JP3591264B2 - Vegf121特異的モノクローナル抗体及び測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトVEGF121に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いたVEGFの測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
血管新生は、正常では胎児期の血管形成や組織の構築、黄体形成や子宮内膜の増殖期に関与するが、病的状態では炎症、創傷治癒、糖尿病性網膜症、関節性リュウマチ、固形癌の増殖に重要な役割を果たしている(実験医学 15 998−1002 (1997) )。血管新生に関与する因子として血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)、血管透過性因子(vascular permeability factor, VPF)、繊維芽細胞増殖因子(fibroblast growth factor, FGF)、血小板由来増殖因子(platelet−derived growth factor, PDGF)、トランスフォーミング成長因子−α(transforming growth factor− α, TGF−α)、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor, TNF)、インターロイキン8(interleukin−8,IL−8)等が知られているが、これらの中で最も中心的かつ重要な役割を果たしているのはVEGFである。その後、VEGFとVPFは同一因子であることが確認されている。
【0003】
VEGFは、腫瘍細胞の分泌する血管透過性因子として(Science, 219, 983−985 (1983))、また、下垂体濾胞細胞培養上清中の内皮細胞増殖因子として見いだされた蛋白質(Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, 851−858 (1989))であり、1989年に遺伝子が単離された(Science, 246, 1306−1309 (1989) 、 Science, 246, 1309−1312 (1989) )。その後の研究によりVEGFはアミノ酸残基数の異なる4つのアイソマーが存在することが明らかになった。アミノ酸残基数で121個(以下、本明細書においてはVEGF121と記載する)、165個(以下、本明細書においてはVEGF165と記載する)、189個(以下、本明細書においてはVEGF189と記載する)、206個(以下、本明細書においてはVEGF206と記載する)の4つのアイソマーは、遺伝子レベルの研究により、VEGF121及びVEGF165の2つが血管内皮細胞に対する作用が強いことが示唆された(Endocrine Reviews, 13, 18−32 (1992) )。しかし、VEGF121とVEGF165の間で、血管内皮細胞に対する作用に質的或いは量的な違いがあるかどうかは明らかにされてはいない。
【0004】
VEGFを蛋白質として捕らえようとする場合、抗VEGF特異的抗体による免疫測定法を用いるのが簡便である。VEGFに対するモノクローナル抗体は既に取得されている(Growth Factor, 7, 53−64 (1992)、Hybridoma, 14, 475−480 (1995) 、Clinical Chemistry, 42, 1777−1784 (1996)、特開平8−16989号、特開平8−53498号、特開平7−330795号、特開平9−124697号)が、VEGF121とVEGF165とを識別仕分けるような抗体は存在せず、VEGF121とVEGF165それぞれの役割については、解明が進んでいなかった。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、VEGF121とVEGF165とを識別するようなモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を用いた免疫測定法を提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、従来の課題を解決すべく、VEGFアイソマーに関する研究を重ねた結果、VEGF121に特異的なモノクローナル抗体を作成し、該モノクローナル抗体を用いた免疫測定方法によりVEGF121を測定することに成功して本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、VEGF121に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いたVEGFの測定方法を提供するものである。
【0008】
本発明のモノクローナル抗体を用いれば、VEGF121のみを直接検出することができ、VEGF121の免疫測定、作用機序の解明等に広く応用することができる。
【0009】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0010】
本発明においてVEGF121とは、配列番号1に示すアミノ酸配列を有する蛋白質である。VEGF121は、そのアミノ酸配列がVEGF165の1〜114までと同一であり、115番目のアスパラギンはリジンに置換され、更にC末端の6アミノ酸残基はVEGF165のC末端と同一である。
【0011】
本発明のVEGF121に特異的なモノクローナル抗体を得るには、免疫原としてVEGF121を用いるよりもVEGF121固有の構造部分を用いるのが好ましく、具体的には、VEGF121固有の立体構造、エクソン5とエクソン8の連続から生じるC末端側のVEGF121独特の連続したアミノ酸部分を含むペプチド等が挙げられる。更に好ましくは、VEGF121の110〜121番目のアミノ酸残基を免疫原とするのが望ましい。
【0012】
上記のような免疫原を、マウス、ラット、ハムスター等の免疫動物に免疫する。免疫は常法に従って行うことができ、抗原は単独でまたはアジュバンドと共に免疫動物に投与する。免疫後は、血清を採取して抗体価の上昇を確認し、必要に応じて追加免疫を行うとよい。抗体価の上昇を確認後、脾臓細胞等のような抗体産生細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞とを、ポリエチレングリコール等のような融合剤で融合してハイブリドーマを作製する。次いでハイブリドーマをHAT培地のような選択培地を用いて選択し、限界希釈法等の適当な方法でモノクローナル化して培養する。この培養上清を酵素免疫測定法のような適当な免疫測定法で分析し、目的とするVEGF121に特異的なモノクローナル抗体を産生しているクローンを選択する。選択の際には、VEGF165、VEGF189、VEGF206等の他のアイソマーとの反応性の有無を確認することが好ましい。これらのモノクローナル抗体作製の手法は、公知の方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン(Nature 256 495 1975 )、シェーラー(Nature 285 446 1980 )等の方法により行うことができる。また上述の手法により作製したモノクローナル抗体は、プリスタン処理したマウスに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを投与して得られた腹水、あるいは該モノクロナール抗体を産生するハイブリドーマの培養上清から、塩折、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインAを固定化したアフィニティークロマトグラフィー等の分析・精製手段により回収することができる。
【0013】
本発明のモノクローナル抗体は、公知の免疫測定方法に用いることができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体を固相化し、液相に標識した公知の抗VEGF抗体を用いたサンドイッチ測定法や標識したVEGF121を用いた競合測定法によるVEGF121の免疫測定法を挙げることができる。免疫測定に用いる標識物質としては、例えば、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質等が挙げられるが、本発明の免疫測定法はこれらに限定されるものではない。
【0014】
なお、測定検体には制限が無く、例えば血清、血漿、全血、尿、リンパ液等の各種体液や細胞組織抽出液等のVEGF121の測定に適応できる。
【0015】
更に、本発明のモノクローナル抗体は、常法に基づき組織免疫染色に用いることもでき、VEGF121の作用機序の解明に有用である。
【0016】
【実施例】
本発明を以下参考例及び実施例により更に詳細に説明する。
【0017】
参考例1 大腸菌由来の組換え体ヒトVEGF121及びヒトVEGF165の調製
ヒト急性前骨髄性白血病由来の培養細胞株HL−60のcDNAライブラリーからPCR法によりヒトVEGF121及びヒトVEGF165のcDNAを単離した。これらをpGEMEX−1(プロメガ社製)とpGEX−2T(ファルマシア社製)より作製した4.6KbのpW6Aベクター(特願平9−121803号)に組み込み、ヒトVEGF121及びヒトVEGF165を発現するベクターとしてpW6A−VEGF121及びpW6A−VEGF165を作製した。pW6A−VEGF121及びpW6A−VEGF165をそれぞれ宿主大腸菌に導入後、1%バクトトリプトン、0.5%イーストエキストラクト、1%塩化ナトリウム、50μg/mlアンピシリン、pH7.5培地(以下、本明細書においてLB培地と記載する)、37℃にて培養し、1mMイソプロピルチオガラクトピラノシド(以下、本明細書においてIPTGと記載する)を添加し3時間培養して発現を誘導した。pW6A−VEGF121で形質転換した大腸菌はトリス緩衝液中で超音波破砕した後遠心分離し、沈渣を6Mウレアを含むトリス緩衝液にて可溶化した後遠心分離した。この遠心上清をQFF陰イオン交換カラム(ファルマシア社製)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、リソースRPCカラム(ファルマシア社製)を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製し、純度95%以上の大腸菌由来の組換え体ヒトVEGF121(以下、本明細書中においてrVEGF121Eと記載する)を得た。一方、pW6A−VEGF165で形質転換した大腸菌も同様に上記の方法で調製した後、更にスーパーデックス200(ファルマシア社製)を用いたゲル濾過により精製し、純度95%以上の大腸菌由来の組換え体ヒトVEGF165(以下、本明細書中においてrVEGF165Eと記載する)を得た。
【0018】
参考例2 抗VEGF121/VEGF165モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
参考例1で調製したrVEGF165Eを免疫原として用いた。rVEGF165Eをフロイント完全アジュバントと等量混合し、BALB/cマウスの腹腔内に100μl(約40μg/マウス)投与した。約2週間後、同じくrVEGF165Eをフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。抗体価の上昇を確認した後、最終免疫としてrVEGF165E約40μgを静脈内に投与し、その3日後に脾臓を摘出した。単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞株であるP3−x63−Ag8−U1(大日本製薬から購入)(以下、本明細書においてP3U1と記載する)とを3:1の細胞数で混合し、50%ポリエチレングリコール1500を用いて細胞融合を行った。細胞はHAT(1x10−4Mヒポキサンチン、4x10−7Mアミノプテリン、1.6x10−5Mチミジン)及び10%ウシ胎仔血清(以下、本明細書においてFCSと記載する)添加RPMI1640培地(以下、本明細書においてHAT培地と記載する)に懸濁し、96穴のマイクロカルチャープレートに分注して培養した。ハイブリドーマが増殖してきたウェルの培養上清を以下のELISA法により調べ、VEGF121及びVEGF165 に反応するモノクローナル抗体を産生してしているハイブリドーマを選択した。
【0019】
すなわち、参考例1で調製したrVEGF121E及びrVEGF165Eをそれぞれリン酸緩衝液(以下、本明細書においてPBSと記載する)で希釈し、96穴ELISAプレートに分注し、4℃で一晩放置して固相に結合させた。次に、0.05%ツィーン20を含むPBS(以下、本明細書においてPBSTと記載する)で洗浄した後、1%スキムミルクを含むPBSを分注し、1時間、37℃に放置してブロッキングした。PBSTで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をrVEGF121E結合プレート及びrVEGF165E結合ELISAプレートそれぞれに分注し、1時間、37℃に放置した。続いて同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ(以下、本明細書においてPODと記載する)標識抗マウス免疫グロブリン抗体(ダコ社製)を1000倍希釈したものを分注し、1時間、37℃に放置した。同様の洗浄後、POD基質(ABTS−過酸化水素系)を加え、室温、10分間放置した後反応停止液を加え、405nmの吸収を測定した。陽性ウェルの細胞は限界希釈法にてクローニングした。単一コロニーを含むウェルの細胞上清の抗体活性を上記の方法で調べ、選択、培養し、VEGF121及びVEGF165に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマVGF3−4を樹立した。ハイブリドーマVGF3−4は大量培養し、マウス腹腔内に投与し、腹水を回収した。さらに、アフィ−プレッププロテインAマップスIIキット(バイオラド社)を用いて腹水より抗体を精製し、モノクローナル抗体を得た。この抗体をモノクローナル抗体VGF3−4と命名した。
【0020】
参考例3 バキュロウイルス−昆虫細胞由来の組換え体ヒトVEGF121及びヒトVEGF165の調製
ヒト急性前骨髄性白血病由来の培養細胞株 HL−60のcDNAライブラリーからPCR法により単離したヒトVEGF121及びヒトVEGF165のcDNAをpBacPAK8トランスファーベクター(クローンテック社製)に組み込み、pBac−VEGF121及びpBac−VEGF165を作製した。これらをそれぞれBacPAK6 DNA(クローンテック社製)と共にSf21細胞(クローンテック社製)にリポフェクチン法でコトランスフェクションし、組換え型バキュロウイルスAcVEGF121及びAcVEGF165を構築させた。組換え型バキュロウイルスはプラーク法にて純化した後、Sf21細胞にインフェクションして組換え体ヒトVEGF121及びヒトVEGF165を発現させ、精製した。すなわち、SF900−II無血清培地(GIBCOBRL社製)で培養したSf21細胞にAcVEGF121またはAcVEGF165を添加してインフェクションさせ、27℃で3日間培養した後、その培養上清を回収した。さらに、参考例2で調製したモノクローナル抗体VGF3−4をHiTrap NHS−activated(ファルマシア社製)に結合させたアフィニティーカラムを用いて、培養上清からバキュロウイルス−昆虫細胞由来の組換え体ヒトVEGF121(以下、本明細書中においてrVEGF121Bと記載する)及びヒトVEGF165(以下、本明細書中においてrVEGF165Bと記載する)を精製した。
【0021】
実施例1 抗VEGF121モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
配列番号2に記載するペプチド(以下、本明細書中においてP2と記載する)を合成し、これをKLH(Keyhole Limpet Hemocyanin )に結合して複合体(以下、本明細書においてP2−KLHと記載する)を作製し、免疫原として用いた。
【0022】
参考例2と同様の方法で免疫し、同様の方法でハイブリドーマを作製した。
【0023】
参考例3で調製したrVEGF121Bを結合させたELISAプレートを用い、参考例2と同様のELISA法でVEGF121に反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。単一コロニーを含むウェルの培養上清は参考例3で調製したrVEGF121B及びrVEGF165Bを結合したELISAプレートを用いて参考例2と同様の方法で調べ、VEGF121に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生してしているハイブリドーマVG2P3−5を樹立した。参考例2と同様にしてハイブリドーマからモノクローナル抗体を得た。この抗体をモノクローナル抗体VG2P3−5と命名した。
【0024】
尚、このハイブリドーマはVG2P3−5生命工学工業技術研究所に寄託され、その受託番号はFERM P−16553である。
【0025】
実施例2 抗VEGFモノクローナル抗体の反応特異性
参考例3で調製したrVEGF121B及びrVEGF165BをPBSで0.1μg/mlの濃度にし、参考例2と同様の手法でrVEGF121B結合ELISAプレート及びrVEGF165B結合ELISAプレートを調製した。これに、それぞれ1%ウシアルブミンを含むPBSで2μg/mlに希釈したモノクローナル抗体VG2P3−5、モノクローナル抗体VGF3−4を加え、参考例2のELISA法と同様の測定を行った。結果を表1に示す。モノクローナル抗体VG2P3−5はVEGF121に特異的に、モノクローナル抗体VGF3−4はVEGF121及びVEGF165の両方に反応した。
【0026】
【表1】
【0027】
実施例4 VEGF121の測定
モノクローナル抗体VG2P3−5をPBSで10μg/mlに希釈し、参考例2と同様の方法でモノクローナル抗体VG2P3−5結合ELISAプレートを調製した。これに、それぞれrVEGF121B、rVEGF165B、組換え体ヒトPDGF−BB(R&Dシステム社製)、組換え体ヒトPlGF(R&Dシステム社製)を加え、37℃で1時間反応させた。続いて同様に洗浄後、POD標識したモノクローナル抗体VGF3−4を加え、37℃で1時間反応させた。同様の洗浄後、POD基質(OPD−過酸化水素系)を加え、室温で25分間放置した後反応停止液を加え、492nmの吸収を測定した。結果を図1に示す。固相化したモノクローナル抗体VG2P3−5とPOD標識モノクローナル抗体VGF3−4とのサンドイッチELISA法はVEGF121を測定することができるが、アイソフォームVEGF165やアミノ酸配列で相同性のあるPDGF−BB、PlGFを測定することはできず、VEGF121特異的であることが確認された。
【0028】
【発明の効果】
本発明により、ヒトVEGF121に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いたヒトVEGF121の測定方法を提供し、ヒトVEGF121を特異的に測定することができる。
【0029】
【配列表】
【0030】
【図面の簡単な説明】
【図1】抗VEGF121モノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法の測定結果を示す図である。
Claims (4)
- 配列番号2に示すアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として調製され、ヒトVEGF121を特異的に認識し、ヒトVEGF165を認識しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体がモノクローナル抗体VG2P3−5である請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体を用いたヒトVEGF121の測定方法。
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