BRPI0314373B1 - produto imunogênico estável para a indução de anticorpos contra uma ou várias proteínas antigênicas em um indivíduo, composições farmacêutica, imunogênica e de vacina e processo de preparação de um produto imunogênico - Google Patents

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Abstract

"produto imunogênico estável para a indução de anticorpos contra uma ou várias proteínas antigênicas em um indivíduo, composições farmacêutica, imunogênica e de vacina e processo de preparação de um produto imunogênico". a invenção refere-se a um produto imunogênico estável para a indução de anticorpos contra uma ou várias proteínas antigênicas em um indivíduo, caracterizado em que ele compreende os heterocomplexos imunogênicos protéicos constituídos por associações entre (i) as moléculas de proteínas antigênicas e (ii) as moléculas protéicas transportadoras e em que menos de 40 por cento das proteínas antigênicas (i) são ligadas com as moléculas protéicas transportadoras (ii) por uma ligação covalente.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a produtos imunogênicos estáveis compreendendo os heterocomplexos proteicos imunogênicos para a obtenção de uma resposta imune humoral com produção de anticorpos específicos dirigida contra um ou vários antígenos, particularmente contra um “auto”- antígeno, assim como sua utilização no domínio das vacinas.
ARTE ANTERIOR [0002] A obtenção de uma resposta de anticorpo de alto nível contra um antígeno dado, em um indivíduo, é um objetivo atualmente procurado, quer o antígeno seja um antígeno “estranho”, quer um antígeno do “próprio indivíduo”.
[0003] Todavia, o problema de um bom reconhecimento do antígeno contra o qual se busca uma resposta de anticorpo, em um indivíduo, deve ser resolvido em alguns casos, notadamente (a) quando o antígeno de interesse se comporta como um “hapteno”, isto é, uma estrutura química de baixa massa molecular que é pouco ou não é imunogênica sob forma livre, mas que, uma vez fixada em uma molécula de elevada massa molecular, é capaz de induzir a produção de anticorpos específicos deste hapteno, e (b) quando o antígeno de interesse é uma proteína do “autoantígeno”, isto é uma proteína que é produzida naturalmente junto ao indivíduo, para o qual existe uma tolerância imunológica devido à deleção dos clones de linfócitos T correspondentes, durante o desenvolvimento do sistema imune.
[0004] A fim de provocar, ou aumentar o reconhecimento de um antígeno de interesse para as células B, foram realizadas diversas construções imunogênicas no estado da técnica.
[0005] Uma primeira forma destas construções imunogênicas consiste em uma copulação covalente do antígeno de interesse sobre uma molécula transportadora, a molécula transportadora suprindo estruturas reconhecidas pelos linfócitos T auxiliares
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2/78 (células “T helper”), em associação com moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade (CMH), e que ativam os linfócitos auxiliares T que produzem, então, diversas citocinas, portanto IL-2, as referidas citocinas indo, por sua vez, ativar os clones de células B específicas do antígeno de interesse. As células B específicas do antígeno de interesse, uma vez ativadas, vão se multiplicar e produzir anticorpos específicos do antígeno de interesse, o que é o objetivo procurado. Geralmente, este tipo de construções imunogênicas consiste em produtos de copulação química covalente entre o antígeno de interesse e a molécula transportadora, os quais, após uma etapa de purificação e eliminação dos produtos não copulados, são os produtos finais de estrutura química bem definida.
[0006] A primeira forma de uma construção imunogênica acima é por exemplo ilustrada no artigo de Richard et al, que descreve a preparação de produtos de copulação covalente entre IL-9 e ovalbumina (Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 97(2) 767- 772); Ela é igualmente ilustrada na patente US 6 340 461 (Terman), que descreve os produtos de copulação entre uma ou várias cópias de um antígeno de interesse, contra o qual uma resposta de anticorpo específica é procurada junto ao indivíduo, e uma molécula transportadora constituída por um “super-antígeno”. O antígeno de interesse é copulação de modo exclusivamente covalente à molécula transportadora, por exemplo com a ajuda do glutaraldeído (também chamado “pentanodial”), os produtos não copulados de modo covalente sendo eliminados a fim de obter um produto final quimicamente bem definido.
[0007] Eventualmente, o produto de copulação covalente entre o antígeno de interesse e o super-antígeno pode ser preparado sob forma de um polímero do referido produto de copulação, por exemplo por fixação não covalente dos produtos de copulação monômeros entre si, através de interações iônicas, interações de adsorção ou ainda interações bio-específicas. Por exemplo, os produtos de copulação monômeros podem formar complexos com as moléculas altamente carregadas positivamente ou negativamente, graças a pontes salinas realizadas nas condições de fraca força iônica. Grandes complexos de produtos de copulação monômeros são preparados usando polímeros carregados, como os polímeros poli (ácido L-glutâmico)
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3/78 ou poli (L-lisina). De acordo com uma outra forma de realização de um polímero dos produtos de copulação monômeros, os produtos de copulação exclusivamente covalentes entre o antígeno de interesse e o super-antígeno podem ser adsorvidos ou copulados de modo não covalente na superfície de micro-partículas, como as esferas de látex ou outros polímeros hidrofóbicos.
[0008] Uma segunda forma destas construções imunogênicas, designada comumente estrutura “MAP” (para Multi-Antigenic Protein”) se apresenta, geralmente, sob a forma de um esqueleto proteico constituído por um polímero de poli (lisina), linear ou ramificado, sobre o qual são fixados de modo covalente um ou vários antígenos de interesse.
[0009] Uma terceira forma de construções imunogênicas consiste em micropartículas sobre as quais são fixados o ou os antígenos de interesse. Conhecem-se formas variadas de micro-partículas transportadoras de antígenos.
[0010] Conhece-se, por exemplo, iscomes (para “immunostimulating complexes”, que são constituídos por um complexo antigênico e um adjuvante, o composto QuilA. [0011] Conhece-se também os lipossomas que possuem as mesmas desvantagens que os iscomes, a saber notadamente uma certa toxidez e os efeitos imunológicos secundários, devido à sua falta de pureza.
[0012] Conhece-se igualmente micro-partículas biodegradáveis, como os polímeros de ácido láctico e ácido glutâmico (Aguado et Lambert, 1992, Immuno. Biol. Vol. 184; 113- 125), ou ainda partículas de amido (pedido de patente US 2002/ 0098203 _ Gutavsson et al), na matriz polimérica das quais são aprisionados os antígenos de interesse. Estas partículas liberam o antígeno sob sua forma solúvel durante a degradação da matriz polimérica.
[0013] Descreveu-se também as partículas constituídas exclusivamente de proteínas recombinantes híbridas, como descrito no pedido de patente FR 2 635 532 (Thiollais et al).
[0014] Conhece-se, igualmente, microesferas porosas nas quais os antígenos são imobilizados no interior dos microporos por captação ou copulação física, como descrito na patente US 5 008116 (Cahn).
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4/78 [0015] Todavia, as diferentes soluções propostas no estado da técnica ou tem todas em comum pelo menos um inconveniente técnico ligado ao seu modo de preparação, a saber a perda de uma grande proporção do material antigênico de interesse, do fato de uma etapa obrigatória de eliminação dos antígenos não copulados ou não adsorvidos.
[0016] Além do mais, se as técnicas anteriores permitem realizar uma associação entre um antígeno de interesse de baixa massa molecular com uma molécula transportadora, elas são geralmente não adaptadas à copulação de um antígeno de interesse de alta massa molecular, por exemplo acima de 10 kDa, à molécula transportadora, em razão notadamente dos impedimentos estereo-químicos que interditam a copulação de um número elevado de moléculas de antígenos de interesse de alta massa molecular a uma mesma molécula transportadora.
[0017] Por fim, a maior parte, se não a totalidade, das construções antigênicas peptídicas conhecidas englobam em sua estrutura uma única molécula transportadora, o que é um inconveniente técnico quando o objetivo é induzir uma resposta imune preventiva ou terapêutica tanto contra o antígeno de interesse como a própria molécula transportadora.
[0018] Existe, portanto, uma necessidade no estado da técnica para construções imunogênicas melhoradas permitindo a produção de um alto nível de anticorpos específicos de um antígeno de interesse junto a um indivíduo no qual uma tal resposta imune humoral é procurada, que sejam pouco onerosas, simples de preparar e que possam ser sintetizadas de modo reprodutível.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0019] A presente invenção fornece novas construções imunogênicas permitindo resolver diversos problemas técnicos encontrados com as construções imunogênicas conhecidas na arte anterior e que permitem satisfazer ás diferentes necessidades técnicas descritas acima.
[0020] A invenção tem por objeto um produto imunogênico estável para a indução de anticorpos contra uma ou várias proteínas antigênicas em um indivíduo, caracterizado em que ele compreende heterocomplexos imunogênicos proteicos
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5/78 constituídos por associações entre (i) as moléculas de proteínas antigênicas e (ii) moléculas proteicas transportadoras e em que menos de 40 por cento das proteínas antigênicas (i) são ligadas com moléculas proteicas transportadoras (ii) por uma ligação covalente.
[0021] A invenção tem também por objeto um produto imunogênico compreendendo heterocomplexos imunogênicos proteicos estáveis para a indução de anticorpos contra uma ou várias proteínas antigênicas em um indivíduo, cada heterocomplexo compreendendo (i) uma pluralidade de proteínas antigênicas, ligadas a (ii) uma molécula proteica transportadora, caracterizado pelo fato de que, no referido produto imunogênico, menos de 40 por cento das proteínas antigênicas (i) são ligadas às moléculas proteicas transportadoras (ii) por uma ligação covalente.
[0022] Preferivelmente, o heterocomplexo imunogênico constitutivo do produto imunogênico da invenção compreende de 5 a 50 proteínas antigênicas (i) para uma molécula proteica transportadora (ii), preferivelmente de 20 a 40 proteínas antigênicas (i) para uma molécula proteica transportadora (ii).
[0023] Preferivelmente, as ligações covalentes entre uma ou várias das proteínas antigênicas (i) e as moléculas proteicas transportadoras (ii) são realizadas por intermédio de um agente químico de ligação funcional.
[0024] Por molécula de interesse antigênica, entende-se qualquer proteína compreendendo um ou vários epítopos B de uma proteína antigênica nativa contra a qual a produção de anticorpos é procurada. A referida molécula de interesse antigênica pode consistir na própria proteína nativa ou um derivado proteico da proteína nativa, como um fragmento peptídico da proteína nativa, ou ainda qualquer forma biologicamente inativada da proteína nativa obtida por tratamento químico, físico ou por mutação genética. A proteína de interesse antigênica pode também consistir em um homo-oligômero ou homo-polímero da proteína nativa ou ainda em um homo-oligômero ou homo-polímero de um fragmento peptídico da proteína nativa. A proteína de interesse antigênico pode também consistir em um hetero-oligômero ou em um hetero-polímero compreendendo uma combinação de vários fragmentos peptídicos distintos inicialmente incluídos na proteína nativa.
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6/78 [0025] De acordo com uma forma de realização geral de um produto imunogênico de acordo com a invenção, a molécula proteica transportadora (ii) é uma proteína imunogênica induzindo a produção de linfócitos T auxiliar e/ou linfócitos T citotóxicos dirigidos contra células apresentando na sua superfície a referida molécula proteica transportadora, ou qualquer peptídeo que é derivado da mesma, em associação com moléculas apresentadoras do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), respectivamente de classe II e/ou de classe I. A molécula proteica transportadora (ii) pode ser igualmente uma proteína imunogênica induzindo tanto a produção de linfócitos T auxiliar como a produção de anticorpos pelos linfócitos B dirigidos contra a proteína transportadora.
[0026] De acordo com uma forma de realização particular de interesse, o produto imunogênico é caracterizado em que a molécula proteica transportadora (ii) é uma proteína imunogênica induzindo a produção de linfócitos citotóxicos dirigidos contra as células apresentando, em sua superfície, a referida molécula proteica transportadora, ou qualquer peptídeo que é derivado da mesma, em associação com as moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC).
[0027] Os produtos imunogênicos preferidos de acordo com a invenção são escolhidos dentre os produtos imunogênicos compreendendo heterocomplexos seguintes, nos quais as proteínas antigênicas (i), de um lado, e a molécula proteica transportadora (ii), de outro lado, são respectivamente a) (i) IL-4 e (ii) KLH;
b) (i) interferon alfa e (ii) KLH;
c) (i) VEGF e (ii) KLH;
d) (i) IL-10 e (ii) KLH;
e) (i) interferon alfa e (ii) gp 160 de HIV 1
f) (i) IL-4 e (ii) o antígeno alergênico Bet v1; e
g) (i) o VEGF e (ii) a proteína E7 de um Papillomavírus.
h) (i) a proteína Tat de HIV1 biologicamente inativada e (ii) a proteína gp 120 de HIV1.
i) (i) um anticorpo humano de isotipo IgE e (ii) a proteína Tat de HIV1 inativada;
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j) (i) o fragmento β de ricina e (ii) KLH.
[0028] A invenção é igualmente relativa a uma composição notadamente uma composição farmacêutica, uma composição imunogênica ou uma composição de vacina, caracterizada em que ela compreende um produto imunogênico como definido acima.
[0029] Ela trata igualmente de um processo de preparação de um produto imunogênico de acordo com uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado em que ele compreende as etapas seguintes:
a) incubar as proteínas antigênicas (i) e a molécula transportadora (ii) em uma relação molar (i): (ii) de 5::1 a 50::1, em presença de um agente químico de ligação,
b) recuperar o produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos imunogênicos que é preparado na etapa a).
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0030] A figura 1 ilustra a caracterização do produto imunogênico compreendendo heterocomplexos KLH-VEGF murino por isoeletrofocalização em gel de agarose seguido por uma revelação das proteínas por imuno-impressão (“Western blot”) [0031] A figura 2 ilustra a caracterização do produto imunogênico compreendendo heterocomplexos KLH-VEGF humano por isoeletrofocalização com revelação de azul Coomassie, seguido por uma imuno-impressão (“Western blot”). A esquerda da figura, é representado o gel de isoeletrofocalização. À direita da figura são representados os géis de imuno- impressão, usando anticorpos anti-KLH (à esquerda) ou anti-VEGF humano (à direita).
[0032] A figura 3 ilustra a caracterização do produto imunogênico compreendendo heterocomplexos KLH- IL4 humano por isoeletrofocalização em gel de agarose seguido por uma revelação das proteínas por imuno-impressão (“Western blot”) [0033] A figura 4 ilustra a caracterização do produto imunogênico compreendendo heterocomplexos gp 160 - IFN por isoeletrofocalização em gel de agarose seguido por uma revelação das proteínas por imuno-impressão (“Western blot”) [0034] A figura 5 ilustra a atividade imunogênica (humoral) do produto
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8/78 imunogênico KLH_VEGF murino, por determinação do título anticorpo obtido após imunização dos camundongos. Figura 5 A: camundongos imunizados com VEGF murino. Figura 5B: camundongos imunizados com o produto imunogênico contendo os heterocomplexos KLH-VEGF. Figura 5C: camundongos testemunhos injetados com o adjuvante incompleto de Freund (AIF).
[0035] A figura 6 a atividade imunogênica (humoral) do produto imunogênico KLH_VEGF murino, por determinação do poder neutralizante dos anticorpos obtidos após imunização, frente à atividade angiogênica da proteína VEGF.
[0036] A figura 7 ilustra a atividade imunogênica (humoral) do produto imunogênico KLH-VEGF humano por determinação de título anticorpo obtido após imunização dos camundongos.
[0037] A figura 8 ilustra a atividade imunogênica (humoral) do produto imunogênico KLH-VEGF humano, por determinação do poder neutralizante de anticorpos obtidos após imunização, frente à atividade angiogênica da proteína VEGF, medida pela proliferação das células endoteliais.
[0038] A figura 9: ilustra a atividade imunogênica (humoral) do produto imunogênico KLH_IL4 murino por determinação do título anticorpo obtido após imunização.
[0039] A figura 10 ilustra a atividade imunogênica (humoral) do produto imunogênico KLH_IL4 murino por determinação do poder neutralizante dos anticorpos obtidos após imunização, frente à atividade de indução da proliferação das células TH-2 por IL4.
[0040] A figura 11 ilustra os resultados da produção de anticorpo de classe IgG e IgE dirigidos contra o Bet v 1, após injeção de pólen de bétula, aos camundongos previamente imunizados com um produto imunogênico de acordo com a invenção compreendendo heterocomplexos KLH- IL4. A figura 12 ilustra a atividade imunogênica (humoral) do produto imunogênico KLH-IL4 humano por determinação do poder neutralizante dos anticorpos obtidos após imunização, frente à atividade de indução da proliferação das células TF-1 por IL4.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
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9/78 [0041] A invenção fornece novas construções imunogênicas induzindo um alto nível de produção de anticorpos específicos de um antígeno de interesse, junto ao indivíduo.
Os heterocomplexos proteicos imunogênicos da invenção [0042] Demonstrou-se, de acordo com a invenção, que a produção de um alto nível de anticorpos específicos de um antígeno de interesse era obtido, em um indivíduo, por imunização deste indivíduo com um produto imunogênico no qual o referido antígeno de interesse é associado com uma molécula proteica transportadora, a associação entre o referido antígeno de interesse e a referida proteína transportador sendo parcialmente covalente e parcialmente não covalente.
[0043] Mais especificamente, mostrou-se, de acordo com a invenção, que uma excelente resposta anticorpo contra um antígeno de interesse é obtida quando se imuniza um indivíduo com um produto imunogênico estável compreendendo heterocomplexos proteicos, em que os heterocomplexos são constituídos por associações estável entre o referido antígeno de interesse e a referida molécula proteica transportadora e em que apenas uma fraca proporção de associações são devidas a uma ligação covalente entre o antígeno de interesse e a molécula proteica transportadora, as outras associações entre o antígeno de interesse e a molécula proteica transportadora são realizadas por ligações fracas interações iônicas, ligações hidrogênios, forças de Van der Waals, etc.
[0044] Particularmente, mostrou-se de acordo com a invenção que uma resposta de anticorpo ótima é atingida quando, em um produto imunogênico estável como descrito acima, menos de 40 por cento das moléculas de antígeno de interesse são ligadas por uma ligação covalente com as moléculas proteicas transportadoras. De acordo com a invenção, uma molécula de antígeno de interesse ligada a uma molécula proteica transportadora por “uma” ligação covalente significa que a referida molécula de antígeno de interesse é ligada de modo covalente, quimicamente, à referida molécula proteica transportadora, por pelo menos uma ligação covalente, isto é eventualmente por duas ligações covalentes ou mais.
[0045] A porcentagem das moléculas proteicas transportadoras e proteínas
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10/78 antigênicas de interesse ligadas entre si por ligações covalentes em um produto imunogênico da invenção pode ser facilmente verificada pelo versado.
[0046] Por exemplo, a determinação da porcentagem das moléculas de antígeno de interesse ligadas às moléculas de proteína transportadora por uma ligação covalente em um produto imunogênico da invenção pode ser realizada de acordo com as etapas seguintes:
(i) submeter o referido produto imunogênico em solução em condições desnaturantes e redutoras, (ii) realizar uma etapa de cromatografia de exclusão de tamanho com o produto obtido no fim da etapa (ii) durante o que os diferentes componentes proteicos de massa molecular decrescentes são eluídos sucessivamente do suporte de cromatografia de exclusão de tamanho, (iii) medir a quantidade de antígeno de interesse ligado por uma ligação covalente à molécula transportadora na fração de eluado contendo os componentes proteicos tendo a mais elevada massa molecular, (iv) comparar a quantidade de antígeno de interesse medida na etapa (iii) com a quantidade total de antígeno de interesse incluído inicialmente no produto imunogênico de partida.
[0047] Na etapa (i) do processo de determinação da porcentagem de ligações covalentes descrita acima, a incubação de uma quantidade dada (em número de mols ou em peso) do produto imunogênico da invenção nas construções desnaturantes e redutores acarreta uma dissociação das ligações fracas entre os diferentes componentes proteicos não ligados entre si por uma ligação covalente.
[0048] As condições desnaturantes preferidas são a presença de uréia, por exemplo em uma concentração final 8M, ou ainda a presença de SDS, por exemplo a uma concentração final de 1 % em peso total da solução contendo o produto imunogênico. Nas condições redutoras preferidas são a presença de βmercaptoetanol, por exemplo a uma concentração final de 5% do volume total da solução contendo o produto imunogênico.
[0049] A etapa (ii) do processo de determinação da porcentagem de moléculas de
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11/78 antígeno de interesse e moléculas de proteína transportadora ligadas entre si por ligações covalentes, o suporte de cromatografia de exclusão de tamanho é escolhido pelo versado de acordo com seus conhecimentos gerais técnicos. Por exemplo, o versado na arte pode ter recurso aos suportes de cromatografia comercializados por Pharmacia sob os nomes comerciais de “Superdex 75 ™”, e “Superdex 200 ™”.
[0050] Na etapa (ii), a fração molecular correspondendo à molécula transportadora ligada de modo covalente às moléculas de antígeno de interesse é eluída em primeiro lugar, tendo a ou as frações de eluado contendo o antígeno de interesse sob forma livre. O antígeno de interesse que é eluído sob forma livre corresponde à fração de antígeno de interesse, que não foi ligado por uma ligação covalente à molécula transportadora, no seio do produto imunogênico de partida. É sobre a fração proteica de alta massa molecular que é realizada a medida da quantidade de antígeno de interesse ligada de modo covalente à molécula proteica transportadora, por exemplo por um teste imuno-enzimático, em um teste radioimunológico, ou em um teste por imunofluorescência, direta ou indireta (“Sandwich”), usando anticorpos específicos de antígeno de interesse e que não apresentam nenhuma reação imunológica cruzada com a molécula proteica transportadora.
[0051] Na etapa (iii), compara-se a quantidade de antígeno de interesse ligada de modo covalente à molécula proteica transportadora, que foi medida como descrito acima, à quantidade inicial de antígeno de interesse incluído inicialmente na quantidade dada (em número de mols ou em peso) do produto imunogênico de partida, e calcula-se assim a porcentagem de antígeno de interesse que está ligada de modo covalente à molécula proteica transportadora, no produto imunogênico da invenção.
[0052] A porcentagem de moléculas proteicas transportadoras e de proteínas antigênicas de interesse ligadas entre si por ligações covalentes, em um produto imunogênico da invenção, pode ser igualmente facilmente verificada por um versado na arte de acordo com um segundo método compreendendo as etapas seguintes:
a) imobilização sobre um suporte de anticorpos dirigidos especificamente contra a proteína transportadora;
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b) colocação em contato com anticorpos contra a proteína transportadora que foram imobilizados sobre o suporte na etapa a) com uma quantidade conhecida de moléculas de produto imunogênico a testar compreendendo a referida proteína transportadora e uma proteína antigênica de interesse;
c) eliminação das moléculas do produto imunogênico que não foram ligadas aos anticorpos anti-proteína transportadora imobilizadas na etapa a) com a ajuda de uma solução aquosa tampão compreendendo um ou vários agentes desnaturantes das proteínas;
d) a1) colocação em contato (i) dos complexos imunogênicos formados na etapa c) entre os anticorpos anti-proteína transportadora imobilizados e as moléculas de produto imunogênico com (ii) os anticorpos dirigidos especificamente contra a proteína transportadora;
d2) separadamente da etapa d1), colocação em contato (i) dos complexos imunogênicos formados na etapa c) entre os anticorpos anti-proteína transportadora imobilizados e as moléculas do produto imunogênico com (ii) anticorpos dirigidos especificamente contra a proteína antigênica de interesse;
e) e1) quantificação dos anticorpos adicionados à etapa d1) que são ligados à proteína transportadora;
e2) quantificação dos anticorpos adicionados na etapa d2) que são ligados à proteína antigênica;
f) cálculo da relação entre:
(i) a quantidade de anticorpos fixados anti-proteína transportadora medida na etapa e1), e (ii) a quantidade de anticorpos fixados anti-proteína antigênica medida na etapa e2), [0053] a referida relação consistindo na proporção de moléculas proteicas transportadoras e moléculas de proteína antigênica de interesse que são ligadas entre si por ligações covalentes, no seio do produto imunogênico de partida.
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13/78 [0054] Na etapa c) do processo acima, a utilização de uma solução aquosa de lavagem contendo um ou vários agentes de desnaturação das proteínas acarreta uma desnaturação do produto imunogênico fixado aos anticorpos anti-proteína transportadora, o que tem por efeito liberar na solução de lavagem as moléculas de proteína antigênica de interesse que não são ligadas por uma ligação covalente às moléculas de proteína transportadora. Assim, na etapa d2) do processo, somente as moléculas de proteína antigênica de interesse que são ligadas por ligações covalentes às moléculas de proteína transportadora são quantificadas.
[0055] Preferivelmente, a solução tampão desnaturante utilizada na etapa (c) contém um agente tensoativo, como Tween ® 20, na concentração final de 0,1% v/v. [0056] Nas etapas d1) e d2), as quantidades de anticorpos fixados são preferivelmente medidas por incubação de complexos antígenos- anticorpos formados no fim de cada uma destas etapas com um novo anticorpo que é marcado por uma molécula detectável, respectivamente;
(i) na etapa d1) um novo anticorpo dirigido contra o anticorpo anti-proteína transportadora e marcado por uma molécula detectável;
(ii) na etapa d2), um novo anticorpo dirigido contra o anticorpo anti-proteína antigênica de interesse e marcado por uma molécula detectável.
[0057] A molécula detectável é indiferentemente uma molécula radioativa, uma molécula fluorescente ou uma enzima. Como enzima, pode-se usar notadamente a peroxidase, cuja presença é revelada por colorimetria após incubação com o substrato orto-fenilenodiamina (OPD).
[0058] Um protocolo detalhado do processo acima é descrito nos exemplos.
[0059] A título ilustrativo, mostrou-se de acordo com a invenção, com a ajuda do primeiro ou segundo processo de quantificação descritos acima, que
- no produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos entre a molécula transportadora KLH e as moléculas de interferon alfa humano, dd 3% a 8% de moléculas de interferon alfa são ligadas de modo covalente à molécula proteica transportadora KLH;
- no produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos entre a
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14/78 molécula proteica transportadora KLH e as moléculas de IL-4 murino, cerca de 11% das moléculas de IL-4 são ligadas de modo covalente à molécula proteica transportadora KLH.
[0060] É evidente que, de acordo com as preparações, a porcentagem de moléculas de proteína antigênica de interesse ligadas por uma ligação covalente ás moléculas de proteínas transportadoras pode variar de modo significativo. Todavia, em todos os casos, esta porcentagem é sempre inferior a 40%.
[0061] A invenção tem por objeto um produto imunogênico estável para a indução de anticorpos contra uma ou várias proteínas antigênicas em um indivíduo, caracterizada em que compreende heterocomplexos imunogênicos proteicos constituídos por associações entre (i) as moléculas de proteínas antigênicas e (ii) moléculas proteicas transportadoras e em que menos de 40 por cento das proteínas antigênicas (i) são ligadas por uma ligação covalente com as moléculas proteicas transportadoras (ii).
[0062] A invenção tem também por objeto um produto imunogênico estável compreendendo heterocomplexos imunogênicos proteicos para a indução de anticorpos contra uma ou várias proteínas antigênicas em um indivíduo, cada heterocomplexo compreendendo (i) uma pluralidade de proteínas antigênicas, ligadas a (ii) uma molécula proteica transportadora, caracterizada em que, no referido produto imunogênico, menos de 40 por cento das proteínas antigênicas (i) são ligadas por uma ligação covalente com as moléculas proteicas transportadoras (ii).
[0063] De modo totalmente preferido, os anticorpos cuja produção é induzida pelo produto imunogênico da invenção consistem em anticorpos “neutralizantes” ou “bloqueadores”. Um anticorpo “neutralizante” ou um anticorpo “bloqueador” é definido, de acordo com a invenção, como um anticorpo cuja fixação sobre a proteína nativa de marcação bloqueia a atividade biológica desta proteína nativa, o que é um objetivo importante procurado pela invenção, quando a proteína nativa contra a qual os anticorpos são dirigidos possui uma atividade biológica deletéria para o organismo, no contexto patológico visado de um indivíduo a tratar, por exemplo quando a proteína nativa possui uma atividade angiogênica, uma atividade imunossupressora ou ainda
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15/78 uma atividade alergênica, notadamente uma atividade de indução da produção de interleucina-4.
[0064] Por “molécula proteica transportadora” incluída no produto imunogênico da invenção, entende-se qualquer proteína ou peptídeo de pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, qualquer que seja sua seqüência em aminoácidos, e que, em associação de modo parcialmente covalente às moléculas de antígeno de interesse para formar os heterocomplexos proteicos constitutivos do produto imunogênico da invenção, permite a apresentação de um grande número de moléculas de antígenos de interesse aos linfócitos B.
[0065] De acordo com um primeiro aspecto, uma molécula proteica transportadora consiste em uma proteína ou um peptídeo de pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, ou ainda um oligômero de um tal peptídeo, compreendendo um ou vários epítopos T auxiliares (“helper”) capazes de ativar os linfócitos T auxiliares (T helper”) de organismo hospedeiro para a produção de citocinas, compreendendo ai a interleucina 2, citocinas que vão por sua vez ativar e induzir a proliferação de linfócitos B, os quais, após maturação, irão produzir anticorpos contra a proteína antigênica (i). [0066] De acordo com um segundo aspecto, uma molécula proteica transportadora consiste em uma proteína ou um peptídeo de pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, ou ainda em um oligômero como um tal peptídeo, compreendendo além disso ou vários epítopos T auxiliares (“helper”) descrito no primeiro aspecto acima, um ou vários epítopos T-citotóxicos capazes de induzir uma resposta imune celular por produção de linfócitos T-citotóxicos específicos da molécula proteica transportadora, os linfócitos sendo capazes de reconhecer especificamente as células expressando em sua superfície a referida proteína transportadora ou qualquer peptídeo que seja derivado, em associação com as moléculas classes I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Conforme o caso, a molécula proteica transportadora consiste em um oligômero de uma proteína ou um peptídeo compreendendo além disso um ou vários epítopos T helper, ou um ou vários epítopos T-citotóxicos definidos acima.
[0067] De acordo com um terceiro aspecto, uma molécula proteica transportadora
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16/78 consiste em uma proteína ou um peptídeo de pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, ou ainda um oligômero de um tal peptídeo, compreendendo além disso ou vários epítopos T auxiliares (“helper”) definido no primeiro aspecto, um ou vários epítopos B, capazes de induzir a produção da anticorpos pelos linfócitos dirigidos contra a proteína transportadora.
[0068] Em algumas formas de realização, a proteína transportadora, além de sua função T helper, utilizada para ativar uma resposta anticorpo contra o antígeno de interesse, pode também ativar uma resposta citotóxica contra as células transportadoras de peptídeos do veículo e/ou estimular uma resposta anticorpo contra a molécula proteica transportadora.
[0069] A molécula proteica transportadora pode também consistir em um homooligômero ou um homo-polímero de uma proteína nativa da qual ela deriva ou ainda em um homo- oligômero ou homo-polímero de um fragmento peptídico da proteína nativa da qual ela deriva. A molécula proteica transportadora pode também consistir em um hetero- oligômero ou em um hetero-polímero compreendendo uma combinação de vários fragmentos peptídicos distintos inicialmente incluídos na proteína nativa da qual ela deriva.
[0070] Por “proteína antigênica” entende-se, de acordo com a invenção, qualquer proteína ou qualquer peptídeo de pelo menos 10 aminoácidos de comprimento, compreendendo um peptídeo hapteno, suscetível de ser reconhecido especificamente pelos receptores para o antígeno expresso pelos linfócitos B de um organismo hospedeiro, humano ou animal, particularmente qualquer mamífero, a qual proteína antigênica, uma vez incluída no produto imunogênico da invenção, estimula a produção de anticorpos reconhecendo a referida proteína antigênica.
[0071] Pela “proteína antigênica” entende-se também qualquer proteína compreendendo um ou vários epítopos B da proteína antigênica nativa contra a qual a produção de anticorpos é procurada. A referida molécula de interesse antigênica pode consistir na própria proteína nativa ou um derivado proteico da proteína nativa, como um fragmento peptídico da proteína nativa, ou ainda qualquer forma biologicamente inativada da proteína nativa obtida por tratamento químico, físico ou
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17/78 por mutação genética. A proteína de interesse antigênica pode também consistir em um homo- oligômero ou homo-polímero da proteína nativa ou ainda em um homooligômero ou homo-polímero de um fragmento peptídico da proteína nativa. A proteína de interesse antigênica pode também consistir em um hetero- oligômero ou em um hetero-polímero compreendendo uma combinação de vários fragmentos peptídicos distintos inicialmente incluídos na proteína nativa.
[0072] Em um produto imunogênico de acordo com a invenção, com vantagem menos de 30 por cento, e preferivelmente menos de 20 por cento das proteínas antigênicas (i) são ligados por uma ligação covalente com as moléculas proteicas transportadoras (ii).
[0073] Em um produto imunogênico de acordo com a invenção, com vantagem pelo menos 1 por cento, e preferivelmente pelo menos 2 por cento das proteínas antigênicas (i) são ligados com as moléculas transportadoras (ii) por uma ligação covalente.
[0074] Mostrou-se que um produto imunogênico da invenção, como definido acima, era estável em solução aquosa. A estabilidade de um produto imunogênico da invenção é notadamente caracterizada em que o referido produto imunogênico possui um ponto isoelétrico apropriado, distinto do ponto isoelétrico de pelo menos um de seus componentes proteicos, respectivamente a proteína antigênica (i) e a molécula proteica transportadora (ii), e que migra consequentemente de acordo com uma banda proteica distinta de, pelo menos, uma das bandas proteicas correspondendo respectivamente aos dois elementos proteicos que o constituem nos testes de isoeletrofocalização.
[0075] Observou-se também, por testes de “imuno-impressões (“Western blot) que o produto imunogênico da invenção migrava em gel de eletroforese, em condições não desnaturadas, de acordo com uma única banda proteica, o que ilustra o fato de que o referido produto imunogênico se apresenta sob a forma de uma população homogênea de construções proteicas solúveis.
[0076] Além disso, mostrou-se que a proteína antigênica (a) assim como a molécula proteica (ii) incluídos sob forma de heterocomplexos proteicos no produto
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18/78 imunogênico da invenção, eram todos os dois reconhecidos pelos anticorpos reconhecendo especificamente cada uma destas proteínas. Assim, o produto imunogênico de acordo com a invenção compreende a proteína antigênica (i) e a molécula proteica transportadora (ii) em sua conformação nativa. Esta característica técnica do produto imunogênico de acordo com a invenção é particularmente vantajosa para a indução de uma resposta imune contra os antígenos nativos, isto é, uma resposta imune eficaz e realmente protetora do organismo hospedeiro. Mostrouse, particularmente, que um produto imunogênico de acordo com a invenção induzia, no organismo hospedeiro no qual ele era administrado, a indução de uma forte resposta humoral eficaz contra os antígenos nativos acompanhados da produção de anticorpos neutralizantes ou bloqueadores frente à atividade biológica deletéria destes antígenos nativos.
[0077] Mostrou-se, de acordo com a invenção, com diversos antígenos de interesse, que a resposta imune humoral obtida com um produto imunogênico como definido acima era superior em 10 a 1000 vezes a resposta imune humoral obtida com uma administração de um conjugado covalente clássico entre o antígeno de interesse e a molécula proteica transportadora.
[0078] Preferivelmente, em um heterocomplexo imunogênico incluído no produto imunogênico da invenção, a pluralidade de proteínas antigênicas (i) é constituída por uma pluralidade de exemplares de uma proteína antigênica única.
[0079] Assim, de acordo com uma forma de realização completamente preferida, o produto imunogênico da invenção é empregado para a obtenção de anticorpos específicos contra um único antígeno de interesse.
[0080] Mostrou-se também de acordo com a invenção que um produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos imunogênicos como definidos acima era particularmente bem adaptado à imunização de um indivíduo, pela produção de anticorpos, contra um antígeno de interesse do “auto-antígeno” (“selfantigen”), isto é contra uma proteína produzida normalmente pelo referido indivíduo, para o qual existe uma tolerância do sistema imune, particularmente uma deleção pelo menos parcial dos clones de linfócitos T auxiliares (células T helper), reconhecendo
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19/78 especificamente o referido antígeno.
[0081] Em outros termos, a apresentação de um “auto”- antígeno às células do sistema imune do referido indivíduo, sob a forma de produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos imunogênicos da invenção, permite “quebrar” a tolerância do sistema imune do indivíduo frente a este antígeno. Sem desejar estar limitado por qualquer teoria, o requerente pensa que a possibilidade de obter um alto nível de resposta anticorpo contra um anticorpo do “auto-antígeno” é devido à presença, no seio do heterocomplexo, de numerosos epítopos de tipo “T auxiliar” (ou T helper) transportados pela molécula proteica transportadora, que ativam os linfócitos T auxiliares, e que as diversas citocinas produzidas pelos linfócitos T auxiliares ativados, notadamente IL-2, permite promover uma ativação das células B aos “auto”antígenos presentes no estado dormente no organismo, e romper assim a tolerância imune das células B aos ‘auto”- antígenos.
[0082] Assim, de acordo com uma forma de realização preferida, o produto imunogênico da invenção é caracterizado em que as proteínas antigênicas (i) são constituídas por uma pluralidade de exemplos de uma proteína normalmente reconhecida como uma proteína do “próprio” pelas células do sistema imune do referido indivíduo.
[0083] Devido ao fato da maior proporção, mais de 60 por cento, das associações entre o antígeno de interesse e a molécula proteica transportadora são realizadas pelas interações não covalentes, não existe nenhuma limitação teórica no número de moléculas de antígeno de interesse associadas a uma única molécula proteica transportadora, além da acessibilidade estereoquímica das moléculas de antígeno de interesse a esta molécula transportadora. Particularmente, o número de moléculas de antígeno de interesse associadas a uma mesma molécula proteica transportadora não é limitado pelo número de funções quimicamente reativas transportadas pela molécula transportadora permitindo a criação de ligações covalentes com uma pluralidade de moléculas de antígeno de interesse. Consequentemente, o único limite físico parece ser o número de sítios da molécula proteica transportadora (ii) que são acessíveis à proteína antigênica (i).
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20/78 [0084] Pelas mesmas razões, o tamanho do antígeno de interesse a associar à molécula proteica transportadora não é também mais estritamente limitado, o antígeno de interesse podendo consistir, consequentemente, em proteínas completas de pelo menos 10 kDa, como as diferentes citocinas como IL-4, IL-10, o VEGF, ou ainda o interferon alfa.
[0085] Por outro lado, mesmo para os antígenos de interesse consistindo em proteínas completas de uma massa molecular superior a 10 kDa, um heterocomplexo imunogênico da invenção pode compreender uma associação de vários antígenos de interesse em uma mesma molécula transportadora, se o tamanho da proteína transportadora permitir.
[0086] Quando a molécula proteica transportadora é de tamanho pequeno, por exemplo de um tamanho inferior a 10 kDa, ou ainda inferior a 5 kDa, o requerente pensa, sem desejar estar limitado por qualquer teoria, que as associações parcialmente covalentes entre o antígeno de interesse e a referida proteína transportadora, que formam os heterocomplexos proteicos incluídos no produto imunogênico da invenção, permitem uma conformação dos heterocomplexos como que de cada vez o antígeno de interesse e a molécula proteica transportadora são acessíveis aos receptores das células do sistema imune.
[0087] Se trata mesmo de uma vantagem técnica suplementar procurada pelo produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos como definidos acima, porque a apresentação aos linfócitos B de uma pluralidade de exemplos de um antígeno de interesse em uma mesma molécula transportadora, compreendida no heterocomplexo, favorece o fenômeno de “capping” por “reticulação” dos receptores da célula B reconhecendo o antígeno, o que contribui para a ativação da célula B que recebe, assim, os sinais de ativação provenientes das citocinas produzidas pelos linfócitos T auxiliares ativados graças aos epítopos T auxiliares transportados pela molécula proteica transportadora.
[0088] Assim, de acordo com uma forma de realização totalmente preferida do produto imunogênico, este compreende de 5 a 50 proteínas antigênicas (i) para uma molécula proteica transportadora (ii), preferivelmente de 20 a 40 proteínas antigênicas
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21/78 (i) para uma molécula proteica transportadora (ii).
[0089] O número de moléculas de antígenos de interesse em uma única molécula proteica transportadora depende respectivamente do tamanho da molécula transportadora e do tamanho da molécula de antígeno de interesse. Mais a molécula transportadora é espessa e oferece uma grande superfície de associação com o antígeno de interesse, e mais o heterocomplexo imunogênico irá compreender, para uma única das moléculas transportadoras que ele contém, um número elevado de exemplos da molécula de antígeno de interesse. Do mesmo modo, mais a molécula de antígeno de interesse é reduzida, mais o número de exemplos da molécula de antígeno de interesse sobre a mesma molécula transportadora é elevado.
[0090] A título ilustrativo, mostrou-se, de acordo com a invenção, que quando a molécula proteica transportadora é o KLH, de 20 a 40 moléculas de IL-4, de IL-10, de interferon alfa ou de VEGF são associados com cada molécula transportadora.
[0091] Mostrou-se que a solubilidade do produto imunogênico na solução aquosa varia com a modificação dos equilíbrios que regem as interações moleculares no seio dos heterocomplexos, particularmente os equilíbrios eletroquímicos que dependem das ligações ditas “fracas” (não covalentes” ou ainda as concentrações respectivas das proteínas antigênicas e da molécula proteica transportadora, assim como com as condições de força iônica, de pH e de temperatura.
[0092] Preferivelmente, as ligações covalentes entre uma ou várias das proteínas antigênicas (i) e da molécula proteica transportadora (ii) são realizadas por intermédio de um agente químico de ligação bifuncional.
[0093] Um tal agente químico pode ser o brometo de cianogênio, glutaraldeído, carbodiimida ou anidrido sucínico.
[0094] Como carbodiimidas, pode-se usar por exemplo os compostos seguintes: 1-ciclohexil-3- (2-morfolinil- (4-etil) carbodiimida (CMC), 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e 1 -etil-3- (4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida, 1 -ciclohexil-3(2-morfolinil- (4-etil) carbodiimida, (1-etil-3- (3-dimetiaminopropil carbodiimida (EDC) e 1-etil-3- (4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida.
[0095] Como agentes de copulação homo-bifuncionais, pode-se citar os
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22/78 compostos seguintes:
- ésteres de N-hidroxisucsinimida, ditiobis (sucinimidilpropionato), disucinimidil suberato, e disucinimidil tartrato; os imidoésteres bifuncionais dimetil adipimidato, dimetil pimelimidato, e dimetil suberimidato;
- os agentes reativos com uma sulfidrila, 1,4-di- [3'- (2’-piridiltio) propionamido] butano, bismaleimidohexano, e bis-N-maleimido-1, 8octano;
- os halogenetos bifuncionais do tipo arila 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno e
4.4’-difluoro-3,3’-dinitrofenilsulfona;
- o SMCC (sucinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato);
- o SIAB (N-sucinimidil (4-iodoacetil) aminobenzoato),
- o SMPB (sucinimidil-4- (p-maleimidofenil) butirato),
- o GMBS (N- (.gama.-maleimidobutirilóxi) sucinimida éster),
- o MPBH (4- (4-N-maleimidopohenil) ácido butírico hidrazida);
- o M2C2H (4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxil-hidrazida),
- o SMPT (sucin-imidiloxicarbonil-.alfa.-metil-.alfa.- (2-piridiltio) tolueno); e o
- SPDP (N-sucinimidil 3-(2-piridiltio) propionato).
[0096] Preferivelmente, o agente químico de ligação usado compreende ao menos duas funções aldeído reativas.
[0097] De modo totalmente preferido, o agente químico de ligação é o glutaraldeído.
[0098] Após formação do produto compreendendo os heterocomplexos proteicos graças à copulação de moléculas proteicas transportadoras com as proteínas antigênicas com a ajuda do agente químico de ligação, o produto obtido pode ser estabilizado graças a um agente de estabilização das proteínas, como o formaldeído, susceptível de criar ligações intra-cadeia.
[0099] Os produtos imunogênicos compreendendo os heterocomplexos imunogênicos da invenção se apresentam sob a forma de micro-partículas solúveis
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23/78 em solução, particularmente em solução aquosa, cujo tamanho médio varia de acordo com (i) o tamanho da molécula proteica transportadora, (ii) o tamanho e o número de proteínas antigênicas associadas a uma mesma molécula proteica transportadora e (iii) o número de moléculas transportadoras associadas às proteínas antigênicas presentes em uma partícula de heterocomplexo.
[0100] Observou-se que as micro-partículas de heterocomplexos descritas nos exemplos tenham um tamanho médio variando de 100 mn a 300 nm.
[0101] De modo mais preferido, um produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos proteicos imunogênicos da invenção compreende exclusivamente as moléculas transportadoras associadas às proteínas antigênicas, com a exclusão de qualquer outro material. Particularmente, um heterocomplexo da invenção não compreende nenhum material polímero, proteico ou não proteico, além das proteínas transportadoras e antigênicas que o caracterizam.
[0102] Recentemente, ZAGURY D et al (2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, (14): 8024- 8029) em um estudo bibliográfico, sugerem induzir uma imunidade anti-citocina junto aos pacientes a fim de contra-atacar a produção anormal nas patologias de algumas citocinas, notadamente as interleucinas, linfocinas, monocinas, interferons que atuam fisiologicamente nos tecidos, localmente como fator de proliferação, de diferenciação ou de morte programa celular.
[0103] Estes autores precisam que as estratégias de terapêutica de vacinação foram, até agora, exclusivamente marcadas sobre o agressor antigênico, qualquer que fosse um microorganismo, uma célula ou um alergênio, mas nunca procuraram combater a desregulação das citocinas induzidas sob o efeito do agressor. Estes autores propõem uma vacinação anti-citocina como que anterior a uma vacinação convencional, cujo fim seria neutralizar ou bloquear os efeitos imunotóxicos do estroma, e permitir o desenvolvimento normal da reação imune adaptada contra o agressor antigênico.
[0104] Além disso, trabalhos anteriores da requerente, relatados no pedido internacional publicado sob o WO 00/03732, mostraram que, no caso de leucemia ATL, câncer do colo uterino, e sarcoma de Kaposi, respectivamente três proteínas
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24/78 estavam implicadas em uma imunossupressão loca ao nível de tumores ou de células infectadas por HIV 1:
- a proteína Tax de víurus HTLV 1,
- proteína E7 de papilomavírus e
- a proteína Tat de vírus HIV-1.
[0105] A requerente também descreveu que algumas destas proteínas imunossupressoras, como as proteína Tat de HIV1 e a proteína E7 de HPV (cepas 16 e 18) tem igualmente efeitos ativadores sobre as células endoteliais vasculares.
[0106] Assim, a requerente consequentemente propôs a elaboração de vacinas anti-câncer e anti-virais compreendendo um composto imunogênico derivado desintoxicado de uma proteína proveniente das células cancerosas, células infectadas por um vírus e células imunes estromais, inicialmente imunossupressiva e/ou angiogênica com ação local, como por exemplo uma proteína derivada da proteína Tat do vírus HIV 1, a proteína Tax de um vírus HTLV1, a proteína E7 de um papilomavírus ou ainda uma lectina mannano-dependente, sob uma forma inativada.
[0107] Ora, foi demonstrado, de acordo com a invenção, que o produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos imunogênicos como definidos acima permitia a indução de uma forte resposta anticorpo contra as diferentes moléculas antigênicas deletérias acima.
[0108] De acordo com um primeiro aspecto, no heterocomplexo imunogênico da in, a ou as proteínas antigênicas (i) consistiam em citocinas produzidas naturalmente pelo referido indivíduo.
[0109] De modo preferido, a ou as proteínas antigênicas (i) são escolhidas dentre a interleucina-4, o interferon alfa, o interferon gama, o VEGF, a interleucina 10, o TNF alfa, o TGF beta, a interleucina 5 e a interleucina 6.
[0110] De acordo com um segundo aspecto, a ou as proteínas antigênicas (i) constitutivas de um heterocomplexo imunogênico da invenção são as proteínas imunossupressoras ou angiogênicas ou as proteínas derivadas de proteínas imunossupressoras ou angiogênicas.
[0111] De modo preferido, a ou as proteínas antigênicas (i) são escolhidas dentre
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25/78 a proteína E7 de um papilomavírus, a proteína Tat do vírus HIV!, a proteína Taxa de um vírus HTLV 1 ou HTLV 2 e a proteína p53 do indivíduo.
[0112] De acordo com um terceiro aspecto, a ou as proteínas antigênicas (i) constitutivas de um heterocomplexo imunogênico da invenção são proteínas tóxicas em baixa dose, para o homem ou para um mamífero não humano. Se trata, mais particularmente, de diversas proteínas que são letais para o homem em uma dose inferior a 1 mg, inferior a 100 pg, inferior a 10 μ g, até mesmo inferior a 1 pg. Se trata, em prioridade, de proteínas tóxicas suscetíveis de serem usadas para a fabricação de armas ditas “biológicas”, como a ricina, as toxinas botulínicas, as enterotoxinas de estafilococo, ou ainda uma proteína tóxica de anthrax. (EF, LF, PA).
[0113] A molécula proteica transportadora (ii) incluída em um heterocomplexo proteico imunogênico da invenção pode ser uma molécula transportadora usada convencionalmente em imunologia, como o KLH, a ovalbumina, a albumina sérica bovina (ASB), o tétano toxóide, a toxina colérica B, etc.
[0114] Além disso, no produto imunogênico da invenção, a molécula proteica transportadora pode ser escolhida de modo a induzir ou para estimular, além da produção de linfócitos T helper, uma resposta imune citotóxica e/ou humoral contra ela mesma e de sua contra-parte da proteína nativa no organismo hospedeiro, respectivamente, pela ativação de linfócitos T citotóxicos e de linfócitos B específicos desta molécula transportadora.
[0115] Esta forma de realização particulada do produto imunogênico da invenção é particularmente útil quando se procura simultaneamente uma resposta de anticorpo eficaz contra uma proteína deletéria imunossupressora ou angiogênica, notadamente para a produção de anticorpos neutralizantes ou bloqueadores, e uma resposta imune celular efetuada pelos linfócitos T citotóxicos dirigidos contra as células apresentando em sua superfície o antígeno nativo associado às moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (CMH), por exemplo um antígeno de um patógeno como o vírus de HIV1 ou um papilomavírus, ou um antígeno especificamente expresso nas células cancerosas, como CEA, p53, Di12, etc.
[0116] Assim, de acordo com esta forma de realização particular, o produto
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26/78 imunogênico da invenção é caracterizado em que a molécula proteica transportadora (ii) é uma proteína imunogênica induzindo, além da produção de linfócitos T helper, a produção de linfócitos T citotóxicos dirigidos contra as células apresentando, em sua superfície, a referida molécula proteica transportadora, ou qualquer peptídeo que é derivado da mesma, em associação com moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e/ou a produção de anticorpos pelos linfócitos B dirigidos contra a proteína transportadora.
[0117] Assim, os produtos imunogênicos compreendendo heterocomplexos imunogênicos da invenção constituem meios imunológicos eficazes para a vacinação terapêutica ativa de um indivíduo, quer seja um mamífero humano quer seja um mamífero não humano, contra uma grande diversidade de patologias.
[0118] Os exemplos ilustrativos de composição de heterocomplexos imunogênicos contidos em um produto imunogênico de acordo com a invenção para prevenir ou tratar, por uma vacinação terapêutica ativa, patologias diversas são indicados abaixo.
a) para a prevenção ou o tratamento da AIDS:
- molécula proteica transportadora (ii): as proteínas gp 120,gp 160, p24, p17, nef, ou Tat do vírus HIV1, desintoxicadas ou estabilizadas, se isto for necessário, dos fragmentos imunogênicos destas proteínas ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada das mesmas. (Zagury, et al, 1998).
[0119] Pode-se também usar a proteína gp120 mimotopo que é descrita por Fouts et al (2000) e por Fouts et al (2002).
- proteína antigênica (i): as proteínas Tat, IFN α, IL10 e TGF β, desintoxicadas, se isto for necessário, dos fragmentos imunogênicos destas proteínas ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada das mesmas.
b) Para a prevenção ou o tratamento do câncer do cólon uterino:
- molécula proteica transportadora (ii): as proteínas L1, L2, e E7 do papilomavírus, preferivelmente de um papilomavírus da cepa 16 e 18,
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27/78 desintoxicadas ou estabilizadas, se isto for necessário, dos fragmentos imunogênicos destas proteínas ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada das mesmas (Le Buanec et al, 1999).
- proteína antigênica (i): as proteínas E7, IFN α, IL 10, TGF β, TNF α, e
VEGF, desintoxicadas ou estabilizadas, se isto for necessário, dos fragmentos imunogênicos destas proteínas ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada.
c) Para a prevenção ou o tratamento da leucemia ATL, induzida pelos vírus
HTLV1 ou 2
- molécula proteica transportadora (ii) das proteínas gp61 e Tax dos vírus
HTLV1 ou 2, desintoxicadas ou estabilizadas, se isto for necessário, dos fragmentos imunogênicos destas proteínas ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada (Cowan et al, 1997, Mori et al, 1996).
- proteínas antigênicas (i): as proteínas Tax, IL 10, IFN α, ou TGF β, TNF α, VEGF, desintoxicadas dos fragmentos imunogênicos destas proteínas ou ainda proteína que é derivada.
d) para a prevenção ou o tratamento do câncer do cólon:
- molécula proteica transportadora (ii): as proteínas CEA e p53, desintoxicadas, se isto for necessário, dos fragmentos imunogênicos destas proteínas ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada (Zusman et al, 1996).
- proteína antigênica (i): as proteínas IFN α, TGF β, IL 10, FasL e VEGF, desintoxicadas dos fragmentos peptídicos imunogênicos destas proteínas ou ainda proteína que é derivada.
e) para a prevenção ou o tratamento do câncer do seio:
- molécula proteica transportadora (ii): a proteína DI12, os fragmentos imunogênicos desta proteína ou ainda uma proteína que é derivada (Yoshiji et al, 1996).
- proteína antigênica (i): as proteínas TGF β, TNF α, e VEGF, desintoxicadas se necessário, dos fragmentos imunogênicos destas
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28/78 proteínas ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada.
f) para a prevenção ou o tratamento do câncer do pâncreas:
- molécula proteica transportadora (ii) a proteína CaSm, desintoxicadas se necessário, dos fragmentos imunogênicos desta proteína ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada.
- proteína antigênica (i): as proteínas VEGF e TNF α, desintoxicadas ou estabilizadas, se necessário, dos fragmentos imunogênicos destas proteínas ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada.
g) para a prevenção ou o tratamento de câncer da próstata:
- molécula proteica transportadora (ii): as proteínas OSA e ETS2, desintoxicadas ou estabilizadas, se necessário, dos fragmentos imunogênicos destas proteínas ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada.
[0120] (Sementchenko VI et al 1998).
- proteína antigênica (i): as proteínas IL6 e TGF β, desintoxicadas ou estabilizadas, se necessário, dos fragmentos imunogênicos destas proteínas ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada. (Adler et al, 1999).
h) Para a prevenção ou o tratamento de algumas alergias:
- molécula proteica transportadora (ii) é escolhida dentre os alogênios moleculares, como as proteínas Bet v 1 (pólen de bétula), Der p 1 (ácaro), e Fel d 1 (gato), seus fragmentos peptídicos imunogênicos ou ainda uma proteína imunogênica que é derivada. O antígeno Bet v 1 é descrito notadamente por Ferreira et al (1993), o antígeno Der p 1 é descrito notadamente por Tovey et al (1981), e o antígeno Fel d 1 é descrito notadamente por Morgestern et al (1991).
- proteína antigênica (i): ela induz a produção de anticorpos neutralizantes ou bloqueadores contra o fator citocínico IL4, que é produzido principalmente pelos linfócitos T de tipo Th2, que orientam a resposta imune humoral para a produção de anticorpos de isotipos IgE. De
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29/78 acordo com uma outra forma de realização, a proteína antigênica (i) induz a produção de anticorpos neutralizantes ou bloqueadores contra o fator citocínico IL5, que é produzido principalmente pelos linfócitos T de tipo Th2.
[0121] De acordo com ainda outra forma de realização, a prevenção da alergia pode ser realizada com a ajuda de um produto imunogênico induzindo uma resposta de anticorpo contra um principal efetuador da granulação dos basófilos, os anticorpos de isotipos IgE. Neste fim, a invenção fornece um produto imunogênico compreendendo (I) um anticorpo humano de isotipo IgE e (ii) a proteína Tat inativada de HIV1.
i) Para a prevenção contra as proteínas letais utilizadas nas armas biológicas [0122] Igualmente, um produto imunogênico de acordo com a invenção pode ser usado para imunizar os indivíduos contra numerosos produtos tóxicos usados notadamente nas armas químicas e biológicas, como por exemplo a ricina.
[0123] Dentre as proteínas as mais tóxicas contra as quais uma imunização, principalmente para a produção de anticorpos, é procurada, prefere-se as toxinas botulínicas, a ricina, as enterotoxinas de estafilococo, as toxinas de Clostridium perfringens e as proteínas tóxicas do antrax.
[0124] De modo geral, para realizar um produto imunogênico de acordo com a invenção, em que a proteína antigênica (i) é uma proteína fortemente tóxica do tipo acima, usa-se uma proteína previamente desintoxicada sob a forma de um toxóide. Para desintoxicar a proteína, antes de sua utilização para preparar um produto imunogênico de acordo com a invenção, pode-se usar diversos métodos, e preferivelmente um dos métodos seguintes:
a) tratamento da proteína tóxica nativa pelo glutaraldeído,
b) tratamento da proteína tóxica nativa por ação combinada do formol e glutaraldeído, ou
c) conforme o caso, por modificação química dos grupamentos His e Tyr com a ajuda de reativos apropriados, por exemplo por carboximetilação
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30/78 destes resíduos de aminoácidos.
[0125] Para a prevenção de ação letal de toxinas provenientes de Bacillus anthracis, usa-se, preferivelmente, como proteínas antigênicas (i), uma proteína desintoxicada proveniente de uma toxina de antrax escolhida dentre as proteínas EF (“Edeme factor”), LF (“|Lethal Factor”) e PA (“Protective Antigen”).
[0126] Para a prevenção da ação letal de toxinas provenientes de Clostridium perfringens, usa-se, preferivelmente, como proteína antigênica (i), uma proteína desintoxicada proveniente da toxina Epsilon de Clostridium perfringens.
[0127] Para a prevenção de ação letal de toxinas provenientes de Clostridium botulinum, usa-se preferivelmente como proteínas antigênicas (i) uma proteína desintoxicada proveniente de uma toxina botulínica escolhida dentre as toxinas A, B, C, D, E, F e G que são naturalmente sintetizadas sob a forma de uma cadeia polipeptídica única de 150 kDa, ou ainda o fragmento Hc das toxinas botulínicas, o qual fragmento Hc possui uma massa molecular de cerca de 50 kDa.
[0128] Para produzir as toxinas botulínicas inativadas, o versado na arte pode usar qualquer técnica conhecida, notadamente as usadas para preparar as composições de vacina anteriores, como as descritas por Flock et al, ou por Siegel et al, (Flock, M.A. Cardella, M.A., Gearinger, N. F., J. Immunol., 1963, 90, 697 - 702; Siegel, L. S., J. Clin. Microbiol., 1988, 26, 2351 - 2356).
[0129] Para a prevenção de ação letal de toxinas provenientes do grão de rícino (Ricinus communis), utiliza-se de preferência, como proteína antigênica (i), uma proteína desintoxicada proveniente da toxina do rícino, preferivelmente o fragmento β da ricina.
[0130] Assim, a invenção fornece também um produto imunogênico compreendendo (i) o fragmento β de ricina e (ii) a proteína KLH.
[0131] Para purificar a ricina, o versado na arte pode usar qualquer técnica conhecida, como as descritas por Osborne et al., Kabat et al. ou Kunnitz et al. (Osborne, T. B., Mendel, L. B. e Harris, J. F.: Amer. J. Physiol., 1905, 14, 259 - 269; Kabat, E. A. Heidelberger, M. e Bezer, A. E.: J. Biol. Chem., 1947, 168, 629-; Kunnitz, M. e McDonald, M.: J. Gen. Physiol., 1948, 22, 25-; Moulé, Y.: Bull. Soc. Chim. Biol.,
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1951, 33, 1461 - 1467). Pode-se também usar as técnicas de purificação por cromatografia de afinidade descritas por Tomila et al., Nicolson et al. ou Olsnes et al. (Tomila, M., Kurokawa, T., Onozaki, K. et al.: Experientia, 1972, 28, 84 - 85; Nicolson, G. L. e Blaustein, J.: J. Biochim. Biophys. Acta, 1972, 266, 543 - 547; Olsnes, S. Salvedt, E. e PihI, A.: J. Biol. Chem., 1974, 249, 803 - 810). As cadeias A e B da ricina podem ser purificadas como descrito por Hedge et al. (Hedge, R. e Podder, S. K.,: Eur. Biochem., 1998, 254, 596 - 601).
[0132] Para a prevenção da ação letal de toxinas provenientes de estafilococo, e mais particularmente de Staphylococcus aureus, usa-se, preferivelmente, como proteína antigênica (i), uma proteína desintoxicada proveniente de uma toxina escolhida dentre a SEA (« Staphylococcal Enterotoxin A »), a SEB (« Staphylococcal Enterotoxin B »), a SEC (« Staphylococcal Enterotoxin C »), a SED (« Staphylococcal Enterotoxin D »), a SEE (« Staphylococcal Enterotoxin E »), a SEG (« Staphylococcal Enterotoxin G »), a SEH (« Staphylococcal Enterotoxin H »), a SEI (« Staphylococcal Enterotoxin I ») e a TSST-1 (« Toxin Shock Syndrome Toxin-1 »)., [0133] As enterotoxinas acima podem ser preparadas pelo versado na arte com a ajuda de técnicas descritas nos trabalhos de referência abaixo, em relação com a descrição de cada uma destas toxinas.
[0134] A SEA é sintetizada sob forma de uma enterotoxina precursora de 257 aminoácidos (Huang, I. Y., Hughes, J. L., Bergdoll, M. S. e Schantz, E. J.: J. Biol. Chem. 1987, 262, 7006 - 7013). A toxina madura de massa molecular igual a 27100 Da deriva da toxina precursora por perda de uma seqüência líder hidrofóbica Nterminal de 24 resíduos de aminoácidos (Betley, M. J. e Mekalanos, J. J.: J. Bacteriol., 1998, 170, 34 - 41). SEA existe sob 3 isoformas diferentes por seu PI.
[0135] A proteína precursora de SEB compreende 267 aminoácidos (Mr=31400 Da) com um peptídeo sinal N-terminal de 27 aminoácidos. Seu sítio de fixação ao receptor de células T (« T-Cell Receptor » ou « TCR ») engloba a cavidade de pequena profundidade, enquanto que a molécula de MHC classe II se fixa sobre um sítio adjacente (Kappler, J. W., Herman, A., Clements, J. e Marrack, P.: J. Exp. Med., 1992, 175, 387 - 396; Papageorgiu, A. C., Trauter, H. S. e Acharya, K. R.: J. Mol. Biol., 1998,
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277, 61 - 79; Soos, J. M. e Johnson, H. M.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 201, 596 - 602).
[0136] A SEC apresenta 3 sub-tipos SEC 1, SEC 2 e SEC 3 antigenicamente distintos. A proteína precursora contém 267 resíduos de aminoácidos (Houde, C. J., Hackett, S. P. e Bohach, G. A.: Mol. Gen. Genet., 1990, 220, 329 - 333) com um peptídeo sinal de 27 resíduos de aminoácidos (Bohach, G. A. e Schlievert, P. M.: Infect. Immun., 1989, 57, 2243 - 2252).
[0137] A SED é feita de 258 resíduos de aminoácidos com um peptídeo sinal de 30 resíduos AA. Sua estrutura tridimensional é semelhante à estrutura dos outros super-antígenos bacterianos.
[0138] A SEE, cuja massa molecular é de 26000 Da apresenta 81 % de homologia de seqüência em AA com SEA.
[0139] SEG é constituída por 233 resíduos de aminoácidos (Munson, S.H. Tremaine, M.T. Betle, M.J. e Welch, RA: Infect. Immun. 1998, 66, 3337- 3348).
[0140] A SEH apresenta uma massa molecular de 27 300 Da (Su, Y.C. e Wong, A.C. Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61, 1438- 1443). Ela não dá uma reação imunológica cruzada com as outras enterotoxinas.
[0141] A SEI tem uma seqüência compreendendo 218 resíduos de aminoácidos. É a toxina que apresenta o nível mais baixo de homologia com as outras enterotoxinas.
[0142] A SEJ feita de 269 resíduos de aminoácidos apresenta uma homologia de seqüência em AA elevada com SEA, SEE e SED (64-66%).
[0143] Preferivelmente, um produto imunogênico de acordo com a invenção compreende, em combinação, várias proteínas antigênicas (i) derivadas, cada uma, de uma proteína tóxica acima, por exemplo 2, 3, 4 ou 5 proteínas antigênicas (i) derivadas, cada uma, de uma proteína tóxica acima.
[0144] Por exemplo, um produto imunogênico de acordo com a invenção para a preparação de uma composição de vacina destinada a prevenir a toxicidade das enterotoxinas de estafilococo compreende, preferivelmente, 2, 3, 4 ou 5 proteínas antigênicas (i) derivadas, cada uma, de uma enterotoxina de estafilococo.
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33/78 [0145] De acordo com uma forma de realização particular de um produto imunogênico de acordo com a invenção em que a ou as proteínas antigênicas (i) são derivadas de proteínas altamente tóxicas para o homem, a proteína transportadora consiste da proteína KLH.
[0146] Assim, de acordo com um primeiro aspecto particular de um produto imunogênico da invenção, em que a molécula proteica transportadora induz tanto à produção de linfócitos T auxiliares (“T helper”), linfócitos T citotóxicos e linfócitos B específicos da molécula proteica transportadora, a referida molécula proteica transportadora (ii) é escolhida dentre as proteínas L1, L2 e E7 de um papilomavírus.
[0147] De acordo com um segundo aspecto particular de um produto imunogênico da invenção, em que a molécula proteica transportadora induz, além da produção de linfócitos T auxiliares (“T helper”), a diferenciação de linfócitos T citotóxicos e linfócitos B específicos da molécula proteica transportadora, a referida molécula proteica transportadora (ii) é escolhida dentre as proteínas gp160, p24, p17, Nef e Tat do vírus HIV1.
[0148] De acordo com um terceiro aspecto particular de um heterocomplexo imunogênico da invenção, em que a molécula proteica transportadora induz tanto à produção de linfócitos T auxiliares (“T helper”), linfócitos T citotóxicos e linfócitos B específicos da molécula proteica transportadora, a referida molécula proteica transportadora (ii) é escolhida dentre as proteínas CEA, p53, Di12, CaSm, OSA e ETS2.
[0149] De acordo com um quarto aspecto particular de um produto imunogênico da invenção, em que a molécula proteica transportadora induz, além da diferenciação de linfócitos T auxiliares (“T helper”) a produção de anticorpos dirigidos contra a molécula proteica transportadora, a referida molécula proteica transportadora (ii) é escolhida dentre as proteínas Bet v1, Der p1 e Fel d 1.
[0150] Em um produto imunogênico da invenção, os heterocomplexos proteicos imunogênicos preferidos são escolhidos dentre os hetero-complexos seguintes, em que as proteínas antigênicas (i), de um lado, e a molécula proteica transportadora (ii) de outro lado, são respectivamente:
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a) (i) IL-4 e (ii) KLH;
b) (i) interferon alfa e (ii) KLH;
c) (i) VEGF e (ii) KLH;
d) (i) IL-10 e (ii) KLH;
e) (i) interferon alfa e (ii) gp 160 de HIV 1
f) (i) IL-4 e (ii) o antígeno alergênico Bet v1; e
g) (i) o VEGF e (ii) a proteína E7 de um Papillomavírus.
h) (i) a proteína Tat de HIV1 biologicamente inativada e (ii) a proteína gp 120 de HIV1.
i) (i) um anticorpo humano de isotipo IgE e (ii) a proteína Tat de HIV1 inativada;
j) (i) o fragmento β de ricina e (ii) KLH.
Processo de preparação de um produto imunogênico compreendendo heterocomplexos proteicos imunogênico da invenção [0151] A invenção tem ainda por objeto um processo de preparação de um produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos imunogênicos como definidos acima, caracterizado em que compreende as etapas seguintes:
a) incubar as proteínas antigênicas (i) e a molécula transportadora (ii) em uma relação molar (i): (ii) de 5::1 a 50::1, em presença de um agente químico de ligação,
b) recuperar o produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos imunogênicos que é preparado na etapa a).
[0152] Preferivelmente, o agente químico de ligação é o glutaraldeído.
[0153] De modo mais preferido, o processo é por outro lado caracterizado em que a etapa a) é seguida por uma etapa de estabilização do produto compreendendo os heterocomplexos imunogênicos para o formaldeído, previamente na etapa b) de recuperação dos heterocomplexos.
[0154] Preferivelmente, quando o glutaraldeído é usado como agente químico de ligação, ele apresenta no meio de reação de copulação a uma concentração final compreendida entre 0,002M e 0,03M, com vantagem entre 0,02 M e 0,03M,
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35/78 preferivelmente na concentração final de 0,026 M.
[0155] A reação de copulação com o glutaraldeído é com vantagem realizada, durante 20 min a 60 min, preferivelmente 30 min, em temperatura indo de 20 a 25 oC. [0156] Após a etapa de copulação, o glutaraldeído em excesso é eliminado, por exemplo por diálise com a ajuda de uma membrana de diálise tendo um limiar de corte de 3 kDa. A etapa de diálise é com vantagem realizada a 4 oC, em um tampão ajustado a pH 7,6.
[0157] Para estabilizar o produto compreendendo os heterocomplexos proteicos preparados na etapa a), o referido produto pode ser tratado em solução pelo formaldeído, por exemplo por formaldeído na concentração final de 3 mM. A reação de estabilização tem com vantagem uma duração compreendida entre 12 e 48 h, preferivelmente entre 20 e 30 h, e de modo mais preferido ainda de 24 horas. A reação de estabilização pelo formaldeído é com vantagem parada por adição de glicina, preferivelmente na concentração de 0,1, durante 1 h e uma temperatura compreendida entre 20 e 25 oC.
As composições compreendendo um produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos proteicos imunogênicos da invenção [0158] A presente invenção tem também por objeto uma composição compreendendo o produto imunogênico como definido acima.
[0159] A invenção é igualmente relativa a uma composição farmacêutica compreendendo um produto imunogênico proteico como definido acima.
[0160] A invenção tem ainda por objeto uma composição imunogênica caracterizada em que ela compreende, a título de princípio ativo, um produto imunogênico como definido, em associação com um ou vários excipientes fisiologicamente compatíveis.
[0161] Ela trata igualmente de uma composição de vacina caracterizada em que ela compreende, a título de princípio ativo, um produto imunogênico como definido, em associação com um ou vários excipientes fisiologicamente compatíveis.
[0162] De acordo com os objetos buscados, usa-se os adjuvantes sistêmicos ou adjuvantes mucosais. Por exemplo, usa-se preferivelmente um adjuvante mucosal
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36/78 para prevenir os cânceres dos tecidos epiteliais e usa-se, preferivelmente, adjuvantes sistêmicos para prevenir ou tratar as infecções pelos vírus, como HIV1 e HTLV1, ou ainda para prevenir ou tratar as alergias.
[0163] Dentre os adjuvantes sistêmicos, usa-se, preferivelmente, os adjuvantes de tipo IFA (adjuvante incompleto de Freund), o fosfato de cálcio ou o hidróxido de alumina.
[0164] Dentre os adjuvantes mucosais, usa-se preferivelmente os adjuvantes como a cloratoxina B (CTB) ou um mutante da toxina LT (LT μ).
[0165] De acordo com um aspecto particular, uma composição imunogênica de acordo com a invenção compreende também um ou vários agentes imunoestimulantes, em combinação com um adjuvante da imunidade, como por exemplo o agente imunoestimulante CpG bem conhecido no estado da técnica.
[0166] Mostrou-se, com efeito, de acordo com a invenção, que a utilização de adjuvante CpG, e mais particularmente o adjuvante CpG em que as ligações intercadeia entre os nucleotídeos consistem em ligações fosforotioato permitia a estimulação da produção simultânea de anticorpos de isotipos de IgG e IgA, após administração sistêmica.
[0167] Ela trata igualmente de uma vacina, mucosal ou sistêmica, caracterizada em que compreende, a título de princípio ativo, um produto imunogênico como definido acima, em associação com um ou vários excipientes, dos quais adjuvantes de imunidade, fisiologicamente compatíveis.
[0168] As composições imunogênicas ou as vacinas de acordo com a presente invenção encontram seu emprego por exemplo no tratamento tanto curativo como preventivo dos cânceres, notadamente os cânceres induzidos pelos vírus como por exemplo ATL (Acute T cell leukemia), causado pelo HTLV1, ou o câncer de colo uterino causado por papilomavírus, ou ainda o linfoma de Burkitt ou o sarcoma de Kaposi causados pelos vírus da família herpes, respectivamente Epstein-Barr (EBV), e o HHV8 assim como no tratamento de AIDS, assim como para prevenir ou tratar as reações alérgicas.
[0169] Os produtos imunogênicos de acordo com a invenção podem ser usados
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37/78 como a seguir:
[0170] Administra-se a um paciente, sob uma forma adaptada à administração sistêmica ou mucosal, um produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos proteicos imunogênicos de acordo com a presente invenção, por exemplo por via intranasal, em quantidade suficiente para ser eficaz no plano terapêutico, a um indivíduo tendo necessidade de tal tratamento. A dose administrada pode ir por exemplo de 10 a 1000 μ g por via intranasal, uma vez por semana durante dois meses, depois, levando-se em conta o caráter transitório da resposta anticorpo dirigida contra o antígeno de interesse, periodicamente em função da taxa de anticorpos séricos, por exemplo a cada 2-6 meses.
[0171] Pode-se administrar em uma mesma preparação dois ou vários produtos imunogênicos diferentes para induzir anticorpos neutralizando todos os sítios funcionais deletérios no caso onde uma molécula não transporta todos os sítios ativos da toxina ou da citocina superproduzida que se deseja neutralizar.
[0172] A título de medicamentos, os produtos imunogênicos da invenção podem ser incorporados nas composições farmacêuticas destinadas a uma administração por via sistêmica ou então a uma administração por via mucosa, notadamente oromucosa, particularmente a via intranasal, a via oral e a via vaginal. A administração pode ter lugar em dose única ou repetida uma ou várias vezes após um certo intervalo de tempo.
[0173] Isto é porque o presente pedido tem igualmente por objeto uma composição farmacêutica, curativa ou preventiva, caracterizada em que ela compreende, a título de princípio ativo, um ou vários produtos imunogênicos como definidos acima. O produto imunogênico pode ser condicionado sozinho ou misturado a um excipiente ou mistura de excipientes farmaceuticamente aceitáveis como um adjuvante. Dentre os excipientes destinados à via intranasal ou oral, retém-se particularmente os capril caproil macrogol glicerídeos como o Labrasol (r) da GATTEFOSSE, ou o hidróxido de alumina (Alhydragel, Superfos, Dinamarca).
[0174] Para a administração oral de acordo com a invenção, pode-se associar o princípio ativo a um adjuvante de imunidade mucosal como um mutante de CT, de LT
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38/78 ou de CTB.
[0175] Retém-se mais particularmente as formas galênicas descritas por Boyaka et al, “Strategies for mucosal vaccine development”, em Am. J. Trap. Med. Hyg. 60 (4), 1999, pag. 35-45. Pode-se citar também os microgrânulos gastro-resistentes notadamente bioadesivos como os descritos por Rojas et al, em Pharmaceutical Research, vol. 16, no. 2, 1999, pag. 255.
[0176] Nas condições particulares de realização, retém-se uma composição farmacêutica vacina acima, caracterizada em que ela compreende um adjuvante de imunidade mucosal, como um mutante de CT (cholera toxine) ou de LT (enterotoxina lábil de E. coli).
[0177] Em outras condições particulares de realização, retém-se uma composição farmacêutica vacina acima, caracterizada em que ela compreende um adjuvante absorvente do princípio ativo, como hidróxido de alumina ou partículas de ouro.
[0178] A presente invenção tem ainda por objeto um processo de preparação de uma composição acima descrita, caracterizada em que se mistura, de acordo com os métodos conhecidos, o ou os produtos imunogênicos ativos como os excipientes aceitáveis, notadamente farmaceuticamente aceitáveis, e conforme o caso, com um adjuvante de imunidade sistêmico ou mucosal.
[0179] Nas condições preferidas de realização do processo acima, prepara-se os microgrânulos bioadesivos e gastro-resistentes para a via oral digestiva contendo os princípios ativos imunogênicos e, conforme o caso, os adjuvantes.
[0180] A presente invenção é ilustrada por outro lado pelos exemplos seguintes: EXEMPLOS [0181] Exemplos de preparação de heterocomplexos:
Exemplo 1- Preparação de heterocomplexo KLH-VEGF murino [0182] 0,58 mg de proteína KLH são dissolvidos em 0,5 ml de tampão fosfato 10 mM pH 8,5. A esta solução são adicionados 1 mg de VEGF murino dissolvido em 1 ml do mesmo tampão.
[0183] A mistura de proteína assim obtida é tratada por glutaraldeído na concentração final de 0,026 M durante 30 min em temperatura ambiente.
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39/78 [0184] O excesso de glutaraldeído é em seguida eliminado por 3 diálises sucessivas de 2 h cada efetuadas em um saco de diálise cujo limiar de corte é de 33 kDa, a 4 oC, contra 200 ml de tampão fosfato pH 7,6 10 mM.
[0185] A mistura é então tratada com formaldeído na concentração final de 3 mM durante 24 h. Depois a reação é bloqueada por adição de glicina 0,1 M final durante 1 h em temperatura ambiente.
[0186] A mistura é em seguida dialisada nas mesmas condições que a diálise efetuada previamente.
Exemplo 2- Heterocomplexo KLH-VEGF humano [0187] Este heterocomplexo representa o princípio ativo de uma vacina apropriada para induzir principalmente junto ao vacinado a produção de anticorpos que neutralizam o VEGF humano.
[0188] 0,58 mg de proteína KLH são dissolvidos em 0,5 ml de tampão fosfato 10 mM pH 8,5. A esta solução são adicionados 1 mg de VEGF humano dissolvido em 1 ml do mesmo tampão.
[0189] A mistura de proteína assim obtida é tratada por glutaraldeído na concentração final de 0,026 M durante 30 min em temperatura ambiente.
[0190] O excesso de glutaraldeído é em seguida eliminado por 3 diálises sucessivas de 2 h cada efetuadas em um saco de diálise cujo limiar de corte é de 3 kDa, a 4 oC, contra 200 ml de tampão fosfato pH 7,6 10 mM.
[0191] A mistura é então tratada com formaldeído na concentração final de 33 mM durante 24 h. Depois a reação é bloqueada por adição de glicina 0,1 M final durante 1 h em temperatura ambiente. A mistura é em seguida dialisada nas mesmas condições que a diálise efetuada previamente.
Exemplo 3- Preparação de um heterocomplexo KLH-IL4 murino [0192] 0,841 mg de proteína KLH são dissolvidos em 0,8 ml de tampão fosfato 10 mM pH 8,5. A esta solução são adicionados 1 mg de IL4 murino dissolvido em 1 ml do mesmo tampão.
[0193] A mistura de proteína assim obtida é tratada por glutaraldeído na concentração final de 0,026 M durante 30 min em temperatura ambiente.
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40/78 [0194] O excesso de glutaraldeído é em seguida eliminado por 3 diálises sucessivas de 2 h cada efetuadas em um saco de diálise cujo limiar de corte é de 3 kDa, a 4 oC, contra 200 ml de tampão fosfato pH 7,6 10 mM.
[0195] A mistura é então tratada com formaldeído na concentração final de 33 mM durante 24 h. Depois a reação é bloqueada por adição de glicina 0,1 M final durante 1 h em temperatura ambiente. A mistura é em seguida dialisada nas mesmas condições que a diálise efetuada previamente.
Exemplo 4 - Preparação de um heterocomplexo KLH-IL4 humano [0196] Este heterocomplexo representa o princípio ativo de uma vacina apropriada para induzir principalmente junto ao vacinado a produto de anticorpos que neutralizam o IL4 humano.
[0197] 1 mg de proteína KLH são dissolvidos em 1 ml de tampão fosfato 10 mM pH 8,5. A esta solução são adicionados 1 mg de proteína IL4 murino dissolvida em 1 ml do mesmo tampão.
[0198] A mistura de proteína assim obtida é tratada por glutaraldeído na concentração final de 0,026 M durante 30 min em temperatura ambiente.
[0199] O excesso de glutaraldeído é em seguida eliminado por 3 diálises sucessivas de 2 h cada efetuadas em um saco de diálise cujo limiar de corte é de 3 kDa, a 4 oC, contra 200 ml de tampão fosfato pH 7,6 10 mM.
[0200] A mistura é então tratada com formaldeído na concentração final de 33 mM durante 24 h. Depois a reação é bloqueada por adição de glicina 0,1 M final durante 1 h em temperatura ambiente. A mistura é em seguida dialisada nas mesmas condições que a diálise efetuada previamente.
Exemplo 5 - Preparação de um complexo KLH-IFN α [0201] Este conjugado representa o princípio ativo de uma vacina apropriada para induzir principalmente junto ao vacinado a produção de anticorpos que neutralizam o IFN α humano.
[0202] 0,625 mg de proteína KLH são dissolvidos em 0,6 ml de tampão fosfato 10 mM pH 8,5. A esta solução são adicionados 1 mg de proteína IFN α humana dissolvida em 1 ml do mesmo tampão.
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41/78 [0203] A mistura de proteína assim obtida é tratada por glutaraldeído na concentração final de 0,026 M durante 30 min em temperatura ambiente.
[0204] O excesso de glutaraldeído é em seguida eliminado por 3 diálises sucessivas de 2 h cada efetuadas em um saco de diálise cujo limiar de corte é de 3 kDa, a 4 oC, contra 200 ml de tampão fosfato pH 7,6 10 mM.
[0205] A mistura é então tratada com formaldeído na concentração final de 33 mM durante 48 h. Depois a reação é bloqueada por adição de glicina 0,1 M final durante 1 h em temperatura ambiente. A mistura é em seguida dialisada nas mesmas condições que a diálise efetuada previamente.
Exemplo 6 - Preparação de um complexo gp160-IFN α [0206] Este heterocomplexo representa o princípio ativo de uma vacina apropriada para induzir junto ao vacinado a produção de anticorpos que neutralizam tanto a proteína de estrutura gp160 de vírus HIV-1 como a proteína IFN α citocina imunossupressiva. Além disso, este heterocomplexo deve permitir induzir uma reação celular (quimiocinas, T auxiliar, CTL) dirigida contra as células infectadas expressando gp 160.
[0207] 0,380 mg de proteína gp160 são dissolvidos em 0,380 ml de tampão fosfato mM pH 8,5. A esta solução são adicionados 1 mg de proteína IFN α humana dissolvida em 1 ml do mesmo tampão.
[0208] A mistura de proteína assim obtida é tratada por glutaraldeído na concentração final de 0,026 M durante 30 min em temperatura ambiente.
[0209] O excesso de glutaraldeído é em seguida eliminado por 3 diálises sucessivas de 2 h cada efetuadas em um saco de diálise cujo limiar de corte é de 3 kDa, a 4 oC, contra 200 ml de tampão fosfato pH 7,6 10 mM.
[0210] A mistura é então tratada com formaldeído na concentração final de 33 mM durante 48 h. Depois a reação é bloqueada por adição de glicina 0,1 M final durante 1 h em temperatura ambiente. A mistura é em seguida dialisada nas mesmas condições que a diálise efetuada previamente.
Exemplo 7 - Preparação de um heterocomplexo gp160-Tat toxóide, (a proteína Tat é inativada de modo bioquímico)
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42/78 [0211] Este heterocomplexo representa o princípio ativo de uma vacina apropriada para induzir junto ao vacinado a produção de anticorpos que neutralizam tanto a proteína de estrutura gp160 de vírus HIV-1 como a proteína Tat extracelular do HIV-
1. Além disso, este complexo deve permitir induzir uma reação celular (quimiocinas, T auxiliar, CTL) dirigida contra as células infectadas expressando gp 160.
[0212] 0,550 mg de proteína gp160 são dissolvidos em 0,550 ml de tampão fosfato mM pH 8,5. A esta solução são adicionados 1 mg de proteína tat toxóide dissolvida em 1 ml do mesmo tampão.
[0213] A mistura de proteína assim obtida é tratada por glutaraldeído na concentração final de 0,026 M durante 30 min em temperatura ambiente.
[0214] Depois a reação é bloqueada por adição de glicina 0,1 M final durante 1 h em temperatura ambiente. O excesso de glicina é em seguida eliminado por 3 diálises sucessivas de 2 h cada efetuadas em um saco de diálise cujo limiar de corte é de 3 kDa, a 4 oC, contra 200 ml de tampão fosfato pH 7,6 10 mM.
Exemplo 8 - Preparação de um heterocomplexo gp160-Tat GM (a proteína Tat é inativada de modo genético) [0215] Este heterocomplexo representa o princípio ativo de uma vacina apropriada para induzir junto ao vacinado a produção de anticorpos que neutralizam tanto a proteína de estrutura gp160 de vírus HIV-1 como a proteína Tat de regulação do HIV-
1. Além disso, este heterocomplexo deve permitir induzir uma reação celular (quimiocinas, T auxiliar, CTL) dirigida contra as células infectadas expressando gp 160.
[0216] 0,550 mg de proteína gp160 são dissolvidos em 0,550 ml de tampão fosfato mM pH 8,5. A esta solução são adicionados 1 mg de proteína Tat GM dissolvida em 1 ml do mesmo tampão.
[0217] A mistura de proteína assim obtida é tratada por glutaraldeído na concentração final de 0,026 M durante 30 min em temperatura ambiente.
[0218] Depois a reação é bloqueada por adição de glicina 0,1 M final durante 1 h em temperatura ambiente. O excesso de glicina é em seguida eliminado por 3 diálises sucessivas de 2 h cada efetuadas em um saco de diálise cujo limiar de corte é de 3
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43/78 kDa, a 4 oC, contra 200 ml de tampão fosfato pH 7,6 10 mM.
Exemplo 9 - Preparação de um heterocomplexo KLH-TNF α murino [0219] Este conjugado representa o princípio ativo de uma vacina apropriada para induzir principalmente junto ao vacinado a produção de anticorpos que neutralizam o TNF α murino.
[0220] 0,625 mg de proteína KLH são dissolvidos em 0,6 ml de tampão borato 10 mM pH 8,8 150 mM NaCl. A esta solução são adicionados 1 mg de proteína IFN α humano dissolvida em 1 ml de mesmo tampão.
[0221] A mistura de proteína assim obtida é tratada por glutaraldeído na concentração final de 0,026 M durante 45 min em temperatura ambiente.
[0222] O excesso de glutaraldeído é em seguida eliminado por 3 diálises sucessivas de 4 horas cada efetuadas em um saco de diálise cujo limiar de corte é de 3 kDa, a 4 oC, contra 200 ml de tampão fosfato pH 7,6 10 mM 150 [0223] mM de NaCl.
[0224] A mistura é então tratada por formaldeído a uma concentração final de 33 mM durante 48 horas. Depois a reação é bloqueada por adição de glicina 0.1 M final durante 1 hora em temperatura ambiente. A mistura é por fim dialisada nas mesmas condições que a diálise efetuada previamente.
Exemplo 10: Preparação de um heterocomplexo peptídeo Tat (19 - 50) - hIgE [0225] O peptídeo de Tat (19 - 50) supre os epítopos auxiliares helper.
[0226] Seqüência do peptídeo Tat usado:
[0227] Lys-Thr-Ala-Cys-Thr-Asn-Cys-Tyr-Cys-Lys-Lys-Cys-Cys-Phe-His-Cys-GlnVal-Cys-Phe-Ile-Thr-Lys-Ala-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys [0228] Este conjugado representa o princípio ativo de um imunogene apropriado para induzir principalmente em um vacinado a formação de anticorpos anti-IgE (humano).
[0229] 0,1 mg de peptídeo Tat (19 - 50) (4,06 x 10-8 moles) são dissolvidos em 0,2 ml de tampão borato 10 mM, pH 8,5. A esta solução são adicionados 1 mg de IgE humano (6,6 x 10-9 moles) dissolvido em 1 ml do mesmo tampão.
[0230] A mistura assim constituída é tratada por glutaraldeído na concentração
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44/78 final de 0,026 M durante 30 minutos em temperatura ambiente.
[0231] O excesso de glutaraldeído é eliminado por 2 diálises sucessivas de 4 h e por diálise final de 16 horas contra um grande volume de tampão fosfato 10 mM, pH 7,4 contendo 0,8% de NaCl (PBS), a 4 °C, usando um saco de diálise com um limiar de corte de 10 kDa. (relação peptídeo IgE = 50:1)
Exemplo 11 - Preparação de um heterocomplexo contra o fragmento da ricina [0232] Este heterocomplexo constitui o princípio ativo de uma vacina apropriada para induzir, no vacinado, a formação de anticorpos neutralizantes dirigidos contra o fragmento implicado na fixação da molécula de ricina, impedindo assim exercer sua atividade tóxica.
[0233] A 0,5 mg de KLH (1,1 x 10-3 mols) dissolvidos em 0,5 ml de tampão fosfato de 10 mM, pH 8,2, são adicionados 1 mg (3,3 x 10-8 mols) de fragmento α de ricina dissolvido em 1 ml do mesmo tampão. Esta mistura é tratada por glutaraldeído na concentração final de 0,026 M durante 30 min, em temperatura ambiente.
[0234] O excesso de glutaraldeído é eliminado por 2 diálises sucessivas de 4 h e por diálise de 16 horas contra um grande volume de tampão fosfato 10 mM, contendo 0,8% de NaCl (PBS), usando um saco de diálise com um limiar de corte de 3 kDa. (relação KLH: ricina-α = 1:30).
Exemplos de caracterizações bioquímicas dos heterocomplexos
A Material e métodos dos exemplos 12 a 23.
[0235] As caracterizações bioquímicas dos heterocomplexos foram efetuadas com a ajuda de técnicas seguintes.
1. Teste de antigenicidade [0236] O estudo da antigenicidade de um heterocomplexo em relação à antigenicidade das proteínas que o compõem é efetuada por um ELISA indireto clássico. Esta técnica permite medir de modo quantitativo uma proteína de reconhecimento específico de um anticorpo contra um antígeno. Este teste consiste em depositar diluições de uma amostra contendo a proteína procurada nos reservatórios de uma placa de microtitulação. Um anticorpo policlonal específico reage com a proteína imobilizada. Um segundo anticorpo, conjugado a peroxidase de raiz
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45/78 forte, específica do primeiro é em seguida adicionado. O complexo formado é revelado por incubação com OPD. A cor amarela obtida é diretamente proporcional à quantidade de proteínas fixadas. A absorbância (DO) de cada reservatório é medida com a ajuda de uma leitora de microplacas. A quantidade de proteína presente na amostra é determinada então com a ajuda de uma faixa de escalonamento.
2. Isoeletrofocalização em gel de agarose seguido por um Western Blot.
[0237] A isoeletrofocalização de gel de agarose permite separar as moléculas em função de seu ponto isoelétrico (pI) nas condições não desnaturantes, o que permite estudar os heterocomplexos sem destruir as ligações fracas existentes no seio destes complexos.
[0238] A isoeletrofocalização é seguida por uma revelação por Western blot. Após separação eletroforética, as moléculas são transferidas sobre uma membrana de nitrocelulose por capilaridade. Estas moléculas são em seguida caracterizadas por imunoquímica.
3. Medida da porcentagem das moléculas de antígeno de interesse ligadas à molécula proteica transportadora por uma ligação covalente (Primeiro processo) [0239] A estimativa da porcentagem das moléculas de antígeno de interesse ligadas às moléculas proteicas transportadoras por uma ligação covalente em um produto imunogênico é efetuada por exemplo por triagem molecular sobre uma coluna contendo Superdex 200, em condições desnaturantes (uréia 8 M) e redutoras (betamercapto etanol 5%).
[0240] A % de moléculas de antígeno de interesse ligadas por uma ligação covalente é deduzida da quantidade de antígeno de interesse (determinada por um ELISA indireto clássico) presente no volume de exclusão da coluna. Com efeito, a molécula proteica transportadora, como KLH, tendo uma massa molecular maior que o limite superior de fracionamento da coluna usada (200 kDa no caso presente), sai no volume de exclusão desta coluna. Assim, nas condições desnaturantes e redutoras, somente os antígenos de interesse ligados de modo covalente à molécula proteica transportadora saem no volume de exclusão.
4. Medida da porcentagem de moléculas de antígeno de interesse ligadas à molécula
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46/78 transportadora por uma ligação covalente (segundo processo) [0241] A porcentagem de citocina fixada sobre a proteína transportadora (KLH) foi determinada por um ELISA duplo sanduíche, com a ajuda de um anticorpo de captura dirigido especificamente contra a proteína transportadora.
[0242] 100 μ l de anticorpos policlonais de cavalos dirigidos contra KLH (1 mg/ml) diluídos em um tampão fosfato 10 mM pH 7,3 NaCl 150 mM (PBS) são fixados em reservatórios de uma placa de microtitulação (high binding, Costar) durante 2 h a 37 oC. Após 3 lavagens em PBS/ 0,1% Tween 20 (PBST), os reservatórios são saturados com PBS contendo 2% de SVF.
[0243] Após 1h 30 de saturação, os reservatórios são lavados 3 vezes com PBST, depois as diluições de 2 em 2 de heterocomplexo (10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,312 e 0,156 p.g/ml), realizadas em duplicata, são adicionadas nos reservatórios (100 μ l/reservatório).
[0244] Após 2 h de incubação, os reservatórios são lavados 3 vezes com o PBST. O Tween, agente dissociante, presente no tampão de lavagem, permite eliminar todas as moléculas não fixadas de modo covalente sobre o KLH que é fixado ao mesmo especificamente sobre o anticorpo de captura.
[0245] Em seguida, as duas diluições de heterocomplexo são tratadas de 2 modos diferentes.
a) a primeira série é incubada com um anticorpo dirigido contra o KLH
b) a segunda série é incubada com um anticorpo dirigido contra a citocina.
[0246] Após 1 h 30 min de incubação a 37 oC, os reservatórios são lavados como previamente depois incubados com um anticorpo secundário copulado à peroxidase, dirigido contra a espécie de origem do primeiro anticorpo. Após 1 h 30 min de incubação a 37 oC, os reservatórios são novamente lavados. Após a adição do substrato da peroxidase, O-fenilenodiamina (OPD) permite revelar a presença de KLH fixado pelo anticorpo de captura e citocinas fixadas de modo covalente sobre o KLH. [0247] A quantidade de KLH fixada pelo anticorpo de captura depois a quantidade de moléculas de citocina fixadas sobre o KLH de modo covalente são calculadas com a ajuda de curvas de escalonamento feitas por ELISA.
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47/78 [0248] A porcentagem de citocina fixada de modo covalente ao KLH é então determinada.
Exemplo 12 - Caracterização bioquímica do heterocomplexo KLH- VEGF murino
1. A antigenicidade [0249] O heterocomplexo KLH_VEGF murino apresenta uma antigenicidade idêntica à antigenicidade do VEGF murino.
2. Isoeletrofocalização em gel de agarose seguida por um Western blot.
[0250] A figura 1 mostra que o heterocomplexo KLH-VEGF murino migra sob a forma de uma única banda com um pI diferente das moléculas nativas que o constituem.
Exemplo 13 - Caracterização bioquímica do heterocomplexo KLH- VEGF humano
1. A antigenicidade [0251] O heterocomplexo KLH_VEGF humano apresenta uma antigenicidade idêntica à antigenicidade do VEGF humano.
2. Isoeletrofocalização seguida por um Western blot.
[0252] A figura 2 mostra que o heterocomplexo KLH-VEGF humano migra sob a forma de uma única banda com um pl diferente das moléculas nativas que o constituem. A amostra de VEGF humano foi depositada em três locais diferentes a fim de mostrar que ela migra sempre para o mesmo lugar.
Exemplo 14 - Caracterização bioquímica do heterocomplexo KLH- IL4 murino
1. A antigenicidade [0253] O heterocomplexo KLH IL4 murino apresenta uma antigenicidade idêntica à antigenicidade do IL4 murino.
Exemplo 15 Caracterização bioquímica do heterocomplexo KLH - IL4 humano
1. Antigenicidade [0254] O complexo KLH_Il4 humano apresenta uma antigenicidade igual à antigenicidade da proteína IL 4 humana.
2. Isoeletrofocalização seguida por um Western blot.
[0255] A figura 3 mostra que o heterocomplexo KLH-IL 4 humano migra sob a forma de uma única banda com um pI diferente das moléculas nativas que o
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48/78 constituem.
Exemplo 16 Caracterização bioquímica do heterocomplexo KLH - IFN α
1. Antigenicidade [0256] O complexo KLH_ IFN α humano apresenta uma antigenicidade idêntica à antigenicidade de IFN α humano.
2. Estimativa da porcentagem de moléculas de antígeno de interesse ligadas à molécula proteica transportadora por uma ligação covalente [0257] A preparação de KLH_ IFN α foi passada em uma coluna superdex S200 de acordo com as condições descritas acima. O topo que sai no volume de exclusão foi coletado, dialisado depois liofilizado. A concentração em antígeno de interesse foi determinada pela técnica de ELISA indireta. A quantidade de IFN α encontrada no volume excluído é de 30 pg, enquanto que 1000 pg de IFN foram usados para preparar o produto imunogênico, saem a perda mensurável de antígeno durante o processo de preparação. A porcentagem de moléculas de antígeno de interesse ligadas à molécula KLH para uma ligação covalente no produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos KLH- IFN α pode ser então estimada à cerca de 3%.
Exemplo 17 Caracterização bioquímica do heterocomplexo Gp 160- IFN α
1. Antigenicidade [0258] O complexo gp160-IFN α humano apresenta uma antigenicidade idêntica à antigenicidade da proteína gp 160 assim como a de IFN α humano.
2. Isoeletrofocalização seguida por Western Blot [0259] A figura 4 mostra que o heterocomplexo gp160- IFN α humano migra sob a forma de uma única banda a um pH que é muito diferente do pI da proteína gp160 recombinante que o constitui. O pI deste heterocomplexo é levemente inferior ao de IFN α.
Exemplo 18 Caracterização bioquímica do heterocomplexo gp160- tat toxóide
1. Antigenicidade [0260] O complexo gp160-Tat toxóide apresenta uma antigenicidade idêntica à antigenicidade da proteína gp160 e à da proteína Tat.
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Exemplo 19 Caracterização bioquímica do heterocomplexo gp160- tat GM
1. Antigenicidade [0261] O complexo gp160-Tat GM apresenta uma antigenicidade idêntica à antigenicidade da proteína gp160 e à da proteína Tat.
Exemplo 20 Caracterização bioquímica do heterocomplexo KLH- IL4 murino
1. Antigenicidade [0262] O heterocomplexo KLH-IL4 murino apresenta uma antigenicidade idêntica à antigenicidade de IL4 murino.
2. Estimativa da % de molécula de antígenos de interesse fixadas de modo covalente à molécula proteica transportadora.
[0263] 11 % de moléculas de IL4 murino são fixadas de modo covalente ao KLH.
Exemplo 21 Caracterização bioquímica do heterocomplexo KLH- IFN α
1. Antigenicidade [0264] O complexo KLH_ IFN α humano apresenta uma antigenicidade idêntica à antigenicidade de IFN α humano.
2. Estimativa da % de molécula de antígenos de interesse fixadas de modo covalente à molécula proteica transportadora.
[0265] 8% das moléculas de IFN α humano são fixadas de modo covalente a KLH.
Exemplo 22 Caracterização bioquímica do heterocomplexo peptídeo Tat-h IgE
1. Antigenicidade [0266] O complexo peptídeo Tat-h IgE apresenta uma antigenicidade comparável à de IgE humano.
Exemplo 23 - Caracterização bioquímica do heterocomplexo KLH- Ricina- β
1. Antigenicidade [0267] O complexo KLH- ricina-β apresenta uma antigenicidade comparável à do fragmento β da ricina.
2. Isoeletrofocalização seguida por um Western blot.
[0268] O complexo migra sob a forma de uma banda única e a presença de fragmento β é colocada em evidência por Western blot.
Exemplos de atividade imunogênica dos heterocomplexos
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Exemplo 24 - Atividade imunogênica de heterocomplexo KLH- VEGF murino
A. Material e métodos [0269] A atividade imunogênica (humoral) da preparação KLH- VEGF murino em relação à de VEGF murino foi estudada junto ao camundongo balb c de 18-20 g.
1. Imunização [0270] No dia 0, 7, 14, 21, um grupo de 8 camundongos recebe uma injeção de 0,1 ml (10 pg) de uma emulsão em AIF por via intramuscular. Uma injeção de reforço de 5 pg em AIF é dada no dia 60.
[0271] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbitral é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2.
camundongos de controle recebem as mesmas preparações sem imunogene. [0272] Os camundongos são sacrificados 12 dias após a última imunização.
1. Toxicidade [0273] A toxicidade anormal é procurada junto a 3 camundongos recebendo 1 dose humana (50 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0274] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado em PBMCs cultivados em presença do complexo e estimulados por PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados
1. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0275] Os camundongos imunizados tanto pela preparação de KLH- VEGF murino como por VEGF murino apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ml de KLH_ VEGF murino não diminuem a proliferação de linfócitos.
[0276] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 50 pg de heterocomplexo manifesta qualquer sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção.
2. Resposta humoral [0277] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo IgG dirigidos contra o VEGF murino, determinada por ELISA e expressa em título
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51/78 (inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3). A figura 5 representa títulos de anticorpos obtidos.
[0278] Os camundongos imunizados com a preparação KLH_ VEGF murino apresentam títulos de anticorpos de tipo IgG maiores do que os dos camundongos imunizados com VEGF murino apenas.
[0279] A atividade neutralizante destes anticorpos foi medida com a ajuda de teste de atividade biológica de VEGF, fator de crescimento seletivo das células endoteliais. As células endoteliais (HUVECs) são cultivadas em reservatórios com fundo plano de uma placa de microcultura à razão de 3.000 células por reservatório. Os soros de cada grupo de camundongos foram reagrupados. Diferentes diluições destas poças de soros (1/100 - 1/800) retirados no dia 2 e dia 72 foram pré-incubados durante 2 h com 20 ng/ml de VEGF murino, depois depositados sobre células endoteliais. A cultura celular foi prosseguida a 37 oC em atmosfera úmida carregada a 5% de CO2 durante 3 dias. 18 h antes do fim da incubação, 0,5 pCi de timidina tritiada/ reservatório são adicionados. Os soros neutralizantes impedem o VEGF murino de induzir a proliferação de células endoteliais, enquanto que os soros não neutralizantes permitem a proliferação destas células. Os resultados são dados em porcentagem de neutralização. A figura 6 apresenta os resultados obtidos.
[0280] Os anticorpos induzidos pelo complexo tem um poder neutralizante maior que o induzido pelo VEGF murino.
Exemplo 25 - Atividade imunogênica de heterocomplexo KLH- VEGF humano
A. Materiais e métodos [0281] A atividade imunogênica (humoral da preparação KLH- VEGF humano em relação à de VEGF humano foi estudada junto ao camundongo Balb c de 18-20 g.
1. Imunização [0282] No dia 0, 7, 14, 21, um grupo de 8 camundongos recebe uma injeção de 0,1 ml (10 pg) de uma emulsão em AIF por via intramuscular. Uma injeção de reforço de 5 pg em AIF é dada no dia 60.
[0283] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbitral é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2.
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52/78 [0284] 3 camundongos de controle recebem as mesmas preparações sem imunogene.
[0285] Os camundongos são sacrificados 12 dias após a última imunização.
2. Toxicidade [0286] A toxicidade anormal é procurada junto a 3 camundongos recebendo 1 dose humana (50 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0287] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado em PBMCs cultivados em presença do complexo e estimulados por PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados
1. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0288] Os camundongos imunizados tanto pela preparação de KLH- VEGF humano como por VEGF humano apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ml de KLH-VEGF humano não diminuem a proliferação de linfócitos.
[0289] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 50 pg de heterocomplexo manifesta sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção.
2. Resposta humoral [0290] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo IgG dirigidos contra o VEGF humano, determinada por ELISA e expressa em título (inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3). A figura 7 representa títulos de anticorpos obtidos.
[0291] Os camundongos imunizados com a preparação KLH_ VEGF humano apresentam títulos de anticorpos de tipo IgG maiores do que os dos camundongos imunizados com VEGF humano apenas.
[0292] A atividade neutralizante destes anticorpos foi medida com a ajuda de teste de atividade biológica de VEGF, fator de crescimento seletivo das células endoteliais. As células endoteliais (HUVECs) são cultivadas em reservatórios com fundo plano de uma placa de microcultura à razão de 3.000 células por reservatório. Os soros de cada
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53/78 grupo de camundongos foram reagrupados. Diferentes diluições destas poças de soros (1/100 - 1/800) retirados no dia 2 e dia 72 foram pré-incubadas durante 2 h com 20 ng/ml de VEGF humano, depois depositadas sobre células endoteliais. A cultura celular foi prosseguida a 37 oC em atmosfera úmida carregada a 5% de CO2 durante 3 dias. 18 h antes do fim da incubação, 0,5 pCi de timidina tritiada/ reservatório são adicionados. Os soros neutralizantes impedem o VEGF humano de induzir a proliferação de células endoteliais, enquanto que os soros não neutralizantes permitem a proliferação destas células. Os resultados são dados em porcentagem de neutralização. A figura 8 apresenta os resultados obtidos.
[0293] Os anticorpos induzidos pelo complexo tem um poder neutralizante maior que o induzido pelo VEGF humano.
Exemplo 26: atividade imunogênica de heterocomplexo KLH-IL4 murino
A. Materiais e métodos [0294] A atividade imunogênica (humoral) da preparação KLH- IL4 murino em relação à de IL4 murino foi estudada junto ao camundongo Balb c de 18-20 g.
1. Imunização [0295] No dia 0, 7, 14, 21, um grupo de 8 camundongos recebe uma injeção de 0,1 ml (10 pg) de uma emulsão em AIF por via intramuscular. Uma injeção de reforço de 5 pg em AIF é dada no dia 60.
[0296] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbitral é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2 ao dia 72.
[0297] 3 camundongos de controle recebem as mesmas preparações sem imunogene.
[0298] 14 dias após a última imunização, os camundongos de controle e os camundongos imunizados com KLH- IL4 murino são desafiados com um pólen de bétula em presença de alúmen (100 ug/camundongo) em sub-cutânea no dia 74, dia 95 e dia 109. As amostras de sangue são efetuadas de modo regular para seguir o aparecimento de anticorpos de classe G e E dirigidos contra Bet v 1, alergênio principal do pólen de bétula.
2. Toxicidade
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54/78 [0299] A toxicidade anormal é procurada junto a 3 camundongos recebendo 1 dose humana (50 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0300] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado em PBMCs cultivados em presença do complexo e estimulados por PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados
1. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0301] Os camundongos imunizados tanto pela preparação de KLH- IL murino como por IL4 murino apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ml de KLH- IL4 murino não diminuem a proliferação de linfócitos.
[0302] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 50 pg de heterocomplexo manifesta sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção.
2. Resposta humoral [0303] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo IgG dirigidos contra IL4 murino, determinado por ELISA e expresso em título (inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3). A figura 9 representa os títulos de anticorpos obtidos.
[0304] Os camundongos imunizados com a preparação de KLH- IL4 murino apresentam títulos de anticorpos de tipo IgG maiores do que os dos camundongos imunizados com o IL4 murino apenas.
[0305] A atividade neutralizante destes anticorpos presentes junto aos camundongos imunizados com a preparação KLH- IL4 murino foi medida com a ajuda do teste de atividade biológica de IL4 murino. Este teste usa células HT-2, linhagens de células de murinos cujo crescimento é II4 murino - dependente (Watson, J. 1979, J. Exp. Med. 150: 1510). As células HT-2 são cultivadas nos reservatórios com fundo redondo de uma placa de microcultura à razão de 10.000 células por reservatório. Os soros diluídos em 1/50 retirados no dia 2 e dia 72 são pré-incubados durante 2 h com 50 ng/ ml de IL4 murino depois depositados sobre as células HT-2. A cultura celular é
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55/78 prosseguida a 37 oC em atmosfera úmida carregada a 5 % de CO2 durante 3 dias. 4 h antes do fim da incubação, 0,5 pCi de timidina tritiada / reservatório são adicionados. Os soros neutralizantes impedem IL4 murino de induzir a proliferação de células HT2, enquanto que os soros não neutralizantes permitem a proliferação destas células. Os resultados são dados em porcentagem de neutralização. A figura 10 apresenta os resultados obtidos.
[0306] Os anticorpos induzidos pelo complexo são neutralizantes.
[0307] Além disso, estes anticorpos neutralizantes dirigidos contra Il4 murino impedem a produção, pelos camundongos, de anticorpos de tipo IgE dirigidos contra Bet v 1, enquanto que estes últimos são desafiados com pólen de bétula. A figura 11 mostra bem que os camundongos imunizados com KLH- IL4 murino possuem IgG neutralizantes dirigidos contra IL4 murino baqueando a produção de IgE dirigidos contra Bet v 1 e começam a produzir os anticorpos de tipo IgG dirigidos contra o Bet v 1. Por outro lado, os camundongos que não receberam KLH- IL4 murino, e que não tem portanto anticorpos de tipo IgG dirigidos contra IL4, produzem apenas anticorpos de tipo IgE dirigidos contra o Bet v 1.
Exemplo 27: Atividade imunogênica de heterocomplexo KLH - IL4 humano
A. Materiais e métodos [0308] A atividade imunogênica (humoral) da preparação KLH- IL4 humano em relação à de IL4 humano foi estudada junto ao camundongo Balb c de 18-20 g.
1. Imunização [0309] No dia 0, 7, 14, 21, um grupo de 8 camundongos recebe uma injeção de 0,1 ml (10 pg) de uma emulsão em AIF por via intramuscular. Uma injeção de reforço de 5 pg em AIF é dada no dia 60.
[0310] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbitral é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2.
[0311] 3 camundongos de controle recebem as mesmas preparações sem imunogene.
[0312] Os camundongos são sacrificados 12 dias após a última imunização.
2. Toxicidade
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56/78 [0313] A toxicidade anormal é procurada junto a 3 camundongos recebendo 1 dose humana (50 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0314] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado em PBMCs cultivados em presença do complexo e estimulados por PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados
1. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0315] Os camundongos imunizados tanto pela preparação de KLH- IL4 humano como por IL4 humano apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ml de KLH- IL4 humano não diminuem a proliferação de linfócitos.
[0316] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 50 pg de heterocomplexo manifesta sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção.
2. Resposta humoral [0317] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo IgG dirigidos contra IL4 humano, determinado por ELISA e expresso em título (inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3).
Tabela 1
Título dia 2 dia 72 camundongos de controle:
camundongo controle 1 <500-1 <500-1 camundongo controle 2 <500-1 <500-1 camundongo controle 3 <500-1 <500-1 camundongos imunizados com IL4 humano: camundongo 4 <500-1 32 000-1 camundongo 5 <500-1 48 000-1 camundongo 6 <500-1 16 000-1 camundongos imunizados com o complexo KLH-IL4 humano:
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57/78 camundongo 7 camundongo 8 camundongo 9 <500-1 256 000-1 <500-1 128 000-1 <500-1 128 000-1 [0318] Os camundongos imunizados com a preparação KLH-IL4 humano apresentam títulos de anticorpos de tipo IgG maiores do que os dos camundongos imunizados com o IL4 humano apenas.
[0319] A atividade neutralizante destes anticorpos induzidos pela preparação de KLH- IL4 humano foi medida com a ajuda do teste de atividade biológica de IL4 humano. Este teste usa células TF-1, linhagem de células humana cujo crescimento é IL4 humano- dependente (Kitamura, T. et al., 1989.. J. Cell Physiol. 140: 323 - 34). As células TF-1 são cultivadas em reservatórios de fundo redondo com uma placa de microcultura à razão de 10 000 células por reservatório. Os soros diluídos em 1/50 retirados no dia 2 e dia 72 pré-incubados du4 2 h com 50 ng/ml IL4 humano são em seguida depositados sobre as células TF-1. A cultura celular foi prosseguida a 37 oC em atmosfera úmida carregada a 5% de CO2 durante 3 dias. 18 h antes do fim da incubação, 0,5 pCi de timidina tritiada/ reservatório são adicionados. Os soros neutralizantes impedem o IL 4 humano de induzir a proliferação de células TF-1, enquanto que os soros não neutralizantes permitem a proliferação destas células. Os resultados são dados em porcentagem de neutralização. A figura 12 apresenta os resultados obtidos.
[0320] Os anticorpos induzidos pelo complexo são neutralizantes.
Exemplo 28: Atividade imunogênica de heterocomplexo KLH-IFNa
A. Materiais e métodos [0321] A atividade imunogênica (humoral) da preparação de KLH-IFNa humano em relação à de IFN α humano foi estudada junto ao camundongo balb c de 18-20 g. 1. Imunização [0322] No dia 0, 7, 14, 21, um grupo de 8 camundongos recebe uma injeção de 0,1 ml (10 ug) de uma emulsão em AIF por via intramuscular. Uma injeção de reforço
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58/78 de 5 pg em AIF é dada no dia 60.
[0323] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbitral é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2.
[0324] 3 camundongos de controle recebem as mesmas preparações sem imunogene.
[0325] Os camundongos são sacrificados 12 dias após a última imunização.
2. Toxicidade [0326] A toxicidade anormal é procurada junto a 3 camundongos recebendo 1 dose humana (50 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0327] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado em PBMCs cultivados em presença do complexo e estimulados por PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados
1. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0328] Os camundongos imunizados tanto pela preparação de KLH- IFN α humano como por IFN α humano apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ml de KLH- IFN α humano não diminuem a proliferação de linfócitos.
[0329] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 100 pg de heterocomplexo manifesta sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção.
2. Resposta humoral [0330] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo IgG dirigidos contra IFN α humano, determinado por ELISA e expresso em título (inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3). A tabela 2 representa os títulos de anticorpos obtidos.
Tabela 2
Título dia 2 dia 72 camundongos de controle:
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59/78 camundongo controle 1 camundongo controle 2 camundongo controle 3 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1 camundongos imunizados com IFNa:
camundongo 4 camundongo 5 camundongo 6 <500-1 96 000-1 <500-1 128 000-1 <500-1 96 000-1 camundongos imunizados com o complexo KLH-IFNa:
camundongo 7 camundongo 8 camundongo 9 <500-1 96 000-1 <500-1 96 000-1 <500-1 128 000-1 [0331] Os camundongos imunizados com a preparação de KLH-IFNa humano apresentam títulos de anticorpos de IgG equivalentes aos dos camundongos imunizados com IFN α humano apenas.
[0332] A atividade neutralizante destes anticorpos foi medida com a ajuda do teste de atividade biológica de IFNa humano. (Rubinstein S, J Virol, 1981, 755 - 8). Este teste de medida do efeito antiviral tem por fim avaliar a inibição da lise de células MDBK por VSV (Vesicular Stomatitis virus) em presença de IFN. As células MDBK foram cultivadas nos reservatórios com fundo redondo de uma placa de microcultura à razão de 350 000 células por reservatório. Diferentes diluições de soros (1/100 a 1/800) retiradas no dia 2 e dia 72 são pré-incubadas durante 2 h com 5 ng/ml de IFN α humano depois depositados sobre células MDBK. Após 20 h de cultura celular realizada a 37 oC em atmosfera úmida carregada a 5% de CO2, os soros diluídos presentes nos reservatórios são retirados, as células lavadas, depois 100 μ l contendo 100 DL50 (dose letal 50%) de vírus VSV são adicionados. 18 h após a adição do vírus, o efeito lítico do vírus é medido. Os soros neutralizantes permitem ao VSV de lisar as células, enquanto que os soros não neutralizantes impedem esta lise. Os resultados são dados em porcentagem de neutralização.
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Tabela 3 camundongos imunizados com IFNa:
1/100 1/200 1/400 1/800
camundongo 4 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 75 65 50
camundongo 5 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 67 60 55
camundongo 6 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 72 65 60
camundongos imunizados com o conjugado KLH-IFNa:
1/100 1/200 1/400 1/800
camundongo 7 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 100 100 100
camundongo 8 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 100 100 100
camundongo 9 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 100 100 100
[0333] Os anticorpos induzidos pelo complexo tem um poder neutralizante maior do que o induzido pelo IFN α humano. Os resultados são dados em % de neutralização.
Exemplo 29: Atividade imunogênica de heterocomplexo gp160-IFNa
A. Materiais e métodos [0334] A atividade imunogênica (humoral) da preparação de gp160-IFNa humano em relação à de IFN α humano foi estudada com o camundongo balb c de 18-20 g.
1. Imunização
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61/78 [0335] No dia 0, 7, 14, 21, um grupo de 8 camundongos recebe uma injeção de 0,1 ml (10 pg) de uma emulsão em AIF por via intramuscular. Uma injeção de reforço de 5 pg em AIF é dada no dia 60.
[0336] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbitral é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2.
[0337] 3 camundongos de controle recebem as mesmas preparações sem imunogene.
[0338] Os camundongos são sacrificados 12 dias após a última imunização.
2. Toxicidade [0339] A toxicidade anormal é procurada junto a 3 camundongos recebendo 1 dose humana (50 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0340] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado em PBMCs cultivados em presença do complexo e estimulados por PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados
1. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0341] Os camundongos imunizados tanto pela preparação de gp160- IFN humano como por IFN α humano apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ml de gp 160 - IFN α humano não diminuem a proliferação de linfócitos.
[0342] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 100 pg de heterocomplexo manifesta sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção.
2. Resposta humoral [0343] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo IgG dirigidos contra IFN humano, determinado por ELISA e expresso em título (inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3).
Tabela 4
Título dia 2 dia 72
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62/78 camundongos de controle:
camundongo controle 1 camundongo controle 2 camundongo controle 3 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1 camundongos imunizados com IFNa:
camundongo 4 camundongo 5 camundongo 6 <500-1 64 000-1 <500-1 96 000-1 <500-1 128 000-1 camundongos imunizados com o complexo gp160-IFNa:
camundongo 7 camundongo 8 camundongo 9 <500-1 96 000-1 <500-1 96 000-1 <500-1 64 000-1 [0344] Os camundongos imunizados com a preparação de gp160-IFNa humano apresentam títulos de anticorpos de tipo IgG equivalentes aos dos camundongos imunizados com IFN α humano apenas.
[0345] A atividade neutralizante destes anticorpos foi medida com a ajuda do teste de atividade biológica de IFN α humano descrito no exemplo precedente. Os resultados são dados em % de neutralização.
Tabela 5 camundongos imunizados com IFNa:
1/100 1/200 1/400 1/800
camundongo 4 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 80 70 53
camundongo 5 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 70 65 50
camundongo 6 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 65 60 57
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63/78 camundongos imunizados com o conjugado gp160-IFNa:
1/100 1/200 1/400 1/800
camundongo 7 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 100 100 100
camundongo 8 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 100 100 100
camundongo 9 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 100 100 100
[0346] Os anticorpos induzidos pelo complexo tem um poder neutralizante maior que o induzido por IFN α humano.
Exemplo 30: Atividade imunogênica de heterocomplexo gp160-Tat toxóide
A. Materiais e métodos [0347] A atividade imunogênica (humoral e celular) da preparação de gp160-Tat toxóide em relação à de Tat toxóide foi estudada junto ao camundongo balb c de 18-20 g.
1. Imunização [0348] No dia 0, 7, 14, 21, um grupo de 3 camundongos recebe uma injeção de 0,1 ml (10 pg) de uma emulsão em AIF por via intramuscular. Uma injeção de reforço de 5 pg em AIF é dada no dia 60.
[0349] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbitral é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2.
[0350] 3 camundongos de controle recebem as mesmas preparações sem imunogene.
[0351] Os camundongos são sacrificados 12 dias após a última imunização.
2. Toxicidade [0352] A toxicidade anormal é procurada junto a 3 camundongos recebendo 1 dose humana (100 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0353] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado em PBMCs cultivados em presença do complexo e
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64/78 estimulados por PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados
1. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0354] Os camundongos imunizados tanto pela preparação de gp 160 - Tat toxóide como por Tat toxóide apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ml de gp 160 - Tat toxóide não diminuem a proliferação de linfócitos.
[0355] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 100 pg de heterocomplexo manifesta sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção.
2. Resposta humoral [0356] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo IgG dirigidos contra Tat, determinado por ELISA e expresso em título (inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3). A tabela 1 representa os títulos de anticorpos obtidos.
Tabela 6
Título dia 2 dia 72 camundongos de controle:
camundongo controle 1 <500-1 camundongo controle 2 camundongo controle 3 camundongos imunizados com o Tat toxóide:
000-1 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1 <500-1
000-1
000-1 camundongo 4 camundongo 5 camundongo 6 camundongos imunizados com o conjugado gp160-Tat toxóide:
camundongo 7 camundongo 8 camundongo 9 <500-1 64 000-1 <500-1 128 000-1 <500-1 64 000-1
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65/78 [0357] Os camundongos imunizados com a preparação de gp160-Tat toxóide apresentam títulos de anticorpos de tipo IgG anti-Tat maiores do que os dos camundongos imunizados com o Tat toxóide apenas.
[0358] A atividade neutralizante destes anticorpos foi medida com a ajuda do teste Cat. Diferentes diluições de soros (1/100 - 1/800) retirados no dia 2 e dia 72 foram incubadas durante 2 h com 50 ng/ml de Tat nativo. Estas diluições foram em seguida depositadas em células HeLa, células transfectadas de modo estável com um plasmídeo contendo o LTR do HIV-1 como promotor do gene cloranfenicol acetil transferase (CAT). Após 24 h de cultura, as células são lisadas e a quantidade de proteína CAT produzida é medida por um teste ELISA, o teste Cat (Boehringer Mannheim). Os soros neutralizantes impedem a proteína Tat de induzir a expressão da proteína CAT, enquanto que os soros não neutralizantes permitem a síntese desta proteína CAT. Os resultados são dados em % de neutralização.
Tabela 7 camundongos imunizados com o Tat toxóide:
1/100 1/200 1/400 1/800
camundongo 4 dia 2 0 0 0 0
dia 72 60 50 25 20
camundongo 5 dia 2 0 0 0 0
dia 72 60 55 30 20
camundongo 6 dia 2 0 0 0 0
dia 72 65 50 30 30
camundongos imunizados com o conjugado gp160-Tat toxóide:
1/100 1/200 1/400 1/800
camundongo 7 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 100 100 100
camundongo 8 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 100 100 100
camundongo 9 dia 2 0 0 0 0
dia 72 100 100 100 100
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66/78 [0359] Os anticorpos induzidos pelo conjugado gp 160-Tat toxóide tem um poder neutralizante maior do que o induzido pelo Tat toxóide.
2. Produção de MIP1 α [0360] A produção de MIP1 α nos sobrenadantes de cultura dos esplenócitos. Os esplenócitos dos camundongos imunizados e dos camundongos de controle são isolados depois cultivados em reservatórios com fundo redondo de uma placa de micro-cultura à razão de 100 000 células / reservatório em presença de 5 pg/ml de p24, de gp160, de Tat nativo e de uma mistura de 5 pg/ ml gp 160 e de 5 pg/ml de Tat nativo. Os sobrenadantes são retirados após 24 h de cultura e a presença de MIP1 nos sobrenadantes é medida com a ajuda de um teste ELISA de R&D. Os resultados são expressos em pg/ ml.
Tabela 8
Gp160 Tat nativo gp160 + Tat nativo p24
Camundongo controle:
Camundongo 1 dia 72 MIP1a 95 90 145 9
Camundongo 2 dia 72 MIP1a 100 90 136 7
Camundongo 3 dia 72 MIP1a 120 110 132 9
Camundongos imunizados pelo Tat toxóide:
Camundongo 4 dia 72 MIP1a 145 130 190 7
Camundongo 5 dia 72 MIP1a 128 145 225 9
Camundongo 6 dia 72 MIP1a 150 230 295 10
Camundongos imunizados pelo conjugado gp160-Tat toxóide
Camundongo 7 dia 72 MIP1a 875 736 1725 9
Camundongo 8 dia 72 MIP1a 945 905 1900 7
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67/78
Camundongo 9 dia 72 ΜΙΡ1α 1025 795 1755 8 [0361] Os esplenócitos dos camundongos imunizados com o conjugado gp 160Tat toxóide produzem mais quimiocinas MIP1 α do que as células dos camundongos imunizados pelo Tat toxóide apenas quando elas são ativadas, in vitro, pelos imunogenes usados quando da imunização.
4. Proliferação dos esplenócitos de camundongos imunizados (teste CMI) [0362] Os esplenócitos dos camundongos imunizados e dos camundongos de controle são isolados depois cultivados nos reservatórios de fundo redondo de uma placa de micro-cultura à razão de 100 000 células / reservatórios em presença de p24, de gp160, de Tat nativo e de uma mistura de gp160 e de Tat nativo. A cultura celular é prosseguida a 37 oC em atmosfera úmida carregada a 5% de CO2 durante 6 dias.
h antes do fim da incubação, 0,5 LiCi de timidina tritiada / reservatório são adicionados. A intensidade da resposta imune é proporcional ao índice de proliferação Ip.
[0363] Ip = cpm (batidas por minuto) para o antígeno dado/ cpm de controle
Tabela 9
Gp160
Tat nativo gp160 + Tat nativo p24
Camundongo controle:
Camundongo 1 dia 72 1,1 1,1 1 1,2
Camundongo 2 dia 72 1 1,1 1,1 1,1
Camundongo 3 dia 72 1,2 1 1 1,1
Camundongos imunizados com o Tat toxóide
Camundongo 4 dia 72 1,2 8 10 1,1
Camundongo 5 dia 72 1 9 9 1,2
Camundongo 6 dia 72 1 10 9 1,2
Camundongos imunizados com o conjugado gp160 -Tat toxóide:
Camundongo 7 dia 72 9 11 8 1
Camundongo 8 dia 72 10 9 7,5 1
Camundongo 9 dia 72 10,5 9 8 1
Petição 870190008294, de 25/01/2019, pág. 84/99
68/78 [0364] Os esplenócitos dos camundongos imunizados com o conjugado gp160Tat toxóide ou o Tat toxóide, proliferam, quando eles são ativados, in vitro, com os imunogenes usados quando da imunização.
Exemplo 31: Atividade imunogênica de heterocomplexo gp160-Tat GM
A. Material e métodos [0365] A atividade imunogênica (humoral e celular) da preparação gp160- Tat GM em relação à de Tat toxóide foi estudada junto ao camundongo balb c de 18-20 g.
1. Imunização [0366] No dia 0, 7, 14, 21, um grupo de 3 camundongos recebe uma injeção de 0,1 ml (10 pg) de uma emulsão em AIF por via intramuscular. Uma injeção de reforço de 5 pg em AIF é dada no dia 60.
[0367] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbitral é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2.
[0368] 3 camundongos de controle recebem as mesmas preparações sem imunogene.
[0369] Os camundongos são sacrificados 12 dias após a última imunização.
2. Toxicidade [0370] A toxicidade anormal é procurada junto a 3 camundongos recebendo 1 dose humana (100 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0371] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado em PBMCs cultivados em presença do complexo e estimulados por PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados
1. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0372] Os camundongos imunizados tanto pela preparação de gp 160 - Tat GM como por Tat toxóide apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ml de gp 160 - Tat toxóide não diminuem a proliferação de linfócitos.
[0373] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 100 pg de heterocomplexo
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69/78 manifesta sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção.
2. Resposta humoral [0374] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo IgG dirigidos contra Tat, determinado por ELISA e expresso em título (inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3). A tabela 1 representa os títulos de anticorpos obtidos.
Tabela 10
Título
camundongos de controle: dia 2 dia 72
camundongo controle 1 <500-1 <500-1
camundongo controle 2 <500-1 <500-1
camundongo controle 3 <500-1 <500-1
camundongos imunizados com o Tat GM:
camundongo 4 <500-1 64 000-1
camundongo 5 <500-1 64 000-1
camundongo 6 <500-1 48 000-1
camundongos imunizados com o conjugado gp160-Tat GM:
camundongo 7 <500-1 128 000-1
camundongo 8 <500-1 128 000-1
camundongo 9 <500-1 64 000-1
[0375] Os camundongos imunizados com a preparação de gp160-Tat GM apresentam títulos de anticorpos de tipo IgG anti-Tat maiores do que os dos camundongos imunizados com o Tat GM apenas.
Exemplo 32: Atividade imunogênica de heterocomplexo KLH-TNFa murino
Material e métodos [0376] A atividade imunogênica (humoral) da preparação KLH- TNF α murino com relação à de TNF α murino foi estudada junto ao camundongo Balb/c de 18-20 g.
Petição 870190008294, de 25/01/2019, pág. 86/99
70/78 [0377] No dia 0, um grupo de 3 camundongos (grupo A) recebe uma injeção de 0,1 ml de uma emulsão em AIF por via intramuscular contendo 60 pg de heterocomplexo KLH-TNF α. Uma injeção de reforço de 30 pg e de 25 pg em AIF é dada respectivamente no dia 21 e dia 60. 3 camundongos de controle recebem uma dose equivalente de TNF α murino de acordo com o mesmo protocolo (grupo B).
[0378] No dia 0, um grupo de 3 camundongos (grupo C) recebe uma injeção de 0,1 ml de uma emulsão em AIF por via intramuscular contendo 60 pg de heterocomplexo KLH-TNF α murino e 30 pg de oligodeoxinucleotídeo fosforotioato 5'TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (CpG DNA: 1826). Uma injeção de reforço de 30 pg e de 15 pg de heterocomplexo KLH-TNFa murino em AIF é dada respectivamente no dia 21 e dia 60. 3 camundongos de controle recebem uma dose equivalente de TNF α murino de acordo com o mesmo protocolo (grupo D).
[0379] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbital é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2.
[0380] Os camundongos são sacrificados 12 horas após a última imunização.
2. Toxicidade [0381] A toxicidade anormal é procurada junto aos 3 camundongos recebendo 1 dose humana (50 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0382] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado nos PBMCs cultivados em presença do complexo e estimuladas pelo PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados
1. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0383] Os camundongos imunizados tanto para a preparação de KLH_ TNF α murino como para TNF α murino apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ ml de KLH- TNF α murino não diminuem a proliferação dos linfócitos.
[0384] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 50 pg de heterocomplexo
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71/78 com ou sem o CpG DNA 1826 manifesta sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção. 2. Resposta humoral [0385] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo IgG dirigidos contra TNF α murino, determinada por ELISA e expressa em título. A presença de anticorpos de tipo IgA dirigidos contra TNF α murino nas secreções vaginais foi igualmente determinada por ELISA e expressa em título. O título representa o inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3. A tabela seguinte representa os títulos de anticorpos obtidos.
Petição 870190008294, de 25/01/2019, pág. 88/99
Tabela 11
IgA vaginal
dia 2 dia 72 dia 2 dia 72
Camundongos imunizados com KLH-TNFa murino (grupo A)
1 64 000-1 20-1
2 < 500-1 48 000-1 < 10-1 20-1
3 64 000-1 40-1
Camundongos imunizados com o
TNFa murino (grupo B)
4 < 500-1 750-1 < 10-1 10-1
5 1 000-1 20-1
6 750-1 10-1
Camundongos imunizados com o
KLH-TNFa murino na presença de CpG (grupo C)
72/78
7 < 500-1 128 000-1 < 10-1 160-1
8 256 000-1 80-1
9 256 000-1 320-1
Camundongos imunizados com o
TNFa murino na presença de CpG (grupo D)
7 < 500-1 2 000-1 < 10-1 20-1
8 4 000-1 40-1
9 3 000-1 40-1
Petição 870190008294, de 25/01/2019, pág. 89/99
73/78
Exemplo 33: Atividade imunogênica de heterocomplexo de peptídeo de Tat-hIgE
A. Material e métodos [0386] A atividade imunogênica (humoral) da preparação KLH- IgE humano em relação à de IgE humano foi estudada junto ao camundongo Balb/c de 18-20 g.
1. Imunização [0387] No dia 0, 7, 14, 21, um grupo de 3 camundongos recebe uma injeção de 0,1 ml (10 pg) de uma emulsão em AIF por via intramuscular. Uma injeção de reforço de 5 pg em AIF é dada no dia 60.
[0388] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbitral é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2.
[0389] 3 camundongos de controle recebem as mesmas preparações sem imunogene.
[0390] Os camundongos são sacrificados 12 dias após a última imunização.
2. Toxicidade [0391] A toxicidade anormal é procurada junto a 3 camundongos recebendo 1 dose humana (50 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0392] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado em PBMCs cultivados em presença do complexo e estimulados por PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados
2. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0393] Os camundongos imunizados tanto pela preparação de KLH- IgE humano como por IgE humano apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ml de KLH- IgE humano não diminuem a proliferação de linfócitos.
[0394] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 50 pg de heterocomplexo manifesta sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção.
2. Resposta humoral [0395] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo
Petição 870190008294, de 25/01/2019, pág. 90/99
74/78
IgG dirigidos contra IgE humano, determinado por ELISA e expresso em título (inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3). A tabela seguinte representa os títulos de anticorpos obtidos.
Tabela 12
Título
dia 2 dia 72
Camundongo controle
1 < 500-1 < 500-1
2
3
Camundongos imunizados com hIgE
4 < 500-1 64 000-1
5 128 000-1
6 128 000-1
Camundongos imunizados com KLHhIgE
7 < 500-1 256 000-1
8 128 000-1
9 256 000-1
[0396] Os camundongos imunizados com a preparação KLH-hIgE apresentam títulos de anticorpos de tipo IgG levemente superiores aos dos camundongos imunizados com a preparação de hIgE.
Exemplo 34: Atividade imunogênica de heterocomplexo KLH-ricina-β
B. Material e métodos [0397] A atividade imunogênica (humoral) da preparação KLH- Ricina- β em relação à do fragmento β da ricina foi estudada junto ao camundongo Balb/c de 18-20 g.
1. Imunização [0398] No dia 0, 7, 14, 21, um grupo de 3 camundongos recebe uma injeção de 0,1 ml (10 pg) de uma emulsão em AIF por via intramuscular. Uma injeção de reforço de 5 pg em AIF é dada no dia 60.
Petição 870190008294, de 25/01/2019, pág. 91/99
75/78 [0399] Uma amostra sanguínea ao nível retro-orbitral é efetuada sobre cada camundongo antes da primeira injeção no dia 2.
[0400] 3 camundongos de controle recebem as mesmas preparações sem imunogene.
[0401] Os camundongos são sacrificados 12 dias após a última imunização.
2. Toxicidade [0402] A toxicidade anormal é procurada junto a 3 camundongos recebendo 1 dose humana (50 pg) de acordo com a farmacopéia.
[0403] A ausência de imunotoxicidade do heterocomplexo é avaliada in vitro por um teste de proliferação celular realizado em PBMCs cultivados em presença do complexo e estimulados por PPD ou tétanos toxóide.
B. Resultados [0404] 2. Ausência de toxicidade do heterocomplexo in vivo e in vitro [0405] Os camundongos imunizados tanto pela preparação de KLH- Ricina humano como pelo fragmento β da ricina apenas não apresentam nenhum sinal clínico e nenhuma lesão anatômica. O teste de imunossupressão mostra que as doses de 100 ng/ml a 1 pg/ml de KLH- Ricina - β não diminuem a proliferação de linfócitos.
[0406] Nenhum dos 3 camundongos imunizados com 50 pg de heterocomplexo manifesta sinais de toxicidade (temperatura, males cutâneos, manifestações sistêmicas ou regionais) durante os 7 dias após a injeção.
2- Resposta humoral [0407] A resposta humoral é medida pela presença no soro de anticorpos de tipo IgG dirigidos contra o fragmento β da ricina, determinado por ELISA e expresso em título (inverso da diluição dando uma densidade óptica superior a 0,3). A tabela seguinte representa os títulos de anticorpos obtidos.
Tabela 13
Título
dia 2 dia 72
Camundongo controle
Petição 870190008294, de 25/01/2019, pág. 92/99
76/78
1 < 500-1 < 500-1
2
3
Camundongos imunizados com ricina-β
4 < 500-1 256 000-1
5 512 000-1
6 256 000-1
Camundongos imunizados com KLHricina-β
7 < 500-1 256 000-1
8 256 000-1
9 128 000-1
[0408] A atividade neutralizante destes anticorpos foi verificada por injeção ao camundongo de misturas de soro anti-ricina β e de ricina que não acarretaram a morte do animal, ao inverso do que foi observado quando da administração ao camundongo de misturas de ricina e de soro normal.
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Claims (12)

1. Produto imunogênico estável para a indução de anticorpos contra uma ou várias proteínas antigênicas em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que ele consiste de heterocomplexos imunogênicos proteicos constituídos por associações entre (i) as moléculas de proteínas antigênicas e (ii) as moléculas proteicas transportadoras e em que pelo menos 1 por cento e menos de 40 por cento das proteínas antigênicas (i) são ligadas covalentemente com as moléculas proteicas transportadoras (ii) por uma ligação covalente e em que as moléculas de proteínas antigênicas (i) consistem em citocinas produzidas naturalmente pelo referido indivíduo, em que as referidas citocinas são de origem humana ou murino, e em que o produto imunogênico é selecionado entre produtos compreendendo os seguintes heterocomplexos:
a) (i) IL-4 e (ii) KLH;
b) (i) interferon alfa e (ii) KLH;
c) (i) VEGF e (ii) KLH;
d) (i) interferon alfa e (ii) gp 160 de HIV 1;
e) (i) TNF alfa e (ii) KLH.
2. Produto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele compreende de 5 a 50 proteínas antigênicas (i) para uma molécula proteica transportadora (ii), preferivelmente de 20 a 40 proteínas antigênicas (i) para uma molécula proteica transportadora (ii).
3. Produto imunogênico de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as ligações covalentes entre uma ou vária das proteínas antigênicas (i) e a molécula proteica transportadora (ii) são realizadas por intermédio de um agente químico de ligação bifuncional.
4. Produto imunogênico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido agente químico de ligação compreende pelo menos duas funções aldeídos livres.
Petição 870190074214, de 02/08/2019, pág. 10/11
2/2
5. Produto imunogênico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido agente químico de ligação é o glutaraldeído.
6. Composição, caracterizada pelo fato de compreender um produto imunogênico tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um produto imunogênico tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em associação com um ou vários excipientes fisiologicamente compatíveis.
8. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de compreender um produto imunogênico tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em associação com um ou vários excipientes fisiologicamente compatíveis.
9. Composição de vacina caracterizada pelo fato de compreender um produto imunogênico tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em associação com um ou vários excipientes fisiologicamente compatíveis.
10. Composição imunogênica ou composição de vacina tal como definido em qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que ela compreende o adjuvante de imunidade CpG.
11. Processo de preparação de um produto imunogênico tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que ele compreende as etapas seguintes:
a) incubar as proteínas antigênicas (i) consistindo em citocinas produzidas naturalmente pelo referido indivíduo e a molécula transportadora (ii) em uma relação molar (i):(ii) de 5:1 a 50:1, em presença de um agente químico de ligação,
b) etapa de estabilização de heterocomplexos imunogênicos por formaldeídos, antes da etapa c) de recuperar o produto imunogênico,
c) recuperar o produto imunogênico compreendendo os heterocomplexos imunogênicos que é preparado na etapa b).
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o agente químico de ligação é o glutaraldeído.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 16/09/2003 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF