HRP20010900A2 - Method for down-regulating gdf-8 activity - Google Patents
Method for down-regulating gdf-8 activity Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20010900A2 HRP20010900A2 HR20010900A HRP20010900A HRP20010900A2 HR P20010900 A2 HRP20010900 A2 HR P20010900A2 HR 20010900 A HR20010900 A HR 20010900A HR P20010900 A HRP20010900 A HR P20010900A HR P20010900 A2 HRP20010900 A2 HR P20010900A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- gdf
- polypeptide
- nucleic acid
- cell
- epitope
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 85
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 27
- 101150004578 gdf-8 gene Proteins 0.000 title description 2
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 title 1
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 claims description 312
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 105
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 77
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 73
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 72
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 63
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 62
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 61
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 39
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 37
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 36
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 31
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 30
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 29
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 25
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 25
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 25
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 20
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 19
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 19
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 19
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 15
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 13
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 4
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 4
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 4
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 4
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 claims description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 claims description 3
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 2
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 2
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 claims description 2
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 claims description 2
- 244000182067 Fraxinus ornus Species 0.000 claims description 2
- 235000002917 Fraxinus ornus Nutrition 0.000 claims description 2
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027421 Heat shock cognate 71 kDa protein Human genes 0.000 claims description 2
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 125000004030 farnesyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 2
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 102000004472 Myostatin Human genes 0.000 claims 59
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 claims 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 2
- OJISWRZIEWCUBN-QIRCYJPOSA-N (E,E,E)-geranylgeraniol Chemical group CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CO OJISWRZIEWCUBN-QIRCYJPOSA-N 0.000 claims 1
- 102100039328 Endoplasmin Human genes 0.000 claims 1
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 claims 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 108010017007 glucose-regulated proteins Proteins 0.000 claims 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 219
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 55
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 6
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 6
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 6
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 5
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 5
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 4
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 4
- 206010028311 Muscle hypertrophy Diseases 0.000 description 4
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 4
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 4
- 230000037257 muscle growth Effects 0.000 description 4
- 230000012042 muscle hypertrophy Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 3
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000886562 Homo sapiens Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 3
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- -1 dextran can be used Chemical class 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 3
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000886576 Bos taurus Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZCJOXAIQXPLNS-UHFFFAOYSA-N 1,1,2,2,3,3,4,4,4a,5,5,6,6,7,7,8,8,8a-octadecafluoronaphthalene 4-(2-aminoethyl)benzene-1,2-diol Chemical compound NCCc1ccc(O)c(O)c1.FC1(F)C(F)(F)C(F)(F)C2(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C2(F)C1(F)F QZCJOXAIQXPLNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 3-aminonaphthalene-1,5-disulfonic acid Chemical compound C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=CC(N)=CC(S(O)(=O)=O)=C21 MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010007556 Cardiac failure acute Diseases 0.000 description 1
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102100032919 Chromobox protein homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- XWNOCINUJAJTTH-UHFFFAOYSA-N DL-Glyceraldehyde 2-Phosphate Chemical compound OCC(C=O)OP(O)(O)=O XWNOCINUJAJTTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010090290 Growth Differentiation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010090293 Growth Differentiation Factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100040892 Growth/differentiation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100035364 Growth/differentiation factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101710165610 Heat-stable 19 kDa antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000797584 Homo sapiens Chromobox protein homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001120082 Homo sapiens P2Y purinoceptor 13 Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 description 1
- 102100026168 P2Y purinoceptor 13 Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical compound C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M dimethyl(dioctadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- MSNWSDPPULHLDL-UHFFFAOYSA-K ferric hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Fe+3] MSNWSDPPULHLDL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 125000002686 geranylgeranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000015604 muscle hyperplasia Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229940024231 poxvirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035938 sexual maturation Effects 0.000 description 1
- 230000004096 skeletal muscle tissue growth Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000002023 somite Anatomy 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 230000005924 vaccine-induced immune response Effects 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Control Of Eletrric Generators (AREA)
Description
Područje izuma
Ovaj izum odnosi se na područje uzgoja životinja i peradi kao i na humanu medicinu. Specifičnije, ovaj izum prikazuje poboljšanje kontrole povećanja rasta mišića, posebice na farmi životinja za klanje. Stoga su prikazane nove metode i načini za povećanje rasta mišića kod životinja za klanje.
Dosadašnje spoznaje
Danas se koriste dva različita medicinska pristupa da bi se povećala brzina rasta životinja na farmama: jedna je davanje životinjama na farmama antibiotika ili spojeva poput antibiotika, a drugi je davanje hormona rasta.
Zadnjih godina je pokazano da davanje antibiotika ili spojeva bliskih antibioticima životinjama na farmama (izrazito svinjama) uzrokuje nekoliko problema. Neki od tih spojeva su kemijski bliski antibioticima za tretman ljudskih bolesti, pa se dokazalo da velika upotreba takvih spojeva kod životinja s farme inducira rezistenciju prema humanim antibioticima i mikroorganizmima koji su patogeni ljudima. Nadalje, ovim spojevima je dobiveno relativno malo povećanje brzine rasta od 1-3%.
Upotreba hormona rasta kod životinja na farmama je skupa i tretman se treba ponavljati u kratkim vremenskim intervalima zbog relativno malog poluvremena života hormona rasta. Nadalje, zbog prisutnost mogućih ostataka hormona rasta u mesu dobivenog od tretiranih životinja nailazi se na zabrinutost, posebno kod europskih potrošača.
GDF-8
GDF-8 ili miostatin je otkriven svibnja 1997 kao faktor reguliranja rasta koji selektivno smanjuje rast mišićne mase (McPherron et al., Nature, 387, 83-90. 1997). Ekspresija GDF-8 je ograničena na miotomski dio embrionskih somita, ali je također eksprimirana u različitim tkivima mišića u cijelom tijelu odrasle životinje.
Miševima kojima je uklonjen GDF-8 ("knock out" miševi) izrazito raste skeletna mišićna masa. Povećanje skeletne mišićne mase je prošireno po cijelom tijelu i izolirani mišići iz GDF-8 negativnih miševa su težili 2-3 puta više od mišića divljeg tipa. Ukupna težina tijela "knock out" miševima je oko 35% veća od miševa divljeg tipa i miševi kojima nedostaje gen za GDF-8 imaju više od 80% više mišićnih vlakana od normalnih miševa. Veliko povećanje skeletnih mišića opaženo u "knock out" miševima, međutim, ne potječe samo od povećanja broja mišićnih vlakana, nego i od značajne hipertrofije vlakana. Veličina mišićnog presjeka kod GDF-8 "knock out" miševa je povećana oko 14 do 49%, ovisno o tipu mišića. Interesantno, također je zamijećen rast brzine povećanja mase mišića kod odraslih transgeničnih miševa. Nadalje, svi GDF-8 negativni miševi su sposobni preživjeti i fertini su.
Studenog 1997. autori koji su originalno otkrili GDF-8 se publicirali o dva legla stoke koji su imali znatno povećanu mišićnu masu, Beian Blue i Piedmontese su imali mutaciju u GDF-8 kodirajućoj sekvenciji što je razlog za veliku mišićnu masu (McPherron i Se-Jin Lee, 1997, PNAS 94, 12457-12461). Taj fenomen "udvostručenja mišića" je opažen u mnogim leglima stoke u zadnjih 190 godina, a životinje su imale povećanu mišićnu masu od 20-25%. Oni također pokazuju veću učinkovitost pri hranjenju, a produciraju meso visoke kvalitete.
Za razliku od GDF-8 "knock out" miševa, kod Belgian Blue goveda su također smanjene mase većine organa. Ta "prirodna knock out goveda" također pate od smanjene fertilnosti ženki, smanjenog preživljavanje potomaka i zakašnjelog seksualnog sazrijevanja.
Relativno povećanje mišićne mase u "knock out govedima" nije tako izrazito kao kod "knock out" miševa - zapravo odgovara mišićnoj hipertrofiji opaženoj kod miševa. McPheron et al. nagađaju da jedan razloga može biti što je normalno govedo bliže maksimalnom broju moguće mišićne mase nego miševi (pa stoga i maksimalnom mogućem broju mišićnih vlakana) nakon generiranja selektivnog legla. Autori nisu publicirali podatke o broju hiperplazija mišićnih vlakana prema hipertrofiji u stoci, ali zasnovano na toj pretpostavci i opaženoj mišićnoj hipertrofiji kod "knock out" miševa, može biti moguće da povećanje mišićne mase i brzina rasta opažena npr. u Bellgian Blue govedima uvelike potječe od hipertrofije mišića, te manjom mjerom od stupnja mišićne hiperplazije.
Fiziološka uloga GDF-8
Ekspresija GDF-8 je vrlo ometena u skeletnim mišićima. Postoji niska razina ekspresije u adipoznom tkivu, ali ne postoji ekspresija u mišićima srca. Fiziološka uloga GDF-8 u odraslom pojedincu nije poznata, mada izgleda da GDF-8 može imati funkciju kao specifični negativni regulator rasta skeletnih mišića. Nagađanja oko fiziološke uloge usredotočeno je na važne funkcije u hipertrofiji izazvane vježbanjem ili regeneracijom nakon ozljede. GDF-8 može, međutim spriječiti rast adipoznog tkiva. Nije poznato da li GDF-8 djeluje lokalno ili sistematski tijekom rasta životinje.
Struktura GDF-8
GDF-8 pripada superobiteji faktora ptransformiranja rasta, a koja obuhvaća skupinu stukturno sličnih proteina obuhvaćenih u razvitku embrija. Humani i goveđi GDF-8 nastaju kao proteinski prekursor dug 375 aminokiselina. Kao i ostali proteini TGF-β superobitelji, GDF-8 je vjerojatno procesuiran proteolitički u mnogo kraći C-terminalni fragment od oko 109 aminokiselina koji tvore disufidima povezane homodimere. Homodimer je vjerojatno biološki aktivni oblik GDF-8.
Aminokiselinske sekvencije GDF-8 glodavaca, štakora, čovjeka, babuna, goveda, svinje, ovce, pileta i purice su poznate i GDF-8 molekule su vrlo konzervirane (McPheron i Se-Jin Lee, PNAS, 94, 12457-12461, 1997). Sekvencije GDF-8 glodavaca, štakora, čovjeka, svinje, pileta i purice su 100% identične u C-terminalnoj regiji, koja vjerojatno sadrži biološki aktivni dio GDF-8. Goveđi i ovčji GDF-8 se razlikuju samo u dva aminokiselinska ostatka od humanog GDF-8 u C-terminalnoj regiji. Goveđa GDF-8 ima sekvenciju -Glu-Gly umjesto -Lys-Glu- u položajima 356-357, a ovčija GDF-8 ima dvije konzervativne supstitucije (Val u položaju 316 i Arg u položaju 333 umjesto Leu i Lys). Ni jedan od poznatih GDF-8 proteina nema potencijalna N-glikoziacijska mjesta u njihovoj C-terminalnoj regiji.
Cilj izuma
Cilj ovog izuma je prikazati rekombinantnu terapeutsku vakcinu koja je sposobna smanjiti aktivnosti faktora 8 diferencijacije rasta (GDF-8) (također poznat kao miostatin) da bi se povećala brzina rasta mišića kod životinjama na farmama. Daljnji cilj je prikazati metodu vakcinacije životinja da bi se povećala brzina rasta mišića. Također je cilj ovog izuma prikazati varijante GDF-8 koje su sposobne razbiti autotoleranciju na analoge GDF-8. Još jedan cilj je prikazati fragmente nukleinske kiseline, vektore i transformirane stanice koje su korisne u pripravi vakcina i GDF-8 varijanata.
Sažetak izuma
Zasnovano na gore navedenim rezultatima u transgeničnim GDF-8 "knock out" životinjama i Belgian Blue i Piedmontese govedima, ovi izumitelji su razvili teoriju koja će omogućiti smanjivanje aktivnosti GDF-8 u životinjama, a indukcijom učinkovite količine i fino prilagođenom imunom odgovoru na GDF-8. Stoga, što je u osnovi prikazano ovim izumom je metoda i načini imunološkog smanjivanja GDF-8 da bi se djelovalo na povećanje mišićne mase kod životinja.
Ovaj pristup ima nekoliko prednosti u odnosu na poznate mjere povećanja brzine rasta životinja na farmi. Prije svega, problemi koji se odnose na unakrsnu rezistenciju u patološkim mikroorganizmima neće postojati kada se koristi ovaj pristup. Nadalje, neće postojati mogućnost zaostalog egzogeno danog hormona rasta u mesu životinja koje su podvrgnute ovom tretmanu. Konačno, etički problem koji je se pojavljuje pri uzgoju o produkciji stoke kao što je Begian Blue i Piedmonte (gdje je rođeno puno telića carskim rezom i gdje su drugi organi smanjene veličine) se mogu potpuno izbjeći odgađanjem smanjivanja GDF-8 nakon rođenja (npr. samo u odraslom životu) - zapravo životinje koje imaju povećanu masu mišića nije potrebno da se množe, pa se tretman stoga može provesti na onim životinjama koje su predviđene za klanje.
Kako je broj tipova mišićnih vlakana određen tijekom embrionalnog života, nije jako vjerojatno da bi anti-GDF-8 vakcina povećala broj mišićnih vlakana kod odrasle životinje s farme. Stoga nije sigurno niti je vjerojatno da bi anti-GDF-8 vakcina mogla smanjiti GDF-8 na istu razinu kao što je viđeno kod "knock out" životinja. To možda i ne bi bilo poželjno jer bi to moglo negativno utjecati na kvalitetu mesa, mogućnost uzgoja i omjer masti. Ipak, povećanje brzine rasta i/ili maksimalne tjelesne težine za od 5-25% dobivene vakcinacijom životinja, a što potječe od hipertrofije mišića nakon rođenja (u rasponu koji ne izgleda nerealistično) bi još uvijek bilo interesantno u produkciji mesa od goveda, svinja i peradi.
Identičnost GDF-8 sekvencije relativno prema ostalim članovima TGF-β obitelji je samo u 30-40 posto aminokiselina. Ta mala identičnost sekvencija neće najvjerojatnije stvarati probleme s ukrštenom reaktivnosti antitijela induciranih prema GDF-8.
Stoga u najširem i najopćenitijem obujmu, ovaj izum se odnosi na in vivo metodu smanjivanja aktivnosti faktora 8 diferencijacije rasta (GDF-8) u životinji, uključujući čovjeka, a metoda sadrži djelovanje na ispoljavanje životinjskog imunog sustava s učinkovitom količinom:
- najmanje jednog polipeptidnog GDF-8 ili njegove podsekvencije koja je formulirana tako da imunizacija životinje s polipeptidnim GDF-8 ili njegovom podsekvnecijom inducira produkciju antitijela na polipeptidni GDF-8, i/ili
- najmanje jednog analoga GDF-8 u koji je uvedena barem jedna modifikacija aminokiselinske sekvencije GDF-8 što rezultira time da imunizacija životinje s analogom inducira produkciju antitijela na polipeptidni GDF-8.
Očekuje se da 1-4 injekcije imunogenih pripravaka godišnje prema izumu budu dovoljne za dobivanje željenog učinka, dok je hormone rasta i antibiotike potrebno davati mnogo češće životinjama u kojima se radi.
Izum se također odnosi na analoge GDF-8 kao i na fragmente nukleinskih kiselina koje kodiraju njihove podgrupe. Dio izuma su također imunogeni pripravci koji sadrže analoge fragmenata nukleinskih kiselina.
Izum se također odnosi na metode identifikacije imunološki učinkovitih analoga GDF-8 kao i na metode priprave pripravaka koji sadrže analoge GDF-8.
Opis slika
Slika 1 Modeli konstrukata autovakcine izvedenih od GDF-8. Dijelovi pokazani tamnosivo su dijelovi u kojima je predloženo da dođe do supstitucije s P2 i P30.
A: Monomerni kronstrukt s insertiranim P2 epitopom, "1" označuje P2 supstituciju aminokiselinskih ostataka 18-32 od 109 aminokiselina C-terminalnog GDF-8 fragmenta, "2" označuje P2 supstituciju aminokiselinskih ostataka 52-66 od 109 amino-kiselina C-terminalnog GDF-8 fragmenta, te "3" označuje P2 supstituciju aminokiselinskih ostataka 83-97 od 109 amino-kiselina C-terminalnog GDF-8 fragmenta.
B: Monomerni konstrukt s insertiranim P30 epitopom."1" označuje P30 supstituciju aminokiselinskih ostataka 21-41 od 109 aminokiselina C-terminalnog GDF-8 fragmenta, "2" označuje P30 supstituciju aminokiselinskih ostataka 49-69 od 109 aminokiselina C-terminalnog GDF-8 fragmenta, te "3" označuje P30 supstituciju aminokiselinskih ostataka 79-99 ili 84-104 od 109 aminokiselina C-terminalnog GDF-8 fragmenta.
C: Prošireni monomerni konstrukt s PZ i P30 supstituiranim u C-terminalnog fragmenta GDF-8 od 160 aminokiselinska ostatka.
D: Dimmerni konstrukt s epitopima P2 i P30 koji su serijski povezani između dviju kopija 109 C-terminalnog fragmenta GDF-8.
Slika 2 Očekivana 3D struktura TGF-β proteina.
Model je zasnovan na analognoj domeni (TGJ-1) iz TGF-β proteina, β-nabrana ploče su pokazane kao strelice, a uzvojnice kao cilindri.
Detaljan opis izuma
Definicije
U sljedećem dijelu bit će definirani i u detalje objašnjeni brojni termini korišteni u ovoj specifikaciji i zahtjevima, a da se raščiste otkrića i područja izuma.
Termin "T-limfocit" i T-stanica" će se koristiti alternativno za limfocite porijeklom iz timusa koji su odgovorni za različite stanice koje su posredovane imunim odgovorima kao i za aktivnost pomoćnih stanica u humoralnom imunom odgovoru. Slično, termin "B-limfocit" i B-stanica" će se koristiti limfocite koji produciraju antitijela.
"Polipeptidni GDF-8" ovdje označuje polipeptide koji imaju aminokiselinsku sekvneciju gore diskutiranih GDF-8 proteina izvedenih iz brojnih životinja (ili skraćene tako da dijele znatnu količinu epitopa B-stanica s netaknutom GDF-8), ali su također terminom obuhvaćeni polipeptidi koji imaju aminokiselinsku sekvneciju identičnu kseno-analozima tih proteina izoliranih iz ostalih vrsta. Kada se termin koristi normalno označuje biološki aktivni oblik, tj. C-terminlni peptid koji kod ljudi ima duljinu od 109 aminokiselina. Također su unutar granica termina neglikolizirani oblici GDF-8 koji su pripravljeni u prokariotskom sustavu, kao i oblici koji imaju različite O-glikolizacijske oblike zbog njihove upotrebe, tj. gljivice ili ostali neeukaritoski ekspresijski sustavi. Međutim, treba naznačiti da kada se koristi termin "polipeptidni GDF-8" namjera je da polipeptid normalno nije imunogen kada se ispoljava u tretiranoj životinji. Drugim riječima, polipeptidni GDF-8 je vlastiti protein ili je kesno-analog takvog vlastitog proteina koji normalno ne povećava imuni odgovor protiv GDF-8 životinje u pitanju.
"GDF-8 analog" je polipeptidni GDF-8 čija je primarna struktura podvrgnuta promjenama. Znakovi promjene mogu npr. biti u obliku vezanja polipeptidnog GDF-8 na pogodni fuzijski partner (tj. promjena primarne strukture obuhvaća samo C, i/ili N-terminalnu adiciju aminokisleinskih ostataka i/ili može biti u obliku delecije i/ili supstitucije u polipeptidnoj aminokiselinskom sekvencijom. U termin "GDF-8 analog" su također obuhvaćeni derivatizirane molekule GDF-8, cf. donju diskusiju modifikacije GDF-8.
Valja naznačiti da upotreba vakcine kod ljudi, s npr. psećim analogom humanog GDF-8 za koji se može zamisliti da producira željeni imunitet na GDF-8. Takva upotreba kseno-analoga za imunizaciju se također smatra da je "analog GDF-8", kao što je gore definirano.
Termin "polipeptid" u ovom kontekstu označuje kratke peptide od 2 do 10 aminokiselinskih ostataka, oligopeptide od 11 do 100 aminokiselinskih ostataka, te polipeptide od više od 100 aminokiselinskih ostataka. Nadalje, namjera je također da termin uključuje proteine, tj. funkcionalne biomolekule koje sadrže najmanje jedan polipeptid, a kad sadrže najmanje dva polipeptida oni mogu biti u obliku kompleksa, kovalentno vezani ili mogu biti nekovalentno vezani. Polipeptid(i) u proteinu može biti glikoliziran i/ili lipidiran i/ili može sadržavati prostetične skupine.
Termin "subsekvencija" označuje dio od najmanje 3 amino-kiseline ili, kada je to važno, najmanje 3 nukleotida izravno izvedene od prirodne aminokiselinske sekvencije GDF-8 ili sekvencije nukleinske kiseline.
Termin "životinja" u ovom kontekstu općenito označuje životinjske vrste (preferirano sisavce) kao što su Homo sapiens, Canis domesticus, itd. a ne samo jednu životinju. Međutim, termin također označuje populaciju takvih životinjskih vrsta jer je važno da jedinke imunizirane prema metodi iz izuma sve sadrže uglavnom isti GDF-8 koji dopušta da imunizaciju životinja s istim imunogenom (imunogenima). Ako primjerice genetske varijante polipeptidnog GDF-8 postoje u različitim humanim populacijiama, može biti neophodno da se koriste različiti imunogeni u tim različitim populacijama, a da bi se mogla razbiti autotolerancija prema GDF-8 u svakoj populaciji. Stručnjaku će biti jasno da je životinja u ovom kontekstu živo biće koje ima imuni sustav. Preferirano je da životinja bude vertebrata, kao što je sisavac.
Terminom "in vivo smanjivanje aktivnosti GDF-8" ovdje označuje smanjivanje u živom organizmu broja interakcija između GDF-8 i njegovih receptora (ili između GDF-8 i ostalih mogućih biološki važnih partnera za vezivanje za tu molekulu). Smanjivanje se može dobiti putem nekoliko mehanizama od kojih je interferencija antitijela koji se veže s aktivnim mjestom najjednostavnija. Međutim, također je unutar obujma ovog izuma da vezivanje antitijela uzrokuje uklanjanje GDF-8 sa stanicama "čistačima" (kao što su makrofagi i ostale fagocitne stanice).
Namjera je da izraz "djeluje na ispoljavanje ....na imuni sustav" označuje da je životinjski imuni sustav podvrgnut imunogenom izazovu na kontrolirani način. Bit će jasno iz donjeg prikaza da se takav izazov imunog sustava može izvesti na brojne načine od kojih je najvažnija vakcinacija s polipeptidom koju sadrži "farmacina" (tj. vakcina koja je dana da poboljša odvijajuću bolest) ili nukleinskom kiselinom koju sadrži "farmacina". Važan rezultat koji treba postići je da su imuno kompetentne stanice u životinji kontrolirane antigenom na imunološki učinkovit način, dok je točan način postizanja to rezultata manje važan od inventivne ideje prikazane u ovom izumu.
Termin "imunogeno učinkovita količina" ima svoje uobičajeno značenje, tj. količina imunogena koja može inducirati imuni odgovor koji značajno zadržava patogena sredstva koja dijele imunološke karakteristike s imunogenom.
Kada se koristi izraz da je GDF-8 "modificiran" ovdje označuje kemijsku modifikaciju polipeptida koji čini skelet tog GDF-8. Takva modifikacija može npr. biti derivatizacija (npr alkiliranje, aciliranje, esterifikacija itd.) na nekim aminokiselinskim ostacima u sekvenciji GDF-8, ali će, kao što će biti razumljivo iz donjeg prikaza, preferirana modifikacija sadržavati promjene (ili još dodatno) primarne strukture animokiselinske sekvencije GDF-8.
Kada se diskutira "autotolerancija prema GDF-8", a zato što je GDF-8 vlastiti protein u populaciji koju treba vakcinirati, podrazumijeva se da normalni pojedinci u populaciji neće povećavati imuni odgovor prema GDF-8. Ne može se isključiti da će ponekad pojedinci u životinjskoj populaciji moći tvoriti antitijela na prirodni GDF-8, npr. kao dio autoimunog poremećaja. Pri bilo kojoj brzini, životinja će normalno biti autotolerantna prema svom vlastitom GDF-8, ali se ne može isključiti da će analozi IL% izvedeni iz ostalih životinjskih vrsta ili iz populacije koja ima različit fenotip GDF-8 takođe biti tolerirani u rečenim životinjama.
"Strani epitop za T-stanice" (ili "strani epitop za T-limfocit") je peptid koji je u stanju vezati se na molekulu MHC i koji stimulira T-stanice u životinjama. Preferirani strani epitop za T-stanice u ovom izumu su epitopi relaksirane specifičnosti, tj. epitopi koji se vežu na veliki udio klase MHC molekula u životinjskim vrstama u populaciji. Poznat je samo vrlo mali broj takvih epitopa za T-stanice relaksirajuće specifičnosti, i ti će dolje biti detaljno prikazani. Valja napomenuti da bi imunogeni koji se koriste u ovom izumu bili učinkoviti u velikom dijelu životinjske populacije, za što može biti neophodno da se 1) insertira nekoliko stranih epitopa za T-stanice u analog GDF-8 ili da se 2) pripravi nekoliko analoga GDF-8 u kojima svaki analog ima insetrirani različiti epitop relaksirane specifičnosti. Valja naznačiti da koncept stranih epitopa za T-stanicu također obuhvaća upotrebu kriptičnih epitopa za T-stanicu, tj. epitopa koji se izvode iz vlastitih proteina i koji pokazuju imunogeno ponašanje samo kad postoje u izoliranom obliku bez početnog dijela vlastitih proteina.
"Strani epitop za T pomoćni limfocit" (strani etitop za TH) je strani epitop za T-stanicu koji se vezuje na MHC klasu II molekula i može biti prisutan na površini stanice koja ispoljava antigen (APC) vezanom na MHC klasu II molekulu.
"Funkcionalni dio" (bio)molekule u ovom kontekstu označuje dio molekule koja je odgovorna za najmanje jedan biokemijski ili fiziološki efekt pod utjecajem molekule. Dobro je poznato u struci da mnogi enzimi ili ostale molekule imaju aktivno mjesto koje je odgovorno za efekte koje se ispoljuju zbog tih molekula. Ostali dijelovi molekule mogu služiti u svrhu stabilizacije ili mogu povećavati topljivost i mogu stoga biti izostavljeni ako ove svrhe nisu važne u kontekstu nekih cjelina ovo izuma. Primjerice, moguće je da se koriste neki citokini kao modificirani ostaci u GDF-8 (vidi detaljnu diskusiju dolje) i u takvom slučaju pitanje stabilnosti može biti nevažno jer vezanje za GDF-8 dovodi do željene stabilnosti.
Termin "adjuvans" ima svoje uobičajeno značenje u tehnologiji vakcina, tj. tvar ili pripravak koji 1) za sebe nije u mogućnosti izazvati specifičan imuni odgovor vakcine, ali koji je 2) ipak u stanju povećati imuni odgovor na imunogen. Drugim riječima vakcinacija adjuvansom ne dovodi do imunog odgovora na imunogen, vakcinacija s imunogenom može ili ne mora povećavati imuni odgovor na imunogenu, ali kombinirana vakcinacija s imunogenom i adjuvansom izaziva imuni odgovor na imunogen koji je jači od onog induciraneg samim imunogenom.
"Usmjeravanje" molekule u kontekstu ovog izuma označuje situaciju u kojoj će nakon uvođenja molekule u životinju preferirati neko tkivo(a) ili će preferirano biti povezana s nekim tipom stanice ili stanicama. Efekt može biti dobiven na brojne načine, uključujući formulaciju molekule u pripravku koja olakšava usmjeravanje uvođenjem u molekulu skupina koje olakšavaju usmjeravanje. Ova tkiva će biti dolje detaljno diskutirana.
"Stimulacija imunog sustava" znači da tvar ili pripravak općenito pokazuje nespecifičan imunostimulirajući učinak. Brojni adjuvansi i oni za koje se pretpostavlja da su adjuvansi (kao neki citokini) dijele sposobnost stimulacije imunog sustava. Rezultat korištenja imunostimulacijskog sredstva je povećanje "pripravnosti" imunog sustava znači da istovremena ili kasnija imunizacija s imunogenom inducira značajno učinkovitiji imuni odgovor u usporedbi kad se koristi samo imunogen.
Preferirane cjeline
Preferirano je da je polipeptidni GDF-8 koji se koristi kao imunogen u metodi iz izuma modificirana molekula pri čemu postoji najmanje jedna promjena u aminokiselinskoj sekvenciji GDF-8, jer je vjerojatnost za dobivanje važne autotolerancije prema GDF-8 općenito olakšana na taj način. Valja naznačiti da to ne isključuje mogućnost upotrebe takvnog GDF-8 u formulacijama koje dalje olakšavaju razbijanje autotolerancije na GDF-8, npr. formulacije koje sadrže određeni adjuvans diskutiran detaljno dolje.
Pokazano je (u Dalum I et al., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804) da su potencijalni samoreaktivni B-limfociti koji prepoznaju vlastite proteine fiziološki prisutni u normalnim pojedincima. Međutim, da bi se ovi B-limfociti inducirali da stvarno proizvode antitijela reaktivna s važnim vlastitim proteinima, pomoć je potrebna od citokina koji produciraju T pomoćne limfocite (TH-stanice ili TH-limfociti). Ta pomoć normalno nije osigurana jer T limfociti općenito ne prepoznaju epitope za T-stanice izvedene iz vlastitih proteina, a kada su ispoljeni stanicama koje ispoljavaju antigene (APC). Međutim, dovođenjem elementa "strasnosti" u vlastiti protein (tj. uvođenjem imunološki značajne modifikacije), T-stanice koje prepoznaju strani element su aktivirane prepoznavanjem stranog epitopa za APC (kao što je, početno, mononuklerna stanica). Poliklonalni B limfociti (koji ispoljavaju epitope za T-stanice) mogu prepoznati vlastite epitope na modificiranim vlastitim proteinima također uvlače antigen i zatim ispoljavaju odgovarajući strani epitop(e) za T satnice, te aktiviraju T limfocite pa time omogućuju pomoć citokina tim samoreaktivnim poliklonalnim B-limfocitima. Kako su antitijela nastala tim poliklonalnim B-limfocitima reaktivna s različitim epitopima na modificiranom polipeptidu, uključujući one koji su također prisutni u prirodnom polipeptidu, međureaktivnost antitijela s nemodificiranim vlastitim proteinima je inducirana. U zaključku, T-limfociti mogu biti vođeni da djeluju kao da populacija poliklonalnih B-limfocita prepoznaje cijeli strani antigen, dok je u stvari samo insert-rani epitop(i) stran domaćinu. Na taj način, induciraju se antitijela sposobna međurakciji s nemodificiranim vlastitim antigenima.
U struci je poznato nekoliko načina modificiranja peptidnog vastitog antigena, a da se dobije razbijanje autotolerancije. Stoga, prema izumu, modifikacija može uključivati
- uvođenje barem jednnog epitopa za T-stanicu, i/ili
- uvođenje najmanje jednog prvog segmenta koji djeluje usmjeravanjem modificirane molekule na stanicu koja ispoljava antigen (APC), i/ili
- uvođenje barem jednog drugog segmenta koji stimulira imuni sustav, i/ili
- uvođenje barem jednog trećeg segmenta koji optimizira ispoljavanje modificiranog polipeptidnog GDF-8 na imuni sustav.
Međutim, sve ove modifikacije se trebaju izvesti dok se održava znatni dio originalnog epitopa za B-limfocit u GDF-8 jer prepoznavanje B-imfocita od prirodne molekule je time povećano.
U jednoj preferiranoj cjelini su bočne skupine (u obliku stranih epitopa za T-stanice ili gore spomenutog prvog, drugog i trećeg segmenta) kovalentno ili nekovalentno uvedene. Namjera je da ovo znači da su lanci aminokiselinskih ostataka izvedenih iz GDF-8 prevedeni u derivate bez mijenjanja primarne aminokiselinske sekvencije, ili barem bez uvođenja promjena u peptidne veze između pojedinih aminokiselina i lancu.
Alternativna i preferirana cjelina koristi aminokiselinsku supstituciju i/ili križanje i/ili umetanje i/ili adiciju (koja se može dobiti rekombinantno ili peptidnom sintezom; modifikacija koja obuhvaća dulje lance aminokiselina povećava vezivanje u polipeptide). Posebno preferirana verzija ove cjeline je tehnika opisana u WO 95/05849, koja prikazuje metodu smanjivanja aktivnosti vlastitih proteina imunizacijom s analozima vlastitih proteina u kojima je broj aminokiselinske sekvencije(a) supstituiran s odgovarajućom sekvencijom(ama) aminokiselina od kojih svaka sadrži početni imunodominantni epitop za T-stanice, dok je u isto vrijeme održavana cjelokupna tercijarna struktura vlastitog proteina u analogu. Za svrhe ovog izuma dozvoljeno je, međutim, da se modifikacijom (koja može biti insercijom, adicijom, delecijom ili supstitucijom) poveća strani epitop za T-stanice, a pri čemu se istovremeno zadržava najveći dio epitopa za B-stanice u GDF-8. Međutim, da bi se dobila maksimalna učinkovitost induciranog imunog odgovora, preferirano je da se ukupna tercijarna struktura GDF-8 održava u modificranoj molekuli.
Sljedeća formula opisuje građevne jedinice GDF-8 koji su općenito pokriveni izumom:
(MOD1)s1 (GDF-8e1)nl (MOD2)S2 (GDF-8e2n2.... (MODx)sx (GDF-8ex) (I)
- u kojoj GDF-8e1-GDF-8ex jesu epitopi x za B-stanice u kojima slijedi GDF-8 koji je neovisno identičan ili nije identičan i koji može sadržavati druge bočne skupine, x je cijeli broj ≥3, n1-nx jesu x cijeli brojevi ≥0 (najmanje jedna je ≥1), MOD1-MODx su x modifikacija uvedenih između sačuvanih epitopa za B-stanice, s1-sx jesu x cijeli brojevi ≥0 (najmanje jedna je ≥1 ako nije uvedena ni jedna bočna skupina u GDF-8e sekvencijama). Stoga prema općem funkcionalnom ograničenju na imunogenost građevnih dijelova, izum dozvoljava za sve vrste permutacija originalne GDF-8 sekvencije sve vrste modifikacija u njoj. Stoga, u izum su uključeni Modificirani GDF-8 dobiveni ispuštanjem dijelova sekvencije GDF-8 koja npr. pokazuje štetan učinak in vivo ili ispuštanjem dijelova koji su normalno unutar stanice i stoga povećavaju neželjene imunološke reakcije.
Održavanje velikog dijela epitopa za B-stanice, ili čak cijele tercijarne strukture proteina koji je podvrgnut modifikaciji kao što je opisano ovdje, može se postići na nekoliko načina. Jedan način je jednostavna priprava poliklonalnog antiseruma na GDF-8 (npr. antiserum pripravljen u zecu) i zatim korištenje tog antiseruma kao reagensa (npr. u kompetitivnom ELISA) na modificirane proteine koji se proizvode. Modificirane verzije (analozi) koji reagiraju do iste mjere s antiserumom kao doza GDF-8 mora se smatrati da ima istu ukupnu tercijarnu strukturi GDF-8 pri čemu analozi pokazuju ograničenu (ali još uvijek značajnu i specifičnu) reaktivnost s takvim antiserumom koji se smatra da ima održanu značajnu frakciju originalnih epitopa za B-stanice.
Alternativno se odabrana monoklonalna antitijela reaktivna s određenim epitopima na GDF-3 mogu pripraviti i koristiti kao testovi. Ovaj pristup ima prednost jer dozvoljava: 1) mapiranje epitopa za GDF-8 i 2) mapiranje epitopa koji su za održavanje u pripravljenim analozima.
Naravno, treći pristup bi bio riješiti trodimenzijska struktura GDF-8 ili biološki aktivnog fragmenta (vidi gore) i usporedba toga s riješenom trodimenzijskom strukturom pripravljenih analoga. Trodimenzijska struktura se može riješiti difrakcijom X-zraka i NMR spektroskopijonu Daljnje informacije koje se odnose na tercijarnu strukturu se do neke mjere mogu dobiti cirkularnim dikroizmom čija je prednost da samo zahtjeva polipeptid u čistom obliku (dok difrakcija X-zraka zahtjeva kristalizirani polipeptid a NMR zahtjeva izotopno obilježene polipeptide), za dobivanje korisne informacije o tercijarnoj strukturi molekule. Međutim, konačno su difrakcija X-zraka i/ili NMR neophodni da se dobiju konkluzivni podaci jer cirkularni dikroizam može dati samo indirektni dokaz o ispravnoj trodimenzijskoj strukturi, a informacijom o sekundarnoj strukturi elemenata.
Jedna preferirana cjelina izuma koristi višestruko ispoljavanje epitopa za B-limfocite GDF-8 (tj. formula I u kojoj je najmanje jedan epitop za B-stanicu prisutan u dva položaja). Taj efekt se može postići na različite načine, npr. pripravom fuzioniranih polipeptida koji sadrže strukturu (GDF-8)m, gdje m jeste cijeli broj ≥2, a zatim uvođenjem ovdje diskutirane modifikacije u najmanje jednu sekvenciju GDF-8, ili alternativno insertirnjem između najmanje dvaju aminokiselinskih sekvencija GDF-8. Preferirano je da uvedena modifikacija uključuje najmanje jednu duplikaciju epitopa B-imfocita i/ili uvođenje haptena.
Kako što je gore spomenuto, uvođenje stranog epitopa za T-stanicu se može izvesti insrecijom, delecijom ili supstitucijom najmanje jedne aminokiseline. Naravno, normalna situacija bi bila uvođenje više od jedne promjene u aminokiselinsku sekvenciju (npr. insercija ili supstitucija kompletnog epitopa za T-stanicu) ali je važno postići da se analogom GDF-8 pri procesiranju, koje ispoljavaju antigen u stanici (APC), poveća strani imunodominantni epitop za T-stanicu koji je prisutan u MCH klasi II molekule na površini APC. Zato, ako aminokiselinska sekvencija GDF-8 u odgovarajućem položaju sadrži broj aminokiselinskih ostataka koji se također mogu naći u stranim TH epitopima, tada se uvođenje stranog TH epitopa može završiti time da se ostale amino-kiseline insertiraju u strani epitop, adiraju, deletiraju ili supstituiraju. Drugim riječima, nije neophodno da se uvede kompletan TH epitop insercijom ili supstitucijom.
Preferirano je da je broj aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili adicija najmanje 2, kao što je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 25 insercija, adicija, supstitucija ili delecija. Nadalje je preferirano da je broj aminokiselinskih insercija, adicija, supstitucija ili delecija nije veći od 150, tako da je uglavnom 100, uglavnom 90, uglavnom 80 i uglavnom 70. Posebno je preferirano ako je broj aminokiselinskih insercija, adicija, supstitucija ili delecija ne prelazi 60, a određenije da ne prelazi 50 ili čak 40. Najpreferiraniji broj nije veći od 30. Što se tiče adicije aminokiselina valja napomenuti da je ona, a kada je nastala struktura u obliku fuzioniranog polipeptida, često znatno veća od 150.
Preferirane cjeline izuma uključuju modifikacije uvođenjem najmanje jednog stranog imunodominantog TH epitopa. Podrazmjevat će se da pitanje dominacije TH epitopa ovisi u vrsti životinje. Po tome kako se ovdje koristi, termin "imunodominacija" odnosi se na epitope koji u vakciniranom pojedincu/populaciji značajno povećavaju imuni odgovor, ali je dobro poznata činjenica da TH epitop koji je imunodominantan u pojedincu/populaciji nije sigurno dominantan u drugom pojedincu iste vrste, mada može biti sposoban vezati se na MHC-II molekule u potonjima.
Sljedeći važni aspekt je pitanje restrikcije MHCTH epitopa. Općenito prirodini TH epitopi su ograničeni na MHC, tj. neki peptidi koji sadrže TH epitop će se vezati učinkovito na podskupinu MHC klase II molekula. To s druge strane ima učinak da će upotreba jednog specifičnog TH epitopa u komponenti vakcine rezultirati time da je ona učinkovita samo u dijelu populacije, a ovisno o veličini tog udjela, može biti neophodno da se uključi višeTH epitopa u istu molekulu, ili da se alternativno pripravi višekomponentna vakcina u kojoj su komponente varijante GDF-8 koje se mogu razlikovati jedna od druge prirodi uvedenog TH epitopa.
Ako je MHC restrikcija korištenih T-stanica potpuno nepoznata (primjerice u situaciji u kojoj vakcinirana životinja ima slabo definirani sastav MHC), udio populacije koja je pokrivena specifičnim sastavom vakcine se može odrediti sljedećom formulom:
[image]
- u kojoj pi jeste frekvencija onih koji daju odgovor u populaciji na i epitopa za T-stanice prisutnih u pripravku vakcine, a n je ukupni broj stranih epitopa za T-stanice prisutnih u sastavu vakcine. Stoga, pripravak vakcine koji sadrži 3 strana epitopa za T-stanice i ima frekvenciju odgovora u populaciji od 0.8, 0.7 i 0.6, dat će
1 - 0.2 x 0.3 x 0.4 = 0.976
tj. 97.6 posto populacije će statistički povećavati odgovor na vakcinu posredovan MHC-II.
Gornja formula se ne odnosi na situaciju u kojoj je poznat više ili manje precizni restrikcijski MHC obrazac korištenih peptida. Ako se, primjerice, neki peptidi vežu samo na humane MHC-II molekule kodirane od HLA-DR aleli DRI, DR2, DR3, DR5 i DR7, tada je korištenje tih peptida skupa s drugim peptidom koji se veže na preostale MHC-II molekule kodirane s HLA-DR alelom će upotpuniti 100% pokrivenosti populacije koja je u pitanju. Slično, ako se drugi peptid
veže samo DR3 i DR5, dodatni peptid uopće neće povećati pokrivenost. Ako se račun zasniva na populacijskom odgovoru samo na MHC restrikciju epitopa za T-stanice u vakcini, udio pokrivene populacije specifičnim pripravkom vakcine se može odrediti pomoću sljedeće formule:
[image]
u kojoj Øj je suma frekvencija u populaciji aleičnog haplotipa koji kodiraju MHC molekule koje vežu bilo koji epitop zaT-stanicu u vakcini i koji pripadaju j-tom od 3 poznata mjesta HLA (DP, DR i DQ); u praksi je prvo određeno koje će MHC molekule prepoznavati svaki epitop za T-stanicu u vakcini koje su zatim navedene po tipu (DP, DR i DQ) - a zatim su pojedine frekvencije različitih navedenih aleičnih haplotipa zbrojene za svaki tip pri čemu su dobiveni Ø1, Ø2 i Ø3.
Može se desiti da vrijednost p± u formuli II prelazi odgovarajući teorijsku vrijednost πi:
[image]
- u kojoj je νj suma frekvencija u populaciji kojom alelični haplotip kodira MHC molekule koje se vežu na i-ti epitop za T-stanicu u vakcini i koja pripada j-tom od 3 poznata mjesta HLA (DP, DR i DQ). To znači da je1- πi -tom dijelu populacije frekvencija odgovora fostatak_i=(pi-- πi )/(1- πi) - Stoga se formula III može podesiti tako da se dobije formule V
[image]
- u kojoj termin 1-fostatak-i je određen kao 0 ako je negativan. Valja napomenuti da formula V zahtjeva da svi epitopi imaju haplotip mapiran na identičan set haplotipa.
Zato, kada se biraju epitopi za T-stanicu koji će se uvesti u analog GDF-8, važno je da se uključe sva znanja o epitopima koji su na raspolaganju: 1) frekvencija onih koji daju odgovor u populaciji na svaki epitop, 2) podaci o restrikciji MHC i 3) frekvencija relevantnih haplotipa u populaciji.
Postoje brojni prirodni epitopi za T-stanice "relaksirane specifičnosti" koji su aktivni u velikom udjelu pojedinaca životinjskih vrsta ili životinjske populacije i oni se preferirano uvode u vakcinu, što smanjuje potrebu za vrlo velikim brojem analoga GDF-8 u istoj vakcini.
Epitop relaksirane specifičnosti može prema ovom izumu biti prirodni etpitop za T-stanice kao što su epitopi iz toksoidnog tetanusa (npr. P2 i P30 epitopi), toksoid difterije, virus influencije hemagluttinin (HA), i antigen P. falciparun CS. Naravno, kad se vakciniraju druge životinje a ne ljudi, valja paziti da se koristi prirodni epitop za T-stanicu koji je relaksirane specifičnosti u životinji u kojoj se radi.
Tijekom godina su identificirani brojni epitopi za T-stanicu relaksirane specifičnosti. Posebno peptidi sposobni da se vežu za veliki dio HLA-DR molekula kodiranih od različitim HLA-DR alelima su identificirani i svi oni su potencijalni epitopi za T-stanicu koji se mogu uvesti u analoge GDF-8 koji će se koristiti u ovom izumu. Cf. također epitope diskutirane u sljedećim referencijama koji su svi ovdje ugrađeni citatom: WO 98/23635 (Frazer IH et al., University od Queensland); SouTHwood S et al. 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F et al. 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM et al. 1993, J. Exp. Med. 178: 27-47; Hammer J et al. 1993, Celi 74: 197-203; te Falk K et al. 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Zadnja referencija se također odnosi na HLA-DQ i -DP ligande. Svi prikazani epitopi u referenciji 5 su važni kandidati prirodnih epitoa za korištenje u ovom izumu, kao i epitopi koji dijele zajednički motiv s ovima.
Alternativno se epitop može biti sintetski epitop za T-stanicu koji se može vezati na veliki dio MHC klase II molekula. U tom kontekstu pan DR epitop peptida ("PARADE") opisan u WO 95/07707 i u odgovarajućem radu Alexander J et al. 1994, Innunity 1: 751-671 (oba ovdje ugrađena citatom) su prema ovom izumu iteresantni kandidati za korištenje kao epitopa. Valja napomenuti da najučinkovitiji PADRE peptidi opisani u ovim radovima nose D-aminokiseline na C- i N-terminalnom kraju, a da se poboljša stabilnost pri davanju. Međutim, ideja ovog izuma je prvenstveno u ugrađivanju važnih epitopa kao dijela modificiranog GDF-8 koji treba zatim biti enzimatski pocijepan unutar lizosomalnog dijela APC, a da se dozvoli ispoljavanje u sadržaju MHC-II molekule, pa stoga nije pogodno da se ugradi D-aminokiselina u epitope korištenih u ovom izumu.
Jedan posebno preferirani PADRE peptid ima aminokiselinsku sekvenciju AKFVAAWTLKAA (SEQ ID NO: 65) ili odgovarajuću imunološki učinkovitu subsekvenciju. Ti i ostali epitopi koji nemaju MHC restrikciju su preferirani epitopi za T-stanicu koje treba koristiti u analozima GDF-8 po ovoj metodi. Takvi epitopi vrlo relaksirane specifičnosti će činiti najjednostavniju cjelinu izuma u kojem je samo jedan modificirani GDF-8 prisutan u vakciniranom životinjskom imunom sustavu.
Kao što je gore spomenuto, modifikacija GDF-8 može također uključivati uvođenje prvog segmenta koji usmjeravaju modificirani GDF-8 u APC ili B-limfocit. Primjerice, prvi segment može biti specifično vezujući partner za specifični površinski antigen B-limfocita ili specifični površinski antigen APC. Poznati su mnogi takvi specifični površinki antigeni. Primjerice, segment može biti ugljikohidrat za koji postoji receptor na B-limfocitu ili APC (npr. manan ili manoza). Alternativno, drugi segment može biti hapten. Također kao fragment antitijela koji specifično prepoznaju površinu molekule APC ili limfocitima se mogu koristiti kao prvi segment (površinska molekule može npr. biti FCγ receptor makrofaga ili monocita, kao što je FCγRI ili alternativno bilo koji druga specifična oznaka površine kao što je CD40 ili CTLA-4). Valja napomenuti da se svi ti primjeri usmjeravanja molekule mogu koristiti kao dio adjuvansa, cf. dolje.
Kao alternativa ili suplement usmjeravanju modificiranog polipeptidnog GDF-8 u neke tipove stanica da bi se postigao povećani imuni odgovor, je moguće povećanje razine odgovora imunog sustava uključivanjem gore spomenutog segmenta koji stimulira imuni sustav. Tipični primjeri takvih drugih segmenata su citokini i proteini podvrgnuti toplinskom šoku ili molekulski šaperoni kao i njihovi učinkoviti dijelovi.
Pogodni citokini koji se mogu koristiti u ovom izumu su oni koji će normalno djelovati kao adjuvansi u pripravku vakcine tj. primjerice interferon γ (IFN-γ), Flt3L, interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15), te stimulirajući faktor kolonije granulacitnog makrofaga (GM-CSF); alternativno funkcionalni dio molekule citokinona može biti pogodan kao drugi segment. Sto se tiče upotrebe citokina kao što su citokini kao adjuvansi, vidi diskusiju dolje.
Prema izumu, pogodni proteini podvrgnuti topinskom šoku ili molekulski šaperoni koji se koriste za drugi segment mogu biti HSP70, HSP90, HSC70, GPR94 (također poznat kao gp96,vidi Wearsch PA et al. 1998, Biochemistry 37: 5709-19) i CRT (kalretikulin).
Alternativno drugi segment može biti toksin kao što je listeiolicin (LLO), lipid A i termolabilan enterotoksin. Također su interesantne mogućnosti brojni mikrobakterijski derivati kao što je MDP (muramil dipeptid) i diesteri tetraloze TDM i TDE.
Također je mogućnost uvođenja cjelina uvođenje trećeg segmenta koji ubrzava ispoljavanje modificiranog GDF-8 na imuni sustav. U struci je poznato nekoliko primjera tog principa. Primjerice, poznato je da se sidrenje lipidacije pamitoila u Borrelia burgdorferi proteinu OspA može koristiti tako da se dobije polipeptidi koji je autoadjuvans (cf. npr. W0 96/40718). Izgleda da lipidirani proteini tvore strukture poput micela čija srž sadrži dijelove za sidrenje lipidacije polipeptida i ostali dijelovi molekule koje se pružaju od njih, rezultirajući višestrukom prezentacijom antigenske determinante. Zato, korištenje ovog i sličnih pristupa koristeći različita sidrišta lipidacije (npr. miristilna skupina, farnezilna skupina geranil-geranilna skupina, GPI sidro i N-acil-digliceridna skupina) su preferirane cjeline izuma, posebice jer je ogrančenje takve lipidacije u rekombinatno nastalom proteinu jednostavno i samo zahtjeva korištenje npr. prirodnih signalnih sekvencija kao partenre za modificirane polipeptidine GDF-8. Daljnja mogućnost je korištenje C3d fragmenta komplementarnog faktroa C3 ili samo C3 (vidi Dempsey et al. 1996, Science 271, 348-350 i Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).
Alternativna cjelina izuma koja također rezultira preferiranim ispoljavanjem višestrukih (npr. barem 2) kopija važnih epitopalnih regija GDF-8 u imunom sustavu je kovalentno vezivanje GDF-8, podsekvenciji ili njegovim varijantama s određenim molekulama. Primjerice, mogu se koristiti polimeri npr. ugljikohidrati kao što je dektran, vidi Lees A et al. 1995, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al. 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, ali također manoza i mana su korisne alternative. Integralni membranski proteini iz nor, e. col i i ostalih bakterija su također korisni konjigacijski partneri. Tradicionalni nosač molekula kao što je hemocianin (KLH), toksoidtetanusa, toksoid difeteria i goveđi serum albumin (BSA) su također preferirani i korisni partneri za konjugaciju.
Vjeruje se da su neki dijelovi prirodnog GDF-8 izvrsno smješteni za izvođenje modifikacija. Predviđeno je da će modifikacije najmanjem jedne od sljedećih podsekvencija C-terminalne GDF-8 nastati pogodne imunogene molekule: ostaci 18-41, 49-69 ili 79-104 i SEQ ID NO: 11 ili 12, ili odgovarajuće podsekvencije od polipeptidnog GDF-8 koji nisu humani, goveđi, svinjski, pileći ili pureći. Razlozi za odabir tih dijelova su a) sačuvanje poznatih i predviđenih epitopa za T-stanicu, b) sačuvanje tercijarnih i kvaternih struktura itd., cf. također diskusiju u uvod u primjere. Pri bilo kojem stupnju, kao što je gore diskutirano, vrlo je lako probrati skupinu modificiranih molekula GDF-8 (koji su podvrgnuti uvođenju epitopa ta T-stanicu na različitim mjestima) za imunu reaktivnost antitijela nastalih na prirodne GFF-8. Posebne je preferirano da je modifikacija izvedena supstitucijom aminokiselinske sekvencije s najmanje jednom aminokiselinskom sekvencijom jednakom ili različitom čija je duljina jednaka ili različita i sadrži strani THepitop. Razlozi za ovakve konstrukte su detaljno diskutirani u primjerima. Također je preferirana insercija (ili supstitucija) u bio koji dio petje ili u fleksibilni terminalni fragment (ostaci 1-12, 18-30, 42-51, 82-86. te 105-109) ili C-terminanog kraja GDF-8 fragmenta.
Formulacije GDF-8 i modificiranog polipeptdinog GDF-8
Utjecanje na ispoljavanje polipeptidnog GDF-8 ili modificiranog polipeptidnog GDF-8 na životinjski imuni sustav davanjem životinjama formulaciju polipeptida je u skladu s općim znanjem struke.
Priprava vakcina koje sadrže peptidne sekvencije kao aktivne komponente je općenito dobro poznata, kao što je prikazano u U. S. Patentima 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; te 4,578,770, svi ovdje ugrađeni citatom. Tipično se takve vakcine pripravljaju kao tekuće otopine ili suspenzije koje se mogu injektirati; kruti oblici pogodni za otopine ili suspenzije, te tekućina koja se također može pripraviti prije injektiranja. Pripravak također može biti emulgiran. Aktivni imunogeni sastojak se često miješa s ekcipijentom koji je farmaceutski prihvatljiv i kompatibilan s aktivnim sastojkom. Pogodni ekscipijensi su primjerice voda, fiziološka otopina, dektroza, glicerol, etanol ili slično te njihova kombinacija. Nadalje, po želji vakcina može sadržavati malu količinu dodatnih tvari kao što su klizna sredstva ili emugatori, sredstva za puferiranje pH, adjuvansi koji povećavaju učinkovitost vakcine; niže vidi detaljnu diskusiju o adjuvansima.
Vakcine se uobičajeno daju parenteralnom injekcijom, primjerice subkutalno, intrakutalno, intradermalno, subder-malno ili intramuskularno. Nadalje, formulacije koje su pogodne za ostale načine davanja uključuju supozitorije, te u nekim slučajevima oralne, bukalne, sublingvalne, intraperitonalne, intravaginalne, analne, epiduralne, spinalne i intrakrainalne formulacije. Za supozitorije tradicionalna veziva i nosači mogu uključivati primjerice polialkalen, glikole ili trigliceride; takvi supozitoriji mogu se tvoriti od smjese koja sadrži aktivni sastojak u rasponu od 0.5% do 10%, preferirano 1-2%. Oralne formulacije uključuju normalno korištene ekcipijente kao što je primjerice manitol farmaceutskog stupnja čistoće, laktoza, škrob, magnezijev strearat, natrijev saharin, ceuloza, magnezijev karbonat i slično. Ti pripravci mogu tvoriti otopine, suspenzije, tablete, pilule, kapsule, formulacije s odgođenim djelovanjem ili praške koji sadrže 10-95% aktivnog sastojka, preferira-no 25-70%. Za oralne formulacije je toksin kolere interesantni formulacijski partner (a također i konjugacijski partner).
Polipeptidi se mogu formulirati u vakcine u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli nastale adicijom (nastale sa slobodnom aminoskupinom peptida) anorganskih kiselina kao što je primjerice klorovodična kiselina ili fosforna kiselina, ili s takvih organskih kiselina kao što je octena, oksalna, vinska, bademova i slične. Soli nastale sa slobodnim karboksilnoim skupinama mogu također biti izvedene iz anorganskih baza kao što je primjerice natrijev, kalijev, amonijev, kalcijev ili željezni(III) hidroksid, te iz takvih organskih baza kao što je izopropilamin, trimetilamin, 2-etilaminoetanol, histidin, prokain i slično.
Vakcine se daju na način koji je kompatibilan s formulacijom doze, i u takvoj količini koja će biti terapijski učinkovita i imunogena. Količina za davanje ovisi o osobi koja je pod tretmanom, uključujući npr. kapacitet imunog sustava pojedinca da podigne imuni odgovor i željenog stupnja zaštite. Pogodni rasponi doze kreću se do razlike nekoliko stotina mikrorama aktivnog sastojka po vakcini s preferiranim rasponom od oko 0.1 μg do 2000 μg (čak su razmatrane i veće količine u rasponu od 1-10 mg) kao što je raspon od oko 0.5 μg do 1000 μg, preferirano u rasponu od 1 μg do 500 μg, a posebno preferirano u rasponu od oko 10 μg do 100 μg. Pogodni režim za početak davanja i ponovljena imunizacija su također primjenjivi ali su tipizirani početnim davanjem koje slijedi inokulaciju ili druga davanja.
Način primjene može široko varirati. Može se primijeniti bilo koja konvencionalna metoda davanja vakcine. To uključuje oralnu primjenu na krutoj fiziološki prihvatljivoj osnovi ili fiziološki prihvatljivu disperziju, parenteralno davanje injekcijom ili slično. Doza vakcine će ovisiti o načinu davanja i prilagoditi će se starosti osobe koja će biti vakciniranai i vrsti formulacije antigena.
Neki polipeptidi vakcine su dovoljno imunogeni u vakcini, ali će za neke druge imune odgovore biti bolje ako vakcina daljnje sadrži adjuvanse.
Poznate su različite metode postizanja učinka adjuvansa za vakcine. Opći principi i metode su opisane detaljno u "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (izd.), John Wiley & Sins Ltd, ISBN 0-471-95170-6, i također u "Vaccines: New Generation Immunologica Adjuvants", 1995, reoriadis . et al. (izd.) Plenum Press, New York, ISBN 0-306-4583-9, a oba su ovdje ugrađeni citatom.
Posebno je preferirano korištenje adjuvansa koji mogu olakšavati uništavanje autotolerancije na autoantigene, a to je suštinski važno u slučaju kad se koristi nemodificiran GDF-8 kao aktivni sastojak u autovakcini. Neograničavajući primjeri pogodnih adjuvansa su odabrani iz skupine koja se sastoji od imunousmjeravajućih adjuvansa, imunomoduirajućih adjuvansa kao što je toksin, citokin i mikobakterijski derivati, formulacije ulja, polimera, adjuvansa koji tvore micele, saponina, matricu imunostimulirajućeg kompleksa (ISCOM matrica) čestica, DDA, aluminijskog adjuvansa, DNA adjuvansa, γ-inulina i adjuvansa koji se može kapsulirati. Općenito, bit će naznačeno da se gornji prikaz odnosi na sredstva korisna kao prvi, drugi i treći segment u analozima se također odnose mutatis mutandis na njihovo korištenje kao adjuvansa vakcine iz izuma.
Primjena adjuvansa uključuje upotrebu sredstva kao što je aluminijev hidroksid ili fosfat (alum), koji se obično koristi kao 0.05 do 01 postotna otopina u puferiranoj fiziološkoj otopini u smjesi sa sintetskim šećernim polimerima (npr. Carbopol????) korišten kao 0.25 postotna otopina, agregacija proteina u vakcini djelovanjem toplinom u rasponu temperature između 70 °C do 101 °C u periodu od 30 sekundi do 2 minute, a također je moguće postići agregaciju pomoću sredstva za umrežavanje. Mogu se također koristiti agregacija reaktiviranjem s antitijelima koji su tretirani pepsinom (Fab fragmenti) u albumin, smjesa bakterijskih stanica kao što je C. pravum ili endotoksini ili lipopoli-saharidne komponente ili gram-negativnih bakterija, emulzija u fiziološki prihvatljivom uljnom vehikulu kao što je manidni monololeat (Aracel A) ili emulzija s 20 postotnom otopinom perfluorugljika (Fluosol-DA) korištena kao blok supstitut. Također je preferirano je miješanje s uljem kao što je skvalen i IFA.
Prema izumu DDA (dimetildioktadecilamonijev bromid) je interesantan kandidat da adjuvans kao i DNA i γ-inulin, ali također su Freudov kompletan i nekompletan adjuvans kao i gulila ja saponons kao što su i Qui1A i QS21 interesantni kao RIBI. daljnje mogućnosti su monofosforil-lipidi a (MPL), gore spomenuti C3, C3d i muramil dipeptidi (MDP).
Formulacije liposoma također prenose učinak adjuvansa, pa su stoga liposomski adjuvansi preferirani u ovom izumu.
Također je adjuvans tipa imunostimulirajuće matrice (ISCOM???? matrica) preferiran izbor prema izumu, posebice jer je pokazano da takav tip adjuvansa može povećati ekspresiju MHC klase II pomoću APC. ISCOM???? matrica se sastoji od (može biti frakcionirana) saponina (tritepenoidi) iz Quillaja saponaria, kolesterola i fosfolipida. Kada se miješa s imunogenim proteinom, nastale formulacija je ono što je poznato kao ISKOM šestica u kojoj saponin čini 60-70% w/w, kolesterol i fosfolipid 10-15% w/w, a protein 1-15% w/w. Detalji koji se odnose na sastav i korištenje imunostimulirajućih kompleksa mogu npr. biti nađeni u gore spomenutim udžbenicima koji prikazuju adjuvanse, ali također u i Morein B et al. 1995 Clin, Immunother. 3: 461-475 kao i Barr IG i Mitchell GF, 1996f Immunol. and Celi Biol. 74: 8-25 (oba ovdje ugrađena citatom) prikazuju korisne upute za pripravu kompletnih imunostimulrajućih kompleksa.
Još jedna vrlo interesantna (pa stoga preferirana) mogućnost postizanja učinka adjuvansa je uporaba tehnike opisane od Gosselin et al. , 1992 (koji je ovdje ugrađen citatom). Ukratko, ispoljavanje relevantnih antigena kao što je antigen u ovom izumu se može povećati konjugiranjem antigena s antitijelima (ili fragmentima antitijela koja vežu antigen) na Fcγ receptore na monocitima/makro-fagima. Posebno su konjugati između antigena i anti-FcγRI pokazali da povećavaju imunogeničnost za svrhe vakciniranja.
Ostale mogućnosti korištenja su gore spomenutih usmjeravajućih i imunomodulirajućih tvari (i.a. citokini) kao kandidata za prvi i drugi segment u modificiranoj verziji GDF-8. S tim u vezi mogući su i citokini koji sintetski induciraju citokine kao što je poli I:C.
Pogodni bakterijski derivati su odabrani od skupine koja se sastoji od muramilnog dipeptida, kompleta Freudovog adjuvansa, RIBI i diestera trehaloze kao što je TDM i TDE.
Pogodni imunousmjeravajući adjuvansi su odabrani od skupine koja se sastoji od CD40 liganda i CD40 antitijela ili njihovih specifično vezanih fragmenata (vidi gornju diskusiju), manoze, Fab fragmenta i CTLA-4.
Pogodni polimerni adjuvansi su odabrani od skupine koja se sastoji od ugljikohidrata kao što je dekstran, PEG, škrob, manan i manoza; plastičnih polimera kao što je lateks u obliku lateksnih zrna.
Sljedeći interesantan način moduliranja imunog odgovora je uključivanje imunogena GDF-8 (može zajedno s adjuvoansom i farmaceutski prihvatljivim nosačima i vehikulima) u "virtualni limfni čvor" (VLN) (odgovarajuća medicinska naprava razvijena je od Immunotherapy, Inc. 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tanka tubularna naprava) imitira strukturu i funkciju limfnog čvora. Umetanje VLN ispod kože stvara mjesto sterilne upale s porastom citokina i kemokina. T- i B-stanice kao i APC brzo odgovaraju na signal opasnosti koji je na mjestu upale i akumuliraju se unutar porozne matrice VLN. Pokazano je da je neophodna doza antigena potrebna za postizanje imunog odgovora na antigen smanjena kada se koristi VLN i da imuna zaštita pri vakcinaciji koja koristi VLN prelazi konvencionalnu imunizaciju koristeći Ribi kao adjuvans. Tehnologija je i.a. opisana ukratko u Gelber C et al. 1998 "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts od Inmmunegens Using a Novel Medical Device Designated THe Virtual Lymph Node" u "From THe Laboratory to THe Clinicf Book od Abstracts, October 12TH - 15TH 1998, Seascape Resort, Aptos, California".
Očekuje se da bi vakcina dana barem jedanput godišnje, kao što je najmanje 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 puta godišnje osobi koja za tim ima potrebu. Specifičnije, očekuje se 1-12 puta godišnje, kao što je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, i 12 puta godišnje osobi koja za tim ima potrebu. PreTHodno je pokazano da pamćenje inducirane imunosti korištenjem preferiranih autovakcina prema izumu nije stalno, pa zato imuni sustav ima potrebu za periodičnim izazovom s analozima.
Zbog genetskih varijacija, različiti pojedinci mogu reagirati na isti polipeptid s imunim odgovorom različite jakosti. Zato vakcina prema ovom izumu može sadržavati nekoliko različitih polipeptida da bi se povećao imuni odgovor, cf. također gornju diskusiju koja se tiče izbora uvođenja stranog epitopa za T-stanicu. Vakcine mogu sadržavati dva ili više polipeptida, pri čemu su svi polipeptidi kao što su gore definirani.
Vakcine mogu sadržavati 3-20 različitih modificiranih ili nemodificiranih polipeptida, kao što je 3-10 različitih polipeptida. Međutim, normalno če broj polipeptida biti držan na minimumu kao što je l ili 2 polipeptida.
Vakcinacija nukleinskom kiselinom
Kao alternativa klasičnom davanju vakcine zasnovane na peptidu, tehnologija vakcinacije nukleinskom kiselinom (također poznata kao "imunizacija nukleinskom kiselinom", "genetska imunizacija" i "imunizacija genom") nudi brojne atraktivne karakteristike.
Prvo, nasuprot tradicionalnom pristupu vakcini, vakcinacija nukleinskom kiselinom ne zahtjeva produkciju konzumiranog resursa u velikim količinama imunogeničnog sredstva (npr. fermentacije mikroorganizama koji produciraju modificirani GDF-8 na industrijskoj skali). Nadalje, nema potrebe za napravom za pročišćavanje i restruktuiranje shema imunogena. Konačno, kako se vakcinacija nukleinske kiseline oslanja na biokemiju vakciniranog pojedinca, a da se producira produkt ekspresije uvedene nukleinske kiseline, očekuje se da dođe do optimuma post-translacijskog procesiranja produkta ekspresije; to je posebice važno u slučaju autovakcinacije jer, kao što je gore spomenuto, značajni dio originalnih GDF-8 epitopa za B-stanicu se može sačuvati u modificiranoj molekuli i kako se epitopi za B-stanicu u načelu mogu sastojati od dijelova bilo koje (bio)molekule (npr. ugljikohidrat, lipid, protein itd.). Zato prirodni način glikozilacije i lipidacije imunogena može biti vrlo značajan dio ukupne imunogenosti, a što se najbolje osigurava domaćinom koji propizvodi imunogen.
Stoga preferirana cjelina sadrži učinkovito ispoljavanje modificiranog GDF-8 u imunom sustavu uvođenjem nukleinske kiselina (kiselina) koja kodira modificirani GDF-8 u životinjskim stanicama i iz toga se dobiva in vivo ekspresija u stanicama u koje je uvedena nukleinska kiselina (kiseline).
O ovoj cjelini, uvedena nukleinska kiselina je preferirano DNA koja može biti u obliku same DNA, DNA formulirane s nabijenim ili nenabijenim lipidima, DNA formulirane u liposomima, DNA uključene u virusni vektor, DNA formulirane s proteinom ili polipeptidom koji olakšava transfekciju, DNA vezane na inertnu molekulu koja je nosač, DNA kapsulirane u hitin ili hitosan, te DNA formulirane s adjuvansom. U ovom kontekstu primijećeno je da su gotovo sve tradicionalne formulacije vakcine koriste za formulaciju DNA vakcine. Zato sve prikazano ovdje koje se odnosi na korištenje adjuvansa u kontekstu vakcina baziranih na polipeptidima se primjenjuju mutatis mutandis na njihovu upotrerbu u tehnologiji vakcijancije nukleinskom kiselinom.
Načini davanja i sheme davanja vakcina baziranih na polipeptidima koji su gore detaljno prikazani, mogu se primijeniti za vakcine nukleinske kiseline iz izuma i sve gornje diskusije koje se odnose na načine davanja i sheme davanja polipeptida primjenjuju se mutatis mutandis na nukleinske kiseline. Tome treba dodati da vakcine nukleinske kiseline mogu biti pogodne za intravenozno davanje. Nadalje, dobro je poznato u struci da se vakcine nukleinske kiseline mogu davati korištenje tzv. genskog pištolja, te zato taj i ekvivalentan način davanja je dio ovog izuma. Konačno, također je prikazano da upotreba VLN pri davanju nukleinskih kiselina daje dobre rezultate i stoga je taj određeni način davanja posebno preferiran.
Nadalje, nukleinska kiselina (kiseline) korištena kao sredstvo za imunizaciju može sadržavati regije koje kodiraju prvi, drugi i/ili treći segment, npr. u obliku imunomodulirajućih tvari koje su opisane gore, kao što je citokin koji je diskutiran kao adjuvans. Preferirana verzija ove cjeline obuhvaća postojanje regije kodiranja za analog i regije kodiranja za imunomodulator u različitim čitajućim okvirima ili su barem kontrolirani različitim promotorima. Tako je izbjegnuto da se analog epitopa stvara kao partner za fuziju imunomodulatora. Alternativno se mogu koristiti dva različita nukleotidna fragmenta, ali je to manje preferirano jer je prednost osiguravanja koekspresije kada su uključene obje regije kodiranja u istu molekulu.
Prema tome, izum se također odnosi na pripravke za izazivanje produkcije antitijela na GDF-8, a pripravak sadrži
- fragment nukleinske kiseline ili vektor iz izuma (cf. donju diskusiju o vektorima), te
- farmaceutski i imunološki prihvatljiv vehikul i/ili nosač i/ili adjuvans, kao što je gore diskutirano.
Pod normalnim uvjetima, GDF-8 varijanta koja kodira nukleinsku kiselinu je uvedena u obliku vektora pri čemu je ekspresija pod kontrolom virusnog promotora. Za detaljniju diskusiju vektora prema ovom izumu, vidi donju diskusiju. Također postoji detaljni prikaz koji se odnosi na formulacije i korištenje nukleinske kiseline za vakcine, vidi Donnelly JJ et al. 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 i Donnelly JJ et al. 1997, Life Sciences 60: 163-172. Oba su ovdje ugrađena citatom.
Žive vakcine
Treća alternativa za učinkovito ispoljavanje modificiranog GDF-8 na imuni sustav je korištenje tehnologije žive vakcine. Živom vakcinacijom je djelovano na imuni sustav davanjem životinji nepatogenih mikroorganizama koji su transformirani fragmentom nukleinske kiseline koja kodira modificirani GDF-8 ili s vektora koji sadrži takav fragment nukeinske kiseline. Pogodan nepatogeni mikroorganizam može biti bilo koja pogodna oslabljena bakterijska vrsta (oslabljena pasažom ili uklanjanjem patogenog produkta ekspresije tehnologijom rekombinantne DNA) npr. Mycobacterium bovls BCG., nepatogen Streptococcus spp., E. coli, Samonella spp., Vibrio Cholerae, Shigea itd. Pregledni radovi koji obrađuju pripravu živih vakcina prema dosadašnjim spoznajama mogu biti nađeni u Saliou P, 11995 Rev. Prat. 45: 1492-1496 i Waker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990, ova ovdje ugrađena citatom. Za detalje o fragmentima nukleinskih kiselina i ovdje korištenih vektora u takvim živim vakcinama vidi donju diskusiju.
Kako alternativa živim bakterijskim vakcinama, fragmenti nukleinske kiseline mogu biti ugrađeni u neživu vakcinu s virusnim vektorom kao što je vrsta vakcine od bilo kojeg pogodnog pox virusa.
Normalno se nepatogeni mikroorganizam ili virus daje samo jedanput životinji, ali u nekim slučajevima može biti neophodno da se miokroorganizam da više od jedanput u životu, a da se održi zaštitna imunost. Čak je razmatrano da će imunizacijske sheme koje su detaljno prikazane gore za vakcinaciju polipeptidom biti korisne kad se koristi živa ili virusna vakcina.
Alternativno je živa ili virusna vakcinacija kombinirana s prethodnom ili sljedećom vakcinacijom polipeptidom i/ili nukleinskom kiselinom. Primjerice, moguće je da se izazove primarna imunizacija sa živom ili virusnom vakcinom koju slijedi ponovljena imunizacija korištenjem polipeptida ili nukleinske kiseline.
Mikroorganizam ili virus se može transformirati nukleinskom kiselinom (kiselinama) koja sadrži regiju koja kodira prvi, drugi i/ili treći segment, npr. u obliku imunomodulirajućih tvari koje su opisane gore, kao što je citokin koji je diskutiran kao koristan adjuvans. Preferirana verziji ove cjeline obuhvaća postojanje regije kodiranja za nalog i regiju kodiranja za imunomodulator u različitim otvorenim ćitajućim okvirima ili barem da su kontrolirani različitim promotorima. Tako je izbjegnuto da se analog epitopa stvara kao partner za fuziju imunomodulatora. Alternativno se mogu koristiti dva različita nukleotidna fragmenta kao sredstva za transformiranja. Naravno, postojanje drugog i/ili trećeg segmenta u istim čitajućim okvirima može omogućiti ekspresiju produkta, analoga iz izuma i takva cjelina je posebno preferirana prema ovom izumu.
Upotreba metode iz izuma u proizvodnji mesa i tretmanu bolesti
Bit će jasno iz gornje diskusije da predstavljena metode iz izuma za smanjivanje aktivnosti GDF-8 omogućuje stimulaciju rasta mase skeletnih mišića kod životinja. Stoga, važna cjelina metode iz izuma za smanjivanje aktivnosti GDF-8 sadrži povećanje rasta mase skeletnih mišića kod životinja, a metoda sadrži smanjivanje aktivnosti GDF-8 prema metodi iz izuma do te mjere da je masa mišića statistički značajno povećana (razina pouzdanosti 95%), a najmanje 5% kad se usporedi s kontrolnim životinjama koje imaju normalnu aktivnost GDF-8.
Povećanje mišićne mase može preferiranije biti više, kao što je najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili čak 45%, cf. povećanje mišićne mase je opaženo u transgeničnim miševima i životinjama prirodno deficijentnim s GDF-8.
Mišićna masa se može odrediti bilo kojom konvencionalnom metodom poznatom u struci za određivanja ukupne i/ili relativne mase mišića.
Anti-GDF-8 vakcina bi mogla također biti korisna za tretman nekih humanih bolesti kao što je karcinom kalcija, gdje je muskularna atropija naglašeni fenomen, i tako je primjenljivo za tretman/poboljšanje ostalih atropičnih mišićnih bolesti. Nedavni prikazi također upućuju da bi smanjivanje GDF-8 bilo povoljno za pacijente koji pate od akutnog ili kroničnog zatajenja srca.
Peptidi, polipeptidi i pripravci od njih u ovom izumu
Bit će očito iz gore izloženog da je ovaj izum zasnovan na konceptu imunizacije pojedinaca antigenom za GDF-8 da bi se indirektno dobila smanjena aktivnost broja eozinofilnih stanica. Preferirani način dobivanja takve imunizacije je korištenje modificiranih verzija GDF-8, dakle molekula koje nisu bile prethodno poznate.
Vjeruje se da su modificirane molekule GDF-8 ovdje diskutirana nove sama po sebi, pa je stoga važan dio izuma koji se tiče analoga GDF-8 koji je izveden iz životinjskog GDF-8 u koji je uvedena modifikacija koja ima rezultat imunizacije životinje s analogom koji izaziva stvaranje antitijela koji specifično reagiraju s nemodificiranim polipeptidnim GDF-8. Preferirano, priroda gore opisanih modifikacija odgovara tipu modifikacija opisanih gore kad su diskutirane razne cjeline metode iz izuma, a kada se koristi modificirani GDF-8. Stoga je ovdje uključen bilo koji prikaz koji se tiče analoga GDF-8 iz izuma i bilo koji prikaz koji se odnosi na mutatis mutandis opis tih analoga.
Valja napomenuti da preferirane modificirane molekule GDF-8 sadrže modifikacije koje kao rezultat imaju polipeptdid koji ima identičnost sekvencije od najmanje 70% s GDF-8 ili s njegovom podsekvencijom najmanju duljinu od 10 aminokiselina. Preferirane su veće identičnosti sekvencija, npr. najmanje 75% ili najmanje 80 ili 85%. Identičnost sekvencija proteina i nukleinskih kiselina se može računati kao (Nref-Nraz) • 100 Nref, pri čemu je Nraz ukupni broj neidentičnih ostataka u dvjema uspoređenim sekvencijama, a Nref je broj aminokiselinskih ostataka u jednoj od sekvencija. Tako će DNA sekvencija AGTCAGTC imati identičnost od 75% sekvenciji AATCAATC (Nraz=2 i Nref=8).
Izum se također tiče pripravaka korisnih u primjeni metode iz izuma. Zato se izum također odnosi na imunogeni pripravak koji sadrži imunogeno učinkovitu količinu polipeptidnog GDF-8 koji je vlastiti protein u životinji, a rečeni polipeptidni GDF-8 je formuliran skupa s imunološki prihvatljivim adjuvansom, tako da se razbije autotolerancija životinje prema polipeptidnom GDF-8, a pripravak nadalje sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljivi razrjeđivač i/ili vehikul i/ili nosač i/ili ekcipijent. Drugim riječima, ovaj dio izuma odnosi se na formulacije prirodnih polipeptidnih GDF-8 koji su opisani u vezi s cjelinom koja je metoda po izumu.
Izum se također odnosi na imunogeni pripravak koji sadrži imunogeno učinkovitu količinu gore definiranog analoga GDF-8, a rečeni pripravak nadalje sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljivi razrjeđivač i/ili vehikul i/ili nosač i/ili ekscipijent i/ili adjuvans. Drugim riječima, ovaj dio izuma tiče se formulacija s modificiranim GDF-8, u suštini kao što je ovdje opisano. Izbor adjuvansa, nosača i vehikula je prema ovom na liniji koja je gore diskutirana kada se pozivalo na formulaciju modificiranog i nemodifi-ciranog GDF-8 za upotrebu u metodi izuma za smanjivanje aktivnosti GDF-8.
Polipeptidi se pripravljaju prema metodama koje su dobro poznate u struci. Dulji polipeptidi se normalno pripravljaju tehnologijom rekombinanacije gena uključujući uvođenje sekvencije nukleinske kiseline koja kodira analog GDF-8 u pogodnom vektoru, transformacijom pogodne stanice domaćina s vektorom, ekspresijom sekvnecije nukleinske kiseline, izolacijom produkta ekspresije iz stanice domaćina ili iz supernatanta njene kulture, te potom čišćenjem i mogućom daljnjom modifikacijom, npr. restruktuiranjem ili prevođenjem u derivate.
Kraći peptidi se preferirano pripravljaju prema dobro poznatim tehnikama sinteze peptida na krutoj ili tekućoj fazi. Međutim, nedavni napredak u toj tehnologiji vraća mogućnost priprave polipeptida pune duljine i proteina tim načinom, pa je stoga također unutar obujma ovog izuma u pripravi dugih građevnih jedinica sintetskom metodom.
Fragmenti nukleinske kiseline i vektori iz izuma
Bit će razumljivo iz gornjeg prikaza da se modificirani polipeptidni GDF-8 mogu prirpaviti tehnologijom rekombinantnog gena, ali također i kemijskom sintezom ili semisintezom; zadnje dvije mogućnosti su posebno važne kada se modifikacija sastoji od vezivanja na protein nosača (kao što je KHL, toksoid difterije, toksoid tetanusa i BSA) i neproteinske molekule kao što su polimeri ugljikovodika i naravno također kada modifikacija sadrži adiciju bočnog lanca ili bočne skupine na iz polipeptida derivirani peptidni lanac GDF-8.
Za svrhe tehnologije rekombinantnog gena, i naravno također za svrhe imunizacije nukleinskom kiselinom, fragmenti nukleinske kiseline koji kodiraju modificirani GDF-8 su važni kemijski produkti. Zato se važan dio izuma odnosi na fragment nukleinske kiseline koja kodira analog GDF-8, tj. polipeptid izveden od GDF-8 koji sadrži neutralnu sekvenciju GDF-8 kojoj je dodan i insertiran partner za fuziju, ili preferirano sadrži polipeptid izveden od GDF-8 u koji je uveden strani epitop za T-stanicu načinom insercije i/ili adicije, preferirano metodom supstitucije i/ili delecije. Fragmenti nukleinske ksieline iz izuma su DNA ili RNA fragmenti.
Fragmenti nukleinskih kiselina iz izuma će normalno biti insertirani u pogodne vektore za tvorbu vektora za kloniranje ili ekspresiju koji nose fragmente nukleinske kiseline iz izuma; takvi novi vektori su također dio izuma. Detalji koji se tiču konstrukcije tih vektora iz izuma će biti diskutirani dolje u kontekstu transformiranih stanica i mikroorganizama. Vektor može, ovisno o svrsi i tipu aplikacije biti u obliku plazmida, faga, kosmida, mini-kromosoma ili virusa, ali također sama DNA koja je sam eksprimirana povremeno u nekim stanicama je važan vektor. Preferirano su vektori za kloniranje i ekspresiju iz izuma sposobni za autonomnu replikaciju, zato omogućuju veliki broj kopija za svrhe velike razine ekspresije ili velike razine replikacije za sljedeće kloniranje.
Općenito vektor iz izuma ima sljedeće karakteristike u 5'-3' smjeru i djelatnom mjestu vezivanja: promotor ekspresije fragmenta nukleinske kiseline iz izuma, koji može biti sekvencija nukleinske kiseline koja kodira vodeći peptid omogućava izlučivanje (u ekstracelularnu fazu ili gdje je primjenljivo u periplazmu) ili integraciju u membranu polipeptidnog fragmenta, u fragment nukleinske kiseline iz izuma, te može i u nukleinsku kiselinu koja može kodirati terminator. Kada se operira s ekpresijskim vektorima u produkciji vrsta ili staničnih linija to je za svrhu genetske stabilnosti transfomianih stanica preferirano je da je vektor pri uvođenju u stanicu domaćina interiran u genom stanice. Nasuprot tome, kada se radi s vektroima koji će se koristiti za djelovanje in vivo ekpresije u životinji (tj. kada se koristi vektor DNA vakcine), zbog razloga sigurnosti preferirano je da vektor ne može biti integriran u genom domaćina; tipično se koristi sama DNA ili neintegrirani virusni vektori, a izbor je dobro poznat stručnjacima.
Vektori iz izuma se koriste da transformiraju stanicu domaćina da se producira modificirani polipeptidni GDF-8 iz izuma. Takve transformirane stanice, koje su također dio izuma mogu biti kultivirane ili stanične linije korištene za propagaciju fragmenata nukeinskih kiselina i vektora iz izuma, ili se koriste za rekombinantnu produkciju modificiranih polipeptidnih GDF-8 iz izuma. Alternativno, transformirane stanice mogu biti pogodne za žive vakcine u kojima je fragment nukleinske kiseline (jedna ili više kopija) insertirana tako da utječe na sekreciju ili interakciju u bakterijsku membranu ili stanični zid modificiranog GDF-8.
Preferirane transformirane stanice iz izuma su mikroorganizmi kao bakterije (kao što su vrste Escherichia [npr. E. coli], Bacillus [npr. Bacius subtilis], Samonella ili Mycobacterium [preferirano nepatogene npr. M. bovis BC ] ) , gljivice (kao što je Saccharomyces cerevisiae) i protozonas. Alternativno, transformirane stanice se izvode iz višestaničnih organizama kao što je kvasac, stanice insekta, stanice biljke ili stanice sisavca. Najpreferiranije su stanice dobivene od ljudi, cf. donju diskusiju o staničnim linijama i vektorima. Nedavni rezultati s pokazali veliku mogućnost upotrebe komercijalno pristupačne Drosophila melanogaster stanične linije (Schneider 2 (S2)stanična linija i vektorski sustav od Invitrogen) za rekombinantnu produkciju analoga GDF-8 iz izuma, pa je stoga je taj ekspresijski sustav posebno preferiran, također i za svrhe ovog izuma.
Za svrhe kloniranja i/ili optimiziranja ekspresije preferirano je da su transformirane stanice sposobne za replikaciju fragmenta nukleinske kiseline iz izuma. Stanice koje eksprimiraju fragmente nukleinske kiseline su preferirana cjelina u ovom izumu i one mogu biti korištene za produkciju na malo i veliko modificiranog GDF-8 ili u slučaju nepatogenih bakterija, kao sastavni dio žive vakcine.
Kada se pripravlja modificirani GDF-8 iz izuma transformiranjem stanica, pogodno je, mada nije suštinski, da je ekspresijski produkt eksportiran u medij kulture ili je nađen na površini transformirane stanice.
Kada je identificirana stanica koja je učinkovit proizvođač, preferirano je da se na toj osnovi utvrdi stanična linija koja nosi vektor iz izuma i koja eksprimira fragment nukleinske kiseline koja kodira modificirani GDF-8. Preferirano, ta stabilna stanična linija izlučuje ili nosi analog GDF-8 iz izuma, pa stoga olakšava njegovo pročišćavanje.
Općenito, vektori plazmida koji sadrže replikon i kontrolnu sekvenciju koji se izvodi iz vrsta kompatibilnim sa stanicama domaćina se koristi u vezi s domaćinima. Vektor obično sadrži mjesto replikacije kao i markirajuću sekvenciju koja je sposobna omogućiti fenotipsku selekciju u transformiranim stanicama. Primjerice, E. coli je tipično transformirana korištenjem pBR322 plazmida izvedenog iz vrste E. coli (vidi npr. Bolivar et al. 1977). Plazmid pBR322 sadrži gene za rezistenciju na ampicilin i tetraciklin i stoga je moguće lako identificiranje transformiranih stanica. Plazmid pBR ili drugi plazmid ili fag mikroorganizma mora također sadržati ili biti modificiran da sadrži promotore koji se mogu koristiti prokariotski mikroorganizam! za ekspresiju.
Ti promotori se najuobičajenije koriste pri konstrukciji rekombinantne DNA koja sadrži B-laktamazu (penicilinaza) i promotorni sustav laktoze (Chang et al., 1978, Itakura et al. 1977; Goeddel et al 1979) i sustav promotora triptofana (trp) (Goeddel et al. 1979; EP-A-0 036 776). Dok se navedeni najviše koriste, pronađeni su i korišteni drugi promotori iz mikroorganizama, a detalji koji se tiču njihovih nukleotidnih sekvencija su publicirani, omogućujući stručnjacima da izvedu funkcionalnu ligaciju s plazmidnim vektorom (Siebwenlist et al. 1980). Neki geni prokariota se mogu eksprimirati učinkovito u E. coli iz njihove vlastite promotorske skevencije, a time otklanjaju potrebu za dodatnim ili drugim promotorom dobivenim na umjetni način.
Uz prokariote se također mogu koristiti eukatiotski mikroorganizmi, kao što su kulture kvasca, a tamo promotor mora imati sposobnost izvođenja ekspresije. Sacchatomycos cerevisiase ili obični pekarski kvasac se najčešće koriste među eukariotskom mikroorganizmima, mada stoje na raspolaganju brojne ostale vrste. Za ekspresiju Sacchatomyces se primjerice obično koristi plazmid YRp7 (Stinchcomb et al. 1979; Kingsman et al. 1979; Tschemper et al. 1980). Taj plazmid već sadrži trpi gen koji omogućuje odabir markera za mutantnu vrstu kvasca kojoj nedostaje mogućnost rasta triptofana primjerice ATCC br 44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977). Prisutnost trpi lezije, kao karakteristike stanice domaćina kvasnog genoma, omogućuje zatim učinkovit okoliš za detekciju transformacije pri rastu u nedostatku triptofana.
Pogodne sekvencije za promociju u vektorima kvasca uključuju promotore za 3-fosfoglicerat kinaze (Hitzman et al. 19080) ili ostale glikolitičke enzime (Hess et al. 1968; Holland et al. 1978) kao što je enolaza, gliceraldhid-2-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, gukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerrat mutaza, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i gukokinaza. U konstrukciji pogodnih ekspresij-skih plazmida, terminacijska sekvencija povezana s tim genima je također podvrgnuta ligaciji u ekspresijski vektor 3' sekvencije koja se želi eksprimirati, a da se dobije poliadenilacija mRNA i terminacija.
Ostali promotori koji imaju dodatnu prednost da su transkripcijski kontrolirani uvjetima rasta jesu regija koja promovira akohol dehidrogenazu 2, izocitokrom C kiselu fosfatazu, degradativnie enzime povezane s metabolizmom dušika, te prije spomenutu gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzime odgovorne za upotrebu maltoze i galaktoze. Pogodan je bilo koji plazmidni vektor koji sadrži promotor koji je kompatibilan s kvascem, a koji potječe od replikacijskih i terminacijskih sekvencija.
Uz mikroorganizme, kulture stanica izvedene od višestaničnih organizama mogu također biti domaćini. U načelu, bilo koja takva stanična kultura se može koristiti, bilo iz kultura vertebrata ili evertebrata. Međutim, najveći je interes pokazan prema stanicama vertabrata, a progagacija vertebrata u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinski postupak zadnjih godina (Tissue Culture 1973). Primjeri takvih korisnih staničnih linija domaćina su VERO i HeLa stanice, stanične linije ovarija kineskog zamorca (CHO), te W138, BHK, COS-7 293, Spodoptera frugiperda (SF) stanice (komercijano pristupačne kao ekspresijski sustav od i.a. Protein Science, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, USA i iz Invitrogen), te MDCK stanične linije. U ovom izumu, posebne su preferirane stanične linije 82 od Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Hroninen, Nizozemska.
Ekspresijski vektori za takve stanice obično uključuju (ako je potrebno) porijeklo replikacije, promotor smješten u prednjem dijelu gena koji će biti eksprimiran, skupa s bilo kojim neophodnim mjestom vezivanja ribosoma, RNA na mjestu izrezivanja introna, polidentilacijsko mjesto i sekvenciju transkripcijskog terminatora.
Za upotrebu u stanicama sisavaca, kontrolna funkcija ekspresijskih vektora često potječe od virusnog materijala. Primjerice, obično korišteni promotori se izvode od polioma, Adenovirusa 2, a najčešće Simian Virusa 40 (SC40). Rani i kasni promotori SV40 virusa su izuzetno korisni jer se oba dobivaju lako iz virusa kao fragment koji također sadrži replikaciju SV40 virusnog porijekla (Fiers et al. 1978). Manji ili veći SV40 fragmenti se također mogu koristiti s tim da je uključeno približno 250 bp sekvencija koja se proteže od HindIII mjesta prema BglI mjestu smještenom u repikatoru virusnog porijekla. Nadalje, također je moguće, a često je poželjno, koristiti promotor ili kontrolnu sekvenciju koja je normalno povezana s željenom genonskom sekvencijom, s tim da je takva kontrolna sekvencija kompatibilna sa sustavima stanice domaćina.
Do replikacije može doći zbog konstrukcijskog vektora koji je egzogenog porijekla, a takav se može izvesti iz SV40 ili ostalih virusa (npr. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) ili može nastati replikacijskim mehanizmom kromosomske stanice. Ako je vektor ugrađen u kromosom stanice domaćina, potonji je često dovoljan.
Identifikacija korisnih analoga GDF-8
Bit će jasno stručnjaku da nemaju sve moguće varijante ili modifikacije prirodnog GDF-8 sposobnost izdvojiti antitijela u životinjama koji su reaktivni s prirodnim oblikom. Međutim, nije teško postaviti učinkovit standard za pronalaženje modificiranih molekula GDF-8 koje zadovoljavaju minimalne zahtjeve za imunološku reaktivnost koja je ovdje diskutirana. Zato se još jedan dio izuma tiče metode za identifikaciju modificiranog polipeptidnog GDF-8 koji je sposoban inducirati antitijela na nemodificirani GDF-8 u životinjskim vrstama u kojima je nemodificirani polipeptidni GDF-8 (neimunogeni) vlastiti protein, a metoda sadrži:
- pripravu načinom peptidne sinteze ili tehnikom genetskog inženjerstva, skupine višestruko različitih modificiranih polipeptidnih GDF-8 u kojima aminokiseline koje su uvedene adicijom, insercijom, uklonjene delecijom ili uvedene supstitucijom u aminokiselinsku sekvenciju polipeptidnog GDF-8 životinjskih vrsta, čime raste sekvencija aminokiselina u skupini koja sadrži epitope T-stanice, koji su strani životinjskoj vrsti,
- testiranje članova skupine na njihovu sposobnost indukcije produkcije antitijela u životinjskim vrstama na nemodificirani GDF-8, te
- izolacija člana (članova) iz skupine koji značajno induciraju produkciju antitijela na nemodificirani GDF-8 u životinjskoj vrsti.
U tom kontekstu, "skupina višestruko modificiranih polipep-tidnih GDF-8" je skupina koja je npr. odabrana na osnovi gore diskutiranih kriterija (npr. u kombinaciji sa rezultatima cirkularnog dikroizma, NMR spektara i/ili difrakcije X-zraka). Skupina se može sastojati od samo nekoliko članova, ali se razmatra da skupina može sadržavati nekoliko stotina članova.
Skupina može biti "pripravljena" in vivo dok je jedan primjenljiv sustav testiranja priprava fragmenata nukleinske kiseline koji kodiraju članove, a zatim korištenje tih fragmenata nukleinske kiseline imunozacijom nukleinske kiseline kao što je ovdje opisano tako da se odredi da li su ekspresijski produkti imunogeni. Stoga, testiranje članova skupine se također može provesti in vivo, ali se i brojni in vitro testovi mogu promijeniti koji sužavaju broj modigiciranih molekula koje služe za svrhe izuma.
Kako je cilj uvođenje stranih epitopa za T-stanicu da pojačaju odgovor B-stanice pomoću T-stanice, uvjet je da je proliferacija inducirana modificiranim GDF-8. Proliferacija T-stanice se može testirati standardiziranim in vitro testom proliferacije. Ukratko, uzorak obogaćen T-stanicama je dobiven od osoba i održavan je u kuturi. Kultivirane T-stanice su zaražene APC od osobe kojoj je prethodno modificirana molekula i procesuirana da ispolji njegove epitope za T-stanicu. Proliferacija T-stanica je praćena i uspoređena s pogodnom kontrolom (npr. T-stanice u kulturi zaražene APC koje su procesuirale nedirnuti prirodni GDF-8). Alternativno, proliferacija se može mjeriti određivanjem koncentracije važnih citokina koji se oslobađaju iz T-stanica kao odgovor na njihovo prepoznavanje stranih T-stanica.
Čini se vrlo vjerojatno da je najmanje jedan modificirani GDF-8 svakog tipa u stanju inducirati proizvodnju antitijela na GDF-8, pa je moguće pripraviti imunogeni pripravak koji sadrži najmanje jedan modificirani polipeptidni GDF-8 koje je sposoban inducirati proizvodnju antitijela na GDF-8 pri čemu je modificirani polipeptidni GDF-8 vlastiti protein, a metoda sadrži miješanje člana (članova) skupine koja značajno inducira produkciju antitijela u životinjskim vrstama koje su reaktvine s GDF-8 s farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i/ili vehikulom i/ili razrjeđivačem i/ili ekcipijentom, a može u kombinaciji s najmanje jednim farmaceutski i imunološki prihvatljivim adjuvansom.
Gornji aspekti izuma tiču se testiranja skupina polipeptida koji se uobičajeno izvode pripremom brojnih višestruko različitih sekvencija nukleinskih kiselina ili vektora iz izuma, transformiranjem pogodnih stanica domaćina vektorima i ekspresijom sekvencija nukleinskih kiseline iz izuma. Ti koraci se mogu pratiti izolacijom ekspresijskig produkata. Peferirano je da se sekvencije nukleinske kiseline i/ili vektori, priprave metodama koje sadrže provođenje tehnike molekuske amplifikacije kao što je PCR ili sintezom nukleinskih kiselina.
UVOD U PRIMJERE
Ekspresija 109 aminokiselinskih ostataka C-terminalne regije GDF-8 fuzioniranih na N-terminalnu His-oznaku je dobivena u E. coli i pročišćeni fuzijski protein je korišten za imunizaciju zečeva. GDF-8 pune duljine je eksprimiran u CHO stanicama i pokazano je da su izlučeni kao dimeri neprocesuiranog i procesuiranog GDF-8 (McPherron et al. Nature 387, 83-90, 1997). Stoga se ne očekuje da će biti problema s ekspresijom dolje diskutiranih GDF-8 autovakcinkih konstrukata. Najvjerojatniji ekspresijski sustav koji će se koristiti za produkciju GDF-8 AutoVac konstrukata su E. coli, gljivica P. pastoris i CHO stanice i stanice insekata kao što su gore spomenute stanice Drosophila.
PRIMJER 1
Dizajn vakcine
Ideja iz ovog izuma je da se supstituiraju dijelovi aminokiselinskih ostataka u ciljnom proteinu sa stranim ili sintetskim epitopima za T-stanicu, npr. epitopima P2 i P30. T-stanice tetanus toksina relaksirane specifičnosti. Preferirano je da ove supstitucije samo malo mijenjaju trodimenzijsku strukturu ciljnog proteina.
Ciljni protein je ovdje homodimer koji ima 109 aminokiselinskih ostataka na C-terminalnom dijelu GDF-8, od kojeg se očekuje da je biološki aktivni oblik GDF-8. Trodimenzijska struktura ove regije GDF-8 nije poznata, ali zasnovano na strukturi homolognog TGF-β proteins, model GDF-8 prikazan na Slici 2 se može smatrati razumno bliskim realnosti. U tom modelu divljeg tipa GDF-8 (wt) α-uzvojnice su pokazane kao cilindri, a β-nabrane ploče su pokazane kao strelice. Cisteinski ostaci, pa stoga disulfidne veze su vrlo blisko smještene u strukturi.
Valja zamisliti da prisutnost relativno velikog broja cisteina (9), pa stoga disulfidnih veza u C-terminalnoj regiji od 109 aminokiselinska ostatka GDF-8 ograničuje moguća mjesta u kojima se može smjestiti strani epitop za T-stanicu.
Uz to da se pripravi C-terminalna regija od 109 aminokiselinska ostatka GDF-8 bez supstitucije (tj. ostaci 267-375 u SEQ ID NO: 1-10), predloženi su sljedeći AutoVac konstrukti.
GDF-8 P2-1 (SEQ ID NO: 15) u C-terminalnoj regiji GDF-8 sa 109 aminokiselinska ostatka su aminokiselinski ostaci 18-32 supstituirani s P2.
GDF-8 P2-2 (SEQ ID NO: 16) u C-terminalnoj regiji GDF-8 sa 109 aminokiselinska ostatka su aminokiselinski ostaci 52-66 supstituirani s P2.
GDF-8 P2-3 (SEQ ID NO: 17) u C-terminalnoj regiji GDF-8 sa 109 aminokiselinska ostatka su aminokiselinski ostaci 83-97 supstituirani s P2.
GDF-8 P30-1 (SEQ ID NO: 18) u C-terminalnoj regiji GDF-8 sa 109 aminokiselinska ostatka su aminokiselinski ostaci 21-41 supstituirani s P30.
GDF-8 P30-2 (SEQ ID NO: 19) u C-terminalnoj regiji GDF-8 sa 109 aminokiselinska ostatka su aminokiselinski ostaci 49-69 supstituirani s P30.
GDF-8 P30-3A (SEQ ID NO: 20) u C-terminalnoj regiji GDF-8 sa 109 aminokiselinska ostatka su aminokiselinski ostaci 79-99 supstituirani s P30.
GDF-8 P30-3B (SEQ ID NO: 21) u C-terminalnoj regiji GDF-8 sa 109 aminokiselinska ostatka su aminokiselinski ostaci 84-104 supstituirani s P30.
GDF-8 dimer (SEQ ID NO: 22) su dvije kopije C-terminalne regije sa 109 aminokiselinska ostatka koje su kovalentno spojene preko P2 i P30 epitopa. Drugim riječima, molekula sadrži dvije polovice. Prva polovica je C-terminalna regija sa 109 aminokiselinska ostatka GDF-8 koja ima P2 vezan na svoj C-terminalni kraj, dok je druga polovica C-terminalna regija sa 109 aminokiselinska ostatka koja ima P30 vezan na njem C-terminalni kraj.
GDF-8 ext (SEQ ID NO: 23) sadrži C-terminalni kraj sa 160 aminokiselinska ostatka GDF-8 u kojima su ostaci 16-36 supstituirani s P30f a ostaci 37-51 supstituirani s P2. Ovaj konstrukt je C-terminalna regija sa 109 aminokiselina GDF-8 sa N-terminalnim produljenjem koje sadrži P2 i P30 epitope.
U svim konstruktima iz primjera osim u 2, očekuje se da produciraju varijantu u kojoj je Cys73 supstituirani sa Ser da se izbjegne dimerizacija preko stvaranja disulfidne veze. U GDF-8 ext se očekuje da pokaže sličnu supstituciju u odgovarajućem položaju (tj. Cysl24 → Ser124).
PRIMJER 2
In vitro modeli
Planirano je da se početno imuniziraju miševi s gore opisanim pročišćenim GDF-8 varijantama. Nakon npr. tri imunozacije, mjerit će se antitijela s ELISA upotrebom nemodificirane molekule GDF-8 kao antigena. Primarni razlog za te početne eksperimente je da se potvrdi da je AutoVac!!!! tehnologija primjenljiva u stvaranju antiGDF-8 ukršteno reaktivnih antitijela i, važno, da se identificira optimalna doza i režim imunizacije. Bit će, međutim, vrlo iznenađujuće ako razina antitijela na GDF-87 nije porasla upotrebom ove tehnologije, jer osnovni imunološki mehanizmi takvih odgovora su najvjerojatnije identični onima koji su već opaženi za TNFα, cf. WO 98/46642 i WO 95/05849.
PRIMJER 3
In vivo modeli
Skupine miševa će biti imunizirane s različitim konstruktima opisanim u Primjeru 1. Miševi će biti imunizorani u dobi od oko 4 tjedna jer trebaju bit imuno kompetentni da bi dali odgovor na vakcinu. Koristit će se Freundov kompletni adjuvans, ali će se također izvesti eksperimenti upotrebom alum adjuvansa kao što je Adjuphos!!!!, koji je prethodno uspješno korišten u miješanju s TNFα autovakcinskim konstruktima. Adjuphos!!!! je prihvaćen za korištenje kod ljudi i životinja. Tijekom cijelog perioda imunizacije ukupna masa s GDF-8 imuniziranih i kontrolnih životinja će biti praćena
redovito. Kada miševi budu stari približno 16 tjedana, bit će žrtvovani i odredit će se veličina njihove mišićne mase.
Zbog relativno uskog vremenskog perioda u kojima su miševi imuno kompetentni a još nisu potpuno porasli, može biti teško pokazati efekt anti-GDF-8 vakcinacije u tim životinjama. Ako se to dokaže točno, razmatra se alternativna imunizaija štakora ili većih životinja kao što su svinje, goveda itd.
Modificirana molekula GDF-8 koja izrazito povećava brzinu rasta životinja i/ili izrazito povećava maksimalnu veličinu mišića je odabrana za kliničko razvijanje.
Claims (52)
1. Metoda za in vivo smanjivanja aktivnosti faktora 8 diferencijacije rasta (GDF-8) u životinjama uključujući ljude, naznačeno time da metoda sadrži djelovanje na ispoljavanje na životinjski imuni sustav imunološki učinkovite količine
- najmanje jednog analoga polipeptidnog GDF-8 u životinji ili njegove podsekvencije koja je formulirana tako da imunizacijom životinje s analogom polipeptidnog GDF-8 ili njegovom podsekvencijom izazove produkciju antitijela na polipeptidni GDF-8, i/ili
- najmanje jednog analoga GDF-8 u koji je uvedena najmanje jedna modifikacija u aminokiselinskoj sekvenciji GDF-8 čiji je rezultat da imunizacija životinje s analogom izaziva produkciju antitijela na polipeptidni GDF-8.
2. Metoda prema patentnom zahtjevu 1, naznačeno time da ispoljeni analog GDF-8 ima najmanje jednu modifikaciju aminokiselinske sekvencije GDF-8.
3. Metoda prema patentnom zahtjevu 2, naznačeno time da modifikacija ima rezultat da je znatan udio GDF-8 epitopa za B-stanice sačuvan, te da je
- uveden najmanje jedan strani epitop za T pomoćni limfocit (TH epitop), i/ili
- da je uveden barem jedan prvi segment čiji je učinak usmjeravanje modificirane molekule u stanicu koja ispoljava antigen (APC) ili u B-limfocit, i/ili
- da je uveden barem jedan drugi segment koji stimulira imuni sustav, i/ili
- da je uveden barem jedan treći segment koji optimizira ispoljavanje modificiranog polipeptidnog GDF-8 u imunom sustavu.
4. Metoda prema patentnom zahtjevu 3, naznačeno time da modifikacija uključuje uvođenje bočnih skupina, kovalentno ili nekovalentno vezanih na pogodne kemijske skupine u GDF-8 ili na njegove podsekvencije, stranog TH epitopa i/ili od prvog i/ili drugog i/ili trećeg segmenta.
5. Metoda prema patentnom zahtjevu 3 ili 4, naznačeno time da modifikacija uključuje aminokiselinsku supstituciju i/ili deleciju i/ili inserciju i/ili adiciju.
6. Metoda prema patentnom zahtjevu 5, naznačeno time da je rezultat modifikacije stvaranje fuzijskog polipeptida.
7. Metoda prema patentnom zahtjevu 5 ili 6, naznačeno time da uvođenje aminokiselinske supstitucije i/ili delecije i/ili insercije i/ili adicije ima za rezultat uveliko zadržavanja ukupne tercijarne strukture GDF-8.
8. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 2-7, naznačeno time da modifikacija uključuje udvostručenje najmanje jednog GDF-8 epitopa za B-stanicu i/ili uvođenje haptena.
9. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 3-8, naznačeno time da je strani epitop za T-stanicu imunodominantan u životinji.
10. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 3-9, naznačeno time da je strani epitop za T-stanicu relaksirane specifičnosti, kao što je prirodni epitop za T-stanicu i na MHC-II vezujuća sintetska peptidna sekvencija.
11. Metoda prema patentnom zahtjevu 10, naznačeno time da je prirodni epitop za T-stanicu odabran od sljedećih: epitop toksoida tetanusa kao što je P2 ili P30, epitop toksoida difterije, hemaglutininski epitop virusa influencije, te CS epitop P. faciparum.
12. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 3-11, naznačeno time da je prvi segment znatno specifičan partner za vezivanje na antigen B-limfocita specifične površine ili antigen APC specifične površine kao što je hapten ili ugljikohidrat za koji postoji receptor na B-limfocitu ili na APC, kao što je mana ili manoza.
13. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 3-12, naznačeno time da je drugi segment odabran od sljedećih: citokin, hormon, te protein podvrgnut toplinskom šoku.
14. Metoda prema patentnom zahtjevu 13, naznačeno time da je citokin odabran ili je učinkoviti dio od sljedećih: interferon γ (IFN-γ), Flt3L, interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15), te stimulirajući faktor kolonije granulacitnog makrofaga (GM-CSF) te da je protein podvrgnut toplinskom šoku odabran ili je učinkovit dio sljedećih: HSP70, HSP90, HSC70, GRP94, te kalretikulin (CRT), ili njihovi učinkoviti dijelovi.
15. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 3-14, naznačeno time da je treći segment lipidne prirode, kao što je palmitoilna skupina, miristilna skupina, farnezilna skupina, geranil-geraniolna skupina, GPI-sidro, te N-acil-digliceridna skupina.
16. Metoda prema bilo kojem od preTHodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da podsekvencija GDF-8 ili analog GDF-8 izveden od C-terminalnog kraja aktivnog oblika GDF-8, kao što je podsekvencija ili analog izvede od goveđeg, svinjskog, humanog, pilećeg, ovčijeg ili purećeg polipeptidnog GDF-8.
17. Metoda prema patentnom zahtjevu 16, naznačeno time da je polipeptidni GDF-8 modificiran supstitucijom najmanje jedne aminokiselinske sekvencije u SEQ ID NO: 11 ili 12 s najmanje jednom aminokiselskom sekvencijom jednake ili različite duljine koja sadrži strani TH epitop, pri čemu su supstituirane aminokiselinske sekvencije sadrže ostatke 1-12, 18-41, 43-48, 49-69 ili 79-104 u SEQ ID NO: 11 ili 12, ili u kojima je polipeptidni GDF-8 modificiran indertiranjem najmanje jedne aminokiselinske sekvencije koja sadrži strani TH epitop, pri čemu je insercija izvedena na bilo kojejem od sljedećih položaja: 1-12, 18-30, 42-51, 82-86, te 105-109 u SEQ ID NO: 11 ili 12.
18. Metoda prema bilo kojem od preTHodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je ispoljavanje na imuni sustav postignuto postojanjem barem dvije kopije polipeptidnog GDF-8, njegove podsekvencije ili modificiranog polipeptidnog GDF-8 koji je kovalentno ili nekovalentno vezan na molekulu nosača koja je sposobna utjecati na ispoljavanje višestrukih kopija antigenskih determinanata.
19. Metoda prema bilo kojem od preTHodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je učinkovita količina polipeptidnog GDF-8, ili analoga GDF-8 dana životinji na način koji je odabran od sljedećih: parenteralanim putem, kao što je intradermalno, subdermalno, intrakutalno, subkutalno, intramuskuarnim putem; peritonalnim putem; oralnim putem; buklalnim putem; sublingvalnim putem; epiduralnim putem; spinalnim putem; analnim putem; te intrakarnialnim putem.
20. Metoda prema patentnom zahtjevu 19, naznačeno time da učinkovita količina iznosi između 0.5 μg i 2000 μg polipeptidnog GDF-8 ili njegove podsekvencije ili njegovog analoga.
21. Metoda prema patentnom zahtjevu 19 ili 20, naznačeno time da uključuje najmanje jedno davanje polipeptidnog GDF-8 ili analoga godišnje, kao što je najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, te najmanje 12 davanja godišnje.
22. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 19-21, naznačeno time da polipeptidni GDF-8, njegova podsekvencija ili modificirani polipeptidni GDF-8 može biti formuliran s farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i/ili vehikulom, te da je formuliran s adjuvansom koji olakšava razbijanje autotolerancije na antigene, kao što je adjuvans odabran iz skupine koju čine: imunousmjereni adjuvans, imunomoduirajući adjuvans kao što je toksin, citokin i mikrobakterijski derivat; uljna formulacija; polimer; adjuvans koji stvara micele; saponin; imunostimulirajuća matrica kompleksa (ISOCOM matrica); čestica DDA; aluminijski adjuvans, DNA adjuvans, γ-inzulin, te adjuvans za kapsuiranje.
23. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 20-22, naznačeno time da je polipeptidni GDF-8 ili njegov analog sadržan u napravi koja je virtualni limfni čvor (VLN).
24. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-18, naznačeno time da na ispoljavanje modificiranog GDF-8 na imuni sustav utječe uvođenje nukleinske kiseline (kiselina) koja kodira modificirani GDF-8 u životinjskim stanicama i čime je dobivena in vivo ekspresija u stanicama u koje je uvedena nukleinska kiselina (kiseline).
25. Metoda prema patentnom zahtjevu 24, naznačeno time da je/jesu uvedena nukleinska kiselina (kiseline) odabrana od sljedećih: sama DNA, DNA formulirana s nabijenim ili nenabijenim lipidima, DNA formulirana u liposomima, DNA uključena u virusni vektor, DNA formulirana s proteinom ili polipeptidom koji olakšavaju transfekciju, DNA formulirana s ciljnim proteinom ili polipeptidom, DNA formulirana sa sredstvom koje taloži kalcij, DNA formulirana sa sredstvom za taloženje kalcija, DNA vezana na inertnu molekulu koja je nosač, DNA kapsuliranu hitinu ili hitosanu, te DNA formuliranu s adjuvansom.
26. Metoda prema patentnom zahtjevu 24 ili 25, naznačeno time da je nukleinska kiselina dana intraarterijski, intravenozno ili putovima definiranim u patentnom zahtjevu 19.
27. Metoda prema patentnom zahtjevu 24 ili 25, naznačeno time da je/jesu nukleinska kiselina sadržana u VLN napravi, i/ili je formulirana kao što je definirano u patentnom zahtjevu 22.
28. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 25-27, naznačeno time da uključuje najmanje jedno davanje nukleinske kiseline godišnje, kao što je najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, te najmanje 12 davanja godišnje.
29. Metoda povećanja mišićne mase kod životinja, naznačeno time da metoda sadrži smanjivanje aktivnosti GDF-8 prema metodi iz bio kojeg patentnog zahtjeva od 1-28 do te mjere da je mišićna masa poveća barem 5% u usporedbi sa životinjama koje imaju normalnu aktivnost GDF-8, kao što je najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 i 45%.
30. Analog GDF-8 koji je izveden iz životinjskog polipeptdnog GDF-8, naznačeno time da je uvedena modifikacija koja ima rezultat imunizacije životinje s analogom koji izaziva stvaranje antitijela na polipeptidni GDF-8, kao što je modifikacija definirana u bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-18.
31. Imunogeni pripravak, naznačeno time da sadrži imunogeno učinkovitu količinu analoga polipeptidnog GDF-8 koji je autologan u životinji, a rečeni polipeptidni GDF-8 je formuliran skupa s imunološki prihvatljivim adjuvansom, tako da se uništi autotolerancija životinje prema polipeptidnom GDF-8, a pripravak nadalje sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljivi nosač i/ili vehikul.
32. Imunogeni pripravak, naznačeno time da sadrži imunogeno učinkovitu količinu analoga GDF-8 prema patentnom zahtjevu 29, s tim da pripravak nadalje sadrži farmaceutski i imunološki prihvatljivi nosač i/ili vehikul, a može biti i adjuvans.
33. Imunogeni pripravak prema patentom zahtjevu 31 ili 32, naznačeno time da je adjuvans odabran iz skupine koju čine adjuvansi iz zahtjeva 22.
34. Fragment nukleinske kiseline, naznačeno time da kodira analog GDF-8 prema patentom zahtjevu 29.
35. Vektor, naznačeno time da nosi fragment nukleinske kiseline prema patentom zahtjevu 34, kao što je vektor sposoban za autonomnu replikaciju.
36. Vektor prema patentnom zahtjevu 35, naznačeno time da je odabran iz sljedeće skupine: plazmid, fag, kosmid, mini-kromosom, te virus.
37. Vektor prema patentnom zahtjevu 35 ili 36, naznačeno time da u 5' → 3' smjeru i u djelatnom mjestu vezivanja sadrži promotor za upravljanje ekspresijom: fragmenta nukleinske kiseline prema patentnom zahtjevu 34, može sekvenciju nukleinske kiseline koja kodira vodeći peptid omogućujući izlučivanje ili integraciju u membranu polipetidnog fragmenta, fragmenta nukleinske kiseline prema zahtjevu 34, a može i terminatora.
38. Vektor prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 41-44, naznačeno time da je pri uvođenju u stanicu domaćina sposoban biti integriran u genom stanice domaćina ili nije sposoban biti integriran u genom stanice domaćina.
39. Vektor prema patentnom zahtjevu 37 ili 38, naznačeno time da promotor upravlja ekspresijom u stanici eukariota i/ili u stanici prokariota.
40. Transformirana stanica, naznačeno time da nosi vektor iz bilo kojeg od zahtjeva 35-39, kao što je transformirana stanica koja je sposobna replicirati fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 34.
41. Transformirana stanica prema patentnom zahtjevu 40, naznačeno time da je mikroorganizam odabran od sljedećih: bakterija kao što je bakterija vrste Escherichia (preferirano E. coli), Bacillus, Salminella ili Mycobacteri-um (preferirano nepatogene stanice Micobacterium kao što je M. bovis BCG) , kvasna gljivica, protozoa ili stanica izvedena iz višestaničnog organizma koji je odabran od sljedećih: gljivice, stanica insekta kao što je 82 ili SF stanica, stanica biljke i stanica sisavca.
42. Transformirana stanica prema patentnom zahtjevu 40 ili 41, naznačeno time da eksprimira fragment nukleinske kiseline prema patentnom zahtjevu 34, kao što je transformirana stanica koja izlučuje ili nosi na svojoj površini analog GDF-8 prema patentnom zahtjevu 30.
43. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 1-18, naznačeno time da se na ispoljavanje imunog sustava utječe davanjem nepatogenih mikroorganizama ili virusa koji nose fragment nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira polipeptidni GDF-8 ili analog.
44. Metoda prema patentnom zahtjevu 43, naznačeno time da je virus nevirulentni pox virus kao što je vaccinia virus ili pri čemu je mikroorganizam bakterija, kao što je bakterija definirana u zahtjevu 41.
45. Metoda prema patentnom zahtjevu 43 ili 44, naznačeno time da je nepatogeni mikroorganizam ili virus dan jedanput životinji.
46. Pripravak za indukciju produkcije antitijela na GDF-8, naznačeno time da pripravak sadrži:
fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 34 ili vektor prema bilo kojem od zahtjeva od 35-39, te farmaceutski i imunološki prihvatljiv nosač i/ili vehikul i/ili adjuvans.
47. Pripravak prema patentnom zahtjevu 46, naznačeno time da je fragment nukleinske kiseline formuliran prema zahtjevu 25 ili 27.
48. Stabilna stanična linija prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 35-39, naznačeno time da eksprimira fragment nukleinske kiseline prema zahtjevu 34, te koja može lučiti ili nositi na površini analog GDF-8 prema patentnom zahtjevu 30.
49. Metoda za pripravu stanica prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 40-42, naznačeno time da metoda sadrži transformiranje stanice domaćina s fragmentom nukleinske kiseline prema patentnom zahtjevu 34 ili s vektorom prema bio kojem od patentnih zahtjeva 35-39.
50. Metoda za identifikaciju modificiranog polipeptidnog GDF-8 koji je sposoban inducirati antitijela na nemodificirani GDF-8 u životinjskim vrstama u kojima je nemodificirani polipeptidni GDF-8 vlastiti protein, naznačeno time da metoda sadrži:
- pripravu načinom peptidne sinteze ili tehnikom genetskog inženjerstva, skupine višestruko različitih modificiranih polipeptidnih GDF-8 u kojima su aminokiseline uvedene adicijom, insercijom, uklonjene delecijom ili uvedene supstitucijom u aminokiselinsku sekvenciju polipeptidnog GDF-8 životinjskih vrsta, čime raste sekvencija aminokiselina u skupini koja sadrži epitope za T-stanicu koji su strani životinjskoj vrsti,
- testiranje članova skupine na njihovu sposobnost indukcije produkcije antitijela u životinjskim vrstama na nemodificirani GDF-8, te
- izolaciju člana (članova) iz skupine koji značajno induciraju produkciju antitijela na nemodificirani GDF-8 u životinjskim vrstama.
51. Metoda priprave imunogenog pripravka, naznačeno time da sadrži barem jedan modificirani polipeptidni GDF-8 koji je sposoban inducirati antitijela na nemodificirani GDF-8 u životinjskim vrstama u kojima je nemodificirani polipeptidni GDF-8 je vlastiti protein, a metoda sadrži:
- pripravu načinom peptidne sinteze ili tehnikom genetskog inženjerstva, skupine višestruko različitih modificiranih polipeptidnih GDF-8 u kojima su aminokiseline uvedene adicijom, insercijom, uklonjene delecijom ili uvedene supstitucijom u aminokiselinsku sekvenciju polipeptidnog GDF-8 životinjskih vrsta, čime raste sekvencija aminokiselina u skupini koja sadrži epitope za T-stanicu koji su strani životinjskoj vrsti,
- testiranje članova skupine na njihovu sposobnost indukcije produkcije antitijela u životinjskim vrstama na nemodificirani GDF-8, te
- miješanje člana (članova) skupine koji značajno induciraju produkciju antitijela u životinjskim vrstama, a koji reagiraju s GDF-8, s farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačen i/ili vehikulom, a može biti u kombinaciji s najmanje jednim farmaceutski i imunološki prihvatljivim adjuvansom.
52. Metoda prema patentnom zahtjevu 50 ili 51, naznačeno time da priprava članova skupine sadrži pripravu višestruko različitih sekvencija nukleinskih kiselina, a svaka sekvencija predstavlja sekvenciju nukleinske kiseline prema zahtjevu 34, inseciju sekvencije nukleinske kiseline u odgovarajuće ekpresijske vektore, transformaciju pogodnih stanica domaćina s vektorima, te ekspresiju sekvencije nukleinske kiseline, nakon čega može slijediti izolacija produkata ekspresije.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA199901014 | 1999-07-20 | ||
| US14527599P | 1999-07-26 | 1999-07-26 | |
| PCT/DK2000/000413 WO2001005820A2 (en) | 1999-07-20 | 2000-07-20 | Method for down-regulating gdf-8 activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20010900A2 true HRP20010900A2 (en) | 2003-08-31 |
Family
ID=26065065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20010900A HRP20010900A2 (en) | 1999-07-20 | 2001-12-04 | Method for down-regulating gdf-8 activity |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7056512B1 (hr) |
| EP (1) | EP1200119A2 (hr) |
| JP (1) | JP2003506325A (hr) |
| KR (1) | KR100750695B1 (hr) |
| CN (1) | CN1384757A (hr) |
| AU (1) | AU778470B2 (hr) |
| CA (1) | CA2379852A1 (hr) |
| EA (1) | EA005248B1 (hr) |
| EE (1) | EE200200025A (hr) |
| HK (1) | HK1048937A1 (hr) |
| HR (1) | HRP20010900A2 (hr) |
| HU (1) | HUP0201861A3 (hr) |
| IL (1) | IL146845A0 (hr) |
| MX (1) | MXPA01013232A (hr) |
| NO (1) | NO20016252L (hr) |
| NZ (1) | NZ517058A (hr) |
| PL (1) | PL353855A1 (hr) |
| SK (1) | SK722002A3 (hr) |
| TR (2) | TR200400621T2 (hr) |
| WO (1) | WO2001005820A2 (hr) |
| ZA (1) | ZA200109901B (hr) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7393682B1 (en) | 1993-03-19 | 2008-07-01 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides |
| US6369201B1 (en) | 1998-02-19 | 2002-04-09 | Metamorphix International, Inc. | Myostatin multimers |
| EP1075272B1 (en) * | 1998-05-06 | 2009-07-15 | Metamorphix, Inc. | Methods for treating diabetes by inhibiting gdf-8 |
| US7037501B2 (en) | 2001-01-04 | 2006-05-02 | Regents Of The University Of Minnesota | Myostatin immnoconjugate |
| TWI329129B (en) | 2001-02-08 | 2010-08-21 | Wyeth Corp | Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof |
| US7320789B2 (en) | 2001-09-26 | 2008-01-22 | Wyeth | Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof |
| AU2003260748A1 (en) * | 2002-08-30 | 2004-03-19 | Glaxo Group Limited | Il-14 vaccine for the treatment of asthma and atopic disorders |
| US7261893B2 (en) | 2002-10-22 | 2007-08-28 | Wyeth | Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor |
| ATE496938T1 (de) * | 2002-12-20 | 2011-02-15 | Amgen Inc | Myostatin hemmende bindungsstoffe |
| EP1635870A2 (en) | 2003-06-02 | 2006-03-22 | Wyeth | Use of myostatin (gdf8) inhibitors in conjunction with corticosteroids for treating neuromuscular disorders |
| ITMI20071072A1 (it) | 2007-05-25 | 2008-11-26 | Lps Electronics S R L | Apparecchiatura per la rilevazione automatica dello stato di calore di una scrofa. |
| EP1699820A2 (en) * | 2003-12-31 | 2006-09-13 | Schering-Plough Ltd. | Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine |
| JP4688483B2 (ja) | 2004-04-15 | 2011-05-25 | 株式会社テクノネットワーク四国 | フォリスタチン変異体ポリペプチド |
| US20080118487A1 (en) | 2004-09-30 | 2008-05-22 | Orico Limited | Myostatin Isoform |
| CN103450359B (zh) | 2005-08-19 | 2018-07-24 | 惠氏有限责任公司 | 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途 |
| CN100450545C (zh) * | 2006-08-03 | 2009-01-14 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 肌肉生长抑制素在制备抗肿瘤药物中的应用 |
| AU2007279456A1 (en) | 2006-08-03 | 2008-02-07 | Myostin Therapeutics Pty Ltd | Myostatin antagonists |
| GB0715087D0 (en) | 2007-08-03 | 2007-09-12 | Summit Corp Plc | Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy |
| LT2170396T (lt) | 2007-08-03 | 2017-03-10 | Summit (Oxford) Limited | Vaistų deriniai, skirti diušeno raumenų distrofijos gydymui |
| KR100857861B1 (ko) * | 2007-10-15 | 2008-09-11 | 주식회사 바이오리더스 | Ｍｙｏ－２ 펩타이드 중합체와 마이오스타틴의 융합단백질표면발현용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미생물 |
| JO3340B1 (ar) | 2010-05-26 | 2019-03-13 | Regeneron Pharma | مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري |
| WO2013003983A1 (zh) * | 2011-07-06 | 2013-01-10 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 猪肌抑素基因座位及其应用 |
| WO2013074557A1 (en) | 2011-11-14 | 2013-05-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing gdf8 and/or activin a |
| EP2861617A1 (en) | 2012-06-15 | 2015-04-22 | Pfizer Inc. | Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor |
| RS60318B1 (sr) | 2012-08-01 | 2020-07-31 | Ikaika Therapeutics Llc | Ublažavanje tkivnog oštećenja i fibroze pomoću anti-ltbp4 antitela |
| EP3816625A1 (en) | 2013-05-06 | 2021-05-05 | Scholar Rock, Inc. | Compositions and methods for growth factor modulation |
| TW201920262A (zh) | 2013-07-30 | 2019-06-01 | 美商再生元醫藥公司 | 抗活化素ａ之抗體及其用途 |
| EP2960653A1 (en) * | 2014-06-24 | 2015-12-30 | Stichting Kwaliteitsgarantie Vleeskalversector | Diagnostic kit and method for the identification of the manipulation of muscle mass in a domestic animal |
| EP3283519A1 (en) | 2015-04-15 | 2018-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of increasing strength and functionality with gdf8 inhibitors |
| MX2020008991A (es) | 2018-03-01 | 2020-12-10 | Regeneron Pharma | Metodos para alterar la composicion corporal. |
| AU2019406214A1 (en) | 2018-12-21 | 2021-08-05 | Northwestern University | Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury |
| WO2020139977A1 (en) | 2018-12-26 | 2020-07-02 | Northwestern University | Use of glucocorticoid steroids in preventing and treating conditions of muscle wasting, aging and metabolic disorder |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6607884B1 (en) * | 1993-03-19 | 2003-08-19 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods of detecting growth differentiation factor-8 |
| DK96493D0 (da) * | 1993-08-26 | 1993-08-26 | Mouritsen Og Elsner Aps | Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden |
| AU698962B2 (en) | 1993-09-14 | 1998-11-12 | Epimmune, Inc. | Alteration of immune response using pan DR-binding peptides |
| AUPO390396A0 (en) | 1996-11-29 | 1996-12-19 | Csl Limited | Novel promiscuous T helper cell epitopes |
| CN1178955C (zh) | 1997-04-15 | 2004-12-08 | 法默卡有限公司 | 经修饰的TNFα分子和编码该TNFα分子的DNA以及含有该TNFα分子和该DNA的疫苗 |
| AU756620B2 (en) * | 1997-07-14 | 2003-01-16 | University Of Liege | Mutations in the myostation gene cause double-muscling in mammals |
| WO1999031262A2 (en) * | 1997-12-16 | 1999-06-24 | Valentis, Inc. | Needle-free injection of formulated nucleic acid molecules |
| GB2333706A (en) | 1998-02-02 | 1999-08-04 | Merck & Co Inc | Method for increasing muscle mass in animals |
| US6369201B1 (en) * | 1998-02-19 | 2002-04-09 | Metamorphix International, Inc. | Myostatin multimers |
-
2000
- 2000-07-20 PL PL00353855A patent/PL353855A1/xx unknown
- 2000-07-20 EA EA200200182A patent/EA005248B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-07-20 CA CA002379852A patent/CA2379852A1/en not_active Abandoned
- 2000-07-20 NZ NZ517058A patent/NZ517058A/en unknown
- 2000-07-20 TR TR2004/00621T patent/TR200400621T2/xx unknown
- 2000-07-20 HU HU0201861A patent/HUP0201861A3/hu unknown
- 2000-07-20 US US09/620,586 patent/US7056512B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-20 AU AU59675/00A patent/AU778470B2/en not_active Ceased
- 2000-07-20 KR KR1020027000866A patent/KR100750695B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-07-20 IL IL14684500A patent/IL146845A0/xx unknown
- 2000-07-20 EP EP00945671A patent/EP1200119A2/en not_active Withdrawn
- 2000-07-20 TR TR2002/00133T patent/TR200200133T2/xx unknown
- 2000-07-20 EE EEP200200025A patent/EE200200025A/xx unknown
- 2000-07-20 WO PCT/DK2000/000413 patent/WO2001005820A2/en active IP Right Grant
- 2000-07-20 US US10/031,342 patent/US7070784B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-20 JP JP2001511477A patent/JP2003506325A/ja active Pending
- 2000-07-20 SK SK72-2002A patent/SK722002A3/sk unknown
- 2000-07-20 CN CN00810614A patent/CN1384757A/zh active Pending
- 2000-07-20 MX MXPA01013232A patent/MXPA01013232A/es active IP Right Grant
-
2001
- 2001-11-30 ZA ZA200109901A patent/ZA200109901B/xx unknown
- 2001-12-04 HR HR20010900A patent/HRP20010900A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2001-12-19 NO NO20016252A patent/NO20016252L/no not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-02-17 HK HK03101114.6A patent/HK1048937A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TR200200133T2 (tr) | 2002-05-21 |
| CN1384757A (zh) | 2002-12-11 |
| EA200200182A1 (ru) | 2002-06-27 |
| AU5967500A (en) | 2001-02-05 |
| KR100750695B1 (ko) | 2007-08-22 |
| EE200200025A (et) | 2003-04-15 |
| JP2003506325A (ja) | 2003-02-18 |
| US7056512B1 (en) | 2006-06-06 |
| SK722002A3 (en) | 2003-02-04 |
| EA005248B1 (ru) | 2004-12-30 |
| AU778470B2 (en) | 2004-12-09 |
| NZ517058A (en) | 2004-04-30 |
| NO20016252D0 (no) | 2001-12-19 |
| WO2001005820A3 (en) | 2001-07-19 |
| HK1048937A1 (zh) | 2003-04-25 |
| MXPA01013232A (es) | 2005-05-24 |
| EP1200119A2 (en) | 2002-05-02 |
| ZA200109901B (en) | 2003-05-28 |
| US7070784B1 (en) | 2006-07-04 |
| NO20016252L (no) | 2002-03-15 |
| HUP0201861A2 (en) | 2002-09-28 |
| IL146845A0 (en) | 2002-07-25 |
| CA2379852A1 (en) | 2001-01-25 |
| PL353855A1 (en) | 2003-12-01 |
| TR200400621T2 (tr) | 2004-08-23 |
| KR20020026544A (ko) | 2002-04-10 |
| WO2001005820A2 (en) | 2001-01-25 |
| HUP0201861A3 (en) | 2004-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HRP20010900A2 (en) | Method for down-regulating gdf-8 activity | |
| HRP20010188A2 (en) | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity | |
| AU2007249087B2 (en) | Novel method for down-regulation of amyloid | |
| HRP20010824A2 (en) | Method for down-regulating il5 activity | |
| JP2005518194A (ja) | 乱交雑ｔ細胞エピトープ挿入物を有するマルチマータンパク質の免疫原性擬態物 | |
| WO2006102901A2 (en) | Immunogenic egfr peptides comprising foreign t cell stimulating epitope | |
| ZA200403686B (en) | Immunogenic mimetics of multimer proteins with promiscuous T cell epitope inserts | |
| EP1539232A1 (en) | Immunization against autologous ghrelin | |
| ZA200502927B (en) | Single chain recombinant T cell receptors. | |
| AU2004235875A1 (en) | Immunogenic human TNF alpha analogues with reduced cytotoxicity and methods of their preparation | |
| KR20050052499A (ko) | 자가 그렐린에 대한 면역화 | |
| BOEVING et al. | Patent 2498739 Summary | |
| EP1541587A2 (en) | Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| AIPI | Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application | ||
| ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20080718 Year of fee payment: 9 |
|
| ODBI | Application refused |