KR20050086040A

KR20050086040A - 상피세포성장인자-키토산 복합체 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20050086040A
Application number: KR1020040012367A
Authority: KR
Inventors: 박세훈; 손태일; 김천호; 손영숙; 박현숙; 진용재; 김태환; 박기숙
Original assignee: 한국원자력연구소
Priority date: 2004-02-24
Filing date: 2004-02-24
Publication date: 2005-08-30
Also published as: KR100616464B1

Abstract

본 발명은 수용성 카보디이미드(carbodiimide)를 사용하여 상피세포성장인자(EGF: Epidermal Growth Factor)의 아미노산 중 산성 아미노산에 존재하는 작용기인 카복시기와 키토산에 존재하는 아미노기를 화학 결합시켜 제조된, EGF와 키토산이 화학적으로 포접된 EGF-키토산 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에서 상피세포성장인자(EGF)-키토산 복합체는 높은 수율로 얻어질 뿐 아니라 활성 반감기와 안정성이 우수하고 세포 무독성이며 절상 등의 상처 치유 효과가 우수하다.

Description

상피세포성장인자-키토산 복합체 및 그의 제조방법{Epidermal Growth Factor-chitosan complexes and preparation method thereof}

본 발명은 상피세포성장인자-키토산 복합체[Epidermal Growth Factor(EGF)-chitosan complexes] 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 수용성 카보디이미드(carbodiimide)를 사용하여 상피세포성장인자의 아미노산 중 산성 아미노산에 존재하는 작용기인 카복시기와 키토산에 존재하는 아미노기를 화학 결합시켜 제조된, 상피세포성장인자와 키토산이 화학적으로 포접(conjugate)된 상피세포성장인자-키토산 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

성장인자(Growth Factor)는 세포의 성장을 촉진시키는 작용을 하며, 특히 성장인자 중의 하나인 상피세포성장인자(EGF: Epidermal Growth Factor)는 세포활성을 자극하는 신호를 전달하는 많은 폴리펩타이드들 중 일부이다. 따라서 펩타이드나 스테로이드와 같은 분자의 이동으로 인하여 한 세포와 인접 세포는 상호작용을 할 수 있으며, 더 나아가 세포 기능을 전체적으로 조절할 수 있다. EGF는 53개 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드로서 창상 및 화상, 족부궤양, 각막궤양, 피부이식 등에 임상 응용되고 있다. 그러나 이러한 성장인자들은 활성 반감기가 짧아 사용상 많은 어려움이 있어왔다.

종래 보고된 바에 의하면, 수용성 CM-셀룰로스와 아밀레이즈(Wykes, J. et al., 1971), 및 수용성 덱스트란과 라이소자임, β-글루코시데이즈(Vegarud, G. et al., 1975) 또는 β-아밀레이즈 간에 공유결합을 형성시킴으로써 pH, 온도, 열, 산소 등의 물리적 외부요인에 대하여 안정화된 효소-당 복합체가 개발되어 왔다. 또한, 덱스트란-효소 복합체를 치료제로써 쥐의 정맥 혈관에 주입하여 효소의 잔존 활성을 측정한 결과 원래의 효소 보다 높은 활성을 나타내었으며, 덱스트란-효소 복합체에서 효소의 순환활성 반감기도 지연된 것으로 보고되었다.

최근에는 EGF를 CDAP(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate) 가교제를 사용하여 덱스트란-³H과 복합체를 형성시켜 이것이 암세포의 세포막에 존재하는 EGF 수용체에 정확히 도달할 수 있도록 EGF를 안정화시키고 EGF의 활성 반감기를 연장시키는 기술이 보고되어 있다(Annelie, A., et al., 1991). 그러나 위 기술에 있어서는 CDAP 가교제의 사용으로 인해 인체 유독성 문제를 수반한다. 또한 이 복합체의 제조과정은 시아닐화(cyanylation) 반응을 기초로 하므로 덱스트란의 3개 하이드록실기에 비특이적으로 EGF가 결합하게 되어 반응의 제어가 어렵게 된다.

한편, 키토산은 글루코스아민과 N-아세틸글루코스아민이 1,4-β-결합된 양이온성 다당류로서, 게나 다른 출처로부터 얻은 키틴을 탈아세틸화하여 얻을 수 있다. 키틴은 생체 내에서 서서히 분해되며 키틴과 그 분해산물은 안전한 천연산물이다. 제제학 분야에서, 키토산은 약물의 지연 방출을 위한 담체로 사용되어 왔으며(Hou et al., Chem Pharm Bull 1985; 33(9): 3986-3992), 키틴 자체는 직조하여 상처 치유용 드레싱으로 사용되어 왔다. 그러나 키토산을 성장인자와 포접시켜 복합체를 제조함으로써 성장인자의 안정성과 응용성을 증대시키고자 한 시도는 없었다.

본 발명자들은 안정성과 응용성이 최대로 증대된 상피세포성장인자를 개발하기 위하여 지속적인 연구를 수행한 결과, 자기멸균성을 가진 생체적합성 생분해성 소재인 키토산과 상피세포성장인자의 복합체를 형성시킴으로써 상피세포성장인자의 생체 내외에서의 안정성과 반감기를 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 높은 효율로 제조될 수 있고 생체 내외에서의 안정성 및 반감기가 증가될 뿐 아니라 세포독성도 갖지 않고 상피세포성장인자 고유의 활성도 증가된 상피세포성장인자-키토산 복합체 및 그의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 상피세포성장인자의 아미노산 중 산성 아미노산에 존재하는 작용기인 카복시기와 키토산에 존재하는 아미노기를 화학 결합시켜 제조된, 상피세포성장인자와 키토산이 화학적으로 포접된 상피세포성장인자-키토산 복합체를 제공한다.

본 발명은 또한

ⅰ) 키토산을 가수분해하여 분자량 10 내지 25 kDa의 키토산 분획을 얻고,

ⅱ) ⅰ)에서 얻은 키토산을 수용성 카보디이미드, 예를 들어, EDC(1-ethyl-(dimethylaminopropyl)carbodiimide) 축합시약 존재 하에 상피세포성장인자와 반응시키고,

ⅲ) ⅱ)에서 얻은 상피세포성장인자-키토산 복합체를 분리하는 단계

를 포함하여, 상기 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는, 키토산의 분자량을 응용목적에 맞게 변형시킨 후, 상피세포성장인자-키토산 복합체를 제조함으로써, 상피세포성장인자의 생체내외에서의 안정성 및 응용성을 최대로 증가시켰다.

본 발명의 EGF-키토산 복합체의 제조과정을 살펴보면 아래와 같다.

먼저, 키토산 가수분해 반응을 수행하여 저분자량 키토산 분획을 제조한다. 이 때, 산농도, 반응시간, 반응온도 등을 조절하여 원하는 분자량 분획의 수율을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 4%(w/w)의 키토산 아세트산 용액을 NaOH 수용액을 사용하여 중화 적정하고, pH 7.0 부근에서 백색 침전이 더 이상 생성되지 않을 때까지 상온에서 방치한다. 그 후 침전물을 세척, 건조 및 정제하여, HCl을 첨가하고 냉욕에서 교반한 후, 50 ℃ 및 83 ℃에서 0.5∼5 시간 반응시키고, 이 반응용액에 증류수를 가하여 침전물을 제거하고, 메탄올을 가하여 얻은 침전물을 다시 증류수에 용해시켜 한외여과함으로써 저분자량(약 10∼25 kDa) 키토산 분획을 얻는다.

얻어진 저분자량 키토산 분획을 EDC와 함께 EGF 첨가 몰수의 10 배 과량으로 첨가한다. 예를 들어, 33.8 pmol 내지 6.76 ㎚ol의 EDC 축합시약을 250 ㎕ 첨가한 후, 1.69 pmol 내지 0.338 ㎚ol의 EGF를 500 ㎕ 첨가하여 4 ℃에서 약 2 분간 진탕하고, 800 pmol 내지 0.16 μmol의 가수분해 키토산을 250 ㎕ 첨가한 후 상온에서 4 시간 반응시킨다. 그 후, 이 용액에 0.13 M 글리신 용액 100 ㎕를 첨가한 후 90분간 더 진탕한다. 90 분 후 투석 막 컷-오프 12,000을 사용하여 하루 동안 4 ℃에서 투석하여, EGF-키토산 복합체를 얻는다.

상기 방법에 따라 제조된 EGF-키토산 복합체의 수율은 60.84∼73.5%로서, CDAP 가교제를 사용한 EGF-덱스트란 복합체의 보고된 수율 30∼40% 보다 훨씬 높았으나, 이러한 수율은 EGF의 양에 비례하여 증가하지는 않는 것으로 나타났다. EGF-키토산 복합체는 또한 DME-배지(무혈청)에서 세포독성을 시험한 결과, 독성이 없는 것으로 나타났다. 또한 3 일 경과 후에도 순수 EGF 보다 높은 세포성장 지속효과를 나타내어 활성 반감기가 증가되었음을 알 수 있었고, 순수 EGF 보다 안정성도 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 랫트의 절상 부위에 EGF-키토산 복합체를 처리하여 14 일에 걸쳐 관찰한 결과, 순수 EGF 양의 50%에 불과한 양으로 제조된 EGF-키토산 복합체를 처리한 부위에서 3 일과 7 일째에 순수 EGF를 처리한 부위와 동일한 수준의 상처 치유 효과를 거두었다. 따라서 EGF-키토산 복합체를 상처 치유제로 사용하면 순수 EGF를 사용하는 경우에 비해 최소 4 배에 달하는 높은 경제적 이익을 가져다 줄 것으로 사료되었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이지, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: EDC 축합시약을 이용한 EGF-키토산 복합체의 제조

2%(w/w)의 키토산 아세트산 용액을 제조하고, NaOH 수용액을 사용하여 중화 적정하였다. pH 7.0 부근에서 백색 침전이 더 이상 생성되지 않을 때까지 상온에서 방치하였다. 그 후 침전물을 증류수, 에탄올, 에테르 순으로 세척하고 건조하여 정제하였다. 정제된 키토산 분말을 2% 아세트산 수용액에 상온에서 약 12 시간 동안 용해시켜 키토산 용액을 제조하였다. 여기에 Conc. HCl을 첨가하여 50 ℃에서 약 30분 동안 반응을 전개하였다. 30 분 후, 가수분해액의 1 부피의 증류수를 첨가하여 미반응물의 침전을 유도하였다. 침전물을 제거한 가수분해액에 1 부피의 메탄올을 첨가하여 침전물을 얻었다. 침전물을 다시 증류수에 용해시켜 YM10(투석 막컷-오프 10 kDa)과 YM3(투석 막 컷-오프 3 kDa) 막을 이용하여 한외여과를 수행하였다. 상기 반응을 통하여 최종적으로 얻어진 키토산 분획의 분자량은 23 kDa과 10 kDa이었다.

상기 공정으로 얻어진 저분자량(1,0535 Da) 키토산을 EDC와 함께 EGF 첨가 몰수의 각각 50 배 및 10 배 과량으로 첨가하였다. 즉, 6.76 ㎚ol/㎖의 EDC 용액 250 ㎕를 반응기에 첨가하였다. 여기에 2000 ng/㎖의 EGF(Human recombinant, Sigma) 용액을 4 ℃에서 500 ㎕ 첨가하였다. 약 120 초 동안 진탕한 후, 0.16 μmol/㎖의 가수분해 키토산(10,535 Da) 용액 250 ㎕를 첨가한 후, 상온에서 4 시간 반응시켰다. 그 후 이 용액에 0.13 M 글리신 용액 100 ㎕를 첨가한 후, 90 분 더 진탕하였다. 90 분 후 투석 막 컷-오프 12,000을 사용하여 하루 동안 4 ℃에서 투석하여 EGF-키토산 복합체를 얻었다.

실시예 2: ELISA 방법에 의한 EGF-키토산 복합체의 검출

실시예 1과 같은 방법으로 얻은 EGF-키토산 복합체의 수율을 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 구체적으로, EGF-키토산 복합체 및 순수 EGF를 96-웰 플레이트에 부착시키고, 그 위에 EGF에 대한 모노클로날 항체(Sigma, anti-monoclonal Human EGF) 첨가하였다. 이어서 2차 항체인 항-마우스 IgG를 첨가한 후, 기질인 pNPP(para-nitrophenyl phosphate)를 2차 항체와 반응시켜 발색 정도에 따라 EGF-키토산 복합체의 양을 측정하였다.

순수 EGF에 대한 농도별 ELISA 결과와 EGF-키토산 복합체의 ELISA 결과를 도 1과 2에 각각 나타내고[EC: EGF-키토산 복합체; 복합체 제조 과정에서 첨가된 순수 EGF 양: 10 ng(EC10), 1,000 ng(EC1000), 2,000 ng(EC2000)], EGF의 농도에 따른 포접반응의 효율(%)을 도 3에 나타내었다. 또한, EGF 복합체가 실제로 형성되었는지 여부를 증명하기 위하여 EGF 복합체 제조과정에서 예상되는 음성 또는 양성 대조군의 ELISA 결과를 도 4에 나타내었다. 도 2 및 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, EGF-키토산 복합체(Pro5로 표기)의 수율은 60.84∼73.5%로서, CDAP 가교제를 사용한 EGF-덱스트란 복합체의 보고된 수율 30∼40% 보다 훨씬 높게 나타났다. 또한, 도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 가교제를 사용하여 제조된 EGF 복합체는 투석과정에서 소실되지 않지만 가교제를 사용하지 않고 제조된 EGF-키토산 혼합물의 EGF는 투석과정에서 소실되는 것으로 나타났다. 따라서 도 4의 결과를 도 2 및 3의 결과와 관련지어 볼 때, EGF 복합체가 실제 형성된 것으로 결론내릴 수 있었으며, 도 2 및 3의 결과가 신뢰할 수 있는 것으로 판단되었다. 그러나 EGF의 양에 비례하여 발색정도가 증가하지는 않는 것으로 나타났다.

실시예 3: EGF-키토산 복합체의 세포독성 시험

EGF-키토산 복합체의 세포독성을 평가하기 위하여, 1∼4 ㎍/㎖ 농도 범위의 EGF-키토산 복합체 20 ㎕를 DME 배지(무혈청) 중에 1×10⁴ 세포/웰 농도의 인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 함유하는 96-웰 플레이트에 첨가하여, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이에 의해 세포독성을 12 시간, 2 일 및 3 일에 걸쳐 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, EGF-키토산 복합체는 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.

실시예 4: EGF-키토산 복합체의 활성 반감기 및 안정성 평가

EGF-키토산 복합체의 세포성장 지속효과를 아래와 같은 방법으로 측정하였다.

섬유아세포를 96 웰 플레이트에 1.0×10⁴ 세포/웰의 농도로 분주하였다. 세포의 부착을 위하여 최소 4 시간 이상 최적 환경에서 배양하였다. 4 시간 후 EGF-키토산 복합체 10 ng/㎖, 1000 ng/㎖ 및 2000 ng/㎖을 각각 포함하는 용액 20 ㎕를 DMEM 배지 180 ㎕와 함께 혼합하여 96 웰에 새롭게 넣어주었다.

그 결과를 도 6에 나타내었다(E10: EGF 10 ng/㎖; E1000: EGF 1000 ng/㎖; E2000: EGF 2000 ng/㎖; EC10: EGF-키토산 복합체 10 ng/㎖; EC1000: EGF-키토산 복합체 1000 ng/㎖; EC2000: EGF-키토산 복합체 2000 ng/㎖). 도 6에 나타낸 바와 같이, 2000 ng/㎖ 농도의 EGF-키토산 복합체가 24 시간 후에도 지속적인 성장효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 이것은 순수 EGF 2000 ng/㎖의 세포성장 지속효과 보다 훨씬 높은 것이다. 이로부터 EGF-키토산 복합체의 EGF가 생체 내에서 활성 반감기가 연장되었음을 알 수 있었다.

또한, EGF-키토산 복합체와 순수 EGF를 37 ℃에서 트립신 처리하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 순수 EGF는 초기 활성의 30% 이하로 급격히 감소한 반면, EGF-키토산 복합체(EGF-LMC로 표기)는 초기 활성의 80%까지 유지되는 것으로 확인되었다. 이로부터 EGF-키토산 복합체의 EGF가 순수 EGF 보다 단백질 분해효소에 대하여 높은 보호(protection) 효과를 갖는 것으로 판단되었다.

실시예 5: EGF-키토산 복합체의 상처 치유 효과 측정

RD 랫트의 등 부위에 4 개의 절상을 입히고 여기에 EGF-키토산 복합체 100 ng을 함유시켜 상처 드레싱하였다. 그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다(도 8a: 음성 대조군(무처리); 도 8b: 양성 대조군(200 ng의 EGF 처리); 도 8c: 시험군(100 ng의 EGF-키토산 복합체 처리; 도 9: A: 무처리; B: 수용성 키토산 처리; C: 200 ng의 EGF 처리; D:100 ng의 EGF-키토산 복합체 처리). 도 8 및 9로부터 알 수 있는 바와 같이, EGF-키토산 복합체로 처리한 경우 7 일째 이후 95% 이상의 상처 치유 효과를 나타내었으며, 이러한 결과는 순수 EGF 200 ng을 처리하여 얻은 상처 치유 효과와 매우 유사하였다. 따라서 EGF를 가수분해 키토산과 결합시킨 EGF-키토산 복합체는 순수 EGF 보다 약 2 배 높은 상처치유효과를 갖는 것으로 판단되었다.

본 발명에 따른 상피세포성장인자-키토산 복합체는 높은 수율로 얻어질 뿐 아니라 활성 반감기와 안정성이 우수하고 세포 무독성이며 절상 등에 대해 순수 EGF 보다 효율적인 상처치유를 가능하게 하므로, 매우 고가인 순수 EGF를 사용하는 경우에 비해 매우 큰 경제적 이익을 가져다준다.

도 1은 ELISA 분석법에 의해 측정된 405 ㎚에서의 순수 EGF의 농도별 흡광도 표준곡선 그래프이고;

도 2는 ELISA 분석법에 의해 측정된 405 ㎚에서의 EGF 복합체의 샘플별 흡광도 히스토그램이며;

도 3은 EGF-키토산 복합체를 형성하는 포접반응의 효율을 보여주는 그래프 이고;

도 4는 EGF 복합체의 형성을 보여주기 위한 음성 또는 양성 대조군의 흡광도 히스토그램이며;

도 5는 EGF-키토산 복합체의 세포독성 실험 결과를 보여주는 그래프이고;

도 6은 EGF 및 EGF-키토산 복합체의 세포성장 자극 효과를 보여주는 그래프이며;

도 7는 EGF 및 EGF-키토산 복합체의 트립신에 의한 단백질가수분해(proteolytic degradation)에 대한 안정성 측정결과를 보여주는 그래프이고;

도 8a 내지 8c 및 도 9은 EGF 및 EGF-키토산 복합체의 절상 부위에서의 상처 치유 효과를 보여주는 사진이다.

Claims

상피세포성장인자(EGF: Epidermal Growth Factor)의 아미노산 중 산성 아미노산에 존재하는 작용기인 카복시기와 키토산에 존재하는 아미노기를 화학 결합시켜 제조되는, 상피세포성장인자와 키토산이 화학적으로 포접된 상피세포성장인자-키토산 복합체.
제1항에 있어서, 키토산이 10 내지 25 kDa의 분자량을 갖는 것인 복합체.
제1항에 있어서, 수용성 카보디이미드(carbodiimide)를 사용하여 EGF의 카복시기와 키토산의 아미노기를 화학 결합시키는 복합체.
제3항에 있어서, 수용성 카보디이미드가 EDC(1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide)인 복합체.
제1항에 있어서, 상처 드레싱에 함유시켜 사용하는 복합체.
ⅰ) 키토산을 가수분해하여 분자량 10 내지 25 kDa의 키토산 분획을 제조하고,

ⅱ) ⅰ)에서 얻은 키토산을 수용성 카보디이미드 존재 하에 EGF와 반응시키고,

ⅲ) ⅱ)에서 얻은 EGF-키토산 복합체를 분리하는 단계

를 포함하여, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 제조하는 방법.