ES2819210T3 - Bioconjugados de citocina-quitosano y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Srinivas Jayanthi
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Abstract

Una composición que comprende quitosano enlazado covalentemente a IL-12, en donde el enlace covalente es un enlace tirosina a amina de la IL-12 al quitosano, está entre los grupos amina en el quitosano y los grupos carboxilo en la IL-12, o está entre los grupos sulfhidrilo en la IL-12 sustituida con cisteína y en el quitosano que está tiolado, y en donde la IL-12 es biológicamente activa.

Description

DESCRIPCIÓN
Bioconjugados de citocina-quitosano y métodos de uso de los mismos
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud de patente reclama el beneficio de prioridad para la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.° 62/006.114, presentada el 31 de mayo de 2014.
Declaración con respecto a la investigación con fondos federales
La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno de Estados Unidos otorgado por los Institutos Nacionales de Salud, número de subvención P30 GM103450 y R01CA172631. Los Estados Unidos tienen determinados derechos sobre esta invención.
Introducción
Las citocinas son poderosos moduladores de la función inmunitaria. Durante décadas, los científicos han planteado la hipótesis de que pueden administrarse citocinas exógenas para superar la disfunción inmunitaria y tratar una amplia diversidad de enfermedades, incluyendo el cáncer. Sin embargo, a pesar de cientos, si no miles, de estudios preclínicos y clínicos, solo 2 de las más de 40 citocinas identificadas se han aprobado como inmunoterapias de agente único para un número limitado de neoplasias malignas. La señalización no intencionada y los efectos secundarios que limitan la dosis debido a la administración sistémica de citocinas pleiotrópicas han impedido que las inmunoterapias basadas en citocinas alcancen su potencial clínico.
Zaharoff et al. 2010 (Journal of Immunotherapy, 33(7): 697-705) desvela la administración intratumoral de IL-12 coformulada con el polisacárido biodegradable quitosano e informa que la inmunoterapia con quitosano/IL-12 aumenta la retención local de IL-12 en el microambiente tumoral, tumores murinos agresivos, establecidos erradicados, y generaron inmunidad protectora sistémica específica de tumores.
El documento WO 2008/039390 A2 desvela métodos y composiciones relacionados con depósitos de antígenos de quitosano y depósitos de citocinas de quitosano, y el uso de composiciones de depósito en el tratamiento y la prevención de enfermedades.
Sumario
En el presente documento se proporcionan las composiciones que comprenden quitosano enlazado covalentemente a IL-12 como se establece en las reivindicaciones . La IL-12 en la composición es biológicamente activa. Se desvelan adicionalmente en el presente documento composiciones que comprenden quitosano enlazado covalentemente a citocinas, incluyendo todas las interleucinas y además incluyen, pero no se limitan a, IL-2, IL-12, GM-CSF, 1L-1, TNF-a, JEFN-y, IFN-a, IL-10, TGF-p, IL-15, IL-23, IL-27, IL-35 e IL-7. Las citocinas o factores de crecimiento pueden unirse al quitosano de diversas formas y pueden contener mutaciones para permitir la unión covalente al quitosano. El quitosano puede tener un peso molecular entre 10 kDa y 500 kDa, entre 100 kDa y 400 kDa o entre 200 kDa y 300 kDa. Las composiciones pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para administración local.
También se proporcionan composiciones para su uso en un método de tratamiento de un trastorno en un sujeto, como se define en las reivindicaciones. Las composiciones se administran al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el trastorno. Las composiciones pueden administrarse por vía local. En un aspecto, el trastorno es cáncer y la composición se administra por vía intratumoral. En otras realizaciones, el trastorno es una enfermedad autoinmunitaria, alergia o infección y la composición está formulada para dirigirse a estos trastornos.
También se proporcionan composiciones para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto, como se define en las reivindicaciones. El método comprende administrar las composiciones proporcionadas en el presente documento con un antígeno al sujeto en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunitaria dirigida al antígeno. El antígeno puede ser una proteína, un polipéptido o una vacuna. El bioconjugado de quitosano de citocina o factor de crecimiento puede actuar como adyuvante para estimular aún más una respuesta inmunitaria al antígeno.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama que muestra la estructura química del quitosano. El quitosano es un copolímero no ramificado de unidades de N-acetilglucosamina (x) y glucosamina (y) unidas por enlaces glucosídicos (3(1-4) donde la relación de y a x es mayor que 1:5
La Figura 2 es un conjunto de fotografías que muestran que la unión al quitosano mejora la retención de citocinas en un sujeto. Los ratones que tenían tumores s.c. MC32a (adenocarcinoma de colon) de 7 días de edad se afeitaron y se les administró una sola inyección i.t. de IL-12 marcada con Alexa Fluor 660 (AP660) (5 |jg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución de quitosano al 1,5 % (p/v). La IL-12 se volvió indetectable entre 24 y 48 horas cuando se administró con PBS. Cuando se mezcló con una solución de quitosano, la IL-12 persistió en el tumor durante al menos 5 a 6 días. Método adaptado de la ref. [6].
La Figura 3 es un gráfico que muestra que la inmunoterapia con quitosano/IL-12 mejora la supervivencia después de la resección del tumor de mama. Los ratones portadores de carcinomas mamarios 4T1 ortotópicos recibieron tratamientos los días 6 y 12 después de la implantación del tumor con (■) solución salina, (▲) quitosano, (•) IL-12 sola (1 jg ) o (o) mezcla de quitosano/IL-12 (1 jg). Los tumores primarios se resecaron el día 15.
La Figura 4 es un conjunto de figuras que muestran la purificación de IL-12 humana recombinante. La Figura 4A es un conjunto de gráficos de isotermogramas que representan la afinidad de unión a heparina de la IL-12 humana. La Figura 4B es un gráfico que muestra el perfil de purificación de proteínas en heparina-sefarosa. La Figura 4C y la Figura 4D son fotografías de geles de s DS-PAGE de la fracción de NaCl 500 mM teñida con azul de Coomassie (Figura 4C) y detectada con anticuerpos específicos para las subunidades p70, p40 y p35 de IL-12, respectivamente (Figura 4D). Los carriles NR y R representan el perfil de electroforesis de IL-12 en condiciones no reductoras y reductoras, respectivamente. Las bandas adicionales menores representan diferentes productos glucosilados de IL-12.
La Figura 5 es un conjunto de gráficos que muestran la bioactividad de los bioconjugados de IL-12 quitosano. La Figura 5A es un gráfico que muestra la proliferación de células 2D6 sensibles a IL-12 tratadas con IL-12 recombinante, bioconjugados de IL-12-quitosano o sin reaccionar, IL-12 dializada quitosano o nada (sin tratar). La proliferación se midió mediante un ensayo de viabilidad celular basado en luminiscencia (Cell-Titer-Glo; Promega). La Figura 5B es un gráfico que muestra el cambio en el volumen del tumor a lo largo del tiempo en ratones C57BL/6 (n=4) inoculados s.c. con 500.000 células de carcinoma de vejiga MB49. Los ratones se trataron i.t. los días 7, 10 y 14 con bioconjugados de IL-12-quitosano que contenían un estimado de 1 jg de IL-12. No se trataron los ratones control que llevaban MB49 (n=5).
La Figura 6 es un gráfico que muestra la bioactividad de conjugados no específicos de IL-12-quitosano según se cuantifica mediante ensayos de proliferación de células T 2D6 dependientes de IL-12. La IL-12 no modificada se conjugó de forma no específica con quitosano siguiendo diversos métodos de bioconjugación. Los métodos seguidos incluyen, 1) enlace peptídico mediado por carbodiimida en donde los grupos amina del quitosano se enlazan covalentemente a los grupos ácido carboxílico de la IL-12. 2) Conjugación mediada por el reticulante amina a sulfhidrilo (sulfo-éster SMCC) de quitosano tiolado a IL-12 y 3) Conjugación catalítica mediada por tirosinasa de o-quinonas modificadas por tirosinasa en IL-12 a un grupo amina nucleófila en quitosano. Como se ve, la conjugación inespecífica de IL-12 a quitosano es eficaz en grado variable con la conjugación mediada por reticulante de amina a sulfhidrilo produciendo un producto completamente inactivo. Los métodos de unión de péptidos y catálisis de tirosinasa produjeron conjugados de quitosano-IL-12 que son bioactivos con hasta el 60 % y el 17% de pérdida de bioactividad de IL-12 observada con enlaces peptídicos y catálisis de tirosinasa respectivamente.
Descripción detallada
Los presentes inventores hipotetizaron que un enfoque más seguro, más eficaz para la administración de productos terapéuticos de citocina es a través de la administración local, sostenida. La administración local reduce las toxicidades mediadas por citocinas y aprovecha el mecanismo de acción paracrino preferido de la mayoría de las citocinas.
Los presentes datos publicados recientemente demuestran que la administración intratumoral (i.t.) de IL-12 mezclada con soluciones de quitosano (quitosano/IL-12) puede retener la IL-12 localmente en el tumor y erradicar el 80-100 % de los tumores colorrectales, pancreáticos y de vejiga establecidos (Zaharoff et al. 2009; Zaharoff et al 2010; Yang et al 2013). Quizás más importante que la regresión del tumor primario, fue el descubrimiento de que el 47-100 % de los ratones libres de tumores rechazaron la reexposición al tumor, lo que implica la generación de inmunidad específica del tumor después de la inmunoterapia con quitosano/IL-12. Se está considerando el uso de mezclas de quitosano/IL-12 administradas por vía intravesical para el tratamiento del cáncer de vejiga superficial.
Con respecto al cáncer de mama, los datos preliminares recientes indican que las mezclas de quitosano/IL-12 pueden controlar las metástasis y mejorar la supervivencia en un modelo preclínico agresivo. En estos estudios, los ratones portadores de tumores 4T1 recibieron 3 inyecciones i.t. antes de la resección del tumor primario. Los ratones fueron seguidos para la supervivencia después de la resección. En un estudio separado, los ratones fueron sacrificados cinco semanas después de la resección para documentar las metástasis pulmonares. En ambos casos, el tratamiento previo a la resección con quitosano/IL-12 mejoró los resultados quirúrgicos. La inmunoterapia neoadyuvante con quitosano/IL-12 dio como resultado un 67% de curaciones duraderas. Por el contrario, ninguno de los ratones que recibieron resección tumoral sola sobrevivió más de 40 días después de la cirugía.
A pesar de estos resultados prometedores, la diseminación sistémica de IL-12 y el potencial asociado de toxicidad sigue siendo una preocupación seria y un obstáculo potencial para la traducción clínica. La retención mejorada de IL-12 se debe al hecho de que las soluciones de quitosano altamente viscosas dificultan el transporte difusivo de IL-12. No obstante, es probable que la mayoría de la IL-12 administrada alcance la circulación sistémica. De hecho, los niveles elevados de IL-12 e IFN-y en suero después de inyecciones de quitosano/IL-12 han confirmado la fuga de IL-12 de un sitio de inyección local.
Para superar esta limitación, los presentes inventores proponen una novedosa tecnología de administración en la cual la IL-12 se conjuga covalentemente con el quitosano antes de la inyección intratumoral (i.t.). La conjugación aumentará el peso molecular eficaz de IL-12 y por lo tanto reducirá su difusividad. Además, se espera que el quitosano policatiónico interactúe electrostáticamente con las proteínas de la matriz extracelular cargadas negativamente y las membranas celulares. Por lo tanto, los bioconjugados de IL-12-quitosano se anclan eficazmente a un sitio de inyección local. También pueden ser útiles métodos similares con otras citocinas o factores de crecimiento. La inmunoterapia con citocinas se ha visto limitada por una toxicidad significativa o efectos secundarios no deseados asociados a la administración sistémica de las citocinas. Por lo tanto, la conjugación de la citocina con quitosano para limitar la difusión de la citocina desde el punto de administración o inyección puede limitar los efectos secundarios o la toxicidad asociados a la administración de citocina.
En los ejemplos, la IL-12 se enlazó covalentemente al quitosano a través de una reticulación de carbodiimida entre los grupos amina del quitosano y los grupos carboxilo de la IL-12. Si bien esta forma de enlace no específico redujo la actividad de la IL-12, se mantuvo una actividad sustancial de IL-12. También se mostró en los Ejemplos que el enlace de tirosina a amina catalizada por tirosinasa de la IL-12 a quitosano da como resultado un bioconjugado con actividad de IL-12 mantenida. También pueden usarse otros métodos más dirigidos a enlazar IL-12 u otra citocina o factor de crecimiento al quitosano de manera covalente y pueden tener efectos más limitados sobre la bioactividad de la citocina o factor de crecimiento conjugados. Por ejemplo el enlace tioéster, un enlace peptídico a través de un péptido enlazador, el enlace a través de lisinas o cisteínas modificadas genéticamente en la citocina colocado para limitar los efectos sobre la bioactividad de la citocina o el enlace entre las aminas en el quitosano y la citocina o factor de crecimiento puede usarse para enlazar covalentemente el quitosano a IL-12 u otra citocina o factor de crecimiento. Varias de estas alternativas se describen en los Ejemplos. El enlace a través de una lisina o cisteína en la citocina o factor de crecimiento puede implicar realizar una mutación de sustitución de lisina o cisteína en la citocina o factor de crecimiento. De forma adecuada, estas mutaciones de sustitución se encuentran en la superficie de los aminoácidos expuestos para permitir un impedimento estérico mínimo para el enlace con el quitosano y las mutaciones tienen adecuadamente efectos mínimos sobre la actividad biológica de la citocina o factor de crecimiento. Por ejemplo, las mutaciones de sustitución para colocar una lisina en una de las posiciones 17, 18, 34, 35, 43, 44 o 248 de IL-12 pueden ser adecuadas. La química usada para enlazar la citocina o el factor de crecimiento al quitosano incluye, pero no se limita a la química clic, química del peryodato, química del tioéter de maleimida o química del tiol. Véase Bioconjugate Chem., 2011, 22 (4), pp 551-555. Los expertos en la materia apreciarán que pueden usarse otros métodos para enlazar covalentemente una citocina o factor de crecimiento al quitosano mientras se mantiene la actividad biológica de la citocina o factor de crecimiento. Los expertos en la materia también son capaces de determinar si la actividad biológica del bioconjugado de citocina-quitosano es suficiente para el uso pretendido del conjugado.
El quitosano también puede modificarse antes del enlace a la citocina o factor de crecimiento. El quitosano puede metilarse o tiolarse para simplificar la química del enlace. La citocina o factor de crecimiento y el quitosano pueden unirse directamente o mediante un enlazador. El enlazador puede ser un enlazador químico o un enlazador peptídico. El quitosano puede conjugarse con el grupo amino alfa N-terminal, el grupo carboxilo alfa C-terminal, los restos de ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína, lisina o tirosina en la citocina o factor de crecimiento.
La IL-12 se conjugó con quitosano en los Ejemplos, pero diversas citocinas o factores de crecimiento podrían conjugarse con quitosano para lograr un resultado similar. Por ejemplo, pueden usarse citocinas o factores de crecimiento incluyendo todas las interleucinas en los bioconjugados descritos en el presente documento. Las citocinas y los factores de crecimiento desvelados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, IL-2, IL-12, GM-CSF, IL-1, TNF-a, IFN-y, IFN-a, IL-10, TGF-p, IL-15, IL-23, IL-27, IL-35 e IL-7. Estas citocinas/factores de crecimiento se han sugerido como potenciales inmunoterapéuticos, pero la adopción de estas citocinas en la práctica clínica se ha visto limitada por la toxicidad debida a la administración sistémica u otros efectos fuera de la diana de estos efectores pleiotrópicos. Cada una de estas citocinas podría conjugarse con quitosano usando los métodos descritos anteriormente y administrarse como una composición farmacéutica similar a IL-12 quitosano en los Ejemplos.
Cada una de las citocinas puede modificarse por ingeniería genética para agregar enlazadores peptídicos o modificar aminoácidos sin impactar negativamente la función de la citocina o el factor de crecimiento para evitar tener enlaces covalentes al quitosano que disminuyan o alteren completamente la actividad de la citocina o el factor de crecimiento. Por ejemplo, la química del tioéster podría usarse para enlazar el quitosano a restos de lisina en la citocina. El análisis estructural de IL-12 sugirió a los presentes inventores que las sustituciones de lisina en el aminoácido 34 o 248 (R34K o S248K) o una combinación de los mismos serían eficaces para el enlace sin alterar la actividad de la citocina. También se contempla la unión mediante enlaces disulfuro a través de sustitución de cisteína y puede usarse para unir la citocina o el factor de crecimiento al quitosano.
El quitosano puede tener un peso molecular entre 10 kDa y 500 kDa, entre 100 kDa y 400 kDa o entre 200 kDa y 300 kDa. Es probable que los pesos moleculares más altos conduzcan a una menor difusión después de la administración. Además, el quitosano puede modificarse y, por tanto, tener diferentes efectos sobre la estabilidad y la velocidad de difusión de los bioconjugados de citocina-quitosano. El grado de desacetilación del quitosano también puede modificarse en las composiciones. También se proporcionan composiciones para su uso en métodos de tratamiento de un trastorno en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de las composiciones, como se define en las reivindicaciones. Las células, tales como células inmunitarias, también puede ponerse en contacto con las composiciones de bioconjugado de citocina/factor de crecimiento-quitosano proporcionadas en el presente documento. En una realización, el poner en contacto las células inmunitarias con las composiciones de bioconjugado de citocina-quitosano da como resultado una respuesta inmunitaria contra un cáncer o células tumorales y da lugar a un crecimiento reducido o una proliferación reducida de las células cancerosas o tumorales. Adecuadamente, la célula es una célula inmunitaria, pero también pueden ser células dentro de un tumor. Adecuadamente, las composiciones se administran localmente a un tumor o en un sitio cercano a las células cancerosas y la administración de las composiciones efectúa la respuesta inmunitaria local al cáncer o tumor. El cáncer puede ser cualquier cáncer, incluyendo pero no limitado a, cáncer de vejiga, de mama, colorrectal, pancreático, de próstata, renal, de pulmón, melanoma, linfoma, de cerebro, de cabeza y cuello o de ovario. En una realización alternativa, el trastorno es un trastorno tratable mediante la inducción o inhibición de una respuesta inmunitaria en un área localizada mediante la administración de las composiciones descritas en el presente documento. El área podría ser el sitio de una infección o una respuesta inmunitaria tal como una respuesta alérgica o autoinmunitaria. En una realización alternativa, el bioconjugado de citocina/factor de crecimiento-quitosano se administra con una vacuna u otro antígeno para actuar como adyuvante y estimular una respuesta inmunitaria contra uno o más antígenos. Adecuadamente, el trastorno puede tratarse mediante inducción o represión de una respuesta inmunitaria mediante la administración de las composiciones descritas en el presente documento. El trastorno puede seleccionarse además de inflamación, artritis, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn u otras. El sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano, tales como un animal doméstico o un animal agrícola. También se proporcionan composiciones para su uso en métodos para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto, como se define en las reivindicaciones. Los métodos incluyen administrar las composiciones que comprenden un bioconjugado de quitosano-citocina/factor de crecimiento al sujeto en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunitaria al antígeno. El antígeno puede ser un antígeno proteico o peptídico o puede ser parte de una vacuna. El sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano, tales como un animal doméstico o un animal agrícola, y puede administrarse por cualquier medio disponible para los expertos en la materia.
La respuesta inmunitaria aumentada puede incluir una respuesta inmunitaria mediada por células B o células T mejorada y puede incluir una producción de anticuerpos aumentada, un cambio de clase aumentado o una muerte mediada por células aumentada de células infectadas o cancerosas.
Las células pueden ponerse en contacto con la composición directa o indirectamente in vivo, in vitro o ex vivo. La puesta en contacto abarca la administración a una célula, tejido, mamífero, paciente o ser humano. Además, poner en contacto con una célula incluye añadir un agente a un cultivo celular. Otros métodos adecuados pueden incluir introducir o administrar la composición a una célula, tejido, mamífero o paciente usando procedimientos y vías de administración apropiados como se define a continuación. Los tejidos incluyen tumores o tejidos que incluyen células cancerosas. Los sujetos pueden ser sujetos humanos o animales e incluyen pacientes con cáncer.
El tratamiento del cáncer incluye, pero no se limita a, reducir la cantidad de células cancerosas o el tamaño de un tumor en el sujeto, reducir la progresión de un cáncer a una forma más agresiva, mantener el cáncer o el tumor en una forma menos agresiva durante un período de tiempo más largo, reducir la proliferación de células cancerosas o reducir la velocidad de crecimiento del tumor, destruir células cancerosas, reducir la metástasis de las células cancerosas o reducir la probabilidad de recurrencia de un cáncer en un sujeto. Tratar a un sujeto como se usa en el presente documento se refiere a cualquier tipo de tratamiento que imparte un beneficio a un sujeto afectado por una enfermedad o en riesgo de desarrollar la enfermedad, incluyendo la mejora en la condición del sujeto (por ejemplo, en uno o más síntomas), retrasar la progresión de la enfermedad, retrasar la aparición de los síntomas o ralentizar la progresión de los síntomas, etc.
Los compuestos pueden usarse para preparar composiciones farmacéuticas. Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las composiciones descritas en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es cualquier vehículo adecuado para la administración in vivo. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para su uso en la composición incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones tamponadas, soluciones de glucosa, fluidos de cultivo basados en aceite o bacterianos. Los componentes adicionales de las composiciones pueden incluir adecuadamente, por ejemplo, excipientes tales como estabilizantes, conservantes, diluyentes, emulsionantes y lubricantes. Los ejemplos de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen estabilizantes tales como carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas tales como albúmina o caseína, agentes que contienen proteínas tales como suero bovino o leche desnatada y tampones (por ejemplo, tampón fosfato). Especialmente cuando se añaden tales estabilizantes a las composiciones, la composición es adecuada para secado por congelación o secado por pulverización. La composición también puede emulsionarse.
Las composiciones descritas en el presente documento también pueden coadministrarse con otro agente tal como un agente terapéutico contra el cáncer. Las dos composiciones pueden administrarse en cualquier orden, al mismo tiempo o como parte de una composición unitaria. Las dos composiciones pueden administrarse de tal manera que una composición se administre antes que la otra con una diferencia en el momento de administración de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 20 horas, 1 día, 2 días, 4 días, 7 días, 2 semanas, 4 semanas o más.
Una cantidad eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz como se usa en el presente documento significa la cantidad de una composición que, cuando se administra a un sujeto para tratar un estado, trastorno o afección es suficiente para efectuar un tratamiento (como se definió anteriormente). La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del compuesto, la formulación o la composición, la enfermedad y su gravedad y la edad, el peso, el estado físico y la capacidad de respuesta del sujeto a tratar.
Las composiciones pueden administrarse por cualquier medio conocido por aquellos expertos en la materia, incluyendo, pero no limitado a, intratumoral, intravesical, oral, tópica, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, transcutánea, nasofaríngea o absorción transmucosa. Por tanto, las composiciones pueden formularse como una formulación ingerible, inyectable, tópica o de supositorio. Las composiciones también pueden administrarse dentro de un vehículo o vesícula liposómicos o de liberación prolongada. La administración de las composiciones a un sujeto de acuerdo con la invención parece presentar efectos beneficiosos de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, dentro de amplios límites, se espera que la administración de cantidades más grandes de la composición logre efectos biológicos beneficiosos aumentados que la administración de una cantidad menor. Asimismo, también se contempla la efectividad a dosis por debajo del nivel al que se observa toxicidad.
Se apreciará que la dosis específica administrada en cualquier caso dado se ajustará de acuerdo con las composiciones que se administren, la enfermedad a tratar o inhibir, la condición del sujeto y otros factores médicos relevantes que puedan modificar la actividad de la composición o la respuesta del sujeto, como es bien conocido por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, la dosis específica para un sujeto en particular depende de la edad, el peso corporal, el estado general de salud, la dieta, el momento y el modo de administración, la velocidad de excreción, los medicamentos usados en combinación y la gravedad del trastorno en particular en el que se aplica el tratamiento. Las dosificaciones para un paciente dado pueden determinarse usando consideraciones convencionales, por ejemplo, por comparación habitual de las actividades diferenciales de las composiciones de la invención y de un agente conocido como una citocina no conjugada, tal como por medio de un protocolo farmacológico o profiláctico convencional apropiado.
La dosificación máxima para un sujeto es la dosificación más alta que no provoca efectos secundarios no deseados o intolerables. El número de variables con respecto a un régimen profiláctico o de tratamiento individual es grande, y se espera un intervalo considerable de dosis. La vía de administración también afectará a los requisitos de dosificación. Se anticipa que las dosificaciones de las composiciones reducirán los síntomas de la afección al menos un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 100 % en comparación con los síntomas previos al tratamiento o los síntomas que se dejan sin tratar. Se contempla específicamente que las preparaciones y las composiciones farmacéuticas pueden paliar o aliviar los síntomas de la enfermedad sin proporcionar una cura, o, en algunas realizaciones, pueden usarse para curar la enfermedad o el trastorno.
Las cantidades de dosificación eficaces adecuadas para administrar las composiciones pueden determinarse por aquellos expertos en la materia, pero normalmente varían de aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 100.000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente, aunque son normalmente de aproximadamente 1.000 microgramos o menos por kilogramo de peso corporal semanalmente. Pueden ser necesarias dosis más pequeñas porque las composiciones no se difunden en el entorno y tienen un efecto más dirigido en comparación con las composiciones homólogas no conjugadas. En algunas realizaciones, la cantidad de dosificación eficaz varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente. En otra realización, la cantidad de dosificación eficaz varía de aproximadamente 50 a aproximadamente 5.000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente. En otra realización, la cantidad de dosificación eficaz varía de aproximadamente 75 a aproximadamente 1.000 microgramos por kilogramo de peso corporal semanalmente. Las cantidades de dosificación eficaces descritas en el presente documento se refieren a las cantidades totales administradas, es decir, si se administra más de una composición, las cantidades de dosificación eficaces corresponden a la cantidad total administrada. La composición puede administrarse como dosis única o como dosis divididas. Por ejemplo, la composición puede administrarse dos o más veces separadas por 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, un día, dos días, tres días, cuatro días, una semana, dos semanas o por tres o más semanas.
La presente divulgación no se limita a los detalles específicos de construcción, disposición de componentes o etapas del método establecidos en el presente documento. Las composiciones y los métodos desvelados en el presente documento son capaces de realizarse, practicarse, usarse, llevarse a cabo y/o formarse de diversas formas que serán evidentes para un experto en la materia a la luz de la divulgación que sigue. La fraseología y la terminología usadas en el presente documento son solo con fines de descripción y no deben considerarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones. Los indicadores ordinales, tales como primero, segundo y tercero, como se usa en la descripción y las reivindicaciones para referirse a diversas estructuras o etapas del método, no pretenden interpretarse para indicar cualquier estructura o etapa específicas, o cualquier orden o configuración particular de tales estructuras o etapas. Todos los métodos desvelados en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, está destinado meramente a facilitar la divulgación y no implica ninguna limitación en el alcance de la divulgación a menos que se indique lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva ni las estructuras mostradas en los dibujos, debe interpretarse como una indicación de que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la materia objeto desvelada. El uso en el presente documento de las frases "que incluye", "que comprende" o "que tiene", y variaciones de los mismos, se entiende que abarca los elementos enumerados en lo sucesivo y equivalentes de los mismos, así como elementos adicionales. Las realizaciones enumeradas como "que incluye", "que comprende" o "que tiene" determinados elementos también se contempla como "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" esos determinados elementos.
La enumeración de intervalos de valores en el presente documento meramente pretende servir como método abreviado de hacer referencia de manera individual a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara de manera individual en el presente documento. Por ejemplo, si un intervalo de concentración se establece entre el 1 % y el 50 %, se pretende que valores tales como del 2 % al 40 %, del 10 % al 30 %, o del 1 % al 3 %, etc., estén enumerados expresamente en la presente memoria descriptiva. Estos son solo ejemplos de lo que se pretende específicamente, y todas las posibles combinaciones de valores numéricos entre e incluyendo el valor más bajo y el valor más alto enumerados deben considerarse expresamente declaradas en esta divulgación. El uso de la palabra "aproximadamente" para describir una cantidad determinada o un intervalo de cantidades indica que los valores muy cercanos a la cantidad mencionada están incluidos en esa cantidad, tales como valores que podrían o naturalmente serían contabilizados debido a las tolerancias de fabricación, error de instrumento y humano en la formación de medidas, y similares. Todos los porcentajes que se refieren a cantidades son en peso a menos que se indique lo contrario.
No se admite que cualquier referencia, incluyendo cualquier documento que no sea de patente o de patente citado en esta memoria descriptiva, constituya el estado de la técnica. En particular, se entenderá que, salvo que se especifique lo contrario, la referencia a cualquier documento en el presente documento no constituye una admisión de que alguno de estos documentos forma parte del conocimiento general común en la técnica en los Estados Unidos o en cualquier otro país. Cualquier análisis de las referencias indica lo que sus autores afirman y el solicitante se reserva el derecho a impugnar la precisión y la pertinencia de cualquiera de los documentos citados en el presente documento. La presente divulgación controlará en caso de que existan disparidades entre las definiciones y/o descripciones encontradas en las referencias citadas.
Los siguientes ejemplos pretenden ser solo ilustrativos y no pretenden ser limitaciones del alcance de la invención ni de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
El presente grupo ha sido pionero en el uso de soluciones basadas en quitosano para la administración local de citocinas y antígenos recombinantes [6, 38, 39, 88-91]. El quitosano es un polisacárido natural abundante derivado principalmente de los exoesqueletos de crustáceos [92]. Es un copolímero no ramificado de unidades de glucosamina y N-acetilglucosamina unidos por enlaces glucosídicos (3(1-4) (Figura 1). El uso de polisacáridos solubles en agua, como el quitosano, evita el uso de disolventes orgánicos desnaturalizantes de citocinas. In vivo, el quitosano se degrada de forma segura en fragmentos de glucosamina y N-acetilglucosamina excretables por lisozima, glucosaminidasa, lipasa y otras enzimas humanas endógenas. La tasa de degradación puede controlarse mediante la concentración de quitosano, el peso molecular (PM), el volumen de inyección y la relación N-acetilglucosamina:glucosamina.
La solución de quitosano mejora la retención local y la actividad de las citocinas administradas: Los estudios de los presentes inventores publicados demostraron que las soluciones sencillas, viscosas de quitosano son capaces de aumentar significativamente la retención local de GM-CSF [88] e IL-12 [6] co-formulados. En particular, las inyecciones de IL-12 sola se disiparon rápidamente y se volvieron indetectables en 24 a 48 horas (Figura 2). Por el contrario, formulando IL-12 en solución de quitosano, la IL-12 fue detectable hasta 6 días [6]. Los presentes inventores creen que una combinación de interacciones viscosas y electrostáticas obstaculiza la capacidad de las citocinas para difundirse fuera de la solución de quitosano y así formar un sistema de liberación de liberación lenta. La naturaleza de las interacciones no covalentes de quitosano/citocina y el mecanismo de liberación de citocinas es objeto de estudios en curso en el laboratorio de los presentes inventores.
Los datos de los presentes inventores también mostraron que los depósitos de quitosano/citocinas también aumentaron la actividad inmunológica frente a las inyecciones de citocinas basadas en solución salina. Específicamente, una sola inyección de quitosano/GM-CSF superó cuatro inyecciones diarias de GM-CSF solo en términos de aumentar el número y la funcionalidad de las células dendríticas en los ganglios linfáticos de drenaje. En experimentos de vacunación, quitosano/GM-CSF fue superior al quitosano o al CM-CSF solos en la mejora de la proliferación de CD4+ específicos de antígeno, la tinción con pentámero CD8+ específico de péptido y la lisis de células T citotóxicas [88]. De forma similar, las formulaciones de quitosano/IL-12 superaron a la IL-12 sola en la erradicación del 80-100 % de tumores sólidos establecidos agresivos (MC38 y Panc02) [6] y el 88-100 % de tumores de la vejiga ortotópicos superficiales (MB49) [38]. De forma interesante, se descubrió que la inmunoterapia intravesical con quitosano/IL-12 induce inmunidad sistémica específica del tumor que confiere protección completa desde una reexposición al tumor s.c. distante. Los datos no publicados más recientes demuestran que las inyecciones de quitosano/IL-12 antes de la resección del tumor son capaces de eliminar la metástasis y prolongar la supervivencia (Figura 3) en un modelo de cáncer de mama agresivo altamente metastásico.
Limitaciones de las mezclas de quitosano/citocinas: Aunque los presentes inventores han demostrado con éxito que las mezclas sencillas de quitosano/citocinas son eficaces para aumentar la retención y la actividad de las citocinas locales, determinaron que la mayoría de las citocinas liberadas se filtran del depósito de quitosano a la circulación. De hecho, Los niveles séricos de IL-12 e IFN-y después de la inyección de IL-12 sola o mezclas de quitosano/IL-12 fueron similares [38]. Debido a que estos datos pueden limitar la aplicación clínica de la presente plataforma de mezcla sencilla debido a preocupaciones sobre la toxicidad mediada por IL-12, los presentes inventores desarrollaron una nueva tecnología de entrega capaz de prevenir la diseminación de IL-12.
Novedosos bioconjugados de IL-12-quitosano: El grupo funcional amina de los restos de glucosamina del quitosano (Figura 1) permite una fácil unión química de diversos restos de cadena lateral incluyendo proteínas. Como resultado, los presentes inventores hipotetizaron que las citocinas podrían conjugarse covalentemente con el quitosano. La conjugación directa tiene dos ventajas sobre las anteriores mezclas sencillas de quitosano/IL-12. Primero, debido a que la difusión de macromoléculas está inversamente relacionada con el tamaño molecular, al conjugar IL-12 (PM=75 kDa) con una molécula de quitosano comparativamente grande (PM=100-500 kDa), el peso molecular eficaz de la citocina puede aumentarse hasta 6-7 veces. Como resultado, el transporte difusivo y, por lo tanto, la diseminación sistémica de citocinas se reduciría drásticamente, si no se eliminaría por completo. Segundo, después de la inyección i.t., las moléculas de quitosano altamente policatiónicas interactúan electrostáticamente con matrices extracelulares cargadas negativamente y membranas celulares [93]. En consecuencia, las citocinas se "anclan" eficazmente al lugar de la inyección mediante la carga policatiónica del quitosano.
El presente grupo ha descubierto que las mezclas de quitosano e IL-12 administradas localmente pueden inducir la regresión completa de los adenocarcinomas de páncreas [6], adenocarcinomas de colon [6], carcinomas de vejiga [38], carcinomas mamarios metastásicos, carcinomas de células renales, melanomas y adenocarcinomas de próstata. Aunque esta plataforma de mezcla sencilla es eficaz en la retención de cantidades significativas de IL-12 en el microambiente del tumor, no previene la diseminación sistémica de la mayoría de IL-12. Se estima que hasta el 75 % de la IL-12 inyectada se absorbió en la circulación y dio como resultado un pico concomitante en el suero de IFN-y [38]. Aunque no se espera que un programa de dosificación semanal de mezclas de quitosano/IL-12 induzca toxicidad clínica [97], las tecnologías novedosas que minimizan o eliminan la exposición sistémica a IL-12 son más traducibles.
Por lo tanto, el proyecto propuesto desarrollará y evaluará una novedosa plataforma de administración basada en la conjugación de IL-12 con quitosano. Esta estrategia dificulta la diseminación de IL-12: 1) aumentando el tamaño eficaz de IL-12; y 2) anclando los bioconjugados de IL-12-quitosano a un sitio de inyección local mediante interacciones bioadhesivas. Este enfoque tiene el potencial de mantener altas concentraciones de IL-12 en el tumor después de su administración con una fuga mínima a la circulación.
Sobreexpresión y purificación de IL-12 humana recombinante: Los planes de la presente aplicación inicial para fabricar IL-12 usando los sistemas de expresión de bacterias (E. coli) y de levaduras (Pichia pastoris) no tuvieron éxito debido a la extensa glucosilación requerida para la expresión y la bioactividad de IL-12. Afortunadamente, la colaboradora de los presentes inventores, la Dra. Barbara Felber, Investigador Senior, Vaccine Branch, NCI, ha desarrollado células de riñón embrionario humano (HEK293) que expresan IL-12 murina (mIL-12) e IL-12 humana (buIL-12).
Para evitar la posible generación de epítopos antigénicos, ninguna de las construcciones de IL-12 recombinante proporcionadas contiene etiquetas de afinidad extrínseca para la purificación. Un examen cuidadoso de la secuencia de aminoácidos de IL-12 reveló que la subunidad p40 de mIL-12 y huIL-12 contienen segmentos de aminoácidos que pueden unirse potencialmente a glucosaminoglucanos tales como, heparina. De forma interesante, los datos de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) mostraron que la IL-12 humana tiene una fuerte afinidad de unión a la heparina (Kd ~ 70 pM, Figura 4A). Basado en la alta afinidad de unión de IL-12 a la heparina, se diseñó un protocolo de purificación basado en cromatografía de afinidad (usando heparina-sefarosa) para purificar IL-12 humana. Se observó que IL-12 eluía como un pico discreto a 500 mM de NaCl (Figura 4B). El análisis en gel SDS-PAGE reveló que la IL-12 era pura (>95%, Figura 4C, D). El rendimiento de la proteína purificada es ~ 6,5 mg/20 ml de sobrenadante de cultivo.
La adquisición de clones HEK293 que expresan IL-12 y la identificación de motivos de unión a heparina en IL-12 son avances útiles necesarios para moverse a sistemas de expresión en mamíferos. Además, los motivos de unión a heparina recientemente identificados permiten una fácil purificación de la auténtica IL-12, así como los mutantes de IL-12 planificados, a partir de sobrenadantes de cultivo sin la participación de etiquetas de afinidad o procedimientos laboriosos multi-etapa. Véase Jayanthi et al. Protein Expr Purif (2014) 102: 76-84.
Validación de bioconjugados de IL-12-quitosano: Los datos preliminares adicionales demuestran la conjugación no específica exitosa de mIL-12 a quitosano a través de la reticulación de carbodiimida. En resumen, Se usó 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) para activar grupos carboxilo en IL-12 que a su vez reaccionaban con grupos amina estabilizados con N-hidroxisuccinamida (NHS) en quitosano para formar un enlace peptídico. La reacción de conjugación se llevó a cabo a pH 5,0 durante 6 horas, después de lo cual se aislaron bioconjugados de IL-12-quitosano mediante diálisis. La bioactividad in vitro se verificó cuantificando la proliferación de células 2D6 sensibles a IL-12 (Figura 5A). Como era de esperar debido a la conjugación no específica, una cantidad significativa, aproximadamente el 35 %, de la bioactividad de IL-12 se perdió. Las posibles causas incluyen la pérdida de IL-12 sin reaccionar, inactivación directa de IL-12 mediante reactivos de reticulación o inactivación indirecta mediante conjugación de IL-12 con quitosano en una orientación inaccesible. No obstante, es razonable suponer que cualquier pérdida en la bioactividad de IL-12 puede contrarrestarse simplemente aumentando las dosis de IL-12-quitosano usadas en estudios de inmunoterapia posteriores. Para controlar la posibilidad de que la proliferación inducida por IL-12-quitosano se deba a IL-12 no conjugada, una mezcla de IL-12 y quitosano se sometió a diálisis pero no a la reacción de conjugación. La IL-12 no conjugada y el quitosano no indujeron la proliferación de 2D6, lo que indica que la purificación de diálisis retiró con éxito la IL-12 libre sin reaccionar.
La bioactividad in vivo de los bioconjugados de IL-12-quitosano se verificó al documentar la regresión del tumor después de su administración i.t. (Figura 5B). La inmunoterapia con Il-12-quitosano i.t. medió la regresión tumoral en 4 de 4 ratones tratados, incluyendo 2 regresiones completas. Estos datos demuestran que las construcciones de IL-12-quitosano de primera generación conjugadas no específicamente no solo son activas, sino también agentes antitumorales prometedores. Los métodos propuestos de conjugación específica de IL-12 con quitosano intentarán mejorar la bioactividad de los bioconjugados de IL-12-quitosano mediante protocolos de conjugación más controlados y específicos del sitio.
IL-12 mantiene la bioactividad cuando se une al quitosano de diversas formas. Se compró quitosano (grado de desacetilación > 90 %) de Primex (Siglufjordur, Islandia) y se purificó antes de su uso. Ácido clorhídrico, hidróxido sódico, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC), N-hidroxisuccinimida (NHS) y tirosinasa de hongos se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). El 4-(N-maIeimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (Sulfo-SMCC) se adquirió de Life Technologies (Green Island, NY).
Reticulación de grupos reactivos de carboxilo a amina mediada por carbodiimida:
Los grupos de amina primaria en el quitosano se reticularon con los grupos de ácido carboxílico libres en las proteínas a través de un enlace peptídico mediado por carbodiimida. En resumen, se disolvió 1 mg de quitosano en HCl 0,1 M y se ajustó el pH de 5,4 a 5,6 usando NaOH 1 M. Se añadió 1 mg de EDAC y NHS a 250 pl de solución madre de quitosano y se mezcló antes de añadir 50 pl de solución de IL-121 mg/ml. La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 6 horas para una eficacia de conjugación óptima. Después de 6 horas, los conjugados de quitosano-IL-12 se dializaron usando una membrana de diálisis de 100 KDa para retirar los productos químicos que no habían reaccionado y se secaron por congelación antes de su uso posterior.
Reticulación de amina a sulfhidrilo mediada por tioéter de maleimida:
Los grupos amina reactivos en IL-12 se reticularon con grupos sulfhidrilo en quitosano tiolado a través de reticulación amina-sulfhidrilo mediada por éster de maleimida NHS. En resumen, se añadió el reticulante de amina a sulfhidrilo SuIfo-SMCC a 50 pg de XL-12 en 50 pl de agua desionizada con un acceso molar 80X. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se desaló y se añadió a 250 pg de quitosano tiolado. Después de 30 min, los conjugados de quitosano-IL-12 se dializaron usando una membrana de diálisis de 100 KDa para retirar los compuestos que no habían reaccionado y se secaron por congelación antes de su uso posterior.
Reticulación de tirosina a amina catalizada por tirosinasa:
La O-quinona reactiva creada por la oxidación catalizada por tirosinasa de tirosina en IL-12 se usó para la reticulación con quitosano a través del grupo amina primaria. En resumen, se disolvió quitosano en HCl 20 mM y se ajustó el pH a 6,0 usando NaOH 1 M para obtener una solución de quitosano al 0,1 % (p/v). La tirosinasa se diluyó en PBS (pH 6,5) para lograr una actividad específica de 120 U/ml. Se mezclaron volúmenes iguales de soluciones madre de tirosinasa y quitosano y se dejaron a temperatura ambiente. Se añadieron 50 pg de IL-12 a la mezcla de reacción y se mezclaron a temperatura ambiente. Después de 8 horas de incubación, los conjugados de quitosano-IL-12 se dializaron usando una membrana de diálisis de 100 KDa para retirar los compuestos que no habían reaccionado y se secaron por congelación antes de su uso posterior.
Bioactividad de los conjugados de quitosano IL-12:
Se determinó la influencia de la conjugación no específica de IL-12 sobre el quitosano sobre la bioactividad de IL-12 cuantificando la proliferación de la línea celular 2D6 que responde a IL-12. En breve, se sembraron células T 2D6 cultivadas en una placa de 96 pocillos a 20.000 células/pocillo. Se añadió IL-12 para lograr concentraciones finales de 0,2 ng/ml, 0,04 ng/ml y 0,008 ng/ml. La IL-12 no conjugada y los medios de cultivo solos sirvieron como controles. Después de una incubación de 24 horas, la proliferación de células 2D6 dependiente de IL-12 se cuantificó mediante un ensayo de proliferación basado en MTT. Los resultados se muestran en la Figura 6 y demuestran que los diversos medios de unir la IL-12 al quitosano dan como resultado diversos niveles de actividad. El enlace carboxilo a amina y tirosina a amina de IL-12 a quitosano dio como resultado una mejor actividad de IL-12.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende quitosano enlazado covalentemente a IL-12, en donde el enlace covalente es un enlace tirosina a amina de la IL-12 al quitosano, está entre los grupos amina en el quitosano y los grupos carboxilo en la IL-12, o está entre los grupos sulfhidrilo en la IL-12 sustituida con cisteína y en el quitosano que está tiolado, y en donde la IL-12 es biológicamente activa.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde la IL-12 está unida covalentemente al quitosano usando una química seleccionada del grupo que consiste en química del clic, química del peryodato, química del tioéter de maleimida y química del tiol para generar el enlace covalente.
3. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el quitosano tiene un peso molecular entre 10 kDa y 500 kDa, opcionalmente entre 100 kDa y 400 kDa y opcionalmente entre 200 kDa y 300 kDa.
4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el quitosano está tiolado o metilado.
5. Una composición farmacéutica que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno en un sujeto, comprendiendo el método administrar la composición al sujeto en una cantidad eficaz para tratar el trastorno.
7. La composición para su uso de la reivindicación 6, en donde el sujeto es un ser humano.
8. La composición para su uso de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el trastorno se localiza en un área y la composición se administra localmente.
9. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde el trastorno es cáncer.
10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, comprendiendo el método administrar la composición y un antígeno al sujeto en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunitaria dirigida al antígeno.
11. La composición para su uso de la reivindicación 10, en donde el antígeno es parte de una vacuna.
12. La composición para su uso de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde el sujeto es un ser humano.
13. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6-12, en donde la composición se administra a través de un método seleccionado del grupo que consiste en administración intratumoral, intravesicular, oral, tópica, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal y transcutánea.
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