EA005248B1 - Способ отрицательной регуляции активности gdf-8 - Google Patents

Abstract

Описаны новые способы увеличения мышечной массы путем иммунизации животных против фактора дифференцировки роста 8 (GDF-8, миостатин). Иммунизацию предпочтительно осуществляют путем введения аналогов GDF-8, способных индуцировать вырабатывание антител против гомологичного GDF-8. Особенно предпочтительным иммуногеном является гомологичный GDF-8, который был модифицирован путем введения одного или нескольких чужеродных иммунодоминантных и смешанных Т-клеточных эпитопов, которые, в основном, сохраняют третичную структуру гомологичного GDF-8. Описана также вакцинация нуклеиновыми кислотами против GDF-8 и вакцинация с использованием живых вакцин, а также способы и средства осуществления такой вакцинации. Такими способами и средствами являются способы идентификации эффективных иммуногенных аналогов GDF-8, способы получения аналогов и фармацевтических композиций, а также фрагменты нуклеиновых кислот, векторы, трансформированные клетки, полипептиды и фармацевтические композиции.

Description

Настоящее изобретение относится главным образом к области разведения домашних животных и птицы, а также к области медицины. Более конкретно, настоящее изобретение относится к улучшению регуляции роста и увеличению мышечной массы, в частности, у сельскохозяйственных животных, предназначенных на убой. Таким образом, настоящее изобретение относится к новым способам и средствам для наращивания мышечной массы у животных, предназначенных на убой.

Предпосылки создания изобретения

В настоящее время используются два медицинских подхода к увеличению скорости роста сельскохозяйственных животных: один из них заключается во введении сельскохозяйственным животным антибиотиков или соединений, подобных антибиотикам, а другой - во введении гормонов роста.

В последние годы было подтверждено, что введение сельскохозяйственным животным (а особенно свиньям) антибиотиков и соединений, подобных антибиотикам, в целях стимуляции скорости роста этих животных связано с рядом проблем. Некоторые из этих соединений являются соединениями, химически близкородственными антибиотикам, используемым для лечения болезней человека, и имеются данные, что широкое использование таких соединений для сельскохозяйственных животных индуцирует перекрестную резистентность к антибиотикам, применяемым человеком, у микроорганизмов, патогенных для человека. Кроме того, использование этих соединений дает относительно небольшое увеличение скорости роста, составляющее 1-3%.

Использование гормонов роста для введения сельскохозяйственным животным является дорогостоящей мерой и эту обработку необходимо повторять через довольно короткие промежутки времени из-за относительно непродолжительного времени полужизни гормона роста. Кроме того, возможное присутствие остаточного гормона роста в мясе, полученном от обработанных животных, вызывает некоторые опасения особенно у европейских потребителей.

ΟΌΡ-8.

ΟΌΡ-8 или миостатин был открыт в мае 1997 г. как фактор регуляции роста, селективно ингибирующий рост скелетной мышцы (МсРйетгоп е! а1., Иа!иге, 387, 83-90, 1997). Экспрессия ΟΌΡ-8 ограничивается миотомным компартментом развивающихся эмбриональных сомитов, однако, ΟΌΡ-8 также экспрессируется в различных мышечных тканях во всем организме взрослого животного.

Мыши, отрицательные по ΟΌΡ-8 (нокаут-мыши) имеют значительно увеличенную скелетную мышечную массу. Очевидно, что увеличение скелетной мышечной массы должно распространяться по всему организму, и мышцы, выделенные у отрицательных по ΟΌΡ-8 мышей, по своей массе в 2-3 раза превышают мышечную массу мышей дикого типа. Общий вес тела нокаут-мышей приблизительно на 35% выше, чем у мышей дикого типа, а мыши, у которых отсутствует ген ΟΌΡ-8, имеют на 80% больше мышечных волокон по сравнению с нормальными мышами. Увеличение массы скелетных мышц, наблюдаемое у нокаут-мышей, является, однако, не просто следствием увеличения числа мышечных волокон, но также и следствием значительной гипертрофии мышечных волокон. Площадь поперечного сечения мышцы у мышей, отрицательных по ΟΌΡ-8, увеличивается приблизительно на 14-49% в зависимости от типа мышцы.

Интересно отметить, что у взрослых трансгенных мышей наблюдалось также увеличение скорости нарастания мышечной массы по сравнению со взрослыми нетрансгенными мышами. Кроме того, было показано, что все отрицательные по ΟΌΡ-8 мыши были жизнеспособными и плодовитыми.

В ноябре 1997 г. авторы, которые первыми открыли ΟΌΡ-8, опубликовали работу, где они сообщали, что две породы племенного скота, отличались значительным увеличением мышечной массы, а именно, бельгийская голубая и пьедмонтез (Ве1щап В1ие и Р1ебшоп1еке), содержали мутации в кодирующей последовательности ΟΌΡ-8, и что этот факт является причиной увеличения мышц (МсРйетгоп & 8е-Лп Бее, 1997, ΡΝΆ8 94, 12457-12461). За последние 190 лет феномен удвоения мышц наблюдался у многих племенных пород крупного рогатого скота, и эти животные имели увеличение мышечной массы, в среднем, на 20-25%. Указанные животные также оказались экономически эффективными в отношении использования кормов и, к тому же, они давали высококачественное мясо.

Однако в отличие от нокаут-мышей по ΟΌΡ-8, крупный рогатый скот породы бельгийская голубая обнаруживали пониженную массу большинства других органов. Эти природные нокаут-коровы также страдали пониженной плодовитостью, пониженной жизнеспособностью потомства и замедленным половым созреванием.

Относительное увеличение мышечной массы у нокаут-коров не так явно выражено, как у нокаут-мышей, т.е. фактически оно соответствует степени гипертрофии мышц, наблюдаемых у мышей. МсРйетгоп и др. считают, что одной из причин является то, что нормальный крупный рогатый скот по сравнению с мышью может иметь более близкий к максимальному пределу размер мышц (а следовательно, максимально возможное число мышечных волокон) после получения поколения от селективного скрещивания. Каких-либо данных относительно степени гипреплазии мышечных волокон по сравнению с гипертрофией мышц у крупного рогатого скота авторами не было опубликовано, однако, на основании этих предположений и гипертрофии мышц, наблюдаемой у нокаутмышей, можно сделать вывод о том, что увеличение мышечной массы и скорости ее роста, наблюдаемое, например, у крупного рогатого скота породы бельгийская голубая, обусловлено, главным образом, гипертрофией мышц и, в меньшей степени, гиперплазией мышц.

Физиологическая роль ΟΌΡ-8.

Экспрессия СЭР-8 ограничивается, главным образом, скелетной мышцей. В жировой ткани наблюдается низкий уровень его экспрессии, а в сердечной мышце эта экспрессия вообще отсутствует. Физиологическая роль ΟΌΡ-8 у взрослого индивида неизвестна, хотя есть предположение, что ΟΌΡ-8 может функционировать как специфический отрицательный регулятор роста скелетной мышцы. Предположения относительно физиологической роли СЭР-8 основаны на той важной роли, которую он играет в индуцировании гипертрофии или регенерации мышц после их повреждения. Однако ОЭР-8 может также подавлять рост жировой ткани. Но до сих пор неизвестно, функционирует ли ОЭР8 локально или системно в процессе роста данного животного.

Структура ОЭР-8.

ОЭР-8 принадлежит к надсемейству трансформирующего фактора роста β (ΤΟΡ-β), которое охватывает группу структурнородственных белков, участвующих в развитии эмбриона. Человеческий и коровий ОЭР-8 продуцируются в виде белков-предшественников длиной в 375 аминокислот. Другой ОЭР-8, относящийся к надсемейству белков ΤΟΡ-β, вероятно, процессируется протеолитически с образованием гораздо более короткого С-концевого фрагмента, состоящего приблизительно из 109 аминокислот, которые образуют связанные посредством дисульфида гомодимеры. Таким гомодимером, вероятно, является биологически активная форма ΟΌΡ-8.

Аминокислотные последовательности ОЭР-8 мышей, крыс, человека, павианов, коров, свиней, овец, кур и индеек хорошо известны, а молекула ΟΌΡ-8 является высококонсервативной (МеРйеггои & 8е-Ли Ьее, ΡΝΑ8, 94, 1245712461, 1997). Последовательности ΟΌΡ-8 у мышей, крыс, человека, свиней, кур и индеек на 100% идентичны в С-концевой области, которая, вероятно, содержит биологически активную часть ΟΌΡ-8. Последовательности ΟΌΡ-8 у коров и овец отличаются от последовательностей ОЭР-8 человека лишь двумя аминокислотными остатками, расположенными в С-концевой области. Коровий ОЭР-8 имеет последовательность -О1и-О1у- вместо -Ьу8-О1и- в положении 356-357, а овечий ΟΌΡ-8 имеет две консервативные замены (Уа1 в положении 316 и Агд в положении 333 вместо Ьеи и Ьу§ соответственно). Ни один из известных белков ОЭР-8 в своей активной С-концевой области не имеет потенциальных сайтов Ν-гликозилирования.

Цель настоящего изобретения

Целью настоящего изобретения является получение рекомбинантной терапевтической вакцины, способной осуществлять эффективную отрицательную регуляцию фактора дифференцировки роста 8 (ΟΌΡ-8) (также известного как миостатин) для увеличения скорости роста мышц у сельскохозяйственных животных. Другой целью настоящего изобретения является разработка способа вакцинации животных для увеличения скорости роста мышц. Целью настоящего изобретения также является получение вариантов ОЭР-8, способных разрушать аутотолерантность к аутологичному ОЭР-8. Еще одной целью настоящего изобретения является получение фрагментов нуклеиновых кислот, векторов и трансформированных клеток, и все они могут быть использованы для получения вакцин и вариантов ОЭР-8.

Сущность изобретения

Исходя из вышеуказанных данных о трансгенных нокаут-животных по ОЭР-8 и о породе бельгийская голубая и пьедмонтез, авторами настоящего изобретения была разработана теория возможной отрицательной регуляции ОЭР-8 у животных путем индуцирования эффективного и тонко настраиваемого иммунного ответа против ΟΌΡ-8. Следовательно, в основном, настоящее изобретение относится к разработке способа и средства для иммунологически отрицательной регуляции ОЭР-8 в целях эффективного увеличения мышечной массы у животных.

По сравнению с известными методами увеличения роста сельскохозяйственных животных, этот способ имеет ряд преимуществ. Прежде всего, использование способа настоящего изобретения позволяет решить проблемы, связанные с перекрестной резистентностью к патологическим микроорганизмам. Кроме того, после обработки животных в соответствии с настоящим изобретением, в мясе животного отсутствуют возможные следовые количества экзогенно введенного гормона роста. И, наконец, этические проблемы, связанные со скрещиванием и разведением крупного рогатого скота, такого как бельгийская голубая и пьедмонтез (у которых множество телят рождается с помощью кесарева сечения, и где другие органы имеют уменьшенный размер), могут быть полностью решены путем отсрочки отрицательной регуляции ОЭР-8 у животных до момента времени после их рождения (например, только у взрослых животных), при этом на самом деле вовсе необязательно, чтобы все рождающиеся животные имели увеличенную мышечную массу, а поэтому данной обработке можно подвергать лишь тех животных, которые предназначены на убой.

Поскольку количество и тип мышечных волокон определяется в процессе эмбрионального развития, то маловероятно, чтобы вакцина против СЭЕ-8 способствовала увеличению количества мышечных волокон у взрослых сельскохозяйственных животных. Поэтому нет какой-либо уверенности или вероятности того, что вакцина против СЭЕ-8 будет способна ингибировать СЭЕ-8 на том же самом уровне, как это наблюдается у животных, отрицательных по СЭЕ-8. Это, вероятно, также является нежелательным, поскольку может отрицательно отражаться на качестве мяса, репродуктивной способности и содержании жира. Тем не менее, возможность увеличения скорости роста и/или максимальной массы тела на 5-25%, достигаемое у вакцинированных животных и обусловленное послеродовой мышечной гипертрофией (в диапазоне значений, который не кажется нереалистичным) все еще представляет интерес для производителей говядины, свинины и мяса домашней птицы.

Идентичность последовательности СЭЕ-8 на аминокислотном уровне по отношению к другим членам семейства ТСЕ-β составляет лишь 30-40%. Такая низкая идентичность последовательности, по всей вероятности, не будет создавать проблем, связанных с перекрестной резистентностью антител, индуцируемых против СЭЕ-8.

Таким образом, в своем наиболее широком и общем объеме настоящее изобретение относится к способу ίη νίνο отрицательной регуляции активности фактора дифференцировки роста 8 (СЭЕ-8) у животных, включая человека, где указанный способ предусматривает эффективную презентацию иммунной системы животного иммунологически эффективного количества:

по крайней мере одного полипептида СЭЕ8 или его подпоследовательности, которые были получены так, что иммунизация указанного животного этим полипептидом СЭЕ-8 или его подпоследовательностью индуцирует вырабатывание антител против полипептида СЭЕ-8, и/или по крайней мере одного аналога СЭЕ-8, где введение в аминокислотную последовательность СЭЕ-8 по крайней мере одной модификации приведет к тому, что иммунизация этого животного данным аналогом будет индуцировать вырабатывание у него антител против полипептида СЭЕ-8. Ожидается, что в соответствии с настоящим изобретением введение 1-4 инъекций иммуногенной композиции в год будет достаточным для достижения желаемого эффекта, тогда как введение данному животному гормонов роста и антибиотиков требует гораздо более частого введения.

Настоящее изобретение также относится к аналогам СЭЕ-8, а также к фрагментам нуклеи новой кислоты, кодирующим подсерию этих аналогов. Частью настоящего изобретения являются также иммуногенные композиции, содержащие данные аналоги или фрагменты нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение также относится к способу идентификации иммуногенно эффективных аналогов СЭЕ-8, а также к способу получения композиции, включающей эти аналоги СЭЕ-8.

Описание графического материала

Фиг. 1. Модели аутовакцинных конструкций, происходящих от СЭЕ-8. Предполагается, что фрагменты, заштрихованные темно-серым цветом, представляют фрагменты, в которых имеются замены Р2 и Р30 соответственно.

А - Мономерная конструкция со вставками эпитопа Р2. 1 означает замену аминокислотных остатков 18-32 С-концевого фрагмента СЭЕ-8, состоящего из 109 аминокислот, эпитопом Р2; 2 означает замену аминокислотных остатков 52-66 С-концевого фрагмента СЭЕ-8, состоящего из 109 аминокислот, эпитопом Р2; и 3 означает замену аминокислотных остатков 83-97 С-концевого фрагмента СЭЕ-8, состоящего из 109 аминокислот, эпитопом Р2.

В - Мономерная конструкция со вставками эпитопа Р30. 1 означает замену аминокислотных остатков 21-41 С-концевого фрагмента СЭЕ-8, состоящего из 109 аминокислот, эпитопом Р30; 2 означает замену аминокислотных остатков 49-69 С-концевого фрагмента СЭЕ-8, состоящего из 109 аминокислот, эпитопом Р30; и 3 означает замену аминокислотных остатков 79-99 или 84-104 С-концевого фрагмента СЭЕ8, состоящего из 109 аминокислот, эпитопом Р30.

С - Удлиненная мономерная конструкция с заменами Р2 и Р30 в С-концевом фрагменте СЭЕ-8, состоящем из 160 аминокислот.

Э - Димерная конструкция с эпитопами Р2 и Р30, последовательно расположенными между двумя копиями С-концевого фрагмента СЭЕ-8, состоящего из 109 аминокислот.

Фиг. 2. Предполагаемая трехмерная структура белка ТСЕ-β.

Эта модель основана на аналогичном домене (ТС1-1) белка ТСЕ-β. β-складки показаны стрелками, а спирали цилиндрами.

Подробное описание изобретения

Определения.

Для более ясного понимания объема и ограничений настоящего изобретения ниже приводится подробное определение и объяснение ряда терминов, используемых в описании и формуле изобретения.

Используемые здесь термины Т-лимфоцит и Т-клетка являются взаимозаменяемыми для лимфоцитов тимического происхождения, которые ответственны за опосредованные различными клетками иммунные ответы, а также за хелперную активность в гуморальном иммунном ответе. Аналогично, используемые здесь термины В-лимфоцит и В-клетка являются взаимозаменяемыми для антителопродуцирующих лимфоцитов.

Используемый здесь термин полипептид СЭР-8 означает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность обсуждаемых выше белков СЭР-8. происходящих от ряда животных (или их усеченных вариантов, включающих основное количество В-клеточных эпитопов с интактным СЭЕ-8), а также охватывает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, идентичную ксено-аналогам этих двух белков, выделенных из других видов животных. Используемый термин обычно означает биологически активную форму, т.е. Сконцевой пептид, который у человека имеет длину в 109 аминокислот. Объем этого термина также включает в себя негликозилированные формы СЭЕ-8, которые были получены в прокариотических системах и которые имели различный характер О-гликозилирования, что было обусловлено использованием, например, дрожжевых или других эукариотических экспрессирующих систем, не относящихся к млекопитающим. Однако следует отметить, что используемый термин полипептид СЭЕ-8 означает, что рассматриваемый полипептид обычно не является иммуногенным, если он введен данному обрабатываемому животному. Другими словами, указанный полипептид СЭЕ-8 представляет собой аутологичный белок или ксеноаналог такого аутологичного белка, который обычно не индуцирует требуемый иммунный ответ против СЭЕ-8 данного животного.

Аналог СЭЕ-8 представляет собой полипептид, первичная структура которого была подвергнута изменению. Такое изменение может быть выражено, например, в форме гибрида полипептида СЭЕ-8 с подходящим партнером по слиянию (т.е. изменение в первичной структуре заключается исключительно в С- и/или Νконцевых добавлениях аминокислотных остатков) и/или оно может быть выражено в форме инсерций, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности полипептида СЭЕ-8. Термин аналог СЭЕ-8 также охватывает дериватизованные молекулы СЭЕ-8, см. нижеприведенное обсуждение, касающееся модификаций СЭЕ-8.

Следует отметить, что для продуцирования нужного иммунного ответа против СЭЕ-8 у человека в качестве вакцины может быть использован собачий аналог СЭЕ-8. Определенный выше термин аналог СЭЕ-8 также рассматривается как ксено-аналог, используемый для иммунизации.

Термин полипептид в настоящем описании означает короткие пептиды, имеющие от 2 до 10 аминокислотных остатков, олигопептиды, имеющие от 11 до 100 аминокислотных остат ков, и полипептиды, имеющие более чем 100 аминокислотных остатков.

Кроме того, этот термин также означает белки, т. е. функциональные биомолекулы, содержащие по крайней мере один полипептид; а в случае включения по крайней мере два полипептида, они могут образовывать комплексы, либо они могут быть ковалентно или нековалентно связанными. Указанный полипептид(ы) в белке может быть гликозилированным и/или липидизированным и/или он может включать простетические группы.

Термин подпоследовательность означает любую последовательную цепь, состоящую по крайней мере из 3 аминокислот, или если это необходимо по крайней мере из 3 нуклеотидов, и происходящую непосредственно от природной аминокислотной последовательности СЭЕ-8 или нуклеиновокислотной последовательности соответственно.

Термин животное в контексте настоящего описания означает вообще вид животного (предпочтительно млекопитающего), такой как Ното 8ар1еи8. Саше ботезйсиз и т.п., а не одно отдельное животное. Однако этот термин означает также популяцию таких видов животных, поскольку важно, чтобы индивиды, иммунизованные способом настоящего изобретения, имели, в основном, тот же самый СЭЕ-8, что позволяет иммунизировать этих животных одним и тем же иммуногеном(ами). Если, например, генетические варианты СЭЕ-8 присутствуют в другой популяции, то может оказаться необходимым использовать различные иммуногены в этих различных популяциях для подавления аутотолерантности по отношению к СЭЕ-8 в каждой популяции. Для каждого специалиста очевидно, что в контексте настоящего изобретения, указанным животным является жизнеспособное животное с нормальной иммунной системой. При этом предпочтительно, чтобы указанным животным являлось позвоночное, такое как млекопитающее.

Термин отрицательная регуляция активности СЭЕ-8 ίη νίνο означает подавление у данного живого организма ряда взаимодействий между СЭЕ-8 и его рецепторами (или между СЭЕ-8 и другими возможными биологически важными партнерами по связыванию для этой молекулы). Данная отрицательная регуляция может быть достигнута посредством нескольких механизмов, одним и самым простым из которых является взаимодействие с активным сайтом в СЭЕ-8 путем связывания с антителом. Однако объем настоящего изобретения включает также связывание с антителом, которое приводит к удалению СЭЕ-8 клетками-акцепторами (такими как макрофаги и другие фагоцитарные клетки).

Выражение эффективная презентация ... иммунной системе означает, что иммунная система данного животного подвергается имму ногенной стимуляции регулируемым способом. Из нижеследующего описания видно, что такая стимуляция иммунной системы может быть осуществлена рядом методов, из которых наиболее важным является вакцинация фармакциной, содержащей полипептид (т.е. вакциной, которую вводят для лечения или ослабления имеющегося заболевания) или вакцинация фармакциной, содержащей нуклеиновую кислоту. Главным достигнутым результатом является то, что иммунокомпетентные клетки этого животного вступают в конфронтацию с антигеном иммунологически эффективным способом, однако, с точки зрения идеи настоящего изобретения конкретный способ достижения этого результата имеет менее важное значение.

Термин иммунологически эффективное количество имеет свое обычное значение, известное специалистам, то есть представляет собой количество иммуногена, способное индуцировать иммунный ответ, в основном, на те патогенные агенты, которые обладают общими иммунологическими признаками с данным иммуногеном.

Используемое здесь выражение СЭЕ-8 был модифицирован означает, что была осуществлена химическая модификация полипептида, который составляет остов СЭЕ-8. Такой модификацией может быть, например, дериватизация (например, алкилирование, ацилирование, этерификация и т.п.) некоторых аминокислотных остатков в последовательности СЭЕ-8, но при этом следует отметить, что в нижеприведенном описании предпочтительные модификации включают изменения первичной структуры (или добавление к первичной структуре) аминокислотной последовательности СЭЕ-8, т.е. модификации, которые приводят к получению аналога СЭЕ-8 с модифицированной первичной аминокислотной последовательностью.

При обсуждении аутотолерантности по отношению к СЭЕ-8 следует учесть, что поскольку СЭЕ-8 является аутологичным белком в вакцинируемой популяции, то у нормальных индивидуумов данной популяции не вырабатывается ответ против СЭЕ-8; хотя нельзя исключить, что случайные индивидуумы в данной популяции животных могут оказаться способными продуцировать антитела против отрицательного СЭЕ-8, что является, например, частью аутоиммунного нарушения. В любом случае, животное будет, в основном, лишь аутотолерантным к своему собственному СЭЕ-8, но нельзя исключить, что аналоги СЭЕ-8, происходящие от животных других видов или от популяции, имеющей другой фенотип СЭЕ-8, будут также толерантно восприниматься указанным животным.

Чужеродный Т-клеточный эпитоп (или чужеродный эпитоп Т-лимфоцита) представляет собой пептид, который способен связываться с молекулой МНС и стимулирует Т клетки у животного данного вида. Предпочтительными чужеродными Т-клеточными эпитопами настоящего изобретения являются смешанные эпитопы, т.е. эпитопы, которые связываются с основной фракцией молекул МНС конкретного класса у животного определенного вида или популяции. Известно только очень ограниченное число таких смешанных Тклеточных эпитопов, и они будут подробно обсуждаться ниже. Следует отметить, что для того, чтобы иммуногены, используемые в соответствии с настоящим изобретением, были эффективны по возможности для большей части популяции животных, может оказаться необходимым 1) встраивание нескольких чужеродных Тклеточных эпитопов в тот же самый аналог СЭЕ-8 или 2) получить несколько аналогов СЭЕ-8, где каждый аналог имеет другой встроенный смешанный эпитоп. При этом следует отметить, что понятие чужеродные Т-клеточные эпитопы также охватывает использование скрытых Т-клеточных эпитопов, т. е. эпитопов, которые происходят от аутологичного белка и которые обнаруживают свое иммуногенное поведение лишь в том случае, когда они присутствуют в изолированной форме, не являясь частью рассматриваемого аутологичного белка.

Чужеродный эпитоп Т-лимфоцита (чужеродный Т_н-эпитоп) представляет собой чужеродный Т-клеточный эпитоп, который связывается с молекулой МНС класса II и может быть презентирован на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АПК), связанной с молекулой МНС класса II.

Термин функциональная часть (био)молекулы в контексте настоящего описания означает часть молекулы, которая ответственна по крайней мере за один из биохимических или физиологических эффектов, осуществляемых данной молекулой. Специалистам хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы имеют активный центр, который ответственен за эффекты, вызываемые рассматриваемой молекулой. Другие части данной молекулы могут служить для усиления стабилизации или растворимости, а поэтому могут быть удалены в том случае, когда это не является необходимым для некоторых вариантов осуществления изобретения. Так, например, в качестве модифицирующей части СЭЕ-8 могут быть использованы некоторые другие цитокины (см. подробное обсуждение, привиденное ниже), и в этом случае вопрос о стабильности может оказаться неактуальным, поскольку связывание с СЭЕ-8 уже обеспечивает необходимую стабильность.

Термин адъювант имеет значение, которое обычно используется специалистами в области технологии изготовления вакцин, то есть он означает вещество или композицию, которое(ая) 1) само(а) по себе не способно(а) индуцировать иммунный ответ против иммуногена вакцины, но которое(ая) 2) тем не менее, способно^) усиливать иммунный ответ против данного иммуногена. Или другими словами вакцинация только одним адъювантом не дает иммунного ответа против данного иммуногена, вакцинация иммуногеном может индуцировать, а может и не индуцировать иммунный ответ против данного иммуногена, тогда как комбинированная вакцинация иммуногеном и адъювантом индуцирует более сильный иммунный ответ против данного иммуногена по сравнению с ответом, индуцированным лишь одним иммуногеном.

В контексте настоящего описания, направленная доставка молекулы означает такую ситуацию, при которой молекула, вводимая данному животному, будет присутствовать преимущественно в определенной(ых) ткани(ях) или будет преимущественно ассоциироваться с клетками или клеткой определенных типов. Этот эффект достигается рядом способов, включая получение данной молекулы в составе композиции, облегчающей направленную доставку, либо введение в данную молекулу групп, облегчающих направленную доставку. Эти вопросы будут более подробно обсуждаться дальше.

Выражение стимуляция иммунного ответа означает, что рассматриваемое вещество или композиция обладает общим неспецифическим иммуностимулирующим действием. Ряд адъювантов и предполагаемых адъювантов (таких как некоторые цитокины) обладают общей способностью стимулировать иммунную систему. Результатом использования иммуностимулирующего агента является повышенная бдительность иммунной системы, означающая, что иммунизация путем его одновременного или последовательного введения с иммуногеном индуцирует более эффективный иммунный ответ по сравнению с использованием лишь одного иммуногена.

Предпочтительные варианты осуществления отрицательной регуляции активности СБЕ-8 Предпочтительно, чтобы полипептид СЭЕ8, используемый в качестве иммуногена в способе настоящего изобретения, представлял собой модифицированную молекулу, где в аминокислотной последовательности СЭР-8 присутствует по крайней мере одна замена, поскольку возможность достижения полного разрушения аутотолерантности по отношению к СЭР-8, что имеет очень важное значение, значительно облегчается именно этим путем. При этом следует отметить, что не исключена возможность использования таких модифицированных СЭР-8 в композициях, которые дополнительно облегчают разрушение аутотолерантности против СЭР8, например, в композициях, содержащих некоторые адъюванты, которые более подробно обсуждаются ниже.

Было показано (Эа1иш I. с1 а1., 1996, 1. 1ттипо1., 157: 4796-4804), что потенциально аутореактивные В-лимфоциты, распознающие аутологичные белки, присутствуют у физиологически нормальных индивидуумов. Однако для того чтобы эти В-лимфоциты действительно индуцировали вырабатывание антител, реагирующих с соответствующими аутологичными белками, им необходима помощь цитокинпродуцирующих хелперных Т-лимфоцитов (Т_нклеток или Т_н-лимфоцитов). Обычно такая помощь не обеспечивается, поскольку Тлимфоциты, в основном, не распознают Тклеточные эпитопы, происходящие от аутологичных белков при их презентации антигенпрезентирующими клетками (АПК). Однако при введении элемента чужеродности в аутологичный белок (т. е. при введении иммунологически значимой модификации) Т-клетки, распознающие этот чужеродный элемент, активируются после распознавания данного чужеродного эпитопа на антиген-презентирующей клетке (АПК) (такой как исходная мононуклеарная клетка). Поликлональные В-лимфоциты (которые также являются специализированными АПК), способные распознавать аутологичные эпитопы на модифицированном аутологичном белке, также интернализируют антиген, а затем презентируют его чужеродный(е) Т-клеточный(е) эпитоп(ы), после чего активированные Тлимфоциты обеспечивают помощь цитокинов указанным аутореактивным поликлональным Влимфоцитам. Поскольку антитела, продуцируемые указанными поликлональными В-лимфоцитами, реагируют с различными эпитопами на модифицированном полипептиде, включая и те эпитопы, которые также присутствуют в нативном полипептиде, то индуцируется антитело, перекрестно реагирующее с немодифицированным аутологичным белком. В заключение можно отметить, что Т-лимфоциты могут приводить к такому эффекту, как если бы данная популяция поликлональных В-лимфоцитов распознавала полностью чужеродный антиген, тогда как на самом деле, чужеродными для данного хозяина является(ются) лишь встроенный(е) эпитоп(ы).

Для достижения разрушения аутотолерантности существует несколько известных способов модификации пептидного аутологичного антигена. Следовательно, в соответствии с настоящим изобретением такая модификация может включать введение по крайней мере одного чужеродного Т-клеточного эпитопа, и/или введение по крайней мере одной первой части, которая обеспечивает направленную доставку модифицированной молекулы к антигенпрезентирующей клетке (АПК), и/или введение по крайней мере одной второй части, которая стимулирует иммунную систему, и/или введение по крайней мере одной третьей части, которая оптимизирует презентацию модифицированного полипептида СЭЕ-8 иммунной системе.

Однако все эти модификации должны быть осуществлены при сохранении в активном СЭЕ8 основной фракции исходных эпитопов для Влимфоцитов, поскольку в этом случае распознавание В-лимфоцитами нативной молекулы усиливается.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения боковые группы (в форме чужеродных Т-клеточных эпитопов или их вышеупомянутых первой, второй и третьей частей) вводят путем ковалентного или нековалентного связывания. Это означает, что фрагменты из аминокислотных остатков, происходящих от СЭЕ-8, дериватизируют без изменения их первичной аминокислотной последовательности, либо, по крайней мере, без введения изменений в пептидные связи между отдельными аминокислотами в цепи.

В альтернативном и предпочтительном варианте осуществления изобретения осуществляют замену, и/или делецию, и/или инсерцию, и/или добавление аминокислот (которое может быть осуществлено рекомбинантными методами или методами пептидного синтеза; модификации, которые включают более длинные фрагменты аминокислот могут приводить к образованию гибридных полипептидов). Одной из предпочтительных версий данного варианта осуществления изобретения является использование метода, описанного в заявке АО 95/05849, в которой описан метод отрицательной регуляции аутологичных белков путем иммунизации аналогами данных аутологичных белков, где ряд аминокислотных последовательностей был заменен соответствующим рядом аминокислотных последовательностей, каждая из которых содержит чужеродный иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп, причем в данном аналоге, в то же самое время, была полностью сохранена третичная структура аутологичного белка. При этом в целях настоящего изобретения достаточно, чтобы данная модификация (будь то инсерция, добавление, делеция или замена аминокислот) продуцировала чужеродный Т-клеточный эпитоп и в то же самое время сохранялся основной ряд В-клеточных эпитопов в СЭЕ-8. Однако для достижения максимальной эффективности в индуцировании иммунного ответа предпочтительно, чтобы в модифицированной молекуле полностью сохранялась третичная структура СЭЕ-8.

Нижеследующие формулы описывают СЭЕ-8-конструкции, в основном, охватываемые настоящим изобретением (МСЮ,) (ΟϋΓ-θβ!) _ηι (МООг) _Зг (6ΌΓ-8_β2) _П2 · . . . (МОО_Х) „ (ООГ-8„) „_х (I) где СЭЕ-8_е1 - (СЭЕ-8_ех)_пх представляют собой Вклеточный эпитоп, содержащий подпоследовательности СЭЕ-8, которые независимо являются идентичными или неидентичными и которые могут содержать или не содержать чужеродную боковую группу, х представляет целое число >3, п1-пх представляют целые числа х > 0 (где по крайней мере один из них > 1), МОЭ₁-МОЭ_х представляют х модификаций, введенных между сохраненными В-клеточными эпитопами, а к1-кх представляют собой целые числа х > 0 (где по крайней мере один из них > 1, если боковые группы не были введены в последовательности СЭЕ-8_е). Таким образом, с учетом общих функциональных ограничений на иммуногенность данных конструкций, настоящее изобретение позволяет осуществлять все перестановки и все типы модификаций в исходной последовательности СЭЕ-8. Таким образом, настоящее изобретение включает модифицированный СЭЕ-8, полученный путем удаления тех частей последовательности СЭЕ-8, которые, например, оказывают неблагоприятное действие ίη νίνο, или удаление тех частей, которые могут продуцировать нежелательные иммунологические реакции.

Сохранение основной фракции Вклеточных эпитопов или даже всей третичной структуры белка, который был подвергнут модификации, описанной в данной заявке, может быть достигнуто несколькими путями. Одним из них является просто получение поликлональной антисыворотки против СЭЕ-8 (например, антисыворотки, полученной от кроликов) с последующим использованием этой антисыворотки в качестве тест-реагента (в конкурентном ЕЬ18А) против продуцируемых модифицированных белков. Модифицированные варианты (аналоги), которые реагируют с данной антисывороткой на таком же уровне, как и СЭЕ-8, должны рассматриваться как аналоги, имеющие ту же самую третичную структуру, что и СЭЕ-8, тогда как аналоги, обладающие ограниченной (но еще значимой и специфической) реактивностью с такой антисывороткой, рассматриваются как аналоги, сохраняющие значительную фракцию исходных В-клеточных эпитопов.

Альтернативно, отбор моноклональных антител, реагирующих с различаемыми эпитопами на СЭЕ-8, могут быть получены и использованы в качестве тест-панели. Этот способ имеет то преимущество, позволяющее проводить 1) эпитопное картирование СЭЕ-8 и 2) картирование эпитопов, сохранившихся в полученных аналогах.

Само собой разумеется, третий способ должен быть направлен на разрешение 3-мерной структуры СЭЕ-8 или ее биологически активной усеченной формы (см. выше) и ее сравнение с разрешенной трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерная структура может быть разрешена с помощью исследований методом рентгенографии и ЯМР-спектроскопии. Кроме того, для получения полезной информа ции о третичной структуре данной молекулы, такая информация о третичной структуре может быть до некоторой степени получена методом кругового дихроизма, который имеет то преимущество, что требует лишь использования полипептида в чистой форме (тогда как рентгенография требует получения кристаллизованного полипептида, а ЯМР-спектроскопия требует получения изотопных вариантов данного полипептида(ов)). Однако в конечном счете рентгенография и/или ЯМР являются необходимыми для получения заключительных данных, поскольку круговой дихроизм дает лишь косвенные данные относительно правильной 3-мерной структуры с использованием информации о элементах вторичной структуры.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения предусматривается использование множественных презентаций эпитопов СЭР-8 для В-лимфоцитов (т.е. формула I, где по крайней мере один В-клеточный эпитоп присутствует в двух положениях). Этот эффект может быть достигнут различными путями, например, просто путем получения гибридных полипептидов, включающих структуру (СЭР-8),,,, где т представляет целое число > 2 с последующим введением обсуждаемых здесь модификаций по крайней мере в одну из последовательностей СЭР-8, или альтернативно, введением эти модификаций по крайней мере между двумя аминокислотными последовательностями СЭР-8. При этом предпочтительно, чтобы эти введенные модификации включали по крайней мере одну дупликацию эпитопа для Влимфоцита и/или введение гаптена.

Как упоминалось выше, включение чужеродного Т-клеточного эпитопа может быть осуществлено путем введения по крайней мере одной инсерции, добавления, делеции или замены аминокислот. Само собой разумеется, что нормальной ситуацией является введение в аминокислотную последовательность более чем одной замены (например, инсерции или замены Тклеточного эпитопа), но главной целью является достижение того, чтобы аналог СЭР-8, при его процессинге для представления антигенпрезентирующей клеткой (АПК), создавал чужеродный иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп, презентируемый в ассоциации с молекулой МНС класса II на поверхности АПК. Таким образом, аминокислотная последовательность СЭР-8 в соответствующем положении включает ряд аминокислотных остатков, которые могут также обнаруживаться в чужеродном эпитопе Т_н, и последующее введение чужеродного эпитопа Т_н может быть осуществлено путем получения остальных аминокислот указанного чужеродного эпитопа посредством инсерции, добавления, делеции и замены аминокислот. Другими словами, введение полного эпитопа Т_н путем инсерции или замены не является обязательным.

Предпочтительно, чтобы число инсерций, делеций, замен или добавлений аминокислот составляло по крайней мере 2, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 25 инсерций, замен, добавлений или делеций. Кроме того предпочтительно, чтобы число инсерций, делеций, замен или добавлений аминокислот не превышало 150, например по большей мере 100, по большей мере 90, по большей мере 80 и по большей мере 70. Особенно предпочтительно, чтобы число инсерций, делеций, замен или добавлений аминокислот не превышало 60, а особенно это число не должно превышать 50 или даже 40. Более предпочтительно это число не должно быть больше 30. Что касается добавлений аминокислот, то в этой связи следует отметить, что если полученная конструкция имеет форму гибридного полипептида, то их число часто значительно превышает 150.

В предпочтительных вариантах своего осуществления настоящее изобретение относится к модификации путем введения по крайней мере одного чужеродного иммунодоминантного Т_н-эпитопа. В этой связи следует отметить, что иммунная доминантность Тн-эпитопа зависит от рассматриваемого вида животного. Используемый здесь термин иммунодоминантность просто означает эпитопы, которые у вакцинированного индивидуума индуцируют значительный иммунный ответ, однако, хорошо известно, что Тн-эпитоп, который является иммунодоминантным у одного индивидуума, необязательно будет иммунодоминантным у другого индивидуума того же вида, даже если он способен связываться с молекулами МНС-11 в указанном индивидууме.

Другой важной целью является достижение МНС-рестрикции Т_н-эпитопов. Нативные Т_н-эпитопы, в основном, являются МНСрестриктированными эпитопами, т.е. определенный пептид, составляющий Тн-эпитоп, будет эффективно связываться с подсерией молекул МНС класса II. Это, в свою очередь, приводит к тому, что в большинстве случаев использование одного конкретного Тн-эпитопа будет приводить к образованию вакцинного компонента, который является эффективным только для определенной части популяции, и в зависимости от размера этой части он может оказаться необходимым включение дополнительных Т_н-эпитопов в ту же самую молекулу, или альтернативно, получение многокомпонентной вакцины, где указанными компонентами являются варианты СЭР-8, которые отличаются друг от друга природой введенного Тн-эпитопа.

Если МНС-рестрикция используемых Тклеток является абсолютно неизвестной (например, в ситуации, где вакцинированные животные имеют плохо определенным МНСсостав), то часть этой популяции животных, сенсибилизированных конкретной вакцинной композицией, может быть определена по следующей формуле:

⁽¹¹⁾ <«1 где р₁ представляет частоту популяции, восприимчивой к ί-тому чужеродному Т-клеточному эпитопу, присутствующему в указанной вакцинной композиции, а η означает полное число чужеродных Т-клеточных эпитопов в данной вакцинной композиции. Таким образом, вакцинная композиция, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, имеющих частоту ответов в данной популяции 0,8, 0,7 и 0,6 соответственно, должна давать ответ

- 0,2 х 0,3 х 0,4 = 0,976

т.е. статистически, 97,6% популяции будет вырабатывать МНС-11-опосредованный ответ на данную вакцину.

Вышеуказанная формула не применима в тех случаях, когда известна более или менее точная картина МНС-рестрикции используемых пептидов. Если, например, определенный пептид связывается лишь с молекулами МНС-11 человека, кодируемыми аллелями НЕЛ-ОК, а именно, ЭКР ΌΒ3. ЭК5 и ΌΒ7. то использование этого пептида вместе с другим пептидом, который связывается с остальными молекулами МНС-ΙΙ, кодируемыми аллелями НЬА-ЭК., будет осуществлять 100% сенсибилизацию рассматриваемой популяции. Аналогично, если второй пептид связывает только ЭК3 и ЭК5, то добавление этого пептида вообще не будет приводить к увеличению сенсибилизации. Если вычисление ответа популяции основано только на МНС-рестрикции Т-клеточных эпитопов в данной вакцине, то часть популяции, сенсибилизированной специфической вакцинной композицией, может быть определена по следующей формуле:

= ⁽¹¹¹⁾ 1=1 где <р, означает сумму частот в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связываются с одним из Тклеточных эпитопов в указанной вакцине, и которые принадлежат )-тому из 3 известных локусов НЬА (ΌΡ, ЭК и ЭО): на практике, сначала определяют какие именно молекулы МНС будут распознавать каждый Т-клеточный эпитоп в данной вакцине, после этого молекулы МНС типируют (ΌΡ, ЭК и ЭР) - а затем, индивидуальные частоты различных перечисленных аллельных гаплотипов суммируют для каждого типа, в результате чего получают φ₁, φ₂ и φ₃.

Может случиться так, что величина ρ₁ в формуле ΙΙ превышает соответствующее теоретическое значение π₁ = <^ιν>

>-ι где ν означает сумму частот в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связываются с ί-тым Т клеточным эпитопом в указанной вакцине, и которые принадлежат |-тому из 3 известных локусов НЬА (ΌΡ, ЭК и ЭР). Это означает, что в 1-π, популяций, частота респондентов равна Γ,',ΐίΙιι.ιΙ—ΐ = ^(ρί^-πί)^/(1^-πί).

Поэтому формула III может быть скорректирована с получением формулы V

где при отрицательном значении 1-Γ_Γβ8υ_υ3ι_ι принимается равным нулю. Следует отметить, что формула V требует, чтобы все эпитопы имели гаплотип, картированный против идентичных серий гаплотипов.

Поэтому при отборе Т-клеточных эпитопов, вводимых в аналог 1Ь-5, важно иметь всю информацию об имеющихся эпитопах, а именно: 1) данные о частоте респондентов в популяции для каждого эпитопа, 2) данные о МНСрестрикции и 3) данные о частоте в популяции соответствующих гаплотипов.

Существует ряд нативных смешанных Тклеточных эпитопов, которые активны в крупной популяции индивидуумов данного вида животных или популяции животных, и предпочтительно, чтобы они были введены в данную вакцину, что позволило бы минимизировать необходимость в получении очень большого числа различных аналогов СЭР-8 в той же самой вакцине.

В соответствии с настоящим изобретением, смешанным эпитопом может быть нативный Т-клеточный эпитоп человека, такой как эпитоп, происходящий от токсоида столбняка (например, эпитопы Р2 и Р30), токсоида дифтерии, гемагглютинина (НА) вируса гриппа, и антигена С8 Ρ. Ра1с1ратит. Само собой разумеется, что при вакцинировании животных, отличных от человека, необходимо использовать нативные Тклеточные эпитопы, которые являются смешанными у рассматриваемых животных.

За последние годы был идентифицирован ряд других смешанных Т-клеточных эпитопов. В частности, были идентифицированы пептиды, способные связываться с большой частью молекул НЬА-ЭК, кодированных различными аллелями НЬА-ЭК, и все эти Т-клеточные эпитопы могут быть введены в аналоги СЭЕ-8, используемые в соответствии с настоящим изобретением. См. также эпитопы, обсуждаемые в нижеуказанных работах, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки: заявка XV О 98/23635 (Ргахсг 1.Н. с! а1., переуступленная Т1с Ишусгайу οί РиссгМапб): 8οιι(1ι\νοοά 8. с! а1., 1998, 1. 1ттипо1. 160: 3363-3373; 8тдщад11а Е. с! а1., 1988, Ыа!игс 336: 778-780; С1ис/ К.М. с! а1., 1993, 1. Ехр. Мсб. 178: 27-47; Наттсг 1. с! а1., 1993, Сс11 74: 197-203 и Еа1к К. с! а1., 1994, 1ттиподспсйск 39:230-242. В последней работе также рассматриваются лиганды НЬА-ЭР и -ΌΡ. Все эпитопы, перечисленные в этих 5 работах, являются подходящими в качестве натив ных эпигонов-кандидатов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, поскольку они являются эпитопами, имеющими с ними общие мотивы.

Альтернативно, таким эпитопом может. быть любой искусственный Т-клеточный эпитоп, способный связываться с большим числом молекул МНС класса II. В этой связи, пан-ОКэпитопные пептиды (ΡΑΌΚΕ), описанные в заявке УО 95/07707 и в соответствующей работе А1ехапбет I. е! а1., 1994, 1ттипйу 1: 751-761 (оба описания включены сюда в качестве ссылки), представляют интерес как кандидаты для эпитопов, используемых в соответствии с настоящим изобретением. Следует отметить, что наиболее эффективные пептиды ΡΑΌΚΕ, описанные в этих работах, несут Ό-аминокислоты у С- и Ν-концов для улучшения стабильности при их введении. Однако главной целью настоящего изобретения является введение соответствующих эпитопов как части модифицированного СЭР-8, который затем должен быть ферментативно расщеплен внутри лизосомного компартмента АПК, что способствует последующей презентации в ассоциации с молекулой МНС-11, а поэтому включение Ό-аминокислот в эпитопы, используемые в настоящем изобретении, не является целесообразным.

Одним из особенно предпочтительных пептидов ΡΑΌΚΕ является пептид, имеющий аминокислотную последовательность

АКЕУААУТЬКААА или его иммунологически эффективную подпоследовательность. Эти и другие эпитопы, у которых также отсутствует МНС-рестрикция, являются предпочтительными Т-клеточными эпитопами, которые должны присутствовать в аналогах СЭР-8, используемых в способе настоящего изобретения. Такие суперсмешанные эпитопы рассчитаны на самые простые варианты осуществления настоящего изобретения, где иммунной системе указанного вакцинированного животного представляют лишь один модифицированный СЭР-8.

Как было упомянуто выше, модификация СЭР-8 может также включать введение первой части, которая нацеливает этот модифицированный СЭР-8 на АПК или на В-лимфоцит. Так, например, такой первой частью может быть специфический партнер по связыванию для специфического поверхностного антигена Влимфоцита и для специфического поверхностного антигена АПК. Многие такие специфические поверхностные антигены известны специалистам. Так, например, такой молекулой может быть углевод, для которого имеется рецептор на В-лимфоците или на АПК (например, маннан или манноза). Альтернативно, второй частью может быть гаптен. Кроме того, в качестве первой молекулы (поверхностной молекулой может быть, например, рецептор РСу макрофагов или моноцитов, такой как РСуК1, или, альтернатив но, любой другой специфический поверхностный маркер, такой как СЭ40 или СТЬА-4) может быть использован фрагмент антитела, который специфически распознает молекулу на поверхности АПК или лимфоцитов. Следует отметить, что все эти проиллюстрированные нацеливающие молекулы могут быть использованы как часть адъюванта, также см. ниже.

В качестве альтернативы или в дополнение к нацеливанию этого модифицированного полипептида СВР-8 на клетки определенного типа в целях достижения усиленного иммунного ответа, уровень восприимчивости иммунной системы можно также повысить посредством включения второй вышеупомянутой молекулы, стимулирующей данную иммунную систему. Типичными примерами этих вторых молекул являются цитокины и белки теплового шока, а также их эффективные части.

Подходящими цитокинами, используемыми в соответствии с настоящим изобретением, являются цитокины, которые, в вакцинной композиции, обычно также функционируют как адъюванты т.е., например, γ-интерферон (ΙΕΝ-γ), Р1!3Ь, интерлейкин-1 (1Ь-1), интерлейкин-2 (1Ь2), интерлейкин-4 (1Ь-4), интерлейкин-6 (1Ь-6), интерлейкин-12 (1Э-12), интерлейкин-13 (ГЛ-13), интерлейкин-15 (ГЛ-15) и гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р); альтернативно, данная функциональная часть этой молекулы цитокина может оказаться достаточной в качестве второй молекулы. Что касается использования таких цитокинов в качестве адъювантов, то его обсуждение см. ниже.

В соответствии с настоящим изобретением подходящими белками теплового шока, используемыми в качестве второй молекулы, могут быть Η8Ρ70, Η8Ρ90, Н8С70, СКР94 (также известный как др96, см. Уеатксй ΡΑ. е! а1. 1998, Вюсйетщйу 37: 5709-19) и СКТ (кальретикулин).

Альтернативно, второй молекулой может быть токсин, такой как листериолицин (ГЬО), липид А и термочувствительный энтеротоксин. Также интересные возможности представляет ряд микобактериальных производных, таких как ΜΌΡ (мурамилдипептид), и сложные диэфиры трегалозы, такие как ΊΌΜ и ΙΌΕ.

Кроме того, возможность введения третьей молекулы, которая увеличивает степень презентации модифицированного СВР-8 иммунной системе, является важным вариантом осуществления изобретения. Специалистам известно несколько примеров такого подхода. Так, например, известно, что якорь для пальмитоиловой липидизации в белке ОкрА Воттейа ЬищбогГеп может быть использован для получения самостимулирующихся полипептидов (см. например, УО 96/40718). Очевидно, что эти липидированные белки образуют мицеллоподобные структуры с сердцевиной, состоящей из частей якоря для липидизации данных полипептидов, а остальные части выступающих из них молекул обеспечивают множественные презентации антигенных детерминант. Следовательно, применение этого и родственного ему способа с использованием различных якорей для липидизации (например, миристоильной группы, фарнезильной группы, геранил-геранильной группы, СР1-якоря и Ν-ацилдиглицеридной группы) является предпочтительным вариантом осуществления изобретения, а особенно потому, что получение такого якоря для липидизации в рекомбинантно-продуцируемом белке является достаточно простым и требует лишь использования, например, природной сигнальной последовательности в качестве партнера по гибридизации для данного модифицированного полипептида СЭЕ-8. Другой возможностью является использование фрагмента С3б фактора комплемента С3 или самого С3 (см. Эетркеу е! а1., 1996, 8спепсе 271, 348-350 и Бои & КоЫет, 1998, №1ите Вю!есйпо1оду 16, 458-462).

Альтернативным вариантом осуществления изобретения, который также обеспечивает предпочтительную презентацию множества (например, по крайней мере 2) копий важных эпитопных областей СЭЕ-8 иммунной системе, является ковалентное или нековалентное связывание СЭЕ-8, его подпоследовательности или его вариантов с определенными молекуламиносителями. Так, например, могут быть использованы полимеры, например, углеводы, такие как декстран, см., например, Беек А. е! а1., 1994, Уассте 12: 1160-1166; Беек А. е! а1., 1990, 1. 1ттипо1., 145: 3594-3600, а в качестве альтернативы могут быть также использованы манноза и маннан. Ценными партнерами по связыванию также являются интегральные мембранные белки, происходящие, например, от Е.сой и других бактерий. Предпочтительными и эффективными партнерами по связыванию также являются традиционные молекулы-носители, такие как гемоцианин лимфы моллюска (КЕН), токсоид столбняка, дифтерийный токсоид и бычий сывороточный альбумин (В8А).

Очевидно, что некоторые области нативного СЭР-8 являются особенно подходящими для осуществления модификаций. Было предположено, что модификации по крайней мере в одной из нижеследующих последовательностей С-концевого СЭЕ-8 могут приводить к получению подходящей иммуногенной молекулы: остатки 18-41, 49-69 или 79-104 в 8Ер Ш ΝΟ: 11 или 12 либо соответствующих последовательностей от полипептидов СЭЕ-8, происходящих от различных видов животных, кроме человека, коров, свиней, кур или индеек. При этом следует подчеркнуть, что рассматриваемые выбранные области а) сохраняют В-клеточные эпитопы, Ь) сохраняют вторичную, третичную и четвертичную структуры и т.п. В любом случае, как обсуждалось в настоящем описании, доста точно легко проскринировать серию модифицированных молекул СЭЕ-8 (каждый из них был введен Т-клеточный эпитоп в разных положениях) на иммунную реактивность с антителами, вырабатываемыми против нативного СЭЕ-8. Особенно предпочтительно, чтобы эта модификация была осуществлена путем замены аминокислотной последовательности по крайней мере одной аминокислотной последовательностью равной или отличающейся длины, которая содержит чужеродный Т_н-эпитоп. Рациональная основа таких конструкций подробно обсуждается в примерах. Предпочтительной также является инсерция (или замена) в любой одной из областей петли или в гибких концах (остатки 12, 18-30, 42-51, 82-86 и 105-109) С-концевого фрагмента СЭЕ-8.

Приготовление СБЕ-8 и модифицированных полипептидов СБЕ-8

Для осуществления презентации полипептида СЭЕ-8 или модифицированного полипептида СЭЕ-8 иммунной системе животного путем его введения данному животному, получение этого полипептида осуществляют в соответствии с методами, которые, в общих чертах, известны специалистам.

Получение вакцин, которые содержат пептидные последовательности в качестве активных ингредиентов, хорошо известно специалистам и проиллюстрировано в патентах США 4608251, 4601903, 4599231, 4599230, 4596792 и 4578770, которые включены сюда в качестве ссылки. Обычно такие вакцины получают в виде инъецируемых или жидких растворов или суспензий либо они могут быть также получены в виде твердых форм, подходящих для приготовления жидкого раствора или суспензии непосредственно перед инъекцией. Активный иммуногенный ингредиент часто смешивают с наполнителем, который является фармацевтически приемлемым и совместимым с активным ингредиентом. Подходящими наполнителями являются вода, физиологический раствор, декстроза, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации. Кроме того, если это необходимо, то эта вакцина может содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, забуферивающие агенты для коррекции рН, или адъюванты, которые усиливают эффективность данных вакцин; см. подробное обсуждение адъювантов, приведенное ниже.

Указанные вакцины обычно вводят парентерально, путем инъекции, например, подкожно, внутрикожно или внутримышечно. Другими композициями, которые являются подходящими для других способов введения, являются суппозитории, а в некоторых случаях композиции для перорального, трансбуккального, сублингвального, внутрибрюшинного, внутривагинального, анального, эпидурального, спинального и внутричерепного введения. Для суппозиториев тра диционными связующими и носителями являются, например, полиалкаленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть изготовлены из смесей, содержащих активный ингредиент в количестве от 0,5 до 10%, а предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают обычно используемые носители фармацевтической чистоты, такие как, например, маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрийсодержащий сахарин, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, драже, капсул, композиций пролонгированного высвобождения или порошков и содержат 10-95%, а предпочтительно 25-70% активного ингредиента. Компонентом, представляющим интерес для пероральных композиций (а также возможным партнером по связыванию), является холерный токсин.

Эти полипептиды могут быть введены в вакцину в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемыми солями являются кислотно-аддитивные соли (образованные свободными аминогруппами пептида) и соли, образованные неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислота, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные свободными карбоксильными группами, могут также быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа(111), и из таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т. п.

Эти вакцины вводят способом, совместимым с данной лекарственной формой и в количестве, которое является терапевтически эффективным и иммуногенным. Количество вводимой вакцины зависит от состояния индивидуума, включая, например, способность иммунной системы данного индивидуума индуцировать иммунный ответ, и степень нужной защиты. Подходящие пределы доз составляют порядка нескольких сот микрограммов активного ингредиента на вакцину, при этом предпочтительным является количество от 0,1 до 2000 мкг (даже если рассматриваются более высокие количества в 1-10 мг), так, например, от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно от 1 до 500 мкг, а особенно предпочтительно от 10 до 100 мкг. Подходящие схемы введения первично иммунизирующей дозы и вторично иммунизирующей дозы также варьируется, но обычно после первоначального введения проводят последующую инокуляцию или дополнительные введения.

Способ введения может широко варьироваться. Для введения вакцины подходящими являются любые стандартные способы введения. Такими способами являются пероральное введение композиции, изготовленной с исполь зованием твердой физиологически приемлемой основы, или парентеральное введение композиции в виде физиологически приемлемой дисперсии путем ее инъекции или т.п. Доза указанной вакцины зависит от способа введения и варьируется в зависимости от возраста вакцинируемого индивидуума и от антигенной композиции.

Некоторые из полипептидов данной вакцины являются достаточно иммуногенными в вакцине, но в некоторых других случаях усиление иммунного ответа может достигаться, если эта вакцина, кроме того, содержит адъювантное вещество.

Известны различные методы достижения адъювантного эффекта для данной вакцины. Общие идеи и методы подробно описаны в работе Тйе Тйеогу апб Ртасйса1 Аррйсайоп оГ Абщуапк. 1995, Энпсап Е.8. 81е\\'аг1-Ти11 (еб.), ,1о1т \\!1е\ & 8опк Ыб, Ι8ΒΝ 0-471-951170-6, а также в работе Уассшек: №\ν Сепегабоп 1ттипо1ощса1 Абщуапй, 1995, Огедопабй О. е( а1. (ебк.), Р1епит Ргекк, №\ν Уотк, Ι8ΒΝ 0-30645283-9, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Особенно предпочтительным является использование адъюванта, который может способствовать облегчению разрушения аутотолерантности к аутоантигенам; в действительности, это, в основном, происходит только в тех случаях, когда немодифицированный ΟΌΡ-8 используется в качестве активного ингредиента в аутовакцине. Неограничивающими примерами подходящих адъювантов являются адъюванты, выбранные из группы, состоящей из адъюванта, стимулирующего иммунный ответ; адъюванта, модулирующего иммунный ответ, такого как токсин, цитокин и микобактериальное производное; масляной композиции; полимера; адъюванта, образующего мицеллы; сапонина; иммуностимулирующего комплекса (18СОМматрицы); частицы; ΌΌΑ; алюминиевых адъювантов; ДНК-адъювантов; γ-инулина и инкапсулирующего адъюванта. Следует отметить, что, в общих чертах, вышеприведенное описание, которое относится к соединениям и агентам, используемым в качестве первой, второй и третьей частей в данных аналогах, также относится с соответствующими изменениями к их использованию в данном адъюванте для получения вакцины настоящего изобретения.

Применение адъювантов предусматривает использование таких агентов, как гидроксид или фосфат алюминия (алюм), обычно используемых в виде 0,05-0,1 процентного раствора в буферном физиологическом растворе, при этом может быть получена смесь с синтетическими полимерами сахаров (например, СатЬоро1®), используемая в виде 0,25-процентного раствора; агрегация белка в данной вакцине, полученная путем тепловой обработки под действием температур в пределах от 70 до 101°С в течение периода времени от 30 с до 2 мин соответственно; а также агрегация, полученная с помощью перекрестно-сшивающих агентов. Может быть также использована агрегация, полученная путем реактивации обработанными пепсином антителами (ЕаЬ-фрагментами) против альбумина, смесь с бактериальными клетками, такими как С. ратуит, или эндотоксинами или липополисахаридными компонентами грамотрицательных бактерий; эмульсия в физиологически приемлемом масляном носителе, таком как моноолеат маннита (Агасе1 А) или эмульсия с 20процентным раствором перфторуглерода (Е1иоко1-ЭА), используемым в качестве блокирующей замены. Также предпочтительной является смесь с маслами, такими как сквален и 1ТА.

В соответствии с настоящим изобретением ЭЭА (бромид диметилдиоктадециламмония) является кандидатом, представляющим такой же интерес на роль адъюванта, как ДНК и γинсулин, тогда как полный и неполный адъюванты Фройнда, а также сапонины с.|ш11а|а. такие как 0ш1А и 0821 представляют такой же интерес как и ΚΤΒΙ. В качестве других кандидатов могут быть использованы монофосфорилированный липид А (МРЬ), вышеупомянутые С3 и С3Т и мурамилдипептид (МЭР).

Известно также, что липосомные композиции также обладают адъювантными эффектами, а поэтому в соответствии с настоящим изобретением липосомы являются предпочтительными адъювантами.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительным выбором в качестве адъювантов является также матрица типа иммуностимулирующего комплекса (18СОМ®матрица), особенно потому, что, как было показано, этот тип адъювантов способен к положительной регуляции экспрессии МНС класса ΙΙ с участием АПК. 18СОМ®-матрица состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов (тритерпеноидов), происходящих от Ош11а)а каропапа, холестерина и фосфолипида. При смешивании с иммуногенным белком, полученной корпускулярной композицией является композиция, известная как 18 СОМ-частица, где сапонин составляет 60-70 мас.%, холестерин и фосфолипид составляют 10-15 мас.%, а белок составляет 10-15 мас.%. Подробное описание композиции и использования иммуностимулирующих комплексов можно найти, например, в вышеупомянутых руководствах, посвященных адъювантам, а также в работе Мотет В. е1 а1., 1995, Сйи., 1ттиио1йег. 3: 461-475, и Вагг 1.С. & Мйсйе11 С.Р., 1996, 1ттипо1. апб Се11 Вю1. 74: 825 (которые включены сюда в качестве ссылки), в которых даются соответствующие инструкции по получению полных иммуностимулирующих комплексов.

Другой чрезвычайно интересной (и таким образом предпочтительной) возможностью достижения адъювантного эффекта является ис пользование метода, описанного в работе Соккейп е1 а1., 1992 (которая вводится в настоящее описание посредством ссылки). Вкратце, презентация соответствующего антигена, такого как антиген настоящего изобретения, может быть усилена путем конъюгирования антигена с антителами (или с фрагментами антигенсвязывающего антитела) против рецепторов Ρсγ на моноцитах/макрофагах. Было продемонстрировано, что для усиления иммуногенности в целях вакцинации используются, в основном, конъюгаты между антигеном и антителом против ΡсγШ.

Другими возможностями является использование нацеливающих и иммуномодулирующих веществ (т.е. цитокинов), упомянутых выше в качестве кандидатов для первой и второй частей в модифицированных вариантах СЭЕ-8. В этой связи возможно также использование синтетических индукторов цитокинов, подобных ро1у 1:С.

Подходящими микобактериальными производными являются производные, выбранные из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фройнда, ΚΙΒΙ и сложного диэфира трегалозы, такого как ТИМ и ΤΌΕ.

Подходящими адъювантами, стимулирующими иммунный ответ, являются адъюванты, выбранные из группы, состоящей из лиганда СЭ40 и антител СЭ40 или из их специфически связывающихся фрагментов (см. обсуждение выше), маннозы, ЕаЬ-фрагмента и СТЬА-4.

Подходящие полимерные адъюванты выбирают из группы, состоящей из углевода, такого как декстран, ПЭГ, крахмал, маннан и манноза; пластикового полимера; и латекса, такого как латексные гранулы.

Еще одним интересным способом модулирования иммунного ответа является включение иммуногена СЭР-8 (необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями) в виртуальный лимфоузел (νΕΝ) (патентованное медицинское устройство, разработанное 1ттипоТйегару, 1пс., 360 ЭехтЦоп Ауепие, Ыете Уотк, ΝΥ 100176501). νΕΝ (устройство в виде тонкой трубки) имитирует структуру и функцию лимфоузла. Введение νΕΝ под кожу создает область стерильного воспаления с резким повышением уровня цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, а также АПК быстро реагируют на сигналы опасности, возвращаются в участок воспаления и накапливаются внутри пористого матрикса νΕΝ. Было показано, что необходимая доза антигена, требуемая для индуцирования иммунного ответа против антигена, снижается при использовании νΕΝ, и что иммунная защита, обеспечиваемая вакцинацией с помощью νΕΝ, усиливает стандартную иммунизацию с использованием К1Ы в качестве адъюванта. Эта технология, 1.а., кратко описана Се1Ьег С. е1 а1., 1998,

ЕНсНабоп οί ВоЬик! Се11и1аг апб Нитога1 1ттипе Векропкек ίο 8та11 Атоип1к οί 1ттиподепк иДпд а Ыоуе1 Меб1са1 Эеу1се Эекфпа1еб (Не У1йиа1 Ьутрй Ыобе, Егот (Не ЬаЬога1огу ίο (Не СБшс, Воок οί АЬк1гас1к, Ос(оЬег 12'¹' - 15¹¹' 1998, 8еаксаре Векой, Αρίοκ, СаБГогша.

Ожидается, что эта вакцина должна быть введена по крайней мере один раз в год, или, например, по крайней мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 12 раз в год. Более конкретно предусматривается введение 1-12 раз в год, так, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 раз в год индивидууму, нуждающемуся в этом. Ранее было показано, что иммунологическая память, индуцируемая с использованием предпочтительных аутовакцин настоящего изобретения, не является перманентной, а следовательно иммунная система нуждается в периодической стимуляции аналогами.

Вследствие генетической вариабельности, различные индивидуумы могут вырабатывать иммунные ответы различной силы на тот же самый полипептид. Следовательно, вакцина настоящего изобретения может включать несколько различных полипептидов для увеличения иммунного ответа, см. также обсуждение, описанное выше, касающееся выбора чужеродного Т-клеточного эпитопа для введения. Указанная вакцина может включать два или более полипептида, где все указанные полипептиды определены выше.

Следовательно, эта вакцина может содержать 3-20 различных модифицированных или немодифицированных полипептидов, таких как 3-10 различных полипептидов. Однако обычно число полипептидов поддерживается на минимальном значении, таком как 1 или 2 полипептида.

Вакцинация нуклеиновыми кислотами

В качестве альтернативы к классическому введению вакцины на основе пептидов, технология вакцинации нуклеиновыми кислотами (также известная как иммунизация нуклеиновой кислотой, генетическая иммунизация и генная иммунизация) имеет ряд привлекательных особенностей.

Во-первых, в противоположность методу традиционной вакцинации, вакцинация нуклеиновой кислотой не требует средств, затрачиваемых на крупномасштабное продуцирование иммуногенного агента (например, в форме промышленной ферментации микроорганизмов, продуцирующих модифицированный СЭЕ-8). Кроме того, нет необходимости в оборудовании для очистки и в схемах для повторной укладки иммуногена. И, наконец, поскольку вакцинация нуклеиновой кислотой зависит от биохимического аппарата вакцинированного индивидуума для продуцирования продукта экпрессии введенной нуклеиновой кислоты, то ожидается, что будет происходить оптимальный посттрансляционный процессинг продукта экспрессии; и это имеет особенно важное значение в случае аутовакцинации, поскольку, как упоминалось выше, в модифицированной молекуле должна быть сохранена значительная фракция исходного Вклеточного эпитопа СЭЕ-8, и поскольку Вклеточные эпитопы в принципе могут быть сконструированы частично из любой (био)молекулы (например, углевода, липида, белка и т.п.). Поэтому характер нативного гликозилирования и липидизации иммуногена может иметь очень важное значение для всей иммуногенности, и, как ожидается, он обеспечивается хозяином, продуцирующим данный иммуноген.

Поэтому в предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к эффективной презентации модифицированного СЭЕ-8 иммунной системе посредством введения нуклеиновых(ой) кислот(ы), кодирующих модифицированный СЭЕ-8, в клетки животного и, тем самым, осуществления 1п νίνο-экспрессии введенной нуклеиновой кислоты данными клетками.

В этом варианте осуществления изобретения введенной нуклеиновой кислотой предпочтительно является ДНК, которая может присутствовать в форме оголенной ДНК; ДНК с заряженными или незаряженными липидами; ДНК, включенной в липосомы; ДНК, включенной в вирусный вектор; ДНК, объединенной с белком или полипептидом, облегчающим трансфекцию; ДНК, объединенной с белком или полипептидом для направленной доставки; ДНК, объединенной с кальций-преципитирующими агентами; ДНК, объединенной с молекулой инертного носителя; и ДНК, объединенной с адъювантом. В этой связи следует отметить, что практически все обсуждения, касающиеся использования адъювантов в традиционной вакцинной композиции, относятся и к композициям для ДНК-вакцин. Поэтому все приведенные здесь описания, которые относятся к использованию адъювантов для вакцин на основе полипептидов, могут быть использованы с необходимыми изменениями в технологии вакцинации нуклеиновыми кислотами.

Способы и схемы введения вакцин на основе полипептидов, которые были подробно описаны выше, также применимы для вакцин на основе нуклеиновых кислот настоящего изобретения, и все обсуждения, которые относятся к способам и схемам введения вакцин на основе полипептидов, могут быть использованы с необходимыми изменениями для нуклеиновых кислот. К этому можно добавить, что вакцины на основе нуклеиновых кислот могут быть соответствующим образом введены внутривенно и внутриартериально. Кроме того, специалистам хорошо известно, что вакцины на основе нуклеиновых кислот могут быть введены с использованием так называемой генной пушки, а поэтому этот и эквивалентные способы введе ния также рассматриваются как часть настоящего изобретения. И, наконец, как сообщалось, использование ΑΕΝ при введении нуклеиновых кислот также дает хорошие результаты, а поэтому этот особый метод введения является наиболее предпочтительным.

Кроме того, эта нуклеиновая(ые) кислота(ы), используемая в качестве иммунизирующего агента, может содержать области, кодирующие 1, 2 и/или 3 части, например, в форме иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые как ценные адъюванты. В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к кодирующей области для данного аналога и к кодирующей области для данного иммуномодулятора в различных рамках считывания, или, по крайней мере, под контролем различных промоторов. Таким образом, можно избежать того, чтобы данный аналог или эпитоп были продуцированы как партнеры по связыванию с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два отличающихся нуклеотидных фрагмента, однако, это является менее предпочтительным из-за преимущественной коэкспрессии, которая обычно происходит в случае присутствия кодирующих областей, включенных в ту же самую молекулу.

В соответствии с этим настоящее изобретение также относится к композиции для стимуляции продуцирования антител против СЭЕ-8, где указанная композиция включает фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор настоящего изобретения (обсуждение векторов см. ниже) и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант, обсуждаемые выше. В обычных условиях, нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант СЭЕ-8, вводят в форме вектора, где экспрессия находится под контролем вирусного промотора. Более подробное обсуждение векторов и ДНКфрагментов настоящего изобретения см. ниже. Кроме того, имеются подробные описания, касающиеся препаратов и использования вакцин на основе нуклеиновой кислоты, см. Эоппе11у

1.1. е! а1., 1997, Аппи. Веу. 1ттипо1. 15:617-648 и Эоппе11у 1.1. е! а1., 1997, Ы£е 8с1епсе 60:163-172. Обе эти работы включены сюда в качестве ссылки.

Живые вакцины

Третьим альтернативным способом эффективной презентации модифицированного СЭЕ-8 иммунной системе является использование технологии получения живой вакцины. При вакцинации живой вакциной, презентацию иммунной системе осуществляют путем введения указанному животному непатогенного микроорганизма, который был трансформирован фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим модифицированный СЭЕ-8 или вектором, включающим такой фрагмент нуклеиновой кислоты. Непатогенным микроорганизмом может быть любой подходящий аттенюированный бактериальный штамм (аттенюированный путем пассирования или путем удаления патогенных экспрессионных продуктов с помощью техники рекомбинантных ДНК), например, МусоЬас!егшт Ьоу1к ВСС., непатогенный 81гер!ососсик крр., Е.сой, 8а1топейа крр./У1Ьгю Сйо1егае, 8Ыдейа, и т.п. Обзор, касающийся получения современных живых вакцин, можно найти, например, в работах 8айои Р., 1995, Веу. Рга!. 45: 1492-1496 и \Уа1кег РЭ, 1992, Уассше 10: 977-990, которые включены сюда в качестве ссылки. Обсуждение подробностей, касающихся фрагментов нуклеиновых кислот и векторов, используемых в таких живых вакцинах, см. ниже.

В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам фрагмент нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, обсуждаемый ниже, может быть включен в невирулентный вирусный вакцинный вектор, такой как штамм коровьей оспы или какой-либо другой подходящий поксвирус, который является инфекционным для вакцинируемого животного.

Обычно указанный непатогенный микроорганизм или вирус вводят животному лишь один раз, однако, в некоторых случаях, для поддержания защитного иммунитета в течение всей его жизни может оказаться необходимым введение указанного микроорганизма более чем один раз. Предполагалось даже, что схемы иммунизации, подробно описанные выше для вакцинации полипептидом, могут быть эффективными при использовании живых или вирусных вакцин.

Альтернативно вакцинацию живой вакциной или вирусом комбинируют с вакцинацией полипептидом и/или нуклеиновой кислотой, проводимой до или после указанной вакцинации живой вакциной или вирусом. Так, например, может быть осуществлена первичная иммунизация живой или вирусной вакциной с последующими повторными иммунизациями с использованием полипептида или нуклеиновой кислоты.

Данный микроорганизм или вирус может быть трансформирован нуклеиновой(ыми) кислотой(ами), содержащей области, кодирующие 1, 2 и/или 3 части, например, в форме иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые как эффективные адъюванты. В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к кодирующей области для данного аналога и к кодирующей области для данного иммуномодулятора в различных рамках считывания или, по крайней мере, под контролем различных промоторов. Это позволяет избежать того, что аналог или эпитопы будут продуцироваться как партнеры по связыванию с иммуномодулятором. Альтернативно два отличающихся нуклеотидных фрагмента могут быть использованы в качестве трансформирующих агентов. Само собой разумеется, если 1, и/или 2, и/или 3 части имеют одну и ту же рамку считывания, то они могут быть получены в качестве продукта экспрессии, т. е. аналога настоящего изобретения, и такой вариант осуществления настоящего изобретения является особенно предпочтительным.

Использование способа настоящего изобретения в производстве мяса и для лечения болезней

Как очевидно из вышепривиденных обсуждений, разработка способа настоящего изобретения для отрицательной регуляции активности СЭЕ-8 позволяет стимулировать рост массы скелетных мышц у животных. Поэтому важным вариантом осуществления способа настоящего изобретения для отрицательной регуляции активности СЭЕ-8 является увеличение массы скелетных мышц у животного, где указанный способ предусматривает отрицательную регуляцию активности СЭЕ-8 в соответствии с настоящим изобретением до такой степени, которая дает статистически значимое увеличение указанной мышечной массы (при доверительном уровне 95%), составляющее по крайней мере 5% по сравнению с контрольными животными, имеющими нормальную активность СЭЕ8.

Увеличение мышечной массы может быть предпочтительно более высоким, таким как по крайней мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или даже 45% по сравнению с увеличением мышечной массы, которая наблюдалась у трансгенных мышей и животных с природным дефицитом СЭЕ-8.

Мышечная масса может быть определена любым стандартным методом, известным специалистам для оценки полной и/или относительной мышечной массы.

Вакцина против СЭЕ-8 может быть также использована для лечения некоторых болезней человека, таких как раковая кахексия, где мышечная атрофия является ярко выраженным феноменом, и использование этой вакцины также является целесообразным для лечения/ ослабления других болезней, вызывающих атрофию мышц. В недавно появившихся работах также предполагается, что суппрессия СЭЕ-8 должна оказывать благоприятное действие на пациентов, страдающих острой и хронической сердечной недостаточностью.

Пептиды, полипептиды и композиции настоящего изобретения

Как очевидно из вышепривиденного описания, настоящее изобретение основано на идее иммунизации индивидуумов против антигена СЭЕ-8 для увеличения скорости наращивания мышечной массы. Предпочтительным способом осуществления такой иммунизации является использование модифицированных вариантов СЭЕ-8, что позволяет, тем самым, получить молекулы, которые ранее не были описаны.

Очевидно, что обсуждаемые здесь модифицированные молекулы СЭЕ-8 сами по себе обладают признаками изобретения, а поэтому важная часть настоящего изобретения относится к аналогу СЭЕ-8, происходящему от СЭЕ-8 животного, в который была введена модификация, в результате чего иммунизация животного этим аналогом индуцирует вырабатывание антител, специфически реагирующих с немодифицированным полипептидом СЭЕ-8. Предпочтительно природа этой модификации соответствует типам модификаций, описанным выше при обсуждении различных вариантов способа настоящего изобретения с использованием модифицированного СЭЕ-8. Поэтому любое представленное здесь описание, относящееся к модифицированным молекулам СЭЕ-8, имеет важное значение для описания аналогов СЭЕ-8 настоящего изобретения, и любое такое описание может быть применено с необходимыми изменениями к описанию этих аналогов.

Следует отметить, что предпочтительные модифицированные молекулы СЭЕ-8 содержат модификации, которые приводят к получению полипептида, имеющего последовательность, идентичную по крайней мере на 70% последовательности СЭЕ-8 или ее подпоследовательности, длиной по крайней мере в 10 аминокислот. Предпочтительными являются последовательности с более высокой идентичностью, например, по крайней мере 75% или даже по крайней мере 80 или 85%. Последовательность, идентичная белкам и нуклеиновым кислотам, может быть вычислена по формуле (Ν,,., - Ν_4£) · 100/ Ν_ι<£. где Ν,ι,Γ представляет полное число неидентичных остатков в двух последовательностях при сопоставлении их первичных последовательностей, и где Ν_γ£ представляет число остатков в одной из этих последовательностей. Поэтому ДНК-последовательность АСТСАСТС будет иметь последовательность, идентичную последовательности ААТСААТС (Ν_ά1£ = 2 и Ν_Γβ£ = 8).

Настоящее изобретение также относится к композициям, используемым для осуществления способа настоящего изобретения. Поэтому настоящее изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество полипетида СЭЕ-8, который является аутологичным белком у данного животного, где указанный полипептид СЭЕ-8 приготавливают в сочетании с иммунологически приемлемым адъювантом так, чтобы в результате этого разрушалась аутотолерантность данного животного к полипептиду СЭЕ-8, причем указанная композиция, кроме того, содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый наполнитель и/или носитель. Другими словами, эта часть настоящего изобретения относится к композициям, включающим природные полипептиды СЭЕ-8, кото рые были описаны в связи с вариантами осуществления способа настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество аналога СЭЕ-8, определенного выше, причем указанная композиция, кроме того, содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или носитель, и/или наполнитель и необязательно адъювант. Другими словами, эта часть настоящего изобретения относится к композициям модифицированного СЭЕ-8, в основном, описанного выше. Выбор адъювантов, носителей и наполнителей осуществляют в соответствии с вышеприведенными обсуждениями, относящимися к композиции модифицированного и немодифицированного СЭЕ-8, используемого в способе настоящего изобретения для отрицательной регуляции СЭЕ-8.

Данные полипептиды получают способами, хорошо известными специалистам. Более длинные полипептиды обычно получают с помощью техники рекомбинантных ДНК, включая введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог СЭЕ-8, в подходящий вектор, трансформацию подходящей клетки-хозяина указанным вектором, экспрессию указанной последовательности нуклеиновой кислоты, получение продукта экспрессии из клеток-хозяев или их супернатанта их культуры, с последующей очисткой и необязательно дополнительной модификацией, например, рефолдингом или дериватизацией.

Более короткие пептиды предпочтительно получают хорошо известными методами твердофазного пептидного синтеза или синтеза пептидов в растворе. Однако последние достижения в этой технологии позволяют продуцировать полноразмерные полипептиды и белки теми же самыми методами, а поэтому получение длинных конструкций методами синтеза также входит в объем настоящего изобретения.

Фрагменты нуклеиновых кислот и векторы настоящего изобретения

Из вышеприведенного обсуждения очевидно, что модифицированные полипептиды СЭЕ-8 могут быть получены с помощью техники рекомбинантных ДНК, а также методами химического синтеза или полусинтеза, причем последние два варианта являются особенно подходящими, если данная модификация предусматривает присоединение белковых носителей (таких как КЬН, дифтерийный токсоид, токсоид столбняка и В8Л) и небелковых молекул, таких как углеводные полимеры и, само собой разумеется, если данная модификация включает присоединение боковых цепей или боковых групп к пептидной цепи, происходящей от полипептида СЭЕ-8.

Для осуществления техники рекомбинантных ДНК и, разумеется, для осуществления иммунизации нуклеиновыми кислотами, фрагмен ты нуклеиновой кислоты, кодирующие модифицированный СЭЕ-8, являются важными химическими продуктами. Поэтому важная часть настоящего изобретения относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, кодирующему аналог СЭЕ-8, т.е. полипептид, происходящий от СЭЕ8 и содержащий нативную последовательность СЭЕ-8, к которой был присоединен или в которую был встроен партнер слияния, либо предпочтительно полипептид, происходящий от СЭЕ-8, в который был встроен чужеродный Тклеточный эпитоп посредством инсерции и/или добавления, а предпочтительно посредством замены и/или делеции. Фрагментами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения являются ДНК- или РНК-фрагменты.

Фрагменты нуклеиновой кислоты настоящего изобретения обычно встраивают в подходящие векторы с получением клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих фрагменты нуклеиновых кислот настоящего изобретения; такие новые векторы также являются частью настоящего изобретения. Ниже обсуждаются детали конструирования векторов настоящего изобретения вместе с трансформированными клетками и микроорганизмами. Такими векторами могут быть, в зависимости от цели и типа применения, плазмиды, фаги, космиды, минихромосомы или вирус, при этом ценным вектором также является оголенная ДНК, которая лишь кратковременно экспрессируется в некоторых клетках. Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы настоящего изобретения способны автономно реплицироваться, что позволяет получить большое число копий, обеспечивающее высокий уровень экспрессии или высокий уровень репликации для последующего клонирования.

В общих чертах, вектор настоящего изобретения включает нижеследующие элементы, в направлении 5' 3' и при функциональном присоединении промотор для регуляции экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лидерный пептид, обеспечивающий секрецию (во внеклеточную фазу, или, где это возможно, в периплазму бактерии) или интеграцию в мембрану данного полипептидного фрагмента; фрагмент нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; и необязательно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая терминатор. При функционировании экспрессирующих векторов в штаммапродуцентах или клеточных линиях, для обеспечения генетической стабильности трансформированной клетки предпочтительно, чтобы данный вектор, при его введении в клеткухозяина, был интергирован в геном данной клетки-хозяина. В противоположность этому при работе с векторами, используемыми для осуществления ίη νίνο-экспресии у животных (т. е. при использовании данного вектора для

ДНК-вакцинации), из-за соображений безопасности предпочтительно, чтобы данный вектор не был способен интегрироваться в геном клетки-хозяина; а поэтому, обычно, используются векторы с оголенной ДНК или неинтегрирующиеся вирусные векторы, выбор которых хорошо известен каждому специалисту.

Векторы настоящего изобретения используются для трансформации клеток-хозяев в целях продуцирования модифицированного полипептида СЭР-8 настоящего изобретения. Такими трансформированными клетками, которые также являются частью настоящего изобретения, могут быть культивированные клетки или клеточные линии, используемые для размножения фрагментов нуклеиновой кислоты и векторов настоящего изобретения, либо они могут быть использованы для рекомбинантного продуцирования модифицированных полипептидов СЭР-8 настоящего изобретения. Альтернативно, такими трансформированными клетками могут быть штаммы, подходящие для получения живых вакцин, где указанный фрагмент нуклеиновой кислоты (однокопийный или многокопийный) встраивают так, чтобы осуществлялась экспрессия или интеграция модифицированного СЭР-8 в бактериальную мембрану или клеточную стенку.

Предпочтительными трансформированными клетками настоящего изобретения являются микроорганизмы, такие как бактерии (таких видов как ЕксНепсЫа [например, Е.со11|. ВасШик [например. ВасШик киЫШк], 8а1топе11а или МусоЬас1епит [предпочтительно непатогенные, например, М. Ьоу18 ВСС]), дрожжи (такие как 8ассйаготусек сегеуШае) и простейшие. Альтернативно указанные трансформированные клетки происходят от многоклеточных организмов, таких как грибки, насекомые, растения или млекопитающие. Полученные недавно результаты открыли большие перспективы для использования коммерчески доступной клеточной линии ЭгокорШа те1аподак1ег (клеточная линия 8с1те1бег 2 (8₂) и векторая система, поставляемая 1пу|1годеп) для рекомбинантного продуцирования аналогов 1Ь-5 настоящего изобретения, а поэтому эта экспрессионная система также является особенно предпочтительной для осуществления настоящего изобретения.

Для клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка была способна реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Клетки, экспрессирующие данный фрагмент нуклеиновой кислоты, являются предпочтительными вариантами настоящего изобретения; они могут быть использованы для лабораторного или крупномасштабного получения модифицированного СЭР-8, или в случае непатогенных бактерий они могут быть использованы в качестве вакцинных компонентов живой вакцины.

При продуцировании модифицированного СЭР-8 настоящего изобретения с помощью трансформированных клеток, как правило, хотя далеко не обязательно, экспрессионный продукт либо секретируется в культуральную среду, либо переносится на поверхность трансформированной клетки.

Если была идентифицирована эффективная клетка-продуцент, то на ее основе предпочтительно получить стабильную клеточную линию, которая несет вектор настоящего изобретения и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный СЭР-8. Предпочтительно, чтобы эта стабильная клеточная линия секретировала или содержала аналог СЭР-8 настоящего изобретения, что облегчает ее очистку.

В основном, плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые происходят от клеток видов, совместимых с клеткой-хозяином, используют в сочетании с данными хозяевами. Этот вектор обычно несет сайт репликации, а также последовательности-маркеры, способные обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Так, например, Е.соН обычно трансформируют с использованием рВК322, плазмиды, происходящей от видов Е.соН (см., например, Войуаг е! а1., 1977). Плазмида рВК322 содержит ген резистентности к ампициллину и тетрациклину, и таким образом, позволяет легко идентифицировать трансформированные клетки. Плазмида рВВ, или другая микробная плазмида, или фаг также должны содержать либо они должны быть модифицированы так, чтобы они содержали промотор, который может быть использован прокариотическим микроорганизмом для экспрессии.

Промоторами, наиболее часто используемыми в рекомбинантной ДНК-конструкции, являются промоторные системы В-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (Сйапд е! а1., 1978; Йакига е! а1., 1977; Соеббе1 е! а1., 1979) и система триптофанового (!гр) промотора (Соеббе1 е! а1., 1979; ЕР-А-0036776). Хотя эти промоторы используются наиболее часто, однако, были обнаружены и использованы другие промоторы, и были опубликованы подробные описания их нуклеотидных последовательностей, позволяющих специалисту функционально присоединять эти последовательности к плазмидным векторам (8|еЬ\\'еп1181 е! а1., 1980). Некоторые гены от прокариотов могут быть эффективно экспрессированы в Е.сой от своих собственных промоторных последовательностей, что позволяет избежать необходимости присоединения другого промотора искусственным способом.

Помимо прокариотов, могут быть также использованы эукариотические микробы, такие как дрожжевые культуры, и в данном случае, этот промотор должен быть способен регулировать экспрессию. Из эукариотических микроор ганизмов наиболее часто используются 8асс1аготусск ссгссыас или обычные пекарские дрожжи, хотя существует и ряд других широко доступных штаммов.

Так, например, для экспрессии в 8ассйаготусск, обычно используют плазмиду Υτρ7 (81шсйсотЬ с! а1., 1979; Кшдктап с! а1., 1978; Тксйстрсг с! а1., 1980). Эта плазмида уже содержит ген !гр1, который обеспечивает селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, неспособного расти в триптофане, например, штамма АТСС № 44076 или РЕР4-1 (1опск, 1977). Присутствие 1тр1-дефекта как признака генома дрожжевой клетки-хозяина, кроме того, обеспечивает эффективное окружение для детекции трансформации по росту в отсутствие триптофана.

Подходящими промоторными последовательностями в дрожжевых векторах являются промоторы для 3-фосфоглицераткиназы (Ηί!ζтап с! а1., 1980) или других гликолитических ферментов (Нскк с! а1., 1968; Но11апб с! а1., 1978), таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триосефосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. При конструировании подходящих экспрессионных плазмид, последовательности терминации, ассоциированные с этими генами, также лигируют в экспрессирующий вектор со стороны 3'-конца от нужной экспрессируемой последовательности для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации.

Другими промоторами, которые имеют дополнительные преимущества в отношении транскрипции, регулируемой условиями роста, являются промоторные области для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, расщепляющих ферментов, ассоциированных с метаболизмом азота, и вышеупомянутой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, а также ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящим является любой плазмидный вектор, содержащий совместимый с дрожжами промотор, сайт инициации репликации и последовательности терминации.

Помимо микроорганизмов в качестве хозяев могут быть также использованы культуры клеток, происходящих от многоклеточных организмов. В принципе, любая такая клеточная культура является функциональной независимо от того, происходит ли эта культура от позвоночных или от беспозвоночных. Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных и размножение клеток позвоночных в культуре (в тканевой культуре) стало в последние годы рутинной процедурой (Тщкис Си1!игс, 1973). Примерами таких подходящих клеточных линий хозяев являются клетки УЕКО и НсЬа, клеточные линии яичника китайского хомячка (СНО) и клетки №138, ВНК, СО8-7 293, ЭгокорЫ1а тс1апода8!сг и 8робор!сга Ггищрсгба (8Е) (коммерчески доступные полные экспрессионные системы от, 1.а., Рго!сш 8с1спсс, 1000 К.сксатсй Рагк\сау. Мспбсп, СТ 06450, и.8.А. и от 1пуйгодсп) и клеточные линии МОСК. В соответствии с настоящим изобретением особенно предпочтительными клеточными линиями являются клетки 8₂ и 8Е₂₁, поставляемые 1пуйгодсп, РО Вох 2312, 9704 СН Сгошпдсп, Т1с №111сг1апбк.

Экспрессирующие векторы для таких клеток обычно включают (если это необходимо) сайт инициации репликации, промотор, локализованный перед экспрессируемым геном, а также какие-либо необходимые сайты связывания с рибосомой, сайты сплайсинга РНК, сайт полиаденилирования и последовательности терминации транскрипции.

Для использования в клетках млекопитающих, регуляторные функции в указанных экспрессирующих векторах часто обеспечиваются вирусным материалом. Так, например, обычно используемыми промоторами являются промоторы, происходящие от полиомы, аденовируса 2, а наиболее часто от обезьяньего вируса 40 (8У40). Ранние и поздние промоторы вируса 8У40 являются особенно ценными, поскольку оба они могут быть легко получены из указанного вируса в виде фрагмента, который также содержит сайт инициации репликации вируса 8У40 (Исгк с! а1., 1978). Могут быть также использованы более мелкие или более крупные фрагменты 8У40, при условии, что они включают приблизительно 250 п.н.последовательность, простирающуюся от НшбШ-сайта до Вд11-сайта, локализованного в сайте инициации репликации данного вируса. Кроме того, можно также, а часто даже желательно, использовать промоторные или регуляторные последовательности, обычно ассоциированные с последовательностью нужного гена, при условии, что указанные регуляторные последовательности являются совместимыми с системами клеток-хозяев.

Сайт инициации репликации может быть также получен либо путем конструирования вектора так, чтобы он содержал экзогенный сайт инициации репликации, например, происходящий от 8У40 или другого вируса (например, полиомавируса, аденовируса, У8У, ВРУ), либо он может быть получен посредством механизма хромосомной репликации клетки-хозяина. Если этот вектор интегрируется в хромосому клеткихозяина, то в большинстве случаев последний механизм является достаточным.

Идентификация эффективных аналогов

СБЕ-8

Для каждого специалиста очевидно, что не все варианты или модификации нативного ΟΌΕ8 могут обладать способностью вырабатывать у животного антитела, которые перекрестно реагируют с нативной формой. Однако не представляет особого труда адаптировать эффективный стандартный скрининг для модифицированных молекул СЭР-8, который удовлетворяет минимальным требованиям для иммунологической реактивности, обсуждаемой в настоящем описании. Поэтому в другой своей части настоящее изобретение относится к способу идентификации модифицированного полипептида СЭР-8, способного индуцировать антитела против немодифицированного СЭР-8 у животных определенного вида, где указанный немодифицированный полипептид СЭР-8 представляет собой аутологичный белок и где указанный способ предусматривает получение путем пептидного синтеза или методами генной инженерии серии отличающихся друг от друга полипептидов СЭР-8, где в аминокислотной последовательности полипептида СЭР-8 данного вида животного были добавлены, инсертированы, делетированы или заменены аминокислоты, в результате чего в данной серии были получены аминокислотные последовательности, включающие Т-клеточные эпитопы, которые являются чужеродными для животного данного вида;

тестирование членов данной серии на их способность индуцировать вырабатывание животным данного вида антител против указанного немодифицированного СЭР-8, и выделение указанного(ых) члена(ов) данной серии, который индуцирует вырабатывание у животного данного вида значительного уровня антител против немодифицированного СЭР-8.

В контексте настоящего описания, термин серия отличающихся друг от друга модифицированных полипептидов СЭР-8 означает набор неидентичных модифицированных полипептидов СЭР-8, которые были, например, отобраны на основании критериев, обсуждаемых выше (например, в комбинации с исследованиями методами кругового дихроизма, ЯМР-спектроскопии и/или рентгенографии). Эта серия может содержать лишь несколько членов, но также рассматривается вариант, где данная серия может содержать несколько сотен членов.

Данная серия может считаться полученной ίη νίνο в том случае, если имеется приемлемая система тестирования полученных фрагментов нуклеиновой кислоты, кодирующих данные члены, для последующего использования этих фрагментов в целях иммунизации нуклеиновой кислотой, как описано в настоящей заявке, для того, чтобы определить, являются ли данные экспрессионные продукты иммуногенными. Следовательно, тестирование членов данной серии может быть осуществлено ίη νίνο, однако, может быть применен ряд ίη νίίΓοтестов, сужающих число модифицированных молекул, которые могут быть использованы в целях настоящего изобретения.

Поскольку целью введения чужеродных Тклеточных эпитопов является поддержание Вклеточного ответа с помощью Т-клеток, необходимо, чтобы пролиферация Т-клеток индуцировалась модифицированным СЭР-8. Пролиферация Т-клеток может быть протестирована с помощью стандартизированных анализов на пролиферацию ίη νίίΓο. Короче говоря, от индивидуума получают образец, обогащенный Тклетками, а затем его выдерживают в культуре. Культивированные Т-клетки подвергают контакту с АПК данного индивидуума, у которого уже присутствует модифицированная молекула, процессированная для презентации ее эпитопов Т-клеткам. Затем проводят мониторинг пролиферации Т-клеток и сравнивают с подходящим контролем (например, Т-клетки в культуре контактируют с АПК, которые имеют процессированный интактный нативный СЭР-8). Альтернативно, пролиферация может быть измерена путем определения концентрации соответствующих цитокинов, высвобождаемых Т-клетками, в ответ на распознавание ими чужеродных Тклеток.

Поскольку существует высокая степень вероятности, что по крайней мере один модифицированный СЭР-8 данной серии способен индуцировать вырабатывание антитела против СЭР-8, то может быть получена иммуногенная композиция, содержащая по крайней мере один модифицированный полипептид СЭР-8, способный индуцировать вырабатывание у животного данного вида антитела против немодифицированного полипетида СЭР-8, где указанным немодифицированным полипептидом СЭР-8 является аутологичный белок, причем указанный способ получения предусматривает смешивание конкретного члена(ов) данной серии, который индуцирует вырабатывание у животного данного вида значительного уровня антител, реагирующих с СЭР-8, с фармацевтически и иммунологически приемлемым носителем, и/или наполнителем, и/или разбавителем, и/или эксипиентом, необязательно в комбинации по крайней мере с одним фармацевтически и иммунологически приемлемым адъювантом.

Вышеуказанные аспекты настоящего изобретения, в основном, осуществляют сначала путем получения ряда отличающихся друг от друга последовательностей нуклеиновых кислот или векторов настоящего изобретения, встраивания этих последовательностей в соответствующие экспрессирующие векторы, трансформации подходящих клеток-хозяев данными векторами и экспрессии указанных последовательностей нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Указанные стадии могут завершаться выделением продуктов экспрессии. Предпочтительно, чтобы указанные последовательности нуклеиновых кислот и/или векторы были получены способами, предусматривающими исполь зование методов молекулярной амплификации, таких как ПЦР или синтез нуклеиновых кислот.

Предисловие к примерам

Экспрессия С-концевой области СЭЕ-8, состоящей из 109 аминокислотных остатков и присоединенной к Ν-концевой Н 15-метке, была осуществлена в Е.со1к а очищенный гибридный белок был использован для иммунизации кроликов. Полноразмерный СЭЕ-8 был экспрессирован в клетках СНО и было показано, что он секретируется в виде димеров непроцессированного и процессированного СЭЕ-8, соответственно (МсРйеггои е! а1., №11иге 387, 83-90, 1997). Таким образом, экспрессия обсуждаемой ниже аутовакцинной конструкции на основе СЭЕ-8, не представляла каких-либо трудностей. Экспрессирующими системами, вероятно, наиболее подходящими для использования в целях продуцирования аутовакцинных конструкций (Аи1оУас) на основе СЭЕ-8, являются Е.со1к дрожжи Р. ра51оп5, клетки СНО и клетки насекомых, такие как вышеупомянутые клетки Эго5ор1и1а.

Пример 1. Конструирование вакцины.

Основной идеей настоящего изобретения является замена фрагментов аминокислотных остатков в целевом белке чужеродными или искусственными Т-клеточными эпитопами, например, смешанными Т-клеточными эпитопами токсина столбняка Р2 и Р30. Предпочтительно, чтобы эти замены оказывали лишь минимальное действие на аутентичную трехмерную структуру целевого белка.

Указанным целевым белком настоящего изобретения является С-концевая область СЭЕ8, состоящая из 109 аминокислотных остатков, гомодимер которой, как ожидается, является биологически активной формой СЭЕ-8. Трехмерная структура этой области неизвестна, но на основании структуры гомологичного белка ТСЕ-β можно сделать предположение, что модель мономерного СЭЕ-8, показанная на фиг.2, является достаточно близкой к реальной структуре. В этой модели СЭЕ-8 дикого типа (д.т.), αспирали показаны как цилиндры, а β-складки показаны стрелками.

В этой структуре цистеиновые остатки, а значит и дисульфидные связи являются очень близко расположенными.

Следует иметь в виду, что присутствие относительного высокого числа цистеиновых остатков (9), а значит и дисульфидных связей в Сконцевой области СЭЕ-8, состоящей из 109 аминокислотных остатков, ограничивает число возможных сайтов, в которых могут находиться чужеродные Т-клеточные эпитопы.

Помимо продуцирования С-концевой области СЭЕ-8, состоящей из 109 аминокислотных остатков, без проведения замен (т.е. остатки 267-375 8ЕО 1Э N0: 1-10), предусматривает ся получение нижеследующих аутовакцинных конструкций на основе СЭЕ-8.

СЭЕ-8 Р2-1 (8Е0 1Э N0: 15) представляет собой С-концевую область СЭЕ-8, состоящую из 109 аминокислотных остатков, в которой аминокислотные остатки 18-32 были заменены Р2.

СЭЕ-8 Р2-2 (8Е0 1Э N0: 16) представляет собой С-концевую область СЭЕ-8, состоящую из 109 аминокислотных остатков, в которой аминокислотные остатки 52-66 были заменены Р2.

СЭЕ-8 Р2-3 (8Е0 1Э N0: 17) представляет собой С-концевую область СЭЕ-8, состоящую из 109 аминокислотных остатков, в которой аминокислотные остатки 83-97 были заменены Р2.

СЭЕ-8 Р30-1 (8ЕО 1Э N0: 18) представляет собой С-концевую область СЭЕ-8, состоящую из 109 аминокислотных остатков, в которой аминокислотные остатки 21-41 были заменены Р30.

СЭЕ-8 Р30-2 (8ЕС 1Э N0: 19) представляет собой С-концевую область СЭЕ-8, состоящую из 109 аминокислотных остатков, в которой аминокислотные остатки 49-69 были заменены Р30.

СЭЕ-8 Р30-3А (НЕС) 1Э N0: 20) представляет собой С-концевую область СЭЕ-8, состоящую из 109 аминокислотных остатков, в которой аминокислотные остатки 79-99 были заменены Р30.

СЭЕ-8 Р30-3В (8ЕО 1Э N0: 21) представляет собой С-концевую область СЭЕ-8, состоящую из 109 аминокислотных остатков, в которой аминокислотные остатки 84-104 были заменены Р30.

Димер СЭЕ-8 (8 ЕС 1Э N0: 22) представляет собой две копии С-концевой области СЭЕ8, состоящие из 109 аминокислотных остатков и ковалентно связанные посредством эпитопов Р2 и Р30.

Другими словами, эта молекула состоит из двух половин. Первая половина представляет собой С-концевую область СЭЕ-8, состоящую из 109 аминокислотных остатков и имеющую Р2, присоединенный к ее С-концу, а другая половина представляет собой С-концевую область СЭЕ-8, состоящую из 109 аминокислотных остатков и имеющую Р30, присоединенный к ее №концу.

СЭЕ-8 ех! (8 ЕС 1Э N0: 23) состоит из Сконцевых 160 аминокислотных остатков СЭЕ-8, где остатки 16-36 заменены Р30, а остатки 37-51 заменены Р2. Эта конструкция представляет собой С-концевую область СЭЕ-8, состоящую из 109 аминокислотных остатков и содержащую как эпитоп Р2, так и эпитоп Р30.

Все проиллюстрированные конструкции, за исключением последних 2, рассматриваются для продуцирования варианта, в котором Су573 заменен 8ег во избежание димеризации посред ством образования дусульфидной связи. В СЭР8 ех! предусматривается осуществление аналогичной замены в соответствующем положении (т.е. Су§124 8ег124).

Пример 2. Ш уйго-модели.

Предусматривается сначала иммунизация мышей очищенными вариантами СЭР-8, описанными выше. После этого, например, антитела для трех иммунизации определяют в ЕЫ8А с использованием немодифицированной молекулы СЭР-8 в качестве антигена. Эти первоначальные эксперименты проводятся, главным образом, для подтверждения того, что эта технология с использованием Аи!оУас™ применима для вырабатывания перекрестно-реагирующих аутоантител, обладающих перекрестной реактивностью против СЭР-8, и что самое важное, для идентификации схемы оптимального введения доз и иммунизации. Однако было бы весьма удивительным, если бы при использовании технологии настоящего изобретения антитела против СЭР-8 не вырабатывались, поскольку фундаментальные иммунологические механизмы продуцирования такого ответа, по всей вероятности, идентичны механизмам, описанным ранее для ΤΝΕα, см. \УО 98/46642 и \УО 95/05849.

Пример 3. Ш νίνο-модели.

Группы мышей иммунизировали различными конструкциями, описанные в примере 1. Мышей следует иммунизировать в возрасте примерно 4 недель, поскольку они должны быть иммуно компетентными для вырабатывания иммунного ответа на данную вакцину. Был использован полный адъювант Фройнда, однако, эти эксперименты могут быть также проведены с использованием адъювантов-квасцов, таких как Аб)ирйо8™, которые ранее были успешно использованы в смеси с аутовакцинными конструкциями ΤΝΕα. Абщрйок™ представляет собой препарат, пригодный для введения как человеку, так и животному. В процессе всего периода иммунизации регулярно проводили мониторинг полной массы тела животных, иммунизированных СЭР-8, а также контрольных животных. Когда мыши достигали возраста приблизительно 16 недель, их умерщвляли, а затем определяли мышечную массу.

Вследствие относительно небольшого промежутка времени, за которое мыши становились иммунокомпетентными, но еще не могли полностью набрать вес, продемонстрировать эффект вакцинации против СЭР-8 у этих животных может быть достаточно трудным. Если, в данном случае, это подтверждается, то рассматривается возможность альтернативной иммунизации крыс или более крупных животных, таких как свиньи, крупный рогатый скот и т. п.

Для клинических исследований была отобрана модифицированная молекула СЭР-8, которая лучше всего способствовала увеличению скорости роста данных животных и/или превосходному увеличению максимального размера их мышц.

Claims (44)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ отрицательной регуляции ίη νίνο активности ростового фактора дифференцировки 8 (СЭР-8) у животных, включая человека, предусматривающий эффективную презентацию иммунной системе данного животного иммуногенно эффективного количества по меньшей мере одного аналога СЭР-8, где в аминокислотную последовательность СЭР-8 введена по меньшей мере одна модификация, которая приводит к тому, что иммунизация животного указанным аналогом индуцирует продуцирование антител против полипептида СЭР-8, и сохраняется значительная часть В-клеточных эпитопов СЭР-8, и чужеродный Т-хелперный эпитоп (Т_нэпитоп), соответствующий любому из остатков 18-41, 49-69 или 79-104 в 8ΕΡ) II) ^: 11 или 12, вводится путем добавления, делеции, инсерции или замены или путем Ν- или С-концевого аминокислотного добавления к 8ΕΟ 1Э NО: 11 или 12, либо встраивается эпитоп, соответствующий эквивалентной последовательности полипептида СВР-8 субъекта, отличного от человека, коровы, свиньи, курицы или индейки, либо чужеродный Тн-эпитоп встраивается или вводится путем замены в одной из петлевых областей или гибких концов в полипептиде СЭР-8, где число аминокислотных добавлений, инсерции, делеции и замен не превышает 60.
2. 2. Способ по п.1, который дополнительно предусматривает введение по меньшей мере одной первой части, осуществляющей нацеливание аналога на антиген-презентирующую клетку (АПК) или Влимфоцит, и/или введение по меньшей мере одной второй части, стимулирующей иммунную систему, и/или введение по меньшей мере одной третьей части, оптимизирующей презентацию аналога иммунной системе.
3. 3. Способ по п.1 или 2, где модификация предусматривает введение в виде боковых групп ковалентным или нековалентным связыванием с подходящими химическими группами

   СЭР-8 или его производного чужеродного Т_нэпитопа и/или первой, и/или второй, и/или третьей части.
4. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где модификация включает в себя замену и/или делецию, и/или инсерцию, и/или добавление аминокислот.
5. 5. Способ по п.4, где модификация приводит к получению гибридного полипептида.
6. 6. Способ по п.4 или 5, где введение замены и/или делеции, и/или инсерции, и/или добавления аминокислот приводит к сохранению в основном общей третичной структуры СЭР-8.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, где указанной модификацией является дупликация по меньшей мере одного В-клеточного эпитопа СЭР-8 и/или введение гаптена.
8. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где чужеродный Тн-эпитоп является иммунодоминантным у животного.
9. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где чужеродный Тн-эпитоп является общим, таким как нативный общий Т_н-эпитоп и искусственная пептидная последовательность, связывающаяся с МНС типа II.
10. 10. Способ по п.9, где нативный Т_н-эпитоп выбран из эпитопа токсоида столбняка, такого как Р2 или Р30, эпитопа токсоида дифтерии, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа С8 Ρ. £а1с1рагит.
11. 11. Способ по любому из пп.2-10, где первой частью является существенно специфичный лиганд специфичного В-клеточного поверхностного антигена или АПК-специфичного поверхностного антигена, такой как гаптен или углевод, для которого имеется рецептор на Влимфоците или АПК, такой как маннан или манноза.
12. 12. Способ по любому из пп.2-11, где вторая часть выбрана из цитокина, гормона и белка теплового шока.
13. 13. Способ по п.12, где цитокин выбран из γ-интерферона (ΣΕΝ-γ), Р1!3Ь, интерлейкина 1 (ГЛ-1), интерлейкина 2 (^-2), интерлейкина 4 (^-4), интерлейкина 6 (^-6), интерлейкина 12 (РЕ-12), интерлейкина 13 (ЕЛ-13), интерлейкина 15 ПЛ-15) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулируюшего фактора (СМ-С8Р) или является их эффективной частью, и где белок теплового шока выбран из группы, состоящей из Η8Ρ70, Η8Ρ90, Н8С70, 6ΚΡ94 и кальретикулина (СКТ) или их эффективной части.
14. 14. Способ по любому из пп.2-13, где третьей частью является часть липидной природы, такая как пальмитоильная группа, миристильная группа, фарнезильная группа, геранилгеранильная группа, СΡI-якорь и Νацилдиглицеридная группа.
15. 15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где аналог СЭР-8 происходит от Сконцевой активной формы СЭР-8, как, напри мер, производное или аналог, происходящие от полипептида СЭЕ-8 коровы, свиньи, человека, курицы, овцы или индейки.
16. 16. Способ по п.15, где полипептид СЭЕ-8 был модифицирован путем замены по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в 8ЕЦ Ш ΝΟ: 11 или 12, по меньшей мере на одну аминокислотную последовательность одинаковой или отличной длины, содержащую чужеродный Тн-эпитоп, где замененные аминокислотные последовательности содержатся в остатках 1-12, 18-41, 43-48, 49-69 или 79-104 8ЕЦ Ш ΝΟ: 11 или 12 или где указанный полипептид СЭЕ-8 был модифицирован путем инсерции по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, которая содержит чужеродный Т_н-эпитоп, где указанную инсерцию осуществляют в любом месте в положениях 112, 18-30, 42-51, 82-86 и 105-109 в 8Ер Ш ΝΟ: 11 или 12.
17. 17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где презентацию иммунной системе осуществляют путем ковалентного или нековалентного связывания по меньшей мере двух копий аналога СЭЕ-8 с молекулой-носителем, способной осуществлять презентацию множества копий антигенных детерминант.
18. 18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где эффективное количество аналога СЭЕ-8 вводят животному способом введения, выбранным из парентерального введения, такого как внутрикожное введение, подкожное введение и внутримышечное введение; внутрибрюшинного введения; перорального введения; трансбуккального введения; подъязычного введения; эпидурального введения, спинального введения; анального введения и внутричерепного введения.
19. 19. Способ по п.18, где указанное эффективное количество полипептида СЭЕ-8, его производного или его аналога составляет от 0,5 до 2000 мкг.
20. 20. Способ по п.18 или 19, предусматривающий по меньшей мере одно введение аналога СЭЕ-8 в год, как, например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений в год.
21. 21. Способ по любому из пп.18-20, где аналог СЭЕ-8 необязательно объединяют с фармацевтически и иммунологически приемлемым носителем и/или наполнителем, а также с адъювантом, который способствует преодолению аутотолерантности к аутологичным антигенам, таким как адъювант, выбранный из группы, состоящей из иммунонацеливающего адъюванта; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и производное микобактерии; масляной композиции; полимера; мицеллообразующего адъюванта; сапонина; иммуностимулирующей комплексной матрицы (I8СΟΜ-матрицы); частицы; ЭЭА; алюминие вых адъювантов; ДНК-адъювантов; γ-инулина и инкапсулирующего адъюванта.
22. 22. Способ по любому из пп.19-21, где аналог СЭЕ-8 содержится в устройстве, имитирующем лимфоузел (УЬЦ).
23. 23. Способ по любому из пп.1-17, где презентацию аналога СЭЕ-8 иммунной системе осуществляют путем введения нуклеиновых(ой) кислот(ы), кодирующих аналог СЭЕ-8, в клетки животного, в результате чего происходит экспрессия ίη упуо введенных(ой) нуклеиновых(ой) кислот(ы) клетками.
24. 24. Способ по п.23, где введенная нуклеиновая(ые) кислота(ы) выбрана из оголенной ДНК; ДНК, объединенной с заряженными или незаряженными липидами; ДНК, включенной в липосомы; ДНК, включенной в вирусный вектор; ДНК, объединенной с белком или полипептидом, облегчающим трансфекцию; ДНК, объединенной с нацеливающим белком или полипептидом; ДНК, объединенной с кальцийпреципитирующими агентами; ДНК, объединенной с молекулой инертного носителя; ДНК, объединенной с хитином и хитозаном; и ДНК, объединенной с адъювантом.
25. 25. Способ по п.23 или 24, где указанные нуклеиновые кислоты вводят внутриартериально, внутривенно или способами, определенными в п.18.
26. 26. Способ по п.24 или 25, где указанные нуклеиновая(ые) кислота(ы) содержится(атся) в устройстве νΣΝ и/или составляют композицию, определенную в п.21.
27. 27. Способ по любому из пп.24-26, предусматривающий по меньшей мере одно введение нуклеиновых кислот в год, как, например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений в год.
28. 28. Способ наращивания мышечной массы у животного, предусматривающий отрицательную регуляцию активности СЭЕ-8 в соответствии со способом по любому из пп.1-27, до такого уровня, чтобы мышечная масса возрастала по меньшей мере на 5%, как, например, по меньшей мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 и 45% по сравнению с животными, имеющими нормальную активность СЭЕ-8.
29. 29. Аналог СЭЕ-8, происходящий от полипептида СЭЕ-8 животного, в который введена модификация, определенная в любом из пп.1-17.
30. 30. Иммуногенная композиция, содержащая иммуногенно эффективное количество аналога СЭЕ-8 по п.29, дополнительно содержащая фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель и/или наполнитель и необязательно адъювант.
31. 31. Иммуногенная композиция по п.30, где адъювант выбран из группы, состоящей из адъювантов, указанных в п.21.
32. 32. Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий аналог СЭЕ-8 по п.29.
33. 33. Вектор, несущий фрагмент нуклеиновой кислоты по п.32, такой как вектор, способный к автономной репликации.
34. 34. Вектор по п.33, выбранный из группы, состоящей из плазмиды, фага, космиды, минихромосомы и вируса.
35. 35. Вектор по п.33 или 34, содержащий в направлении 5'^3' и в функциональном соединении промотор для управления экспрессией фрагмента нуклеиновой кислоты по п.32, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, обеспечивающий секрецию или интеграцию в мембрану полипептидного фрагмента, фрагмент нуклеиновой кислоты по п.32 и, необязательно, терминатор.
36. 36. Вектор по любому из пп.33-35, который при введении в клетку-хозяина либо способен, либо не способен интегрироваться в геном клетки-хозяина.
37. 37. Вектор по п.35 или 36, где промотор управляет экспрессией в эукариотических клетках или в прокариотических клетках.
38. 38. Способ по любому из пп.1-17, где презентацию иммунной системе осуществляют путем введения непатогенного микроорганизма или вируса, несущего фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий и экспрессирующий полипептид или аналог СЭЕ-8.
39. 39. Способ по п.38, где вирусом является невирулентный поксвирус, такой как вирус коровьей оспы, или где указанным микроорганизмом является бактерия рода ЕксЕепсЫа (предпочтительно Е.со11), ВасШик, 8а1топе11а или МусоЬас1епит (предпочтительно непатогенная МусоЬас1есшт, такая как М. Ьоу1к ВСС).
40. 40. Способ по п.38 или 39, где непатогенный микроорганизм или вирус одновременно вводят животному.
41. 41. Композиция для индуцирования выработки антител против СЭЕ-8, содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.32 или вектор по любому из пп.33-37 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель и/или наполнитель, и/или адъювант.
42. 42. Композиция по п. 41, где указанный фрагмент нуклеиновой кислоты получают в соответствии со способом по п.24 или 26.
43. 43. Стабильная клеточная линия, несущая вектор по любому из пп.33-37 и экспрессирующая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.32, и необязательно секретирующая или несущая аналог СЭЕ-8 по п.29 на своей поверхности.
44. 44. Способ получения клеточной линии по п.43, предусматривающий трансформацию клетки-хозяина фрагментом нуклеиновой кислоты по п.32 или вектором по любому из пп.33-37.