PT1056845E

PT1056845E - Composições imunologicas para modular a miostatina em vertebrados

Info

Publication number: PT1056845E
Application number: PT99904660T
Authority: PT
Inventors: Christopher A Barker; Mohamad Morsey
Original assignee: Metamorphix International Inc
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2007-04-30
Also published as: AR019818A1; DK1056845T3; IL137831A0; DK1770162T3; CA2687533C; EP1770162A1; ATE352619T1; DE69940230D1; US6369201B1; ATE419353T1; EP1056845B1; ZA991369B; DE69934970D1; AU765014B2; JP2002504326A; EP2018871A1; CY1108074T1; CY1108889T1; EP1770162B1; CA2323607C

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES IMUNOLÓGICAS PARA MODULAR A MIOSTATINA EM VERTEBRADOS" Área Técnica São descritas composições para aumentar a síntese de músculo e tratar doenças em vertebrados.

Mais particularmente, são descritas composições imunológicas para reduzir a actividade da miostatina em vertebrados.

Antecedentes da Invenção

Os produtores de gado têm utilizado tradicionalmente programas de reprodução para seleccionar animais que produzam quantidades máximas de proteína com um desempenho aceitável como avaliado pela eficiência alimentar, função reprodutora e estado geral de saúde. Gado que apresenta aumento da massa muscular devido a hipertrofia e hiperplasia das células musculares tem sido observado num número de raças. A incidência desta condição, a qual é mencionada como musculação dupla, é mais pronunciada em gado Belga Azul. Nestes animais a massa muscular sofre um aumento de aproximadamente 20% com uma diminuição do osso e massa de gordura (Shahin e Berg, Can. J. Anim. Sei. (1985) _65_:279-293) . O gado Belga Azul também utiliza a alimentação eficientemente e dá origem a uma maior percentagem de peças de carne desejáveis (Casas et al., J. Anim. Sei. (1997) 75. (Supl. 1):149). A musculação dupla no gado Belga Azul é hereditária e julga-se que seja recessiva uma vez que os heterozigotos podem ser normais ou ter apenas um aumento modesto na massa muscular. 2

Apesar das vantagens desta condição, o gado de músculo duplo tem frequentemente caracteristicas indesejáveis. Por exemplo, devido ao facto dos vitelos serem geralmente 10-38% mais pesados que o normal há uma predominância de distocias, que requerem partos por cesariana. Os animais também apresentam reprodução anormal devido a aparelhos reprodutores mal desenvolvidos e possuem outras anormalidades anatómicas tal como macroglossia. Outras raças de gado, tal como a Piemontese do Norte de Itália, possuem graus variáveis de musculação dupla e apresentam também muitas destas caracteristicas indesejáveis. A caracteristica de musculação dupla identificada em algumas raças de gado foi agora atribuída a mutações no gene da miostatina (Grobet et al., Nature Genetics (1997) ^17: 71-74; Kambadur et al., Genome Research (1997) 1_:910-915; McPherron e Lee, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 9_4:12457-12461) . Esta mutação parece resultar principalmente num aumento no número de células musculares (hiperplasia) do que num aumento no tamanho das fibras musculares individuais (hipertrofia). A condição referida como hipertrofia muscular também foi identificada na raça Pietrain de porcos. Esta condição não está relacionada com o gene da miostatina e foi identificada como uma mutação num gene responsável pelo transporte de cálcio.

McPherron et al., Nature (1997) 387:83-90 identificaram um membro da superfamília de factor transformante de crescimento-β (TGF-β) de proteínas em ratinhos, mencionado como factor de crescimento/diferenciação-8 (GDF-8). O GDF-8 actua como um regulador negativo para o crescimento do músculo-esquelético e é expressado nos músculo-esqueléticos em 3 desenvolvimento e no adulto. Experiências de inactivação total de gene em ratinhos resultaram em mutantes homozigotos os quais são 30% maiores do que os ratinhos de tipo normal. Este aumento no tamanho é devido principalmente a um aumento na massa muscular com os músculos individuais dos mutantes a pesar 2-3 vezes mais do que os dos ratinhos de tipo normal (McPherron et al., Nature (1997) 387:83-90) . McPherron e Lee, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 9jk 12457-12461 e Grobet et al., Nature Genetics (1997) 1_7:71-74 avaliaram sequências genómicas semelhantes num número de espécies, incluindo gado, e descreveram que o gado de músculo duplo tinha defeitos no gene que codifica uma proteína extremamente homóloga ao GDF-8. Esta proteína é agora chamada de miostatina.

Deste modo parece que a miostatina é produzida pelas células musculares e regula a proliferação e diferenciação de mioblastos. No gado Belga Azul e Piemontese, julga-se que os defeitos naturais no gene resultem quer na produção de uma proteína anormal ou numa quantidade reduzida de miostatina, qualquer uma das quais tem o efeito de aumentar o crescimento muscular. 0 gene da miostatina de um número de espécies de vertebrados, incluindo ratinhos, ratos, humanos, babuínos, gado, porcos, ovelhas, frangos, perus e peixe zebra foi identificado e as proteínas sequenciadas (McPherron e Lee, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 94:12457-12461). A sequência proteica da miostatina é extremamente conservada através de todas estas espécies. De modo semelhante foi determinada a sequência de nucleótidos para a miostatina de ratinhos, ratos, humanos, babuínos, gado, porcos, ovelhas, 4 frangos e perus. Ver, por exemplo, Patente U.S. n° 5 827 733 para as sequências de nucleótidos de miostatina de murídeos e humanos; a Publicação Internacional n° WO 99/02667 para a sequência de nucleótidos da miostatina bovina; a Publicação Internacional n° WO 98/33887, para as sequências de nucleótidos de miostatina de ratos, humanos, babuínos, bovinos, suínos, ovinos, frangos e perus. A sequência de nucleótidos do gene da miostatina prevê uma proteína com cerca de 376 aminoácidos com uma massa molecular de aproximadamente 43 kDa. Esta proteína contém uma sequência líder de secreção e um sítio de processamento proteolítico o qual liberta um péptido de 13 kDa, contendo 9 resíduos de cisteína. A miostatina clonada expressada em células de ovários de hamster Chinês produz duas proteínas. A primeira tem uma massa molecular aparente de cerca de 52 kDa e a segunda de cerca de 15 kDa. Em condições não redutoras, estas proteínas surgem como dímeros com massas moleculares de cerca de 101 kDa e 25 kDa (McPherron et al., Nature (1997) 387 : 83-90).

Investigadores propuseram a administração de miostatina mutante a animais para a produção de espécies transgénicas possuindo maior massa muscular. Ver, por exemplo, Publicação Internacional n° WO 98/33887. No entanto, estas abordagens colocam vários inconvenientes. Por exemplo, uma vez que o gene da miostatina se torna activo durante a fase embrionária, uma produção diminuída de miostatina provoca um desenvolvimento excessivo de músculo no útero. Deste modo, os animais transgénicos que incluem genes mutantes requererão com grande probabilidade parto por cesariana, um encargo significativo para os grandes produtores de animais. Além disso existe uma 5 oposição pública a animais manipulados geneticamente para consumo humano pelo que seria desejável ter outros métodos para a produção desses animais.

Outras abordagens incluem a utilização de antigénios de miostatina para gerar anticorpos contra a miostatina: Publicação Internacional n° WO9902667. Embora tenham sido descritos alguns determinantes antigénicos de miostatina (Publicação Internacional n° W094/21681), existe uma necessidade de proporcionar determinantes antigénicos adequados para induzir um aumento na massa muscular.

Descrição da Invenção A invenção relaciona-se com determinadas composições imunológicas para modular a actividade endógena da miostatina num vertebrado. Pode tratar-se um número de patologias em vertebrados, incluindo humanos e outros animais, tal como uma diversidade de distúrbios que provocam degeneração ou emaciação do músculo. Devido à natureza ubiqua da miostatina, as composições e os métodos aqui descritos encontram aplicação numa grande variedade de vertebrados, como se descreve mais abaixo.

Surpreendentemente, estes resultados são conseguidos por técnicas imunológicas. É claramente conhecido na técnica que a imunização contra moléculas endógenas, tal como miostatina, é problemática porque o sistema imune não reconhece estas moléculas "próprias". Assim é proporcionada uma solução para um problema que seria normalmente encontrado quando se imuniza contra uma substância endógena. 6

Polipéptidos de miostatina de vários organismos são apresentados nas Figuras 1A-1D (SEO ID NOS:27-36).

Os péptidos de miostatina consistem de cerca de 3 até cerca de 200 aminoácidos e são provenientes de uma região da miostatina seleccionada do grupo consistindo da região de miostatina que atravessa e inclui os aminoácidos 1 até 350, aminoácidos 1 até 275, aminoácidos 25 até 300, aminoácidos 50 até 325 e aminoácidos 75 até 350, inclusive, das Figuras 1A-1D (SEQ ID NOS:27-36).

Um péptido de miostatina pode compreender a sequência de aminoácidos Lys-Arg-Serg-Arg-Arg-Asp (SEQ ID NO:37), a sequência de aminoácidos Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO:38) ou a sequência de aminoácidos Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO:39).

Um multimero de miostatina pode ser construído juntando dois ou mais imunogénios de miostatina seleccionados, em que cada um dos imunogénios compreende independentemente pelo menos 3 aminoácidos que definem pelo menos um determinante antigénico de miostatina. Cada um dos imunogénios de miostatina seleccionados consiste independentemente de cerca de 3 até cerca de 200 aminoácidos, ou cerca de 3 até cerca de 100 aminoácidos, ou cerca de 3 até cerca de 30 aminoácidos, ou cerca de 3 até cerca de 15 aminoácidos. Cada um dos imunogénios de miostatina seleccionados num multimero pode compreender independentemente um péptido de miostatina seleccionado como descrito acima. O multimero pode compreender uma molécula com unidades estruturais de acordo com a fórmula geral (MP-X-MP)y, em que MP é um péptido de miostatina, X é seleccionado do grupo consistindo de uma ligação peptídica, 7 um grupo espaçador de aminoácidos, um polipéptido de leucotoxina e [MP]n, em que n é maior ou igual a 1, e y é maior ou igual a 1.

Um imunoconjugado de miostatina pode ser produzido ligando pelo menos um péptido ou multimero de miostatina, como se descreveu acima, a um veiculo imunológico.

Pode produzir-se composições para vacinas compreendendo o péptido de miostatina, o multimero de miostatina e/ou o imunoconjugado de miostatina, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Pode obter-se polinucleótidos que codificam os péptidos de miostatina, os multimeros de miostatina e os imunoconjugados de miostatina anteriores, assim como vectores recombinantes compreendendo os polinucleótidos, células hospedeiras transformadas com os vectores recombinantes, e métodos para produzir de modo recombinante os péptidos de miostatina, multimeros de miostatina e imunoconjugados de miostatina. A presente invenção lida com o problema de induzir uma resposta imunológica contra um imunogénio de miostatina num vertebrado para reduzir a actividade endógena da miostatina no vertebrado e conduzir a pelo menos um dos efeitos biológicos seguintes: (a) um aumento do peso corporal; (b) um aumento da massa muscular; (c) um aumento do número de células musculares; (d) um aumento do tamanho das células musculares; (e) uma redução do teor de gordura do organismo; (f) um aumento da robustez muscular; (g) um aumento do tecido das glândulas mamárias; 8 (h) um aumento da lactação; (i) um aumento do apetite ou ingestão de alimentos; ou (j) um aumento da longevidade do vertebrado.

Estes são efeitos desejáveis, úteis no tratamento de um distúrbio que compreende a degeneração ou emaciação de músculo num vertebrado.

Estes efeitos podem ser conseguidos administrando composições para vacinas ou polinucleótidos adequados ao indivíduo. A invenção proporciona uma tal composição adequada, a invenção proporciona um conjugado de um multímero de miostatina ligado a um polipéptido de leucotoxina, em que o multímero tem a fórmula geral (MP-X-MP)y, como se definiu acima, e MP é seleccionado dos aminoácidos 3-15, inclusive, da SEQ ID N0:6; aminoácidos 3-17, inclusive, da SEQ ID N0:8; aminoácidos 3-16, inclusive, da SEQ ID NO:10; aminoácidos 3-22, inclusive, da SEQ ID NO:12; aminoácidos 3-25, inclusive, da SEQ ID NO:14; aminoácidos 3- 22, inclusive, da SEQ ID NO:16; aminoácidos 3-18, inclusive, da SEQ ID NO: 20; e aminoácidos 3-18, inclusive, da SEQ ID NO:22.

As formas de realização preferidas da presente invenção são definidas nas reivindicações 2-16.

Breve Descrição das Figuras

As Figuras 1A-1D mostram uma comparação de miostatinas derivadas de várias espécies como se segue: Ratinho (SEQ ID NO:27); Rato (SEQ ID NO:28); Humano (SEQ ID NO:29); Babuíno (SEQ ID NO:30) ; Bovino (SEQ ID NO:31); Suíno (SEQ ID 9 NO:32); Ovino (SEQ ID NO: 33); Frango (SEQ ID NO:34); Peru (SEQ ID NO: 35) ; e peixe zebra (SEQ ID NO:36). Os aminoácidos estão numerados à direita e esquerda das sequências. A Figura 2 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO: 4) do péptido MYOS 1. O MYOS 1 inclui o sítio de clivagem proteolitica, Arg-Ser-Arg-Arg e a extremidade N da proteína activa. A Figura 3 representa a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:5) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:6) do péptido MYOS 3. A Figura 4 representa a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:7) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:8) do péptido MYOS 5. A Figura 5 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 9) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:10) do péptido MYOS 7. A Figura 6 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:11) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:12) do péptido MYOS 9. A Figura 7 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:13) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:14) do péptido MYOS 11. A Figura 8 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:15) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:16) do péptido MYOS 13. A Figura 9 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:17) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:18) do péptido MYOS 15. A Figura 10 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:19) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:20) do péptido MYOS 17. 10 A Figura 11 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:21) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO: 22) do péptido MYOS 19. O MYOS 19 inclui o sitio de clivagem proteolitica, Arg-Ser-Arg-Arg. A Figura 12 mostra a posição aproximada dos péptidos MYOS 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 dentro da sequência de miostatina. A Figura 13 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:23) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:24) para uma região activa de miostatina reconstruída contendo três conjuntos de grupos de ligação de aminoácidos (Arg-Ser) inseridos na sequência nas posições 55-60, 139-144 e 241-246 do nucleótido e na extremidade C. A Figura 14 é um diagrama de plasmideo pCBl50, que codifica um veiculo polipéptido de leucotoxina e que é utilizado para gerar vectores de expressão de miostatina como se descreve nos exemplos.

As Figuras 15A-15D mostram a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:25) e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO:26) do veiculo polipéptido de leucotoxina presente no plasmideo pCB150. Repetições oligo de miostatina são inseridas no sitio BamHl presente na posição 3334 do nucleótido. A Figura 16A mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO:l) e a Figura 16B mostra a sequência de aminoácidos prevista (SEQ ID NO:2) de uma miostatina representativa para ser utilizada na presente invenção. O sítio de clivagem proteolitica encontra-se nas posições 263-266 da Figura 16B. A região activa de miostatina do polipéptido atravessa os aminoácidos 264-375. A Figura 17 mostra um perfil de hidrofilicidade da proteína miostatina. O perfil foi calculado utilizando um comprimento médio de grupo de seis aminoácidos. Os três 11 pontos mais altos de hidrofilicidade encontram-se nas posições de aminoácido 263-268, os quais percorrem o sítio de clivagem proteolítica; nas posições 31-37; e nas posições 106-111. A Figura 18 mostra a quantidade de ganho de peso em animais tratados com imunogénios do péptido de miostatina, como se descreve nos exemplos.

Descrição Pormenorizada A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, virologia, tecnologia de ADN recombinante e imunologia, as quais estão dentro da perícia na técnica. Estas técnicas são explicadas em pormenor na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning, vol. I e II (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning·, a série, Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); e Handbook of Experimental Immunology, Vol. I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications). A. Definições

Ao descrever a presente invenção serão empregues os termos seguintes, os quais são definidos como se indica a seguir.

Por "imunogénio de miostatina" refere-se um polipéptido derivado de uma molécula de miostatina o qual induz uma resposta imunológica como se define abaixo. O termo inclui moléculas que induzem uma resposta imunológica 12 sem um veículo, adjuvante ou imunoestimulante imunológico associado, assim como moléculas de miostatina capazes de se tornarem imunogénicas, ou mais imunogénicas, por associação a uma molécula portadora, adjuvante ou imunoestimulante, ou por mutação de uma sequência nativa, e/ou por incorporação numa molécula contendo várias unidades estruturais de pelo menos um determinante antigénico de uma molécula de miostatina. 0 termo pode ser utilizado para referir uma macromolécula individual ou uma população homogénea ou heterogénea de macromoléculas antigénicas derivadas de miostatina.

Um imunogénio de miostatina pode ser proveniente de qualquer uma das várias sequências de miostatina conhecidas, incluindo sem restrição, polipéptidos de miostatina provenientes de ratinho, rato, humano, babuíno, gado, porco, ovelha, frango, peru e peixe zebra (ver, McPherron e Lee, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 9_4:12457-12461) . A sequência da proteína de miostatina está extremamente conservada ao longo de todas estas espécies (ver Figuras 1A-1D).

Como aqui utilizado um "imunogénio de miostatina" também inclui uma molécula derivada de uma sequência natural de miostatina, bem como polipéptidos produzidos de modo recombinante ou sintetizados quimicamente incluindo a sequência de referência da miostatina completa, assim como péptidos de miostatina que permanecem imunogénicos, como se descreve abaixo.

Um "péptido de miostatina" é um imunogénio de miostatina, como aqui descrito, o qual inclui menos do que a totalidade da molécula de referência da miostatina em 13 questão e o qual inclui pelo menos um determinante antigénico como se define a seguir. Deste modo, uma composição de vacina compreendendo um péptido de miostatina incluiria uma parte da molécula completa mas não a totalidade da molécula de miostatina em questão.

Por "multímero de miostatina" refere-se uma molécula possuindo mais do que uma cópia de um imunogénio de miostatina, péptido de miostatina ou determinante antigénico seleccionado, ou repetições tandem múltiplas de um imunogénio de miostatina, péptido de miostatina ou determinante antigénico seleccionado. 0 multímero de miostatina da invenção corresponde a uma molécula como descrita na reivindicação 1.

Por conseguinte, Y pode definir 1-40 ou mais unidades estruturais, mais preferencialmente, 1-30 unidades estruturais e muito preferencialmente, 1-20 unidades estruturais.

Adicionalmente, se os péptidos de miostatina estiverem ligados quimicamente ou de modo recombinante a um veículo, os péptidos de miostatina podem estar ligados à extremidade 5', à extremidade 3' ou podem flanquear o veículo em questão. Além disso, o multímero de miostatina pode estar localizado em sítios internos ao veículo. Os multímeros de miostatina são discutidos em mais pormenor abaixo.

Uma "resposta imunológica" a um imunogénio ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imunológica celular e/ou mediada por anticorpo ao imunogénio ou vacina de interesse. Em geral, uma tal resposta inclui mas não se limita a um ou mais dos efeitos seguintes; a produção de 14 anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas e/ou células T γδ, dirigidas especificamente para um imunogénio ou imunogénios incluídos numa composição ou vacina de interesse. Uma resposta imunológica pode ser detectada utilizando qualquer um de vários ensaios bem conhecidos na técnica, tais como imunoensaios e ensaios de neutralização correntes, incluindo transferências de Western, transferências de manchas e ensaios de imunoafinidade. A presença de respostas imunológicas mediadas por células pode ser determinada utilizando ensaios células citotóxicos CTL, bem conhecidos na técnica, tal como o ensaio descrito em Erickson et al. J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; e Doe et al. Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376.

Um "determinante antigénico" refere-se a qualquer fracção ou região de uma molécula com a capacidade ou potencial para induzir, e combinar-se com, um anticorpo específico para a miostatina. Para os efeitos da presente invenção, um polipéptido determinante antigénico incluirá geralmente pelo menos cerca de 3 aminoácidos, preferencialmente pelo menos cerca de 5 aminoácidos e muito preferencialmente pelo menos cerca de 10-15 aminoácidos até 20-30 ou mais aminoácidos, da molécula de referência. Não existe nenhum limite superior crítico em relação ao comprimento do fragmento, o qual poderá compreender quase a totalidade de uma sequência proteica ou até mesmo uma proteína de fusão compreendendo dois ou mais determinantes antigénicos da proteína em questão.

Os determinantes antigénicos em moléculas de polipéptido podem ser identificados utilizando qualquer número de técnicas de mapeamento de determinantes 15 antigénicos, bem conhecidas na matéria. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols em Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por exemplo, os determinantes antigénicos lineares podem ser determinados, por exemplo, sintetizando concorrentemente um grande número de péptidos em suportes sólidos, correspondendo os péptidos a fracções da molécula de proteina e fazendo reagir os péptidos com anticorpos enquanto os péptidos estão ainda ligados aos suportes. Estas técnicas são conhecidas na matéria e estão descritas, por exemplo, na Patente U.S. n° 4 708 871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23_:709-715. De modo semelhante, os determinantes antigénicos conformacionais são facilmente identificados determinando a conformação espacial de aminoácidos tal como, por exemplo, por cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Também se pode utilizar programas de computador que elaboram escalas de hidropatia a partir da sequência de aminoácidos da proteina, utilizando as propriedades hidrófobas e hidrófilas de cada um dos 20 aminoácidos, como descrito, por exemplo, em Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132; e Hopp e Woods, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981) 78g3824-3828, para determinar as partes antigénicas de uma dada molécula. Por exemplo, a técnica de Hopp e Woods atribui a cada aminoácido um valor numérico de hidrofilicidade e depois determina repetitivamente a média destes valores ao longo da cadeia do péptido. Os pontos de hidrofilicidades médias locais mais elevadas são indicativos de partes antigénicas da molécula. 16

Por "veículo imunológico" refere-se qualquer molécula que, quando associada a um imunogénio da miostatina de interesse, confere imunogenicidade a essa molécula, ou intensifica a imunogenicidade da molécula. Exemplos de veículos adequados incluem macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tais como: proteínas; polissacáridos, tais como sepharose, agarose, celulose, esferas de celulose e semelhantes; aminoácidos poliméricos tais como poli(ácido glutâmico), polilisina e semelhantes; copolímeros de aminoácidos; partículas de vírus inactivos; toxinas bacterianas tais como toxóide da difteria, tétano, cólera, moléculas de leucotoxina e semelhantes. Os veículos são descritos a seguir em mais pormenor.

Um imunogénio de miostatina está "ligado" a uma molécula veículo especificada quando o imunogénio está quimicamente acoplado ou associado ao veículo, ou quando o imunogénio é expressado de uma molécula de ADN quimérico que codifica o imunogénio e o veículo de interesse.

Um "imunoconjugado" é um imunogénio de miostatina tal como um péptido ou multímero de miostatina o qual está ligado a uma molécula veículo, como se definiu acima. O termo "polipéptido de leucotoxina" ou "polipéptido de LKT" refere-se a um polipéptido que é derivado de uma proteína pertencente à família de moléculas caracterizadas pela sequência de aminoácidos consenso da extremidade carboxilo Gly-Gly-X-Gly-X-Asp (Highlander et al. (1989) DNA 8_: 15-28), em que X é Lys, Asp, Vai ou Asn. Estas proteínas incluem, entre outras, leucotoxinas provenientes de P. haemolytica e Actinobacillus pleuropneumoniae, assim como hemolisina alfa de E. coli (Strathdee et al. (1987) Infect. 17

Immun. 55:3233-3236; Lo (1990) Can. J. Vet. Res. 54:S33-S35; Welch (1991) Mol. Microbiol. 5^:521-528). Esta família de toxinas é conhecida como a família "RTX" de toxinas (Lo (1990) Can. J. Vet. Res. 54:S33-S35). Além disso, o termo "polipéptido de leucotoxina" refere-se a um polipéptido de leucotoxina que é sintetizado quimicamente, isolado de um organismo que o expressa ou produzido de modo recombinante. Além disso, o termo tem em consideração uma proteína imunogénica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente homóloga a uma sequência contígua de aminoácidos presente na molécula de leucotoxina natural em especial. Deste modo, o termo inclui sequências completas e parciais, assim como análogos. Embora as leucotoxinas nativas completas apresentem actividade citotóxica, o termo "leucotoxina" também abrange moléculas que permaneçam imunogénicas ainda que careçam do carácter citotóxico das leucotoxinas nativas. Conhece-se as sequências de nucleótidos e as sequências de aminoácidos correspondentes para várias leucotoxinas. Ver, por exemplo, Patentes U.S. n° 4 957 739 e 5 055 400; Lo et al. (1985) Infect. Immun. .50:667-67; Lo et al. (1987) Infect. Immun. 55:1987-1996; Strathdee et al. (1987) Infect. Immun. 55:3233-3236; Highlander et al. (1989) DNA 8:15-28; e Welch (1991) Mol. Microbiol. _5 :521-528. Em formas de realização preferidas da invenção são proporcionadas quimeras de leucotoxina possuindo uma sequência seleccionada de polipéptido de leucotoxina que confere maior imunogenicidade a um ou mais multímeros de miostatina com elas fundidos.

Exemplos particulares de polipéptidos de leucotoxina imunogénicos para serem utilizados na presente invenção são moléculas truncadas de leucotoxina descritas nas Patentes U.S. n° 5 476 657 e 5 837 268. Estas moléculas truncadas 18 incluem LKT 352, LKT 111 e LKT 114. A LKT 352 é derivada de um gene lktA presente no plasmideo pAA352 (N° de Registo ATCC 68283). A sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos correspondente deste gene são descritas na Patente U.S. 5 476 657. 0 gene codifica uma leucotoxina truncada, possuindo 914 aminoácidos e uma massa molecular estimada de aproximadamente 99 kDa. A LKT 111 é um polipéptido de leucotoxina derivado de um gene lktA presente no plasmideo pCBlll (N° de Registo ATCC 69748). A sequência de nucleótidos deste gene e a sequência de aminoácidos correspondente são descritas na Patente U.S. n° 5 837 268. 0 gene codifica uma versão mais curta da leucotoxina a qual foi desenvolvida a partir do gene recombinante da leucotoxina presente no plasmideo pAA352 (N° de Registo ATCC 68283) por remoção de um fragmento de ADN interno com aproximadamente 1300 pb de comprimento. O polipéptido LKT 111 tem uma massa molecular estimada de 52 kDa (que compara com os 99 kDa do polipéptido LKT 352), mas retém partes da extremidade N do LKT 352 contendo determinantes antigénicos de células T os quais são necessários para imunogenicidade suficiente de células T e partes da extremidade C do LKT 352 contendo sítios de restrição convenientes para serem utilizados na produção de proteínas de fusão para utilização na presente invenção. A LKT 114 é proveniente do gene presente no plasmideo pAAH4 (descrito na Patente U.S. n° 5 837 268) e é mostrada aqui nas Figuras 15A-15D. A LKT 114 difere da LKT 111 por uma delecção adicional de aminoácido da parte interna da molécula. "Adjuvantes" refere-se a agentes que actuam de uma maneira não específica para aumentar uma resposta imunológica a um antigénio particular, reduzindo deste modo 19 a quantidade de antigénio necessária em qualquer vacina e/ou a frequência de injecção necessária para gerar uma resposta imunológica adequada ao antigénio de interesse. Ver, por exemplo, A.C. Allison J. Reticuloendothel. Soc. (1979) 26:619-630.

As proteínas, polipéptidos ou péptidos "nativos" são proteínas, polipéptidos ou péptidos isolados da fonte nas quais as proteinas ocorrem naturalmente. Polipéptidos "recombinantes" refere-se a polipéptidos produzidos por técnicas de ADN recombinantes; isto é, produzidos a partir de células transformadas por uma construção de ADN exógena que codifica o polipéptido desejado. Polipéptidos "sintéticos" são os preparados por sintese química.

Por "polinucleótido" refere-se uma sequência de nucleótidos incluindo, mas não se limitando a, sequências de ARN tal como ARNm, ADNc, ADN genómico e até mesmo sequências de ADN sintético. 0 termo também captura sequências que incluem qualquer uma das bases análogas conhecidas de ADN e ARN.

Um "vector" é um replicão, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual se pode ligar outro segmento de ADN para se levar à replicação do segmento ligado.

Uma "sequência de ADN de codificação" ou uma "sequência de ADN que codifica" um proteína particular é uma sequência de ADN que é transcrita e traduzida num polipéptido in vitro ou in vivo quando colocada sob o controlo de elementos reguladores apropriados. Os limites da sequência de codificação são determinados por um códão de arranque na extremidade 5' e um códão de paragem de 20 tradução na extremidade 3'. Uma sequência de codificação pode incluir, mas não se limita a, sequências procariotas, ADNc de ARNm eucariota, sequências de ADN genómico de ADN eucariota (por exemplo, mamífero) e até mesmo sequências de ADN sintético. Uma sequência de finalização da transcrição situar-se-á geralmente em 3' relativamente à sequência de codificação. O termo "elementos de controlo" de ADN refere-se colectivamente aos promotores, sítios de ligação de ribossomas, sinais de poliadenilação, sequências de finalização da transcrição, domínios reguladores a montante, intensificadores e semelhantes, os quais colectivamente providenciam a transcrição e tradução de uma sequência de codificação numa célula hospedeira. Estas sequências de controlo não têm de estar todas sempre presentes num vector recombinante desde que o gene desejado seja capaz de ser transcrito e traduzido. "Ligado operacionalmente" refere-se a uma combinação de elementos em que os componentes descritos são configurados de modo a desempenhar a sua função habitual. Deste modo, os elementos de controlo ligados operacionalmente a uma sequência de codificação são capazes de efectuar a expressão da sequência de codificação. Os elementos de controlo não têm de ser contíguos com a sequência de codificação desde que eles actuem para dirigir a expressão desta. Assim, por exemplo, sequências intervenientes não traduzidas mas mesmo assim transcritas podem estar presentes entre um promotor e a sequência de codificação e o promotor pode ser mesmo assim considerado como estando "ligado operacionalmente" à sequência de codificação. 21

Um elemento de controlo, tal como um promotor, "orienta a transcrição" de uma sequência de codificação numa célula quando a ARN-polimerase liga o promotor e transcreve a sequência de codificação em ARNm, o qual é depois traduzido no polipéptido codificado pela sequência de codificação.

Uma "célula hospedeira" é uma célula que foi transformada, ou é capaz de ser transformada, por uma molécula de ácido nucleico exógeno.

Uma célula foi "transformada" por ADN exógeno quando esse ADN exógeno foi introduzido no lado de dentro da membrana da célula. 0 ADN exógeno pode ou não ser integrado (ligado covalentemente) no ADN cromossómico que constitui o genoma da célula. Nos procariotas e leveduras, por exemplo, o ADN exógeno pode ser mantido num elemento epissomal, tal como um plasmideo. No que se refere às células eucariotas, uma célula estavelmente transformada é aquela na qual o ADN exógeno se integrou no cromossoma pelo que ele é herdado pelas células descendentes através da replicação do cromossoma. Esta estabilidade é demonstrada pela aptidão da célula eucariota para estabelecer linhas celulares ou clones constituídos por uma população de células descendentes contendo o ADN exógeno. 0 termo "derivado de," como é aqui utilizado, denota uma fonte ou origem efectiva ou teórica da molécula ou do imunogénio objecto. Por exemplo, um imunogénio que é "derivado de" uma molécula particular de miostatina terá uma semelhança de sequência próxima de uma parte relevante da molécula de referência. Deste modo, um imunogénio que é "derivado de" uma molécula particular de miostatina pode 22 incluir toda a sequência nativa da miostatina, ou pode ser alterada por inserção, delecção ou substituição de resíduos de aminoácidos, desde que a sequência derivada proporcione um imunogénio que corresponda à molécula de miostatina alvo. Os imunogénios derivados de uma molécula assinalada conterão pelo menos um determinante antigénico específico para a molécula assinalada.

Por "vertebrado" refere-se qualquer membro da subphylum chordata, incluindo, sem restrições, mamíferos tais como gado, ovelha, porcos, cabras, cavalos e humanos; animais domésticos tais como cães e gatos; e aves, incluindo aves domésticas, selvagens e de competição tais como galos e galinhas incluindo frangos, perus e outras aves galináceas; e peixe. 0 termo não denota uma idade ou género particular. Deste modo estão abrangidos animais machos e fêmeas adultos e recém-nascidos, assim como fetos e ovos.

As composições servirão para "reduzir a actividade da miostatina." Esta redução da actividade pode ser uma redução dos níveis de miostatina em circulação normalmente presentes num vertebrado ou uma redução dos níveis de miostatina em circulação em indivíduos com distúrbios que resultam em níveis elevados de miostatina em circulação. Uma redução na actividade da miostatina resulta geralmente da inactivação da miostatina em circulação por anticorpos gerados contra o péptido de imunogénio de miostatina administrado ao indivíduo em questão. No entanto, a redução de actividade não se limita a um modo de inactivação particular, mas pode ser o resultado de uma menor produção ou secreção de miostatina para a circulação. Embora não se esteja limitado por qualquer teoria particular, o péptido 23 de imunogénio de miostatinas pode induzir a produção de anticorpos que impedem que a miostatina seja clivada para libertar a parte activa da proteína ou impedem a proteína de se ligar ao seu receptor. Alternativamente, os anticorpos podem eliminar a miostatina segregada da circulação ou de outros fluidos orgânicos antes de atingir o sítio activo. A redução na actividade da miostatina pode manifestar-se ela própria numa variedade de formas. Por exemplo, a redução na actividade da miostatina pode resultar num aumento do peso corporal, aumento da massa muscular, aumento da robustez muscular, numa alteração na proporção de músculo em relação à gordura, num aumento da massa muscular sem gordura, num aumento do tamanho e/ou número de células musculares, numa redução do teor de gordura do organismo, num aumento da longevidade num vertebrado normal ou doente, num aumento do apetite ou ingestão de alimentos, numa melhor qualidade de vida, e nos mamíferos, num aumento do tecido das glândulas mamárias e da lactação.

Por "aumento da massa muscular" pretende-se dizer que o animal administrado com uma composição da presente invenção apresenta um aumento no tamanho das células musculares (hipertrofia) ou no número de células musculares (hiperplasia). 0 aumento pode ocorrer em fibras musculares de tipo 1 e/ou tipo 2. 0 termo "músculo" como aqui utilizado destina-se a abranger tipos de tecidos análogos em peixe. Os métodos para determinar a "massa muscular aumentada" são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o teor de músculo pode ser medido antes e após administração de um péptido de miostatina da invenção utilizando técnicas correntes, tais como pesagem debaixo de água (ver, por 24 exemplo, Bhasin et al. New Eng. J. Med. (1996) 335:1-7) e absorção de raios X de dupla energia (ver, por exemplo, Bhasin et al. Mol. Endocrinol. (1998) 83_: 3155-3162) . Um aumento no tamanho do músculo pode ser evidenciado pelo ganho no peso de pelo menos cerca de 5-10%, preferencialmente pelo menos cerca de 10-20% ou mais. B. Métodos Gerais

Foram desenvolvidas composições imunológicas para modular a produção endógena de miostatina num vertebrado. Embora a miostatina seja geralmente reconhecida como "própria" e portanto não imunogénica, as composições aqui descritas proporcionam surpreendentemente um meio para produzir uma resposta imunológica num indivíduo imunizado com as mesmas.

Por conseguinte, a invenção é dirigida para multímeros de miostatina imunogénicos como descritos nas reivindicações 1-16 para serem utilizados na produção de uma resposta imunológica num vertebrado. Uma vez que a proteína miostatina é segregada, a imunização activa ou passiva de animais jovens serve para aumentar a massa muscular e evita os problemas associados a outras anormalidades que surgem de alterações induzidas durante o período embrionário. Deste modo, por exemplo, os programas de vacinação podem ser iniciados pouco depois do nascimento para se conseguir hipertrofia e/ou hiperplasia. Alternativamente, a imunização pode ser feita numa fase posterior do desenvolvimento (por exemplo, a gado em lotes nutricionais) para melhorar o rendimento em proteína muscular. Adicionalmente, a imunização pode ser feita numa fase pré-natal ou a animais no útero, para se conseguir os resultados desejados. 25

As composições e técnicas aqui descritas são igualmente aplicáveis a vertebrados que põem ovos, tais como aves e peixes. A este respeito, McPherron e Lee, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 9_4:12457-12461, identificaram genes de miostatina em aves e peixes que são extremamente homólogos aos genes de miostatina de mamíferos. Por conseguinte, o gene é conservado entre espécies e julga-se que tenha uma função semelhante em todas as espécies. Deste modo, por exemplo, as aves e os peixes que põem ovos são imunizados para criar teores elevados de anticorpos no plasma maternal. Uma vez que os anticorpos são transferidos para o saco vitelino do ovo, estes anticorpos são capazes de reduzir a miostatina durante o periodo embrionário e provocar o aumento desejado no tamanho e/ou número de células musculares. Alternativamente, a imunização pode ser feita in ovo.

Além disso, as vacinas aqui descritas encontrarão utilização para o tratamento de vários distúrbios em seres humanos e outros animais que provoquem quer principal ou incidentalmente emaciação muscular. Para a postura vertical de paraplégicos e quadriplégicos, a atrofia muscular é um problema grave. A falta de força muscular é frequentemente uma limitação grave para um estilo de vida activo, saudável em indivíduos idosos. Adicionalmente, a emaciação muscular pode resultar de vários cancros, anorexia, caquexia, SIDA e distúrbios semelhantes. Além disso a emaciação muscular é um sintoma de várias distrofias, tais como distrofias musculares pseudo-hipertróficas, distrofias facio-escapulo-humerais, distrofias musculares de Erb, distrofias musculares distais, miopatias oculares e distrofias miotónicas. Estas doenças incluem os distúrbios conhecidos como distrofia muscular de tipo Becker, distrofia muscular 26 de Dejerine-Landouzy, distrofia muscular de tipo Duchenne, distrofia muscular Landouzy, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular de Erb, distrofia muscular de tipo Fukuyama, distrofia muscular de Gowers, distrofia muscular neuroaxonal infantil, distrofia muscular de Leyden-Mõblus, distrofia muscular óculo-faringea, distrofia muscular pelvifemoral, distrofia muscular progressiva, distrofia muscular escapulo-humeral e distrofia muscular de Simmerlin. A imunização pode ser conseguida por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando à, utilização de vacinas de péptidos ou imunização com ADN. Estes métodos são descritos em pormenor a seguir. 1. Péptidos de Miostatina

Os péptidos de miostatina incluem geralmente pelo menos cerca de 3 aminoácidos até cerca de 200 aminoácidos, preferencialmente pelo menos cerca de 3 aminoácidos até cerca de 100 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 3 até cerca de 50 aminoácidos, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 3 aminoácidos até cerca de 30 aminoácidos, preferencialmente cerca de 3 até cerca de 15 aminoácidos e muito preferencialmente pelo menos cerca de 5 aminoácidos até cerca de 25 aminoácidos ou 5 até cerca de 15 aminoácidos, de uma proteina de miostatina seleccionada.

As proteínas de miostatina representativas de 10 espécies a partir das quais podem ser provenientes os péptidos de miostatina são mostradas nas Figuras 1A-1D. A sequência de aminoácidos da miostatina bovina é também 27 apresentada na Figura 16B. 0 péptido incluirá pelo menos um determinante antigénico que confere imunogenicidade à molécula de miostatina. Exemplos de péptidos de miostatina incluem, mas não se limitam à região que se estende dos aminoácidos 1 até 350, inclusive, das Figuras 1A-1D (SEQ ID NOS:27-36); a região de miostatina que se estende dos aminoácidos 1 até 275, inclusive, das Figuras 1A-1D (SEQ ID NOS:27-36); a região de miostatina que se estende dos aminoácidos 25 até 300, inclusive, das Figuras 1A-1D (SEQ ID NOS:27-36); a região de miostatina que se estende dos aminoácidos 50 até 325, inclusive, das Figuras 1A-1D (SEQ ID NOS:27-36); a região de miostatina que se estende dos aminoácidos 75 até 350, inclusive, das Figuras 1A-1D (SEQ ID NOS:27-36); a região de miostatina que se estende dos aminoácidos 45 até 376, inclusive, das Figuras 1A-1D (SEQ ID NOS:27-36); 100 até 376, inclusive, das Figuras 1A-1D (SEQ ID NOS:27-36); a região de miostatina que se estende dos aminoácidos 235 até 376, inclusive, das Figuras 1A-1D (SEQ ID NOS:27-36); ou de qualquer região que se julgue incluir um determinante antigénico de miostatina capaz de induzir uma resposta imunológica num indivíduo ao qual é administrado o péptido.

Os péptidos de miostatina podem ser derivados de uma de três regiões da miostatina que apresentam os pontos mais elevados de hidrofilicidade no perfil de hidrofilicidade mostrado na Figura 17. Os três pontos mais elevados de hidrofilicidade encontram-se nas posições de aminoácido 263-268, que atravessa o sitio de clivagem proteolitica; posições 31-37; e posições 106-111. Deste modo, o péptido de miostatina compreende uma sequência de aminoácidos Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEQ ID NO:37) que atravessa o sitio de clivagem proteolitica; a sequência de aminoácidos Lys-Glu- 28

Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO:38) a qual corresponde aos aminoácidos 31-37 da miostatina; ou a sequência de aminoácidos Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO:39) a qual corresponde aos aminoácidos 106 até 111 da miostatina. É também descrito um péptido de miostatina que tem pelo menos cerca de 75% de identidade de aminoácidos com um péptido compreendendo a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 3-18, inclusive da SEQ ID NO:4 (MYOS 1, mostrada na Figura 2); aminoácidos 3-15, inclusive da SEQ ID NO: 6 (MYOS 3, mostrada na Figura 3); aminoácidos 3-17, inclusive, da SEQ ID NO:8 (MYOS 5, mostrada na Figura 4); aminoácidos 3-16, inclusive da SEQ ID NO:10 (MYOS 7, mostrada na Figura 5); aminoácidos 3-22, inclusive da SEQ ID NO:12 (MYOS 9, mostrada na Figura 6); aminoácidos 3-25, inclusive da SEQ ID NO:14 (MYOS 11, mostrada na Figura 7); aminoácidos 3-22, inclusive da SEQ ID NO:16 (MYOS 13, mostrada na Figura 8); aminoácidos 3-19, inclusive, da SEQ ID NO:18 (MYOS 15, mostrada na Figura 9); aminoácidos 3-18, inclusive, da SEQ ID NO:20 (MYOS 17, mostrada na Figura 10); ou aminoácidos 3-18, inclusive da SEQ ID NO: 22 (MYOS 19, mostrada na Figura 11) . A relação das posições dos vários péptidos de MYOS acima com a miostatina completa é mostrada na Figura 12. Alguns dos últimos péptidos constituem a base da invenção. O péptido de miostatina pode ser ligado a uma molécula portadora imunológica para formar um imunoconjugado de miostatina, como se descreve a seguir.

De acordo com formas de realização preferidas da presente invenção, o péptido de miostatina é como definido em qualquer uma das reivindicações 3-16. 29 2. Imunoconjugados de Miostatina

Como se explicou acima, a miostatina é uma molécula endógena e, como tal, pode ser vantajoso aumentar a imunogenicidade do péptido de miostatina (ou multímeros descritos abaixo) ligando-o a um veiculo para formar um imunoconjugado de miostatina. Isto é especialmente necessário se o imunogénio de miostatina se destinar a ser administrado à mesma espécie da qual é proveniente.

Os veículos adequados são geralmente polipéptidos que incluem regiões antigénicas de uma proteína derivada de um material infeccioso tal como uma proteína da superfície virai, ou uma sequência peptídica portadora. Estes veículos para estimular não especificamente a actividade das células T auxiliares e para ajudar a orientar um imunogénio de interesse para células apresentadoras de antigénio (APCs) para processamento e apresentação na superfície celular associados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Têm sido desenvolvidos vários sistemas portadores para este fim. Por exemplo, haptenos peptídicos pequenos são frequentemente acoplados a veículos proteicos tal como hemocianina de lapa (Bittle et al. (1982) Nature 298:30-33), toxinas bacterianas tal como toxóide do tétano (Muller et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 79:569-573), ovalbumina, polipéptidos de leucotoxina e mioglobina de esperma de baleia, para produzir uma resposta imunológica. Estas reacções de acoplamento resultam tipicamente na incorporação de várias moles de haptenos peptídicos por mole de proteína portadora. 30

Outros veículos adequados incluem os polipéptidos VP6 de rotavírus, ou fragmentos funcionais destes, como descrito na Patente U.S. número 5 071 651. Igualmente útil é um produto de fusão de uma proteína vitral e um ou mais determinantes antigénicos de miostatina, produtos de fusão esses que são feitos pelos métodos descritos na Patente U.S. n° 4 722 840. Ainda outros veículos adequados incluem células, tais como linfócitos, uma vez que a apresentação nesta forma mimetiza o modo natural de apresentação no indivíduo, que origina o estado imunizado. Alternativamente, o imunogénio de miostatinas pode ser acoplado a eritrócitos, preferencialmente os eritrócitos do próprio indivíduo. Os métodos de acoplamento de péptidos a proteínas ou células são conhecidos dos especialistas na técnica.

Os sistemas de administração também podem utilizar veículos particulares. Por exemplo, tem-se utilizado partículas pré-formadas como plataformas nas quais os imunogénios podem ser acoplados e incorporados. Também são conhecidos na técnica sistemas com base em proteossomas (Lowell et al. (1988) Science 240:800-802) e complexos imunoestimuladores (Morein et al. (1984) Nature 308:457-460) .

Também podem ser utilizados sistemas portadores utilizando proteínas quiméricas produzidas de modo recombinante que se auto-organizam em partículas. Por exemplo, o retrotransposão, Ty, de levedura codifica uma série de proteínas que se organizam em partículas de tipo virai (Ty-VLPs; Kingsman et al. (1988) Vacinas 6_:304—306) . Deste modo, um gene, ou fragmento deste, que codifica o imunogénio de miostatina de interesse pode ser inserido no 31 gene TyA e expressado na levedura como uma proteína de fusão. A proteína de fusão retém a capacidade de auto-organização em partículas de tamanho uniforme. Outros sistemas portadores de tipo virai úteis baseiam-se em HBsAg, (Valenzuela et al. (1985) Bio/Technol. 3^:323-326;

Patente U.S. n° 4 722 840; Delpeyroux et al. (1986) Science 233:472-475), antigénio nuclear da Hepatite B (Clarke et al. (1988) Vaccines 8_8 (Ed. H. Ginsberg, et al.) pág. 127-131), Poliovírus (Burke et al. (1988) Nature 332:81-82) e Vírus do Mosaico do Tabaco (Haynes et al. (1986) Bio/Technol. _4:637—641) .

Os veículos especialmente preferidos incluem albuminas de soro, hemocianina de lapa, ovalbumina, mioglobina de esperma de baleia, moléculas de leucotoxina como se descreveu acima, e outras proteínas bem conhecidas dos especialistas na técnica. Um polipéptido de leucotoxina particular para ser aqui utilizado como um veículo é mostrado nas Figuras 15A-15D. A miostatina é convenientemente inserida no sítio BamHl presente na posição 3334 do nucleótido, como se descreve em mais pormenor nos exemplos.

Os veículos proteicos podem ser utilizados na sua forma nativa ou o seu conteúdo de grupos funcionais pode ser modificado, por exemplo, por succinilação de resíduos de lisina ou reacção com Cis-tiolactona. No veículo (ou antigénio) também pode ser incorporado um grupo sulfidrilo, por exemplo, por reacção de funções amino com 2-iminotiolano ou o éster de N-hidroxissuccinimida do 3-(4-ditiopiridil)propionato. Os veículos adequados também podem ser modificados para incorporar cadeias espaçadoras (tal como hexametilenodiamina ou outras moléculas bifuncionais 32 de tamanho semelhante) para fixação de imunogénios péptidos.

Os veículos podem ser fisicamente conjugados ao imunogénio de miostatina de interesse utilizando reacções de condensação correntes. Alternativamente pode preparar-se moléculas quiméricas de modo recombinante tal como fundindo um gene que codifica um veículo polipéptido adequado a uma ou mais cópias de um gene, ou fragmento deste, que codifica um imunogénio de miostatina seleccionado.

Os imunogénios de miostatina também podem ser administrados via um vírus portador que os expressa. Os vírus portadores que encontram aqui aplicação incluem, mas não se limitam ao vírus vaccinia e outros vírus pox, adenovírus e vírus herpético. A título de exemplo, os vírus vaccinia recombinantes que expressam as proteínas podem ser construídos como se segue. 0 ADN que codifica uma proteína particular é primeiramente inserido num vector apropriado para que fique adjacente a um promotor de vaccinia e sequências flanqueadoras de ADN de vaccinia, tal como a sequência que codifica a timidina cinase (TK). Este vector é depois utilizado para transfectar células que são simultaneamente infectadas com vaccinia. A recombinação homóloga serve para inserir o promotor de vaccinia mais o gene que codifica o imunogénio desejado no genoma virai. A TK recombinante resultante pode ser seleccionada cultivando as células na presença de 5-bromodesoxiuridina e seleccionando as placas virais que lhe são resistentes. 3. Multímeros de Miostatina A imunogenicidade dos imunogénios de miostatina também pode ser significativamente aumentada produzindo formas 33 imunogénicas das moléculas que compreendem várias cópias de determinantes antigénicos seleccionados. Deste modo, a miostatina endógena pode ser transformada num autoantigénio eficaz.

Por conseguinte são descritas composições para vacinas contendo multimeros de miostatina na forma de ácido nucleico ou péptido para administração a um indivíduo. 0 multimero de miostatina terá mais do que uma cópia de imunogénios, péptidos ou determinantes antigénicos de miostatina seleccionados, como se descreveu acima, ou repetições tandem múltiplas de um imunogénio, péptido ou determinante antigénico de miostatina seleccionado. Deste modo, os multimeros de miostatina podem compreender repetições múltiplas ou tandem de sequências seleccionadas de miostatina, repetições múltiplas ou tandem de determinantes antigénicos de miostatina seleccionados ou qualquer combinação concebível destes. Os determinantes antigénicos de miostatina podem ser identificados utilizando técnicas como se descreve em pormenor abaixo.

Por exemplo, o multimero de miostatina pode corresponder a uma molécula com unidades estruturais da fórmula geral (MP-X-MP)y em que MP é um péptido de miostatina, X é seleccionado do grupo consistindo de uma ligação peptídica, um grupo espaçador de aminoácidos e [MP] n, em que n é maior ou igual a 1, y é maior ou igual a 1, e ainda em que "MP" pode compreender qualquer péptido de MP. Deste modo, o multimero de miostatina pode conter de 2-64 ou mais péptidos de miostatina, mais preferencialmente 2-32 ou 2-16 péptidos de miostatina. Na presente invenção, o MP é seleccionado dos aminoácidos 3-15, inclusive da SEQ ID NO:6; aminoácidos 3-17, inclusive, da SEQ ID NO:8; 34 aminoácidos 3-16, inclusive da SEQ ID NO:10; aminoácidos 3-22, inclusive da SEQ ID N0:12; aminoácidos 3-25, inclusive da SEQ ID NO: 14; aminoácidos 3- 22, inclusive da SEQ ID NO:16; aminoácidos 3-18, inclusive da SEQ ID NO:20; e aminoácidos 3-18, inclusive, da SEQ ID NO:22. Se os imunogénios de miostatina estiverem ligados quimicamente ou de modo recombinante a um veiculo, os péptidos de miostatina podem estar ligados à extremidade 5', à extremidade 3' ou podem flanquear o veiculo em questão. Além disso, o multimero de miostatina pode estar localizado em sítios internos ao veículo.

Um veículo particular para ser utilizado com os multímeros de miostatina é um polipéptido de leucotoxina como se descreveu acima. Por exemplo, pode-se inserir convenientemente repetições oligo de miostatina no sítio BamHl presente na posição 3334 do nucleótido do polipéptido de leucotoxina mostrado nas Figuras 15A-15D.

Como se explicou acima podem estar presentes sequências espaçadoras entre as unidades de miostatina. Por exemplo, nos péptidos MYOS aqui exemplificados estão presentes dímeros de Arg-Ser e Gly-Ser os quais proporcionam espaçadores entre sequências repetidas dos péptidos de miostatina. A colocação estratégica das várias sequências espaçadoras entre imunogénios de miostatina seleccionados pode ser utilizada para conferir uma maior imunogenicidade às construções objecto. Por conseguinte, uma sequência espaçadora seleccionada pode codificar uma grande variedade de unidades tais como um grupo de ligação constituído por um único aminoácido ou uma sequência de dois ou vários aminoácidos. Os grupos espaçadores seleccionados podem proporcionar preferencialmente sítios 35 de clivagem de enzimas para que o multímero expressado possa ser processado por enzimas proteolíticas in vivo (por APCs, ou semelhantes) para produzir um número de péptidos, cada um dos quais contém pelo menos um determinante antigénico de células T derivado da parte portadora, e os quais estão preferencialmente fundidos a uma sequência substancialmente completa do péptido de miostatina.

Os grupos espaçadores podem ser construídos para que a região de junção entre as unidades de miostatina seleccionadas compreenda uma sequência claramente estranha para o indivíduo imunizado, conferindo desse modo maior imunogenicidade aos péptidos de miostatina associados. Adicionalmente podem ser construídas sequências espaçadoras para fornecer antigenicidade de células T, tais como as sequências que codificam sequências peptídicas anfipáticas e/ou α-helicoidais as quais são geralmente reconhecidas na técnica como proporcionando determinantes antigénicos imunogénicos de células τ auxiliares. A escolha dos determinantes antigénicos de células T particulares a serem proporcionados por tais sequências espaçadoras pode variar em função da espécie vertebrada particular a ser vacinada. Embora sejam exemplificadas partes de miostatina particulares que incluem sequências espaçadoras, é também descrito um ou mais multimeros de miostatina compreendendo sequências de miostatina directamente adjacentes (sem sequências espaçadoras intervenientes).

As sequências multiméricas de miostatina assim produzidas originam um antigénio de miostatina extremamente imunogénico. 36

Os péptidos, imunoconjugados e multímeros de miostatina podem ser produzidos utilizando os métodos descritos abaixo, e utilizados para métodos de imunização com ácido nucleico, métodos de imunização à base de proteínas ou para a produção de anticorpos. 4. Métodos de Imunização à Base de Ácido Nucleico

Duma maneira geral, as vacinas à base de ácido nucleico incluirão regiões relevantes que codificam um imunogénio de miostatina, com sequências de controlo adequadas e, opcionalmente, sequências de nucleótidos terapêuticas auxiliares. As moléculas de ácido nucleico são preparadas na forma de vectores que incluem os elementos necessários para orientar a transcrição e tradução numa célula receptora.

Para aumentar uma resposta imunológica num indivíduo imunizado, as moléculas de ácido nucleico podem ser administradas conjuntamente com substâncias auxiliares, tais como agentes farmacológicos, adjuvantes ou conjuntamente com a administração de vectores que codificam modificadores da resposta biológica tais como citocinas e semelhantes. Outras substâncias auxiliares incluem, mas não se limitam a substâncias para aumentar o ganho de peso, a massa muscular ou a robustez muscular, tais como hormonas de crescimento, agentes promotores do crescimento, beta-antagonistas, agentes de partição e antibióticos.

As sequências de nucleótidos seleccionadas para serem utilizadas podem ser derivadas de fontes conhecidas, por exemplo, isolando-as de células ou tecidos contendo um gene ou sequência de nucleótidos desejado utilizando técnicas 37 correntes, ou utilizando técnicas recombinantes ou de sintese.

Uma vez preparadas ou isoladas as sequências de codificação para os imunogénios de miostatina, essas sequências podem ser clonadas em qualquer vector ou replicão adequado. O grande número de vectores de clonagem é conhecido dos especialistas na técnica e a selecção de um vector de clonagem apropriado é uma questão de escolha. A ligação a outras sequências, por exemplo, moléculas auxiliares ou moléculas portadoras, são realizadas utilizando procedimentos correntes, conhecidos na matéria. Uma ou mais partes imunogénicas de miostatina da quimera podem ser fundidas 5' e/ou 3' a uma sequência auxiliar desejada ou molécula portadora. Alternativamente, uma ou mais partes imunogénicas de miostatina podem ser localizadas em sitios internos à molécula portadora ou essas partes podem ser posicionadas em ambas as posições interna e terminal na quimera.

Alternativamente, as sequências de ADN que codificam os imunogénios de miostatina de interesse, opcionalmente ligadas a moléculas portadoras, podem ser preparadas sinteticamente em vez de serem clonadas. As sequências de ADN podem ser concebidas com códãos apropriados para a sequência particular. A sequência completa do imunogénio é depois organizada a partir dos oligonucleótidos sobreponiveis preparados por métodos correntes e organizados numa sequência de codificação completa. Ver, por exemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; e Jay et al. (1984) j. Biol. Chem. 259:6311. 38 A sequência de codificação é depois colocada sob o controlo de elementos de controlo adequados para expressão in vivo num tecido hospedeiro adequado. A escolha dos elementos de controlo dependerá do indivíduo a ser tratado e do tipo de preparação utilizada. Assim, se for utilizada a maquinaria endógena de transcrição e tradução do indivíduo para expressar os imunogénios serão utilizados elementos de controlo compatíveis com o indivíduo particular. A este respeito conhece-se na técnica vários promotores para utilização em sistemas mamíferos. Por exemplo, os promotores típicos para expressão de células de mamíferos incluem o promotor precoce SV40, um promotor CMV tal como promotor precoce imediato CMV, o promotor TLR do virus do tumor da mama de ratinhos, o promotor principal tardio de adenovírus (Ad MLP) e o promotor do vírus de herpes simplex, entre outros. Outros promotores não virais, tal como um promotor derivado do gene de metalotioneína murideo, também encontrarão utilização para a expressão mamífera.

Tipicamente também estarão presentes sequências de finalização da transcrição e de poliadenilação, localizadas 3' em relação ao códão de paragem da tradução. Preferencialmente, também está presente uma sequência para optimização do inicio da tradução, localizada 5' em relação à sequência de codificação. Exemplos de sinais da transcrição/poliadenilação incluem os derivados do SV40, como descrito em Sambrook et al., supra, assim como uma sequência de finalização da hormona de crescimento bovina. Também podem ser incluídos nas construções intrões contendo sítios doadores e aceitadores de excisão-união. 39

Também podem ser aqui utilizados elementos intensificadores para aumentar os níveis de expressão das construções. Exemplos incluem o intensificador precoce de genes SV40 (Dijkema et al. (1985) embo J. £:761), o intensificador/promotor derivado da repetição de terminal comprido (LTR) do Vírus de Sacorma de Rous (Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA £9:6777) e elementos derivados do CMV humano (Boshart et al. (1985) Cell £1:521), tais como elementos incluídos na sequência do intrão A do CMV.

Uma vez preparadas, as composições de ácido nucleico para vacinas podem ser administradas ao indivíduo utilizando métodos conhecidos. A este respeito foram descritas várias técnicas para imunização com ADN que codificam antigénios. Ver, por exemplo, Patente U.S. n° 5 589 466 de Felgner et al.; Tang et al. (1992) Nature 358:152; Davis et al. (1993) Hum. Molec. Genet. 2: 1847;

Ulmer et al. (1993) Science 258:1745; Wang et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA £0:4156; Eisenbraun et al. (1993) DNÃ Cell Biol. 12:791; Fynan et al. (1993) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 90:12476; Fuller et al. (1994) AIDS Res. Human Retrovir. £0:1433; e Raz et al. (1994) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 9£:9519. Também podem ser utilizados métodos gerais para administrar moléculas de ácido nucleico a células in vitro, para reintrodução subsequente no hospedeiro, tal como transferência de genes mediada por lipossomas. Ver, por exemplo, Hazinski et al. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. _4:206-209; Brigham et al. (1989)

Am. J. Med. Sei. 298:278-281; Canonico et al. (1991) Clin.

Res. 3_9:219A; e Nabel et al. (1990) Science 249:1285-1288. Deste modo, as composições de ácido nucleico para vacinas podem ser administradas na forma líquida ou em partículas 40 utilizando uma diversidade de técnicas conhecidas. As composições típicas para vacinas são descritas a seguir em mais pormenor. 5. Métodos de Imunização à Base de Proteína

As composições à base de péptidos para vacinas também podem ser produzidas utilizando uma variedade de métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Em particular, os imunogénios de miostatina podem ser isolados directamente de fontes nativas, utilizando técnicas de purificação correntes. Alternativamente, os imunogénios podem ser produzidos de modo recombinante utilizando os sistemas de expressão de ácido nucleico descritos acima e purificados utilizando técnicas conhecidas. Os imunogénios peptidicos também podem ser sintetizados, com base em sequências de aminoácidos descritas ou sequências de aminoácidos derivadas da sequência de ADN de uma molécula de interesse, utilizando sintese quimica de polímeros tal como síntese de péptidos em fase sólida. Estes métodos são conhecidos dos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, J. M. Stewart e J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) e G. Barany e R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editores E. Gross e J. Meienhofer, vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pág. 3-254, para técnicas de síntese de péptidos em fase sólida; e M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) e E. Gross e J. Meienhofer, Ed., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, para síntese clássica em solução.

Os imunogénios peptidicos também podem ser produzidos clonando as sequências de codificação para esse fim em 41 qualquer vector de expressão ou replicão adequado. Os especialistas na técnica conhecem um grande número de vectores de clonagem e a selecção de um vector de clonagem apropriado é uma questão de escolha. Exemplos de vectores de ADN recombinante para clonagem e de células hospedeiras que eles podem transformar incluem o bacteriofago lambda (E. coli), PBR322 (E. coli), pACYCl77 (E. COli), pKT230 (bactérias gram-negativas), pGVH06 (bactérias gram-negativas), pLAFRl (bactérias gram-negativas), pME290 (bactérias gram-negativas não E. coli), pHVl4 (E. coli e Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), plJ61 (Streptomyces), pUC6 {Streptomyces), Ylp5 [Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces) e virus do papiloma bovino (células de mamíferos). Ver, em geral, DNA Cloning: Vol. I & II, supra-, Sambrook et al., supra-, B. Perbal, supra.

Por exemplo, a sequência de codificação para a miostatina de um número de espécies de vertebrados, incluindo ratinhos, ratos, humanos, babuínos, gado, porco, ovelha, frango e peru foi determinada. Ver, por exemplo, Patente U.S. n° 5 827 733 e N° de Registo NCBI U840C5 para a sequência de nucleótidos da miostatina de murídeos; Patente U.S. n° 5 827 733, Publicação Internacional n° WO 98/33887, e N° de Registo NCBI AF019627 para a sequência de nucleótidos da miostatina humana; Figura 16A nesta descrição, assim como as Publicações Internacionais n° WO 99/02667 e WO 98/33887, e o N° de Registo NCBI AFO19620 para a sequência de nucleótidos da miostatina bovina; N° de Registo NCBI AF019626 para a sequência de nucleótidos da miostatina do peixe; Publicação Internacional n° WO 98/33887, para as sequências de nucleótidos da miostatina de ratos (ver, também N° de Registo NCBI AF019624), babuínos (ver, também N° de Registo NCBI AF019619), suínos 42 (ver, também N° de Registo NCBI AF019623), ovinos (ver, também N° de Registo NCBI AF019622), frango (ver, também N° de Registo NCBI AF019621) e peru (ver, também N° de Registo NCBI AF019625). A sequência de miostatina está extremamente conservada ao longo de todas estas espécies.

Partes destas sequências que codificam péptidos de miostatina desejados, e se pretendido, uma sequência que codifica uma proteina portadora, podem ser clonadas, isoladas e ligadas em conjunto utilizando técnicas recombinantes geralmente conhecidas na matéria. Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra. 0 gene pode ser colocado sob o controlo de um promotor, sitio de ligação de ribossoma (para expressão bacteriana) e, opcionalmente, um operador, para que a sequência de ADN de interesse seja transcrita em ARN por um transformante adequado. A sequência de codificação pode ou não conter um péptido de sinalização ou uma sequência lider. Os imunogénios peptidicos podem ser expressados utilizando, por exemplo, o promotor tac de E. coli ou o promotor e a sequência de sinalização do gene da proteina A (spa). As sequências lider podem ser eliminadas pelos hospedeiros bacterianos no processamento pós-tradução. Ver, por exemplo, Patentes U.S. n° 4 431 739; 4 425 437; 4 338 397. Também podem estar presentes sequências auxiliares, tais como as descritas acima.

Além das sequências de controlo pode ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitem a regulação da expressão das sequências imunogénicas em relação ao crescimento da célula hospedeira. Os especialistas na técnica conhecem sequências reguladoras, e os exemplos 43 destas incluem aquelas que levam a que a expressão de um gene seja ligada ou desligada em resposta a um estimulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Também podem estar presentes no vector outros tipos de elementos reguladores, por exemplo, sequências intensificadoras.

Um vector de expressão é construído de modo a que a sequência de codificação particular fique localizada no vector com as sequências reguladoras apropriadas, sendo a posição e orientação da sequência de codificação em relação às sequências de controlo tal que a sequência de codificação é transcrita sob o "controlo" as sequências de controlo (isto é, ARN polimerase que se liga à molécula de ADN nas sequências de controlo transcreve a sequência de codificação). Pode ser desejável a modificação das sequências que codificam o imunogénio de miostatina particular para se atingir este objectivo. Por exemplo, nalguns casos pode ser necessário modificar a sequência de modo a que ela possa ser ligada às sequências de controlo na orientação apropriada; isto é, para manter a grelha de leitura. As sequências de controlo e outras sequências reguladoras podem ser ligadas à sequência de codificação antes da inserção num vector, tais como os vectores de clonagem descritos acima. Alternativamente, a sequência de codificação pode ser clonada directamente num vector de expressão que já contém as sequências de controlo e um sítio de restrição apropriado.

Nalguns casos, pode ser desejável adicionar sequências que provocam a secreção do imunogénio a partir do organismo hospedeiro, com clivagem subsequente do sinal secretor. Também pode ser desejável produzir mutantes ou análogos do 44 imunogénio. Os mutantes ou análogos podem ser preparados por delecção de uma parte da sequência que codifica o imunogénio, ou se presente, uma parte da sequência que codifica a molécula portadora desejada, por inserção de uma sequência, e/ou por substituição de um ou mais nucleótidos dentro da sequência. As técnicas para modificar sequências de nucleótidos, tais como mutagénese orientada, e semelhantes, são bem conhecidas dos especialistas na matéria. Ver, por exemplo, Sambrook et ai., supra; DNA Cloníng, Vol. I e II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; Kunkel, T.A. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al. BioTechniques (1987) 5_:786;

Zoller e Smith, Methods Enzymol. (1983) 100:468; Dalbie-

McFarland et al. Proc. Natl. Acad. Sei USA (1982) 79:6409.

Os imunogénios de miostatina podem ser expressados numa grande variedade de sistemas, incluindo sistemas de expressão de insectos, mamíferos, bacterianos, virais e levedura, todos eles bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os sistemas de expressão em células de insectos, tais como os sistemas de baculovírus, são conhecidos dos especialistas na técnica e descritos, por exemplo, em Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletín No. 1555 (1987) . Os materiais e métodos para sistemas de expressão de baculovírus/células de insectos estão comercialmente disponíveis na forma de estojo de, inter alia, Invitrogen, San Diego CA (estojo "MaxBac"). De modo semelhante, os sistemas de expressão em células bacterianas e de mamíferos são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Sambrook et al., supra. Os sistemas de expressão de levedura são também conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, London. 45

Também é conhecido um número de células hospedeiras apropriadas para serem utilizadas nos sistemas anteriores. Por exemplo, na técnica são conhecidas linhas de células de mamíferos as quais incluem linhas de células imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC), tais como, mas não se limitando às células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, células de rim de cria de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células do carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células do rim de bovino Madin-Darby ("MDBK"), assim como outras. De modo semelhante, hospedeiros bacterianos tais como E. coli, Bacillus subtilis e Streptococcus spp.r encontram utilização nas actuais construções de expressão. Hospedeiros de levedura úteis na presente invenção incluem inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polimorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia llpolitica. As células de insectos para serem utilizadas com vectores de expressão de baculovirus incluem, inter alia, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni.

Dependendo do sistema de expressão e hospedeiro seleccionados, os imunogénios de miostatina são produzidos por células hospedeiras em crescimento transformadas por um vector de expressão descrito acima em condições em que o imunogénio é expressado. 0 imunogénio expressado é depois isolado das células hospedeiras e purificado. Se o sistema de expressão segregar o imunogénio para o meio de crescimento, o produto pode ser purificado directamente a partir do meio. Se ele não for segregado, ele pode ser 46 isolado dos lisados celulares. A selecção das condições de crescimento apropriadas e os métodos de recuperação estão dentro da perícia na técnica.

Uma vez obtidos, os péptidos de miostatina, com ou sem veículo associado, pode ser formulado em composições para vacinas, tais como composições para vacinas como se descreve mais abaixo, para induzir a produção de anticorpos num vertebrado. 6. Produção de Anticorpo

Os péptidos de miostatina também podem ser utilizados para gerar anticorpos para serem utilizados em métodos de imunização passiva ou para efeitos de imunopurificação ou imunodiagnóstico. Tipicamente, os péptidos úteis para produzir anticorpos terão geralmente pelo menos cerca de 3-5 aminoácidos de comprimento, preferencialmente 7-10 aminoácidos de comprimento e muito preferencialmente pelo menos cerca de 10 até 15 aminoácidos de comprimento, ou mais.

Os anticorpos contra os imunogénios do indivíduo incluem preparações de anticorpos policlonais e monoclonais, anti-soros não específicos, assim como preparações incluindo anticorpos híbridos, anticorpos alterados, fragmentos F(ab')2, fragmentos F(ab), fragmentos Fv, anticorpos de domínio único, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e fragmentos funcionais destes, os quais retêm especificidade para a molécula alvo em questão. Por exemplo, um anticorpo pode incluir regiões variáveis ou fragmentos de regiões variáveis, os quais retêm especificidade para a molécula em questão. O remanescente do anticorpo pode ser proveniente das espécies nas quais o 47 anticorpo será utilizado. Deste modo, se o anticorpo for para ser utilizado num ser humano, o anticorpo pode ser "humanizado" para reduzir a imunogenicidade mantendo contudo a actividade. Para uma descrição de anticorpos quiméricos, ver, por exemplo, Winter, G. e Milstein, C. (1991) Nature 349:293-299; Jones, P.T. et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann, L. et al. (1988) 332:323-327; e Cárter, P. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_9: 4285-4289. Tais anticorpos quiméricos podem conter não só sitios de combinação para a molécula alvo, mas também sitios de ligação para outras proteínas. Deste modo podem ser gerados reagentes bifuncionais com especificidade orientada para antigénios externos e internos.

Se forem desejados anticorpos policlonais, um mamífero seleccionado (por exemplo, ratinho, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com o antigénio desejado, ou um seu fragmento, ou um antigénio mutante, como se descreveu acima. Antes da imunização, pode ser desejável aumentar ainda mais a imunogenicidade de um imunogénio particular. Isto pode ser conseguido por qualquer uma das maneiras conhecidas dos especialistas na técnica.

Por exemplo, a imunização para a produção de anticorpos é geralmente realizada misturando ou emulsionando a proteína num excipiente adequado, tal como soro fisiológico, preferencialmente num adjuvante tal como adjuvante completo de Freund, ou qualquer um dos adjuvantes descritos abaixo, e injectando a mistura ou emulsão por via parentérica (geralmente por via subcutânea ou intramuscular). 0 animal é geralmente reforçado 2-6 semanas mais tarde com uma ou mais injecções da proteína em soro fisiológico, preferencialmente utilizando adjuvante 48 incompleto de Freund, ou semelhantes. Os anticorpos também podem ser gerados por imunização in vitro, utilizando métodos conhecidos na técnica. 0 anti-soro policlonal é depois obtido dos animais imunizados e tratado de acordo com procedimentos conhecidos. Ver, por exemplo, Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348:363-370. Se se utilizar o soro contendo anticorpos policlonais, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia de afinidade, utilizando procedimentos conhecidos.

Os anticorpos monoclonais são geralmente preparados utilizando o método de Kohler e Milstein, Nature (1975) 256:495-96 ou uma modificação deste. Tipicamente, um ratinho ou rato é imunizado como se descreveu acima. No entanto, em vez de se sangrar o animal para extrair o soro, retira-se o baço (e opcionalmente vários gânglios linfáticos grandes) e dissocia-se em células isoladas. Se desejado, as células do baço podem ser rastreadas (após remoção de células aderentes de modo não especifico) aplicando uma suspensão de células a uma placa ou poço revestido com o antigénio da proteína. As células B, que expressam imunoglobulina ligada a membrana especifica para o antigénio, ligar-se-ão à placa e não são eliminadas por lavagem com o resto da suspensão. As células B resultantes, ou todas as células de baço dissociadas, são depois induzidas a fundir-se com células de mieloma para formar hibridomas, e são cultivadas num meio selectivo (por exemplo, meio com hipoxantina, aminopterina, timidina "HAT"). Os hibridomas resultantes são aplicados por diluição limitante e são avaliados para a produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antigénio imunizado (e os quais não se ligam a antigénios não relacionados). Os hibridomas secretores de anticorpos 49 monoclonais seleccionados são depois cultivados in vitro (por exemplo, em frascos de cultura de tecidos ou reactores de fibras ocas) ou in vivo (como ascites em ratinhos). Ver, por exemplo, M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antíbodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); var também as Patentes U.S. n° 4 341 761; 4 399 121; 4 427 783; 4 444 887; 4 452 570; 4 466 917; 4 472 500, 4 491 632; e 4 493 890. Os painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra o péptido de miostatina de interesse, ou seu fragmento, podem ser seleccionados por várias propriedades; isto é, por isotipo, determinante antigénico, afinidade, etc.

Também podem ser preparados fragmentos funcionais dos anticorpos contra o péptido de miostatina de interesse e podem ser produzidos clivando uma região constante, não responsável pela ligação ao antigénio, da molécula de anticorpo, utilizando por exemplo, pepsina, para produzir fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos conterão dois sítios de ligação de antigénio, mas carecem de uma parte da região constante de cada uma das cadeias pesadas. De modo semelhante, se desejado, pode produzir-se fragmentos Fab, compreendendo um único sítio de ligação ao antigénio, por exemplo, por digestão de anticorpos policlonais ou monoclonais com papaína. Os fragmentos funcionais, incluindo apenas as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, também podem ser produzidos, utilizando técnicas correntes. Estes fragmentos são conhecidos como Fv.

Os anticorpos quiméricos ou humanizados também podem ser produzidos utilizando os imunogénios objecto. Estes anticorpos podem ser concebidos para minimizar reacções 50 imunológicas indesejadas atribuíveis a regiões heterólogas constantes e regiões variáveis de grelha específica da espécie tipicamente presentes em anticorpos monoclonais e policlonais. Por exemplo, se os anticorpos forem para ser utilizados em indivíduos humanos, pode-se criar anticorpos quiméricos substituindo regiões constantes não humanas, na cadeia pesada ou leve, ou em ambas, com regiões constantes humanas, utilizando técnicas geralmente conhecidas na matéria. Ver, por exemplo, Winter, G. e Milstein, C. (1991) Nature 349:293-299,- Jones, P.T. et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann, L. et al. (1988) 332:323-327; e Cárter, P. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4285-4289. 7. Composições para Vacinas

Uma vez produzidas as moléculas de miostatina de interesse, elas são formuladas em composições para vacinas para administração a um vertebrado. A molécula de miostatina relevante é administrada sozinha ou misturada com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Os veículos adequados são, por exemplo, água, soro fisiológico, dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes, e combinações destes. Além disso, o veículo pode conter quantidades mais pequenas de substâncias auxiliares tais como agentes humectantes ou emulsionantes, agentes de tampão de pH ou adjuvantes que intensificam a eficácia da vacina. Os adjuvantes adequados são descritos com mais pormenor abaixo. Os métodos efectivos para preparar tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão evidentes, aos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18a edição, 1990. A composição ou formulação a ser administrada conterá uma quantidade do imunogénio de 51 miostatina adequada para se atingir o estado imunizado desejado no indivíduo a ser tratado.

Como se explica acima, as composições para vacinas podem incluir adjuvantes para aumentar mais a imunogenicidade do imunogénio de miostatina. Os adjuvantes podem incluir por exemplo, emulsionantes, dipéptidos de muramilo, avridina, hidróxido de alumínio, óleos, saponinas e outras substâncias conhecidas na técnica. Por exemplo, os compostos que podem aqui servir de emulsionantes incluem agentes emulsionantes naturais e sintéticos, assim como compostos aniónicos, catiónicos e não iónicos. Entre os compostos sintéticos, os agentes emulsionantes aniónicos incluem, por exemplo, os sais de potássio, sódio e amónio do ácido láurico e oleico, os sais de cálcio, magnésio e alumínio de ácidos gordos (isto é, sabões metálicos) e sulfinatos orgânicos tais como laurilsulfato de sódio. Os agentes catiónicos sintéticos incluem, por exemplo, brometo de cetiltrimetilamónio, enquanto os agentes não iónicos sintéticos são exemplificados por ésteres de glicerilo (por exemplo, monoestearato de glicerilo), ésteres e éteres de polioxietileno glicol, e os ésteres de ácidos gordos do sorbitano (por exemplo, monopalmitato de sorbitano) e os seus derivados de polioxietileno (por exemplo, monopalmitato de sorbitano e polioxietileno). Os agentes emulsionantes naturais incluem goma-arábica, gelatina, lecitina e colesterol.

Pode preparar-se outros adjuvantes adequados com um componente oleoso, tal como um único óleo, uma mistura de óleos, uma emulsão de água-em-óleo ou uma emulsão de óleo-em-água. 0 óleo pode ser um óleo mineral, um óleo vegetal ou um óleo animal. São preferidos o óleo mineral ou as 52 emulsões de óleo-em-água nas quais o componente oleoso é óleo mineral. A este respeito, um "óleo mineral" é aqui definido como uma mistura de hidrocarbonetos líquidos obtidos de petrolatum via uma técnica de destilação; o termo é sinónimo de "parafina líquida," "vaselina líquida" e "óleo mineral branco." 0 termo também se destina a incluir "óleo mineral leve," isto é, um óleo que é igualmente obtido por destilação de petrolatum, mas o qual tem uma gravidade específica ligeiramente menor do que o óleo mineral branco. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Um componente oleoso particularmente preferido é a emulsão de óleo-em-água vendida sob o nome comercial de EMULSIGEN PLUS™ (compreendendo um óleo mineral leve assim como 0,05% de formalina e 30 mcg/mL de gentamicina como conservantes), disponível de MVP Laboratories, Ralston, Nebraska, ou o adjuvante VSA-3 o qual é uma forma modificada do adjuvante EMULSIGEN PLUS™. Os óleos animais adequados incluem, por exemplo, óleo de fígado de bacalhau, óleo de halibute, óleo de sável, óleo de olho-de-vidro laranja e óleo de fígado de tubarão, os quais estão todos comercialmente disponíveis. Os óleos vegetais adequados incluem, sem restrições, óleo de canola, óleo de amêndoas, óleo de semente de algodão, óleo de milho, azeite, óleo de amendoim, óleo de açafrão, óleo de sésamo, óleo de soja e semelhantes.

Alternativamente, pode utilizar-se um número de bases azotadas alifáticas como adjuvantes com as formulações de vacina. Por exemplo, os adjuvantes imunológicos conhecidos incluem aminas, compostos de amónio quaternário, guanidinas, benzamidinas e tiourónios (Gall, D. (1966) Immunology 1_1:369-386) . Os compostos específicos incluem brometo de dimetildioctadecilamónio (DDA) (disponível de 53

Kodak) e N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)-propanodiamina ("avridina"). Foi descrita a utilização de DDA como um adjuvante imunológico; ver, por exemplo, the Kodak Laboratory Chemicals Bulletin 56(1):1-5 (1986); Adv. Drug Deliv. Rev. 5_(3) : 163-187 (1990); J. Controlled Release 7:123-132 (1988); Clin. Exp. Immunol. 78(2):256-262 (1989); J. Immunol. Methods 9_72): 159-164 (1987); Immunology 5_8 (2):245-250 (1986); e Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 6_8 (3) :201-208 (1982). A avridina é também um adjuvante bem conhecido. Ver, por exemplo, Patente U.S. n° 4 310 550 de Wolff, III et al., a qual descreve a utilização de N,N-alquil superior-N',Ν'-bis(2-hidroxietil)propanodiaminas em geral e da avridina em particular, como adjuvantes de vacinas. A Patente U.S. n° 5 151 267 de Babiuk, e Babiuk et al. (1986) Vlrology 159:57-66, também descreve a utilização de avridina como um adjuvante de vacina.

As composições para vacinas também podem incluir substâncias auxiliares, tais como agentes farmacológicos, citocinas ou outros modificadores da resposta biológica. Outras substâncias auxiliares incluem, mas não se limitam a substâncias para aumentar o ganho de peso, massa muscular ou robustez muscular, tais como hormonas de crescimento, agentes de promoção de crescimento, beta-antagonistas, agentes de partição e antibióticos.

As vacinas são normalmente preparadas como injectáveis, quer como soluções ou suspensões liquidas, ou como formas sólidas as quais são adequadas para dissolução ou suspensão em veículos líquidos antes da injecção. A preparação também pode ser emulsionada ou a substância activa encapsulada em veículos de lipossomas ou outros veículos em partículas utilizados. 54

As composições para vacinas também podem ser preparadas na forma sólida. Por exemplo, pode preparar-se formulações em partículas sólidas para serem administradas a partir de dispositivos injectores sem agulha comercialmente disponíveis. Alternativamente podem ser proporcionados implantes de dose sólida para implantação num indivíduo. Também podem ser utilizadas formulações de libertação controlada ou prolongada as quais são preparadas incorporando os imunogénios de miostatina em portadores ou veículos tais como lipossomas, polímeros impermeáveis não reabsorvíveis tais como copolímeros de etileno e acetato de vinilo e copolímeros Hytrel®, polímeros dilatáveis tais como hidrogeles ou polímeros reabsorvíveis tais como colagénio e determinados poliácidos ou poliésteres tais como os utilizados para preparar suturas reabsorvíveis.

Além disso, os imunogénios podem ser formulados em composições para vacinas guer na forma neutra ou salina. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (preparados com os grupos amino livres dos polipéptidos activos) e os quais preparados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais preparados a partir de grupos carboxilo livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio ou hidróxidos férricos, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e semelhantes. A composição de vacina é formulada de modo a conter uma quantidade eficaz do imunogénio de miostatina, sendo a quantidade exacta facilmente determinada por um 55 especialista na técnica, em que a quantidade depende do animal a ser tratado, da capacidade do sistema imunitário do animal para sintetizar anticorpos e do grau de imunoneutralização de miostatina desejada. As formulações de vacina contendo aproximadamente 1 μρ até cerca de 1 mg, mais geralmente cerca de 5 pg até cerca de 200 pg de imunogénio por dose de solução injectada, quando administradas deverão ser adequadas para induzir uma resposta imunológica. Se for utilizada uma quimera péptido-veículo, a proporção de imunogénio em relação ao veiculo na formulação de vacina variará em função do veiculo e imunogénio particulares seleccionados para construir tais moléculas. As dosagens eficazes podem ser facilmente estabelecidas por um técnico médio na matéria através de experiências de rotina para estabelecer curvas dose-resposta. O indivíduo é imunizado por administração de uma das composições de vacina em pelo menos uma dose, e preferencialmente duas ou mais doses. Além disso, o animal pode ser administrado com tantas doses quantas as necessárias para manter um estado de imunidade.

Pode utilizar-se qualquer meio de administração farmacêutica adequado para administrar a composição de vacina ao vertebrado. Por exemplo, as seringas de agulha convencionais, injectores de mola ou gás (ar) comprimido (Patentes U.S. n° 1 605 763 de Smoot; 3 788 315 de Laurens; 3 853 125 de Clark et al.; 4 596 556 de Morrow et al.; e 5 062 830 de Dunlap), injectores de jacto liquido (Patentes U.S. n° 2 754 818 de Scherer; 3 330 276 de Gordon; e 4 518 385 de Lindmayer et al.), e injectores de partículas (Patentes U.S. n° 5 149 655 de McCabe et al. e 5 204 253 de 56

Sanford et al.) são todos apropriados para administrar as composições de vacina.

Preferencialmente, a composição de vacina é administrada por via intramuscular, subcutânea, intravenosa, subdérmica ou intradérmica, ao indivíduo. Se for utilizado um injector de jacto, um único jacto da composição de vacina liquida é ejectado sob pressão e velocidade elevadas, por exemplo, 1200-1400 PSI, criando deste modo uma abertura na pele e penetrando a profundidades adequadas para imunização.

Os inventores identificaram péptidos, multimeros de miostatina e seus conjugados, os quais podem ser utilizados para induzir uma resposta imunológica contra a miostatina e desse modo aumentar a massa muscular. A seguir encontram-se exemplos de formas de realização especificas. C. Secção Experimental

Exemplo 1

Identificação de Péptidos de Miostatina Imunogénicos

Identificou-se um número de regiões da molécula de miostatina bovina como potencialmente imunogénicas com base na análise computacional da molécula completa utilizando vários programas de computador. Um programa utilizou escalas de hidropatia formuladas a partir da sequência de aminoácidos da proteína com base nas propriedades hidrófoba e hidrófila de cada um dos 20 aminoácidos. Hopp e Woods, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981) 78.:3824-3828. A Figura 17 representa um perfil de hidrofilicidade calculado utilizando um comprimento médio de grupo de seis aminoácidos. Os três pontos mais elevados de 57 hidrofilicidade da molécula de miostatina foram encontrados nas posições de aminoácido 263-268, que atravessam o sítio de clivagem proteolítica e tem a sequência de aminoácidos Lys-Arg-Ser-Arg-Arg-Asp (SEQ ID NO:37); posições 31-37 a qual tem a sequência de aminoácidos Lys-Glu-Asn-Val-Glu-Lys-Glu (SEQ ID NO:38); e posições 106-111 a qual tem a sequência de aminoácidos Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 39) . A análise da proteína também foi feita utilizando o programa PC/Gene, Release 6.60 (Intelligenetics Inc., Geneva, Suíça). A análise tridimensional da proteína de miostatina foi realizada utilizando o Swiss-Pdb Viewer v2.6 (http://expasy.hcuge.ch/ spdbv/mainpage.html). A partir desta informação, concebeu-se e construi-se uma séria de oligómeros de ADN representativos com um sintetizador de ADN Beckman Oligo 1000M utilizando a química de fosforamidito. Os oligómeros foram chamados MYOS 1-20. Os Myos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 (mostrados nas Figuras 2 até 11, respectivamente) incluem partes da cadeia de codificação do ADN enquanto os MYOS 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20 incluem partes da cadeia complementar. A posição destes péptidos relativamente à molécula de miostatina completa é mostrada na Figura 12.

Os oligómeros de ADN codificavam péptidos com 12 até 23 aminoácidos, flanqueados por grupos de ligação com 2 aminoácidos para ligação a uma molécula portadora (ver mais abaixo). Estes péptidos representavam colectivamente a totalidade da parte activa da proteína, assim como três secções individuais a montante do sítio de clivagem proteolítica que liberta a proteína activa. 58

Em particular, com base na análise computacional, seleccionou-se três fracções da proteína activa como alvos primários de imunização. A primeira fracção foi preparada combinando o par oligonucleótido designado MYOS 1 e 2 e continha o sítio de clivagem proteolítica e a extremidade N da proteína activa. 0 MYOS 1 deu a classificação de determinante antigénico mais elevada utilizando o programa de computador de Hopp e Woods (ver Figura 17) . A análise tridimensional da parte activa da miostatina mostrou que o péptido MYOS 1 está exposto à superfície da proteína e é, por conseguinte, provavelmente visto pelo sistema imunológico. 0 MYOS 1 também sobrepõe o sítio de clivagem proteolítica, o qual liberta a parte activa da proteína. 0 bloqueio deste sítio utilizando anticorpos para aquela impede a clivagem da proteína e a libertação da parte activa da proteína para impedir o seu efeito no tecido do músculo.

Seleccionou-se outros dois segmentos da proteína activa (MYOS 5 e 6 e MYOS 9 e 10) porque aparentemente eles formavam uma ansa e uma hélice com base numa análise estrutural tridimensional. Esta estrutura em ansa está provavelmente exposta na superfície da proteína e é, por conseguinte, vista pelo sistema imunológico. Os anticorpos gerados para estas partes da molécula ligam provavelmente a proteína de miostatina e eliminam-a de circulação. O remanescente da parte activa da proteína foi reconstruído a partir dos pares de oligonucleótidos (MYOS 3 e 4, MYOS 7 e 8, MYOS 11 e 12, MYOS 13 e 14) . A utilização da parte activa completa garante a estrutura tridimensional adequada para induzir uma resposta imunológica eficaz. Seleccionou-se uma das regiões a montante da parte activa da proteína, (MYOS 15 e 16) com base na análise computacional de 59 determinantes antigénicos prováveis. As outras duas fracções a montante da proteína foram seleccionadas de modo a conterem o sítio de clivagem proteolítica (MYOS 19 e 20, os quais contêm o sítio de clivagem e os aminoácidos imediatamente a montante do sítio de clivagem) ou a estarem próximos dele (MYOS 17 e 18) pelo que um anticorpo que se liga a este sítio interferirá com a actividade protease.

Com base em comparações com outras sequências proteicas conhecidas, a miostatina tem áreas de homologia com outras proteínas do factor transformante de crescimento-β. A proteína morfogenética do osso-6 (BMP-6) tem uma grande homologia com as regiões central e da extremidade C da parte activa da miostatina.

Exemplo 2

Construção de pCB!50

Os oligómeros anteriores foram concebidos para estarem fundidos à extremidade 3' de um polinucleótido que codifica uma proteína portadora de leucotoxina (LKT) com 52 kDa, aqui designada por "LKT 114". Este polinucleótido foi derivado do gene lktA presente no plasmídeo pCB114, descrito na Patente U.S. n° 5 837 268. Este plasmídeo, a sequência de nucleótidos deste gene e a sequência de aminoácidos correspondente são aqui mostrados nas Figuras 15A-15D e também descritos na Patente U.S. n° 5 837 268. O gene codifica uma versão encurtada da leucotoxina o qual foi desenvolvido a partir do gene de leucotoxina recombinante presente no plasmídeo pAA352 (N° de Registo ATCC 68283 e descrito na patente U.S. 5 476 657) por eliminação de uma fragmento de ADN interno com aproximadamente 1300 pb de comprimento. O polipéptido LKT 60 114 tem uma massa molecular estimada de 52 kDa e contém sítios de restrição convenientes para serem utilizados na produção de proteínas de fusão da presente invenção. O plasmídeo pCBl50 contendo a sequência de codificação para o LKT 114, no qual foram clonados os oligonucleótidos MYOS, foi preparado como se segue. Isolou-se o gene da leucotoxina como descrito nas Patentes U.S. n° 5 476 657 e 5 837 268. Em particular, para isolar o gene da leucotoxina, construiu-se bibliotecas de gene de P. haemolytica Al (estirpe B122) utilizando técnicas correntes. Ver, Lo et al., Infect. Immun., supra; DNA CLONING: Vol. I e II, supra; e Sambrook et al., supra. Construiu-se uma biblioteca genómica no vector plasmídeo pUCl3 e construiu-se uma biblioteca de ADN no bacteriófago lambda gtll. Utilizou-se os clones resultantes para transformar E. coli e combinou-se as colónias individuais e rastreou-se para a reacção com soro de um vitelo que sobreviveu a uma infecção com p. haemolytica e que tinha sido reforçado com um sobrenadante de cultura concentrado de P. haemolytica para aumentar os níveis de anticorpos anti-leucotoxina. As colónias positivas foram rastreadas em relação à sua aptidão para produzir leucotoxina incubando lisados de células com neutrófilos de bovino e medindo subsequentemente a libertação de lactato-desidrogenase a partir dos últimos.

Identificou-se várias colónias positivas e analisou-se estas recombinantes por mapeamento com endonuclease de restrição. Um clone era aparentemente idêntico a um gene de leucotoxina anteriormente clonado. Ver, Lo et al., Infect. Immun., supra. Para confirmar esta observação, reclonou-se fragmentos mais pequenos e comparou-se os mapas de 61 restrição. Determinou-se que foram clonadas aproximadamente 4 quilopares de bases de ADN. Isolou-se clones progressivamente maiores realizando um varrimento do cromossoma (na direcção de 5' para 3') para isolar os recombinantes completos os quais tinham aproximadamente 8 kb de comprimento. A construção final foi designada de pAAll4. Esta construção continha a totalidade da sequência do gene de leucotoxina.

Tratou-se o lktA, um fragmento do pAAH4 pela endonuclease de restrição Mael o qual continha todo o gene de leucotoxina, com o fragmento Klenow da ADN polimerase I conjuntamente com trifosfatos dos nucleótidos e ligou-se no sitio Smal do vector de clonagem pUC13. Este plasmídeo foi designado pAAl79. A partir deste, preparou-se duas construções de expressão no vector baseado em ptac pGH432:lacI digerido com Smal. Um, o pAA342, consistia do fragmento 5'-AhaIII do gene lktA enquanto o outro, o pAA345, continha o fragmento Mael completo descrito acima. 0 clone pAA342 expressava um péptido de leucotoxina truncado a níveis elevados enquanto o pAA345 expressava a leucotoxina completa a níveis muito baixos. Por conseguinte, a extremidade 3' do gene lktA (fragmento Styl BamHl do pAA345) foi ligada ao pAA342 digerido com Styl BamRI, para proporcionar o plasmídeo pAA352. A leucotoxina de P. haemolytica produzida a partir da construção pAA352 é doravante referida como lkt 352.

Utilizou-se em seguida o plasmídeo pAA352 para preparar uma versão encurtada do polipéptido de leucotoxina recombinante. 0 gene LKT encurtado foi produzido eliminando um fragmento de ADN interno com aproximadamente 1300 pb de comprimento do gene LKT recombinante como se segue. O 62 plasmídeo pCBH3, (N° de Registo ATCC 69749 e descrito na Patente U.S. n° 5 837 268) o qual inclui o polipéptido LKT 352, foi digerido com a enzima de restrição BstBl (New England Biolabs). 0 plasmideo linearizado resultante foi depois digerido com nuclease de feijão verde (Pharmacia) para eliminar as extremidades de cadeia única salientes produzidas pela digestão com BstBl. 0 ADN rombo foi depois digerido com a enzima de restrição Nae1 (New England Biolabs), e o ADN digerido foi carregado num gel com 1% de agarose onde os fragmentos de ADN foram separados por electroforese. Isolou-se um fragmento de ADN grande com aproximadamente 6190 bp e purificou-se a partir do gel de agarose utilizando um estojo Gene Clean (Bio 101) e deixou-se que o fragmento purificado se ligasse a ele próprio utilizando ADN ligase de bacteriófago T4 (Pharmacia). A mistura de ligação resultante foi utilizada para transformar células competentes JM105 de E. coli e os clones positivos foram identificados pela sua aptidão para produzir uma proteína agregada possuindo uma massa molecular apropriada. O plasmídeo recombinante assim obtido foi designado por pCBH4, (descrito na Patente U.S. n° 5 837 268) e produz um polipéptido de leucotoxina encurtado designado "LKT 114". O plasmídeo pCBH4 foi depois utilizado para produzir o plasmídeo pSLKT-30. O plasmídeo pSLKT-30 foi preparado clonando o fragmento que codifica a leucotoxina do pCBll4 por PCR no plasmídeo pAA352 (N° de Registo ATCC 68283 e descrito na Patente U.S. 5 476 657). Ao fazer deste modo, introduziu-se mutações próximo da extremidade C, resultando em duas alterações de aminoácido na molécula nativa de leucotoxina. Deste modo, clonou-se um fragmento de PCR da área afectada no plasmídeo pSLKT-30. Especificamente, 63 criou-se um fragmento de pSLKT-30 por PCR utilizando LKT6 (SEQ ID NO:40) como um iniciador de PCR a montante e LKT13 (SEQ ID NO:41) como o iniciador de PCR a jusante: LKT6: TTA GAG AGT TAT GCC GAA CGC (SEQ ID NO:40);

LKT13: GAT GCC ATC GCT AGC TAG CTA GGA TCC CCT AGC AAA TTC AAG AGA ÂGÂ TAA ACT TTG ATC CAA CAT TGA {SEQ ID NO:41}. O fragmento continha a alteração desejada e os sítios de restrição Nsi 1 e Ncol. O fragmento isolado foi digerido utilizando as enzimas de restrição Nsil e Ncol, como sucedeu com o plasmídeo pSLKT-30. O fragmento Nsil/Ncol foi retirado do plasmídeo e substituído com o fragmento de PCR, resultando na mutação de regresso à sequência original. O plasmídeo foi designado pCBl50. Um diagrama do plasmídeo pCBl50 é mostrado na Figura 14. A sequência de ácido nucleico de LKT 114 do plasmídeo pCBl50 é mostrada nas Figuras 15A-15D.

Exemplo 3

Construção de Multímeros de Fusão LKT-Peptídico de Miostatina

Utilizou-se cópias múltiplas de cada par oligómero descrito no Exemplo 1 para preparar repetições tandem das sequências de codificação para os multímeros de péptidos de miostatina ligadas ao gene LKT 114. A totalidade da parte activa da proteína também foi reconstruída e fundida com LKT 114 para ser utilizada como um agente de imunização. 64

As fusões de LKT-péptidos de miostatina representativas foram construídas como se segue. Emparelhou-se pares de oligonucleótido do Exemplo 1 e ligou-se ao vector pUCl9 (Pharmacia) o qual tinha sido digerido com a endonuclease de restrição HincII. 0 ADN ligado foi utilizado para transformar a estripe TOP10F' de E. coli (Invitrogen). Identificou-se os transformantes contendo as inserções de oligonucleótido por PCR e mapeamento com endonuclease de restrição.

Os pares de oligonucleótidos foram concebidos para serem ligados em conjunto ligando o sítio Bamftl na extremidade frontal de um par oligonucleótido ao sítio BglII na extremidade final de uma segunda cópia do par oligonucleótido. Os sítios de restrição no ponto de ligação foram desactivados deixando um único sítio Bamhl na extremidade frontal da repetição e um único sítio BglII na extremidade final da repetição. Construiu-se repetições tandem de cada par oligonucleótido digerindo o plasmídeo contendo o oligonucleótido com as endonucleases de restrição BamRI e BglII para libertar o fragmento de oligonucleótido inserido. Ligou-se então este fragmento novamente ao plasmídeo contendo o oligonucleótido, o qual tinha sido digerido com a endonuclease de restrição BglII. Utilizou-se o ADN ligado para transformar a estirpe TOPIOF' de E. coli. Os transformantes contendo repetições das inserções de oligonucleótido foram identificados por PCR e mapeamento com endonuclease de restrição. Este processo foi repetido até serem produzidos plasmídeos pUC19 contendo pelo menos quatro cópias de repetição e até 8 cópias de cada par oligonucleótido na orientação correcta. 65

Além de estarem ligados a eles próprios, alguns dos pares oligonucleótidos foram também concebidos para se ligarem um ao outro para recriar a região activa da proteína de miostatina de modo tão próximo quanto possível. Isto foi efectuado ligando o par oligonucleótido MYOS 3/4 cortado com Bamtil, BglII no sítio BglII atrás do par oligonucleótido MYOS 1/2 no vector pUCl9. Este foi seguido ligando o par oligonucleótido MYOS 5/6 cortado com BstBI e BglII no vector contendo a região activa de miostatina reconstruída cortada com BstBI e BglII. 0 par oligonucleótido MYOS 7/8 foi cortado com Bamtil e BglII e ligado ao vector contendo a região activa de miostatina reconstruída no sítio BglII. 0 vector contendo o par oligonucleótido MYOS 9/10 foi cortado com EcoRI e ligou-se o fragmento EcoRI da reconstrução pUCl9 de miostatina. O par oligonucleótido MYOS 11/12 foi cortado com Bamtil e BglII e ligado no vector contendo a região activa de miostatina reconstruída no sítio BglII. Ligou-se em seguida o par oligonucleótido MYOS 13/14 cortado com Bsml e BglII no vector contendo a região activa de miostatina reconstruída cortada com Bsml e BglII. Isto completou a reconstrução da sequência de codificação para a região activa de miostatina, a qual continha três conjuntos de grupos de ligação de dois aminoácidos inseridos na sequência da região activa de miostatina nas posições 55-60, 139-144 e 241-246 e na extremidade C (ver Figura 13).

Libertou-se em seguida cópias múltiplas de cada par oligonucleótido e da reconstrução da região activa de miostatina a partir do plasmídeo pUC19 por digestão com as endonucleases de restrição BamHl e BglII. Estes fragmentos de ADN foram depois ligados no plasmídeo pCB150. O plasmídeo pCB150 foi digerido com a endonuclease de 66 restrição Bamtil. 0 ADN ligado foi utilizado para transformar a estirpe TOPIOF' de E. coli. Os transformantes contendo as inserções de oligonucleótido foram identificados por PCR e mapeamento com endonuclease de restrição. Os plasmideos recombinantes foram designados por pJS121, pJS122, pJS123, pJS124, pJS125, pJS126, pJS127, pJS128, pJSl29, pJS130, e pCB317. 0 plasmideo pJS121 contém 6 cópias repetidas do par oligonucleótido MYOS 1/2 fundido com LKT 114. 0 plasmideo pJS122 contém 8 cópias repetidas do par oligonucleótido MYOS 3/4 fundido com LKT 114. 0 plasmideo pJS123 contém 8 cópias repetidas do par oligonucleótido MYOS 5/6 fundido com LKT 114. 0 plasmideo pJS124 contém 8 cópias repetidas do par oligonucleótido MYOS 7/8 fundido com LKT 114. O plasmideo pJS125 contém 6 cópias repetidas do par oligonucleótido MYOS 9/10 fundido com LKT 114. O plasmideo pJS126 contém 4 cópias repetidas do par oligonucleótido MYOS 11/12 fundido com LKT 114. O plasmideo pJSl27 contém 6 cópias repetidas do par oligonucleótido MYOS 13/14 fundido com LKT 114. O plasmideo pJS128 contém 4 cópias repetidas do par oligonucleótido MYOS 15/16 fundido com LKT 114. O plasmideo pJSl29 contém 8 cópias repetidas do par oligonucleótido MYOS 17/18 fundido com LKT 114. O plasmideo pJS130 contém 4 cópias repetidas do par oligonucleótido MYOS 19/20 fundido com LKT 114. O plasmideo pCB317 contém uma única cópia da reconstrução da região activa de miostatina fundida com LKT 114.

Exemplo 4

Purificação das Fusões LKT-Péptido de Miostatina 67

As proteínas de fusão recombinantes LKT-péptido de miostatina anteriores foram expressadas como corpos de inclusão e purificadas utilizando o procedimento seguinte. Inoculou-se uma ansa de células de cada cultura-mãe congelada em 10 ml de caldo TB num Erlenmeyer de 50 ml. O caldo TB foi reforçado com 100 μg/ml de ampicilina e incubado a 37°C durante 12-16 horas num agitador Innova 4000 a 250 rpm. Utilizou-se a cultura para inocular um litro de caldo TB num Erlenmeyer de 4L. O caldo TB foi reforçado com 100 μρ/πιΐ de ampicilina e incubado a 37°C durante aproximadamente 3 horas num agitador innova 4000 a 250 rpm. Adicionou-se então 1 ml de uma solução 1M de IPTG (isopropil-B,D-tiogalactopiranosideo) à cultura para induzir a produção de proteína recombinante. Incubou-se em seguida a cultura durante mais duas horas. Colheu-se as células por centrifugação durante 10 min a 6000 rpm em frascos de polipropileno 3x 500 ml utilizando um rotor JA 10 numa centrífuga Avanti J25. Ressuspendeu-se o sedimento celular em 40 ml de sacarose a 25%, cloridrato de Tris 50mM, pH 8,0 e congelou-se a -70°C durante 15 min. Descongelou-se as células congeladas à temperatura ambiente e misturou-se com 10 ml de Lisozima (Sigma, 10 mg/ml em cloridrato de Tris 250mM, pH 8,0). Após incubação durante 15 min em gelo, adicionou-se 300 ml de tampão de lise (2% de Triton X100, EDTA 50mM, cloridrato de Tris lOOmM, pH 8,0) e misturou-se por agitação. Submeteu-se então a suspensão de lisado celular a ultra-sons durante 4x 30 segundos na potência máxima com uma sonda grande num sonicador Misonix. Dividiu-se a solução para frascos de centrífuga 2x 250 ml e centrifugou-se durante 25 min a 10000 rpm num rotor JA 14. Lavou-se os sedimentos dos corpos de inclusão ressuspendendo em 100 ml de água 68 bidestilada e centrifugando para colher os organismos de inclusão. Este procedimento de lavagem foi repetido mais uma vez e o sedimento do corpo de inclusão final foi suspendido em 10 ml de água bidestilada e armazenado a -20°C até ser necessário.

Todas as proteínas de fusão isoladas foram testadas por SDS-PAGE para determinar a sua entidade por massa molecular, concentração e pureza, comparando as proteínas com padrões conhecidos. Solubilizou-se alíquotas de 10 μΐ de cada proteína de fusão com 10 μΐ de Ureia 8M e misturou-se então 2 μΐ de proteína solubilizada com 100 μΐ de tampão de carga lx SDS-PAGE. Aqueceu-se as amostras em tampão de carga a 94°C durante 5 min e analisou-se num gel de poliacrilamida a 10%. Também se analisou LKT 114 recombinante de pCBl50 como um controlo.

Exemplo 5

Efeito Biológico In Vivo das Proteínas de Fusão de LKT-Péptido de Miostatina

Para testar a aptidão das proteínas de fusão compreendendo cópias múltiplas de vários péptidos de miostatina fundidos com uma proteína portadora para manifestar um efeito biológico in vivo realizou- -se o seguinte estudo de vacinação. As proteínas de fusão recombinantes LKT-péptido de miostatina foram preparadas como se descreveu acima. Preparou-se vacinas para cada uma delas solubilizando cada uma das proteínas de fusão numa concentração final de Ureia 6M (utilizada para a primeira injecção) ou Guanidina-HCl 4M (utilizada para todas as injecções subsequentes). A alíquotas de 2,5 ml (utilizados 69 para as primeiras duas injecçoes) ou 1,5 ml (utilizados para a última injecção) de adjuvante VSA-3 (um adjuvante de Emulsigen Plus modificado) adicionou-se 1250 pg de cada proteina solubilizada e misturou-se com impulsos de 5x5 s com um ultra-sons Misonix com uma sonda de microponta regulado para uma potência de 5. A estas misturas, adicionou-se 50 μΐ de uma solução de Timerosal a 1% e PBS pH 7,4 (Soro Fisiológico Tamponado com Fosfato) até um volume final de 5 ml e submeteu-se novamente as misturas a ultra-sons. Utilizou-se um volume de 200 μΐ para cada injecção. Cada injecção continha 50 pg de proteina de fusão. Esta injecção inicial (dia 0) foi administrada às 3-4 semanas de idade com injecçoes subsequentes aos dias 28 e 56.

Catorze grupos de tratamento contendo cada um 15 ratinhos Suiços CDl. Os grupos de tratamento foram como se segue (ver Quadro 1): Grupo 1 controlo sem vacinação, Grupo 2 controlo apenas com adjuvante, Grupo 3 pCBl50 controlo com proteina portadora, Grupos 4 até 13 proteínas de ensaio pJS121 até pJS130, Grupo 14 proteina de ensaio pCB317. Pesou-se os ratinhos semanalmente para determinar o ganho de peso ao longo dos 98 dias da experiência. Os resultados deste estudo estão resumidos no Quadro 2 e na Figura 18. Utilizou-se guanidina-HCl como agente de solubilização de eleição já que ela parecia proporcionar uma melhor estabilidade da proteina em relação à Ureia na formulação de vacina. A concentração de VSA-3 foi reduzida de 50% para 30% na formulação de vacina num esforço para reduzir reacções no sítio de injecção. 70

Quadro 1 Grupo de Tratamento Oligo Myos Plasmídeo 1 - - 2 - - 3 - pCB 150 4 1 pJS121 5 3 pSJ122 6 5 pSJl23 7 7 pJS124 8 9 pJS125 9 11 pJS126 10 13 pJSl27 11 15 pJS128 12 17 pJS129 13 19 pJS130 14 reconstrução pCB317

Quadro 2 Grupo de Tratamento Peso Médio do Grupo Dia 0 ± EPM Peso Médio do Grupo Dia 98 ± EPM Ganho de Grupo Ao Peso Médio do Dia 84 ± EPM 1 Controlo 16, 67 + o, 32 29, 33 + o, 71 12, 67 + o, 65 2 Controlo 16, 11 ± 0, 25 29, 09 ± 0, 79 12, 99 ± 0, 72 3 Controlo 16, 05 ± 0, 34 29, 33 ± 0, 70 13, 27 ± 0, 61 4 Teste 16, 39 ± 0, 37 30, 02 ± 0, 60 13, 63 ± 0, 60 5 Teste 15, 52 ± 0, 35 30, 48 ± 0, 84 14, 96 ± 0, 72 6 Teste 15, 78 ± 0, 33 30, 84 ± 0, 99 15, 06 ± 0, 90 7 Teste 15, 72 ± 0, 27 30, 36 ± 0, 76 14, 64 ± 0, 65 8 Teste 15, 46 ± 0, 25 29, 42 ± 0, 84 13, 96 ± 0, 79 9 Teste 15, 32 ± 0, 32 29, 48 ± 0, 54 14, 16 ± 0, 50 10 Teste 16, 44 ± 0, 31 31, 27 ± 0, 92 14, 85 ± 0, 92 11 Teste 16, 30 ± 0, 41 31, 02 ± 0, 70 14, 72 ± 0, 75 12 Teste 15, 54 ± 0, 28 30, 73 ± 0, 71 15, 19 ± 0, 69 13 Teste 15, 57 + 0, 30 31, 04 + 0, 96 15, 47 + o, 99 14 Teste 15, 51 + 0, 20 29, 25 + 0, 62 13, 73 + 0, 56 71

Exemplo 6

Análise Estatística dos Resultados do Estudo A análise estatística dos resultados do estudo foi realizada utilizando um pacote de software estatístico (Statistix Versão 1.0). Neste estudo, todos os grupos de controlo tinham pesos totais médios muito semelhantes, ao passo que vários grupos teste tinham pesos totais médios elevados. Foi efectuada uma ANOVA unifactorial no ganho de peso ao longo dos 98 dias da experiência. Uma comparação LSD das médias dos ensaios indicou que o grupo de tratamento 13 era significativamente diferente de qualquer um dos grupos de controlo. Os grupos teste 12 e 6 foram significativamente diferentes de dois dos três grupos de controlo. Os grupos de tratamento também foram analisados agrupando-os em controlos (grupos 1-3) e grupo teste (grupos 4-14). Efectuou-se uma ANOVA unifactorial nos ganhos de peso destes dois grupos. Uma comparação LSD das médias dos ensaios indicou que o grupo que recebeu um tratamento de ensaio era significativamente diferente do grupo de controlo.

Depósito de Estirpes Úteis na Prática da Invenção

Fez-se um depósito de culturas biologicamente puras das estirpes seguintes na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA. O número de registo indicado foi atribuído após um ensaio de viabilidade com sucesso e foram pagas as taxas indispensáveis. Os depósitos foram feitos nas condições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos de Procedimento de Patentes e das Regulações relacionadas (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção de culturas viáveis 72 durante um período de trinta (30) anos desde a data do depósito e de pelo menos cinco (5) anos após o pedido mais recente de fornecimento de uma amostra do depósito pelo depositário. Os organismos serão disponibilizados pela ATCC nos termos do Tratado de Budapeste, o qual garante disponibilidade permanente e sem restrições das culturas a alguém que seja reconhecido pelo Comissário de Patentes e Marcas Registadas dos E.U.A como tendo esse direito de acordo com a 35 U.S.C. §122 e as regras do Comissário em conformidade com aquelas (incluindo 37 C.F.R. §1.12). Após concessão da patente, todas as restrições sobre a disponibilização ao público das culturas depositadas serão irrevogavelmente retiradas.

Estirpe Data de Depósito N° ATCC pAA352 em E. coli W1485 30 de Março de 1990 68283 pCB113 em E. coli JM105 1 de Fevereiro de 1995 69749

Assim são descritos péptidos, multímeros e imunoconjugados imunogénicos de miostatina, assim como o são métodos para os preparar e utilizar. Embora tenham sido descritas formas de realização preferidas da presente invenção com algum pormenor, entenda-se que podem ser feitas variações óbvias sem que se saia do âmbito da invenção como definido nas reivindicações apensas. 73

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Biostar Inc.

<120> MÉTODOS IMUNOLÓGICOS PARA

<130> 08-882641WO <140> PCT/CA99/00128 <141> 1999-02-19 <150> 60/075 213 <151> 1998-02-19 <160> 36 <170> Patent In Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1128 <212> ADN <213> bof taurus <400> 1 atgcaaaaac tgcaaatctc tgtttatatt gtggatctga atgagaacag cgagcagaag gcatgttcgt ggagggaaaa cactacatcc çtoagfcaaac ttcgcctgga aacagctcct ttgcccaagg etectccact cetggaactg agcagtgaeg getecttgga agaegatgae atgcccacgg agtctgatct tctáacgcaa aaatttagct ctaagataca atacaataaa aggccfcgtca agactcctge gacagtgttfc aaagacggta çaaggtatac tggaatccga ggtatttggc agagcattga tgtgaagaca tccaacttag gcattgaaat caaagcttta ttcççagaaç caggagaaga tggactgact ccaaaaagat etaggagaga ttttgggctfc tgotgtcgct accccctcac ggtggatttt MODULAR A MIOSTATINA EM VERTEBRADOS tacctattta cgctgattgt tgctggccca 50 gaaaatgtgg aaaaagaggg gctgtgtaafc 120 teaagactag aagccataaa aatccaaatc 100 áacatcagca aagatgctat cãgacááctt 240 attgatcagt tcgatgtcca gagagatgcc 300 taccaegcca ggacggasac ggtcattaec 360 gtggaaggaa aacccaaatg tfcgetfcettfc 420 ctagtaaagg cccaactgtg gatatatctg 480 gtgcaaatcc tgagactcat c&aacccatg 540 tctctgaaac fcfcgacafcgaa cccaggcact 600 gtgfctgcaga acfcggetcaa acaacctgaa 650 gatgagaatg gceatgatet tgotgtaaee 720 ccttttttag aagtcaaggfc aacagacaca 780 gattgfcgatg aacactccaa agaatcfccga 840 gaagcfctttg gatgggattg gattattgca 800 74 74 cccaaaagat ataaggccaa ttactgctcfc ggagaatgtg aatttgtatt fcfctgeaaaag 360 tatcctcata cccatcttgt gcaccaagca aaccccagag gttcagccgg cccctgctgt 1020 actcctacaa agafcgtctcc aattaatatg çtatafcttta atggcgaagg acaaataata 1080 tacgggaaga ttccagccat ggtagtagat cgctgtgggt gctcatga 112$ <210> 2 <211> 375 <212> PRT <213> bof taurus <400> 2

Met Gin Lys Leu Gin Ile Ser Vai Tyr Ile Tyr Leu Phe Thr Leu Ile 1 5 10 15 Vai Ala Gly Pro Vai Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn 20 25 30 Vai Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg GlU Asn Thr 35 40 45 Thr Ser Ser Arg Leu Glu Ala lie Lys Ile Gin Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 SO Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala IlS Arg Gls Leu $5 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu Ile Asp Gin Phe Asp Vai 65 90 9$ Gin Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Arg Thr Glu Thr Vai Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu 115 120 125 Thr Gin Vai Glu Gly Lys Pro Lya Cys Cys Phe Phe Lys Phe ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gin Tyr Asn Lys Leu Vai Lys Ala Glu Leu Trp Ile Tyr Leu 14 S 150 155 160 Arg Pro vai Lys Thr Pro Ala Thr Vai Phe Vai Gin Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lya Pro Mec Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gin Ser Ile Asp Vai 195 200 205

Lys Thr Vai Leu Gin Mn Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly 75 210 21S 220

Ile Glu II® Lys Ala Leu Asp Glu Asa Gly His Asp Leu Ala Vai Thr 225 230 235 240

Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Thr Pro Phe Léu Glu Vai Lys 245 250 255

Vai Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 .265 270

Asp Glu Eis Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai 275 210 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300

Lys Ala Aan Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Vai Phe Leu Gin Lys 305 310 315 320

Tyr Pro His Thr His Leu Vai His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335

Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 345 350 Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 360 365

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr 340

Phe Asn Gly Glu Gly Gin Ile 355 val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375

<210> 3 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> CDS <222> (1).. (60) <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de codificação do péptido MYOS 1, Figura 2 <400> 3 gga tcc cgt tct cgt ogc gae ttc ggt ctg gac tgc gae gaa cat tct 48

Gly Ser Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu Eis Ser 1 5 1Q 15 aoc gaa aga tct Thr Glu Arg Ser 20 60 76

< 210 > 4 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <400> 4

Qly Ser Arg Ser Arg ftrg Asp Phe 31 y Leu Asp Cys ftsp Glu His Ser 15 10 15 thr Glu Arg Ser 20

<210> 5 < 211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de codificação do péptido MYOS 3, Figura 3 <220> <221> CDS <222> (1) .. (51) <400> 5 48

gga tcc tct cgt tgc tgt cgc tat ccg ctg acc gfcfc gac ttc gaa aga Gly Ser Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai Asp Phe Glu Arg 1 S 3.0 IS

BI tct

Ser < 210 > 6 < 211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <400> 6

Gly Ser Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai Asp Phe Glu ftrg 15 io is

Ser

<210> 7 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de codificação do péptido MYOS 5, Figura 4 77 <220> <221> CDS <222> (1)..(57) <400> 7 gga tcc ttc gaa gct ttt ggt tgg gac tgg ate att gea ceg aaa cgt 48

Giy Ser Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp ile lie Ala Pro Lys Arg

1 s 10 IS tat aga tet 57

Tyr Arg Ser

<210> 8 <211> 19 <212 > PRT <213> Sequência Artificial < 4 0 0 > 8

Gly Ser Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie rle Ala Pro Ly» Arg 1 s lo 15

Tyr Axg Ser <210> 9 <211> 54

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de codificação do péptido MYOS 7, Figura 5 < 2 2 0 > <221> CDS <222> (1) .. (54) <400> 9 gga tcc aaa cgt tat aaa gct aac tat tgc tet ggt gaa tgc gaa fcte 48

Gly Ser Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cya Glu Phe 1 S 10 15 aga tet S4

Arg Ser

<210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <400> 10 78

Gly Ser Lys Arg Tyr Lya Ala Asn Tyr Cya Ser Gly 6iu Cys Giu Phe 15 10 IS

Arg Ser

<210> 11 <211> 72 < 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de codificação do péptido MYOS 9, Figura 6 <220>

<2 21> CDS <222> (1) . . (72) <400> 11

gsfa tcc gaa tfcc gtt ttc etg eag aaa tât eeg çat acc cãt ctg gtt 4S

Gly Ser Giu Phe Vai Phe teu Gin Lya Tyr Pro Bis Thr His teu Vai 15 10 15 aafc cag gct aac ceg cgt aga fcct 72

Hia Gin Ala Asa Pr© Arg Arg Ser 20 <210> 12 <211> 24 <212> PRT <213> Sequência Artificial <400> 12

Gly Ser Glu Phe Vai Phe teu Gin tys Tyr Pro His Thr His teu Vai 15 10 is

His Gin Ala Asn Pro Arg Arg Ser 20

<210> 13 <211> 81 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de codificação do péptido MYOS 11, Figura 7 <220>

<2 21> CDS <222> (1)..(81) <400> 13 79 gga tec gct ggt ccg tgc tgt tat ccg acc aaa atg tot ccg ate aac 48

Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Tyr Pro Thr Lys Met Ser pro lie Asn

15 10 IS atg ctg tat ttc aac ggt gaa tgc cag aga tet 81

Met Leu Tyr Phe Asn Gly Glu Cys Gin Arg Ser 20 25

<210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Sequência Artificial <400> 14

Gly Ser Ala Gly Pro cys Cys Tyr Pro Thr Lys Met Ser Pro tle Asn 15 10 15

Met Leu Tyr Phe Asn Gly Glu Cys Gin Arg Ser 20 25

<210> 15 <211> 72 < 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de codificação do péptido MYOS 13, Figura 8 <220> <2 21> CDS <222> (1) . . (72) <400> 15 48 gga tcc gaa tgc cag ate att tat tgc aaa ate ccg gct atg gtt gta Gly Ser Glu Cys Gin Ile Xle Tyr Cys Lys lie Pro Ala Met Vai Vai 15 10 15 gac cgt tgc ggt tgt tet aga tet Asp Arg Cys Gly Cys Ser Arg Ser 20

<210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Sequência Artificial <400> 16 72 80

Gly Ser Glu çys ôln Ile Ile Tyr Cys Lys lie piro Ma Met vai vai 1 5 10 15

Aap Arg Cys Gly Cys Ser Arg Ser 20

<210> 17 <211> 63 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de codificação do péptido MYOS 15, Figura 9 <220> <221> CDS <222> (1) .. (63) <400> 17 gga tcc gaa cag aaa gaa aac gtt gaa aaa gaa ggt ctg tgc aac gct 40

Gly Ser Glu Gin Lys Gin Asn Vai Gltt Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala 15 10 15

tgc ctg tgg aga tct SI

Cys Leu Trp Arg Ser 20

<210> 18 <211> 21 <212 > PRT <213> Sequência Artificial <400> 18

Gly Ser Glu Gin Lys Glu Asn Vai Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala 1 5 10 15

Cys Leu Trp Arg Ser 20 <210> 19 <211> 60

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de codificação do péptido MYOS 17, Figura 10 < 2 2 0 >

<2 21> CDS <222> (1)..(60) 81 < 4 Ο Ο > 19 gga tcc cat gac ctg gct gtt acc tte ceg gaa ccg ggt gaa gac ggt 48

Gly Ser His Asp leu Ala Vai Thr Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp giy 15 10 is ctg acc aga tcC ¢0

Leu Thr Arg Ser 20

<210> 20 <211> 20 <212 > PRT <213> Sequência Artificial <400> 20

Gly Ser Mie Asp heu Ala Vai Thr Phe Pro Glu Pro Gly Glu Asp Gly 1 S 10 IS leu Thr Arg Ser 20 <210> 21 <211> 60

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de codificação do péptido MYOS 19, Figura 11 <220> <2 21> CDS <222> (1) . . (60) < 4 0 0 > 21 gga tce acc ccg ttc ctg gaa gtt aaa gtt acc gac aet ceg aaa cgt 48

Gly Ser Tta Pro Phe leu Glu vai lys Vai Thr Asp Thr pro Lya Arg 1 5 10 15 tct cgt aga fcct ¢0

Ser Arg Arg Ser 20 < 210 > 22 <211> 20 < 212 > PRT < 213 > Sequência Artificial < 4 0 0 > 22

Gly s&r Thr Pro Phe leu Glu Vai Lys Vai Thr Asp Ifcr Pro Lys Arg 1.5 10 15 82

Ser Arg Arg Ser 20 <210> 23 <211> 372

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: região activa de miostatina reconstruída, Figura 13 <220> <221> CDS <222> (1) . . (372) <400> 23 gga tcc cgt tct cgt cgc gac ttt ggt ctg gac tgc gac gaa cat tcfc 40 Gly Ser Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser 1 5 10 15 acc gaa aga tcc tct cgt tgc tgt ege tat ccg ctg acc gtt gac ttc 96 Thr Glu Arg Ser Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr vai Asp Phe 20 25 30 gaa gct ttt ggt tgg gac tgg ate att gea ccg aaa cgt tat aga tcc 144 Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Arg Ser 35 40 45 aaa cgt tat aaa gct aac tat tgc tct ggt gaa tgc gaa ttc gtt ttc 192 Lys Arg Tyr Lys Ala Asa Tyr Cys Ser Gly Glu cys Glu Phe vai Phe 50 55 eo ctg cag aaa fcafc ccg cat acc cat ctg gtt cat cag gct aac ccg cgt 240 Leu Gin Lys Tyr Prc His Thr His Leu Vai His Gin Ala Asn Pro Arg 65 70 75 80 aga tcc gct ggt ccg t§c tgt tat ccg acc aaa atg tcfc ccg ate aac 286 Arg ser Ala Gly Pro Cys Cys Tyr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn 85 90 95 atg ctg tat ttc aac ggt gaa tgc cag ate att tat tgc aaa ate ccg 316 Met Leu Tyr Phe As» Gly Glu Cys Gin rie Ile Tyr Cys Lys Ile Pro 100 105 110 gct atg gtt gta gac cgt tgc ggt tgt tct aga tct 372 Ala Met vai Vai ASp Arg cys Gly cys Ser Arg Ser 115 120

<210> 24 <211> 124 <212 > PRT <213> Sequência Artificial <400> 24 83

Gly Ser Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser 1 5 10 15

Thr Glu Arg Ser Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai Asp Phe 20 25 30 GSlu Ala Phe Gly Trp * Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr Arg Ser 35 40 45 Lys Arg Tyr Lya Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Vai Phe 50 55 60 Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Vai His Gin Ala Asn Pro Arg 85 70 ' 7S 80 Arg Ser Ala Gly Pro Cys cys Tyr Pro Thr Lys Met Ser Pro Xle Asn §5 90 95 Met Leu Tyr Phe Asn Gly Glu Cys Gin Ile Ile Tyr Cys Lya Ile Pro ;ioo 105 110 Ala Mefc Vai vai Asp Arg Cys Gly Cys ser Arg Ser 115 120

<210> 25 <211> 1473 < 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: veiculo polipéptido leucotoxina, Figuras 15A-15D <220> <2 21> CDS <222> (1) . . (1473) <400> 25 atg gct aat gtt ata gat cta age tte cea aaa act ggg gea aaa aaa Met Ala Thr Val Ile Asp Leu Ser Phe Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys 1 5 10 15 att ato ctc fcafc att ccc caa aat tac caa tat gat act gaa caa ggt Ile Ile Leu Tyr Ile Pro Gin Asn Tyr Gin Tyr Asp Thr Glu Gin Gly 20 25 30 aat ggt tta cag gat tta gtc aaa gcg gee gaa gag ttg ggg att gag Aen Gly Leu Gin Asp Leu Val Lys Ala Ala Glu Glu Leu Gly Ile Glu 35 40 45 gta caa aga gaa gaa cgc aat aat att gea aca gct caa aec agt tta Vai sln Arg Glu Glu Arg Asn Asn lie Ala Thr Ala Gin Thr Ser Leu 50 55 60 48 96 144 192 84 ggc acg att caa acc gct att ggc tta act gag cgt ggc att gtg tta 240 Gly Thr íle Gin Thr Ala íle Gly Leu Thr Glu Arg Gly ile vai Leu 65 70 75 80 tcc gct cca caa att gat aaa ttg cta cag aaa act aaa gca ggc caa 288 Ser Ala Pro Gla Ile ASp Lys Leu Leu Gin Lys Thr Lys Ala Gly Gin 95 90 95 gca tta ggt tet gee gaa age att gta caa aat gca aat aaa gee aaa 336 Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser Ile vai Gin Asn Ala Asn Lys Ala Lys 100 105 110 act gta tta tet ggc att caa tet att tta ggc tca gta ttg gct gga 384 Thr Vai Leu Ser Gly íle Gin Ser Ile Leu Gly Ser Vai Leu Ala Gly U5 120 125 atg gat tta gat Wt gee tta cag aat aac age aac caa cat gct ctt 432 Met Mp Leu Asp Glu Ala Leu Gin Asn Asn Ser Asn Gin Sis Ala Leu 130 135 140 gct aaa gct SSC ttg gag cta aca aat tca tta att gaa aat att gct 480 Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Ser Leu Ile Glu Asn Ile Ala 145 150 155 160 aat tca gta aaa aca ctt S*c gaa ttt ggt gag caa att agt caa ttt 528 Asn Ser Vai Lys Thr Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gin Ile Ser Gin Phe 165 170 175 ggt tca aaa cta caa aat ate aaa ggc tta ggg act tta gga gac aaa 576 Gly Ser Lys Leu Gin Asn Ile Lys Gly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys ISO 185 190 ctc aaa aat ate ggt gga ett gat aaa gct ggc ctt ggt tta gat gtt 624 Leu Lys Asn lie Gly Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Gly Leu Asp Vai 195 200 205 ate tca ggg cta tta teg ggc gca acc gct gca ctt gta ctt gca gat 672 Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Vai Leu Ala Asp 210 21S 220 aaa aat gct tca aca gct aaa aaa gtg ggt gcg ggt ttt gaa ttg gca 720 Lya Asa, Ala Ser Thr Ala Lys Lys Vai Gly Ma Gly Phe Glu Leu Ala 225 230 235 240 aac caa gtt gtt ggt aat att acc aaa gee gtt tet tet tac att tta 768 Asa Gin Vai vai Gly Asn Ile Thr Lys Ala Vai Ser Ser Tyr Ile Leu 245 250 255 gee caa egt gtt gca gca ggt tta tet tca act ggg cct gtg gct gct 816 Ala Gin Arg vai Ala Ala Gly Leu ser Ser Thr Gly Pro Vai Ala Ala 26Q 265 270 tta att gct tet act gtt tet ctt gcg att age cca tta gca ttt gee 864 Leu Ile Ala Ser Thr Vai Ser Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ala Phe Ala 275 280 285 85 ggt att gcc gat aaa ttt aat cat gca aaa agt tta gag agt tat gcc 912 Gly He Ala Asp Lys Phe Asn Hís Ala Lys Ser Leu Glu Ser Tyr Ala 290 235 300 gaa cge ttt sâçi aaa tta ggc tat gac 9SF» gat aat tta tta gca gaa 960 Glu Arg Phe Lys Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu 305 310 315 320 tat cag cgg 33* aca ggg act att gat gca tcg gtt aet gca att aat 1008 Tyr Gin Arg Gly Thr Gly Thr He Asp Ala Ser Val Thr Ala 11e Asn 325 330 335 acc gca ttg gcc gct att gct ggt ggt gtg tefc gct gct gca gcc gat 1056 Thr Ala Leu Ala Ala He Ala Gly Gly val Ser Ala Ala Ala Ala Asp 340 345 350 tta aca ttt gaa aaa gtt aaa cat aat ctt gtc ate acg aat age aaa 1104 Leu Thr Phe Glu Lyg Vai Lys His Asn Leu Val He Thr Asn Ser Lys 355 360 365 aaa gag aaa Sft8 acc att caa aac tgg ttc cga gag gct gat ttt gct 1152 Lys Glu Lys Val Thr He Gin Asn Trp Phe Arg Glu Ala Asp Phe Ala 370 375 380 aaa gaa gtg cct aat tat aaa gca act aaa gat gag aaa atç gaa gaa 1200 Lys Glu Val Pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu Lys Ile Glu Glu 385 390 395 400 ate ate ggt eaa aat gag cgg ate acc tea aag caa gtt gat gat 1248 He He Gly Gin Asn Gly Glu Arg Ile Thr Ser Lys Gin Val Asp Asp 405 410 41$ ctt ate gca aaa ggt aac ggc aaa att acrc caa gat 3*9 cta tea aaa 1296 Leu Ile Ala Lys Gly Asn Gly Lys Ile Thr Gin Asp Glu Leu Ser Lys 420 425 430 gtt gtt gat aac tat gaa ttg ctc aaa cat age aaa aat gtg aca aac 1344 val val Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys Asn Val Thr Aan 43$ 440 44$ age tta gat ââg tta ate tea tet gta agt gca ttt acc tcg tet aat 1392 Ser Leu Asp Lys Leu He Ser Ser Val Ser Ala Phe Thr Ser Ser Asn 450 455 460 gat tcg aga aat gta tta gtg gct cca act tea atg ttg gat caa agt 1440 Asp Ser Arg Asn Val Leu Val Ala Pro Thr Ser Met Leu Asp Gin Ser 465 470 475 480 tta tet tet ctt caa ttt gct agg gga fccc tag 1473 Leu Ser Ser Leu Gin Phe Ala Arg Gly Ser 435 430

<210> 26 <211> 490 <212> PRT <213> Sequência Artificial 86 < 4 Ο Ο > 26

Met Ala Th* Vai Ile Asp Leu Ser Phe Pro Lys Thr Gly Ala Lys Lys 15 10 IS

Ile Ile Leu Tyr Ile Pro Gin Asn Tyr Gin Tyr Asp Thr Gin Gin Gly 20 25 20

Asn Gly Leu Gin Asp Leu Vai Lye Ala Ala Glu Glu Leu Gly lie Glu 3$ 40 45

Val Gin Arg Glu Glu Arg Asn Asn Ile Ala Thr Ala Gin Thr Ser Leu 50 55 60

Gly Thr Ile Gin Thr Ala Ile Gly Leu Thr Glu Arg Gly Ile Val Leu 65 70 75 80

Ser Ala Pro Gin Ile Asp Lys Leu Leu Gin Lys Thr Lys Ala Gly Gin 85 90 95

Ala Leu Gly Ser Ala Glu Ser ile val Gin Asn Ala Asn Lys Ala Lys 100 105 110

Leu Gly Ser Val Leu Ala Gly 125

Thr Val Leu Ser Gly Ile Gin Ser lie 11$ 120

Ket Asp Leu Asp Glu Ala Leu Gin Asn Asn ser Asn Gin His Ala Leu 130 135 140

Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Ser Leu Ile Glu Asn Ile Ala 145 150 155 160

Asn Ser Val Lys Thr Leu Asp Glu Phe Gly Glu Gin Ile Ser Gin Phe 165 170 175

Gly Ser Lys Leu Gin Asn ile Lys Gly Leu Gly Thr Leu Gly Asp Lys 180 185 190

Leu Lys Asn Ile Gly Gly Leu Asp Lys Ala Gly Leu Gly Leu Asp Val 19S 200 205

Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Thr Ala Ala Leu Val Leu Ala Asp 210 215 220

Lya Asn Ala Ser Thr Ala Lys Lys Val Gly Ala Gly Phe Glu Leu Ala 225 230 235 240

Asn Gin Val Val Gly Asn Ile Thr Lya Ala Val Ser Ser Tyr ile Leu 34$ 250 255

Ala Gin Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala 2S0 265 270 87

Xjgu Ile Ala Ser Thr Vai Ser Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ala Phe Ala 275 280 285

Gly Ile Ala Asp Lys Phe Asn His Ala Lys Ser Leu Clu Ser Tyr Ala 220 295 300

Glu Arg Phe Lys Lys hm Gly Tyr Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu 305 310 315 320

Tyr Gin Ârcj Gly Thr Gly Thr Ile Asp Ala Ser Vai Thr Ala lie Asn 325 330 335

Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ala Gly Gly Vai ser Ala Ala Ma Ala Asp 340 345 350

Leu Thr Phe Glu Lys Vai Lys His Asa Leu Vai Ile Thr Asa Ser Lys 355 360 365

Lys Glu Lys Vai Thr Ile Sln Asn Trp Phe Arg Glu Ala Asp Phe Ala 370 375 380

Lys Glu Vai pro Asn Tyr Lys Ala Thr Lys Asp Glu Lys Ile Glu Glu 385 390 395 400

Gin Vai Asp Asp 415

Ile Ile Gly Gin Asa Gly Glu Arg Ile Thr Ser Lya 405 410

Leu Ile Ala Lys Gly Asn Gly Lys Ile Thr Gin Asp Glu Leu Ser Lys 420 425 430

Vai Vai Asp Asn Tyr Glu Leu Leu Lys His Ser Lys Asa Vai Thr Asn 435 440 445

Ser Leu Aap Lys Leu Ile 450

Ser Ser Vai Ser Ala Phe Thr Ser Ser Asn 455 460

Asp Sar Arg Asa Vai Leu Vai Ma Pro Thr Ser Met Leu Asp Gin Ser 465 470 475 480

Ala Arg Gly Ser 490

Leu Ser Ser Leu Gin Phe 485

<210> 27 <211> 376 <212 > PRT <213> Mus musculus <400> 25 88

Met Met Gin Lys Lsu Gin Met Tyr Vai Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu 15 10 15

Ile Ala Ala Gly Pro Vai Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu 20 , 25 30

Asn Vai Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gin Asn 15 40 45

Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gin Ile Leu Ser Lys 50 SS €0

Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn ile ser Lys Asp Ala Ile Arg Gin 65 70 75 80

Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Aap Gin Tyr Asp SS P0 95

Vai Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr 100 105 110

Sis Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe 115 120 125

Leu Met Gin Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser 130 135 140

Ser Lys Ile Gin Tyr Asn Lys Vai Vai Lys Ala Glu Leu Trp ile Tyr 145 150 155 160

Leu Arg Pro Vai Lys Thr Pro Thr Thr Vai Phe Vai Gin Ile Leu Arg 165 170 175

Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly ile Arg Ser 180 18ã 150

Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gin Ser Ile Asp 155 200 205

Vai Lys Thr Vai Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu 210 215 220

Gly ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ma Vai 225 230 235 240 89

Thr Phe Pro Gly Pro 6ly Glu ASP Gly leu Asn Pro Phe Leu Glú val 245 250 255 Jjys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp 250 2S5 270 Cys Asp Glu ais Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr 275 280 285 Vâl ASp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile lie. Ala Pro Lys Arg 250 235 300 * Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu cys Glu Phe val Phe Leu Gin 305 310 315 320 Lys Tyr Pro His Thr His Leu val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly ser 325 330 335 Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Mefe Ser Pro Xle Asn Met Leu 340 345 350 Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin ile Xle Tyr Gly Lys 31e Pro Ala Met 355 350 365 vai Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375

<210> 28 <211> 376 <212 > PRT <213> Rattus norvegicus <400> 28

Met Xle Gin Lys Pro Gin Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Val Leu 1 5 10 15 Ile Ala Ala Gly Pro val Asp Leu Asn Glu Asp Ser Glu Arg Glu Ala 20 25 30 Asn val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gin Asn 3$ 40 45 Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gin ile Leu ser Lye 50 55 €0 Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gin S5 70 75 80 90 90 Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu 85 Vãl Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp 100 His Ala Thr Thr Glu Thr lie tle 115 120 Leu Met Gin Ala Asp Gly Lys Pro 130 135 Ser Lys Ile Gin Tyr Asn Lys Val 145 150 Leu Arg Ala Val Lys Thr Pro Thr 165 Leu Ile Lys Pro Mefc Lys Asp Gly 180 Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly 195 200 val Lys Thr Val Leu Gin Asn Trp 210 215 Gly He Glu Ile Lys Ala Leu Asp 225 230 Thr Phe pro Gly Pro Gly Glu Asp 245 Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg 260 Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser 275 280 Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp 230 235 Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly 305 310 Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val 325 Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr 340

Tyr Pite As» Gly Lys Glu Gin Ile 355 360

Arg Glu Leu Xle Asp Gin Tyr Asp 30 9S Gly Ser Leu Glu Asp Asp ASp Tyr 105 110 Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe 125 Lys cys cys Phe Phe Lys Phe ser 148 Val Lys Ala Gin Leu Trp Ile Tyr 155 160 Thr Val Phe Val Gin Ile Leu Arg 170 175 Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser 185 190 Thr Gly Ile Trp Gin Ser Ile Asp 205 Leu Lys Gin Prc Glu Sez Asn Leu 220

Glu Asn Gly His Asp Leu Ala vai 235 240

Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Vai 250 255

Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp 265 270

Arg Cys Cya Arg Tyr Pro Leu Thr 285

Glu Cys Glu Pite Vai Phe Leu Gin 315 320 ais Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser 330 335

Lys Met Ser Pro Ile Asn Mefc Leu 345 350

Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Mefc 365 val vai Asp Arg Cys Gly cys Ser 370 375 91 < 210 > 29 <211> 375 < 212 > PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 29

Mac Gin hys leu Gin leu Cys Val Tyr Ile Tyr leu Phe Met leu Ile 1 5 10 15 vai Ala Gly Pro Val Asp leu As» Glu Asn Ser Glu Gin lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gin Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg He Glu Ala Ile lys Ile Gin Ile leu Ser lya leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser lys Asp Val ile Arg Gin leu 65 70 75 80 Leu iro Lys Ala Pro Pro leu Arg Glu leu Ile Asp Gin Tyr ASp vni 55 90 95 Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu ASp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 tfefc Gin val Asp Gly Lys Pro lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys 21e Gin Tyr As» Lys Val Val lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu 145 ISO .155 160 Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gin Ile leu Arg Leu 165 170 175 92

Ue Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gin Ser lie Aap Vai 195 200 205

Lys Thr Vai Leu Gl» As» Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asa Leu Gly 210 21S 220

Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly Hie Asp Leu Ala Vai Thr 225 230 235 240

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Vai Lys 24$ 250 255

Vai Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai 275 280 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Mp Trp Ile ile Aja Pro Lys Arg Tyr 290 295 300

Lys Ala Asn Tyr Cys ser Gly Glu Cys Glu Phe Vai Phe Leu Gin Lys 305 310 315 320

Tyr Pro His Thr His Leu Vai His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser AXa 325 330 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gin Ile Ile Tyr Gly Lys ile Pro Ala Met Vai 355 360 365

Vai Asp Arg cys Gly Cys ser 370

<210> 30 <211> 375 <212 > PRT <213> Papio hamadryas <400> 30 375 93

Met Gin Lys Leu Gin Leu Cys Vai Tyr ile Tyr Leu phe Met Leu Ile 15 10 IS vai Ala Gly Pro vai Asp Leu Asa Glu As» Ser Giu Gin Lys Glu Asn 2S as 30

Vai Glu Lys Glu Gly Leu cys Asa Ala cys Thr Trp Arg ala Asn Thr 35 40 45

Lys Ser ser Arg ile Glu Ala He Lys Ile Gin 11« Leu Ser Lyg Leu 50 55 «0

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gin Leu 65 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gla Tyr Asp Vai 85 80 95

Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 no

Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 ' 125

Met Gin Vai Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140

Lya Ile Gin Tyr Asa Lys Vai Vai Lys Ala Gin Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160

Arg Prô Vai Glu Thr Pro Thr Thr Vai Phe Vai Gin Ile Leu Arg Leu 165 170 175

Ile Lys Pro Met Lya Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly ile Trp Gin Ser Ile Asp Vai 195 200 205

Lys Thr Vai Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220

Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Vai Thr 225 230 235 240

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Vai Lys

245 250 2SS

Vai Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 94 ASp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai 275 200 285 Asp Phe Glu Ma Leu Gly Trp Aap Trp Ile Xle Ala Pro Lys Arg Tyr 230 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Vai Phe Leu Gin Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Vai His Gin Ala Mn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 33S Gly Pro Cye Cyâ Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro ile Asn Met Leu Tyr 340 34S 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gin Ile Xle Tyr Gly Lys Xle Pro Ma Met Vai 355 360 365 Vai Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 31 <211> 375 <212> PRT <213> bof taurus < 4 0 0 > 31

Met Gin Lys Leu Gin He Ser Vai Tyr He Tyr Leu Phe Met Leu Xle 1 S 10 15

Vai Ma Gly Pro Vai Asp Leu Asn Glu Mn Ser Glu Gin Lys Glu Mn 20 25 30

Vai Glu Lya Glu Gly Leu Cya Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Aso Thr. 35 40 45

Thr Ser Ser Arg Leu Glu Ala He Lys He Gin Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Asp Ma Ha Arg Gin Leu ¢5 70 75 80

Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu Ile Asp Gin Phe Asp Vai 85 - 30 95 -

Gin Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 UO

Ma Arg Thr Glu Thr Vai Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Aap Leu Leu 95 115 120 125 Thr GXn Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys cys Phe Phe Lys Phe ser ser 130 135 140 Lys 11 e Gin Tyr Asn Lys Leu Val Lys Ala Gin Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 keg Pro Val Lys Thr Pro Ala Thr Val Phe val Gin Ile Leu Arg Leu 165 170 175 τι& Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 ISO Lys Leu Asp Met Mn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gin Ser Ile Asp Val 105 200 205 Lys Thr Val Leu Gin Asn Ttp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 W H Glu ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Glu Pro Gly Glu ASp Gly Leu Thr Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp cys 260 265 270 Aap Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 2S0 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe val Phe Leu Gin Lys 305 310 31S 320 Tyr Pro His Thr Bis Leu Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Mn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asm Gly Glu Gly Gin Ile ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala !4êt Val 355 380 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 32 <211> 375 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 32 96

Met Gin Lys Leu Gin Ile Tyr Val 1 S

Vai Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn 20 Vai Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn 35 40 Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile 50 55 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile 65 . 70 Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Axg 85 Gin Arg ASp Asp Ser Ser Asp Gly. 100 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr 11S 120 Met Gin Vai Glu Gly Lys Pro Lys 130 135 Lys Ile Gin Tyr Asn Lys val Val 145 150 Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr 165 Ile Lya Pro Met Lya Asp Gly Thr 130 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr 195 200 Lys Thr Val Leu Gin Asn Trp Leu 210 215 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu 225 230 Phe Pro Gly Pro Gly GlU Asp Gly 245 Vai Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser 260 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg 275 230

Tyr Ile Tyr leu Phe Met Leu Ile 10 is

Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn 25 30

Ala Cys Met Trp Arg Gin Asn Thr 45

Lys He Gin He Leu Ser Lys Leu 60

Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gin Leu 75 80

Glu Leu Ile Asp Gin Tyr Asp Vai 90 95

Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 105 110

Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu 125

Cys Cys Phe Phe Lys Phe ser Ser 140

Lys Ala Gin Leu Trp Ile Tyr Leu 155 160

Vai Phe Vai Gin Ile Leu Arg Leu 170 175

Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 185 190

Gly Ile Trp Gin Ser Ile Asp Vai 205

Lys Gl» Pro Glu Ser Asn Leu Gly 220

Asn Gly His Asp Leu Ala Vai Thr 235 240

Leu Asn Pro Phe Leu Glu Vai Lys 250 255

Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 265 270

Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai 225 97

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile lie Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Vâl Phe Leu Gin Lys 305 310 315 320 Tyr Pro Bis Thr HiS Leu vai His Gin Ala Aan Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys «et Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gla Ile lie Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Vai 355 360 355 vai ASp Arg Cys Gly Cys ser 370 375 <210> 33 <211> 375 <212 > PRT <213> Ovis aries <400> 33 Mêt Gin Lys Leu Gin lie Phe Vai Tyr lie Tyr Leu Phe Kst teu Leu i 1 S 10 is VAI Ala Gly Pro Vai Asp Leu Asn Glu Asa Ser Glu Gla Lys Glu Asn j 20 25 30

Vai Glu Lys Lys Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Gin Asn Asn i 35 40 45

Lys Ser ser Arg Leu GXu Ala lie Lys xle Gin lie Leu Ser Lys Leu 50 55 £0

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gin Leu 65 70 7$ 80

Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu lie Asp Gin Tyr Asp Vai 65 90 95

Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110

Vai Thr Thr Glu Thr Vai He Thr Mee Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu 115 120 125

Ala Glu Vai Gin Glu Lys Pro Lys Cys Cys lhe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140

Lys Ile Gin His Asn Lys Vai Vai Lys Ala Gin Leu Trp íle Tyr Leu 145 150 155 160 98

Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr vai Phe Val Gin Ile Leu Arg Leu 1S5 170 175 ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 105 190 Lys Leu Asp «et Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gin Ser Ile ÃSp vai 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gin ASU Trp Leu Lys Glu pro Glu Ser Asm Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly ais Asp Leu Ala val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Glu Pro Gly Glu Glu Gly Leu Âsn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255

Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp cys 260 265 270 Asp Glu Sis Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 375 280 2S5 Asp Phe Glu Ala Phe oiy Ttp Asp Trp Ile Ua Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Τ'/r Cya Ser Gly Glu Cys Glu Phe Leu Phe Leu Gin Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr Hía Leu Val ain Gin Ala Asn Pro Lya Gly Ser Ala 325 330 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Aso Met teu Tyx 340 345 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gin Ile lie Tyr Gly Lys Ile Pro Gly «et Vai 355 3€0 365

Vai Asp Arg Cys Gly Cys Ser 37Ô 375

<210> 34 <211> 375 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 34 «et Gin lys Leu Ala Vai Tyr Vai Tyr Ils Tyr teu Phe Met Gin ile 15 10 15

Ale Val Asp Pro Vai Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gin ?ro Thr Glu Asn 20 25 30 99

Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gin Asa Tftr 35 40 4S

Lya Ser Ser Arg Ile Glu Ala lie Lys Ile Gin Xle Leu Ser Lys Leu 50 ss 60

Arg Leu Glu Gin Ma Pro Asn Ile Ser Arg Asp Vai lie Lys Gin Leu €5 ?0 75 80

Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Gin Glu Leu Ile Asp Gin Tyr Asp vai 85 80 85

Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr Hís 100 105 110

Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125

Vai Gin Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140

Lys Ile Gin Tyr Asn Lys Vai Vai Lys Ala Gin Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 15$ 180

Arg Gin vai Gin Lys Pro Thr Thr Vãi Phe Vál Gin Ile Leu Arg Leu 165 170 1?5 Ile Lya Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly ile Arg Ser Leu ISO 185 190 Lys Leu ASp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gin Ser Xle Asp Vai 195 200 205 Lys Thr Vai Leu Gin Asn Trp Leu Lys Gin Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile GlU Xle Lys Ala Phe Asp Glu Thr Gly Arg Asp Leu Ala Vai Thr 225 330 235 240 Phe Pró Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Vai Arg 245 2S0 255 vai Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp cys 260 26$ 270 Asp Glu His ser Thr Glu Ser Axg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai 275 28o 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp % Trp Xle Xle Ala Pro Lys Arg Tyr 290 285 300 Lys Ala ask Tyr cys ser Gly Glu Cys Glu Phe Vai Phe Leu Gin Lys 305 310 315 320

Tyr Pro Eis Thr Eis Leu Vai Hís Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 100 325 330 335 aly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asa Met Leu Tyr 340 34$ 350 Phe Asn Giy hys Glu Gin Ile ile Tyr Gly Lys ile Pro Ale Met Vai 355 350 365 val Asp Arg Cys Giy cys Ser 370 375 < 210 > 35 <211> 375 < 212 > PRT < 213 > Meleagris gallopavo <400> 35

Met Gin Ile Leu Ala Vâl Tyr Vai Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gin Ile 1 5 10 15 Leu Vai His Pro V&l Ala Leu Asp Giy ser Ser Gla Pro Thr Glu Asa 20 25 30 Ala Glu Lys Aap Giy Leu Cys Asn Ala cys Thr Trp Arg Gin Asa Thr 35 40 45 Lys Ser ser Arg Ile Gin Ala Ile Lys ile Gin Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Gin Ala Pro Asa lie Ser Arg Asp Vai Ile Lys Gin Leu 65 70 75 00 Leu Pro Asg Ala Pro Pro Leu Gin Glu Leu Xlé Asp Gin Tyr Asp Vai 8$ 80 95 Glo Arg Asp Asp Ser Ser Asp Giy Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr Ris 100 205 210 Ala Thr Thr Gl» Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 Vai Gin Met Glu Giy Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gin Tyr Asa Lys vai Vàl Lys Ala Gin teu Trp Ue Tyr Leu 145 250 255 160 Arg Gin Vai Gin Lys Pro Thr Thr Vai Phe Vai Gin Ile Leu Arg Leu 155 270 275 Ile Lys Pro Met Lys Asp Sly Thr Arg Tyr Thr Giy Ile Arg Ser Leu ieo 185 190

Lys Leu Asp Met Asa Pro Giy Thr Giy Ile Trp Gin Ser Ile Asp Vai 101 195 200 205

Lys Thr Vai Leu Gin Rsn Trp teu Lys Gin Pro Glu Ser asa Leu Gly 210 215 220 lie Glu lie Lys Ala Phe Asp Glu âsa Gly Arg Asp Leu Ala Vai Thr 225 230 235 240

Phe Pro Gly Pro Gly Giu Asp Gly Leu Aen Pro Phe Leu Giu Vai Arg 245 250 255 vai Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 250 255 270

Asp Giu His Ser Thr Glu ser Arg Cys Cys Srg Tyr Pro Leu Thr Vai 275 2SÔ 205

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile ile AXa Pro Lys Arg Tyr 290 295 300

Lys Ala Atsn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Vai phe Leu Gin Lys 305 310 315 320

Tyr Pro Sis Thr His Leu Vai Sis Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser pro lie Asn Met Leu Tyr 340 345 35Ô

Phe Asn Gly Lys Glu Gin ile Ile Tyr Gly Lys ile Pro Ala Met Vai 3SS 3S0 305 val Asp Arg cys Gly cye ser 370 375 <210> 36 <211> 374 <212 > PRT <213> Danio rerio <400> 36

Met His Phe Thr Gin Val Leu Ile Ser Leu Ser Val Leu Ile Ala çys 1 5 10 15 Gly Pro Val Gly Tyr Gly Asp lie Thr Ala His Gin Gin Pro Ser Thr 20 25 30 Ala Thr Glu Glu Ser Glu Leu Cys Ser Thr Cys Glu Phe Arg Gin Hde 35 40 45 Ser Lys Leu Met Axg Leu His Ala Ile Lys Ser Gin Ile Leu Ser Lys 50 55 60

Leu Arg Leu Lys Gin Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Val Lys Gin 102 65 70 75 80 i

Leu Leu Pro Arg Ale Pro Pro Leu Gin ala Leu Leu Asp Gin Tyr Asp 85 P0 ?S

Vai Leu Gly Asp Asp Ser Lye Asp Gly Ale Val Glu Glu Asp Asp Glu 100 105 110

His Ala Thr Thr Glu Thr lie Met Thr Met Ala Thr Glu Pro Asp Pro 115 120 125

Ile Vai Glu Vai Asp Arg Lys Pro lys Cys Cys Phe Phe Ser Phe Ser 130 135 140

Pro Lys ile Qln Ala Asa Arg Ile Vai Arg Ala Glo Leu Trp Vai His 145 ISO 155 160

Leu Arg Pro Ala Glu GXu Ala Thr Tbr Vai Phe Leu Gin Ile Ser Arg

X65 170 17S Léu Met Pro Vai Lys Asp Gly Gly Arg His Arg ile Arg Ser Leu Lys 180 185 180 lie Asp Val Asa Ala Gly Vai Thr Ser Trp Gin Ser Ile Asp Vai Lys 155 200 205

Gin Val Leu Thr Val Trp Leu Lys Gin Pro Glu Thr Asa Arg Gly Ile 210 215 220

Glu ile Asm Ala Tyr Asp Ala Lys Gly as» Asp Leu Ala Val Thr Ser 225 330 235 240

Thr Glu Thr oiyftGlu Asp Gly Leu Leu Pro Phe Met Glu val Lys Ile 245 250 355

Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ile Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp 260 265 270

Glu As» Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp 275 280 285

Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys 380 255 300

Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Asp Tyr Met Tyr Leu Glu Lys Tyr 305 310 315 320

Pro His Thr His Leu val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly 325 330 335

Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Hat Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe 340 345 350

Asn Gly Lys Glu Gin Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val 355 360 365

Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370

Lisboa, 3 de Abril de 2007

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Imunoconjugado de miostatina compreendendo um multímero de miostatina compreendendo uma molécula de acordo com da fórmula geral (MP-X-MP)y, em que MP é um péptido de miostatina, em que cada um dos referidos péptidos de miostatina compreende independentemente uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de a) aminoácidos 3-15 da SEQ ID NO: 6; b) aminoácidos 3-17 da SEQ ID NO: 8; c) aminoácidos 3-16 da SEQ ID NO:10; d) aminoácidos 3-22 da SEQ ID NO:16; e) aminoácidos 3-19 da SEQ ID NO:18; f) aminoácidos 3-18 da SEQ ID O C\I d 3 g) aminoácidos 3-18 da SEQ ID NO 22; X é seleccionado do grupo consistindo de uma ligação peptídica, um grupo espaçador de aminoácidos, e [MP]n, em que n é maior ou igual a 1 e y é maior ou igual a 1; e em que o referido multímero de miostatina está fundido com um polipéptido de leucotoxina.
2. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 1, em que X compreende um grupo espaçador de aminoácidos incluindo pelo menos um determinante antigénico de células T auxiliares.
3. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 1, em que o referido multímero compreende pelo menos duas cópias da SEQ ID NO:6. 2
4. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 3, em que o referido multimero compreende oito cópias da SEQ ID NO:6 fundido com a LKT 114 como representado nas FIGS. 15A-15D (SEQ ID NO:26).
5. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 1, em que o referido multimero compreende pelo menos duas cópias da SEQ ID NO:8.
6. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 5, em que o referido multimero compreende oito cópias da SEQ ID NO:8 fundido com a LKT 114 como representado nas FIGS. 15A-15D (SEQ ID NO:26).
7. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 1, em que o referido multimero compreende pelo menos duas cópias da SEQ ID NO:10.
8. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 7, em que o referido multimero compreende oito cópias da SEQ ID NO: 10 fundido com a LKT 114 como representado nas FIGS. 15A-15D (SEQ ID NO:26).
9. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 1, em que o referido multimero compreende pelo menos duas cópias da SEQ ID NO:16.
10. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 9, em que o referido multimero compreende seis cópias da SEQ ID NO: 16 fundido com a LKT 114 como representado nas FIGS. 15A-15D (SEQ ID NO:26). 3
11. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 1, em que o referido multimero compreende pelo menos duas cópias da SEQ ID NO:18.
12. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 11, em que o referido multimero compreende quatro cópias da SEQ ID NO: 18 fundido com a LKT 114 como representado nas FIGS. 15A-15D (SEQ ID NO:26).
13. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 1, em que o referido multimero compreende pelo menos duas cópias da SEQ ID NO:20.
14. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 13, em que o referido multimero compreende oito cópias da SEQ ID NO:20 fundido com a LKT 114 como representado nas FIGS. 15A-15D (SEQ ID NO:26).
15. imunoconjugado de miostatina da reivindicação 1, em que o referido multimero compreende pelo menos duas cópias da SEQ ID NO:22.
16. Imunoconjugado de miostatina da reivindicação 15, em que o referido multimero compreende quatro cópias da SEQ ID NO:22 fundido com a LKT 114 como representado nas FIGS. 15A-15D (SEQ ID NO:26).
17. Imunoconjugado de miostatina definido por qualquer uma das reivindicações 1-lb para ser utilizado como um medicamento. Lisboa, 3 de Abril de 2007