CN1723041A - 包含抗原性杂络物的稳定的免疫原性产物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在受试者中诱导针对一种或多种抗原性蛋白的抗体的稳定的免疫原性产物，其特征在于该免疫原性产物含有由(i)抗原性蛋白分子和(ii)载体蛋白分子之间的结合组成的蛋白质免疫原性杂络物，并且其特征还在于40％以下的抗原性蛋白(i)共价连接到载体蛋白分子(ii)。

Description

包含抗原性杂络物的稳定的免疫原性产物
发明领域
本发明涉及包含免疫原性蛋白质杂络物的稳定的免疫原性产物，其用于获得体液免疫应答，产生针对一种或多种抗原尤其针对自身抗原的特异抗体，以及这些免疫原性产物在疫苗领域中的用途。
现有技术
在个体中从给定抗体得到高水平抗体应答是通常探求的目的，无论抗原是外来抗原还是自身抗原。
然而，应该在许多情况下解决个体中抗体应答对抗原的良好识别问题，这些情况更具体地为(a)当目标抗原表现得像“半抗原”，即低分子量化学结构时，其在游离形式免疫原性很低或者没有免疫原性，但是，一旦固定在高分子量分子上，能够诱导对这种半抗原产生特异抗体，和(b)当目标抗原是自身蛋白，即在个体中天然产生的蛋白时，对于自身蛋白，由于在免疫系统的发育期间相应淋巴细胞T克隆的去除而对其存在免疫耐受性。
为了导致或者增加B细胞对目标抗原的识别，在本领域中已经开发了多种免疫原性结构。
第一种免疫原性结构形式包括将目标抗原共价偶联到载体分子上，该载体分子具有被辅助性T淋巴细胞(T辅助细胞)识别的结构，其与主要组织相容性复合体(MHC)的II类分子结合，并活化辅助性T淋巴细胞，然后产生多种细胞因子，包括IL-2，所述细胞因子再活化目标抗原的特异B细胞克隆。目标抗原的特异B细胞克隆一旦被活化，就增殖并产生对目标抗原特异的抗体，这就是所寻求的目标。通常，这种类型的免疫原性结构包含目标抗原和载体分子之间的共价化学偶联产物，其在纯化和除去未偶联的产物的步骤后，是可充分定义化学结构的终产物。
免疫原性结构的第一种形式由例如Richard等的文章阐明，其描述了IL-9和卵清蛋白之间共价偶联产物的制备(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，卷97(2)：767-772)。还在美国专利6,340,461(Terman)进行了阐明，该专利公开了目标抗原的一份或多份拷贝与由“超级抗原”组成的载体分子之间的偶联产物，针对其中所述目标抗原的特异抗体应答是在个体中所寻求的。通过例如戊二醛(也称作“pentanedial”)将目标抗原排他性地偶联到载体分子，除去非共价偶联的产物以得到化学上可充分定义的终产物。
任选地，目标抗原和超级抗原之间的共价偶联产物可以以所述偶联产物的聚合物形式制备，该制备可例如，通过单体偶联产物相互之间的非共价结合、通过离子相互作用、吸附相互作用以及生物特异相互作用来实现。例如，单体偶联产物可与带大量正电荷或负电荷的分子通过低离子强度条件下产生的盐桥形成复合体。使用带电聚合物如聚(L-谷氨酸)或者聚(L-赖氨酸)聚合物制备单体偶联产物的大复合体。根据单体偶联产物聚合物的另一个实施方案，目标抗原和超级抗原之间的排他性共价偶联产物可被吸附或者非共价地偶联在微粒如乳胶珠或者其他疏水聚合物的表面。
这种通常称为“MAP”(多抗原性蛋白)结构的免疫原性结构的第二个实施方案通常具有由线性或分枝的聚(赖氨酸)聚合物组成的蛋白质主链的形式，一种或多种目标抗原共价地结合到该聚合物上。
这种免疫原性结构的第三个实施方案为微粒，微粒上结合目标抗原。抗原载体微粒的多种形式是公知的。
熟知例如iscomes(免疫刺激复合体)，其由抗原性复合体和佐剂QuilA化合物组成。
还公知脂质体具有和iscomes相同的不利之处，即更具体地，由于它们纯度不够而具有一定毒性和免疫学副作用。
生物可降解的微粒是熟知的，如乳酸和谷氨酸聚合物(Aguado和Lambert，1992，Immuno.Biol.，卷184：113-125)以及淀粉微粒(美国专利申请2002/0098203-Gutavsson等人)，目标抗原被捕获在聚合物基质中。聚合物基质降解期间，这些微粒以可溶形式释放抗原。
还公开了仅由杂化重组蛋白组成的微粒，如法国专利申请FR 2,635,532(Thiollais等人)中所公开的。
还公知有孔微球体，其中通过捕集(captation)或者物理偶联将抗原固定在微球体内，如美国专利5,008,116(Cahn)中公开的。
然而，在本领域现状中提出的各种解决方案都具有关于它们的制备方法的至少一种技术上的不利之处，即由于除去非偶联的或者非吸附的抗原的必要步骤，而损失大部分目标抗原性材料。
而且，尽管现有技术允许提供低分子量目标抗原和载体分子之间的结合，但是它们通常不适于将高分子量目标抗原例如大于10kDa的目标抗原与载体分子偶联，特别是因为空间位阻妨碍具有高分子量的许多目标抗原分子与同一载体分子的偶联。
最后，多数(如果不是所有)公知的肽抗原性结构在它们的结构中包括单一的载体分子，当目标是诱导针对目标抗原和该载体分子自身的预防性或治疗性免疫应答时，该单一载体分子是技术上的不利之处。
因此在本领域中需要改进的免疫原性结构，其允许在个体中产生针对目标抗原特异的高水平抗体，这是这种体液免疫应答所寻求的，该免疫原性结构较便宜、容易制备并且能够重复合成。
发明概述
本发明提供了新的免疫原性结构，其允许解决使用现有技术中公知的免疫原性结构遇到的各种技术问题，并且满足上面描述的各种技术需求。
本发明的目的是提供稳定的免疫原性产物以在受试者中诱导产生针对一种或多种抗原性蛋白的抗体，该免疫原性产物的特征是其含有蛋白免疫原性杂络物，该杂络物由(i)抗原性蛋白分子和(ii)载体蛋白分子之间的结合组成，另一特征是40％以下的抗原性蛋白(i)共价连接到载体蛋白分子(ii)。
本发明的另一目的也是免疫原性产物，其含有稳定的蛋白免疫原性杂络物，其用于在受试者中诱导产生针对一种或多种抗原性蛋白的抗体，每种杂络物含有(i)许多抗原性蛋白，其连接到(ii)载体蛋白分子，该杂络物的特征是40％以下的抗原性蛋白(i)共价连接到载体蛋白分子(ii)。
优选地，组成根据本发明的免疫原性产物的免疫原性杂络物的对每个载体蛋白分子(ii)含有5到50个抗原性蛋白(i)，优选地对每个载体蛋白分子(ii)含有20到40个抗原性蛋白(i)。
优选地，通过功能结合化学剂产生一种或多种抗原性蛋白(i)和载体蛋白分子(ii)之间的共价键。
目标抗原分子指含有天然抗原性蛋白的一个或多个B表位的任一种蛋白，针对其产生的抗体是所寻求的。所述目标抗原分子可以包括天然蛋白自身或者该天然蛋白衍生的蛋白，如该天然蛋白的肽片段，以及通过化学、物理处理或基因突变得到的该天然蛋白的任一种生物学上失活的形式。目标抗原分子也可以包括该天然蛋白的同型-寡聚体或者同型-聚合物以及该天然蛋白质的肽片段的同型-寡聚体或者同型-聚合物。目标抗原性蛋白也可以包括异型-寡聚体或异型-聚合物，其包含最初包括在该天然蛋白中的几种不同肽片段的组合。
根据本发明的免疫原性产物的一般实施方案，载体蛋白分子(ii)是免疫原性蛋白，其诱导产生T辅助淋巴细胞和/或细胞毒性T淋巴细胞，所述T辅助淋巴细胞和/或细胞毒性T淋巴细胞针对在细胞表面具有所述载体蛋白分子或由其衍生的任一种多肽与主要组织相容性复合体(MHC)的呈递分子分别是II类和/或II类分子结合而产生。载体蛋白分子(ii)也可以是免疫原性蛋白，其诱导产生T辅助淋巴细胞和通过B淋巴细胞产生针对该载体蛋白的抗体。
根据具体的目标实施方案，免疫原性产物的特征是载体分子(ii)是免疫原性蛋白，其诱导产生T细胞毒性淋巴细胞，所述T细胞毒性淋巴细胞针对在细胞表面具有所述载体蛋白分子或由其衍生的任一种多肽与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子结合而产生。
根据本发明的优选免疫原性产物选自含有下列杂络物的免疫原性产物，其中一方面，抗原性蛋白(i)和另一方面，蛋白质载体分子(ii)分别为：
a)i)IL-4和(ii)KLH；
b)(i)α干扰素和(ii)KLH；
c)(i)VEGF和(ii)KLH；
d)(i)IL-10和(ii)KLH；
e)(i)α干扰素和(ii)VIH1的gp 160
f)(i)IL-4和(ii)Bet v1变应原性抗原；和
g)(i)VEGF和(ii)乳头瘤病毒E7蛋白；
h)(i)失活的VIH1 Tat蛋白和(ii)VIH1 gp 120蛋白。
i)(i)IgE同种型人抗体和(ii)失活的VIH1 Tat蛋白；
j)(i)蓖麻毒蛋白β片段和(ii)KLH。
本发明还涉及组合物，更具体地，药物组合物、免疫原性组合物或疫苗组合物，其特征是该组合物含有如上文中描述的免疫原性产物。
本发明还涉及制备根据权利要求1到16任一项的免疫原性产物的方法，该方法的特征是包括下面的步骤：
a)在结合化学品存在下，将抗原性蛋白(i)和载体分子(ii)以摩尔比(i)∶(ii)为10∶1到50∶1的比例孵育；和
b)收集含有步骤a)中制备的免疫原性杂络物的免疫原性产物。
附图简述
图1图解通过在琼脂糖凝胶中等电聚焦，然后通过免疫印迹(蛋白质印迹)显现蛋白以表征含有鼠KLH-VEGF杂络物的免疫原性产物。
图2图解通过等电聚焦、考马斯蓝染色，然后免疫印迹(蛋白质印迹)表征含有人KLH-VEGF杂络物的免疫原性产物。等电聚焦凝胶在图的左边提供。在图的右边图解使用抗-KLH(左)或人抗-VEGF(右)抗体的免疫印迹凝胶。
图3图解通过在琼脂糖凝胶中等电聚焦，然后通过免疫印迹(蛋白质印迹)显现蛋白以表征含有人KLH-IL4杂络物的免疫原性产物。
图4图解通过在琼脂糖凝胶中等电聚焦，然后通过免疫印迹(蛋白质印迹)显现蛋白以表征含有gp 160-IFNα复合体的免疫原性产物。
图5图解了鼠KLH-VEGF免疫原性产物的免疫原性(体液)活性，通过确定小鼠免疫后所得抗体效价来确定免疫原性活性。图5A涉及用鼠VEGF免疫的小鼠。图5B涉及用含有KLK-VEGF杂络物的免疫原性产物免疫的小鼠。图5C图解了用弗氏不完全佐剂(FIA)注射的对照小鼠。
图6显示了鼠KLH-VEGF免疫原性产物的免疫原性(体液)活性，通过确定免疫后所得抗体对VEGF蛋白血管生成活性的中和能力来确定免疫原性活性。
图7图解了人KLH-VEGF免疫原性产物的免疫原性(体液的)活性，通过确定小鼠免疫后所得抗体效价来确定免疫原性活性。
图8图解了人KLH-VEGF免疫原性产物的免疫原性(体液的)活性，通过确定免疫后所得抗体对VEGF蛋白的血管生成活性的中和能力(通过内皮细胞的增殖测量)来确定免疫原性活性。
图9图解了鼠KLH-IL4免疫原性产物的免疫原性(体液)活性，通过免疫后所得抗体效价的确定来确定免疫原性活性。
图10图解了鼠KLH-IL4免疫原性产物的免疫原性(体液)活性，通过确定免疫后所得抗体对IL4诱导HT-2细胞增殖活性的中和能力来确定免疫原性活性。
图11图解了对用含有KLH-IL4复合体的本发明免疫原性产物预先免疫的小鼠注射桦树花粉后，针对Bet v1的IgG和IgE类抗体的产生结果。
图12图解了人KLH-IL4免疫原性产物的免疫原性(体液)活性，通过确定免疫后所得抗体对IL4诱导HT-2细胞增殖活性的中和能力来确定免疫原性活性。
发明详述
本发明提供了用于在个体中针对目标抗原诱导产生高水平特异抗体的新免疫原性结构。
根据本发明的免疫原性蛋白杂络物
根据本发明已经表明用免疫原性产物免疫个体，可以在该个体中产生针对目标抗原的高水平特异抗体，其中所述目标抗原与载体蛋白分子结合，所述目标抗原与所述载体蛋白之间的结合是部分共价的和部分非共价的。
更特别地，根据本发明已经表明当用含有蛋白质杂络物的稳定免疫原性产物免疫个体后，可以得到针对目标抗原产生的极好抗体应答，其中该蛋白质杂络物包含目标抗原和所述蛋白质分子之间的稳定结合，并且其中仅一小部分这些结合是由于目标抗原和载体蛋白分子之间的共价键，目标抗原和载体蛋白分子之间的其他结合由弱键、离子相互作用、氢键、范德华力等产生。
具体地，根据本发明已经表明，当在如上文描述的稳定免疫原性产物中，40％以下的目标抗原分子共价连接载体蛋白分子时，可以实现最佳抗体应答。根据本发明，目标抗原性分子通过共价键共价连接载体蛋白分子指所述目标抗原分子通过至少一个共价键，即任选通过两个或多个共价键共价地化学连接到所述载体蛋白分子。
本领域技术人员可容易地检查本发明的免疫原性产物中通过共价键相互连接的载体蛋白分子和目标抗原性蛋白的百分数。
例如，使用下面的步骤可以确定本发明的免疫原性产物中通过共价键连接到载体蛋白分子的抗原性蛋白的百分数：
(i)将溶液中的所述免疫原性产物置于变性和还原条件；
(ii)使用步骤(i)结束时得到的产物实施大小排阻层析步骤，排阻层析步骤期间，分子量递减的多种蛋白质组分不断从大小排阻层析支持体洗脱出来；
(iii)测量含有最高分子量的蛋白质组分的洗脱物级分中通过共价键连接到载体分子的目标抗原量；
(iv)将步骤(iii)中测量的目标抗原量与最初包括在起始免疫原性产物的目标抗原总量比较。
在用于确定上述共价键百分数的方法的步骤(i)中，在变性和还原条件下孵育给定量(摩尔数或重量)的本发明免疫原性产物导致不是通过共价键相互连接的各种蛋白质组分之间的弱键解离。
优选的变性条件包括存在例如终浓度为8M浓度的脲，或者存在SDS，其终浓度例如为含有免疫原性产物的溶液总重量的1％。在优选的还原条件中，存在β-巯基乙醇，其终浓度例如为含有免疫原性产物的溶液总体积的5％。
在用于确定通过共价键相互连接的目标抗原和载体蛋白分子的百分数的方法的步骤(ii)中，本领域技术人员可根据其一般技术知识选择大小排阻层析支持体。例如，本领域技术人员可以利用如Pharmacia公司以Superdex75TM和Superdex 200TM商标上市的层析支持体。
在步骤(ii)中，相应于共价连接有目标抗原分子的载体分子的分子级分在含有游离形式的目标抗原的洗脱物级分之前被首先洗脱。以游离形式洗脱的目标抗原相应于目标抗原的级分，其非共价地连接到起始免疫原性产物内的载体分子。在例如免疫-酶试验、放射免疫学试验或者免疫荧光试验中，使用对目标抗原特异并且与载体蛋白分子不具有任何免疫学交叉反应的抗体，直接或间接地(三明治)对高分子量蛋白质级分测量共价连接到载体蛋白分子的目标抗原的量。
在步骤(iii)中，将如上文中描述测量的共价连接载体蛋白分子的目标抗原的量与包括在起始免疫原性产物的给定量(摩尔数或重量)中的目标抗原的起始量比较，从而计算本发明的免疫原性产物中共价连接到载体蛋白分子的目标抗原的百分数。
本领域技术人员利用第二种方法可以容易地检查本发明的免疫原性产物中通过共价键相互连接的载体蛋白分子和目标抗原性蛋白蛋白质的百分数，该第二种方法包括下面的步骤：
a)将针对载体蛋白产生的特异抗体固定在支持体上；
b)将在步骤a)中固定在支持体上的针对载体蛋白的抗体与所要测试的免疫原性产物分子的已知量接触，其中所述免疫原性产物含有所述载体蛋白和目标抗原性蛋白；
c)通过含有一种或多种蛋白质变性剂的缓冲水性溶液除去没有连接到步骤a)中固定的抗-载体蛋白抗体的免疫原性产物分子；
d)d1)将(i)在步骤c)中形成的固定化抗-载体蛋白抗体与免疫原性产物分子之间的免疫原性复合体与(ii)针对载体蛋白特异产生的抗体接触；d2)与步骤d1)分开地，将(i)在步骤c)中形成的固定化抗-载体蛋白抗体与免疫原性产物分子之间的免疫原性复合体与(ii)针对目标抗原性蛋白特异产生的抗体接触；
e)e1)对步骤d1)中加入的已经连接到载体蛋白的抗体定量；e2)对步骤d2)中加入的已经连接到抗原性蛋白的抗体定量；
f)计算(i)步骤e1)中测量的结合抗载体蛋白的抗体的量；和(ii)步骤e2)中测量的结合抗载体蛋白的抗体的量；之间的比值。
所述比值由所述起始免疫原性产物中通过共价键相互连接的载体蛋白分子和目标抗原性蛋白分子的比例组成。
在上述方法的步骤c)中，用含有一种或多种蛋白质变性剂的水性洗涤溶液使连接到抗-载体蛋白抗体的免疫原性产物变性，导致没有共价连接到载体蛋白分子的目标抗原性蛋白分子释放到洗涤溶液中。因此，在该方法的步骤d2)中，仅仅定量共价连接到载体蛋白分子的目标抗原性蛋白分子。
优选地，用于步骤c)中的变性缓冲液含有表面活性剂如Tween20，其终浓度为0.1％v/v。
在步骤d1)和d2)中，优选通过将所述步骤的每一步骤末尾形成的抗原-抗体复合体分别与通过可检测分子标记的新抗体孵育来测量所结合的抗体的量：
(i)在步骤d1)中，新抗体针对抗-载体蛋白抗体并且用可检测分子标记；
(ii)在步骤d2)中，新抗体针对抗-目标抗原性蛋白的抗体并且用可检测分子标记；
可检测分子任选地为放射性分子、荧光分子或者酶。作为酶，更尤其使用过氧化物酶，将其与邻-苯二胺(OPD)底物孵育后，可通过比色法显示过氧化物酶的存在。
在实施例中描述了上述方法的详细方案。
为了阐明，使用上述第一或第二种定量方法，根据本发明已经表明：
-在含有KLH载体分子和人α干扰素分子之间的杂络物的免疫原性产物中，3到8％α干扰素分子共价连接到KLH载体蛋白分子；
在含有KLH载体蛋白分子和鼠IL-4分子之间的杂络物的免疫原性产物中，约11％的IL-4分子共价连接到KLH载体蛋白分子；
显然，共价连接到载体蛋白的目标抗原性蛋白分子的百分数可以根据制剂而显著变化。然而，在所有情况下，这种百分数总是低于40％。
本发明的目的是提供用于在受试者中诱导产生针对一种或多种抗原性蛋白的抗体的稳定免疫原性产物，其特征是其含有这样的蛋白质免疫原性杂络物，该杂络物含有(i)抗原性蛋白分子和(ii)载体蛋白分子之间的结合，且40％以下的抗原性蛋白(i)共价连接到载体蛋白分子(ii)。
本发明的另一目的也是提供用于在受试者中诱导产生针对一种或多种抗原性蛋白的抗体的、包含稳定蛋白免疫原性杂络物的免疫原性产物，每种杂络物含有(i)许多抗原性蛋白，它们连接到(ii)载体分子，该杂络物的特征是40％以下的抗原性蛋白(i)共价连接到载体蛋白分子(ii)。
最优选地，通过本发明的免疫原性产物诱导产生的抗体包含“中和性”或“封闭性”抗体。根据本发明，“中和性”或“封闭性”抗体被定义为这样的一种抗体，其在天然蛋白质上的结合封闭了这种天然蛋白质的生物活性，其是本发明所寻求的一个重要目标，其中抗体所针对的天然蛋白对所要治疗的个体的靶定病理学背景中具有有害生物活性，例如其中该天然蛋白具有血管生成活性、免疫抑制活性以及变应原活性，更具体地具有诱导产生白介素4的活性。
本发明的免疫原性产物中包括的“载体蛋白分子”指无论氨基酸序列如何，长为至少15个氨基酸的蛋白质或者肽，并且当其部分共价连接目标抗原分子以形成组成本发明的免疫原性产物的蛋白质杂络物时，允许大量目标抗原分子被呈递到B淋巴细胞。
根据第一方面，载体蛋白分子包括至少15个氨基酸长的一种蛋白质或一种肽，或者这种肽的寡聚体，该载体蛋白含有一个或多个辅助性T表位(“辅助者”)，能够活化宿主生物的辅助性T淋巴细胞(“T辅助细胞”)以产生细胞因子，包括白介素2，这些细胞因子接下来活化并诱导B淋巴细胞增殖，B淋巴细胞成熟后将产生针对抗原性蛋白(i)的抗体。
根据第二方面，载体蛋白分子包括至少15个氨基酸长的一种蛋白质或一种肽，或者这种肽的寡聚体，该载体蛋白除了含有如上述第一方面中描述的一个或多个辅助性T表位(“辅助者”)之外，还含有一个或多个细胞毒性T表位，它们能够通过产生对载体蛋白分子特异的细胞毒性T淋巴细胞而诱导细胞免疫应答，这些淋巴细胞能够特异识别这样的细胞，其表面上表达有所述载体蛋白或者从这些载体蛋白衍生的肽与I类主要组织相容性复合体(MHC)分子的结合。如果需要，载体蛋白分子由蛋白质或肽的寡聚体组成，它们除了含有一个或多个T辅助表位，还含有一个或多个上面定义的细胞毒性T表位。
根据第三方面，载体蛋白分子包括长为至少15个氨基酸的蛋白质或肽，以及这种肽的寡聚体，该载体分子除了含有如第一方面中定义的一个或多个辅助性T表位(“辅助者”)之外，还含有一个或多个B表位，该B表位能够诱导针对载体蛋白产生的淋巴细胞产生抗体。
在一些实施方案中，载体蛋白除了用于活化针对目标抗原的抗体应答的T辅助表位外，还能够针对具有载体肽细胞产生细胞毒性应答和/或刺激针对这种载体蛋白分子的抗体应答。
载体蛋白分子还可以包括从天然蛋白衍生的同型-寡聚体或者同型-多聚体，以及从该天然蛋白衍生的肽片段的同型-寡聚体或者同型-多聚体。目标抗原性蛋白也可以包括异型-寡聚体或异型-聚合物，其含有最初包括在该天然蛋白中并且从该天然蛋白衍生的几种不同肽片段的组合。
如此处所用的，表述“抗原性蛋白”指长为至少10个氨基酸的蛋白质或肽，包括半抗原肽，该抗原性蛋白能够被宿主生物的B淋巴细胞表达的抗原受体特异识别，该宿主生物可以是人或动物，更具体地是哺乳动物，这种抗原性蛋白一旦被包括在本发明的免疫原性产物中，就刺激产生能够识别所述抗原性蛋白的抗体。
“抗原性蛋白”指含有天然抗原性蛋白的一个或多个B表位的蛋白，针对该天然抗原性蛋白产生的抗体是所寻求的目的。所述目标抗原性分子可包括天然蛋白自身或者该天然蛋白的蛋白质衍生物，如该天然蛋白的肽片段，以及通过化学、物理处理或基因突变得到的该天然蛋白的任一种生物学上失活的形式。目标抗原性分子也可以包括该天然蛋白的同型-寡聚体或者同型-聚合物以及该天然蛋白质的肽片段的同型-寡聚体或者同型-聚合物。目标抗原性蛋白也可以包括异型-寡聚体或异型-聚合物，其包括最初包括在该天然蛋白中的几种不同的肽片段的组合。
在根据本发明的免疫原性产物中，有利地，30％以下，优选20％以下的抗原性蛋白(i)被共价连接到载体蛋白分子(ii)。
在根据本发明的免疫原性产物中，有利地，至少1％，优选至少2％的抗原性蛋白(i)被共价连接到载体蛋白分子(ii)。
已经表明根据本发明的免疫原性产物，如上文中定义的免疫原性产物，在水性溶液中是稳定的。本发明免疫原性产物的稳定性更具体的特征在于所述免疫原性产物具有自己的等电点，该等电点与其蛋白质组分—分别为抗原性蛋白(i)和载体蛋白分子(ii)—的至少一种的等电点不同，并且其特征还在于所述免疫原性产物在等电聚焦中迁移的蛋白质条带与组成该免疫原性产物的两种蛋白质组分的相应蛋白质条带的至少一种不同。
通过免疫印迹试验(蛋白质印迹)已经表明，在非变性条件下，本发明的免疫原性产物在电泳凝胶中迁移得到一条蛋白质条带，其表明所述免疫原性产物具有可溶蛋白质结构的均一群体的形式。
此外，已经表明以蛋白质杂络物形式包括在本发明的免疫原性产物中的抗原性蛋白(i)以及蛋白质分子(ii)都被特异识别这些蛋白质中每一种蛋白质的抗体识别。从而，根据本发明的免疫原性产物含有天然结构的抗原性蛋白(i)和载体蛋白分子(ii)。根据本发明的免疫原性产物的这种技术特征对于诱导针对天然抗原的免疫应答，即宿主生物的有效并且真正保护性的免疫应答尤其有效。已经更具体地表明根据本发明的免疫原性产物在其所施用的宿主生物中诱导了针对天然抗原的强烈有效体液应答，伴随着产生针对这种天然抗原有害生物活性的中和或封闭性抗体。
根据本发明，使用各种目的抗原已经表明用上文中定义的免疫原性产物得到的体液免疫应答比通过施用目标抗原和载体蛋白分子的常规共价缀合物得到的体液免疫应答高10到1000倍。
优选地，在本发明的免疫原性产物所包括的免疫原性杂络物中，这许多抗原性蛋白(i)由一种抗原性蛋白的许多样本组成。
这样，根据最优选的实施方案，产生本发明的免疫原性产物以得到针对一种目标抗原的特异抗体。
根据本发明还表明含有如上文中定义的免疫原性杂络物的免疫原性产物非常适于免疫个体，通过产生针对目标“自身抗原”即个体天然存在蛋白质的抗体，其中对该目标自身抗原存在免疫系统的耐受性，特别是特异识别所述抗原的辅助淋巴细胞T克隆(T辅助细胞)的至少部分缺失。
换句话说，将“自身”抗原以含有本发明免疫原性杂络物的免疫原性产物形式呈递给所述个体免疫系统的细胞，该呈递允许打破个体对这一抗原的免疫系统耐受性。不希望被任何理论所束缚，本申请人相信得到针对自身抗原的高水平抗体反应的可能性是因为杂络物中存在的载体蛋白分子携带许多“辅助性T”型表位(或T辅助表位)，其活化辅助性T淋巴细胞，并且所活化的辅助性T淋巴细胞产生的各种细胞因子，包括IL-2，促进生物中B细胞对潜伏状态中的自身抗原产生某种程度的活化，从而打破B细胞对自身抗原的免疫耐受性。
这样，根据优选的实施方案，本发明的免疫原性产物的特征在于抗原性蛋白(i)含有通常被所述受试者免疫系统中的细胞识别为自身蛋白的多种蛋白质样本。
作为主要比例，目标抗原和载体蛋白分子之间60％以上的结合通过非共价相互作用发生，对与一个载体蛋白分子结合的目标抗原分子的数目没有别的理论上的限制，除了受到目标抗原分子对该载体分子的空间有效性的限制。具体地，与一个载体蛋白分子结合的目标抗原的分子数不受该载体分子所携带的允许与许多目标抗原分子产生共价连接的化学反应官能数的限制。因此，唯一的物理限制似乎是抗原性蛋白(i)可以利用的载体蛋白分子(ii)的位点数目。
由于相同的原因，与载体蛋白分子结合的目标抗原的大小不被严格限制，因此，目标抗原可以包括至少10kDa的完整蛋白，如多种细胞因子，如IL-4、IL-10、VEGF以及α干扰素。
此外，即使对于含有分子量高于10kDa的完整蛋白的目标抗原，本发明的免疫原性杂络物也可以含有一个载体分子上结合若干目标抗原，如果该载体分子的大小使得其可能的话。
当载体蛋白分子具有小的尺寸，例如，低于10kDa，或者甚至低于5kDa的大小时，不希望被理论所束缚，本申请人相信，目标抗原和所述载体之间的部分共价结合形成本发明的免疫原性产物所包括的蛋白质杂络物，该部分共价结合允许杂络物的构象为使得目标抗原和载体蛋白分子都可以被免疫系统细胞的受体利用。
这为含有如上文中定义的免疫杂络物的免疫原性产物所提供了附加的技术优点，因为杂络物中包含的一个载体分子上多个样本向B淋巴细胞呈递通过识别该抗原的B细胞受体的交联增强了帽化现象，有助于B细胞的活化，以及通过载体蛋白分子携带的辅助性T表位活化辅助性T淋巴细胞，所活化的辅助性T淋巴细胞产生的细胞因子产生活化信号。
从而，根据免疫原性产物的最优选实施方案，免疫原性产物的一个载体蛋白分子(ii)含有5到50个抗原性蛋白(i)，优选一个载体蛋白分子(ii)含有20到40个抗原性蛋白(i)。
单个载体蛋白分子上目标抗原分子的数目分别取决于载体分子的大小和目标抗原分子的大小。载体分子越大并提供与目标抗原大的结合表面，免疫原性杂络物的一个载体分子将含有更多的目标抗原分子样本。类似地，目标抗原的分子大小越小，同一载体分子上目标抗原分子的样本数越多。
为了阐明，根据本发明已经表明当载体蛋白分子是KLH时，每个载体分子结合20到40个分子的IL-4、IL-10、α干扰素或VEGF。
已经表明水性溶液中免疫原性产物的溶解性随着主宰杂络物中分子间相互作用的平衡的变化而变，更具体地，电化学平衡依赖于通常称为的“弱”(非共价)键以及抗原性蛋白和载体蛋白分子中的各自浓度，以及离子强度、pH和温度的条件。
优选地，通过双功能结合化学剂产生一种或多种抗原性蛋白(i)和载体蛋白分子(ii)之间的共价键。
这种化学剂可以是溴化氰、戊二醛、碳二亚胺或琥珀酐。
对于碳二亚胺，可以使用下面的化合物：
1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺(CMC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺、1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)-碳二亚胺、(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)和1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。
作为同型-双功能偶联剂，可以使用下面的化合物：
-N-羟基琥珀酰亚胺、二硫代二(琥珀酰亚胺基丙酸)酯、辛二酸二琥珀酰亚胺酯和酒石酸二琥珀酰亚胺酯；双功能亚氨酸酯：己二酰亚胺(adipimidate)二甲酯、庚二酰亚胺(pimelimidate)二甲酯、和辛二酰亚胺(suberimidate)二甲酯；
-巯基试剂，1，4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺基]丁烷、二马来酰亚胺己烷和二-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷；
芳基型双功能卤化物和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基砜；
SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)；
SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯)；
SMPB(琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯)；
GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁氧基)琥珀酰亚胺酯)；
-MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺苯基)酰肼丁酸)；
-M2C2H(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-酰肼)；
-SMPT(琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)；
和
-SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)。
优选地，所用的结合化学剂含有至少两个反应性醛官能。
最优选地，结合化学剂为戊二醛。
用结合化学剂将载体蛋白分子与抗原性蛋白偶联形成含有蛋白质杂络物的产物后，可通过能够产生链内键的蛋白质稳定剂，如甲醛，稳定所得产物。
含有本发明的免疫原性杂络物的免疫原性产物具有可溶于溶液，尤其水性溶液中的微粒形式，它们的平均大小随(i)载体蛋白质分子的大小，(ii)连接到一个载体蛋白分子的抗原性蛋白的大小和数目和(iii)杂络物微粒中连接抗原性蛋白的载体分子的数目而变。
已经发现实施例中描述的杂络物微粒的平均大小为100nm到300nm。
最优选地，含有本发明的免疫原性蛋白质杂络物的免疫原性产物排他性地包含与抗原性蛋白连接的载体分子，排除任何其他物质。更具体地，本发明的杂络物除了表征该杂络物的载体和抗原性蛋白之外，不含有任何其他聚合的、蛋白质的或者非蛋白质材料。
最近，ZAGURY D等人(2001，Proc.Nail.Acad.Sci.USA.98(14)：8024-8029)在书目研究中提出在患者中诱导抗-细胞因子免疫性以抵消这些病理中某些细胞因子的异常产生，这些细胞因子包括白介素、淋巴因子、单核因子、干扰素，它们在组织中起生理作用，局部地作为程序性细胞增殖、分化或死亡的因子。
上述作者陈述直到现在，疫苗治疗策略仅集中在抗原性侵入者，不管该侵入者是微生物、细胞或者变应原，但是从未试图对侵入者所诱导的细胞因子去调节。所述作者建议将抗-细胞因子接种作为常规接种之前的步骤，目的是中和或者封闭基质的免疫毒性效果，以及允许正常发生适应抗原性侵入者的免疫反应。
而且，在公布的国际专利申请WO 00/03732中提及的本申请人以前的工作表明分别对于ATL白血病、宫颈癌和卡波西肉瘤，三种蛋白与肿瘤或者HIV1感染的细胞水平上的局部免疫抑制有关：HTLV1病毒Tax蛋白、乳头瘤病毒E7蛋白和VIH-1病毒Tat蛋白。
申请人还陈述这些免疫抑制蛋白中的一些，如HIV1 Tat蛋白和HPVE7蛋白(株系16和18)也对血管内皮细胞具有活化作用。
他们因此建议开发含有脱毒的免疫原性化合物的抗癌或抗病毒疫苗，该免疫原性化合物是来自癌细胞、病毒感染的细胞或者基质免疫细胞的蛋白质的衍生物，该蛋白质衍生物最初具有免疫抑制和/或血管生成的局部作用，该蛋白质衍生物为处于失活形式的从HIV1细菌Tat蛋白、HTLV1病毒Tax蛋白、乳头瘤E7蛋白以及依赖甘露聚糖的凝集素衍生的蛋白质。
现在，根据本发明已经表明含有如上文中定义的免疫原性杂络物的免疫原性产物允许诱导针对多种上述有害抗原性分子的强烈抗体应答。
根据第一方面，在本发明的免疫原性杂络物中，一种或几种抗原性蛋白(i)包括由所述受试者天然产生的细胞因子。
优选地，抗原性蛋白选自白介素-4、α干扰素、γ干扰素、VEGF、白介素-10、TNFα、TGFβ、白介素-5和白介素-6。
根据第二方面，组成本发明的免疫原性杂络物的抗原性蛋白(i)为免疫抑制性或血管生成蛋白，或者为衍生自免疫抑制性或血管生成蛋白的蛋白。
优选地，抗原性蛋白(i)选自乳头瘤病毒E7蛋白、VIH 1病毒Tat蛋白、HTLV1或HTLV2病毒Tax蛋白和自身p53蛋白。
根据第三方面，组成本发明的免疫原性杂络物的抗原性蛋白(i)为在低剂量对人或非人哺乳动物有毒性的蛋白质。更具体地，它们是在低于1mg，低于100μg，低于10μg，甚至低于1μg的剂量下对人致命的各种蛋白质。它们主要是毒性蛋白质，能够用于生产通常称作的生物武器，如蓖麻毒蛋白、肉毒杆菌毒素(botulic toxin)、葡萄球菌肠毒素以及炭疽毒蛋白(EF、LF、PA)。
本发明的免疫原性蛋白杂络物所包括的载体蛋白分子(ii)可以是方便地用于免疫学的载体分子，如KLH、卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、破伤风类毒素(toxoid tetanos)、B霍乱毒素，等。
此外，在本发明的免疫原性产物中，可以选择蛋白质载体分子以便除了产生T辅助淋巴细胞外，还通过活化细胞毒性T淋巴细胞和活性这种载体分子特异的B淋巴细胞，诱导或刺激针对宿主生物中该蛋白质载体分子自身和天然蛋白质的对应物的细胞毒性和/或体液免疫应答。
当同时寻求针对免疫抑制性或血管生成毒性蛋白的有效抗体应答时，本发明的免疫原性产物的这种具体实施方案尤其有用，更具体地，用于产生中和或封闭性抗体，和通过细胞毒性T淋巴细胞针对某些细胞产生的细胞免疫应答，其中所述某些细胞在它们的表面具有与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子结合的天然抗原，例如病原如VIH1病毒和乳头瘤病毒的抗原或者在癌细胞中特异表达的抗原如CEA、p53、Di12等。
从而，根据该具体实施方案，本发明的免疫原性产物的特征在于该载体蛋白分子(ii)是免疫原性蛋白，其除了诱导产生T辅助淋巴细胞外，还诱导产生针对某些细胞的细胞毒性T淋巴细胞，其中所述某些细胞在它们的表面具有所述载体蛋白分子或者从该载体蛋白分子衍生的肽与主要组织相容性复合体(HMC)I类分子结合，和/或诱导B淋巴细胞产生针对载体蛋白的抗体。
从而，含有本发明的免疫原性杂络物的免疫原性产物是个体(人类哺乳动物或非人哺乳动物)针对多种病原的主动治疗性接种的有效免疫方法。
下文中提及根据本发明的免疫原性产物中所含的这些免疫原性杂络物组合物的说明性实例，这些组合物通过主动治疗性接种用于预防或治疗多种病理疾病。
a)用于预防或治疗AIDS：
-载体蛋白分子(ii)：HIV1病毒的gp 120、gp 160、p24、p17、nef或Tat蛋白，如果需要进行脱毒或者稳定化，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白(Zagury等人，1998)。
也可以使用如Fouts等人(2000)和Fouts等人(2002)描述的模拟表位(mimotope)gp120蛋白。
-抗原性蛋白(i)：Tat、IFNα、IL10和TGFβ蛋白，如果需要进行脱毒，以及这些蛋白的免疫原性片段，或者由其衍生的免疫原性蛋白。
b)用于预防或治疗宫颈癌：
载体蛋白分子(ii)：乳头瘤病毒L1、L2和E7蛋白，优选来自株系16或18的乳头瘤病毒，如果需要进行脱毒或者稳定化，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白(Le Buanec等人，1999)。
抗原性蛋白(i)：E7、IFNα、IL10、TGFβ、TNFα和VEGF蛋白，如果需要进行脱毒或者稳定化，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白。
c)用于预防或治疗HTLV1或2病毒诱导的ATL白血病：
-载体蛋白分子(ii)：gp61和HTLV1或2病毒Tax蛋白、如果需要，进行脱毒，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白。(Cowan等人，1997；Mori等人，1996)。
-抗原性蛋白(i)：Tax、IL10、IFNα或TGFβ、TNFα、VEGF蛋白，如果需要进行脱毒，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白。
d)用于预防或治疗结肠癌：
载体蛋白分子(ii)：CEA和p53蛋白，如果需要，进行脱毒，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白(Zusman等人，(1996))。
抗原性蛋白(i)：IFNα、TGFβ、IL10、FasL和VEGF蛋白，如果需要，进行脱毒，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白。
e)用于预防或治疗乳腺癌：
载体蛋白分子(ii)：Di12蛋白，以及这种蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白(Yoshiji等人，1996)。
抗原性蛋白(i)：IFNα、TGFβ、IL10、FasL和VEGF蛋白，如果需要，进行脱毒，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白。
f)用于预防或治疗胰腺癌：
载体蛋白分子(ii)：CaSm蛋白，如果需要，进行脱毒，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白。
抗原性蛋白(i)：VEGF和TNFα蛋白，如果需要，进行脱毒或者稳定化，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白。
g)用于预防或治疗前列腺癌：
-载体蛋白分子(i)：OSA和ETS2蛋白，如果需要，进行脱毒或者稳定化，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白。(Sementchenko VI等人，1998)。
-抗原性蛋白(i)：IL6和TGFβ蛋白，如果需要，进行脱毒或者稳定化，以及这些蛋白的免疫原性片段以及由其衍生的免疫原性蛋白(Adler等人，1999)。
h)用于预防或治疗某些变态反应：
载体蛋白分子(ii)：其选自异源分子，如Bet v1(桦树花粉)、Der p1(螨)和Fel d1(猫)蛋白、它们的免疫原性肽片段以及由其衍生的免疫原性蛋白。Ferreira等人(1993)更具体地描述了Bet v1抗原，Tovey等人(1981)详细地描述了Der p1抗原，Morgensterm等人(1991)详细描述了Fel d1抗原。
抗原性蛋白(i)：其诱导产生针对IL4细胞因子的中和或封闭抗体，IL4细胞因子主要由Th2型T淋巴细胞产生，引起的体液免疫应答产生IgE同种型抗体。根据另一实施方案，抗原性蛋白(i)诱导产生针对IL5细胞因子的中和性或封闭性抗体，IL5细胞因子主要由Th2型T淋巴细胞产生。
根据再一个实施方案，通过诱导针对主要嗜碱性粒细胞粒化效应子即IgE同种型抗体的抗体应答的免疫原性产物可以防止变态反应。为此，本发明提供了免疫原性产物，其含有(i)IgE同种型人抗体和(ii)VIH1失活的Tat蛋白。
i)预防生物武器中的致命蛋白
而且，根据本发明的免疫原性产物可用于免疫个体以针对具体地在化学和生物武器中所用的多种毒性产物，例如蓖麻毒蛋白。
主要通过产生抗体，达到针对多数毒性蛋白的免疫，其中所述毒性蛋白包括肉毒杆菌毒素、蓖麻毒蛋白、葡萄球菌肠毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素和炭疽毒蛋白。
一般说来，为了产生根据本发明的免疫原性产物，其中抗原性蛋白(i)是上述类型的剧毒蛋白，将实现脱毒的蛋白以类毒素的形式使用。为了在该蛋白用于产生根据本发明的免疫原性产物之前将该蛋白脱毒，可以使用多种方法，优选下面的方法之一：
a)通过戊二醛处理天然毒性蛋白；
b)通过甲醛和戊二醛联合作用处理天然毒性蛋白；或者
c)如果需要，通过适宜的试剂对His和Tyr基团实施化学修饰，例如，对这些氨基酸残基实施羧甲基化。
为了防止来自炭疽杆菌(Bacilus anthracis)的毒素致死作用，优选使用来自EF(水肿因子)、LF(致命因子)和PA(保护性抗原)蛋白的炭疽蛋白的脱毒蛋白作为抗原性蛋白(i)。
为了防止来自产气荚膜梭菌的蛋白质的致命作用，优选使用来自产气荚膜梭菌的ε毒素的脱毒蛋白作为抗原性蛋白(i)。
为了防止来自肉毒梭菌(Clostridium botulinum)的毒素的致命作用，优选使用选自150kDa多肽单链形式的天然合成A、B、C、D、E、F和G毒素以及这些肉毒杆菌毒素的Hc片段的脱毒蛋白作为抗原性蛋白(i)，所述片段Hc的分子量约为50kDa。
为了产生失活的肉毒杆菌毒素，技术人员可以使用公知的技术，更具体地，用于制备前面的疫苗组合物的技术，如Fiock等人或者Siegel等人(Fiock，M.A.，Cardella，M.A.，Gearinger，N.F.，J.Immunol.，1963，90，697-702；Siegel，L.S.，J.Clin.Microbiol.，1988，26，2351-2356)描述的技术。
为了防止来自蓖麻毒蛋白种子(蓖麻籽)的毒素的致命作用，优选使用蓖麻毒蛋白毒素的脱毒蛋白，优选蓖麻毒蛋白的β片段作为抗原性蛋白(i)。
从而，本发明还提供了含有(i)蓖麻毒蛋白的β片段和(ii)KLH蛋白的免疫原性产物。
为了纯化蓖麻毒蛋白，技术人员可以使用任何一种公知的技术，如Osborne等人、Kabat等人或Kunnitz等人(Osborne，T.B.，Mendel，LB.和Harris，J.F.：Amer.J.Physiol.，1905，14，259-269；Kabat，E.A.Heidelberger，M.和Bezer，A.E.：J.Biol.Chem.，1947，168，629-；Kunnitz，M.和McDonald，M.：J.Gen.Physiol.，1948，22，25-Moulé，Y.：Bull.Soc.Chim.Biol.，1951，33，1461-1467)所描述的技术。他还可以利用Tomila等人、Nicolson等人或Olsnes等人(Tomila，M.，Kurokawa，T.，Onozaki，K.等人：Experientia，1972，28，84-85；Nicolson，G.L.和Blaustein，J.：J.Biochim.Biophys.Acta，1972，266，543-547；Olsnes，S.，Salvedt，E.和Pihl，A.：J.Biol.Chem.，1974，249，803-810)描述的亲和层析纯化技术。可以如Hedge等人(Hedge，R.和Podder，S.K.，：Eur.Biochem.，1998，254，596-601)描述的那样纯化蓖麻毒蛋白A和B链。
为了防止来自葡萄球菌，更具体地来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的毒素的致命作用，优选使用选自SEA(葡萄球菌肠毒素A)、SEB(葡萄球菌肠毒素B)、SEC(葡萄球菌肠毒素C)、SED(葡萄球菌肠毒素D)、SEE(葡萄球菌肠毒素E)、SEG(葡萄球菌肠毒素G)、SEH(葡萄球菌肠毒素H)、SEI(葡萄球菌肠毒素I)和TSST-1(毒性休克综合症毒素-1)的毒素的脱毒蛋白作为抗原性蛋白(i)。
本领域技术人员使用下面列出的工作中描述的技术制备上面列出的肠毒素，这些工作涉及这些毒素的每一种的描述。
SEA以具有257个氨基酸的前体肠毒素的形式被合成(Huang，I.Y.，Hughes，J.L，Bergdoll，M.S.和Schantz，E.J.J Biol.Chem.1987，262，7006-7013)。前体毒素通过损失24个氨基酸残基的N-末端疏水前导序列得到分子量为27,100Da的成熟毒素(Betley，M.J.和Mekalanos，J.J.JBacteriol.，1998，170.34-41)。SEA通过它们的IP以三种不同同种型存在。
SEB前体蛋白含有267个氨基酸(Mr＝31,400Da)，具有27个氨基酸的N-末端信号肽。SEB前体蛋白与T细胞受体(T-细胞受体或TCR)的结合位点包括浅腔，而II类MHC分子固定在邻近位点上(Kappler，J.W.，Herman，A.，Clements，J.和Marrack，P.：J.Exp.Med.，1992，175，387-396；Papageorgiu，A.C.，Trauter，H.S.和Acharya，K.R.J Mol.Biol.，1998，277，61-79；Soos，J.M.和Johnson，H.M.Biochem.Biophys.Res.Commun.，1994，201，596-602)。
SEC具有3种抗原性不同的亚型：SEC1、SEC2和SEC3。前体蛋白含有267个氨基酸残基(Houde，C.J.，Hackett，S.P.和Bohach，G.A.Mol.Gen.Genet.，1990，220，329-333)，具有27个氨基酸残基的信号肽(Bohach，G.A.和Schlievert，P.M.：Infect.Immun.，1989，57，2243-2252)。
SED由258个氨基酸残基组成，具有30个氨基酸残基的信号肽。SED的三维结构与类似于其他细菌超级抗原的结构。
SEE的分子量为26,000Da，与SEA的氨基酸序列同源性为81％。
SEG由233个氨基酸残基组成(Munson，S.H.，Tremaine，M.T.，Betley，M.J.和Welch，R.A.：Infect.Immun.，1998，66，3337-3348)。
SEH的分子量为27,300Da(Su，Y.C.和Wong，A.C.：Apll.Environ.Microbiol.，1995，61，1438-1443)。其与其他肠毒素没有交叉免疫反应。
SEI的序列含有218个氨基酸残基。该毒素与其他肠毒素的同源性水平最低。
SEJ由269个氨基酸残基组成，与SEA、SEE和SED具有高的氨基酸序列同源性(64-66％)。
优选地，根据本发明的免疫原性产物含有几种抗原性蛋白(i)的组合，每种抗原性蛋白(i)来自上述毒性蛋白，例如，2、3、4或5种抗原性蛋白(i)，每种抗原性蛋白(i)来自上面列出的毒性蛋白。
例如，用于制备旨在防止葡萄球菌肠毒素毒性的疫苗组合物的根据本发明的免疫原性产物优选含有2、3、4或5种抗原性蛋白(i)，每种抗原性蛋白(i)来自葡萄球菌肠毒素。
根据本发明的免疫原性产物的具体实施方案，其中抗原性蛋白(i)来自对人具有高度毒性的蛋白，载体蛋白是KLH蛋白。
从而，根据本发明的免疫原性产物的第一个具体方面，其中载体蛋白分子诱导产生载体蛋白分子特异的辅助性T淋巴细胞(T辅助细胞)、细胞毒性T淋巴细胞和B淋巴细胞，所述载体蛋白分子(ii)选自乳头瘤病毒L1、L2和E7蛋白。
从而，根据本发明的免疫原性产物的第二个具体方面，其中载体蛋白分子除了诱导产生辅助性T淋巴细胞(T辅助细胞)，还诱导载体蛋白分子特异的细胞毒性T淋巴细胞和B淋巴细胞的分化，所述载体蛋白分子(ii)选自HIV1病毒gp160、p24、p17、Nef和Tat蛋白。
从而，根据本发明的免疫原性杂络物的第三个具体方面，其中载体蛋白分子诱导产生载体蛋白分子特异的辅助性T淋巴细胞(T辅助细胞)、细胞毒性T淋巴细胞和B淋巴细胞，所述载体蛋白分子(ii)选自CEA、p53、Di12、CaSm、OSA和ETS2蛋白。
根据本发明的免疫原性产物的第四个具体方面，其中载体蛋白分子除了诱导辅助性T淋巴细胞(T辅助细胞)的分化外，还诱导产生针对该载体分子的抗体，所述载体蛋白分子(ii)选自Bet v1、Der p1和Fel d1蛋白。
在根据本发明的免疫原性产物中，免疫原性蛋白杂络物选自下面的杂络物，其中一方面，抗原性蛋白(i)和另一方面蛋白质载体分子(ii)分别为：
a)i)IL-4和(ii)KLH；
b)(i)α干扰素和(ii)KLH；
c)(i)VEGF和(ii)KLH；
d)(i)IL-10和(ii)KLH；
e)(i)α干扰素和(ii)VIH1的gp 160；
f)(i)IL-4和(ii)Bet v1变应原性抗原；和
g)(i)VEGF和(ii)乳头瘤病毒E7蛋白；
h)(i)失活的VIH1 Tat蛋白和(ii)VIH1 gp 120蛋白；
i)(i)IgE同种型人抗体和(ii)失活的VIH1 Tat；
j)(i)蓖麻毒蛋白β片段和(ii)KLH。
制备含有本发明的免疫原性蛋白杂络物的免疫原性产物的方法
本发明的另一个目的也是制备含有上文中定义的免疫原性杂络物的免疫原性产物的方法，其特征是该方法包括下面的步骤：
a)结合化学试剂存在下，将抗原性蛋白(i)和载体分子(ii)以摩尔比(i)∶(ii)为10∶1到50∶1的比例孵育；和
b)集含有步骤a)中制备的免疫原性杂络物的免疫原性产物。
优选地，结合化学试剂为戊二醛。
最优选地，该方法的进一步特征在于步骤a)后接着是通过甲醛稳定含有免疫原性杂络物的产物的步骤，该步骤在回收杂络物的步骤b)之前。
优选地，当将戊二醛用作结合化学试剂时，戊二醛在偶联反应介质中的终浓度为0.002M到0.03M，有利地0.02M到0.03M，优选终浓度为0.026M。
与戊二醛的偶联反应有利地在20到25℃的温度下进行20到60分钟，优选30分钟。
偶联步骤后，通过例如用截留阈值为3kDa的透析膜透析除去过量戊二醛。透析步骤有利地在4℃，pH7.6的缓冲液中进行。
为了稳定含有如步骤a)中制备的蛋白质杂络物的产物，可通过甲醛，例如终浓度为3mM的甲醛处理溶液中的所述产物。稳定反应有利地进行12到48小时，优选20到30小时，最优选24小时。有利地通过加入优选0.1M浓度的甘氨酸，在20℃到25℃进行1小时以中止使用甲醛进行的稳定化反应。
含有包含本发明的免疫原性蛋白质杂络物的免疫原性产物的组合物
本发明的另一个目的也是提供含有如上文中定义的免疫原性产物的组合物。
本发明还涉及含有如上文中定义的蛋白质免疫原性产物的药物组合物。
本发明的另一个目的是免疫原性组合物，其特征是其含有作为活性成分的如上文中定义的免疫原性产物，并含有一种或多种生理学上相容的赋形剂。
还涉及疫苗组合物，其特征是其含有作为活性成分的如上文中定义的免疫原性产物，并含有一种或多种生理学上相容的赋形剂。
取决于目标对象，使用全身性佐剂或者粘膜佐剂。例如，优选使用粘膜佐剂用于预防上皮组织癌，优选使用全身性佐剂用于预防或治疗病毒感染如HIV1和HTLV1感染以及用于预防或治疗变态反应。
在全身性佐剂中，优选使用IFA型佐剂(不完全弗氏佐剂)，以及磷酸钙或氢氧化铝。
在粘膜佐剂中，优选使用霍乱弧菌毒素B亚单位(CTB)或者LT毒素突变体(LTμ)。
根据一具体方面，根据本发明的免疫原性组合物还含有一种或多种免疫刺激剂，并含有免疫佐剂，如本领域中熟知的CpG免疫刺激剂。
实际上根据本发明已经表明了CpG佐剂的用途，更具体地，其中核苷酸之间的链内键含有硫代磷酸酯键的CpG佐剂的用途，用于全身性施用后刺激同时产生IgG和IgA同种型抗体。
还涉及粘膜或全身疫苗，其特征是其含有作为活性成分的如上文中定义的免疫原性产物，并含有一种或多种赋形剂，包括生理学上相容的佐剂。
根据本发明的免疫原性组合物或者疫苗可用于例如治疗癌，即治疗性和预防性治疗癌，尤其是治疗病毒诱导的癌，例如，HTLV1导致的ATL(急性T细胞白血病)，或者乳头瘤病毒导致的宫颈癌，以及疱疹家族病毒—分别为EB病毒(Epstein-Barr)(EBV)和HHV8-导致的伯基特氏淋巴瘤以及卡波西肉瘤，以及用于治疗AIDS或者用于预防或治疗变态反应。
可以如下使用根据本发明的免疫原性产物。
对需要这种治疗的受试者以适于全身性或粘膜施用的形式，例如鼻内施用含有本发明免疫原性杂络物的免疫原性产物，所施用的量是足够治疗有效的。施用的剂量可以为例如鼻内施用10到1000μg，每周一次持续2个月，然后考虑到针对目标抗原的抗体应答的暂时性特征，根据血清抗体滴度，周期性地例如每2到6个月施用一次。
如果一种免疫原性产物的一种分子不具有所要中和的过量产生的毒素或细胞因子的所有活性位点，那么可以施用在单一制剂中的两种或多种不同的免疫原性产物以对所有有害的功能位点诱导中和性抗体。
对于药物，本发明的免疫原性产物可被掺入到药物组合物中，该药物组合物适于通过全身性途径施用或者通过粘膜途径施用(包括口粘膜途径)，更具体地，为鼻内途径、经口途径和阴道途径。可以以单一剂量或者一定时间间隔后重复一次或几次的剂量实施施用。
因此本申请的另一目的是治疗性或者预防性的药物组合物，其特征是该组合物含有作为活性成分的一种或多种如上文中定义的免疫原性产物。免疫原性产物可以单独包装或者与赋形剂或者几种药学上可接受的赋形剂如佐剂的混合物混合。适于鼻内或经口途径的赋形剂具体选自癸酰基己酰基聚乙二醇甘油酯，如GATTEFOSSE公司的Labrasol，或者氢氧化铝(Alhydragel，Superfos，丹麦)。
对于根据本发明的经口途径，活性成分将结合粘膜免疫佐剂，如CT、LT或CTB突变体。
药物制剂(Galenic)形式尤其适宜，如Boyaka等人《粘膜疫苗开发策略》Am.J.Trop.Med.Hyg.60(4)，1999，35-45页中所描述的。还提及胃抗性的更具体地生物粘附性微粒剂，如Rojas等人，PharmaceuticalResearch，16卷，2期，1999，255页中所描述的。
在具体实施条件下，将选择上述疫苗药物组合物，其特征是其含有粘膜免疫佐剂，如CT突变体(霍乱毒素)或者LT突变体(大肠杆菌不稳定肠毒素)。
在其他具体实施条件下，将选择一种疫苗药物组合物，其特征是其含有吸附活性成分的佐剂，如氢氧化铝或金颗粒。
本发明的另一个目的是制备如上文中描述的组合物的方法，其特征是用公知的方法将一种或几种活性免疫原性产物与可接受的赋形剂，包括药学上可接受的赋形剂混合，并且如果需要，与全身性或粘膜免疫佐剂混合。
在上述方法的优选实施条件下，制备对消化途径具有生物粘附性和胃抗性微粒剂，其含有免疫原性活性成分，并且如果需要，还含有佐剂。
通过下面的实施例进一步阐明本发明。
实施例
杂络物制剂实施例
实施例1：制备鼠KLH-VEGF杂络物
将0.58mg KLH蛋白溶于0.5ml 10mM磷酸缓冲液(pH8.5)。向该溶液中加入溶于1ml相同缓冲液中的1mg鼠VEGF。
将所得蛋白质混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理30分钟。
然后通过三次连续透析(每次2小时)除去过量戊二醛，每次透析都在截留阈值为3kDa的透析管，于4℃用200ml磷酸缓冲液(pH7.6，10mM)进行。
然后用终浓度为33mM的甲醛处理混合物24小时。通过室温下加入终浓度0.1M甘氨酸1小时以阻止反应。在与前面实施的透析相同的条件下最后透析混合物。
实施例2：人KLH-VEGF杂络物
这种杂络物是疫苗的活性成分，该疫苗能够主要诱导产生中和人VEGF的抗体。
将0.58mg KLH蛋白溶于0.5ml 10mM磷酸缓冲液(pH8.5)。向该溶液中加入溶于1ml相同缓冲液中的1mg人VEGF。
将所得蛋白质混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理30分钟。
然后通过三次连续透析(每次2小时)除去过量戊二醛，每次透析都在截留阈值为3kDa的透析管中，于4℃用200ml磷酸缓冲液(pH7.6，10mM)进行。
然后用终浓度为33mM的甲醛处理混合物24小时。通过室温下加入终浓度0.1M甘氨酸1小时以阻止反应。在与前面实施的透析相同的条件下最后透析混合物。
实施例3：鼠KLH-IL4杂络物的制备
将0.841mg KLH蛋白溶于0.8ml 10mM磷酸缓冲液(pH8.5)。向该溶液中加入溶于1ml相同缓冲液中的1mg鼠IL4。
将所得蛋白质混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理30分钟。
然后通过三次连续透析(每次2小时)除去过量戊二醛，每次透析都在截留阈值为3kDa的透析管中，于4℃用200ml磷酸缓冲液(pH7.6，10mM)进行。
然后用终浓度为33mM的甲醛处理混合物24小时。通过室温下加入终浓度0.1M甘氨酸1小时以阻止反应。在与前面实施的透析相同的条件下最后透析混合物。
实施例4：人KLH-IL4杂络物的制备
这种杂络物是疫苗的活性成分，该疫苗能够主要诱导产生中和人IL4的抗体。
将1mg KLH蛋白溶于1ml 10mM磷酸缓冲液(pH8.5)。向该溶液中加入溶于1ml相同缓冲液中的1mg鼠IL4蛋白。
将所得蛋白质混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理30分钟。
然后通过三次连续透析(每次2小时)除去过量戊二醛，每次透析都在截留阈值为3kDa的透析管中，于4℃用200ml磷酸缓冲液(pH7.6，10mM)进行。
然后用终浓度为33mM的甲醛处理混合物24小时。通过室温下加入终浓度0.1M甘氨酸1小时以阻止反应。在与前面实施的透析相同的条件下最后透析混合物。
实施例5：KLH-IFNα复合体的制备
这种缀合物是疫苗的活性成分，该疫苗能够主要诱导产生中和人IFNα的抗体。
将0.625mg KLH蛋白溶于0.6ml 10mM磷酸缓冲液(pH8.5)。向该溶液中加入溶于1ml相同缓冲液中的1mg人IFNα蛋白。
将所得蛋白质混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理30分钟。
然后通过三次连续透析(每次2小时)除去过量戊二醛，每次透析都在截留阈值为3kDa的透析管中，于4℃用200ml磷酸缓冲液(pH7.6，10mM)进行。
然后用终浓度为33mM的甲醛处理混合物48小时。通过室温下加入终浓度0.1M甘氨酸1小时以阻止反应。在与前面实施的透析相同的条件下最后透析混合物。
实施例6：gp160-IFNα复合体的制备
这种杂络物是疫苗的活性成分，该疫苗能够诱导产生中和HIV-1病毒的gp160结构蛋白和免疫抑制性IFNα细胞因子蛋白的抗体。此外，这种杂络物应该能够诱导针对表达gp160的受感染细胞产生细胞反应(趋化因子、辅助性T细胞、CTL)。
将0.380mg gp160蛋白溶于0.380ml 10mM磷酸缓冲液(pH8.5)。向该溶液中加入溶于1ml相同缓冲液中的1mg人IFNα蛋白。
将所得蛋白质混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理30分钟。
然后通过三次连续透析(每次2小时)除去过量戊二醛，每次透析都在截留阈值为3kDa的透析管中，于4℃用200ml磷酸缓冲液(pH7.6，10mM)进行。
然后用终浓度为33mM的甲醛处理混合物48小时。通过室温下加入终浓度0.1M甘氨酸1小时以阻止反应。在与前面实施的透析相同的条件下最后透析混合物。
实施例7：gp160-类毒素Tat杂络物的制备(Tat蛋白是生物化学失活的)
这种杂络物是疫苗的活性成分，该疫苗能够诱导产生中和HIV-1病毒的gp160结构蛋白和HIV-1的胞外Tat蛋白的抗体。此外，这种复合体应该能够诱导针对表达gp160的受感染细胞产生细胞反应(趋化因子、辅助性T细胞、CTL)。
将0.550mg gp120蛋白溶于0.550ml 10mM磷酸缓冲液(pH8.5)。向该溶液中加入溶于1ml相同缓冲液中的1mg类毒素Tat蛋白。
将所得蛋白质混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理30分钟。
然后，通过室温下加入终浓度0.1M甘氨酸1小时阻止反应。然后通过三次连续透析(每次2小时)除去过量甘氨酸，每次透析都在截留阈值为3kDa的透析管中，于4℃用200ml磷酸缓冲液(pH7.6，10mM)进行。
实施例8：gp160-GM Tat杂络物的制备(Tat蛋白被遗传失活)
这种杂络物是疫苗的活性成分，该疫苗能够诱导产生中和HIV-1病毒的gp160结构蛋白的抗体和对调节HIV-1的Tat蛋白产生中和抗体。此外，这种复合体应该能够诱导针对表达gp160的受感染细胞产生的细胞反应(趋化因子、辅助性T细胞、CTL)。
将0.550mg gp160蛋白溶于0.550ml 10mM磷酸缓冲液(pH8.5)。向该溶液中加入溶于1ml相同缓冲液中的1mg GM Tat蛋白。
将所得蛋白质混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理30分钟。
然后，通过室温下加入终浓度0.1M的甘氨酸1小时阻止反应。然后通过三次连续透析(每次2小时)除去过量甘氨酸，每次透析都在截留阈值为3kDa的透析管中，于4℃用200ml磷酸缓冲液(pH7.6，10mM)进行。
实施例9：鼠KLH-TNFα杂络物的制备
这种缀合物是疫苗的活性成分，该疫苗能够在受接种者中主要诱导产生中和鼠TNFα的抗体。
将0.625mg KLH蛋白溶于0.6ml 10mM硼酸盐缓冲液(pH8.8，150mM NaCl)。向该溶液中加入溶于1ml相同缓冲液中的1mg人IFNα蛋白。
将所得蛋白质混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理45分钟。
然后通过三次连续透析(每次4小时)除去过量戊二醛，每次透析都在截留阈值为3kDa的透析管中，于4℃用200ml磷酸缓冲液(pH7.6，10mM，150mM NaCl)进行。
然后用终浓度33mM的甲醛处理混合物48小时。然后，通过室温下加入终浓度0.1M的甘氨酸1小时阻止反应。在和前面实施的透析相同的条件下最后透析混合物。
实施例10：Tat肽杂络物(19-50)-hIgE的制备
Tat肽(19-50)带来了辅助性辅助表位。
所用的Tat肽序列：
Lys-Thr-Ala-Cys-Thr-Asn-Cys-Tyr-Cys-Lys-Lys-Cys-Cys-Phe-His-Cys-Gln-Val-Cys-Phe-lle-Thr-Lys-Ala-Leu-Gly-lle-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys
这种缀合物是疫苗的活性成分，该疫苗能够主要在受接种者中诱导(人)抗-IgE抗体的形成。
将0.1mg Tat肽(19-50)(4.06×10-8摩尔)溶于0.2ml 10mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)。向该溶液中加入溶于1ml相同缓冲液中的1mg人IgE(6.6×10-9摩尔)。
将所得蛋白质混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理30分钟。
通过2次连续透析(每次4小时)和最后的16小时透析以除去过量戊二醛，每次透析都用截留阈值为10kDa的透析袋，于4℃用含有0.8％NaCl的大体积磷酸缓冲液(pH7.4，10mM)(PBS)进行。(IgE∶肽＝50∶1)
实施例11：针对蓖麻毒蛋白片段的杂络物的制备
这种杂络物是疫苗的活性成分，该疫苗能够在受接种者中针对参与蓖麻毒蛋白分子结合的片段诱导中和抗体，从而防止毒素发挥有毒活性。
向溶于0.5ml 10mM磷酸缓冲液(pH8.2)的0.5mg KLH(1.1×10-3摩尔)中加入溶于1ml相同缓冲液中的蓖麻毒蛋白的α片段1mg(3.3×10-8摩尔)。将制备的混合物在室温下用终浓度为0.026M的戊二醛处理30分钟。
通过2次连续透析(每次4小时)和16小时透析以除去过量戊二醛，每次透析都用截留阈值为3kDa的透析袋对含有0.8％NaCl的大体积磷酸缓冲液(10mM)(PBS)进行。(KLH∶蓖麻毒蛋白比例＝1∶30)。
杂络物的生物化学表征实施例
A.实施例12到23的材料和方法
通过下面的技术实施杂络物的生物化学表征：
1.抗原性试验
通过常规间接ELISA比较杂络物的抗原性和组成该杂络物的蛋白质的抗原性。这种技术容许通过针对抗原产生的特异识别抗体定量测量蛋白质。这种试验包括将含有目的蛋白质的样品稀释液置于微量滴定板的孔中。一种特异多克隆抗体与所固定的蛋白质反应。然后加入对第一抗体特异的第二抗体，该第二抗体缀合辣根过氧化物酶。通过与OPD孵育显示形成的复合体。所得黄色与结合的蛋白质的量成正比。用微板读出器测量每孔的吸收(DO)。然后通过校准范围确定样品中蛋白质的量。
2.在琼脂糖凝胶中等电聚焦然后进行蛋白质印迹
琼脂糖凝胶中的等电聚焦容许在非变性条件下根据等电点(Ip)分离分子，从而可以研究杂络物而不破坏这些复合体中存在的弱键。
通过蛋白质印迹显现来跟踪等电聚焦。电泳分离后，将分子通过毛细管作用转移到硝酸纤维素膜上。然后通过免疫化学表征这些分子。
3.测量共价连接到载体蛋白分子的目标抗原分子的百分数(第一种方法)
在例如变性(8M尿素)和还原(5％β-巯基乙醇)条件下，通过含有Superdex 200的柱上的分子筛评估免疫原性产物中与载体蛋白分子共价连接的目标抗原分子的百分数。
从存在于柱子的排斥体积中的目标抗原的量(通过常规间接ELISA确定)推导目标抗原分子的共价连接％。实际上，在这种柱子的排斥体积中存在载体蛋白分子，如KLH，该载体蛋白分子的分子量比所用柱子的最大分级极限(在该情况中为200kDa)高得多。从而，在变性和还原条件下，排斥体积中仅存在共价连接到载体蛋白分子的目标抗原。
4.测量共价连接到载体蛋白分子的目标抗原分子的百分数(第二种方法)
通过双三明治ELISA，利用特异针对载体蛋白的捕捉抗体确定固定在载体蛋白(KLH)上的细胞因子的百分数。
将在10mM磷酸缓冲液(pH7.3，NaCl 150mM)(PBS)中稀释的针对KLH的马多克隆抗体100μl(1mg/ml)于37℃下在微量滴定板(高结合Costar)的孔中结合2小时。用PBS/0.1％Tween 20(PBST)洗涤3次后，用含有2％BCS的PBS使孔饱和。
饱和1.30小时后，用PBST洗涤孔3次，然后向孔中加入一式两份的杂络物的连续两倍稀释液(10、5、2.5、1.25、0.625、0.312和0.156μg/ml)(100μl/孔)。
孵育2小时后，用PBST洗涤孔3次。用存在于洗涤缓冲液中的一种解离剂Tween除去没有共价结合KLH的所有分子，而KLH自身特异结合捕获抗体。
然后，以两种不同方法处理两组杂络物稀释液：
a)用针对KLH的抗体孵育第一组，
b)用针对细胞因子的抗体孵育第二组。
37℃孵育1.30小时后，将孔如前面描述的洗涤，然后用偶联过氧化物酶的第二抗体孵育，该第二抗体针对第一抗体的来源物种。37℃孵育1.30小时后，再次洗涤抗体。然后，加入过氧化物酶底物邻苯二胺(OPD)显示被捕获抗体结合的KLH和共价结合KIH的细胞因子的存在。
通过用ELISA制作的校准曲线计算被捕获抗体结合的KLH的量和共价结合在KLH上的细胞因子的量。
然后确定共价结合KLH的细胞因子的百分数。
实施例12：KLH-鼠VEGF杂络物的生物化学表征
1.抗原性
KLH-鼠VEGF杂络物的抗原性和鼠VEGF的抗原性相同。
2.在琼脂糖凝胶中等电聚焦然后进行蛋白质印迹
图1显示KLH-鼠VEGF杂络物以单一条带的形式迁移，该条带具有和组成该杂络物的天然分子不同的Ip。
实施例13：KLH-人VEGF杂络物的生物化学表征
1.抗原性
KLH-人VEGF杂络物的抗原性和人VEGF的抗原性相同。
2.等电聚焦然后进行蛋白质印迹
图2显示KLH-人VEGF杂络物以单一条带的形式迁移，该条带具有和组成该杂络物的天然分子不同的Ip。人VEGF样品被放置在三个不同的位置以表明其仍然迁移到相同的位置。
实施例14：KLH-鼠IL4杂络物的生物化学表征
1.抗原性
KLH-鼠IL4杂络物的抗原性和鼠IL4的抗原性相同。
实施例15：KLH-人IL4杂络物的生物化学表征
1.抗原性
KLH-人IL4杂络物的抗原性和人IL4的抗原性相同。
2.在琼脂糖凝胶中等电聚焦然后进行蛋白质印迹
图3显示人KLH-IL4杂络物以单一条带的形式迁移，该条带具有和组成该杂络物的天然分子不同的Ip。
实施例16：KLH-IFNα杂络物的生物化学表征
1.抗原性
人KLH-IFNα杂络物的抗原性和人IFNα的抗原性相同。
2.评估共价连接到载体蛋白分子的抗原分子的百分数
在上述条件下将KLH-IFNα制备物通过superdex S200柱。收集排斥体积中的表观峰，将其透析然后冻干。通过间接ELISA技术确定目标抗原的浓度。虽然1000μg IFN被用于制备免疫原性产物且在制备方法中抗原没有任何可测量的损失，但排斥体积中存在的IFNα的量仍为30μg。因此，估计含有KLH-IFNα杂络物的免疫原性产物中共价连接到KLH分子的目标抗原分子百分数为约3％。
实施例17：gp160-INFα杂络物的生物化学表征
1.抗原性
人gp160-IFNα复合体的抗原性和gp160蛋白以及人IFNα的抗原性相同。
2.在琼脂糖凝胶中等电聚焦然后进行蛋白质印迹
图4表明人gp160-IFNα杂络物以单一条带迁移，其Ip与组分中的gp160蛋白的Ip明显不同。这种杂络物的Ip稍低于IFNα的Ip。
实施例18：gp160-类毒素Tat杂络物的生物化学表征
1.抗原性
gp160-类毒素Tat复合体的抗原性与gp160蛋白以及Tat蛋白的抗原性相同。
实施例19：gp160-GM Tat杂络物的生物化学表征
1.抗原性
gp160-GM Tat复合体的抗原性与gp160蛋白以及Tat蛋白的抗原性相同。
实施例20：KLH-鼠IL4杂络物的生物化学表征
1.抗原性
鼠KLH-IL4杂络物的抗原性与鼠IL4的抗原性相同。
2.估计共价结合到载体蛋白分子的抗原分子的百分数
11％鼠IL4分子共价固定到KLH。
实施例21：KLH-INFα杂络物的生物化学表征
1.抗原性
KLH-人INFα复合体的抗原性和人INFα的抗原性相同。
2.估计共价结合到载体蛋白分子的抗原分子的百分数
8％人INFα分子共价固定到KLH。
实施例22：Tat-hIgE肽杂络物的生物化学表征
1.抗原性
Tat-hIgE肽复合体具有和人IgE的抗原性相当的抗原性。
实施例23：KLH-β蓖麻毒蛋白杂络物的生物化学表征
1.抗原性
KLH-β蓖麻毒蛋白复合体具有和β蓖麻毒蛋白片段的抗原性相当的抗原性。
2.等电聚焦后进行蛋白质印迹
所述复合体以单一条带的形式迁移，并通过蛋白质印迹证实β片段的存在。
杂络物免疫原性活性实施例
实施例24：KLH-鼠VEGF杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab c小鼠中研究与鼠VEGF的免疫原性相比KLH-鼠VEGF制剂的免疫原性(体液)。
1-免疫
在第0、7、14和21天，一组8只小鼠接受通过肌内途径注射的0.1ml(10μg)AIF乳剂。在第60天给予AIF中的5μg强化注射。
第一次注射前2天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
3只对照小鼠接受没有任何免疫原的相同制剂。
最后一次免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(50μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1.杂络物没有体内和体外毒性
用KLH-鼠VEGF制剂和仅用鼠VEGF免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/ml KLH-鼠VEGF剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用50μg杂络物免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对鼠VEGF的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价(稀释的倒数给出了大于0.3的光密度)。图5显示了所得抗体效价。
用KLH-鼠VEGF制剂免疫的小鼠表现出比仅用鼠VEGF免疫的那些小鼠更高的IgG型抗体效价。
通过VEGF(内皮细胞的选择性生长因子)的生物学活性试验测量这些抗体的中和活性。将内皮细胞(HUVECs)以每孔3,000个细胞的水平培养于微培养板的平底孔中。合并每组小鼠的血清。将在第-2天和第72天采集的这些血清库的不同稀释液(1/100-1/800)用20ng/ml鼠VEGF预孵育2小时，然后沉积在这些内皮细胞上。在含有5％CO2的湿润空气中37℃下继续培养细胞3天。孵育结束前18小时，加入0.5μCi滴定的胸苷/孔。中和性血清防止鼠VEGF诱导内皮细胞的增殖，而非中和性血清允许这些细胞增殖。结果以中和百分数表达。图6显示了所得结果。
由复合体诱导的抗体具有比由鼠VEGF诱导的抗体更高的中和能力。
实施例25：KLH-人VEGF杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab c小鼠中研究与人VEGF的免疫原性相比KLH-人VEGF制剂的免疫原性(体液)。
1-免疫
在第0、7、14和21天，一组8只小鼠接受通过肌内途径注射的0.1ml(10μg)AIF乳剂。在第60天给予AIF中的5μg强化注射。
第一次注射前2天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
3只对照小鼠接受没有任何免疫原的相同制剂。
最后一次免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(50μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1.杂络物没有体内和体外毒性
用KLH-人VEGF制剂和仅用人VEGF免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/ml KLH-人VEGF剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用50μg杂络物免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对人VEGF的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价(稀释的倒数给出了大于0.3的光密度)。图7显示了所得抗体效价。
用KLH-人VEGF制剂免疫的小鼠表现出比仅用人VEGF免疫的那些小鼠更高的IgG型抗体效价。
通过VEGF(内皮细胞的选择性生长因子)的生物学活性试验测量这些抗体的中和活性。将内皮细胞(HUVECs)以每孔3,000个细胞的水平培养于微培养板的平底孔中。合并每组小鼠的血清。将在第-2天和第72天采集的这些血清库的不同稀释液(1/100-1/800)用20ng/ml人VEGF预孵育2小时，然后沉积在这些内皮细胞上。在含有5％CO2的湿润空气中37℃下继续培养细胞3天。孵育结束前18小时，加入0.5μCi滴定的胸苷/孔。中和性血清防止人VEGF诱导内皮细胞的增殖，而非中和性血清允许这些细胞增殖。结果以中和百分数表达。图8显示了所得结果。
由复合体诱导的抗体具有比由人VEGF诱导的抗体更高的中和能力。
实施例26：KLH-鼠IL4杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab c小鼠中研究与鼠IL4的免疫原性相比鼠KLH-IL4制剂的免疫原性(体液)。
1-免疫
在第0、7、14和21天，一组8只小鼠接受通过肌内途径注射的0.1ml(10μg)AIF乳剂。在第60天给予AIF中的5μg强化注射。
第一次注射前第-2天和在第72天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
3只对照小鼠接受没有任何免疫原的相同制剂。
最后一次免疫后14天，在第74天、第95天和第109天通过皮下途径在alum(100μg/小鼠)存在下用桦树花攻击对照小鼠和用KLH-鼠IL4免疫的小鼠。有规律地采集血样以跟踪针对Bet v1—桦树花粉的一种主要变应原—产生的IgG和IgE类抗体。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(50μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1.杂络物没有体内和体外毒性
用KLH-鼠IL4制剂和仅用鼠IL4免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/ml KLH-鼠IL4剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用50μg杂络物免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对鼠IL4的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价(稀释的倒数给出了大于0.3的光密度)。图9显示了所得抗体效价。
用KLH-鼠IL4制剂免疫的小鼠表现出比仅用鼠IL4免疫的那些小鼠更高的IgG型抗体效价。
通过鼠IL4的生物学活性试验测量这些用KLH-鼠IL4制剂免疫的小鼠中所存在那些抗体的中和活性。该试验使用HT-2细胞，该细胞是鼠细胞系，其生长是依赖鼠IL4的(Watson，J.1979.J.Exp.Med.150：1510.)。将内皮细胞HT-2以每孔10,000个细胞的水平培养于微培养板的圆底孔中。将在第-2天和第72天采集的以1/50稀释的血清用50ng/ml鼠IL4预孵育2小时，然后沉积在HT-2细胞上。在含有5％CO2的湿润空气中37℃下继续培养细胞3天。孵育结束前4小时，加入0.5μCi滴定的胸苷/孔。中和性血清防止鼠IL4诱导HT-2细胞的增殖，而非中和性血清允许这些细胞增殖。结果以中和百分数表达。图10显示了所得结果。
通过复合体诱导的抗体具有中和性。
此外，用桦树花粉攻击小鼠时，针对鼠IL4产生的这些中和抗体可以防止这些小鼠产生针对Betv1的IgE型抗体。图11实际上表明用KLH-鼠IL4免疫的小鼠具有针对IL4的中和性IgG，其阻碍针对Betν1产生IgE并且这些小鼠开始产生针对Betν1的IgG型抗体。另一方面，没有接受任何鼠KLH-IL4的小鼠不具有针对IL4的IgG型抗体，而仅产生针对Betν1的IgE型抗体。
实施例27：KLH-人IL4杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab c小鼠中研究与人IL4的免疫原性相比KLH-人IL4制剂的免疫原性(体液)。
1-免疫
在第0、7、14和21天，一组3只小鼠接受通过肌内途径注射的0.1ml(10μg)AIF乳剂。在第60天给予AIF中的5μg强化注射。
第一次注射前2天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
3只对照小鼠接受没有任何免疫原的相同制剂。
最后一次免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(50μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1.杂络物没有体内和体外毒性
用KLH-人IL4制剂和仅用人IL4免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/ml KLH-人IL4剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用50μg杂络物免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对人IL4的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价(稀释的倒数给出了大于0.3的光密度)。
                                       表1
                                                     效价
  第-2天                                            第72天
  对照小鼠：
  对照小鼠1   ＜500-1   ＜500-1
  对照小鼠2   ＜500-1   ＜500-1
  对照小鼠3   ＜500-1   ＜500-1
  用人IL4免疫的小鼠：
  对照小鼠4   ＜500-1   32,000-1
  对照小鼠5   ＜500-1   48,000-1
  对照小鼠6   ＜500-1   16,000-1
  用KLH-人IL4复合体免疫的小鼠：
  对照小鼠7   ＜500-1   256,000-1
  对照小鼠8   ＜500-1   128,000-1
  对照小鼠9   ＜500-1   128,000-1
用KLH-人IL4制剂免疫的小鼠表现出比仅用人IL4免疫的那些小鼠更高的IgG型抗体效价。通过人IL4的生物学活性试验测量被人的KLH-IL4制剂诱导的这些抗体的中和活性。该试验使用TF-1细胞，该细胞是人细胞系，其生长是依赖人IL4的(Kitamura，T.等人，1989.J.CellPhysiol.140：323-34)。将TF-1细胞以每孔10,000个细胞的水平培养于微培养板的圆底孔中。将在第-2天和第72天采集的以1/50稀释的血清用50ng/ml人IL4预孵育2小时，然后沉积在TF-1细胞上。在含有5％CO2的湿润空气中37℃下继续培养细胞3天。孵育结束前4小时，加入0.5μCi滴定的胸苷/孔。中和性血清防止人IL4诱导TF-1细胞的增殖，而非中和性血清允许这些细胞增殖。结果以中和百分数表达。图12显示了所得结果。
通过复合体诱导的抗体具有中和性。
实施例28：KLH-INFα杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab c小鼠中研究与人INFα的免疫原性相比KLH-人INFα制剂的免疫原性(体液)。
1-免疫
在第0、7、14和21天，一组3只小鼠接受通过肌内途径注射的0.1ml(10μg)AIF乳剂。在第60天给予AIF中的5μg强化注射。
第一次注射前2天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
3只对照小鼠接受没有任何免疫原的相同制剂。
最后免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(50μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1.杂络物没有体内和体外毒性
用KLH-人INFα制剂和仅用人INFα免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/ml KLH-人INFα剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用100μg杂络物免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对人INFα的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价(稀释的倒数给出了大于0.3的光密度)。表2显示了所得抗体效价。
表2
                                                  效价
  第-2天                                           第72天
  对照小鼠：
 对照小鼠1   ＜500-1   ＜500-1
 对照小鼠2   ＜500-1   ＜500-1
 对照小鼠3   ＜500-1   ＜500-1
  用IFNα免疫的小鼠：
  小鼠4   ＜500-1   96,000-1
  小鼠5   ＜500-1   128,000-1
  小鼠6   ＜500-1   96,000-1
  用KHL-IFNα复合体免疫的小鼠：
  小鼠7   ＜500-1   96,000-1
  小鼠8   ＜500-1   96,000-1
  小鼠9   ＜500-1   128,000-1
用KHL-人IFNα制剂免疫的小鼠表现出的IgG型抗体效价等于仅用人IFNα免疫的小鼠表现出的IgG型抗体效价。
通过人IFNα的生物学活性试验测量这些抗体的中和活性(RubinsteinS，J Viral，1981，755-8)。用于测量抗病毒作用的该试验目的是评估IFN存在下VSV(疱疹性口腔炎病毒)对MDBK细胞裂解的抑制。MDBK细胞以每孔350,000个细胞的水平培养于微培养板的圆底孔中。在第-2天和第72天采集的血清的不同稀释液(1/100到1/800)用5ng/ml人IFNα预孵育2小时，然后沉积在MDBK上。在含有5％CO2的湿润空气中37℃下实施细胞培养20小时后，除去孔中的稀释血清，洗涤细胞，然后加入100μl含有100LD50(50％致死剂量)的VSV病毒。病毒加入后18小时测量病毒的裂解效果。中和性血清允许VSV裂解细胞，而非中和性血清防止这种裂解。结果以中和百分数表达。
表3
  用IFNα免疫的小鼠：
  1/100   1/200   1/400   1/800
  小鼠4   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   75   65   50
  小鼠5   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   67   60   55
  小鼠6   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   72   65   60
  用KLH-IFNα缀合物免疫的小鼠
  1/100   1/200   1/400   1/800
  小鼠7   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   100   100   100
  小鼠8   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   100   100   100
  小鼠9   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   100   100   100
被复合体诱导的抗体具有比用人IFNα诱导的更高的中和能力。结果以中和百分数表达。
实施例29：gp160-IFNα杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab c小鼠中研究与人IFNα的免疫原性相比人gp160-IFNα制剂的免疫原性(体液)活性。
1-免疫
在第0、7、14和21天，一组3只小鼠接受通过肌内途径注射的0.1ml(10μg)AIF乳剂。在第60天给予AIF中的5μg强化注射。
第一次注射前第-2天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
3只对照小鼠接受没有任何免疫原的相同制剂。
最后一次免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(100μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1.杂络物没有体内和体外毒性
用gp160-人IFNα制剂和仅用人IFNα免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/ml gp160-人IFNα剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用100μg杂络物免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对人IFNα的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价(稀释的倒数给出了大于0.3的光密度)。
                                               表4
效价
  第-2天   第72天
  对照小鼠：
  对照小鼠1   ＜500-1   ＜500-1
  对照小鼠2   ＜500-1   ＜500-1
  对照小鼠3   ＜500-1   ＜500-1
  用IFNα免疫的小鼠：
  小鼠4   ＜500-1   64,000-1
  小鼠5   ＜500-1   96,000-1
  小鼠6   ＜500-1   128,000-1
  用gp160-IFNα复合体免疫的小鼠：
  小鼠7   ＜500-1   96,000-1
  小鼠8   ＜500-1   96,000-1
  小鼠9   ＜500-1   64,000-1
用gp160-人IFNα制剂免疫的小鼠产生的IgG型抗体效价等于仅用人IFNα免疫的小鼠产生的IgG型抗体效价。
通过前面实施例中描述的人IFNα生物学活性试验测量这些抗体的中和活性。结果以中和百分数给出。
                                                     表5
 用IFNα免疫的小鼠：
  1/100   1/200   1/400   1/800
 小鼠4   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   80   70   53
 小鼠5   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   70   65   50
 小鼠6   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   65   60   57
  用gp160-IFNα缀合物免疫的小鼠：
  1/100   1/200   1/400   1/800
 小鼠7   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   100   100   100
 小鼠8   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   100   100   100
 小鼠9   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   100   100   100
通过复合体诱导的抗体具有比通过人IFNα诱导的抗体更高的中和能力。
实施例30：gp160-类毒素Tat杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab c小鼠中研究与类毒素Tat的免疫原性相比gp160-类毒素Tat制剂的免疫原性(体液和细胞的)活性。
1-免疫
在第0、7、14和21天，一组3只小鼠接受通过肌内途径注射的0.1ml(10μg)AIF乳剂。在第-2天给予AIF中的5μg强化注射。
第一次注射前2天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
3只对照小鼠接受没有任何免疫原的相同制剂。
最后一次免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(100μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1.杂络物没有体内和体外毒性
用gp160-类毒素Tat制剂和仅用类毒素Tat免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/mlgp160-类毒素Tat剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用100μg杂络物免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对Tat的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价(稀释的倒数给出了大于0.3的光密度)。表6显示了所得抗体效价。
                                            表6
                                                 效价
  A)效价
  第-2天   第72天
  对照小鼠：
  对照小鼠1   ＜500-1   ＜500-1
  对照小鼠2   ＜500-1   ＜500-1
  对照小鼠3   ＜500-1   ＜500-1
  用类毒素Tat免疫的小鼠：
  小鼠4   ＜500-1   48,000-1
  小鼠5   ＜500-1   64,000-1
  小鼠6   ＜500-1   48,000-1
  用gp160-类毒素Tat缀合物免疫的小鼠：
  小鼠7   ＜500-1   64,000-1
  小鼠8   ＜500-1   128,000-1
  小鼠9   ＜500-1   64,000-1
用gp160-类毒素Tat制剂免疫的小鼠比仅用类毒素Tat免疫的小鼠表现出抗-Tat IgG型更高的抗体效价。
通过Cat测定法测量这些抗体的中和活性。在第-2天和第72天采集的血清的不同稀释液(1/100-1/800)与50ng/ml天然Tat孵育2小时。然后将这些稀释液置于HeLa细胞上，该Hela细胞是被质粒稳定转染的细胞，该质粒含有VIH-1的LTR作为氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)的启动子。培养24小时后，将细胞裂解并通过一种ELISA试验-Cat测定法(Boehringer Mannheim)测量产生的CAT蛋白的量。中和性血清防止Tat蛋白诱导CAT蛋白的表达，而非中和性血清允许该CAT蛋白的合成。结果以中和百分数表示。
                                                 表7
 用类毒素Tat免疫的小鼠：
  1/100   1/200   1/400   1/800
 小鼠4   第-2天   0   0   0   0
  第72天   60   50   25   20
 小鼠5   第-2天   0   0   0   0
  第72天   60   55   30   20
 小鼠6   第-2天   0   0   0   0
  第72天   65   50   30   30
 用gp160-类毒素Tat缀合物免疫的小鼠：
  1/100   1/200   1/400   1/800
 小鼠7   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   100   100   100
 小鼠8   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   100   100   100
 小鼠9   第-2天   0   0   0   0
  第72天   100   100   100   100
gp160-类毒素Tat缀合物诱导的抗体比类毒素Tat诱导的抗体具有更高的中和能力。
2.MIP1α的产生
在脾细胞的培养上清液中产生MIP1α。分离受免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞并在5μg/ml p24、gp160、天然Tat、以及5μg/ml gp160和5μg/ml天然Tat的混合物存在下将分离的脾细胞以100,000个细胞/孔的水平培养在微培养板的圆底孔中。培养24小时后取上清液并通过R&DELISA试验测量上清液中MIP1的存在。结果以μg/ml表示。
                                         表8
  Gp160   天然Tat   Gp160+天然Tat   P24
 对照小鼠：
 小鼠1第72天   MIP1α   95   90   145   9
 小鼠2第72天   Mip1α   100   90   136   7
 小鼠3第72天   MIP1α   120   110   132   9
 用类毒素Tat免疫的小鼠：
 小鼠4第72天   MIP1α   145   130   190   7
 小鼠5第72天   MIP1α   128   145   225   9
 小鼠6第72天   MIP1α   150   230   295   10
 用gp160-类毒素Tat缀合物免疫的小鼠：
 小鼠7第72天   MIP1α   875   736   1725   9
 小鼠8第72天   MIP1α   945   905   1900   7
 小鼠9第72天   MIP1α   1025   795   1755   8
当在免疫期间用免疫原体外活化时，用gp160-类毒素Tat缀合物免疫的小鼠的脾细胞比仅用类毒素Tat免疫的小鼠的细胞产生更多的MIP1α趋化因子。
4.受免疫小鼠的脾细胞增殖(CMI试验)
分离受免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞并在p24、gp160、天然Tat、以及gp160与天然Tat的混合物存在下将分离的脾细胞以100,000个细胞/孔的水平培养在微培养板的圆底孔中。在含有5％CO2的湿润空气中37℃下继续细胞培养6天。孵育结束前18小时，加入0.5μCi滴定的胸苷/孔。免疫应答的强度与增殖指数Ip成比例。
Ip＝给定抗原的spm(每分钟冲程)/对照spm
                                                表9
  Gp160   天然Tat   Gp160+天然Tat   P24
 对照小鼠：
 小鼠1第72天   1.1   1.1   1   1.2
 小鼠2第72天   1   1.1   1.1   1.1
 小鼠3第72天   1.2   1   1   1.1
 用类毒素Tat免疫的小鼠：
 小鼠4第72天   1.2   8   10   1.1
 小鼠5第72天   1   9   9   1.2
 小鼠6第72天   1   10   9   1.2
 用gp160-类毒素Tat缀合物免疫的小鼠：
 小鼠7第72天   9   11   8   1
 小鼠8第72天   10   9   7.5   1
 小鼠9第72天   10.5   9   8   1
用gp160-类毒素Tat缀合物或者类毒素Tat免疫的小鼠脾细胞当在免疫期间被免疫原体外活化时增殖。
实施例31：gp160-GMTat杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab c小鼠中研究与类毒素Tat的免疫原性相比gp160-GMTat制剂的免疫原性(体液和细胞的)活性。
1-免疫
在第0、7、14和21天，一组3只小鼠接受通过肌内途径注射的0.1ml(10μg)AIF乳剂。在第-2天给予AIF中的5μg强化注射。
第一次注射前2天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
3只对照小鼠接受没有任何免疫原的相同制剂。
最后一次免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(100μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1.杂络物没有体内和体外毒性
用gp160-GMTat制剂和仅用类毒素Tat免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/mlgp160-GMTat剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用100μg杂络物免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对Tat的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价(稀释的倒数给出了大于0.3的光密度)。表10显示了所得抗体效价。
                                      表10
  效价
  第-2天   第72天
  对照小鼠：
  对照小鼠1   ＜500-1   ＜500-1
  对照小鼠2   ＜500-1   ＜500-1
  对照小鼠3   ＜500-1   ＜500-1
  用GM Tat免疫的小鼠：
  小鼠4   ＜500-1   64,000-1
  小鼠5   ＜500-1   64,000-1
  小鼠6   ＜500-1   48,000-1
  用gp160-GM Tat缀合物免疫的小鼠：
  小鼠7   ＜500-1   128,000-1
  小鼠8   ＜500-1   128,000-1
  小鼠9   ＜500-1   64,000-1
用gp160-GM Tat制剂免疫的小鼠比仅用GM Tat免疫的小鼠表现出更高的抗-Tat IgG型抗体效价。
实施例32：KLH-鼠TNFα杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab c小鼠中研究与鼠TNFα的免疫原性相比KLH-鼠TNFα制剂的免疫原性(体液)活性。
在第0天，一组3只小鼠(组A)接受通过肌内途径注射的0.1ml含有60μg KLH-TNFα复合体的AIF乳剂。在第21天和第60天分别给予AIF中的30μg和15μg强化注射。3只对照小鼠根据相同方案接受鼠TNFα的相等剂量(组B)。在第0天，一组3只小鼠(组C)通过肌内途径接受含有60μg KLH-鼠TNFα杂络物和30μg硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′(CpG ADN：1826)的0.1ml AIF中的注射液。在第21天和第60天分别给予AIF中的30μg和15μg KLH-鼠TNFα杂络物强化注射。3只对照小鼠根据相同方案接受鼠TNFα的相等剂量(组D)。
第一次注射前2天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
最后一次免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(50μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1.杂络物没有体内和体外毒性
用鼠KLH-TNFα制剂和仅用鼠TNFα免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/ml KLH-鼠TNFα剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用50μg杂络物并且用或不用DNA CPG1826免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对鼠TNFα的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价。还通过ELISA确定了阴道分泌物中针对鼠TNFα的IgA型抗体的存在。效价代表得到大于0.3的光密度的稀释倒数。下表显示了所得抗体效价。
                                      表11
                                                                    阴道IgA
  第-2天   第72天   第-2天   第72天
用KLH-鼠TNFα免疫的小鼠(组A)
  1 ＜500-1   64,000-1 ＜10-1   20-1
  2   48,000-1   20-1
  3   64,000-1   40-1
用鼠TNFα免疫的小鼠(组B)
  4 ＜500-1   750-1 ＜10-1   10-1
  5   1,000-1   20-1
  6   750-1   10-1
CpG存在下用KLH-鼠TNFα免疫的小鼠(组C)
  7 ＜500-1   128,000-1 ＜10-1   160-1
  8   256,000-1   80-1
  9   256,000-1   320-1
CpG存在下用鼠TNFα免疫的小鼠(组D)
  7 ＜500-1   2000-1 ＜10-1   20-1
  8   4,000-1   40-1
  9   3,000-1   40-1
实施例33：KLH-hIgE杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab c小鼠中研究与人IgE的免疫原性相比KLH-人IgE制剂的免疫原性(体液)活性。
1-免疫
在第0、7、14和21天，一组3只小鼠接受通过肌内途径注射的0.1ml(10μg)AIF乳剂。在第60天给予AIF中的5μg强化注射。
第一次注射前2天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
3只对照小鼠接受没有任何免疫原的相同制剂。
最后一次免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(50μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1-杂络物没有体内和体外毒性
用KLH-人IgE制剂和仅用人IgE免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/ml KLH-人IgE剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用50μg杂络物免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对人IgE的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价(稀释的倒数给出了大于0.3的光密度)。下表显示了所得抗体效价。
                                        表12
效价
  第-2天   第72天
  对照小鼠：
  1 ＜500-1 ＜500-1
  2
  3
  用hIgE免疫的小鼠
  4 ＜500-1   64,000-1
  5   128,000-1
  6   128,000-1
  用KLH-hIgE免疫的小鼠：
  7 ＜500-1   256,000-1
  8   128,000-1
  9   256,000-1
用KLH-hIgE制剂免疫的小鼠比仅用hIgE制剂免疫的那些小鼠表现出稍高的IgG型抗体效价。
实施例34：KLH-蓖麻毒蛋白-β杂络物的免疫原性活性
A.材料和方法
在18到20g blab-/c小鼠中研究与蓖麻毒蛋白β片段的免疫原性相比KLH-蓖麻毒蛋白-β制剂的免疫原性(体液)活性。
1-免疫
在第0、7、14和21天，一组3只小鼠接受通过肌内途径注射的0.1ml(10μg)AIF乳剂。在第60天给予AIF中的5μg强化注射。
第一次注射前2天从每只小鼠的后眼窝采集血样。
3只对照小鼠接受没有任何免疫原的相同制剂。
最后一次免疫后12天处死小鼠。
2-毒性
根据药典对接受人用剂量(50μg)的3只小鼠研究所产生的异常毒性。
通过体外细胞增殖试验评估杂络物的免疫毒性的缺乏，在复合体存在下培养PBMCs并通过PPD或者破伤风类毒素刺激实施细胞增殖试验。
B.结果
1-杂络物没有体内和体外毒性
用人KLH-蓖麻毒蛋白-β制剂和仅用蓖麻毒蛋白-β片段免疫的小鼠都不表现出任何临床病征并且没有解剖伤口。免疫抑制试验表明100ng/ml到1μg/ml KLH-蓖麻毒蛋白-β剂量不减少淋巴细胞的增殖。
用50μg杂络物免疫的三只小鼠在注射后的7天期间没有一只表现出中毒病征(温度、皮肤失调、全身性或局部病征)。
2-体液应答
通过血清中针对蓖麻毒蛋白-β片段的IgG型抗体的存在测量体液应答，抗体的存在通过ELISA确定并表达为效价(稀释的倒数给出了大于0.3的光密度)。下表显示了所得抗体效价。
                                           表13
                                                          效价
  第-2天   第72天
  对照小鼠：
  1 ＜500-1 ＜500-1
  2
  3
  用蓖麻毒蛋白-β免疫的小鼠
  4 ＜500-1 256,000-1
  5   512,000-1
  6   256,000-1
  用KLH-蓖麻毒蛋白-β免疫的小鼠
  7 ＜500-1   256,000-1
  8   256,000-1
  9   128,000-1
通过抗-蓖麻毒蛋白-β的蓖麻毒蛋白血清的混合物注射小鼠来检查这些抗体的中和活性，注射该混合物不导致动物死亡，与对小鼠施用蓖麻毒蛋白和正常血清混合物期间所观察到的结果相反。
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Claims (26)

1.在受试者中针对一种或多种抗原性蛋白诱导抗体的稳定的免疫原性产物，其特征在于该免疫原性产物包含由(i)抗原性蛋白分子和(ii)载体蛋白分子之间的结合组成的蛋白质免疫原性杂络物，并且其特征还在于40％以下的抗原性蛋白(i)共价连接到载体蛋白分子(ii)。
2.根据权利要求1的免疫原性产物，其特征在于每个杂络物包含连接到(ii)一个载体蛋白分子的(i)多个抗原性蛋白。
3.根据权利要求2的免疫原性产物，其特征在于，对于每个免疫原性杂络物，这多个抗原性蛋白(i)由单一抗原性蛋白的多个样本组成。
4.根据权利要求2或3的免疫原性产物，其特征在于，对于每个免疫原性杂络物，抗原性蛋白(i)是由通常被所述受试者的免疫系统细胞识别为自身蛋白的多个样本组成的。
5.根据权利要求1到4任一项的产物，其特征在于每个载体蛋白分子(ii)包含5到50个抗原性蛋白(i)，优选地每个载体蛋白分子(ii)包含20到40个抗原性蛋白(i)。
6.根据权利要求1到5任一项的免疫原性产物，其特征在于通过双官能结合化学剂产生一种或多种抗原性蛋白(i)和载体蛋白分子(ii)之间的共价键。
7.根据权利要求6的免疫原性产物，其特征在于所述结合化学剂包含至少两个游离醛官能。
8.根据权利要求7的免疫原性产物，其特征在于所述结合化学剂是戊二醛。
9.根据权利要求1到8任一项的免疫原性产物，其特征在于抗原性蛋白(i)为由所述受试者天然产生的细胞因子。
10.根据权利要求9的免疫原性产物，其特征在于抗原性蛋白(i)选自白介素-4、α干扰素、γ干扰素、VEGF、白介素-10、TNFα、TGFβ、白介素-5和白介素-6。
11.根据权利要求1到8任一项的免疫原性产物，其特征在于抗原性蛋白(i)选自乳头瘤病毒蛋白、VIH1病毒Tat蛋白、HTLV1或HTLV2病毒Tax蛋白和自身p53蛋白。
12.根据权利要求1到8任一项的免疫原性产物，其特征在于抗原性蛋白(i)为在低于1mg剂量下对人致命的蛋白质，如蓖麻毒蛋白、肉毒杆菌毒素、葡萄球菌肠毒素以及炭疽毒蛋白(EF、LF、PA)。
13.根据权利要求1到12任一项的免疫原性产物，其特征在于载体蛋白分子(ii)是免疫原性蛋白，其诱导产生针对某些细胞的细胞毒性淋巴细胞，其中所述某些细胞在它们的表面呈递所述载体蛋白分子或者自该载体蛋白分子衍生的任意肽与主要组织相容性复合体(HMC)I类分子的结合。
14.根据权利要求13的免疫原性产物，其特征在于载体蛋白分子(ii)选自乳头瘤病毒L1、L2和E7蛋白。
15.根据权利要求13的免疫原性产物，其特征在于载体蛋白分子(ii)选自HIV1病毒的gp160、p24、p17、Nef和Tat蛋白。
16.根据权利要求13的免疫原性产物，其特征在于载体蛋白分子(ii)选自CEA、p53、Di12、CaSm、OSA和ETS2蛋白。
17.根据权利要求13的免疫原性产物，其特征在于载体蛋白分子(ii)选自变应原性蛋白如Betv1、Derp1和Feld1。
18.根据权利要求1到8任一项的免疫原性产物，其特征在于其选自包含以下杂络物的免疫原性产物，所述杂络物中免疫原性蛋白(i)和蛋白质载体分子(ii)分别为：
a)(i)IL-4和(ii)KLH；
b)(i)α干扰素和(ii)KLH；
c)(i)VEGF和(ii)KLH；
d)(i)IL-10和(ii)KLH；
e)(i)α干扰素和(ii)VIH1的gp160
f)(i)IL-4和(ii)Betv1变应原性抗原；和
g)(i)VEGF和(ii)乳头瘤病毒E7蛋白；
h)(i)失活的VIH1Tatα蛋白和(ii)VIH1gp120蛋白；
i)(i)IgE同种型人抗体和(ii)失活的VIH1Tat蛋白；
j)(i)蓖麻毒蛋白β片段和(ii)KLH。
19.包含根据权利要求1到18任一项的免疫原性产物的组合物。
20.包含与一种或多种生理学上可相容的赋形剂结合的根据权利要求1到18任一项的免疫原性产物的药物组合物。
21.包含与一种或多种生理学上可相容的赋形剂结合的根据权利要求1到18任一项的免疫原性产物的免疫原性组合物。
22.包含与一种或多种生理学上可相容的赋形剂结合的根据权利要求1到18任一项的免疫原性产物的疫苗组合物。
23.根据权利要求21或22的免疫原性组合物或疫苗组合物，其特征是其包含CpG免疫佐剂。
24.制备根据权利要求1到18任一项的免疫原性产物的方法，其特征是该方法包括下面的步骤：
a)在化学结合剂存在下，将抗原性蛋白(i)和载体分子(ii)以摩尔比(i)∶(ii)为10∶1到50∶1的比例孵育；和
b)收集包含步骤a)中制备的免疫原性杂络物的免疫原性产物。
24.根据权利要求23的方法，其特征是化学结合剂是戊二醛。
25.根据权利要求23或24的方法，其特征是步骤a)后是通过甲醛稳定免疫原性杂络物的步骤，该稳定步骤在收集免疫原性产物的步骤b)之前。
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