CN1568197A - 用于间质组织紊乱相关疾病治疗的具有双功能疫苗用途的复合超免疫原 - Google Patents

用于间质组织紊乱相关疾病治疗的具有双功能疫苗用途的复合超免疫原 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于某些癌症、病毒感染和过敏症的系统或粘膜疫苗治疗新手段，根据本发明，所述手段以具有双功能疫苗功能的复合超免疫原化合物家族的形式提供，所述化合物可以诱导针对两个不同靶的免疫应答，一个靶是致病性抗原结构，另一个靶是造成随后免疫毒性或新血管形成性间质紊乱的局部产生的因子。

Description

用于间质组织紊乱相关疾病治疗的具有双功能疫苗用途的复合超免疫原
发明领域
本发明涉及预防和治疗由致病性抗原结构的局部组织表达引起的疾病，所述表达与免疫或血管秩序的间质性紊乱相关，从而导致免疫毒性或新血管发生(neoangiogenesis)，此类疾病包括一些病毒感染、一些癌症及过敏症。
本发明涉及开发的新预防性或治疗性治疗手段，称作复合超免疫原，它诱导对致病性抗原结构和引起相关间质组织紊乱的蛋白的免疫应答。
现有技术
作为Louis Pasteur首次实验工作的一个结果，在二十世纪，以制备更高特异性和效率的疫苗为目的，试图了解免疫机制。首先大规模使用的疫苗包括减毒活病菌或伴随有蛋白或膜杂质的免疫原制品，此时用作免疫佐剂的是未清楚表征的组合物和结构。
后来，从纯化的抗原，例如蛋白亚单位或蛋白类毒素研发了疫苗，而此时使用更为明确、更为有效且无毒性的免疫佐剂，这些疫苗主要设计用于通过针对致感染因子的免疫应答来克服和控制感染性疾病。
近二十年间，大规模的疫苗成功(包括通过基因工程技术获得的)和对免疫反应机制的更好理解使得研究者可以扩展疫苗的使用，以治疗与载有外源抗原或异常表达的抗原的生物结构(病菌、惰性或活性环境细胞或颗粒)有关的慢性病，例如艾滋病、癌症、过敏症和自身免疫病等疾病。
为了使用疫苗预防或治疗上面提到的疾病，已经系统地尝试诱导针对致病结构的免疫应答，所述致病结构例如由病毒感染的细胞选择表达的病毒蛋白、由癌细胞选择表达的蛋白或变应性蛋白，这些都是此类疾病的主要致病因子。
作为例子，为了克服艾滋病病毒，尤其是HIV1感染，当前制备的候选疫苗旨在诱导专门地靶向某些病毒蛋白或肽的免疫应答。
相似地，作为最新临床研究对象的抗癌疫苗旨在诱导专门定向破坏表达癌症相关抗原(例如，在由某些乳头瘤病毒引起的癌症情况下，病毒蛋白)的细胞或者病毒(例如艾滋病中HIV1)感染细胞的免疫应答。
根据同样的疫苗策略，目前抗过敏疫苗仅仅旨在诱导针对主要致病性变应原的免疫应答。
癌是后来能在体内传播以至于形成转移的细胞增殖。已知正常个体的免疫系统有规律地清除早期癌细胞，癌症的产生(1)与逃脱局部免疫监视系统和在癌晚期出现系统免疫抑制有关；(2)与保证肿瘤细胞获得营养供应的血管内皮细胞的增殖有关，此肿瘤细胞增殖称为新血管形成。
通过诱导宿主免疫防御的原位麻痹而逃脱宿主细胞的免疫防御是大多数癌症采用的策略，且是它们存活所必需的。起初，免疫抑制局限在肿瘤水平，因为个体仍能保卫自己防御其他攻击，例如感染。
然而，在后期，免疫抑制可能蔓延，扩及全身，这可以由转移瘤的扩散以及癌症患者对感染的高易感性看出。此免疫抑制涉及由癌细胞或它们周围细胞产生的麻痹因子(paralyzing factor)。免疫系统细胞的局部麻痹或免疫抑制因此是癌细胞逃脱宿主免疫系统的主要武器。在某些感染性疾病中，例如艾滋病中，病毒入侵者使用的也正是此免疫抑制策略。因此，由HIV1感染的细胞释放的蛋白对周围免疫细胞而言是一种真正的毒素，其扰乱并原位，即，以旁分泌方式阻碍免疫系统细胞从而保护受感染的细胞、病毒复制及它们的传播。
申请人以前的工作(在出版的国际申请WO00/03732中提到的)显示在ATL白血病、宫颈癌及卡波西肉瘤的情况下，以下三种蛋白分别参与了肿瘤或HIV1感染细胞水平的局部免疫抑制：
HTLV1病毒的Tax蛋白；
乳头瘤病毒的E7蛋白，及
HIV1病毒的Tat蛋白。
申请人还公开了一些免疫抑制性蛋白，例如HIV1的Tat蛋白及HPV(16和18株)的E7蛋白也有对血管内皮细胞的激活效应。
他们因此提出开发含有衍生自如下蛋白的去毒免疫原性化合物的抗癌或抗病毒疫苗；其中所述蛋白源自癌细胞、病毒感染的细胞或间质免疫细胞，并且起初具有局部的免疫抑制和/或生血管作用；所述去毒免疫原性化合物为例如衍生自HIV1病毒Tat蛋白、HTLV-1病毒Tax蛋白、乳头瘤病毒E7蛋白及甘露聚糖依赖性凝集素的灭活蛋白形式。
在克服艾滋病、癌症和过敏症的潜在治疗策略的另一方面，基于与上面PCT申请WO00/03732中所提供的疫苗的原理相类似的原理，ZAGURY D等(2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 98(14)：8024-8029)通过文献研究提出在患者体内诱导一些抗细胞因子免疫以制衡在此类疾病中异常产生的某些细胞因子，所述细胞因子包括白介素、淋巴因子、单核因子、干扰素，它们在组织中具有生理作用并局部地用作细胞增殖、分化或程序死亡的因子。
上面提到的作者指出，直到今天，疫苗治疗策略仅仅旨在靶向抗原性攻击者，无论它是微生物、细胞或过敏原，但从没有尝试过克服在攻击者作用下诱导的细胞因子失调。这些作者提出将抗细胞因子疫苗接种作为传统疫苗接种方法的辅助手段以中和或封闭间质免疫毒性效应及允许免疫应答能适应于抗原性攻击者正常发展。然而，ZAGURY等(2001)没有提供能证实诱导此免疫应答对病毒感染患者、癌症患者及严重(例如系统的)过敏反应易感个体具有益处的任何具体实验证据。
为了预防或治疗某些癌症、病毒感染(包括HTLV-1或HIV-1病毒)或严重过敏症，本领域目前需要比现有疫苗疗法更安全且更有效的改进的疫苗疗法。
发明概述
本发明以具有双功能疫苗用途的复合超免疫原化合物家族的形式提供了针对某些癌症、病毒感染及过敏症的系统或粘膜疫苗治疗新方法，所述化合物能诱导针对两个不同靶标的免疫应答，所述靶标分别地为致病性抗原结构和局部产生的负责后来的间质免疫毒性或新血管形成紊乱的因子。
本发明的目的是含有物理上彼此相连的两个不同免疫原性多肽的双功能复合超免疫原，其中，两个多肽分别为：
(a)诱导针对惰性或活性细胞、微生物或颗粒致病性抗原结构的细胞免疫应答或细胞和体液免疫应答的第一免疫原性多肽；
(b)诱导产生针对间质局部循环蛋白的中和或封闭性抗体的第二免疫原性多肽，此间质局部循环蛋白选自有免疫毒性或生血管特性的细胞因子或细胞调节因子，此类因子或能由癌细胞、病毒感染细胞或间质细胞(包括T淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC))产生，或能被致病性(包括变应性)颗粒结构诱导，
所述复合超免疫原可以用于生产具有诱导对致病性抗原结构和间质局部循环蛋白的粘膜或系统免疫的抗癌、抗病毒或抗过敏作用的药物。
第一方面，多肽(a)诱导对癌细胞、病毒感染细胞特异表达的抗原或颗粒结构的抗原成分的细胞免疫应答以及任选地体液免疫应答；颗粒结构包括活性颗粒结构，例如花粉、蜱螨类和一些寄生虫例如硕大利什曼原虫(Leishmania major)，及惰性颗粒结构，例如灰尘和猫的毛发。
第一免疫原性多肽(a)选自：(i)由癌细胞选择表达的、由病毒感染细胞选择表达的或作为变应性致病结构的组分的免疫原性蛋白(如果需要的话，去毒形式的该蛋白)和(ii)衍生自(i)的蛋白。
第二方面，多肽(b)诱导针对在间质组织中以异常方式局部释放的循环蛋白的体液应答。
在此第二方面，免疫原性多肽(b)选自：(i)间质局部循环蛋白(如果需要的话可以去毒)和(ii)衍生自(i)的蛋白。
我们认为作为细胞致病性结构的成分在间质中释放的一些有免疫毒性或生血管特性的蛋白，可用作复合超免疫原的多肽(a)或多肽(b)。HIV的Tat蛋白、HPV的E7蛋白及细胞调节因子p53正是这种情况。
优选地，使用以下超免疫原化合物：
a)抗病毒疫苗
-复合超免疫原(a)HIVI的gp160-(b)HIV1的Tat类毒素；
-复合超免疫原(b)HIVI的Tat肽[1-15；46-60]-(a)HIV1的gp160；
-复合超免疫原(a)HIV1的Tat类毒素-(b)IFNα；
-复合超免疫原(a)HIV1的Tat类毒素-(b)HIV1的Tat肽[1-15；46-60]；
b)抗癌疫苗
-复合超免疫原(a)HPV的L1-(b)HPV的E7；
-复合超免疫原(a)HPV的E7-(b)VEGF；
c)抗过敏疫苗
-复合超免疫原(a)Betv1a-(b)异源IL4。
根据本发明，多肽(a)和(b)物理上彼此连接，在所有情况下，它们在一个载体上一起呈递给免疫系统细胞。多肽(a)和(b)可以共价连接在同一分子结构上。
多肽(a)和(b)也可以一起包含于单个物理结构中，例如直径10-500纳米，优选10-1000纳米，最优选10-100纳米的单颗粒上，例如IMS纳米颗粒(参见例如Aucouturier等(2001)的公开)，脱乙酰壳多糖纳米颗粒(参见例如Skaugrud(1999)等的公开)，脂质体，或可生物降解颗粒例如聚乳酸(PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)或聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)(参见Baras等(1999)的公开)。
第一方面，所述用途的特征在于多肽(a)和(b)彼此直接共价连接。
第二方面，所述用途的特征在于多肽(a)和(b)通过间隔链在超免疫原肽中彼此分开。间隔链例如可以是线性间隔肽、分支间隔肽及双官能间隔化合物例如SMCC或SIAB。
第三方面，多肽(a)和(b)固定于纳米颗粒(nanoparticle)上或嵌在微米颗粒(microparticle)或纳米颗粒中。优选地，多肽(a)和(b)一起固定于同一纳米颗粒上或嵌入同一纳米颗粒中。
本发明也涉及含有两个彼此相连的不同多肽的免疫原性肽缀合物，两个多肽分别为如上定义的多肽(a)和(b)。
本发明也涉及编码如此处以上定义的复合超免疫原化合物的核酸，及含有此核酸的表达盒及重组载体；还有此核酸、表达盒或重组载体在生产有抗癌、抗病毒或抗过敏作用的药物中的用途。
本发明也涉及免疫原性组合物，它含有免疫学有效量的如上面定义的免疫原性化合物以及一种或多种赋形剂，包括生理上相容的免疫佐剂。
依赖于所要达到的目的，使用系统的或粘膜的佐剂。例如，粘膜佐剂优选用于预防上皮组织癌，系统佐剂优选用于预防或治疗病毒(例如HIV1和HTLV1)感染及预防或治疗过敏症。
系统佐剂中，优选使用的佐剂是IFA类(弗氏不完全佐剂)、磷酸钙或氢氧化铝。
粘膜佐剂中，优选使用的佐剂是例如霍乱毒素B(CTB)或大肠杆菌不稳定毒素LT的突变体(LTμ)。
本发明也涉及粘膜的或系统的疫苗，其特征在于它包含如上面定义的免疫原性化合物作为活性成分并包含一种或多种赋形剂，包括生理上相容的免疫佐剂。
本发明的另一个目的是用于粘膜或系统目的的免疫原性组合物和疫苗，其特征在于它们含有治疗有效量的如上面定义的核酸、表达盒或重组载体。
附图描述
图1是使用复合超免疫原化合物开发的疫苗接种策略的一般方案。
在图1左侧的箭头显示常规抗癌、抗病毒和抗过敏疫苗制品所针对的结构的性质，即作为引起病理症状发展的主要因素的致病性抗原结构，例如癌细胞、HIV感染细胞或花粉变应性抗原。
在图1右侧的双箭头显示根据本发明的疫苗制品所针对的结构的两种性质：
a)如上面详述的致病性抗原结构；和
b)在间质微环境中循环并可以引起在某些癌症、重度病毒感染或过敏症中见到的免疫和血管类间质组织紊乱的蛋白因子。
发明详述
申请人发现，某些病毒例如HIV-1感染的细胞的微环境和癌细胞的微环境所具有的免疫抑制和血管发生作用可以为本领域目前的疫苗接种策略缺乏有效性提供合理解释，本领域现有的疫苗接种策略仅仅旨在靶向癌细胞而非它的微环境紊乱。
申请人的工作显示，由HIV-1感染细胞分泌的可溶性因子，尤其是Tat蛋白、或者由HIV感染患者的免疫细胞分泌的可溶性因子，尤其是IFN-α和TGF-β、或者由癌细胞产生的可溶性因子例如宫颈癌中HPV的E7蛋白或ATL白血病中HTLV-1的Tax蛋白具有能抑制感染组织或肿瘤内的细胞免疫应答的免疫抑制特性，由此解释了仅仅使用致病性抗原结构(例如癌细胞、HIV感染细胞)所携带的免疫原的传统疫苗为何缺乏有效性。
通过文献研究可以支持申请人的观点，证实恶性肿瘤的胞外介质中存在释放的免疫抑制因子。
这些因子中的某些，至今仍没有鉴定，其产生自：
-结肠直肠癌细胞(Ebert EC，Roberts AI，O`Connell SM，RobertsonFM，Nagase H，表征源自结肠癌细胞的免疫抑制性因子，J.Immuneol.(1987)138.2161-8；或者Remacle-Bonn和MM，Pommier FJ，KaplanskiS，Rance RJ，Depieds RC，从结肠癌中提取的可溶性抑制剂抑制同种异体淋巴细胞的正常有丝分裂，J.Immunol.(1976)117：1145-51)，
-成胶质细胞瘤细胞(29-Fontana A，Hengartner H，de TriboletN，Weber E.成胶质细胞瘤细胞释放白介素1和能抑制白介素2介导的作用的因子，J.Immunol.(1984)132：1837-44)，
-黑素瘤(30.Hersey P，Bindon，Czerniecki M，spurling A，WassJ，McCarthy WH.肿瘤细胞释放的因子抑制白介素2的产生，J.Immunol(1983)131：2837-42)或
-恶性腹水(Tamura K，Shibata Y，Matsuda Y，Ishida N.分离并表征来自癌症患者的酸性体液的免疫抑制性酸性蛋白，CancerRes.(1981)41：3244-52；Oh SK，Moolten FL，恶性腹水中的非特异性免疫抑制因子：进一步的表征和与人外周T细胞的红细胞受体的可能关系，J.Immunol(1981)127：2300-7)。
其他转录调节因子，例如上面讨论的，是细胞来源的，例如p53蛋白，其在某些恶性肿瘤，更特别地结肠直肠肿瘤中聚积(Remvikos Y.TominagaO，Hammel P，Laurent-Puig P，Salmon RJ，Dutrillaux B，Thomas G.结肠直肠肿瘤中p53蛋白含量的增加与差的存活相关，Br.J.Cancer 199266：758-64；Gan H，Ouyang Q，Wang Y.p53蛋白在结肠直肠癌中的表达及其与细胞增生活性和预后的关系，Chung Hua Chung Liu Tsa Chih(1996))。p53蛋白经主动运输通过分泌途径释放(不使用信号肽)或通过被动扩散释放出现在胞外介质中，并且已经从癌症患者的血清中通过在玻璃纤维上层析分离出来(Zusman I，Sandler B，Gurevich P.，Zusman R，SmirnoffP，Tendler Y，Bass D，Shani A，Idelevich E，Pfefferman R，DavidovichB，Huszar M，Glick J，比较性研究p53抗原血清水平和其肿瘤细胞浓度在结肠癌检测中的作用，Hum Antibodies Hybridomas，(1996)：123-8；Sandler B，Smirnoff P，Tendelr Y，Zinder O，Zusmar R，Zusma I，用于从人血清中分离可溶性p53抗原的多克隆抗p53 IgG的特异性，Int J.Mol.Med，1998，1：767-70))。
细胞因子，例如有名的免疫抑制性TGFβ、有生血管活性的生长因子VEGF、也有免疫抑制活性的促炎因子IL-6或IL-10会异常分泌并释放于某些癌细胞的胞外介质中。申请人自己证实来自SIHA癌细胞系的细胞、前列腺癌的DU145细胞和来自白血病细胞系的MT2细胞可以异常产生并释放细胞因子例如VEGF和/或IL-6于胞外介质中，而白血病细胞系RAJI细胞向胞外介质中分泌IL10。
根据本发明，目前证实，为了预防或治疗某些癌症、某些病毒感染或过敏症，更尤其是有过敏性休克危险的重度过敏症，必需同时诱导针对如下(a)和(b)的免疫应答：
a)作为引起疾病的主要因素的致病性抗原结构，细胞、微生物或颗粒；
b)造成与疾病有关的免疫或血管水平上的间质组织紊乱的间质局部循环蛋白。
本发明证实，上述免疫应答可以根据本发明使用称作复合超免疫原的化合物家族来诱导，获得高刺激水平的免疫系统细胞，所述复合超免疫原具有双功能，其包含通过物理方式彼此连接的第一多肽和第二多肽，其中，第一多肽诱导对致病性抗原结构的免疫应答而第二多肽诱导对间质局部循环蛋白的免疫应答。
对于给定的组织，间质是指作为组织的特化细胞的微环境的细胞间隙。肝组织中，环绕在特化的肝细胞周围的间质包括其中容纳着两种免疫细胞(T和B淋巴细胞，抗原呈递细胞或APC)、多核细胞、肥大细胞、成纤维细胞的营养介质(也称作淋巴)以及具有内皮细胞衬里的毛细管。在粘膜的或皮肤的上皮组织中，上皮下间质称为真皮，也包含细胞间隙，其固定于作为其基质的结缔组织上并也在其中包含循环的免疫系统细胞和上面提到的毛细管。
为了预防或治疗某些癌症，本发明的复合超免疫原同时诱导：
a)细胞免疫应答，该免疫应答通过T辅助细胞(T helper或Th细胞)的活化和/或对癌细胞表达的致病抗原结构(例如TAA或TSA肿瘤抗原)特异的细胞毒性T细胞(CTL)的产生及杀伤细胞(也称作自然杀伤细胞或NK)的产生而实现，从而允许选择性地杀死所述癌细胞；和
b)体液免疫应答，该免疫应答通过诱导中和性抗体或封闭性抗体的产生而实现，所述抗体特异地针对异常产生的间质循环蛋白，主要是有免疫毒性特性或生血管特性的蛋白。
为了预防或治疗某些病毒感染，如果需要，与癌症发展有关的病毒感染，本发明的复合超免疫原同时诱导：
a)细胞免疫应答，该免疫应答通过T辅助细胞的活化和/或通过诱导对病毒感染细胞表达的病毒致病抗原结构(例如某些HIV1或乳头瘤病毒蛋白)特异的细胞毒性T细胞(CTL)的产生或诱导杀伤细胞(也称作自然杀伤细胞或NK)的产生来实现，从而允许选择性地杀死所述病毒感染细胞；和
b)体液免疫应答，该免疫应答通过诱导中和性抗体或封闭性抗体的产生而实现，所述抗体特异地针对异常产生的间质局部循环蛋白，包括病毒循环蛋白或细胞因子，主要是有免疫抑制或致细胞凋亡(apoptogenic)(免疫毒性)特性或生血管特性的蛋白。
而且，申请人把HIV1病毒或HTLV1病毒感染情况下的某些细胞毒性观察数据和Sadick等(1990，J.Exp.Med，171：115-127)报道的在针对花粉、蜱螨类或寄生虫，例如硕大利什曼原虫的颗粒结构的免疫过程中由IL-4细胞因子异常产生诱导的免疫应答偏离观察结果联系起来。
为了预防或治疗过敏症，尤其是重度过敏症，本发明复合超免疫原同时诱导：
a)通过辅助性T细胞活化而进行的细胞免疫应答，和通过诱导对组成变应性颗粒的变应性致病结构特异的抗体而进行的体液免疫应答；和
b)通过诱导对异常产生的间质循环蛋白特异的中和性抗体或封闭性抗体产生而进行的体液免疫应答，其中所述蛋白主要是尤其通过Th2型T淋巴细胞合成的IL4细胞因子。IL4是引起B淋巴细胞产生IgE的共刺激物，其过量产生具有免疫毒性，因为它可以诱导过敏性炎症类型的致病性免疫应答。
本发明的一个目的是复合超免疫原的用途，所述复合超免疫原包含物理上彼此连接的两个不同免疫原性多肽，两个多肽分别包含：
a)第一免疫原性多肽，其诱导对惰性或活性细胞、微生物或颗粒致病抗原结构的细胞免疫应答或者细胞和体液免疫应答；
b)第二免疫原性多肽，其诱导针对间质局部循环蛋白的中和性抗体或封闭性抗体的产生，其中所述蛋白选自有免疫毒性或生血管特性的细胞因子或细胞调节因子，此类因子可由癌细胞、病毒感染细胞产生或可以由包括T淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC)的间质细胞产生，或者可以由致病性颗粒结构，尤其是变应原诱导。
本发明中使用的复合超免疫原被称作“双功能的”，因为组成其的两个主要部分，即，多肽(a)和(b)允许同时诱导针对两个不同靶，即，分别地致病抗原结构和间质局部循环蛋白的免疫应答。然而，根据本发明的双功能复合超免疫原在其结构中可以含有多个拷贝的多肽(a)和/或多肽(b)。
组成本发明复合超免疫原的多肽(a)和多肽(b)被称作是物理上彼此连接的，这是因为在所有情况中它们一起包含在同一个物理结构、分子或颗粒(纳米颗粒或微米颗粒)中，在其中它们彼此有一定程度的间隔。由于在复合超免疫原中多肽(a)和多肽(b)是彼此物理上连接的，故多肽(a)和多肽(b)可以一起呈递给相同免疫活性细胞，巨噬细胞和T或B淋巴细胞。
细胞免疫应答是指激活：
-具有特异识别与主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原结合的多肽(a)或多肽(b)的受体的辅助T淋巴细胞(Th)；
-具有特异识别与MHC I类抗原结合的多肽(a)的受体的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，
和任选地NK细胞。
可以用小鼠体外测量细胞应答，通过脾细胞的趋化因子(MIP1α和MIP1β)产生和通过在此免疫原存在下此活化的脾细胞的增殖，或者还通过这些细胞的IFNγ产量的增加来显示细胞毒性T细胞活性。
体液免疫应答是指，产生对组成复合超免疫原的多肽(a)或多肽(b)特异的抗体。
细胞、微生物或颗粒致病性抗原结构是指：
-选择性表达可称作肿瘤抗原的抗原的癌细胞，它能被细胞免疫应答杀死，优选被特异识别此癌细胞选择性携带的抗原的细胞毒性细胞(CTL)杀死，或者能被活化的NK细胞杀死；
-或者选择性表达病毒抗原的病毒感染细胞，它能被细胞免疫应答杀死，优选被特异识别此感染细胞选择性表达的抗原的细胞毒性细胞(CTL)杀死，或者能被活化的NK细胞杀死；
-或者含有变应性抗原的变应性颗粒，它能被对此变应性抗原特异的抗体封闭或灭活，所述抗体在体液免疫应答中产生。变应性颗粒包括活性变应性颗粒，例如花粉或寄生虫例如蜱螨类或硕大利什曼原虫和惰性变应性颗粒，例如灰尘和猫毛发颗粒。
在间质中异常释放的有免疫毒性特性的蛋白包括：
-有免疫抑制特性的蛋白，例如HIV1的Tat蛋白、乳头瘤病毒的E7蛋白、α干扰素(IFNα)、TGFβ或IL10、循环形式的p53蛋白或者还有Fas配体致细胞凋亡细胞因子(Fasl)；
-使免疫应答偏离从而产生有害作用的蛋白，例如刺激IgE同种型抗体产生的IL4细胞因子，IgE可造成例如肥大细胞的组胺异常释放，从而可能导致强烈的炎症反应，甚至器官损伤，表现为过敏性休克形式。
有生血管特性的蛋白是诱导内皮细胞增生的蛋白，例如VEGF细胞因子。在癌细胞肿瘤的情况下，有生血管特性的蛋白在肿瘤周围间质中的局部释放可以在称作新血管形成的事件中诱导血管内皮细胞的某种增生，从而允许肿瘤的血管化，血管化对肿瘤存活来说是必需的，更具体地血管形成可以为构成肿瘤的癌细胞提供生存和增殖所需的营养。
粘膜免疫是指诱导导致主要IgA同种型抗体产生的体液免疫应答(此抗体由位于上皮组织的B淋巴细胞产生，称作分泌型IgA抗体(s-IgA))和在淋巴节(肠系膜淋巴节、阴道的髂淋巴节)中诱导细胞免疫应答。
系统免疫是指诱导导致主要IgG同种型抗体产生的体液免疫应答(此抗体全身循环，特别是通过血清途径循环)和在外周淋巴节或脾中诱导细胞免疫应答。
根据本发明显示，对于如上限定的各种复合超免疫原化合物，体内获得的免疫应答水平比施用彼此没有物理上连接的多肽(a)和(b)后观察到的免疫应答水平要高的多。
不想要受到任何理论的束缚，申请人认为，在复合超免疫原中多肽(a)提供了辅助T细胞表位，该表位将刺激“辅助”效应并因此活化对多肽(b)的体液免疫应答或增加该体液免疫应答的活化。当多肽(b)是自体细胞因子，例如设计用于向人给药的复合超免疫原中的人IL4，则为了诱导抗多肽(b)的抗体产生将尤其需要免疫原性多肽(a)的此辅助作用。
根据本发明显示，当gp160-灭活的Tat(类毒素)肽缀合物体内给药时，抗天然Tat蛋白的IgG类抗体的产生量可以比灭活的Tat蛋白(类毒素)以游离形式给药时的反应高两倍。而且，被gp160-Tat(类毒素)复合超免疫原诱导产生的抗体可以中和天然Tat蛋白100％的活性，而在Tat蛋白(类毒素)以游离形式给药后观察到抗体对Tat蛋白活性的最大中和是75％。
而且，实施例的结果显示，用gp160-Tat(类毒素)复合超免疫原免疫的动物的脾细胞比用Tat(类毒素)免疫过的动物的脾细胞产生更高水平的MIP1α和MIP1β趋化因子，这说明使用根据本发明的复合超免疫原可以获得对免疫细胞的最佳刺激。
用gp160-Tat(类毒素)复合超免疫原免疫的动物的脾细胞，当其在体外被天然Tat蛋白活化时，还产生大量的干扰素-γ。
用根据本发明的其他超免疫原，例如E7-SIAB-VEGF缀合物或者Betv1a-IL4缀合物也获得类似的结果。
因此，使用如上面限定的复合超免疫原至少在某些情况下可以使治疗效果增强，这可以通过分开使用多肽(a)和(b)而观察到，或者也可以通过使用没有彼此物理相连的多肽(a)和(b)的组合而观察到，而且这种增强至少有两个原因：
(i)由于同时降低或阻断了免疫抑制、免疫细胞凋亡或血管内皮细胞增生，从而可以诱导对肿瘤细胞表达的抗原或病毒感染细胞表达的抗原的有效免疫应答(该反应根据情况可以是细胞类型或体液类型)，或者，由于降低或封闭了IL4诱导的导致IgE抗体产生的同种型转换，从而可以诱导有效但无害的针对变应原的免疫应答；
(ii)在许多情况下，可观察到针对肽缀合物中的一个免疫原性多肽的免疫应答的增强，这是因为带有新辅助位点的第二免疫原性多肽被联合呈递给免疫系统细胞，这可以例如在gp160-Tat(类毒素)复合超免疫原情况中看到。
用于治疗某些癌症及某些病毒感染的复合超免疫原
根据本发明使用的复合超免疫原的第一必要技术特征，第一免疫原性多肽(a)选自：
(i)癌细胞选择性表达的、病毒感染细胞选择性表达的或构成变应性致病抗原结构的，如果需要的话，去毒形式的免疫原性蛋白，和(ii)衍生自(i)的蛋白。
根据本发明使用的复合超免疫原的第二必要技术特征，免疫原性多肽(b)选自：
(i)间质局部循环蛋白，如果需要的话，去毒形式的该蛋白，和(ii)衍生自(i)的蛋白。
当癌细胞选择表达的免疫原性蛋白、病毒感染细胞选择表达的免疫原性蛋白或组成变应性致病抗原结构的免疫原性蛋白有毒性，例如有免疫毒性时，或者当间质局部循环蛋白有毒性，例如有免疫毒性时，在没有预先降低或封闭其毒性，例如其免疫毒性而保留其免疫原性时，其本身不能用作根据本发明的复合超免疫原的多肽(a)或多肽(b)。
如果一种免疫原性蛋白施用于人或动物时可对所述人或动物的健康造成严重有害效应，例如诱导免疫毒性以麻痹免疫防御应答或引起该反应偏离，则此免疫原性蛋白有初始毒性。
如果一种免疫原性蛋白在对人或动物给药时引起下列效应之一，则此免疫原性蛋白有初始免疫毒性：
-免疫抑制，包括免疫细胞凋亡，这可见于HIV1的Tat蛋白、乳头瘤病毒的E7、IFNα、TGFβ或IL10细胞因子，或者还有在间质中循环的p53细胞调节因子；
-体液免疫应答的偏离，例如诱导导致B淋巴细胞产生IgE的同种型转换，这可见于IL4。
通过修饰可以使初始有毒(例如免疫毒性)的免疫原性蛋白去毒，更具体地可以使用物理的、化学的或基因工程的技术来去毒，这在以下详述中有更详细的描述。
也可以使用能使多肽(a)和/或多肽(b)去毒的技术，尤其是化学技术从没有初始毒性或免疫毒性的蛋白来制备多肽(a)或多肽(b)，因为此处理能使多肽稳定以利于更好的疫苗保存。
本质上说，与抗破伤风或抗白喉疫苗的类毒素，去毒毒素类似，去毒蛋白保留其免疫原性，即，诱导以下反应的能力：
-对致病抗原结构的细胞免疫应答，或细胞和体液免疫应答，其中，所述去毒蛋白制备自癌细胞选择表达的免疫原性蛋白、病毒感染细胞选择表达的免疫原性蛋白、或者组成变应性致病结构的免疫原性蛋白；
-或，对如前面限定的间质局部循环蛋白的体液免疫应答，其中，所述去毒蛋白制备自此间质循环蛋白。
从包含在靶致病抗原结构或靶间质局部循环蛋白中的免疫原性蛋白“衍生”是指，免疫原多性肽(a)或(b)可以从包括在初始免疫原性蛋白中的肽片段制得，或者多肽(a)或(b)与初始免疫原性蛋白相比含有一个或多个氨基酸替换、缺失或添加，这在说明书中有进一步描述。在所有情况下，衍生自初始免疫原性蛋白的多肽(a)或(b)保留了诱导对靶致病性抗原结构或靶间质局部循环蛋白的免疫应答的能力。如果初始免疫原性蛋白有毒性，衍生自它的多肽(a)或(b)将有减弱的毒性或者失去毒性。这是因为多肽(a)或(b)仅仅是初始免疫原性蛋白的无毒片段，或者其相对于初始免疫原性蛋白的氨基酸序列包含了减弱或封闭初始蛋白的毒性的氨基酸修饰。
根据本发明用于预防或治疗某些癌症或某些病毒感染的复合超免疫原的第一实施方案，所述复合超免疫原的特征在于多肽(a)诱导对癌细胞或病毒感染细胞特异表达的抗原的细胞免疫应答。
“细胞免疫应答的诱导”是指，复合超免疫原结构内的多肽(a)可用于起始有效的免疫应答，在癌细胞或病毒感染细胞的情况下，所述免疫应答主要为特异识别靶致病性抗原结构的细胞毒性细胞(CTL)的产生，其中所述抗原结构为例如肿瘤抗原或病毒抗原，它以与主要组织相容性复合物(MHC)I类抗原结合的形式呈递在癌细胞或感染细胞的表面；或者所述免疫应答主要为NK杀伤细胞(优选地破坏癌细胞)的产生。
另外，免疫原性多肽(a)诱导的细胞免疫应答可以引起辅助性T细胞(T辅助细胞)的活化，从而增强或允许诱导基于免疫原性多肽(b)并特异针对间质循环蛋白的体液应答。这并不意味着不诱导对多肽(a)的体液免疫应答。然而，在癌症或病毒感染的情况下，对多肽(a)的体液应答的诱导，尽管其与细胞免疫应答的诱导一起发生，但不是所要寻求的目标。
优选地，由宫颈癌(HUCC)的癌细胞或者HIV感染的细胞或者ATL白血病细胞特异表达的抗原分别选自：(i)乳头瘤病毒的L1、L2和E7蛋白，(ii)HIV-1病毒的gp160、p24、p17、Nef和Tat蛋白，(iii)Tax蛋白，(iv)HTLV-1或2病毒的gp61或gag蛋白(如果需要，这些蛋白可以去毒)或衍生自它们的蛋白。
多肽(a)优选地选自：HIV1的免疫原性蛋白，此蛋白的免疫原性片段或衍生自此的蛋白。
优选地，第一免疫原性多肽(a)选自：(i)乳头瘤病毒的L1、L2和E7蛋白，(ii)HIV-1病毒的gp160、p24、p17、Nef和Tat蛋白，(iii)HTLV-1或2病毒的Tax蛋白(如果需要，这些蛋白可以去毒)或衍生自它们的蛋白。
为了诱导对致病性抗原结构的免疫应答，多肽(a)可以含有致病性蛋白本身。
以上列出的致病性蛋白中的一些有免疫毒性，例如，HIV-1病毒的Tat蛋白、乳头瘤病毒的E7蛋白或者HTLV-1病毒的Tax蛋白，因此其本身不能用作复合超免疫原的多肽(a)。
在这种情况下，多肽(a)优选选自：(i)致病性蛋白的失活形式，例如去毒形式，(ii)致病性蛋白的失活片段，和(iii)衍生自致病性蛋白的无初始免疫毒性的蛋白，例如基因突变体或此蛋白的片段。
制备例如上文中限定的多肽(a)的各种技术在说明书中有进一步描述。
优选地，多肽(a)和多肽(b)选自：
a)对于预防或治疗AIDS：
-多肽(a)：HIV-1病毒的gp160、p24、p17、Nef和Tat蛋白(如果需要的话，可以为去毒或稳定化形式)、此蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白(Zagury等1998)；
-多肽(b)：Tat、IFNα和TGFβ蛋白(如果需要的话，可以去毒)、此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自此的免疫原性蛋白；
b)对于预防或治疗宫颈癌：
-多肽(a)：乳头瘤病毒，优选的乳头瘤病毒16或18株系的L1、L2和E7蛋白(如果需要的话可以去毒或稳定化)、此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白(Le Buanec等，1999)；
-多肽(b)：E7、IFNα、TGFβ、TNFα和VEGF蛋白(如果需要的话去毒或稳定化的形式)、此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白；
c)对于预防或治疗由HTLV1或2病毒诱导的ATL白血病：
-多肽(a)：HTLV-1或2病毒的gp61和Tax蛋白(如果需要的话可以去毒)、此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白(Cowan等，1997；Mori等，1996)；
-多肽(b)：Tax、IL10、IFNα和TGFβ蛋白(去毒的)、此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的蛋白；
d)对于预防或治疗结肠癌：
-多肽(a)：CEA和p53蛋白(如果需要的话可以去毒)、此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白(Zusman等，1996)；
-多肽(b)：TGFβ、IL10、p53、FasL和VEGF蛋白(去毒的)、此类蛋白的免疫原性肽片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白；
e)对于预防或治疗乳腺癌：
-多肽(a)：Di12蛋白，此蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的蛋白(Yoshiji等，1996)；
-多肽(b)：TGFβ、TNFα和VEGF蛋白(如果需要的话可以去毒)、此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白；
f)对于预防或治疗胰腺癌：
-多肽(a)：CaSm蛋白(如果需要可以去毒)、此蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白；
-多肽(b)：蛋白VEGF和TNFα蛋白(如果需要的话去毒或稳定化)此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白；
g)对于预防或治疗前列腺癌：
-多肽(a)：OSA和ETS2蛋白(如果需要的话去毒或稳定化)、此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白(Sementchenko VI等，1998)；
-多肽(b)：IL6和TGFβ蛋白(如果需要的话去毒或稳定化)、此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白(Adler等，1999)。
为了预防或治疗某些其他癌症，也可以将TSA抗原(肿瘤特异性抗原类型)或TAA抗原(肿瘤相关抗原类型)、此类蛋白的免疫原性片段或者衍生自它们的免疫原性蛋白用作免疫原性多肽(a)。
Gp160、Tat、Tax和p53蛋白在其天然形式下是有毒的。从这些蛋白制备免疫原性多肽(a)必须要对其去毒，或者制备其无毒的免疫原性肽片段或衍生自其的无毒蛋白，例如可以通过相对于参照天然蛋白序列进行一个或多个氨基酸替换、缺失或添加来制备。
IFNα、Tat、TGFβ、E7、Tax、p53和FasL蛋白在其天然形式下高浓度时是有免疫毒性的。从这些蛋白制备免疫原性多肽(b)必须要对其去毒，或者制备其无毒的免疫原性肽片段或衍生自其的无毒蛋白，例如可以通过相对于参照天然蛋白序列进行一个或多个氨基酸替换、缺失或添加来制备。
VEGF免疫原性蛋白可以以天然形式或者以化学处理后的稳定形式用作组成复合超免疫原的多肽(b)，其中所述化学处理优选为用于使蛋白去毒的化学处理。
以上列出的免疫原性多肽(b)中有免疫毒性或生血管特性的细胞因子或细胞调节因子具有如下详述的特征：
-TGFβ蛋白：TGFβ是由多种癌细胞产生的主要免疫抑制细胞因子；
-IL10蛋白：IL10也是主要免疫抑制细胞因子，FasL(Fas配体)同样也是；
-p53蛋白：由癌细胞异常表达的p53调节蛋白是现在技术已证实的肿瘤相关抗原(TAA)。当p53蛋白自异常细胞释放并在胞外间质区室中累积时，它可以作用于免疫细胞产生免疫抑制因子和致细胞凋亡(免疫毒性的)间质因子的作用，因此是具有免疫毒性的间质循环蛋白，根据本发明p53是复合超免疫原诱导的体液免疫应答的作用对象，其中所述复合超免疫原中的多肽(b)为丧失初始蛋白的免疫毒性特性的去毒的p53蛋白或其衍生蛋白。
-VEGF，内皮细胞生长因子：VEGF细胞因子是血管形成的主要细胞因子，其激活内皮细胞增生；
-IL6、IFNγ和TNFα促炎细胞因子也参与血管形成过程，激活内皮细胞粘着分子(ICAM、VCAM、和E选择蛋白)的表达。
由组成本发明复合超免疫原的多肽(b)诱导的体液免疫应答通过如下方式使得对多肽(a)的特异免疫应答可以有效地产生：
(i)中和或封闭某些异常产生的间质局部循环蛋白，例如IFNα或Tat蛋白的免疫抑制活性(免疫毒性)；或者
(ii)中和或封闭某些异常产生的间质局部循环蛋白，例如p53细胞调节因子所具有的诱导免疫细胞凋亡的特性(免疫毒性)；或者
(iii)中和或封闭由某些异常产生的间质循环蛋白，例如VEGF诱导的血管形成，包括肿瘤的新血管形成。
对预防或治疗某些癌症和某些病毒感染有用的第一复合超免疫原优选家族包括以下复合超免疫原：
-复合超免疫原(a)gp160-(b)Tat类毒素；
-复合超免疫原(b)Tat肽[1-15；46-60]-(a)gp160；
-复合超免疫原(a)Tat类毒素-(b)IFNα；
-复合超免疫原(a)Tat类毒素-(b)Tat肽[1-15；46-60]。
 第二复合超免疫原优选家族包括以下复合超免疫原：
-复合超免疫原(a)L1-(b)E7；
-复合超免疫原(a)E7-(b)VEGF。
上文中，“(a)”代表多肽(a)，“(b)”代表多肽(b)。以上列出的复合超免疫原的结构是从左到右为NH2-端部分到COOH-端部分。
在复合超免疫原(a)gp160-(b)Tat类毒素中，gp160蛋白诱导对HIV1感染细胞的细胞免疫应答，该细胞免疫应答可以被诱导的中和或封闭HIV1Tat蛋白(已知可以引起IFNα免疫抑制细胞因子产生)的免疫毒性特性的抗体所促进。
在(a)L1-(b)E7超免疫原中，HPV的L1蛋白诱导对HPV感染细胞(该细胞可以是癌性的)的细胞免疫应答，该免疫应答可以被中和或封闭HPV E7蛋白的免疫毒性特性的抗体所促进。
由宫颈癌的癌细胞表达并由此也可以作为识别此致病性抗原结构的细胞毒性T细胞或NK细胞的靶标的E7蛋白同样可以用于制备复合超免疫原的多肽(a)，其中E7蛋白可以为去毒的E7蛋白形式或者衍生自E7蛋白并失去免疫毒性的蛋白形式。
在复合超免疫原(a)E7-(b)VEGF中，E7蛋白诱导对HPV感染细胞(该细胞可以是癌性的)的细胞免疫应答，该免疫应答由于中和或封闭VEGF细胞因子的生血管特性的抗体的诱导而变得更为有效。
用于预防或治疗过敏反应的复合超免疫原
在用于预防或治疗过敏反应的复合超免疫原中，多肽(a)诱导针对组成颗粒致病性抗原结构的变应性致病蛋白的体液免疫应答，此颗粒致病性抗原结构可以是，例如花粉、蜱螨类、灰尘或猫的毛发。
优选地，变应性致病蛋白选自Betv1a，Der p1和Fel d1蛋白，它们是本领域技术人员已知的。
优选地，多肽(a)选自：Betv1a，Der p1和Fel d1蛋白、它们的免疫原性肽片段或衍生自它们的免疫原性蛋白。
Betv1抗原具体地由Ferreira等(1993)公开，Der p1抗原具体地由Tovey等(1981)公开，Fel d1抗原具体地由Morgenstern等(1991)公开。
优选地，复合超免疫原中的多肽(b)诱导中和或封闭IL4细胞因子的抗体产生，所述IL4主要由Th2型T淋巴细胞产生并可以引起体液免疫应答向IgE同种型抗体产生的方向偏移。
因此多肽(b)优选是自体IL4蛋白，并优选通过化学、物理或遗传处理去毒的自体IL4蛋白，此蛋白的免疫原性肽片段或者衍生自它的蛋白。
根据另一个实施方案，多肽(b)诱导中和或封闭IL5细胞因子的抗体产生，所述IL5主要由Th2型T淋巴细胞产生。
根据第二实施方案，多肽(b)优选是自体IL5蛋白(优选是去毒的)，此蛋白的免疫原性肽片段或者衍生自它的蛋白。
在复合超免疫原(a)Betv1a-(b)LI4(鼠的)中，Betv1a蛋白诱导针对变应性致病抗原结构的系统或粘膜体液免疫应答，该反应通过产生IgG或IgA同种型抗体，优选分泌的IgA而实现；而IL4蛋白诱导对此细胞因子的免疫应答，从而允许在过敏症状初期中和或封闭可导致IgE抗体产生的同种型转换，同时还诱导对致病变应原的有效免疫应答。针对自体IL4蛋白的体液免疫应答由于复合超免疫原中多肽(a)的同时存在而变得可能，此多肽(a)含有诱导辅助T细胞活化的辅助T细胞表位，而辅助T细胞活化是针对IL4的B细胞体液免疫应答所必需的。
“辅助T细胞表位”是免疫原性多肽的一个区域，它可以被至少一个辅助T淋巴细胞克隆的抗原受体所选择性地识别，免疫原性多肽与特异识别此表位区域的T淋巴细胞受体的结合将导致所述T淋巴细胞克隆的活化，此T淋巴细胞克隆将自身增殖并产生细胞因子例如IL2，而这又将允许体液免疫应答发生，包括允许针对自体蛋白的体液免疫应答发生，对于根据本发明的复合超免疫原中的IL4而言情况正是如此。
通过去毒作用，灭活组成复合超免疫原的多肽(a)或多肽(b)的免疫抑 制或致细胞凋亡特性
如上面阐释，用于本发明的复合超免疫原应当没有毒性，更具体地不应当由于其成分(更具体地多肽(a)或多肽(b))之一的内在特性而诱导任何免疫系统抑制或造成免疫系统的靶向反应发生偏离。
因此，如果多肽(a)初始具有免疫毒性，则在将其包含于本发明复合超免疫原之前，首先要灭活这些特性。
相似地，如果组成根据本发明免疫原性肽缀合物的多肽(b)为具有免疫毒性特性的细胞因子或细胞调节因子，如IL4，则在其被包含于所述复合超免疫原中之前，首先要灭活这些特性，其中所述免疫毒性特性为免疫抑制或致细胞凋亡特性或者为使免疫应答偏离的能力，例如使辅助T细胞(T辅助细胞)反应向利于Th2型细胞产生的方向偏移的能力。
使用有毒的多肽(a)和/或(b)时重要的是，以尤其是物理、化学和/或遗传修饰的形式(灭活的但仍有免疫原性)及非本来的(或天然)形式，或者以适当的盖伦制剂形式使用，以便其不再具有天然蛋白的免疫毒性效应或引起免疫应答偏离的特性但仍保留其免疫原性特性。
相反地，非免疫毒性多肽(a)或多肽(b)，例如VEGF，可以以天然形式使用或者以经过稳定化处理后的修饰形式使用。
通过热、UV辐射、X射线或与富含O2的空气接触可以实现物理处理。在化学部分(例如巯基)之间产生分子内修饰的物理处理能适当地改变分子构象并灭活其功能而保留其免疫原性特性。
通过偶联剂例如二醛或以二醛(优选戊二醛)预处理活化的载体蛋白，可以实现化学处理。使用一元醛，更具体地为甲醛也可以实现此化学处理。对于此，可以参考WO-A-96/27389的教导。
特别地，也可以使用其他方法例如羧甲基化或氨甲酰化进行化学处理。在WO-A-99/33872中阐述了羧甲基化技术的例子。也可以通过N-乙基马来酰亚胺化并结合或不结合戊二醛化来实施化学处理。
也可以提及以下反应作为灭活技术：蛋白的至少一个巯基官能团与4-氯-7-磺基苯并呋咱铵、N-[碘乙基]三氟乙酰胺或N-(6-[7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺]己基)-3’-(2’-吡啶二硫)-丙酰胺反应，以及蛋白的至少一个氨基官能团与乙酰亚氨酸乙基酯、酐、2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)盐酸盐、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯、乙酸磺基琥珀酰亚胺酯、4-O-[4，4-二甲氧基三苯甲基]丁酸磺基琥珀酰亚胺酯、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸琥珀酰亚胺酯、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀亚胺酯或苯甲酰甲醛反应。
使用油性液体，例如弗氏不完全佐剂中的盖伦制剂形式也可以灭活免疫原，或者也可以修饰毒性效应所需的非共价连结(静电力、范德华力或氢键)。
通过基因工程进行残基插入、缺失或替换可以获得遗传修饰物，上述操作设计用于减弱或抑制天然分子的有害功能位点。可以对遗传突变体进行或不进行补充化学和/或物理处理。以上的修饰蛋白例如可以制备自与免疫致病性蛋白的肽序列有相同或类似序列的蛋白，所述免疫致病性蛋白尤其是免疫抑制蛋白或生血管蛋白，例如HIV1 Tat蛋白、乳头瘤病毒的E7蛋白或HTLV1 Tax蛋白或这些蛋白的片段，并且上述修饰蛋白可以通过例如在树脂上的传统肽合成或基因工程获得。所有这些方法都是本领域已知的。这些失活但有免疫原性的突变体可以至少是编码这些产物的DNA分子。在本发明中此DNA分子尤其有意义，这在下文中可以看到。
为了检查具有免疫毒性和/或生血管特性的天然蛋白是否可以被针对(经处理去毒或稳定化的)本发明修饰蛋白或者其修饰或未修饰片段的抗体正确地识别，可以例如在有特异性抗体存在情况下通过ELISA免疫学检查抗原-抗体复合体的形成。
在优选实施条件下，免疫原性化合物由天然化合物(蛋白或多肽片段)经过醛、或者氨甲酰、或者羧甲基、或者马来酰亚胺处理产生。
为了测定免疫毒性和/或生血管特性被修饰的蛋白或此蛋白的片段是否令人满意地保留了免疫原特性(即，它是否被灭活但没有变性)以致可以用于产生能封闭所述天然蛋白的效应的抗体，可以用根据本发明的免疫原性化合物免疫动物(兔子、大鼠、小鼠)并检查产生的抗体是否能中和蛋白的免疫抑制、致细胞凋亡或生血管活性。
为了测定修饰的免疫毒性蛋白或片段是否失去了其免疫毒性特性的至少期望部分，可以例如在加强抗原(例如PPD或破伤风类毒素抗原)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)培养物上研究修饰蛋白对Th2(IL4)和Th1(IFNγ)细胞因子产生和/或对免疫抑制的影响。
免疫毒性(免疫抑制或致细胞凋亡或引起免疫应答偏离)或生血管特性被修饰的免疫原性蛋白可以衍生自任何蛋白，更尤其是具有由AIDS患者的感染细胞或肿瘤细胞诱导的局部免疫毒性作用的蛋白；更尤其要提到的是HIV1病毒的Tat蛋白、乳头瘤病毒的E7蛋白或HTLV病毒的Tax蛋白。也要提到的是由活化的免疫细胞产生的依赖甘露聚糖的凝集素。还要提到的是具有生血管特性的VEGF和具有免疫毒性特性并导致免疫应答偏向Th2反应的IL4。
如上面已经阐释的，本发明复合超免疫原的多肽(a)或多肽(b)也可以为：作为靶致病抗原结构的组分的初始免疫原性蛋白的片段或者与初始免疫原性蛋白相比在氨基酸上有修饰的多肽。
可以在此蛋白或片段的氨基酸中包含一个或多个修饰，例如缺失、替换、添加或官能团化例如氨基酸酰化，前提条件是这些修饰应属于上面限定的范围(缺少毒性、免疫学特性)。例如，通常，用异亮氨酸代替亮氨酸并不改变此类特性；通常，对免疫致病性蛋白，尤其是免疫毒性或生血管性蛋白，修饰应施用于少于40％的氨基酸，优选少于20％，更优选地少于10％的氨基酸上。重要的是修饰的蛋白或片段不应发生变性(因为这在例如使用物理处理(例如热)时可能发生)以便保持其构象位点以使修饰衍生物诱导的抗体对天然蛋白具有活性。
在优选条件下，本发明免疫原性化合物含有免疫致病性蛋白(尤其是免疫毒性的或生血管的)之全部或一个片段的至少50％，优选至少70％，更优选至少90％，更特别的是所述免疫抑制或生血管蛋白的全部或几乎全部。
通常，就修饰而言，修饰的免疫原与天然免疫毒性蛋白或其部分的同源性或相似性及免疫原性多肽的大小及应用方式及组成本发明复合超免疫原的免疫原性多肽与免疫原性蛋白(例如破伤风类毒素)的偶联条件，可以更具体地参看WO-A-86/06414或EP-A-0.220.273及同族PCT/US 86/00831，它们的教导以参考文献形式并入此处。
也优选通过基因重组获得的例如上面限定的免疫原性化合物，它与HIV1的Tat蛋白、HTLV1的Tax蛋白或者HPV的L2及E7蛋白、或者由活化免疫细胞产生的甘露聚糖依赖性凝集素或者这些蛋白的片段具有至少70％的肽同源性。
也优选例如上面限定的免疫原性化合物，其特征在于用醛、氨甲酰、羧甲基、或者马来酰亚胺对其进行处理。
还优选例如上面限定的免疫原性化合物，其特征在于用佐剂调制使其生物学上失活，例如弗氏不完全佐剂(IFA)中的油性乳剂。
也可以从同源突变体衍生所需的免疫原性化合物。
此处应当注意的是，使用生理活性蛋白的盖伦制剂，可以隐藏其生物学活性而保留其免疫原性。
羧甲基化反应使得可以在氨基酸序列的半胱氨酸残基水平上修饰巯基(硫氢基)。羧甲基化作为本领域人员已知的技术可以灭活依赖于SH基团的某些有毒功能，Frankel等(Cell，vol.55，1988)公开了用于Tat蛋白的此技术。
除了羧甲基化，氨甲酰化或马来酰亚胺化也可以用于封闭SH基，并形成S-羧乙基、S-氨甲酰或S-马来酰亚胺复合物。
例如，Tat蛋白有7个半胱氨酸。这些半胱氨酸参与形成链间及链内二硫桥并有助于形成寡聚体。
在每种情况下的反应产物是S-羧甲基半胱氨酰基或S-羧甲基酰氨基半胱氨酰残基。
片段可以包含例如8到110个氨基酸，优选12-60个氨基酸，更优选12-40个氨基酸。片段也可以含有一个或多个有1-5个附加氨基酸的C或N端侧，所谓“附加”即不同于初始片段。此外，为了实现例如羧甲基化，片段还应当至少含有半胱氨酸。片段如果优选本身是灭活的，则可以在需要时进行与整个或几乎整个蛋白相同的灭活处理。
上面提到的羧甲基化反应同样可以用其他化学试剂进行，例如过甲酸、3-溴代丙酸、氮丙啶、(2-溴乙基)三甲基铵溴化物、2-溴乙烷磺酸、1，3-propanesulfone等。
在上述方法的优选实施条件下，所述起始蛋白或所述起始片段可以为与标记物的融合形式(FP)或非融合形式(P)。FP形式可以本身修饰分子构象，并因此改变其活性。
本方法的起始蛋白或片段是已知产物，它们的灭活方法在文献如WO-A-99/33872中有描述。此起始蛋白甚至可以购买获得(immunodiagnostics.Inc.货号1002-2)或者进行传统制备。
特别是，可以通过如下方式制备上述起始蛋白或片段：
1)基因工程或生化合成方法合成；
2)纯化。
使用基因工程，可以用例如针对蛋白或其一个片段的抗体通过亲和层析来纯化产生的蛋白；也可以合成与标记物融合的蛋白(FP)，标记物可以用于与亲和柱结合。
本发明复合超免疫原的优选实施方案
为了制备根据本发明的复合超免疫原，可以用化学或遗传重组的方法将多肽(a)和多肽(b)偶联。
根据本发明肽缀合物的优选实施方案，多肽(a)和(b)通过formolation、氨甲酰化、羧甲基化、马来酰亚胺化或通入氧气鼓泡进行氧化而在它们的免疫毒性特性方面被灭活和/或被稳定化。
另一方面，如果使多肽(a)和(b)在免疫毒性或生血管特性方面被灭活，可以通过遗传重组实现此灭活。
在本发明免疫原性肽缀合物的特定实施方案中，多肽(a)和(b)彼此直接地共价连接，例如通过-CO-NH-肽键连接。
然而，为了在免疫原性肽缀合物结构中引入一些弹性，更具体地是允许免疫原性肽缀合物中多肽(a)和(b)一个相对另一个在空间上有一定活动性，优选缀合物中多肽(a)和(b)通过间隔链彼此分开的肽缀合物。
根据免疫原性肽缀合物的第一优选实施方案，在所述缀合物中，通过选自SMCC和SIAB的间隔链(它们都是双官能化合物)使多肽(a)和(b)彼此分开。
SIAB化合物，如Hermanson G.T.(1996，Bioconjugate techniques，SanDiego：Academic Press，pp239-242)所公开，是下式(I)的化合物：
SIAB化合物含有两个反应基团，分别是碘乙酰基团和磺基-NHS酯基，两个基团分别与氨基和硫氢基反应。
SMCC化合物，如Samoszuk M.K.等(1989，Antibody，ImmunoconjugatesRadiopharm.，2(1)：37-46)所公开，是下式(II)的化合物：
Figure A0282008400332
SMCC化合物含有两个反应基团，分别是磺基-NHS酯基和马来酰亚胺基团，它们分别与氨基和硫氢基反应。
根据第二优选实施方案，复合超免疫原含有线性间隔肽作为间隔链。线性间隔肽优选选自3-30个氨基酸长，5-20个氨基酸长度是有利的，最优选7-15个氨基酸长度。
优选地，线性间隔肽基本上，也就是排它地，由pH7.0时带正电或负电的氨基酸组成，从而增加所述复合超免疫原的整体亲水性。应理解，应当避免使用由疏水氨基酸组成的间隔肽。优选地，间隔肽的特征在于，它由聚(赖氨酸)链组成，此链由3-30个赖氨酸残基组成，更优选地5-20个，最优选7-15个赖氨酸残基长度。
根据本发明复合超免疫原的另一实施方案，所述肽缀合物中，多肽(a)和(b)通过间隔链彼此分开，所述间隔链由分支间隔肽组成，所述分支间隔肽优选聚(赖氨酸)的寡聚树状结构(oligodendrimeric structure)，如Basak等(1995)公开的那些。
在本发明复合超免疫原的后一实施方案中，所述肽缀合物在每个缀合物分子中可以含有几个拷贝的多肽(a)和(b)，多肽(a)和(b)的2-8个拷贝是有利的，优选在每个缀合物分子中多肽(a)和(b)各有至多4个拷贝。
多肽(a)和(b)也可以一起包含于单个物理结构中，例如直径10-500纳米，优选10-1000纳米，最优选10-100纳米的单颗粒上，所述颗粒例如IMS纳米颗粒(参见如Aucouturier等(2001)的公开)，脱乙酰壳多糖(参见例如Sjaugrud等(1999)的公开)，脂质体，或生物可降解颗粒例如聚乳酸(PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)或聚(内交酯-共-乙交酯)(PLG)(参见Baras等(1999)的公开)。
根据另一个实施方案，多肽(a)和(b)在单一载体结构内实现物理上连接，从而允许它们同时呈递给免疫系统的细胞。在这个特定实施方案中，多肽(a)和(b)固定于纳米颗粒上，例如脱乙酰壳多糖纳米颗粒、IMS纳米颗粒、(可以从Societe Seppic Corporation，法国获得的免疫调制剂、由脂质纳米颗粒组成，直径范围为100-300纳米)或脂质体。
优选地，此纳米颗粒有小尺寸，以至于可以同时将多肽(a)和(b)呈递给细胞，就好像这些多肽共价连接成单个分子似的。纳米颗粒的直径范围为10-1000nm是有利的，优选10-500nm，更优选10-300nm，最优选10-200nm。
使用如下面限定的免疫原性肽缀合物主要用于治疗AIDS、癌症和过敏症。
本发明的另一个目的是含有两个彼此物理相连的不同免疫原性多肽的复合超免疫原，两个多肽分别为：
(a)诱导对惰性或活性细胞、微生物或颗粒致病性抗原结构的细胞免疫应答或细胞和体液免疫应答的第一免疫原性多肽；
(b)诱导产生能中和或封闭间质局部循环蛋白的抗体的第二免疫原性多肽，此间质局部循环蛋白选自有免疫毒性或生血管特性的细胞因子或细胞调节因子，此类因子可以由癌细胞、病毒感染细胞或间质细胞(包括T淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC))产生或能被致病性(特别是变应性)颗粒结构诱导。
上述复合超免疫原的详细特征在上面的说明书中已经阐述，本领域人员可以查阅之。
在第一优选实施方案中，免疫原性肽缀合物的特征在于它是gp160-Tat类毒素缀合物；
在第二优选实施方案中，免疫原性肽缀合物的特征在于它是Tat类毒素-IFNα缀合物；
在第三优选实施方案中，免疫原性肽缀合物的特征在于它是E7-SIAB-VEGF；
在第四优选实施方案中，免疫原性肽缀合物的特征在于它是Betv1a-SIAB-IL4。
编码本发明复合超免疫原的核酸的用途
本发明的另一个目的是编码某些本发明复合超免疫原的核酸，所述复合超免疫为仅由一条线性肽链组成的超免疫原肽，此超免疫原肽含有直接或者通过如上面限定的线性肽间隔链彼此相连的多肽(a)和(b)。
本发明也涉及在哺乳动物，优选人中具有功能的表达盒，其包含被置于在哺乳动物，优选人中有功能的调节多核苷酸的控制之下的如上面限定的核酸。
本发明也涉及含有上面限定的核酸或表达盒的重组载体，其允许在哺乳动物，优选人中表达本发明复合超免疫原。
本发明也涉及使用上面限定的核酸、表达盒或重组载体来获得有抗癌、抗病毒或抗过敏功能的药物。
通常，可以将DNA(带启动子的质粒)以裸露DNA形式递送至粘膜表面，例如可以将DNA配制成例如阳离子脂质体形式或浓缩于金颗粒周围，或者制成微球体形式。在有佐剂的情况下这可以有利地实施，佐剂更具体地是细菌毒素例如CTB(霍乱毒素)或LT(大肠杆菌不稳定肠毒素)，优选突变的LT(LTμ)。使用基于DNA分子的疫苗进行粘膜免疫的技术尤其在McCluskie等，Microbes and Infection，1999，685-698页公开。
根据有利的实施方案，本发明的重组载体更具体地含有以下元件：
(1)用于表达编码复合超免疫原的核酸的调节元件，例如启动子和增强序列(“增强子”)；
(2)包含在待插入此载体的复合超免疫原的编码核酸中的编码序列，所述编码序列与如(1)中所述的调节信号同相放置。
(3)转录的适当起始和终止序列。
另外，根据本发明的重组载体还可以含有一个或多个在用于扩增或表达所述载体的细胞宿主中有功能的复制起点、标记或选择标记。
根据本发明的重组载体也可以是逆转录病毒载体或者腺相关病毒载体(AAV)。此腺相关病毒载体由例如Flotte等(1992)、Samulski等(1989)及McLaughlin BA等(1996)公开。
为了将多核苷酸或载体引入宿主细胞，本领域人员可以有利地使用各种技术，例如磷酸钙沉淀技术(Graham等1993；Chen等1987)、葡聚糖DEAE(Gopal，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa，1896；Potter等，1984)、直接微注射(Harland等，1985)、负载DNA的脂质体(Nicolau等，1982；Fraley等，1979)。
根据特定实施方案，将本发明多核苷酸引入宿主细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞的体内方法包括引入制品的步骤，所述制品包含可药用载体(vactor)和“裸露”的本发明多核苷酸(所述多核苷酸处于适当调节序列的控制之下)，通过在所选组织，例如平滑肌组织水平的局部注射，“裸露”多核苷酸可以被该组织细胞吸收。
在体外及体内使用的含有“裸露”多核苷酸的组合物在例如PCT申请WO95/11307(Institut Pasteur，Inserm，Ottawa University)中及在Tacson等(1996)和Huygen等(1996)的文章中公开。
它们也可以是腺病毒载体如2或5型人类腺病毒。
注射入所选宿主生物的载体量因注射位点不同而异。例如，可以在动物体内，优选患者体内注射约10-1000μg编码复合超免疫原的多核苷酸。
含有复合超免疫原或编码它的核酸的免疫原性组合物或疫苗组合物
本发明另一个目的是免疫原性组合物，其特征在于它含有如上面限定的复合超免疫原(作为活性剂)与一种或多种生理可接受赋形剂。
本发明涉及免疫原性组合物，其特征在于它含有足够量的，如免疫学活性的如本说明书限定的复合超免疫原。
依据所要达到的目的，使用系统佐剂或粘膜佐剂。例如，上皮组织癌优选使用粘膜佐剂进行预防；为了预防或治疗病毒感染，例如HIV1和HTLV1病毒感染，或者预防或治疗过敏症，优选使用系统佐剂。
在系统佐剂中，优选使用IFA型佐剂(弗氏不完全佐剂)、磷酸钙或氢氧化铝。
粘膜佐剂中，优选使用的佐剂为例如霍乱毒素B(CTB)或毒素LT的突变体(LTμ)。
本发明也涉及粘膜或系统疫苗，其特征在于它含有如上面限定的复合超免疫原作为活性剂并含有一种或多种生理可接受赋形剂，包括免疫佐剂。
本发明免疫原性组合物或疫苗可以用于例如治疗，以致治愈癌症，以及治疗AIDS和预防或治疗过敏性炎症反应，其中所述癌症尤其是病毒诱导的癌症，例如由HTLV1引起的ATL(急性T细胞白血病)或由乳头瘤病毒引起的宫颈癌或者由疱疹病毒引起的伯基特氏淋巴瘤或卡波西肉瘤(分别由Epstein-Barr(EBV)病毒和HHV8病毒引起)。
根据本发明的复合超免疫原可以如下使用：
以适合于系统或粘膜给药的形式将根据本发明的复合超免疫原化合物或DNA分子施用给患者，例如可以通过鼻内途径将对治疗有效的足够量施用给需要此治疗的个体。给药剂量范围可以为例如每周一次鼻内10至1000μg，持续2个月，然后依据诱导的分泌抗体率周期性地给药，例如每隔2-6月给药。
当单个超免疫原分子和DNA分子上未携带待被中和的过量产生的毒素或细胞因子的所有活性位点时，可以在一个制品中施用两个或多个不同复合超免疫原分子和/或DNA分子，以诱导中和所有有害功能位点的抗体。
本发明另一个目的是提供设计用于粘膜的药物组合物，其含有至少一个上面提到的免疫原性肽缀合物或DNA分子作为活性成分。
当用作药物时，本发明免疫原性肽缀合物或DNA分子可以掺入设计用于系统给药或粘膜给药，包括口粘膜，尤其是鼻内、口和阴道给药的药物组合物中。可以一次性给药或者一段时间间隔后重复一次或几次给药。
因此，本申请也涉及治疗性或预防性药物组合物，其特征在于它含有一个或多个与要克服的天然蛋白相应的如上面限定的复合超免疫原，或其片段或DNA分子作为活性成分。免疫原性化合物、DNA片段或分子可以单独配制或与一种赋形剂混合，或者与药物可接受赋形剂(例如佐剂)混合物混合。设计用于鼻内或口腔给药的赋形剂中，特别值得提到的是癸酰基己酰基聚乙二醇甘油酯例如来自GATTEFOSSE公司的Labrasol或者氢氧化铝(Alhydragel，superfos，丹麦)。
应该注意，当按照传统口服制剂象这样给药时，根据本发明的活性成分应该是灭活的。
为了根据本发明口服给药，活性成分与粘膜免疫佐剂例如CT、LT或者CTB突变体结合。
特别要提及的是由Boyaka等在“开发粘膜免疫的策略”Am.J.Trop.Med.Hyg.60(4).1999，35-45页公开的盖伦制剂形式。也要提及的是胃抗性微颗粒，包括生物粘合剂例如由Rojas等在PharmaceuticalResearch，16卷，2号，1999，255页公开的那些。
在特定实施方案下，涉及上面提到的疫苗药物组合物，其特征在于它含有粘膜免疫佐剂，例如CT突变体(霍乱毒素)或LT突变体(大肠杆菌不稳定肠毒素)。
在另外特定实施方案下，涉及上面提到的疫苗药物组合物，其特征在于它含有吸附活性成分的佐剂，例如氢氧化铝或金颗粒。
在另外优选的实施方案下，涉及上面提到的药物组合物，其特征在于免疫原性肽缀合物通过遗传重组获得。
在另外优选的实施方案下，涉及上面提到的药物组合物，其特征在于组成肽缀合物的多肽(a)和/或多肽(b)已经被醛处理过或者被羧甲基化、氨甲酰化或马来酰亚胺化。
本发明的另一个目的是制备上述组合物的方法，其特征在于使用本身已知的方法，将一种或多种活性成分与可接受的赋形剂混合，如果需要的话，还与系统或粘膜免疫佐剂混合。
在上面提到的方法的优选实施方案下，制备具有生物粘性(bioadhesive)和胃抗性的微颗粒(microgranule)用于口消化道给药，所述微颗粒含有免疫原活性成分以及如果需要的话佐剂。
本发明的另一个目的是免疫原性组合物，其特征在于它含有治疗有效量的、编码本发明中限定的复合超免疫原的核酸、包含此核酸的表达盒或包含此核酸或此表达盒的重组载体。
本发明也涉及疫苗，其特征在于它含有治疗有效量的如上限定的核酸、表达盒或重组载体。
通过以下实施例进一步阐释本发明。
实施例
制备复合超免疫原的实施例
实施例1：制备[gp160-Tat类毒素]缀合物
此缀合物应是能主要地诱导对表达gp160的感染细胞的细胞应答(趋化因子；辅助T细胞，CTL)和诱导对胞外Tat蛋白的抗体反应的复合疫苗的活性成分。
通过以下过程活化溶解在1ml PBS中的810μg的gp160蛋白：在100ml于PBS中的0.2％戊二醛溶液中过夜透析，之后，经过在100ml PBS中3次连续透析，每次2小时，去除过多的戊二醛。
向此活化的1ml gp160中加入522μl浓度1.55mg/ml的Tat类毒素溶液(即810μg的Tat类毒素)。4℃搅拌混合物过夜，然后通过加入50μ12.5M甘氨酸溶液来终止反应。用排阻层析最终纯化反应混合物。制品中Tat蛋白和gp160蛋白的抗原性相应于每个单独测定的蛋白的抗原性。
实施例2：制备[Tat类毒素-IFNα]缀合物
这个实施例涉及复合疫苗的制备，此疫苗能主要地诱导对表达Tat蛋白的感染细胞的细胞免疫应答(趋化因子；辅助T细胞，CTL细胞)和诱导对IFNα的体液免疫应答。另外此缀合物能诱导抗胞外Tat蛋白的抗体的形成。
偶联反应是通过还原的IFNα与被SIAB活化的Tat类毒素分子反应而发生的。(参见实施例2)
1. 活化Tat类毒素(Tx)
5mg的Tx溶解在3ml 5mM PBS-EDTA中，向其中加入187μl的SIAB溶液(1.7mg/ml)。在室温下反应1小时后，用0.1M-EDTA 5mM硼酸缓冲液(pH8.5)平衡的Sephadex G25柱子过滤反应混合物。
2. 还原IFNα
条件与实施例3中的一样。回收2.6mg还原的IFNα。
搅动下，5mg Tx-SIAB与2.6mg还原的IFNα混合，在室温下继续搅拌1小时，然后4℃过夜。通过加入Cys.HCl到终浓度5mM并反应30分钟来终止反应。
通过排阻层析纯化反应混合物。发现在缀合物中Tat类毒素和IFNα的抗原性仍能保持。
实施例3：制备[Tat肽(1-15；46-60)-SIAB-Tat]缀合物
此实施例涉及复合疫苗的制备，此疫苗能主要地诱导对表达Tat蛋白的感染细胞的细胞免疫应答(趋化因子；辅助T细胞，CTL细胞)和诱导对胞外Tat蛋白的体液免疫应答。
1. 用SIAB活化Tat肽
溶解在600μl水中的每个肽(1-15和46-60)的1.5mg混合物，通过用在PBS中的500μl SIAB溶液(1.7mg/ml)在室温下处理1小时来活化，然后用PBS缓冲液平衡过的Sephadex G25(1*15cm柱子)过滤反应混合物。
2. 还原Tat蛋白
用2-巯基乙胺还原Tat(参见实施例3中的条件)
3. 偶联Tat蛋白与Tat肽
由SIAB活化的0.75mg Tat肽与1.25mg还原的Tat混合，室温下搅动混合物45分钟，然后4℃过夜保存。通过加入Cys.HCl到终浓度5mM来终止反应，然后使用分级滤膜(calibrated membrane)过滤纯化混合物。通过氨甲酰化灭活缀合物中的Tat蛋白。
用常规间接ELISA测定与Tat类毒素相比肽Tat-Tat类毒素缀合物的抗原性。肽Tat-Tat类毒素缀合物的抗原性与Tat类毒素蛋白的抗原性相当。
实施例4：制备[E7-SIAB-VEGF]缀合物
此缀合物为能主要地诱导对表达E7蛋白的感染细胞的细胞应答(趋化因子；辅助T细胞，CTL细胞)和诱导对VEGF蛋白的抗体反应的复合疫苗的活性成分。另外，此缀合物能诱导抗胞外E7蛋白的抗体的形成。
1. 活化E7蛋白
1mg E7蛋白溶解于含有20％二噁烷的1ml 0.1M EDTA-5mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)中。向此溶液中加入溶解于同样缓冲液中的400μl 1.7mg/mlSIAB溶液。室温下继续反应1小时，在硼酸-EDTA-二噁烷缓冲液平衡过的Sephadex G25柱子(1*16cm)上上样反应混合物，回收并合收对应于蛋白的级分。
2. 还原VEGF蛋白
在如实施例3中描述的条件下，通过与2-巯基乙胺反应来还原蛋白。
3. 偶联还原的VEGF到E7-SIAB
由磺基-SIAB活化的1mg E7与1mg还原的VEGF反应。室温下反应1小时后，通过加入半胱氨酸到终浓度5mM来终止反应，通过向固体蔗糖的扩散来浓缩反应混合物。用排阻层析最终纯化浓缩溶液。在缀合物中E7和VEGF的抗原性仍保留。
实施例5：制备[Betv1a-SIAB-IL-4(鼠的)]缀合物
此缀合物为复合疫苗的活性成分，此复合疫苗设计用于使免疫应答朝导致抗BetV1a桦树变应原的IgG类抗体而非IgE类抗体形成的方向转移。
1.还原IL-4
根据实施例3中的条件，用2-巯基乙胺还原溶解于250μl 10mM磷酸缓冲液，pH7.2+1mM EDTA中的1mg IL-4，通过在Sephadex G25中过凝胶回收还原的细胞因子。
2.用SIAB活化Betv1a蛋白
室温下用80μl 1.7mg/ml磺基-SIAB溶液稀释溶解于500μl在10mM磷酸缓冲液-1mM EDTA中的1mg BetV1a蛋白2小时。用排阻层析纯化反应混合物。
3.偶联还原的IL-4到Betv1a-SIAB
由磺基-SIAB活化的0.5mg Betv1a与1mg还原的IL-4反应。室温下反应1小时后，通过加入半胱氨酸到终浓度5mM来终止反应，通过向固体蔗糖的扩散来浓缩反应混合物。用排阻层析最终纯化浓缩溶液。在缀合物中Betv1a与IL-4的抗原性仍保留。
超免疫原的免疫原活性实施例
实施例6：gp160-Tat类毒素缀合物的免疫原活性
A.材料与方法
gp160-Tat类毒素制品与单独Tat类毒素相比的免疫原活性及其毒性的缺乏，已经在18-20g Balbc小鼠中测定。
  1-免疫接种
 在第0天，通过肌内途径将0.2ml(50μg)ACF乳剂注射入一组3只小鼠体内。在第21天及60天加强注射5μg AIF。
在第一次注射前第2天，从每个小鼠后眼眶采集血液样本。
3只对照小鼠接受没有免疫原的相同制品。最后一次免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
在接受1人剂量(100μg)(根据药典)的3只小鼠内研究异常毒性。
用细胞增殖实验体外估计超免疫原的免疫毒性缺失，在缀合物存在下培养并被PPD或类毒素Tetanos刺激的PBMC上进行此细胞增殖实验。
B.结果：
1-超免疫原在体内和体外毒性的缺乏
用Tat类毒素单独免疫过的小鼠及用gp160-Tat类毒素制品免疫过的小鼠都没有任何临床症状和解剖学上的伤口。免疫抑制实验显示100ng/ml至3μg/ml剂量的gp160-Tat类毒素没有降低淋巴细胞增殖。
注射后7天没有任何一只用100μg剂量制品免疫过的小鼠(共3只)显示任何毒性迹象(体温、皮肤病症、系统或局部征兆)。
2-体液应答
体液应答是通过血清中存在的抗天然Tat重组蛋白的IgG型抗体来确定的，所述抗体通过ELISA测量并以效价(导致光密度高于0.3的稀释倍数的倒数)表示。
                      表1
                              效价
                            d-2      D72
对照小鼠：
    对照小鼠1              ＜500-1 ＜500-1
    对照小鼠2              ＜500-1 ＜500-1
    对照小鼠3              ＜500-1 ＜500-1
用Tat类毒素免疫的小鼠：
    小鼠4                  ＜500-1  32,000-1
    小鼠5                  ＜500-1  48,000-1
    小鼠6                  ＜500-1  48,000-1
用gp160-Tat类毒素缀合物免疫的小鼠：
    小鼠7                  ＜500-1  64,000-1
    小鼠8                  ＜500-1＞64,000-1
    小鼠9                  ＜500-1＞64,000-1
用gp160-Tat类毒素制品免疫过的小鼠比单用Tat类毒素免疫过的小鼠有更高的IgG型抗-Tat抗体效价。
通过Cat分析测量此抗体的中和活性。在第2和第72天采集的不同血清稀释物(1/50-1/400)与50ng/ml天然Tat温育2小时。然后再将此稀释物放在Hela细胞上，所述细胞稳定地转染了含有HIV-1的LTR作为氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)的启动子的质粒。培养24小时后，裂解细胞并用ELISA实验及Cat分析(Boehringer Mannheim)测量产生的CAT蛋白的量。中和血清阻止Tat蛋白诱导CAT蛋白表达，而非中和血清允许合成此CAT蛋白。结果以中和百分率给出：
                       表2
用Tat类毒素免疫的小鼠：
             1/50      1/100 1/200     1/400
小鼠4 d-2    0         0     0         0
      d72    75        50    25        20
小鼠5 d-2    0         0     0         0
      d72    75        60    30        20
小鼠6 d-2    0         0     0         0
      d72    75        60    30        20
                   表3
用gp160-Tat类毒素缀合物免疫的小鼠：
                   1/50     1/100    1/200     1/400
小鼠7 d-2          0        0        0         0
      d72          100      100      100       75
小鼠8 d-2          0        0        0         0
      d72          100      100      100       100
小鼠9 d-2          0        0        0         0
      d72          100      100      100       100
gp160-Tat类毒素缀合物诱导的抗体比Tat类毒素诱导的抗体有更强的中和能力。
3.细胞应答
3.1在脾细胞培养物上清液中MIP1α和MIP1β的产生
分离免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞，然后在微量培养板的圆底孔中培养，100,000细胞/孔，培养在有5μg/ml p24、gp160、天然Tat及5μg/mlgp160和5μg/ml天然Tat的混合物的情况下进行。培养24小时后收集培养物的上清液，用R&D的ELISA实验测量上清液中MIP1α和MIP1β的存在。结果用pg/ml表示。
                              表4
                     Gp160     天然Tat   gp160+    天然Tat p24
对照小鼠：
    小鼠1 d72 MIP1α   110       100       150          10
              MIP1b 100        90        140          7
    小鼠2 d72 MIP1α   120       95        153          8
              MIP1β   112       80        114          6
    小鼠3 d72 MIP1α   124       98        128          9
              MIP1β   99        112       117          7
                              表5
用Tat类毒素免疫的小鼠：
    小鼠4 d72 MIP1α   152       122       203          10
              MIP1β   140       118       196          11
    小鼠5 d72 MIP1α   145       150       215          8.5
              MIP1β   130       160       230          9
    小鼠6 d72 MIP1α   147       222       290          7
              MIP1β   152       218       300          9
                             表6
               用gp160-Tat类毒素缀合物免疫的小鼠：
    小鼠7 d72 MIP1α   810       729       1,600        7.5
              MIP1β   1,100     850       2,000        10
    小鼠8 d72 MIP1α   1,000     821       1,700        8
              MIP1β   1,125     876       2,100        9
    小鼠9 d72 MIP1α   975       768       1,685        8
              MIP1β   1,000     803       1,862        9
用gp160-Tat类毒素缀合物免疫过的小鼠的脾细胞比单独用Tat类毒素免疫过的小鼠的脾细胞产生更多的MIP1α和MIP1β趋化因子，所述产生发生在当脾细胞在体外被用于免疫接种的这些免疫原活化时。
3.2在脾细胞的培养上清液中IFNγ的产生
在有5μg/ml p24、gp160、天然Tat及5μg/ml gp160和5μg/ml天然Tat的混合物存在下培养脾细胞，培养72小时后用R&D的ELISA测量培养上清液中IFNγ的存在。结果用pg/ml表示。
                           表7
                  Gp160   天然Tat gp160+天然Tat p24
对照小鼠：
    小鼠1  d72      0        0      0         0
    小鼠2  d72      0        0      0         0
    小鼠3  d72      0        0      0         0
                            表8
用Tat类毒素免疫的小鼠：
    小鼠4  d72      ND       ND     ND        ND
    小鼠5  d72      ND       ND     ND        ND
    小鼠6  d72      ND       ND     ND        ND
                            表9
用gp160-Tat类毒素缀合物免疫的小鼠：
    小鼠7  d72      40      600         6,000
    小鼠8  d72      50      620         5,950
    小鼠9  d72      65      700         6,850
用gp160-Tat类毒素缀合物免疫过的小鼠的脾细胞当它们在体外被用于免疫过程的这些免疫原活化时产生大量IFNγ。
3.3免疫过的小鼠的脾细胞增殖(CMI)
分离免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞，然后在微量培养板的圆底孔中培养，100,000细胞/孔，培养在有p24、gp160、天然Tat及gp160和天然Tat的混合物存在下进行。37℃在含有5％CO2的潮湿空气中持续培养细胞6天。温育结束前18小时，每个孔中加入0.5μCi氚化胸苷。免疫应答的强度与增殖系数(IP)成比例。
Ip＝给定抗原的cpm(每分钟的计数)/对照cpm
                              表10
                 Gp160          天然Tat    gp160+ 天然Tat  p24
对照小鼠：
    小鼠1  d72     1.2          1          1.1             1
    小鼠2  d72     1            1.2        1               1.1
    小鼠3  d72     1.1          1.1        1               1
                            表11
用Tat类毒素免疫的小鼠：
                Gp160    天然Tat    gp160+ 天然Tat  p24
小鼠4 d72           1.2       10         9          1
小鼠5 d72           1         8          10         1.2
小鼠6 d72           1.1       9          8          1.1
                           表12
用gp160-Tat类毒素缀合物免疫的小鼠：
                Gp160    天然Tat    gp160+ 天然Tat  p24
小鼠7 d72           8         10         9          1
小鼠8 d72           9         8          10         1
小鼠9 d72           11        10         9          1
用gp160-Tat类毒素缀合物或Tat类毒素免疫过的小鼠的脾细胞在体外被用于免疫过程的免疫原活化后发生增殖。
实施例7：[Tat肽(1-15；46-60)]-SIAB-[Tat类毒素]缀合物的免疫 原活性
A.材料与方法
根据实施例6中描述的方案，与单独Tat类毒素相比Tat肽-Tat类毒素的免疫原活性及其毒性的缺乏，已经在18-20g Balbc小鼠中测定。
B.结果
1-超免疫原在体内和体外毒性的缺乏
用Tat类毒素单独免疫过的小鼠及用Tat肽-Tat类毒素制品免疫过的小鼠都没有显示任何临床征兆和解剖学上的伤口。免疫抑制实验显示100ng/ml至3μg/ml剂量的肽-Tat类毒素没有降低淋巴细胞增殖。
注射后7天用100μg制品免疫过的3只小鼠没有任何一只显示任何毒性征兆(体温、皮肤病症、系统或局部征兆)。
2-体液应答
体液应答是通过血清中存在的抗天然Tat重组蛋白的IgG类抗体来测量的，抗体的存在通过ELISA测量并以效价(导致光密度比0.3高的稀释倍数的倒数)表示。
                             表13
                                    效价
                             d-2              d72
对照小鼠：
              小鼠1          ＜500-1        ＜500-
              小鼠2          ＜500-1        ＜500-1
              小鼠3          ＜500-1        ＜500-1
                                     效价
                             d-2              d72
用Tat类毒素免疫的小鼠：
             小鼠4           ＜500-1          32,000-1
             小鼠5           ＜500-1          48,000-1
             小鼠6           ＜500-1          48,000-1
用Tat肽-Tat类毒素缀合物免疫的小鼠：
             小鼠7           ＜500-1          64,000-1
             小鼠8           ＜500-1          64,000-1
             小鼠9           ＜500-1          64,000-1
用Tat肽-Tat类毒素缀合物免疫过的小鼠比单用Tat类毒素免疫过的小鼠有更高的IgG型抗-Tat抗体效价。
用Cat分析测定此抗体的中和活性。
结果以中和百分率给出。
                                      表14
用Tat类毒素免疫的小鼠：
                                         中和％
                               1/50   1/100  1/200  1/400
           小鼠4 d-2           0      0      0      0
                 d72           75     50     25     20
           小鼠5 d-2           0      0      0      0
                 d72           75     60     30     20
           小鼠6 d-2           0      0      0      0
                 d72           75     60     30     20
                                表15
用Tat肽-Tat类毒素缀合物免疫的小鼠：
                               1/50   1/100  1/200  1/400
      小鼠7 d-2                0      0      0      0
            d72                100    100    50     25
      小鼠8 d-2                0      0      0      0
            d72                100    100    75     50
      小鼠9 d-2                0      0      0      0
            d72                100    100    60     30
Tat肽-Tat类毒素缀合物诱导的抗体比Tat类毒素诱导的抗体有更强的中和能力。
实施例8：E7-SIAB-VEGF缀合物的免疫原活性
A.材料与方法
根据实施例6中描述的方案，在6周龄黑色C576小鼠中测定，与VEGF和E7蛋白相比E7-SIAB-VEGF缀合物的免疫原活性及其毒性的缺乏。
B.结果
1-超免疫原在体内和体外毒性的缺乏
用E7蛋白或VEGF免疫过的小鼠及用E7-SIAB-VEGF制品免疫过的小鼠都没有任何临床征兆和解剖学上的伤口。免疫抑制实验显示100ng/ml至3μg/ml剂量的E7-SIAB-VEGF缀合物没有降低淋巴细胞增殖。
注射后7天用100μg制品免疫过的3只小鼠没有任何一只显示任何毒性征兆(体温、皮肤病症、系统或局部征兆)。
2-体液应答
体液应答是通过血清中存在的抗E7蛋白和抗VEGF的IgG类抗体来测量的，抗体的存在通过ELISA测量并以效价(导致光密度比0.3高的稀释倍数的倒数)表示。
                                  表16
                    效价           d-2              d72
对照小鼠：
小鼠1               E7            ＜500-1        ＜500-1
                    VEGF          ＜500-1        ＜500-1
小鼠2               E7            ＜500-1        ＜500-1
                    VEGF          ＜500-1        ＜500-1
小鼠3               E7            ＜500-1        ＜500-1
                    VEGF          ＜500-1        ＜500-1
                             表17
                     用VEGF免疫的小鼠：
小鼠4               E7            ＜500-1        ＜500-1
                    VEGF          ＜500-1        ＜1000-1
小鼠5               E7            ＜500-1        ＜500-1
                    VEGF          ＜500-1        1,500-1
小鼠6               E7            ＜500-1        ＜500-1
                    VEGF          ＜500-1        500-1
                              表18
用E7免疫的小鼠：
小鼠7       E7            ＜500-1           48,000-1
            VEGF          ＜500-1           ＜500-1
小鼠8       E7            ＜500-1           64,000-1
            VEGF          ＜500-1           ＜500-1
小鼠9       E7            ＜500-1           48,000-1
            VEGF          ＜500-1           ＜500-1
                            表19
用E7-SIAB-VEGF缀合物免疫的小鼠：
小鼠10      E7            ＜500-1           48,000-1
            VEGF          ＜500-1           48,000-1
小鼠11      E7            ＜500-1           64,000-1
            VEGF          ＜500-1           32,000-1
小鼠12      E7            ＜500-1           48,000-1
            VEGF          ＜500-1           48,000-1
用E7-SIAB-VEGF缀合物免疫过的小鼠比单独用VEGF免疫过的小鼠有更高的IgG型抗VEGF抗体效价，而它们的抗-E7反应与单独用E7免疫的小鼠中所得到的反应是相同的。
3.细胞应答
3.1免疫过的小鼠的脾细胞增殖(CMI)
分离免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞，然后在微量培养板的圆底孔中培养，100,000细胞/孔，培养在天然E7存在下进行。37℃在含有5％CO2的潮湿空气中持继培养细胞6天。温育结束前18小时，每个孔中加入0.5μCi氚化胸苷。免疫应答的强度与增殖系数(IP)成比例。
Ip＝给定抗原的cpm(每分钟的计数)/对照cpm
                     表20
对照小鼠：
         小鼠1 d72                1.2
         小鼠2 d72                1
         小鼠3 d72                1.1
用VEGF免疫的小鼠：
         小鼠4 d72                1.2
         小鼠5 d72                1
         小鼠6 d72                1.1
用E7免疫的小鼠：
         小鼠7 d72                6
         小鼠8 d72                10
         小鼠9 d72                8
用E7-SIAB-VEGF缀合物免疫的小鼠：
         小鼠10 d72               7
         小鼠11 dj72              10
         小鼠12 d72               9
用E7-SIAB-VEGF缀合物免疫过的小鼠的脾细胞在体外被E7蛋白活化后增殖。
实施例9：Betv1a-SIAB-IL4(小鼠的)缀合物的免疫原性
A.材料与方法
根据实施例6中描述的方案，与Betv1a和IL4(鼠的)相比Betv1a-SIAB-IL4(鼠的)缀合物的免疫原活性及其毒性的缺乏，已经在18-20g Balbc小鼠中测定。
B.结果
1-超免疫原在体内和体外毒性的缺乏
用IL4单独免疫过的小鼠及用Betv1a-SIAB-IL4缀合物免疫过的小鼠都没有显示任何临床征兆和解剖学上的伤口。免疫抑制实验显示100ng/ml至3μg/ml剂量的Betv1a-SIAB-IL4缀合物没有降低淋巴细胞增殖。
注射后7天用100μg制品免疫过的3只小鼠没有任何一只显示任何毒性征兆(体温、皮肤病症、系统或局部征兆)。
2-体液应答
体液应答是通过血清中存在的抗Betv1a和IL4的IgG型抗体来测量的，抗体的存在通过ELISA测量并以效价(导致光密度比0.3高的稀释倍数的倒数)表达。
                                 表21
                    效价         d-2            D72
对照小鼠：
    小鼠1           Betv1a      ＜500-1       ＜500-1
                    IL4         ＜500-1       ＜500-1
    小鼠2           Betv1a      ＜500-1       ＜500-1
                    IL4         ＜500-1       ＜500-1
    小鼠3           Betv1a      ＜500-1       500-1
                    IL4         ＜500-1       ＜500-1
                                表22
                         用Betv1a免疫的小鼠：
                    效价          d-2              D72
    小鼠4           Betv1a      ＜500-1         48,000-1
                    IL4         ＜500-1         ＜500-1
    小鼠5           Betv1a      ＜500-1         64,000-1
                    IL4         ＜500-1         ＜500-1
    小鼠6           Betv1a      ＜500-1         64,000-1
                    IL4         ＜500-1         ＜500-1
                      用IL4免疫的小鼠：
                    效价           d-2              D72
    小鼠7           Betv1a       ＜500-1        ＜500-1
                    IL4          ＜500-1        500-1
    小鼠8           Betv1a       ＜500-1        ＜500-1
                    IL4          ＜500-1        1,500-1
    小鼠9           Betv1a       ＜500-1        ＜500-1
                    IL4          ＜500-1        1,000-1
                                  表23
                    E7-SIAB-IL4缀合物免疫的小鼠：
               效价         d-2          D72
小鼠10        Betv1a      ＜500-1    48,000-1
              IL4         ＜500-1    48,000-1
小鼠11        Betv1a      ＜500-1    64,000-1
              IL4         ＜500-1    32,000-1
小鼠12        Betv1a      ＜500-1    48,000-1
              IL4         ＜500-1    48,000-1
用Betv1a-SIAB-IL4缀合物免疫过的小鼠比单独用IL4免疫过的小鼠有更高的IgG型抗IL4抗体效价，而它的抗-Betv1a反应与单独用Betv1a免疫的小鼠所得到的反应仍是同样的。
                              参考文献
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Claims (31)

1.包含两个彼此物理上连接的不同多肽的复合超免疫原的用途，其中所述两个多肽分别是：
(a)诱导对惰性或活性细胞、微生物或颗粒致病性抗原结构的细胞免疫应答或细胞和体液免疫应答的第一免疫原性多肽；
(b)诱导产生抗间质局部循环蛋白的中和性或封闭性抗体的第二免疫原性多肽，其中所述间质局部循环蛋白选自有免疫毒性或生血管特性的细胞因子或细胞调节因子，此类因子能够由癌细胞、病毒感染细胞或间质细胞，包括T淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC)产生，或者能被致病性，包括变应性，颗粒结构诱导，
所述用途为用于获得具有诱导对致病性抗原结构和间质局部循环蛋白的粘膜或系统免疫的抗癌、抗病毒或抗过敏作用的药物。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于第一免疫原性多肽(a)选自：(i)由癌细胞选择性表达的、由病毒感染细胞选择性表达的或作为变应性致病结构之组分的免疫原性蛋白，如果需要的话，去毒形式的免疫原性蛋白，和(ii)衍生自蛋白(i)的蛋白。
3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于免疫原性多肽(b)选自：(i)间质局部循环蛋白，如果需要的话，去毒形式的间质局部循环蛋白，和(ii)衍生自蛋白(i)的蛋白。
4.根据权利要求1到3之任一项的用途，其特征在于第一免疫原性多肽(a)选自：HIV1的免疫原性蛋白、此蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的蛋白。
5.根据权利要求1到3之任一项的用途，其特征在于第一免疫原性多肽(a)选自：TAA或TSA肿瘤抗原、此蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白。
6.根据权利要求1到3之任一项的用途，其特征在于第一免疫原性多肽(a)选自：变应性Betv1a、Der p1和Fel d1蛋白、这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白。
7.根据权利要求1到3之任一项的用途，其特征在于多肽(a)和多肽(b)选自：
a)对于预防或治疗AIDS：
-多肽(a)：HIV1病毒的gp160、p24、p17、Nef和Tat蛋白，如果需要的话，去毒或稳定化形式的蛋白，以及这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
-多肽(b)：Tat、IFNα和TGFβ蛋白，如果需要的话，去毒形式的蛋白，以及这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
b)对于预防或治疗宫颈癌：
-多肽(a)：乳头瘤病毒，优选来自16或18株系的乳头瘤病毒的L1、L2和E7蛋白，如果需要的话，去毒或稳定化形式的蛋白，以及这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
-多肽(b)：E7、IFNα、TGFβ、TNFα和VEGF蛋白，如果需要的话，去毒或稳定化形式的蛋白，以及这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
c)对于预防或治疗由HTLV1或2病毒诱导的ATL白血病：
-多肽(a)：HTLV1或2病毒的gp61和Tax蛋白，如果需要的话，去毒形式的蛋白，以及这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
-多肽(b)：去毒形式的Tax、IL10、IFNα和TGFβ蛋白，这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的蛋白；
d)对于预防或治疗结肠癌：
-多肽(a)：CEA和p53蛋白，如果需要的话，去毒形式的蛋白，以及这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
-多肽(b)：去毒形式的TGFβ、IL10、p53、FasL和VEGF蛋白，这些蛋白的免疫原性肽片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
e)对于预防或治疗乳腺癌：
-多肽(a)：Di12蛋白，此蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的蛋白；
-多肽(b)：TGFβ、TNFα和VEGF蛋白，如果需要的话，去毒形式的蛋白，以及这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
f)对于预防或治疗胰腺癌：
-多肽(a)：CaSm蛋白，如果需要的话，去毒形式的蛋白，此蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
-多肽(b)：VEGF和TNFα蛋白，如果需要的话，去毒或稳定化形式的蛋白，这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
g)对于预防或治疗前列腺癌：
-多肽(a)：OSA和ETS2蛋白，如果需要的话，去毒形式的蛋白，这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白；
-多肽(b)：IL6和TGFβ蛋白，如果需要的话，去毒形式的蛋白，这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白。
8.根据权利要求6的用途，其特征在于多肽(b)选自：IL4和IL5蛋白、这些蛋白的免疫原性片段和衍生自它们的免疫原性蛋白。
9.根据权利要求7的用途，其特征在于复合超免疫原选自：
-复合超免疫原(a)gp160-(b)Tat类毒素；
-复合超免疫原(b)Tat肽[1-15；46-60]-(a)gp160；
-复合超免疫原(a)Tat类毒素-(b)IFNα；
-复合超免疫原(a)Tat类毒素-(b)Tat肽[1-15；46-60]。
10.根据权利要求7的用途，其特征在于复合超免疫原选自：
-复合超免疫原(a)L1-(b)E7；
-复合超免疫原(a)E7-(b)VEGF。
11.根据权利要求1到3和6之任一项的用途，其特征在于复合超免疫原是(a)Betv1a-(b)IL4。
12.根据权利要求1到11之任一项的用途，其特征在于多肽(a)和(b)直接彼此共价连接。
13.根据权利要求1到11之任一项的用途，其特征在于多肽(a)和(b)在复合超免疫原中由间隔链彼此隔开。
14.根据权利要求13的用途，其特征在于间隔链含有线性间隔肽。
15.根据权利要求13的用途，其特征在于肽链含有分支间隔肽。
16.根据权利要求13的用途，其特征在于间隔链是SIAB或SMMC型链。
17.根据权利要求16的用途，其特征在于复合超免疫原选自：
-复合超免疫原(a)E7-SIAB-(b)VEGF；和
-复合超免疫原(a)Betv1a-SIAB-(b)IL4。
18.根据权利要求1到8之任一项的用途，其特征在于多肽(a)和多肽(b)被固定于单个纳米颗粒上或嵌入单个微米颗粒或单个纳米颗粒中。
19.含有两个彼此物理上连接的不同免疫原性多肽的复合超免疫原，其中，两个多肽分别是：
(a)诱导对惰性或活性细胞、微生物或颗粒致病性抗原结构的细胞免疫应答或细胞和体液免疫应答的第一免疫原性多肽；
(b)诱导产生抗间质局部循环蛋白的中和性或封闭性抗体的第二免疫原性多肽，所述间质局部循环蛋白选自有免疫毒性或生血管特性的细胞因子或细胞调节因子，此类因子或者能由癌细胞、病毒感染细胞或间质细胞，包括T淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC)产生，或者能被致病性，包括变应性，颗粒结构诱导。
20.根据权利要求19的复合超免疫原，其特征在于它是(a)gp160-(b)Tat类毒素缀合物。
21.根据权利要求19的复合超免疫原，其特征在于它是(a)Tat类毒素-(b)IFNα缀合物。
22.根据权利要求19的复合超免疫原，其特征在于它是(a)E7-SIAB-(b)VEGF缀合物。
23.根据权利要求19的复合超免疫原，其特征在于它是(a)Betv1a-SIAB-(b)IL4缀合物。
24.含有编码根据权利要求19到23之任一项的复合超免疫原的序列的核酸。
25.含有编码根据权利要求19的复合超免疫原的多核苷酸的表达盒，其中所述多核苷酸处于在哺乳动物，更优选地人中有功能的调节多核苷酸的控制下。
26.含有根据权利要求24的核酸或根据权利要求25的表达盒的重组载体。
27.根据权利要求24的核酸、根据权利要求25的表达盒或根据权利要求26的重组载体的用途，用于获得有抗癌、抗病毒或抗过敏作用的药物。
28.免疫原性组合物，其特征在于它含有免疫学有效量的根据权利要求19到23之任一项的复合超免疫原以及一种或多种生理相容性赋形剂。
29.疫苗，其特征在于它含有根据权利要求19到23之任一项的复合超免疫原作为活性成分并含有一种或多种生理相容性赋形剂。
30.免疫原性组合物，其特征在于它含有治疗有效量的根据权利要求24的核酸、根据权利要求25的表达盒或根据权利要求26的重组载体。
31.疫苗，其特征在于它含有治疗有效量的根据权利要求24的核酸、根据权利要求25的表达盒或根据权利要求26的重组载体。
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