JP4698223B2 - 抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性産物 - Google Patents
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Description
この第1の形の免疫原構成の例はIL-9とオバルブミンとの間の共有結合産物の調製方法に関する下記論文に記載されている。
Richard達〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.97(2):767-772〕
関連抗原と超抗原との間の共有結合からの産物をポリマーの形にすることもできる。この場合にはモノマー状の結合産物を共有結合でない例えばイオン相互作用、吸着相互作用および生物特異性相互作用で互いに結合させる。例えばモノマー結合産物を低イオン強度状態で生じた塩ブリッジで結合して正または負に強く荷電した分子の複合体に形成できる。モノマー結合産物から大きな複合体を作るにはポリ(L-グルタミン酸)またはポリ(L-リシン)のような荷電ポリマーを用いる。モノマー結合産物からポリマーを作る別の実施例では関連抗原と超抗原との間の共有結合のみからなる結合産物を微小粒子(ラテックスビーズ、その他の疎水性ポリマー)の表面で吸収するか、共有結合以外の結合で結合させる。
さらに、乳酸およびグルタミン酸のような生体分解性微小粒子も知られている(非特許文献2参照)。
Aguado and Lambert(1992、Immuno.Biol.、Vol.184:113-125)
ハイブリッド組換え蛋白のみで構成される粒子も開示されている(特許文献3参照)。
さらに、従来法では低分子量の関連抗原と担体分子とを組合わせることはできるが、高分子量(例えば10kDa以上)の関連抗原を担体分子と結合させるのは一般に適していない。すなわち、高分子量の関連抗原の分子は立体障害のため同一担体分子に結合させることができない。
本発明の免疫原性産物を構成する免疫原性ヘテロ複合体は、1つの担体蛋白分子(ii)に対して5〜50個の抗原蛋白(i)、好ましくは1つの担体蛋白分子(ii)に対して20〜40個の抗原蛋白(i)を含むのが好ましい。
一種または複数の抗原蛋白(i)と担体蛋白分子(ii)との間の共有結合は官能性結合剤によって行うのが好ましい。
b) (i)αインターフェロン、(ii)KLH;
c) (i)VEGF、(ii)KLH;
d) (i)IL-10、(ii)KLH;
e) (i)αインターフェロン、(ii)VIH1のgp 160;
f) (i)IL-4、(ii)Bet v1 アレルゲン性抗原;
g) (i)VEGF、(ii)パピロマウイルスE7蛋白;
h) (i)不活性化VIH1 Tat蛋白、(ii)VIH1 gp120蛋白;
i) (i)アイソタイプIgEヒト抗体、(ii)不活性化VIH1 Tat蛋白;
j) (i)リシンβ断片、(ii)KLH
本発明のさらに他の対象は、下記の段階を含む上記免疫原性産物の調製方法にある:
a)抗原蛋白(i)と担体分子(ii)とを化学結合剤の存在下で(i):(ii)のモル比を10:1〜50:1にして培養し、
b)段階a)で得られた免疫原性ヘテロ複合体を含む免疫原性産物を回収する。
本発明の免疫原性蛋白ヘテロ複合体
本発明者は、関連抗原と担体蛋白とを一部が共有結合で且つ一部が共有結合でない結合で組合せた関連抗原と担体蛋白とを組合せた免疫原性産物で個体を免疫化することによって、個体において関連抗原に対して特異な抗体を高レベルで生産できるということを見出した。
(i)免疫原性産物を溶液中の変性状態および還元状態にし、
(ii)サイズ排除クロマトグラフィー段階を行い、この段階(ii)の最後にサイズ排除クロマトグラフィー担体から分子量が低下した各種の蛋白成分を溶離させ、
(iii)最高分子量の蛋白成分を含む溶離フラクション中の担体分子と共有結合で結合している関連抗原の量を測定し、
(iV)段階(iii)で測定した関連抗原の量を出発原料の免疫原性産物中に初期に含まれていた関連抗原の総量と比較する。
a)担体蛋白に対して産生される特異抗体を支持体に固定化し、
b)段階a)で支持体に固定化した担体蛋白に対して産生される抗体を、担体蛋白と関連抗原蛋白とを含む試験する免疫原性産物の所定量の分子と接触させ、
c)段階a)で固定化した抗担体蛋白抗体と結合していない免疫原性産物の分子を、一種または複数の蛋白変性剤を含む緩衝水溶液によって除去し、
d)
d1)固定化された抗担体蛋白抗体と免疫原性産物の分子との間に段階c)で形成された免疫原性複合体(i)を担体蛋白に対して特異的に産生された抗体(ii)と接触させ、
d2)固定化された抗担体蛋白抗体と免疫原性産物の分子との間に段階c)で形成された免疫原性複合体(i)を、段階d1)とは別に、関連抗原に対して特異的に産生された抗体(ii)と接触させ、
e)
e1)担体蛋白と結合した、段階d1)で追加した抗体を定量し、
e2)抗原蛋白と結合した、段階d2)で追加した抗体を定量し、
f)段階e1)で測定された抗担体蛋白結合抗体の量(i)と、段階e2)で測定された抗担体蛋白結合抗体の量(ii)との比を計算する。この比が出発原料の免疫原性産物において共有結合によって互いに結合した担体蛋白分子と関連抗原蛋白分子の比率である。
上記の方法の詳細なプロトコルについては実施例で説明する。
1) KLH担体分子とヒトαインターフェロン分子との間にヘテロ複合体を含む免疫原性産物では3〜8%のαインターフェロン分子がKLH担体蛋白分子と共有結合で結合されている。
2) KLH担体蛋白分子とマウスIL-4分子との間にヘテロ複合体を含む免疫原性産物では約11%のIL-4分子がKLH担体蛋白分子と共有結合で結合している。
本発明の免疫原性産物では抗原蛋白(i)の少なくとも1%、好ましくは少なくとも2%が担体分子(ii)と共有結合で結合されているのが有利である。
換言すれば、本発明の免疫原性ヘテロ複合体を含む免疫原性産物の形で「自己」抗原を個体の免疫系の細胞に与えることによって、そのような抗原に対する個体の免疫系の寛容を「破壊する」ことができる。本出願人は本発明によって「自己」抗原に対して高いレベルの抗体応答が得られるのは補助的Tリンパ球を活性化する、担体蛋白分子が有する「補助的なT」型(またはTヘルパー)の多数のエピトープがヘテロ複合体中に存在すること、さらに、活性化された補助的Tリンパ球によって生産されたIL-2を含むサイトカインによって生物中に潜伏状態で存在する「自己」抗原に対するB細胞の活性化の一部を促進され、それによって「自己」抗原に対するB細胞の免疫寛容が破壊できるためと考えるが、この理論に縛られるものではない。
関連抗原と担体蛋白分子との結合の60%以上の大部分が共有結合でない相互作用によって行われるという事実から、一つの担体蛋白分子に結合する関連抗原の分子の数は担体分子を有する関連抗原の分子の立体的構造上のアクセス可能性以外には理論的に制限されない。特に、一つの同じ担体蛋白分子に結合する関連抗原の分子の数は関連抗原の複数の分子と共有結合で結合を形成できる担体分子の化学反応の官能基の数で制限されない。従って、唯一の制限は物理的なもので、抗原蛋白(i)にアクセス可能な担体蛋白分子(ii)のサイトの数と思われる。
水溶液中の免疫原性産物の溶解度はヘテロ複合体中の分子相互作用を規制する平衡、特にいわゆる(共有結合でない)「弱い」結合および抗原蛋白および担体蛋白分子の濃度に依存する電気化学的平衡、さらには、イオン強度、pHおよび温度条件によって変わることも確認された。
1)N-ヒドロキシスクシンイミド、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)エステル、ジスクシンイミジルスベレートおよびジスクシンイミジルタータラート;二官能性イミドエステルジメチルアジピミデート、ジメチルピメリミデートおよびジメチルスベリミデート;
2)メルカプト基を有する反応剤、1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジレジチオ)プロピオンアミド]ブタン、ビスマレイミドヘキサンおよびビス−N−マレイミド-1,8-オクタン;
3)アリール型の二官能性ハロゲン化物および4,4'-ジフルオロ-3,3'-ジニトロフェニルスルホン;
4)SMCC(スクシンイミジル-4-(N-マレインイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート);
5)SIAB(N-スクシンイミジル(4-イオドアセチル)アミノベンゾエート);
6)SMPB(スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート);
7)GMBS(N-(γ-マレイミドブチルオキシ)スクシンイミドエステル);
8)MPBH(4-(4-N−マレイミドフェニル)ヒドラジドブチル酸;
9)M2C2H(4-(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシル−ヒドラジド);
10)SMPT(スクシンイミジルオキシカルボニル-α-(2-ピリジル−ジチオ)トルエン)、および、
11)SPDP(N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート)。
本発明の免疫原性ヘテロ複合体を含む免疫原性産物は溶液、特に水溶液に可溶なミクロ粒子の形をしている。その平均粒径は(i)担体蛋白分子の寸法、(ii)単一の担体蛋白分子に結合した抗原蛋白の寸法と数および(iii)ヘテロ複合体粒子中に存在する抗原蛋白に結合した担体分子の数によって変わる。
本発明の免疫原性蛋白ヘテロ複合体を含む免疫原性産物は抗原蛋白に結合した担体分子のみを含み、他の物質を全く含まないのがさらに好ましい。特に、本発明のヘテロ複合体は担体と担体を特徴付ける抗原蛋白以外、ポリマー、蛋白または非蛋白の物質を含まない。
ZAGURY D達(2001、Proc.Nail.Acad.Sci.USA.98(14):8024-8029)
第1の観点では、本発明の免疫原性産物の一つまたは複数の抗原蛋白(i)は対象者によって自然に生産されるサイトカインからなる。この一つまたは複数の抗原蛋白(i)はインターロイキン-4、αインターフェロン、γインターフェロン、VEGF、インターロイキン-10、TNFα、TGFβ、インターロイキン-5およびインターロイキン-6の中から選択するのが好ましい。
次に、本発明の免疫原性産物中に含まれるこのような免疫原性ヘテロ複合体組成物の各種の病理の治療に有効なワクチン接種による予防または治療法の例を説明する。
担体蛋白分子(ii): 必要に応じて無毒化または安定したHIV1 ウイルスのgp 120、gp 160、p24、p17、nefまたはTat蛋白、これら蛋白の免疫原性断片と、それに由来する免疫原性蛋白(下記文献参照)。
Zagury et al., 1998
Fouts et al. (2000) Fouts et al. (2002)
担体蛋白分子(ii):必要に応じて無毒化または安定したパピロマウイルスL1, L2およびE7蛋白、好ましくは系統16または18からのパピロマウイルス、これら蛋白の免疫原性断片またはそれに由来する免疫原性蛋白(下記文献参照)。
Le Buanec et al., 1999
担体蛋白分子(ii): 必要に応じて無毒化または安定したgp61およびHTLV1または2ウイルスTax蛋白、これら蛋白の免疫原性断片またはそれに由来する免疫原性蛋白(下記文献参照)。
Cowan et al., 1997 Mori et al.,1996
担体蛋白分子(ii): 必要に応じて無毒化したCEAおよびp53蛋白、これら蛋白の免疫原性断片またはそれに由来する免疫原性蛋白(下記文献参照)。
Zusman et al., (1996)
担体蛋白分子(ii):Di12蛋白、この蛋白の免疫原性断片またはそれに由来する免疫原性蛋白(下記文献参照)。
Yoshiji et al., 1996
担体蛋白分子(ii):必要に応じて無毒化したCaSm蛋白、この蛋白の免疫原性断片またはそれに由来する免疫原性蛋白。
抗原蛋白(i):必要に応じて無毒化または安定したVEGFおよびTNFα蛋白、この蛋白の免疫原性断片またはそれに由来する免疫原性蛋白。
担体蛋白分子(i):必要に応じて無毒化または安定したOSAおよびETS2蛋白、この蛋白の免疫原性断片またはそれに由来する免疫原性蛋白(下記文献参照)。
Sementchenko VI et al.,1998
Adler et al.,1999
担体蛋白分子(ii): Betν1(カバノキの花粉)、Der p 1(コナダニ)およびFel d 1(猫)蛋白、これら蛋白の免疫原性断片またはそれに由来する免疫原性蛋白のような分子同種異系の中から選択される。Betν1抗原(非特許文献14)、Der p 1抗原(非特許文献15)、Fel d 1抗原(非特許文献16)はそれぞれ下記文献に記載されている。
Ferreira et al. (1993) Tovey et al. (1981) Morgensterm et al. (1991)
本発明の免疫原性産物はさらに、化学兵器および生物兵器で使用される多数の毒物、例えばリシンに対して個体を免疫化するために用いることもできる。
抗体の生産によって免疫化することが求められる最も毒性のある蛋白としてはボツリヌス毒素、リシン、ブドウ球菌エンテロトキシン、ウェルシュ菌毒素および炭疽毒素蛋白がある。
a)グルタルアルデヒドによる天然毒性蛋白の処理、
b)ホルモールとグルタルアルデヒドとの併用による天然毒性蛋白の処理、または、
c)必要に応じた適切な試薬を用いたHisおよびTyrグループの化学修飾、例えばアミノ酸基のカルボキシメチル化。
ボツリヌス菌に由来する毒の致死作用を防止するためには抗原蛋白(i)として単鎖の150 kDaポリペプチド鎖の形で自然に合成されたA, B, C, D, E, FおよびGと、これら毒素の分子量が約50 kDaのHc断片の中から選択されるボツリヌス毒素に由来する無毒化された蛋白を用いるのが好ましい。
Fiock, M.A., Cardella, M.A.,Gearinger, N.F., J. Immunol., 1963, 90, 697-702 Siegel, L.S., J. Clin. Microbiol., 1988, 26, 2351-2356
本発明は(i)リシンのβ断片と、(ii)KLH蛋白とを含む免疫原性産物を提供する。
Osborne,T.B., Mendel,LB. and Harris,J.F.: Amer. J. Physiol., 1905, 14,259-269; Kabat,E.A.Heidelberger,M. and Bezer,A.E.: J. Biol. Chem., 1947, 168,629-; Kunnitz,M. and McDonald,M. :J.Gen.Physiol., 1948,22,25-Moule,Y.:Bull.Soc.Chim.Biol., 1951,33,1461-1467
Tomila,M., Kurokawa, T., Onozaki, K. et al.:Experientia, 1972, 28, 84-85 Nicolson, G.L. and Blaustein, J.: J. Biochim. Biophys.Acta, 1972, 266, 543-547 Olsnes,S., Salvedt, E. and Pihl,A.:J. Biol. Chem.,1974,249,803-810
Hedge,R. and Podder,S.K.,:Eur.Biochem., 1998, 254, 596-601)
SEAは257個のアミノ酸を有する前駆エンテロトキシンの形で合成される(下記文献参照)。
Huang, I.Y., Hughes, J.L, Bergdoll, M.S. and Schantz, E.J. J Biol. Chem. 1987, 262, 7006-7013
Betley, M.J. and Mekalanos, J.J. J Bacteriol., 1998, 170. 34-41。SEAは抗原的に異なる3つのアイソフォームを有する。
Kappler, J.W., Herman,A., Clements, J. and Marrack, P.: J. Exp. Med., 1992, 175, 387-396; Papageorgiu, A.C., Trauter, H.S. and Acharya, K.R. J Mol. Biol., 1998, 277, 61-79; Soos, J.M. and Johnson, H.M. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 201, 596-602
Houde, C.J., Hackett, S.P. and Bohach, G.A. Mol. Gen. Genet., 1990, 220, 329-333 Bohach, G.A. and Schlievert, P.M. : Infect. Immun., 1989, 57, 2243-2252
SEGは233個のアミノ酸基で構成される(下記文献参照)。
Munson, S.H., Tremaine, M.T., Betley, M.J. and Welch, R.A.: Infect. Immun., 1998, 66, 3337-3348
Su, Y.C. and Wong, A.C.: Apll. Environ. Microbiol., 1995, 61, 1438-1443
SEIは218個のアミノ酸基を含む配列を有する。これは他のエンテロトキシンとの相同性が最低レベルの毒素である。
269個のアミノ酸基で構成されるSEJはSEA, SEEおよびSEDとのAA 配列相同性が高い(64〜66%)。
例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンの毒性防止用のワクチン組成物を調製するための本発明の免疫原性産物はブドウ球菌エンテロトキシンにそれぞれ由来する2,3,4または5個の抗原蛋白(i)を有するのが好ましい。
従って、本発明の免疫原性産物の第1の観点では、担体蛋白分子が補助的なTリンパ球(「ヘルパーT」)と、細胞障害性Tリンパ球と、担体蛋白分子に特異なBリンパ球との生産を同時に誘発し、この担体蛋白分子(ii)はパピロマウイルスL1、L2およびE7蛋白の中から選択される。
b) (i)αインターフェロン、(ii)KLH;
c) (i)VEGF、(ii)KLH;
d) (i)IL-10、(ii)KLH;
e) (i)αインターフェロン、(ii)VIH1のgp 160;
f) (i)IL-4、(ii)Bet v1 アレルゲン性抗原;
g) (i)VEGF、(ii)パピロマウイルスE7蛋白;
h) (i)不活性化VIH1 Tat蛋白、(ii)VIH1 gp120蛋白;
i) (i)アイソタイプIgEヒト抗体、(ii)不活性化VIH1 Tat蛋白;
j) (i)リシンβ断片、(ii)KLH
本発明のさらに他の対象は、下記の段階を含む上記定義の免疫原性ヘテロ複合体を含む免疫原性産物の調製方法にある:
a)抗原蛋白(i)と担体分子(ii)とを化学結合剤の存在下で(i):(ii)のモル比を10:1〜50:1にして培養し、
b)段階a)で得られた免疫原性ヘテロ複合体を含む免疫原性産物を回収する。
本発明方法は段階a)の後かつ免疫原性産物の回収段階b)の前に、ホルムアルデヒドによる免疫原性ヘテロ複合体の安定化段階を含むのがさらに好ましい。
化学結合剤としてグルタルアルデヒドを用いるときは、グルタルアルデヒドがカップリング反応媒体中に最終濃度で0.002M〜0.03M、好ましい0.02M〜0.03M、さらに好ましくは0.026Mの濃度で存在する。
カップリング段階後、過剰グルタルアルデヒドを例えばカットオフ閾値が3kDaである透析膜を用いた透析によって除去する。透析段階はpH7.6に調整された4℃の緩衝液中で行うのが有利である。
本発明のさらに別の対象は上記定義の免疫原性産物を含む組成物にある。
本発明のさらに他の対象は上記定義の免疫原性産物を含む医薬組成物にある。
本発明のさらに他の対象は活性成分として上記定義の免疫原性産物を含む、一種または複数の生理学的に許容される賦形剤と組み合わせた免疫組成物にある。
本発明のさらに他の対象は上記定義の免疫原性産物を一種または複数の生理学的に許容される賦形剤と組み合わせて含むワクチン組成物にある。
全身免疫用のアジュバントの中ではIFAタイプ・アジュバント(不完全フロイントアジュバント)、リン酸カルシウムまたは水酸化アルミナ物を使用するのが好ましい。
粘膜免疫用アジュバントとしては当業者に周知のchloratoxin B(CTB)、LT毒突然変異(LTμ)等を使用するのが好ましい。
実際に、CpGアジュバント、特にヌクレオチド間の鎖内結合がホスホロチオネート結合中に存在するCpGアジュバントを用いることによって全身投与後にIgGおよびIgAのアイソタイプ抗体の生産を同時に刺激できるということを本発明は確認した。
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは癌、特にウイルスによって誘発される癌、例えばHTLV1に起因するATL(急性T細胞白血病)またはパピロマウイルスに起因する子宮頸癌およびヘルペス属ウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV)およびHHV8に起因するバーキットリンパ腫ならびにカポジ肉腫の治療的または予防的処置やアレルギー反応の予防または治療で有用である。
患者には予防または治療に有効な量の本発明の免疫原性蛋白ヘテロ複合体を含む免疫原性産物を治療の必要に応じて全身または粘膜投与するのが好ましい。投与量は例えば2ヵ月間、鼻腔内経路で毎週投与した場合、10〜1000μgであり、その後は、関連抗原に対する抗体応答の一過性の特徴を考慮して、血清抗体率に応じて定期的に、例えば2〜6ヵ月間投与する。
下記文献に記載のガレヌス型のものが特に適している。
Boyaka et al. ≪ Strategies for mucosal vaccine development ≫ in Am. J. Trop. Med. Hyg. 60(4), 1999, pages 35-45
Rojas et al. in Pharmaceutical Research, vol. 16, n°2, 1999, page 255
他の特定実施条件下では水酸化アルミナまたは金粒子のような活性成分を吸収するアジュバントを含むワクチン医薬組成物を選択する。
上記方法の好ましい実施条件下では消化経路用の生体接着性および抗胃性の微粒剤を調製する。この場合には免疫原性活性成分と必要に応じてアジュバントとを含む。
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
実施例1
KLH-VEGFヘテロ複合体の調製
0.58mgのKLH蛋白を0.5mlのpH8.5の10 mM燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1mlに1mgのマウスVEGFを溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて最終濃度が0.026 Mとなるように室温で30分間処理する。
次いで過剰グルタルアルデヒドを2時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析管中で4°Cでカットオフ閾値3 kDaにしてpH 7.6の10 mM燐酸緩衝液200 mlに対して行う。
次に、混合物をホルムアルデヒドを用いて33mMの最終濃度で24時間処理した後、最後に0.1 Mのグリセリンを室温で1時間添加して反応を止める。
混合物を前回行った透析と同じ条件下で透析する。
ヒトKLH-VEGFヘテロ複合体
このヘテロ複合体は主としてヒトVEGFを中和する抗体の生産をワクチン中で誘発するワクチンの活性成分である。
0.58mgのKLH蛋白を0.5mlのpH 8.5の10mM燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に同じ緩衝液1mlに1mgのマウスVEGFを溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で30分間処理する。
次いで過剰グルタルアルデヒドを2時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析管中で、pH 7.6の10 mM燐酸緩衝液200 mlに対して、カットオフ閾値3 kDa、4°Cで行う。
次に、混合物をホルムアルデヒドを用いて33mMの最終濃度で24時間処理した後、最終0.1 Mのグリセリンを室温で1時間添加して反応を止める。
最後に、前回行った透析と同じ条件下で混合物を透析する。
マウスKLH-IL4ヘテロ複合体の調製
0.841 mgのKLH蛋白を0.8mlのpH 8.5の10 mM燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1mlに1mgのマウスIL4を溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で30分間処理する。
次いで過剰グルタルアルデヒドを2時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析管中で、pH 7.6の10 mM燐酸緩衝液200 mlに対して、カットオフ閾値3 kDa、4°Cで行う。
次に、混合物をホルムアルデヒドを用いて33mMの最終濃度で24時間処理し、最終0.1 Mのグリセリンを室温で1時間添加して反応を止める。
最後に、前回行った透析と同じ条件下で混合物を透析する。
ヒトKLH-IL4ヘテロ複合体の調製
このヘテロ複合体は主としてヒトIL4を中和する抗体の生産をワクチン中で誘発するワクチンの活性成分である。
1mgのKLH蛋白を1mlのpH 8.5の10 mM燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1mlに1mgのマウスIL4を溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で30分間処理する。
次いで過剰グルタルアルデヒドを2時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析管中で、pH 7.6の10 mM燐酸緩衝液200 mlに対して、カットオフ閾値3 kDa、4°Cで行う。
次に、混合物をホルムアルデヒドを用いて33mMの最終濃度で24時間処理した後、最終0.1 Mのグリセリンを室温で1時間添加して反応を止める。
最後に、前回行った透析と同じ条件下で混合物を透析する。
KLH-IFNα複合体の調製
このヘテロ複合体は主としてヒトIFNαを中和する抗体の生産をワクチン中で誘発するワクチンの活性成分である。
0.625mgのKLH蛋白を0.6mlのpH 8.5の10 mM燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1mlに1mgのヒトIFNαを溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で30分間処理する。
次いで過剰グルタルアルデヒドを2時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析管中で、pH 7.6の10 mM燐酸緩衝液200 mlに対して、カットオフ閾値3 kDa、4°Cで行う。
次に、混合物をホルムアルデヒドを用いて33mMの最終濃度で48時間処理した後、最終0.1 Mのグリセリンを室温で1時間添加して反応を止める。
最後に、前回行った透析と同じ条件下で混合物を透析する。
gp160-IFNα複合体の調製
このヘテロ複合体は主としてHIV-1 ウイルスのgp160構造蛋白とIFNαサイトカイン蛋白の両方を中和する抗体の生産をワクチン中で誘発するワクチンの活性成分である。このヘテロ複合体はgp160を発現する感染細胞に対して細胞反応(chemiokin、補助的T、CTL)を誘発できるものでもなければならない。
0.380mgのgp160蛋白を0.380mlのpH 8.5の10 mM燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1mlに1mgのヒトIFNαを溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で30分間処理する。
次いで過剰グルタルアルデヒドを2時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析管中で、pH 7.6の10 mM燐酸緩衝液200 mlに対して、カットオフ閾値3 kDa、4°Cで行う。
次に、混合物をホルムアルデヒドを用いて33mMの最終濃度で48時間処理した後、最終0.1 Mのグリセリンを室温で1時間添加して反応を止める。
最後に、前回行った透析と同じ条件下で混合物を透析する。
gp160-トキソイドTatヘテロ複合体(Tat蛋白は生化学的に不活性化)の調製
このヘテロ複合体は主としてHIV-1 ウイルスのgp160構造蛋白とVIH-1の細胞外Tat蛋白の両方を中和する抗体の生産をワクチン中で誘発するワクチンの活性成分である。このヘテロ複合体はgp160を発現する感染細胞に対して細胞反応(chemiokin、補助的T、CTL)を誘発できるものでもなければならない。
0.550mgのgp120蛋白を0.550mlのpH 8.5の10 mM燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1mlに1mgのトキソイドTat蛋白を溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で30分間処理する。
次いで、最終0.1 Mのグリセリンを室温で1時間添加して反応を止める。次に、過剰グリセリンを2時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析管中で、pH 7.6の10 mM燐酸緩衝液200 mlに対して、カットオフ閾値3 kDa、4°Cで行う。
gp160-GM Tatヘテロ複合体(Tat蛋白は遺伝学的に不活性化)の調製
このヘテロ複合体は主としてHIV-1 ウイルスのgp160構造蛋白とVIH-1を制御するTat蛋白の両方を中和する抗体の生産をワクチン中で誘発するワクチンの活性成分である。このようなヘテロ複合体はgp160を発現する感染細胞に対して細胞反応(chemiokin、補助的T、CTL)を誘発できるものでもなければならない。
0.550mgのgp160蛋白を0.550mlのpH 8.5の10 mM燐酸緩衝液に溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1mlに1mgのGM Tat蛋白を溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で30分間処理する。
次いで、最終0.1 Mのグリセリンを室温で1時間添加して反応を止める。次に、過剰グリセリンを2時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析管中で、pH 7.6の10 mM燐酸緩衝液200 mlに対して、カットオフ閾値3 kDa、4°Cで行う。
マウスKLH-TNFαヘテロ複合体の調製
このヘテロ複合体は主としてマウスTNFαを中和する抗体の生産をワクチン中で誘発可能なワクチンの活性成分である。
0.625mgのKLH蛋白を0.6mlのpH 8.5の10 mM硼酸緩衝液、150mM NaClに溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1mlに1mgのヒトIFNαを溶解したものを添加する。こうして得られた蛋白混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で45分間処理する。
過剰グルタルアルデヒドを次いで4時間の透析を3回続けて除去する。各透析は透析管中で、pH 7.6の10 mM 150mM NaCl 硼酸緩衝液200 mlに対して、カットオフ閾値3 kDa、4°Cで行う。
次いで混合物をホルムアルデヒドを用いて33mMの最終濃度で48時間処理した後、最終0.1 Mのグリセリンを室温で1時間添加して反応を止める。
最後に、前回行った透析と同じ条件下で混合物を透析する。
Tatペプチドヘテロ複合体(19-50)- h IgEの調製
Tatペプチド(19-50)は補助的なヘルパーエピトープを有する。
用いたTatペプチドの配列:
Lys-Thr-Ala-Cys-Thr-Asn-Cys-Tyr-Cys-Lys-Lys-Cys-Cys-Phe-His-Cys-Gln-Val-Cys-Phe-lle-Thr-Lys-Ala-Leu-Gly-lle-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys
この接合体(コンジュゲート)は(ヒト)抗IgE抗体の形成をワクチン中で誘発するワクチンの主活性成分である。
0.1mgのTatペプチド(19-50)(4.06×10-8mol)を0.2mlのpH 8.5の10mM硼酸緩衝液に溶解する。この溶液に、同じ緩衝液1mlに1mgのヒトIgE(6.6×10-9mol)を溶解したものを添加する。こうして得られた混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で30分間処理する。
次いで過剰グルタルアルデヒドを4時間の透析を続けて2回、さらに、最後に16時間の透析を行って除去する。透析は透析バッグを用いて、0.8%のNaCl(PBS)を含む10mM、pH7.4の大量の燐酸緩衝液に対して、カットオフ閾値10kDa、4℃で行う(IgEペプチド比50:1)。
リシン断片に対するヘテロ複合体の調製
このヘテロ複合体は主としてリシン分子の結合に関与する断片に対する中和抗体の形成をワクチン中で誘発してその毒性作用を及ぼさないようにするワクチンの活性成分である。
0.5mgのKLH(1.1×10-3mol)を0.5mlのpH 8.2の10mM燐酸緩衝液に溶解したものに、同じ緩衝液1mlに1mg(3.3×10-8mol)のリシンα断片を添加する。こうして調製された混合物をグルタルアルデヒドを用いて0.026 Mの最終濃度で室温で30分間処理する。
次いで過剰グルタルアルデヒドを4時間の透析を続けて2回、さらに、最後に16時間の透析を行って除去する。透析は透析バッグを用いて、0.8%のNaCl(PBS)を含む10mMの大量の燐酸緩衝液に対して、カットオフ閾値3kDaで行う(KLH:リシン比=1:30)。
A. 実施例12〜23の原料および方法
ヘテロ複合体は下記の方法で生化学的に特徴付けた。
1. 抗原性試験
ヘテロ複合体とヘテロ複合体を構成する蛋白の抗原性と比較する抗原性試験は、従来の間接ELISAによって行う。この技術では抗原に対して産生される抗体を特異的に認識することによって蛋白を定量的に測定できる。この試験では求める蛋白を含むサンプルの希釈液をミクロタイタープレートのウェルに入れ、特異的ポリクローナル抗体を固定化された蛋白と反応させる。次に、西洋わさびペルオキシダーゼと接合させた第1の抗体に特異な第2の抗体を添加する。形成された複合体をOPDと一緒に培養し、検出する。得られた黄色は結合した蛋白の量に正比例する。各ウェルの吸収度(DO)をミクロプレートリーダーで測定する。次いで、サンプル中に存在する蛋白の量を較正曲線を用いて決定する。
アガロースゲルでの等電点電気泳動は分子の等電点(Ip)に応じて分子を非変性状態で分離でき、それによってヘテロ複合体中に存在する弱い結合を切断せずにヘテロ複合体を調べることができる。
等電点電気泳動後、ウェスタンブロットで検出する。電気泳動で分離した分子を毛管作用でニトロセルロース膜に移し、分子を免疫化学的に特徴付ける。
免疫原性産物中で担体蛋白分子と共有結合で連結された関連抗原の分子の割合は、例えば変性(8M尿素)および還元(5%のβ-メルカプトエタノール)状態下でSuperdex 200を入れたカラムで分子篩いを用いて求めることができる。
共有結合で連結された関連抗原の割合は、カラムの排除容量中に存在する関連抗原の量(従来の間接ELISAによって決定)から求められる。すなわち、使用したカラムの最高分画限界以上のはるかに大きな分子量(実施例の場合には200 kDa)を有するKLHのような担体蛋白分子はカラムの排除容量中に存在する。従って、変性および還元状態下では担体蛋白分子と共有結合で連結された関連抗原のみが排除容量中に存在する。
担体蛋白分子(KLH)に固定されたサイトカインの割合を、担体蛋白に対して特異的な捕獲蛋白を用いた二重サンドイッチによって決定した。
10mM燐酸緩衝液、pH 7.3の150mM NaCl(PBS)に希釈されたKLH(1mg/ml)に対して産生された100μlのウマポリクローナル抗体をミクロタイタープレート(結合性が高いCostar)のウェル中で37℃で2時間結合させる。PBS/0.1%Tween20(PBST)中で3回洗浄した後、2%のBCSを含むPBSでウェルを飽和する。
2時間培養した後、ウェルをPBSTで3回洗浄する。洗浄緩衝液中に存在する解離剤のTweenで捕獲抗体に特異的に結合されたKLHと共有結合で連結されていない分子を全て除去する。
次に、両方のヘテロ複合体希釈液を2つの異なる方法で処理する:
a) 第1セットはKLHに対して産生された抗体と一緒に培養する。
b) 第2セットはサイトカインに対して産生された抗体と一緒に培養する。
捕獲抗体によって固定されたKLHの量、次いで、KLHに共有結合で連結されたサイトカインの量をELISAで作成した較正曲線によって計算する。
こうしてKLHに共有結合で連結されたサイトカインの割合が決定される。
KLH-マウスVEGFヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
KLH-マウスVEGFヘテロ複合体はマウスVEGFの抗原性と同一の抗原性を有する。
2. アガロースゲル中の等電点電気泳動後のウエスタンブロット
[図1]はKLH-マウスVEGFヘテロ複合体はそれを構成する天然分子とは異なるIpへ単一バンドの形で移動することを示している。
KLH-ヒトVEGFヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
KLH-ヒトVEGFヘテロ複合体はヒトVEGFの抗原性と同一の抗原性を有する。
2. 等電点電気泳動後のウエスタンブロット
[図2]からKLH-ヒトVEGFヘテロ複合体がそれを構成する天然分子とは異なるIpへ単一のバンドの形で移動することがわかる。ヒトVEGFのサンプルを3つの異なる位置に塗布したが、それでもやはり同じ位置へ移動した。
KLH-マウスIL4ヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
KLH-マウスIL4ヘテロ複合体はマウスIL4の抗原性と同一の抗原性を有する。
KLH-ヒトIL4ヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
KLH-ヒトIL4ヘテロ複合体はヒトIL4蛋白の抗原性と同一の抗原性を有する。
2. 等電点電気泳動とその後のウエスタンブロット
[図3]からKLH-ヒトIL4ヘテロ複合体がそれを構成する天然分子とは異なるIpへ単一バンドの形で移動することがわかる。
KLH-IFNαヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
ヒトKLH-IFNα複合体はヒトIFNαの抗原性と同一の抗原性を有する。
2. 担体蛋白分子と共有結合で連結された関連抗原の分子の割合の推定
KLH-IFNα調製物を上記条件に従ってSuperdex S200カラムに通す。排除容量の見掛けのピークを回収、透析、次いで、凍結乾燥する。関連抗原の濃度は間接ELISA技術で決定した。排除容量中に存在するIFNαの量は30μgであり、免疫原性産物の調製で用いたIFNの量は1000μgで、調製中に測定可能な抗体の損失はなかった。従って、KLH-IFNαを含む免疫原性産物中でKLH分子と共有結合で連結された関連抗原の分子の割合は約3%と推定できる。
gp160-IFNαヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
gp160-IFNα複合体はgp160蛋白の抗原性およびヒトIFNαの抗原性と同一の抗原性を有する。
2. 等電点電気泳動後のウエスタンブロット
[図4]からgp160-IFNαヘテロ複合体が、それを構成する組換えgp160蛋白とは異なるIpへ単一バンドの形で移動することがわかる。このようなヘテロ複合体のIpはIFNαのIpよりもわずかに低い。
gp160-トキソイドTatヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
gp160-トキソイドTat複合体はgp160蛋白の抗原性およびTat蛋白の抗原性と同一の抗原性を有する。
gp160-GM Tatヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
gp160-GM Tat複合体はgp160蛋白の抗原性およびTat蛋白の抗原性と同一の抗原性を有する。
KLH-マウスIL4ヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
マウスKLH-IL4複合体はマウスIL4の抗原性と同一の抗原性を有する。
2. 担体蛋白分子と共有結合で連結された関連抗原の分子の割合の推定
マウスIL4の分子の11%がKLHに共有結合で固定されている。
KLH-IFNαヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
KLHヒトIFNα複合体はヒトIFNαの抗原性と同一の抗原性を有する。
2. 担体蛋白分子に共有結合で固定された関連抗原の分子の割合の推定
ヒトIFNαの分子の8%がKLHに共有結合で連結されている。
Tat- h lgEペプチドヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
Tat-hlgEペプチド複合体はヒトlgEの抗原性と同等の抗原性を有する。
KLH-βリシンヘテロ複合体の生化学的特徴付け
1. 抗原性
KLH-βリシン複合体はリシンのβ断片の抗原性と同等の抗原性を有する。
2. 等電点電気泳動後のウエスタンブロット
複合体は単一バンドの形で移動し、ウェスタンブロットによってβ断片の存在が証明される。
実施例24
KLHマウスVEGFヘテロ複合体の免疫原性活性
A. 原料および方法
マウスVEGFと比較したKLHマウスVEGF調製物の免疫原(液性)活性を18〜20gのbalb/cマウスで試験した。
1 免疫化
8匹のマウス群に0、7、14、21日に0.1ml(10μg)のAIFエマルションを筋肉内注射した。60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−2日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
3匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
最後の免疫化から12日後にマウスを犠牲にした。
薬局方に従ってヒト1回量(50μg)を投与した3匹のマウスで異常毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
KLH-マウスVEGF調製物で免疫化したマウスと、マウスVEGFのみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのKLH-マウスVEGFはリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
50μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間、毒性の徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)は示さない。
液性応答性をマウスVEGFに対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した(0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数)。[図5]は得られた抗体価を示している。
KLH-マウスVEGF調製物で免疫化したマウスはマウスVEGFのみで免疫化したマウスよりも高いIgGタイプの抗体価を示す。
この抗体の中和活性を内皮細胞の選択的成長因子であるVEGFの生物活性テストを用いて測定した。内皮細胞(HUVEC)はミクロ培養プレートの平底ウエルで3,000細胞/ウエルで培養した。各マウス群の血清を貯蔵した。−2日および72日に採取した血清プールの各希釈液(1/100-1/800)を20 ng/mlのマウスVEGFと一緒に2時間予備培養した後、内皮細胞に塗った。細胞培養は5%CO2を含む湿った雰囲気中で37℃で3日間連続して行った。培養終了18時間前に0.5μCiのトリチウムチミジン/ウエルを加える。中和した血清はマウスVEGFが内皮細胞の増殖を誘発するのを防止し、中和していない血清はこのような細胞の増殖を許す。結果は中和%で表す。得られた結果は[図6]に示してある。
複合体で誘発される抗体はマウスVEGFで誘発される抗体よりも高い中和能を有する。
KLHヒトVEGFヘテロ複合体の免疫原性活性
A. 原料および方法
ヒトVEGFと比較したKLHヒトVEGF調製物の免疫原(液性)活性を18〜20gのbalb/cマウスで試験した。
1 免疫化
8匹のマウス群に0、7、14、21日に0.1ml(10μg)のAIFエマルションを筋肉内注射した。60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−2日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
3匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
最後の免疫化から12日後にマウスを犠牲にした。
薬局方に従ってヒト1回量(50μg)を投与した3匹のマウスで異常毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
KLH-ヒトVEGF調製物で免疫化したマウスと、ヒトVEGFのみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのKLH-ヒトVEGFはリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
50μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間、毒性徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)は全く示さない。
液性応答性をヒトVEGFに対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した(0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数)。[図7]は得られた抗体価を示している。
KLH-ヒトVEGF調製物で免疫化したマウスはヒトVEGFのみで免疫化したマウスよりも高いIgGタイプの抗体価を示す。
この抗体の中和活性を、内皮細胞の選択的成長因子であるVEGFの生物活性テストを用いて測定した。内皮細胞(HUVEC)はミクロ培養プレートの平底ウエルで3,000細胞/ウエルで培養した。各マウス群の血清を貯蔵した。−2日および72日に採取した血清プールの各希釈液(1/100-1/800)を20 ng/mlのヒトVEGFと一緒に2時間予備培養した後、内皮細胞に塗った。細胞培養は5%CO2を含む湿った雰囲気中で37℃で3日間連続して行った。培養終了18時間前に0.5μCiのトリチウムチミジン/ウエルを加える。中和した血清はヒトVEGFが内皮細胞の増殖を誘発するのを防止し、中和していない血清はこのような細胞の増殖を許す。結果は中和%で表す。得られた結果は[図8]に示してある。
複合体で誘発される抗体はヒトVEGFで誘発される抗体よりも高い中和能を有する。
KLHマウスIL4ヘテロ複合体の免疫原性活性
A. 原料と方法
マウスIL4と比較したマウスKLH-IL4調製物の免疫原(液性)活性を18〜20gのbalb/cマウスで試験した。
1 免疫化
8匹のマウス群に0、7、14、21日に0.1ml(10μg)のAIFエマルションを筋肉内注射した。60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−2日および72日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
3匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
対照マウスおよびKLHマウスIL4で免疫化したマウスには、最後の免疫化から14日後にカバノキの花粉を、ミョウバン(100μg/マウス)の存在下で74日、95日および109日に皮下経路で抗原投与した。カバノキ花粉の主要なアレルゲンであるBet ν 1に対して産生されるクラスGおよびE抗体の発生を追うために血液サンプルを定的的に採取する。
薬局方に従ってヒト1回量(50μg)を投与した3匹のマウスで異常毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
KLH-マウスIL4調製物で免疫化したマウスと、マウスIL4のみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのKLH-マウスIL4はリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
50μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間、毒性の徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)は全く示さない。
液性応答性をマウスVEGFに対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した(0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数)。[図9]は得られた抗体価を示している。
KLH-マウスIL4調製物で免疫化したマウスはマウスIL4のみで免疫化したマウスよりも高いIgGタイプの抗体価を示す。
KLHマウスIL4調製物で免疫化したマウス中に存在するこの抗体の中和活性をマウスIL4の生物活性テストを用いて測定した。このテストではIL4マウスに依存して成長するマウス細胞系譜であるHT-2細胞を用いる(下記文献参照)。
Watson, J. 1979. J. Exp. Med. 150:1510
複合体で誘発される抗体は中和抗体である。
KLH-ヒトIL4ヘテロ複合体の免疫原性活性
A. 原料および方法
ヒトIL4と比較したKLHヒトIL4調製物の免疫原(液性)活性を18〜20gのbalb/cマウスで試験した。
1 免疫化
3匹のマウス群に0、7、14、21日に0.1ml(10μg)のAIFエマルションを筋肉内注射した。60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−2日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
3匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
最後の免疫化から12日後にマウスを犠牲にした。
薬局方に従ってヒト1回量(50μg)を投与した3匹のマウスで異常な毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
KLH-ヒトIL4調製物で免疫化したマウスと、ヒトIL4のみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのKLH-ヒトIL4はリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
50μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる毒性の徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)も示さない。
液性応答はヒトIL4に対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した(0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数)。
ヒトKLH-IL4調製物で誘発されたこのような抗体の中和活性をヒトIL4の生物活性テストを用いて測定した。このテストではIL4ヒトに依存して成長するマウス細胞系譜であるTF-1細胞を用いる(下記文献参照)。
Kitamura,T. et al., 1989. J. Cell Physiol. 140:323-34
複合体で誘発される抗体は中和抗体である。
KLH-IFNαヘテロ複合体の免疫原性活性
A. 原料と方法
ヒトIFNαと比較したKLHヒトIFNα調製物の免疫原(液性)活性を18〜20gのbalb/cマウスで試験した。
1 免疫化
3匹のマウス群に0、7、14、21日に、0.1ml(10μg)のAIFエマルションを筋肉内注射した。60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−2日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
3匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
最後の免疫化から12日後にマウスを犠牲にした。
薬局方に従ってヒト1回量(50μg)を投与した3匹のマウスで異常毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
KLH-ヒトIFNα調製物で免疫化したマウスと、ヒトIFNαのみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのKLH-ヒトIFNαはリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
100μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる毒性の徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)も示さない。
液性応答性をヒトIFNαに対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した(0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数)。得られた抗体価は〔表2〕に示してある。
このような抗体の中和活性をヒトIL4の生物活性テストを用いて測定した(下記文献参照)。
Rubinstein S, J Viral, 1981, 755-8
gp160-IFNαヘテロ複合体の免疫原性活性
A. 原料と方法
ヒトIFNαと比較したヒトgp160-IFNα調製物の免疫原(液性)活性を18〜20gのbalb/cマウスで試験した。
1 免疫化
3匹のマウス群に0、7、14、21日に、0.1ml(10μg)のAIFエマルションを筋肉内注射した。60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−2日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
3匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
最後の免疫化から12日後にマウスを犠牲にした。
薬局方に従ってヒト1回量(100μg)を投与した3匹のマウスで異常な毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
gp160-ヒトIFNα調製物で免疫化したマウスと、ヒトIFNαのみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのgp160-ヒトIFNαはリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
100μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる毒性の徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)も示さない。
液性応答はヒトIFNαに対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した(0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数)。
このような抗体の中和活性は実施例28で説明したヒトIFNαの生物活性テストを用いて測定してある。結果は中和%で表す。
gp160-トキソイドTatヘテロ複合体の免疫原性活性
A. 原料および方法
トキソイドTatと比較したgp160-トキソイドTat調製物の免疫原活性(液性および細胞性活性)を18〜20gのbalb/cマウスで試験した。
3匹のマウス群に0、7、14、21日に、0.1ml(10μg)のAIFエマルションを筋肉内注射した。60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−2日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
3匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
最後の免疫化から12日後にマウスを犠牲にした。
薬局方に従ってヒト1回量(100μg)を投与した3匹のマウスで異常な毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
gp160-トキソイドTat調製物で免疫化したマウスと、トキソイドTatのみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのgp160-トキソイドTatはリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
100μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる毒性の徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)も示さない。
液性応答性をTatに対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した(0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数)。得られた抗体価は〔表6〕に示してある。
このような抗体の中和活性はCATアッセイ法を用いて測定した。−2日および72日に採取した血清の各希釈液(1/100-1/800)を50ng/mlの天然Tatと一緒に2時間培養する。次いで、各希釈液をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(CAT)のプロモータとしてVIH-1のLTRを含むプラスミドで安定に感染した細胞であるHeLa細胞に塗った。24時間培養した後、細胞を溶解して生産されたCAT蛋白の量ををELISAテスト、Catアッセイ法(ベーリンガーマンハイム)で測定する。中和した血清はTat蛋白がCAT蛋白の発現を誘発するのを防止するが、中和していない血清はこのようなCAT蛋白の合成を許す。結果は中和%で表す。
脾細胞の培養上澄み中でのM1P1αの生産
免疫化したマウスと対照マウスの脾細胞を単離し、次いで、5 Mg/mlのp24、gp160、天然Tatおよび5 μg/mlのgp160と5 μg/mlの天然Tatとの混合物の存在下でミクロ培養プレートの丸底ウエルで100,000細胞/ウエルで培養する。24時間培養した後、培養上澄みを回収し、上澄み液中のM1P1の量をR&D ELISAテストで測定する。結果はμg/mlで示した。
免疫化したマウスと対照マウスの脾細胞を単離し、p24、gp160、天然Tatおよびgp160と天然Tat との混合物の存在下でミクロ培養プレートの丸底ウエルで100,000細胞/ウエルで培養する。細胞培養は5%CO2を含む湿った雰囲気中で37℃で6日間連続して行った。培養終了18時間前に0.5μCiのトリチウムチミジン/ウエルを加える。免疫応答強さはIp増殖指数に比例する。
Ip=所定抗原のspm(ストローク/分)/対照spm
gp160-GM Tatヘテロ複合体の免疫原性活性
A 原料および方法
トキソイドTatと比較したgp160-GM Tat調製物の免疫原活性(液性および細胞性活性)を18〜20gのbalb/cマウスで試験した。
1 免疫化
3匹のマウス群に0、7、14、21日に0.1ml(10μg)のAIFエマルションを筋肉内注射した。60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−2日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
3匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
最後の免疫化から12日後にマウスを犠牲にした。
薬局方に従ってヒト1回量(100μg)を投与した3匹のマウスで異常な毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
gp160-GM Tat調製物で免疫化したマウスと、トキソイドTatのみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのgp160-トキソイドTatはリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
100μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる毒性の徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)も示さない。
液性応答はTatに対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した(0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数)。得られた抗体価は〔表10〕に示してある。
KLH-マウスTNFαヘテロ複合体の免疫原性活性
A 原料および方法
マウスTNFαと比較したKLH-マウスTNFα調製物の免疫原活性(液性および細胞性活性)を18〜20gのbalb/cマウスで試験した。
0日に3匹のマウス群(A群)に60μgのKLH-TNFα複合体を含む0.1mlのAIFエマルションを筋肉内経路で投与する。ブースター注射はAIFを21日に30μg、60日に15μg与えた。3匹の対照マウスには同じプロトコルに従って同等の用量のマウスTNFαを投与する(B群)。
0日に3匹のマウス群(C群)に、60μgのKLH-マウスTNFαヘテロ複合体と、30μgのホスホロチオネートオリゴデオキシヌクレオチド 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (CpG ADN: 1826)とを含む0.1mlのAIFエマルションを筋肉内経路で投与する。ブースター注射はKKL-マウスTNFαヘテロ複合体を含むAIFを21日に30μg、60日に15μg与えた。3匹の対照マウスには同じプロトコルに従って同等の用量のマウスTNFαを投与する(D群)。
最初の免疫前の−2日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
最後の免疫化から12日後にマウスを犠牲にした。
薬局方に従ってヒト1回量(50μg)を投与した3匹のマウスで異常毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
マウスKLH-TNFα調製物で免疫化したマウスと、TNFαのみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのKLH-マウスTNFαはリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
DNA CPG 1826を有する(または有していない)50μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる毒性の徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)も示さない。
液性応答性をマウスTNFαに対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した。また、マウスの膣分泌物中に存在するTNFαに対するIgAタイプの抗体の存在をELISAで測定し、抗体価で示した。抗体価は0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数を表す。得られた抗体価は〔表11〕に示してある。
Tatペプチド- h IgEヘテロ複合体の免疫原活性
A 原料および方法
ヒトIgEと比較したKLH-ヒトIgE調製物の免疫原活性(液性および細胞性活性)を18〜20gのbalb/cマウスで試験した。
1 免疫化
3匹のマウス群に0、7、14、21日に0.1ml(10μg)のAIFエマルションを筋肉内注射した。60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−2日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
3匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
最後の免疫化から12日後にマウスを犠牲にした。
薬局方に従ってヒト1回量(50μg)を投与した3匹のマウスで異常な毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
KLH-ヒトIgE調製物で免疫化したマウスと、ヒトIgEのみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのKLH-ヒトIgEはリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
50μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる毒性の徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)も示さない。
液性応答はヒトIgEに対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した(0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数)。得られた抗体価は〔表12〕に示してある。
KLH-リシン-βヘテロ複合体の免疫原性活性
A 原料と方法
リシン-β断片と比較したKLH-ヒトIgE調製物の免疫原性(液性および細胞性)活性を18〜20gbalb/cマウスで試験した。
1 免疫化
0、7、14、21日に、3匹のマウス群に0.1ml(10μg)のAIFエマルションを筋肉内注射した。60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−2日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
3匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
最後の免疫化から12日後にマウスを犠牲にした。
薬局方に従ってヒト1回量(50μg)を投与した3匹のマウスで異常な毒性を調べた。
ヘテロ複合体の免疫毒性がないことを複合体の存在下で培養され且つPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるPBMCに対して行った細胞増殖テストを用いてインビトロで評価した。
インビボおよびインビトロでヘテロ複合体に毒性なし
KLH-リシン調製物で免疫化したマウスと、リシン-β断片のみで免疫化したマウスはいずれも臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。免疫抑制テストから、用量100ng/ml〜1μg/mlのKLH-リシン-βはリンパ球の増殖を抑制しないことがわかる。
50μgのヘテロ複合体で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる毒性の徴候(体温、皮膚疾患、全身性または局所的兆候)も示さない。
液性応答はリシン-β断片に対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ(ELISA)で測定し、抗体価で示した(0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数)。得られた抗体価は〔表13〕に示してある。
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Claims (10)
- 一つまたは複数の抗原蛋白に対して産生される抗体を対象者において誘発する安定な免疫原性組成物であって、この免疫原性組成物は(i)抗原蛋白分子と(ii)担体蛋白分子との組合せからなる免疫原性蛋白ヘテロ複合体から成り、
(a)上記抗原蛋白(i)の40%以下が担体蛋白分子(ii)にグルタルアルデヒドを介した共有結合で結合しており、
(b)上記抗原蛋白(i)および蛋白担体分子(ii)がそれぞれ下記の(1)〜(7)の組合せ:
(1) (i) ヒトIL−4、(ii) Keyhole limpet hemocyanin(KLH);
(2) (i) ヒトIFN−α、(ii) KLH;
(3) (i) ヒトVEGF、(ii) KLH;
(4) (i) ヒトTNFα、(ii) KLH;
(5) (i) ヒトIFN−α、(ii) VIH1のgp160;
(6) (i) 不活性化VIH1 Tat蛋白、(ii) VIH1 gp160蛋白;
(7) (i) リシンβ断片、(ii) KLH
のいずれかであることを特徴とする免疫原性組成物。 - 上記ヘテロ複合体の各々が担体蛋白(ii)分子に結合した複数の抗原蛋白(i)を含む請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 上記の免疫原性ヘテロ複合体の各々において、複数の抗原蛋白(i)が単一の抗原蛋白の複数の標本で構成される請求項2に記載の免疫原性組成物。
- 1つの担体蛋白分子(ii)に対して5〜50個の抗原蛋白(i)を含む請求項1〜3のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 1つの担体蛋白分子(ii)に対して20〜40個の抗原蛋白(i)を含む請求項4に記載の免疫原性組成物。
- 一つまたは複数の生理学的に許容される賦形剤をさらに含む請求項1〜5のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- CpG免疫アジュバントを含む請求項6に記載の免疫原性組成物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の免疫原性組成物と、一つまたは複数の生理学的に許容される賦形剤とを組み合わせて含むワクチン組成物。
- CpG免疫アジュバントをさらに含む請求項8に記載のワクチン組成物。
- 下記の(a)と(b)の段階を含む請求項1〜5のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の調製方法:
(a)抗原蛋白(i)と担体分子(ii)とをグルタルアルデヒドの存在下で(i):(ii)のモル比を10:1〜50:1にして培養し、
(b)段階(a)で得られた免疫原性ヘテロ複合体をホルムアルデヒドで安定化させ、
(b)得られた免疫原性ヘテロ複合体を含む免疫原性組成物を回収する。
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