KR100737297B1 - 전이 성장인자-키토산 복합체 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전이 성장인자 (transforming growth factor)의 아미노산 잔기들에 존재하는 작용기와 키토산에 존재하는 아민기가 공유결합 되어 형성된 전이 성장인자-키토산 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 관절염 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 복합체에서, 전이 성장인자의 생체 내/외에서의 안정성과 반감기가 크게 증가되며, 결국 전이 성장인자의 생물학적 활성이 크게 증가된다. 더욱이, 복합체 자체는 세포 독성이 없어 생체에 매우 안전한 이점이 있다.
키토산, 전이 성장인자, 관절염, 복합체

Description

전이 성장인자-키토산 복합체 및 그의 제조방법{Transforming Growth Factor-Chitosan Complexes and Preparation Method thereof}
도 1은 전이 성장인자-키토산 복합체의 세포독성 실험 결과를 보여주는 그래프이고;
도 2는 전이 성장인자 및 전이 성장인자-키토산 복합체의 트립신에 의한 단백질가수분해 (proteolytic degradation)에 대한 안정성 측정결과를 보여주는 그래프이며;
도 3은 전이 성장인자-키토산 복합체의 관절염에 대한 치유 효과를 순수 전이 성장인자와 토끼의 자연적인 관절염 치유 능력과 비교하여 보여주는 그래프이고;
도 4는 전이 성장인자-키토산 복합체를 투여한 후 9주가 지난 동물 실험용 토끼의 관절 표면을 보여주는 사진이며; 그리고,
도 5는 조직형태학적 정량 분석에서 전이 성장인자-키토산 복합체가 대조군에 비하여 관절 낭에 더 높은 치유 효과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 전이 성장인자-키토산 복합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 전이 성장인자-키토산 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 관절염 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
성장인자 (Growth Factor)는 세포의 성장을 촉진시키는 작용을 하며, 특히 성장인자 중의 하나인 전이성장인자 (TGF: Transforming Growth Factor)는 연골세포 (Chondrocyte) 활성을 자극하는 신호를 전달하는 많은 폴리펩타이드들 중 하나이다. 따라서 펩타이드나 스테로이드와 같은 분자의 이동으로 인하여 한 세포와 인접 세포는 상호작용을 할 수 있으며, 더 나아가 세포 기능을 전체적으로 조절할 수 있다.
전이성장인자 (TGF-β)는 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드로서 관절염 및 연골세포 분화촉진, 암세포 전이 억제, 상피세포를 포함한 대부분의 세포주에 대한 성장억제효과에 관한 실험 등에 임상 응용되고 있다. 그러나 이러한 성장인자들은 활성 반감기가 짧아 사용상 많은 어려움이 있었다.
종래 보고된 바에 의하면, 수용성 CM-셀룰로오스와 아밀라아제 (Wykes, J. et al., Biochemica et Biophysica Acta ( BBA ), 250:522-529(1971)) 및 수용성 덱스트란과 라이소자임, β-글루코시다아제 (Vegarud, G. et al., Biochemica et Biophysica Acta ( BBA ), 266:431-452(1975)) 또는 β-아밀라아제 간에 공유결합을 형성시킴으로써 pH, 온도, 열, 산소 등의 물리적 외부요인에 대하여 안정화된 효소-당 복합체가 개발되었다. 또한, 덱스트란-효소 복합체를 치료제로써 쥐의 정맥 혈관에 주입하여 효소의 잔존 활성을 측정한 결과 원래의 효소보다 높은 활성을 나타내었으며, 덱스트란-효소 복합체에서 효소의 순환활성 반감기도 연장된 것으로 보고 되었다.
한편, 키토산은 글루코스아민과 N-아세틸글루코스아민이 1,4-β-결합된 양이온성 다당류로서, 게나 다른 출처로부터 얻은 키틴을 탈아세틸화하여 얻을 수 있다. 키틴은 생체 내에서 서서히 분해되며 키틴과 그 분해산물은 안전한 천연산물이다. 제제학 분야에서, 키토산은 약물의 지연 방출을 위한 담체로 사용되어 왔으며 (Hou et al., Chem Pharm Bull 33(9):3986-3992(1985)), 키틴 자체는 직조하여 상처 치유용 드레싱으로 사용되어 왔다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 전이 성장인자의 안정성 (특히, 인 비보 안정성)과 응용성이 최대로 개선된 전이 성장인자를 개발하기 위하여 지속적인 연구를 수행하였고, 그 결과 자기멸균성을 가진 생체적합성 생분해성 소재인 키토산에 전이 성장인자를 공유결합시켜 제조된 복합체 형태로 전이 성장인자를 이용하는 경우에는, 전이 성장인자의 생체 내/외에서의 안정성과 반감기를 크게 증가시켜, 결국 전이 성장인자의 생물학적 활성을 크게 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 전이 성장인자-키토산 복합체를 제조하는 데 있다.
본 발명의 목적은 전이 성장인자-키토산 복합체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전이 성장인자-키토산 복합체를 포함하는 관절염 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 전이 성장인자 (transforming growth factor: TGF)의 아미노산 잔기들에 존재하는 작용기와 키토산에 존재하는 아민기가 공유결합 되어 형성된 전이 성장인자-키토산 복합체를 제공한다.
본 발명자들은 전이 성장인자의 안정성 (특히, 인 비보 안정성)과 응용성이 최대로 개선된 전이 성장인자를 개발하기 위하여 지속적인 연구를 수행하였고, 그 결과 자기멸균성을 가진 생체적합성 생분해성 소재인 키토산에 전이 성장인자를 공유결합시켜 제조된 복합체 형태로 전이 성장인자를 이용하는 경우에는, 전이 성장인자의 생체 내/외에서의 안정성과 반감기를 크게 증가시켜, 결국 전이 성장인자의 생물학적 활성을 크게 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 더욱이, 이렇게 개발된 전이 성장인자-키토산은 세포 독성이 없어 생체에 매우 안전하다.
본 명세서에서 용어 “전이 성장인자”는 다른 특별한 언급이 없는 한, 전이 성장인자-β (TGF-β)를 의미한다.
본 발명의 복합체에서, 전이 성장인자와 키토산은 공유결합 되어 있다. 이러한 공유결합은 키토산의 아민기와 전이 성장인자의 아미노산 잔기들에 존재하는 작용기 사이에 이루어진다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 키토산의 아민기에 결합되는 아미노산의 작용기는 카르복실기 또는 설프히드릴기이며, 가장 바람직하게는 카르복실기이다. 본 발명자들은 전이 성장인자의 아미노산 잔기들에 존재하는 카르복실기가 본 발명의 목적에 가장 적합한 결합 작용기임을 발견하였다.
만일, 키토산의 아민기와 전이 성장인자의 아미노산 잔기의 설프히드릴기를 결합시켜 복합체를 제조하는 경우에는, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), m-말레이미도벤조일-N-히드록시설포숙신이미드 에스테르 (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy sulfosuccinimide ester) 또는 N-말레이미도부티릴옥시숙신아미드 에스테르 (N- Maleimidobutyryloxysuccinamide ester)와 같은 헤테로이중작용기 링커 (heterobifunctional linker)를 이용하여 TGF-키토산 복합체를 제조한다.
본 발명의 특징 중 하나는, TGF-키토산 컨쥬게이션을 제조함에 있어서 컨쥬게이션 파트너로서 전이 성장인자의 아미노산 잔기의 카르복실기와 키토산의 아민기를 선택한 것이다. 상기 작용기 사이의 결합은 다양한 헤테로이중작용기 링커 (heterobifunctional linker)를 통하여 실시할 수 있으며, 바람직하게는 카보다이이마이드 (carbodiimide)-함유 화합물, ASBA (4-[p-azidosalicylamido]butylamine) 또는 AEDP (3-[(2-aminoethyl)dithio]propionic acid)에 의해 결합을 형성시킨다. 보다 바람직하게는 전이 성장인자의 아미노산 잔기의 카르복실기와 키토산의 아민기 사이의 공유결합은 수용성 카보다이이마이드 (carbodiimide)-함유 화합물에 의해, 가장 바람직하게는 EDC (1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide)에 의해 형성된다. 본 발명자들은 EDC가 본 발명의 목적에 적합한 TGF-키토산 복합체를 제조하는 데 가장 적합한 헤테로이중작용기 링커임을 최종적으로 확인하였다. 즉, TGF을 키토산과 공유결합시켜 복합체를 제조함에 있어서, TGF의 고유한 활성은 손상시키지 않으면서도 TGF의 생체 내 안정성을 크게 개선시킬 수 있도록 키토산과 안정되게 결합시킬 수 있는 최적의 링커로서 EDC를 선별한 것이다. 또한, EDC가 제로-길이 (zero-length) 링커라는 측면도 본 발명에 적합한 특징이다.
TGF에 결합되는 키토산은 크게 제한되지 않지만, 바람직하게는 5-100 kDa, 보다 바람직하게는 5-50 kDa, 가장 바람직하게는 10-25 kDa의 분자량을 갖는 것이다. 분자량이 10 kDa 미만인 경우에는 분자량이 너무 작아 TGF의 성장인자로서의 작용을 하는 단백질의 작용기를 제대로 보호하지 못하는 문제점이 있고, 25 kDa을 초과하는 경우에는 TGF 주위를 보호하고 있는 키토산이 분해되어 TGF의 작용기가 드러나서 연골세포를 자극하는 시간이 너무 오래 걸려서 성장인자의 관절염 치표효과를 제 때 발휘하지 못하는 단점이 있다.
본 발명의 TGF-키토산 복합체는 생체 내에서 개선된 안정성을 나타내며 세포 무독성이므로, TGF의 활성에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 다양한 질병 또는 질환에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 복합체에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 질병 또는 질환은, 퇴행성 관절염에 의한 손상 연골조직의 재생이지만 좀 더 활용범위를 넓혀 생체 외 연골세포 배양 또는 퇴행성 관절염 외에도 연골 세포 손상에 관련된 모든 질병에 대한 치료제로 적용될 수 있다.
본 발명의 TGF-키토산 복합체는 다양한 방법을 통해 제조될 수 있지만, 바람직하게는 (a) 키토산을 가수분해하여 분자량 10-25 kDa의 키토산 분획을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 분자량 10-25 kDa의 키토산을 수용성 카보다이이마이드 (carbodiimide)-함유 화합물의 존재 하에 전이성장인자와 반응시켜 전이 성장인자-키토산 복합체를 수득하는 단계를 포함하는 전이 성장인자-키토산 복합체의 제조방법에 따라 제조된다.
본 발명의 제조방법의 구체적인 일 실시예에 따라 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다:
키토산 가수분해 반응을 수행하여 저분자량 키토산 분획을 제조한다. 이 때, 산농도, 반응시간 및 반응온도 등을 조절하여 원하는 분자량 분획의 수율을 증 가시킬 수 있다. 예를 들어, 4%(w/w)의 키토산 아세트산 용액을 NaOH 수용액을 사용하여 중화 적정하고, pH 7.0 부근에서 백색 침전이 더 이상 생성되지 않을 때까지 상온에서 방치한다. 그 후 침전물을 세척, 건조 및 정제하여, HCl을 첨가하고 냉욕에서 교반한 후, 50℃ 및 83℃에서 0.5-5 시간 반응시키고, 이 반응용액에 증류수를 가하여 침전물을 제거하고, 메탄올을 가하여 얻은 침전물을 다시 증류수에 용해시켜 한외여과 함으로써 저분자량 (약 10-25 kDa) 키토산 분획을 얻는다.
얻어진 저분자량 키토산 분획을 수용성 카보다이이마이드-함유 화합물 (바람직하게는, EDC)와 함께 TGF 첨가 몰수의 약 50배 과량으로 첨가한다. 예를 들어, 84.348 ng/㎖의 EDC 시약을 250 ㎕ 첨가한 후, 30 ng/㎖의 TGF를 500 ㎕ 첨가하여 4℃에서 약 2 분간 진탕하고, 23.2 ㎍/ml의 가수분해 키토산을 250 ㎕ 첨가한 후 상온에서 4 시간 반응시킨다. 그 후, 이 용액에 0.13 M 글리신 용액 100 ㎕를 첨가한 후 90분간 더 진탕한다. 90분 후 투석 막 컷-오프 12,000을 사용하여 하루 동안 4℃에서 투석하고, 여과막을 사용하여 전이 성장인자-키토산 복합체를 얻는다.
상기 방법에 따라 제조된 전이 성장인자-키토산 복합체의 수율은 60.84-73.5%로서, CDAP 가교제를 사용한 상피세포성장인자-덱스트란 복합체의 보고된 수율 30-40% 보다 훨씬 높았으나, 이러한 수율은 전이성장인자의 양에 비례하여 증가하지는 않는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명 제조방법의 수율이 매우 우수한다는 것을 알 수 있다.
하기의 실시예에 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명의 전이 성장인자-키토산 복합체의 세포 독성이 없으며, 3일 경과 후에도 순수 전이 성장인자 보다 높은 세포성장 지속효과를 나타내어 활성 반감기가 증가되었음을 알 수 있었고, 순수 전이 성장인자보다 안정성도 우수하다. 또한, 토끼의 관절염 부위에 전이 성장인자- 키토산 복합체를 처리하면, 순수 전이 성장인자 양의 50%에 불과한 양으로 제조된 전이 성장인자-키토산 복합체를 처리한 부위에서 순수 전이 성장인자를 처리한 부위보다 우수한 수준의 상처 치료 효과를 달성한다. 따라서 전이 성장인자-키토산 복합체를 관절염 치료제로 사용하면 순수 전이 성장인자를 관절염 치료제로 사용하는 경우에 비해 더욱 높은 경제적 이익을 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 전이 성장인자-키토산 복합체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 관절염 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분으로서 상술한 전이 성장인자-키토산 복합체를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 TGF-키토산 복합체는 생체 내에서 개선된 안정성을 나타내며 세포 무독성이므로, 관절염 치료에 특히 유효하다.
본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 관절염 치료 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상 적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 특히 바람직하게는, 발생된 관절에 직접 주입하는 관절내 주입 (intraarticular injection)이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 가장 바람직한 투여량은 1회 투여 시 1 ㎖이며 이 경우 TGF의 양은 15 ng 이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/ 또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: EDC 축합시약을 이용한 TGF -키토산 복합체의 제조
2%(w/w)의 키토산 (Ja-Kwang, Korea) 아세트산 용액을 제조하고, NaOH 수용액을 사용하여 중화 적정하였다. pH 7.0 부근에서 백색 침전이 더 이상 생성되지 않을 때까지 상온에서 방치하였다. 그 후 침전물을 증류수, 에탄올과 에테르 순으로 세척하고 건조하여 정제하였다. 정제된 키토산 분말을 2% 아세트산 수용액에 상온에서 약 12시간 동안 용해시켜 키토산 용액을 제조하였다. 여기에 Conc. HCl을 첨가하여 50℃에서 약 30분 동안 반응을 전개하였다. 30분 후, 가수 분해 액의 1 부피의 증류수를 첨가하여 미 반응물의 침전을 유도하였다. 침전물을 제거한 가수분해 액에 1 부피의 메탄올을 첨가하여 침전물을 얻었다. 침전물을 다시 증류수에 용해시켜 YM10 (투석 막 컷-오프 10 kDa)과 YM3 (투석 막 컷-오프 3 kDa) 막을 이용하여 한외여과를 수행하였다. 상기 반응을 통하여 최종적으로 얻어진 키토산 분획의 분자량은 23 kDa과 10 kDa이었다.
상기 공정으로 얻어진 저분자량 (10,535 Da) 키토산을 EDC (1-ethyl-(dimethylaminopropyl)carbodiimide; Sigma, USA)와 함께 TGF 첨가 몰수의 각각 50배 및 10배 과량으로 첨가하였다. 즉, 6.76 nmol/㎖의 EDC 용액 250 ㎕를 반응기에 첨가하였다. 여기에 2000 ng/㎖의 TGF (human recombinant, Sigma) 용액을 4℃에서 500 ㎕ 첨가하였다. 약 120초 동안 진탕한 후, 0.16 μmol/㎖의 가수분해 키토산 (10,535 Da) 용액 250 ㎕를 첨가한 후, 상온에서 4시간 반응시켰다. 그 후 이 용액에 0.13 M 글리신 용액 100 ㎕를 첨가한 후, 90분 더 진탕하였다. 90분 후, 투석 막 컷-오프 12,000을 사용하여 하루 동안 4℃에서 투석하여 TGF-키토산 복합체를 얻었다. 상기 방법에 따라 제조된 전이 성장인자-키토산 복합체의 수율은 60.84-73.5%로서, CDAP 가교제를 사용한 상피세포성장인자-덱스트란 복합체의 보고된 수율 30-40% 보다 훨씬 높았으나, 이러한 수율은 전이성장인자의 양에 비례하여 증가하지는 않는 것으로 나타났다.
실시예 2: EGF -키토산 복합체의 세포독성 시험
전이 성장인자-키토산 복합체의 세포독성을 평가하기 위하여, 1-4 ㎍/㎖ 농도 범위의 전이 성장인자-키토산 복합체 20 ㎕를 DMEM (무혈청) 중에 1× 104 세포/웰 농도의 인간 연골세포 (human chondrocyte)를 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가 하여, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 분석을 통하여, 세포독성을 12시간, 2일 및 3일에 걸쳐 측정하였다 (도 1). 도 1에서 볼 수 있듯이, 전이 성장인자-키토산 복합체는 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다. 도 1에서 TGF-LMC는 상기 실시예 1에서 제조한 TGF-키토산 복합체를 나타낸다.
실시예 3: 전이 성장인자-키토산 복합체의 단백질 분해 효소에 대한 안정성 평가
전이 성장인자-키토산 복합체의 세포성장 지속효과를 아래와 같은 방법으로 측정하였다. 전이 성장인자-키토산 복합체와 순수 전이 성장인자를 37℃에서 대표적인 단백질 분해 효소인 트립신 처리하였다 (도 2). 도 2에서 확인할 수 있듯이, 순수 전이 성장인자 (TGF로 표기)는 초기 활성의 30% 이하로 급격히 감소한 반면, 전이 성장인자-키토산 복합체 (TGF-LMC로 표기)는 초기 활성의 80%까지 유지되는 것으로 확인되었다. 이로부터 전이 성장인자-키토산 복합체의 TGF가 순수 TGF 보다 단백질 분해효소에 대하여 높은 보호 (protection) 효과를 갖는다는 사실을 알 수 있다.
실시예 4: 전이 성장인자-키토산 복합체의 상처 치유 효과 측정
체중이 3-4 kg이고 생후 12주 이상 되어 성장판이 닫힌 성숙한 토끼 (New Zealand White Rabbit) 30마리를 Yoshioka 등 (Osteoarthritis cartilage 4:87-98(1996))의 방법에 따라 슬 관절 전방십자인대 절단술을 시행하여 인위적인 골관 절염을 유도한 후에 제1실험군 (전이 성장인자-키토산 복합체 주입군, N=10)과 제2실험군 (순수 전이 성장인자 주입군, N=10) 그리고 제3실험군 (무 투여군, N=10)의 3가지 실험군으로 나누어 시술 4주후에 실험군에 해당되는 관절염 치유 예상 물질을 관절염 부위에 주입하고, 시술 9주후에 토끼를 희생시켜 전이 성장인자-키토산 복합체의 관절염 치유 효과를 다른 대조군과 비교하였다. 실험 결과는 도 3, 4 및 5에 나타나 있다.
도 3은 각 대조군에서 생겨난 관절염의 등급을 측정한 결과로 전이 성장인자-키토산 복합체를 투여한 실험군이 다른 대조군에 비하여 낮은 등급의 관절염을 보였음을 알 수 있는 결과이며 이를 통해 전이 성장인자-키토산 복합체가 비교된 다른 인자들에 비하여 관절염 치료에 더 높은 효과를 나타내고 있음을 알 수 있다. 도 3에서, 막대 내의 숫자는 개체수를 나타내며, 백분율은 10%가 한 마리의 실험 대상 개체수를 나타낸다.
도 4는 시술 바로 직후의 토끼 관절 표면의 연골 조직과 전이 성장인자-키토산 복합체를 투여하여 시술 후 9주가 지난 토끼의 관절 표면의 연골조직을 비교한 사진으로 전이 성장인자-키토산 복합체가 우수한 관절염 치유 효과를 나타냄을 알 수 있는 사진이다. 유관 상으로 확인 시에 성장인자-키토산의 투여군이 그렇지 않은 쪽에 비하여 형태적으로 더욱 정상적으로 재활이 되어 있음을 확인할 수 있었다.
도 5는 조직형태학적 정량 분석 (histomorphometry-quantitative analysis) 의 결과를 나타내는 그래프이다. 활액막 세포층의 두께는 100군데의 표본을 설정 하여 평균값을 구하여 측정하였고, 각 군에서 양측의 측정치간의 차이를 분석함에 있어서는 비모수적인 방법인 윌콕손 사인드 랭크 테스트 (Wilcoxon signed rank test)를 이용하였다. 각 군간의 차이를 비교함에 있어서는 모수적 방법으로 일원 배치 분산 분석법을 이용하였고 사후 검정에는 Duncun test와 Turkey b test를 시행하였고, 비모수적 검사로는 Kruskall-Wallis test와 사후 분석으로 Mann-Whiteney U test를 이용하였다. 통계학적 분석은 SPSS 프로그램 (SPSS for Windows Release 11.5; Chicago, Illinios)을 이용하였고, 신뢰구간은 95%로 하였다.
활액막 세포층의 두께가 반대측에 비하여 의미있게 증가하였다(p<0.05). 성장인자-키토산 복합체 주입군 에서는 반대편과 차이의 평균이 10.2± 2.7 ㎛로 가장 높은 수치를 보였고 다음으로는 순수 성장인자 주입군으로 평균 5.2± 1.6 ㎛, 대조군은 평균 4.5 ± 2.0 ㎛ 로 가장 낮은 수치를 보였다. 성장인자-키토산 복합체 주입군은 나머지 두 군과 의미 있는 차이를 보였다. 따라서, 전이 성장인자-키토산 복합체 투여군이 여타 다른 실험군에 비하여 두꺼운 활액막 세포층의 두께를 생성해 내어 높은 관절염 치유 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.
이상의 동물실험 결과를 통하여, 전이 성장인자-키토산 복합체는 순수한 전이 성장인자나 토끼 고유의 자연적인 관절염 치료 효과보다 크게 개선된 관절염 치유 효과를 나타냄을 알 수 있다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 전이 성장인자-키토산 복합 체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 관절염 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 복합체에서, 전이 성장인자의 생체 내/외에서의 안정성과 반감기가 크게 증가되며, 결국 전이 성장인자의 생물학적 활성이 크게 증가된다. 더욱이, 복합체 자체는 세포 독성이 없어 생체에 매우 안전한 이점이 있다.

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  7. 다음을 포함하는 관절염 치료용 약제학적 조성물.
    (a) 전이 성장인자의 아미노산 잔기들에 존재하는 작용기인 카르복실기 또는 설프히드릴기와 키토산에 존재하는 아민기가 공유결합되어 형성된 전이 성장인자-키토산 복합체의 약제학적 유효량; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체.
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  10. 제 7 항에 있어서, 상기 전이 성장인자의 아미노산 잔기의 카르복실기와 키토산의 아민기 사이의 공유결합은 카보다이이마이드 (carbodiimide)-함유 화합물, ASBA (4-[p-azidosalicylamido]butylamine) 또는 AEDP (3-[(2-aminoethyl)dithio]propionic acid)에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 전이 성장인자의 아미노산 잔기의 카르복실기와 키토산의 아민기 사이의 공유결합은 수용성 카보다이이마이드 (carbodiimide)-함유 화합물에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 약제학적 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 수용성 카보다이이마이드 (carbodiimide)-함유 화합물은 EDC (1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide)인 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 키토산은 10-25 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 약제학적 조성물.
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