JP2001521386A

JP2001521386A - 被修飾ＴＮＦα分子、このような被修飾ＴＮＦα分子をコードするＤＮＡ、並びにこのような被修飾ＴＮＦα分子及びＤＮＡを具備するワクチン

Info

Publication number: JP2001521386A
Application number: JP54338798A
Authority: JP
Inventors: ジェンセン、マーティン・ローランド; モーリトセン、ソレン; エルスナー、ヘンリック; ダルム、イベン
Original assignee: ファーマシューティスク・ラボラトリウム・フェリング・エー／エス
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2001-11-06
Also published as: NO995002L; TR199902562T2; SK140999A3; CN1252809A; HRP980203A2; EP0975668A1; KR100522289B1; ZA983148B; US7118750B1; TW510921B; KR20010006416A; SK285639B6; AR012427A1; CN1178955C; EE9900461A; HUP0001930A2; AU743400B2; PL194221B1; DE69834556T2; NZ337955A

Abstract

(57)【要約】ヒト宿主に投与した後に、野生型ヒトTNFαに対する中和抗体を生じせしめ得る被修飾ヒトTNFα分子であって、ヒトTNFα分子の少なくとも一つのペプチド断片が、主要Ｔ細胞エピトープを含有することが知られている少なくとも一つのペプチド、又は主要エピトープを含有する前記分子の末端切断型、及び少なくとも一つのTNFαＢ細胞エピトープを含むヒトTNFα分子の一方又は双方の隣接領域によって置換されており、該置換によって、フロントβシートの何れか一つのストランドのアミノ酸配列中、接続ループの何れか一つ、及び／又はバックβシートのB'、I、又はＤストランドの何れか一つに実質的な変化が導入されている被修飾ヒトTNFα分子。被修飾ヒトTNFα分子又はそれらをコードするDNAは、必要に応じて薬学的許容されるアジュバントとともに、リューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、癌、散在性硬化症、糖尿病、乾癬、骨粗鬆症、又は喘息のような慢性炎症性疾患を予防又は治療するための抗TNFαワクチンとして処方し得る。被修飾TNFαを含有する組成物に接触させることによって、ヒトの体液にTNFαが存在するかどうかをテストし得る。

Description

【発明の詳細な説明】被修飾TNFα分子、このような被修飾TNFα分子をコードするDNA、並びにこのような被修飾TNFα分子及びDNAを具備するワクチン発明の分野本発明は、被修飾TNFα分子をヒト宿主に投与した後に、野生型ヒトTNFαに対する中和抗体を生じさせ得るように修飾されたヒトサイトカイン腫瘍壊死因子α (TNFα)に関する。本発明は、前記被修飾TNFα分子をベースとするヒトTNFαワクチンにも関する。本発明のさらなる側面は、以下の論述から明らかになるであろう。発明の背景生理学的には、脊椎動物の免疫システムは、微生物等のような感染性の物体による身体への侵害に対する防御機構として機能している。外来タンパク質は、高度に特異的な循環している抗体により、網内皮系を介して、効率的に除去され、ウイルスや細菌は、抗体、細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)、ナチュラルキラー細胞( NK)、補体等を含む一連の複雑な細胞性及び液性機構により攻撃される。この戦闘のリーダーは、抗原提示細胞(APC；antigen presenting cells)と協働して、複雑なサイトカインのネットワークを介して免疫防御を制御するヘルパーT(T_H) リンパ球である。 T_Hリンパ球は、APCの表面に提示されたタンパク質抗原を認識する。しかしながら、それらはそのままの状態の抗原それ自体は認識せず、二つの成分（「ブロセッシングされた」(断片化された)タンパク質抗原（所謂Ｔ細胞エピトープ）及び主要組織適合遺伝子複合体クラスII分子(O.Werdelin et al.,Imm.Rev.106,181 (1988)）からなる複合リガンドを認識するようである。この認識によって、T_Hリンパ球が特異的にＢリンパ球を補助し、完全な状態のタンパク質中にある抗原に対する特異的抗体を最終的に産生せしめることが可能となる（Werdelin et al. ，上記）。あるＴ細胞は、ある種の抗原−MHCの組み合わせしか認識せず、別のM HC対立遺伝子の遺伝子産物によって提示された同じ又は別の抗原は認識しないであろう。この現象は、MHC拘束と呼ばれている。自己タンパク質の断片もAPCによって提示されるが、このような断片は、通常ヘルパーＴリンパ球に無視されるか、又は認識されない。これが、一般に、個体の血清中に自己抗体が存在するために、最終的にその個体自身のタンパク質(所謂、自己又は自身タンパク質(self-or autoprotein))への攻撃が起こることがない主たる理由である。しかしながら、この過程が誤って進行する珍しいケースでは、個体自身の成分が免疫系の標的となり、自己免疫疾患を生じせしめることがある。疾病の徴候を引き起こす状態においては、幾つかの自己タンパク質が、上昇したレベルで存在することは望ましくない。このため、腫瘍壊死因子α(TNFα)は、癌患者及び他の慢性疾患に罹患した患者に悪液質を引き起こし得ることが知られている(H.N.Langstein et al.Cancer Res．51,2302-2306,1991)。TNFαは、炎症性のプロセスにも重要な役割を果たしているため(W.P.Arend et al.Arthritis Rheum.33,305-315,1990)、モノクローナル抗体の使用によるTNFαの中和は、リウマチ性関節炎のような慢性炎症性疾患の患者に有用であることが実証されている(Elliott et al.,Lancet 1994,344:1105-10 and Crohn's disease,van Dullem en et al.,Gastroenterology 109(1):129-135(1995))。それ故、このようなTNF αタンパク質に対する中和抗体を誘導する方法が必要であり、本発明は、このような特性を与えるTNFαに対するワクチンを包含する。腫瘍壊死因子１．一般的なバックグラウンド腫瘍壊死因子(TNF)は、インターフェロン及びインターロイキンも含まれる制御タンパク質のサイトカインファミリーのメンバーである（Walsh，G．and Head on,D.E.,Protein Biotechnology,1994,John Wiley & Sons Ltd.England,p．257- 267参照）。現在では、それぞれTNFα及びTNFβという二つの型のTNFが認められている。両タンパク質とも同一の受容体に結合し、広く類似した生物学的反応を生じせしめるが、これらは別個の分子であり、30％未満の相同性を有している。腫瘍壊死因子と名付けられ、TNFと呼称された最初のタンパク質は、より適切にT NFαと名付けられ、カケクチンとしても知られている。TNF βは、リンホトキシンとも称されている。 TNFαは、極めて様々なタイプの細胞、特に活性化されたマクロファージ、単球、ある種のＴリンパ球、及びNK細胞によって産生され、さらに脳及び肝臓の細胞によっても産生される。最も強力な既知のTNFα合成誘導物質は、リポ多糖(LP S,lipopolysaccharide)という名称の複雑な生物分子である。これは、脂肪成分と多糖成分を併せ持っており、エンドトキシンとも称されている。リポ多糖自身は、抗腫瘍活性を全く欠如している。リポ多糖を投与した動物の血清は、癌細胞に対して毒性のある因子を含有していることが見出され、リポ多糖に応答して特異的な細胞によって産生されるこの因子は、腫瘍壊死因子と名付けられた。幾つかのウイルス、真菌、及び寄生虫のような他の様々な因子も、このサイトカインの合成及び放出を刺激する。さらに、TNFαは、自己分泌的に作用して、自分自身の産生を刺激することもある。ネイティブのヒトTNFαはホモ三量体であり、以下でさらに説明されているように、三回対称軸の周囲に、強固に会合した３つの同じポリペプチドサブユニットからなる。この配置は、多くのウイルスのキャプシドタンパク質中に存在するタンパク質サブユニットの集合に類似する。ヒトTNFαの各ポリペプチドサブユニットは、グリコシル化されておらず、157個のアミノ酸からなる。該分子は、17300Daの分子量を有し、単一の鎖内ジスルフィド結合を含有する。ヒトTNFαは、まず233アミノ酸の前駆体分子として合成される。シグナル配列を含む-76〜-1のプレ配列がタンパク質分解によって切断されると、ネイティブTNFαが放出される。TNFα は、26000Daの膜結合型としても存在し得る。３つのTNFαモノマーサブユニットは、非共有結合により会合して、以下でさらに説明するトリマーを形成する。 TNFαは、応答性のある細胞の表面上に存在する特異的な受容体に結合することによって、その生物的効果を引き起こす。二つの異なるTNFα受容体が同定されている。第一の受容体(TNF-R55)は、55000Daの分子量を有しているのに対して、第二の受容体(TNF-R75)は、約75000Daの分子量を有している。これら二つの異なる受容体タイプは、25％の配列相同性しか示さない。TNF-R55は、広範な細胞上に存在しているのに対して、TNF-R75受容体の分布は、より限局している。何れも細胞外結合ドメイン（疎水性膜貫通ドメインと細胞内エフェクタードメイン）を有する膜貫通糖タンパク質である。 TNFαがその生物学的効果を引き起こす正確な分子機序は、未だ決定されていない。TNFαがその受容体に結合すると、アデニレートサイクレース、ホスホリパーセＡ、及びプロテインキナーゼの活性化に加えて、Ｇタンパク質を介した様々な現象を引き起こすようである。TNFαによって引き起こされる正確な生物学的作用は、細胞のタイプ毎に変化し得る。別のサイトカインの存在のように、他の因子は、感受性細胞に対するTNFαの作用として観察された分子的効果をさらに調節する。 TNFα遺伝子は、クローニングされて、様々な組換え発現系（細菌と真核細胞の両者）に挿入されている。得られた大量の生物学的に活性な精製TNFαの利用によって、多くの疾患、とりわけ癌の臨床評価が容易になった。しかしながら、 TNFαのみ、又はインターフェロンと組み合わせた多くのこのような試験は、極めて不満足な結果であった。致死的ではないとしても、その有害な副作用のために、大量のTNFαを患者に投与することはできない。上述のように、不適切に上昇したレベルのTNFαの産生が長引くと、悪液質、しばしば慢性の寄生虫感染又は他の感染を伴うるいそう症候群が進行することも示されている。TNFαは、ある種の腫瘍の転移及び増殖並びに貧血の惹起にも関与している。さらに、TNFαは、モノクローナル抗TNFα抗体の投与が有益であることが示されているリューマチ性関節炎及びクローン病を含む、ある種のヒトの慢性炎症性疾患の進行にも直接関与している。TNFαは、骨粗鬆症及び乾癬にも関与している。さらに、動物モデルでは、抗TNFα抗体の投与は、グラフトされた組織又は移植された組織の拒絶を減少又は防止し得る。２．TNFαの構造 I. 序論ヒト腫瘍壊死因子(TNFα)の三次元構造は、解明されている("Tumor Necrosis Factors,Structure,Function,and Mechanism of Action"、edited by Bharat B. Aggarwal and Jan Vilcek，1992 Marcel Dekker，Ind.，New York，Chapter 5， “Crystal structure of TNFα”,by Jones,E.Y.Stuart,D.I.and Walker N.P.C. 参照）。TNFαの生物学的な作用は、その受容体との相互作用に依存する。これらの相互作用は、正しく折り畳まれた三次構造の正確な配置によって支配されている。このため、TNFα分子が、アミノ酸相互作用のレベルでその生物学的機能を発現する方法を理解するためには、アミノ酸配列のみならず、三次元構造をも知らなければならない。II. 三次元構造生物学的に活性なTNFαは、分析的超遠心、小角ｘ線散乱、及びゲル電気泳動によって、溶液中ではトリマーコンフォメーションであることが示されており、クロスリンキング研究により、これが該タンパク質の活性な形態であることが示されている（Smith and Baglioni,1987,J.Biol.Chemistry 252,6951-6954）。結合アッセイによって、トリマーが、モノマーに比べて少なくとも８倍を超える活性を有することが示された。実験的な証拠は、天然のTNFαと組換えTNFαともに、生理的な条件下では、主にトリマーとして存在することを示している。円二色性スペクトル分析により、TNFαはオールシートクラスのタンパク質に分類された(Davis et al.,Biochemistry 1987,26，1322-1326は、スルフヒドリル滴定、ゲル濾過、及び円二色性による精製組換えTNFαの構造分析の結果を報告している)。ヒトの組換えTNFαには、幾つかの異なる結晶型が報告されている。報告された結晶型は全て、結晶学及び／又は非結晶学的な三重対称を示し、TNFαが結晶中でトリマーとして存在していることを示唆している。TNFαトリマーは、直径100Åの溶媒チャネルが貫通した緩くパッキングされたアレーとして存在する。分子表面の僅かな部分のみが、結晶のパッキング接触に関与している。このような接触は、2〜3の側鎖、おそらくは、元来柔軟性のある主鎖の短い部分をも、それらの好ましい溶液コンフォメーションから若干擾乱させ得るものと思われる。A.TNF αモノマーの主鎖のホールディング TNFαトリマーの単一157アミノ酸サブユニットの全形は、高さが約55Å、最大幅がベース近傍の35Åである楔状である。主鎖のトポロジーは、図1a〜cに示されている。それは、実質的には、二つの半平行βプリーツシートによって形成されたβサンドイッチ構造である。主鎖のフォールディングは、古典的なゼリーロールモチーフをとっている（図1c）（ウイルスのキャプシドタンパク質と共通）。二次構造ユニットのラベルに対して図１で採用した命名法は、ウイルス構造について確立された慣習に従っている。標準的な８つのβストランド(B〜I)は全て存在しているが、各βプリーツシート（バックβシートはβストランドB',B I,Ｄ及びＧを含み、フロントシートはβストランドC',C,H,Ｅ及びＦを含んでいる）が５つの反平行βストランドを含有するように、βシートと末端部分（ＣのＮ末端側の半分）の両端に短いストランドを加えるＢとＣのに位置する挿入部分を有している。Ｎ末端は極めて柔軟性がある。この領域は、10残基に関する限り（図1b参照）、むしろ分子の他の部分とは独立しており、最初の2〜3個の残基は、溶媒中で様々なコンフォメーションをとることができる。これに対して、Ｃ末端は、バック βシートの基底部に埋没し、比較的フラットなこの二次構造ユニットの内在部分を形成している。βストランド長の差及びβストランドＢとＣの間に存在する挿入は、ほぼ完全にループが形成されたフロント表面を作り出し、トリマー中で、溶媒に提示されるのは、βサンドイッチのこの「マスクされた」側である。結晶学的なデータは、該構造の様々な部分の相対的柔軟性の測定を与える。βストランドは、かなり柔軟でない足場を形成する。特に、バックβシートは、トリマーのコアに位置し、従って特に堅固である。予想されたように、高レベルの柔軟性／移動性を示す、該分子の外側にある溶媒接近可能表面を修飾するのはループである。総体として、コアが分子の上半分の中により緩くパックされると、全体的な堅固さが減少する。B.TNF αトリマーの一般的トポロジー３つのTNFαモノマーサブユニットは、非共有結合によって会合し、約55Åの長さと50Åの最大幅を有するコンパクトな円錐形のトリマーを形成する。３つの各βサンドイッチのβストランドは、該トリマーの三回対称軸と略平行に（傾きは約30°）配置されている。三回対称軸によって関連するサブユニット間の相互作用は、βサンドイッチの単純なエッジ−フェースパッキングを介する。一つのサブユニットのストランドＦとＧからなるβストランドのエッジは、三者関連したサブユニットのバックβシートを横切るように存在する（図２参照）。カルボキシル末端は、三回対称軸の近くに存在する。エッジ−フェースのパッキング様式は、サブユニット間に極めて強い会合を生じせしめる。このため、トリマーのコアは、完全に溶媒には接近できない。C. アミノ酸タイプの分布 TNFαの三次元構造中に存在する残基タイプの全体的な分布は、タンパク質に対する一般的なルールと同様である。すなわち、疎水性残基クラスターは分子のコア内に存在しているのに対して、電荷を有する残基は表面を修飾する。このため、TNFαサンドイッチのコアには、予想どおり、緊密に挿入された大きな非極性残基が充填している。該システムのエネルギー論は、モノマー状態のTNFαの存在を好まない。相補的な残基によって構成される大きな界面領域（例えば、極性残基と対合した極性残基）の場合、溶媒が接近可能な領域がなくなれば、オリゴマー（すなわちトリマー）を形成することがエネルギー的に相当有利になる。通常はトリマーの界面より下の部分に埋没されている強い疎水性残基の巨大な領域が溶媒と接触することも、TNFαモノマーは不安定化させるように作用する。3. 構造−機能の探索 A.TNF α／抗体相互作用配列の同一性が80％を超え、TNFαは別の種のTNFα受容体に結合し得るにもかかわらず、ある種（例えばヒト）のTNFαに対する抗体は、別の種（例えばマウス）のTNFαと交叉反応しない。配列の可変性の程度を三次元構造上にマッピングすれば、該分子の中で最も配列が変動する領域が、抗体の接近が可能な表面ループに対応することが即座に明らかとなろう。サンドイッチ内部又はトリマーの界面に位置する残基が高度に保存された領域は、抗体からは効果的に隠れされている。このため、抗TNFα抗体に対するエピトープは、種間で異なる幾つかの残基を常に含有しており、そのために抗体が結合できなくなるのであろう。このことは、TNFαとその受容体との相互作用の特徴が、抗体のTNFαへの結合に必要な特徴と幾分違っているはずであるということを示唆している。B. 位置指定突然変異誘発生物(細胞毒性)活性及び受容体の結合に関する、TNFα分子の様々な特定の残基及び領域の役割は、位置指定突然変異誘発（Jones et al.,op.cit.p.113-119 ）の手法を用いて、それらの残基を別のアミノ酸に置換し、又は配列の一部を欠失させることによって探索された。生物活性に何ら有害な影響を与えずに、Ｎ末端からは８個までの残基を欠失できたことは、この領域が分子全体の安定性に不可欠な性質を有していないことを強調するものである。Ｎ末端の残基は、TNFαトリマーの生物学的効力に対して間接的で、二次的な効果を発揮していると思われる。通常は高度に保存され、βサンドイッチの緊密にパックされたコアを形成している残基を非保存的に置換すれば、構造が破壊されて、TNFαの生物活性が喪失する(Yamagishi et al.,Protein Engineering,Vol.3,No.8,p.713-719(1989))。このような変異タンパク質(mutated protein；mutein)の多くは、正しくフォールディングされた安定な分子を形成することができない。三回対称軸の底部にある疎水性領域内部には、幾つかの保存的な置換を行うことが可能であるが、トリマーのトップ付近にあるより緩くパックされた領域には、ずっと大きな余裕が存在するようである。特に、緩くパックされた分子のトップにある繋がった２つのループの間にジスルフィド架橋を形成するCys69とCys101は、比較的変化に対して影響を受けない（図1a参照）。しかしながら、一般的には、TNFαの生物活性を保持するためには、TNFαの中央軸近傍の変異は、高度に保存的で、TNFαの全体的な形状を保持すRUものでなければならない。分子の表面上に存在する残基は、このカテゴリ-中の残基の変動が種の間に広がっていることから明らかなように、有害な構造的不利益を招来させずに、突然変異させ得る自由度が相当大きい。このため、この領域中の置換によって、TNF αの生物活性がドラスティックに減少するということは、TNFαトリマーがその受容体と機能的な相互作用をする上で、このような残基が直接関与していることを示している。バックβシートのＢ及びB'ストランドの間の接続ルーPU中に位置するArg31、Arg32、及びAla33、フロントβシートのＥ及びＦストランドの間の接続ループ中に位置するSer86及びTyr87、並びにフロントβシートのＨストランドとバックβシートのＩストランドの間の接続ループ中に位置するGlu146を含む残基は、このようなアミノ酸残基であるように思われる（図３参照）。それらは、TNFαモノマーのフロント側とバック側に存在する２つの別個の「ホットスポット」領域に分かれるようである。構造的なカテゴリーとは無関係な、全ての有害変異の分布は、この予測をさらに確固たるものにする。変異に対する生物的機能の感受性を与える「ホットスポット」の存在は、「Yamagishi et al.,op.cit. ,and Goh et al.Protein Engineering,Vol.4,No.4,p.385-389(1991)」に概説されている。ヒトTNFαポリペプチドの変異に関する研究は、数多くの特許出願で報告されている。この点、ヤマギシら(EP 251 037)は、可溶性であり、インビトロ及び／又はインビボで、ヒトTNFαに特徴的な細胞障害活性及び抗腫瘍活性を有する多数の位置指定突然変異TNFα分子を開示している。 TNFα活性を有する他の変異タンパク質は、WO 90/07579に記載されている。ヒトp55-TNF受容体よりも、ヒトp75-TNF受容体に対して高い結合親和性を有する変異タンパク質が、EP.A-619372に記載されている。これらの文献（参照文献として本明細書に取り込まれる）は何れも、TNFαの生物活性を喪失せしめ、且つ野生型ヒトTNFαに対する抗体を誘導する能力を与えるためのTNFα分子の修飾は開示していない。しかしながら、それらは、TNFα及びその生物的効果に関する有益なバックグラウンドとなる情報を与えてくれる。受容体結合アッセイとともに、TNFα類縁体の製造及び発現、それらの調合も開示されている。４．総括現在、TNFαの具体的な構造活性相関に関して、多くの様々なデータがもたらされているようである。利用可能な全ての証拠は、安定な天然のユニットとしてトリマーの重要性を指摘している。トリマー中でサブユニットが隣接していることからすれば、TNFαモノマーの異なる側に位置する２つのホットスポット領域は、互いに近接しているものと思われる。このため、残基31〜35、84〜87、及び 143〜148からなる機能的に重要な領域は、二つのサブユニット間の界面にあり、トリマーの下半分に位置すると思われる。ヤマギシら（前掲）は、Asp143をTyr に変異させると受容体の結合と細胞毒性がなくなることを報告しており、ツジモトら(Tsujimoto et al.)、J.Biochem.101,p.919-925(1987)は、Arg31とArg32をA snとThrに変異した場合にも同様の効果を報告している。このように、該部位は、受容体結合と細胞毒性に直接関与しているかもしれない。TNFαの受容体結合領域が、２つのサブユニット間の界面に存在していると思われることは興味深い。要約すれば、TNFαの詳細な三次元構造は、抗体結合、オリゴマー化、及び位置指定突然変異誘発に関する広範な観察を説明するのに役立つ。最近の多数の位置指定変異体と構造を組み合わせて考えれば、受容体結合に関して生物学的に重要な領域が、サブユニット中のトリマーの下半分に当たる部分に存在するように思われる。従来技術の記載 WO 95/05849で、本発明者のうちの幾人かが、未修飾の自己タンパク質に対する抗体の応答を誘導するための自己タンパク質の修飾法であって、自己タンパク質類縁体が、分子生物学的手段によって提供される自己タンパク質の修飾法を開示している。より具体的には、自己タンパク質の一以上のペプチド断片が、主要外来Ｔ細胞エピトープ(immunodominant foreign T cell epitope)を含有する一以上のペプチド断片と置換されている。 WO 95/05849を導いた該発明の以前には、Ｔ細胞エピトープを含むキャリアータンパク質に、自己タンパク質を含むペプチド又はタンパク質をコンジュゲートさせることが知られていた。WO 92/19746は、LHRH配列、一以上のＴ細胞エピトープ、及び精製部位を含み、動物用の免疫去勢ワクチン(animal immunocast ration vaccine)に有用な組換えポリペプチドを開示している。 WO 95/05849には、少なくとも４つのアミノ酸を含む元のタンパク質の隣接領域が、挿入されたエピトープの何れかの側で保存されるように、主要Ｔ細胞エピトープを挿入することが好ましいと述べられている。換言すれば、該エピトープは、融合タンパク質として自己タンパク質にコンジュゲートさせるべきではない。好ましくは、該置換は、実質的に元のタンパク質の三次構造を保存するように行うべきである。これ以外には、未修飾の自己タンパク質に対して最も強力な抗体応答を作り出すために、挿入したエピトープの分子内での最適な位置については、何ら具体的な教示がなされていない。おそらく、これは自己タンパク質毎に変わるであろうが、該明細書の一般的な教示に基けば、適切な主要エピトープを含むペプチドを選択し、自己タンパク質分子の様々な部分で、ほぼ同じ長さのペプチド配列を交換し、適切なアッセイ手法によって、生じた抗体応答を決定するという過度な実験操作を行わずに、最も適切な位置を決定できるであろう。現在の模型制作ツールを用いることによって、タンパク質中の一以上のペプチド断片を置換が、元のタンパク質の三次構造の変化をもたらすかどうかを予測することは、おそらく極めて困難である。それ故、薬物開発プログラムのリード化合物探索では、開発の初期段階での標準的なスクリーニング操作として、何れの修飾自己タンパク質が元のタンパク質の三次構造を保存しているか評価することを考慮しなければならない。これは、タンパク質の特性決定に関する多くのテキストブックに記載されているような幾つかの実験手法、例えば蛍光顕微鏡、近紫外円二色性、フーリエ変換赤外線分光法、及び多次元ＮＭＲ手法(“Physical Me thods to Characterize Pharmaceutical Proteins”，Pharmaceutical Biotechn ology Vol．7．Eds．J．N．Herron，W．Jiskoot & D.J.A．Crommelin，Plenumn Press,New York(1995))を用いて行い得る。理想的には、三次構造の変化が起こっているか否かを評価するために、リード化合物のスクリーニングプコセスでは、上述した実験手法のうち２以上の手法を組み合わせるべきである。図面の簡単な記載図1(a)は、ネイティブTNFαモノマーの結晶構造を示している。該図は、サブユニットフォールディングの模式図であり、βストランドは、アミノからカルボキシル方向への太い矢印として示され、これを接続しているループは、細い線として図示されている。ジスルフィド架橋は、閃光によって表記されており、高度に柔軟な領域には、陰影が付されている。トリマーの三回対称軸は、この方向に対して垂直であろう。図1(b)は、TNFαモノマー結晶構造のＣα鎖トレーシングである。より明瞭であるが、様式化されたサブユニットフォールディングの表記を用いてアミノ酸配列の正確なアラインメントを得るためには、図1(a)とともに、この詳細な表示を用いるべきである。図1(c)は、TNFαの構造をゼリーロールモチーフとして示している。βストランドＢとＣの間の挿入は、破線で示されている。ＢとＣとの接続は、該分子の一番上を真っ直ぐに走っている。図２は、TNFトリマー中のβサンドイッチのエッジ−フェースパッキングを示している。この図は、ページの中と外に向かって走行するリボンで表されている βストランドを有する密集したトリマーの厚板を、三回対称軸から見下ろした状態で示している。図3(a)は、図3(b)に示されたアミノ酸配列を有する主要壊死因子(TNFα)をコードするDNA配列を示している。 DNA配列は、受付番号M10988、配列番号339737で、Gen Bankから入手し得る。該配列は、「Wang et al.,Science 228,149-154(1985)」に記載されている。該配列には、ヒトTNFαの-76〜-1プレ配列をコードするコドンが含まれている。イントロンを含む完全な遺伝子配列は、「Nedwin et al.,Nucleic Acids,Res. 13(17)63G1-6373(1985)」、「Shirai et al.,Nature 313(6005),803-806(1985) 」、及び「Dennica et al.,Nature 312(5996),724.729(1984)」に記載されている。図3(b)は、-76〜-1プレ配列を含むヒトTNFαのアミノ酸配列を示している。図4(a)は、野生型TNF(WT)α中に存在する主要エピトープP2及びP30の置換による、TNFα類縁体TNF2-1〜2-7、及びTNF30-1〜30-5の形成を図示している。図4(b)は、各TNFα類縁体のWT配列中に存在する置換の正確な位置を示している。図5(a)及び5(b)は、図1(a)をベースにした類縁体の構造を示しており、それぞれ、βシートのストランド中に存在するP2とP30及び接続ループの各置換は、黒でマークされている。図６は、組換えTNFαと比較した、L929アッセイ(Meager,A.,Leung,H.,& Wooll ey，J．Assays for Tumour Necrosis Factor and related cytokines，J.Immuno l.Meth.116，1-17(1989))におけるTNFα類縁体の生物活性を示している。図７は、修飾TNFα分子のウサギへのワクチン接種に対する、ウサギの抗ヒトT NFα抗体応答を示している。図８は、L929細胞アッセイで測定した、P2/P30修飾ヒトTNFα分子が中和抗体を誘導する能力を示している。図９は、受容体アッセイで測定した、ウサギに投与されたP2/P30修飾ヒトTNF α分子が、中和抗体を誘導する能力を示している。図１０は、３つのドナーにおける、TT及びP2とP30ペプチドに対する末梢血単核細胞(PBMC)の応答を示している。図１１は、様々なP2及びP30修飾TNFα分子を用いた、２つのドナーにおけるポリクローナル増殖応答を示している。図１２は、P2及びP30修飾TNFα分子に対して、34実験から算出した増殖指数(P I)を示している。図１３は、それぞれ、P2及びP30特異的反応者におけるP2とP30修飾TNFαタンパク質に対するPBMC応答を示している。図１４は、別の２つのドナーにおける同様のPBMC応答を示している。図１５は、P2及びP30のＴ細胞認識に対する隣接アミノ酸の影響を示している。図１６は、修飾TNFα分子の調製に用いた変異戦略を示している。発明の概要本発明の目的は、生物学的に不活性で、且つ野生型の生物活性なTNFαに対する強力な中和抗体応答を引き起こし得るように、上記WO 95/05849の包括的な範囲に属する、ある自己タンパク質、すなわちヒトTNFαをどのように修飾すべきかについて指針を与えることである。本明細書で、「生物学的に不活性な(inact ive)」とは、野生型TNFαの活性、主として細胞傷害活性をいうものとする。上述したTNFα三次構造の論述から生物学的に活性なTNFαは、３つのサブユニットからなるトリマーであることが想起されるであろう。「エッジ−フェース」パッキングのために、「バックβシート」とは、溶媒が完全に接近できないサブユニット間の「隠れた」接触領域を指す。この領域を相当置換すれば、殆ど常に、TN Fα分子から全ての生物活性が奪われてしまうであろう。これに対して、「フロントβシート」と接続領域は、TNFα受容体と相互作用する領域を含む接近可能な表面領域を与える。それ故、これらの領域に対する抗体は、おそらく受容体結合を妨害することができ、TNFα中和特性を持つことができるであろう。それ故、WO 95/08549に従って、毒性はないが、免疫原性があるTNFα分子を構築したいと思った当業者は、第一の選択として、TNFαモノマーのバックβシート中の主要Ｔ細胞エピトープを挿入することであろう。このように、この領域の修飾は、TNFαの生物活性を喪失せしめ、且つ抗体が自由に相互作用するための受容体−接近可能フロントβシートをそのまま保持する可能性が最も高い。これは、上述したβサンドイッチの緊密にパックされたコアにおける位置指定突然変異誘発の考察とも一致している。しかしながら、驚くべきことにそうではない。以下の試験結果から明らかなように、バックβシートのＢ及びＧストランドを含む置換は、驚くべきことに、抗 TNFα中和抗体を誘導できないTNFα与えたので、結果は正反対であった。このため、本発明は、ヒト宿主に投与した後に、野生型ヒトTNFαに対する中和抗体を生じせしめ得る修飾ヒトTNFα分子であって、ヒトTNFα分子の少なくとも一つのペプチド断片が、主要Ｔ細胞エピトープを含有することが知られている少なくとも一つのペプチド、又は主要エピトープを含有する前記分子の末端切断型、及び少なくとも一つのTNFαＢ細胞エピトープを含むヒトTNFα分子の一方又は双方の隣接領域によって置換されており、該置換によって、フロントβ シートのアミノ酸配列中、接続ループの何れか一つ、及び／又はバックβシートのB'、Ｉ、又はＤストランドの何れか一つに実質的な変化が導入されている修飾ヒトTNFα分子を提供することを目的とする。バックβシートのＢ及びＧストランド中の置換は避けるべきであると思われる。本明細書において、「実質的な変化」とは、各アミノ酸の単なる保存的な置換、及び野生型TNFαの二次構造及び／又は三次構造を変えない点変異を超える変化を意味するものとする。換言すれば、TNFα配列に導入されたＴ細胞エピトープは、野生型TNFα配列と相同性が極めて低い配列を導入することが好ましいはずである。本発明によれば、ヒト宿主に投与した後に、野生型ヒトTNFαに対する中和抗体を生じせしめ得る修飾ヒトTNFα分子であって、ヒトTNFα分子の少なくとも一つのペプチド断片が、主要Ｔ細胞エピトープを含有することが知られている少なくとも一つのペプチド、又は主要エピトープを含有する前記分子の末端切断型、及び少なくとも一つのTNFαＢ細胞エピトープを含むヒトTNFα分子の一方又は双方の隣接領域によって置換されており、前記被修飾TNFα分子が実質的にTNFα活性がない修飾ヒトTNFα分子も提供する。本明細書において、「実質的にTNFα活性がない」とは、このような被修飾TNF α分子をヒトに投与したときに、ネイティブTNFαによって発現される公知のサイトカイン効果による極めて有害な効果をもたらさないことを意味するものとする。換言すれば、本発明の修飾TNFαは、薬学的に許容される物質である。本発明の修飾ヒトTNFα分子に実質的なTNFα活性がないかどうかをテストすろためには、本明細書で上述したL929バイオアッセイを使用し得る。さらに、修飾 TNFα分子の免疫原性を確認するために、適切な宿主中で修飾TNFα分子に対して産生された抗本は、本明細書で上述したL929バイオアッセイにおける野生型TNF αの活性を著しく阻害するか、及び／又は前記抗体は、55kD TNFα受容体１(TNF α-R55)又は75kD TNFα受容体(TNFα-R75)への野生型TNF αの結合を著しく阻害する。これらの適切な宿主は、例えば、アカゲザル及びサイノミュレウス(Cyno-mule us)、ラット若しくはマウス、モルモットのようなげっ歯類、ウサギのようなウサギ目であり得る。本発明の修飾分子の能力を評価するのに適したアッセイは、アッセイ条件に応じた濃度の抗体又は抗血清を用いて実施しなければならず、反応物に関しては生理的な条件を反映しているか、又は該アッセイから得られた結果から生理的条件に外挿可能であるべきである。換言すれば、アッセイから得られた結果は、生理的濃度の抗TNFα抗体が、インビボで、少なくとも10％、15％、25％、30％、35 ％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95 ％、又は100％までTNFα活性を減少させ得ることを示さなければならない。当業者は、このような条件を決定する方法を容易に知り得るであろう。「野生型TNFαを実質的に阻害」とは、適切には、野生型TNFαの有害な効果を減少又は除去し得るようなものであり得ることを理解しなければならない。このような阻害は、適切には、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％であり得る。このような背景により、本発明の修飾ヒトTNFα分子は、バックβシートの任意のストランドのβシート構造が実質的に保持されるように、フロントβシート及び／又は接続ループのストランドを含むTNFα分子の領域中に置換がなされことを特徴とする。実験的に完全に明らかとなっているわけではないが、この特性は、バックβシートを形成するストランドに共通であると仮定しなければならず、好ましくは、該置換は、バックβシートの完全なストランドを全く含まないTNFα分子の領域に行わなければならない。残基31〜35の機能的な重要性に関する上述の議論からは、バックβシートの各ストランド間の接続ループも好ましくは避けるべきと推測できる。しかしながら、バックβシートのＤストランドの配列のみを含むTNFα分子の領域に置換を行うことは差し支えない。本発明の好ましい態様によれば、該置換には、少なくともフロントβシートのＨストランドのセグメントとバックβシートのＩストランドへの接続ループのセグメント、好ましくはアミノ酸132〜146が含まれる。本発明の別の態様によれば、該置換には、ＨとＩストランドのセグメント、及び接続ループ全域、好ましくはアミノ酸132〜152が含まれる。本発明のさらに別の好適な実施態様によれば、該置換には、バックβシートのＤストランドのセグメントと、少なくともフロントβシートのＥストランドのセグメント、及び接続ループ全体、好ましくはアミノ酸65〜79、又は69〜84が含まれる。本発明のさらなる態様によれば、該置換には、フロントβシートのC'ストランドとＣストランド全体、及びバックβシートのＤストランドのセグメント、好ましくはアミノ酸40〜60が含まれる。本発明のさらなる態様によれば、該置換には、少なくともフロントβシートのＥストランドのセグメント、及び接続ループの一方又は双方のセグメント、好ましくはアミノ酸76〜90が含まれる。挿入されるＴ細胞エピトープは、好ましくは雑多であり、大部分のヒトHLAクラスIIタイプに免疫原性が知られたものであるべきでめる。使用可能なエピトープは、例えば、破傷風トキソイド由来のエピトープ、好ましくはエピトープP2及び／又P30であり得る。(Panina-Bordingnon et al.，Eur．J．Immunol．19:2237 -42，1989)。ジフテリアトキソイド由来のエピトープも使用し得る。上述の好適な修飾ヒトTNFα分子（TNFα類縁体）の置換位置に関しては、添付の配列表の配列番号８及び配列番号16に示されている。利用し得る他のTNFα類縁体は、配列番号4、10、14、及び16に掲げられている。本発明は、本発明の上記修飾TNFα類縁体の末端切断類縁体にも関する。このため、プロミスカス(promiscus)主要Ｔ細胞エピトープ、及び少なくとも一つのT NFαＢ細胞エピトープ、好ましくは少なくとも５つのアミノ酸を含む一又は両隣接領域を含有するTNFα分子の末端切断類縁体は、本発明のTNFαワクチンの活性成分にもなり得るであろう。Ｔ細胞エピトープは、APCによってMHCクラスII分子に提示されると、Ｔ細胞の増殖を誘導するが、Ｂ細胞エピトープは、Ｂ細胞上に存在する免疫グロブリン受容体によって認識され、続いて、これらの細胞上に存在するMHCクラスＩ分子によって提示され得るであろう。WO 95/05849及び本発明によれば、これは、Ｂ細胞エピトープを有する、野生型TNFαに対する免疫応答を生じせしめる基礎を成している。Ｂ細胞エピトープは、理論的にも実験的にもTNFα中に同定され得る。直線状のＢ細胞エピトープ候補を同定するためのアルゴリズムが公開されており、これは、これらのエピトープ候補の性状の実験に基づいた調査の基礎を成すであろう。Ｔ細胞エピトープを含むこのような末端切断TNFα分子の投与に応じて異種システム（例えば、ウサギ）中に産生された抗体は、インビトロでネイティブヒト TNFαを結合し得る能力について、好ましくは中和試験の態様で分析することができる。TNFαのＢ細胞エピトープ候補に結合する能力について、中和抗体であることが知られている一群のモノクローナル抗体をインビトロでスクリーニングすることができる。これらは両者とも、可能性があり、最良のＢ細胞エピトープを同定する戦略である。おそらく該修飾は野生型TNFαに固有のトリマー化傾向を破壊するので、上述のTNFα類縁体は、モノマー型であると思われる。しかしながら、本発明はさらに、請求の範囲に記載されたTNFα活性を欠くTNF α分子のダイマー、オリゴマー、特にトリマー又はマルチマー、及び請求の範囲に記載された修飾TNFα分子をコードする単離されたDNA分子にも関する。好ましいTNFα類縁体をコードする単離されたDNA分子は、配列番号７及び15にリストされた配列を有し、他の利用可能な類縁体をコードするDNA分子は、配列番号3、9、13、及び15にリストされている。さらに本発明は、該類縁体をコードする単離されたDNA分子を含むベクター、及び適切な発現制御配列に作用可能に連結された前記DNA分子を含む発現ベクターも包含する。本発明の別の側面は、前記類縁体用の発現ベクターで形質転換された宿主である。前記宿主は、一般的に発現のために用いられる任意の宿主、例えば、細菌株、酵母、又は真菌、又は昆虫、哺乳動物、若しくは鳥類の細胞株であり得る。さらに本発明は、請求の範囲に記載されたTNFα類縁体を産生する方法であって、該類縁体の産生が可能な適切な条件下で、該類縁体用の発現ベクターを形質転換した宿主細胞を増殖し、産生された類縁体を回収する方法に関する。所望であれば、本発明の修飾TNFα分子は、適切なアジュバント分子、好ましくは、GM-CSF、HSP70、又はインターロイキン、例えばインターロイキン２のような、免疫学的に活性なアジュバントを有する融合タンパク質として、又は融合タンパクの一部として発現され得る。より具体的には、被修飾TNFα分子は、ネイティブのヒトTNFα分子をコードする遺伝子を主要Ｔ細胞エピトープを含有又は構成するペプチドをコードする適切な遺伝子セグメントに置き換えることによって作られる。続いて、適切な真核又は原核性発現ベクターで、該被修飾TNFα遺伝子を発現させる。以下の記載されているように、発現した被修飾TNFα分子を精製し、リフォールディングさせる。Ｔ細胞エピトープ全体を挿入することが好ましいかもしれないが、ある場合には、エピトープと該エピトープが得られたタンパク質中の隣接領域の両者を含むペプチド配列を挿入することが有利であるかもしれない。本発明によれば、被修飾ヒトTNFα分子は、TNFαに対するワクチンに使用し得る。モジュレートされた自己タンパク質のような精製タンパク質をベースとするワクチンの調合開発における戦略は、一般的には、タンパク質をベースとする他の任意の薬物製品に対する調合戦略と一致する。例えば、三次構造の保持のようなこれらの問題を克服するのに必要とされるであろう問題点及び指針は、いくつかのテキストブック、例えば、"Therapeutic Peptides and Protein Formulatio n．Processing and Delivery Systems Ed．A．K．Banga；Technomic Publishing AG Basel 1995."で扱われている。アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム(Adju-Phos)、リン酸カルシウム、ムラミルジペプチド類縁体、又は生分解性微粒子及びIscomのようなワクチンアジュバントとしてより最近開発されたものの使用は、この分野に従事する薬学者にとって一般的な調合時の攻撃誘発である。活性成分としてペプチド配列を含有する本発明のワクチンの調製は、例えば、米国特許第4,608,251号；第4,601,903号；第4,599, 231号；第4,599,230号；第4,596,792号、及び第4,578,770号に記載されているように（全て参考文献として本明細書に取り込まれる）、一般的に、本分野で極めてよく理解されている。典型的には、このようなワクチンは、液状の溶液又は懸濁物の何れかとして注入可能医薬品として調製される；注射の前に液体中の溶液、又は懸濁物にするのに適した固体形態も調製し得る。該調製物は乳化してもよい。免疫原性活性成分は、多くの場合、薬学的に許容され、且つ活性成分に適合する賦形剤と混合される。例えば、適切な賦形剤は、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、又はワクチンの効力を増強するアジュバントのような少量の補助物質を含有してもよい。ワクチンは、簡便には、注射によって、非経口的に、例えば皮下又は筋肉内の何れかに投与される。他の投与様式に適したさらなる調合には、座薬、ある場合には、経口用調合が含まれる。座薬の場合、伝統的なバインダー及び担体には、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセライドが含まれ得る。このような座薬は、0.5〜10％、好ましくは1〜2％範囲の活性成分を含有する混合物から形成し得る。経口用調合物には、通常利用される賦形剤、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルコース、炭酸マグネシウム等が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放調合、又は粉末の形態をとり、、10〜95％、好ましくは25〜70％の活性成分を含有する。ポリペプチドは、中性形態又は塩形態としてワクチンの中に調合し得る。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸又はリン酸のような無機酸、又は酢酸、蓚酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸によって形成される酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離のカルボキシル基と形成された塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から由来するものでもあり得る。ワクチンは、投与処方に適合した様式、及び治療的に有効且つ免疫原性のある量で投与される。投与すべき量は、例えば、免疫応答を引き起こす個体の免疫系の能力、患者のTNFαのレベルに依存する所望の保護程度を含む治療すべき患者に依存する。適切な投薬量の範囲は、ワクチン投与当たり数百μgのオーダーの活性成分でめり、約1〜300μg、特に約10〜50μgのような約0.1〜1000μg範囲が好ましい。初回投与及び追加投与に適した処方も様々なものであり得るが、典型的には、初回投与の後に引き続いて接種又はその他の投与を行う。適用様式は、広く変化させ得る。ワクチンを投与するための任意の従来法を適用し得る。これらは、生理学的に許容され得る固体塩基上、又は生理学的に許容され得る分散液中での経口適用、注射等の非経口的な適用が含まれるものと考えられる。ワクチンの投薬量は、投与経路に依存し、ワクチンを接種すべき者の年齢に応じて、年齢に比べて程度は低いが、ワクチンを接種すべき者のサイズに応じて変化するであろう。本発明の修飾TNFα分子には、ワクチンの中でも十分に免疫原性を示すものもあるが、ワクチンがさらにアジュバント物質を含めば、免疫応答が増大するものもあろう。ワクチンに対してアジュバント効果を達成する様々な方法には、一般的には、 PBSの中の0.05〜1パーセント溶液として用いられる水酸化アルミニウム又はリン酸(alum)のような物質、0.25％溶液として用いられる糖の合成ポリマー(Carbopo l)との混合物、70〜101℃の温度で、30秒〜2分間熱処理したワクチン中のタンパク質凝集物の使用が、それぞれ含まれる。ペプシン処理した(Fab)抗体を用いた再活性化によるアルブミン、クリソスポリウム・パルバム(C．parvum)のような細菌細胞との混合物、エンドトキシン、又はグラム陰性細菌のリポ多糖成分、マンニッドモノオレエート(mannide mono-oleate)(Aracel A)生理的に許容されるオイルビークル中のエマルジョン、又はブロックサブスティチュート(block sub stitute)として使用されるペルフルオロカーボン(Fluosol-DA)の20％溶液とのエマルジョンへの凝集も利用し得る。本発明には、DDA(ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド)は、興味深いアジュバント候補であり、QuilA とRIBIも興味深い候補である。さらに、モノホスホリルリピドA(MPL)、及びムラミルジペプチド(MDP)も可能性がめる。他の適切なアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム(Adju-Phos)、リン酸カルシウム、ムラミルジペプチド類縁体である。生分解性微粒子、及びIscom'sのような、より最近開発されたワクチンアジュバントのうちの幾つかも適切に使用できるかもしれない。アジュバント効果を達成し得る他の極めて興味深い（従って、好ましい）可能性は、ゴッセリンら(Gosselin et al.)、1992に記載されている手法を利用することである（本明細書に参考文献として取り込む）。要約すれば、本発明の被修飾TNFα分子のような適切な抗原の提示は、単球／マクロファージ上に存在するF cγ受容本に対する抗体（又は抗原結合抗体フラグメント）にこのような抗原をコンジュゲートすることによって増強され得る。特に、抗原と抗FcγRIとのコンジュゲートは、予防接種のための免疫原性を増強させることが実証されている。他の可能性には、リンフォカイン（例えば、IFN-γ、IL-2、及びIL-12）のような免疫制御物質又は上述したアジュバントと組み合わせたポリI:Cのような合成IFN-γ誘導物質の使用が含まれる。多くの例では、ワクチンを複数回投与すること、通常は６回を超えない予防接種、より通常には４回を超えない予防接種、好ましくは１回以上、通常は少なくとも約３回の予防接種が必要となるであろう。予防接種は、通常2〜12週間隔であり、より通常には3〜5週間隔であろ。所望のレベルの保護免疫を維持するために、1〜5年、通常は３年間隔の定期的な追加免疫を行うことが望ましい。本発明のポリペプチドをアジュバントと混合する一つの理由は、細胞性免疫応答を効果的に活性化することである。しかしながら、この効果は、他の方法、例えば、非病原性微生物の中でワクチンに効果的な抗原を発現させることによっても達成できる。このような微生物の周知例は、マイコバクテリウム・ボウビス（ Mycobacterium bovis）BCGである。非病原性微生物は、例えば、マイコバクテリウム、サルモネラ、シュードモナス、及びエシェリヒア属からなる群から選択される細菌であることが好ましい。非病原性微生物は、マイコバクテリウム・ボウビスであることが特に好ましい。本発明の分子をコードするヌクレオチド配列をマイコバクテリウム・ボウビス BCG株から得られたマイコバクテリウムに一コピー以上取り込ませれば、BCG株の免疫原性効果が増大するであろう。本発明のヌクレオチド配列を一以上取り込ませれば、さらに免疫応答を増大させると推察され、従って、分子をコードするDN A配列が、少なくとも５コピーのように少なくとも２コピー、微生物のゲノムに取り込まれたワクチンは、本発明の一側面である。DNA配列のコピーは、同一の分子をコードする同一のものであるか、同一のポリペプチド又はポリペプチドの相同物をコードする同じDNA配列の変異形の何れかであり得、他の態様では、少なくとも一つのポリペプチドが本発明のポリペプチドである異なるポリペプチドをコードする異なるDNA配列である。本発明の生ワクチンは、本発明の形質転換された非病原性細胞を培養し、これらの細胞をワクチン用の媒体に移し、必要に応じて担体、ビークル、及び／又はアジュバント物質を加えることによって調製できる。本発明の分子の合成の開始点としての使用、及びハイブリダイゼーションプローブとしての使用（直接ハイブリダイゼーションアッセイ、又は、例えば、ＰＣＲ若しくは他の分子増幅法のプライマーとして有用）以外に、本発明の核酸断片は、インビボでの抗原の発現を実施するために使用し得る。すなわち、該核酸断片は、所謂DNAワクチンに使用し得る。最近の研究により、例えば、筋肉内注射又は経皮的投与（所謂、「ジーン・ガン(gene gun)」アプローチ）によって、真核細胞内で複製できないベクターにクローニングされたDNA断片を動物（ヒトを含む）に導入し得ることが明らかとなった。DNAは、例えば筋肉細胞によって摂取され、所望の遺伝子は、真核細胞で機能するプロモーター、例えば、ウイルスプロモーターによって発現された後、遺伝子産物が免疫系を刺激する。これらの新しく発見された方法は、ウルマーら(Ulmer et al.)、1993にまとめられており、参考文献として本明細書に含まれる。このような「DNAワクチン」の効力は、おそらく、発現産物をコードする遺伝子とともに、免疫応答を調節する能力を有するポリペプチドをコードするDNA断片を投与することによって増強させ得る。例えば、リンホカイン前駆体又はリンホカイン（例えば、IFN-γ、IL-2、又はIL-12）をコードする遺伝子は、二つの分離したDNA断片を投与するか、又は同一のベクター中に両DNA断片を含有させて投与ずることによって、免疫原性タンパク質をコードする遺伝子とともに投与し得る。ワクチンは、TNFαの放出によって特徴づけられる病態生理を有する上述の疾病の何れか、特に慢性の炎症性疾患を予防／治療するために使用し得る。例としては、リューマチ性関節炎、及び炎症性腸疾患(IBD；inflammatory boweldiseas es)を挙げることができる。後者には、潰瘍性大腸炎、クローン病、特にクローン性大腸炎が含まれる。他の例は、癌、しばしば癌と関連する悪液質、散在性硬化症、糖尿病、乾癬、骨粗鬆症、及び喘息である。本発明によって好ましく治療又は予防できる癌は、組織発生学的に、カルシノーマと腺癌を含む悪性上皮腫瘍、脂肪肉腫、繊維肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、悪性黒色腫、悪性髄膜腫、様々な白血病、様々な骨髄増殖性疾患、様々なリンパ腫（ホジキンのリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫）、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、悪性奇形腫、未分化胚細胞腫、精上皮腫、絨毛上皮腫を含む悪性非上皮腫瘍に分類できる。カルシノーマと線癌が最も多く（癌による死亡の約90％を占める）、それ故、本発明によって治療／予防すべき興味深い標的疾病である。最も重要なカルシノーマ及び腺癌は、気道（特に、気管支由来）、乳、結腸直腸、及び胃のカルシノーマ及び腺癌である。しかし、前立腺、卵巣、リンパ組織、及び骨髄、子宮、膵臓、食道、膀胱、及び腎臓のカルシノーマ及び線癌も、かなりの数の死を引き起こしており、それ故興味深い。好ましくは、ワクチンは、予防処置として与えられるであろうが、これらの疾病の慢性的な性質、及びそれらの鎮静と再発傾向の見地からは、それらは一以上の上述の疾病が診断された患者に投与してもよく、患者を鎮静状態に維持する役割を果たし得る。マウスにおけるより初期の研究に基づけば、本発明の被修飾TNFα類縁体も、急性状態にある上述の疾病の治療的処置の一部として、又は少なくとも患者を鎮静状態にして、定常状態を維持するためにも使用できる。何れかの疾病に罹患したヒトに対して該ワクチンをテストしていないので、現段階では、具体的な有効量範囲を述べることはできない。何れにしろ、、投与量は、信頼できる医師の処方によるべきであろう。本発明の態様の一つによれば、該ワクチンは、二つの異なるＴ細胞エピトープ、例えば破傷風トキソイドに由来するP2及びP30を含有する異なって修飾された二つのTNFα分子の混合物を含む。この混合物は、必要に応じて、適切な量の薬学的に許容されるアジュバントを含有する。本発明のさらに別の側面によれば、該ワクチンは、被修飾ヒトTNFα分子自体ではなく、ヒトにおいてDNA配列の発現を調節することができるプロモーター配列に作用可能に連結された前記分子をコードする非感染性非組込み(non-integra teing)DNA配列を含む構築物を、該構築物の摂取が起こり、TNFαに対する中和抗体応答を誘導するのに十分な発現が起こる十分な量具備する。このタイプのワクチンの利用は、所謂DNAワクチンであり、例えば、米国特許第5,589,466号、及び第5,580,859号に、特に投与方法に関連して示されており、参考文献として両者を本明細書に取り込む。該DNAワクチンは、レトロウイルス発現ベクターのようなウイルス発現ベクターを具備してもよい。一般的には、本発明のワクチンは、経口又は非経口に適し得るものであって、特に、皮下、筋肉内、又は皮内投与に適し得る。さらに、本発明は、本発明のワクチンを投与することによって生じた抗体の使用、好ましくはモノクローナル抗体、特に診断用途を含む。さらに本発明は、ヒトの体液にTNFαが存在するかどうかをテストする方法であって、本発明の被修飾TNFαを含有する組成物をヒト体液の試料と接触させることと、前記抗体が前記試料中のTNFαに結合するかどうかを決定することを具備する方法に関する。本発明は、ヒト体液中のTNFαを検出するためのインビトロ免疫アッセイを利用するTNFα関連疾患の診断法にも関する。前記方法には、サンドイッチアッセイ、ELISAアッセイ、又はこれらと均等なアッセイの使用が含まれ得る。これらは、増幅しなくてもよく、例えば、アビジン／ビオチン技術を用いて、増幅してもよい。ワクチン／組換えタンパク質は、当業者に周知の以下のアッセイを用いて、特性決定し得る。クマシー又は銀で染色したSDS-Pageゲル（サイズと純度に関する情報）、 IEF（等電点電気泳動）（等電点に関する情報）、エンドトキシンLALアッセイ（純度に関する情報）、宿主細胞のタンパク質（純度に関する情報）、質量分折計（質量に関する情報）、 UV検出プロフィールを用いたSE-HPLC（分子量分布に関する情報）、Ｎ末端配列（同一性に関する情報）、円二色性（三次構造に関する情報）、モールズ(malls)検出を用いたSE-HPLC(光散乱による三次構造に関する情報)、アミノ酸組成（同一性に関する情報）異なる種における免疫原性（マウス、ラット、又はウサギ）、ウェスタンブロットでの抗体への反応性、 NMR分光機、結晶構造、完全なアミノ酸配列の決定好ましい態様を記載した実験の部１．序論先の出願WO95/05849では、Ｔ細胞エピトーブを修飾したマウスのTNFα分子が、ネイティブ（野生型）マウスTNFαと交叉反応する高力価の抗体を誘導することが示された。これらの抗体は、インビトロ及びインビボで、TNFαとその受容体を妨害することができた。実験的な悪液質、コラーゲン関節炎、及び実験的なアレルギー性脳脊髄炎(EAE)のようなTNFαによって誘導される疾病の幾つかの動物モデルで、TNFαに対する免疫化が有益な効果を示すことが実証された。用いた二つの修飾されたマウスTNFα分子(MR 103及びMR 106と表記)は、DBA/1及びSJ LマウスというMHCクラスIIハプロタイプで最適な免疫原性を示すものではなかったという事実にもかかわらず、これらの動物実験の結果が得られた。これらのマウス系統は、それぞれ、コラーゲン関節炎及びEAE実験に使用した。別の実験では、別の修飾を施したマウスのTNFα分子(MR 105) は、ホルムアルデヒドを用いてE.Coliタンパク質にコンジュゲートされた組換えマウスTNFαよりも強い免疫応答を与えることが示された。 MR103、MR105、及びMR10Gは、マウスの分子であって、先の出願WO95/05849をベースとするが、それらは全て活性であったので、適切にＴ細胞置換されたヒトの被修飾TNFα分子の免疫原性についても、またこのような分子がTNFα中和自己抗体を誘導する潜在的な能力についても何ら具体的な結論を引き出すことができなかった。２．ヒトTNFα構築物の開発一般的にいって、ヒトに使用されるTNFαワクチンでは、被修飾ヒトTNFα分子は、以下の要件を充足すべきである。 a.それらは、集団の大部分で免疫原性を示すべきである。 b.それらは、TNFα中和抗体を最適に誘導可能であるべきである。 c.それらは、生物的なTNFα活性を残しているべきではないさらに、選択過程では、組換え発現のレベル、精製の容易さ、溶解度等のその他の実用的パラメーターを考慮してもよい。2.1. 被修飾TNF分子の免疫学的乱雑性ヒトTNFαワクチンの開発中には、目標は、最終的に、ヒトの集団中のできるだけ多くの部分（勿論多数の異なるHLAクラスIIタイプを示す）に免疫原性がある被修飾ヒトTNFα分子を産生することであった。それ故、以前の動物実験で用いたMHC特異的エピトープの代わりに、プロミスカスＴ細胞エピトープを用いた。先の出願WO95/05849からは、このようなエピトープが、どのようにこのような分子が中和抗体を誘導し得る能力に影響を与えることができるのかは分からなかった。科学文献で十分に特定された二つの破傷風トキソイド(TT)由来Ｔ細胞エピトープ、P2及びP30を選択した。これらのエピトープは、TTの主要エピトープであり、ヒト集団中のHLAクラスII分子の少なくとも80％に結合できることが知られていろ。さらに、これらのTTエピトープを用いることによって、末梢血単核細胞 (PBMC)及びTT免疫血ドナーから産生されたＴ細胞株に対するインビトロでのTNF α構築物の免疫原性をテストすることが可能であると予測された。 P2エピトープのアミノ酸配列はQYIKANSKFIGITELであって、TTアミノ酸830〜84 4に対応し、P30エピトーブの配列は、FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEであって、TTアミノ酸947〜967に対応する。二つの異なるヒトTNFα分子をP2とP30に置換すると、それぞれ、ネイティブTNFα配列の約10％及び15％が変化する。両エピトープを単一のTNFα分子に挿入すると、約25％の分子が変化することになるので、これはTNFα分子の残りのネイティブ部分に余りにも大きな影響を与えるのではないかと危惧する者もいるであろう。それ故、各々P2又はP30の何れかを含有する二つのTNFα分子を開発することにした。このような二つの分子は、合わせて、ヒト集団の少なくとも80％に免疫原性を示すと予測されよう。さらに、一部分がP2 又はP30エピトープから構成され、一部分がTNFα隣接領域から構成される末端切断分子も免疫原性を与える可能性が非常に高く、これらの構築物はほぼ100％の集団に免疫原性を示すであろう。全てのマウスTNFα構築物により、これまでテストした全てのマウスの系統に抗体を誘導することが可能であったが、TNFα中のある位置に外来Ｔ細胞エピトープを挿入すると、他の位置に挿入したときに比べて、MHCクラスII分子によるＴ細胞へのエピトープの提示に関して、より有用であることをア・プリオリに予測するかもしれない。それ故、P2及びP30エピトープが分子内の異なる位置に挿入された異なる修飾を施した一連のヒトTNFα分子を作成することにした（図４参照）。続いて、多数の健康なTT免疫血ドナーから単離された末梢血単核細胞(P BMC)又はP2/P30特異的Ｔ細胞株に基づくＴ細胞アッセイによって、インビトロでテストした。しかしながら、予想に反して、僅かな量的差異はみられたが、P2及びP30エピトープの細胞内での位置は、抗原提示細胞によってプロセッシングされた後、TT 特異的Ｔ細胞に提示され得る能力は不可欠でないことが示された。このように、 132〜146、65〜79、76〜90位に挿入されたP2、及び40〜60及び132〜152位に挿入されたP30（TNF2-5、2-3、2-7、30-2、30-5）は全てプロセッシングされ、Ｔ細胞に提示された。従って、上記考察から、これらの分子は、最終的にヒトの集団で広く免疫原性を示す可能性が非常に高い。2.2. 被修飾ヒトTNFα分子が中和抗体を誘導する能力上述のように、置換領域が異なるにもかかわらず、三つの類縁体MR103、MR105 、及びMR106は全て、抗体を誘導できるので、中和TNFα抗体の誘導を可能にするために、WO95/05849に記載された以前のマウスの研究からは、どの位置が最も適切なのかを予想することはできなかった。それ故、異なる部位にP2又はP30が挿入された一連の異なるヒトTNFα分子を作成した。該置換は分子全体にわたってランダムに分布していた。これらの分子を投与したときにウサギに誘導された抗体は、続いて、TNFαの生物活性を妨害する能力について、生化学的及び生物学的なインビトロアッセイでテストした。本発明者らによる未発表の観察では、挿入したエピトープの分子内での位置に応じて、誘導された自己抗体の全体的な特異性は異なることが観察されることが示された。TNFα分子の構造データに基づく予想には全く反して、P2又はP30の何れかでフロントβシート中に置換を施すと、分子の生物学的なTNFα活性は完全に奪われるが、修飾された分子がTNFα中和抗体を誘導する能力は保存されることが観察された。上述の位置にP2又はP30を含有する分子は、中和抗体を誘導するのに特に効果的であることが示された。それ故、これらの分子は全て、ヒトTNFαワクチンに使用するための候補になり得る。2.3. 様々なTNFα構築物の生物的活性 TNFαと同程度の毒性を示す分子をワクチンに用いることができないのは自明であろう。それ故、被修飾TNFα分子は、非毒性、すなわち、全くTNFα活性が残存していないことが必要である。このため、非毒性であるかどうかを調べるために、インビトロのTNFα依存バイオアッセイと受容体結合アッセイで、全ての変異TNFαタンパク質をテストした。被修飾ヒトTNFα分子（TNF2-5、2-3、2-7、30-2、及び30-5）は全て、TNFα の生物活性を失っていることが明確に示された。それ故、これらの分子が、抗ヒトTNFα中和抗体を誘導し得る汎用性のある非毒性ワクチンの一部となるために必要な要件は全て充足された。例１遺伝子構築作業 10個の異なる被修飾ヒトTNFα分子（P2を含有するものを５個、P30エピトープを含有するものを５個）を作成することにした。このエピトープは、分子内の様々な位置に分布していた。様々な標準的制限酵素及びPCRベースの突然変異誘発技術を用いることによって、遺伝的構築物を作成した。該遺伝的構築物は、図4a 及び4bに図示されている。被修飾TNFα分子をコードするDNA配列及び対応するアミノ酸配列は、配列番号1〜20として取り込まれている。変異ヒトTNF2-5遺伝子の構築、クローニング、及び変異手法、並びにその後の発現、単離、及びTNF2-5 類縁体の精製は、以下の例で説明する。 TNF2-5の構築及び作成：変異ヒトTNF2-5遺伝子の遺伝的構築、クローニング、及び変異手法変異ヒトTNF2-5類縁体をコードする遺伝子の遺伝的構築は、他の全ての遺伝的構築と同様に、伝統的なPCRベースの突然変異誘発手法に基いて行った。ヒトTNFα分子の可溶性部分をコードするヒトTNFαのネイティブDNA配列は、合成プライマーI及びII（表１、配列番号21と22）を用いて、市販のヒトcDNAライブラリー（CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA，USA(Fig.16,1)から、伝統的なPCRクローニングによって、合成的に取得した（図16,1）。該遺伝子がIPT G誘導性プロモーターからインフレームに転写され得るように、ネイティブ遺伝子を市販の大腸菌発現ベクターpET28c（Novagen,Madison,WI53711,USA）に挿入した。 TNFα変異類縁体TNF2-5の遺伝的構築は、PCR突然変異誘発手法をネイティブの DNA配列に適用することによって行った。TNFに相同なDNAの二つの3'及び5'アニーリングストレッチの間に位置する合成的に合成した75マーのオリゴヌクレオチド（プライマー「mut2-5」、表１、及び配列番号27）の中に、Ｔ細胞エピトープをコードする核酸配列を取り込んだ。このため、「mut」プライマーは、TNF2-5 について選択したネイティブヒトTNFα遺伝子配列の所定部位にアニーリング寸ることができる（図16,2a参照）。「mut」オリゴヌクレオチドでは、Ｔ細胞エピトープをコードするコドンの数は、TNFに相同なDNAの二つの 3'及び5'アニーリングストレッチの間から除去されたTNFコドンの数に正確に合致していた。Ｔ細胞エピトープをコードするDNA、及び挿入されたエピトープの下流（すなわち3'）にあるTNFα配列を含有するPCR産物を作成するために、突然変異誘発プライマーを使用した（図16,2a）。エピトープの挿入位置の上流（すなわち5'）にあるTNFαDNAのストレッチは、プライマーIとIIIを用いた第二のPC R産物によって与えられた(表１、配列番号23)、(図16,2b)。最終的に、二つの最も遠位に位置するプライマー(I,II)を用いて、二反応から、最後のPCR反応で二つのPCR産物を結合させる(図16,3)。続いて、形質転換された細胞から、IPTG誘導性プロモーターから遺伝子が転写され得るように、ネイティブ遺伝子の発現クローニングと同等の市販の大腸菌発現ベクターに、完全な変異TNF2-5DNA配列を導入する。他の類縁体(TNF2-1,2-3,2-4,2-7,30-1,30-2,30-3,30-4及び30-5)を構築するために使用した「mut」プライマーは、それぞれ配列番号23〜26、及び28〜33に示されている。組換え細菌の培養、採取、及び封入体の溶解 TNF2-5 類縁体のタンパク質精製 TNF2-5タンパク質の産生は、他の組換えTNF分子の産生と同様であった。 1.50μg/mLのカルベニシリンを含有する20mLのTB培地に、組換えタンパク質をコードするTNF遺伝子を有するIPTG誘導性プラスミドベクターを担持する形質転換された大腸菌株を播種し、37℃で振盪させながら該大腸菌を一晩増殖させる。 2.50μg/mLのカルベニシリンを加えた250mLのTB培地で、一晩培養した培養物を1:25に希釈し、OD₄₅₀が１になるまで該培養物を増殖させる。最終濃度が1mMになるようにIPTGを添加することによって、組換えタンパク質の発現を誘導する。激しく振盪させながら37℃で一晩増殖させる 3.3500×gの遠心によって培地から組換え細胞を採取する。BSB緩衝液中でベレットを一度洗浄する。50g湿重量の細菌当たり150mLのBSBを使用する。 4.細菌の懸濁液が完全に均一になるまで、最大振幅で30秒４回音波処理する。音波処理は、9.5mmのスタンダード・プローブ（Soniprep 05 38 121-1154）を搭載したMSEソニプレップ150ソニケーターを用いて行う。 5.細胞ペレット1g当たり８μＬのPMSF(50mM)と80μＬのリソザイム溶液(10mg/ mL)を加える。室温で30分インキュベートする。 6.ペレット1g当たり4mgのデオキシコール酸を加え、混合し、3T℃で保存する。 7.溶液が粘着性を帯びたら、ペレット1g当たり20μＬのDNAse、及び最終濃度5 mMになるようにMgClを加え、混合し、室温で30分保存する。 8.溶液が液状、且つ非粘着性になるまで、最大の振幅にして、30秒間隔で、５回30秒、氷上にて音波処理する。 9.一時間20.000×gで遠心し、後に洗浄操作をチェックして、全ての封入体が沈殿したかどうかをチェックするために、上清を保存する。 10．ペレットをミリＱ水（大腸菌1g当たり1mLの水）に再懸濁し、１時間振盪する。 11．20.000×gで一時間遠心し、全ての封入体が沈殿したかどうかをチェックするために上清を保存する。 12．大腸菌1g当たり1mLに溶かした1Mの尿素にペレットを再懸濁し、１時間振盪する。 13．20.000×gで一時間遠心し、全ての封入体が沈殿したかどうかをチェックするために上清を保存する。 14．大腸菌1g当たり1mLに溶かした1Mのグアニジンにペレットを再懸濁し、１時問振盪する。 15．20.000×gで一時間遠心し、全ての封入体が沈殿したかどうかをチェックするために上清を保存する。 16．25mLの6Mグアニジン＋20mM Tris pH8.0にペレットを再懸濁し、一晩攪拌する。 17．20.000×gで一時間遠心し、組換えタンパク質封入体を含有する上清を保存し、全ての封入体が溶解したかどうかをチェックするためにペレットを保存する。 18．タンパク質溶液をミリＱ水に対して徹底的に透析し、続いて、該溶液を凍結乾燥する。 19．20mM Tris、6Mグアニジン、30％2-プロパノール(pH8.0)に、20mg/mLの濃度になるように凍結乾燥した物質を可溶化させる。穏やかに攪拌しながら、一晩可溶化させる。スーパーデックス200カラム(XK16,Pharmacia，直径:1.6cm,高さ: 750cm)によって、モノマーの存在を調べる。ランニングバッファー中を1mL/分で走らせる。同一の緩衝液中でスタンダードと比較する。 20．平衡化緩衝液で平衡化したスーパーデックス200カラム(XK26,Pharmacia，高さ:100cm，直径:2.6cm)上でのゲル濾過によって、タンパク精製を行う。平衡化緩衝液中を走らせる。総カラム容積の約1％の試料容量を適用する。 21．組換えタンパク質のリフォールディングは、透析によって行う。平衡化緩衝液でタンパク質を0.11mg/1mLに希釈し、沸騰した透析バッグの中に該溶液を入れ、３回交換しながら、室温で一晩、20mM Tris、4M尿素(pH8.5)に対して透折する。Tris緩衝液(20mM Tris，150mM NaCl(pH8.0))に、透析バッグを移す。これを三回交換して、一回目は室温で行う。一晩低温室におく。 Tris緩衝液(20mM Tris，150mM NaCl(pH8.0))で平衡化したスーパーロース12カラム上で、リフォールディングを調べる。スタンダードと比較する。保存組換えタンパク質を凍結乾燥して保存する。被修飾TNFα分子の大規摸な産生は、以下に記載されているように実施し得る。開始物質 500Lの発酵した大腸菌培養、約50Lになるように水でダイアフィルトレート(di afiltrate)した。 1)細胞の洗浄 A)凍結した細胞のスラリーを溶かす B)4000×gで、10分間細胞を延伸する C)50mM Tris，150mM NaCl,pH8.0にペレットを再懸濁するステップB)及びC)を三回繰り返す 2)細胞をホモゲナイズする A)Rannieホモゲナイザーによって細胞をホモゲナイズする、５サイクル、700 バール B)封入体を16,500^*gで30分間遠心する C)3Mグアニジン、1M NaCl、5mM EDTA、20％スクロース、50mMトリスpH８で３回封入体を洗浄する。封入体を16,500^*gで30分間遠心する。 3)封入体の可溶化 6Mグアニジン、10mM DTT、150mM NaCl、5％エタノール、50mMトリスpH８にペレットを再懸濁する。約１mLの緩衝液／100mgペレットを使用する。 4)封入体の限外濾過 A)0.45μのフィルターで大きな不純物を除去する B)30KDフィルターで高分子成分を除去する C)5K0フィルターで封入体を濃縮する 5)緩衝液の交換 A)イオン交換クロマトグラフィーのためのサンプルを調製する。ダイアフィルトレーションによって、50mMトワスpH８中の6M尿素、1mM DTTに緩衝液を交換する。 6)SPセファロース精製タンパク質をSPセファロースカラムに載せる。４倍量のＡ緩衝液でカラムを洗浄し、100％のＢ緩衝液でタンパク質を溶出して、TNFαの存在する画分を全てプールする。Ａ緩衝液:GM尿素、1mM DTT、50mMトリス/Cl pH８Ｂ緩衝液:6M尿素、1M NaCl、1mM DTT、50mMトリス/Cl pH８ 7)ヒトTNFαのリフォールディング 20mMトリス/Cl pH8.8中の6M尿素、1mM DTT、50mM NaCl、５％エタノール中の約0.1mg TNFα/mLになるようにタンパク質プールを希釈し、ダイアフィルトレーションによって、以下の緩衝液組成物にしていくことによって、段階的に尿素を除去する。 A)20mMトリス/Cl pH8.8中の2M尿素、1mM DTT、150mM NaCl−５℃で一晩 B)20mMトリス/Cl pH8.8中の1M尿素、1mM DTT、150mM NaCl−５℃で８時間 C)20mMトリス/Cl pH8.8中の1mM DTT、150mM NaCl−５℃で一晩 D)20mMトリス/Cl pH8.8中の150mM NaCl−５℃で一晩 8)ヒトTNFα類縁体の保存 1.0mg/mLにタンパク質を濃縮し、該サンプルを-20℃で保存する TB培地製造者のマニュアルに従って、ミリＱ水にテリフィック・ブロス(Terrific Br othm GIBCO BRL 22711-22)を溶解させる。121℃で20分間オートクレーブにかける。カルベニシリン×100ストック溶液(50mg/mL) カルベニシリン二ナトリウム塩（Sigma C1389）を50mg/mLの濃度でミリＱ水に溶かす。該溶液を0.2μｍフィルター(Sterifix 0409 9206)に通してフィルター滅菌する。 IPTG×100ストック溶液100mM イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG，USB 17884)、1.19gのIPTG を50mLまでのミリＱ水に溶かす。該溶液を0.2μｍフィルター(Sterifix 0409 92 06)に通してフィルター滅菌する。 BSB緩衝液細菌懸濁緩衝液(Bacterial Suspension Buffer) 50mMトリス(Trisma base，SigmaT1503) 0.5M NaCl(Ridel-de.Haen 31434) 5mM DTT(DL-ジチオスレイトール,Sigma D-0632)pH8.0 PMSF 50mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド、SIGMA#P-7626、2-プロパノールに溶解ライソザイム溶液ニワトリの卵白由来のグレードIIIライソザイム(EC3.2.1.17)10mg/mL、SIGMA#L- 7001 デオキシコール酸 (7-デオキシコール酸)Sigma#D-6750 DNAse 1mg/mLのDnaseI、デオキシリボヌクレアーゼI、(EC.3.1.21.1)Boehringer Cat#1 284932 尿素尿素(GibcoBRL 15716-020) グアニジングアニジン塩酸(Sigma G4505) 2-プロバノールランニング緩衝液 20mMトリス(Trisma base，Sigma T1503) 8M尿素(GibcoBRL 15716-020) 0.1％βメルカプトエタノール pH8.0 平衡化緩衝液 20mMトリス(Trisma base，Sigma T1503) 8M尿素(GibcoBRL 15716-020) 0.1％βメルカプトエタノール例２ P2 及びP30被修飾TNFα分子の発現、精製、及びリフォールディング発現、精製、及びリフォールディングの過程で組換えタンパク質が異なる挙動を示すことは、よく確立されている。全てのタンパク質は大腸菌で発現させ、２〜20％の発現レベルを得た。全てのタンパク質は、市販のポリクローナルウサギ抗ヒトTNFα抗体を用いたウェスタンブロッティング実験で認識された。続いて、3〜4Lのバッチサイズ中の250mL培養液中で、一つずつTNFα構築物を発現させた。全ての被修飾TNFαタンパク質は、封入体として発現され、85％を超える純度であり、以下に記載されているようにリフォールディングしたタンパク質調製物を作成した。タンパク質含量は、標準的なBCA分析で決定した。全てのタンパク質精製は、各分子について、少なくとも３回の別個の操作によって行った。全てのケースで、個々のタンパク質バッチをテストし、同様であることを見出した。-20℃、PBS 中0.2〜1.0mg/mLの濃度で、使用するまで該タンパク質を保存した。標準的な品質管理分析には、各タンパク質調製物のクマシーブル染色とシルバー染色を用いたSDSゲル電気泳動を含んでいた。全てのケースで、該タンパク質は予想されたサイズを有し、85％を超える純度であることが分かった。エピトープが４位に挿入された分子(TNF2-4とTNF30-4)は、比較的低いレベルで発現したにすぎなかった（約２％）。さらに、これらの分子は、極めて精製が困難であり、特にリフォールディングが面倒であった。両分子、特にTNF30-４は、PBSにあまり溶けず、保存中に沈殿する傾向があった。例３様々なTNFα構築物の生物活性精製TNFα分子の直接的生物活性は、TNFαの生物活性を決定するための標準的なインビトロアッセイであるL929バイオアッセイでテストした。図６から明らかなように、P2又はP30で被修飾TNFα分子は何れも、テストした濃度範囲(60mg/mL まで）のL929細胞を死滅させることができなかった。市販の組換えTNFα分子は、約0.6mg/mLで完全に活性であった。野生型TNFα調製物もテストした全濃度範囲で完全に活性であった。例４被修飾TNFα分子が中和抗体を誘導する能力生物活性なヒトTNFαをインビトコで中和できる抗体を誘導し得るかどうかを知るために、10の構築物各々でウサギを免疫化した。３匹のウサギのグループを用い、各ウサギに、フロイントの安全アジュバント中のTNFα100mgを皮下投与し、続いてフロイントの不完全アジュバント中の100mgを約３週毎に投与した。18 週間の全免疫期間の間、一定の間隔で血液サンプルを集め、市販の純粋な非修飾ヒトTNFαを抗原として使用した従来型ELISAアッセイで血清の抗TNFα活性をテストした。全てのウサギは、免疫期間中抗TNFα抗体を産生し、最大レベル又は抗体力価は、各グループで、10年の範囲で変動した。平均抗体力価は、図７に示されている。TNF2-5、TNF2-7、TNF2-3、TNF2-1、及びWT-TNFαは、2〜4週以内に100の力価を誘導したのに対して、TNF2-4は著しく遅い応答を与えた。同様のカイネティクスはTNF30でも観察され、ここでもTNF30-4では、より遅い応答が得られた。これらの血清がヒトTNFαとその受容体とを妨害する能力は、L929アッセイと固相受容本結合アッセイでテストした。 L920アッ七イでは、L929細胞に混合物を添加する前に、市販のヒトTNFαに抗血清と非免疫対照血清の希釈系列を添加した。各グループの３匹のウサギ全てから得た血清は、２回繰り返してテストし、平均値を算出した。正常な血清は、色検出システムのバックグラウンド値を増加させる傾向があったので、全ての値からこれらを差し引き、パーセント相対阻害を算出した。全ウサギの免疫スケジュールの14週目の阻害能の結果を図８に示す。バックβシートストランドのセグメント中に全く置換を含まないTNF2-5は、他の構築物に比べて明確に優れており、該分子は、完全に毒性なWT-TNFα分子と同等の中和抗体誘導能を有していた（データは示されていない）。Ｄβストランド中に小さな置換されたセグメントを含むTNF2-3、及び置換されたバックβシートストランドのセグメントを全く含んでいないTNF2-7も阻害能のある抗体を誘導することが可能であり、TNF2-7に対する中和抗体の力価は、その後３週の間に顕著に増加した（データは示されていない）。それぞれ、バックβシートのＧ及びＢ βストランドを含むTNF2-4及びTNF2-1は、L929アッセイで中和抗体を誘導することができなかった。 TNF30-3が14週目に最高であるようにみえたが、TNF30タンパク質に関する結果はより不揃いであった。それぞれ、バックβシートのＧ及びＢβストランドに置換を含むTNF30-1及びTNF30-4は、L929アッセイで中和抗体を誘導しなかった。固相受容体結合アッセイでは、マイクロタイタープレート上に組換えヒト55kD TNFα受容体1(TNF-R55)を固定化し、市販のビオチン化されたヒトTNFαを適切な希釈率で加えた。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼでラベルされたストレプトアビジンと発色性基質を用いて、受容体への特異的な結合を検出した。免疫したウサギの血清をテストするときには、TNF-R55コートされたマイクロタイタープレートに混合物を添加する前に、ビオチン化されたヒトTNFα溶液にこれらを加えた。各グルーブの３匹のウサギ全てから得た血清をテストし、平均値を算出した。非免疫ウサギの血清をネガティブコントコールとして用いた。バックグラウンド値は極めて低く、該アッセイは非常に感度が高い。結果を図９に示す。 L929アッセイ及び固相受容体結合アッセイから得た結果は、それぞれ、TNFα ２構築物とほぼ同じであることが分かるであろう。固相アッセイでは、TFN30-2 、TFN30-3、及び30-5間の差は、L929アッセイで観察された差に比べて顕著ではなかった。しかしながら、細胞特性よりもむしろ生化学的特性故に、固相アッセイはより再現性が高く、正常血清値は、該アッセイでは差し引かなかった。 TNFα結合の最大阻害の半分をもたらす血清の相対量（パーセントで表す）(IC 50値）を、TNF2-3、TNF2-5、TNF2-7、TNF30-2、TNF30-5、及びWT-TNFαについて、各対応する血清に対して算出した。TNF2-1、TNF2-1、TNF30-1、及びTNF30-4に対する抗血清についても同様の形状のカーブが得られると仮定して、外挿を行い、これらの血清に対するIC50値も算出した。結果を表IIに示す。 TNF2-5がウサギに中和抗マウスTNFα抗体を誘導する能力は、野生型(WT)マウスTNFαと同等であることが分かる。全てバックβシートのＢ又はＧストランドに置換を有するTNF2-1、TNF2-4、TNF30-1、及びTNF30-4は、このような抗体をごく僅かしか誘導しないか、又は全く誘導できなかった。このことは、驚くべきことに、バックβシートのストランドＢ及びＧは受容体結合に関与していないにもかからわらず、この領域に生じた変異は、受容体結合に関与するヒトTNFαの領域の妨害を何らかの形で引き起こすということを示している。TNF30-2及びTNF30 -3は、同じ程度に中和抗体を良好に誘導するようである。例５被修飾TNFα分子がP2及びP30免疫された健康な血液ドナーから得たＴ細胞を刺激する能力被修飾TNFα分子中でのP2及びP30エピトープの位置も抗原のプロセッシング及び挿入されたエピトープの提示に、従ってそれらの免疫原性に影響を与えると予測されたので、10分子全てを様々なＴ細胞アッセイでテストした。ポリクローナル末梢血分子細胞(PBMC)アッセイを使用し、TNFαペプチド及びP2及びP30エピトープが挿入された組換えタンパク質をテストするために、従来の免疫学的方法を用いて、多数のP2及びP30特異的Ｔ細胞株を樹立した。まず、従来のPBMC増殖アッセイで、28人の健康なボランティア（ドナー）が、 TT並びにP2及びP30エピトープに応答する能力をテストした。これらの結果に基いて、TT、P2、及びP30ペブチドに対して顕著に応答し得る19人をさらなる実験のために選んだ。応答レベルは非常に変動したが、これは、P2及びP30並びに主要Ｔ細胞エピトープが雑多であることを明確に示している。 28人のドナーに加えて、さらに７人のドナーも選んだ。P30又はP2の何れがに応答する能力をみるために、以下に説明する理由で、これらの中から何人かを選んだ。強力なＴ細胞応答が得られるように、これらのうちの何人かには、さらに TTを接種した。P2及びP30修飾された合成TNFαペプチドと被修飾分子の抗原提示を研究するために、第二グループのドナーの何人かは、P2又はP30特異的Ｔ細胞株を生じせしめるためにも使用した。図10には、３人のドナーにおけるTT並びに P2及びP30ペプチドに対するポリクローナルPBMC増殖応答の代表的な例を示す。 10の組換えタンパク質は全て、約100mg/mLから始まる少なくとも６種類の異なる濃度で、３回繰り返してテストし、全てのPBMC実験は、各人に対して2〜3回繰り返した。Ｔ細胞増殖を評価するためには、³Hラベルしたチミジンの細胞内への取り込みを使用し、該実験を採集し、96穴のフォーマットでカウントした。無抗原ウェル(CPMのみ)で得られたCPMの平均数で除した、実験を行っていろウェル中に存在するCPMの平均数間の関係として、各滴定曲線から得た最大増殖指標(PI) を算出した。３度繰り返してＴ細胞増殖データを作成し、P2及びP30のConAも、それぞれネガティブコントロール及びポジティブコントロールとして使用した。図11には、P2及びP30で修飾された異なるTNFα分子を用いた、２人の異なる血液ドナーに対する実験から得られた３つの例が示されている。 JHはP2のみに応答するのに対して、SRはP2とP30の両者に応答する。これは、様々な程度に、殆ど全てPBMCを刺激することができるP2とP30で修飾されたTNFα タンパク質に対する増殖応答にも反映されている。図12には、34の実験から算出された増殖指数(PI)が示されている。PBSバックグラウンドが変動するために、異なる実験でPIを定量的に比較することは極めて困難であるが、全ての構築物が、多かれ少なかれ、増殖応答を惹起し得ることは明確であると思われる。第２のドナーグループの間では、実験の1〜2ヶ月前に、幾人かの者にTTに対してワクチンを接種した。これらの人々(HB、MR、KG及びMW)から得たPIは、全て、全ての被修飾TNFα構築物において、観察されたPIが全て最高レベルにあり、データを評価することは容易であった。他の３人(DL、ID、及びLS)は、５年より前にワクチンを接種されていたが、彼らは全員平均を下回るPI値を示した。これは、観察されたPIが抗原特異的であることを支持している。第１のドナーグループについては、最後のTTワクチン接種に関するデータは入手できなかったが、彼らの免疫状態は、明確に極めて多様であった。単に、PI値の平均サイズに基いて、好ましいTNFα２又はTNFα30タンパク質を選択することは可能でない。これは、用いた各人のワクチン接種状態が一様でなく、多様な応答状態を有する者から得たPBMCアッセイも変動する性質を持っているためであるがもしれない。とにかく、TFα中に挿入された全ての位置のP2及び P30がプロセッシングされ、Ｔ細胞に提示され得るようにみえることは驚くべきことであった。アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過及び透折を繰り返したにもかかわらず、抗原調製物が、なお非特異的分裂促進因子を有意な濃度で含有しているかもしれないという可能性を除去するために、さらに幾つかの実験を行った。 P2に応答せず、P30に応答することが知られている第２グループからのドナー及びこれと反対の応答パターンを有するドナーをPBMCアッセイでテストした。図 13には、P2、P30、並びにTNFα２及びTNFα30タンパク質に対する応答が、DLとI Dについて示されている。それぞれのＴ細胞エピトープ及びそれぞれに修飾されたTNFα分子に対して特異的な応答が得られることが分かる。しかしながら、TNFα30タンパク質に対するDLの有意な増殖応答は全く観察されず（上段）、TNFα２タンパク質に対するI Dの有意な増殖応答は全く観察されなかったので（下段）、精製TNFα調製物中に非特異的分裂促進因子が存在しないことが支持される。第２のドナーグループから単離され、それぞれ合成P2及びP30ペプチドによろ少なくとも３ラウンドの刺激で、少なくとも６週間培養したP2及びP30特異的Ｔ細胞株の使用によって、この可能性をさらに調べた。図14には、このような２つの実験の結果が示されている。 P2及びP30特異的Ｔ細胞株は、それらの対応するP2及びP30タンパク質によってのみ刺激されたことが分かる。さらに、全てのTNFα構築物はＴ細胞増殖を誘導し得ることも分かり、抗原のプロセッシングはP2及びP30の提示に定量的には重要であるかもしれないが、抗原提示には重要な定性的リミティングファクターではないように思われることが強調される。文献には、Ｔ細胞エピトープの隣接領域がＭＨＣクラスII分子への抗原性ペプチドの結合に影響を与え得ることが報告されている。P2又はP30を挿入するために選択したTNFα中の位置には、抗原提示に対して抑制的なものは全くないと思われるので、ヒトHLAクラスII分子への結合に差異がある結果、挿入されたエピトープの異なる隣接TNFα配列が、P2及びP30エピトープへのＴ細胞応答に影響を及ぼし得るかどうか調べた。それ故、挿入されたエピトープ及び隣接ヒトTNFα アミノ酸を提示する表IIIに示されたペプチドを合成した。これらは、PP2-5、PP 30-3等と表記されている。該アミノ酸配列は、Pep2-1〜Pep30-5と表記され、配列番号34〜42として配列表に示されている。これらのペプチドは、P2及びP30特異的Ｔ細胞株を刺激するために用いた。P30 株の刺激から得られた結果を図15に示す。MR及びKGから得たP2特異的Ｔ細胞株は、ペプチド又は対応するTNFα２タンパク質の何れかで刺激したときに同様の刺激パターンを示すことが分かる。TNF2-5が優れた抗原候補であることは明らかであり、これらのデータは、観察されたＴ細胞の増殖が抗原特異的であることをさらに支持する。MR及びKGから得たP30特異的Ｔ細胞株をペプチド又はタンパク質の何れかで刺激したときには、刺激パターンには定性的な差異は一般的に存在しなかった（データは示されていない）。HCから得たP30特異的Ｔ細胞株は、好ましくはTNF30-3によって認識され、TNF30-2には僅かに反応した。結論様々な修飾を施された人TNFαタンパク質を作成し、特性を決定した。少なくとも集団の85％に免疫原性を示し得るようにするために、それらは、二つの周知のプロミスカスＴ細胞エピトープP2及びP30を含有するように構築した。 TNF2-4及びTNF30-4は低レベルであったが、全てのタンパク質を発現し、精製することができた。この位置におけるTNFαの変異もリフォールディングを妨害し、溶解度の低いタンパク質がもたらされるように思われる。被修飾TNFα分子には全て、TNFα活性が全く検出できなかった。 10個のタンパク質全てとネイティブTNFαでウサギを免疫した。免疫から2〜3 ヶ月後、ヒトの未修飾TNFαに対して強力に交叉反応する高力価の抗体を全ての血清中に検出することができた。これらの抗体がネイティブTNFαの生物活性を妨害する能力は、二つの異なるインヒトロアッセイ、L929バイオアッセイと固相受容体結合アッセイででテストした。両アッセイは、実質的に同じように、TNF2-1、TNF2-4、TNF30-1、及びTNF 30-4が有意な中和抗体を誘導できないのに対して、TNF2-5は他の構築物に比べて優れていた。TNF30-2及びTNF30-3も同じ程度に効率的に中和抗体を誘導することができ、かなり優れていたTNF30-5の二倍有効であった。幾分驚くべきことは、分子がPBMCの増殖を刺激する能力には有意な差が見られなかったことである。これは、抗原調製物中に分裂促進因子が存在することによるものではないことが実証でき、これらのデータに基いて、P2及びP30に対して選択した部位は全て、各エピトープを提示し得ると結論した。エピトープ特異的なＴ細胞株と挿入されたエピトープと隣接TNFα配列を提示する合成ペプチドを用いた被修飾TNFαタンパク質のテストを用いることによって、応答の特異性をさらに裏付けた。これらの実験から、TNF2-5、TNF30-2、及びTNF30-3（他の構築物に比べて）、最も強力な免疫原候補であることが明確に実証された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年６月２６日（１９９９．６．２６）【補正内容】請求の範囲１．ヒト宿主に投与した後に、野生型ヒトTNFαに対する中和抗体を生じさせしめ得る被修飾ヒトTNFα分子であって、ヒトTNFα分子の少なくとも一つのペプチド断片が、主要Ｔ細胞エピトープを含有することが知られている少なくとも一つのペプチド、又は主要エピトープを含有する前記分子の末端切断型、及び少なくとも一つのTNFαＢ細胞エピトープを含むヒトTNFα分子の一方又は双方の隣接領域によって置換されており、該置換によって、フロントβシートの何れか一つのストランドのアミノ酸配列中、接続ループの何れか一つ、及び／又はバックβ シートのＢ'、I、又はＤストランドの何れか一つに実質的な変化が導入されている被修飾ヒトTNFα分子。２．前記被修飾TNFα分子が実質的にTNFα活性を欠如している、請求項１に記載の被修飾ヒトTNFα分子３．請求項２に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、L929バイオアッセイてテストしたときに、該被修飾ヒトTNFα分子に実質的にTNFα活性がなく、適切な宿主中で該被修飾TNFα分子に対して産生された抗体が、L929バイオアッセイにおいてネイティブTNFαの活性を著しく阻害し、及び／又は前記抗体が、55kD TN Fα受容体1(TNFα-R55)又は75kD TNFα受容体(TNF α-R75)への野生型ヒトTNFα の結合を著しく阻害する修飾ヒトTNFα分子。４．請求項１〜３の何れか１項に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、Ｂ及びＧストランドのβシート溝造が保存されるように、置換がTNFα分子の領域中になされている被修飾ヒトTNFα分子。５．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、バックβシートの全てのストランドのβシート構造が実質的に保存されるように、フロントβシート及び／又は接続ループのストランドを含むTNFα分子の領域中に置換がなされている被修飾ヒトTNFα分子。６．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、バックβシートのＤストランドのセグメントを含むTNFα分子の領域中に置換がなされている被修飾ヒトTNFα分子７．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、置換が少なくともフロントβシートのＨストランドのセグメントと、Ｉストランドへの接続ループのセグメント、好ましくはアミノ酸132〜146とを含む被修飾ヒトTNFα分子。８．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、置換がＨとＩストランドのセグメント、及び接続ループ全体、好ましくはアミノ酸132〜152を含む被修飾ヒトTNFα分子。９．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、置換がＤストランドのセグメント、少なくともＥストランドのセグメント、及び接続ループ全体好ましくはアミノ酸65〜79又は64〜84を含む被修飾ヒトTNFα分子。１０．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、置換がC'及びＣストランド全体、並びにＤストランドのセグメント、好ましくはアミノ酸40〜60 を含む被修飾ヒトTNFα分子。１１．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、置換が少なくともＥストランドのセグメントと、接続ループの一方又は双方のフロントβシートのセググメント、好ましくはアミノ酸76〜90を含む被修飾ヒトTNFα分子。１２．配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する請求項１〜４に記載の被修飾TNFα。１３．配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有する請求項１〜４に記載の被修飾TNFα。１４．配列番号４又は配列番号１６に示されているアミノ酸配列を有する請求項１〜４に記載の被修飾TNFα分子。１５．配列番号２０に示されているアミノ酸配列を有する請求項１〜４に記載の被修飾TNFα。１６．配列番号１４に示されしているアミノ酸配列を有する請求項１〜４に記載の被條飾TNFα。１７．請求項１〜１１の何れか１項に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、挿入されたＴ細胞エピトープがプロミスカスであり、大部分のヒトＨＬＡクラス IIタイプにおいて免疫原性であることが知られている被修飾ヒトTNFα分子。１８．請求項１７に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、エピトープが破傷風トキソイド、好ましくはエピトープP2及び／又はP30に由来する被修飾ヒトTNFα分子。１９．請求項１〜１８の何れか１項に記載の被修飾ヒトTNFα分子のダイマー、オリゴマー、又はマルチマー。２０．請求項１〜１８の何れか１項に記載の被修飾TNFα分子をコードする単離されたDNA分子。２１．請求項２０に記載の単離されたDNA分子を含むベクター。２２．発現制御配列に作用可能に連結された請求項２０に記載の単離されたDN A分子を含む発現ベクター。２３．請求項２２の発現ベクターで形質転換された宿主。２４．細菌株、酵母、又は他の真菌及び昆虫、哺乳類細胞株又は鳥類細胞株から選択される請求項２３に記載の宿主。２５．請求項１〜１８の何れか１項に記載の被修飾ヒトTNFα分子を作成すろ方法であって、被修飾TNFαを産生し得る適切な条件下で請求項２３又は２４の宿主細胞を増殖させることと、このように産生された被修飾TNFαを回収することとを具備する方法。２６．アジュバント分子、好ましくはGM-CSF、HSP70、又はインターロイキンのような免疫的に活性なアジュバントとの融合タンパク質の形態の請求項１〜１８の何れか１項に記載の被修飾ヒトTNFα分子。２７．免疫原性を示す量の請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載された被修飾ヒトTNFα分子を一以上含み、必要に応じてリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、ムラミルジペプチド、又はiscomのような薬学的に許容されるアジュバントを含む抗TNFαワクチン。２８．リューマチ性関節炎、及びクローン病と潰瘍性犬腸炎を含む炎症性腸疾患、癌、散在性硬化症、糖尿病、乾癬、骨粗鬆症、及び喘息のような慢性炎症性疾患のようなTNFαの放出又は活性によって促進される疾病を予防又は治療するための請求項２７に記載のワクチン。２９．適切な発現ベクターに挿入された請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載の被修飾ヒトTNFα分子をコードする単利されたDNAを含むむ抗TNF αワクチン。３０．請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載の被修飾TNFα分子をコードする非感染性非組込みDNA配列であって、ヒトの中で該DNA配列の発現を制御し得るプロモーター配列に作用可能に連結されたDNA配列を具備する構築物を、該構築物の摂取が起こり、十分な発現が起こってTNFαに対する中和抗体応答を誘導するのに十分な量含有する請求項２９に記載のワクチン。３１．レトロウイルス発現ベクターのようなウイルス発現ベクターを具備する請求項２９に記載のワクチン。３２．経口、又は非経口投与、例えば皮下、筋肉内、若しくは皮内投与のための請求項２７〜３１の何れか１項に記載のワクチン。３３．TNFαの診断テストで請求項２７〜３２の何れか１項に記載のワクチンを投与することによって産生された請求項１〜１８、又は２６の何れか１項に記載の被修飾TNFα分子に対する抗体の使用。３４．抗体がモノクローナル抗体である請求項３３に記載の方法。３５．ヒトの体液にTNFαが存在するどうかをテストする方法であって、請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載の被修飾TNFαに対して産生された抗体を含有する組成物をヒトの体液のサンプルに接触させることと、前記抗体が前記サンプル中のTNFαに結合するかどうかを決定することとを具備する方法。３６．請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載の被修飾TNFα分子に対して産生された抗体を使用することによって、ヒトの体液中のTNFαを検出するためにインビトロイムノアッセイを利用してTNF関連疾病を診断する方法。３７．増幅しなくても、又は増幅してもよく、例えばアビジン／ビオチン手法を用いるサンドイッチアッセイ、ELISAアッセイ、又は均等なアッセイの使用を具備する請求項３５又は３６の方法。３８．その病態生理が少なくとも、部分的にはTNFαの放出又は活性によるものであるヒトの疾病を治療又は予防するための方法であって、必要に応じて適切なアジュバント又は担体分子とともに、有効量の請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載されている被修飾TNFα分子を少なくとも一つ、又は請求項２７〜３２の何れか１項に記載のワクチンをヒトに投与することを具備する方法。３９．その病態生理が少なくとも部分的にTNFα又は活性によるものである疾病の冶療又は予防用の医薬を調製するための請求項１〜１８何れか１項又は請求項２６に記載の被修飾TNFα分子の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 19/02 17/06 19/10 19/02 29/00 19/10 １０１ 29/00 35/00 １０１Ｃ０７Ｋ 14/525 35/00 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/525 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 5/10 Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/53 5/00 Ｂ // Ｃ０７Ｋ 16/24 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者エルスナー、ヘンリックデンマーク国、ディーケー―2700 ブロンショイ、スベンド・ゴンゲスベイ 36 (72)発明者ダルム、イベンデンマーク国、ディーケー―2970 ホルスホルム、オルガスベイ 13

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト宿主に投与した後に、野生型ヒトTNFαに対する中和抗体を生じせしめ得る被修飾ヒトTNFα分子であって、ヒトTNFα分子の少なくとも一つのペプチド断片が、主要Ｔ細胞エピトープを含有することが知られている少なくとも一つのペプチド、又は主要エピトープを含有する前記分子の末端切断型、及び少なくとも一つのTNFαＢ細胞エピトープを含むヒトTNFα分子の一方又は双方の隣接領域によって置換されており、該置換によって、フロントβシートの何れか一つのストランドのアミノ酸配列中、接続ループの何れか一つ、及び／又はバックβシートのＢ'、Ｉ、又はＤストランドの何れか一つに実質的な変化が導入されている被修飾ヒトTNFα分子。２．ヒト宿主に投与した後に、野生型ヒトTNFαに対する中和抗体を生じせしめ得る被修飾ヒトTNFα分子であって、ヒトTNFα分子の少なくとも一つのペプチド断片が、主要Ｔ細胞エピトープを含有することが知られている少なくとも一つのペプチド、又は主要エピトープを含有する前記分子の末端切断型、及び少なくとも一つのTNFαＢ細胞エピトープを含むヒトTNFα分子の一方又は双方の隣接領域によって置換されており、前記被修飾TNFα分子が実質的にTNFα活性を欠いている被修飾ヒトTNFα分子。３．請求項２に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、L929バイオアッセイでテストしたときに、該被修飾ヒトTNFα分子に実質的にTNFα活性がなく、適切な宿主中で該被修飾TNFα分子に対して産生された抗体が、L929バイオアッセイにおいてネイティブTNFαの活性を著しく阻害し、及び／又は前記抗体が、55kD TN Fα受容体１(TNFα-R55)又は75kD TNFα受容体(TNFα-R75)への野生型ヒトTNFα の結合を著しく阻害する修飾ヒトTNFα分子。４．ヒト宿主に投与した後に、野生型ヒトTNFαに対する中和抗体を生じせしめ得る被修飾ヒトTNFα分子であって、ヒトTNFα分子の少なくとも一つのペプチド断片が、主要Ｔ細胞エピトープを含有することが知られている少なくとも一つのペプチド、又は主要エピトープを含有する前記分子の末端切断型、及び少なくとも一つのTNFαＢ細胞エピトープを含むヒトTNFα分子の一方又は双方の隣接領域によって置換されており、Ｂ及びＧストランドのβシート構造を実質的に保存するように、TNFα分子の領域中に置換がなされている被修飾ヒトTNF α分子。５．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、バックβシートの全てのストランドのβシート構造が実質的に保存されるように、フロントβシート及び／又は接続ループのストランドを含むTNFα分子の領域中に置換がなされている被修飾ヒトTNFα分子。６．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、バックβシートのＤストランドのセグメントを含むTNFα分子の領域中に置換がなされている被修飾ヒトTNFα分子。７．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、置換が少なくともフロントβシートのＨストランドのセグメントと、Ｉストランドへの接続ループのセグメント、好ましくはアミノ酸132〜146とを含む被修飾ヒトTNFα分子。８．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、置換がＨとＩストランドのセグメント、及び接続ループ全体、好ましくはアミノ酸132〜152を含む被修飾ヒトTNFα分子。９．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、置換がＤストランドのセグメント、少なくともＥストランドのセグメント、及び接続ループ全体、好ましくはアミノ酸65〜79又は64〜84を含む被修飾ヒトTNFα分子。１０．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、置換がC'及びＣストランド全体、並びにＤストランドのセグメント、好ましくはアミノ酸40〜60 を含む被修飾ヒトTNFα分子。１１．請求項１〜４に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、置換が少なくともＥストランドのセグメントと、接続ループの一方又は双方のフロントβシートのセグメント、好ましくはアミノ酸76〜90を含む被修飾ヒトTNFα分子。１２．配列番号８に示されているアミノ酸配列を有する請求項１〜４に記載の被修飾TNFα。１３．配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有する請求項１〜４に記載の被修飾TNFα。１４．配列番号４又は配列番号１６に示されているアミノ酸配列を有する請求項１〜４に記載の被修飾TNFα分子。１５．配列番号２０に示されているアミノ酸配列を有する請求項１〜４に記載の被修飾TNFα。１６．配列番号１４に示されているアミノ酸配列を有する請求項１〜４に記載の被修飾TNFα。１７．請求項１〜１１の何れか１項に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、挿入されたＴ細胞エピトープがプロミスカスであり、大部分のヒトHLAクラスII タイプにおいて免疫原性であることが知られている被修飾ヒトTNFα分子。１８．請求項１７に記載の被修飾ヒトTNFα分子であって、エピトープが破傷風トキソイド、好ましくはエピトープP2及び／又はP30に由来する被修飾ヒトTNF α分子。１９．請求項１〜１８の何れか１項に記載の被修飾ヒトTNFα分子のダイマー、オリゴマー、又はマルチマー。２０．請求項１〜１８の何れか１項に記載の被修飾TNFα分子をコードする単離されたDNA分子。２１．請求項２０に記載の単離されたDNA分子を含むベクター。２２．発現制御配列に作用可能に連結された請求項２０に記載の単離されたDN A分子を含む発現ベクター。２３．請求項２２の発現ベクターで形質転換された宿主。２４．細菌株、酵母、又は他の真菌及び昆虫、哺乳類細胞株又は鳥類細胞株から選択される請求項２３に記載の宿主。２５．請求項１〜１８の何れか１項に記載の被修飾ヒトTNFα分子を作成する方法であって、被修飾TNFαを産生し得る適切な条件下で請求項２３の宿主細胞を増殖させることと、このように産生された被修飾TNFαを回収することとを具備する方法。２６．アジュバント分子、好ましくはGM-CSF、HSP70、又はインターロイキンのような免疫的に活性なアジュバントとの融合タンパク質の形態の請求項１〜１８の何れか１項に記載の被修飾ヒトTNFα分子。２７．免疫原性を示す量の請求項１〜１８の何れか１項に記載された被修飾ヒトTNFα分子を一以上含み、必要に応じてリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、ムラミルジペプチド、又はiscomのような薬学的に許容されるアジュバントを含む抗TNFαワクチン。２８．リューマチ性関節炎、及びクローン病と潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、癌、散在性硬化症、糖尿病、乾癬、骨粗鬆症、及び喘息のような慢性炎症性疾患のようなTNFαの放出又は活性によって促進される疾病を予防又は治療するための請求項２７に記載のワクチン。２９．適切な発現ベクターに挿入された請求項１〜１８の何れか１項に記載の被修飾ヒトTNFα分子をコードする単離されたDNAを含む抗TNFαワクチン。３０．請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載の被修飾TNFα分子をコードする非感染性非組込みDNA配列であって、ヒトの中で該DNA配列の発現を制御し得るプロモーター配列に作用可能に連結されたDNA配列を具備する構築物を、該構築物の摂取が起こり、十分な発現が起こってTNFαに対する中和抗体応答を誘導するのに十分な量含有する請求項２９に記載のワクチン。３１．レトロウイルス発現ベクターのようなウイルス発現ベクターを具備する請求項２９に記載のワクチン。３２．経口、又は非経口投与、例えば皮下、筋肉内、若しくは皮内投与のための請求項２７〜３１の何れか１項に記載のワクチン。３３．TNFαの診断テストで請求項２７〜３２の何れか１項に記載のワクチンを投与することによって産生された請求項１〜１８、又は２６の何れか１項に記載の被修飾TNFα分子に対する抗体の使用。３４．抗体がモノクローナル抗体である請求項３３に記載の方法。３５．ヒトの体液にTNFαが存在するどうかをテストする方法であって、請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載の被修飾TNFαに対して産生された抗体を含有する組成物をヒトの体液のサンプルに接触させることと、前記抗体が前記サンプル中のTNFαに結合するかどうかを決定することとを具備する方法。３６．請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載の被修飾TNFα分子に対して産生された抗体を使用することによって、ヒトの体液中のTNFαを検出するためにインビトロイムノアッセイを利用してTNF関連疾病を診断する方法。３７．増幅しなくても、又は増幅してもよく、例えばアビジン／ビオチン手法を用いるサンドイッチアッセイ、ELISAアッセイ、又は均等なアッセイの使用を具備する請求項３５又は３６の方法。３８．その病態生理が少なくとも部分的にはTNFαの放出又は活性によるものであるヒトの疾病を治療又は予防するための方法であって、必要に応じて適切なアジュバント又は担体分子とともに、有効量の請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載されている被修飾TNFα分子を少なくとも一つ、又は請求項２７〜３２の何れか１項に記載のワクチンをヒトに投与することを具備する方法。３９．その病態生理が少なくとも部分的にTNFα又は活性によるものである疾病の治療又は予防用の医薬を調製するための請求項１〜１８の何れか１項又は請求項２６に記載の被修飾TNFα分子の使用。