ES2318654T3

ES2318654T3 - Composiciones inmunologicas para modular la miostatina en vertebrados.

Info

Publication number: ES2318654T3
Application number: ES06026306T
Authority: ES
Inventors: Christopher A. Barker; Mohamad Morsey
Original assignee: MetaMorphix International Inc
Current assignee: MetaMorphix International Inc
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2019-02-19
Also published as: AR019818A1; DK1056845T3; IL137831A0; DK1770162T3; CA2687533C; EP1770162A1; PT1056845E; ATE352619T1; DE69940230D1; US6369201B1; ATE419353T1; EP1056845B1; ZA991369B; DE69934970D1; AU765014B2; JP2002504326A; EP2018871A1; CY1108074T1; CY1108889T1; EP1770162B1

Abstract

Composición de vacuna que comprende un inmunoconjugado de miostatina que comprende un multímero de miostatina que comprende la fórmula general (MP-X-MP)y, en la que MP es un polipéptido de miostatina seleccionado de entre el grupo constituido por: a) aminoácidos 3-15 de SEC ID nº 6; b) aminoácidos 3-17 de SEC ID nº 8; c) aminoácidos 3-16 de SEC ID nº 10; d) aminoácidos 3-22 de SEC ID nº 16; e) aminoácidos 3-18 de SEC ID nº 18; f) aminoácidos 3-18 de SEC ID nº 20, y; g) aminoácidos 3-18 de SEC ID nº 22, X se selecciona de entre el grupo constituido por un enlace peptídico, un grupo espaciador aminoácido, y [MP] n, en el que n es mayor o igual a 1, e y es mayor o igual a 1; y en la que dicho multímero de miostatina está fusionado a un polipéptido de leucotoxina; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Description

Composiciones inmunológicas para modular la miostatina en vertebrados.

Campo técnico

Se describen composiciones para aumentar la síntesis de músculo y tratar enfermedades en vertebrados.

Más particularmente, se describen composiciones inmunológicas para reducir la actividad de la miostatina en vertebrados.

Antecedentes de la invención

Los productores de ganado han utilizado tradicionalmente programas de cría a efectos de seleccionar animales que proporcionen cantidades máximas de proteínas con un rendimiento aceptable, medido a través de la eficacia de alimentación, la función reproductiva y la salud general. En cierto número de razas, se ha observado ganado que exhibe una masa muscular aumentada debido a hipertrofia e hiperplasia de las células musculares. La incidencia de esta condición, designada "musculatura doble", es más pronunciada en el ganado de raza Belgian Blue. La masa muscular aumenta aproximadamente un 20%, y en estos animales se produce una disminución en la masa ósea y la masa grasa (Shahin y Berg, Can. J. Anim. Sci. (1985) 65:279-293). El ganado de tipo Belgian Blue también utiliza el alimento de forma eficiente y da lugar a un porcentaje más elevado de cortes deseables de carne (Casas y otros, J. Anim. Sci. (1997), 75 (Sup. 1): 149). En el ganado Belgian Blue, la musculatura doble es hereditaria, y se cree que es recesiva, ya que los heterocigotos pueden ser normales o presentar un discreto aumento de la masa muscular.

A pesar de las ventajas de esta condición, frecuentemente el ganado con musculatura doble presenta rasgos no deseables. Por ejemplo, debido a que los terneros son generalmente entre 10 y un 38% más pesados de lo normal, abundan las distocias, que requieren partos con cesárea. Estos animales, además, exhiben una reproducción anormal debido a tractos reproductivos pobremente desarrollados y presentan otras anormalidades anatómicas, tales como macroglosia. Otras razas de ganado, tal como la Piamontesa del norte de Italia, presentan diversos grados de musculatura doble y también presentan muchos de estos rasgos no deseables.

La característica de musculatura doble identificada en algunas razas de ganado se ha asociado a mutaciones en el gen de la miostatina (Grobet y otros, Nature Genetics (1997), 17:71-74; Kambadur y otros, Genome Research (1997) 7:910-915; McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. US nº (1997) 94:12457-12461). Esta mutación parece tener como consecuencia básicamente un aumento en el número de células musculares (hiperplasia) más que un aumento en el tamaño de las fibras musculares individuales (hipertrofia). También se ha identificado una condición designada hipertrofia muscular en la raza Pietrain de cerdo. Dicha condición no está relacionada con el gen de la miostatina, y ha sido identificada como una mutación en un gen responsable del transporte de calcio.

McPherron y otros, Nature (1997), 387:83-90, han identificado un miembro de la superfamilia de proteínas de factor \beta transformante (TGF-\beta) en los ratones, designado factor de crecimiento y diferenciación 8 (GDF-8). El GDF-8 actúa como regulador negativo para el crecimiento de músculo esquelético, y se expresa en los músculos esqueléticos en desarrollo y adultos. Los experimentos de "knockout" de genes en ratones han dado lugar a mutantes homocigóticos que son un 30% mayores que los ratones de tipo salvaje. Este aumento del tamaño se debe principalmente a un aumento de la masa muscular, pesando los músculos individuales de los mutantes de 2 a 3 veces más que los de ratones de tipo salvaje (McPherron y otros, Nature (1997), 387:83-90). McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. US nº (1997), 94:12457-12461 y Grobet y otros, Nature Genetics (1997), 17:71-74, evaluaron secuencias genómicas similares en una serie de especies, incluyendo el ganado, y dieron a conocer que el ganado de musculatura doble presentaba defectos en el gen que codificaba una proteína altamente homóloga al GDF-8. Actualmente, dicha proteína se designa miostatina.

De este modo, parece que la miostatina está producida por las células musculares y regula la proliferación y diferenciación de los mioblastos. En el ganado Belgian Blue y Piamontés, se cree que los defectos naturales en el gen da lugar a la producción de una proteína anormal o a una cantidad reducida de miostatina, lo que en ambos casos tiene el efecto de aumentar el crecimiento muscular.

El gen de la miostatina de una serie de especies de vertebrados, incluyendo el ratón, la rata, el humano, el babuino, el ganado, el cerdo, la oveja, el pollo, el pavo y el pez cebra, ha sido identificado y las proteínas han sido secuenciadas (McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. US nº (1997), 94:12457-12461). La secuencia de la proteína miostatina está altamente conservada en todas estas especies. De forma similar, se ha determinado la secuencia de nucleótidos para la miostatina de ratón, rata, humano, babuino, ganado, cerdo, oveja, pollo y pavo. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.827.733 para las secuencias de nucleótidos de la miostatina murina y humana; la publicación internacional WO 99/02667 para la secuencia de nucleótidos de la miostatina bovina; la publicación internacional WO 98/33887 para las secuencias de nucleótidos de la miostatina de rata, humana, de babuino, bovina, porcina, ovina, de pollo y de pavo.

La secuencia de nucleótidos del gen de la miostatina predice una proteína de aproximadamente 376 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 43 kDa. Esta proteína contiene una secuencia líder de secreción y un lugar de procesamiento proteolítico que libera un péptido de 13 kDa que contiene 9 residuos de cisteína. La miostatina clonada expresada en las células de ovario del hámster de China da lugar a dos proteínas. La primera tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 52 kDa, y la segunda de aproximadamente 15 kDa. En condiciones no reductoras, estas proteínas aparecen como dímeros con pesos moleculares de aproximadamente 101 kDa y 25 kDa (McPherron y otros, Nature (1997), 387:83-90).

Los investigadores han propuesto el suministro de genes de miostatina mutados a sujetos animales para la producción de especies transgénicas con un tejido muscular aumentado. Véase, por ejemplo, la publicación internacional WO 98/33887. Sin embargo, estos enfoques adolecen de diversos inconvenientes. Por ejemplo, debido a que el gen de la miostatina se vuelve activo durante el estadio embrionario, una producción reducida de miostatina provoca un desarrollo muscular excesivo en el útero. Así, es muy probable que los animales transgénicos que incluyen genes mutados requieran parto con cesárea, una carga considerable para los grandes productores de animales. Además, existe una oposición por parte de la opinión pública a los animales tratados mediante ingeniería genética para consumo humano, por lo que serían deseables otros métodos para producir dichos animales.

Otros enfoques incluyen la utilización de antígenos de miostatina para generar anticuerpos contra la miostatina: publicación internacional WO9902667. Aunque se han descrito algunos epítopes de miostatina (publicación internacional WO94/21681), existe una necesidad de proporcionar epítopes adecuados capaces de inducir un aumento en la masa muscular.

Exposición de la invención

La presente invención se refiere a determinadas composiciones inmunológicas para modular la actividad de la miostatina endógena en un vertebrado. Se pueden tratar una serie de condiciones de los vertebrados, incluyendo humanos y otros animales, tales como una variedad de desórdenes que provocan la degeneración o el deterioro de la musculatura. Debido a la naturaleza ubicua de la miostatina, las composiciones y métodos descritos en la presente memoria encuentran aplicación en una amplia variedad de vertebrados, tal como se describe a continuación.

Sorprendentemente, estos resultados se alcanzan mediante técnicas inmunológicas. Es conocido en la técnica que la inmunización contra las moléculas endógenas, tales como la miostatina, resulta problemática porque el sistema inmune no reconoce dichas moléculas "propias". De este modo, se da a conocer una solución a un problema que se encuentra normalmente cuando se inmuniza contra una sustancia endógena.

En las figuras 1A-1D (SEC ID nº 27-36) se dan a conocer polipéptidos de miostatina de diversos organismos.

Los péptidos de miostatina consisten en aproximadamente 3 a aproximadamente 200 aminoácidos y derivan de una región de miostatina seleccionada de entre el grupo constituido por la región de miostatina que recorre e incluye los aminoácidos 1 a 350, los aminoácidos 1 a 275, los aminoácidos 25 a 300, los aminoácidos 50 a 325 y los aminoácidos 75 a 350, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEC ID nº 27-36).

Un péptido de miostatina puede comprender la secuencia de aminoácidos Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEC ID nº 37), la secuencia de aminoácidos Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEC ID nº 38) o la secuencia de aminoácidos Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEC ID nº 39).

Un multímero de miostatina se puede construir uniendo dos o más inmunogenes de miostatina seleccionados, comprendiendo cada uno de los inmunogenes independientemente, por lo menos, 3 aminoácidos que definen, por lo menos, un epítope de miostatina. Cada uno de los inmunogenes de miostatina seleccionados consiste independientemente en aproximadamente 3 a 200 aminoácidos, o aproximadamente 3 a aproximadamente 100 aminoácidos, o aproximadamente 3 a aproximadamente 30 aminoácidos, o aproximadamente 3 a aproximadamente 15 aminoácidos. Cada uno de los inmunogenes de miostatina seleccionados en el multímero puede comprender independientemente un péptido de miostatina seleccionado, tal como se ha descrito anteriormente. El multímero puede comprender una molécula con unidades repetitivas según la fórmula general (MP-X-MP)y, en la que MP es un péptido de miostatina, X se selecciona entre el grupo que consiste en un enlace peptídico, un grupo espaciador aminoácido, un polipéptido de leucotoxina y [MP]_{n}, donde n es mayor o igual a 1 e y es mayor o igual a 1.

Se puede preparar un inmunoconjugado de miostatina enlazando, por lo menos, un péptido o multímero de miostatina, tal como se ha descrito anteriormente, a un portador inmunológico.

Se pueden preparar composiciones de vacuna que comprenden el péptido de miostatina, el multímero de miostatina y/o el inmunoconjugado de miostatina, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Se pueden obtener polinucleótidos que codifican los péptidos de miostatina, los multímeros de miostatina y los inmunoconjugados de miostatina anteriores, así como vectores recombinantes que comprenden los polinucleótidos, células huésped transformadas con los vectores recombinantes, y métodos para preparar de forma recombinante péptidos de miostatina, multímeros de miostatina e inmunoconjugados de miostatina.

La presente invención aborda el problema de provocar una respuesta inmune contra un inmunogen de miostatina en un vertebrado a efectos de reducir la actividad de la miostatina endógena en dicho vertebrado y obtener, por lo menos, uno de los siguientes efectos biológicos:

(a) un aumento del peso corporal;

(b) un aumento de la masa muscular;

(c) un aumento del número de células musculares;

(d) un aumento en el tamaño de las células musculares;

(e) una reducción en el contenido graso corporal;

(f) un aumento de la fuerza muscular;

(g) un aumento del tejido de las glándulas mamarias;

(h) un aumento de lactancia;

(i) un aumento del apetito o de la ingesta de alimento; o

(j) un aumento de los años de vida del vertebrado.

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Estos efectos son efectos deseables, útiles para tratar un desorden que comprende la degeneración o el deterioro de la musculatura en un vertebrado.

Estos efectos se pueden alcanzar administrando composiciones de vacuna adecuadas o polinucleótidos al sujeto.

La presente invención da a conocer una composición adecuada de este tipo. La presente invención da a conocer un conjugado de un multímero de miostatina enlazado a un polipéptido de leucotoxina, en el que el multímero presenta la fórmula general (MP-X-MP)_{y}, tal como se ha definido anteriormente, y MP se selecciona entre los aminoácidos 3-15, inclusive, de la SEC ID nº 6; los aminoácidos 3-17, inclusive, de la SEC ID nº 8; los aminoácidos 3-16, inclusive, de la SEC ID nº 10; los aminoácidos 3-22, inclusive, de la SEC ID nº 12; los aminoácidos 3-25, inclusive, de la SEC ID nº 14; los aminoácidos 3- 22, inclusive, de la SEC ID nº 16; los aminoácidos 3-18, inclusive, de la SEC ID nº 20; y los aminoácidos 3-18, inclusive, de la SEC ID nº 22.

En las reivindicaciones 2-16 se exponen las formas de realización preferidas de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-1D muestran una comparación de la miostatina derivada de diversas especies, tal como sigue: ratón (SEC ID nº 27); rata (SEC ID nº 28); humano (SEC ID nº 29); babuino (SEC ID nº 30); bovino (SEC ID nº 31); porcino (SEC ID nº 32); ovino (SEC ID nº 33); pollo (SEC ID nº 34); pavo (SEC ID nº 35); y pez cebra (SEC ID nº 36). Los aminoácidos se enumeran a derecha e izquierda de las secuencias.

La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 3) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 4) del péptido MYOS 1. MYOS 1 incluye el lugar de disociación proteolítica, Arg-Ser-Arg-Arg, y el extremo N-terminal de la proteína activa.

La figura 3 representa la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 5) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 6) del péptido MYOS 3.

La figura 4 representa la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 7) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 8) del péptido MYOS 5.

La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 9) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 10) del péptido MYOS 7.

La figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 11) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 12) del péptido MYOS 9.

La figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 13) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 14) el péptido MYOS 11.

La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 15) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 16) del péptido MYOS 13.

La figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 17) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 18) del péptido MYOS 15.

La figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 19) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 20) del péptido MYOS 17.

La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 21) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 22) del péptido MYOS 19. MYOS 19 incluye el lugar de disociación proteolítica, Arg-Ser-Arg-Arg.

La figura 12 muestra la posición aproximada de los péptidos MYOS 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 dentro de la secuencia de miostatina.

La figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 23) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 24) para una región activa de la miostatina reconstruida que contiene tres conjuntos de dos linkers aminoácidos (Arg-Ser) insertados en la secuencia en las posiciones nucleótidas 55-60, 139-144 y 241-246, y en el extremo C-terminal.

La figura 14 es un diagrama del plásmido pCB150, que codifica un polipéptido portador de leucotoxina y se utiliza para crear vectores de expresión de miostatina, tal como se describe en los ejemplos.

Las figuras 15A-15D muestran la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 25) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 26) del polipéptido portador de leucotoxina presente en el plásmido pCB150. Las oligo repeticiones de la miostatina se insertan en el lugar de BamH1 presente en la posición de nucleótido 3334.

La figura 16A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 1) y la figura 16B muestra la secuencia de aminoácidos predecida (SEC ID nº 2) de una miostatina representativa para su utilización con la presente invención. El lugar de disociación proteolítica se encuentra en las posiciones 263-266 de la figura 16B. La región activa de miostatina del polipéptido abarca los aminoácidos 264-375.

La figura 17 muestra un perfil de hidrofilia de la proteína de miostatina. Dicho perfil se calculó utilizando una longitud de grupo promedio de seis aminoácidos. Los tres puntos más altos de hidrofilia se encuentran en las posiciones de aminoácidos 263-268, que abarcan el lugar de disociación proteolítica; las posiciones 31-37; y las posiciones 106-111.

La figura 18 muestra la cantidad de peso ganada en animales tratados con inmunogenes de péptidos de miostatina, tal como se describe en los ejemplos.

Descripción detallada

A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención utilizará técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, virología, tecnología de ADN recombinante e inmunología, conocidas en la técnica. Dichas técnicas están descritas con todo detalle en la biografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning, Vols. I y II (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific
Publications).

A. Definiciones

En la descripción de la presente invención, se utilizan los siguientes términos, que se definen tal como se indica a continuación.

La expresión "inmunogen de miostatina" se refiere a un polipéptido derivado de una molécula de miostatina que desencadena una respuesta inmunológica tal como se define a continuación. El término incluye moléculas que desencadenan una respuesta inmunológica sin ningún portador inmunológico, adyuvante o inmunoestimulante asociados, así como polipéptidos de miostatina capaces de volverse inmunogénicos, o más inmunogénicos, mediante la asociación con una molécula portadora, un adyuvante o un inmunoestimulante, o por mutación de una secuencia nativa, y/o mediante la incorporación a una molécula que contiene múltiples unidades repetitivas, por lo menos, de un epítope de una molécula de miostatina. El término se puede utilizar para referirse a una macromolécula individual o a una población homogénea o heterogénea de macromoléculas antigénicas derivadas de la miostatina.

Un inmunogen de miostatina puede ser derivado de cualquiera de las diversas secuencias de miostatina conocidas, incluyendo, sin limitación, los polipéptidos de miostatina derivados del ratón, la rata, el humano, el babuino, el ganado, el cerdo, la oveja, el pollo, el pavo y el pez cebra (véase McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. US nº (1997) 94:12457-12461). La secuencia proteica de la miostatina se conserva en un grado muy elevado a lo largo de todas estas especies (véase figuras 1A-1D).

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "inmunogen de miostatina" incluye también una molécula derivada de una secuencia de miostatina nativa, así como polipéptidos de miostatina producidos recombinantemente o sintetizados químicamente, incluyendo la secuencia de referencia de miostatina de longitud completa, así como péptidos de miostatina que permanecen inmunogénicos, tal como se describe a continuación.

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Un "péptido de miostatina" es un inmunogen de miostatina, tal como se describe en la presente memoria, que incluye menos que la longitud completa de la molécula de miostatina de referencia en cuestión, y que incluye, por lo menos, un epítope tal como se define a continuación. De este modo, una composición de vacuna que comprende un péptido de miostatina incluiría una parte de la molécula de longitud completa, pero no toda la molécula de miostatina en cuestión.

La expresión "multímero de miostatina" se refiere a una molécula que presenta más de una copia de un inmunogen de miostatina, un péptido o un epítope de miostatina seleccionado, o múltiples repeticiones en tándem de un inmunogen de miostatina, un péptido o un epítope de miostatina seleccionado. El multímero de miostatina según la presente invención corresponde a una molécula tal como se describe en la reivindicación 1.

En consecuencia, Y puede definir 1-40 o más unidades repetitivas, más preferentemente 1-30 unidades repetitivas, y de la forma más preferente 1-20 unidades repetitivas.

Adicionalmente, si los péptidos de miostatina están enlazados química o recombinantemente a un portador, los péptidos de miostatina pueden estar enlazados al extremo 5', al extremo 3', o pueden flanquear al portador en cuestión. Además, el multímero de miostatina puede estar situado en lugares internos del portador. Los multímeros de miostatina se describen con mayor detalle a continuación.

Una "respuesta inmunológica" a un inmunogen o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos al inmunogen o vacuna de interés. Habitualmente, dicha respuesta incluye, aunque sin limitarse a los mismos, uno o más de los siguientes efectos: producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxicas y/o células T \gamma\delta, dirigidos específicamente a un inmunogen o inmunogenes incluidos en una composición o vacuna de interés. Una respuesta inmunológica se puede detectar mediante cualquiera de los diversos ensayos bien conocidos en la técnica, tales como inmunoensayos estándar y ensayos de neutralización, incluyendo "Western blot", "dot blot" y ensayos de inmunoafinidad. La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células se puede determinar mediante ensayos de células citotóxicas CTL, bien conocidos en la técnica, tal como el ensayo descrito en Erickson y otros, J. Immunol. (1993), 151:4189-4199; y Doe y otros Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376.

Un "epítope" se refiere a cualquier parte o región de una molécula con la capacidad o potencial de desencadenar un anticuerpo específico a la miostatina y combinarse con el mismo. Para el propósito de la presente invención, un epítope de polipéptido habitualmente incluye, por lo menos, aproximadamente 3 aminoácidos, preferentemente, por lo menos, aproximadamente 5 aminoácidos, y de la forma más preferente, por lo menos, aproximadamente de 10-15 aminoácidos a 20-30 o más aminoácidos, de la molécula de referencia. No existe ningún límite superior crítico para la longitud del fragmento, que puede comprender prácticamente la longitud completa de una secuencia proteica, o incluso una proteína de fusión que comprende dos o más epítopes de la proteína en cuestión.

Los epítopes presentes en las moléculas de polipéptidos se pueden identificar utilizando cualquier técnica de mapeo de epítopes, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, en Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Los epítopes lineales se pueden determinar, por ejemplo, sintetizando simultáneamente grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo dichos péptidos a partes de la molécula proteínica, y haciendo reaccionar dichos péptidos con anticuerpos mientras dichos péptidos permanecen todavía enlazados a los soportes. Estas técnicas son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, en la patente US nº 4.708.871; Geysen y otros (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. US nº 81: 3998-4002; Geysen y otros (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. De forma similar, los epítopes conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de los aminoácidos, tal como, por ejemplo, por cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Los programas informáticos que formulan escalas de hidropatía a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína, que utilizan las propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas de cada uno de los 20 aminoácidos, tal como se describen, por ejemplo, en Kyte y otros, J. Mol. Biol. (1982), 157:105-132; y Hopp y Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. US nº (1981), 78:3824-3828, también se pueden utilizar para determinar las partes antigénicas de una determinada molécula. Por ejemplo, la técnica de Hopp y Woods asigna a cada aminoácido un valor numérico de hidrofilia y a continuación promedia repetitivamente estos valores a lo largo de la cadena peptídica. Los puntos con hidrofilias promedio locales más elevadas indican partes antigénicas de la molécula.

La expresión "portador inmunológico" se refiere a cualquier molécula que, al asociarse con un inmunogen de miostatina de interés, confiere inmunogenicidad a dicha molécula o la aumenta. Ejemplos de portadores adecuados incluyen macromoléculas grandes y de metabolización lenta, tales como: proteínas; polisacáridos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa, gránulos de celulosa y similares; aminoácidos poliméricos, tales como ácido poliglutámico, polilisina y similares; copolímeros de aminoácidos; partículas víricas inactivas; toxinas bacterianas, tales como toxoides de difteria, tétanos, cólera, moléculas de leucotoxina y similares. Los portadores se describen con mayor detalle a continuación.

Un inmunogen de miostatina está "enlazado" a una molécula portadora especificada cuando dicho inmunogen está acoplado químicamente o asociado con dicho portador, o cuando el inmunogen es expresado por una molécula de ADN quimérica que codifica el inmunogen y el portador de interés.

Un "inmunoconjugado" es un inmunogen de miostatina, tal como un péptido o multímero de miostatina, que está enlazado a una molécula portadora, tal como se ha definido anteriormente.

La expresión "polipéptido de leucotoxina" o "polipéptido LKT" se refiere a un polipéptido derivado de una proteína perteneciente a la familia de moléculas caracterizada por la secuencia de aminoácidos según el consenso carboxi-terminal Gly-Gly-X-Gly-X-Asp (Highlander y otros (1989), DNA 8:15-28), en la que X es Lys, Asp, Val o Asn. Dichas proteínas incluyen, entre otros, leucotoxinas derivadas de P. haemolytica y Actinobacillus pleuropneumoniae, así como hemolisina de E. colialpha, en Strathdee y otros (1987), Infect. Immun. 55:3233-3236; Lo (1990), Can. J. Vet. Res. 54:S33-S35; Welch (1991), Mol. Microbiol. 5:521-528. Esta familia de toxinas se conoce como familia "RTX" de toxinas (Lo (1990), Can. J. Vet. Res. 54:S33-S35). Además, el término "polipéptido de leucotoxina" se refiere a un polipéptido de leucotoxina que se sintetiza químicamente, se aísla en un organismo que lo expresa, o se produce recombinantemente. Además, el término incluye una proteína inmunogénica con una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a una secuencia de aminoácidos contigua que se encuentra en la molécula de leucotoxina nativa particular. Así, el término incluye tanto secuenciales de longitud completa como parciales, así como análogos. Aunque las leucotoxinas nativas de longitud completa exhiben actividad citotóxica, el término "leucotoxina" también incluye moléculas que permanecen inmunogénicas pero están desprovistas del carácter citotóxico de las leucotoxinas nativas. Las secuencias de nucleótidos y las correspondientes secuencias de aminoácidos para diversas leucotoxinas son conocidas. Véase, por ejemplo, las patentes US nº 4.957.739 y 5.055.400; Lo y otros (1985), Infect. Immun. 50:667-67; Lo y otros (1987), Infect. Immun. 55:1987-1996; Strathdee y otros (1987), Infect. Immun. 55:3233-3236; Highlander y otros (1989), DNA 8:15-28; y Welch (1991), Mol. Microbiol. 5:521-528. En formas de realización preferidas de la invención, se disponen quimeras de leucotoxina que presentan una secuencia de polipéptidos de leucotoxina seleccionada que confiere una inmunogenicidad aumentada a uno o más multímeros de miostatina fundidos con las mismas.

Ejemplos particulares de polipéptidos de leucotoxina inmunogénicos para su utilización en la presente invención son las moléculas truncadas de leucotoxina descritas en las patentes US nº 5.476.657 y 5.837.268. Estas moléculas truncadas incluyen LKT 352, LKT 111 y LKT 114. LKT 352 se deriva del gen IktA presente en el plásmido pAA352 (Número de acceso ATCC 68283). La secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos de dicho gen se describen en la patente US nº 5.476.657. El gen codifica una leucotoxina truncada que presenta 914 aminoácidos y un peso molecular estimado de aproximadamente 99 kDa. LKT 111 es un polipéptido de leucotoxina derivado del gen IktA presente en el plásmido pCB111 (Número de acceso ATCC 69748). La secuencia de nucleótidos de dicho gen y la correspondiente secuencia de aminoácidos se dan a conocer en la patente US nº 5.837.268. Dicho gen codifica una versión acortada de la leucotoxina desarrollada a partir del gen recombinante de leucotoxina presente en el plásmido pAA352 (Número de acceso ATCC 68283) mediante la eliminación de un fragmento interno de ADN de aproximadamente 1.300 bp de longitud. El polipéptido LKT 111 presenta un peso molecular estimado de 52 kDa (en contraste con el polipéptido LKT 352, de 99 kDa), pero conserva partes del terminal N de LKT 352 que contiene epítopes de células T necesarias para una suficiente inmunogenicidad de las células T, y partes del terminal C de LKT 352 que contienen lugares de restricción convenientes para su utilización en la preparación de proteínas de fusión para su utilización en la presente invención. LKT 114 se deriva del gen presente en el plásmido pAA114 (descrito en la patente US nº 5.837.268) y se muestra en las figuras 15A-15D de la presente memoria. LKT 114 difiere de LKT 111 por una supresión adicional de un aminoácido de la parte interna de la molécula.

El término "adyuvantes" se refiere a agentes que actúan de un modo no específico para incrementar una respuesta inmune a un antígeno particular, reduciendo de este modo la cantidad de antígeno necesaria en una determinada vacuna, y/o la frecuencia de inyección necesaria para generar una respuesta inmune adecuada al antígeno de interés. Véase, por ejemplo, A.C. Allison, J. Reticuloendothel. Soc. (1979), 26:619-630.

Proteínas, polipéptidos o péptidos "nativos" son proteínas, polipéptidos o péptidos aislados a partir de la fuente en la que dichas proteínas están presentes de forma natural. El término polipéptidos "recombinantes" se refiere a polipéptidos preparados mediante técnicas de ADN recombinante; es decir, preparadas a partir de células transformadas mediante un constructo de ADN exógeno que codifica el polipéptido deseado. Los polipéptidos "sintéticos" son los que se preparan por síntesis química.

El término "polinucleótido" se refiere a una secuencia de nucleótidos, incluyendo, aunque sin limitarse a las mismas, secuencias de ARN tales como ARNm, ADNc, ADN genómico, e incluso secuencias de ADN sintético. El término también comprende secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN.

Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, un fago o un cósmido, al que puede estar unido otro segmento de ADN, de tal modo que se produzca la replicación del segmento unido.

Una "secuencia codificadora" de ADN o una "secuencia que codifica" una proteína en particular es una secuencia de ADN que se transcribe y se traduce en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de elementos reguladores apropiados. Los límites de la secuencia codificadora están determinados por un codón de inicio en el terminal 5' y un codón de finalización de traducción en el terminal 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, aunque sin limitarse a las mismas, secuencias procariotas, ADNc procedente de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico procedente de ADN eucariota (por ejemplo, de mamíferos), e incluso secuencias de ADN sintético. Generalmente, una secuencia de terminación de transcripción estará situada en la posición 3' con respecto a la secuencia codificadora.

El término "elementos de control" de ADN se refiere colectivamente a promotores, lugares de enlace de ribosomas, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de transcripción, dominios reguladores en dirección ascendente, mejoradores, y similares, que colectivamente facilitan la transcripción y traducción de una secuencia codificadora en una célula huésped. No siempre todas estas secuencias de control deben estar presentes en un vector recombinante, siempre y cuando el gen deseado sea capaz de ser transcrito y traducido.

El término "enlazado operativamente" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes descritos de este modo están configurados a efectos de llevar a cabo su función habitual. Así, los elementos de control enlazados operativamente a una secuencia codificadora son capaces de llevar a cabo la expresión de la secuencia codificadora. Los elementos de control no deben ser necesariamente contiguos a la secuencia codificadora, siempre y cuando funcionen a efectos de dirigir la expresión de la misma. Así, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias involucradas no traducidas aunque sí transcritas entre un promotor y la secuencia codificadora, y dicho promotor puede seguirse considerando "enlazado operativamente" a la secuencia codificadora.

Un elemento de control, tal como un promotor, "dirige la transcripción" de una secuencia codificadora en una célula cuando la ARN polimerasa se enlaza a dicho promotor y transcribe la secuencia codificadora en ARNm, que a continuación se traduce en el polipéptido codificado por la secuencia codificadora.

Una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada, o es capaz de sufrir una transformación, por una molécula de ácido nucleico exógeno.

Una célula ha sido "transformada" por ADN exógeno cuando dicho ADN exógeno ha sido introducido en el interior de la membrana celular. El ADN exógeno puede estar o no integrado (enlazado covalentemente) en el ADN cromosómico que constituye el genoma de la célula. En organismos procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno se puede mantener en un elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a células eucariotas, una célula establemente transformada es aquella en la que el ADN exógeno se ha integrado en el cromosoma, de tal modo que es heredado por parte de las células hijas a través de la replicación del mismo. Esta estabilidad viene demostrada por la capacidad de la célula eucariota de establecer líneas celulares o clones comprendidos por una población de células hijas que contienen el ADN exógeno.

La expresión "derivado de", tal como se utiliza en la presente memoria, indica una fuente u origen real o teórico de la molécula sujeto o inmunogen. Por ejemplo, un inmunogen que es "derivado de" una molécula de miostatina particular guardará una estrecha similitud de secuencia con una parte relevante de la molécula de referencia. Así, un inmunogen que es "derivado de" una molécula de miostatina particular puede incluir toda la secuencia de miostatina de tipo salvaje, o puede ser modificado por inserción, eliminación o sustitución de residuos aminoácidos, siempre y cuando la secuencia derivada proporcione un inmunogen que se corresponda con la molécula de miostatina objetivo. Los inmuno-
genes derivados de una determinada molécula contendrán, por lo menos, un epítope específico a dicha molécula.

El término "vertebrado" se refiere a cualquier miembro de los subfilos de Chordata, incluyendo sin limitación mamíferos, tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras, caballos y humanos; animales domésticos, tales como perros y gatos; y pájaros, incluyendo pájaros domésticos, salvajes y aves de caza, incluyendo machos y hembras tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas; y peces. El término no indica ninguna edad ni sexo particular. En consecuencia, se pretenden cubrir animales adultos machos y hembras, animales recién nacidos, así como fetos y huevos.

Las composiciones servirán para "reducir la actividad de la miostatina". Esta reducción de la actividad puede ser una reducción de los niveles de miostatina en circulación habituales en un vertebrado, o una reducción de los niveles de miostatina en circulación en sujetos con desórdenes que conllevan niveles elevados en circulación de miostatina. Habitualmente, la reducción de la actividad de la miostatina es producto de la inactivación de la miostatina en circulación por parte de anticuerpos generados contra el inmunogen de péptido de miostatina suministrado al sujeto en cuestión. Sin embargo, la reducción de la actividad no se limita a un modo particular de inactivación, sino que puede ser el resultado de una producción o secreción reducida de miostatina al sistema circulatorio. Sin limitarse a ninguna teoría en particular, los inmunogenes de péptido de miostatina pueden desencadenar la producción de anticuerpos que impiden que la miostatina se disocie para liberar la parte activa de la proteína, o impiden que la proteína se enlace a su receptor. Alternativamente, los anticuerpos pueden extraer la miostatina secretada del sistema circulatorio o de otros fluidos corporales antes de que alcance el lugar activo.

La reducción de la actividad de la miostatina se puede manifestar de diversas maneras. Por ejemplo, la reducción de la actividad de la miostatina puede provocar un incremento del peso corporal, un aumento de la masa muscular, un aumento de la fuerza muscular, una modificación en la relación masa muscular/grasas, un aumento de la masa muscular libre de grasas, un aumento del tamaño y/o número de células musculares, una reducción del contenido en grasas del cuerpo, un aumento de los años de vida en un vertebrado normal o enfermo, un aumento del apetito o de la ingesta de alimentos, una mejora de la calidad de vida y, en los mamíferos, un aumento del tejido de las glándulas mamarias y de la lactancia.

La expresión "aumento de la masa muscular" se refiere a que el animal al que se administra una composición según la presente invención muestra un aumento en el tamaño de las células musculares (hipertrofia) o en el número de células musculares (hiperplasia). Dicho aumento se puede producir en las fibras musculares de tipo 1 y/o de tipo 2. El término "músculo", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir los tipos de tejido análogos en los peces. Los métodos para determinar el "aumento de la masa muscular" son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede medir el contenido muscular antes y después de la administración de un péptido de miostatina según la presente invención utilizando técnicas estándar, tales como pesado subacuático (véase Bhasin y otros, New Eng. J. Med. (1996), 335:1-7) y absorciometría de energía dual de rayos X (véase, por ejemplo, Bhasin y otros, Mol. Endocrinol. (1998), 83:3155-3162). El aumento del tamaño muscular se puede poner de manifiesto mediante una ganancia de peso, por lo menos, de aproximadamente el 5-10%, preferentemente, por lo menos, de aproximadamente el 10-20% o más.

B. Métodos generales

Se han desarrollado composiciones inmunológicas para modular la producción de miostatina endógena en un vertebrado. Aunque generalmente la miostatina se reconoce como "propia" y, en consecuencia, no es inmunogénica, las composiciones descritas en la presente memoria, sorprendentemente, proporcionan un medio para producir una respuesta inmunológica en un sujeto inmunizado contra la misma.

En consecuencia, la presente invención se dirige a multímeros de miostatina inmunogénica tal como se describen en las reivindicaciones 1-16 para su utilización en la generación de una respuesta inmune en un vertebrado. Dado que la proteína miostatina se secreta, la inmunización activa o pasiva de los animales jóvenes sirve para aumentar la masa muscular, pero evita los problemas asociados con otras anormalidades que surgen de los cambios inducidos durante el periodo embrionario. Así, por ejemplo, los calendarios de vacunación se pueden iniciar poco después del nacimiento a efectos de alcanzar la hipertrofia y/o la hiperplasia. Alternativamente, la inmunización se puede llevar a cabo en un estadio posterior del desarrollo (por ejemplo, en el ganado en cebaderos) a efectos de mejorar el rendimiento en proteína muscular. Adicionalmente, la inmunización se puede llevar a cabo de forma prenatal o en animales in útero a efectos de alcanzar los resultados deseados.

Las composiciones y técnicas descritas en la presente memoria son igualmente aplicables a vertebrados ovíparos, tales como pájaros y peces. A este respecto, McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. US nº (1997), 94:12457-12461, han identificado genes de la miostatina en pájaros y peces que son altamente homólogos a los genes de la miostatina en mamíferos. En consecuencia, el gen se conserva a través de las especies y se cree que cumple una función similar en todas ellas. Así, por ejemplo, los pájaros y peces ovíparos se inmunizan a efectos de crear títulos de anticuerpos en el plasma materno. Dado que los anticuerpos se transfieren a la bolsa de yema del huevo, dichos anticuerpos son capaces de reducir la miostatina durante el periodo embrionario y provocar el aumento deseado de tamaño y/o número de células musculares. Alternativamente, la inmunización se puede llevar a cabo in ovo.

Además, las vacunas descritas en la presente memoria encuentran aplicación en el tratamiento de diversos desórdenes en humanos y otros animales que provocan, primariamente o de forma incidental, una pérdida de la musculatura. Por ejemplo, la atrofia muscular constituye un grave problema en el caso de parapléjicos y cuadriplégicos. Frecuentemente, la falta de fuerza muscular constituye una seria limitación a una vida activa y saludable en sujetos de edad avanzada. Además, la pérdida de musculatura se puede deber a diversos cánceres, anorexia, cachexia, SIDA y desórdenes similares. Además, la pérdida de musculatura es un síntoma de diversas distrofias, tales como distrofias musculares pseudohipertróficas, distrofias facioescapulohumerales, distrofias musculares de cinturas, distrofias musculares distales, miopatías oculares y distrofias miotónicas. Estas enfermedades incluyen los desórdenes conocidos como distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Dejerine-Landouzy, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Landouzy, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular de Erb, distrofia muscular de Fukuyama, distrofia muscular de Gower, distrofia muscular neuroaxonal infantil, distrofia muscular de Leyden-Möblus, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular pelvifemoral, distrofia muscular progresiva, distrofia muscular escapulohumeral, y distrofia muscular de Simmerlin.

La inmunización se puede alcanzar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitarse a los mismos, la utilización de vacunas peptídicas o inmunización por ADN. Dichos métodos se describen con detalle a continuación.

1. Péptidos de miostatina

Generalmente, los péptidos de miostatina incluyen, por lo menos, de aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 200 aminoácidos, preferentemente, por lo menos, de aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, más preferentemente, por lo menos, de aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, aún más preferentemente, por lo menos, de aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 30 aminoácidos, preferentemente de aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 15 aminoácidos, y de la forma más preferente, por lo menos, de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos o de 5 a aproximadamente 15 aminoácidos, de una proteína de miostatina seleccionada.

En las figuras 1A-1D, se muestran proteínas de miostatina representativas de 10 especies, de las que se pueden derivar los péptidos de miostatina. La secuencia de aminoácidos de la miostatina bovina también se muestra en la figura 16B. El péptido incluye, por lo menos, un epítope que confiere inmunogenicidad a la molécula de miostatina. Los ejemplos de péptidos de miostatina incluyen, aunque sin limitarse a los mismos, la región que comprende los aminoácidos 1 a 350, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEQ ID NOS:27-36); la región de miostatina que comprende los aminoácidos 1 a 275, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEC ID nº 27-36); la región de miostatina que comprende los aminoácidos 25 a 300, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEC ID nº 27-36); la región de miostatina que comprende los aminoácidos 50 a 325, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEC ID nº 27-36); la región de miostatina que comprende los aminoácidos 75 a 350, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEC ID nº 27-36); la región de miostatina que comprende los aminoácidos 45 a 376, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEC ID nº 27-36); 100 a 376, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEC ID nº 27-36); la región de miostatina que comprende los aminoácidos 235 a 376, inclusive, de las figuras 1A-1D (SEC ID nº 27-36); o de cualquier región que se crea que incluye un epítope de miostatina capaz de desencadenar una respuesta inmune en un sujeto al que se suministra el péptido.

Los péptidos de miostatina se pueden derivar de una o tres regiones de miostatina que exhiben los puntos más elevados de hidrofilia en el perfil de hidrofilia mostrado en la figura 17. Los tres puntos más altos de hidrofilia se encuentran en las posiciones de aminoácidos 263-268, que cubre el lugar de disociación proteolítica; las posiciones 31-37; y las posiciones 106-111. Así, el péptido de miostatina comprende la secuencia de aminoácidos Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEC ID nº 37), que comprende el lugar de disociación proteolítica; la secuencia de aminoácidos Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEC ID nº 38), que corresponde a los aminoácidos 31-37 de la miostatina; o la secuencia de aminoácidos Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEC ID nº 39), que corresponde a los aminoácidos 106 a 111 de la miostatina.

También se describe un péptido de miostatina que presenta, por lo menos, aproximadamente 75% de identidad de aminoácidos con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 3-18, inclusive, de la SEC ID nº 4 (MYOS 1, mostrado en la figura 2); los aminoácidos 3-15, inclusive, de la SEC ID nº 6 (MYOS 3, mostrado en la figura 3); los aminoácidos 3-17, inclusive, de SEC ID nº 8 (MYOS 5, mostrado en la figura 4); los aminoácidos 3-16, inclusive, de la SEC ID nº 10 (MYOS 7, mostrado en la figura 5); los aminoácidos 3-22, inclusive, de la SEC ID nº 12 (MYOS 9, mostrado en la figura 6); los aminoácidos 3-25, inclusive, de la SEC ID nº 14 (MYOS 11, mostrado en la figura 7); los aminoácidos 3-22, inclusive, de la SEC ID nº 16 (MYOS 13, mostrado en la figura 8); los aminoácidos 3-19, inclusive, de SEC ID nº 18 (MYOS 15, mostrado en la figura 9); los aminoácidos 3-18, inclusive, de SEC ID nº 20 (MYOS 17, mostrado en la figura 10); o los aminoácidos 3-18, inclusive, de la SEC ID nº 22 (MYOS 19, mostrado en la figura 11). Las posiciones de los diversos péptidos de MYOS en relación con la miostatina de longitud completa se muestra en la figura 12. Algunos de estos últimos péptidos forman la base de la presente invención.

El péptido de miostatina se puede enlazar a una molécula portadora inmunológica a efectos de formar un inmunoconjugado de miostatina, tal como se describe a continuación.

Según formas de realización preferidas de la presente invención, el péptido de miostatina es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3-16.

2. Inmunoconjugados de miostatina

Tal como se ha explicado anteriormente, la miostatina es una molécula endógena y, como tal, puede ser deseable aumentar adicionalmente la inmunogenicidad del péptido de miostatina (o de los multímeros descritos a continuación) enlazándolo a un portador a efectos de formar un inmunoconjugado de miostatina. Esto resulta especialmente necesario si el inmunogen de miostatina se administra a la misma especie de la que se deriva.

Los portadores adecuados son generalmente polipéptidos que incluyen regiones antigénicas de una proteína derivada de un material infeccioso, tal como una proteína de superficie vírica, o una secuencia peptídica portadora. Estos portadores sirven para estimular de forma no específica la actividad de las células T auxiliares y para ayudar a dirigir un inmunogen de interés a las células presentadoras de antígeno (APC) para el procesamiento y la presentación en la superficie celular en asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

Se han desarrollado diversos sistemas portadores con este propósito. Por ejemplo, con frecuencia se acoplan pequeños haptenos peptídicos a portadores proteínicos, tales como hemocianina de lapa californiana ("keyhole limpet") (Bittle y otros (1982), Nature 298:30-33), toxinas bacterianas, tales como el toxoide del tétanos (Muller y otros (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:569-573), ovoalbúmina, polipéptidos de leucotoxinas y mioglobina de esperma de ballena, a efectos de producir una respuesta inmune. Típicamente, estas reacciones de acoplamiento tienen como resultado la incorporación de diversos moles de hapteno peptídico por mol de proteína portadora.

Otros portadores adecuados incluyen polipéptidos VP6 de rotavirus, o fragmentos funcionales de los mismos, tal como se da a conocer en la patente US nº 5.071.651. También resulta útil un producto de fusión de una proteína viral y uno o más epítopes de miostatina, preparándose dichos productos de fusión mediante los métodos dados a conocer en la patente US nº 4.722.840. Otros portadores adecuados incluyen células, tales como linfocitos, ya que esta forma de presentación imita el modo natural de presentación en el sujeto, lo que da lugar al estado inmunizado. Alternativamente, los inmunogenes de miostatina pueden estar acoplados a eritrocitos, preferentemente los eritrocitos del propio sujeto. Los expertos en la materia conocen métodos de acoplamiento de péptidos a proteínas o células.

Los sistemas de suministro también pueden utilizar portadores particulados. Por ejemplo, se han utilizado partículas preformadas como plataformas sobre las que se pueden acoplar e incorporar inmunogenes. También se conocen en la técnica sistemas basados en proteosomas (Lowell y otros (1988), Science 240:800-802) y complejos estimuladores del sistema (Morein y otros (1984), Nature 308:457-460).

También se pueden utilizar sistemas portadores que utilizan proteínas quiméricas producidas recombinantemente que se autoensamblan en partículas. Por ejemplo, el retrotransposón de levadura, Ty, codifica una serie de proteínas que se agregan formando partículas parecidas a virus (Ty-VLPs; Kingsman y otros (1988), Vaccines 6:304-306). De este modo, un gel o fragmento del mismo que codifica el inmunogen de miostatina de interés, se puede introducir en el gen TyA y ser expresado en la levadura como una proteína de fusión. Dicha proteína de fusión mantiene la capacidad de autoensamblarse en partículas de tamaño uniforme. Otros sistemas portadores útiles parecidos a virus se basan en HBsAg, (Valenzuela y otros (1985), Biol Technol. 3:323-326; patente US nº 4.722.840; Delpeyroux y otros (1986), Science 233:472-475), antígeno de núcleo de Hepatitis B (Clarke y otros (1988), Vaccines 88 (ed. H. Ginsberg, y otros), págs. 127-131), poliovirus (Burke y otros (1988), Nature 332:81-82), y virus del mosaico del tabaco (Haynes y otros (1986), Biol Technol. 4:637-641).

Los portadores particularmente preferentes incluyen albúminas de suero, hemocianina de lapa californiana, ovoalbúmina, mioglobina de esperma de ballena, moléculas de leucotoxina tal como se han descrito anteriormente, y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la materia. Un polipéptido de leucotoxina específico, para su utilización como portador de la presente invención, se muestra en las figuras 15A-15D. La miostatina se introduce convenientemente en el lugar BamH1, presente en la posición de nucleótido 3334, tal como se describe posteriormente en los ejemplos.

Los portadores proteínicos se pueden utilizar en su forma nativa o su contenido en grupos funcionales se puede modificar, por ejemplo, por succinilación de residuos de lisina o por reacción con cis-tiolactona. También se puede incorporar un grupo sulfhidrilo al portador (o antígeno), por ejemplo, por reacción de funciones amino con 2-iminotiolano o el éster de N-hidroxisuccinimida de 3-(4-ditiopiridilpropionato). Los portadores adecuados también se pueden modificar a efectos de incorporar brazos espaciadores (tales como hexametilendiamina u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar) para que incorporen inmunogenes peptídicos.

Los portadores pueden estar físicamente conjugados con el inmunogen de miostatina de interés, utilizando reacciones de acoplamiento estándar. Alternativamente, se pueden preparar moléculas quiméricas recombinantemente, tal como por fusión de un gen que codifica un portador polipeptídico adecuado con una o más copias de un gen, o un fragmento del mismo, que codifica un inmunogen de miostatina seleccionado.

Los inmunogenes de miostatina también se pueden administrar a través de un virus portador que los expresa. Los virus portadores que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, sin limitarse a los mismos, el virus vaccinia y otros poxvirus, adenovirus y virus del herpes. A título de ejemplo, los recombinantes de virus vaccinia que expresan las proteínas se pueden construir como sigue. En primer lugar, el ADN que codifica una proteína particular se introduce en un vector apropiado, de tal modo que sea adyacente a un promotor de vaccinia y flanquee las secuencias de ADN de vaccinia, tal como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK). A continuación, este vector se utiliza para transfectar células simultáneamente infectadas con el vaccinia. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica el inmunogen deseado en el genoma viral. El recombinante de TK resultante se puede seleccionar cultivando las células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y escogiendo placas virales resistentes a la misma.

3. Multímeros de miostatina

La inmunogenicidad de los inmunogenes de miostatina también se puede incrementar significativamente preparando formas inmunogénicas de las moléculas que comprenden múltiples copias de epítopes seleccionados. De este modo, a la miostatina endógena se le puede proporcionar un autoantígeno efectivo.

Correspondientemente, se describen composiciones de vacuna que contienen multímeros de miostatina en forma de ácido nucleico o forma peptídica para su suministro a un sujeto. El multímero de miostatina tendrá más de una copia de inmunogenes, péptidos o epítopes de miostatina seleccionados, tal como se ha descrito anteriormente, o múltiples repeticiones en tándem de un inmunogen de miostatina, un péptido o un epítope de miostatina seleccionado. De este modo, los multímeros de miostatina pueden comprender repeticiones múltiples o por parejas de secuencias de miostatina seleccionadas, repeticiones múltiples o por parejas de epítopes de miostatina seleccionados, o cualquier combinación imaginable de los mismos. Los epítopes de miostatina se pueden identificar utilizando técnicas tal como se describen en detalle anteriormente.

Por ejemplo, el multímero de miostatina puede corresponder a una molécula con unidades repetitivas de fórmula general (MP-X-MP)y, en la que MP es un péptido de miostatina, X se selecciona entre el grupo que consiste en un enlace peptídico, un grupo espaciador aminoácido, un polipéptido de leucotoxina y [MP]_{n}, donde n es mayor o igual a 1, y es mayor o igual a 1, y además donde "MP" puede comprender cualquier péptido MP. De este modo, el multímero de miostatina puede contener de 2 a 64 o más péptidos de miostatina, más preferentemente de 2 a 32 o de 2 a 16 péptidos de miostatina. En la presente invención, MP se selecciona entre los aminoácidos 3-15, inclusive, de la SEC ID nº 6; los aminoácidos 3-17, inclusive, de la SEC ID nº 8; los aminoácidos 3-16, inclusive, de la SEC ID nº 10; los aminoácidos 3-22, inclusive, de la SEC ID nº 12; los aminoácidos 3-25, inclusive, de la SEC ID nº 14; los aminoácidos 3- 22, inclusive de la SEC ID nº 16; los aminoácidos 3-18, inclusive, de la SEC ID nº 20; y los aminoácidos 3-18, inclusive, de la SEC ID nº 22. Si los inmunogenes de miostatina están enlazados química o recombinantemente a un portador, los péptidos de miostatina pueden estar enlazados al extremo 5' o al extremo 3', o pueden flanquear al portador en cuestión. Además, el multímero de miostatina puede estar situado en lugares internos del portador.

Un portador particular para su utilización con los multímeros de miostatina es un polipéptido de leucotoxina tal como se describe anteriormente. Por ejemplo, las oligo repeticiones de la miostatina se pueden insertar convenientemente en el lugar BamH1 presente en la posición de nucleótido 3334 del polipéptido de leucotoxina mostrada en las figuras 15A-15D.

Tal como se ha explicado anteriormente, pueden estar presentes secuencias espaciadoras entre los restos de miostatina. Por ejemplo, los dímeros Arg-Ser y Gly-Ser están presentes en los péptidos MYOS ejemplificados en la presente memoria, que proporcionan espaciadores entre secuencias repetitivas de los péptidos de miostatina. La colocación estratégica de diversas secuencias espaciadoras entre inmunogenes de miostatina seleccionados se puede utilizar para conferir una inmunogenicidad aumentada a los constructos del sujeto. Correspondientemente, una secuencia espaciadora seleccionada puede codificar una amplia variedad de restos, tales como un linker de un único aminoácido o una secuencia de dos a diversos aminoácidos. Los grupos espaciadores seleccionados pueden proporcionar preferentemente lugares de disociación enzimáticos, de tal modo que el multímero expresado puede ser procesado por enzimas proteolíticas in vivo (por APC o similares) a efectos de obtener una serie de péptidos, cada uno de los cuales contiene, por lo menos, un epítope de célula T derivado de la parte portadora, y preferentemente se fusionan con una secuencia peptídica de miostatina sustancialmente completa.

Los grupos espaciadores se pueden construir de tal modo que la región de unión entre los restos de miostatina seleccionados comprende una secuencia marcadamente extraña al sujeto inmunizado, confiriendo de este modo una inmunogenicidad aumentada a los péptidos de miostatina asociados. Adicionalmente, las secuencias espaciadoras se pueden construir de tal modo que proporcionen antigenicidad de células T, tal como las secuencias que codifican secuencias peptídicas anfipáticas y/o \alpha-helicoidales, que en la técnica se consideran generalmente como proveedoras de epítopes inmunogénicos de células T auxiliares. La selección de los epítopes particulares de células T que deben suministrar este tipo de secuencias espaciadoras puede variar en función de la especie de vertebrado que se debe vacunar en particular. Aunque se indican a título de ejemplo partes particulares de miostatina que incluyen secuencias espaciadoras, también se describen uno o más multímeros de miostatina que comprenden directamente secuencias de miostatina adyacentes (sin intervención de secuencias espaciadoras).

La secuencia multimérica de miostatina producida de este modo da lugar a un antígeno de miostatina altamente inmunogénico.

Los péptidos, inmunoconjugados y multímeros de miostatina se pueden preparar utilizando los métodos descritos a continuación, y se pueden utilizar para métodos de inmunización basados en ácidos nucleicos, métodos de inmunización basados en proteína o para la producción de anticuerpos.

4. Métodos de inmunización basados en ácidos nucleicos

Generalmente, las vacunas basadas en ácidos nucleicos incluyen regiones relevantes que codifican un inmunogen de la miostatina, con secuencias de control adecuadas y, opcionalmente, secuencias de nucleótidos terapéuticas auxiliares. Las moléculas de ácido nucleico se preparan en forma de vectores que incluyen los elementos necesarios para dirigir la transcripción y la traducción en una célula destinataria.

A efectos de aumentar la respuesta inmune en un sujeto inmunizado, las moléculas de ácido nucleico se pueden administrar junto con sustancias auxiliares, tales como agentes farmacológicos o adyuvantes, o junto con el suministro de vectores que codifican modificadores de la respuesta biológica, tales como citoquinas y similares. Otras sustancias auxiliares incluyen, sin limitarse a las mismas, sustancias para incrementar la ganancia de peso, la masa muscular o la fuerza muscular, tales como hormonas de crecimiento, agentes promotores del crecimiento, beta antagonistas, agentes de partición y antibióticos.

Las secuencias de nucleótidos seleccionadas para su utilización se pueden derivar de fuentes conocidas, por ejemplo, aislándolas a partir de células o de tejido que contienen una secuencia génica o de nucleótidos deseada utilizando técnicas estándar, o utilizando técnicas recombinantes o sintéticas.

Una vez que se han preparado o aislado secuencias codificadoras para los inmunogenes de la miostatina, dichas secuencias se pueden clonar en cualquier vector o replicón adecuado. Los expertos en la materia conocen numerosos vectores de clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado es cuestión de preferencias. Las asociaciones con otras secuencias, por ejemplo moléculas auxiliares o moléculas portadoras, se llevan a cabo utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica. Una o más partes de inmunogen de miostatina de la quimera se pueden fusionar en 5' y/o 3' con una secuencia auxiliar o una molécula portadora deseada. Alternativamente, una o más partes de inmunogen de miostatina se pueden colocar en lugares internos de la molécula portadora, o dichas partes se pueden colocar a la vez en posiciones terminales e internas de la quimera.

Alternativamente, se pueden preparar secuencias de ADN que codifican los inmunogenes de la miostatina de interés, opcionalmente enlazados a moléculas portadoras, sintéticamente en lugar de por clonación. Las secuencias de ADN se pueden diseñar con codones apropiados para la secuencia particular. A continuación, la secuencia completa del inmunogen se ensambla a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados mediante métodos estándar, y se ensambla hasta obtener una secuencia codificadora completa. Véase, por ejemplo, Edge (1981), Nature 292:756; Nambair y otros (1984), Science 223:1299; y Jay y otros (1984), J. Biol. Chem. 259:6311.

A continuación, la secuencia codificadora se pone bajo el control de elementos de control adecuados para la expresión en el tejido huésped adecuado in vivo. Así, si se utilizará la maquinaria de transcripción y traducción endógena del sujeto para expresar inmunogenes, se utilizarán elementos de control compatibles con el sujeto en particular. A este respecto, en la técnica se conocen diversos promotores para su utilización en sistemas de mamíferos. Por ejemplo, los promotores típicos para la expresión celular en mamíferos incluyen el promotor temprano SV40, un promotor CMV tal como el promotor temprano inmediato CMV, el promotor del virus del tumor mamario de ratón LTR, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP), y el promotor del virus herpes simplex, entre otros. Otros promotores no víricos, tales como un promotor derivado del gen de metalotioneína murina, encuentran también aplicación para la expresión en mamíferos.

Típicamente, las secuencias de terminación de transcripción y poliadenilación también estarán presentes, situadas en 3' con respecto al codón de terminación de la traducción. Preferentemente, está presente también una secuencia para la optimización del inicio de la traducción, situada en 5' con respecto a la secuencia codificadora. Los ejemplos de las señales de terminación de transcripción/poliadenilación incluyen las derivadas de SV40, tal como se describen en Sambrook y otros, supra, así como una secuencia de terminación de hormona del crecimiento bovina. También se pueden diseñar dentro de los constructos intrones que contienen lugares dadores y aceptores de empalmes.

También se pueden utilizar elementos promotores en la presente invención a efectos de aumentar los niveles de expresión de los constructos. Los ejemplos incluyen el promotor génico temprano SV40 (Dijkema y otros (1985), EMBO J. 4:761), el promotor/favorecedor derivado de la repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Gorman y otros (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. US nº 79:6777) y elementos derivados del CMV humano (Boshart y otros (1985), Cell 41:521), tales como elementos incluidos en la secuencia del intrón A de CMV.

Una vez preparadas, las composiciones de vacuna de ácido nucleico se pueden suministrar al sujeto utilizando métodos conocidos. A este respecto, se han descrito diversas técnicas para la inmunización con ADN codificador de antígenos. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.589.466 de Felgner y otros; Tang y otros (1992), Nature 358:152; Davis y otros (1993), Hum. Molec. Genet. 2:1847; Ulmer y otros (1993), Science 258:1745; Wang y otros (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. US nº 90:4156; Eisenbraun y otros (1993), DNA Cell Biol. 12:791; Fynan y otros (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. US nº 90:12476; Fuller y otros (1994), AIDS Res. Human Retrovir. 10:1433; y Raz y otros (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. US nº 91:9519. También se pueden utilizar métodos generales para suministrar moléculas de ácidos nucleicos a las células in vitro, para una posterior reintroducción en el huésped, tal como una transferencia génica mediada por liposomas. Véase, por ejemplo, Hazinski y otros (1991), Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4:206-209; Brigham y otros (1989), Am. J. Med. Sci. 298:278-281; Canonico y otros (1991), Clin. Res. 39:219A; y Nabel y otros (1990), Science 249:1285-1288. Así, las composiciones de vacuna de ácido nucleico se pueden suministrar en forma de líquido o de particulado utilizando una serie de técnicas conocidas. A continuación se describen con mayor detalle composiciones de vacuna típicas.

5. Métodos de inmunización basados en proteínas

Las composiciones de vacunas basadas en péptidos también se pueden preparar utilizando una serie de métodos conocidos por los expertos en la materia. En particular, se pueden aislar inmunogenes de miostatina directamente a partir de fuentes nativas, utilizando técnicas de purificación estándar. Alternativamente, los inmunogenes se pueden preparar recombinantemente utilizando los sistemas de expresión de ácidos nucleicos descritos anteriormente, y se pueden purificar utilizando técnicas conocidas. Los inmunogenes peptídicos también se pueden sintetizar, en base a las secuencias de aminoácidos descritas o las secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de ADN de una molécula de interés, utilizando síntesis polimérica química, tal como síntesis peptídica en fase sólida. Dichos métodos son conocidos por el experto en la materia. Véase, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editores E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, Nueva York, (1980), pp. 3-254, para técnicas de síntesis peptídica en fase sólida; y M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) y E. Gross y J. Meienhofer, eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, para la síntesis clásica en solución.

Los inmunogenes peptídicos también se pueden preparar clonando las secuencias codificadoras para los mismos en cualquier vector de expresión o replicón adecuado. Los expertos en la materia conocen diversos lectores de clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado es cuestión de preferencias. Los ejemplos de vectores de ADN recombinante para la clonación, y de células huésped en las que se pueden transformar, incluyen el bacteriófago lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacteria Gram negativa), pGV1106 (bacteria Gram negativa), pLAFR1 (bacteria Gram negativa), pM E290 (bacteria Gram negativa no-E. coli), pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), Ylp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y virus del papiloma bovino (células de mamíferos). Véase, en general, DNA Cloning: Vols. I & II, supra; Sambrook y otros, supra; B. Perbal, supra.

Por ejemplo, la secuencia codificadora para la miostatina de una serie de especies de vertebrados, incluyendo el ratón, la rata, el humano, el babuino, el ganado, el cerdo, la oveja, el pollo y el pavo, ha sido determinada. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.827.733 y NCBI número de acceso U84OC5 para la secuencia de nucleótidos de miostatina murina; la patente US nº 5.827.733, la publicación internacional WO 98/33887, y NCBI número de acceso AFO19627 para la secuencia de nucleótidos de miostatina humana; la figura 16A de la presente memoria, así como las publicaciones internacionales WO 99/02667 y WO 98/33887, y NCBI número de acceso AFO19620 para la secuencia de nucleótidos de miostatina bovina; NCBI número de acceso AFO19626 para la secuencia de nucleótidos de miostatina de pez cebra; la publicación internacional WO 98/33887 para la secuencia de nucleótidos de miostatina de rata (véase, también, NCBI número de acceso AFO19624), de babuino (véase, también, NCBI número de acceso AFO19619), porcina (véase, también, NCBI número de acceso AFO19623), ovina (véase, también, NCBI número de acceso AFO19622), de pollo (véase, también, NCBI número de acceso AFO19621) y de pavo (véase, también, NCBI número de acceso AFO19625). La secuencia de miostatina está altamente conservada a lo largo de todas estas especies.

Partes de estas secuencias codificadoras de los péptidos de miostatina deseados, y, si se desea, una secuencia que codifica una proteína portadora, se pueden clonar, aislar y enlazar entre sí utilizando técnicas recombinantes generalmente conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros, supra.

El gen se puede poner bajo el control de un promotor, un lugar de enlace de ribosoma (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de tal modo que la secuencia de ADN de interés se transcribe en ARN mediante un transformante adecuado. La secuencia codificadora puede contener o no un péptido de señal o una secuencia líder. Los inmunogenes peptídicos se pueden expresar utilizando, por ejemplo, el promotor tac de E. coli, o el promotor del gen de proteína A (spa) y secuencia de señal. Las secuencias líder pueden ser eliminadas por el huésped bacteriano en un procesamiento postraducción. Véase, por ejemplo, las patentes US nº 4.431.739; nº 4.425.437; nº 4.338.397. También pueden estar presentes secuencias auxiliares, tales como las descritas anteriormente.

Además de secuencias de control, puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión de las secuencias de inmunogen en relación con el crecimiento de la célula huésped. Las secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la materia, y ejemplos de las mismas incluyen aquellas que provocan que la expresión de un gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores pueden estar también presentes en el vector, por ejemplo, secuencias promotoras.

Un vector de expresión se construye de tal modo que la secuencia codificadora en particular se sitúa en dicho vector con las secuencias reguladoras apropiadas, siendo tal el posicionamiento y orientación de la secuencia codificadora con respecto a las secuencias de control que la secuencia codificadora se transcribe bajo el "control" de dichas secuencias de control (es decir, la ARN polimerasa que se enlaza a la molécula de ADN en las secuencias de control transcribe la secuencia codificadora). La modificación de las secuencias que codifican el inmunogen de miostatina en particular puede resultar deseable a efectos de alcanzar este propósito. Por ejemplo, en algunos casos, puede resultar necesario modificar la secuencia de tal modo que se pueda enlazar a las secuencias de control en la orientación apropiada; es decir, mantener el marco de lectura. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden estar enlazadas a la secuencia codificadora antes de la inserción en un vector, tal como los vectores de clonación descritos anteriormente. Alternativamente, la secuencia codificadora se puede clonar directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un lugar de restricción apropiado.

En algunos casos, puede resultar deseable añadir secuencias que provocan la secreción del inmunogen por parte del organismo huésped, con la posterior disociación de la señal de secreción. También puede ser deseable producir mutantes o análogos del inmunogen. Los mutantes o análogos se pueden preparar mediante la eliminación de una parte de la secuencia que codifica el inmunogen, o, si está presente, una parte de la secuencia que codifica la molécula portadora deseada, mediante la inserción de una secuencia, y/o mediante la sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y similares, son bien conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros, supra; DNA Cloning, Vols. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; Kunkel, T.A. Proc. Natl. Acad. Sci. US nº (1985), 82:448; Geisselsoder y otros BioTechniques (1987), 5:786; Zoller y Smith, Methods Enzymol. (1983), 100:468; Dalbie-McFarland y otros Proc. Natl. Acad. Sci US nº (1982), 79:6409.

Los inmunogenes de miostatina se pueden expresar en una amplia variedad de sistemas, incluyendo sistemas expresión de insectos, mamíferos, bacterias, virus y levaduras, todos ellos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sistemas de expresión celular de insectos, tales como sistemas de baculovirus, son conocidos por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin nº 1555 (1987). Los materiales y métodos para los sistemas de expresión celular de baculovirus/insectos están comercialmente disponibles en forma de kit a través, entre otros, de Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). Similarmente, los sistemas de expresión celular de bacterias y mamíferos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros, supra. También son conocidos en la técnica los sistemas de expresión de levaduras y se describen, por ejemplo, en Yeast Genetic Engineering (Barr y otros, eds., 1989), Butterworths, Londres.

También se conocen una serie de células huésped apropiadas para su utilización con los sistemas anteriores. Por ejemplo, las líneas celulares de mamíferos son conocidas en la técnica e incluyen líneas celulares inmortalizadas, disponibles a través de la American Type Culture Collection (ATCC), tales como, aunque sin limitarse a las mismas, células de ovario de hámster de China (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñón bovino de Madin-Darby ("MDBK"), así como otras. Similarmente, los huéspedes bacterianos, tales como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp., encuentran aplicación con los constructos de expresión de la presente invención. Los huéspedes de levaduras útiles en la presente invención incluyen, entre otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las células de insectos para su utilización con vectores de expresión de baculovirus incluyen, entre otros, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni.

En función del sistema de expresión y del huésped seleccionados, los inmunogenes de miostatina se producen cultivando células huésped transformadas mediante un vector de expresión descrito anteriormente en condiciones en las que se expresa el inmunogen. A continuación, el inmunogen expresado se aísla de las células huésped y se purifica. Si el sistema de expresión secreta el inmunogen en el medio de crecimiento, el producto se puede purificar directamente a partir del mismo. Si no se secreta, se puede aislar a partir de lisados de las células. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas y de los métodos de recuperación entra dentro del alcance de un experto en la materia.

Una vez obtenidos, los péptidos de miostatina, con o sin portador asociado, se pueden formular como composiciones de vacuna, tales como las composiciones de vacuna que se describen a continuación, a efectos de desencadenar la producción de anticuerpos en un vertebrado.

6. Producción de anticuerpos

Los péptidos de miostatina también se pueden utilizar para generar anticuerpos para su utilización en métodos de inmunización pasiva, o con propósitos de inmunopurificación o inmunodiagnóstico. Típicamente, los péptidos útiles para producir anticuerpos tendrán una longitud, por lo menos, de 3-5 aminoácidos, preferentemente de 7-10 aminoácidos, y de la forma más preferente, por lo menos, de aproximadamente 10 a 15 aminoácidos o más.

Los anticuerpos que se dirigen contra los inmunogenes del sujeto incluyen preparaciones de anticuerpos policlonales y monoclonales, antisueros monoespecíficos, así como preparaciones que incluyen anticuerpos híbridos, anticuerpos modificados, fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos F(ab), fragmentos F_{V}, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y fragmentos funcionales de los mismos, que mantienen la especificidad para la molécula diana en cuestión. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir regiones variables, o fragmentos de regiones variables, que mantienen la especificidad para la molécula en cuestión. El resto del anticuerpo se puede derivar de las especies en las que se va a utilizar dicho anticuerpo. Así, si el anticuerpo se va a usar en un humano, el anticuerpo puede ser "humanizado", a efectos de reducir la inmunogenicidad, aunque conservando la actividad. Para una descripción de anticuerpos quiméricos, véase, por ejemplo, Winter, G. y Milstein, C. (1991), Nature 349:293-299; Jones, P.T. y otros (1986), Nature 321:522-525; Riechmann, L. y otros (1988) 332:323-327; y Carter, P. y otros (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. US nº 89:4285-4289. Estos anticuerpos quiméricos pueden contener no sólo lugares de combinación para la molécula diana, sino también lugares de enlace para otras proteínas. De este modo, se pueden generar reactivos bifuncionales con una especificidad frente a antígenos externos e internos.

Si se desean anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con el antígeno deseado, o con su fragmento, o con un antígeno mutado, tal como se ha descrito anteriormente. Antes de la inmunización, puede ser deseable aumentar adicionalmente la inmunogenicidad de un inmunogen en particular. Esto se puede alcanzar mediante una de las diversas formas conocidas por los expertos en la materia.

Por ejemplo, la inmunización para la producción de anticuerpos se lleva a cabo generalmente mezclando o emulsionando la proteína en un excipiente adecuado, tal como solución salina, preferentemente en un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund, o cualquiera de los adyuvantes descritos a continuación, e inyectando la mezcla o emulsión por vía parenteral (generalmente por vía subcutánea o intramuscular). Generalmente, el animal se estimula unas 2-6 semanas más tarde con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, preferentemente utilizando el adyuvante incompleto de Freund o similares. Los anticuerpos también se pueden generar mediante inmunización in vitro, utilizando métodos conocidos en la técnica. A continuación, se obtienen antisueros policlonales a partir del animal inmunizado, y el mismo se trata de acuerdo con los procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Jurgens y otros (1985), J. Chrom. 348:363-370. Si se utiliza suero que contiene anticuerpos policlonales, dichos anticuerpos policlonales se pueden purificar mediante cromatografía de inmunoafinidad, utilizando procedimientos conocidos.

Generalmente, los anticuerpos monoclonales se preparan utilizando el método de Kohler y Milstein, Nature (1975), 256:495-96, o una modificación del mismo. Típicamente, un ratón o una rata se inmunizan tal como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en lugar de extraer sangre del animal a efectos de extraer suero, se extrae el bazo (y opcionalmente diversos nódulos linfáticos grandes) y se disocia en células individuales. Si se desea, las células del vaso se pueden cribar (tras eliminar las células no específicamente adherentes) aplicando una suspensión celular a una placa o pocillo recubiertos con el antígeno proteínico. Las células B, que expresan inmunoglobulina enlazada a la membrana específica para el antígeno, se enlazan a la placa y no se eliminan en el enjuagado con el resto de la suspensión. A continuación, se induce la fusión de las células B resultantes, o de todas las células de bazo disociadas, con las células de mieloma a efectos de formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio de hipoxantina, aminopterina, timidina, o medio "HAT"). Los hibridomas resultantes se colocan en placas por disolución limitante y se analiza la producción de anticuerpos que se enlazan específicamente al antígeno inmunizante (y que no se enlazan a antígenos no relacionados). A continuación, los hibridomas monoclonales secretores de anticuerpos seleccionados se cultivan in vitro (por ejemplo, en ampollas de cultivo de tejidos o reactores de fibra hueca), o in vivo (como ascitis en ratones). Véase, por ejemplo, M. Schreier y otros, Hybridoma Techniques (1980); Hammerling y otros, Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett y otros, Monoclonal Antibodies (1980); véase también las patentes US nº 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.452.570; 4.466.917; 4.472.500, 4.491.632; y 4.493.890. Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra el péptido de miostatina de interés, o un fragmento del mismo, se pueden cribar según diversas propiedades; es decir, según isotipo, epítope, afinidad, etc.

Los fragmentos funcionales de los anticuerpos también se pueden preparar contra el péptido de miostatina de interés, y se pueden producir disociando una región constante, no responsable del enlace con el antígeno, de la molécula de anticuerpo, utilizando, por ejemplo, pepsina, a efectos de obtener fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos contienen dos lugares de enlace de antígeno, pero están desprovistos de una parte de la región constante de cada una de las cadenas pesadas. Similarmente, si se desea, se pueden preparar fragmentos Fab que comprenden un único lugar de enlace de antígeno, por ejemplo, por digestión de anticuerpos policlonales o monoclonales con papaína. Los fragmentos funcionales, incluyendo únicamente las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, también se pueden producir utilizando técnicas estándar. Dichos fragmentos se conocen como F_{V}.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados también se pueden producir utilizando los inmunogenes del sujeto. Estos anticuerpos pueden estar diseñados para minimizar las reacciones inmunológicas no deseadas, atribuibles a regiones heterólogas constantes y de armazón variable específicas de especie, típicamente presentes en anticuerpos monoclonales y policlonales. Por ejemplo, si los anticuerpos se deben utilizar en sujetos humanos, se pueden crear anticuerpos quiméricos sustituyendo regiones constantes no humanas, en la cadena pesada o en la cadena ligera, o en ambas, por regiones constantes humanas, utilizando técnicas generalmente conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Winter, G. y Milstein, C. (1991), Nature 349:293-299; Jones, P.T. y otros (1986), Nature 321:522-525; Riechmann, L. y otros (1988), 332:323-327; y Carter, P. y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. US nº 89:4285-4289.

7. Composiciones de vacuna

Una vez preparadas las moléculas de miostatina de interés, se formulan en composiciones de vacuna para su administración a un vertebrado. La molécula de miostatina relevante se administra sola o mezclada con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, son vehículos adecuados agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, así como combinaciones de los mismos. Además, el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tampones del pH o adyuvantes que aumentan la eficacia de la vacuna. Posteriormente se describen adyuvantes adecuados. Los métodos para preparar este tipo de formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 18ª edición, 1990. La composición o formulación administrada contiene una cantidad adecuada del inmunogen de miostatina para alcanzar el estado inmunizado deseado en el sujeto que se somete a tratamiento.

Tal como se ha descrito anteriormente, las composiciones de vacuna pueden incluir adyuvantes a efectos de aumentar adicionalmente la inmunogenicidad del inmunogen de miostatina. Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, emulsionantes, dipéptidos de muramilo, avridina, hidróxido de aluminio, aceites, saponinas y otras sustancias conocidas en la técnica. Por ejemplo, los compuestos que pueden servir como emulsionantes en la presente invención incluyen agentes emulsionantes naturales y sintéticos, así como compuestos aniónicos, catiónicos y no iónicos. Entre los compuestos sintéticos, los agentes emulsionantes aniónicos incluyen, por ejemplo, las sales de potasio, sodio y amonio de los ácidos láurico y oleico, las sales de calcio, magnesio y aluminio de ácidos grasos (es decir, jabones metálicos), y sulfonatos orgánicos tales como laurilsulfato de sodio. Los agentes catiónicos sintéticos incluyen, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio, mientras que son ejemplos de agentes no iónicos sintéticos los ésteres de glicerilo (por ejemplo, monoestearato de glicerilo), ésteres y éteres de polioxietilenglicol y ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monopalmitato de sorbitán) y sus derivados de polioxietileno (por ejemplo, monopalmitato de polioxietileno sorbitán). Los agentes emulsionantes naturales incluyen acacia, gelatina, lecitina y colesterol.

Otros adyuvantes adecuados se pueden formar con un componente de aceite, tal como un solo aceite, una mezcla de aceites, una emulsión agua en aceite, o una emulsión aceite en agua. Dicho aceite puede ser un aceite mineral, un aceite vegetal o un aceite animal. Resultan preferentes los aceites minerales o emulsiones aceite en agua en las que el componente de aceite es un aceite mineral. A este respecto, un "aceite mineral" se define en la presente memoria como una mezcla de hidrocarburos líquidos obtenidos a partir de petrolato mediante una técnica de destilación; el término es sinónimo de "parafina líquida", "petrolato líquido" y "aceite mineral blanco". El término también pretende incluir "aceite mineral ligero", es decir, un aceite similarmente obtenido por destilación del petrolato, pero con una gravedad específica ligeramente menor que la del aceite mineral blanco. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Un componente de aceite particularmente preferente es la emulsión aceite en agua comercializada bajo el nombre comercial EMULSIGEN PLUS^{TM} (que comprende un aceite mineral ligero, así como 0,05% de formalina y 30 mg/ml de gentamicina como conservantes), disponible a través de MVP Laboratories, Ralston, Nebraska, o el adyuvante VSA-3, que es una forma modificada del adyuvante EMULSIGEN PLUS^{TM}. Los aceites animales adecuados incluyen, por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceite de mero, aceite de Menhaden, aceite de pez emperador y aceite de hígado de tiburón, todos ellos comercialmente disponibles. Los aceites vegetales adecuados incluyen, sin limitación, aceite de canola, aceite de almendras, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de soja y similares.

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Alternativamente, se pueden utilizar una serie de bases nitrogenadas alifáticas como adyuvantes con las formulaciones de vacuna. Por ejemplo, los adyuvantes inmunológicos conocidos incluyen aminas, compuestos de amonio cuaternario, guanidinas, benzamidinas y tiouronios (Gall, D. (1966), Immunology 11:369-386). Los compuestos específicos incluyen bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) (disponible a través de Kodak) y N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propandiamina ("avridina"). La utilización de DDA como adyuvante inmunológico ha sido descrita; véase, por ejemplo, Kodak Laboratory Chemicals Bulletin 56(1):1-5 (1986); Adv. Drug Deliv. Rev. 5(3):163-187 (1990); J. Controlled Release 7:123-132 (1988); Clin. Exp. Immunol. 78(2):256-262 (1989); J. Immunol. Methods 97(2):159-164 (1987); Immunology 58(2):245-250 (1986); y Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 68(3):201-208 (1982). La avridina también es un adyuvante bien conocido. Véase, por ejemplo, la patente US nº 4.310.550 de Wolff, III y otros, que describe la utilización de alquil-N',N'-bis(2-hidroxietil)propandiaminas N,N-superiores en general, y avridina en particular, como adyuvantes de vacuna. La patente US nº 5.151.267 de Babiuk, y Babiuk y otros (1986), Virology 159:57-66, también se refieren a la utilización de avridina como adyuvante de vacuna.

Las composiciones de vacuna también pueden incluir sustancias auxiliares, tales como agentes farmacológicos, citoquinas u otros modificadores de respuesta biológica. Otras sustancias auxiliares incluyen, aunque sin limitarse a las mismas, sustancias que aumentan la ganancia de peso, la masa muscular o la fuerza muscular, tales como hormonas de crecimiento, agentes promotores de crecimiento, beta antagonistas, agentes de partición y antibióticos.

Normalmente, las vacunas se preparan como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones, o como formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar, o se puede utilizar el ingrediente activo encapsulado en vehículos de liposoma u otros portadores particulados.

Las composiciones de vacuna también se pueden preparar en forma sólida. Por ejemplo, se pueden preparar formulaciones particuladas sólidas para su suministro en dispositivos inyectores sin aguja comercialmente disponibles. Alternativamente, se pueden suministrar implantes de dosis sólida para su implantación en un sujeto. También se pueden utilizar formulaciones de liberación controlada o prolongada, preparadas incorporando los inmunogenes de miostatina en portadores o vehículos tales como liposomas, polímeros impermeables no reabsorbibles, tales como copolímeros de etilenvinilo y acetato, y copolímeros de Hytrel®, polímeros hinchables, tales como hidrogeles, o polímeros reabsorbibles, tales como colágeno y determinados poliácidos o poliésteres, tales como los utilizados para preparar suturas reabsorbibles.

Además, los inmunogenes se pueden formular en composiciones de vacuna en forma neutral o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos activos) y que están formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a partir de grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxido férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.

La composición de vacuna se formula de tal modo que contiene una cantidad eficaz del inmunogen de miostatina, pudiendo determinar fácilmente la cantidad exacta el experto en la materia, y dependiendo dicha cantidad del animal que se debe tratar, de la capacidad del sistema inmune de dicho animal para sintetizar anticuerpos, y del grado de inmunoneutralización de miostatina que se desea.

Las formulaciones de vacuna que incluyen aproximadamente de 1 \mug a aproximadamente 1 mg, más generalmente de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 200 \mug de inmunogen por dosis de solución inyectada deben ser adecuadas para provocar una respuesta ecológica al ser administradas. Si se utiliza una quimera portadora de péptido, la relación de inmunogen a portador en la formulación de vacuna variará en función del portador en particular y el inmunogen seleccionado para construir dichas moléculas. El experto en la materia puede establecer fácilmente dosificaciones efectivas mediante ensayos de rutina que den lugar a curvas de respuesta a la dosis.

El sujeto se inmuniza mediante la administración de una de las composiciones de vacuna, por lo menos, en una dosis, y preferentemente dos o más dosis. Además, se pueden administrar al animal tantas dosis como sea necesario a efectos de mantener un estado de inmunidad.

Se puede utilizar cualquier medio farmacéutico adecuado de suministro para administrar la composición de vacuna al vertebrado. Por ejemplo, jeringuillas de aguja convencionales, inyectores de resorte o de gas comprimido (aire) (patentes US nº 1.605.763 de Smoot; nº 3.788.315 de Laurens; nº 3.853.125 de Clark y otros; nº 4.596.556 de Morrow y otros; y nº 5.062.830 de Dunlap), inyectores de chorro líquido (patentes US nº 2.754.818 de Scherer; 3.330.276 de Gordon; y nº 4.518.385 de Lindmayer y otros), e inyectores de partículas (patentes US nº 5.149.655 de McCabe y otros, y nº 5.204.253 de Sanford y otros) son todos ellos apropiados para el suministro de las composiciones de vacuna.

Preferentemente, la composición de vacuna se administra por vía intramuscular, subcutánea, intravenosa, subdérmica o intradérmica al sujeto. Si se utiliza un inyector de chorro, se emite un único chorro de la composición de vacuna líquida a presión y velocidad elevadas, por ejemplo, 1.200-1.400 psi, creando con ello una abertura en la piel y penetrando hasta profundidades adecuadas para la inmunización.

Los inventores han identificado péptidos y multímeros de miostatina, y conjugados de los mismos, que se pueden utilizar para generar una respuesta inmune contra la miostatina y, de este modo, aumentar la masa muscular. A continuación se indican ejemplos de formas de realización específicas.

C. Parte experimental Ejemplo 1 Identificación de péptidos de miostatina inmunogénicos

Se han identificado una serie de regiones de la molécula de miostatina bovina como potencialmente inmunogénicas en base al análisis computacional de la molécula de longitud completa utilizando diversos programas informáticos. Uno de dichos programas fórmula escalas de hidropatía a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína en base a las propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas de cada uno de los 20 aminoácidos. Hopp y Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. US nº (1981), 78:3824-3828. La figura 17 representa un perfil de hidrofilia calculado utilizando una longitud promedio del grupo de seis aminoácidos. Los tres puntos más elevados de hidrofilia de la molécula de miostatina se encontraron en las posiciones de aminoácido 263-268, región que incluye el lugar de disociación proteolítica y presenta la secuencia de aminoácidos Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEC ID nº 37); las posiciones 31-37, que presentan la secuencia de aminoácidos Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEC ID nº 38); y las posiciones 106-111, que presentan la secuencia de aminoácidos Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEC ID nº 39).

También se lleva a cabo un análisis de la proteína utilizando el programa PC/Gene, versión 6.60 (Intelligenetics Inc., Génova, Suiza). Se llevó a cabo un análisis tridimensional de la proteína de miostatina utilizando el Swiss-Pdb Viewer v2.6 (http://expasy.hcuge.ch/spdbv/mainpage.html).

A partir de esta información, se diseñaron y construyeron una serie de oligómeros de ADN representativos con un Beckman Oligo 1000M DNA Synthesizer, utilizando química de fosforamidita. Los oligómeros se designaron MYOS 1-20. MYOS 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19 (mostrados en las figuras 2 a 11, respectivamente) incluyen partes de la hebra codificadora de ADN, mientras que MYOS 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 incluyen partes de la hebra complementaria. La posición de estos péptidos con referencia a la molécula de miostatina de longitud completa se muestra en la figura 12.

Los oligómeros de ADN codificaban péptidos con de 12 a 23 aminoácidos, flanqueados por 2 linkers de aminoácidos para el enlace con una molécula portadora (véase más adelante). Estos péptidos, colectivamente, representaban toda la parte activa de la proteína, así como tres secciones individuales en dirección ascendente con respecto al lugar de disociación proteolítica que libera la proteína activa.

Particularmente, en base al análisis computacional, se seleccionaron tres partes de la proteína activa como dianas de inmunización primarias. La primera parte se preparó combinando el par de oligonucleótidos designado MYOS 1 y 2, y contenía el lugar de disociación proteolítica y el terminal N de la proteína activa. MYOS 1 arrojó la calificación de determinante antigénico más elevada utilizando el programa informático de Hopp y Woods (véase figura 17). El análisis tridimensional de la parte activa de la miostatina mostró que el péptido MYOS 1 está expuesto sobre la superficie de la proteína y, en consecuencia, es probable que sea visto por el sistema inmune. MYOS 1 también se superpone al lugar de disociación proteolítica, que libera la parte activa de la proteína. El bloqueo de este lugar utilizado anticuerpos impide la disociación de la proteína y la liberación de la parte activa de la misma a efectos de impedir su efecto sobre el tejido muscular.

Se seleccionaron dos segmentos más de la proteína activa (MYOS 5 y 6 y MYOS 9 y 10) porque parecían formar un bucle y una hélice en base a un análisis estructural tridimensional. Esta estructura de bucle está expuesta probablemente sobre la superficie proteínica y, en consecuencia, puede ser vista por el sistema inmune. Los anticuerpos generados para estas partes de la molécula se enlazan probablemente con la proteína miostatina y la retiran de la circulación. El resto de la parte activa de la proteína se reconstruyó a partir de los pares de oligonucleótidos (MYOS 3 y 4, MYOS 7 y 8, MYOS 11 y 12, MYOS 13 y 14). La utilización de toda la parte activa garantiza la estructura tridimensional adecuada para desencadenar una respuesta inmune eficaz. Una de las regiones situada en dirección ascendente de la parte activa de la proteína (MYOS 15 y 16) se seleccionó en base al análisis computacional de los epítopes antigénicos probables. Las otras dos partes situadas en dirección ascendente de la proteína se seleccionaron de tal modo que contenían el lugar de disociación proteolítica (MYOS 19 y 20, que contienen el lugar de disociación y aminoácidos en dirección inmediatamente ascendente con respecto al lugar de disociación) o se encontraban cerca del mismo (MYOS 17 y 18), de tal modo que un anticuerpo que se enlace al lugar interferiría con la actividad proteasa.

En base a la comparación con otras secuencias proteínicas conocidas, la miostatina presenta zonas de homología con otras proteínas de factor de crecimiento transformante. La proteína morfogenética ósea 6 (BMP-6) presenta un grado elevado de homología en las regiones central y C-terminal de la parte activa de la miostatina.

Ejemplo 2 Construcción de pCB150

Los oligómeros anteriores se diseñaron para fusionarse con el terminal 3' de un polinucleótido que codifica una proteína portadora de leucotoxina (LKT) de 52 kDa, designada "LKT 114" en la presente memoria. Este polinucleótido se derivó del gen lktA presente en el plásmido pCB114, descrito en la patente US nº 5.837.268. Este plásmido, la secuencia de nucleótidos de este gen y la correspondiente secuencia de aminoácidos, se muestran en las figuras 15A-15D de la presente memoria, y el mismo también está descrito en la patente US nº 5.837.268. El gen codifica una versión acortada de leucotoxina que se desarrolló a partir del gen de leucotoxina recombinante presente en el plásmido pAA352 (Número de acceso ATCC 68283 y descrito en la patente US nº 5.476.657) mediante la extracción de un fragmento de ADN interno de aproximadamente 1.300 bp de longitud. El polipéptido LKT 114 tiene un peso molecular estimado de 52 kDa y contiene lugares de restricción adecuados para su utilización en la preparación de las proteínas de fusión según la presente invención.

El plásmido pCB150, que contiene la secuencia codificadora para LKT 114, en la que se clonaron los oligonucleótidos MYOS, se preparó del modo siguiente. Se aisló el gen de la leucotoxina tal como se describe en las patentes US nº 5.476.657 y nº 5.837.268. En particular, para aislar el gen de la leucotoxina, se construyeron bibliotecas génicas de P. haemolytica A1 (cepa B122) utilizando técnicas estándar. Véase Lo y otros, Infect. Immun., supra; DNA CLONING: Vols. I y II, supra; y Sambrook y otros, supra. Se construyó una biblioteca genómica en el vector plásmido pUC13 y una biblioteca de ADN construida en el bacteriófago lambda gt11. Los colores resultantes se utilizaron para transformar E. coli y se acumularon y cribaron colonias individuales para la reacción con suero procedente de una ternera que había sobrevivido a una infección por P. haemolytica y que se había estimulado con un sobrenadante de cultivo concentrado de P. haemolytica a efectos de aumentar los niveles de anticuerpos antileucotoxina. Las colonias positivas se cribaron según su capacidad de producir leucotoxina incubando lisados celulares con neutrófilos bovinos, inhibiendo a continuación la liberación de lactato deshidrogenasa a partir de esta última.

Se identificaron diversas colonias positivas, y estos recombinantes se analizaron por mapeo de endonucleasa de restricción. Un clon apareció idéntico a un gen de leucotoxina clonado previamente. Véase Lo y otros, Infect. Immun., supra. Para confirmar este hecho, se reclonaron fragmentos más pequeños y se compararon los mapas de restricción. Se determinó que aproximadamente 4 kilobases de pares de ADN se habían clonado. Progresivamente, se aislaron clones mayores llevando a cabo un paseo cromosómico (dirección 5' a 3') a efectos de aislar recombinantes de longitud completa de aproximadamente 8 kb de longitud. El constructo final se designó pAA114. Dicho constructo contenía la secuencia génica completa de la leucotoxina.

IktA, un fragmento de endonucleasa de restricción Mael de pAA114 que contenía el gen completo de leucotoxina se trató con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I más trifosfatos de nucleótidos y se ligó en el lugar SmaI del vector de clonación pUCl3. Este plásmido se designó pAA179. A partir del mismo, se prepararon dos constructos de expresión en el vector basado en ptac pGH432:lacI digerido con SmaI. Uno, pAA342, consistía en el fragmento 5'-AhaIII del gen IktA, mientras que el otro, pAA345, contenía el fragmento Mael entero descrito anteriormente. El clon pAA342 expresaba un péptido de leucotoxina truncada a niveles elevados, mientras que el pAA345 expresaba leucotoxina de longitud completa a niveles muy bajos. En consecuencia, el extremo 3' del gen IktA (fragmento StyI BamHI de pAA345) se ligó al pAA342 digerido por StyI BamHI, obteniéndose el plásmido pAA352. La leucotoxina de P. haemolytica producida a partir del constructo pAA352 se designa en adelante LKT 352.

A continuación, el plásmido pAA352 se utilizó para preparar una versión acortada del polipéptido de leucotoxina recombinante. El gen de LKT acortado se produjo eliminando un fragmento de ADN interno de aproximadamente 1.300 bp de longitud en el gen LKT recombinante, tal como sigue. El plásmido pCB113 (número de acceso ATCC 69749 y descrito en la patente US nº 5.837.268), que incluye el polipéptido LKT 352, se digirió con la enzima de restricción BstB1 (New England Biolabs). A continuación, el plásmido linearizado resultante se digirió con nucleasa Mung Bean (Pharmacia) a efectos de eliminar los terminales salientes de una hebra producidos por digestión con BstB1. A continuación, el ADN despuntado se digirió con la enzima de restricción Nae1 (New England Biolabs), y el ADN digerido se cargó en un gel de agarosa al 1% en el que los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis. Un fragmento grande de ADN, de aproximadamente 6.190 bp, se aisló y purificó a partir del gel de agarosa utilizando un kit Gene Clean (Bio 101), y el fragmento purificado se dejó ligar a sí mismo utilizando bacteriófago T4 ADN ligasa (Pharmacia). La mezcla de ligación resultante se utilizó para transformar células competentes de E. coli JM105, y se identificaron clones positivos por su capacidad de producir una proteína agregada con un peso molecular apropiado. El plásmido recombinante formado de este modo se designó pCB114, (descrito en la patente US nº 5.837.268), y produce un polipéptido de leucotoxina acortado designado "LKT 114".

A continuación, se utilizó el plásmido pCB114 para preparar el plásmido pSLKT-30. El plásmido pSLKT-30 se preparó por clonación del fragmento codificador de leucotoxina de pCB114 mediante PCR en el plásmido pAA352 (Número de acceso ATCC 68283 y descrito en la patente US nº 5.476.657). De este modo, se introdujeron mutaciones cerca del terminal C, lo que dio lugar a dos modificaciones de aminoácido en la molécula de leucotoxina nativa. Así, un fragmento PCR de la zona afectada se volvió a clonar en el plásmido pSLKT-30. Específicamente, un fragmento de pSLKT-30 se creó por PCR utilizando LKT6 (SEC ID nº 40) como el primer PCR en dirección ascendente, y LKT13 (SEC ID nº 41) como el primer PCR en dirección descendente:

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El fragmento contenía la modificación deseada y los lugares de restricción Nsi1 y Nco1. El fragmento aislado se digirió utilizando las enzimas de restricción Nsi1 y Nco1, al igual que el plásmido pSLKT-30. El fragmento Nsi1/Nco1 se extrajo del plásmido y se sustituyó con el fragmento PCR, dando lugar a la mutación nuevamente en la secuencia original. El plásmido se designó pCB150. En la figura 14 se muestra un diagrama del plásmido pCB150. En las figuras 15A-15D se muestra la secuencia de ácido nucleico de LKT 114 a partir del plásmido pCB150.

Ejemplo 3 Construcción de fusiones de multímero de péptido de miostatina LKT

Se utilizaron diversas copias de cada par de oligómeros descrito en el ejemplo 1 para preparar repeticiones en tándem de secuencias codificadoras para multímeros peptídicos de miostatina unidos al gen LKT 114. La parte activa entera de la proteína también se reconstruyó y fusionó con LKT 114 para su utilización como agente inmunizante.

Se construyeron fusiones peptídicas de miostatina-LKT representativas del modo siguiente. Se recocieron y ligaron pares de oligonucleótidos procedentes del ejemplo 1 en el vector pUC19 (Pharmacia), que se había digerido con la endonucleasa de restricción HincII. El ADN ligado se utilizó para transformar la cepa de E. coli TOP1OF' (Invitrogen). Los transformantes que contenían las inserciones de oligonucleótidos se identificaron mediante PCR y mapeo por endonucleasa de restricción.

Los pares de oligonucleótidos se diseñaron para ser enlazados entre sí ligando el lugar BamHI en el extremo anterior de un par de oligonucleótidos al lugar Bg/II en el extremo posterior de una segunda copia del par de oligonucleótidos. Los lugares de restricción en el punto de ligamiento se desactivaron, lo que dejó un único lugar BamHI en el extremo anterior de la repetición y un único lugar Bg/II en el extremo posterior de la repetición. Se construyeron repeticiones en tándem de cada par de oligonucleótidos digiriendo el plásmido que contenía el oligonucleótido con las endonucleasas de restricción BamHI y Bg/II a efectos de liberar el fragmento de oligonucleótido insertado. A continuación, este fragmento se volvió a ligar al plásmido que contenía el oligonucleótido, que se había digerido con la endonucleasa de restricción Bg/II. El ADN ligado se utilizó para transformar la cepa de E. coli TOP10F'. Los transformantes que contenían las repeticiones de las inserciones de oligonucleótidos se identificaron mediante PCR y mapeo por endonucleasa de restricción. Este procedimiento se repitió hasta que se obtuvieron los plásmidos pUC19 conteniendo, por lo menos, cuatro copias repetitivas y hasta 8 copias de carga de oligonucleótidos en la orientación correcta.

Además de estar enlazados a sí mismos, algunos de los pares de oligonucleótidos también se diseñaron para enlazarse entre sí a efectos de recrear la región activa de la proteína miostatina lo más fielmente posible. Esto se llevó a cabo ligando el par de oligonucleótidos MYOS 3/4 cortado con BamHI, Bg/II en el lugar Bg/II detrás del par de oligonucleótidos MYOS 1/2 en el vector pUC19. A continuación, se ligó en el par de oligonucleótidos MYOS 5/6 cortado con BstBI y Bg/II en el vector que contenía la región activa de miostatina reconstruidas con BstBI y Bg/II. El par de oligonucleótidos MYOS 7/8 se cortó con BamHI y Bg/II y se ligó en el vector que contenía la región activa de miostatina reconstruida en el lugar Bg/II. El par de oligonucleótidos MYOS 9/10 que contenía el vector se cortó con EcoRI, y se ligó el fragmento EcoRI de la reconstrucción de miostatina pUC19. El par de oligonucleótidos MYOS 11/12 se cortó con BamHI y Bg/II y se ligó en el vector que contenía la región activa de miostatina reconstruida en el lugar Bg/II. A continuación, se ligó en el par de oligonucleótidos MYOS 13/14 cortado con BsmI y Bg/II en el vector que contenía la región activa de miostatina reconstruida cortada con BsmI y Bg/II. Esto completó la reconstrucción de la secuencia codificadora para la región activa de miostatina, que contenía tres conjuntos de dos linkers de aminoácidos insertados en la secuencia de la región activa de miostatina en las posiciones 55-60, 139-144 y 241-246, y el terminal C (véase la figura 13).

A continuación, las múltiples copias de cada par de oligonucleótidos y la reconstrucción de la región activa de miostatina se liberaron del plásmido pUC19 mediante digestión con las endonucleasas de restricción BamHI y Bg/II. A continuación, estos fragmentos de ADN se ligaron en el plásmido pCB150. El plásmido pCB150 se digirió con la endonucleasa de restricción BamHI. El ADN ligado se utilizó para transformar la cepa de E. coli TOP10F'. Los transformantes que contenían las inserciones de oligonucleótidos se identificaron mediante PCR y mapeo por endonucleasa de restricción. Los plásmidos recombinantes se designaron pJS121, pJS122, pJS123, pJS124, pJS125, pJS126, pJS127, pJS128, pJS129, pJS130, y pCB317.

El plásmido pJS121 contiene 6 copias repetitivas del par de oligonucleótidos MYOS 1/2 fusionado con LKT 114. El plásmido pJS122 contiene 8 copias repetitivas del par de oligonucleótidos MYOS 3/4 fusionado con LKT 114. El plásmido pJS123 contiene 8 copias repetitivas del par de oligonucleótidos MYOS 5/6 fusionado con LKT 114. El plásmido pJS124 contiene 8 copias repetitivas del par de oligonucleótidos MYOS 7/8 fusionado con LKT 114. El plásmido pJS125 contiene 6 copias repetitivas del par de oligonucleótidos MYOS 9/10 fusionado con LKT 114. El plásmido pJS126 contiene 4 copias repetitivas del par de oligonucleótidos MYOS 11/12 fusionado con LKT 114. El plásmido pJS127 contiene 6 copias repetitivas del par de oligonucleótidos MYOS 13/14 fusionado con LKT 114. El plásmido pJS128 contiene 4 copias repetitivas del par de oligonucleótidos MYOS 15/16 fusionado con LKT 114. El plásmido pJS129 contiene 8 copias repetitivas del par de oligonucleótidos MYOS 17/18 fusionado con LKT 114. El plásmido pJS130 contiene 4 copias repetitivas del par de oligonucleótidos MYOS 19/20 fusionado con LKT 114. El plásmido pCB317 contiene una única copia de la reconstrucción de la región activa de la miostatina fusionada con LKT 114.

Ejemplo 4 Purificación de fusiones peptídicas de miostatina-LKT

Las proteínas de fusiones peptídicas miostatina-LKT recombinantes anteriores se expresaron como cuerpos de inclusión y se purificaron utilizando el siguiente procedimiento. Se inoculó un bucle de células procedente de cada stock congelado en 10 ml de caldo TB en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. El caldo TB se suplementó con 100 \mug/ml de ampicilina y se incubó a 37ºC durante 12-16 horas en un agitador Innova 4000 a 250 rpm. El cultivo se utilizó para inocular un litro de caldo TB en un matraz Erlenmeyer de 4 l. El caldo TB se suplementó con 100 \mug/ml de ampicilina y se incubó a 37ºC durante aproximadamente 3 horas en un agitador Innova 4000 a 250 rpm. A continuación, 1 ml de una solución 1 M de IPTG (isopropil-\beta,D-tiogalactopiranósido) se añadió al cultivo a efectos de inducir la producción de proteína recombinante. A continuación, el cultivo se incubó durante otras dos horas. Las células se recogieron por centrifugación durante 10 min a 6.000 rpm en botellas de polipropileno de 3X 500 ml utilizando un rotor JA 10 en una centrifugadora Avanti J25. El comprimido celular se volvió a suspender en 40 ml de sucrosa al 25%, tris-hidrocloruro 50 mM, pH 8,0 y se congeló a -70ºC durante 15 min. Las células congeladas se fundieron a temperatura ambiente y se mezclaron con 10 ml de lisozima (Sigma, 10 mg/ml en tris-hidrocloruro 250 mM, pH 8,0). Tras la incubación durante 15 min sobre hielo, se añadieron 300 ml de tampón de lisis (2% Triton X100, EDTA 50 mM, tris-hidrocloruro 100 mM, pH 8,0) y se mezcló por agitación. A continuación, la suspensión celular lisada se sometió a ultrasonidos con impulsos de 4X 30 segundos a máxima potencia con una sonda grande en un sonicador Misonix. La solución se dividió en botellas de centrifugado de 2X 250 ml y se centrifugó durante 25 min a 10.000 rpm en un rotor JA 14. Los comprimidos de cuerpo de inclusión se lavaron mediante resuspensión en 100 ml de agua bidestilada y centrifugación a efectos de recoger los cuerpos de inclusión. Este procedimiento de lavado se repitió una vez más y el comprimido de cuerpo de inclusión final se suspendió en 10 ml de agua bidestilada y se almacenó a -20ºC hasta su utilización.

Todas las proteínas de fusión aisladas se analizaron por SDS-PAGE a efectos de determinar su identidad por peso molecular, concentración y pureza, comparando las proteínas con estándares conocidos. Se disolvieron alícuotas de 10 \mul de cada proteína de fusión en 10 \mul de urea 8M y a continuación se mezclaron 2 \mul de la proteína disuelta con 100 \mul de tampón de carga 1 X SDS-PAGE. Las muestras de tampón de carga se calentaron a 94ºC durante 5 min y se pasaron por un gel de poliacrilamida al 10%. También se hizo pasar LKT 114 recombinante del pCB150 como control.

Ejemplo 5 Efecto biológico in vivo de las proteínas de fusiones peptídicas LKT-miostatina

A efectos de analizar la capacidad de las proteínas de fusión que comprenden diversas copias de diversos péptidos de miostatina fusionados en una proteína portadora a efectos de manifestar un efecto biológico in vivo, se llevó a cabo el siguiente ensayo de vacunación. Se prepararon proteínas de fusiones peptídicas LKT-miostatina tal como se ha descrito anteriormente. Se prepararon vacunas para cada una de ellas disolviendo cada una de las proteínas de fusión en una concentración final de urea 6 M (utilizada para la primera inyección) o de guanidina-HCl 4 M (utilizada para todas las inyecciones posteriores). A alícuotas de 2,5 ml (utilizadas para las dos primeras inyecciones) o 1,5 ml (utilizadas para la última inyección) de adyuvante VSA-3 (un adyuvante Emulsigen Plus modificado), se añadieron 1.250 \mug de cada proteína disuelta y se mezclaron mediante impulsos de 5X5 segundos con un sonicador Misonix con una sonda de microaguja con un ajuste de potencia de 5. A estas mezclas se añadieron 50 \mul de una solución al 1% de timerosal y PBS pH 7,4 (solución salina tampón de fosfato) hasta un volumen final de 5 ml, y las mezclas se sometieron de nuevo a ultrasonidos. Se utilizó un volumen de 200 \mul para cada inyección. Cada inyección contenía 50 \mug de proteína de fusión. Esta inyección inicial (día 0) se administró a las 3-4 semanas de edad, con inyecciones subsiguientes en los días 28 y 56.

Cada uno de los catorce grupos de tratamiento contenía 15 ratones suizos CD1. Los grupos de tratamiento eran los siguientes (véase tabla 1): grupo 1, control de no vacunación; grupo 2, control de sólo adyuvante; grupo 3, control de proteína portadora pCB150; grupos 4 a 13, proteínas de ensayo pJS121 a pJS130; grupo 14, proteína de ensayo pCB317. Los ratones se pesaron cada semana a efectos de determinar la ganancia de peso en el transcurso de los 98 días de experimento. Los resultados de este ensayo se resumen en la tabla 2 y en la figura 18. Se utilizó guanidina-HCl como agente disolvente de preferencia, ya que parecía conferir una mejor estabilidad proteínica que la urea en la formulación de vacuna. La concentración de VSA-3 se redujo del 50% al 30% en la formulación de vacuna en un esfuerzo para reducir las reacciones en el lugar de inyección.

2

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3

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Ejemplo 6 Análisis estadístico de los resultados del ensayo

El análisis estadístico de los resultados del ensayo se llevó a cabo utilizando un paquete de software de estadística (Statistix Version 1.0). En este ensayo, todos los grupos de control tenían pesos totales promedio similares, mientras que diversos grupos de ensayo presentaban pesos totales promedio elevados. Se llevó a cabo un ensayo ANOVA de una vía sobre la ganancia de peso durante los 98 días del experimento. Una comparación LSD del ensayo de promedios indicó que el grupo de tratamiento 13 era significativamente diferente de cualquiera de los grupos de control. Los grupos de ensayo 12 y 6 eran significativamente diferentes de dos de los tres grupos de control. Los grupos de tratamiento también se analizaron agrupándolos en controles (grupos 1-3) y grupos de ensayo (grupos 4-14). Se llevó a cabo un ensayo ANOVA de una vía sobre las ganancias de peso de estos dos grupos. Una comparación LSD del ensayo de promedios indicó que el grupo que había recibido un tratamiento de ensayo era significativamente distinto del grupo de control.

Depósitos de cepas útiles para la práctica de la invención

Se estableció un depósito de cultivos biológicamente puros de las siguientes cepas con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA. El número de acceso indicado se asignó tras un ensayo de viabilidad exitoso y tras el pago de las tarifas correspondientes. Los depósitos se establecieron según las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y sus regulaciones (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de cultivos viables durante un periodo de treinta (30) años a partir de la fecha del depósito y, por lo menos, de cinco (5) años tras la última solicitud de suministro de una muestra del depósito por parte del depositario. Los organismos estarán disponibles a través de la ATCC en los términos del Tratado de Budapest, que garantiza la disponibilidad permanente y sin restricciones de los cultivos para aquel designado apto por el U.S. Commissioner of Patents and Trademarks (Oficina de Patentes y Marcas Registradas de EE.UU.) según 35 U.S.C. \NAK122 y las normativas de la Oficina de acuerdo con el mismo (incluyendo 37 C.F.R. \NAK1.12). Tras la concesión de una patente, todas las restricciones sobre la disponibilidad para el público de los cultivos depositados serán levantadas irrevocablemente.

4

De este modo, se dan a conocer péptidos, multímeros e inmunoconjugados de miostatina inmunogénicos, así como métodos para prepararlos y utilizarlos. Aunque se han descrito con cierto detalle formas de realización preferidas del objeto de la presente invención, se entiende que se pueden llevar a cabo variaciones obvias sin apartarse del alcance de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

<110> Metamorphix International, Inc

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<120> Composiciones inmunológicas para modular la miostatina en vertebrados

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<130> P009750EPA

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<150> US 60/075,213

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<151> 1998-02-19

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<160> 39

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<170> PatentIn Ver 2.0

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<210> 1

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<211> 1128

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<212> ADN

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<213> Bos taurus

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<400> 1

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5

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<210> 2

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 2

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6

7

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<210> 3

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<211> 60

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(60)

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificadora de péptido MYOS 1, Figura 2

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<400> 3

\hskip1cm

8

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<210> 4

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 4

\hskip1cm

9

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<210> 5

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artifical: secuencia codificadora de péptido MYOS 3, Figura 3

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(51)

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<400> 5

\hskip1cm

10

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<210> 6

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 6

\hskip1cm

11

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<210> 7

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artifical: secuencia codificadora de péptido MYOS 5, Figura 4

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1) .. (57)

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<400> 7

\hskip1cm

12

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<210> 8

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 8

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\hskip1cm

13

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<210> 9

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<211> 54

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artifical: secuencia codificadora de péptido MYOS 7, Figura 5

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(54)

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<400> 9

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\hskip1cm

14

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<210> 10

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 10

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\hskip1cm

15

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<210> 11

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<211> 72

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artifical: secuencia codificadora de péptido MYOS 9, Figura 6

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(72)

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<400> 11

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\hskip1cm

16

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<210> 12

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 12

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\hskip1cm

17

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<210> 13

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<211> 81

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artifical: secuencia codificadora de péptido MYOS 11, Figura 7

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1) .. (81)

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<400> 13

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\hskip1cm

18

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<210> 14

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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\newpage

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<400> 14

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\hskip1cm

19

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<210> 15

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<211> 72

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artifical: secuencia codificadora de péptido MYOS 13, Figura 8

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(72)

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<400> 15

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\hskip1cm

20

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<210> 16

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 16

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\hskip1cm

21

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<210> 17

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<211> 63

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artifical: secuencia codificadora de péptido MYOS 15, Figura 9

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(63)

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<400> 17

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\hskip1cm

22

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<210> 18

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 18

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\hskip1cm

23

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<210> 19

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<211> 60

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artifical: secuencia codificadora de péptido MYOS 17, Figura 10

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(60)

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<400> 19

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24

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<210> 20

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<400> 20

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25

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<210> 21

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<211> 60

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artifical: secuencia codificadora de péptido MYOS 19, Figura 11

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(60)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región activa de miostatina reconstruida, Figura 13

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(372)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

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29

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1473

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuandi artifical: portador de polipéptido de leucotoxinas, Figuras 15A-15D

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1) .. (1473)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

33

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 490

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

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34

35

36

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

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<211> 376

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 27

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37

38

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<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 376

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 29

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41

42

43

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<210> 30

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> Papio hamadryas

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<400> 30

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44

45

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 31

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46

47

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> Sus scrofa

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<400> 32

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48

49

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> Ovis aries

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<400> 33

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50

51

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> Gallus gallus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

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52

53

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Meleagris gallopavo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

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54

55

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<210> 36

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<211> 374

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<212> PRT

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<213> Danio rerio

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido de miostatina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido de miostatina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

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<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido de miostatina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

Claims

1. Composición de vacuna que comprende un inmunoconjugado de miostatina que comprende un multímero de miostatina que comprende la fórmula general (MP-X-MP)y, en la que MP es un polipéptido de miostatina seleccionado de entre el grupo constituido por:

a) aminoácidos 3-15 de SEC ID nº 6;

b) aminoácidos 3-17 de SEC ID nº 8;

c) aminoácidos 3-16 de SEC ID nº 10;

d) aminoácidos 3-22 de SEC ID nº 16;

e) aminoácidos 3-18 de SEC ID nº 18;

f) aminoácidos 3-18 de SEC ID nº 20, y;

g) aminoácidos 3-18 de SEC ID nº 22,

X se selecciona de entre el grupo constituido por un enlace peptídico, un grupo espaciador aminoácido, y [MP]_{n}, en el que n es mayor o igual a 1, e y es mayor o igual a 1; y en la que dicho multímero de miostatina está fusionado a un polipéptido de leucotoxina; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que X comprende un grupo espaciador aminoácido que incluye, por lo menos, un epítope de célula T auxiliar.

3. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho multímero comprende, por lo menos, dos copias de SEC ID nº 6.

4. Composición de vacuna según la reivindicación 3, en la que dicho multímero comprende ocho copias de SEC ID nº 6 fusionadas con LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A a 15D (SEC ID nº 26).

5. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho multímero comprende, por lo menos, dos copias de SEC ID nº 8.

6. Composición de vacuna según la reivindicación 5, en la que dicho multímero comprende ocho copias de SEC ID nº 8 fusionadas con LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A a 15D (SEC ID nº 26).

7. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho multímero comprende, por lo menos, dos copias de SEC ID nº 10.

8. Composición de vacuna según la reivindicación 7, en la que dicho multímero comprende ocho copias de SEC ID nº 10 fusionadas con LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A a 15D (SEC ID nº 26).

9. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho multímero comprende, por lo menos, dos copias de SEC ID nº 16.

10. Composición de vacuna según la reivindicación 9, en la que dicho multímero comprende seis copias de SEC ID nº 16 fusionadas con LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A a 15D (SEC ID nº 26).

11. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho multímero comprende, por lo menos, dos copias de SEC ID nº 18.

12. Composición de vacuna según la reivindicación 11, en la que dicho multímero comprende cuatro copias de SEC ID nº 18 fusionadas con LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A a 15D (SEC ID nº 26).

13. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho multímero comprende, por lo menos, dos copias de SEC ID nº 20.

14. Composición de vacuna según la reivindicación 13, en la que dicho multímero comprende ocho copias de SEC ID nº 20 fusionadas con LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A a 15D (SEC ID nº 26).

15. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicho multímero comprende, por lo menos, dos copias de SEC ID nº 22.

\newpage

16. Composición de vacuna según la reivindicación 15, en la que dicho multímero comprende cuatro copias de SEC ID nº 22 fusionadas con LKT 114, tal como se representa en las figuras 15A a 15D (SEC ID nº 26).

17. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende asimismo un adyuvante.