ES2355711T3 - Superinmunógeno compuesto de cunal bifuncional tat-gp 160 para el tratamiento del sida. - Google Patents

Superinmunógeno compuesto de cunal bifuncional tat-gp 160 para el tratamiento del sida. Download PDF

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Abstract

Utilización de un superinmunógeno compuesto que comprende dos polipéptidos inmunógenos distintos acoplados entre sí por vía química y separados entre sí, en el seno de dicho superinmunógeno compuesto, por una cadena espaciadora, comprendiendo dicho superinmunógeno compuesto: - un primer polipéptido (a) inmunógeno que consiste en la proteína gp160 del virus VIH1, destoxicada o estabilizada si es necesario, un fragmento inmunógeno de gp160 o una proteína inmunógena que se deriva de los mismos; y - un segundo polipéptido (b) inmunógeno que consiste en la proteína Tat del virus VIH1, destoxicada o estabilizada si es necesario, un fragmento inmunógeno de Tat o una proteína inmunógena que se deriva de los mismos, para la obtención de un medicamento de acción antivírica para la prevención o el tratamiento del SIDA, que induce una inmunidad mucosal o sistémica simultáneamente contra la estructura antigénica patógena y la proteína circulante local del estroma.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la prevención y al tratamiento de patologías provocadas por la expresión tisular local de una estructura antigénica patógena, expresión asociada a un desajuste estromal de orden inmunitario o vascular que provoca una inmunotoxicidad o una neoangiogénesis, abarcando estas patologías algunas infecciones por 5 unos virus, algunos cánceres y las alergias.
Se refiere a la puesta a punto de nuevos medios terapéuticos preventivos o curativos, designados compuestos superinmunógenos compuestos, que inducen una reacción inmunitaria al mismo tiempo contra la estructura antigénica patógena y contra la proteína o proteínas que causan el desajuste tisular estromal asociado.
TÉCNICA ANTERIOR 10
Tras los primeros estudios experimentales de Louis Pasteur, se ha intentado, durante el siglo veinte, comprender los mecanismos de la inmunidad con el fin de preparar unas vacunas de especificidad y de eficacia siempre mayores. Las primeras vacunas utilizadas a gran escala han consistido en unos microbios vivos atenuados o en unas preparaciones inmunógenas asociadas a unas impurezas proteicas o membranarias de composición y de estructura mal caracterizadas que actúan como adyuvantes de la inmunidad. 15
Después, se han realizado unas vacunas preparadas a partir de antígenos purificados, tales como unas sub-unidades proteicas o unas proteínas toxoides, asociadas a unos adyuvantes de la inmunidad mejor definidos, más eficaces y desprovistos de toxicidad, esencialmente destinados a combatir y controlar unas enfermedades infecciosas mediante el cribado de la reacción inmunitaria contra el agente infeccioso causal.
Durante las dos últimas décadas, el éxito de las vacunaciones a gran escala, incluyendo mediante las técnicas 20 de ingeniería genética, así como una mejor comprensión de los mecanismos de la reacción inmunitaria, ha permitido que los investigadores extiendan el recurso a la vacunación con vistas a tratar unas enfermedades crónicas asociadas a unas estructuras biológicas (los microbios, células o partículas del medioambiente inertes o vivas) portadoras de antígenos extraños o también de antígenos anormalmente expresados, tal como en las patologías del SIDA, de los cánceres, de la alergia y de las enfermedades autoinmunes. 25
Para prevenir o tratar las patologías anteriores por medio de la vacunación, se ha buscado, de manera sistemática, inducir una reacción inmunitaria centrada en la estructura patógena, por ejemplo unas proteínas víricas expresadas selectivamente por las células infectadas por un virus, las proteínas expresadas selectivamente por las células cancerígenas o también las proteínas alérgenas, que son los agentes causales primarios de estas enfermedades. 30
A título ilustrativo, las vacunas candidatas preparadas actualmente con vistas a combatir la infección por los virus del SIDA, en particular por el virus VIH1, prevén la inducción de una reacción inmunitaria centrada exclusivamente contra ciertas proteínas o péptidos víricos.
Asimismo, las vacunas anti-cáncer objeto de los estudios clínicos más avanzados prevén inducir una reacción inmunitaria que se centra exclusivamente en la destrucción de las células que expresan unos antígenos asociados al 35 cáncer, tales como unas proteínas víricas en el caso de cánceres provocados por ciertos papilomavirus, o la destrucción de las células infectadas por un virus, tal como el VIH1 en la enfermedad del SIDA.
Según una misma estrategia vacunal, las vacunas anti-alérgicas actuales prevén exclusivamente inducir una reacción inmunitaria centrada en el alérgeno causal primario.
Los cánceres son unas proliferaciones de células que pueden dispersarse a continuación en el organismo para 40 formar unas metástasis. Es conocido que el sistema inmunitario de un individuo normal elimina regularmente las células cancerígenas nacientes, y que la formación de un cáncer está asociada (1) al escape del sistema de vigilancia inmunitario local y después, en un periodo avanzado del cáncer, a una inmunosupresión sistémica, y (2) a una proliferación de las células endoteliales vasculares que asegura la aportación nutritiva de las células tumorales, siendo esta proliferación de las células endoteliales designada neoangiogénesis. 45
El fenómeno de escape a las defensas inmunitarias celulares del hospedante mediante la inducción de su parálisis in situ es una estrategia utilizada por numerosos cánceres y es necesario para su supervivencia. Inicialmente, la inmunosupresión permanece localizada a nivel del tumor, puesto que el individuo es todavía capaz de defenderse contra las demás agresiones tales como unas infecciones.
Sin embargo, en un estado más tardío, esta inmunosupresión puede extenderse, generalizarse, así como lo 50 demuestra la diseminación de metástasis y la gran vulnerabilidad de la persona que padece cáncer frente a las infecciones. Esta inmunosupresión utiliza unos factores paralizantes que son producidos por las células cancerígenas o por las células de su entorno. La parálisis local de las células del sistema inmunitario, o inmunosupresión, representa por lo tanto un arma principal de las células cancerígenas que les permite escapar al sistema inmunitario del hospedante. Esta misma estrategia inmunosupresiva es utilizada asimismo por el agresor vírico, en algunas enfermedades 55 infeccionas, tal como el SIDA. Así, unas proteínas liberadas por las células infectadas por el VIH1 actúan como verdaderas toxinas sobre las células inmunitarias del entorno, las desajustan y las bloquean in situ, es decir de manera paracrina, las células del sistema inmunitario, que protegen las células infectadas, la replicación de los virus y su diseminación.
Investigaciones anteriores del solicitante, descritas en la solicitud internacional publicada con el nº WO 00/03732, han mostrado que, en el caso de la leucemia ATL, del cáncer del cuello uterino, y del sarcoma de Kaposi, respectivamente tres proteínas estaban implicadas en una inmunosupresión local a nivel de tumores o de células infectadas por el VIH1:
la proteína Tax del virus HTLV 1, 5
la proteína E7 del papilomavirus, y
la proteína Tat del virus VIH-1
El solicitante describió asimismo que algunas de estas proteínas inmunosupresivas, tales como la proteína Tat del VIH1 y la proteína E7 de HPV (cepas 16 y 18) tienen asimismo unos efectos activadores sobre las células endoteliales vasculares. 10
Propuso en consecuencia la puesta a punto de vacunas anti-cáncer o antivíricas que comprenden un compuesto inmunógeno derivado destoxicado de una proteína que procede de células cancerígenas, de células infectadas por un virus o de células inmunitarias estromales, inicialmente inmunosupresiva y/o angiogénica de acción local, tal como, por ejemplo, una proteína derivada de la proteína Tat del virus VIH1, la proteína Tax de un virus HTLV1, la proteína E7 de un papilomavirus o también una lectina manano-dependiente, en forma desactivada. 15
Según otro aspecto de una estrategia terapéutica potencial para luchar contra el SIDA, el cáncer y las alergias, basada en un principio parecido a las vacunas propuestas en la solicitud PCT nº WO 00/03732 anterior, ZAGURY D et al. (2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(14): 8024-8029), en un estudio bibliográfico, sugieren inducir una inmunidad anti-citoquina en los pacientes con el fin de contraatacar la producción anormal en estas patologías de ciertas citoquinas, en particular unas interleuquinas, linfoquinas, monoquinas, interferones que actúan fisiológicamente en los 20 tejidos, localmente como factor de proliferación, de diferenciación o de muerte programada celular.
Estos autores precisan que las estrategias de terapia vacunal han estado, hasta ahora, exclusivamente centradas en el agresor antigénico, ya sea un microorganismo, una célula o un alérgeno, pero no han intentado nunca combatir el desajuste de las citoquinas inducidas bajo el efecto del agresor. Estos autores proponen una vacunación anti-citoquina como auxiliar de una vacunación convencional cuyo objetivo sería neutralizar o bloquear los efectos 25 inmunotóxicos del estroma, y permitir el desarrollo normal de la reacción inmunitaria adaptada contra el agresor antigénico. Sin embargo, ZAGURY et al. (2001) no aportan ninguna demostración experimental concreta de manera que demuestren el beneficio que podría aportar la inducción de dicha respuesta inmunitaria para los pacientes infectados por un virus, los pacientes que padecen cáncer o también sujetos a unas reacciones alérgicas graves, por ejemplo sistémicas. 30
Existe una necesidad en el estado de la técnica de unos medios que permitan una terapia vacunal mejorada, al mismo tiempo más segura y más eficaz que las terapias vacunales actuales, con el fin de prevenir o tratar ciertos cánceres, infecciones víricas, en particular por los virus HTLV-1 o VIH1, o las alergias graves.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Un nuevo medio de terapia vacunal sistémica o mucosal contra el SIDA se proporciona en la invención en 35 forma de compuestos superinmunógenos compuestos de uso vacunal bifuncional que comprenden la proteína gp160 y Tat del virus VIH1 tal como se define en las reivindicaciones.
Se describe la utilización de un superinmunógeno compuesto bifuncional que comprende dos polipéptidos inmunógenos distintos físicamente unidos entre sí, consistiendo los dos polipéptidos respectivamente en:
(a) un primer polipéptido inmunógeno que induce una reacción inmunitaria celular, o una reacción inmunitaria 40 celular y humoral, contra una estructura antigénica patógena celular, microbiana o particulada inerte o viva;
(b) un segundo polipéptido inmunógeno que induce la producción de anticuerpos neutralizantes o bloqueantes contra una proteína circulante local del estroma seleccionada de entre un factor citoquínico o un factor de regulación celular con propiedades inmunotóxicas o angiogénicas, pudiendo ser este factor o bien producido por las células cancerígenas, las células infectadas por un virus o las células estromales, incluyendo los 45 linfocitos T y las células que presentan el antígeno (APC), o bien inducido por unas estructuras particuladas patógenas, en particular alergénicas,
para la obtención de un medicamento de acción anti-cancerígena, antivírica o antialérgica que induce una inmunidad mucosal o sistémica simultáneamente contra la estructura antigénica patógena y la proteína circulante local del estroma. 50
Según un primer aspecto, el polipéptido (a) induce una reacción inmunitaria celular, y eventualmente también una reacción inmunitaria humoral, contra un antígeno expresado específicamente por las células cancerígenas, las células infectadas por un virus o un antígeno constitutivo de las estructuras particuladas, incluyendo las estructuras particuladas vivas, tales como el polen, los ácaros y algunos parásitos tales como los Leishmania major, y las estructuras particuladas inertes, tal como el polvo, o los pelos de gato. 55
El primer polipéptido (a) inmunógeno se selecciona de entre (i) una proteína inmunógena selectivamente expresada por las células cancerígenas, selectivamente expresada por las células infectadas por un virus o constitutiva de una estructura patógena alérgena, llegado el caso destoxicada, y (ii) una proteína derivada de la proteína (i).
Según un segundo aspecto, el polipéptido (b) induce una reacción humoral contra la proteína circulante liberada localmente en el estroma tisular de manera anormal.
Según este aspecto, el polipéptido (b) inmunógeno se selecciona de entre (i) la proteína circulante local del estroma, llegado el caso destoxicada, y (ii) una proteína derivada de la proteína (i).
Se precisará que ciertas proteínas con propiedades inmunotóxicas o angiogénicas, que son constitutitas de 5 estructuras patógenas celulares y que son liberadas en el estroma, pueden ser utilizadas como polipéptido (a) o polipéptido (b) de un superinmunógeno compuesto. Es el caso para la proteína Tat del VIH, de la proteína E7 del HPV o también del factor de regulación celular p53.
Se utilizan preferentemente los compuestos superinmunógenos siguientes:
a) Vacunación antivírica 10
- el superinmunógeno compuesto (a) gp160 - (b) Tat toxoide del VIH1;
- el superinmunógeno compuesto (b) péptido Tat [1-15; 46-60] - (a) gp160 del VIH1;
- el superinmunógeno compuesto (a) Tat toxoide del VIH1 - (b) IFNα;
- el superinmunógeno compuesto (a) Tat toxoide - (b) péptido Tat [1-15; 46-60] del VIH
b) Vacunación anticáncer 15
- el superinmunógeno compuesto (a) L1 - (b) E7 del HPV;
- el superinmunógeno compuesto (a) E7 del HPV - (b) VEGF;
c) Vacunación anti-alérgeno:
- el superinmunógeno compuesto (a) Betv1a - (b) IL heterólogo
Los polipéptidos (a) y (b) están unidos físicamente entre sí porque están, en todos los casos, presentados 20 conjuntamente a las células del sistema inmunitario sobre un soporte único. Los polipéptidos (a) y (b) pueden estar unidos de manera covalente en la misma estructura molecular.
Los polipéptidos (a) y (b) pueden asimismo ser incluidos ambos en el seno de una misma estructura física por ejemplo sobre unas monopartículas que tienen un diámetro comprendido entre 10 y 500 nanómetros, preferentemente 10 y 1.000 nanómetros, y de manera completamente preferida entre 10 y 100 nanómetros, por ejemplo unas 25 nanopartículas de IMS, tal como se describe por ejemplo por Aucouturier et al. (2001), quitosano, tal como se describe por ejemplo por Sjaugrud et al. (1999), liposomas, o partículas biodegradables tal como el ácido poliláctido (PLA), la poli--caprolactona (PCL) o la poli(lactido-coglicolida) (PLG) descrita por Baras et al. (1999).
Según un primer aspecto, la utilización se caracteriza porque los polipéptidos (a) y (b) están unidos directamente entre sí de manera covalente. 30
Según un segundo aspecto, la utilización se caracteriza porque los polipéptidos (a) y (b) están separados entre sí, en el seno del superinmunógeno peptídico, por una cadena espaciadora. La cadena espaciadora puede consistir en particular en un péptido espaciador lineal, un péptido espaciador ramificado, o también un compuesto espaciador bifuncional tal como el SMCC o el SIAB.
Según un tercer aspecto, los polipéptidos (a) y (b) están inmovilizados sobre unas nanopartículas o intercalados 35 en unas micropartículas o en unas nanopartículas. Preferentemente, el polipéptido (a) y el polipéptido (b) están inmovilizados ambos en la misma nanopartícula, o intercalados en la misma nanopartícula.
Asimismo, se describe un conjugado peptídico inmunógeno que comprende dos polipéptidos distintos unidos físicamente entre sí, consistiendo los dos polipéptidos respectivamente en los polipéptidos (a) y (b) definidos anteriormente. 40
La descripción se refiere asimismo a un ácido nucleico que codifica un compuesto superinmunógeno compuesto tal como se ha definido anteriormente, así como a un casete de expresión y a un vector recombinante que comprende dicho ácido nucleico, así como a la utilización de este ácido nucleico, de este casete de expresión o este vector recombinante para la obtención de un medicamento de acción anticancerígena, antivírica o anti-alérgica.
Se refiere asimismo a una composición inmunógena que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de 45 un compuesto inmunógeno tal como se ha definido anteriormente, en asociación con uno o varios excipientes, incluyendo unos adyuvantes de inmunidad, fisiológicamente compatibles.
Según los objetivos pretendidos, se utilizan unos adyuvantes sistémicos o unos adyuvantes mucosales. Por ejemplo, se utiliza preferentemente un adyuvante mucosal para prevenir los cánceres de los tejidos epiteliales y se utilizan preferentemente unos adyuvantes sistémicos para prevenir o tratar las infecciones por unos virus, tales como 50 VIH1 y HPTL1, o también para prevenir o tratar las alergias.
Entre los adyuvantes sistémicos, se utilizan preferentemente los adyuvantes de tipo IFA (Adyuvante incompleto de Freund), el fosfato de calcio o el hidróxido de alúmina.
Entre los adyuvantes mucosales, se utilizan preferentemente unos adyuvantes tales como la coleratoxina B
(CTB) o un mutante de la toxina lábil de Escherichia coli LT (LTµ).
Se refiere asimismo a una vacuna, mucosal o sistémica, caracterizada porque comprende, a título de principio activo, un compuesto inmunógeno tal como se ha definido anteriormente, en asociación con uno o varios excipientes, incluyendo unos adyuvantes de inmunidad, fisiológicamente compatibles.
La descripción tiene asimismo por objeto una composición inmunógena y una vacuna con objetivo mucosal o 5 sistémico, caracterizadas porque comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico, de un casete de expresión o de un vector recombinante tales como se han definido anteriormente.
DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA ÚNICA
La figura 1 es un esquema general de la estrategia vacunal realizada gracias a los compuestos superinmunógenos compuestos. 10
La flecha representada en el lado izquierdo de la figura 1 designa la naturaleza de las estructuras apuntadas por las preparaciones vacunales convencionales anticáncer, antivíricas y antialérgicas, es decir las estructuras antigénicas patógenas que representan los agentes causales primarios del desarrollo de la patología, tales como las células cancerígenas, las células infectadas por el VIH o los antígenos alérgenos de los pólenes.
La doble flecha representada en el lado derecho de la figura 1 designa la naturaleza de las estructuras 15 apuntadas por las preparaciones vacunales según la invención, que son de dos tipos:
a) las estructuras antigénicas patógenas detalladas anteriormente; y
b) los factores proteicos que circulan en el micro-entorno estromal responsables del desajuste estromal tisular de orden inmunitario y vascular observado en algunos cánceres, infecciones víricas y alergias graves.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 20
El solicitante ha descubierto que la inmunosupresión y la angiogénesis del micro-entorno de las células infectadas por ciertos virus tales como el VIH1 y del micro-entorno de las células cancerígenas aportan una explicación racional a la ausencia de eficacia de las estrategias vacunales del estado de la técnica, que tienen por diana exclusivamente la célula cancerígena y no el desajuste de su micro-entorno.
Las investigaciones del solicitante han mostrado que unos factores solubles segregados por las células 25 infectadas por el VIH-1, en particular la proteína Tat o por las células inmunitarias de pacientes infectados por el VIH, en particular el IFN-α y el TGF-β, o producido por unas células cancerígenas, tales como la proteína E7 del HPV en el cáncer del cuello uterino o la proteína Tax del HTLV1 en las leucemias ATL, tenían unas propiedades inmunosupresivas susceptibles de inhibir las reacciones inmunitarias celulares en el seno de los tejidos infectados o de los tumores y explicar así una ausencia de eficacia de las vacunas convencionales, que utilizan exclusivamente unos inmunógenos 30 contenidos por unas estructuras antigénicas patógenas, tales como las células cancerígenas, o las células infectadas por el VIH.
El estudio bibliográfico ha permitido apoyar las observaciones del solicitante, confirmando la presencia de factores inmunosupresivos liberados en el medio extracelular de tumores malignos.
Algunos de estos factores, todavía no identificados, han sido producidos por: 35
- unas células de cáncer colorrectal (Ebert EC, Roberts Al, O'Connell SM, Robertson FM, Nagase H. Characterization of an immunosuppressive factor dérived from colon cancer cells. J. Immunol. (1987) 138.2161-8 o Remacle-Bonn y MM, Pommier FJ, Kaplanski S, Rance RJ, Depieds RC. Inhibition of normal allogenic lymphocyte mitogenesis by a soluble inhibitor extracted from human colonic carcinoma J. Immunol. (1976) 117:1145-51, 40
- unas células de glioblastoma (29-Fontana A, Hengartner H, de Tribolet N, Weber E. Glioblastoma cells release interleukin 1 and factors inhibiting interleukin 2-mediated effects. J. Immunol. (1984) 132:1837-44),
- unos melanomas (30.Hersey P. Bindon, Czemiecki M, spurting A, Wass J, McCarthy WH. Inhibition of interleukin 2 production by factors released from tumor cells J. Immunol. (1983) 131:2837-42), o
- unos ascitos malignos (Tamura K, Shibata Y, Matsuda Y, Ishida N. Isolation and characterization of an 45 immunosuppressive acidid protein from ascitic fluids of cancer patients. Cancer Res. (1981) 41:3244-52, Oh SK, Moolten FL. Non specific immunosuppressive factors in malignant ascites: further characterization and possible relationship to erythrocyte receptors of human peripheral Moolten FL. Non specific immunosuppressive factors in malignant ascites: further characterisation and possible relationship to erythrocyte receptors of human peripheral T cells. J. Immunol (1981) 127:2300-7). 50
Otros factores de regulación transcripcional, tal como se ha indicado anteriormente, son de origen celular tal como la proteína p53, acumulada en ciertos tumores malignos, en particular colorrectal (Remvikos Y. Tominaga 0, Hammel P, Laurent-Puig P, Salmon RJ, Dutrillaux B, Thomas G. Increased p53 protein content of colorectal tumours correlates with poor survival. Br J Cancer 1992 66:758-64, Gan H, Ouyang Q, Wang Y. Expression of p53 protein in colorectal cancer and its relationship to cell proliferative activity and prognosis. Chung Hua Chung Liu Tsa Chih (1996). 55 La proteína p53 liberada mediante transporte activo por unas vías de secreción que no utilizan la señal peptídica o mediante difusión pasiva está presente en el medio extracelular, y ha sido aislada mediante cromatografía sobre fibra de
vidrio a partir de suero de personas que padecen cáncer (Zusman I, Sandler B, Gurevich P, zusman R, Smimoff P, Tendler Y, Bass D, Shani A, Idelevich E, Pfefferman R, Davidovich B, Huszar M, Glick J. Comparative study of the role of serum levels of p53 antigen and its tumor cell concentration in colon cancer detection. Hum Antibodies Hybridomas. (1996): 123-8, Sandler B, Smimoff P, Tendelr Y, Zinder 0, Zusman R, Zusman I. Specificity of polyclonal anti-p53 IgG for isolation of the soluble p53 antigen from human serum. Int J. Mol. Med. 1998 1:767-70). 5
Unas citoquinas, tales como el TGFβ, notablemente inmunosupresivo, el VEGF factor de crecimiento angiogénico, la IL-6 pro-inflamatoria o la IL-10 asimismo inmunosupresiva, son anormalmente segregados y liberados en el medio extracelular de ciertas células cancerígenas. El solicitante ha demostrado que las células de línea cancerigena SIHA, así como las células DU145 del cáncer de la próstata y las células MT2 de líneas leucémicas producen anormalmente y liberan en el medio extracelular unas citoquinas tales como el VEGF y/o la IL-6 mientras que las células 10 RAJI de líneas leucémicas segregan en el medio extracelular IL-10.
Se ha demostrado ya, para la prevención o el tratamiento de algunos cánceres, que algunas infecciones víricas y alergias, en particular las alergias graves que comprenden un riesgo de choque anafiláctico, era esencial inducir una reacción inmunitaria simultáneamente:
a) contra una estructura antigénica patógena, celular, microbiana o particulada, que constituye el agente causal 15 primario de la enfermedad; y
b) contra una proteína circulante local del estroma responsable del desajuste estromal tisular de orden inmunitario o vascular asociado a la enfermedad.
Se muestra que la reacción inmunitaria definida anteriormente puede ser inducida según la invención, a alto nivel de simulación de las células del sistema inmunitario, gracias a una familia de compuestos designados 20 superinmunógenos compuestos, que son bifuncionales, que comprenden, en forma físicamente unida entre sí, un primer polipéptido que induce una reacción inmunitaria contra la estructura antigénica patógena y un segundo polipéptido que induce una reacción inmunitaria contra la proteína circulante local del estroma.
Por el término "estromal" se entienden, para un tejido dado, los espacios intercelulares que constituyen el micro-entorno de las células especializadas de un tejido. En el tejido hepático, el estroma que rodea los cordones de las 25 células hepáticas especializadas contiene un medio nutritivo, también denominado linfa, que alberga al mismo tiempo unas células inmunitarias (linfocitos T y B, células que presentan el antígeno o APC), unos polinucleares, unos mastocitos, unos fibroblastos y unos vasos capilares cubiertos de células endoteliales. En los tejidos epiteliales mucosos o cutáneos, el estroma sub-epitelial, denominado dermis, también está formado por espacios intercelulares que se unen al tejido conjuntivo que constituye su matriz y en los que circulan también las células del sistema inmunitario y los vasos 30 capilares citados anteriormente.
Para prevenir o tratar algunos cánceres, los superinmunógenos compuestos inducen simultáneamente:
a) una reacción inmunitaria de tipo celular, mediante la activación de células T auxiliares (células "T helper" o "Th") y/o producción de células T citotóxicas (CTL) específicas de la estructura antigénica patógena expresada por las células cancerígenas, por ejemplo los antígenos de tumores TAA o TSA, o también la producción de 35 células asesinas "natural killer" o "NK" que permiten asesinar selectivamente dichas células cancerígenas; y
b) una reacción inmunitaria humoral, mediante la inducción de la producción de anticuerpos neutralizantes o bloqueantes específicos de una proteína circulante local del estroma anormalmente producida, principalmente una proteína con propiedades inmunotóxicas o con propiedades angiogénicas.
Para prevenir o tratar algunas infecciones víricas, llegado el caso asociadas al desarrollo de cánceres, los 40 superinmunógenos compuestos inducen simultáneamente:
a) una reacción inmunitaria de tipo celular, mediante la activación de células T auxiliares y/o mediante la inducción de la producción de células T citotóxicas (CTL) específicas de la estructura antigénica patógena vírica expresada por las células infectadas por un virus, tales como algunas proteínas de VIH1 o del papilomavirus, o también la producción de células asesinas "natural killer" o "NK" que permiten asesinar selectivamente dichas 45 células infectadas por el virus; y
b) una reacción inmunitaria humoral, mediante la inducción de la producción de anticuerpos neutralizantes o bloqueantes específicos de una proteína circulante local del estroma anormalmente producida, incluyendo una proteína circulante vírica o una citoquina, principalmente una proteína con propiedades inmunosupresivas o apoptógenas (inmunotóxicas) o con propiedades angiogénicas. 50
Además, el solicitante ha cotejado los datos que se refieren a la observación de una inmunotoxicidad en el caso de infecciones por el virus VIH1 o el virus HTLV1 con las observaciones de desviaciones de reacciones inmunitarias inducidas por la producción anormal del facto citoquínico IL4 durante inmunizaciones dirigidas contra unas estructuras particuladas del polen, de ácaros o parasitarias, tales como el Leshmania major que han sido descritas por Sadick et al. (1990, J. Exp. Med., 171: 115-127). 55
Para prevenir o tratar las alergias, sobretodo las alergias graves, los superinmunógenos compuestos inducen simultáneamente:
a) una reacción inmunitaria celular mediante la activación de células T auxiliares y una reacción inmunitaria
humoral, mediante la inducción de anticuerpos específicos de la estructura antigénica patógena alérgena constitutiva de la partícula alergénica,
b) una reacción inmunitaria humoral, mediante la inducción de la producción de anticuerpos neutralizantes o bloqueantes específicos de una proteína circulante local del estroma anormalmente producida, principalmente el factor citoquínico IL4 sintetizado en particular por los linfocitos T de tipo Th2. La sobreproducción de IL4, que 5 es un co-estímulo de la producción de IgE por los linfocitos B, es asimismo inmunotóxica porque induce unas respuestas inmunitarias patógenas, de tipo inflamatorio alérgico.
La descripción tiene por objeto la utilización de un superinmunógeno compuesto que comprende dos polipéptidos inmunógenos distintos físicamente unidos entre sí, consistiendo los dos polipéptidos respectivamente en:
(a) un primer polipéptido inmunógeno que induce una reacción inmunitaria celular, o una reacción inmunitaria 10 celular y humoral, contra una estructura antigénica patógena celular, microbiana o particulada inerte o viva;
(b) un segundo polipéptido inmunógeno que induce la producción de anticuerpos neutralizantes o bloqueantes contra una proteína circulante local del estroma seleccionada de entre un factor citoquínico o un factor de regulación celular con propiedades inmunotóxicas o angiogénicas, pudiendo ser este factor o bien producido por las células cancerígenas, las células infectadas por un virus o las células estromales, incluyendo los 15 linfocitos T y las células que presentan el antígeno (APC), o bien inducido por unas estructuras particuladas patógenas, en particular alergénicas,
El superinmunógeno compuesto utilizado se denomina "bifuncional" porque los dos polipéptidos (a) y (b), que son las dos partes esenciales que lo constituyen, permiten la inducción simultánea de una reacción inmunitaria dirigida contra dos dianas distintas, respectivamente la estructura antigénica patógena y la proteína circulante local del estroma. 20 Sin embargo, un superinmunógeno compuesto bifuncional puede comprender en su estructura una pluralidad de copias respectivamente de un polipéptido (a) y/o de un polipéptido (b).
El polipéptido (a) y el polipéptido (b) constitutivos de un compuesto superinmunógeno compuesto se denominan "físicamente unidos" entre sí puesto que están en todos los casos incluidos ambos en una misma estructura física, molécula o partícula (micropartícula o nanopartícula), en el seno de la cual están poco distantes entre sí. Debido a que 25 están físicamente unidos entre sí en el superinmunógeno compuesto, el polipéptido (a) y el polipéptido (b) son presentados conjuntamente a las mismas células inmunocompetentes, tanto a los macrófagos como a los linfocitos T o B.
Por el término reacción inmunitaria "celular", se entiende una activación:
- o bien de los linfocitos T auxiliares (Th) que poseen un receptor que reconoce específicamente el polipéptido 30 (a) o el polipéptido (b) en asociación con un antígeno de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MCH);
- o bien de los linfocitos T citotóxicos (CTL) que poseen un receptor al antígeno que reconoce específicamente el polipéptido (a) en asociación con un antígeno de clase I del MHC, y eventualmente de células NK.
La reacción celular podrá medirse in vitro en el ratón mediante la producción de quimioquinas (MIP1α y MIP1β) 35 por los esplenocitos y por la proliferación de estos esplenocitos activados en presencia de estos inmunógenos, o también mediante el aumento de la producción de IFNγ por estas células, ilustrando la actividad T citotóxica.
Por el término inmunitario "humoral" se entiende la producción de anticuerpos específicamente contra el polipéptido (a) o el polipéptido (b) constitutivos del superinmunógeno compuesto.
Mediante la expresión "estructura antigénica patógena celular, microbiana o particulada" se entiende: 40
- o bien una célula cancerígena que expresa selectivamente un antígeno, que puede ser designado "antígeno de tumores", y que puede ser asesinada por una reacción inmunitaria celular, y preferentemente por unas células citotóxicas (CTL) que reconocen específicamente el antígeno contenido selectivamente por esta célula cancerígena, o que puede ser asesinada por unas células NK activadas;
- o bien una célula infectada por un virus que expresa selectivamente un antígeno vírico, y que puede ser 45 asesinada por una reacción inmunitaria celular, y preferentemente por unas células citotóxicas (CTL) que reconocen específicamente el antígeno expresado selectivamente por esta célula infectada, o que puede ser asesinada por unas células NK activadas;
- o bien una partícula alergénica que comprende un antígeno alérgeno que puede ser bloqueado o desactivado mediante un anticuerpo dirigido específicamente contra este antígeno alérgeno, siendo dicho anticuerpo 50 producido durante una reacción inmunitaria humoral. Las partículas alergénicas abarcan las partículas alergénicas vivas, tales como los pólenes o los parásitos tales como los ácaros o los Leishmania major, y las partículas alergénicas inertes, tales como las partículas de polvo o los pelos de gato.
Las proteínas "con propiedades inmunotóxicas" anormalmente liberadas en el estroma engloban:
- las proteínas con propiedades inmunosupresivas, tales como la proteína Tat de VIH1, la proteína E7 del 55 papilomavirus, el interferón alfa (IFNα), el TGFβ o la IL10, la proteína p53 en su forma circulante o también la citoquina apoptógena Fas Ligand (FasL);
- las proteínas que desvían la reacción inmunitaria hacia una acción deletérea, tal como el factor citoquínico IL4 que estimula la producción de anticuerpos de isotipo IgE, responsables en particular de la liberación de histamina por los mastocitos, que pueden provocar una acción deletérea inflamatoria fuerte, incluso mortal para el organismo, en forma de un choque anafiláctico.
Las proteínas "con propiedades angiogénicas" son las proteínas que inducen la multiplicación de las células 5 endoteliales, tales como el factor citoquínico VEGF. En el caso de tumores de células cancerígenas, la liberación de las proteínas con propiedades angiogénicas, localmente, en el estroma del entorno del tumor, induce una proliferación de las células endoteliales vasculares durante un evento denominado "neoangiogénesis" que permitirá una vascularización del tumor necesaria para su supervivencia, en particular mediante la aportación de los elementos nutritivos requeridos para la viabilidad y la multiplicación de las células cancerígenas constitutivas del tumor. 10
Mediante inmunidad "mucosal" se entiende la inducción de una reacción inmunitaria humoral que llega a la producción principalmente de anticuerpos de isotipo IgA producidos por los linfocitos B localizados a nivel de los tejidos epiteliales, denominados anticuerpos IgA segregadores (s-IgA) y de una reacción inmunitaria celular en el sendo de los ganglios que drenan las mucosas (ganglios mesentéricos para los intestinos, ganglios iliacos para la vagina).
Por el término inmunidad "sistémica" se entiende la inducción de una reacción humoral que llega a la 15 producción principalmente de anticuerpos de isotipo IgG, que circulan de manera sistémica, en particular por la vía sérica y de una reacción inmunitaria celular en el seno de los ganglios periféricos o del bazo.
Se ha demostrado que, para una diversidad de compuestos superinmunógenos compuestos tales como se han definido anteriormente, el nivel de respuesta inmunitaria obtenido in vivo es muy superior a la respuesta inmunitaria observada después de la administración de cada uno de los polipéptidos (a) y (b), no unidos físicamente entre sí. 20
Sin pretender estar vinculados a cualquier teoría, los inventores creen que el polipéptido (a) aporta, en el seno del superinmunógeno compuesto, unos epítopos T auxiliares que estimularán un efecto "helper" y así activarán o aumentarán la activación de la reacción inmunitaria humoral contra el polipéptido (b). Esta acción auxiliar del polipéptido (a) inmunógeno es particularmente necesaria para inducir la producción de anticuerpos dirigidos contra el polipéptido (b), cuando el polipéptido (b) es un factor citoquínico autólogo, como por ejemplo la IL4 humana en un superinmunógeno 25 compuesto destinado a la administración en el ser humano.
Se ha demostrado que la producción de anticuerpos de tipo IgG dirigidos contra la proteína Tat nativa es dos veces más importante cuando el conjugado peptídico gp160-Tat desactivado (toxoide) se administra in vivo que como respuesta a la administración de la proteína Tat desactivada (toxoide) en forma libre. Además, los anticuerpos cuya producción está inducida por el superinmunógeno compuesto gp160-Tat (toxoide) permiten neutralizar el 100% de la 30 actividad de la proteína Tat nativa, mientras que una neutralización máxima de 75% de la actividad de la proteína Tat nativa se observa con los anticuerpos producidos después de la administración de la proteína Tat (toxoide) en forma libre.
Asimismo, los resultados de los ejemplos muestran que los esplenocitos de animales inmunizados con el superinmunógeno compuesto gp160-Tat (toxoide) producen un nivel más elevado de quimioquinas MIP1α y MIP1β que 35 las células de los animales inmunizados por el Tat (toxoide), lo cual muestra que una estimulación óptima de las células inmunitarias se obtiene con un superinmunógeno compuesto de acuerdo con la invención.
Los esplenocitos de animales inmunizados con el superinmunógeno compuesto gp160-Tat (toxoide) producen asimismo una cantidad importante de interferón-γ cuando están activados, in vivo por la proteína Tat nativa.
Se han obtenido unos resultados similares con otros superinmunógenos compuestos de acuerdo con la 40 invención, tales como el conjugado E7-SIAB-VEGF o también el conjugado Betv1a-IL4.
Así, la utilización de un superinmunógeno compuesto tal como se ha definido anteriormente puede, por lo menos en algunos casos, potenciar el efecto terapéutico que sería observado mediante la utilización separada de cada uno de los polipéptidos (a) y (b) o también mediante la utilización de una asociación de los polipéptidos (a) y (b) no físicamente unidos entre sí, por lo menos por dos razones: 45
(i) la inducción de una respuesta inmunitaria eficaz, de tipo celular o humoral según el caso, contra un antígeno expresado por las células tumorales o de un antígeno expresado por las células infectadas por un virus, debido a la reducción o al bloqueo simultáneo de una inmunosupresión, de una apoptosis de las células inmunitarias o de una proliferación de las células endoteliales vasculares, o también la inducción de una respuesta inmunitaria eficaz y no deletérea contra un alérgeno, debido a la reducción o al bloqueo de la conmutación isotípica hacia la 50 producción de anticuerpos IgE inducida por IL4;
(ii) en numerosos casos, la observación de una potenciación de la respuesta inmunitaria contra uno de los péptidos inmunógenos presente en el conjugado peptídico, debido a la presentación conjunta del segundo polipéptido inmunógeno, portador de nuevos sitios auxiliares, a las células de sistema inmunitario, tal como se ha observado, por ejemplo, en el caso del superinmunógeno compuesto gp160-Tat (toxoide). 55
Superinmunógenos compuestos utilizados para el tratamiento de algunos cánceres y de algunas infecciones víricas
Según una primera característica esencial de un superinmunógeno compuesto, el primer polipéptido (a) inmunógeno se selecciona de entre (i) una proteína inmunógena selectivamente expresada por unas células
cancerígenas, selectivamente expresada por unas células infectadas por un virus o constitutiva de una estructura antigénica patógena alérgena, llegado el caso destoxicada, y (ii) una proteína derivada de la proteína (i).
Según una segunda característica de un superinmunógeno compuesto, el polipéptido (b) inmunógeno se selecciona de entre (i) la proteína circulante local del estroma, llegado el caso destoxicada, y (ii) una proteína derivada de la proteína (i). 5
Cuando la proteína inmunógena selectivamente expresada por unas células cancerígenas, selectivamente expresada por unas células infectadas por un virus o constitutiva de una estructura antigénica patógena alérgena es "tóxica", por ejemplo "inmunotóxica", o cuando la proteína circulante local del estroma es "tóxica", por ejemplo "inmunotóxica", no podrá ser incluida tal cual como polipéptido (a) o polipéptido (b) de un superinmunógeno compuesto, sin reducir o bloquear previamente su toxicidad, por ejemplo su inmunotoxicidad conservando al mismo tiempo su 10 inmunogenicidad.
La proteína inmunógena es inicialmente "tóxica" cuando su administración al ser humano o al animal provoca unos efectos deletéreos importantes en la salud de este ser humano o de este animal, por ejemplo o bien induciendo una inmunotoxicidad paralizante o desviando las reacciones inmunitarias de defensa.
La proteína inmunógena es inicialmente "inmunotóxica" cuando su administración al ser humano o al animal 15 provoca uno de los efectos siguientes:
- una inmunosupresión, incluyendo la apoptosis de las células inmunitarias, tal como es el caso para las proteínas Tat de VIH1, E7 del papilomavirus, los factores citoquínicos IFNα, TGFβ o IL10, o también el factor de regulación celular p53, en su forma circulante en el estroma;
- una desviación de la reacción inmunitaria humoral, por ejemplo induciendo una conmutación isotípica ("switch") 20 de los linfocitos B que provoca la producción de IgE, tal como es el caso de la IL4.
La proteína inmunógena inicialmente tóxica, por ejemplo inmunotóxica, puede ser destoxicada modificándola en particular físicamente, químicamente o mediante las técnicas de ingeniería genética; tal como se expone con mayor detalle en la continuación de la descripción.
Las técnicas particularmente químicas que permiten la destoxicación de un polipéptido (a) y/o de un polipéptido 25 (b) pueden ser utilizadas asimismo para la preparación de un polipéptido (a) o de un polipéptido (b) a partir de una proteína que no es inicialmente tóxica o inmunotóxica, debido a que estos tratamientos pueden permitir asimismo estabilizar el polipéptido para una mejor conservación de la vacuna.
Es esencial que, tal como los toxoides, toxinas destoxicadas de las vacunas antitetánicas o antidiftéricas, la proteína destoxicada conserve su inmunogenicidad, es decir su capacidad para inducir: 30
- o bien una reacción inmunitaria celular, o celular y humoral, contra la estructura antigénica patógena, cuando la proteína destoxicada está preparada a partir de la proteína inmunógena selectivamente expresada por unas células cancerígenas, selectivamente expresada por unas células infectadas por un virus, o constitutiva de una estructura patógena alérgena;
- o bien una reacción inmunitaria humoral contra la proteína circulante local del estroma tal como se ha definido 35 anteriormente, cuando la proteína destoxicada está preparada a partir de esta proteína circulante del estroma.
Por los términos "se deriva" o "derivado" de una proteína inmunógena contenida en la estructura antigénica patógena apuntada o de la proteína circulante local del estroma apuntada, se entiende que el polipéptido inmunógeno (a) o (b) puede estar constituido de un fragmento peptídico incluido en la proteína inmunógena inicial o bien que el polipéptido (a) o (b) comprende una o varias sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, con respecto a la 40 secuencia de aminoácidos de la proteína inmunógena inicial, tal como se describirá en la continuación de la descripción. En todos los casos, un polipéptido (a) o (b) que "se deriva" de la proteína inmunógena inicial conserva su capacidad para inducir una reacción inmunitaria contra la estructura antigénica patógena apuntada o de la proteína circulante local apuntada del estroma. Cuando la proteína inmunógena inicial es "tóxica", el polipéptido (a) o (b) que se deriva de la misma posee una toxicidad reducida o ha perdido su toxicidad, debido a que constituye sólo un fragmento no tóxico de 45 la proteína inmunógena inicial, o bien porque comprende unas modificaciones de aminoácidos, con respecto a la secuencia de aminoácidos de la proteína inmunógena inicial, que reducen o bloquean sus propiedades tóxicas.
Según un primer modo de realización de un superinmunógeno compuesto para la prevención o el tratamiento de ciertos cánceres o ciertas infecciones víricas, dicho superinmunógeno compuesto se caracteriza porque el polipéptido (a) induce una reacción inmunitaria celular contra un antígeno expresado específicamente por las células cancerígenas 50 o por las células infectadas por un virus.
Mediante la expresión "inducción de una reacción inmunitaria celular" se entiende que el polipéptido (a), en el seno de la estructura del superinmunógeno compuesto, es útil para el inicio de una respuesta inmunitaria eficaz, la cual, en el caso de las células cancerígenas y de las células infectadas por un virus, consiste principalmente en la producción o bien de células T citotóxicas (CTL) que reconocen específicamente la estructura antigénica patógena diana, por 55 ejemplo un antígeno tumoral o un antígeno vírico, que es presentada en la superficie de la célula cancerígena o de la célula infectada en una forma asociada a los antígenos de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), o bien de células asesinas NK, que destruyen preferentemente las células cancerígenas.
Además, la reacción inmunitaria celular inducida por el polipéptido inmunógeno (a) produce una activación de las células T auxiliares ("T helper") que aumenta o permite inducir la reacción humoral basada en el polipéptido (b) inmunógeno y dirigida específicamente contra la proteína circulante del estroma. Esto no significa por ello que no se induce una reacción inmunitaria humoral contra el polipéptido (a). Sin embargo, la inducción de una respuesta humoral contra el polipéptido (a) en el caso de los cánceres y de las infecciones por un virus, si tiene lugar conjuntamente con la 5 inducción de la reacción inmunitaria celular, no es el objetivo perseguido.
Preferentemente, el antígeno expresado específicamente por las células cancerígenas del cáncer del cuello uterino (HUCC) o por las células infectadas por el VIH o por las células leucémicas ATL se selecciona respectivamente de entre (i) las proteínas L1, L2 y E7 del papilomavirus, (ii) las proteínas gp160, p24, p17, Nef y Tat del virus VIH-1, (iii) la proteína Tax, (iv) la proteína gp61 o las proteínas gag de los virus HTLV1 ó 2, siendo la proteína llegado el caso 10 destoxicada, o también una proteína que se deriva de los mismos.
El polipéptido (a) se selecciona preferentemente de entre las proteínas inmunógenas del VIH1, de los fragmentos inmunógenos de estas proteínas o una proteína que se deriva de los mismos.
Preferentemente, el primer polipéptido (a) inmunógeno se selecciona de entre (i) las proteínas L1, L2 y E7 del papilomavirus, (ii) las proteínas gp160, p24, p17, Nef y Tat del virus VIH1, (iii) la proteína Tax de los virus HTLV1 ó 2, 15 llegado el caso destoxicadas o una proteína que se deriva de los mismos.
Para inducir la reacción inmunitaria contra la estructura antigénica patógena, el polipéptido (a) puede consistir en la proteína patógena en sí.
Algunas de las proteínas patógenas listadas anteriormente poseen unas propiedades inmunotóxicas, tal como por ejemplo las proteínas Tat del virus VIH1, E7 del papilomavirus o Tax del virus HTLV1, y no pueden por lo tanto ser 20 utilizadas tal cual como polipéptido (a) de un superinmunógeno compuesto.
El polipéptido (a) será en este caso seleccionado preferentemente de entre (i) una forma desactivada, por ejemplo destoxicada, de la proteína patógena, (ii) un fragmento inactivo de la proteína patógena y (iii) una proteína derivada de la proteína patógena, tal como un mutante genético, o un fragmento de esta proteína, libres de las propiedades iniciales inmunotóxicas. 25
Se detallan en la continuación de la descripción diversas técnicas de preparación de un polipéptido (a) tal como se ha definido anteriormente.
Preferentemente, el polipéptido (a) y el polipéptido (b) se seleccionan de entre:
a) Para la prevención o el tratamiento del SIDA:
- Polipéptido (a): las proteínas gp160, p24, p17, nef, o Tat del virus VIH1, destoxicadas o estabilizadas si es 30 necesario, unos fragmentos inmunógenos de estas proteínas o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos (Zagury et al., 1998).
- Polipéptido (b): las proteínas Tat, IFNα, TGFβ, destoxicada si es necesario, unos fragmentos inmunógenos de estas proteínas o una proteína inmunógena que se deriva de los mismos.
b) Para la prevención o el tratamiento del cáncer del cuello uterino: 35
- Polipéptido (a): las proteínas L1, L2 y E7 del papilomavirus, preferentemente de un papilomavirus de la cepa 16 ó 18, destoxicadas o estabilizadas si es necesario, unos fragmentos inmunógenos de estas proteínas o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos (Le Buanec et al., 1999).
- Polipéptido (b): las proteínas E7, IFNα, TGFβ, TNFα y VEGF, destoxicadas o estabilizadas si es necesario, unos fragmentos inmunógenos de estas proteínas o una proteína inmunógena que se deriva de los mismos. 40
c) Para la prevención o el tratamiento de la leucemia ATL inducida por los virus HTLV1 ó 2:
- Polipéptido (a): las proteínas gp61 y Tax de los virus HTLV1 ó 2, destoxicadas si es necesario, unos fragmentos inmunógenos de estas proteínas o una proteína inmunógena que se deriva de los mismos (Cowan et al., 1997; Mori et al., 1996).
- Polipéptido (b): las proteínas Tax, IL10, IFNα o TGFβ, destoxicadas, unos fragmentos inmunógenos de estas 45 proteínas o una proteína que se deriva de los mismos.
d) Para la prevención o el tratamiento del cáncer del colon:
- Polipéptido (a): las proteínas CEA y p53, destoxicadas si es necesario, unos fragmentos inmunógenos de estas proteínas o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos (Zusman et al., (1996).
- Polipéptido (b): las proteínas TGFβ, IL10, p53, FasL y VEGF, destoxicadas, unos fragmentos peptídicos 50 inmunógenos de estas proteínas o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos.
e) Para la prevención o el tratamiento del cáncer de pecho:
- Polipéptido (a): la proteína Di12, unos fragmentos inmunógenos de esta proteína o también una proteína que se deriva de los mismos (Yoshiji et al., 1996).
- Polipéptido (b): las proteínas TGFβ, TNFα y VEGF, destoxicadas si es necesario, unos fragmentos 55
inmunógenos de estas proteínas o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos.
f) Para la prevención o el tratamiento del cáncer del páncreas:
- Polipéptido (a): la proteína CaSm, destoxicada si es necesario, unos fragmentos inmunógenos de esta proteína o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos.
- Polipéptido (b): las proteínas VEGF y TNFα, destoxicadas o estabilizadas si es necesario, unos fragmentos 5 inmunógenos de estas proteínas o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos.
g) Para la prevención o el tratamiento del cáncer de la próstata:
- Polipéptido (a): las proteínas OSA y ETS2, destoxicadas o estabilizadas si es necesario, unos fragmentos inmunógenos de estas proteínas o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos (Sementchenko VI et al., 1998). 10
- Polipéptido (b): las proteínas IL6 y TGFβ, destoxicadas o estabilizadas si es necesario, unos fragmentos inmunógenos de estas proteínas o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos (Adler et al., 1999).
Para la prevención o el tratamiento de algunos cánceres, se pueden utilizar asimismo, como polipéptido inmunógeno (a), los antígenos TSA (por "Tumor Specific Antigen Type") o los antígenos TAA (por "Tumor Associated 15 Antigen Type"), unos fragmentos inmunógenos de estas proteínas o una proteína inmunógena que se deriva de los mismos.
Las proteínas gp160, Tat, Tax y p53 son tóxicas en su forma nativa. La preparación de un polipéptido (a) inmunógeno a partir de estas proteínas necesitará imperativamente destoxicarlas, o preparar a partir de las mismas unos fragmentos peptídicos inmunógenos no tóxicos o también una proteína no tóxica que se deriva de los mismos, por 20 ejemplo mediante una o varias sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, con respecto a la secuencia de la proteína nativa de referencia.
Las proteínas IFNα, Tat, TGFβ, E7, Tax, p53 y FasL, a una concentración elevada, son inmunotóxicas, en su forma nativa. La preparación de un polipéptido (b) inmunógeno a partir de estas proteínas necesitará imperativamente destoxicarlas, o preparar a partir de ellas unos fragmentos peptídicos inmunógenos no tóxicos o también una proteína 25 no tóxica que se deriva de los mismos, por ejemplo mediante una o varias sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, con respecto a la secuencia de la proteína nativa de referencia.
La proteína inmunógena VEGF podrá ser utilizada, como polipéptido (b) constitutivo de un superinmunógeno compuesto, o bien en su forma nativa, o bien en una forma estabilizada mediante tratamiento químico, preferentemente un tratamiento químico de un tipo utilizado para destoxicar las proteínas. 30
Los polipéptidos inmunógenos (b), listados anteriormente, y que constituyen un factor citoquínico o un factor de regulación celular con propiedades inmunotóxicas o angiogénicas, poseen las características detalladas a continuación.
- la proteína TGFβ: siendo la TGFβ una citoquina inmunosupresiva mayor producida por numerosas células cancerígenas;
- la proteína IL10: siendo IL10 asimismo una citoquina inmunosupresiva mayor, así como el FasL (Ligando Fas); 35
- la proteína p53: la proteína de regulación p53 producida anormalmente por las células cancerígenas puede representar un antígeno de tumor asociado (TAA) tal como se ha mostrado en la técnica anterior. Cuando la proteína p53 es liberada por las células anormales y se acumula en el compartimento estromal extracelular, actúa entonces como factor estromal inmunosupresivo y apoptógeno (inmunotóxico) sobre las células inmunitarias, y constituye en consecuencia una proteína circulante estromal inmunotóxica, en el sentido de la 40 invención, contra la cual se busca la inducción de una reacción inmunitaria humoral mediante un superinmunógeno compuesto que comprende, como polipéptido (b), la proteína p53 destoxicada o una proteína que se deriva de la misma y que ha perdido las propiedades inmunotóxicas de la proteína inicial.
- el VEGF, factor de crecimiento de las células endoteliales: siendo la citoquina VEGF una citoquina mayor de la angiogénesis, que activa la proliferación de las células endoteliales; 45
- la IL6, IFNγ y TNFα, citoquinas pro-inflamatorias que participan asimismo en los procesos de angiogénesis, activando la expresión de las moléculas de adherencia de las células endoteliales (ICAM, VCAM y E selectina).
La reacción inmunitaria humoral que es inducida por el polipéptido (b) constitutivo de un superinmunógeno compuesto según la invención permite hacer eficaz la reacción inmunitaria específica del polipéptido (a):
(i) neutralizando o bloqueando la actividad inmunosupresiva (la inmunotoxicidad) de algunas proteínas circulantes 50 locales del estroma anormalmente producidas, tal como el IFNα o la proteína Tat; o
(ii) neutralizando o bloqueando las propiedades apoptógenas frente a unas células inmunitarias (la inmunotoxicidad) inducida por ciertas proteínas circulantes del estroma anormalmente producidas, tal como el factor de regulación celular p53; o
(iii) neutralizando o bloqueando la angiogénesis, incluyendo la neovascularización de los tumores, inducida por 55 algunas proteínas circulantes del estroma anormalmente producidas, tal como el VEGF.
Una primera familia preferida de superinmunógenos compuestos utilizados para la prevención o el tratamiento de algunos cánceres y de algunas infecciones víricas está constituida por los superinmunógenos compuestos siguientes:
- el superinmunógeno compuesto (a) gp160 - (b) Tat toxoide;
- el superinmunógeno compuesto (b) péptido Tat [1-15; 46-60] - (a) gp160;
- el superinmunógeno compuesto (a) Tat toxoide - (b) IFNα; 5
- el superinmunógeno compuesto (a) Tat toxoide - (b) péptido Tat [1-15; 46-60]
Una segunda familia preferida de superinmunógenos compuestos está constituida por los superinmunógenos siguientes:
- el superinmunógeno compuesto (a) L1 - (b) E7;
- el superinmunógeno compuesto (a) E7 - (b) VEGF; 10
Anteriormente, "(a)" designa el polipéptido (a) y "(b)" designa el polipéptido (b). La estructura de los superinmunógenos compuestos listados anteriormente va, de izquierda a derecha, de la parte NH2-terminal hacia la parte COOH-terminal.
En el superinmunógeno compuesto (a) gp160 - (b) Tat toxoide, la proteína gp160 induce una reacción inmunitaria celular contra unas células infectadas por VIH1, reacción inmunitaria que se encuentra facilitada por la 15 inducción de anticuerpos que neutralizan o que bloquean las propiedades inmunotóxicas de la proteína Tat de VIH1, conocida por provocar la producción de IFNα, factor citoquínico inmunosupresivo.
En el superinmunógeno (a) L1 - (b) E7, la proteína L1 de HPV induce una reacción inmunitaria celular contra unas células infectadas por HPV, que pueden ser cancerígenas, reacción inmunitaria que se encuentra facilitada por la inducción de anticuerpos que neutralizan o que bloquean las propiedades inmunotóxicas de la proteína E7 de HPV. 20
La proteína E7, que está expresada por la célula cancerígena del cáncer del cuello uterino, la cual, de hecho, puede ser asimismo la diana de células T citotóxicas o de células NK que reconocen la estructura antigénica patógena, puede ser utilizada asimismo para preparar un polipéptido (a) de un superinmunógeno compuesto, o bien en forma de la proteína E7 destoxicada, o bien en forma de una proteína que se deriva de la proteína E7 y que ha perdido su inmunotoxicidad. 25
En el superinmunógeno compuesto (a) E7 - (b) VEGF, la proteína E7 induce una reacción inmunitaria celular contra unas células infectadas por HPV, que pueden ser cancerígenas, reacción inmunitaria que se vuelve más eficaz debido a la inducción de anticuerpos que neutralizan o que bloquean las propiedades angiogénicas del factor citoquínico VEGF.
Superinmunógenos compuestos utilizados para la prevención o el tratamiento de las alergias. 30
En un superinmunógeno compuesto utilizado para la prevención o el tratamiento de las alergias, el polipéptido (a) induce una reacción inmunitaria humoral contra la proteína patógena alérgena constitutiva de la estructura antigénica patógena particulada, que puede, a título ilustrativo, ser un polen, un ácaro, un polvo o un pelo de gato.
Preferentemente, la proteína patógena alérgena se selecciona de entre las proteínas Betv1a, Der p 1 y Fel d 1, bien conocidas por el experto en la materia. 35
Preferentemente, el polipéptido (a) se selecciona de entre las proteínas Betv1a, Der p 1 y Fel d 1, sus fragmentos peptídicos inmunógenos o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos.
El antígeno Betv1 está descrito en particular por Ferreira et al. (1993), el antígeno Der p 1 está descrito en particular por Tovey et al. (1981) y el antígeno Fel d 1 está descrito en particular por Morgenstern et al. (1991).
Preferentemente, el polipéptido (b), en el seno del superinmunógeno compuesto, induce la producción de 40 anticuerpos neutralizantes o bloqueantes contra el factor citoquínico IL4, que está producido principalmente por los linfocitos T de tipo Th2, que orientan la respuesta inmunitaria humoral hacia la producción de anticuerpos de isotipo IgE.
El polipéptido (b) es por lo tanto preferentemente la proteína IL4 autóloga, preferentemente destoxicada mediante un tratamiento químico, físico o genético, un fragmento peptídico inmunógeno de esta proteína o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos. 45
Según otro modo de realización, el polipéptido (b) induce la producción de anticuerpos neutralizantes o bloqueantes contra el factor citoquínico IL5, que está producido principalmente por los linfocitos T de tipo Th2.
Según este segundo modo de realización, el polipéptido (b) es preferentemente la proteína IL5 autóloga, preferentemente destoxicada, un fragmento peptídico inmunógeno de esta proteína o también una proteína inmunógena que se deriva de los mismos. 50
En el superinmunógeno compuesto (a) Betv1a - (b) IL4 (ratón), la proteína Betv1 induce una reacción inmunitaria humoral, sistémica o mucosal, contra la estructura antigénica patógena alérgena mediante la producción de anticuerpos de isotipo IgG o IgA, preferentemente IgA segregadores, y la proteína IL induce una reacción inmunitaria contra este factor citoquínico, lo cual permite inhibir o bloquear la conmutación isotípica hacia la producción de anticuerpos IgE, origen de los síntomas alérgicos, induciendo al mismo tiempo una respuesta inmunitaria eficaz contra el 55
alérgeno causal. La reacción inmunitaria humoral obtenida contra IL4, que es una proteína autóloga, resulta posible gracias a la presencia simultánea del polipéptido (a) asimismo constitutivo del superinmunógeno compuesto, comprendiendo el polipéptido (a) unos epitopos T auxiliares que inducen la activación de células T auxiliares necesarias para la reacción inmunitaria humoral de las células B dirigidas contra la IL4.
Un "epítopo T auxiliar" es una región del polipéptido inmunógeno que es reconocida selectivamente por el 5 receptor del antígeno de por lo menos un clon de linfocitos T auxiliares, activando el evento de unión del polipéptido inmunógeno al receptor de los linfocitos T que reconoce específicamente esta región de epítopo dichos clones de linfocitos T, que se multiplicarán y producirán unas citoquinas tales como la IL2, que permitirán a su vez el desarrollo de una reacción inmunitaria humoral, incluyendo una reacción inmunitaria humoral contra una proteína autóloga, tal como es el caso para IL4 en un superinmunógeno compuesto según la invención. 10
Desactivación de las propiedades inmunosupresivas o apoptógenas de un polipéptido (a) o de un polipéptido (b) constitutivo de un superinmunógeno compuesto de la invención, mediante destoxicación.
Tal como se ha expuesto anteriormente, un compuesto superinmunógeno compuesto debe estar libre de cualquier toxicidad y no debe, en particular debido a las propiedades intrínsecas de uno de sus constituyentes, más específicamente el polipéptido (a) o el polipéptido (b), inducir una supresión o una desviación de las reacciones diana del 15 sistema inmunitario.
Así, cuando el polipéptido (a) es un polipéptido inicialmente inmunotóxico, se desactiva en primer lugar para estas propiedades antes de ser incluido en un superinmunógeno compuesto según la invención.
Asimismo, cuando un polipéptido (b) constitutivo de un conjugado peptídico inmunógeno es una citoquina o un factor de regulación celular con propiedades inmunotóxicas, o bien inmunosupresivas o apoptógenas, o bien susceptible 20 de desviar la reacción inmunitaria, por ejemplo orientando la reacción de las células T auxiliares ("T helper") hacia la producción de células de tipo Th2, tal como es el caso de la IL4, se desactiva en primer lugar para dichas propiedades antes de ser incluido en dicho superinmunógeno compuesto.
Es importante utilizar el (los) polipéptido(s) (a) y/o (b) deletéreo(s) en forma en particular física, química y/o genéticamente modificada (desactivada pero todavía inmunógena) y no nativa (o natural) o en una forma galénica 25 apropiada con el fin de que ya no ejerza los efectos inmunotóxicos o las propiedades de desviación de la reacción inmunitaria de la proteína nativa, conservando al mismo tiempo sus propiedades inmunógenas.
Por el contrario, un polipéptido (a) o un polipéptido (b) no inmunotóxico, tal como el VEGF, puede ser utilizado en el estado nativo o en forma modificada después de un tratamiento de estabilización.
Los tratamientos físicos pueden ser realizados mediante calor, radiaciones UV, rayos X o el contacto con una 30 atmósfera rica en O2. Estos tratamientos físicos que generan unas modificaciones intramoleculares entre radicales químicos (grupo tiol por ejemplo), pueden cambiar de manera apropiada la conformación de la molécula, desactivarla funcionalmente conservando al mismo tiempo sus propiedades inmunógenas.
El tratamiento químico puede ser efectuado con la ayuda de un agente de acoplamiento tal como un dialdehído, o de una proteína portadora activada mediante un pretratamiento con la ayuda de un dialdehído preferentemente o el 35 glutaraldehído. El tratamiento químico se puede realizar mediante la utilización de un monoaldehído, en particular de formaldehído. Se puede para ello hacer referencia a las enseñanzas del documento WO-A-96/27389.
El tratamiento químico se puede realizar en particular mediante otros procedimientos tales como la carboximetilación o la carboxamidación. Un ejemplo de técnica de carboximetilación se ilustra en el documento WO-A-99/33872. El tratamiento químico se puede realizar asimismo mediante N-etilmaleidación asociada o no a una 40 glutaraldehidación.
Se puede citar asimismo como técnica de desactivación de la reacción de por lo menos una función tiol de la proteína con el 4-cloro-7-sulfobenzofurazano de amonio, el N-[yodoetil]-trifluoroacetamida o la N-(6-[7-amino-4-metil-cumarin-3-acetamido]hexil)-3’-(2’-piridilditio)-propionamida así como la reacción de por lo menos una función amino de la proteína con el aetilacetimidato, un anhídrido, el clorhidrato de 2-iminotiolano, el S-acetiltioacetado de N-succinimidilo, el 45 acetato de sulfosuccinimidilo, el sulfosuccinimidil-4-O-[4,4-dimetoxitritil]butirato, el 7-amino-4-metil-cumarin-3-acetado de succinimidilo, el 7-amino-4-metilcumarin-3-acetato de sulfosuccinimidilo o el fenilglioxal.
El inmunógeno puede ser desactivado gracias a una presentación galénica en el seno de un líquido oleoso, tal como un adyuvante incompleto de Freund o también susceptible de modificar los enlaces no covalentes (fuerzas electroestáticas, fuerzas de Van der Waals o enlaces hidrógeno) necesarios para sus efectos tóxicos. 50
Las modificaciones genéticas se pueden obtener mediante ingeniería genética realizando unas inserciones, unas deleciones o unas sustituciones de residuos, operaciones destinadas a disminuir o suprimir los sitios funcionales deletéreos de la molécula natural. Los mutantes genéticos podrán o no sufrir un tratamiento químico y/o físico complementario. Las proteínas modificadas anteriormente pueden ser preparadas por ejemplo a partir de una proteína que tiene una secuencia idéntica o similar a una secuencia peptídica de una proteína inmunopatógena, en particular 55 inmunosupresiva o angiogénica, tal como la proteína Tat del VIH-1, la proteína E7 del papilomavirus o la proteína Tax de HTLV1 o de un fragmento de estas proteínas, y ser obtenidas por ejemplo mediante síntesis peptídica convencional sobre resina o mediante ingeniería genética. Todos estos procedimientos son bien conocidos en el estado de la técnica. Los mutantes inactivos pero inmunógenos tienen por lo menos una molécula de ADN que codifica para su producción.
Dichas moléculas de ADN presentan un interés particular en la presente invención, tal como se observará a continuación.
Con el fin de verificar que la proteína nativa inmunotóxica y/o angiogénica es bien reconocida por unos anticuerpos dirigidos contra dicha proteína modificada, destoxicada o estabilizada mediante tratamiento, o su fragmento modificado o no según la invención, se puede por ejemplo verificar inmunológicamente mediante Elisa en presencia de 5 anticuerpos específicos, la formación de complejos antígeno-anticuerpo.
En unas condiciones preferidas de realización, el compuesto inmunógeno procede de un compuesto nativo (proteína o fragmento polipeptídico) tratado mediante un aldehído, o carboxamidado, o carboximetilado o maleimidado.
Con el fin de determinar si las propiedades inmunógenas de la proteína modificada inmunotóxica y/o angiogénica o de un fragmento de esta proteína han sido suficientemente conservadas (es decir si ha sido 10 desactivado(a) pero no desnaturalizado(a)) para crear unos anticuerpos que bloquean los efectos de dicha proteína nativa, se puede por ejemplo inmunizar unos mamíferos (conejos, ratas, ratones) con la ayuda de un compuesto inmunógeno según la invención y verificar que los anticuerpos producidos neutralizan las actividades inmunosupresivas, apoptógenas o angiogénicas de la proteína.
Con el fin de determinar si la proteína inmunotóxica modificada o el fragmento ha perdido por lo menos la 15 proporción deseada de sus propiedades inmunotóxicas, se puede estudiar por ejemplo el efecto de la proteína modificada sobre la producción de citoquinas Th2 (IL4) y Th1 (IFNγ) y/o sobre la inmunosupresión de cultivos de células mononucleadas de la sangre periférica humana (PBMC) estimuladas por unos antígenos de recuerdo, tales como los antígenos PPD o tétanos toxoide.
La proteína inmunotóxica (inmunosupresiva o apoptógena o que provoca una desviación de la reacción 20 inmunitaria) o angiogénica modificada e inmunógena puede derivarse de cualquiera de las proteínas en particular inmunotóxicas de acción local inducidas por unas células tumorales o por unas células infectadas de enfermos de SIDA; se considera particularmente la proteína Tat del virus VIH-1, la proteína E7 del papilomavirus o la proteína Tax del virus HTLV1. Se consideran asimismo la lectina manano-dependiente producida por unas células inmunitarias activadas. Se considera asimismo el VEGF con propiedades angiogénicas y el IL4 con propiedades inmunotóxicas y que provoca una 25 desviación de la reacción inmunitaria hacia una respuesta Th2.
Como ya se ha expuesto anteriormente, el polipéptido (a) o el polipéptido (b) de un superinmunógeno compuesto puede consistir en un fragmento de la proteína inmunógena inicial constitutiva de la estructura antigénica patógena diana, o también en un polipéptido que presenta, con respecto a la proteína inmunógena inicial, unas modificaciones en los aminoácidos. 30
Puede comprender una o varias modificaciones en los aminoácidos de esta proteína o fragmento tales como unas deleciones, sustituciones, adiciones o funcionalizaciones tales como acilación de aminoácidos, en la medida en la que estas modificaciones permanecen en el marco citado anteriormente (ausencia de toxicidad, caracteres inmunológicos). Por ejemplo, en general, la sustitución de un residuo leucina por un residuo isoleucina no modifica dichas propiedades; las modificaciones deben afectar generalmente a menos de 40% de aminoácidos, preferentemente 35 menos de 20% y muy particularmente menos de 10% de la proteína inmunopatógena, en particular inmunotóxica o angiogénica. Es importante que la proteína o el fragmento modificado no sean desnaturalizados tal como se puede realizar por ejemplo mediante un tratamiento físico tal como el calor con el fin de conservar sus sitios conformacionales para que los anticuerpos inducidos por los derivados modificados sean activos frente a la proteína nativa.
En unas condiciones preferidas, los compuestos inmunógenos comprenden por lo menos 50% de la totalidad o 40 de un segmento de la proteína inmunopatógena, en particular inmunotóxica o angiogénica, preferentemente por lo menos 70%, particularmente por lo menos 90%, y muy particularmente la totalidad o casi totalidad de dicha proteína inmunosupresiva o angiogénica.
De manera general, en lo que se refiere a las modificaciones, la homología o la similitud entre el inmunógeno modificado y la proteína o parte de proteína inmunotóxica nativa, así como las dimensiones del polipéptido inmunógeno, 45 al igual que las modalidades de uso, o de acoplamiento del polipéptido inmunógeno constitutivo de un superinmunógeno compuesto según la invención a una proteína inmunógena tal como la toxoide tetánica, se puede hacer referencia en particular al documento WO-A-86/06 414 o al documento EP-A-0 220 273 o también al documento PCT/US 86/00831, equivalentes, cuyas enseñanzas se incorporan a la presente memoria a modo de referencia.
Se prefiere asimismo un compuesto inmunógeno tal como se ha definido anteriormente que es un producto 50 obtenido mediante recombinación genética que presenta una homología peptídica de 70% por lo menos con las proteínas Tat del VIH-1, Tax del HTLV1 o L2 y E7 de HPV o la lectina manano-dependiente producida por unas células inmunitarias activadas o con un segmento de estas proteínas.
Se prefiere asimismo un compuesto inmunógeno tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque se trata mediante un aldehído, porque está carboxamidado, carboximetilado o maleimidado. 55
Se prefiere por último un compuesto inmunógeno tal como se ha definido anteriormente, caracterizado por un acondicionamiento adyuvante que lo hace biológicamente inactivo, tal como una emulsión oleosa en adyuvante incompleto de Freund (IFA).
Se puede asimismo hacer derivar de un mutante homólogo el compuesto inmunógeno deseado.
Se recuerda en este caso que mediante un acondicionamiento galénico de una proteína activa fisiológicamente, se puede enmascarar su actividad biológica conservando al mismo tiempo su inmunogenicidad.
La reacción de carboximetilación permite modificar los grupos tiol (grupos sulfhidrilo) presentes a nivel de los residuos cisteínas de la cadena de aminoácidos. La carboximetilación, técnica bien conocida por el experto en la materia, desactiva ciertas funciones tóxicas que dependen de los grupos SH según la técnica descrita para la proteína 5 Tat por Frankel et al. (Cell, vol. 55 ,1988).
Aparte de la carboximetilación, la carboxamidación o la maleimidación se pueden utilizar para bloquear los grupos SH y formar unos complejos S-carboxietilados, S-carboxamidados o S-maleimidados.
Por ejemplo, la proteína Tat posee 7 cisteínas. Estas cisteínas participan en la formación de puentes disulfuro inter o intra-cadenas y contribuyen a la formación de oligómeros. 10
El producto de la reacción es, en cada caso, un residuo S-carboximetilcisteinil o S-carboximetilamidocisteinil.
Un fragmento puede comprender de 8 a 110 aminoácidos por ejemplo, preferentemente de 12 a 60 aminoácidos y en particular de 12 a 40 aminoácidos. Tal fragmento puede comprender asimismo por el lado o por los lados C o N terminal de 1 a 5 aminoácidos suplementarios, es decir diferentes del fragmento de origen. Un fragmento debe comprender además una cisteína por lo menos para poder ser objeto por ejemplo de una carboximetilación. Los 15 fragmentos, si se seleccionan preferentemente inactivos por sí mismos, podrán en efecto ser sometidos si se desea a los mismos tratamientos de desactivación que las proteínas enteras o prácticamente enteras.
La reacción de carboximetilación anterior se puede realizar asimismo con otros agentes químicos tales como el ácido perfórmico, el ácido 3-bromopropiónico, la etilenimina, el bromuro de (2-bromoetil)trimetilamonio, el sulfonato de 2-bromoetano, la 1,3-propanosulfona, etc. 20
En las condiciones preferidas de realización del procedimiento descrito anteriormente, dicha proteína o dicho fragmento de partida puede presentarse en forma fusionada a un marcador (FP) o no fusionada (P). La forma FP puede modificar per se la conformación molecular y entonces modificar así su actividad.
Las proteínas o fragmentos de partida del procedimiento son unos productos conocidos cuyos procedimientos de desactivación pueden haber sido descritos en la bibliografía tal como en el documento WO-A-99/33872. Estas 25 proteínas de partida pueden incluso estar comercializadas (Immunodiagnostics Inc, Cat # 1002-2) o pueden estar preparadas de manera convencional.
Se puede preparar en particular las proteínas o fragmentos de partida anteriores mediante:
1) Síntesis mediante ingeniería genética o mediante síntesis bioquímica;
2) Purificación. 30
Mediante ingeniería genética, se pueden purificar las proteínas producidas por cromatografía de afinidad utilizando por ejemplo unos anticuerpos dirigidos contra la proteína o uno de sus fragmentos; se puede asimismo sintetizar la proteína fusionada a un marcador (FP) que servirá para el enganche a una columna de afinidad.
Modos de realización preferidos de un superinmunógeno compuesto de la invención.
Para fabricar un superinmunógeno compuesto, se realiza un acoplamiento del polipéptido (a) y del polipéptido 35 (b) por vía química o por recombinación genética.
Según un modo de realización preferido del conjugado peptídico inmunógeno los polipéptidos (a) y (b) son desactivados en sus propiedades inmunotóxicas y/o estabilizadas por formolación, carboxamidación, carboximetilación, maleimidación u oxidación por burbujeo de oxígeno.
Según otro aspecto, los polipéptidos (a) y (b), cuando están desactivados en sus propiedades inmunotóxicos o 40 angiogénicas, son desactivados por recombinación genética.
En un modo de realización particular del conjugado peptídico inmunógeno, los polipéptidos (a) y (b) están unidos directamente entre sí de manera covalente, por ejemplo a través de un enlace peptídico-CO-NH-.
Sin embargo, con el fin de introducir una cierta flexibilidad en la estructura del conjugado peptídico inmunógeno, y en particular permitir una movilidad en el espacio de los polipéptidos (a) y (b), uno con respecto al otro en el seno del 45 conjugado peptídico inmunógeno, se prefiere un conjugado peptídico en el que los polipéptidos (a) y (b) son separados entre sí, en el seno de dicho conjugado, mediante una cadena espaciadora.
Según un primer modo de realización preferido de un conjugado peptídico inmunógeno, los polipéptidos (a) y (b) son separados entre sí, en el seno de dicho conjugado, por una cadena espaciadora seleccionada de entre el SMCC o el SIAB, que son ambos unos compuestos bifuncionales. 50
El compuesto SIAB, descrito por Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego: Academic Press, p. 239-242), es el compuesto de fórmula (I) siguiente:
El compuesto SIAB comprende dos grupos reactivos, respectivamente un grupo yodoacetato y un grupo éster sulfo-NHS, reaccionando estos grupos respectivamente sobre unos grupos amino y sulfhidrilo.
El compuesto SMCC, descrito por Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1): 37-46), es el compuesto de fórmula (II) siguiente: 5
El compuesto SMCC comprende dos grupos reactivos, respectivamente un grupo éster sulfo-NHS y un grupo maleimida, que reaccionan respectivamente con un grupo amino y un grupo sulfhidrilo.
Según un segundo modo de realización preferido, el superinmunógeno compuesto comprende una cadena espaciadora constituida por un péptido espaciador lineal. Se seleccionará preferentemente un péptido espaciador lineal 10 que tiene de 3 a 30 aminoácidos de longitud, ventajosamente de 5 a 20 aminoácidos de longitud y de manera muy preferida de 7 a 15 aminoácidos de longitud.
Preferentemente, el péptido espaciador lineal está esencialmente, incluso exclusivamente, constituido por aminoácidos cargados positivamente o negativamente a pH 7,0 con el fin de aumentar la hidrofilicidad global de dicho superinmunógeno compuesto. Se entiende que se deberá evitar utilizar unos péptidos espaciadores constituidos por 15 aminoácidos hidrófobos. De manera preferida, el péptido espaciador está caracterizado porque está constituido por una cadena de poli-(lisina) constituida por 3 a 30 residuos lisina, ventajosamente por 5 a 20 y de manera muy preferida por 7 a 15 residuos lisina de longitud.
Según todavía otro modo de realización de un superinmunógeno compuesto, los polipéptidos (a) y (b) están separados entre sí, en el seno de dicho conjugado peptídico, por una cadena espaciadora constituida por un péptido 20 espaciador ramificado, preferentemente una estructura oligodendrimérica de poli(lisina), tal como la descrita por ejemplo por Basak et al. (1995).
En este último modo de realización de un superinmunógeno compuesto, dicho conjugado peptídico puede comprender varias copias de los polipéptidos (a) y (b) por molécula de conjugado, ventajosamente de 2 a 8 copias de los polipéptidos (a) y (b), preferentemente como máximo 4 copias de cada uno de los polipéptidos (a) y (b) por molécula de 25 conjugado.
Los polipéptidos (a) y (b) pueden estar incluidos ambos asimismo en el seno de una misma estructura física, por ejemplo sobre unas monopartículas que tienen un diámetro comprendido entre 10 y 500 nanómetros, preferentemente entre 10 y 1.000 nanómetros, y de manera completamente preferida entre 10 y 100 nanómetros, por ejemplo unas nanopartículas de IMS, tal como se ha descrito por ejemplo por Aucouturier et al. (2001), de quitosano, tal 30 como se ha descrito por ejemplo por Sjaugrud et al. (1999), de liposomas, o de partículas biodegradables tal como el ácido poliláctido (PLA), la poli--caprolactona (PCL) o la poli(lactido-coglicolida) (PLG) descrita por Baras et al. (1999).
Según todavía otro modo de realización, los polipéptidos (a) y (b) están unidos físicamente en el seno de una misma estructura portadora que permite su presentación simultánea a las células del sistema inmunitario. En este modo de realización particular, los polipéptidos (a) y (b) están inmovilizados sobre unas nanopartículas, por ejemplo unas 35 nanopartículas de quitosano, de IMS (Inmunomodulador disponible en la compañía Seppic, Francia), constituido por nanopartículas lipídicas de un diámetro de 100 a 300 nanómetros) o por liposomas.
Preferentemente, dichas nanopartículas son de tamaño pequeño de manera que presenten simultáneamente los polipéptidos (a) y (b) a las células, de la misma manera que si estos polipéptidos estuvieran unidos de manera
covalente en el seno de la misma molécula. Ventajosamente, las nanopartículas tienen un diámetro comprendido entre 10 y 1.000 nm, mejor entre 10 y 500 nm, preferentemente entre 10 y 300 nm y de manera completamente preferida entre 10 y 200 nm.
La utilización de un conjugado peptídico inmunógeno tal como se ha definido anteriormente encuentra una aplicación principal para el tratamiento del SIDA, de los cánceres y de la alergia. 5
La presente descripción tiene asimismo por objeto un compuesto superinmunógeno compuesto que comprende dos polipéptidos inmunógenos distintos físicamente unidos entre sí, consistiendo los dos polipéptidos respectivamente en:
(a) un primer polipéptido inmunógeno que induce una reacción inmunitaria celular, o una reacción inmunitaria celular y humoral, contra una estructura antigénica patógena celular, microbiana o particulada inerte o viva; 10
(b) un segundo polipéptido inmunógeno que induce la producción de anticuerpos neutralizantes o bloqueantes contra una proteína circulante local del estroma seleccionada de entre un factor citoquínico o un factor de regulación celular con propiedades inmunotóxicas o angiogénicas, pudiendo ser este factor producido por las células cancerígenas, las células infectadas por un virus o las células estromales, incluyendo los linfocitos T y las células que presentan el antígeno (APC), o bien inducido por unas estructuras particuladas patógenas, en 15 particular alergénicas.
Las características detalladas del superinmunógeno compuesto anterior han sido ya expuestas anteriormente en la presente invención, a la que el experto en la materia podrá hacer referencia.
En un primer modo de realización preferido, el conjugado peptídico inmunógeno se caracteriza porque consiste en el conjugado gp160 - Tat toxoide. 20
Según un segundo modo de realización preferido, el conjugado peptídico se caracteriza porque consiste en el conjugado Tat toxoide-IFNα.
Según un tercer modo de realización preferido, el conjugado peptídico inmunógeno se caracteriza porque consiste en E7-SIAB-VEGF.
Según un cuarto modo de realización preferido, el conjugado peptídico inmunógeno se caracteriza porque 25 consiste en BetV1a-SIAB-IL-4.
Utilización de un ácido nucleico que codifica un superinmunógeno compuesto
La descripción tiene asimismo por objeto un ácido nucleico que codifica ciertos compuestos superinmunógenos compuestos, es decir los superinmunógenos peptídicos constituidos exclusivamente por una sola cadena peptídica lineal que comprende los polipéptidos (a) y (b) unidos entre sí, o bien directamente o bien a través de una cadena espaciadora 30 peptídica lineal, tal como se ha definido anteriormente.
Se refiere asimismo a un casete de expresión funcional en un mamífero, preferentemente en el ser humano, que comprende un ácido nucleico tal como se ha definido anteriormente, dispuesto bajo el control de un polinucleótido regulador funcional en un mamífero, preferentemente en el ser humano.
Se refiere asimismo a un vector recombinante que comprende un ácido nucleico o un casete de expresión tales 35 como se han definido anteriormente, que permite la expresión de un superinmunógeno compuesto según la invención en un mamífero, preferentemente en el ser humano.
Se refiere asimismo a la utilización de un ácido nucleico, de un casete de expresión o de un vector recombinante tales como se han definido anteriormente para la obtención de un medicamento de acción anti-cancerígena, antivírica o antialérgica. 40
De manera general, el ADN (plásmido con promotor) puede ser suministrado en las superficies mucosales en forma de ADN desnudo o formulado, por ejemplo en forma de liposomas catiónicos o concentrado alrededor de partículas de oro o también en forma de microesferas. Se realiza ventajosamente en presencia de adyuvantes, en particular unas toxinas bacterianas tales como CTB (toxina de cólera) o de LT (enterotoxina lábil de E. coli), preferentemente mutada (LTµ). Dichas técnicas de inmunización mucosal con unas vacunas a base de moléculas de 45 ADN están descritas en particular en Microbes and Infection, 1999, 685-698 por McCluskie et al.
Según un modo de realización ventajoso, un vector recombinante según la invención comprenderá en particular los elementos siguientes:
(1) unos elementos de regulación de la expresión del ácido nucleico que codifica el superinmunógeno compuesto, tales como unos promotores y unas secuencias activadoras ("enhancers"); 50
(2) la secuencia codificante comprendida en el ácido nucleico que codifica un superinmunógeno compuesto a insertar en dicho vector, estando dicha secuencia codificante dispuesta en fase con las señales de regulación descritas en (1); y
(3) unas secuencias apropiadas de iniciación y de parada de la transcripción.
Además, los vectores recombinantes podrán incluir uno o varios orígenes de replicación en los hospedantes 55 celulares en los que se busca su amplificación o su expresión, unos marcadores o unos marcadores de selección.
Un vector recombinante puede asimismo ser un vector retrovírico o también un vector adeno-asociado (AAV). Dichos vectores adeno-asociados se describen, por ejemplo por Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), o también McLaughlin BA et al. (1996).
Para introducir los polinucleótidos o los vectores en una célula hospedante, el experto en la materia podrá ventajosamente hacer referencia a diferentes técnicas, tal como la técnica de precipitación con fosfato de calcio 5 (Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), el DEAE Dextran (Gopal, 1985), la electroporación (Tur-Kaspa, 1896; Potter et al., 1984), la microinyección directa (Harland et al., 1985), los liposomas cargados con ADN (Nicolau et al., 1982, Fraley et al., 1979).
Según un modo de realización particular, un método para introducir un polinucleótido en una célula hospedante, en particular una célula hospedante que procede de un mamífero, in vivo, comprende una etapa durante la cual se 10 introduce una preparación que comprenden un vector farmacéuticamente compatible y un polinucleótido "desnudo" dispuesto bajo el control de secuencias de regulación apropiadas, mediante inyección local a nivel del tejido seleccionado, por ejemplo un tejido muscular liso, siendo el polinucleótido "desnudo" absorbido por las células de este tejido.
Unas composiciones para la utilización in vitro e in vivo que comprende unos polinucleótidos "desnudos" están 15 por ejemplo descritas en la solicitud PCT n° WO 95/11307 (Institut Pasteur, Inserm, Université d'Ottawa) así como en los artículos de Tacson et al. (1996) y de Huygen et al. (1996).
Puede tratarse asimismo de vectores adenovíricos tales como el adenovirus humano de tipo 2 ó 5.
La cantidad de vector que se inyecta al organismo hospedante seleccionado varía según el sitio de inyección. A título indicativo, éste se puede inyectar entre aproximadamente 10 µg y 100 µg del polinucleótido que codifica un 20 superinmunógeno compuesto en el cuerpo de un animal, preferentemente de un paciente.
Composiciones inmunógenas o vacunales que comprenden un superinmunógeno compuesto o un ácido nucleico que lo codifica.
La descripción tiene asimismo por objeto una composición inmunógena caracterizada porque comprende, a título de principio activo, un superinmunógeno compuesto tal como se ha definido anteriormente, en asociación con uno 25 o varios excipientes fisiológicamente compatibles.
Se refiere a una composición inmunógena caracterizada porque comprende una cantidad eficaz, por ejemplo inmunológicamente activa, de un superinmunógeno compuesto tal como se ha definido en la presente descripción.
Según los objetivos pretendidos, se utilizan unos adyuvantes sistémicos o unos adyuvantes mucosales. Por ejemplo, se utiliza preferentemente un adyuvante mucosal para prevenir los cánceres de los tejidos epiteliales y se 30 utilizan preferentemente unos adyuvantes sistémicos para prevenir o tratar las infecciones por unos virus, tales como por VIH1 y HTLV1, o también para prevenir o tratar las alergias.
Entre los adyuvantes sistémicos, se utilizan preferentemente los adyuvantes de tipo IFA (adyuvante incompleto de Freund), el fosfato de calcio o el hidróxido de alúmina.
Entre los adyuvantes mucosales, se utilizan preferentemente unos adyuvantes tal como la coleratoxina B (CTB) 35 o un mutante de la toxina LT (LTµ).
La descripción se refiere asimismo a una vacuna, mucosal o sistémica, caracterizada porque comprende, a título de principio activo, un superinmunógeno compuesto tal como se ha definido anteriormente, en asociación con uno o varios excipientes, incluyendo los adyuvantes de inmunidad, fisiológicamente compatibles.
Las composiciones inmunógenas o las vacunas encuentran su utilización por ejemplo en el tratamiento tanto 40 curativo de los cánceres, en particular de los cánceres inducidos por unos virus tal como, por ejemplo, ATL (Acute T cell leucemia) causado por HTLV1, o el cáncer del cuello uterino causado por el papilomavirus, o también el linfoma de Burkitt o el sarcoma de Kaposi causados por unos virus de la familia del herpes, respectivamente el Epstein-Barr (EBV) y el HHV8 así como en el tratamiento del SIDA, así como para prevenir o tratar las reacciones inflamatorias alérgicas.
Los superinmunógenos compuestos pueden ser utilizados como sigue: 45
Se administra a un paciente, en una forma adaptada a la administración sistémica o mucosal, un compuesto superinmunógeno compuesto o una molécula de ADN, por ejemplo por vía intranasal, en una cantidad suficiente para ser eficaz en el plano terapéutico, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. La dosis administrada puede estar comprendida por ejemplo entre 10 y 1.000 µg por vía intranasal, una vez por semana durante dos meses, y después periódicamente en función del índice de los anticuerpos segregadores inducidos, por ejemplo cada 2-6 meses. 50
Se podrá administrar en una misma preparación dos o más moléculas superinmunógenas compuestas y/o moléculas de ADN diferentes para inducir unos anticuerpos que neutralizan todos los sitios funcionales deletéreos en el caso en el que una sola molécula no contenga todos los sitios activos de la toxina o de la citoquina sobreproducida que se desea neutralizar.
La invención tiene asimismo por objeto las composiciones farmacéuticas destinadas a las mucosas que 55 contienen por lo menos un conjugado peptídico inmunógeno o una molécula de ADN citados anteriormente, a título de principio activo.
A título de medicamentos, los conjugados peptídicos inmunógenos o moléculas de ADN de la invención pueden ser incorporados en unas composiciones farmacéuticas destinadas a una administración por vía sistémica o bien a una administración por la vía mucosa, en particular oro-mucosa, en particular la vía intranasal, la vía oral y la vía vaginal. La administración puede tener lugar en una dosis única o repetida una o varias veces después de un cierto intervalo de tiempo. 5
Es por eso que la presente solicitud tiene asimismo por objeto una composición farmacéutica, curativa o preventiva, caracterizada porque comprende a título de principio activo, uno o varios superinmunógenos compuestos tales como se han definido anteriormente, o sus fragmentos o moléculas de ADN que corresponden a la proteína nativa a combatir. El compuesto inmunógeno, fragmento o molécula de ADN pueden ser acondicionados solos o en mezcla con un excipiente o mezcla de excipientes farmacéuticamente aceptables tales como un adyuvante. Entre los 10 excipientes destinados a la vía intranasal u oral, se consideran particularmente los capril caproil macrogol glicéridos tal como el Labrasol® de la compañía GATTEFOSSE o el hidróxido de alúmina (Alhydragel, Superfos, Dinamarca).
Se debe observar que administrado tal cual, según una formulación oral convencional, el principio activo según la invención sería inactivo.
Para la administración oral, se puede asociar el principio activo a un adyuvante de inmunidad mucosal tal como 15 un mutante de CT, de LT o de CTB.
Se consideran muy particularmente las formas galénicas descritas por Boyaka et al. "Strategies for mucosal vaccine development" en Am. J. Trop. Med. Hyg. 60(4), 1999, páginas 35-45. Se pueden citar asimismo los microgránulos gastro-resistentes en particular bioadhesivos tales como los descritos por Rojas et al en Pharmaceutical Research, vol. 16, n°2, 1999, página 255. 20
En unas condiciones particulares de realización, se considera una composición farmacéutica vacunal tal como se ha descrito anteriormente, caracterizada porque comprende un adyuvante de inmunidad mucosal, tal como un mutante de CT (toxina de cólera) o de LT (enterotoxina lábil de E. coli).
En otras condiciones particulares de realización, se considera una composición farmacéutica vacunal tal como se ha descrito anteriormente, caracterizada porque contiene un adyuvante que absorbe el principio activo, tal como el 25 hidróxido de alúmina o las partículas de oro.
En todavía otras condiciones preferidas de realización, se considera una composición farmacéutica tal como se ha descrito anteriormente, caracterizada porque el conjugado peptídico inmunógeno se obtiene mediante recombinación genética.
En todavía otras condiciones preferidas de realización, se considera una composición farmacéutica tal como se 30 ha descrito anteriormente, caracterizada porque el polipéptido (a) y/o el polipéptido (b) constitutivo del conjugado peptídico ha sido tratado mediante un aldehído y ha sido carboximetilado, carboxamidado o maleimidado.
La presente descripción tiene asimismo por objeto un procedimiento de preparación de una composición descrita anteriormente, caracterizado porque se mezcla, según unos métodos conocidos en sí, el o los principios activos con unos excipientes aceptables, en particular farmacéuticamente aceptables y, llegado el caso, con un adyuvante de 35 inmunidad sistémico o mucosal.
En unas condiciones preferidas de realización del procedimiento anterior, se preparan unos microgránulos bioadhesivos y gastro-resistentes para la vía oral digestiva que contiene los principios activos inmunógenos y, llegado el caso los adyuvantes.
La descripción tiene asimismo por objeto una composición inmunógena, caracterizada porque comprende una 40 cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico que codifica un superinmunógeno compuesto tal como se ha definido en la presente descripción, un casete de expresión que comprende dicho ácido nucleico, o un vector recombinante que comprende este ácido nucleico o este casete de expresión.
Asimismo, se refiere a una vacuna caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente activa de un ácido nucleico, de un casete de expresión o de un vector recombinante tales como se han definido anteriormente. 45
La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos:
EJEMPLOS
Ejemplos de preparaciones de superinmunógenos compuestos
EJEMPLO 1: Preparación de un conjugado [gp160 - Tat toxoide]
Este conjugado debe representar el principio activo de una vacuna compuesta apta para inducir principalmente 50 en el vacunado una reacción celular (quimioquinas; T auxiliar, CTL) dirigida contra las células infectadas que expresan la gp160 y una reacción anticuerpo contra la proteína Tat extracelular.
Se han activado 810 µg de la proteína gp160 disueltos en 1 ml de PBS mediante diálisis, durante una noche, contra 100 ml de una disolución de glutaraldehído al 0,2% en PBS, después de lo cual el exceso de glutaraldehído ha sido eliminado mediante 3 diálisis sucesivas contra 100 ml de PBS, de 2 horas cada una. 55
A 1 ml de gp160 así activada se han añadido 522 µl de una disolución de Tat toxoide a 1,55 ml/ml (es decir
810 µg de Tat toxoide). La mezcla se agitó durante 1 noche a 4ºC y después se bloqueó mediante la adición de 50 µl de una disolución de glicina 2,5M. Por último, la mezcla de reacción se purificó mediante cromatografía de exclusión. La antigenicidad de la preparación frente a la proteína Tat y la proteína gp160 corresponde a la antigenicidad de cada una de las proteínas determinadas aisladamente.
EJEMPLO 2: Preparación de un conjugado [Tat toxoide - IFNα] 5
Se trata de la producción de una vacuna compuesta apropiada para inducir principalmente una reacción inmunitaria celular (quimioquinas; T auxiliares, CTL) dirigida contra las células infectadas que expresan la proteína Tat y una reacción inmunitaria humoral dirigida contra el IFNα. Además este conjugado podrá inducir la formación de anticuerpos dirigidos contra la proteína Tat extracelular.
El acoplamiento ha sido realizado mediante la reacción del IFNα reducido con la molécula Tat toxoide activada 10 por SIAB (véase el ejemplo 2).
1. Activación del Tat toxoide (Tx)
Se adicionaron 5 mg de Tx disuelto en 3 ml de PBS-EDTA 5 mM con 187 µl de una disolución de SIAB (1,7 mg/ml). Después de una hora de reacción a temperatura de laboratorio, la mezcla de reacción se filtró a través de una columna de Sephadex G25 equilibrada con tampón borato 0,1 M-EDTA 5 mM, pH 8,5. 15
2. Reducción del IFNα
Las mismas condiciones que en el ejemplo 3. Recuperación de 2,6 mg del IFNα reducido.
Se mezclaron 5 mg de Tx-SIAB bajo agitación con 2,6 mg de IFNα reducido y la agitación a temperatura de laboratorio continuó durante 1 hora y después durante 1 noche a 4ºC. La reacción se bloqueó mediante la adición de Cys, HCl a concentración final de 5 mM y reacción durante 30 minutos. 20
La mezcla de reacción se purificó mediante cromatografía de exclusión. La antigenicidad del Tat-toxoide y del IFNα se conservó en el conjugado.
EJEMPLO 3: Preparación de un conjugado [Tat péptidos (1-15) (46-60) SIAB-Tat]
Se trata de la producción de una vacuna compuesta apropiada para inducir principalmente una reacción inmunitaria celular (quimioquinas; T auxiliar, CTL) dirigida contra las células infectadas que expresan la proteína Tat y 25 una reacción inmunitaria humoral dirigida contra la proteína Tat extracelular.
1. Activación de los péptidos Tat con SIAB
Una mezcla de 1,5 mg de cada uno de los péptidos (1-15 y 46-60) disueltos en 600 µl de agua han sido activados mediante tratamiento, durante 1 hora a temperatura de laboratorio con 500 µl de una disolución de SIAB a 1,7 mg/ml en PBS, después de lo cual la mezcla de reacción se filtró sobre Sephadex G25 (columna 1 x 15 cm) 30 equilibrada con tampón OBS.
2. Reducción de la proteína Tat
Tat reducida por 2-mercaptoetilamina (véanse las condiciones en el ejemplo 3).
3. Acoplamiento de la proteína Tat a los péptidos Tat
Se mezclaron 0,75 mg de Tat péptidos activados mediante SIAB con 1,25 mg de Tat reducido, y se agitó la 35 mezcla durante 45 minutos a temperatura de laboratorio, y después se conservó durante 1 noche a 4ºC. La reacción fue bloqueada mediante la adición de Cys, HCl a concentración final de 5 mM, y después la mezcla se purificó y se filtró a través de las membranas calibradas. La proteína Tat en el conjugado fue desactivada mediante carboxamidación.
La antigenicidad del conjugado Tat péptidos - Tat toxoide con respecto a la del Tat toxoide fue determinada con la ayuda de un ELISA indirecto clásico. El conjugado Tat péptidos - Tat toxoide presenta una antigenicidad igual a la 40 antigenicidad de la proteína Tat toxoide.
EJEMPLO 4: Preparación de un conjugado [E7-SIAB-VEGF]
Este conjugado representa el principio activo de una vacuna compuesta apropiada para inducir principalmente en el vacunado una reacción celular (quimioquinas; T auxiliar, CTL) dirigida contra las células infectadas que expresan la proteína E7 y una reacción anticuerpo contra la proteína VEGF. Además, este conjugado podrá inducir la formación de 45 anticuerpos dirigidos contra la proteína E7 extracelular.
1 Activación de la proteína E7
Se disuelve 1 mg de proteína E7 en 1 ml de tampón borato 0,1 M - EDTA 5 mM, pH 8,5, que contiene 20% de dioxano. A esta disolución se añaden 400 µl de una disolución de SIAB a 1,7 mg/ml disuelto en el mismo tampón. La reacción continúa durante 1 hora a temperatura de laboratorio y la mezcla de reacción se aplica a una columna de 50 Sephadex G25 (1 x 16 cm) equilibrada con el tampón borato-EDTA-dioxano, y las fracciones que corresponden a la proteína se recogen y se agrupan.
2. Reducción de la proteína VEGF
La reducción se efectuó mediante la reacción con la 2-mercaptoetilamina en las condiciones descritas en el
ejemplo 3.
3. Acoplamiento de VEGF reducido a E7-SIAB
Se pone a reaccionar 1 mg de VEGF con 1 mg de E7 activado mediante el sulfo-SIAB. Después de 1 hora de reacción a temperatura de laboratorio, la reacción se bloqueó mediante la adición de cisteína a una concentración final de 5 mM y la mezcla de reacción se concentró mediante difusión contra sacarosa sólida. La disolución concentrada se purificó por último mediante cromatografía de exclusión. La antigenicidad de E7 y de VEGF se conservó en el 5 conjugado.
EJEMPLO 5: Preparación de un conjugado [Bet V 1a - SIAB - IL-4 (murino)]
Este conjugado representa el principio activo de una vacuna compuesta destinada a orientar la respuesta hacia la formación de anticuerpos de clase IgG y no ya IgE contra el alérgeno del abedul Bet V 1a.
1. Reducción de la IL-4 10
Se ha reducido 1 mg de IL-4 disuelto en 250 µl de tampón fosfato 10 mM, pH 7,2 + EDTA 1 mM mediante 2-mercaptoetilamina de acuerdo con las condiciones del ejemplo 3, y la citoquina reducida recogida mediante gelificación sobre Sephadex G25.
2. Activación de la proteína Bet V 1a por SIAB
Se ha diluido 1 mg de la proteína Bet V 1a disuelto en 500 µl de tampón fosfato 10 mM - EDTA 1 mM mediante 15 80 µl de disolución a 1,7 mg/ml de sulfo-SIAB durante 2 horas a temperatura de laboratorio. La mezcla de reacción se purificó mediante cromatografía de exclusión.
3. Acoplamiento de la IL4 reducida a Bet V 1a-SIAB
Se ha puesto a reaccionar 1 mg de IL4 con 0,5 mg de Bet V 1a activado por el sulfo-SIAB. Después de 1 hora de reacción a temperatura de laboratorio, la reacción se bloqueó mediante la adición de cisteína a una concentración 20 final de 5 mM y la mezcla de reacción se concentró mediante difusión contra sacarosa sólida. La disolución concentrada fue por último purificada mediante cromatografía de exclusión. La antigenicidad de IL4 y de Bet V 1a se conserva en el conjugado.
Ejemplos de actividad inmunogénica de los superinmunogénicos
EJEMPLO 6: Actividad inmunogénica del conjugado gp160-Tat toxoide 25
A. Material y métodos
La actividad inmunogénica de la preparación gp160-Tat toxoide con respecto a la del Tat toxoide solo y su ausencia de toxicidad han sido determinadas en el ratón Balb c de 18-20 g.
1- Inmunización:
El día 0, un grupo de 3 ratones recibe una inyección de 0,2 ml (50 µg) de una emulsión en ACF por vía 30 intramuscular. Una inyección de recuerdo de 5 µg en AIF se da el D21 y D60.
Una extracción sanguínea a nivel retro-orbital se efectúa sobre cada ratón antes de la primera inyección el D-2.
Tres ratones de control reciben las mismas preparaciones sin inmunógeno.
Los ratones son sacrificados 12 días después de la última inmunización.
2- Toxicidad: 35
La toxicidad anormal se busca en 3 ratones que reciben 1 dosis humana (100 µg) según la farmacopea.
La ausencia de inmunotoxicidad del superinmunógeno se evalúa in vitro mediante un ensayo de proliferación celular realizado sobre unos PBMC cultivados en presencia del conjugado y estimuladas por PPD o tétanos, toxoide.
B. Resultados:
1- Ausencia de toxicidad del superinmunógeno in vivo e in vitro 40
Los ratones inmunizados tanto por la preparación de gp160-Tat toxoide como por el Tat toxoide únicamente, no presentan ninguna señal clínica y ninguna lesión anatómica. El ensayo de inmunosupresión muestra que unas dosis de 100 ng/ml a 3 µg/ml de gp160-Tat toxoide no disminuyen la proliferación de los linfocitos.
Ninguno de los 3 ratones inmunizados con 100 µg de la preparación manifiesta señales de toxicidad (temperatura, trastornos cutáneos, manifestaciones sistémicas o regionales) durante los 7 días después de la inyección. 45
2- Respuesta humoral
La respuesta humoral se mide por la presencia en el suero de anticuerpos de tipo IgG dirigida contra la proteína recombinante Tat nativa, medida por ELISA y expresada en título (al contrario de la dilución que da una densidad óptica superior a 0,3).
Tabla 1
Título
D-2 D72
ratón de control:
ratón de control 1
<500-1 <500-1
ratón de control 2
<500-1 <500-1
ratón de control 3
<500-1 <500-1
ratón inmunizado con el Tat toxoide:
ratón 4
<500-1 32.000-1
ratón 5
<500-1 48.000-1
ratón 6
<500-1 48.000-1
Ratón inmunizado con el conjugado gp160-Tat toxoide:
ratón 7
<500-1 64.000-1
ratón 8
<500-1> 64.000-1
ratón 9
<500-1> 64.000-1
Los ratones inmunizados con la preparación de gp160-Tat toxoide presentan unos títulos de anticuerpos de tipo IgG anti-Tat más importantes que los de los ratones inmunizados con el Tat toxoide únicamente.
La actividad neutralizante de esos anticuerpos ha sido medida con la ayuda del Cat assay. Diferentes diluciones de sueros (1/50 - 1/400) extraídas el D-2 y D72 se incuban durante 2 horas con 50 ng/ml de Tat nativo. Estas diluciones se depositan a continuación sobre unas células HeLa, células transfectadas de manera estable con un plásmido que 5 contiene el LTR del VIH1 como promotor del gen cloramfenicol acetil transferasa (CAT). Después de 24 horas de cultivo, las células son lisadas y la cantidad de proteína CAT producida se mide mediante un ensayo ELISA, el Cat assay (Boehringer Mannheim). Lo sueros neutralizantes impiden que la proteína Tat induzca la expresión de la proteína CAT, mientras que los sueros no neutralizantes permiten la síntesis de esta proteína CAT. Los resultados se dan en % de neutralización. 10
Tabla 2
ratón inmunizado con el Tat toxoide:
1/50 1/100 1/200 1/400
ratón 4D-2
0 0 0 0
D72
75 50 25 20
ratón 5D-2
0 0 0 0
ratón inmunizado con el Tat toxoïde:
1/50 1/100 1/200 1/400
D72
75 60 30 20
ratón 6D-2
0 0 0 0
D72
75 60 30 20
Tabla 3
1/50 1/100 1/200 1/400
ratón 7D-2
0 0 0 0
D72
100 100 100 75
ratón 8D-2
0 0 0 0
D72
100 100 100 100
ratón 9D-2
0 0 0 0
D72
100 100 100 100
Los anticuerpos inducidos por el conjugado gp160-Tat toxoide tienen un poder neutralizante más importante que el inducido por el Tat toxoide.
3. Respuesta celular
3.1 Producción de MP1α y de MP1β en los sobrenadantes de cultivo de los esplenocitos
Los esplenocitos de los ratones inmunizados y de los ratones de control son aislados y después cultivados en unos pocillos de fondo redondo de una placa de microcultivo en una cantidad de 100.000 células/pocillo en presencia de 5 µg/ml de p24, de gp160, de Tat nativo y de una mezcla de 5 µg/ml de gp160 y de 5 µg/ml de Tat nativo. Los 5 sobrenadantes se recogen después de 24 horas de cultivo y se mide la presencia de MIP1α y de MIP1β en los sobrenadantes con la ayuda de un ensayo ELISA de R&D. Los resultados se expresan en pg/ml.
Tabla 4
Gp160 Tat nativo gp160+Tat nativo p24
Ratón de control:
Ratón 1
D72 MIP1α 110 100 150 10
MIP1β 100 90 140 7
Ratón 2
D72 MIP1α 120 95 153 8
MIP1β 112 80 114 6
Ratón 3
D72 MIP1α 124 98 128 9
MIP1β 99 112 117 7
Tabla 5
Ratones inmunizados por el Tat toxoide:
Ratón 4
D72 MIP1α 152 122 203 10
MIP1β 140 118 196 11
Ratón 5
D72 MIP1α 145 150 215 8,5
MIP1β 130 160 230 9
Ratón 6
D72 MIP1α 147 222 290 7
MIP1β 152 218 300 9
Tabla 6 10
Ratones inmunizados por el conjugado gp160-Tat toxoide:
Ratón7
D72 MIP1α 810 729 1600 7,5
MIP1β 1100 850 2000 10
Ratón8
D72 MIP1α 1000 821 1700 8
MIP1β 1125 876 2100 9
Ratón9
D72 MIP1α 975 768 1685 8
MIP1β 1000 803 1862 9
Los esplenocitos de los ratones inmunizados con el conjugado gp160-Tat toxoide producen más quimioquinas MIP1α y MIP1β que las células de los ratones inmunizados por el Tat toxoide únicamente cuando están activados, in vitro, mediante los inmunógenos utilizados durante la inmunización.
3.2 Producción de IFN gamma en los sobrenadantes de cultivo de los esplenocitos
La presencia de IFN gamma en los sobrenadantes de cultivo de los esplenocitos cultivados en presencia de 15 5 µg/ml de p24, de gp160, de Tat nativo y de una mezcla de 5 µg/ml de gp160 y de 5 µg/ml de Tat nativo se determina después de 72 horas de cultivo con la ayuda de un ensayo ELISA de R&D. Los resultados se expresan en pg/ml.
Tabla 7
Gp160 Tat nativo gp160+Tat nativo p24
Ratones de control:
Ratón 1
D72 0 0 0 0
Ratón 2
D72 0 0 0 0
Ratón 3
D72 0 0 0 0
Tabla 8
Ratones inmunizados con el Tat toxoide
Ratón 4
D72 ND ND ND ND
Ratón 5
D72 ND ND ND ND
Ratón 6
D72 ND ND ND ND
Tabla 9
Ratones inmunizados con el conjugado gp160-Tat toxoide:
Ratón 7
D72 40 600 6000
Ratón 8
D72 50 620 5950
Ratón 9
D72 65 700 6850
Los esplenocitos de los ratones inmunizados con el conjugado gap160-Tat toxoide producen una cantidad importante de IFN gamma cuando están activados, in vitro, con los inmunógenos utilizados durante la inmunización.
3.3. Proliferación de los esplenocitos de ratones inmunizados (CMI)
Los esplenocitos de los ratones inmunizados y de los ratones de control se aíslan y después se cultivan en 5 unos pocillos de fondo redondo de una placa de micro-cultivo en una cantidad de 100.000 células/pocillo en presencia de p24, de gp160, de Tat nativo y de una mezcla de gp160 y de Tat nativo. El cultivo celular continúa a 37ºC en atmósfera húmeda cargada con CO2 al 5% durante 6 días. Se añaden 18 horas antes del final de la incubación 0,5 µCi de timidina tritiada/pocillo. La intensidad de la respuesta inmunitaria es proporcional al índice de proliferación Ip.
Ip = cpm (golpes por minuto) para el antígeno dado/cpm de control 10
Tabla 10
Gp160 Tat nativo gp160+Tat nativo p24
Ratón de control :
Ratón 1 D72
1,2 1 1,1 1
Ratón2 D72
1 1,2 1 1,1
Ratón3 D72
1,1 1,1 1 1
Tabla 11
Ratones inmunizados con el Tat toxoide
Gp160 Tat nativo gp160+Tat nativo p24
Ratón 4 D72
1,2 10 9 1
Ratón 5 D72
1 8 10 1,2
Ratón 6 D72
1,1 9 8 1,1
Tabla 12
Ratones inmunizados con el conjugado gp160-Tat toxoide:
Gp160 Tat nativo gp160+Tat nativo p24
Ratón 7 D72
8 10 9 1
Ratón 8 D72
9 8 10 1
Ratón 9 D72
11 10 9 1
Los esplenocitos de los ratones inmunizados con el conjugado gp160-Tat toxoide o el Tat toxoide proliferan cuando están activados, in vitro, con los inmunógenos utilizados durante la inmunización. 15
EJEMPLO 7: Actividad inmunogénica del conjugado [Tat péptidos (1-15; 46-60)] SIAB-[Tat toxoide]
A. MATERIAL Y MÉTODOS
La actividad inmunogénica de la preparación de péptidos Tat-Tat toxoide con respecto a la del Tat toxoide solo y su ausencia de toxicidad han sido determinados en el ratón Balb c de 18-20 g según los protocolos descritos en el ejemplo 6. 20
B. Resultados:
1- Ausencia de toxicidad del superinmunógeno in vivo e in vitro
Los ratones inmunizados tanto por la preparación de péptidos Tat-Tat toxoide como por el Tat toxoide
únicamente no presentan ninguna señal clínica y ninguna lesión anatómica. El ensayo de inmunosupresión muestra que unas dosis de 100 ng/ml a 3 µg/ml de péptidos Tat toxoide no disminuyen la proliferación de los linfocitos.
Ninguno de los 3 ratones inmunizados con 100 µg de la preparación manifiesta señales de toxicidad (temperatura, trastornos cutáneos, manifestaciones sistémicas o regionales) durante los 7 días después de la inyección.
2- Respuesta humoral 5
La respuesta humoral se mide por la presencia en el suero de anticuerpos de tipo IgG dirigida contra la proteína recombinante Tat nativa, medida mediante ELISA y expresada en título (a la inversa de la dilución que da una densidad óptica superior a 0,3).
Tabla 13
Título
D-2 D72
ratón de control :
ratón 1
<500-1 <500-
ratón 2
<500-1 <500-1
ratón 3
<500-1 <500-1
ratones inmunizados con el Tat toxoide:
ratón 4
<500 1 32.000-1
ratón 5
<500-1 48.000-1
ratón 6
<500-1 48.000-1
ratones inmunizados con el Tat péptdo-Tat toxoide:
ratón 7
<500-1 64.000-1
ratón 8
<500-1 64.000-1
ratón 9
<500-1 64.000-1
Los ratones inmunizados con el conjugado péptidos Tat-Tat toxoide presentan unos títulos de anticuerpos de 10 tipo IgG anti-Tat más importantes que los de los ratones inmunizados con el Tat toxoide únicamente.
La actividad neutralizante de estos anticuerpos ha sido medida con la ayuda del Cat assay.
Los resultados se dan en % de neutralización.
Tabla 14
Ratones inmunizados con el Tat toxoide
% de neutralización
1/50 1/100 1/200 1/400
ratón 4D-2
0 0 0 0
D72
75 50 25 20
ratón 5D-2
0 0 0 0
D72
75 60 30 20
ratón 6D-2
0 0 0 0
D72
75 60 30 20
Tabla 15 15
Ratones inmunizados con el conjugado péptido Tat-Tat toxoide
1/50 1/100 1/200 1/400
ratón 7D-2
0 0 0 0
D72
100 100 50 25
ratón 8D-2
0 0 0 0
D72
100 100 75 50
ratón 9D-2
0 0 0 0
D72
100 100 60 30
Los anticuerpos inducidos por el conjugado péptidos Tat-Tat toxoide tienen un poder neutralizante más importante que el inducido por el Tat toxoide.
EJEMPLO 8: Actividad inmunogénica del conjugado E7-SIAB-VEGF
A. MATERIALES Y MÉTODOS
La actividad inmunogénica del conjugado E7-SIAB-VEGF con respecto a la del VEGF y de la proteína E7 y su 5 ausencia de toxicidad han sido determinadas en el ratón C57 black 6 de 6 semanas de edad según los protocolos descritos en el ejemplo 6.
B. Resultados:
1. Ausencia de toxicidad del superinmunógeno in vivo e in vitro
Los ratones inmunizados tanto por la preparación de E7-DIAB-VEGF como por la proteína E7 o por el VEGF no 10 presentan ninguna señal clínica ni ninguna lesión anatómica. El ensayo de inmunosupresión muestra que unas dosis de 100 ng/ml a 3 µg/ml del conjugado E7-SIAB-VEGF no disminuyen la proliferación de los linfocitos.
Ninguno de los 3 ratones inmunizados con 100 µg de la preparación manifiesta señales de toxicidad (temperatura, trastornos cutáneos, manifestaciones sistémicas o regionales) durante los 7 días después de la inyección.
2. Respuesta humoral 15
La respuesta humoral se mide mediante la presencia en el suero de anticuerpos de tipo IgG dirigida contra la proteína E7 y contra el VEGF y, se mide mediante ELISA y se expresa en título (a la inversa de la dilución que da una densidad óptica superior a 0,3).
Tabla 16
Título D-2 D72
ratón de control:
ratón 1
E7 <500-1 <500-1
VEGF <500-1 <500-1
ratón 2
E7 <500-1 <500-1
VEGF <500-1 <500-1
ratón 3
E7 <500-1 <500-1
VEGF <500-1 <500-1
Tabla 17 20
ratones inmunizados con el VEGF:
ratón 4
E7 <500-1 <500-1
VEGF <500-1 <1.000-1
ratón 5
E7 <500-1 <500-1
VEGF <500-1 1.500-1
ratón 6
E7 <500-1 <500-1
VEGF <500-1 500-1
Tabla 18
ratones inmunizados con el E7:
ratón 7
E7 <500-1 48.000-1
VEGF <500-1 <500-1
ratón 8
E7 <500-1 64.000-1
VEGF <500-1 <500-1
ratón 9
E7 <500-1 48.000-1
VEGF <500-1 <500-1
Tabla 19
ratones inmunizados con el conjugado E7-SIAB-VEGF:
ratón 10
E7 <500-1 48.000-1
VEGF <500-1 48.000-1
ratón 11
E7 <500-1 64.000-1
VEGF <500-1 32.000-1
ratón 12
E7 <500-1 48.000-1
VEGF <500-1 48.000-1
Los ratones inmunizados con el conjugado E7-SIAB-VEGF presentan unos títulos de anticuerpos de tipo IgG anti-VEGF más importantes que los de los ratones inmunizados con el VEGF únicamente, mientras que su respuesta anti-E7 sigue siendo idéntica a la obtenida en los ratones inmunizados con el E7 únicamente.
3. Respuesta celular:
3.1. Proliferación de los fenocitos de ratones inmunizados (CMI) 5
Los esplenocitos de los ratones inmunizados y de los ratones de control se aíslan y después se cultivan en unos pocillos de fondo redondo de una placa de micro-cultivo a razón de 100.000 células/pocillo en presencia de E7 nativo. El cultivo celular continúa a 37ºC en atmósfera húmeda cargada con CO2 al 5% durante 6 días. Se añaden, 18 horas antes del final de la incubación, 0,5 µCi de timidina tritiada por pocillo. La intensidad de la respuesta inmunitaria es proporcional al índice de proliferación Ip. 10
Ip = cpm (golpes por minuto) para el antígeno dado/cpm de control
Tabla 20
Ratones de control:
Ratón 1 D72
1,2
Ratón 2 D72
1
Ratón 3 D72
1,1
Ratones inmunizados con el VEGF:
Ratón 4 D72
1,2
Ratón 5 D72
1
Ratón 6 D72
1,1
Ratones inmunizados con el E7:
Ratón 7 D72
6
Ratón 8 D72
10
Ratón 9 D72
8
Ratones inmunizados con el conjugado E7-SIAB-VEGF:
Ratón 10 D72
7
Ratón 11 D72
10
Ratón 12 D72
9
Los esplenocitos de ratones inmunizados con el conjugado E7-SIAB-VEGF, proliferan, cuando están activados, in vitro con la proteína E7.
EJEMPLO 9: Inmunogenicidad del conjugado Betv1a-SIAB-IL4 (murino) 15
A. MATERIALES Y MÉTODOS
La actividad inmunogénica del conjugado Betv1a-SIAB-IL4 (murino) con respecto a la del Betv1a y de la IL4 (murino) y su ausencia de toxicidad han sido determinadas en el ratón Balb c de 18-20 g según los protocolos descritos en el ejemplo 6.
B- Resultados: 20
1- Ausencia de toxicidad del superinmunógeno in vivo e in vitro
Los ratones inmunizados tanto por el conjugado Betv1a-SIAB-IL4 como por la IL-4 únicamente no presentan ninguna señal clínica ni ninguna lesión anatómica. El ensayo de inmunosupresión muestra que unas dosis de 100 ng/ml a 3 µg/ml del conjugado Betv1a-SIAB-IL4 no disminuyen la proliferación de los linfocitos.
Ninguno de los 3 ratones inmunizados con 100 µg de la preparación manifiesta señales de toxicidad (temperatura, trastornos cutáneos, manifestaciones sistémicas o regionales) durante los 7 días después de la inyección.
2. Respuesta humoral
La respuesta humoral se determina mediante la presencia en el suero de anticuerpos de tipo IgG dirigida contra el Betv1a y la IL4, medida mediante ELISA y expresada en título (a la inversa de la dilución que da una densidad óptica 5 superior a 0,3).
Tabla 21
Título D-2 D72
ratón de control:
ratón 1
Betv1 a <500-1 <500-1
IL4 <500-1 <500-1
ratón 2
Betv1 a <500-1 <500-1
IL4 <500-1 <500-1
ratón 3
Betvl a <500-1 500-1
IL4 <500-1 <500-1
Tabla 22
ratones inmunizados con el Betv1a
Título D-2 D72
ratón 4
Betv1 a <500-1 48.000-1
IL4 <500-1 <500-1
ratón 5
Betv1 a <500-1 64.000-1
IL4 <500-1 <500-1
ratón 6
Betv1 a <500-1 64.000-1
IL4 <500-1 <500-1
ratón 7
Betv1 a <500-1 <500-1
IL4 <500-1 500-1
ratón 8
Betv1 a <500-1 <500-1
IL4 <500-1 1.500-1
ratón 9
Betv1 a <500-1 <500-1
IL4 <500-1 1.000-1
Tabla 23
ratones inmunizados con el conjugado Betv1 a-SIAB-IL4
Título D-2 D72
ratón 10
Betv1 a <500-1 48.000-1
IL4 <500-1 48.000-1
ratón 11
Betv1 a <500-1 64.000-1
IL4 <500-1 32.000-1
ratón 12
Betv1 a <500-1 48.000-1
IL4 <500-1 48.000-1
Los ratones inmunizados con el conjugado Betv1a-SIAB-IL4 presentan unos títulos de anticuerpos de tipo IgG 10 anti-IL4 más importantes que los de los ratones inmunizados con IL4 únicamente, mientras que su respuesta anti-Betv1a sigue siendo idéntica a la obtenida en los ratones inmunizados con el Betv1a únicamente.
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Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
  2. 1. Utilización de un superinmunógeno compuesto que comprende dos polipéptidos inmunógenos distintos acoplados entre sí por vía química y separados entre sí, en el seno de dicho superinmunógeno compuesto, por una cadena espaciadora, comprendiendo dicho superinmunógeno compuesto:
    - un primer polipéptido (a) inmunógeno que consiste en la proteína gp160 del virus VIH1, destoxicada o 5 estabilizada si es necesario, un fragmento inmunógeno de gp160 o una proteína inmunógena que se deriva de los mismos; y
    - un segundo polipéptido (b) inmunógeno que consiste en la proteína Tat del virus VIH1, destoxicada o estabilizada si es necesario, un fragmento inmunógeno de Tat o una proteína inmunógena que se deriva de los mismos, 10
    para la obtención de un medicamento de acción antivírica para la prevención o el tratamiento del SIDA, que induce una inmunidad mucosal o sistémica simultáneamente contra la estructura antigénica patógena y la proteína circulante local del estroma.
  3. 2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el superinmunógeno compuesto comprende un primer polipéptido inmunógeno (a) que consiste en la proteína gp160 del VIH1 y un segundo polipéptido inmunógeno (b) 15 que consiste en la proteína Tat del VIH destoxicada.
  4. 3. Utilización según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque la cadena espaciadora consiste en un péptido espaciador lineal.
  5. 4. Utilización según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque la cadena espaciadora consiste en un péptido espaciador ramificado. 20
  6. 5. Utilización según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque la cadena espaciadora es una cadena de tipo SIAB o SMCC.
  7. 6. Compuesto superinmunógeno compuesto que comprende dos polipéptidos inmunógenos distintos acoplados entre sí por vía química y separadas entre sí, en el seno de dicho superinmunógeno compuesto, por una cadena espaciadora, comprendiendo dicho superinmunógeno compuesto: 25
    - un primer polipéptido (a) inmunógeno que consiste en la proteína gp160 del virus VIH1, destoxicada o estabilizada si es necesario, un fragmento inmunógeno de gp160 o una proteína inmunógena que se deriva de los mismos; y
    - un segundo polipéptido (b) inmunógeno que consiste en la proteína Tat del virus VIH1, destoxicada o estabilizada si es necesario, un fragmento inmunógeno de Tat o una proteína inmunógena que se deriva de los 30 mismos,
  8. 7. Compuesto superinmunógeno compuesto según la reivindicación 6, caracterizado porque el superinmunógeno compuesto comprende un primer polipéptido inmunógeno (a) que consiste en la proteína gp160 del VIH1 y un segundo polipéptido inmunógeno (b) que consiste en la proteína Tat del VIH destoxicada.
  9. 8. Compuesto superinmunógeno compuesto según una de las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque la 35 cadena espaciadora consiste en un péptido espaciador lineal.
  10. 9. Compuesto superinmunógeno compuesto según una de las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque la cadena espaciadora consiste en un péptido espaciador ramificado.
  11. 10. Compuesto superinmunógeno compuesto según una de las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque la cadena espaciadora es una cadena de tipo SIAB o SMCC. 40
  12. 11. Composición inmunógena, caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un superinmunógeno compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 10, en asociación con uno o varios excipientes fisiológicamente compatibles.
  13. 12. Vacuna, caracterizada porque comprende, a título de principio activo, un superinmunógeno compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 10, en asociación con uno o varios excipientes fisiológicamente compatibles. 45
ES02772502T 2001-08-10 2002-08-09 Superinmunógeno compuesto de cunal bifuncional tat-gp 160 para el tratamiento del sida. Expired - Lifetime ES2355711T3 (es)

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