información sobre la estructura terciaria por dispersion luminosa),

Composición de aminoácidos (información sobre la identidad),

Inmunogenicidad en especies heterólogas (ratón, rata o conejo),

Reactividad a los anticuerpos en Transferencia Electroforética Occidental ("Western blottin"), Espectroscopia RMN, Estructura de los cristales,

Determinación de secuencia de aminoácidos completa.

Parte experimental con descripción de las modalidades preferidas 1. Introducción

En la solicitud WO 95/05849 anterior se demuestra que las moléculas de TNF\alpha murino modificadas, con epitope de células T pueden inducir altas titulaciones de anticuerpos, de reacción cruzada con el TNF\alpha murino (tipo silvestre) nativo. Estos anticuerpos pueden interferir con el TNF\alpha y su receptor in vitro, así como también, in vivo. Los efectos de beneficio de la inmunización contra el TNF\alpha se demuestran en varios modelos animales de enfermedad inducida por el TNF\alpha, tales como: caquexia experimental, artritis por colágeno y encefalomielitis alérgica experimental (EAE). Estos resultados experimentales en animales se obtienen a pesar del hecho que las dos moléculas de TNF\alpha murino modificadas utilizadas (denominadas MR 103 y MR 106) no se optimizaron para que fueran inmunogénicas en los haplotipos de clase II del MHC de los ratones DBA/1 y SJL. Estas cepas de ratones, se usan para los experimentos con artritis por colágeno y EAE, respectivamente. En otro experimento, se demuestra que una molécula de TNF\alpha murino modificada de un modo diferente (MR 105) proporciona una respuesta inmune más fuerte que el TNF\alpha murino recombinante conjugado en proteínas E. coli, mediante el uso de formaldehído.

Las MR 103, MR 105 y MR 106 son moléculas de ratón y, en base a la solicitud WO 95/05849 previa, no pueden sacarse conclusiones específicas con respecto a la inmunogenicidad de las moléculas de TNF\alpha humano modificadas sustituidas debidamente con células T, ni respecto de la capacidad potencial de tales moléculas para inducir a los auto-anticuerpos de TNF\alpha neutralizantes, ya que todas son activas.

2. Desarrollo de construcciones de TNF\alpha humano

En términos generales, en una vacuna de TNF\alpha para el uso humano, las moléculas de TNF\alpha humano modificadas deben satisfacer los siguientes requerimientos:

a.- Deben ser inmunogénicas en una gran proporción de la población.

b.- Deben ser óptimamente capaces de inducir a los anticuerpos neutralizantes de TNF\alpha.

c.- No deben poseer ninguna actividad biológica del TNF\alpha remanente.

Además en un proceso de selección también pueden considerarse otros parámetros prácticos tales como los niveles de expresión recombinante la facilidad de purificación la solubilidad etc.

2.1 Promiscuidad inmunológica de las moléculas de TNF\alpha modificadas

Durante el desarrollo de la vacuna de TNF\alpha humano, el objetivo es el de producir moléculas de TNF\alpha humano modificadas, las cuales, eventualmente, serán inmunogénicas en la mayor parte posible de la población humana que por supuesto representa un gran numero de tipos de clase 11 de HLA diferentes. Por lo tanto en lugar de los epitopes específicos de MHC usados en los experimentos previos con animales se utilizaron epitopes de células T promiscuos. Por la solicitud WO 95/05849 previa no se sabia cómo podrían influir tales epitopes sobre la capacidad de tales moléculas para inducir a los anticuerpos neutralizantes.

Se escogieron los dos epitopes de células T derivados de toxoides tetánicos (TT) P2 y P30 que han sido bien caracterizados en la literatura científica. Se sabe que estos epitopes son inmuno-dominantes en TT y que son capaces de ligar por lo menos el 80% de las moléculas de clase 11 de HLA en la población humana.

Además, mediante el uso de esto epitopes TT, se esperaba que fuese posible someter a prueba la inmunogenicidad de las construcciones de TNF\alpha in vitro sobre las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) y las líneas de células T generadas a partir de donante E1 de sangre inmunes al TT.

La secuencia de aminoácidos del epitope P2 es QYIKANSKFIGITEL y corresponden a los aminoácidos TT 830-844 y la secuencia del epitope P30 es FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE y corresponde a los aminoácidos TT 947-967. La sustitución P2 y P30 en dos moléculas diferentes de TNF\alpha humano intercambiaría aproximadamente 10% al 15% respectivamente de la secuencia de TNF\alpha nativo. En el caso en que ambos epitopes fueran insertados en una sola molécula de TNF\alpha, aproximadamente el 25% de la molécula sería intercambiada y podría temerse que esto interfiriese demasiado con las partes nativas remanentes de la molécula de TNF\alpha. Por lo tanto se decide desarrollar dos moléculas de TNF\alpha, contendiendo cada una de ellas P2 ó P30. Juntas, se esperaría que tales dos moléculas fueran inmunogénicas en por lo menos el 80% de la población humana. Además, es muy probable que las moléculas truncadas compuestas en parte por el epitope P2 ó P30 y en parte por las regiones flanqueadoras de TNF\alpha, también contribuyan a la inmunogenicidad resultante en las construcciones, que son inmunogénicas en casi el 100% de la población.

Aunque era posible inducir anticuerpos con todas las construcciones de TNF\alpha murino en todas las cepas de ratones probados hasta el momento -comparar con la discusión anterior sobre la MR 103, MR 105 y MR 106 habría de esperarse a priori que la inserción del epitope extraño de células T en ciertas posiciones en el TNF\alpha sería más beneficiosa que otras posiciones con respecto a la presentación del epitope ante las células T por las moléculas de la clase II de MHC. Por lo tanto se decide producir un conjunto de moléculas de TNF\alpha humano modificadas de una manera diferente con el epitope P2 y P30 insertado en diferentes posiciones en las moléculas; ver la Figura 4. Posteriormente, se probaron todas las moléculas in vitro en ensayos con células T en base a las células mononucleares de la sangre perifé-
rica (PBMC) 6 líneas de células T específicas P2/P30 aisladas de una serie de donantes de sangre inmunes ATT sanos.

Sin embargo, contrariamente a lo que se esperaba, se demuestra que aunque se observan diferencias cuantitativas menores, la posición intramolecular de los epitopes P2 y P30 no es esencial para que la capacidad fuera procesada por células presentadoras de y, posteriormente, presentadas ante las células T específicas de TT. De este modo, el P2 insertado en las posiciones 132 a 146, 65 a 79 y 76 a 90 y el P30 insertado en las posiciones 40 a 60 y 132 a 152 (TNF2-5, 2-3, 2-7, 30-2, 30-5) fueron todos procesados y presentados ante las células T. De este modo, a partir de la discusión anterior, es muy probable que estas moléculas eventualmente, sean universalmente inmunogénicas en la población humana.

2.2 La capacidad de las moléculas de TNF\alpha humano modificadas para inducir a los anticuerpos neutralizantes

Tal como se ha mencionado con anterioridad, no fue posible, a partir de los estudios anteriores con ratones descritos en el documento WO 95/05849, predecir qué posición sería la más apropiada con el fin de poder inducir a los anticuerpos del TNF\alpha neutralizantes, dado que los tres análogos MR 103, MR 105 y MR 106 son capaces de inducir a los anticuerpos a pesar de sus áreas diferentes de sustitución. Por lo tanto, se produce un conjunto de moléculas de TNF\alpha humano diferentes, con P2 y P30 insertados en posiciones diferentes. Las sustituciones se distribuyen al azar sobre toda la molécula. Los anticuerpos inducidos en conejos al inyectar estas moléculas se probaron posteriormente en ensayos bioquímicos, así como también en ensayos biológicos in vitro, para determinar su capacidad de interferir con la actividad biológica del TNF\alpha.

Los presentes inventores han demostrado en observaciones no publicadas que, dependiendo de la posición intramolecular del epitope insertado, se observa una especificidad general diferente de los anticuerpos inducidos. Muy por el contrario a lo que sería de esperarse en base a los datos estructurales de la molécula de TNF\alpha, se observa que las sustituciones realizadas en la lámina frontal con P2 o P30, privan totalmente a las moléculas de la actividad de TNF\alpha biológica, pero al mismo tiempo, conservan la capacidad de las moléculas modificadas de inducir a los anticuerpos de TNF\alpha neutralizantes.

Se demuestra que las moléculas que contienen P2 o P30, en las posiciones mencionadas con anterioridad, son particularmente efectivas para inducir a los anticuerpos neutralizantes. Por lo tanto, cualesquiera de estas moléculas son candidatos potenciales para usar en las vacunas de TNF\alpha humano.

2.3 La actividad biológica de las diferentes construcciones de TNF\alpha

Obviamente no sería posible usar una molécula que fuera tan tóxica como el TNF\alpha en una vacuna. Las moléculas de TNF\alpha modificadas, en consecuencia, tendrían que ser no tóxicas, es decir, deberían estar desprovistas de toda actividad del TNF\alpha residual.

Por lo tanto, todas las proteína de TNF\alpha mutantes se prueban in vitro, en bioensayos dependientes del TNF\alpha, así como también en ensayos de enlace de receptores, con el propósito de examinar si son o no tóxicas. Se demuestra claramente que las moléculas de TNF\alpha humano modificadas (TNF 2-5, 2-3, 2-7, 30-2 y 30-5) todas ellas, estaban desprovistas de actividad biológica del TNF\alpha. Entonces, se cumplen todos los requerimientos necesarios de estas moléculas, de formar parte de una vacuna universalmente no tóxica capaz de inducir a los anticuerpos neutralizantes del TNF\alpha anti-humano.

Ejemplo 1 Trabajo de construcción genética

Se decide producir 10 moléculas de TNF\alpha humano modificadas diferentes -cinco de las cuales contienen el epitope P2 y cinco que contengan el epitope P30. Los epitopes se distribuyen en diferentes posiciones dentro de la molécula. Las construcciones genéticas se hacen usando diversas enzimas de restricción estándar y técnicas de mutagénesis basadas en PCR. Las construcciones genéticas se muestran esquemáticamente en las Figuras 4a y 4b. Las secuencias de ADN que codifican las moléculas de TNF\alpha modificadas y las correspondientes secuencias de aminoácidos se incorporan como SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 20. Las construcciones del gen TNF2-5 humano mutante, la estrategia de clonación y mutación y la expresión, aislamiento y purificación subsecuente del análogo de TNF2-5 posteriores se explican a continuación, a modo de ejemplo:

Construcción y producción del TNF2-5 Construcción genética del gen TNF2-5 humano mutante: estrategia de clonación y mutación

La construcción genética del gen que codifica, al análogo TNF2-S humano mutante se basa en las técnicas de mutagénesis basadas en PCR tradicionales, así como también que todas las otras construcciones.

La secuencia de ADN nativo del TNF\alpha que codifica la parte soluble de esta molécula se obtiene mediante clonación por PCR tradicional, usando los cebadores 1 y 11 sintéticamente sintetizados (Tabla 1 y SEQ ID NO: 21 y 22) de una biblioteca de cADN disponible en plaza, CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA, Estados Unidos (Figura 16, 1). El gen nativo se inserta en un vector de expresión E. coli comercial, pET28c, comercializado por Novagen, Madison WI S3711, Estados Unidos, de modo tal que el gen pueda transcribirse en el cuadro de un promotor inducible por IPTG.

La construcción genética del TNF2-S análogo mutante de TNF\alpha se llevó a cabo mediante una técnica de mutagénesis por PCR aplicada a la secuencia de ADN nativa. La secuencia de ácido nucleico que codifica al epitope de células T se incorporó en un oligonucleótido 75-mer' sintéticamente sintetizado (Cebador "mut2-5", tabla 1 y SEQ ID NO: 27), entre las dos extensiones fijadoras 3'- y 5'- de ADN homólogo al TNF, siendo de este modo el cebador "mut" capaz de fijarse a la secuencia de genes de TNF\alpha humanos nativos en el sitio definido, seleccionado para TNF2-S (ver la figura 16, 2a). En el oligonucléotido "mut", el número de codones que codifican al epitope de células T, corresponde con exactitud al número de codones de TNF omitidos entre las dos extensiones fijadoras 3'- y 5'- del ADN homólogo al TNF. El cebador de mutagénesis se usa para producir un producto de PCR que contiene al ADN que codifica al epitope de las células T y la secuencia de TNF\alpha posterior (ó 3') al epitope insertado (Fig. 16, 2a). La extensión del ADN de TNF\alpha anterior (ó 5') al punto de inserción del epitope se proporciona por un segundo producto de PCR, usando los cebadores 1 y 111 (Tabla 1, SEQ ID NO: 23) (Fig. 16, 2b). Los dos productos PCR eventualmente se unen entre sl en una reacción PCR final (Fig. 16, 3) usando los dos cebadores más distales (1, 11) de las dos reacciones. La secuencia de ADN de TNF2-5 mutante completa se introduce luego en un vector de expresión E. coli comercial, en analogía con la clonación de expresión del gen nativo, de manera tal que el gen pueda ser transcrito de un promotor inducible por IPGT proveniente de las células transformadas.

Los cebadores "mut" que se usan para la construcción de los otros análogos (TNF2-1, 2-3, 2-4, 2-7, 30-1, 30-2, 30-3, 30-4 y 30-5) se identifican como SEQ ID NO: 23-26 y 28-33, respectivamente.

TABLA 1

101

Cultivo de Bacterias recombinantes. recolección y cuerpos de inclusión disueltos Purificación de proteínas del analogo TNF2-5

La producción de la proteína TNF2-5 es análoga a la producción de las otras moléculas de TNF recombinantes.

1. Inocular 20 ml de medio de TB con un contenido de 50 \mug/ml de Carbenicilina con la cepa de E. coli transformada que porta el vector de plásmido inducible por IPTG, que aloja el gen de TNF, el cual codifica la proteína recombinante cultivar el E. coli durante la noche, a 37ºC, bajo agitación.

2. Diluir el cultivo en desarrollo durante la noche en una proporción de 1:25, en 250 ml de medio TB con 50 \mug g/ml de Carbenicilina y dejar que se desarrolle el cultivo hasta que OD_{450} sea 1. Inducir la expresión de la proteína recombinante mediante el agregado de IPTG a una concentración final de 1 mM. Cultivar durante toda la noche, con agitación vigorosa a 37°C.

3. Cosechar las células recombinantes del medio por centrifugación, a 3500 x g. Lavar el gránulo una vez en amortiguador BSB. Usar 150 ml de BSB por 50 g de bacteria, peso húmedo.

4. Sonicar 4 veces durante 30 segundos a amplitud máxima, hasta que la suspensión de bacterias sea completamente homogénea. La sonicación se lleva a cabo usando un sonicador Soniprep MSE 150, equipado con una sonda estándar de 9,5 mm (Soniprep 05 38 121-1154).

5. Agregar 8 \mul de PSMF (50 mM) y 80 \mul de solución de lisosomas (10 mg/ml) por gramo de gránulo de células, Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

6. Agregar 4 mg de ácido desoxicólico por gramo de gránulo, mezclar y conservar a 37°C.

7. Cuando la solución se ha tornado viscosa, agregar 20 \mul de DNAsa (1 mg/ml) por gramo de gránulo y MgCl_{2} a una concentración final de 5 mM, mezclar y conservar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

8. Sonicar en hielo 5 veces 30 segundos, con intervalos de 30 segundos, a una amplitud máxima, hasta que la solución se torne liquida y no viscosa.

9. Centrifugar a 20.000 x g durante una hora, conservar el sobrenadante para una verificación posterior del procedimiento de lavado y controlar que todos los cuerpos de inclusión hayan sido precipitados.

10. Resuspender el gránulo en agua MiliG (1 ml H_{2}O por gramo de E. coli); agitar durante 1 hora.

11. Centrifugar a 20.000 x g durante una hora, conservar el sobrenadante para verificar si todos los cuerpos de inclusión han sido precipitados.

12. Resuspender el granulo en urea 1 M, disolver en un ml por gramo de E. coli, agitar durante 1 hora.

13. Centrifugar a 20.000 x g durante una hora, conservar el sobrenadante para verificar si todos los cuerpos de inclusión han sido precipitados.

14. Resuspender el granulo en guanidina 1M, disuelta en 1 ml por gramo de E. coli, agitar durante 1 hora.

15. Centrifugar a 20.000 x g durante una hora, conservar el sobrenadante para verificar si todos los cuerpos de inclusión han sido precipitados.

16. Resuspender el granulo en 25 ml de guanidina 6M + Tris 20 mM, pH 8,0, agitar durante toda la noche.

17. Centrifugar a 20.000 x g durante una hora, conservar el sobrenadante que contiene los cuerpos de inclusión de proteína recombinante, conservar el granulo para verificar si todos los cuerpos de inclusión han sido disueltos.

18. La solución de proteínas se dializa extensivamente contra agua MiliQ y posteriormente, la solución se seca por congelamiento.

19. El material seco por congelamiento se solubiliza en Tris 20 mM, guanidina 6 M, 2-propanol al 30% (pH 8,0), a una concentración de 20 mg/ml. Se deja solubilizar durante toda la noche, bajo una agitación SUgve. Se examina la presencia de monómeros en una columna superdex 200 (XK 16, Pharmacia, diámetro: 1,6 cm; altura: 750 cm). Dejar correr en amortiguador corriente a 1 ml/min. Comparar con los estándares en el mismo buffer.

20. La purificación de proteínas se realiza por filtración con gel en una columna superdex 200 (XK 26, Pharmacia, diámetro: 2,6 cm; altura: 100 cm), que se equilibra con amortiguador de equilibración. Dejar correr en el amortiguador de equilibración. Se aplica un volumen de muestra de aproximadamente 1% del volumen de columna total.

21. Se lleva a cabo el repliegue de la proteína recombinante por diálisis. La proteína se diluye a 10,1 mg/ml en amortiguador de equilibración y esta solución se coloca en una bolsa para diálisis hervida y se dializa contra: Tris 20 mM, urea 4 (pH 8,5), con tres cambios, durante toda una nqche a temperatura ambiente. La bolsa para diálisis se transfiere a un amortiguador Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM (pH 8,0). Cambiar tres veces, de las cuales la primera tiene lugar a temperatura ambiente. Dejar toda la noche en la sala de frío.

El repliege se evalua en una columna Superose 12 equilibrada en amortiguador Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM (pH 8,0)). Comparar con estandares.

Almacenamiento. Las proteínas recombinantes se almacenan secas por congelamiento. La producción a gran escala de las moléculas de TNF\alpha modificadas puede llevarse a cabo del modo que se describe a continuación.

Material de inicio:

500 litros de cultivo E. coli fermentado, diafiltrado con agua a aproximadamente 50 Litros.

1) Lavado de células

A)

Descongelado de la suspensión de células congeladas

B)

Centrifugado de las células durante 10 minutos a 4000 x g

C)

Re-suspensión del granulo en Tris 50 mM, NaCl, 150 mM, pH 8,0

Repetir los pasos B) y C) tres veces.

2) Homogeneización de las células

A)

Homogeneizar las células por un homogeneizador Rannie, ciclico, 5 a 700 bar.

B)

Centrifugar los cuerpos de inclusión durante 30 minutos, a 16.500 x g

C)

Lavar los cuerpos de inclusión tres veces con guanidina 3M, NaCl 1M, EDTA 5 mM, Sacarosa al 20%, Tris 50 mM, pH 8. Centrifugar los cuerpos de inclusión durante 30 minutos a 16.500 x g.

3) Solubilización de los cuerpos de inclusión. Resuspender el granulo en guanidina 6 M, DTT 10 mM, NaCl 150 mM, Etanol al 5%, Tris 50 mM, pH 8. Usar aproximadamente 1 ml amortiguador/100 mg de granulo

4) Ultrafiltración de los cuerpos de inclusión

A)

Eliminar las impurezas gruesas mediante un filtro de 0,45 \mu

B)

Eliminar los componentes de alta peso molécula mediante un filtro de 30 KD

C)

Concentrar los cuerpos de inclusión mediante un filtro de 5 KD

5) Cambio de Amortiguador

Preparar la muestra para cromatografía de intercambiador de iones. Cambiar el amortiguador a Urea 6 M, DTT 1 mM en Tris 50 mM, pH 8 por diafiltración.

6) Purificación SP-Sepharose

Cargar la proteína en una columna de SP-Sepharose. Lavar la columna con cuatro volúmenes de amortiguador A y eluir la proteína con amortiguador B al 100%.

Recoger en conjunto todas las fracciones con TNF\alpha Amortiguador A: Urea 6 M, DTT 1 mM, cl/Tris 50 mM, pH 8.

Amortiguador B: Urea 6 M, NaCl 1 mM, DTT 1 mM, Cl/Tris 50 mM, pH 8.

7) Replegado del TNF\alpha humano.

Diluir el conjunto de proteínas a aproximadamente 0,1 mg de TNF\alpha/ml en urea 6 M, DTT 1 mM, NaCl 50 mM, EtOH al 5% en Tris 20 mM/Cl, pH, 8,8 y eliminar la Urea paso a paso, yendo a la composición de amortiguador siguiente, por diafiltración.

A)

Urea 2 M, DTT 1 mM, NaCl 150 mM en Tris 20 mM/Cl, pH 8,8, durante toda la noche, a 5°C

B)

Urea 1 M, DTT 1 mM, NaCl 150 mM en Tris 20, mM/Cl, pH 8,8, durante ocho horas, a 5°C

C)

DTT 1 mM, NaCl 150 mM en Tris 20 mM/CI, pH 8,8, durante toda la noche, a 5°C

D)

NaCl 150 mM en Tris 20 mM/Cl, pH 8,8, durante toda la noche, a 5°C

8) Almacenar los análogos de TNF\alpha humano.

Concentrar la proteína a 1,0 mg/ml y almacenar la muestra a -20°C.

Medio TB

Disolver el caldo Terrific Broth (GIBCO BRL 2271122) en agua MiliQ, de acuerdo con las instrucciones de fábrica. Autoclave a 121°C durante 20 minutos.

Solución de reserva de Carbenicilina x 100 (50 mg/ml)

La sal disódica de Carbenicilina (Sigma C1389) se disuelve en agua MiliQ a una concentración de 50 mg/ml. La solución se filtroesteriliza a través de un filtro de 0,2 \mum (Sterifix 0409 9206).

Solución de reserva IPTG x 100 mM

Se disuelven 1,19 g de IPTG isopropilbeta-Dtiogalactopiranosuro (IPTG, USB 17884) en agua MiliQ, 50 ml. La solución de filtroesteriliza a traves de un filtro de 0,2 \mum (Sterifix 0409 9206).

Amortiguador BSB

Amortiguador de Suspensión Bacteriana

TRIS 50 mM (Base Trisma, Sigma T 1503)

NaCl 0,5 M (Rider-de.Haën 31434)

DTT 5 mM (DL-ditiotretiol, Sigma D-0632)

pH, 8,0.

PMSF

Fenilmetil-sulfonilfluoruro 50 mM, SIGMA nº 0-76.26, disuelto en 2-propanol

Solucion de Lisosimas

10 mg/ml lisosimas de Grado 111 de clara de huevo de gallina (EC 3.2.1.17) SIGMA nº L-7001.

Ácido Deoxicólico

(ácido 7-deoxicólico) Sigma # D-6750.

DNAsa

1 mg/ml Dnasa, Desoxirribonucleasa 1, (EC. 3.1.21.1) Boehringer nº de Cat 1284932.

Urea

Urea (GibcoBRL 15716-020)

Guanidina

Clorhidrato de guanidina (Sigma G4505)

2-Propanol Amortiguador Corriente

TRIS 20 mM (Base Trisma, Sigma T1503)

Urea 8 M (GibcoBRL 15716-020)

p-mercaptoetanol al 0,1%

pH 8,0

Amortiguador de equilibrio

TRIS 20 mM (Base Trisma, Sigma T1503)

Urea 8 m (GibcoBRL 15716-020)

p-mercaptoetanol al 0,1%

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Ejemplo 2 Expresión, purificación y replegado de las moléculas de TNF\alpha modificadas P2 y P30

Está bien establecido que las proteínas recombinantes se comportan de una manera diferente durante la expresión, la purificación y el replegado. Todas las proteínas se expresaron en E. coli y se obtienen niveles, de expresión comprendidos de 2-20%. Todas las proteínas fueron reconocidas en experimentos de "Western blotting", utilizando un anticuerpo de TNF\alpha anti-humano de conejo policlonal que se comercializa en el mercado.

Las construcciones de TNF\alpha se expresan posteriormente una por una en cultivos de 250 ml con tamaños de lotes de 3-4. Todas las proteínas de TNF\alpha modificadas se expresaron como cuerpos de inclusión y se producen más del 85% de las preparaciones de proteína pura y replegada, de acuerdo con lo que se ha descrito anteriormente.

Se determina el contenido de proteína mediante análisis BCA estándar. Todas las purificaciones de la proteína se llevan a cabo por lo menos en tres corridas separadas para cada molécula y, en todos los casos, se someten a prueba los lotes de proteína por separado, a los cuales se los encontró similares. Se almacenan las proteínas en concentraciones de 0,2 - 1,0 mg/ml en PBS a -20°C hasta su uso.

Los análisis de control de calidad estándar incluyen electroforesis con gel SDS, tanto con tinción de azul Coommassie como tinción de plata de las preparaciones, de proteína individuales. En todos los casos, se observa que las proteínas tienen el tamaño esperado y poseen una pureza superior al 85%.

Las moléculas con epitopes insertados en la posición 4 (TNF2-4 y TNF30-4) solamente se expresan a niveles relativamente bajos (aproximadamente 2%). Además, estas moléculas son muy difíciles de purificar y, en especial, su replegado resulta problemático. Ambas moléculas, pero en particular la TNF30-4, no son muy solubles en PBS y manifiestan una tendencia a precipitarse durante el almacenamiento.

Ejemplo 3 Actividad biológica de las diferentes construcciones de TNF\alpha

La actividad biológica directa de las moléculas de TNF\alpha purificadas es analizada mediante el bioensayo L929, que es un ensayo in vitro estándar para la determinación de la actividad biológica del TNF\alpha. Tal como se observa en la Figura 6, ninguna de las moléculas de TNF\alpha modificadas P2 ó P30 son capaces de matar a las células L929 en el rango de concentración sometido a prueba (hasta 60 mg/ml). Una molécula de TNF\alpha recombinante comercialmente disponible esta completamente activa a alrededor de 0,6 mg/ml. La preparación de TNF\alpha del tipo silvestre también esta completamente activa dentro de todo el rango de concentración analizado.

Ejemplo 4 Capacidad de las moléculas de TNF\alpha modificadas para inducir anticuerpos neutralizantes

Se inmunizan conejos con cada una de las diez construcciones para determinar si las mismas pueden inducir anticuerpos capaces de neutralizar el TNF\alpha humano biológicamente activo in vitro. Se usan grupos de tres conejos y cada uno de los conejos recibió 100 mg de TNF\alpha s.c. en Adyuvante Completo Freunds y, posteriormente, aproximadamente 100 mg cada tres semanas, en Adyuvante Incompleto de Freunds.

Durante todo el período de inmunización de 18 semanas, se toman muestras de sangre a intervalos regulares y se analizan los sueros para verificar la actividad anti TNF\alpha en un ensayo ELISA convencional, toda vez que se encuentre comercialmente disponible. Se usa TNF\alpha humano puro y no modificado como antígeno.

Todos los conejos desarrollaron anticuerpos antiTNF\alpha durante el periodo de inmunización y el nivel máximo o las titulaciones de anticuerpo tuvieron variaciones en el periodo de una década, para cada grupo. Las titulaciones promedio para el anticuerpo se presentan en la Fig. 7. Las TNF2-5, TNF2-7, TNF2-3, TNF2-1 y WT-TNF\alpha indujeron una titulación de cien entre las semanas 2-4, mientras que la TNF2-4 respondió de una manera notablemente más lenta. Se observó una cinética similar para las proteínas TNF30, en las que también se obtuvo una respuesta más lenta con la TNF30-4.

La capacidad que poseen estos sueros para interferir con el TNF\alpha humano y su receptor se somete a prueba mediante el ensayo L929 y también mediante un ensayo de enlace de receptores de fase sólida.

En el ensayo L929, se agregaron las diluciones de sueros inmunes como así también, de suero de control no inmune al TNF\alpha humano comercialmente disponible, antes de proceder con el agregado de la mezcla a las células L929. Se analizaron los sueros de estos tres conejos de cada uno de los grupos por duplicado y se calcularon los valores promedio. Como el suero normal manifestó una tendencia a aumentar los valores básicos del sistema de detección de colores, los mismos se restaron de todos los valores y se calculó el porcentaje de inhibición relativa. En la Fig. 8 se presentan los resultados obtenidos para la capacidad inhibitoria en la semana 14 del plan de inmunización para todos los conejos.

La TNF2-5, que no comprende sustituciones en ninguno de los segmentos de las cadenas de la lámina \beta posterior, es claramente superior en comparación con las otras construcciones y esta molécula es comparable con la molécula de WT-TNF\alpha completamente tóxica, con relación a su capacidad para inducir anticuerpos neutralizantes (datos no presentados). La TNF2-3, que comprende un segmento sustituido pequeño en la cadena \beta D y la TNF2-7 que no comprende ningún segmento sustituido de las cadenas de la lámina D posterior, también son capaces de inducir anticuerpos inhibitorios, y la titulación del anticuerpo neutralizante con respecto a TNF2-7 aumentó significativamente durante las tres semanas siguientes (datos no presentados). Las TNF2-4 y TNF2-1, que comprenden las cadenas \beta G y B, respectivamente, de la lámina \beta posterior, no pudieron inducir anticuerpos neutralizantes en el ensayo
L929.

Los resultados obtenidos en relación con las proteínas TNF30 son más heterogéneos aunque la TNF30-3 aparentemente es la mejor en la semana 14. Las TNF30-1 y TNF30-4, que comprenden sustituciones en las cadenas \beta G y B de la lámina posterior, respectivamente, no inducen anticuerpos neutralizantes en el ensayo L929.

En el ensayo de enlace de receptores de fase sólida se inmoviliza el receptor 1 de TNF\alpha 55 kD humano recombinante (TNF-R55) en placas de microtitulación y se agrega TNF\alpha humano biotinilado, comercialmente disponible, en una dilución apropiada. Posteriormente, se detecta el enlace específico al receptor con estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano y un substrato cromogénico. Después de analizar los sueros provenientes de los conejos inmunizados, estos se agregan en la solución de TNF\alpha humano biotinilada antes de la adición de la mezcla en la placa de microtitulación recubierta con TNF-R55. Se analizan los sueros de los tres conejos de cada uno de los grupos y se calculan los valores promedios. Se utiliza el suero de un conejo no inmunizado como control negativo. Los valores básicos son muy bajos y el ensayo es extremadamente sensible. En la Fig. 9 se presentan los resultados obtenidos.

Puede observarse que los resultados obtenidos en el ensayo L929 y en el ensayo de enlace de receptores de fase sólida, respectivamente, son prácticamente idénticos en lo que se refiere a las construcciones de TNF\alpha 2. En el ensayo de fase sólida, la diferencia entre las TNF30-2, 30-3 y 30-5 no es tan pronunciada como se observa en el ensayo L929. No obstante, el ensayo de fase sólida tiene una mayor capacidad de reproducción debido a su naturaleza bioquímica más que celular y, en este ensayo, no se sustrajeron los valores de suero normales.

Se calculan las cantidades relativas de suero (en porcentaje) por las cuales se alcanza una inhibición de enlace de TNF\alpha máxima media (valores CI_{50}) para TNF2-3, TNF2-5, TNF2-7, TNF30-2, TNF30-3, TNF30-5 y WT-TNF\alpha, para cada uno de los antisueros correspondientes. Suponiendo que aparecería una forma curva similar para los antisueros cultivados contra las TNF2-1, TNF2-1, TNF30-1 y TNF30-4 se llevaron a cabo extrapolaciones y también se calcularon los valores CI_{50} para estos sueros. En la Tabla II se presentan los resultados obtenidos.

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TABLA II

Valores CI_{50} de sueros de TNF\alpha antihumano de conejos en el ensayo de fase solida
2 - 1	2 - 3	2 - 4	2 - 5	2 - 7	WT	30 - 1	30 - 2	30 - 3	30 - 4	30 - 5
>100%	2,02%	>100%	0,5%	1,38%	0,43%	>100%	0,82%	0,88%	>74%	1,69%

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Puede observarse que al TNF2-5 equivale al TNF\alpha de ratón de tipo silvestre (WT) en lo que se refiere a la capacidad para inducir anticuerpos de TNF\alpha anti-ratón neutralizantes en conejos. Las TNF2-1, TNF2-4, TNF30-1 y TNF30-4, las cuales comprenden sustituciones en la cadena B o g de la lámina P posterior pueden inducir en forma muy deficiente tales anticuerpos o no pueden hacerlo en absoluto. Asombrosamente, esto indica que aunque las cadenas \beta y G de la lámina \beta posterior no están implicadas en el enlace de receptores, las mutaciones representadas en esta área conducen de alguna manera a una disturbio en las regiones del TNF\alpha humano implicadas en el enlace de receptores. Las TNP30-2 y TNF30-3 parecen inducir anticuerpos neutralizantes con la misma eficacia.

Ejemplo 5 La capacidad de las moléculas de TNF\alpha modificadas para estimular las células T provenientes de donantes de sangre inmune P2 y P30 sanos

Dado que se espera que la localización de los epitopes P2 y P30 en las moléculas de TNF\alpha modificadas también pueden afectar el procesamiento y la presentación de de los epitopes insertados y -en consecuencia, su inmunogenicidad se analizan la totalidad de 10 moléculas, en diferentes ensayos para células T. Se utiliza un ensayo de Células Moleculares de Sangre Periférica policlonal (PBMC) y se establece un numero de líneas de células T P2 y P30 específicas usando métodos inmunológicos convencionales para evaluar péptidos de TNF\alpha y proteínas recombinantes con los epitopes P2 y P30 insertados.

En principio, se someten a prueba 28 voluntarios sanos (donantes) con un ensayo de proliferación de PBMC convencional para determinar su capacidad de respuesta a los TT y a los péptidos P2 y P30. En base a estos resultados, se seleccionan 19 individuos capaces de responder significativamente a los TT, así como también a los péptidos P2 y P30, con el objeto de llevar a cabo otros experimentos. Aunque los niveles de respuesta varían mucho, esto confirma claramente que P2 y P30 son epitopes de células T promiscuos, como así también, inmunodominantes.

Además de los 28 donantes, se seleccionan también otros siete donantes. Por razones que se explican más adelante, algunos de ellos se seleccionan por su capacidad para responder a P30 o a P2. Varios de ellos, además, se vacunan con TT con el fin de poder obtener una fuerte respuesta de las células T. También se usa a algunos individuos del segundo grupo de donantes para desarrollar líneas de células T específicas P2 o P30, con el objeto de estudiar la presentación antigénica de los péptidos de TNF\alpha sintéticos modificados P2 y P30, así como también las moléculas modificadas. En la Fig. 10 se presentan ejemplos representativos de la respuesta proliferante de PBMC policlonal en tres donantes hacia los TT y los péptidos P2 y P30.

Se somete a prueba la totalidad de las 10 proteínas recombinantes por triplicado en, al menos, 6 concentraciones diferentes partiendo de alrededor de 100 mg/ml, y se repiten todos los experimentos de PBMC entre 2 - 3 veces, para cada individuo. Se usa la incorporación intracelular de timidina 3H-marcada para evaluar la proliferación de células T y, los experimentos se cosechan y se cuentan en un formato de 96 cavidades. Se calculan los índices máximos de proliferación (IP) de cada curva de titulación como la relación entre el numero promedio de CPM en los pozos experimentales divididos por el numero promedio de CPM obtenido en los pozos libres de antígeno s (sólo PBS). Los datos sobre la proliferación de células T se realizan por triplicado y se usa con A, así como P2 y P30 como los controles negativo y positivo respectivamente. En la Fig. 11 se ilustran tres ejemplos de los experimentos realizados con dos donantes de sangre diferentes, usando las diversas moléculas de TNF\alpha modificadas por P2 y P30.

JH solamente responde a P2, mientras que SR responde tanto a P2 como a P30. Esto también se refleja en las respuestas de proliferación a las proteínas de TNF\alpha modificadas por P2 y P30 las cuales, en cierto grado, son capaces de estimular PBMC.

En la Fig. 12 se ilustran los Índices de Proliferación (PI) calculados a partir de los 34 experimentos. Si bien es muy difícil comparar cuantitativamente los PI entre los diferentes experimentos, debido a los antecedentes variados de PBS resulta claramente evidente que todas las construcciones son capaces, más o menos de suscitar una respuesta proliferante.

Entre el segundo grupo de donantes, se vacunan algunos individuos contra TT, entre 1 y 2 meses antes de los experimentos. Todos PI obtenidos a partir de estas personas (HB, MR, KG y MW) se encontraron entre los PI más altos observados para todas las construcciones de TNF\alpha modificadas y la evaluación de los datos fue sencilla. Se vacunan otros tres individuos (DL, ID y LS) con una anterioridad de más de 5 años y en todos ellos se observan valores de PI inferiores al valor promedio. Esto soporta el hecho de que los PI observados son específicas para antígenos. No había datos sobre la última vacunación de TT para el primer grupo de donantes, pero el estado de inmunización de los mismos es claramente muy variable.

No es posible seleccionar una proteína de TNF\alpha 2 o TNF\alpha 30 preferida tan sólo sobre la base del tamaño promedio de los valores PI. Esto puede deberse al estado de vacunación heterogénea del individuo utilizado y a la naturaleza variable de los ensayos de PBMC obtenidos a partir de los individuos con estado de respuesta variable. De todos modos, es sorprendente que P2 y P30, en todas las posiciones de inserción en TNF\alpha, parecen, aparentemente, ser procesadas y presentadas ante las células T. Para excluir la posibilidad de que -a pesar de la cromatografía por afinidad, repetida la filtración con gel y la diálisis- las preparaciones de antígeno todavía pueden contener concentraciones significativas de mitógenos no específicos, se realizan a cabo otros experimentos.

Se someten a prueba a los donantes del segundo grupo -que como sabe son, eran grupos no respondentes a P2 y respondentes con respecto a P30- así como también a los donantes con el patrón de respuesta opuesto, mediante los ensayos de PBMC. En la Fig. 13 se ilustra la respuesta a P2, P30 así como también a las proteínas TNF\alpha 2 y TNF\alpha 30 para DL e ID.

Puede observarse que se obtienen respuestas específicas a los respectivos epitopes de células T y las moléculas TNF\alpha modificadas, respectivamente. Sin embargo, no se observan respuestas de proliferación significativas de DL contra las proteínas TNF\alpha 30 (panel superior) como tampoco se observan respuestas de proliferación significativas de ID a las proteínas TNF\alpha 2 (panel inferior), lo que sustenta el hecho de que los mitógenos no específicos están ausentes en las preparaciones de TNF\alpha purificadas.

Se analiza aún más esta posibilidad mediante la utilización de líneas de células T P2 y P30 específicas aisladas del segundo grupo de donantes, las cuales han sido cultivadas durante por lo menos seis semanas en por lo menos tres rondas diferentes de estimulación con los respectivos péptidos P2 y P30 sintéticos. En la Fig. 14 se presentan los resultados obtenidos con estos dos experimentos.

Se puede apreciar que las líneas de células T específicas de P2 y P30 sólo son estimuladas por sus proteínas P2 y P30 correspondientes. Adicionalmente, nuevamente puede observarse que todas las construcciones de TNF\alpha son capaces de inducir la proliferación de células T, enfatizando que, aunque el procesamiento de antígeno s puede ser cuantitativamente importante para la presentación de p2 y P30, no parece ser un factor limitante cualitativo de importancia para la presentación de antígenos.

En la literatura se ha informado que las regiones flanqueadoras de los epitopes de células T pueden influir sobre el enlace de los péptidos antigénicos a las moléculas de MHC clase 11. Dado que ninguna de las posiciones en el TNF\alpha, que se seleccionan para la inserción de P2 ó P30, parecen ser prohibitivas para la presentación antigénica, se investiga si es posible que las diferentes secuencias de TNF\alpha de flanqueo de los epitopes insertados pueden influir sobre la respuesta de las células T a los epitopes P2 y P30 como resultado de la unión diferencial a las moléculas de HLA clase 11 humanas. Por lo tanto, se sintetizan los péptidos que se presentan en la Tabla 111, los cuales representan los epitopes insertados así como también los aminoácidos de TNF\alpha humanos de flanqueo. Estos son designados PP2-5, PP30-3, etc. Las secuencias de aminoácidos se presentan en el listado de secuencias como SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 42, a las que se designa como Pep2-1 a Pep30-5.

TABLA III

100

Estos péptidos son utilizados para la estimulación de líneas de células T específicas de P2 y P30. En la Fig. 15 se presentan los resultados de la estimulación de las líneas P30. Puede observarse que las líneas de células T específicas de P2 provenientes de MR y KG presentan patrones paralelos de estimulación cuando se les estimula con el péptido o con la proteína de TNF\alpha 2 correspondiente. Es evidente que la TNF2-5 es un antígeno potencial bueno y estos datos sustentan, además, el hecho de que las proliferaciones de células T observadas son específicas para antígenos. En general, no se observan diferencias cualitativas en el patrón de estimulación cuando se estimulan líneas de células T específicas de P30 provenientes de MR y KG con péptidos o proteínas (datos no indicados). La línea de células T específica de P30 proveniente de HC preferentemente reconoce la TNF30-3 y reacciona en un menor grado con la TNF30-2.

Conclusión

Se producen y caracterizan diez proteínas de TNF\alpha humano modificadas de maneras diferentes. Estas se construyeron para contener dos epitopes P2 y P30 de células T promiscuos muy conocidos para que fueran potencialmente inmunogénicos en por lo menos el 85% de las poblaciones.

Todas las proteínas pueden expresarse y purificarse aunque TNF2-4 y TNF30-4, a niveles muy bajos. Las mutaciones en esta posición en el TNF\alpha también parece interferir con el replegado, lo que resulta en proteínas con una escasa solubilidad. No puede detectarse actividad biológica del TNF\alpha en ninguna de las moléculas de TNF\alpha modificadas.

Se inmunizan conejos con las 10 proteínas y también con TNF\alpha nativo. Después de 2-3 meses desde la inmunización es posible detectar altas titulaciones de anticuerpos con una fuerte reactividad cruzada hacia el TNF\alpha no modificado humano, en todos los sueros.

La capacidad de estos anticuerpos para interferir con la actividad biológica del TNF\alpha nativo se analiza en dos ensayos in vitro diferentes el bioensayo L929 y un ensayo de enlace de receptores de fase sólida. En ambos ensayos se observa esencialmente lo mismo, que las TNF2-1, TNF2-4, TNF30-1 y TNF30-4 no pueden inducir anticuerpos neuturalizantes importantes, mientras que la TNF2-5 es superior en comparación con las otras construcciones. TNF30-2 y TNF30-3 resultaron igualmente eficientes en la inducción de anticuerpos neutralizantes y el doble de eficientes que TNF30-5, que es razonablemente bueno.

Casi con asombro, no se pueden observar diferencias significativas entre las aptitudes de las moléculas para estimular la proliferación de PBMC. Pudo demostrarse que esto no se debe a la presencia de mitógenos en las preparaciones de antígenos y, en base a estos datos, se llega a la conclusión que los lugares elegidos para P2 y P30 permiten, en su totalidad, la presentación de los respectivos epitopes. La especificidad de las respuestas se documenta aun más usando el análisis de proteínas de TNF\alpha modificadas, empleando líneas de células T específicas de epitope y también péptidos sintéticos que representan los epitopes insertados y las secuencias de TNF\alpha flanqueadoras. Con estos experimentos se demuestra que TNF2-5, TNF30-2 y TNF30-3 (entre otras construcciones) son los inmunógenos potenciales más poderosos.

(I) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Farmaceutisk Laboratorium Ferring A/S

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

DOMICILIO: Indertoften 10

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Vanloese

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PAÍS: Dinamarca

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

CODIGO POSTAL (ZIP): DK-2720

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Moléculas de TNF-alfa humano modificadas, ADN que las codifica y vacunas que contienen dicho TNF-alfa modificada o ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 42

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

PLANILLA DE LECTURA POR COMPUTADORA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADORA: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 477 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA DOBLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .477

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /inicio de codón = 1

\hskip6,63cm/función = "Antígeno"

\hskip6,63cm/producto "análogo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,63cm/gen= "tnfP2-1"

\hskip6,63cm/denominación estándar= "TNF2-1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEQ NO: 1:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 477 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA DOBLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FUENTE DE ORIGEN

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .477

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN: /inicio de codón = 1

\hskip6,63cm/función= "Antígeno "

\hskip6,63cm/producto = "análogo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/gen= "tnfP2-3"

\hskip6,63cm/denominación estándar = "TNF2-3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 477 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: dobles

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .477

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN: /inicio de codón = 1

\hskip6,63cm/función = "Antígeno "

\hskip6,63cm/producto = "análogo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/gen= "tnfP2-4"

\hskip6,63cm/denominación estándar = "TNF2-4"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 477 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: dobles

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .477

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN: /inicio de codón= 1

\hskip6,63cm/función= "Antígeno "

\hskip6,63cm/producto = "análogo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/gen= "tnfP2-5"

\hskip6,63cm/denominación estándar = "TNF2-5"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 477 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: dobles

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .477

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN: /inicio de codón = 1

\hskip6,63cm/función = "Antígeno"

\hskip6,63cm/producto = "análogo de TNF-alfa"

\hskip6,12cm/gen= "tnP2-7"

\hskip6,63cm/denominación estándar = "TNF2-7"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 477 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: dobles

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .477

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /inicio de codón= 1

\hskip6,63cm/función= "Antígeno "

\hskip6,63cm/producto= "análogo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/gen= "tnfP30-1"

\hskip6,63cm/denominación estándar= "TNF30-1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 477 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .477

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /inicio de codón= 1

\hskip6,63cm/función= "Antígeno "

\hskip6,63cm/producto= "análogo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/gen= "tnfP30-2"

\hskip6,63cm/denominación_estándar= "TNF30-2"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 13:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 477 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: dobles

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

ORIGEN TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .477

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN: /inicio de codón= 1

\hskip6,63cm/función= "Antígeno"

\hskip6,63cm/producto= "análogo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/gen= "tnfP30-3"

\hskip6,63cm/denominación estándar= "TNF30-3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 477 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: dobles

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: . .477

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN: /inicio de codón= 1

\hskip6,63cm/función= "Antígeno "

\hskip6,63cm/producto= "análogo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/gen= "tnfP30-4"

\hskip6,63cm/denominación estándar= "TNF30-4"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 477 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: Dobles

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: . .477

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN: /inicio de codón= 1

\hskip6,63cm/función= "Antígeno "

\hskip6,63cm/producto= "análogo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/gen= "tnfP30-S"

\hskip6,63cm/denominación estándar= "TNF30-S"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc-feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .24

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cebador para clonación de PCR del ADN que codifica {}\hskip3,7cm TNF-alfa"

\hskip6,75cm/producto= "Enlace de cebador al gen de TNF alfa"

\hskip6,75cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,75cm/denominación estándar= "Cebador i de TNF-alfa"

\hskip6,75cm/rótulo= Cebador 1 (Primer 1)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACAAGCCCA TGGTCAGATC ATCT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc-feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .30

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cebador para clonación de PCR del ADNA que codifica {}\hskip3,7cm TNF-alfa"

\hskip6,75cm/producto= "enlace de cebador al gen de TNF alfa"

\hskip6,75cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,75cm/denominación estándar= "Cebador 11 de TNF-alfa"

\hskip6,75cm/rótulo= Cebador 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTCTAGAGG GCAATGATCC CAAAGTAGAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: micc-feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: . .21

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cebador para clonación de PCR del ADN que codifica {}\hskip3,7cm TNF-alfa"

\hskip6,75cm/producto= "Enlace cebador al gen de TNF-alfa"

\hskip6,75cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,75cm/denominación estándar= "Cebador 111 de TNF alfa"

\hskip6,75cm/rótulo= Cebador 3 (Primer3)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAAGTAG ACCTGCCCAG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 69 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: insertion-seq

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 7. .51

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "cebador para clonación de PCR del ADN que codifica aná- {}\hskip3,55cm logo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,63cm/organismo= "Homo sapiens"

\hskip6,63cm/denominación estándar= ``Cebador "mut2-1"

\hskip6,63cm/rótulo= mut2-1

\hskip6,63cm/nota= "El Cebador ``mut2-1'' es un oligonucleótido sintéticamente sin- {}\hskip5,45cm tetizado 69-mer que comprende el ADN que codifica el epitope P2 de {}\hskip5,45cm células T humano entre extensiones de ADN homólogas a las extensio- {}\hskip5,45cm nes del gen de TNF-alfa-humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 73 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: insertion-seq

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 15. .59

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cebador para clonación de PCR del ADN que codifica {}\hskip3,67cm análogo de TNF-alfa"

\hskip6,75cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,75cm/organismo= "Homo sapiens"

\hskip6,75cm/denominación estándar= ``Cebador "mut2-3"

\hskip6,75cm/rótulo= mut2-3

\hskip6,75cm/nota= "El Cebador ``mut2-3'' es un oligonucleótido sintéticamente {}\hskip5,55cm sintetizado 69-mer que comprende el ADN que codifica el epitope P2 {}\hskip5,55cm de células T humano entre extensiones de ADN homólogas a las ex- {}\hskip5,55cm tensiones del gen de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 75 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: insertion-seq

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 12. .56

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cebador para clonación de PCR del ADN que codifica {}\hskip3,65cm análogo de TNF-alfa"

\hskip6,75cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,75cm/organismo = "Homo sapiens"

\hskip6,75cm/denominación estándar = ``Cebador "mut2-4"

\hskip6,75cm/rótulo= mut2-4

\hskip6,75cm/nota= "El Cebador ``mut2-4'' es un oligonucleótido sintéticamente {}\hskip5,55cm sintetizado 75-mer que comprende el ADN que codifica el epitope P2 {}\hskip5,55cm de células T humano entre extensiones de ADN homólogas a las ex- {}\hskip5,55cm tensiones del gen de TNF-alfa-humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 75 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: insertion_seq

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 8. .52

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función "Cebador para clonación de PCR del ADN que codifica aná- {}\hskip3,57cm logo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,63cm/ORGANISMO= "Homo sapiens"

\hskip6,63cm/denominación_estándar= "Cebador ``mut2-5''"

\hskip6,63cm/rótulo= mut2-5

\hskip6,63cm/nota= "El Cebador ``mut2-511'' es un oligonucleótido sintéticamente {}\hskip5,51cm sintetizado 75-mer que comprende el ADN que codifica el epitope P2 {}\hskip5,52cm de células T humano entre extensiones de ADN homólogas a las exten- {}\hskip5,52cm siones del gen de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 80 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: insertion_seq

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 14. .58

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cebador para clonación de PCR del ADN que codifica {}\hskip3,65cm análogo de TNF-alfa"

\hskip6,75cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,75cm/organismo= "Homo sapiens"

\hskip6,75cm/denominación estándar = ``Cebador "mut2-7"

\hskip6,75cm/rótulo= mut2-7

\hskip6,75cm/nota = "El Cebador "mut2-7" es un oligonucleótido sintéticamente {}\hskip5,55cm sintetizado 80-mer que comprende el ADN que codifica el epitope P2 {}\hskip5,55cm de células T humano entre extensiones de ADN homólogas a las ex- {}\hskip5,55cm tensiones del gen de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 28:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: insertion_seq

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 10. .72

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cebador para clonación de PCR del ADN que codifica {}\hskip3,65cm análogo de TNF-alfa"

\hskip6,75cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,75cm/organismo= "Homo sapiens"

\hskip6,75cm/denominación_estándar= "Cebador "mut30-1""

\hskip6,75cm/rótulo= mut30-1

\hskip6,75cm/nota= "El Cebador ``mut30-1'' es un oligonucleótido sintéticamente {}\hskip5,55cm sintetizado 96-mer que comprende el ADN que codifica el epitope P30 {}\hskip5,55cm de células T humano entre extensiones de ADN homólogas a las exten- {}\hskip5,55cm siones del gen de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 29:

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: insertion_seq

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 12. .74

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cebador para clonación de PCR del ADN que codifica {}\hskip3,65cm análogo de TNF-alfa"

\hskip6,75cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,75cm/organismo "Homo sapiens"

\hskip6,75cm/denominación_estándar= "Cebador ``mut30-2''"

\hskip6,75cm/rótulo= mut30-2

\hskip6,75cm/nota= "El Cebador "mut30-2" es un oligonucleótido sintéticamente {}\hskip5,55cm sintetizado 100-mer que comprende el ADN que codifica el epitope {}\hskip5,55cm P30 de células T humano entre extensiones de ADN homólogas a las {}\hskip5,56cm extensiones del gen de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: insertion_seq

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 12. .74

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función "Cebador para clonación de PCR del ADN que codifica aná- {}\hskip3,6cm logo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,63cm/ORGANISMO= "Homo sapiens"

\hskip6,63cm/denominación_estándar= ``Cebador "mut30-311"

\hskip6,63cm/rótulo= mut30-3

\hskip6,63cm/nota= "El Cebador ``mut30-3'' es un oligonucleótido sintéticamente {}\hskip5,46cm sintetizado 100-mer que comprende el ADN que codifica el epitope {}\hskip5,46cm P30 de células T humano entre extensiones de ADN homólogas a las {}\hskip5,46cm extensiones del gen de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: insertion_seq

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 15. .77

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "Cebador para clonación de PCR del ADN que codifica {}\hskip3,7cm análogo de TNF-alfa"

\hskip6,75cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,75cm/organismo= "Homo sapiens"

\hskip6,75cm/denominación_estándar= "Cebador ``mut30-4''"

\hskip6,75cm/rótulo= mut30-4

\hskip6,75cm/nota= "El Cebador ``mut30-4'' es un oligonucleótido sintéticamente {}\hskip5,54cm sintetizado 100-mer que comprende el ADN que codifica el epitope {}\hskip5,54cm P30 de células T humano entre extensiones de ADN homólogas a las {}\hskip5,54cm extensiones del gen de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simples

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENSORIAL: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: insertion_seq

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 14. .76

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función= "cebador para clonación de PCR del ADN que codifica aná- {}\hskip3,6cm logo de TNF-alfa"

\hskip6,63cm/evidencia= EXPERIMENTAL

\hskip6,63cm/organismo= "Homo sapiens"

\hskip6,63cm/denominación_estándar= "Cebador ``mut30-5''"

\hskip6,63cm/rótulo= mut30-5

\hskip6,63cm/nota= "El Cebador ``mut30-4'' es un oligonucleótido sintéticamente {}\hskip5,46cm sintetizado 100-mer que comprende el ADN que codifica el epitope {}\hskip5,46cm P30 de células T humano entre extensiones de ADN homólogas a las {}\hskip5,46cm extensiones del gen de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 33:

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SEC0ENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: . .25

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /rótulo= Pep2-1

\hskip6,63cm/nota= "Pep2-1 es una forma truncada preparada sintéticamente de un {}\hskip5,46cm análogo de TNF-alfa que comprende el epitope P2 de células T huma- {}\hskip5,46cm nas y porciones flanqueadoras de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Arg Thr Pro Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly}

\sac{Ile Thr Glu Leu Gln Leu Gln Trp Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .25

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /rótulo= Pep2-3

\hskip6,63cm/nota= "Pep2-3 es una forma truncada preparada sintéticamente de un {}\hskip5,46cm análogo de TNF-alfa que comprende el epitope P2 de células T huma- {}\hskip5,46cm nas y porciones flanqueadoras de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gln Val Leu Phe Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly}

\sac{Ile Thr Glu Leu Ile Ser Arg Ile Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .25

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /rótulo= Pep2-4

\hskip6,63cm/nota= "Pep2-4 es una forma truncada preparada sintéticamente de un {}\hskip5,46cm análogo de TNF-alfa que comprende el epitope P2 de células T huma- {}\hskip5,46cm nas y porciones flanqueadoras de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Ala Lys Pro Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly}

\sac{Ile Thr Glu Leu Gly Asp Arg Leu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .25

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /rótulo= Pep2-5

\hskip6,63cm/nota "Pep2-5 es una forma truncada preparada sintéticamente de un {}\hskip5,46cm análogo de TNF-alfa que comprende el epitope P2 de células T huma- {}\hskip5,46cm nas y porciones flanqueadoras de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Lys Gly Asp Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly}

\sac{Ile Thr Glu Leu Ser Gly Gln Val Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .31

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /rótulo= Pep30-1

\hskip6,63cm/nota= "Pep30-1 es una forma truncada preparada sintéticamente de un {}\hskip5,46cm análogo de TNF-alfa que comprende el epitope P30 de células T huma- {}\hskip5,46cm nas y porciones flanqueadoras de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Arg Thr Pro Ser Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg}

\sac{Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Arg Ala Asn Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .31

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /rótulo= Pep30-2

\hskip6,63cm/nota= "Pep30-2 es una forma truncada preparada sintéticamente de un {}\hskip5,46cm análogo de TNF-alfa que comprende el epitope P30 de células T huma- {}\hskip5,46cm nas y porciones flanqueadoras de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Leu Ala Asn Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg}

\sac{Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Glu Val Leu Phe Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .31

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /rótulo= Pep30-3

\hskip6,63cm/nota= "Pep30-3 es una forma truncada preparada sintéticamente de un {}\hskip5,46cm análogo de TNF-alfa que comprende el epitope P30 de células T huma- {}\hskip5,46cm nas y porciones flanqueadoras de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ser Gln Val Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg}

\sac{Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val Ser Tyr Glu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: . .31

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /rótulo= Pep30-4

\hskip6,63cm/nota "Pep30-4 es una forma truncada preparada sintéticamente de un {}\hskip5,46cm análogo de TNF-alfa que comprende el epitope P30 de células T huma- {}\hskip5,46cm nas y porciones flanqueadoras de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Arg Glu Thr Pro Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg}

\sac{Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE DE ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1. .31

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN

\hskip6,63cm/rótulo= Pep30-5

\hskip6,63cm/nota= "Pep30-5 es una forma truncada preparada sintéticamente de un {}\hskip5,46cm análogo de TNF-alfa que comprende el epitope P30 de células T huma- {}\hskip5,46cm nas y porciones flanqueadoras de TNF-alfa humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Lys Gly Asp Arg Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg}

\sac{Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ile Ile Ala Leu}

Claims (40)

1. Una molécula de TNF\alpha humano modificada capaz de producir anticuerpos neutralizantes hacia el TNF\alpha humano del tipo silvestre, luego de la administración de tal molécula de TNF\alpha modificada a un huésped humano, en la que por lo menos un segmento de la molécula de TNF\alpha humano ha sido sustituido por al menos un péptido conocido que contiene un epitope de células T inmuno-dominante, o una forma truncada de dicha molécula que contiene un epitope de células T inmuno dominante, y una o ambas regiones flanqueadoras de la molécula de TNF\alpha humano que comprende por lo menos un epitope de células B de TNF\alpha, en donde la sustitución se introduce en cualesquiera de las cadenas B', I o D de la lámina \beta posterior, en donde la sustitución se ha hecho en regiones de la molécula de TNF\alpha de manera que preserve la estructura de la lámina \beta de las cadenas B y G, y en donde la sustitución conduce a la inactivación de la actividad biológica de un TNF\alpha humano cuando se prueba en el bioensayo L929.

2. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sustitución no comprende ninguna cadena completa de la lámina \beta posterior.

3. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la sustitución comprende al menos un segmento de la cadena H de la lámina \beta posterior del bucle conector a la cadena I de la lámina \beta posterior, un segmento de las cadenas H e I y el bucle conector completo, un segmento de la cadena D de la lámina \beta posterior y al menos un segmento de la cadena E de la lámina \beta frontal y el bucle conector completo, las cadenas C’ y C completas de la lámina \beta frontal y un segmento de la cadena D de la lámina \beta posterior, o al menos un segmento de la cadena E de la lámina \beta frontal y uno o ambos de los bucles conectores.

4. La molécula de TNF\alpha modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la sustitución se ha realizado en las regiones de la molécula del TNF\alpha que comprende las cadenas de las láminas \beta frontales y/o los bucles conectores de manera que preserven esencialmente la estructura de la lámina \beta de cualesquiera de las cadenas de la lámina \beta posterior.

5. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la sustitución se ha realizado en las regiones de la molécula del TNF\alpha, que comprende un segmento de la cadena D de la lámina \beta posterior.

6. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 3, en conde la sustitución comprende al menos un segmento de la cadena H de la lámina \beta frontal del bucle conector a la cadena I, preferentemente los aminoácidos 132 a 146.

7. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la sustitución comprende segmentos de las cadenas H e I y la totalidad del bucle conector, preferentemente los aminoácidos 132 a 152.

8. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la sustitución comprende un segmento de la cadena D, por lo menos un segmento de la cadena E y la totalidad del bucle conector, preferentemente los aminoácidos 65 a 79 ó 64 a 84.

9. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la sustitución comprende la totalidad de las cadenas C' y C y un segmento de la cadena D, preferentemente los aminoácidos 40 a 60.

10. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la sustitución comprende por lo menos un segmento de la cadena E y de la lámina \beta frontal de uno o ambos bucles conectores, preferentemente los aminoácidos 76 a 90.

11. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los anticuerpos neutralizantes producidos contra dicha molécula de TNF\alpha modificada en un huésped adecuado es capaz de inhibir significativamente la actividad de TNF\alpha nativo en el bioensayo L929, y/o en donde dichos anticuerpos significativamente inhiben la unión del TNF\alpha humano de tipo silvestre al receptor 1 de TNF\alpha de 55 kD (TNF\alpha-R55) o al receptor TNF\alpha de 75 kD (TNF\alpha R-75).

12. La molécula TNF\alpha humano modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el epitope de células T insertado es promiscuo y, corno se sabe, es inmunogénico en una mayoría de tipos de clase II de HLA humano.

13. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el epitope se deriva del toxoide tetánico, preferentemente, el epitope P2 y/o P30.

14. El TNF\alpha modificado de acuerdo con la reivindicación 13, que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 8.

15. El TNF\alpha modificado de acuerdo con la reivindicación 13, que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 10.

16. La molécula de TNF\alpha modificada de acuerdo con la reivindicación 13, que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 4 ó SEQ ID NO: 16.

17. El TNF\alpha modificado de acuerdo con la reivindicación 13, que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 20.

18. El TNF\alpha modificado de acuerdo con la reivindicación 13, que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 14.

19. Dímeros, oligómeros o multiímeros de la molécula de TNF\alpha humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

20. Una molécula de ADN aislada que se codifica para una molécula de TNF\alpha modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

21. Un vector que comprende la molécula de ADN aislada de acuerdo con la reivindicación 20.

22. Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN aislada de acuerdo con la reivindicación 21, operativamente enlazado a una secuencia de control de expresión.

23. Una célula huésped que se transforma con el vector de expresión de la reivindicación 22.

24. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 23, que se selecciona de cepas de bacterias, levadura u otros hongos y líneas celulares de insectos, mamíferos ó aves.

25. Un procedimiento para producir una molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, que comprende cultivar las células huésped de la reivindicación 23 ó 24, en condiciones adecuadas que permiten la producción del TNF\alpha modificado y la recuperación del TNF\alpha modificado producido de este modo.

26. Una molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18 en forma de una proteína de fusión con una molécula adyuvante.

27. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 26, en donde la molécula adyuvante es un adyuvante inmunológicamente activo.

28. La molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con la reivindicación 26, en donde la molécula adyuvante es GM-SCF, HSP70 o interleuquina.

29. Una vacuna contra el TNF\alpha, que comprende una o más de las moléculas de TNF\alpha humano modificadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-20 y opcionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

30. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el adyuvante farmacéuticamente aceptable es fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, fosfato de calcio, dipéptido de muramilo o iscom.

31. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 29 ó 30 para la prevención o tratamiento de enfermedades promovidas por liberación o actividad del TNF\alpha, tales como enfermedades inflamatorias crónicas.

32. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 31, en donde las enfermedades inflamatorias crónicas son artritis reumatoide y enfermedades inflamatorias de los intestinos.

33. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 32, en donde las enfermedades inflamatorias de los intestinos son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa.

34. Una vacuna contra el TNF\alpha, que comprende ADN aislado que se codifica para la molécula de TNF\alpha humano modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 insertado en un vector de expresión adecuado.

35. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 34 que contiene una construcción que comprende una secuencia de ADN no infecciosa, no integradora que codifica una molécula de TNF\alpha modificada de acuerdo con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 18 operativamente enlazada con una secuencia promotora que puede controlar la expresión de dicha secuencia de ADN en seres humanos, en una cantidad suficiente como para que tenga lugar la absorción de la construcción y para que se produzca la expresión suficiente como para inducir una respuesta de los anticuerpos neutralizantes contra el TNF\alpha.

36. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 33 ó 34, que comprende un vector de expresión viral.

37. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el vector de expresión viral es un vector de expresión retroviral.

38. Una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29-37 para administración oral o parenteral.

39. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la vacuna es para administración subcutánea, intramuscular o intradérmica.

40. El uso de al menos una molécula de TNF\alpha modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, opcionalmente en combinación con un adyuvante adecuado o molécula vehículo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de inflamación crónica, cáncer, caquexia, esclerosis diseminada, diabetes, psoriasis, osteoporosis o asma.