KR20100084623A - 골관절염 치료용 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 척추동물의 골관절염 치료용 백신으로서, IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 포함하고, 상기 IL-1β 및 임의적인 TNF-α, 또는 그 유도체와 연합된, 상기 백신이 상기 척추동물에서 상기 척추동물의 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 자가 분자에 대한 면역 반응을 유발하도록 상기 척추동물에 대해 비자가인 부분을 포함하는 백신에 관한 것이다.

Description

골관절염 치료용 백신{VACCINE FOR THE TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS}

본 발명은 척추동물의 골관절염 치료용 백신, 이러한 백신의 제조를 위한 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인의 용도 및 상기 백신을 투여하는 것에 의한 척추동물의 골관절염 치료법에 관한 것이다.

골관절염(OA)은 고령의 인간 및 동물에서 주로 발생하는 비염증성 퇴행성 관절 질환으로서 관절 연골의 퇴행, 관절 변두리 뼈의 비대 및 활막의 변화를 특징으로 한다. 이 질환은 다중 기원으로부터 발생할 수도 있지만, 기계적 힘과 생화학적 힘 양자가 그 양상 및 진행의 주된 원인인 것으로 일반적으로 인식되고 있다. 이 질환은, 특히 장시간의 활동 후에 통증 및 경직을 동반한다. 이 질환은 인간 및 동물, 특히 개와 말에게 만연되어 있기 때문에, 인간은 물론 동물의 보건에 있어서 중대한 이슈가 되고 있다.

경도의 골관절염 환자는 아세트아미노펜과 같은 진통제만으로 치료할 수 있다. 그러나 다수의 환자들에게 비스테로이드성 소염제(NSAID)가 투여되고 있다. 이러한 NSAID는 통증만 완화시킬 뿐이며, 위궤양, 일광 노출에 대한 민감성, 신장 장애, 신경과민 및 우울증 유발을 비롯한 잠재적으로 위험한 부작용을 갖는다. 일부 환자들은 골관절염 진행을 늦추기 위해 관절에 직접 코티코스테로이드를 주사하는 치료를 받는다. 그러나 이 치료법은 코티코스테로이드의 잠재적 유해 부작용을 고려할 때 바람직하지 않다. 문헌에는 또한, 골관절염 연골 병변의 특징인 기질 분해 증가를 매개하는 데 관여하는 것으로 생각되는 사이토카인에 대한 길항제를 사용한 동소 치료(in situ treatment), 즉 골관절염의 관절에서의 치료로 골관절염을 치료하는 방법이 제안되어 있다. 이것은, 예를 들어 문헌[Pelletier (Arthritis & Rheumatism, Vol. 40, No. 6, June 1997, pp 1012-1019)] 및 문헌[Fernandes (Biorheology 39, 2002, 237-246)]에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 실험적으로 유도된 병변의 진행을 저하시킬 수 있는 인터루킨 수용체 길항제(IL-Ra) 유전자의 관절내 주사에 기초한 유전자 치료법을 개시한다. 그러나, 긍정적 효과는 지속 기간이 매우 짧고 치료법으로서의 적용성은 아직 입증되지 않았다. 또한, 사이토카인 자체, 특히 인터루킨 6에 대해 유도된 단일클론 항체의 동소 투여가 유럽 특허 출원 EP 1 715 891(Warner-Lambert Company, 2006년 공개)에 개시되어 있다. 이 치료법의 단점은 고용량이 요구됨으로 인해 치료가 본질적으로 고비용이라는 점, 국소(침습적) 투여라는 점 및 효과의 지속 기간이 짧다는 점이다.

본 발명의 목적은 알려진 골관절염 치료법의 단점을 극복하거나 그러한 단점이 적어도 많이 감소된 골관절염 치료법을 제공하는 것이다. 이러한 점에서의 치료법은 골관절염을 예방하거나, 임상 징후를 경감하거나, 질환을 완화 또는 치유하거나, 발병 시작 후 질환의 진행을 억제하는 치료법을 포함할 수 있다.

상기 목적을 위해, IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 포함하고, 상기 IL-1β 및 TNF-α 또는 그 유도체와 연합된, 백신이 척추동물에서 IL-1β 및 TNF-α 자가 분자에 대한 면역 반응을 유발하도록 상기 척추동물에 대해 비자가인 부분을 포함하는 상기 서문에 따른 백신을 개발하였다. 임의적으로 상기 백신은 상기 비자가 부분과 연합된 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 담지하는 매체를 포함한다.

이러한 점에서 백신은 척추동물, 즉, 관절을 가진 임의의 살아있는 동물, 예컨대 어류, 양서류, 파충류, 조류(鳥類), 및 인간을 비롯한 포유동물(이하, "동물"이란 용어는 임의의 척추동물을 지칭하는 것으로 사용됨)에 적용하기에 적합한 구성물이다. 일반적으로, 백신은 약독화 또는 사 미생물 및 그 서브유닛, 또는 유기체의 대사산물과 같은 임의의 다른 물질 등의 1종 이상의 항원을 포함한다. 백신을 동물에게 투여하면, 항원(들)에 대한 면역 반응이 유발되며, 이 반응은 질환 또는 질병의 예방, 개선 또는 치료를 보조한다. 일반적으로, 항원(들)은, 흔히 "약학적으로 허용되는 담체"라 칭하는, 항원을 담지하기 위한 매체와 혼합된다. 이러한 담체는 척추동물에 생리학적 적합성을 나타내는 임의의 용매, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등일 수 있다. 이러한 담체 중 몇 가지 예로 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 박테리아 배양액, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합을 들 수 있다. 이들은 의도된 투여 방식에 따라 액체, 반고체 및 고체 제형을 제공할 수 있다. 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, 담체의 존재는 백신의 유효성에 필수적이지 않지만, 항원의 투여량을 현저히 줄이고 투여 방법을 크게 단순화할 수 있다.

백신은 흔히 보조제 또는 면역보조제(adjuvant)라 불리는 비특이적 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다. 원칙적으로, 면역학적 사건의 캐스케이드의 특정 과정을 촉진 또는 증폭시킴으로써 궁극적으로 더 우수한 면역 반응(즉, 항원에 대한 종합적인 신체 반응, 특히 림프구에 의해 매개되고, 일반적으로 특정 항체 또는 이전에 감작화된 림프구에 의한 항원의 인식을 수반하는 반응)을 유도할 수 있는 각각의 물질이 면역보조제로서 정의될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 상기 특정 과정의 발생에 요구되는 것은 아니지만 상기 과정을 촉진하거나 증폭시킨다.

본 발명의 백신은 IL-1β(인터루킨 1β) 및 TNF-α(종양 괴사 인자 α) 사이토카인을 사용하는 것에 기반을 두고 있다. 사이토카인은 일반적으로 항원과의 접촉시 세포 집단에 의해 방출되는 비항체 단백질로서 면역 반응의 생성에 있어서 세포내 매개체로서 작용한다. 인터루킨 1β는 인터루킨류의 하위 그룹, 즉, 주로 대식 세포 및 T 림프구에 의해 분비되며 림프구 및 조혈모 세포의 증식 및 분화를 유도하는 단백질류이다. 이것은 B 세포 및 T 세포의 활성화를 비롯한 광범위한 면역 및 염증 반응을 매개하는 강력한 면역 조절인자이다. TNF-α는 "종양 괴사 인자" 패밀리의 가장 잘 알려진 구성원으로서, 내독소 존재 하에 특히 대식 세포에 의해 생성되며 특히 암성 종양을 공격하여 파괴할 수 있음이 실험적으로 입증된 단백질을 대표하는 패밀리이다. 본 발명의 경우, 백신이 IL-1β 및 TNF-α 또는 그 유도체를 포함하고, 이것과 연합된, 척추동물에 대해 비자가인 부분을 포함한다. 이러한 점에서 비자가란 치료되는 동물에서 면역원성인 것, 즉, 면역 반응을 유발할 수 있는 것을 의미한다. 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, 다른 분자와 연합된 비자가 부분을 사용함으로써, 이 다른 분자가 동물에 대해 자가인 경우에도 이 다른 분자에 대한 면역 반응을 제공할 수 있다. 사이토카인과 연합된 비자가 부분(또는 복수의 부분들)은 동물에 대해 이종성인 IL-1β 및 TNF-α를 선택함으로써 간단히 제공될 수 있다. 여기서 이종성이란 (동종성과는 반대로) 동일 종으로부터 유래된 것이 아님을 의미한다. 이 경우, 사이토카인은 치료되는 동물에 대해 비자가인 부분을 그 분자 구조 내에 본질적으로 포함하고 있다. 대안으로, 예를 들어 치료되는 동물에 대해 동종성이지만 돌연변이체이거나 재조합 기법에 의해 이종 단백질 부분과 함께 제공되는 사이토카인을 선택할 수도 있다. 사이토카인 또는 그 유도체와 연합된 비자가 부분을 제공하는 다른 방법으로는, 예를 들어 하나 이상의 비자가 분자, 비자가 구조물, 화합물, 또는 단지 임의의 비자가 구성체를 사이토카인에 물리적 또는 화학적으로 결합시키는 것이다. 어느 경우에나, 면역원성 구성체가 자가 사이토카인(즉, IL-1β 및 TNF-α)에 대한 면역 반응을 유발할 수 있도록 사이토카인 또는 그 유도체와 비자가 부분 사이에 기능적인(작동 가능한) 결합이 존재하는 면역원성 구성체가 제공된다. 상기에 언급한 바와 같이, 예를 들어 자가 단백질을 대형 이종 면역원성 담체 단백질에 화학적으로 결합하는 것(US 4,161,519), 자가 단백질과 이종 담체 단백질 간의 융합 구성체를 제조하는 것(WO 86/07383), 또는 하나의 단일 이종 T 헬퍼 에피토프를 자가 단백질에 치환하는 것(WO 95/05849)에 의해, 자가 단백질(자기 단백질이라고도 함)에 대한 백신을 개발하는 기법은 20세기 80년대 중반 이래로 공지되어 있다. 이러한 경우, 면역원성 구성체의 비자가 부분은 자가관용성의 파괴를 초래할 수 있는 T 헬퍼 림프구에 대한 에피토프를 제공하는 역할을 한다. 본 발명에 있어서 IL-1β 및/또는 TNF-α의 유도체는 출발 사이토카인보다 작거나 크지만, 이 출발 사이토카인에 대해 동종성인 하나 이상의 부분을 또한 포함하는 분자를 의미하는 것으로서, 상기 부분 또는 부분들은 이들 사이토카인의 항원성 결정인자를 구성한다. 이러한 부분은 하나의 단일 에피토프 정도로 작을 수 있다. 하나의 단일 에피토프만을 사용하는 것은 자가 IL-1β 및 TNF-α에 대해 매우 특이적인 항체, 실제로 단일클론 항체를 생성할 수 있다는 이점을 갖는다. 이것은 다른 사이토카인과의 교차 반응의 위험을 줄이거나 심지어 완전히 방지한다. 이러한 원리 자체는 공지되어 있고, 예를 들어, 사이토카인의 면역원성 펩티드(즉, 면역 반응을 유발할 수 있는 펩티드)를 명시적으로 개시하는 WO 2005/084198, WO 03/084979 및 EP 218531에 기재되어 있다. 백신에 두 사이토카인에 대한 유도체를 동시에 사용할 수도 있으나, 1종의 사이토카인은 천연 형태로 사용하고 다른 1종의 사이토카인은 천연 형태의 유도체로 사용할 수도 있다.

본 출원인은 놀랍게도 본 발명에 따른 백신을 투여하는 것에 의해 골관절염을 성공적으로 치료할 수 있음을 발견하였다. 특히, 골관절염이 발병하기 전에 동물에게 백신접종을 할 경우 그 동물에게 실제로 골관절염을 발병하였을 때 임상 징후가 적게 나타난다는 것을 발견하였다. 이 질환의 임상 징후가 임의의 심각한 만성 부작용 없이 억제된다. 이러한 긍정적 결과를 고려할 때, 예측과는 달리, 적정량의 유도된 IL-1β 항체와, 적용 가능하다면, TNF-α 항체가 골관절염 관절에 도달한다는 것이 분명하다. 사이토카인 길항제가 골관절염 관절에 존재할 때 골관절염 진행이 억제된다는 사실을 고려할 때(상기에 언급한 Pelletier, Fernandes 및 Warner-Lambert Company의 문헌 참조), 본 발명에 따른 백신으로 치료된 동물은 골관절염의 진행에 대한 감수성이 적다. 골관절염은 진행성 퇴행성 질환이기 때문에, 골관절염 발병이 시작된 후 본 발명에 따른 백신으로 동물을 치료할 때에도 상응하는 결과가 얻어지는 것으로 이해되어야 한다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 백신을 사용한 백신접종은 동물에 있어서 자가 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α의 완전한 기능적 파괴를 초래하지는 않지만, 특히 관절 내에서의 이들 사이토카인의 농도를 정상 수준으로 줄인다는 것을 가정하면, 중증의 만성 부작용이 예상외로 없는 점이 설명될 수 있다.

문헌[Goldring (Clinical Orthopaedics and Related Research, No 427S, pp S27-S36)]은 IL-1 및 TNF-α 등의 향염증성 사이토카인이 연골 기질의 진행성 분해와 관절 기능의 상실을 초래하는 연골 세포 기능의 조절 장애에 기여한다는 점이 시사된다고 언급한다. 그러나, 상기 문헌에서는 또한 Clements에 의한 최근의 연구[Arthritis & Rheumatism, Vol. 48, No. 12, pp 3452- 3463, 2003]가 IL-1β 또는 IL-1β 전환 효소의 유전자 결실이 무릎 골관절염의 발달을 더 가속화한다는 것을 입증하였다고 언급한다. 따라서, 선행 기술은 골관절염에 있어서의 상기 사이토카인의 역할에 대해 확신을 갖고 있지 않다. 심지어 이들 사이토카인이 골관절염을 촉진하는지 억제하는지도 알고 있지 않다. 이것은, 예를 들어 골관절염의 발병에 있어서의 사이토카인의 역할을 평가하기 위한 연구 프로그램을 기술하는 최근의 연구 논문에 의해 확인된다[Baggio, Veterinary Immunology and Immunopathology 107 (2005) 27-39]. 이 연구 논문은, IL-1과 TNF가 둘 다 골관절염을 촉진하는 것으로 보고되었지만, 이들 사이토카인의 파괴가 골관절염을 치료하는 데 적합한지에 대해서는 여전히 논의의 여지가 있음을 명시적으로 언급한다. 문헌[Wildbaum (Immunity, Vol. 19, 679-688, November, 2003]은 또한 중화 TNF-α가 염증성 질환인 류마티스성 관절염은 억제하지만 골관절염은 억제하지 못한다고 보고한다. 따라서, 전문 의료인이 골관절염 치료법을 검토할 때 IL-1β 및 임의적인 TNF-α의 억제를 확신을 가지고 선택하지는 않을 것이다. 게다가, 사이토카인 길항제를 사용한 동소 치료법이 골관절염에 도움이 될 수 있는 경우에도 전신적 방법은 성공적이지 못하다는 것이 선행 기술로부터 명백히 알려져 있다(EP 1 715 891; 실시예 3 참조). 이것은 혈액-관절 장벽으로 인해 관절에의 도달이 매우 어렵다는 일반적 이해와 일치한다[Bas et al., British Journal of Rheumatology, 1996; 35(6): 548-552; 및 Kushner et al., Arthritis Rheum, 1971; 14(5): 560-570].

또한, 급성 염증성 질환의 치료에 관한 많은 참고 문헌들이 알려져 있고, 이 문헌들에서는 자가 IL-1 및/또는 TNF-α에 대한 면역 반응을 유발하기 위해 IL-1 및/또는 TNF-α를 포함하는 백신을 사용하여 질환을 치료할 수 있음을 보여주었다. 이러한 참고 문헌의 대표적 예로 스위스의 Cytos Biotechnology AG에 양도된 WO 2007/039552가 있다. 골관절염과 같은 질환과는 달리 염증에 있어서의 사이토카인의 역할은 매우 분명한데, 즉, 하향 조절이 경감을 제공하고 따라서 이것이 치료에 유효하다. 상기 참고 문헌에서는, 실시예의 형태로 증거를 개시하지 않은 채, IL-1β 및 TNF-α가 이 질환에서 역할을 할 수 있기 때문에, 동일한 치료가 골관절염에도 유효할 것이라고 종종 시사하거나 심지어 명시하고 있다. 그러나, 상기에 설명한 바와 같이, 골관절염은 비염증성 질환이며, 따라서, 염증성 질환과는 완전히 다르다. IL-1β 및/또는 TNF-α와 같은 사이토카인의 역할은 아직 명확하지가 않고 모호한 부분이 있는 것으로 생각된다. 따라서, 골관절염 분야의 전문 의료인에게 있어서 이같은 참고 문헌은, 전신 투여되는 면역원성 IL-1β 및 임의적으로 면역원성 TNF-α가 골관절염의 적절한 치료를 제공할 것임을 예측하는 것은 말할 것도 없이, 면역원성 IL-1β 및/또는 TNF-α를 사용한 골관절염 치료의 합리적인 성공 기회를 예측하는 데 합당한 기반을 제공하지 못한다.

요약하면, 골관절염에 대한 입수 가능한 지식에 기초해서는, 당업자가 골관절염 치료를 위해 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α에 대한 백신을 개발하려고 하지 않는 것에는 2 가지의 중요한 이유가 있다: 첫째, 선행 기술은 골관절염에서의 사이토카인, 특히 IL-1β 및 TNF-α의 역할이 무엇인지 명확하게 교시하고 있지 않으며, 둘째, 관절 자체에서의 사이토카인의 역할을 조절하기 위해 사이토카인 길항제를 사용하는 전신적 방법은 동일한 길항제에 기초한 동소 치료법이 성공적인 것으로 입증된 경우에도 성공적이지 못한 것으로 입증되었기 때문이다. 따라서, 이것은, 매우 불이익이 될 수 있는 이들 사이토카인에 대한 전신 공격이 발생할 수 있음을 의미하기 때문에, 당업자는 현재 입수 가능한 지식에 기초해서는 골관절염 치료를 위해 자가 사이토카인 IL-1β 및/또는 TNF-α에 대한 백신을 개발할 생각은 하지 못할 것이다. 예를 들어 인터루킨-1은 미생물 감염에 대한 면역 반응에 관여하고, 골수 세포의 수를 증가시키고, (구강) 상처 치유에 있어서 중요한 역할을 하고, 항당뇨병 효과를 나타내며, 임신 말기의 세포내 사건을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 사이토카인의 봉쇄는 일반적으로 바람직하지 않은 것으로 간주된다.

일 실시형태에서, IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체는 치료되는 척추동물에 대해 동종성이다. 여기서 동종성이란, 상기에 정의된 이종성과는 반대의 의미로, 동일한 종으로부터 유래되었음을 의미한다. 예측과는 달리, 본 발명에서는 동일한 종으로부터 유래된 항원 사이토카인이 치료된 척추동물에서 더 높은 항체 역가를 유도한다는 것을 발견하였다.

또 다른 실시형태에서, 척추동물에 대해 비자가인 부분은 미생물로부터 유래된 항원성 결정인자를 포함한다. 여기서 미생물(microorganism)이란, 특히 박테리아, 효모, 사상균, 원생동물, 조류(藻類), 리케차, 미생물(microbe) 또는 바이러스에 속하는 미소 또는 극미소 크기의 유기체를 의미한다. 이러한 항원성 결정인자, 즉 림프구 또는 분비된 항체 상의 항원 특이적 막 수용체에 결합하는 면역학적 활성 부위를 제공하는 에피토프를 포함시키는 것에 의해, 척추동물의 자가 사이토카인에 대한 고항체 역가를 제공할 수 있는 것으로 생각된다.

또 다른 실시형태에서, 척추동물에 대해 비자가인 부분은 면역보조제를 포함한다. 상기에 기재한 바와 같이, 면역보조제는 원칙적으로 임의의 비특이적 면역자극제일 수 있다. 면역보조제 부분은 임의의 화학적 또는 물리적 결합에 의해 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체에 연합될 수 있으며, 또는 면역보조제 부분이 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체와 기능적으로 연결되어 있는 한, 즉, 면역보조제 부분이 이러한 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체에 대한 면역 반응, 따라서, 또한, 척추동물의 자가 IL-1β 및 TNF-α의 상응하는 항원성 결정인자에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 한 다른 방식으로 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체에 연합될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 이것이 유도하는 면역학적 사건에 따라 분류될 수 있다. 특히 ISCOM(면역자극 복합체), 사포닌(또는 QuilA와 같은 그 분획 및 유도체), 수산화알루미늄, 리포솜, 코클레이트(cochleate), 폴리락트산/글리콜산을 포함하는 제1 부류는 항원 흡수, 수송 및 APC(항원 제시 세포)에 의한 항원 제시를 촉진한다. 오일 에멀션, 겔, 중합체 미소구, 비이온성 블록 공중합체 및 가장 바람직하게는 또한 수산화알루미늄을 포함하는 제2 부류는 데포 효과를 제공한다. 특히 CpG 풍부 모티프, 모노포스포릴 지질 A, 마이코박테리아(뮤라밀 디펩티드), 효모 추출물, 콜레라 독소를 포함하는 제3 부류는 보존된 미생물 구조, 소위 시그널 0으로 정의되는 병원균 관련 미생물 패턴(pathogen associated microbial pattern: PAMP)의 인식에 기초한다. 특히 오일 에멀션 표면 활성제, 수산화알루미늄, 하이폭시아(hypoxia)를 포함하는 제4 부류는 위험한 것과 유해한 것을 구별하는(자가 및 비자가와 동일할 필요는 없음) 면역계의 능력을 촉진하는 것에 기초한다. 특히 사이토카인을 포함하는 제5 부류는 APC에 대한 동시 자극 분자 시그널 2의 상향 조절에 기초한다. 면역보조제는 적절한 면역 반응을 제공하는 것을 돕는다. 따라서, 사이토카인 또는 그 유도체의 비자가 부분이 이미 자가관용성을 파괴할 수 있는 점은 덜 중요하다. 따라서, 면역보조제는 항원 선택에 더 많은 자유를 제공한다. 특히, 예를 들어 사포닌, 그 분획 및 수중유 에멀션(예를 들어, 리포솜)으로 구현되는 제1 부류로부터의 면역보조제를 사용할 때, 우수한 결과가 얻어졌다.

또 다른 실시형태에서, IL-1β 및 TNF-α 사이토카인 또는 그 유도체는 척추동물의 자가 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인와 비교하여 감소된 생물학적 활성을 갖는다. 감소된 생물학적 활성, 즉, 살아있는 동물 또는 그 조직에 대한 물질의 감소된 효과는 백신 투여시 급성 부작용의 위험을 줄인다. 사이토카인의 생물학적 활성이 감소되지 않을 경우, 구토, 쇼크, 배앓이 등과 같은 급성 부작용이 발생할 수 있다. 생물학적 활성의 감소는 박테리아 독소를 변성독소로 전환하는 데 사용되는 것과 유사한 화학적 포름알데히드 치료 등의 다양한 사이토카인 불활성화법에 의해 얻을 수 있다. 이러한 방법은 백신 기술 분야에 일반적으로 알려져 있다. 대안적 방법으로, 감소된 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 사이토카인을 제조할 수 있다. 이 역시 당업계에 일반적으로 알려져 있다. 감소된 생물학적 활성을 갖는 사이토카인을 (실질적인 생물학적 활성이 남아 있더라도) 생물학적 불활성 사이토카인이라고 칭하기도 한다.

본 발명은 또한 척추동물의 골관절염 치료를 위한 백신을 제조하기 위한 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인의 용도 및 치료법 그 자체에 관한 것이다. 백신은 백신 기술 분야에서 사용되는 임의의 통상적인 경로에 의해, 특히 근육내 경로, 피하 경로, 피내 경로 또는 점막하 경로에 의해, 또는 예를 들어 주사 가능한 현탁액의 형태로 정맥내 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여는 단일 용량으로 또는 일정한 간격을 두어 1회 이상 반복 투여되는 용량으로 실시될 수 있다. 적절한 용량은 특히 치료 대상 개체의 체중에 따라 달라질 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예와 관련하여 보다 상세히 설명한다.

1. 재료 및 방법

A. 개에서의 자가 IL-1β 및 TNF-α에 대한 항체의 유도

재조합 개(Ca) 및 말(Eq) 단백질:

각각 개 또는 말의 혈액으로부터 추출한 말초혈 림프구(PBL)로부터의 단리된 RNA를 사용한 표준 분자생물학 기법을 이용하여 CaIL-1β, CaTNF-α, EqIL-1β 및 EqTNF-α를 클로닝하였다. Ca 분자의 3' 말단을 개 디스템퍼(Distemper) 바이러스 융합 단백질(CDV-F)의 유래의 최소(17 aa) T 세포 에피토프에 유전적으로 융합시켰다[Ghosh et al. (2001) Immunology 104 pp. 58-66]. IL-1β 및 TNF-α를 코딩하는 cDNA 단편을, (정제를 위해) 5' 말단이 His 태그와 프레임 내에 있도록 pET 벡터로 최종적으로 결찰시켰다. 말 IL-1β 및 TNF-α에는 CDV 태그를 결찰시키지 않았다. 모든 단백질을 이. 콜라이(E. coli)에 의해 발현시키고, His 태그로 정제하고, LPS 함량을 조사하였다. 항원으로서 사용된 단백질은 모두 LPS 함량이 20 U/ml 미만이었다. 서열 번호 1은 최소 CDV-F 태깅 CaIL-1β에 대한 DNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 CDV F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)을 나타낸다. 서열 번호 2는 최소 CDV-F 태깅 CaIL-1β 단백질 자체를 나타낸다. 서열 번호 3은 최소 CDV-F 태깅 CaTNFα에 대한 DNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 535∼588은 CDV F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타낸다. 서열 번호 4는 최소 CDV-F 태깅 CaTNFα 단백질 자체를 나타낸다. 서열 번호 5는 말 IL-1β에 대한 DNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타낸다. 서열 번호 6은 말 IL-1β 단백질 자체를 나타낸다. 서열 번호 7은 말 TNFα에 대한 DNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타낸다. 서열 번호 8은 말 TNFα 단백질 자체를 나타낸다.

가능한 전신 유해 반응을 방지하기 위해, 부위 지정 돌연변이 유발법을 이용하여, 상기 단락에서 언급된 이러한 야생형 분자 다음에 일련의 생물학적 불활성 돌연변이체(mt) 분자를 생성하였다(주: 본 명세서에서, 생물학적 활성의 야생형 분자를 "wt"로 언급하거나 이것으로 표시하기도 하고, 생물학적 불활성 또는 생물학적 활성이 "적은" 돌연변이체 분자를 "mt"로 언급하거나 이것으로 표시하기도 하며, 이러한 언급 또는 표시가 없을 경우 야생형 형태임을 의미함). 이러한 돌연변이체를 개 디스템퍼 바이러스 융합 단백질(CDV-F)[Ghosh et al. (2001) Immunology 104 pp. 58-66] 유래의 최소(17 aa) 또는 최대(32 aa) T 세포 에피토프의 3' 말단 및 개 파보 바이러스(CPV)[Rimmelzwaan et al. (1990) J. Gen. Virology 71 pp. 2321-2329] 유래의 최대(35 aa) T 세포 에피토프의 5' 말단(His 태그 뒤)에 유전자 조작으로 융합시켰다. 돌연변이 부위는 인간 IL-1β 및 TNF-α에 대한 입수 가능한 과학 문헌에 기초하여 선택하였다: IL-1β 점 돌연변이에 대해서는 문헌[Simon et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, pp. 9771-9779]; 및 문헌[Evans et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, pp. 11477-11483], TNF-α 점 돌연변이에 대해서는 문헌[Zhang et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, pp. 24069-24075] 참조. 1개 TNF-α 돌연변이체(12번 돌연변이체 12번, 하기 참조)는 자발적 돌연변이와 조합된 특정 점 돌연변이의 유도체이다. 모든 단백질을 이. 콜라이에 의해 발현시키고, His 태그로 정제하고, LPS 함량을 조사하였다. 항원으로서 사용된 테스트 단백질은 모두 LPS 함량이 20 U/ml 미만이었다. 18종의 생물학적 불활성 돌연변이체를 제조하였다. 이러한 돌연변이체를 코딩하는 DNA를 이하에 기재한다.

1번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 H30G CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 이 DNA의 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 163C>G 및 164A>G는 H30G 돌연변이를 나타낸다.

2번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 K92G CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼72는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 529∼582는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 346A>G 및 347A>G는 K92G 돌연변이를 나타낸다.

3번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 H30G + K92G CaIL-1β 이중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 163C>G 및 164A>G는 H30G 돌연변이를 나타내고, 뉴클레오티드 349A>G 및 350A>G는 K92G 돌연변이를 나타낸다.

4번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 C7S CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 98G>C는 C7S 돌연변이를 나타낸다.

5번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 K8E CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 100A>G 및 102G>A는 K8E 돌연변이를 나타낸다.

6번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 L9S CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 104T>C는 L9S 돌연변이를 나타낸다.

7번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 C7S + K8E + L9S CaIL-1β 삼중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 98G>C는 C7S 돌연변이를 나타내고, 뉴클레오티드 100A>G 및 102G>A는 K8E 돌연변이를 나타내며, 뉴클레오티드 104T>C는 L9S 돌연변이를 나타낸다.

8번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 C7S CaIL- 1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 76∼171은 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 628∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 194G>C는 C7S 돌연변이를 나타낸다.

9번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 K8E CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 76∼171은 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 628∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 196A>G 및 198G>A는 K8E 돌연변이를 나타낸다.

10번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 L9S CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 76∼171은 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 628∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 200T>C는 L9S 돌연변이를 나타낸다.

11번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 C7S + K8E + L9S CaIL-1β 삼중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼76은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 76∼171은 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 628∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 194G>C는 C7S 돌연변이를 나타내며, 뉴클레오티드 196A>G 및 198G>A는 K8E 돌연변이를 나타내고, 뉴클레오티드 200T>C는 L9S 돌연변이를 나타낸다.

12번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 K8D + L9S + Q10del CaIL-1β 삼중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼76은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 76∼171은 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 625∼723은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 196A>G 및 198G>T는 K8D 돌연변이를 나타내며, 뉴클레오티드 200T>C는 L9S 돌연변이를 나타내고, 야생형 서열에 비해 10번 아미노산이 결실되었다(Q10del).

13번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 Y87S CaTNF-α 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 535∼588은 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 323A>C는 Y87S 돌연변이를 나타낸다.

14번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 Y119N CaTNF-α 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 535∼588은 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 418T>A는 Y119N 돌연변이를 나타낸다.

15번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 Y87S + Y119N CaTNF-α 이중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 535∼588은 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 323A>C는 Y87S 돌연변이를 나타내고, 뉴클레오티드 418T>A는 Y119N 돌연변이를 나타낸다.

16번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 Y87S CaTNF-α 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 64∼159는 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 631∼729는 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 419A>C는 Y87S 돌연변이를 나타낸다.

17번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 Y119N CaTNF-α 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 64∼159는 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 631∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 514T>A는 Y119N 돌연변이를 나타낸다.

18번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 Y87S + Y119N CaTNF-α 이중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 64∼159는 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 631∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 419A>C는 Y87S 돌연변이를 나타내며, 뉴클레오티드 514T>A는 Y119N 돌연변이를 나타낸다.

백신 보조제:

사용된 보조제는 QuilA(0.01 M 인산염 완충 식염수(PBS로 약칭함) 중 250 ㎍/ml, "식염수"라 칭하기도 함), 매트릭스 C(0.01 M PBS 중 125 ㎍/ml) 및 마이크로솔(25% 수중유 에멀션)이다. QuilA는 남아메리카 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)(장미과)의 나무껍질로부터 분리된 잘 알려진 사포니 보조제이다. 이것은 덴마크 칼브헤이브 소재의 Biolang 또는 독일 칼스루에 소재의 Roth로부터 입수할 수 있다. 매트릭스 C(면역자극 복합체 또는 ISCOM)는 사포닌, 콜레스테롤 및 인지질(포스파티딜콜린)을 함유하는 백신 보조제로서, 일반적으로 직경 40 nm의 케이지형 구조를 형성한다. 이것은 오스트레일리아 멜버른 소재의 CSL 또는 스웨덴 웁살라 소재의 Isconova로부터 입수할 수 있다. 마이크로솔은, Acros Organics로부터 입수 가능한, 1% Tween 80 계면활성제(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레에이트)를 사용하여 안정화시킨, 수중 작은(일반적으로 1 ㎛ 이하) 미네랄 오일 소적(ExxonMobil의 Marcol 52)으로 이루어진 수중유 에멀션이다.

실험 계획:

생물학적 활성(wt) 사이토카인 "단독" 실험의 경우, 그 계획은 다음과 같다. 약 4월령의 일반 품종 비글견으로 구성된 5개 그룹에 하기 표 1에 기재된 제제 1.0 ml를 오른쪽 옆구리로 피하 주사하여 백신접종하였다.

1차 백신접종 후 4주, 8주, 20주 및 24주째 개에게 1.0 ml를 (오른쪽 옆구리에 피하 주사로) 추가 접종하였다. 1차 백신접종 후 T = 0주, 3주, 6주, 9주, 12주, 16주, 20주, 24주, 28주, 32주 및 36주째 혈액 샘플을 수집하였다. 혈청은 항원 특이적 ELISA를 이용하여 CaIL-1β 및 CaTNF-α에 대한 항체 수치를 측정하기 위해(1); 웨스턴 블롯 분석을 위해(2); 중화 항체를 확인하기 위해(3) 사용하였다.

혼합 생물학적 활성(wt)/생물학적 불활성(mt) 사이토카인 실험의 경우, 그 계획은 다음과 같다. 15∼18 주령의 일반 품종 비글견으로 구성된 6개 그룹에 하기 표 1A에 기재된 제제 1.0 ml를 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 백신접종하였다. 이 실험에서는, 1개의 돌연변이체 CaIL-1β 단백질(4번 돌연변이체: 최소 CDV-F 태깅 C7S CaIL-1β 돌연변이체) 및 1개의 돌연변이체 CaTNF-α 단백질(13번 돌연변이체: 최소 CDV-F 태깅 Y87S CaTNF-α 돌연변이체)를 단일 단백질 항원으로서 또는 조합물로 테스트하였다.

1차 백신접종 후 4주, 8주, 11주, 14주 및 16주째 개에게 1.0 ml를 (오른쪽 옆구리에 피하 주사로) 추가 접종하였다. 1차 백신접종 후 T = 0주, 4주, 8주, 11주, 14주, 16주 및 17주째 혈액 샘플을 수집하였다. 혈청은 항원 특이적 ELISA(샌드위치 포획법)를 이용하여 CaIL-1β 및 CaTNF-α에 대한 항체 수치를 측정하는 데 사용하였다.

ELISA 및 웨스턴 블롯 분석:

표준 절차를 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다. 이를 위해, 포획성 다클론 염소 항개 IL-1β 및 포획성 단일클론 마우스 항개 TNF-α 항체를 사용하여 96웰 미량적정 플레이트를 코팅하였다. 그 후, C 말단 His(C-His)-태깅 CaIL-1β 또는 C-His-태깅 CaTNF-α를 플레이트에 첨가한 후, 개 혈청을 계열 희석액을 조제하였다. 다클론 토끼 항개 IgG(H+L) HRP 표지 항체를 사용하여 항IL-1β 또는 항TNF-α 특이적 항체의 결합을 검출하였다.

IL-1β 및 TNF-α의 억제에 대한 생물학적 분석:

억제를 측정하기 위해 IL-1β 및 TNF-α 반응성 NIH-3T3 NFκB 루시퍼라제 리포터 세포주를 사용하였다. 여러 시점으로부터 얻은 혼주(pooled) 개 혈청을 10 ng/ml의 Ca 및 Eq IL-1β 및 TNF-α 단백질과 함께 사전 항온처리하고, 중화(즉, 수용체 결합) 활성의 억제에 대해 테스트하였다. 항체에 의한 IL-1β 또는 TNF-α 활성의 억제는 상대 광 단위(Relative Light Unit: RLU)로 정량하였다.

B. 비글견에서의 요산염 결정 유도성 골관절염 모델의 구축

실험 계획: 본 발명자들은 요산염(urate) 결정 유도성 골관절염 모델을 사용하였다(특히, 문헌[Bonneau et al; Revue Med. Vet., 2005, 156, 4, 179-181] 참조). 일반 품종의 비글견(약 5월령) 4 마리로 구성된 2개 그룹에 0.9% NaCl 1.0 ml(대조군)(대조 그룹) 또는 0.9% NaCl 중 10 mg/ml의 요산염 결정 1.0 ml(골관절염 모델 그룹)을 한쪽 무릎 관절(뒷다리)에 관절내 주사하였다. 용액 1.0 ml의 관절내 주사는 전신 마취 하에 행하였다. 주사 후 T = 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 30 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간째 각각의 개별 개에 대해 일반적 행동, 파행(서있기 및 걷기로 점수 매김), 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창)의 점수를 매겼다. 실험 종료시 개를 안락사시키고 병리학자 참석 하에 무릎을 육안으로 관찰하였다.

요산염 결정: 0.9% NaCl 용액 중 10 mg/ml의 요산염 결정(Sigma 물품 번호 U2875; 뱃치 번호 120K5305)을 관절내 주사에 사용하였다. 이를 위해, 50 mg/g 농도의 0.9% NaCl 중 22 g의 요산염 결정 용액을 제조하였다. 이 용액을 50 ㎛ 이하의 입자(현미경 관찰)를 갖는 현탁액이 얻어질 때까지 음파 처리(sonify)하였다. 현미경 이미지로 입자 크기가 50 ㎛ 이하임을 확인한 후, 현탁액 20 g을 0.9% NaCl로 100 g으로 희석시켰다(최종 농도 10 mg/ml). pH를 pH 7.0으로 조정하고, 현탁액을 고압 멸균처리하였다. 또한, 고압 멸균처리 직전과 후에 현탁액의 현미경 이미지로 결정 크기(50 ㎛ 이하여야 함)를 조사하였다. 제조 후 후속 사용시까지 현탁액을 2∼8℃에 보관하였다.

식별: 개들의 귀에 개별적으로 번호를 매겼다(문신하였다).

사육: 개들을 자연적인 비제한 환경 하에 표준 개집에서 개별적으로 사육하였고, 야외 운동 기회를 주었으며, 물은 무제한 공급하였다. 사료는 일정량만 공급하였다.

0.9% NaCl의 주사: 그룹 1(대조 그룹)의 동물 4 마리에 전신 마취 하에 한쪽 무릎 관절(털을 깎은 왼쪽 뒷다리)에 0.9% NaCl 1.0 ml를 관절내 주사하였다.

요산염 결정의 주사: 그룹 2(골관절염 모델 그룹)의 동물 4 마리에 전신 마취 하에 한쪽 무릎 관절(털을 깎은 왼쪽 뒷다리)에 0.9% NaCl 중 10 mg/ml 요산염 결정 1.0 ml를 관절내 주사하였다.

실험 절차 및 파라미터

관찰: 각각의 개별 개에 대해 주사 후 T = 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 3O 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간째 일반적 행동, 파행(서있기 및 걷기로 점수 매김), 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창)의 점수를 매겼다. 먼저 개집 안에서의 개를 관찰하여 점수를 매기고, 그 후 관찰대 위에서 걷기, 마지막으로 서있기를 관찰하여 점수를 매겼다.

파행 점수 채점:

서있기 점수

0: 완전 체중 부하 상태로 정상적으로 서있음.

1: 부분 체중 부하 상태의 비정상적인 자세.

2: 체중 비부하 상태의 비정상적인 자세(세 다리만 사용하는 개).

3: 서려고 하지 않음.

걷기 점수

0: 완전 체중 부하 상태로 정상적으로 걸음.

1: 부분 체중 부하 상태로 약간 절뚝거림.

2: 간헐적 부분 체중 부하 상태로 눈에 띄게 절뚝거림.

3: 체중 비부하 상태(세 다리만 사용하는 개).

4: 걸으려고 하지 않음.

빨리 걷기 점수

0: 완전 체중 부하 상태로 정상적으로 빨리 걸음.

1: 부분 체중 부하 상태로 약간 절뚝거림.

2: 간헐적 부분 체중 부하 상태로 눈에 띄게 절뚝거림.

3: 체중 비부하 상태(세 다리만 사용하는 개).

4: 빨리 걸으려고 하지 않음.

촉진시 통증 점수:

0: 통증 징후 없음.

1: 경도 내지 중등도의 통증(촉진은 허용했으나 머리를 돌리거나 끌거나 하지는 못하게 하며, 소리를 내고, 의기소침함).

2: 중도의 통증(관찰자의 관절 촉진을 허용하지 않음).

주사하지 않은 관절 점수와 비교한 무릎 관절 삼출(종창):

0: 관절 삼출 없음(촉진할 수 있는 슬개 인대가 뚜렷함).

1: 경도의 삼출(인대를 감지할 수 있으며 극소량의 활액이 참).

2: 중등도의 삼출(인대가 뚜렷하지 않으며 현저히 활액이 참).

3: 중도의 삼출(인대를 촉진할 수 없음).

C. 셰틀랜드 포니에서의 요산염 결정 유도성 골관절염 모델의 구축

실험 계획: 본 발명자들은 포니를 대상으로 구축한 동일한 골관절염 모델을 사용하였다. 일반 품종의 셰틀랜드 포니(약 12 월령) 2 마리로 구성된 2개 그룹에 0.9% NaCl 5.0 ml(대조 그룹) 또는 0.9% NaCl 중 10 mg/ml 요산염 결정 5.0 ml(골관절염 모델 그룹)를 한쪽 무릎 관절(오른쪽 뒷다리)에 관절내 주사하였다. 약간의 진정제를 사용하여 용액 5.0 ml의 관절내 주사를 행하였다. 각각의 개별 포니에 대해 주사 후 T = 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 30 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간째 일반적 행동, 파행(서있기 및 걷기로 점수 매김), 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창)의 점수를 매겼다. 실험 종료시, 포니를 안락사시키고, 병리학자가 무릎을 육안으로 관찰하였다.

요산염 결정: 섹션 B 참조.

식별: 셰틀랜드 포니는 이식된 칩 및 번호가 매겨진 목벨트로 식별하였다.

사육: 포니를 자연적인 비제한 환경 하에 통상적인 마구간에서 개별적으로 사육하였고, 건초와 물은 무제한 공급하였으며, 사료는 일정량만 공급하였다.

0.9% NaCl의 주사: 그룹 1(대조 그룹)의 동물 2 마리에 약간의 진정제를 사용하여 한쪽 무릎 관절(털을 깎은 오른쪽 뒷다리)에 0.9% NaCl 5.0 ml를 관절내 주사하였다.

요산염 결정의 주사: 그룹 2(골관절염 모델 그룹)의 동물 2 마리에 약간의 진정제를 사용하여 한쪽 무릎 관절(털을 깎은 오른쪽 뒷다리)에 0.9% NaCl 중 10 mg/ml 요산염 결정 5.0 ml를 관절내 주사하였다.

실험 절차 및 파라미터

관찰: 각각의 개별 포니에 대해 주사 후 T = 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 3O 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간째 일반적 행동, 파행(서있기 및 걷기로 점수 매김), 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창)의 점수를 매겼다.

먼저 마구간 안에서의 포니를 관찰하여 점수를 매기고, 그 후 회랑에서의 걷기를 관찰하여 점수를 매겼다.

파행 점수 채점:

서있기 점수

0: 완전 체중 부하 상태로 정상적으로 서있음.

1: 부분 체중 부하 상태의 비정상적인 자세.

2: 체중 비부하 상태의 비정상적인 자세(세 다리만 사용하는 포니).

3: 서려고 하지 않음.

걷기 점수

0: 완전 체중 부하 상태로 정상적으로 걸음.

1: 부분 체중 상태로 약간 절뚝거림.

2: 간헐적 체중 부하 상태로 눈에 띄게 절뚝거림.

3: 체중 비부하 상태(세 다리만 사용하는 포니).

4: 걸으려고 하지 않음.

촉진시 통증 점수:

0: 통증 징후 없음.

1: 경도 내지 중등도의 통증(촉진은 허용했으나 머리를 돌리거나 끌거나 하지는 못하게 하며, 소리를 내고, 의기소침함).

2: 중도의 통증(관찰자의 관절 촉진을 허용하지 않음).

주사하지 않은 관절 점수와 비교한 무릎 관절 삼출(종창):

0: 관절 삼출 없음(촉진할 수 있는 슬개 인대가 뚜렷함).

1: 경도의 삼출(인대를 감지할 수 있으며 극소량의 활액이 참).

2: 중등도의 삼출(인대가 뚜렷하지 않으며 현저히 활액이 참).

3: 중도의 삼출(인대를 촉진할 수 없음).

D. IL-1β 및 TNF-α에 대해 예방 목적으로 백신접종된 비글견에 있어서의 골관절염 증상의 예방

실험적 백신접종 계획: 연구 A에서는, "wt 단독" 실험을 위해, 그룹당 몇 종의 상이한 면역증강제와 함께 조제한 IL-1β 및 TNF-α로 백신접종 후 T = 0주, 4주, 8주, 20주 및 24주째 개에게 백신접종하였다(하기 표 1 참조). 본 연구에서는, 이들 개에게 마지막 백신접종 후 24주째 2회, 즉, 제1기(primo) 백신접종 후 T = 48주 및 T = 54주째 하기 표 4에 기재된 백신 제제 1.0 ml를 (오른쪽 옆구리에 피하 주사로) 재접종하였다. 혈청 분석을 위해 1차 백신접종 후 T = 48주, T = 54주 및 T = 58주째 혈액 샘플을 수집하였다. 혈청은 항원 특이적 ELISA 및 표준 절차를 이용하여 IL-1β 및 TNF-α에 대한 항체 수치를 측정하는 데 사용하였다.

혼합 wt/mt 실험을 위해, 표 1A에 기재된 실험적 백신접종을 이용하였다.

골관절염의 유도: wt 단독 실험의 경우, 그룹 1(PBS 대조 그룹)의 개로부터 마지막으로 혈액 샘플을 수집한(T = 59주) 후 1주째 2개의 새 그룹으로 나누었다(N=2 및 N=4). 이 시점에서 약 18월령인 5개 그룹의 개 모두에게 0.9% NaCl 1.0 ml(대조 그룹 1) 또는 0.9% NaCl 중 10 mg/ml 요산염 결정 1.0 ml(골관절염 그룹 2∼5)를 한쪽 무릎 관절(뒷다리)에 관절내 주사하였다. 용액 1.0 ml의 관절내 주사는 전신 마취 하에 행하였다. 주사 후 T = 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 32 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간째 각각의 개별 개에 대해 일반적 행동, 파행(서있기 및 걷기로 점수 매김), 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창)의 점수를 매겼다. 실험 종료시 개를 안락사시키고, 병리학자 참석 하에 무릎을 육안으로 관찰하였다.

혼합 wt/mt 실험의 경우, 표 1A에 기재된 바와 같이 골관절염 유도를 계획하였다.

파행 점수: 섹션 B 참조

통계 분석: 다중 비교 검정으로서 최소 유의차(L.S.D.)를 갖는 분산 분석(ANOVA)을 이용하여 평균 득점값의 비교를 행하였다. 모든 결과는 SAS 엔터프라이즈 가이드 2 소프트웨어(미국 노쓰개롤라이나주 캐리 소재의 SAS Institute Inc. 제품)를 이용하여 생성하였다. 신뢰 수준 95%(P<0.05)에서 차이는 유의적인 것으로 간주되었다.

2. 결과

A. 개에서의 자가 IL-1β 및 TNF-α에 대한 항체의 유도

백신접종에 기인한 부작용(wt 단독 실험): 제1기 백신접종(제1기) 후, QuilA 중 Eq 단백질을 투여받은 개에게서 국소(피부) 반응이 관찰되었다. 따라서, 이 백신접종 그룹에서 후속 추가 백신접종은 PBS 중 QuilA로 대체하였다(역시 표 1 참조). 1차 추가 백신접종 직후, 그룹 2(QuilA 중 Ca 단백질), 그룹 3(매트릭스 C 중 Ca 단백질) 및 그룹 4(마이크로솔 중 Ca 단백질)의 개 대부분은 앓기 시작하였고, 이것은 아마도 백신 제제 중의 고농도의 (유리) 생물학적 활성 TNF-α의 존재 때문인 것으로 생각된다. 이러한 급성 전신 부작용은, Ca 단백질 및 Eq 단백질 둘 다에 대해 TNF-α의 양을 개 1 마리당 투여량을 50 ㎍에서 5 ㎍으로 줄임으로써 방지하였다.

백신접종에 기인한 부작용(혼합 wt/mt 실험): 제1기 백신접종(제1기) 후, 마이크로솔 보조제를 투여받은 개(그룹 3∼6)의 대부분에서 국소(피부) 반응이 관찰되었다. 1차 및 후속(추가) 백신접종 후, 국소 반응은 덜 현저하였다. 이용된 CaIL-1β 및 CaTNF-α 단백질 농도에서는 급성 전신 부작용이 관찰되지 않았다.

IL-7β 및 TNF-α에 대한 항체 역가(wt 단독 실험): 도 1A∼D에 도시된 바와 같이, 자가 분자 CaIL-1β 및 CaTNF-α에 대해 유의적인 ELISA 항체 역가가 생성될 수 있다. 이 도면으로부터, 항체가 교차 반응성이라는 것, 즉, Ca 단백질에 대해 생성된 항체가 Eq 단백질을 인식하고, 또한 그 반대도 가능하다는 것이 명백하다. CaTNF-α에 대해 생성된 항체는, (아마도 친화성/특이성으로 인해) 특히 이른 시점에, CaTNF-α 단백질보다 더 높은 역가로 EqTNF-α를 인식한다는 것이 주목할 만하다(도 1C 및 1D). 일반적으로, Ca 단백질로 백신접종한 개에게서 상응하는 Eq 대응물로 백신접종한 개보다 총 항체 역가가 더 높게 생성되었다. 제1기 백신접종 후 12주째 그룹 1 및 3은 사육 제약으로 인해 실험으로부터 배제되었다. 요약하면, 유전적으로 변형된 개 자가 분자 또는 이종성 말 단백질을 사용함으로써, 자가 분자에 대한 면역 관용성을 파괴하고 높은 항체 역가를 유도할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다. 돌연변이 사이토카인에 대해서도 유사한 결과를 얻었다.

웨스턴 블롯 분석: 항IL-1β 및 항TNF-α 항체의 특이성을 확인하기 위해, CDV 태깅 및 비태깅 단백질을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯을 제1기 백신접종 후 T = 9주째의 혈청과 함께 항온처리하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 모든 항체가 Ca 및 Eq IL-1β 및 TNF-α 단백질과 교차 반응한다. 비관련 His 태그 정제 이. 콜라이 발현 단백질인 닭 IL-18(ChIL-18)을 대조군으로 사용하였으며 이것은 항체에 의해 인식되지 않았다.

항IL-1β 항체 및 항TNF-α 항체의 중화 능력: 개에서 IL-1β 및 TNF-α에 대해 고항체 역가가 유도되었지만, 이 항체가 상응하는 단백질의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는지는 불분명하였다. 이를 위해, IL-1β 및 TNF-α 반응성 NIH-3T3 NFκB 루시퍼라제 리포터 세포주를 사용하였다. Ca 및 Eq IL-1β 및 TNF-α를 여러 시점에 얻은 혼주 혈청과 함께 사전 항온처리하고, 중화(즉, 수용체 결합의 억제) 활성을 테스트하였다. 도 3A 및 3B에 도시된 결과로부터, 제1기 백신접종 후 24주째 얻은 혼주 혈청이 가장 많은 항CaIL-1β 및 항EqIL-1β 중화 항체를 포함하고 있다는 결론을 내릴 수 있다. 상대 광 단위(RLU)로 측정된 CaIL-1β 및 EqIL-1β의 생물학적 활성은 다른 혈청과 비교할 때 현저히 감소된다. 이것은 또한, 덜 두드러지긴 하지만, CaTNF-α 및 EqTNF-α의 생물학적 활성의 억제에 있어서도 그러하다(도 3C 및 3D). 제1기 백신접종 후 6주, 9주 및 12주째 얻은 혼주 혈청은 중화 IL-1β 항체를 거의 함유하고 있지 않지만, 중화 TNF-α 항체를 상당량 함유하고 있다.

결론

결론적으로 본 발명자들은 최소 CDV 태깅 야생형 및 돌연변이체 CaIL-1β 및 CaTNF-α 자가 분자에 대한 능동 면역화에 의해 항체를 생성할 수 있다는 분명한 증거를 제공하였다.

B. 비글견에서의 요산염 결정 유도성 골관절염 모델의 구축

무릎 관절로의 액 주사: 일반적으로, 0.9% NaCl 1.0 ml 또는 0.9% NaCl 중 10 mg/ml의 요산염 결정 1.0 ml의 무릎 관절로의 주사를 어떠한 심각한 부작용도 없이 행하였다.

임상 평가: 파행 점수 채점: 요산염 결정을 주사한 동물은 주사 후 2 시간 내에 걷기와 서있기 둘 다에서 명백한 파행을 나타내었다(도 4 참조). 2 마리의 개는 24 시간 내에 완전히 회복된 반면, 다른 2 마리의 개는 실험 종료시까지 요산염 결정으로 인해 괴로워했다. 안락사시킨 개의 무릎 관절의 육안 관찰 결과는 상기 2 마리 개는 슬개골 탈구(해부학적 관절 이상)가 있음을 나타내었다. 이러한 슬개골 탈구가 요산염 결정 용액의 주사와 함께 작용하여, 상기에 언급한 장기간의 고통을 초래했을 가능성이 가장 크다. 0.9% NaCl 용액을 주사한 개의 그룹에서는, 1 마리의 개만이 다소 단기간 동안 주사에 기인한 고통을 받았다(T = 8 시간에 관찰 가능). 이 개의 무릎 관절을 육안으로 관찰하였을 때, 이 개 역시 슬개골 탈구가 있었음이 분명해졌다.

임상 평가: 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창): 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출도 모니터링하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, SEM(평균의 표준 오차)은 크고, 이것은 개별 개들 간에 상당한 편차가 있음을 나타낸다. 요산염 결정을 주사한 후 2∼8 시간 사이에 촉진시 통증을 측정할 수 있으며, 4∼6 시간 사이에 최대였다. 무릎 관절 삼출은 촉진시 통증에 비해 다소 늦게 나타나나, 주사 후 4 시간째 나타나기 시작하여 8 시간째 최대였다.

임상 평가: 무릎의 병리학적 분석: 실험 종료시, 모든 개를 안락사시키고, 무릎을 육안으로 관찰하였다. 모든 개에게서, 주사액의 흔적은 관찰되지 않았다. 개 1 마리에서만 주사 부위가 여전히 관찰되었다. 개 3 마리의 무릎에서 다량의 액이 관찰되었다. 이것은 이들 개 3 마리에 슬개골 탈구가 발생하였음을 입증하였다.

결론

한쪽 무릎 관절(뒷다리)로 요산염 결정 함유 용액을 관절내 주사함으로써 적용된 개의 관절염 모델은 신속하고(2 시간 내에 효과를 관찰할 수 있음), 유효 기간이 짧고(수시간 내지 1, 2일), 가역적이다. 과정을 모니터링하기 위한 관련 파라미터는 걷기 및 서있기시의 파행, 촉진시 통증 및 관절 삼출의 점수 채점을 포함한다. 이 모델에서 체온과 무릎 온도는 관련이 없는 파라미터이다.

C. 셰틀랜드 포니에서의 요산염 결정 유도성 골관절염 모델의 구축

무릎 관절로의 액 주사: 일반적으로, 0.9% NaCl 5.0 ml 또는 0.9% NaCl 중 10 mg/ml의 요산염 결정 5.0 ml의 무릎 관절로의 주사를 어떠한 심각한 부작용도 없이 행하였다.

임상 평가: 파행 점수 채점: 요산염 결정을 주사한 포니는 주사 후 2 시간 내에 걷기와 서있기 둘 다에서 명백한 파행을 나타내었다(도 6 참조). 주사 후 6∼8 시간 사이에 최대 고통이 기록되었다. 대조 그룹 포니 2 마리는 파행 징후를 나타내지 않았다.

임상 평가: 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창): 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출도 모니터링하였다. 도 7A에서 알 수 있는 바와 같이, 주사 후 2 시간 내에 통증이 기록된 반면, 무릎 관절 삼출(도 7B)은 후기 단계에서(48 시간 초과) 검출할 수 있었다. 무릎 관절 삼출은 72∼96 시간 사이에 증가하지 않기 때문에, 이것은 종창이 96시간째 최고에 도달함을 나타낼 수 있다.

임상 평가: 무릎의 병리학적 분석: 실험 종료시, 모든 포니를 안락사시키고, 무릎을 육안으로 관찰하였다. 모든 포니에게서, 주사액의 흔적은 관찰되지 않았다. 요산염을 주사한 포니의 무릎 관절을 육안 관찰하여, 황색 활액량의 증가, 부종 및 출혈이 있는 활막의 비후를 확인하였다. 대조 그룹은 병리학적 소견을 보이지 않았다.

결론

개에게서도 나타난 바와 같이, 한쪽 무릎 관절(오른쪽 뒷다리)로 요산염 결정 함유 용액을 관절내 주사함으로써 적용된 포니의 관절염 모델은 신속하고(2 시간 내에 효과를 관찰할 수 있음), 유효 기간이 짧고(수시간 내지 1, 2일), 파행 및 통증 점수 채점시 가역적이다. 주사 후 48 시간째부터 무릎 관절 삼출(종창)을 촉진할 수 있고 72∼96 시간 사이에 최고에 도달하는 것으로 보인다.

D. IL-1β 및 TNF-α에 대해 예방 목적으로 백신접종한 비글견에서의 골관절염 증상의 예방

재백신접종 후 IL-1β 및 TNF-α에 대한 항체 역가: 도 8A∼D(wt 단독 실험)에 도시된 바와 같이, 백신접종 후 T = 48주째, 즉, 마지막 추가 백신접종 후 24주째의 총 항체 역가는 다소 높은 수준으로 유지되었다. 개의 재백신접종은 테스트된 모든 항원과 모든 그룹에서 항체 역가를 중간 정도로 증가시켰다.

임상 평가: 불편감 점수: 도 9(wt 단독 실험)에는, '서있기'(도 9B), '걷기'(도 9C), '촉진시 통증'(도 9D), '무릎 관절 삼출(종창)'(도 9E)에 대한 불편감 점수 및 측정된 모든 불편감 점수의 평균인 '총 임상 점수'(도 9A)가 도시되어 있다. 모든 도면으로부터, 비백신접종 개가 주사 후 2 시간 내에 현저한 불편감을 나타내었음이 명백하다. 몇몇 사례에서 백신접종 개는 유의적으로 감소된 또는 중등도 내지 경도의 불편감을 나타내었다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 백신접종 개에 대한 불편감 점수는 비백신접종 개와 비교할 때 현저히 낮었거나 지연을 나타내었다.

임상 평가: 무릎의 병리학적 분석: 실험 종료시, 모든 개를 안락사시키고, 병리학자가 무릎을 육안 관찰하였다. 일반적으로, NaCl 대조 그룹 개를 제외하고, 모든 개에서 활막이 두꺼워지고 붉어지는 것으로 나타났다. 이외에도 모든 무릎에서 소량의 점액이 검출되었다.

임상 평가: 불편감 점수: 도 10(혼합 wt/mt 실험)에는, 관절내 요산염 주사 후 6 시간 및 8 시간 시점에 '서있기'(도 10A) 및 '걷기'(도 10B)에 대한 불편감 점수가 도시되어 있다. 두 도면으로부터, 비백신접종 개(요산염 대조 그룹)는 주사 후 6 시간 및 8 시간째 현저한 불편감을 나타내었음이 명백하다. 몇몇 사례에서 백신접종 개는 유의적으로 감소된 또는 중등도 내지 경도의 불편감을 나타내었다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 백신접종 개에 대한 불편감 점수는 비백신접종 개(요산염 대조 그룹)와 비교할 때 현저히 낮았다. 또한, 특히, 주사 후 8 시간째, 야생형 CaIL-1β 단독 또는 돌연변이체 CaIL-1β 단독을 사용한 백신접종이 비백신접종 요산염 대조 그룹 개와 비교할 때 불편감을 감소시킨다는 것이 분명하다.

결론

이 실험에서 얻은 결과로부터, 본 발명자들은 야생형 또는 돌연변이 사이토카인을 사용하는 것에 기초하여 자가 분자 IL-1β 및 TNF-α에 대한 항체를 유도할 수 있고, IL-1β 단독에 대해 유도된, 또는 TNF-α에 대해 유도된 이들 항체가 관절염 증상을 억제할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다. 또한, IL-1β 및 TNF-α 둘 다에 대해 유도된 백신을 사용할 때 최상의 결과가 얻어질 것이라는 결론을 내릴 수 있다.

E. 기타

생물학적 활성 IL-1β 및 TNF-α를 사용할 때, 본 발명자들은 급성 부작용을 관찰하였다. 이러한 부작용은, 예를 들어 미국 특허 제6,093,405호에 기재된 바와 같이, 상기 사이토카인의 생물학적 불활성 형태를 사용함으로써 예방할 수 있다. 면역원성과 생물학적 활성 간의 균형을 맞추기 위해 부분 불활성화 사이토카인을 선택할 수 있다. 본 발명자들은 골관절염을 유도하기 위해 요산염 결정을 사용하였다. 골관절염에 대한 다른 모델, 예를 들어 전방 십자 인대 횡단면(Anterior Cruciate Ligament Transection) 모델(ACLT, 문헌[Fleming et al; Curr Opin Orthop. 2005 October; 16(5): 354-362]에 개시됨) 또는 그루브(Groove) 모델(문헌[Mastbergen et al; Rheumathology, 2006; 45(4): 405-413]에 기재됨)은 선행 기술에 개시되어 있다. 본 출원에 기재된 실험의 긍정적 결과를 고려할 때, 자연적 원인으로 인해 골관절염을 앓고 있거나 골관절염이 진행중인 이러한 모델 또는 환자에게 적용될 때 상응하는 결과가 얻어질 것으로 생각한다. 본 발명자들은 IL-1β 및 TNF-α 또는 그 유도체의 조합을 사용하여 백신접종하였을 때 골관절염 환자에게 현저한 경감 효과를 보여주었다. 이것은 비글견에서 확인되었다. 이 척추동물에서의 결과 및 척추동물군, 특히 개, 말 및 인간 등 포유류 척추동물의 관절과 관련된 생리학적 과정의 유사성을 고려할 때, 본 발명은 임의의 척추동물, 특히 포유류 척추동물에 사용될 수 있다.

F. 도면의 설명

도 1은 백신접종 후 여러 시점에 측정된 IL-β 및 TNF-α 특이적 항체 반응을 보여준다. 개를 면역화하지 않거나(식염수 대조군), QuilA, 매트릭스 C 또는 마이크로솔 중에서 조제한 [CaIL-1β + CaTNF-α] 단백질(Ca로 약칭함)로 면역화하거나, 또는 QuilA(제1기 접종 단독)/식염수(추가 접종) 중에서 조제한 [EqIL-1β + EqTNF-α] 단백질(Eq로 약칭함)로 면역화하였다. 제1기 백신접종 후 4주, 8주, 20주 및 24주째, 개에게 추가 백신접종을 실시하였다. CDV 태그가 없는 단백질이 사용되는 항원 특이적 ELISA를 이용하여 항체를 측정하였다. [A]. CaIL-1β에 대해 측정된 항체 역가; [B]. EqIL-1β에 대해 측정된 항체 역가; [C]. CaTNF-α에 대해 측정된 항체 역가; [D]. EqTNF-α에 대해 측정된 항체 역가. T = 제1기 백신접종 후 경과 일수(주).

도 2는 CDV 태깅 및 비태깅 CaIL-β, CaTNF-α 및 EqIL-1β 및 EqTNF-α 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 레인당 1 ㎍의 단백질을 4∼12% Nu-PAGE하고, 제1기 백신접종 후 9주째 각각의 백신접종 그룹의 개 1 마리로부터 얻은 혈청을 사용하여 웨스턴 블로팅을 실시함으로써 분석하였다. [A]. 쿠마시 염색 겔; [B]. 대조군 혈청과 함께 항온처리한 웨스턴 블롯; [C]. QuilA 보조제 중에서 조제한 [CaIL-1β + CaTNF-α]로 백신접종한 개로부터 얻은 혈청과 함께 항온처리한 웨스턴 블롯; [D]. 매트릭스 C 보조제 중에서 조제한 [CaIL-1β + CaTNF-α]로 백신접종한 개로부터 얻은 혈청과 함께 항온처리한 웨스턴 블롯; [E]. 마이크로솔 보조제 중에서 조제한 [CaIL-1β + CaTNF-α]로 백신접종한 개로부터 얻은 혈청과 함께 항온처리한 웨스턴 블롯; [F]. QuilA(제1기 백신접종 단독)/식염수(추가 접종) 보조제 중에서 조제한 [EqIL-1β + EqaTNF-α]로 백신접종한 개로부터 얻은 혈청과 함께 항온처리한 웨스턴 블롯.

도 3은 백신접종된 개로부터 얻은 혈청에 의한 IL-1β 또는 TNF-α 유도성 NFκB 활성화의 억제를 보여준다. 10 ng/ml의 [A] CaIL-1β, [B] EqIL-1β, [C] CaTNF-α, 또는 [D] EqTNF-α를, [CaIL-1β + CaTNF-α]로 백신접종한 개로부터 얻은 항체 혈청의 희석액과 혼합하여 NIH-3T3 리포터 세포와 함께 항온처리하였다. 항체의 의한 IL-1β 또는 TNF-α 활성의 억제는 상대 광 단위(RLU)로 정량하였다. T = 6주: 이것은 제1기 백신접종 후 6주째 수집한 그룹 2+3+4의 개로부터 얻은 혼주 혈청이다(표 1 참조). T = 9+12주: 이것은 제1기 백신접종 후 9주 및 12주째 수집한 그룹 2+3+4의 개로부터 얻은 혼주 혈청이다(표 1 참조). T = 24주: 이것은 제1기 백신접종 후 24주째 수집한 그룹 2+4의 개로부터 얻은 혼주 혈청이다(표 1 참조).

도 4는 비글견에 대한 서있기 평가시의 평균 점수[A], 걷기 평가시의 평균 점수[B] 및 평균 총 파행 점수[C](서있기 + 걷기)를 보여준다. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다.

도 5는 비글견에 대한 촉진시 통증 평가시의 평균 점수[A] 및 무릎 관절 삼출 평가시의 평균 점수[B]를 보여준다. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다.

도 6은 셰틀랜드 포니에 대한 서있기 평가시의 평균 점수[A], 걷기 평가시의 평균 점수[B] 및 평균 총 파행 점수[C](서있기 + 걷기)를 보여준다. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다. 왼쪽 세로축의 화살표는 표시된 파라미터에 대한 최고 점수를 가르킨다.

도 7은 촉진시 통증 평가시의 평균 점수[A] 및 무릎 관절 삼출 평가시의 평균 점수[B]를 보여준다. 도 7[C]는 셰틀랜드 포니에 대한 총 임상 점수(서있기 + 걷기 +통증 + 종창)를 보여준다. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다. 왼쪽 세로축의 화살표는 표시된 파라미터에 대한 최고 점수를 가르킨다.

도 8은 제1기 백신접종 후 여러 시점에서 측정한 IL-β 및 TNF-α 특이적 항체 반응을 보여준다. 개를 면역화하지 않거나(식염수 대조군), 제1기 백신접종 후 T = 48주 및 T = 54주째 QuilA 또는 마이크로솔 중에서 조제한 [CDV 태깅 CaIL-1β + CaTNF-α] 단백질(Ca로 약칭함)로 재백신접종하거나, 또는 QuilA(제1기 접종 단독)/식염수(추가 접종) 중에서 조제한 [EqIL-1β + EqTNF-α] 단백질(Eq로 약칭함)로 재백신접종하였다. 제1기 백신접종 후 T = 4주, T = 54주 및 T = 58주째 CDV 태그가 없는 단백질이 사용되는 항원 특이적 ELISA를 이용하여 항체를 측정하였다. [A]. CaIL-1β에 대해 측정된 항체 역가; [B]. EqIL-1β에 대해 측정된 항체 역가; [C]. CaTNF-α에 대해 측정된 항체 역가; [D]. EqTNF-α에 대해 측정된 항체 역가. ★ = 식염수 그룹과 유의적인 차이 있음(P<0.05);

= 표시된 그룹 간에 유의적인 차이 있음(P<0.05). T = 제1기 백신접종 후 경과 일수(주).

도 9는 비글견에 대한 평균 총 임상 점수를 보여준다. 도 9[A]는 총 임상 점수(서있기 + 걷기 + 촉진시 통증 + 무릎 관절 종창)을 제시한다. 도 9[B]는 서있기 평가시의 평균 점수를 제시한다. [C]에는 걷기 평가시의 평균 점수, [D]에는 촉진시 통증 평가시의 평균 점수, [E]에는 무릎 관절 삼출(종창) 평가시의 평균 점수가 제시된다. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다. ★ = 표시된 시점에서 요산염 결정 대조 그룹과 유의적인 차이 있음(P<0.05);

= 표시된 그룹 간에 유의적인 차이 있음(P<0.05).

도 10은 비글견에 대한 평균 임상 점수를 보여준다. [A]. 서있기 평가시의 평균 임상 점수; [B]. 걷기 평가시의 평균 임상 점수. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다. ★ = 표시된 시점에서 요산염 결정 대조 그룹과 유의적인 차이 있음(P<0.05).

SEQUENCE LISTING <110> Intervet International BV <120> Osteo arthritis vaccine <130> 2007.018 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 585 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(582) <400> 1 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg ata tcg aat tca gca gcc atg caa tcg gtg gac 96 Arg Gly Ser His Met Ile Ser Asn Ser Ala Ala Met Gln Ser Val Asp 20 25 30 tgc aag tta cag gac ata agc cac aaa tac ctg gtg ctg tct aac tca 144 Cys Lys Leu Gln Asp Ile Ser His Lys Tyr Leu Val Leu Ser Asn Ser 35 40 45 tat gag ctt cgg gct ctc cac ctc aat ggg gaa aat gtg aac aaa caa 192 Tyr Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn Gly Glu Asn Val Asn Lys Gln 50 55 60 gtg gtg ttc cac atg agc ttt gtg cac ggg gat gaa agt aat aac aag 240 Val Val Phe His Met Ser Phe Val His Gly Asp Glu Ser Asn Asn Lys 65 70 75 80 ata cct gtg gtc ttg ggc atc aaa caa aag aat ctg tac ctg tcc tgt 288 Ile Pro Val Val Leu Gly Ile Lys Gln Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys 85 90 95 gtg atg aag gat gga aag ccc acc cta cag cta gag aag gta gac ccc 336 Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Lys Val Asp Pro 100 105 110 aaa gtc tac cca aag agg aag atg gaa aag cga ttt gtc ttc aac aag 384 Lys Val Tyr Pro Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys 115 120 125 ata gaa atc aag aac aca gtg gaa ttt gag tct tct cag tac cct aac 432 Ile Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe Glu Ser Ser Gln Tyr Pro Asn 130 135 140 tgg tac atc agc acc tct caa gtc gaa gga atg cct gtc ttc cta gga 480 Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Val Glu Gly Met Pro Val Phe Leu Gly 145 150 155 160 aat acc aga ggt ggc cag gat ata act gac ttc acc atg gaa ttt tct 528 Asn Thr Arg Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Glu Phe Ser 165 170 175 tcc aca gct gca caa atc act gca gga ata gct tta cat caa tcc aac 576 Ser Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn 180 185 190 ctc aat tag 585 Leu Asn <210> 2 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ile Ser Asn Ser Ala Ala Met Gln Ser Val Asp 20 25 30 Cys Lys Leu Gln Asp Ile Ser His Lys Tyr Leu Val Leu Ser Asn Ser 35 40 45 Tyr Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn Gly Glu Asn Val Asn Lys Gln 50 55 60 Val Val Phe His Met Ser Phe Val His Gly Asp Glu Ser Asn Asn Lys 65 70 75 80 Ile Pro Val Val Leu Gly Ile Lys Gln Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys 85 90 95 Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Lys Val Asp Pro 100 105 110 Lys Val Tyr Pro Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys 115 120 125 Ile Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe Glu Ser Ser Gln Tyr Pro Asn 130 135 140 Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Val Glu Gly Met Pro Val Phe Leu Gly 145 150 155 160 Asn Thr Arg Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Glu Phe Ser 165 170 175 Ser Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn 180 185 190 Leu Asn <210> 3 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(585) <400> 3 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg gtc aaa tca tct tct cga acc cca agt gac aag 96 Arg Gly Ser His Met Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys 20 25 30 cca gta gct cat gtt gta gca aac ccc gaa gct gag ggg cag ctc cag 144 Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Glu Ala Glu Gly Gln Leu Gln 35 40 45 tgg ctg agc cga cgt gcc aat gcc ctc ctg gcc aac ggc gtg gag ctg 192 Trp Leu Ser Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu 50 55 60 aca gac aac cag ctg ata gtg ccg tca gat ggg ttg tac ctc atc tac 240 Thr Asp Asn Gln Leu Ile Val Pro Ser Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 tcc cag gtc ctc ttc aag ggc caa ggg tgc cct tcc acc cat gtg ctc 288 Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu 85 90 95 ctc acc cac acc atc agc cgc ttc gcc gtc tcc tac cag aca aag gtc 336 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Phe Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val 100 105 110 aac cta ctc tct gcc atc aag agc cct tgc caa agg gag acc cca gag 384 Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu 115 120 125 ggg acc gag gcc aag ccc tgg tac gag ccc atc tac ctg gga ggg gtc 432 Gly Thr Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val 130 135 140 ttc caa ctg gag aag ggt gat cga ctc agc gct gag atc aat ctg cct 480 Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro 145 150 155 160 aac tat ctg gac ttt gcc gag tcc ggg cag gtg tac ttt ggg atc att 528 Asn Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile 165 170 175 gcc ctg aca gct gca caa atc act gca gga ata gct tta cat caa tcc 576 Ala Leu Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser 180 185 190 aac ctc aat tag 588 Asn Leu Asn 195 <210> 4 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys 20 25 30 Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Glu Ala Glu Gly Gln Leu Gln 35 40 45 Trp Leu Ser Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu 50 55 60 Thr Asp Asn Gln Leu Ile Val Pro Ser Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu 85 90 95 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Phe Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val 100 105 110 Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu 115 120 125 Gly Thr Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile 165 170 175 Ala Leu Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser 180 185 190 Asn Leu Asn 195 <210> 5 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(522) <400> 5 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg gca gct gtg cat tca gtg aac tgc aga ctc cgg 96 Arg Gly Ser His Met Ala Ala Val His Ser Val Asn Cys Arg Leu Arg 20 25 30 gac ata tac cat aaa tcc ctg gtg ctg tcc ggt gca tgt gag ctg cag 144 Asp Ile Tyr His Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Ala Cys Glu Leu Gln 35 40 45 gct gtc cac ctc aat gga gag aat aca aac caa caa gtg gtg ttc tgc 192 Ala Val His Leu Asn Gly Glu Asn Thr Asn Gln Gln Val Val Phe Cys 50 55 60 atg agc ttt gtg caa gga gaa gaa gag act gac aag ata cct gtg gcc 240 Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Glu Thr Asp Lys Ile Pro Val Ala 65 70 75 80 ttg ggc ctc aag gga aag aat ctg tac ctg tct tgt ggg acg aaa gat 288 Leu Gly Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Gly Thr Lys Asp 85 90 95 ggg aag ccc atc ctg cag ctg gag aca gta gac ccc aat act tac cca 336 Gly Lys Pro Ile Leu Gln Leu Glu Thr Val Asp Pro Asn Thr Tyr Pro 100 105 110 aag agg aaa atg gaa aag cga ttt gtc ttc aac aag atg gaa atc aag 384 Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Met Glu Ile Lys 115 120 125 ggc aac gtg gaa ttt gag tct gca atg tac ccc aac tgg tac atc agc 432 Gly Asn Val Glu Phe Glu Ser Ala Met Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser 130 135 140 acc tct caa gca gaa aaa aag cct gtc ttc cta gga aat acc aga ggc 480 Thr Ser Gln Ala Glu Lys Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Arg Gly 145 150 155 160 ggc cgg gac ata act gac ttc atc atg gaa atc acc tct gcc taa 525 Gly Arg Asp Ile Thr Asp Phe Ile Met Glu Ile Thr Ser Ala 165 170 <210> 6 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ala Val His Ser Val Asn Cys Arg Leu Arg 20 25 30 Asp Ile Tyr His Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Ala Cys Glu Leu Gln 35 40 45 Ala Val His Leu Asn Gly Glu Asn Thr Asn Gln Gln Val Val Phe Cys 50 55 60 Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Glu Thr Asp Lys Ile Pro Val Ala 65 70 75 80 Leu Gly Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Gly Thr Lys Asp 85 90 95 Gly Lys Pro Ile Leu Gln Leu Glu Thr Val Asp Pro Asn Thr Tyr Pro 100 105 110 Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Met Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Asn Val Glu Phe Glu Ser Ala Met Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser 130 135 140 Thr Ser Gln Ala Glu Lys Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Arg Gly 145 150 155 160 Gly Arg Asp Ile Thr Asp Phe Ile Met Glu Ile Thr Ser Ala 165 170 <210> 7 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(534) <400> 7 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg ctc aga tca tct tct cga acc cca agt gac aag 96 Arg Gly Ser His Met Leu Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys 20 25 30 cct gta gcc cat gtt gta gca aac ccc caa gcc gag ggg cag ctc cag 144 Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln 35 40 45 tgg ctg agt ggg cgt gca aat gcc ctc ctg gcc aat ggc gtg aag ctg 192 Trp Leu Ser Gly Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Lys Leu 50 55 60 aca gac aac cag ctg gtg gta cca ttg gat ggg ctg tac ctc atc tac 240 Thr Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Leu Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 tcc cag gtc ctc ttc aaa ggc caa ggc tgc cct tcc acc cat gtg ctc 288 Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu 85 90 95 ctc acc cac acc atc agc cgc tta gct gtc tcc tac ccg tcc aag gtc 336 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Leu Ala Val Ser Tyr Pro Ser Lys Val 100 105 110 aac ctc ctc tct gcc atc aag agc cct tgc cac acg gag tcc cca gag 384 Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys His Thr Glu Ser Pro Glu 115 120 125 cag gct gaa gcc aag ccc tgg tat gag ccc atc tac ctg gga gga gtc 432 Gln Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val 130 135 140 ttc cag ctg gag aag ggt gat caa ctc agc gct gag atc aat cag ccc 480 Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln Leu Ser Ala Glu Ile Asn Gln Pro 145 150 155 160 aac tat ctc gac ttt gcg gag tcc ggg cag gtc tac ttt ggg atc att 528 Asn Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile 165 170 175 gcc ctg tga 537 Ala Leu <210> 8 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Leu Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys 20 25 30 Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln 35 40 45 Trp Leu Ser Gly Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Lys Leu 50 55 60 Thr Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Leu Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu 85 90 95 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Leu Ala Val Ser Tyr Pro Ser Lys Val 100 105 110 Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys His Thr Glu Ser Pro Glu 115 120 125 Gln Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln Leu Ser Ala Glu Ile Asn Gln Pro 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile 165 170 175 Ala Leu

Claims (11)

1. 척추동물의 골관절염 치료용 백신으로서, IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 포함하고, 상기 IL-1β 및 임의적인 TNF-α, 또는 그 유도체와 연합된, 상기 백신이 상기 척추동물에서 상기 척추동물의 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 자가 분자에 대한 면역 반응을 유발하도록 상기 척추동물에 대해 비자가인 부분을 포함하는 백신.
2. 제1항에 있어서, 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체가 치료되는 척추동물에 대해 동종성인 백신.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 척추동물에 대해 비자가인 부분이 미생물로부터 유래된 항원성 결정인자를 포함하는 것인 백신.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 척추동물에 대해 비자가인 부분이 면역보조제(adjuvant)를 포함하는 것인 백신.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체가 상기 척추동물의 자가 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인과 비교할 때 감소된 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 백신.
6. 척추동물의 골관절염 치료용 백신을 제조하기 위한 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인의 용도.
7. 제6항에 있어서, 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체가 치료되는 척추동물에 대해 동종성인 용도.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 백신을 제조하기 위해 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 미생물로부터 유래된 항원성 결정인자와 연합하는 것인 용도.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신을 제조하기 위해 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 면역보조제와 연합하는 것인 용도.
10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체가 상기 척추동물의 자가 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인과 비교할 때 감소된 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 백신을 투여하는 것에 의한 척추동물의 골관절염 치료법.
    

Images