SK722002A3 - Method for down-regulating GDF-8 activity - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa obecne týka oblasti živočíšnej výroby, a to chovu dobytka a hydiny, a tiež oblasti humánnej medicíny. Konkrétnejšie sa predkladaný vynález týka zlepšenia kontroly a zvýšenia nárastu svaloviny, obzvlášť u zvierat chovaných na farmách pre porážku. Sú teda poskytnuté nové metódy a prostriedky pre zrýchlený nárast svaloviny u zvierat určených na porážku.

Doterajší stav techniky

V súčasnosti sú používané dva rôzne prístupy pre zrýchlenie rýchlosti rastu chovných zvierat, založené na užití medikamentov: na jednej strane sú chovným zvieratám podávané antibiotiká alebo zlúčeniny antibiotikám podobných chovným zvieratám (najmä ošípaným), aby sa poďporovalá ich rýchlosť rastu, spôsobilo niekoľko problémov. Niektoré z týchto zlúčenín sú chemicky blízko príbuzné antibiotikám používaným pre liečenie humánnych chorôb a sú zhromažďované dôkazy, že nadmerné použitie týchto zlúčenín u chovných zvierat vyvoláva skríženú rezistenciu na humánne antibiotiká u mikroorganizmov pre človeka patogénnych.

Naviac pri použití týchto zlúčenín je získané relatívne nízke zvýšenie rýchlosti rastu o 1-3%.

Použitie rastových hormónov u chovných zvierat je nákladné a liečenie musí byť opakované . v pomerne krátkych intervaloch, čo je spôsobené relatívne krátkym biologickým polčasom rastového hormónu. Okrem toho prítomnosť potenciálneho reziduálneho rastového hormónu v mäsu produkovanom z ošetrených zvierat vyvolala určité obavy, konkrétne u európskych spotrebiteľov.

GDF-8

GDF 8 alebo myostatín bol objavený v máji 1997 ako rastový regulačný faktor selektívne znižujúci alebo tlmiaci (downregulujúci) rast kostrového svalstva (McPherron et al. , Náture, 387, 83-90, 1997). Expresia GDF-8 je obmedzená na mytómový kompartment vyvíjajúcich sa embryonálnych somitov, ale je tiež exprimovaný v rôznych svalových tkanivách v tele u dospelého živočícha.

U GDF-8 ,,„knock-out myší (myši, z ich genómu bol funkčne vyradený/odstránený gén pre GDF-8) sa prejavoval silno zvýšený nárast kostrovej svaloviny. Nárast kostrovej svaloviny sa javil v organizme všeobecný, a izolované svaly z GDF-8 negatívnych myší vážili približne 2-3 krát viacej než svaly myší divokého typu. Celkové telesné hmotnosti „knock-out myší boli približne o 35 % vyššie než hmotnosti myší divokého typu a myši, ktorým chýbal gén GDF-8 mali viacej než o 80 % viacej svalových vlákien v porovnaní s normálnymi myšami. Ale masívny nárast kostrového svalstva pozorovaný u „knock-out myší nie je spôsobený iba zvýšeným počtom svalových vlákien, ale tiež významnou hypertrofiou svalových vlákien. Oblasť svalu na priečnom reze GDF-8 „knock-out myší je zväčšená približne o 14 až 49% v závislosti na typu svalu.

Je zaujímavé, že bola tiež pozorovaná zvýšená rýchlosť nárastu svaloviny u dospelých transgénnych myší v porovnaní s dospelými netransgénnymi myšami. Ďalej bolo dokázané, že všetky GDF-8 negatívnych myší boli životaschopné a fertílne.

I

V novembri 1997 autori, ktorý pôvodne objavili GDF-8, publikovali, že dva chovy dobytka, ktoré sú charakterizované silným nárastom svaloviny, plemená Belgian Blue a Piedmontese, majú mutácie v GDF-8 kódujúcej sekvencie a že tieto sú zodpovedné za ich objemné svalstvo (McPherron a Se-Jin Lee, 1997, PNAS 94, 12457-12467). Tento jav dvojnásobného svalstva bol pozorovaný u viacerých chovov dobytka posledných 190 rokov a zvieratá vykazovali priemerný nárast svaloviny o 20-25 %. Preukazovala tiež zvýšenú účinnosť krmiva, ale stále produkovala mäso vysokej kvality.

Na rozdiel od GDF-8 „knock-out myší ale dobytok plemena Belgian Blue tiež prejavoval redukciu hmoty väčšiny ďalších orgánov. Tieto prírodné „knock-out kravy tiež trpeli zníženou fertilitou samíc, zníženou životaschopnosťou potomstva a opozdenou pohlavnou zrelosťou.

Relatívny nárast svaloviny u „knock-out kráv nie je ani zďaleka vyjadrený tak, ako je pozorovaný u „knock-outmyší - v skutočnosti odpovedá rozsahu svalovej hypertrofie pozorovanej u myší. McPherron et al. uvažovali, že jedným dôvodom by mohlo byť, že normálny dobytok môže mať nižší maximálny limit veľkosti svalu než myši (a teda maximálny získateľný počet svalových vlákien) po generáciách selektívneho kríženia. Autorami nebola publikovaná žiadne dáta týkajúce sa veľkosti hyperplazie versus hypertrofie svalových vlákien u dobytka, ale na základe tohto predpokladu a svalovej hypertrofie pozorované u „knock-out myší by bolo možné, že zvýšenie svaloviny a rýchlosť rastu pozorované napr. u dobytka plemena Belgian Blue sú spôsobené prevážne svalovou hypertrofiou a menšou mierou svalovou hyperplaziou.

Fyziologická úloha GDF-8

Expresia GDF-8 je vysoko obmedzená na kostrové svalstvo. V tukovom tkanive je nízky stupeň expresie, ale najmä v srdečnom sväle nie je žiadna expresia. Fyziologická úloha GDF-8 dospelých jedincov nie je známa, i keď sa zdá, že GDF-8 môže pôsobiť ako špecifický negatívny regulátor rastu kostrového svalstva. Špekulácie o fyziologickej úlohe sa sústreďuje na dôležité funkcie pri hypertrofii svalstva indukovanej záťažou alebo regeneráciou po svalovom poranení. GDF-8 môže ale tiež potlačovať rast tukového tkaniva. Nie je známe, či GDF-8 pôsobí behom rastu zvieraťa lokálne alebo systémovo.

Štruktúra GDF-8

GDF-8 patrí do tzv. superrodiny transformačného rastového faktoru β (TGF-β), kktorá obsahuje skupinu štruktúrne príbuzných proteínov zapojených do vývoja embrya. Humánne a bovinné GDF-8 sú vytvárané ako 375 aminokyseliny dlhé prekurzorové proteíny. Ako iné proteíny TGF-β superrodiny je GDF-8 pravdepodobne proteolyticky spracovaný na oveľa kratšom C-koncovom fragmente o približne 109 aminokyselinách, ktorý tvorí disulfidom spojené homodiméry. Homodimér je pravdepodobne biologicky aktívna forma GDF-8.

Sú známe aminikyselinové sekvencie myší, potkaní, humánny, paviánny, bovinný (hovädzí), prasaci, ovčí, kurací a morčací GDF-8 a GDF-8 molekula je vysoko konzervatívna (McPherron a Se-Jin Lee, PNAS, 94, 12457-12961, 1997). Sekvencia myšieho, potkanieho, humánneho, prasacieho kuracieho a morčacieho GDF-8 sú 100 % identické v C-koncovom úseku, ktorý pravdepodobne obsahuje biologicky aktívnu časť GDF-8. Obidva bovinný a ovčí GDF-8 sa odlišuje iba dvomi aminokyselinovými zvyškami od humánneho GDF-8 v C-koncovom úseku. Bovinný GDF-8 má sekvenciu -Glu-Gly- namiesto -Lys-Glu- v plohách 356-357 a ovčí GDF-8 má dve konzervatívne substitúcie (Val v polohe 316 a Arg v polohe 333 namiesto Leu a Lys, v danom poradí). Žiadny známy GDF-8 proteín neobsahuje potenciálne miesto N-glykosylácie vo svojom aktívnom C-koncovom úseku.

Podstata vynálezu

Cielom predkladaného vynálezu je poskytnúť rekombinantnú terapeutickú vakcínu schopnú prevádzať down-reguláciu (znižovanie aktivity) rastového diferenciačného faktoru 8 (GDF-8) (tiež známeho ako myostatín), aby sa zrýchlil nárast svaloviny u zvierat chovaných na farmách. Ďalším cieľom je poskytnúť spôsob vakcinácie zvierat, aby sa zrýchlil nárast svaloviny. Cieľom je tiež poskytnúť varianty GDF-8, ktoré sú schopné uniknúť autotolerancii proti autolognému GDF-8. Ešte ďalším cieľom je poskytnúť fragmenty nukleovej kyseliny, vektory a transformované bunky, ktoré sú všetky použiteľné pre prípravu vakcíny a GDF-8 variant.

Na základe vyššie uvedených zistení ú transgénnych GDF-8 „knock-out zvierat a u Belgian Blue a Piedmontese vyvinuli pôvodcovia teóriu, že je možné down-regulovať GDF-8 u zvierat indukciou účinnej a jemne ladenej imunitnej reakcie proti GDF8. Čo je v zásade poskytnuté predkladaným vynálezom, je spôsob a prostriedky pre imunologickú down-reguláciu GDF-8, aby sa dosiahlo nárastu svaloviny u zvierat.

Tento prístup má niekoľko výhod oproti známym postupom urýchľujúcim rast u chovných zvierat. Pri použití postupu podľa vynálezu predovšetkým nevznikajú problémy týkajúce sa skrížené rezistencie u patologických mikroorganizmov. Ďalej, v mäsu zvierat, ktoré boli podrobené ošetreniu podľa vynálezu, nebude žiadny potenciálny reziduálny exogénne podávaný rastový hormón. Konečne je tiež možnosť sa vyhnúť etických problémom týkajúcich sa kríženia a produkcie dobytka, ako sú plemená Belgian Blue a Piedmontese (kde sa veľa teliat rodí cisárskym rezom a kde ďalšie orgány majú menšiu veľkosť) tak, že sa down-regulácie GDF-8 u zvierat odsunie až po narodení (napr. iba do dospelého veku) - v skutočnosti zvieratá majúce zvýšenú svalovinu nemusia rodiť vôbec a ošetrenie môže byť teda vyhradené iba zvieratám, ktoré sú určené na porážku.

Pretože počet a typ svalových vlákien je určený behom embryonálneho vývoja, nie je veľmi pravdepodobné, že by antiGDF-8 vakcína zvýšila počet svalových vlákien u dospelých chovných zvierat. Nie je teda isté ani pravdepodobné, že by anti-GDF-8 vakcína bola schopná suprimovať GDF-8 do rovnakého stupňa, ako je pozorovaný u GDF-8 „knock-out zvierat. Toto by pravdepodobne nebolo tiež žiadúce, pretože by to mohlo možno negatívne ovplyvniť kvalitu mäsa, schopnosť kríženia a pomer tuku. Ale aj tak zrýchlenie rastu a/lebo maximálne telesné hmotnosti o 5-25 % dosiahnuté u očkovaných zvierať spôsobené svalovou hypertrofiou post partum (číselné rozmedzie, ktoré sa nezdá byť nerealistické) je stále zaujímavé pri produkcii mäsa z hovädzieho dobytka', ošípaných a hydiny.

Identita sekvencie GDF-8 relatívne s ďalšími členmi TGF-β rodiny je iba 30-40 percent na úrovni aminokyselín. Táto nízka identita sekvencie so všetkou pravdepodobnosťou nevytvorí problémy so skríženou reaktivitou protilátok indukovaných proti GDF-8.

Teda vo svojom najširšom a naj obecnejšom rozsahu sa predkladaný vynález týka spôsobu in vivo down-regulácie (zníženie) aktivity rastového diferenciačného faktoru 8 (GDF8) u zvieraťa i človeka, tento spôsob obsahuje prezentáciu imunitnému systému zvieraťa imunologický účinného množstva aspoň jedného GDF-8 polypeptidu alebo jeho subsekvencie, ktorý bol formulovaný tak, že imunizácia zvieraťa GDF-8 polypeptidom alebo jeho subsekvencií indukuje produkciu protilátok proti GDF-8 polypeptidu, a/lebo

- aspoň jedného GDF-8 analógu, do ktorého je zavedená aspoň jedna modifikácia v GDF-8 aminokyselinovej sekvencie, čo má za následok, že imunzácia zvieraťa analógom indukuje produkciu protilátok proti GDF-8 polypeptidu.

.Očakáva sa, že 1 až 4 ročné injekcie imunogénneho prípravku podľa vynálezu budú postačujúce pre vznik požadovaného účinku, zatiaľ čo podávanie oboch rastových hormónov vyžaduje omnoho častejšie podávanie danému zvieraťu.

Vynález sa tiež i týka analógov GDF-8, a tiež fragmentov nukleovej kyseliny kódujúcich ich podskupinu. Súčasťou vynálezu s tiež imunogénne prípravky obsahujúce analógy alebo fragmenty nukleovej kyseliny.

Vynález sa tiež týka spôsobu identifikácie imunogénne účinných analógov GDF-8, a tiež spôsobu výroby prípravku obsahujúceho analógy GDF-8.

Popis obrázkov

Obr. 1: Modely konštruktov autovakcíny derivovaných z GDF-8. Úseky vyznačené tmavo šedo sú úseky, kde je navrhované uskutočnenie substitúcie P2 a P3Ô,v danom poradí.

A: Konštrukt monoméru s inzertmi P2 epitópu. 1 označuje P2 substitúciu aminokyselinových zvyškov 18-32 z C-koncového GDF8 framgentu o veľkosti 109 aminokyselín, 2 označuje P2 substitúciu aminokyselinových zvyškov 52-66 c C-koncového GDF8 fragmentu o veľkosti 109 aminokyselín a 3 označuje P2 substitúcie aminokyselinových zvyškov 83-97 z C-koncového GDF8 fragmentu o veľkosti 109 aminokyselín.

B: konštrukt monoméru s inzertmi P30 epitópu. 1 označuje P30 substitúciu aminikyselinových zvyškov 21-41 z C-koncového GDF8 fragmentu o veľkosti 109 aminokyselín, 2 označuje P30 substitúciu aminokyselinových zvyškov 49-69 z C-koncového GDF8 fragmentu o veľkosti 109 aminokyselín a 3 označuje P30 substitúciu aminokyselinových zvyškov 79-99 alebo 84-104 z Ckoncového GDF-8 fragmentu o veľkosti 109 aminokyselín.

C: rozšírený konštrukt monoméru s P2 a P30 substituovanými v C-koncovom GDF-8 fragmente o veľkosti 160 aminokyselín.

* ' ^{1 r} ; ^!

D: konštrukt diméru s P2 a P30 epitópami sériovo spojenými medzi dvomi kópiami C-koncového GDF-8 fragmentu o veľkosti 109 aminokyselín.

Obr. 2: očakávaná 3D štruktúra TGF-β proteínu. Model je založený na analógnej doméne (TGJ-1) z TGF-β proteínu. β-listy sú ukázané ako šípky a helixy ako valce.

Definícia

V nasledujúcom texte je definovaná a detailne vysvetlená rada termínov použitých v prítomnom popise a patentových nárokoch, aby sa objasnili ciele a súvislosti vynálezu.

Termíny T lymfocyt a T bunka sú používané zamenitelne pre lymfocyty pochádzajúce z thymu, ktoré sú zodpovedné za rôzne imunitné reakcie sprostredkované bunkami a tiež za pomocnú aktivitu v humorálnej imunitnej reakcii. Podobne sú použité termíny B' lymfocyt a B bunka zamenitelne pre lymfocyty produkujúce protilátky.

Termín GDF-8 polypeptid v tomto texte označuje polypeptidy majúce aminikyselinovú sekvenciu vyššie diskutovaných GDF-8 proteínov pochádzajúcich z celej rady zvierat (lebo ich skrátených variant, ktoré majú podstatné množstvo epitópov B lymfocytu s intaktným GDF-8), ale týmto termínom sú tiež obsiahnuté polypeptidy majúce aminokeselinovú sekvenciu totožnú s xeno-analógmi týchto dvoch proteínov izolovanými z ďalších živočíšnych druhov. Použitím tohto termínu sa normálne mieni biologicky aktívna forma, t. j. Ckoncový peptid, ktorý je u človeka dlhý 109 aminokyselín. Tiež neglykosylované formy GDF-8, ktoré sú pripravené v prokaryotických systémoch, sú ohraničené týmto termínom, ako sú formy majúce rôzny charakter O-glykosylácie vďaka použitiu napr. kvasiniek alebo ďalších iných než cicavčích eukaryotických expresných systémov. Je ale nutné poznamenať, že používaním termínu GDF-8 polypeptid je myslené, že uvažovaný polypeptid je normálne neimunogénny, keď je prezentovaný liečenému zvieraťu. Inými slovami GDF-8 polypeptid je autoproteín alebo je to xeno-analóg takého autoproteínu, ktorý nedáva normálne vzniknúť reakcii proti GDF-8 u skúmaného zvieraťa.

Termín GDF-8 analóg označuje GDF-8 polypeptid, v ktorom boli prevedené zmeny primárnej štruktúry. Táto zmena môže byť napr. vo forme fúzie GDF-8 polypeptidu k vhodnému fúznemu partnerovi (t. j. zmena primárnej štruktúry zahrňujúcej výlučne C-koncové a/lebo N-kóncové pridanie aminokyselinových zvyškov)a/lebo môže byť vo forme inzercie a/lebo delécie a/lebo substitúcie v GDF-8 polypeptidovej aminokyselinovej sekvencii. Termínom GDF-8 analóg sú tiež zhrnuté derivované GDF-8 molekuly, zrovnaj diskusiu nižšie o modifikáciách GDF-8.

Je nutné poznamenať, že použitie u človeka napr. psieho analógu humánneho GDF-8 ako vakcíny môže byť chápané tak, že sa vytvorí požadovaná imunita proti GDF-8. Takéto použitie xeno-analógu pre imunizáciu je tiež považované za GDF-8 analóg tak, ako je definovaný vyššie.

Je myslené, že termín polypeptid v prítomnom kontexte znamená obidva krátke peptidy o 2 až 10 aminokyselinovcýh zvyškoch, oligopeptidy o 11 až 100 aminokyselinových zvyškoch a polypeptidy o viacej než 100 aminokyselinových zvyškoch. Okrem toho je tiež myslené, že tento termín obsahuje proteíny, t.j. funkčné biomolekuly obsahujúce aspoň jeden polypeptid, keď obsahuje aspoň dva plypeptidy, tieto môžu tvoriť komplexy, môžu byť kovalentne spojené alebo môžu byť spojené nekovalentne. Polypeptid (y) v proteíne môžu byť glykosylované a/lebo lipodované a/lebo obsahujú próspetické skupiny.

Termín subsekvenica znamená akýkoľvek nepretržitý úsek aspoň 3 aminokyselín alebo prípadne aspoň 3 nukleotídov, pochádzajúcich priamo z prirodzene sa vyskytujúcich GDF-8 aminokeselinovej sekvencie alebo sekvencie nukleovej kyseliny, v danom poradí.

Je myslené, že termín zviera v danom kontexte obecne označuje druhy živočíchov (výhodne cicavcov) , ako je napríklad Homo sapiens, Canis domesticus, apod. A nie iba jedno jediné zviera. Ale termín tiež označuje populáciu takého živočíšneho druhu, pretože je dôležité, že všetci jedinci imunizovaní podľa spôsobu vynálezu obsahujú v podstate rovnaký GDF-8, čo umožňuje imunizáciu zvierat rovnakým imunogénom (imunogény). Ak napríklad v rôznych varianty GDF-8, môže populáciách odlišné autotolerancii na GDF-8 použiť v týchto rôznych ľudských populáciách existujú genetické byť nutné imunogény, v každej jasné, že zviera v danom kontexte imunitný systém. Je výhodné, napríklad cicavec.

Termínom down-regulácia tomto texte mienené zníženie aby bolo populácii.

je živá bytosť, ktorá keď zviera je stavovec, ako možné uniknúť

Odborníkovi je má je (alebo medzi GDF-8 a inými väzobnými byť dosiahnutá naj j ednoduchšia v aktívnom mieste partnermi tejto niekoľkými j ednoduchá

GDF-8. Ale že väzba

GDF-8 aktivity in vivo je počtu interakcií medzi GDF-8 jeho receptormi v živom organizme možnými biologicky dôležitými molekuly). Down-regulácia môže mechanizmami: z nich je interferencia s väzbou protilátky v rozsahu predkladaného vynálezu je tiež to, protilátky má za následok odstránenie GDF-8 bunkami so scavengerovými („upratovacími) receptormi (ako sú napríklad makrofágy a ďalšie fagocytujúce bunky).

Výraz prezentuje... imunitný systém zvieraťa podnetu. Ako bude jasné podnecovanie imunitného imunitnému systému označuje to, že je vystavený riadenému imunogénnemu z popisu uvedeného nižšie, toto systému môže byť prevádzané celou radnou spôsobov, z ktorých je najdôležitejšia vakcinácia polypetidom obsahujúcim farmakologické vakcínu, ktorá je podávaná pre liečbu alebo pokračujúcou chorobou) alebo očkovanie vakcínou nukleovou kyselinou. Dosiahnutým je, že imunokompetentné bunky zvieraťa antigénom imunologický účinne, zatiaľ čo vakcíny (t.j. zmiernenia stále farmakologickou dôležitým výsledkom sú konfrontované s presný spôsob, ako tento výsledok dosiahnuť, je pre vynálezcovskú myšlienku predkladaného vynálezu menej dôležitý.

Termín imunogénne účinné množstvo má svoj obvyklý význam v obore, t.j. označuje množstvo imunogénu schopné indukovať imunitnú reakciu, ktorá sa významne zaoberá patogénnymi agens, ktorá sa podieľa na imunologických rysoch s imunogénom.

Používaním výrazu, že GDF-8 bol modifikovaný sa v tomto texte myslí chemická modifikácia polypeptidu, ktorý vytvára hlavný reťazec GDF-8. Takú modifikáciu môže napr. byť derivácia (napr. alkylácia, acylácia, esterifikácia ap.) určitých aminokyselinových zvyškov v GDF-8 sekvencii, ale ako vyplynie z poisu nižšie, výhodné modifikácie zahrňujú zmeny (alebo pridávaním k) primárne štruktúry GDF-8 aminokyselinové sekvencie, t.j. modifikácie, ktoré majú za následok poskytnutie GDF-8 analógu, v ktorom bola modifikovaná primárna aminokyselinová sekvencia.

Pojmom autotolerancia ku GDF-8 sa rozumie, že i keď GDF8 je autoproteín v populácii, ktorá má byť očkovaná, normálni jedinci v populácii nevyvíjajú imunitnú reakciu proti GDF-8, hoci nemôže byť vylúčené, že príležitostní jedinci vo zvieracej populácii by mohli byť schopní tvoriť protilátky proti natívnemu GDF-8, napr. ako časť autoimunitnej poruchy. Kedykoľvek bude zviera normálne autoleratné iba k svojmu vlastnému GDF-8, ale nemôže byť vylúčené, že analógy GDF-8 pochádzajú z iných druhov zvierat alebo, z populácie majúcej odlišný GDF-8 fenotyp, by tiež mohli byť tolerované uvedeným zvieraťom.

Termíny cudzorodý epitóp T lymfoytu (alebo: cudzorodý T lymfocytárny epitóp) označujú peptid, ktorý je schopný viazať MHC molekulu a ktorý stimuluje T lymfocyty v živočíšnych druhoch. Výhodné cudzorodé epitópy T lymfocytu podľa vynálezu sú všeobecné (alebo tzv. promiskuitné) epitópy, t.j. epitópy, ktoré viažu podstatnú časť konkrétnej triedy MHC molekúl v živočíšnych druhoch alebo populácii. Je známy iba veľmi obmedzený počet týchto všeobecných epitópov T lymfocytu a budú diskutované detailne nižšie. Je nutné poznamenať, že aby imunogény, ktoré sú použité podľa predkladaného vynálezu, boli účinné u čo najväčšej frakcie populácie zvierat, ako je len možné, môže byť nevyhnutné 1) vložiť niekoľko cudzorodých epitópov T lymfocytu do rovnakého GDF-8 analógu alebo 2) pripraviť niekoľko analógov GDF-8, kde každý analóg má vložený odlišný všeobecný epitóp. Je tiež nutné potrebné, poznamenať, že pojem cudzorodých epitópov T lymfocytu tiež obsahuje použitie kryptických epitópov T lymfocytu, t.j. epitópov ktoré pochádzajú z autoproteínu a ktoré prejavujú imunogénne chovanie iba vtedy, keď existujú v izolovanej forme bez toho, aby boli časti skúmaného autoproteínu.

Termín cudzorodý epitóp pomocného T lymfocytu (cudzorovy T_H epitóp) je cudzorodý epitóp T lymfocytu, ktoré sa viaže na molekulu MHC triedy II a môže byť predložený na povrchu bunky prezentujúcej antigén (APC) naviazanej k molekule MHC triedy

II.

Termín funkčná časť (bio)molekuly v danom kontexte znamená časť molekuly, ktorá je zodpovedná za aspoň jeden biochemický alebo fyziologický účinok prejavovaný molekulou. V obore je známe, že veľa enzýmov a iných efektorových molekúl majú aktívne miesto, ktoré je zodpovedné za účinky prejavované skúmanou molekulou. Ďalšie časti molekuly môže slúžiť účelom stabilizácie alebo zvýšeniu rozpustnosti a môžu teda byť vynechané, ak tento účel nie je relevatný pre určité prevedenie predkladaného vynálezu. Napríklad je možné použiť určité ďalšie cytokíny ako' modifikujúcu skupinu v GDF-8 (porovnaj detailné diskusie nižšie) a v takomto prípade môže byť otázka stability irelevantná, pretože kondenzácia ku GDF-8 poskytuje nezbytnú stabilitu.

Termín adjuvanš má svoj obvyklý význam v obore vakcinačnej technológie, t.j. znamená predmentú látku alebo prípravok, ktorý 1) nie je sám o sebe schopný vyvolať špecifickú imunitnú reakciu proti imunogénu vakcíny, ale ktorý je 2) schopný zosiliť imunitnú reakciu proti imunogénu. Alebo inými slovami, vakcinácia adjuvans samotným neposkytuje imunitnú reakciu proti imunogénu, vakcinácia imunogénom môže alebo nemusí vyvolať imunitnú reakciu proti imunogénu, ale kombinácie vakcinácie imunogénom a adjuvans indukuje imunitnú reakciu proti imunogénu, ktorá je silnejšia, než reakcia indukovaná imunogénom samotným. .

Termínom cielenie molekuly je v danom kontexte označovaná situácia, kedy sa molekula po zavedení do zvieraťa objaví prednostne v určitom tkanive (tkanivách) alebo je prednostne združovaná s určitými bunkami alebo bunečnými typmi. Účinok môže byť uskutočnený radu spôsobov vrátane formulácie molekuly do prípravku uľahčujúceho cielenie alebo zavedením skupiny uľahčujúcej cielenie do molekuly. Tieto otázky budú diskutované detailne nižšie.

Termín stimulácia imunitného systému znamená, že predmetná látka alebo prípravok prejavuje obecný, nešpecifický imunostimulačný účinok. Počet adjuvancií a predpokladaných adjuvancií (ako sú napríklad určité cytokíny) podieľajú sa na schopnosti stimulovať imunitný systém. Výsledkom použitia imunostimulačného agens je zvýšená pohotovosť imunitného systému znamenajúca, že simultánna alebo následná imunizácia imunogénom indukuje významne účinnejšie imunitnú reakciu v porovnaní s použitím izolovaného imunogénu.

Výhodné prevedenie down-regulácie GDF-8 aktivity

Je výhodné, kdeď GDF-8 polypeptid použitý ako imunogén v spôsobe podľa vynálezu je modifikovaná molekula, kde je v GDF8 aminokyseilovej sekvencie prítomná aspoň jedna zmena, pretože šanca na získanie dôležitého úniku autotolerancií na GDF-8 je týmto spôsobom výrazne uľahčená. Je nutné poznamenať, že to vylučuje možnosť použitia takto modifikovaného GDF-8 vo formuláciách, ktoré ďalej uľahčujú únik autotolerancií na GDF8, napr. formulácia obsahujúca určité adjuvancie diskutované detailne nižšie.

Bolo dokázané (v Daum I et al. , 1996, J. Immunol. 157, 4796-4804), že potenciálne autoreaktívne B lymfoyty rozpoznávajúce autoproteíny sú u normálnych jedincov fyziologicky prítomné. Ale aby v týchto B lymfocytoch bola indukovaná skutočná tvorba protilátok reagujúcich s relevantnými autoproteínmi, je potrebné prispenie T pomocných lymfocytov produkujúcich cytokíny (T_H bunky alebo T_H lymfocyty). Normálne táto pomoc nie je poskytnutá, pretože T lymfocyty obecne nerozoznávajú epitópy T lymfocytov pochádzaj úcich z áutoproteinov, keď sú predkladnaé bunkami prezentuj úcimi antigén (APC).

ale po zaistení prvku cudzorodosti v autoproteíne (t. j .

zavedenie imunologický významnej modifikácie) T lymfocyty rozpoznávajúce cudzorodý prvok sú aktivované po rozpoznávaní cudzorodého epitópu na APC (ako je napríklad spočiatku mononukleárna bunka). Polyklonálne

B lymfocyty (ktoré sú tiež špecializované APC) schopné rozoznanie autoepitópov na modifikovanom autoproteíne tiež internalizujú antigén a potom prezentujú jeho cudzorodý.epitóp (y) T lymfocytu a aktivované T lymfocyty potom poskytujú cytokínovú pomoc týmto autoreaktívnym polyklonálnym B lymfocytom. Pretože protilátky vytvorené týmito polyklonálnymi B lymfocytmi sú reaktívne s odlišnými epitópmi modifikovaného , polypeptidu, vrátane tých, ktoré šú tiež prítomné nnatívnom polypeptide, je indukovaná protilátka skrížené reagujúca s nemodifikovaným autoproteínom. Záverom, T lymfocyty môžu byť vedené k tomu, že jednajú tak, ako keby populácia polyklonálnych B lymfocytov rozpoznávala úplne cudzorodý antigén, zatiaľ čo v skutočnosti je pre hostiteľa cudzorodý iba vložený epitóp (epitópy). Týmto spôsobom sú indukované protilátky schopné skríženej reakcie s nemodifikovanými autoantigénmi.

V obore je známych niekoľko spôsobov, ako modifikovať peptidový autoantigén, aby sa dosiahlo úniku autotolerancie. Teda podľa vynálezu modifikácia môže zahrňovať, že zavedený aspoň jeden cudzorodý epitóp T lymfocytov a/lebo je zavedená aspoň jedna prvá skupina, ktorá prevádza cielenie modifikovanej molekuly k bunke prezentujúcej antigén (APC), a/lebo

- je zavedená aspoň jedna druhá skupina, ktorá stimuluje imunitný systém a/lebo

- je zavedená aspoň jedna tretia skupina, ktorá optimalizuje prezentáciu modifikovaného GDF-8 polypeptidu imunitnému systému.

Ale všetky tieto modifikácie by mali byť prevádzané pri udržovaní podstatnej frakcie pôvodných epitópov B lymfocytov na aktívnom GDF-8, pretože je takto zosilené rozoznávanie natívnej molekuly B lymfocytom.

V jednom výhodnom prevedení sú kovalentne alebo nekovalentne zavedené postranné skupiny (vo forme cudzorodých epitópov T lymfocytov alebo vyššie uvedené prvé, druhé a tretie skupiny). To znamená, že úseky aminokyselinových zvyškov pochádzajúce z GDF-8 sú derivované bezo zmeny primárnej aminokyselinovej sekvencie alebo aspoň bez zavedenia zmien v peptidových väzbách medzi jednotlivými aminokyselinami v reťazci.

Alternatívne a výhodné prevedenie používa substitúciu a/lebo deléciu a/lebo inzerciu a/lebo adíciu aminokyselín (čo môže byť prevádzané rekombinantnými technikami alebo pepitodovou syntézou, modifikácie, ktoré sa týkajú dlhších úsekov aminokyselín môžu dať vzniku fúznym polypeptidom). Jedná obzvlášť výhodná verzia tohto prevedenia je technika popísaná vo WO 95/05849, ktorá popisuje spôsob down-regulácie autoproteínov imunizácie analógmi autoproteínov, kde bol veľký počet aminokyselinových sekvencii substituovaný odpovedajúcim počtom aminokyselinových sekvencii, z ktorých každá obsahovala cudzorodý imunodominantý epitóp T lymfocytov, zatiaľ čo bola súčasne udržaná obecná terciárna štruktúra autoproteínou v analógu. Pre účely predkladaného vynálezu je ale postačujúce, ak modifikácia (či už to je inzercia, adícia, delécia alebo substitúcia lymfocytu' a aminokyseliny) ’ založila súčasne uchovala lymfocytu účinnosti

GDF-8.

Ale aby imunitnej cudzorodý podstatný počet bolo dosiahnutej je výhodné, že je .

terciárna štruktúra epitóp T epitópov B maximálnej reakcie, udržovaná indukovanej v modifikovanej molekule obecná

GDF-8.

Naslédujúci vzorec popisuje GDF-8 spadajúcej do rozsahu vynálezu:

konštrukty obecne (MODJsí (GDF-8_ei)ni (MOD2)_s2 (GDF-8_e2)n2. (MOD_X) _sx (GDF-8_ex)nx (I)

- kde GDF-8_ei-GDF-8_ex je x epitópov B lymfocytov obsahujúcich subsekvencie GDF-8, ktoré sú nezávisle identické alebo neidentické a ktoré môžu obsahovať alebo neobsahujú cudzorodé postranné skupiny, x je celé číslo > 3, nl-nx sú x celá čísla > 0 (aspoň jedno je > 1), MODi-MOD_x sú x modifikácie zavedené medzi zachované epitópmi B (asoň jedno je > 1, ak žiadne postranné skupiny).

lymfocytov a. si-s_x sú x celé čísla >

v GDF-8_e sekvencii nie sú

I zavedené

Teda za daných obecných obmedzeniach imunogenicity konštruktov, vynález všetky druhy permutácií pôvodnej GDF-8 sekvencie druhy modifikácií. Teda vo vynáleze sú GDF-8 získané vynechaním časti prejavuje vedľajšie účinky in ktorá by mohla založiť nežiadúce funkčných umožňuj e a všetky zahrnuté modifikované

GDF-8 sekvencie, ktorá napr.

vivo alebo vynechaním časti, imunologické reakcie.

Udržovanie podstatnej frakcie epitópov B lymfocytov alebo dokonca obecnej terciárne j štruktúry proteínov, ktorý je podrobený modifikácii tak, ako bolo v tomto 'texte popísané, môže byť dosiahnuté niekoľkými spôsobmi. Jedným z nich je jednoducho pripraviť polyklonálne antisérum namierené proti GDF-8 )napr. antisérum pripravené v králikovi) a potom použitie tohto antiséru ako testovanej reagencie (napr. v kompetitívnom teste ELISA) proti modifikovaným proteinom, ktoré sú vytvárané. Modifikované verzie (analógy), ktoré reaguj do rovnakej miery s antisérom ako GDF-8, zatiaľ čo analógy prejavujúce obmedzenú (ale ešte významnú a špecifickú) reaktivitu s týmto antisérom si zachovávajú podstatnú časť pôvodných epitópov B lymfocytu.

Alternatívne môže byť pripravená a použitá ako testovací panel selekcia monoklonálnych protilátok reagujúcich s rozdielnymi epitópmi GDF-8. Tento postup výhodne umožní 1) mapovanie epitópov GDF-8 a 2) mapovanie epitópov, ktoré sú udržované v pripravených analógoch.

Samozrejme tretím prístupom by bolo rozložiť trojrozmernú štruktúru GSF-8 alebo jeho biologický aktívne skrátené varianty (porovnaj vyššie) a zrovnať ju s rozloženou trojrozmernou štruktúrou pripravených analógov. Trojrozmerná štruktúra môže byť rozložená prostredníctvom štúdia rôntgenovej difrakcie a NMR spektroskopie. Ďalšie informácie týkajúce sa terciárnej štruktúry môžu byť do určitej miery získané zo štúdií cirkulárneho dichroizmu, ktoré majú výhodu, že vyžadujú polypeptid iba v čistej forme (zatiaľ čo rontgenová difrakcia vyžaduje obstaranie kryštalizovaného polypeptidu a NMR vyžaduje obstaranie izotópových variant polypeptidu), aby bola poskytnutá použiteľná informácia o terciárnej štruktúre danej molekuly. Ale nakoniec rontgenová difrakcia a/lebo NMR sú potrebné pre zisk smerodajných dát, pretože cirkulárny dichroizmus môže poskytnúť iba nepriamy dôkaz správnej trojrozmernej štruktúry prostredníctvom informácie o sekundárnych štruktúrnych prvkoch.

Jedno výhodné prevedenie vynálezu používa mnohonásobné prezentácie epitópov B lymfocytov GDF-8 (t.j. vzorec I, kde aspoň jeden epitóp B lymfocytu je prítomný vo dvoch pozíciách). Tohto účinku sa môže dosiahnuť rôznymi spôsobmi, napr. jednoduchou prípravou fúznych polypeptidov obsahujúcich štruktúru (GDF-8(_m, kde m je celé číslo > 2, a potom zavedením modifikácie diskutovaných v tomto texte do aspoň jednej GDF-8 sekvencie alebo alternatívne vložením medzi aspoň dve GDF-8 aminokyselinovej sekvencie. Je výhodné, že zavedené modifikácie zahrňujú aspoň jeden duplikát epitópu B lmyfocytu a/lebo zavedenie hapténu.

Ako bolo uvedené vyššie, zavedenie cudzorodého epitópu T lymfocytu môže byť uskutočnené zavedením inzercie, adície, delécie alebo substitúcie aspoň jednej aminokyseliny. Pravdaže normálne bude zavedenie viacej nej jednej zmeny do aminokyselinovej sekvencie (napr. inzercie alebo substitúcie kompletného epitópu T lymfocytu), ale je dôležité dosiahnuť, aby GDF-8 analóg, keď je spracovávaný bunkou prezentujúcej antigén (APC), založil taký cudzorodý imunodominantný epitóp T lymfocytu, ktorý bude predložený molekule MHC triedy II na povrchu APC. Teda, ák GDF-8 aminokyselinová sekvencia vo vhodných pozíciách obsahuje množstvo aminokyselinových zvyškov, ktoré môžu byť tiež zistené v cudzorodom T_H epitópe, potom zavedenie cudzorodého T_H epitópu môže byť uskutočnené poskytnutím zvyšných aminokyselín cudzorodého epitópu pomocou inzercie, adície, delécie a substitúcie aminokyseliny. Inými slovami, nie je nutné zaviesť inzerciou alebo substitúciou kompletný T_H epitóp.

Je výhodné, keď je počet aminokyselinových inzercií, delécii, substitúcií alebo adícií aspoň 2, napríklad 3, 4, 5,

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 a 25 inzercií, substitúcií, adícií alebo delécii. Ďalej je výhodné,

I keď počet aminokyselinových inzercií, substitúcií, adícií alebo delécii nepresahuje 150, je napríklad najviacej 100, najviacej 90, najviacej 80 a najviacej 70. Je obzvlášť výhodné, keď počet substitúcií, inzercií, delécii alebo adícií nepresiahne 60 a konkrétne by počet nemal presiahnuť 50 alebo dokonca 40. Najvýhodnejší je počet nie viacej než 30. Čo sa týka adícii aminokyselín, je nutné poznamenať, že počet adícií, keď je výsledný konštrukt vo forme fúzneho polypeptidu, je často značne vyšší než 150.

Výhodné prevedenie vynálezu zahrňuje .modifikáciu zavedením aspoň jedného cudzorodého imunodominantného T_H epitópu. Je nutné porozumieť, že otázka imunitnej dominancie T_H epitópu závisí na skúmanom živočíšnom druhu. Termín imunodominancie používaný v tomto texte sa jednoducho týka epitópov, ktoré u očkovaného jedinca vyvolajú významnú' imunitnú reakciu, ale je známym faktom, že T_H epitóp, ktorý je imunodominantný u jedného jedinca, nie je nutne imunodominantný u ďalšieho jedinca rovnakého živočíšneho druhu, dokonca i keď môže byť schopný väzby MHC-II molekuly u posledne uvedeného jedinca.

Ďalším dôležitým bodom je otázka MHC reštrikcie T_H epitópov. Obecne prirodzene sa vyskytujúce T_H epitópy sú MHC obmedzené, t. j. určitý peptid tvoriaci T_H epitóp sa účinne viaže iba k podskupine molekúl MHC triedy II. To má ďalej ten účinok, že vo väčšine prípadov použite jedného špecifického T_H epitópu má za následok zložku vakcíny, ktorá je účinná iba vo frakcii populácie a v závislosti na veľkosti tejto frakcie, môže byť nezbytné zahrnúť viacej T_H epitópov do rovnakej molekuly alebo alternatívne pripraviť vakcínu s veľkým počtom zložiek, kde zložky sú GDF-8 varianty, ktoré sa od seba líšia povahou zavedeného T_H epitópu.

Ak je MHC reštrikcie použitých T lymfocytov je úplne neznáma (napríklad v situácii, keď má očkované zviera nedostatočne definované MHC zloženie) , frakcia populácie zvierat pokrytá špecifickým vakcinačným prípravkom môže byť určená pomocou nasledujúceho vzorca:

- kde Pi je početnosť jedincov v populácii reagujúcich na i -tý cudzorodý epitóp T lymfocytu prítomný vo vakcinačnom prípravku a n je celkový počet cudzorodých epitópov T lymfocytu vo vakcinačnom prípravku. Tak teda vakcinačný prípravok obsahujúci 3 cudzorodé epitópy T lymfocytu majúci početnosť reakcií v populácii 0,8 0,7 a 0,6 v danom poradí, by dal

- 0,2 x 0,3 X 0,4 = 0,976

- t.j. u 97,6 % populácie sa štatisticky vyvinie MHC-II sprostredkovaná reakcia na vakcínu.

Vyššie uvedený vzorec nie je možné použiť v situáciách, keď je viacej alebo menej presne známy typ MHC reštrikcie použitých peptidov. Ak sa napríklad určitý peptid viaže iba na humánne molekuly MHC-II kódované HLA-DR aleliami DRI, DR3, DR5 a DR7, potom použitie tohto peptidu spolu s ďalšími peptidmi, ktoré sa viažu na zvyšné molekuly MHC-II kódované HLA-DR aleliami dovŕši 100 % pokrytie v skúmanej populácii. Podobne, ak sa druhý peptid viaže iba na DR3 a DR5, pridanie tohto peptidu nezvýši pokrytie všetkých. Ak je kalkulácia reakcie populácie založená iba na MHC reštrikcii epitópov T lymfocytu vo vakcíne, frakcia populácie pokrytej špecifickým vakcinačným prípravkom môže byť určená pomocou nasledujúceho vzorca:

(III)

- kde <f)j je suma frekvencií alelických haplotypov v populácii, ktoré kódujú MHC molekuly, ktoré viažu ’ akýkoľvek epitóp T lymfocytu vo vakcíne a ktoré patria k j-tému z 3 známych HLA lokusov (DP, DR a DQ), v praxi je najprv určené, ktoré MHC molekuly rozpoznajú každý epitóp T lymfocytu vo vakcíne a preto sú tieto MHC molekuly uvedené typom (DP, DR a DQ) potom sú jednotlivé frekvencie odlišných uvedených alelických haplotypov pre každý typ sumarizovaný, a tým poskytujú φγ, φ₂ a φ3.

Môže nastať situácia, keď sa hodnota pi vo vzorci II prekročí odpovedajúcu teoretickú hodnotu π± :

(IV)

- kde vj suma frekvencií alelických haplotypov v populácii, ktoré kódujú MHC molekuly, ktoré viažu ϊ-tý epitóp T lymfocytu vo vakcíne a ktoré patria k j-tému z 3 známych HLA lokusov (DP, DR a DQ) . To znamená, že v 1-π±, populácii je početnosť reagujúcich osôb f_rezíduáiny-i = (Pi - Ki)/(1 -Kí) . Tak teda, vzorec III môže byť upravený tak, že vzniká vzorec V:

(v)

- kde termín f_reziduáiny-i sa rovná nule, ak je negatívny. Je nutné poznamenať, že vzorec V vyžaduje, aby všetky epitópy boli haplotypy mapované proti identickým sadám palotypov.

Pri selekcii epitópov T lymfocytu, ktoré majú byť zavedené do GDF-8 analógu, je dôležité obsiahnuť znalosť všetkých epitópov, ktoré sú k dispozícii: 1) početnosť osôb v populácii odpovedajúcich na každý epitóp, 2) MHC reštrikčné dáta a 3) frekvencia relevantných haplotypov v populácii.

Existuje veľký počet prirodzene sa vyskytujúcich všeobecných epitópov T lymfocytu, ktoré sú aktívne u veľkej časti jedincov živočíšneho druhu alebo populácie zvierat a tie sú výhodne zavedené do vakcíny, a tým znižujú potrebu veľmi vysokého počtu odlišných analógov GDF-8 v tej istej vakcíne.

Všeobecný epitóp môže byť podľa vynálezu prirodzene sa vyskytujúci humánny epitóp T lymfocytu, ako sú napríklad epitópy tetanického toxoidu (napríklad epitópy P2 a P30) , epitóp difterického toxoidu, hemaglutinín víru chrípky (HA) a

CS antigén P. laciparum. Pri vakcinácii iných živočíchov než je človek by sa samozrejme mala venovať pozornosť tomu, aby sa používali prirodzene sa vyskytujúce epitópy T lymfocytu, ktoré sú všeobecné u skúmaného zvieraťa.

V priebehu rokov bol identifikovaný veľký počet ďalších všeobecných epitópov T lymfocytu. Boli identifikované najmä peptidy schopné viazať veľký podiel HLA-DR molekúl kódovaných odlišnými Hla-DR aleliami a všetky z nich sú možné epitópy T lymfocytu pre zavedenie do analógov GDF-8 použitých podľa predkladaného vynálezu. (Porovnaj tiež epitóp diskutované v nasledujúcich odkazoch, ktoré sú týmto všetky zahrnuté do odkazov v tomto texte: WO 98/23635 (Frazer IH et al. , pridelená University Queesland) , Southwood S et al. , 1998, J. Immunol., 160, 3363-3373, Sinigaglia F et al., 1988, Náture, 336, 778-780, Chicz RM et al., 1993, J. Exp. Med., 178, 27-47, Hammer J et al., 1993, Celí, 74, 197-203 a Falk K et al. , 1994, Immunogenetics, 39, 230-242(. Posledný odkaz sa tiež zaoberá HLA-DQ a -DP ligandami. Všetky epitópy uvedené v týchto 5 odkazoch sú relevantné ako uvažované prírodné epitópy pre použitie v predkladanom vynáleze, ako i. epitópy, ktoré sa s nimi podieľajú na spoločných motívoch.

Alternatívne epitópom môže byť každý syntetický epitóp T lymfocytu, ktorý je schopný viazať veľkú časť molekúl MHC triedy II. V tomto kontexte „panpeptidy DR epitópu (PADRE) popísané vo W095/07707 a v odpovedajúcom článku Alexander J et al. , 1994, Immunity, 1, 751-761 (obidva popisy sú zahrnuté formou odkazu v tomto texte) sú zaujímavé uvažované epitópy pre použitie podľa prekladaného vynálezu. Je nutné poznamenať, že najúčinnejšie peptidy PADRE popísané v týchto článkoch nesú D-aminokyseliny na C- a N-koncoch, aby sa zlepšila stabilita pri podávaní. Ale predkladaný vynález primárne usiluje o zavedenie relevantných, epitópov ako časti modifikovaného' GDF8, ktoré by potom následne boli rozložené enzymatický v lyzozomoch APC, aby sa umožnila následná prezentácia molekule MHC-II, a preto nie je prospešné zaviesť D-aminokyseliny do epitópov použitých v predkladanom vynáleze.

Jeden obzvlášť výhodný PADRE peptid je peptid majúci aminokyselinovú sekvenciu AKFVAAWTLKAA alebo jeho imunologický účinnú subsekvenciu. Jento a ďalšie epitópy, ktorým chýba rovnaká MHC reštrikcia, sú výhodné epitópy T lymfocytov, ktoré by mali byť prítomné v analógoch GDF-8 použitých vo vynálezcovskom spôsobe. Tieto super-všeobecné epitópy by umožnili najjednoduchšie prevedenie vynálezu, kde iba jeden jediný modifikovaný GDF-8 je predložený imunitnému systému očkovaného zvieraťa.

Ako bolo uvedené vyššie, modifikácie GDF-8 môže tiež zahrnúť zavedenie prvej skupiny, ktoré cieli modifikovaný GDF8 k APC alebo B lymfocytu. Napríklad, prvá skupina môže byť špecificky väzobný partner pre špecificky povrchový antigén B lymfocytu alebo pre špecificky povrchový antigén APC. V obore je známych veľa takých špecifických povrchových antigénov. Napríklad, skupina môže byť sacharid, pre ktorý je receptor na G lymfocyte alebo na APC (napr. manán alebo manóza). alternatívne, druhá skupina môže byť hapten. Ako prvá skupina sa môže tiež použiť protilátkový fregment, ktorý špecificky rozpoznáva povrchovú molekulu na APC alebo lymfocytoch (povrchové molekuly môžu napr. byť FCy receptor makrofágov a monocytov, ako je napríklad FcyRI alebo alternatívne každý ďalší špecifický povrchový marker, ako je napríklad CD40 alebo CTLA-4). Je nutné poznamenať, že všetky tieto príklady cieliacich molekúl môžu byť tieť oužité ako časť adjuvans, porovnaj nižšie.

ako alternatíva alebo doplnok polypeptidu k určitému bunečnému typu, zosilenej imunitnej reakcie, odpovedavosti imunitného systému druhej skupiny, ktorá stimuluje príklady takých druhých skupín tepelného šoku, a tiež ich účinnej cielenia modifikovaného GDFje možné zahrnutím aby sa zvýšiť vyššie systém.

dosiahlo imunitný sú cytokíny a časti.

stupeň uvedenej

Typické proteíny

Vhodné cytokíny pre použitie podľa vynálezu sú tie, ktoré normálne tiež pôsobia ako adjuvancia vo vakcinačnom prípravku, t.j. napríklad interferón γ (IFN-γ), Flt3L, interleukín 1 (IL1) , interleukín 1 (IL-2), interleukín 4 (IL-4), interleukín 6 (IL-6), interleukín 12 (IL-12), interleukín (IL-13), interleukín 15 (IL-15) a faktor stimulujúci kolónie granulocytov a makrofágov (GM-CSF), alternatívne, funkčná časť molekuly cytokínu môže dostačovať ako druhá skupina. Čo sa týka použitia týchto cytokínov ako adjuvancií, porovriaj i

diskusiu nižšie.

byť vhodnými proteínmi tepelného šoku skupina HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (tiež porovnaj Wearsch PA et al.

môžu

1998,

Podľa vynálezu použitými ako druhá známy ako gp96,

Biochemistry, 37, 5709-19) a CRT (kalretikulín).

Alternatívne môže napríklad listeriolycín enterotoxín. Zaujímavou derivátov, mykobakteriálnych (muramyldipeptid) a

Tiež možnosť byť druhá skupina toxín, (LLO), lipid A možnosťou je a teplene tiež celá ako je labilný rada ako napríklad

MDP diestery trehalózy TDM.a tretej skupiny, ktorá zosiluje

GDF-8 imunitnému systému, je

V obore bolo ukázaných niekoľko zavedenia prezentáciu modifikovaného dôležité prevedenie vynálezu.

TDE.

príkladov tohto princípu. Napríklad je známe, že palmitoylová lipidačná kotva v proteíne OspA Borrelia burgdorferi môže byť použitá tak, že poskytne autoadjuvačné polypeptidy (porovnaj napr. WO 96/40718). Zdá sa, že lipidované proteíny vytvárajú štruktúry podobné micelám s jadrom, ktoré tvoria lipidačné časti kotvy polypeptidov a zvyšné časti molekuly z nich vyčnievajú, čo má za následok mnohonásobnú prezentáciu antigénnych determinatov. Teda použitie tohto a príbuzných postupov s použitím rôznych lipidačných kotiev (napr. myristylové skupiny, farnesylové skupiny, geranyl-geranylové skupiny, GPI-kotvy a N-acylové skupiny diglyceridu) sú výhodné prevedenie vynálezu, obzvlášť preto, že poskytnutie tejto lipidačnéj kotvy v rekombinantne vytvorenom proteíne je úplne jasné a vyžaduje iba použitie napr. prirodzene sa vyskytujúca signálna sekvencia ako fúzneho partnera pre modifikovaný GDF-8 polypeptid. Ďalšou možnosťou je použitie C3d fragmentu faktoru komplementu C3 alebo samotného C3 (porovnaj Dempsey et al.,

1996, Science, 271, 3478-350 a Lou & Kohler, 1998, Náture

Biotechnology, 16, 458-462).

Alternatívne prevedenie vynálezu, ktoré má tiež za následok výhodnú prezentáciu mnohopočetných (napr. aspoň 2) kópií dôležitých epitópových úsekov GDF-8 imunitnému systému, je kovalentná alebo nekovalentná väzba GDF-8, jeho subsekvencia alebo variant k molekulám určitých nosičov. Môžu byť použité napríklad polyméry, napr. sacharidy, ako je napr. dextran (porovnaj napr. Lees A et al. , 1994, Vaccine, 12, 1160-1166, Lees A et al. , 1990, J. Immunol., 145, 3594-3600), ale použiteľné alternatívy sú tiež manóza a manán. Úplné membránové proteíny napr. z E. coli a ďalších baktérií sú tiež použiteľní konjugační partneri. Tradičné nosičské molekuly, ako je napríklad hemokyanín z morskej prilipky (KLH), tetanický toxoid, difterický toxoid a albumín bovinného séra (BSA) sú tiež výhodní a použiteľní partneri.

Má sa za to, že určité oblasti natívneho GDF-8 sú obzvlášť vhodné pre tvorenie modifikácií. Predpovedá sa, že modifikácia v aspoň jednej z nasledujúcich subsekvencií C-koncovej časti GDF-8 majú za následok vhodné imunogénne molekuly: ?vyšky 18.41, 49-69 alebo 79-104 v sekvencií id č. 11 alebo 12 alebo odpovedajúca subsekvencia z GDF-8 polypeptidov odlišného pôvodu, než pochádzajúceho z človeka, hovädzieho dobytka, prasiat, kuriatok alebo moriek. Dôvody pre tieto vybrané úseky sú a( konzervácia epitópov B lymfocytu, b) konzervácia sekundárnej, terciárnej a kvartérnej štruktúry ap. V každom prípade, ako je diskutované vyššie, je úplne ľahké prevádzať screening skupiny modifikovaných GDF-8 molekúl (ktoré boli všetky podrobené zavedeniu epitópu T lymfocytu v rôznych polohách) na imunitnú reaktivitu s protilátkami vypestovanými proti natívnemu GDF-8. Je obzvlášť výhodné, že modifikácia je prevádzaná substitúciou aminokyselinovej sekvencie aspoň jednou aminokyselinovou sekvenciou rovnakej alebo odlišnej dĺžky, ktorá obsahuje cudzorodý T_H epitóp. Zdôvodnenie týchto konštruktov je detailne diskutované v príkladoch. Tiež inzercia (alebo substitúcia) v ktorejkoľvek oblasti kľučiek alebo flexibilných koncov (zvyšky 1-12, 18-30, 42-51, 82-86 a 105-109) C-koncového fragmentu GDF-8 sú výhodné.

Formulácia GDF-8 a modifikovaných GDF-8 polypeptidov

I

Pri prezentácii GDF-8 polypeptidu alebo modifikovaného GDF-8 polypeptidu imunitnému systému zvieraťa jeho podávaním zvieraťu, formulácia polypeptidu sleduje princípy v obore obecne prijímané.

Príprava vakcín, ktoré obsahujú peptidové sekvencie ako účinné zložky, sa v obore obecne dobre rozumejú, ako- je doložené príkladmi z patentov Spojených štátov č. 4 608 251, 4 601 903, 4 599 231, 4 599 230, 4 596 792 a 4 578 770, všetky sú zahrnuté formou odkazu v tomto texte. Typicky sú takéto vakcíny pripravené ako injikovatelné, buď ako tekuté roztoky alebo suspenzie, môžu tiež byť pripravené pevné formy vhodné pre vytvorenie roztoku alebo . suspenzie v tekutine pred injekciou. Prípravok môže byť tiež emulgovaný. Aktívna imunogénna zložka je často zmiešaná s excipientami, ktoré sú farmaceutický prijateľné a kompatibilné s účinnou zložkou. Vhodnými excipientami sú napríklad voda,. fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol ap. a ich kombinácie. Okrem toho, ak je žiadúce, vakcína môže obsahovať menšie množstvo pomocných látok, ako sú napríklad zmáčadlá alebo emulgátory, pH pufre alebo adjuvanciá, ktoré zosilujú účinnosť vakcín, porovnaj detailnú diskusiu o adjuvanciách nižšie.

Vakcíny sú obvykle podávané parenterálne injekciou, napríklad buď subkutánne, intrakutánne, intradermálne, subdermálne alebo intrámuskulárne. Ďalšie formulácie, ktoré sú 'vhodné pre ďalšie spôsoby podávania obsahujú čipky a v niektorých prípadoch formulácie pre perorálne, bukálne, sublingválne, intraperitoneálne, intravaginálne, análne, epidurálne, spinálne a intrakraniálne podávanie. Čo sa týka čípkov, môžu obsahovať tradičné spájadlá a nosiče napríklad polyalkalenglykoly alebo triglyceridy, tiež čipky môžu byť vytvorené zo zmesí obsahujúcich účinnú zložku v rozmedzí 0,5 % až 10 %, výhodne 1 až 2 %. Perorálne formulácie obsahujú normálne používané excipienty, ako sú napríklad manit, laktóza, škrob, stearát horečnatý, sacharín sodný, celulóza, uhličitan horečnatý, ap. farmaceutického stupňa čistoty. Tieto prípravky majú formy, ako sú roztoky, suspenzie, tablety, pilulky, tobolky, formulácie alebo prášky s predĺženým uvoľňovaním a obsahujú 10 až 95 % účinnej zložky, výhodne 25 až 70 %. Čo sa týka prerorálnych formulácií, toxín cholery je zaujímavý formulačný partner (a tiež možný konjugačný partner) . ·

Polypeptidy môžu byť formulované do vakcíny ako. nutrálne formy alebo soli. Farmaceutický prijateľné soli zahrňujú kyslé adičné soli (vytvorené s voľnými aminoskupinami peptidov) a ktoré sú tvorené s anorganickými kyselinami, ako je napríklad chlorovodíková alebo fosforečná kyselina, alebo takými organickými kyselinami, ako je octová, šťaveľová, vinná, mandľová, ap. Soli vytvorené s voľnými karboxylovými skupinami môžu tiež pochádzať z anorganických báz, ako je napríklad sodík, draslík, amónium, vápnik alebo hydroxid železitý, a takých organických báz, ako je izopropylamin, trimetylamín, 2etylaminoetanol, histidín, prokain, ap.

Vakcíny sú podávané spôsobom kompatibilným s liekovou formuláciou a v takom množstve, aké je terapeuticky účinné a imunogénne. Podávané množstvo závisí na liečenom pacientovi, vrátane napr. kapacity imunitného systému jednotlivca vyvinúť imunitnú reakciu a stupňa požadovanej protekcie. Vhodné rozmedzie dávky je cca niekoľko sto mikrogramov účinnej zložky na vakcinácii s výhodným rozmedzím približne od 0,1 pg do 2000 pg (i keď vyššie množstvá v rozmedzí 1 až 10 mg sú tiež predpokladané), ako je napríklad v rozmedzí približne od 0,5 pg do 1000 pg, výhodne v rozmedzí od 1 pg do 500 pg a obzvlášť v rozmedzí približne od 10 pg do 100 pg. Vhodné režimy pre počiatočné podávanie a upominacie dávky sú tiež variabilné, ale je pre ne typické počiatočné podávanie nasledované dodatočnými inokuláciami alebo ďalším podávaním.

Spôsob aplikácie každá obvyklá metóda zahrňujú perorálnu sa môže široko odlišovať.

pre podávanie vakcíny, aplikáciu na pevnej

Je použiteľná

Tieto metódy fyziologicky prijateľnej báze alebo na fyziologicky prijateľnej disperzii parenterálne, injekciou alebo podobne. Dávka vakcíny závisí na spôsobe podávania a mení sa podľa veku očkovanej osoby a formulácii antigénu.

Niektoré polypeptidy vakcíny sú dostatočne imunogénne vo vakcíne, ale pre iné ďalšie bude imunitná reakcia zosilená, ak vakcína ďalej obsahuje adjuvans.

Sú známe rôzne metódy, ako pre vakcínu dosiahnuť adjuvatný účinok. Obecné princípy a metódy sú detailne uvedené v The Theory adn Practical Application of Adjuvants, 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (vyd), John Wiley & Sons Ltd., ISBN 0-47195170-6, a tiež vo Vaccines: New Generation Imunological Adjuvants, 1995, Gregoriadis g et al. , (vyd.), Plénum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, obidve publikácie sú týmto zahrnuté formou odkazu v tomto texte.

Je obzvlášť výhodné použiť adjuvans, u ktorého 'môže byť preukázané, že uľahčuje únik autotolerancií k autoantigénom, to je v skutočnosti esenciále v prípadoch, keď je použitý ako účinná zložka autovakcíny nemodifikovanej GDF-8. Neobmedzujúce príklady vhodných adjuvancií sú vybrané zo skupiny, ktorú tvorí imunitné cieliaci adjuvans, imunitné modulujúci adjuvans, ako je napríklad toxín, cytokín a mykobakteriálny derivát, olejový prípravok, polymér, adjuvans tvoriaci micely, saponín, imunostimulačný komplexný matrix (ISCOM matrix), častice, DDA, hlinitá adjuvancia, DNA adjuvancia, γ-inulín a opúzdrovací adjuvans. Obecne je nutné poznamenať, že vyššie uvedené popisy, ktoré sa týkajú zlúčenín a prípravkov použiteľných ako prvá, druhá a tretia skupina v analógoch, sa tiež týkajú mutatis mutandis ich použitia v adjuvans vakcíny podľa vynálezu.

Aplikácia adjuvancií zahrňuje použitie činidiel, ako je napríklad hydroxid alebo fosfát hlinitý (alum), obecne používaných ako 0,05 až 0,1 percentný roztok v prufrovanom fyziologickom roztoku, zmes sa syntetickými polymérmi sacharidov (napríklad Carbopol®) používanú ako 0,25 percentný roztok, agregácia proteínu vo vakcíne zahrievaním pri teplotách v rozmedzí od 70° C do 101° C po dobu 30 sekúnd až 2 minút, v danom poradí, a je tiež možná agregácia prostredníctvom skrížené viazacích činidiel. Môže tiež byť použitá agregácia reaktivácie s pepsínom ošetrenými protilátkami (Fab fragmenty) k albumínu, zmesí bakteriálnych buniek, ako je napríklad C. parvum alebo endotoxíny alebo lipopolysacharidovými zložkami gramnegatívnych baktérií, emulzií vo fyziologicky prijateľnom oleji vehikula, ako je napríklad mono-oleátmanitu (Aracel A) alebo emulzia s 20 percentným roztokom perfluorovaných uhľovodíkov (Fluosol-DA) použitým ako bloková substitúcia. Je tiež výhodná zmes s olejmi, ako je napríklad skvalen a IFA.

Podľa vynálezu DDA (dimetyldioktadecylamoniumbrómid) je zaujímavý kandidát adjuvans, ako je DNA a y-inulín, ale tiež Freundovo kompletné a nekompletné adjuvans, a tiež saponíny z quillaja, ako je napríklad QuilA a QS21, sú zaujímavé, ako je tiež RIBI. Ďalšie možnosti sú monofosforyllipid A (MPL), vyššie uvedené C3 a C3d a muramyldipeptid (MDP).

Je tiež známe, že lipozómové formulácie môžu prepožičať adjuvantné účinky, a teda podľa vynálezu sú výhodné lipozómové adjuvanciá.

Tieť adjuvanciá typu imunostimulačný komplexný matrix (ISCOM® matrix) sú výhodným výberom podľa vynálezu,. obzvlášť pretože bolo ukázané, že tento typ adjuvans je schopný upsa skladá z expresie APC (voliteľne

MHC triedy II. Matrix ISCOM® (triterpenoidov) fosfolipidu. Keď časticová formulácia je

Quillaja primiešaný je až.

f rakc ionovaných) saponaria, imunogénny to, čo je známe ako %

saponínov cholesterolu a proteín, výsledná

ISCOM častica, kde (hmotnostnýc) , cholesterol a (hmotnostných) a proteín 10 až 15 % týkajúce sa prípravku a saponín tvorí 60 fosfolipid 10 až 15 % (Hmotnostných). Detaily imunostimulačných komplexov môžu byť zistené napr. uvedených príručkách zaoberajúcich sa adjuvanciou, použitia vo vyššie ale tiež práci Morein B et al. , 1995, Clin. Immunother., 3 461-475, a tiež Barr IG . a Michell GF, 1996, Immunol. and Celí Biol. , 74, 8-25 (obidva zahrnuté formou odkazu v tomto texte) poskytujú použiteľné inštrukcie pre prípravu kompletných imunostimulačných komplexov.

Ďalšia vysoko zaujímavá (a teda výhodná) možnosť dosiahnutia adjuvatného účinku je použitie techniky popísanej v práci Gosselin et al., 1992 (ktorá je týmto zahrnutá formou odkazu v tomto texte). Stručne, prezentácia relevantného antigénu, ako je napríklad antigén podľa predkladaného vynálezu, môže byť zosilená konjugaciou antigénu k protilátkam (alebo protilátkovým fragmentom viazacích antigén) proti Fcy receptorom na monocytoch/makrofázách. Bolo dokázané, že najmä konjugáty medzi antigénom a anti-FcyRI zosilujú imunogeničnosť pre účely očkovania.

Ďalšie možnosti sa týkajú použitia cieliacich a imunomodulačných látok (i.a. cytokínov) uvedených vyššie ako uvažovaných látok pre prvé a druhé skupiny v modifikovaných verziách GDF-8. V tomto spojení sú možnosti tiež syntetické induktory cytokínov, ako sú poly I:C.

Vhodné mykobakteriálne deriváty sú vybrané zo skupiny, ktorú tvorí muramyldipeptid, kompletné Fréundové adjuvans, RIBI a diestér trehalózy, ako napríklad TDM a TDE.

Vhodné imunitné cieliace adjuvancie sú vybrané zo skupiny, ktorú tvorí CD4 0 ligand a CD40 protilátky alebo jej špecifické väzobné fragmenty (porovnaj diskusiu vyššie), manóza, Fab fragment a CTLA-4.

Vhodné polymérové adjuvancie sú vybrané zo skupiny, ktorú tvorí sacharid, ako je napríklad dextrán, PEG, škrob, manán a manóza, plastický polymér ako taký a latex ako sú napríklad latexové perličky.

Ešte ďalší zaujímavý spôsob modulácie imunitnej reakcie je zahrnutie GDF-8 imunogénu (voliteľne dohromady s adjuvanciou a farmaceutický prijateľnými nosičmi a vehikulmi) do virtuálne lymfatickej uzliny (VLN) (patentové liečebné zariadenie vyvinuté firmou ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tenké tubulárne zariadenie) napodobuje štruktúru a funkciu lymfatickej uzliny. Vloženie VLN do kože vytvorí miesto sterilného zápalu s náhlym vzostupom koncentrácie cytokínov a chemokínov. T a B lymfocyty, ako i APC rýchle odpovedajú na signalizáciu nebezpečia, mieria do zápalového miesta a akumulujú sa v poréznej matrix VLN. Bolo ukázané, že dávka antigénu nutná pre vyvolanie imunitnej reakcie na antigén je redukovaná pri použití VLN a že imunitná protekcia získaná vakcináciou s použitím VLN predčí obvyklú imunizáciu s použitím Ribi ako ajduvans. Technológia je i.a. stručne popísaná v práci Gelber C et al., 1998, Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node, v: From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, 12.-15. október 1998, Seascape Resort, Aptos, California.

Očakáva sa, že vakcína by bola podávaná aspoň raz, ako je napríklad aspo'l, 2, 3, 4, 5, 6, a 12 krát ročne. Konkrétnejšie sa očakáva podávanie jedincovi, ktorý to potrebuje, 1 až 12 krát ročne, už skôr bolo ukázané, že pamäťová imunita indukovaná použitím výhodných autovakcín podlá vynálezu nie je permanentná, a preto imunitný systém potrebuje byť periodicky podnecovaný analógmi.

Vďaka genetickým odchýlkam môžu rôzny jedinci reagovať imunitnými reakciami rozdielnej sily na rovnaký polypeptid. Teda vakcína podlá vynálezu môže obsahovať niekoľko odlišných polypeptidov, aby sa zvýšila imunitná reakcia, porovnaj tiež diskusiu vyššie týkajúcu sa výberu cudzorodého epitópu T lymfocytu pre zavedenie. Vakcína môže obsahovať dva alebo viacej polypeptidov, pričom všetky polypeptidy sú, ako je definované vyššie.

Vakcína môže ďalej obsahovať 3 až 20 odlišných modifikovaných alebo nemodifikovaných polypeptidov, ako je napríklad 3 až 10 odlišných polypeptidov. Ale normálne hľadaný počet polypeptidov bude udržovaný na minime, ako je napríklad 1 alebo 2 polypeptidy.

Očkovanie nukleovou kyselinou

Ako alternatíva kuj klasickému podávaniu vakcíny založenej na peptidu ponúka technológie vakcinácie nukleovou kyselinou (tiež známa ako imuzácia nukleovou kyselinou, genetická .imunizácia a génová imunizácia) veľký počet príťažlivých vlastností.

Za prvé, na rozdiel od postupu s tradičnou vakcínou, vakcinácia nukleovou kyselinou nevyžaduje zdroje spotrebovávajúce produkciu imonegénneho agens vo velkom meradle (napr. vo forme priemyselnej fermentácie mikroorganizmov produkujúcich modifikovaný GDF-8). Okrem toho nie je potrebná prístrojová purifikácia a schmémy skladania imunogénu. A nakoniec, pretože vakcinácia nukleovou kyselinou spolieha na biochemmický aparát očkovaného jedinca pre vytváranie expresného produktu zavedenej nukleovej kyseliny, očakáva sa, že nastane optimálne posttranslačné spracovanie expresného produktu, čo je v prípade autovakcinácie obzvlášť dôležité, pretože, ako bolo uvedené vyššie, môže byť zachovaná významná frakcia pôvodných GDF-8 epitópov B lymfocytu v modifikovanej molekule, a pretože epitópy B lymfocytu v princípe môžu byť tvorené časťou ktorejkoľvek (bio)molekuly (napr. sacharid, lipid, proteín, ap.). Tým tedy, natívna gykosylácia a typy lipidá'cie imunogénu môžu byť veľmi dobre dôležité pre celkovú imunogeničnosť, a očakáva sa, že je to zistené tým, že imunogén je produkovaný hostiteľom.

Preto výhodné prevedenie vynálezu obsahuje prezentáciu modifikovaného GDF-8 imunitnému systému zavedením nukleovej kyseliny (kyselín) kódujúcej modifikovaný GDF-8 do buniek zvieraťa, a tým získanie in vivo expresie zavedenej nukleovej kyseliny (kyselín) bunkami.

V tomto prevedení je zavedená nukleová kyselina výhodne DNA, ktorá môže byť vo forme nahej DNA, DNA formulované s nabitými alebo nenabitými lipidmi, DNA formulované v lipozómoch, DNA obsiahnuté vo vírovom vektore, DNA formulované s proteínom alebo polypeptidom uľahčujúcim transfekciu, DNA formulované s cieliacim proteínom alebo polypeptidom, DNA formulované s vápnikovými precipitačnými činidlami, DNA kondenzované k molekule inertného nosiča a DNA formulované s adjuvans. V tomto kontexte je nutné poznamenať, že prakticky všetky dôvody týkajúce sa použitia adjuvancií v tradičnej vakcinačnej formulácii je možné aplikovať pre formulácie DNA vakcín. Preto teda všetky popisy v tomto texte, ktoré sa týkajú použitia adjuvancií v kontexte vakcín založených na polypeptidoch je možné aplikovať mutatis mutandis na ich použití v technológii vakcinácie nukleovou kyselinou.

Čo sa týka spôsobu podávania a aplikačných schém vakcín založených na polypeptidoch, ktoré boli detailne popísané vyššie, sú tiež použiteľné pre vakcíny s nukleovou kyselinou podľa vynálezu a všetkých diskusii uvedených vyššie týkajúcich sa spôsobov podávania a aplikačných schém pre polypeptidy je možné aplikovať mutatis mutandis na nukleové kyseliny. Malo by byť pridané, že vakcíny s nukleovou kyselinou môžu byť vhodne podávané intravenózne a intraarteriálne. Okrem toho je v obore známe, že vakcíny ' s nukleovou kýselinou môžu byť podávané s použitím takzvanej „génovej pištole (biobalistické metódy), a tak teda tiež tento a ekvivalentné spôsoby podávania sú považované za časť predkladaného vynálezu. Konečne bolo tiež publikované použitie VLN pre podávanie nukleových kyslín za vzniku dobrých výsledkov, a preto je tento konkrétny spôsob podávania najmä výhodný.

Okrem toho nukleová kyselina (kyseliny) použitá ako imunizačný agens môže obsahovať úseky kódujúce prvú, druhú a/lebo tretiu skupinu, napr. vo vorme imunomodulačné látky popísané vyššie, ako sú napríklad cytokíny diskutované ako použiteľná adjuvancia. Výhodná verzia tohto prevedenia zahrňuje kódujúci úsek analogu a kódujúci úsek imunomodulátora v odlišných čítacích rámcoch alebo aspoň pod kontrolou rôznych promotórov. Tým sa zabráni tomu, že analóg alebo epitóp je vytvorený ako fúzny partner k imunomodulátoru. Alternatívne, môžu byť použité dva rozdielne nukleotidové fragmenty, ale to je menej výhodne oproti výhode zaistenej kbexpresie, keď sú obidva kódujúce úseky zahrnuté v tej istej molekule.

V súlade s tým, sa vynález tiež týka prípravku pre indukciu produkcieprotilátok proti GDF-8. Prípravok obsahuje fragment nukleovej kyseliny alebo vektor podľa vynálezu (porovnaj diskusiu o vektoroch nižšie) a farmaceutický a imunologický prijateľné vehikulum a/lebo nosič a/lebo adjuvans, ako bolo diskutované vyššie.

Za normálnych okolností je nukleová kyselina kódujúca GDF

-8 variantu zavedená vo forme vektoru, pričom expresia je pod kontrolou vírového promotóru. Pre detailnejšiu diskusiu o vektoroch a DNÄ fragmentoch podľa vynálezu porovnaj diskusiu nižšie. Sú tiež k dispozícii detailné popisy týkajúce sa formulácie a použitia vakcín s nukleovou kyselinou (porovnaj Donelly JJ et al. , 1997, Annu. Rev. Immunol. , 15, 617-648 a Donelly JJ et al.,1997, Life Sciences, 60, 163-172. Obidva tieto odkazy sú zahrnuté formou odkazu v tomto texte).

Živé vakcíny

Tretia alternatíva pre prezentáciu modifikovaného GDF-8 imunitnému systému je použitie technológie živej vakcíny. Pri živom očkovaní je prezentácia imunitnému systému prevádzaná podávaním zvieraťu nepatogénnych mikroorganizmov, ktoré boli transformované fragmentom nukleovej kyseliny. kódujúcim modifikovaný GDF-8 alebo vektorom zavádzajúcim tento fragment nukleovej kyseliny. Nepatogénny mikroorganizmus môže byť ktorýkoľvek vhodný oslabený bakteriálny kmeň (oslabený pasážou alebo odstránením patogénnych expresných produktov technológií rekombinatnej DNA), napr. Mycobakterium bovis BCG, nepatogénny Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, ap. Prehľady týkajúce sa prípravy živých vakcín podľa súčasného stavu techniky je možné nájsť napr. v publikáciách Saliou P., 1995, Rev. Prat., 45, 1492-1496 a Walker PD, 1992, Vaccine, 10, 977-990, obidva zahrnuté formou odkazu v tomto texte). Pre detaily o fragmentoch nukleovej kyseliny a vektoroch použitých v týchto živých vakcínach porovnaj diskusiu nižšie.

Ako alternatíva živých bakteriálnych vakcín, fragment nukleovej kyseliny podľa vynálezu diskutovaný nižšie môže byť zavedený do nevirulentného vírového vakcinačného vektoru, ako je napríklad kmeň vakcíny alebo ktorýkoľvek ďalší vhodný vírus kiahní, ktorý infekčný u očkovaného zvieraťa.

Normálne je nepatogénny mikroorganizmus alebo vírus podávaný zvieraťu iba raz, ale v určitých prípadoch môže byť nutné podávať v priebehu života mikroorganizmus viacej než rad, aby bola udržovaná protektívna imunita. Dokonca sa predpokladá, že imunizačné schémy, ako sú tie uvedené detailne vyššie pre vakcináciu polypeptidom, budú použiteľné pri použití živej alebo vírovej vakcíny.

Alternatívne, živá alebo vírová vakcinácia je spojená s predchádzajúcou a/lebo nukleovou alebo následnou vakcináciou polypeptidom kyselinou. Napríklad je možné prevádzať primárnu imunizáciu živou alebo vírovou vakcínou, po ktorej nasleduje posilňovacia imunizácia s použitím postupu s plypeptidom alebo nukleovou kyselinou.

Mikroorganizmus alebo vírus môže byť transformovaný nukleovou kyselinou(kyselinami) obsahujúci úseky kódujúce prvú, druhú a/lebo tretiu skupinu, napr. vo forme imunomodulačnej látky popísanej vyššie, ako sú napríklad cytokíny diskutované ako použiteľná adjuvancia. Výhodná verzia tohto prevedenia zahrňuje kódujúci úsek analógu a kódujúci úsek imunomodulátoru v odlišných čítacích rámcoch alebo aspoň pod kontrolou rôznych promotórov. Týmto sa zabráni tomu, že analóg alebo epitópy sú vytvorené ako fúzni partneri k imunomoldulátoru. Alternatívne, môžu byť použité dva rozdielne nukleotidové fragmenty ako transformačné prípravky. Samozrejme, keď je prvá a/lebo druhá a/lebo tretia skupina v rovnakom čítacom rámci, môžu poskytnúť expresný produkt, analóg podľa vynálezu, a takéto prevedenie je obzvlášť výhodné podľa predkladaného vynálezu.

Použitie vynálezu pri produkcii mäsa a pri liečení chorôb

Ako je zrejmé z diskusií uvedených vyššie, poskytnutie spôsobu podľa vynálezu down-regulácie GDF-8 aktivity umožňuje stimuláciu rastu kostrovej svaloviny u zvierat.

Dôležité prevedenie vynálezu pre down-reguláciu GDF-8 aktivity zahrňuje teda nárast kostrovej svaloviny zvieraťa, tento spôsob obsahuje down-reguláciu GDF-8 aktivity podľa spôsobu podľa vynálezu do takého stupňa, že svalovina je štatisticky významne zvýšená (na hladine významnosti 95 %) aspoň o 5 % v porovnaní s kontrolnými zvieratami prejavujúcimi normálnu GDF-8 aktivitu.

Nárast svaloviny môže byť výhodne vyšší, ako je napríklad aspoň 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 alebo dokonca 45 %, porovnaj nárast svaloviny, ktorý bol pozorovaný u transgénnych myší a prirodzene sa vyskytujúcich GDF-8 deficitných zvierat.

Svalovina môže byť zaisťovaná každým vhodηým spôsobom v obore známom pre stanovenie celkovej a/lebo relatívnej svaloviny.

Vakcína anti-GDF-8 môže byť potencionálne tiež použiteľná pre liečenie určitých humánnych ochorení, ako sú napríklad karcinómy, kachexie, keď je svalová atrofia výrazným javom a je tiež prevoditeľný prostriedok liečenia/zmiernenia ďalších atrofických svalových ochorení. Nedávne publikácie tiež svedčia pre to, že supresia GDF-8 by mohla byť prospešná u pacientov trpiacich akútnym a chronickým srdečným zlyhaním.

Peptidy, polypeptidy a prípravky podlá vynálezu

Ako je zjavné z vyššie uvedeného, predkladaný vynález je zlaožený na myšlienke imunizácie jedincov proti GDF-8 antigénu, aby sa dosiahlo zrýchlenie rastu svalovej hmoty. Výhodný spôsob, ako dosiahnuť tejto imunizácie, je použitie modifikovaných verzií GDF-8, a takto poskytnúť molekuly, ktoré doposial neboli v obore popísané.

Má sa za to,že modifikované GDF-8 molekuly diskutované v tomto texte sú hlavným predmetom vynálezu, a teda dôležitá časť vynálezu sa týka GDF-8 analógu, ktorý pochádza zo zvieracieho GDF_8, pričom je zavedená modifikácia, ktorá má za následok to, že imunizácia zvieraťa analógom indukuje produkciu protilátok skrížené reagujúcich s nemodifikovaným GDF-8 polypeptidom. Výhodne je povaha modifikácie prispôsobená typom midifikácií popísaných vyššie pri diskusii o rôznych prevedeniach spôsobu podľa vynálezu pri použití modifikovaného

GDF-8. Preto každý popis predložený v tomto texte týkajúci sa modifikovanej GDF-8 molekuly je relevantný pre účel popísaní analógov GDF-8 podlá vynálezu a každý taký popis je možné aplikovať mutatis mutandis pre popis analógov.

Je nutné poznamenať, že výhodné modifikované GDF-8 molekuly obsahujú modifikácie, ktoré majú za následok polypeptid majúci sekvencie identické aspoň zo 70 % s GDF-8 alebo s jeho subsekvenciou dlhou aspoň 10 aminokyselín. Sú výhodné sekvencie viacej identické, napr. aspoň zo 75 % alebo dokonca aspoň z 80 % alebo z 85 %. Identita sekvencií pre proteíny a nukleové kyseliny môže byť vypočítaná ako (N_ref Ndíf) □ 100/ N_reíl kde N<uf je celkový počet neidentických zvyškov vo dvoch sekvenciách pri porovnaní a kde N_ref je počet zvyškov v jednej sekvencií. Preto DNA sekvencie AGTCAGTC má sekvenciu identickú zo 75 % so sekvenciou AATCAATC (N_dif = 2 a Nref = 8) .

Vynález sa tiež týka prípravkov použiteľných pri prevádzaní spôsobu podľa vynálezu. Preto sa vynález tiež týka imunogénneho prípravku obsahujúceho imunogénne účinne množstvo GDF-8 polypeptidu, ktorý je autoproteín pre zviera, uvedený GDF-8 polypeptid je formulovaný spoločne s imunologický prijateľným adjuvans tak, aby sa dosiahlo úniku autotolerancie zvieraťa na GDF-8 polypeptid, prípravok ďalej obsahuje farmaceutický aimunologicky prijateľné vehikulum a/lebo nosič. Inými slovami, táto časť vynálezu sa týka formulácie prirodzene sa vyskytujúcich GDF-8 polypeptidov, ktoré boli popísané v spojení s prevedeniami spôsobu podľa vynálezu.

Vynález sa tiež týka imunogénneho prípravku obsahujúceho imunologický účinne množstvo GDF-8 vyššie, uvedený prípravok ďalej a imunologický prijateľné riedidlo nosič a/lebo excipient a voliteľne táto časť vynálezu sa týka formulácie modifikovaného GDF-8 analógu obsahuj úci a/lebo .definovaného farmaceutický vehikulom a/lebo adjuvans. Inými slovami, v podstate tak, ako bolo popísané v tomto texte vyššie. Výber adjuvancii, nosičov a vehikúl je v súlade s tým, čo bolo diskutované vyššie pri odkazoch na formulácie modifikovaného a nemodifikovaného GDF-8 pre použitie pri down-regulácii GDF8.

Polypeptidy sú pripravené podľa metód v obore známych. Dlhšie polypeptidy sú normálne pripravované pomocou rekombinantnej génovej technológie vrátane zavedenia sekvencie nukleovej kyseliny kódujúci GDF-8 analóg do vhodného vektoru, transformácie vhodnej hostiteľskej bunky vektorom, expresie sekvencie nukleovej kyseliny, opätovného získania expresného produktu z hostiteľských buniek alebo ich tkanivového supernatantu a následnej purifikácie a voliteľnej ďalšej modifikácie, napr. opätovného skladania alebo derivatizácie.

Kratšie peptidy sú výhodne pripravené pomocou známych techník syntézy peptidu na pevnej alebo tekutej fáze. Ale nedávne pokroky tejto technológie poskytli možnosť produkcie kompletných polypeptidov a proteínov týmito prostriedkami, a teda je tiež v rozsahu predkladaného vynálezu pripraviť dlhé konštrukty syntetickými prostriedkami.

Fragmenty nukleovej kyseliny a vektory podľa vynálezu

Z vyššie uvedeného popisu sa uznáva, že modifikované GDF-8 polypeptidy môžu byť pripravené prostriedkami' .rekombinantnej génovej technológie, ale tiež prostriedkami chemickej syntézy alebo semisyntézy, tieto dve druhé uvedené možnosti sú obzvlášť relevantné, keď modifikácia spočíva v kondenzácii k proteínovým nosičom (ako je napríklad KLH, difterický toxoid, tetanický toxoid a BSA) a neproteínovým molekulám, ako sú napríklad sacharidové polyméry a samozrejme tiež, keď modifikácia zahrňuje adíciu postranných reťazcov alebo postranných skupín k peptidovému reťazci pochádzajúcemu z GDF8 polypeptidu.

Pre účely rekombinantnej génovej technológie, a samozrejme tiež pre účely imunizácie nukleovou kyselinou, sú fragmenty nukleovej kyseliny kódujúci modifikovaný GDF-8 dôležité chemické produkty. Preto sa dôležitá časť vynálezu týka fragmentu nukleovej kyseliny, ktorý kóduje GDF-8 analóg, t.j. polypeptid pochádzajúci z GDF-8, ktorý obsahuje buď prírodnú GDF-8 sekvenciu, ku ktorej bol pridaný alebo vložený fúzny partner alebo výhodne polypeptid pochádzajúci z GDF-8, do ktorého bol zavedený cudzorodý epitóp T lymfocytu inzerciou a/lebo adíciou, výhodne substitúciou a/lebo deléciou. Fragmenty nukleovej kyseliny podľa vynálezu sú buď DNA alebo RNA fragmenty.

Fragmenty nukleovej kyseliny podľa vynálezu sú normálne vložené do vhodných vektorov za vzniku klonovacích alebo expresných vektorov nesúcich fragmenty nukleové kyseliny podľa vynálezu, tieto nové vektory sú tiež časťou vynálezu. Detaily týkajúce sa konštrukcie týchto vektorov podľa vynálezu budú diskutované v kontexte transformovaných buniek a mikroorganizmov nižšie. Vektory môžu byť, v závislosti, na účelu a typu aplikácie, vo forme plazmidov, fagov, kosmidov, minichromozómov. alebo vírov, ale tiež ' nahá DNA, ktorá je exprimovaná iba prechodne v určitých bunkách, je dôležitý vektor. Výhodné klonovacie a expresné vektory podľa vynálezu sú schopné autonómnej replikácie, a tým umožni vysoké počty kópií pre účely vysokého stupňa éxpresie alebo vysokého stupňa replikácie pre následne klonovanie.

Obecný profil vektoru podľa vynálezu obsahuje nasledujúce charakteristické rysy v smere 5Π- 30 a v operatívnej väzbe:

promotór pre riadenie expresie fragmentu nukleovej kyseliny podľa vynálezu, voliteľne kódujúci vedúci peptid extracelulárneho priestoru sekvencie nukleovej kyseliny umožňujúci sekréciu (do alebo, kde použiteľné, do periplazmy) alebo integráciu polypeptidového fragmentu do membrány, fragment nukleovej kyseliny podľa vynálezu a voliteľne sekvencie nukleovej kyseliny kódujúci terminátor. Pri zachádzaní s expresnými vektormi v producentských kmeňoch alebo bunečných líniách je pre účely genetickej stability transformovanej bunky výhodne, keď je vektor po zavedení do hostiteľskej bunky integrovaný do genómu hostiteľskej bunky. Na rozdiel od toho pri zachádzaní s vektormi, ktoré budú použité pre prevádzanie in vivo expresie vo zvierati (t.j. pri použití vektoru pre DNA očkovanie) je z bezpečnostných dôvodov výhodné, keď hostiteľskej neintegrujúce známy.

vektor bunky, vírové nie je typicky vektory, schopný integrácie sú použité nahé ktorých výber je do genómu

DNA alebo odborníkovi podľa buniek,

Vektory hostiteľských polypeptid podľa vynálezu, sú tiež sú použité pre transformáciu tvorili modifikovaný bunečné kyseliny rekombinantnú vynálezu aby

Tieto transformované bunky, môžu byť pestované bunky fragmentov nukleovej alebo použité pre

GDF-8 polypeptidov časťou vynálezu, línie použité pre propagáciu a vektorov podľa vynálezu produkciu modifikovaných

GDF-8 ktoré alebo podľa vynálezum. Alternatívne transformované bunky môžu byt vhodné kmene pre živú vakcínu, kam fragmenty nukleovej kyseliny (jedna jediná alebo mnohopočetné kópie( boli vložené tak, aby sa previedla sekrécia alebo integrácia do bakteriálnej membrány alebo bunečnej steny modifikovaného GDF8. „

Výhodne transformované bunky podľa vynálezu sú mikroorganizmy, ako sú napr. baktérie (ako je napr. druhu Escherichia [napr. E.coli] , Bacillus [napr. Bacullus subtilis], Salmonella alebo Bycobakterie [výhodne nepatogénna, napr. M. bovis BCG] ) , kvasinky (ako je napr. Saccharomyces cerevisiae) a protozoa. Alternatívne pochádzajú z mnohobunečných organizmov, hmyzie bunky, rastlinné bunky alebo ukázané, že nedávne výsledky sú sľubné, čo sa týka použitia transformované ako sú napríklad cicavčie bunky.

bunky huby,

Bolo komerčne dostupnej bunečnej línie Drosophila melanogaster (Schneider 2 (S₂) bunečná línia a vektorový systém k dispozícii od firmy Invitrogen) pre rekombinantnú produkciu analógov GDF8 podlá vynálezu, a teda tento expresný systém je obzvlášť výhodný tiež pre účely predkladaného vynálezu.

Pre účely klonovania a/lebo optimalizované expresie je výhodné, že transformovaná bunka je schopná replikácie fragmentu nukleovej kyseliny podľa vynálezu. Bunky exprimujúce nukleový fragment sú výhodné použiteľné prevedenia vynálezu, môžu byť použité pre prípravu modifikovaného GDF-8 v malom alebo väčšom meradle alebo, v prípade nepatogénnych baktérií, ako súčasťou vakcíny v živej vakcíne.

Pri produkcii modifikovaného GDF-8 podľa vynálezu pomocou transformovaných buniek je pohodlné, i keď to nie je nutné, keď je buď expresný produkt exportovaný do kultivačného média alebo nesený na povrch transformovanej bunky.

Keď bola identifikovaná účinná producentská bunka, je výhodné na jej základe založiť stabilnú bunečnú líniu, ktorá nesie vektor podľa vynálezu a ktorá exprimuje fragment nukleovej kyseliny kódujúci modifikovaný GDF-8. Výhodne, táto stabilná bunečná línia sekrétuje alebo nesie GDF-8 analóg podľa vynálezu, a tým uľahčuje jeho purifikáciu.

Obecne, plazmidové vektory obsahujúce replikon a kontrolnú sekréciu, ktoré pochádzajú z živočíšnych druhov kompatibilných, s hostiteľskou bunkou, sú použité v spojení s'hostiteľmi.

Vektor obyčajne nesie miesto replikácie, a tiež markerové sekvencie, ktoré sú schopné poskytnúť fenotypovú selekciu v transformovaných bunkách, použitím transformovaná s

Napríklad E. coli je typicky pochádzaj úceho pBR322, plazmidu z druhu E. coli

Bolivar et al.

(viď napr.

gény pre rezistenciu

1977). Plazmid na ampicilín pBR322 obsahuje a tetracyklín, a identifikáciu transformovaných buniek. Plazmid pBR alebo tak teda poskytuje ľahký prostriedok pre iný mikrobiálny plazmid alebo fág tiež musí obsahovať alebo byť modifikovaný tak, aby obsahoval promotóry, ktoré môžu byť použité prokaryotickým mirkoorganizrnom pre expresiu.

Promotóry najčastejšie používané v prokaryotických rekombinantných DNA konštruktoch obsahujú B laktamázu (penicilinázu) a laktózové promotorové systémy (Chang et al.,

1978, Itakura et al. , 1977, Goeddel et al. , 1979) a tryptofanový (trp) promotorový systém (Goeddel et al., 1979, EP-A-0 036 776) . I keď tieto sú najčastejšie používané, boli objavené a používané ďalšie mikrobiálne promotóry a boli publikované detaily týkajúce sa ich nukleotidovej sekvencie, čo umožňuje skúseným odborníkom ligovať je funkčne s plazmidovými vektormi (Siebwenlist et al., 1980). Určité gény z prokaryótov môžu byť exprimované účinne v E. coli z ich vlastných promótorových sekvencií, čo vylučuje potrebu pridávania ďalšieho promotóru umelými prostriedkami.

Okrem prokaryótov môžu byť tiež použité eukaryotické mikróby, ako sú napríklad kvasinkové kultúry a tu by mal byť promotór schopný riadenia expresie. Najčastejšie používaný eukaryotický mikroorganizmus je Saccharomyces cerevisiase alebo bežné pekárske droždie, aj keď je obecne k dispozícii velký počet ďalších kmeňov. Pre expresiu v Saccharomyces je obecne používaný napríklad plazmid Yrp7 (Stinchcomb et al. ,

1979, Kingsman et al. , 1979, Tschemper et al. , 198. Tento plazmid už obsahuje trpí gén, ktorý poskytuje selekčný marker pre mutantný kmeň kvasiniek, ktorý nemá schopnosť rastu v tryptofane, napríklad kmeň ATCC č. 44076 alebo PEP4-1 (Jones, 1977). Prítomnosť trpí lézie ako charakteristiky kvasinkového genómu hostitelskej bunky potom poskytuje účinné prostredie pre detekciu transformácie rastom v neprítomnosti tryptofane.

Vhodné promotorové sekvencie v kvasinkových vektoroch obsahujú promotóry pre 3-fosfoglycerátkinázu (Hitzman et al. ,

1980) alebo ďalšie glykolytické enzýmy (Hess et al. , 1968, Holland et al. , 1978), ako je napríklad enoláza, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, hexokináza, pyruvátdekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukóza-6-fosfátizomeráza,

3-fosfoglycerátmutáza, pyruvátkináza, triosefosfátizomeráza, fosfoglukózoizomeráza a glukokináza. Pri konštrukcii vhodných expresných plazmidov sú terminačné sekvencie spojené s týmito génmi tiež ligované do expresného vektora v smere 3Q od sekvencie, ktorú je žiaduce exprimovať, aby bola zaistená polyadenylácia mRNA a terminácia.

Iné promotóry, ktoré majú ďalšiu výhodu transkripcie riadenej rastovými podmienkami, sú úsek promotóru pre alkoholdehydrogenázu 2, izocytochróm C, kyslú fosfatázu, degradačné enzýmy spojené s dusíkovým metabolizmom a vyššie uvedená glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza a enzýmy zodpovedné pre využitie maltózy a galaktózy. Je vhodný každý plazmidový vektor obsahujúci promotór kompatibilnej s kvasinkami, počiatok replikácie a terminačnej sekvencie.

Okrem príjemcovia organi zmov.

kultúra, či mikroorganizmov kultúry buniek princípe je už môžu byť tiež pochádzajúcich z mnoho bunečných použité ako bezstavcového spracovatelná z tkaninovej živočícha. Ale každá taká bunečná stavovcov kultúra)

Culture, kultúry najväčší stavovcov od stavovca alebo záujem je o bunky v kultúre (tkanivová a propagácia buniek sa „v súčasnosti stala rutinným , postupom, (Tissue 1973). Príklady týchto použiteľných hostiteľských línie línií sú bunky bunečných z vaječníkov čínskeho škrečka

293, Drophilla melanogaster (komerčne dostupné ako kompletné expresné

VERO a HeLa, (CHO) a bunky a Spodoptera bunečné

W138, BHK, frugiperda systéme od

COS-7 (SF) i .a.

firmy Protein Sciences, 1000 Reseach Parkway, Meriden, CT

06450, U.S.A. A od firmy Invitrogen) a bunečné línie MDCK.

V predkladanom vynáleze sú obzvlášť výhodné bunečné línie S₂ a SF₂i k dispozícii od firmy Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Holandsko.

Expresné vektory pre tieto bunky obyčajne obsahujú (ak je to nutné) počiatok replikácie, promotór lokalizovaný pred exprimovaným génom, spolu s ktorýmkoľvek nevyhnutným ribozomálnym väzobným miestom, miestami zostrihu RNA, polyadenylačným miestom a sekvenciou terminátora transkripcie.

Pre použitie v cicavčích bunkách sú kontrolné funkcie expresných vektorov často poskytnuté vírovým materiálom. Napríklad obecne používané promotóry pochádzajú z polyoma, adenovirus 2 a najčastejšie z opičieho víru 40 (SV40) . Ranné a neskoršie promotóry SV40 víru sú obzvlášť užitočné, pretože obidva je možné ľahko získať z víru ako fragment, ktorý tiež obsahuje počiatok replikácie SV40 víru (Fiers et al., 1978). Môžu byť tiež použité menšie alebo väčšie SV40 fragmenty pri predpoklade, že je zahrnutá sekvencia o veľkosti približne 250 bp šíriaca sa z miesta Hindlll k miestu BglI lokalizovanému vo vírovom počiatku replikácie. Ďalej je tiež možné a často žiadúce, použiť promotorové alebo kontrolné sekvencie normálne združené s požadovanou génovou sekvenciou, pri predpoklade, že tieto kontrolné sekvencie sú kompatibilné s hostiteľskými bunečnými systémami.

Počiatok replikácie môže byť zaistený buď konštrukciou vektoru obsahujúceho exogénny počiatok, ako napríklad môže pochádzať z SV40 alebo iných vírov (napr. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) alebo môže byť zaistený chromozomálnym mechanizmom replikácie hostiteľskej bunky. Ak je vektor integrovaný do chromozómu hostiteľskej bunky, je tento často postačujúci.

Identifikácia použiteľných analógov GDF-8

Odborníkovi je jasné, že nie všetky varianty alebo modifikácie natívneho GDF-8 budú mať schopnosť vyvolať tvorbu protilátok u zvieraťa, ktoré skrížené reagujú s natívnou formou. Nie je ale obťažné zostaviť účinný štandardný screening modifikovaných GDF-8 molekúl, ktoré splní minimálne požiadavky na imunologickú reaktivitu diskutovanú v tomto texte. Preto sa ďalšia časť vynálezu týka spôsobu identifikácie modifikovaného GDF-8 polypeptidu, ktorý je schopný indukovať protilátky proti nemodifikovanému GDF-8 u živočíšneho druhu, kde je nemodifikovaný GDF-8 plypeptid autoproteín, tento spôsob obsahuje

- prípravu peptidovou syntézou alebo prostriedky molekulárnej biológie sady vzájomne rozdielnych modifikovaných GDF-8 polypeptidov, kde aminokyseliny boli pridané, vložené, odstránené alebo substituované v aminokyselinovej sekvencii GDF-8 polypeptidu živočíšneho druhu, a tým epitópy T lymfocytu, ktoré sú cudzorodé pre živočíšny druh,

- testovanie členov sady na ich schopnosť indukovať produkciu protilátok proti nemodifikovanému GDF-8 živočíšnym druhom, a izoláciu člena (členov) sady, ktorý významne indukuje produkciu protilátok proti nemodifikovanému GDF-8 v živočíšnom druhu.

V tomto kontexte sada vzájomne rozdielnych modifikovaných GDF-8 polypeptidov je kolekcia neidentických modifikovaných GDF-8 polypeptidov, ktoré boli vybrané napr. na základe kritérií diskutovaných vyššie (napr. v kombinácii so štúdiami cirkulárneho dichroizmu, NMR spekter a/lebo typu rôntgenovej difrakcie). Sada sa môže skladať z iba niekoľkých členov, ale predpokladá sa, sada môže obsahovať niekoľko stoviek členov.

Sada môže byť pripravená in vivo tak, že jeden použiteľný testovací systém pripraví fragmenty nukleovej kyseliny kódujúce členy, a potom sa s použitím týchto fragmentov nukleovej kyseliny pri imunizácii. nukleovou i

kyselinou, ako bolo popísané ν tomto texte, určí, či sú expresné produkty imunogénne. Test členov sady môže byť nakoniec prevádzaný in vivo, ale môže byť použitý veľký počet in vitro testov, ktoré zúžia počet modifikovaných molekúl, ktoré budú slúžiť účelu vynálezu.

Pretože cieľom zavedenia cudzorodých epitópov T lymfocytu je podporovať reakciu B lymfocytov pomocou T lymfocytov, je bezpodmienečne nutné, aby bola modifikovaným GDF-8 indukovaná proliferácia T lymfocytov. Proliferácia T lymfocytov môže byť testovaná štandartizovanými proliferačnými testmi in vitro. Stručne, od pacienta je získaná vzorka bohatá na T lymfocyty a je potom udržovaná v kultúre. Pestované T lymfocyty sú uvedené do kontaktu s APC pacienta, ktoré už prv nabrali modifikovanú molekulu a spracovali ju pre prezentáciu epitópom T lymfocytu. Proliferácia T lymfocytov je monitorovaná a zrovnaná s vhodnou kontrolou (napr. s ktoré spracovali proliferácia môže koncentrácie

T lymfocytmi v kultúre v kontakte s ÁPC, intaktný natívny GDF-8). Alternatívne, byť hodnotená na základe určovania relevantných cytokínov uvoľňovaných T lymfocytmi ako reakcia na ich rozpoznávanie cudzorodých T lymfocytov.

Ak je veľmi zo sady je je možné

GDF-8

GDF-8, pravdepodobné, že aspoň jeden modifikovaný schopný indukovať produkciu protilátky proti pripraviť imunogénny prípravok obsahujúci aspoň indukovať j eden živočíšneho modifikovaný protilátky druhu, kde je schopný

GDF-8 u autoproteín,

GDF-8 polypeptid, ktorý proti nemodifikovanému nemodifikovaný GDF-8 polypeptid je spôsob obsahuje zmiešanie členačlenov) sady, ktorý významne indukuje produkciu protilátok v živočíšnom druhu, ktorý reaguje s GDF-8, s farmaceutický a imunologický prijateľným nosičom a/lebo vehikulom a/lebo riedidlom a/lebo excipientom, voliteľne v kombinácii s aspoň jedným farmaceutický a imunologický prijateľným adjuvans.

Vyššie uvedené aspekty vynálezu sú obyčajne prevádzané východzie prípravou veľkého počtu vzájomne rozdielnych sekvencii nukleovej kyseliny alebo vektorov podľa vynálezu, ich zavedenie do vhodných expresných vektorov, transformácia vhodných hostiteľských buniek vektormi a expresia sekvencii nukleovej kyseliny podľa vynálezu. Tieto kroky potom môžu byť nasledované izoláciou expresných produktov. Je výhodné, keď sú sekvencie nukleovej kyseliny a/lebo vektory pripravené metódami používajúcimi techniku molekulárnej amplifikácie, ako je napríklad PCR, alebo syntézou nukleových kyselín.

Príklady prevedenia vynálezu

Expresia C-koncového úseku GDF-8 pri veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov fúzovaného k .N-koncovej značke His bolo dosiahnuté v E. coli a purifikovaný fúzny proteín bol použitý pre imunizáciu králikov. Kompletný GDF-8 bol exprimovaný v bunkách CHO a bolo ukázané, že je sekrétovaný ako diméry nespracovaného a spracovaného GDF-8, v danom poradí (McPherron et al. , Náture 387, 83-90, 1997). Neboli teda očakávané žiadne problémy s expresiou nižšie diskutovaných konšťruktov GDF-8 autovakcíny. Najvhodnejšie expresné systémy použité pre produkciu GDF-8 AutoVac konšťruktov sú Έ. coli, kvasinka P. pastoris a bunky CHO a hmyzie bunky, ako sú napríklad vyššie uvedené bunky Droshophila.

Príklad 1

Návrh vakcíny

Cieľom predkladaného vynálezu je substituovať úseky aminokyselinových zvyškov v cieľovom proteíne cudzorodými alebo arteficiálnymi epitópmi T lymfocytu napr. všeobecnými epitópmi T lymfocytu tetanického toxínu P2 a P30. Výhodne by tieto substitúcie mali iba minimálne poškodiť autentickú trojrozmernú štruktúru cieľového proteinu.

Cieľovým proteinom je C-koncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov, o jeho homodiméru sa predpokladá, že je biologicky aktívna forma GDF-8. Trojrozmerná štruktúra tohto úseku GDF-8 nie je známa, ale na základe štruktúry homologného TGF-β proteíne je možné očakávať, že model monomerného GDF-8 ukázaný na obr. 2 môže byť rozumne blízky realite. V tomto modelu GDF-8 divokého typu (wt) sú ukázané α-helixy ako valce a β-listy sú ukázané ako šípky. Cysteínové zvyšky, a teda disulfidové väzby, sú v štruktúre umiestnené velmi tesne.

Je nutné pamätať na to, že prítomnosť relatívne vysokého ' ¹ l počtu cysteínov (9), a teda disulfidových väzieb, v C-koncovom úseku GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov obmedzuje možné miesta, kde môžu byť umiestnené cudzorodé epitópy T lymfocytu.

Okrem vytvorenia C-koncového úseku GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov bez substitúcií (t.j. zvyšky 267-375 sekv. id. č. 1-10) boli navrhnuté nasledujúcou GDF-8 AutoVac kostruktou.

GDF-8 P2-1 (sekv. id. č. 15) je C-koncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov s aminokyselinovými zvyškami 18-32 substituovanými P2.

GDF-8 P2-2 (sekv. id. č. 16) je Č-koncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov s aminokyselinovými zvyškami 52-66 substituovanými P2.

GDF-8 P2-3 (sekv. id. č. 17) je C-koncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov s aminokyselinovými zvyškami 83-97 substituovanými P2.

GDF-8 P30-1 (sekv. id. č. 18) je C-koncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov s aminokyselinovými zvyškami 21-41 substituovanými P30.

GDF-8 P30-2. (sekv. id,. č. 19) je C-koncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov s aminokyselinovými zvyškami 49-69 substituovanými P30.

GDF-8 P30-3A (sekv. id. č. 20) je C-koncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov s aminokyselinovými zvyškami 79-99 substituovanými P30.

GDF-8 P30-3B (sekv. id. č. 21) je C-koncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov s aminokyselinovými zvyškami 84-104 substituovanými P30.

GDF-8 dimér (sekv. id. č. 22) sú dve kópie C-koncového úseku GDF-8 o veľkosti 109 amoinokyselinových zvyškov kovalentne spojené prostredníctvom epitópov P2 a P30. Inými slovami, molekula je zložená z dvoch polovíc. Prvá polovica je Ckoncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov majúci k jeho C-koncu fúzovaný P2, zatiaľ čo druhá polovica je C-koncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov majúci k jeho N-koncu fúzovaný P30.

GDF-8 ext (sekv. id. č. 23) sa skladá z C-koncového úseku GDF-8 o veľkosti 160 aminokyselinových zvyškov so zvyškami 1636 substituovanými P30 a zvyšky 37-51 substituovanými P2. Tento koňštrukt je C-koncový úsek GDF-8 o veľkosti 109 aminokyselinových zvyškov s N-koncovou extenziou obsahujúcou obidva epitópy P2 a P30.

Vo všetkých uvedených príkladoch konštruktov okrem posledne menovaného 2, sa predpokladá tvorba varianty, kde Cys73 je substituovaný Ser, aby sa zabránilo dimerizácii vytvorením disulfidovej väzby. V GDF-8 ext sa predpokladá prevedenie podobnej substitúcie v odpovedajúcej polohe (t.j. Cysl24 - Ser₁₂4) .

Príklad 2

Modely in vitro

Predpokladá sa počiatočná imunizácia myší purifikovanými GDF-8 variantmi, ako bolo popísané vyššie. Po napr. troch imunizáciách budú ‘protilátky merané testom ELISA s použitím nemodifikovaných GDF-8 molekúl ako antigénu. Primárnym dôvodom pre tieto počiatočné pokusy je potvrdenie, že technológie

AutoVac™ je použiteľná pre vytváranie anti-GDF-8 skrižene reaktívnych autoprotilátok a, čo je dôležité, pre rozpoznanie optimálneho dávkovacieho a imunizačného režimu. Bolo by ale veľmi prekvapivé, keby neboli s použitím prítomné technológie vypestované protilátky proti GDF-8, pretože základné imunologické mechanizmy takéto reakcie sú veľmi pravdepodobne identické s mechanizmami, ktoré už boli pozorované pre TNFa, porovnaj WO 98/46642 a WO 95/05849.

Príklad 3

Modely in vivo

Skupiny popísanými približne reagovali adjuvans, a1urnového imunizované myší budú v príklade 1. Myši budú týždne, pretože musí byť na vakcínu. Bude použité ale experimenty budú tiež rôznymi konštruktami imunizované vo veku imunokompetentné, aby Freundové kompletné prevádzané s použitím adjuvans, ako je napríklad Adjuphos™, ktoré bolo prv úspešne použité v zmesi s TNFa autokvacínovými konštruktami. Adjuphos™ je schválený pre použitie u človeka i zvierat.

V priebehu celého imunizačného obdobia bude pravidelne monitorovaná celková telesná hmotnosť GDF-8 imunizovaných, a tiež kontrolných zvierat. Keď budú myši vo veku približne 16 týždňov, budú utratené a bude zisťovaná veľkosť ich svaloviny.

Vďaka relatívne úzkemu časovému úseku, ke)d už sú myši imunokompetentné, ale nié sú ešte plne vyspelé, by mohlo byť obtiažne demonštrovať účinok anti-GDF-8 vakcinácie u týchto zvierat. Ak sa'preukáže, že to je tento prípad, predpokladá sa alternatívna imunizácia laboratórnych potkanov alebo väčších zvierat, ako sú napríklad ošípané, dobytok, ap.

Modifikovaná GDF-8 molekula, ktorá bude zvyšovať rýchlosť rastu zvierat a/lebo bude zvyšovať maximálnu veľkosť svalstva, bude vybraná vývoj.

nadpriemerne nadpriemerne pre klinický

5Ί

ZOZNAM SEKVENCIÍ <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Ηοιηο sapiens <400> 1

Met 1

Gin Lys

Leu

Gin Leu Cys Val 5

Tyr

íle Tyr 10

Leu Phe Met

Leu 15

íle

Val

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys

Glu

Asn

20

25

30

Val

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

35

40

45

Lys

Ser

Ser

Arg

íle

Glu

Ala

íle

Lys

íle

Gin

íle

Leu

Ser

Lys

Leu

50

55

60

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

íle

Ser

Lys

Asp

Val

íle

Arg

Gin

Leu

65

70

75

80

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

íle

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

85

90

95

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

Ala

Thr Thr 115

Glu

Thr

íle

íle Thr Met 120

Pro Thr Glu Ser Asp Phe iLeu 125

Met

Gin

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

Lys

íle

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

íle

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Val

Glu

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

íle

Leu

Arg

Leu

165

170

175

íle

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

íle

Arg

Ser

Leu

180

185

19Ô

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

íle

Trp

Gin

Ser

íle

Asp

Val

195

200

205

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

210

215

220

íle

Glu

íle

•Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Lys

245

250

255

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

325 330 335

Gly Pro Cys

Cys 340

Thr

Pro Thr Lys

Met Ser Pro íle Asn Met

Leu Tyr

345

350

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370

375

<220> 2 <211> 362 <212> PRT <213> Meleagris gallopavo <400> 2

Mét Gin íle Leu Val Hia Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gin Pro

1015

Thr Glu Asn Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg

2530

Gin Asn

Thr 35

Lys

Ser Ser Arg íle Glu Ala íle' 40

Lys

íle 45

Gin

íle

Leu

Ser Lys 50

Leu

Arg

Leu

Glu

Gin 55

Ala

Pro

Asn

íle

Ser 60

Arg

Asp

Val

íle

Lys Gin 65

Leu

Leu

Pro

Lys 70

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin 75

Glu

Leu

íle

Asp

Gin 80

Tyr Asp

Val

Gin

Arg 85

Asp

1 Asp

Ser

Ser

Asp 90

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp 95

Asp

Asp Tyr

His

Ala 100

Thr

Thr

Glu

Thr

íle 105

íle

Thr

Met

Pro

Thr 110

Glu

Ser

Asp Phe Leu Val Gin Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys

115 120125

Phe Ser 130

Ser Lys

íle Gin

Tyr 135

Asn Lys Val

Val

Lys Ala 140

Gin

Leu

Trp

íle

Tyr

Leu

Arg

Gin

Val

Gin

Lys

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

íle

145

150

155

160

Leu

Arg

Leu

íle

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

íle

165

170

175

Arg

Ser

Leu

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

íle

Trp

Gin

Ser

180

185

190

íle

Asp

Val

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

195

200

205

Asn

Leu

Gly

íle

Glu

íle

Lys

Ala

Phe

Asp

Glu

Asn

Gly

Arg

Asp

Leu

210

215

220

Ala

Val

Thr

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

225

230

235

240

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg Arg Asp

Phe

Gly

245

250

255

Leu

Asp

Cys

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

260

265

270

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

íle

Ala

Pro

275

280

285

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

S, e r

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

290

295

300

Leu

Gin

Lys

Tyr

Ero

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

305

310

315

320

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

íle

Asn

325 330 335

Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin íle íle Tyr Gly Lys íle Pro

340 345 350

Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

355

360 <210> 3 <211> 375 <212> PRT <213> Gallus sp.

<400> 3

Met Gin Lys Leu Ala

Val

Tyr

Val Tyr

íle 10

Tyr Leu Phe Met

Gin 15

íle 1

1

5

Ala

Val

Asp

Pro

Val

Ala

Leu

Asp

Gly

Ser

Ser

Gin

Pro

Thr

Glu

Asn

20

25

30

Ala

Glu

Lys

Asp

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

35

40

45

Lys

Ser

Ser

Arg

íle

Glu

Ala

íle

Lys

íle

Gin

íle

Leu

Sex

Lys

Leu

50

55

60

Arg 65

Leu

Glu

Gin Ala

Pro 70

Asn íle

Ser

Arg

Asp Val íle 75

Lys

Gin

Leu 80

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin

Glu

Leu

íle

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

85

90

95

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Set

Asp

Gly

Sex

Leu

Glu

Asp Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

íle

íle

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

Leu

115

120

125

Val

Gin

Met

Glu

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

Lys

íle

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

íle

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Gin

Val Gin

Lys 165

Pra

Thr Thr Val

Phe 170

Val

Gin íle

Leu

Arg 175

Leu

íle

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

Íle

Arg

Ser

Leu

180

185

190

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

íle

Trp

Gin

Ser

íle

Asp

Val

195

200

205

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

210

215

220

íle

Glu

íle

Lys

Ala

Phe

Asp

Glu

Thr

Gly Arg

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Arg

245

250

255

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr,His

Leu

Val

His

Gin'

Ala

Asn

Pro

Arg Glý

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

355 360 365

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

370 375 <210> 4 <211> 376 <212> PRT <213> Mu s musculus <400> 4

Met 1

Met

Gin Lys

Leu 5

Gin Met Tyr Val

Tyr íle Tyr Leu Phe 10

Met 15

Leu

íle

Ala

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Gly

Ser

Glu

Arg

Glu

Glu

20

25

30

Asn

Val

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Ala

Trp

Arg

Gin

Asn

35

40

45

Thr

Arg

Tyr

Ser

Arg

íle

Glu

Ala

íle

Lys

íle

Gin

íle

Leu

Ser

Lys

50

55

60

Leu

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

íle

Ser

Lys

Asp

Ala

íle

Arg

Gin

65

70

75

80

Leu

Leu

Pro

Arg

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

íle

Asp

Gin

Tyr

Asp

85

90

95

Val

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

100

105

110

His

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

íle

íle

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

115

120

125

Leu

Met

Gin

Ala

Asp

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

130

1

135

140

Ser

Lys

íle

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

íle

Tyr

145

150

155

160

Leu

Arg

Pro

Val

Lys

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

íle

Leu

Arg

165

170

175

Leu íle

Lys

Pro 180

Met

Lys

Asp Gly

Thr Arg Tyr Thr Gly íle Arg

Ser

185

190

Leu

Lys

Leu

Asp

Met

Ser

Pro

Gly

Thr

Gly

íle

Trp

Gin

Ser

íle

Asp

195

200

205

Val

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

210

'215

220

Gly

íle

Glu

íle

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

225

230

235

240

Thr

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

245

250

255

Lys

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

260

265

270

Cys

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

275

280

285

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp Asp

Trp

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

290

295

300

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

305

310

315

320

Lys

Tyr

Pro

His

Thr'His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

325

330

335

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

íle

Asn

Met

Leu

340

345

350

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

Lys

íle

Pro

Ala

Met

355

360

365

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370

375

<210> 5 <211> 375 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 5

Met Gin Lys 1

Leu Gin 5

íle

Ser

Val Tyr

íle Tyr Leu 10

Phe Met

Leu 15

íle

Val

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys

Glu

Asn

20

25

30

Val

Glu

Lys.

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Leu

Trp

Arg

Glu

Asn

Thr

35

40

45

Thr

Sex

Ser

Arg

Leu

Glu

Ala

íle

Lys

íle

Gin

íle

Leu

Ser

Lys

Leu

50

55

60

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

íle

Ser

Lys

Asp

Ala

íle

Arg

Gin

Leu

65

70

75

80

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Leu

Glu

Leu

íle

Asp

Gin

Phe

Asp

Val

85

90

95

Gin

Arg

Asp

Ala

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

Ala

Arg

Thr

Glu

Thr

Val

íle

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Leu

Leu

115

120

125

Thr

Gin

Val

Glu

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

Lys

íle

Gin

Tyr

Asn

Lys

Leu

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

íle

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Val

Lys

Thr

Pro

Ala

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Íle

Leu

Arg

Leu

165

170

175

íle

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

íle

Arg

Ser

Leu

180

185

190

Lys Leu

Asp 195

Met Asn Pro

Gly

Thr 200

Gly

íle

Trp

Gin

Ser 205

íle

Asp

Val

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

210

215

220

1

íle

Glu

íle

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

Phe

Pro

Glu

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Thr

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Lys

245

250

255

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Glu

Gly

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 6 <211> 375 <212> PRT <213> Ovis sp.

<400> 6

Met Gin 1

Lys Leu

Gin 5

íle Phe Val Tyr

íle Tyr Leu Phe Met Leu

Leu

10

15

Val

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys

Glu

Asn

20

25

30

Val

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Leu

Trp

Arg

Gin

Asn

Asn

35

40

45

Lys

Ser

Ser

Arg

Leu

Glu

Ala

íle

Lys

íle

Gin

íle

Leu

Ser

Lys

Leu

50

55

60

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

íle

Ser

Lys

Asp

Ala

íle

Arg

Gin

Leu

65

70

75

80

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

íle

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

85

90

95

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

Val

Thr

Thr

Glu

Thr

Val

íle

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Leu

Leu

115

120

125

Ala

Glu

Val

Gin

Glu

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

Lys

íle

Gin

His

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

íle

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Val

Lys

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

íle

Leu

Arg

Leu

165

170

175

íle

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr, Gly

íle

Arg

Ser

Leu

180

185

190

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

íle

Trp

Gin

Ser

íle

Asp

Val

195

200

205

Lys Thr Val 210

Leu Gin

Asn Trp 215

Leu Lys

Gin

Pro Glu Ser 220

Asn

Leu

Gly

íle

Glu

íle

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

Phe

, Pro

Glu

Pro

Gly

Glu

Glu

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Lys

245

.250

255

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Leu

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Lys

Gly

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

Lys

íle

Pro

Gly

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 7 <211> 376 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 7

Met 1

íle

Gin

Lys

Pro 5

Gin Met Tyr Val Tyr íle 10

Tyr

Leu

Phe

Val 15

Leu

íle

Ala

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asp

Ser

Glu

Arg

Glu

Ala

20

25

30

Asn

Val

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Ala

Trp

Arg

Gin

Asn

35

40

45

Thr

Arg

Tyr

Ser

Arg

íle

Glu

Ala

íle

Lys

íle

Gin

íle

Leu

Ser

Lys

50

55

60

Leu

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

íle

Ser

Lys

Asp

Ala

íle

Arg

Gin

65

70

75

80

Leu

Leu

Pro

Arg

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

íle

Asp

Gin

Tyr Asp

85

90

95

Val

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

100

105

110

His

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

íle

íle

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

115

120

125

Leu

Met

Gin

Ala

Asp

Gly

Lys

Pro

Ĺys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

130

135

140

Ser

Lys

íle

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

íle

Tyr

145

150

155

160

Leu

Arg

Ala

Val

Lyš

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

íle

•Leu

Arg

165

170

175

Leu

íle

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

íle

Arg

Ser

180

185

190

Leu

Lys

Leu

Asp

Met

Ser

Pro

Gly

Thr

Gly

íle

Trp

Gin

Ser

íle

Asp

195

200

205

Val

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

210 215 220

Gly 225

íle Glu

íle

Lys Ala 230

Leu Asp Glu Asn Gly 235

His

Asp

Leu

Ala

Val 240

Thr

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

245

250

255

Lys

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

260

265

270

Cys

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

275

280

285

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

290

295

300

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

305

310

315

320

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

325

330

335

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

íle

Asn

Met

Leu

340

345

350

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

Lys

íle

Pro

Ala

Met

355

360

365

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370

375

<210> 8 <211> 375 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 8

Met Gin Lys Leu Gin íle Tyr Val Tyr íle Tyr Leu Phe Met Leu íle

r

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn

Ser Glu Gin Lys

Glu Asn

Val Glu Lys

Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Met Trp Arg

Gin Asn Thr

Lys Ser

Ser Arg Leu Glu

Ala íle Lys íle 55

Gin

íle Leu 60

Ser

Lys

Leu

50

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

íle

Ser

Lys

Asp

Ala

íle

Arg

Gin

Leu

65

70

75

80

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

íle

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

85

90

95

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

Ala Thr Thr Glu Thr íle íle Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu

115

120

125

Met

Gin

Val

Glu

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

Lys

íle

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

íle

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Val

Lys

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

íle

Leu

Arg

Leu

165

170

175

íle

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

1 Arg

Tyr

Thr

Glý

íle

Arg

Ser

Leu

180

185

190

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

íle

Trp

Gin

Ser

íle

Asp

Val

195

200

205

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser

Asn

Leu

Gly

210

215

220

íle

Glu

íle

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225 230 235 240

Phe Pro

Gly Pro

Gly Glu Asp Gly Leu Asn

Pro Phe Leu Glu Val 255

Lys

245

250

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe> Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

275

280

285

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370

375

<210> 9 <211> 374 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 9

Gly Pro Val Gly Tyr Gly Asp íle Thr Ala His Gin Gin Pro Ser Thr
20	25	30

Ala Thr

Glu 35

Glu Ser

Glu

Leu

Cys 40

J. i Ser Thr Cys

Glu

Phe 45

Arg

Gin

His

Ser

Lys

Leu

Met

Arg

Leu

His

Ala

íle

Lys

Ser

Gin

íle

Leu

Ser

Lys

50

55

60

Leu

Arg

Leu

Lys

Gin

Ala

Pro

Asn

íle

Ser

Arg

Asp

Val

Val

Lys

Gin

65

70

75

80

Leu

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Gin

Gin

Leu

Leu

Asp

Gin

Tyr

Asp

85

90

95

Val

Leu

Gly

Asp

Asp

Ser

Lys

Asp

Gly

Ala

Val

Glu

Glu

Asp

Asp

Glu

100

105

110

His

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

íle

Met

Thr

Met

Ala

Thr

Glu

Pro

Asp

Pro

115

120

125

íle

Val

Gin

Val

Asp

Arg

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Ser

Phe

Ser

130

135

140

Pro

Lys

íle

Gin

Ala

Asn

Arg

íle

Val

Arg

Ala

Gin

Leu

Trp

Val

His

145

150

155

160

Leu

Arg

Pro

Ala

Glu

Glu

Ala

Thr

Thr

Val

Phe

Leu

Gin

íle

Ser

Arg

165

170

175

Leu

Met

Pro

Val

Lys

Asp

Gly

Gly

Arg

His

Arg

íle

Arg

Ser

Leu

Lys

180

185

190

íle

Asp

Val

Asn

Ala

Gly

Val

Thr

Ser

Trp

Gin

Ser

íle

Asp

Val

Lys

195

200

205

Gin

Val

Leu

Thr

Val

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Thr

Asn

Arg

Gly

íle

210

215

220

Glu

íle

Asn

Ala

Tyr

Asp

Ala

Lys

Gly

Asn

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

Ser

225

230

235

240

Thr Glu Thr Gly Glu Asp Gly Leu Leu Pro Phe Met Glu Val Lys íle

245 250 255

Ί4

Ser Glu

Gly

Pro Lys 260

Arg

íle Arg

Arg Asp 265

Ser Gly

Leu Asp 270

Cys

Asp

Glu

Asn

Ser

Ser

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

275

280

285

Phe Glu 290

Asp

Phe Gly Trp Asp Trp íle íle Ala Pro Lys

Arg

Tyr Lys

295

300

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Asp

Tyr

Met

Tyr

Leu

Gin

Lys

Tyr

305

310

315

320

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Asn

Lys

Ala

Ser

Pro

Arg

Gly

Thr

Ala

Gly

325

330

335

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

340

345

350

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

Lys

íle

Pro

Ser

Met

Val

Val

355

360

365

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370

<210> 10 <211> 375 <212> PRT <213> Papio hamadryas <400> 10

Met 1

Gin

Lys

Leu Gin Leu Cys Val Tyr íle Tyr Leu Phe Met Leu íle

5

10

15

Val

Ala

Gly

Pro

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Asn

Ser

Glu

Gin

Lys

Glu

Asn

20

25

30

Val

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu

Cys

Asn

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

35

40

45

Lys Ser Ser Arg 50 Arg Leu. Glu Thr 65

íle Ala

Glu Ala 55

íle Lys

íle Lys

Gin íle Leu Ser Lys 60 Asp Ala íle Arg Gin 75

Leu Leu 80

Pro 70

Asn

íle

Ser

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

Arg

Glu

Leu

íle

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val

85

90

95

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

100

105

110

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

íle

íle

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

Leu

115

120

125

Met

Gin

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

130

135

140

Lys

íle

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

íle

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Val

Glu

Thr

Pro

Thr

Thr

Val

Phe

Val

Gin

íle

Leu

Arg

Leu

165

170

175

íle

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

Gly

Thr

Arg

Tyr

Thr

Gly

íle

Arg

Ser

Leu

180

185

190

Lys

Leu

Asp

Met

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

íle

Trp

Gin

Ser

íle

Asp

Val

195

200

205

Lys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Trp

Leu

Lys

Gin

Pro

Glu

Ser Asn

Leu

Gly

210

215

220'

íle

Glu

íle

Lys

Ala

Leu

Asp

Glu

Asn

Gly

His

Asp

Leu

Ala

Val

Thr

225

230

235

240

Phe

Pro

Gly

Pro

Gly

Glu

Asp

Gly

Leu

Asn

Pro

Phe

Leu

Glu

Val

Lys

245

250

255

Val

Thr

Asp

Thr

Pro

Lys

Arg

Ser

Arg

Arg

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

260

265

270

Asp Glu His

Ser Thr

Glu Ser Arg Cys 280

Cys

Arg

Tyr

Pro 285

Leu Thr

Val

275

Asp

Phe

Glu

Ala

Leu

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

290

295

300

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

305

310

315

320

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

325

330

335

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

340

345

350

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

355

360

365

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

370 375 <210> 11 <211> 109 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220>

<221> peptid <222> (1)..(109) <223> Identická so zvyškami 267-375 zo sekv. id. č.: 1

<400> 11
Asp Phe Gly	Leu Asp Cys Asp Glu His	Ser Thr	Glu Ser Arg Cys Cys
1	5	10	15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp íle

25 30

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

35

40

45

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

50

55

60

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

65

70

75

80

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

85

90

95

Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

100 105 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> Bos taurus <220>

<221> peptid <222> (1) . . (109) <223> identická so zvyškami 267-375 zo sekv. id. č. 5 <400> 12

Asp Phe 1

Gly Leu Asp 5

Cys

Asp

Glu His

Ser 10

Thr Glu Ser

Arg

Cys 15

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

20

25

30

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

35

40

45

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

50

55

60

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

65

70

75

80

Pro íle Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Glu Gly Gin íle íle Tyr Gly 85 90 95

Lys íle Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

100 105 i

<210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridiu'm tetani <400> 13

Gin Tyr íle Lys Ala Asn Ser Lys Phe íle Gly íle Thr Glu Leu 15 10 15 <210> 14 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 14

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser- Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

Ala Ser His Leu Glu <210> 15 <211> 109 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> ' <221> Mutagén <222> (18)..(32) <223> '·Epitóp P2 tetanického toxoidu< (sekv. id. č. 13) <220>

<221> Podobná <222> (1) .. (17) <223> Identická so zvyškami 2 67-283 zo sekv. id. č. 1 <220>

<221> Podobná <222> (33)..(109) <223> Identická so zvyškami 299-375 zo sekv. id. č. 1

ΊΟ <220>

<221> Miesto <222> (73) <223> Cysalebo Ser <220>

<221> Miesto <222> (90).. (91) <223> Lys Glualebo Glu Gly <400> 15

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp

Glu

His

Ser Thr Glu Ser Arg Cys

Cys

1

5

10

15

Arg

Gin

Tyr

íle

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

íle

Gly

íle

Thr

Glu

Leu

20

25

30

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

35

40

45

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

50

55

60

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

65

70

75

80

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

85

90

95

Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

100 105 <210> 16 <211> 109 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<221> Mutagén

<222> <223>	(52) . . (66) Epitóp P2 tetanického toxoidu:	(sekv.	id.	č.	13)
<220> <221> <222> <223>	Podobná (1)·-(51) Identická so zvyškami 267-317	zo sekv.	id.	č.	1

<220>

<221> Podobná <222> (67)..(109) <223> Identická so zvyškami 333-375 zo sekv. id. č. 1 <220>

<221> Miesto <222> (73) <223> Cys alebo Ser <220>

<221> Miesto <222> (90).. (91) <223> Lys Glu alebo Glu Gly <400> 16

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

1

5

10

15

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

20

25

30

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

35

40

45

Phe

Val

Phe

Gin

Tyr

íle

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

íle

Gly

íle

Thr

50

55

60

Glu

Leu

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

65

70

75

80

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

85

90

95

Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

100 105 <210> 17 <211> 109 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>

<221> Mutagén <222> (83)..(97) <223> Epitóp P2 tetanického toxoidu· (sekv. id. č. 13) <220>

<221> Podobná <222> (1).. (82)

<223>Identická so zvyškami 267-348	ze sekv.	id.	č. 1
<220>	1 i
<221>	Podobná
<222>	(98)..(109)
<223>	Identická so zvyškami 364-375	z G sekv.	id.	č. 1
<220>
<221>	Miesto
<222>	(73)
<223>	Cys alebo Ser
<220>
<221>	Miesco
<222>	(90)..(91)
<223>	Lys Glu alebo Glu Gly

<400> 17

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

Cys

1

5

10

15

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

20

25

30

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

35

40

45

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

50

55

60

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

65

70

75

' 80

Pro

íle

Gin

Tyr

íle

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

íle

Gly

íle

Thr

Glu

85

90

95

Leu

íle

Pro

Ala

Met

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

100

105

<210> 18 <211> 109 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<221> Mutagén <222> (21) .. (41) <223> Epitóp Ρ30 tetanického toxoidu (sekv. id. č. 14) <220>

<221> Podobná <222> (42)..(109) <223> identická so zvyškami 307-375 zo sekv. id. č. 1 <220>

<221> Podobná <222> (42)..(109) <2 2 3> identická so zvyškami 308-37 5 z? sekv. id. č. : 1 <220>

<221> Miesto <222> (73) ‘ <223> Cys alebo Ser <220>

<221> Miesto <222> (90) .. (91) <223> Lys Glu alebo Glu Gly <400> 1Θ

Asp 1

Phe Gly Leu Asp 5

Cys Asp Glu

His

Ser Thr 10

Glu

Ser

Arg

Cys 15

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

.Val

20

25

30

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

35

40

45

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

50

55

60

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

65

70

75

80

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe.

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

85

90

95

Lys íle Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

100 105 <210> 19 <211> 109 <212> PRT <213> Umelá sekvencia

I <220>

<221> Mutagén <222> (49) . . (69) <223> Epitóp Ρ30 tetanického toxoidu (sekv. id. č. 14) <220>

<221> .Podobná <222> (1)..(48) <223> identická so zvyškami 267-314 zc sekv. id. č. 1 <220>

<221> Podobná <222> (70) . . (109) <223> identická so zvyškami 336-375 zo sekv. id. č. 1 <220>

<221> Miesto <222> (73) <223> Cys alebo Ser <220>

<221> Miesto <222> (90)..(91) <223> Lys Glualebo Glu Gly <400> 19

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

Glu

His

Ser Thr

Glu Ser

Arg

Cys

Cys

1

5

10

15

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Ala Phe

Gly Trp

Asp

Trp

íle

20

25

30

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr Cys

Ser Gly

|. Glu

Cys

Glu

35

40

45

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu Arg

Val Pro

Lys

Val

Ser

55 60

Ala Ser His Leu Glu Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser

70 75 80

Pro íle Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys

Glu Gin íle íle Tyr Gly

Lys íle Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

100

105 <210> 20 <211> 109 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<221> Mutagén <222> (79)..(99) <223> Epitóp P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č. 14) <220>

<221> Podobná <222> (1) . . (78) <223> Identická so zvyškami 267-345 zo sekv. id. č. 1 <220>

<221> Podobná <222> (100)..(109) <223> identická so zvyškami 366-375 zo sekv. id. č. 1 <220>

<221> Miesto <222> (73) <223> Cys alebo 5er <220>

<221> Miesto <222> (90)..(91) <223> Lys Glu alebo Glu Gly <400> 20

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys

5 10 15

Arg Tyr

Pro

Leu 20

Thr

Val

Asp

Phe Glu 25

Ala

Phe

Gly Trp

Asp 30

Trp

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Äsn

Tyr

Cys

Ser

dy

Glu

Cys

Glu

35

40

45

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

50

55

60

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Phe

Asn

65

70

75

80

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

85

90

95'

His

Leu

Glu

Ala

Met

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

100 105 <210> 21 <211> 109 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<221> Mutagen <222> (84) . . (104) <223> Epitóp Ρ30 tetanického toxoidu (sekv. id. č. 14) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(83) ' <223> Identická so zvyškami 267-349 zo sekv. id. č. 1 <220> ' ' <221> Podobná <222> (105) .. (109) <223> Identická so zvyškami 371-375 zg sekv. id. č. 1 <220>

<221> Miesto <222> (73) <223> Cys alebo Ser <220>

<221> Miesto <222> (90) .. (91) <223> Lys Glu alebo Glu Gly <400> 21

Asp Phe Gly Leu Asp

Cys Asp Glu

His

Ser Thr Glu 10

Ser Arg

Cys 15

Cys

1

5

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

20

25

30

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

35

40

45

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

50

55

60

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

65

70

75

80

Pro

íle

Asn

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

85

90

95

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

100

105

<210> 22 <211> 254 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<221> Podobná <222> (110) .. (124) <223> Epitóp Ρ2 tetanického toxoidu (sekv. id. č. 13) <220> ' ' · ’ , <221> Podobná <222> (125)..(145) <223> Epitóp P30 difterického toxoidu (sekv. id. č. 14) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(109) <223> 109 C-koncových zvyškov humánneho a bovinného GDF-8 (zvyšky 267-375 zo sekv. id. č. 1) <220>

<221> Podobná <222> (146)..(254) <223>109 C-koncových zvyškov humánneho a bovinného GDF-8 (zvyšky 267-375 zo sekv. id. č. 1) <220>

<221> Miesto <222> (90)..(91) <223> Lys Glu alebo Glu Gly <220>

<221> Miesto <222> (235)..(236) <223> Identická se (90)..(91) <400> 22

Asp Phe 1

Gly Leu

Asp 5

Cys Asp

Glu His

Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys

10

15

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

íle

20

25

30

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

Glu

35

40

45

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

Ala

50

55

60

Asn 65

Pro

Arg

Gly Ser Ala 70

Gly

Pro Cys

Cys

Thr 75

Pro

Thr

Lys

Met

Ser 80

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

Gly

85

90

95

Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

Gin

Tyr

íle

100

105

110

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

íle

Gly

íle

Thr

Glu

Leu

Phe

Asn

Asn

Phe

115

120

125

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

130

135

140

Glu

Asp

Phe

Gly

Leu

Asp

Cys

Asp

Glu

His

Ser

Thr

Glu

Ser

Arg

Cys

145

150

155

160

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

165

170

175

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys.

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Cys

180

185

190

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

His

Gin

195

200

205

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

210

215

220

Ser

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

íle

Tyr

225

230

235

240

Gly

Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

245 250 <210> 23 <211> 160 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<221> Mutagén <222> (16)..(36) <223> Epitóp Ρ30 tetanického toxoidu (sekv. id. č. 14) <220>

<221> Mutagén <222> (37) . . (51)

<223>	Epitóp P2 tetanického toxoidu	(sekv.	id.	č.	13)
<220>
<221>	Podobná
<222>	(D·. (15)
<223> Identická so	zvyškami 216-230	Z0	sekv.	id.	č.	1
<220>
<221>	Podobná
<222>	(52).. (160)
<223>	Identická so	zvyškami 2 67-375	Zó	sekv.	id.	č.	1

<220>

<221> Miesto <222> (124) <223> Cys alebo Ser <220>

<221> Miesto <222> (141) .. (142) <223> Lys Glu alebo Glu Gly <400> 23

Leu 1

Lys

Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly íle

Glu íle

Lys

Ala

Leu 15

Phe

5

10

Asn

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

20

25

30

Ser

His

Leu

Glu

Gin

Tyr

íle

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

íle

Gly

íle

. 40 45

Thr Glu

Leu

Asp Phe

Gly Leu 55

Asp

Cys Asp

Glu His 60

Ser .Thr

Glu

Ser

50

Arg

Cys

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

65

70

75

80

Asp

Trp

íle

íle

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

85

90

95

Glu

Cys

Glu

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Léu

Val

100

105

110

His

Gin

Ala

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

115

120

125

Lys

Met

Ser

Pro

íle

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

Asn

Gly

Lys

Glu

Gin

íle

130

135

140

íle

Tyr

Gly

Lys

íle

Pro

Ala

Met

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

145

150

155

160

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie aspoň jedného GDF-8 analógu, alebo fragmentu n^ukleovej kyseliny kódujúceho aspoň jeden GDF-8 analóg, alebo nepatogénneho mikroorganizmu alebo víru, ktorý obsahuje fragment nukleovej kyseliny kódujúci aspoň jeden GDF-8 analóg, *

   pričom analóg obsahuje prírodný GDF-8 aminokyselinovou sekvenciou, kde je zavedená aspoň jedna modifikácia, ktorá má za následok, že imunizácia analógom u zvieraťa, vrátane človeka, kedy GDF-8 plypeptid je autológny, indukuje produkciu protilátok proti GDF-8 polypeptidu a je zachovaná podstatná frakcia GDF-8 epitópov B lymfocytu a je zavedený cudzorodý epitóp pomocného T lymfocytu (T_H epitóp) odpovedajúci ktorémukoľvek zo zvyškov 18-41, 49-69 alebo 79-104 v sekv. id. č. 11 alebo 12 adícií, delécií, inzercií alebo substitúcií alebo odpovedajúcej ekvivalentnej sekvencii z GDF-8 polypeptidu pôvodu iného než humánneho, bovinného, prasačieho, kuracieho alebo morčacieho, alebo cudzorodý T_H epitóp je vložený alebo subtituovaný do ktorejkoľvek oblasti kľučky alebo flexibilných koncov v GDF8 polypeptidu, pre výrobu farmaceutického prípravku pre in vivo downreguláciu GDF-8 aktivity u zvierat.

   2. Použitie podľa nároku 1, kde v analógu je zavedená aspoň jedna prvá skupina, ktorá prevádza cielenie analógu k bunke prezentujúcej antigén (APC) alebo B lymfocyt a/lebo v analógu je zavedená aspoň jedna druhá skupina, ktorá stimuluj e imunitný systém a/lebo

   v analógu je zavedená aspoň jedna tretia skupina, ktorá optimalizuje prezentáciu modifikovaného GDF-8 polypeptidu imunitnému systému.

   3. Použitie podľa nároku 2, pričom modifikácia zahrňuje zavedenie cudzorodého T_H epitópu a/lebo prvej a/lebo druhej a/lebo tretej skupiny ako postranných skupín, kovalentnou alebo nekovalentnou väzbou k vhodným chemickým skupinám v GDF8 alebo jeho subsiekvencií.

   4. Použitie podľa nároku 4 alebo 5, pričom modifikácia zahrňuje substitúciu a/lebo deléciu a/lebo inzerciu a/lebo adíciu aminokyseliny.

   5. Použitie podľa nároku 4, pričom modifikácia má za následok poskytnutie fúzneho polypeptidu.

   6. Použitie podľa nároku 4 alebo 5, pričom zavedenie substitúcie a/lebo delécie a/lebo inzercie a/lebo adície aminokyseliny má za následok podstatnú konzerváciu obecnej terciárnej štruktúry GDF-8..

   7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až' 6, pričom modifikácia zahrňuje duplikáciu aspoň jedného GDF-8 epitópu B lymfocytu a/lebo zavedenie hapténu.

   8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, pričom cudzorodý epitóp T_H lymfocytu je u zvieraťa imunodominantný.

   9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, kde cudzorodý T_H epitóp je všeobecný, ako je napríklad prírodný všeobecný T_H epitóp a syntetická sekvencia väzobného peptidu MHC-II.

   10. Použitie podľa nároku 9, pričom prírodný epitóp T_H lymfocytu je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí epitóp tetanického toxoidu, ako je napríklad P2 alebo P30, epitóp difterického toxoidu, epitóp hemaglutinínu' víru chrípky a CS epitóp P. falciparum.

   11. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 10, pričom prvá skupina je v podstate špecifický väzobný partner pre špecifický povrchový antigén B lymfocytu alebo pre špecifický povrchový antigén APC, ako je napríklad haptén alebo sacharid, pre ktorý je receptor na B lymfocytu alebo APC, ako je napríklad manán alebo manóza.

   12. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 11, pričom druhá skupina je vybraná zo skupiny, ktorú tvorí cytokín, hormón a proteín tepelného šoku.

   13. Použitie podľa nároku 12, pričom cytokín je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí, alebo je príslušnou účinnou časťou, interferón γ (IFN-ý), Flt3L, interleukín 1 (IL-1), interleukín
2. 2 (IL-2), interleukín 4 (IL-4), interleukín 6 (IL-6), interleukín 12 (IL-12), interleukín 13 (IL-13), interleukín 15 (IL-15) a faktor stimulujúci kolónie granulocytov a makrofágov (GM-CSF) a proteín tepelného šoku je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí alebo je účinnou časťou ktoréhokoľvek z nich, HSP70, SP90, HCS70, GRP941 a kalretikulín (CRT).

   14. Použitie podlá ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 13, pričom tretia skupina je lipidovej povahy, ako je napríklad palmitoylová skupina, myristylová skupina, farnesylová skupina, geranyl-geranylová skupina, GPI kotva a Nacyldiglycerodová skupina.

   15. Použitie podlá ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, pričom GDF-8 subsekvencie alebo GDF-8 analóg pochádza z Ckoncovej, aktívnej formy GDF-8, ako je napríklad subsekvencia alebo analóg ochádzajúci z bovinného, prasačieho, humánneho, kuracieho, ovčieho alebo morčacieho GDF-8 polypeptidu.

   16. Použitie podľa nároku 15, pričom GDF-8 polypeptid bol modifikovaný substitúciou sekvencie v sekv. id. č.

   aspoň jednej aminokyselinovej

   11 alebo č. 12 aspoň jednou aminokyselinovou sekvenciou rovnakej alebo odlišnej dĺžky, ktorá obsahuje cudzorodý T_H epitóp, pričom substituované aminokyselinové sekvencie sú obsiahnuté vo zvyškoch 1 až 12, 18 až 41, 43 až 48, 49 až 69 alebo 79 až 104 v sekv. id. č. 11 alebo č. 12 alebo kde GDF-8 polypeptid bol modifikovaný inzerciou aspoň jednej aminokyselinovej sekvencie, ktorá obsahuje cudzorodý T_H epitóp, pričom inzercia je prevádzaná kdekoľvek v polohách 1 až 12, 18 až 30, 42 až 51, 82 až 86 a 105 až 109 v sekv. id. č. 11 alebo č. 12.

   17. Použitie podlá ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, pričom prezentácia imunitnému systému je prevádzaná poskytnutím aspoň dvoch kópií analógu kovalentne alebo nekovalentne spojeného s nosičovou molekulou, schopného prezentácie mnohopočetných kópií antigénnych determinánt.

   18. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, pričom účinné množstvo GDF-8 analógu je podávané zvieraťu spôsobom vybraným z parenterálnych spôsobov, ako sú napríklad intradermálne, subdermálne, intrakutánne, subkutánne a intramuskulárne spôsoby, spôsob peritoneálny, perorálny, bukálny, sublingválny, epidurálny, spinálný, análný a intrakraniálny spôsob.

   19. Použitie podľa nároku 18, pričom účinné množstvo je medzi 0,5 pg a 200 pg analógu.

   20. Použitie podľa nároku 18 alebo 19, ktoré zahrňuje aspoň jedno podávanie GDF-8 polypeptidu alebo analógu ročne, ako je napríklad aspoň 2, aspoň 3, aspoň 4, aspoň 6 a aspoň 12 podávaní ročne.

   21. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 a 20, pričom analóg bol voliteľne formulovaný s farmaceutický a imunologický prijateľným nosičom a/lebo vehikulom a bol formulovaný s adjuvans, ktoré uľahčuje únik autotolerancií¹ k autoantigénom, ako ne napríklad adjuvans vybrané zo skupiny, ktorú tvorí imunitné cieliaci adjuvans, imunitné modulujúci adjuvans, ako je napríklad toxín, cytokín a mykobateriálny derivát, olejový prípravok, polymér, adjuvans tvoriaci micely, saponín, imunostimulačný komplexný mátrix (ISCOM matrix), častice, DDA, hlinitá adjuvancia, DNA adjuvancia, γ-inulín a opúzdrovací adjuvans.

   22. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 19 až 21, pričom GDF-8 analóg je obsiahnutý vo virtuálnej lymfatickej uzline (VLN) .

   ,23. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 17, pričom prezentácia analógu imunitnému systému je prevádzaná zavedením nukleovej kyseliny (nukleových kyslín) analóg do buniek zvieraťa, a tým sa dosiahne in vivo experesie zavedenej nukleovej kyseliny (nukleových kyselín) bunkami.

   24. Použitie podľa nároku 23, pričom zavedená nukleová kyselina (nukleové kyseliny) je (sú) vybraná zo skupiny, ktorú tvorí nahá DNA, DNA formulovaná s nabitými alebo nenabitými lipidmi, DNA formulovaná vírovém vektore, DNA v lipozómoch, DNA obsiahnutá vo formulovaná s proteínom alebo polypeptidom uľahčujúcim transfekciu,

   DNA formulovaná cieliacim proteínom alebo polypeptidom,

   DNA formulovaná vápnikovými precipitačnými činidlami,

   DNA kondenzovaná molekule intertného nosiča,

   DNA formulovaná' s chitinom alebo chotosanom a DNA formulovaná adjuvans.

   25. Použitie podľa nárokov 23 až 24, pričom nukleové kyseliny sú podávané • intraarteriálne, intravenózne alebo spôsobmi definovanými ' v nároku 18. 26. Použitie podľa nároku 24 alebo 25, pričom nukleová

   kyselina (nukleové kyseliny) je(sú) obsiahnutá v zariadení VLN a/lebo sú formulované, ako je definované v nároku 21.

   J ' . -

   27. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 24 až 26, ktoré zahrňuje aspoň jedno podávanie nukleových kyselín ročne, ako je napríklad aspoň 2, aspoň 3, aspoň 4, aspoň 6 a aspoň 12 podávaní ročne.

   28. Použitie podía ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokov, kde down-regulácia GDF-8 je pre nárast svaloviny zvieraťa a kde GDF-8 je down-regulovaný do takého stupňa, že svalovina je zvýšená aspoň o 5 % v porovnaní so zvieratami, ktoré prejavujú normálny GDF-8 aktivitu, ako je napríklad aspoň o 10, 15, 20, .25, 30, 35, 40 a 45 %.

   29. GDF-8 analóg, ktorý pochádza z GDF-8 polypeptidu zvieraťa a do ktorého je zavedená modifikácia, ako je definované v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 17.

   30. Imunogénny prípravok vyznačujúci sa tým, že obsahuje imunogérine účinné množstvo GDF-8 analógu podľa nároku 29, pričom prípravok ďalej obsahuje farmaceutický a imunologický prijateľný nosič a/lebo vehikulum a voliteľne adjuvans.

   31. Imunogénny prípravok podľa nároku 30 vyznačujúci sa tým, že adjuvans je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí adjuvancia podľa . nároku 21.

   32. Fragment nukleovej kyseliny, ktorý kóduje GDF-8 analóg podlá nároku 29.

   33. Vektor nesúci fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 32, ako je napríklad vektor schopný autonómnej repklikácie.

   34. Vektor podľa nároku 33, ktorý je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí plazmid, fág, kosmid, mini-chromozóm a vírus.

   35. Vektor podía nároku 33 alebo 34, obsahujúci v smere 5DD3D a v operabilnej väzbe pre riadenie expresie framgnetu nukleovej kyseliny podlá nároku 32, voliteľne sekvencii nukleovej kyseliny kódujúci vedúci peptid umožňujúci sekréciu alebo integráciu poplypeptidového fragmentu do membrány, fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 32 a voliteľne' terminátor.

   36. Vektor podľa ktoréhokoľvek z. nárokov 33 až 35, ktorý po zavedení do hostiteľskej bunky jé buď schopný integrácie do génomu hostiteľskej bunky alebo ktorý nie je schopný' integrácie do génomu hostiteľskej bunky.

   37. Vektor podľa nároku 35 alebo 36 v závislosti na nároku 35, kde promotor riadi expresiu v eukaryotickej bunke alebo riadi expresiu v prokaryotickej bunke.

   38. Transformovaná bunka nesúca vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 33 až 37, ako je napríklad transformovaná bunka, ktorá je schopná replikácie framgentu nukleovej kyseliny podľa nároku 32.

   39. Transformovaná bunka podľa nároku 38, čo je mikroooganizmus vybraný zo skupiny, ktorú tvoria baktérie, ako je napríklad rod baktérií Escherichia (výhodne E.coli}, Bacillus, Salmonella alebo Mycobacterium (výhodne nepatogénne Mycobacterium, ako je napríklad M. Bovis BCG), kvasinky, protozoa alebo bunky pochádzajúce z mnohobunečného organizmu vybraného zo skupiny, ktorú tvoria huby, hmyzie bunky, ako sú napríklad bunky S₂ alebo SF, rastlinné bunky a cicavčie bunky.

   40. Transformovaná bunka podľa nároku 38 alebo 39, ktorá exprimuje fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 32, ako je napríklad transformovaná bunka, ktorá sekretuje alebo nesie na svojom povrchu GDF-8 analóg podľa nároku 29.

   41. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 17, pričom prezentácie imunitnému systému je prevádzaná podávaním nepatogénneho mikroorganizmu alebo víru, ktorý nesie fragment nukleovej kyseliny, ktorý kóduje a exprimuje anallóg.

   42. Použitie podľa nároku 41, prčom vírus je nevirulentný víru kiahní, ako je napríklad vírus vakcínie alebo mikroorganizmus je baktéria, ako je napríklad baktéria definovaná v nároku 39.

   43. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 41 alebo 42, pričom nepatogénny mikroorganizmus alebo vírus je zvieraťu podávaný raz jedenkrát.

   44. Prípravok pre indukciu produkciu protilátok proti GDF-8 vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

   fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 32 alebo vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 33 až 37 a

   - farmaceutický a aimunologicky prijateľný nosič a/lebo vehikulum a/lebo adjuvans.

   45. Prípravok podľa nároku 44 vyznačujúci sa tým, že fragment nukleovej kyseliny je formulovaný podľa nároku 24 alebo 26.

   100

   46. Stabilná bunečná línia, ktorá nesie vektor podľa .ktoréhokoľvek z nárokov 33 až 37 a ktorá exprimuje fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 32 a ktorá voliteľne sekretuje alebo nesie na svojom povrchu GDF-8 analóg podľa nároku 29.

   47. Spôsob prípravy bunky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 38 až 40 vyznačujúci sa tým, že zahrňuje transformáciu hostiteľskej bunky fragmentom nukleovej kyseliny podľa nároku 32 alebo vektorom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 33 až 37.