EA007533B1

EA007533B1 - Способ понижающей регуляции белка-предшественника амилоида

Info

Publication number: EA007533B1
Application number: EA200400332A
Authority: EA
Inventors: Петер Бирк Расмуссен; Мартин Роланд Енсен; Клаус Грегориус Нильсен; Петер Кофод; Флоранс Даль Деган
Original assignee: Фармекса А/С
Priority date: 2001-08-20
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2006-10-27
Also published as: DE60213615T3; ATE334698T1; EP1420815A2; ES2269749T3; AU2010212381B2; JP2004538332A; EP1685847A1; ES2269749T5; CO5560581A2; PL215125B1; HUP0400669A2; KR20090074830A; KR20040044465A; CN101675992A; AU2002325199B2; DE60213615D1; CA2457140A1; EP3299029A1; AU2007249087B2; JP2009280582A

Abstract

Раскрыты новые способы борьбы против заболеваний, характеризующихся накоплением амилоида. Способы в основном основаны на иммунизации против белка-предшественника амилоида (АРР) или β-амилоида (Аβ). Предпочтительно иммунизацию осуществляют посредством введения аналогов аутологичных АРР или Аβ, где указанные аналоги способны вызывать продукцию антител против аутологичных амилоидогенных полипептидов. В качестве иммуногена особенно предпочтителен Аβ, который модифицируют введением одиночного или немногих чужеродных Т-клеточных эпитопов. Также раскрыта вакцинация нуклеиновой кислотой против АРР или Аβ и вакцинация с применением живых вакцин, а также способы и средства, пригодные для вакцинации. Такие способы и средства включают в себя способы получения аналогов и фармацевтических препаратов, а также фрагментов нуклеиновой кислоты, векторов, трансформированных клеток, полипептидов и фармацевтических препаратов.

Description

Настоящее изобретение относится к усовершенствованиям в лечении и профилактике болезни Альцгеймера (АО) и других заболеваний, характеризующихся накоплением амилоида, например характеризующихся накоплением амилоида в центральной нервной системе (ЦНС). Более конкретно, в настоящем изобретении предложен способ понижающей регуляции (нежелательного) накопления амилоида посредством включения продукции антител против соответствующего белка (АРР или Ав) или его компонентов у субъектов, страдающих от заболеваний с патологией, включающей в себя отложение амилоида, или рискующих пострадать от данных заболеваний, а также применение этого способа для лечения и/или профилактики заболеваний, характеризующихся отложениями амилоида. Изобретение также относится к способам получения полипептидов, которые можно использовать в указанном способе, а также к модифицированным пептидам как таковым. Также в настоящее изобретение включены фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированные полипептиды, а также векторы, включающие в себя указанные фрагменты нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева и клеточные линии, трансформированные ими. Наконец, в данном изобретении предоставлен новый тип иммуногена на основе конъюгированных пептидов.

Предпосылки изобретения

Амилоидоз представляет собой внеклеточное накопление нерастворимых пептидных фибрилл, приводящее к повреждению тканей и заболеванию (Рерук, 1996; Тап с1 а1., 1995; Ке11у, 1996). Фибриллы формируются, когда растворимые в норме белки и пептиды самопроизвольно ассоциируются аномальным образом (Ке11у, 1997). Амилоид ассоциирован с серьезными заболеваниями, включая системный амилоидоз, АО, диабет взрослых, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, фронто-темпоральную деменцию и связанные с прионами передающиеся губчатые энцефалопатии (куру и болезнь КрейцфельдтаЯкоба у человека и скрэпи и В8Е у овец и крупного рогатого скота, соответственно), и формирование амилоидных бляшек, например, при болезни Альцгеймера, по-видимому, тесно связано с прогрессированием заболевания у человека. На животных моделях показано, что избыточная экспрессия или экспрессия модифицированных форм белков, обнаруженных в отложениях, таких как белок β-амилоид, вызывают различные симптомы заболевания, например, подобные симптомам при болезни Альцгеймера. Специфического лечения накопления амилоида не существует, и такие заболевания, как правило, приводят к смертельному исходу.

Субъединицы фибрилл амилоида могут представлять собой белки дикого типа, измененные или укороченные белки, и подобные фибриллы можно формировать ίη νίίτο из олигопептидов и денатурированных белков (ВтабЬшу еί а1., 1960; ЕйкЫе еί а1., 1964; Вигке & Иои^зе, 1972). Характер амилоидоза определяет природа полипептидного компонента фибрилл. Несмотря на большие различия в размере, нативной структуре и функции амилоидных белков, все амилоидные фибриллы представляют собой фибриллы неопределенной длины, неразветвленные, имеющие в диаметре от 70 до 120 А и характерно окрашивающиеся конго красным (Рерук, 1996). Они представляют собой характерную складчатую βструктуру, в которой полипептидная цепь уложена в β-слои. Хотя амилоидные белки обладают чрезвычайно разнообразными структурами предшественников, все они могут подвергаться структурной конверсии, возможно, по сходному пути, в неправильно уложенную форму, которая представляет собой строительный блок протофиламента спирали β-слоя.

Данная характерная фибриллярная форма приводила к амилоидозам, называемым β-фибриллезами (С1еппет, 1980а, Ь), а фибриллярный белок АО, до того как узнали его вторичную структуру, называли βбелком (61еппет & \Уопд. 1984). Характерная дифракционная картина перекрестных р-структур, вместе с появлением фибрилл и свойствами при окраске в настоящее время представляют собой общепринятые диагностические признаки амилоида и означают, что фибриллы, хотя и сформированы из совершенно разных белковых предшественников, обладают определенным структурным сходством и составляют структурное надсемейство, безотносительно к природе их белков-предшественников (8ип6е М., 8егре11 Ь.С., Вагбаш М., Етакет Р.Е., Рерук М.В., В1аке ССЕ1 Мо1. Βΐο1. 1997 Οοί 31; 273 (3): 729-739).

Одно из наиболее широко распространенных и хорошо известных заболеваний представляет собой АО, где, как предполагают, центральной ролью в развитии заболевания является отложение амилоида в центральной нервной системе.

Αϋ

Болезнь Альцгеймера (АО) представляет собой необратимое, прогрессирующее расстройство головного мозга, которое происходит постепенно и приводит к потере памяти, изменениям в поведении и личности и снижению умственных способностей. Такие потери связаны с гибелью клеток головного мозга и разрушению связей между ними. Течение заболевания, как и степень деградации варьируют от человека к человеку. В среднем пациенты с АО после установления диагноза живут от 8 до 10 лет, хотя болезнь может длиться и до 20 лет.

АО прогрессирует по стадиям, от ранней умеренной забывчивости до тяжёлой потери умственной деятельности. Такая потеря известна как деменция. У большинства людей с АО первые симптомы появляются после 60 лет, но не редки более ранние возрасты начала. Самые ранние симптомы часто включа- 1 007533 ют в себя потерю кратковременной памяти, ложное суждение и личностные изменения. Часто люди на начальных стадиях АО мыслят менее ясно и забывают имена близких родственников и названия обычных вещей. Позже, при развитии болезни, они могут забывать, как выполнять даже простые задачи. В итоге, люди с АО полностью теряют способность к мышлению и становятся зависимыми от других людей из-за необходимости ежедневного ухода за ними. В конечном счете, болезнь так ослабляет силы, что пациенты становятся прикованными к постели, и возрастает вероятность развития других заболеваний и инфекции. Как правило, люди, страдающие АО, умирают от пневмонии.

Несмотря на то, что риск развития АО увеличивается с возрастом, симптомы АО и деменции не являются частью нормального старения. АО и другие приводящие к слабоумию заболевания вызываются заболеваниями, влияющими на мозг. При нормальном старении нервные клетки головного мозга в большом количестве не разрушаются. В отличие от этого, при АО разрушаются три ключевых процесса: связь, метаболизм и восстановление нервных клеток. Такое разрушение, в конечном счете, вызывает остановку функционирования многих нервных клеток, потерю связей с другими нервными клетками и смерть.

Вначале АО разрушает нейроны в частях головного мозга, контролирующих память, главным образом, в гиппокампе и связанных структурах. По мере того как клетки в гиппокампе, по существу, прекращают функционирование, ослабевает краткосрочная память, и зачастую способность субъекта выполнять простые и привычные задачи начинает снижаться. АО также воздействует на кору головного мозга, особенно в областях, отвечающих за речь и мышление. В конечном счете, вовлекаются и другие области головного мозга, все эти области головного мозга атрофируются (сокращаются), и пациенты с АО становятся прикованными к постели, не способными к самоконтролю, полностью беспомощными и невосприимчивыми к окружающему миру (источник: Νηΐίοηηΐ 1п5(11и(с оп Адшд Ргодгекк Верой оп АШюипег'к Όίδеаке, 1999).

Влияние Αϋ

АО представляет собой наиболее общую причину деменции у человека в возрасте 65 лет и старше. Она представляет собой большую проблему для здоровья по причине ее огромного влияния на индивидов, семьи, систему здравоохранения и общество в целом. Ученые подсчитали, что в настоящее время свыше 4 млн людей страдают от данного заболевания, и частота заболевания у тех индивидов, кому более 65 лет, удваивается каждые 5 лет. Также предполагают, что каждый год возникнет примерно 360000 новых случаев (инцидент), хотя эта цифра будет увеличиваться по мере старения населения (Вгооктеуег е! а1., 1998).

АО накладывает тяжелое экономическое бремя на общество. В последнем исследовании в Соединенных Штатах рассчитали, что ежегодная стоимость лечения одного пациента с АО представляет собой $18408 для пациента со слабой АО, $30096 - для пациента с умеренной АО и $36132 - для пациента с тяжелой АО. Подсчитано, что ежегодные государственные расходы в США на лечение пациентов с АО составляют немногим больше $50 миллиардов (Ьеоп е! а1., 1998).

Примерно 4 млн американцев находятся в возрасте 85 лет или более и в наиболее индустриализованных странах эта возрастная группа представляет собой одну из наиболее быстро растущих частей населения. Рассчитано, что данная группа к 2030 г. в США составит приблизительно 8,5 млн; некоторые эксперты, изучающие изменения населения предполагают, что данное число может даже являться большим. Так как все больше и больше людей живет дольше, число людей, пораженных заболеваниями, связанными с возрастом, включая АО, будет продолжать увеличиваться. Например, некоторые исследования показывают, что приблизительно половина из всех людей в возрасте 85 лет и старше обладают какой-либо формой слабоумия (№Шопа1 1п81йи1е оп Адшд Ргодгекк Верой оп АМюппег'к О18еа8е, 1999).

Основные характеристики Αϋ

Признаками АО являются две аномальные структуры в головном мозге: амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки (ΝΡΤ). Бляшки представляют собой плотные, почти совершенно нерастворимые накопления белка и клеточного вещества вне и вокруг нейронов головного мозга. Клубки представляют собой нерастворимые переплетенные волокна, накапливающиеся внутри нейронов.

Существует две формы АО: семейная АО (РАО), которая подчиняется определенному типу наследования, и спорадическая АО, для которой не наблюдается очевидного типа наследования. По причине различий в начале заболевания АО дополнительно описывают как заболевание с ранним началом (возникающее у человека моложе 65 лет) и с поздним началом (возникающее у человека 65 лет и старше). АО с ранним началом случается редко (примерно 10% случаев) и, как правило, поражает людей в возрасте от 30 до 60 лет. Некоторые формы АО с ранним началом являются наследственными и поражают членов семей. АО с ранним началом также часто прогрессирует быстрее, чем более частая форма с поздним началом.

Все РАО, известные до настоящего времени, характеризуются ранним началом, а в настоящее время известно, что до 50% случаев РАО вызваны дефектами в трех генах, расположенных на трех разных хромосомах. Они представляют собой мутации в гене АРР на хромосоме 21; мутации в гене, называемом пресенилин-1, на хромосоме 14 и мутации в гене, называемом пресенилин-2, на хромосоме 1. Однако пока нет доказательств того, что какая-либо из этих мутаций играет основную роль в более частой, спо

- 2 007533 радической или несемейной форме АО с поздним началом (Ναΐίοηαΐ 1и5!йи!е оп Ащпд Ргодгезз Керой оп АНйетег'з О1зеазе, 1999).

Амилоидные бляшки

При АО амилоидные бляшки вначале развиваются в областях головного мозга, связанных с памятью и другими когнитивными функциями. Они состоят из почти совершенно нерастворимых накоплений бета-амилоида (в дальнейшем обозначаемом Ав, представляющего собой белковые фрагменты большего белка, называемого белком-предшественником амилоида (АРР, аминокислотная последовательность которого приведена далее в 8ЕЦ 10 N0:2), смешанного с частями нейронов и клеток, не являющихся нейронами, таких как микроглия и астроциты. Неизвестно, являются ли амилоидные бляшки как таковые основной причиной АО или они представляют собой побочный продукт процесса АО. Безусловно, как показано для наследуемой формы АО, вызываемой мутациями в гене АРР, изменения белка АРР могут вызывать АО, а формирование бляшек Ав представляется тесно ассоциированным с прогрессией заболевания у человека (Ирра С. Р. е! а1., 1998).

АРР

АРР представляет собой один из многих белков, связанных с клеточными мембранами. После его образования АРР встраивается в мембрану нервной клетки, располагаясь частично внутри и частично снаружи клетки. Последние исследования с использованием трансгенных мышей показали, что, повидимому, АРР играет важную роль в росте и выживании нейронов. Например, определенные формы и количества АРР могут защитить нейроны и от краткосрочного, и от длительного повреждения, а также могут приводить поврежденные нейроны в состояние с лучшей способностью к самовосстановлению и помогают частям нейронов расти после травмы головного мозга.

Пока АРР встроен в клеточную мембрану, на особые участки АРР действуют протеазы, расщепляя его на белковые фрагменты. Одна протеаза помогает расщепить АРР, с образованием Ав, а другая протеаза расщепляет АРР посередине амилоидного фрагмента, так, что Ав не может сформироваться. Фрагмент Ав сформирован из двух различных частей, более короткого Ав длиной 40 (или 41) аминокислот, который является относительно растворимым и медленно агрегирует, и немного более длинного липкого Ав, длиной 42 аминокислоты, который быстро образует нерастворимые агрегаты. Пока Ав формируется, еще точно неизвестно, как он движется через нервные клетки или вокруг них. На финальной стадии процесса липкий Ав агрегирует в длинные филаменты снаружи клетки и вместе с фрагментами отмерших или отмирающих нейронов и микроглией с астроцитами формирует бляшки, характеризующие АО в ткани головного мозга.

Существуют некоторые доказательства, что мутации в АРР становятся более вероятными, когда от предшественника АРР отрежется Ав, таким образом вызывая образование или больших количеств общего Ав, или относительно больших количеств «липкой» формы. Также обнаружили, что мутации в генах пресенилина могут вносить вклад в дегенерацию нейронов по меньшей мере двумя путями: посредством модификации продукции Ав или посредством запуска клеточной смерти более непосредственно. Другие исследования наводят на мысль, что мутированные пресенилины 1 и 2 могут быть вовлечены в возрастающую скорость апоптоза.

Полагают, что Ав токсичен для нейронов. В исследованиях на культуре ткани исследователи обнаружили увеличение смерти нейрональных клеток гиппокампа, сконструированных для повышенной экспрессии мутантных форм АРР человека по сравнению с нейронами с повышенной экспрессией нормального АРР человека (Ьио е! а1., 1999).

Кроме того, повышенная экспрессия или экспрессия модифицированных форм белка Ав, как показано на животных моделях, вызывает симптомы, подобные симптомам при болезни Альцгеймера (Нз1ао К. е! а1., 1998).

На основании данных о том, что увеличенное образование Ав, его агрегация в бляшки и результирующая нейротоксичность могут вести к АО, исследование состояний, в которых агрегацию Ав в бляшки можно снизить или даже блокировать, представляет интерес для лечения.

Пресенилины

Мутации в пресенилине-1 (8-180) отвечают почти за 50% всех случаев семейной АО с ранним началом (РАО). Идентифицировано около 30 мутаций, приводящих к АО. Начало АО варьирует, в зависимости от мутаций. Мутации в пресенилине-2 отвечают за гораздо меньшую часть случаев РАО, но тем не менее представляют собой значимый фактор. Вовлечены ли пресенилины в спорадическую несемейную АО, неизвестно. Функция пресенилинов неизвестна, но они оказываются вовлечены в процессинг АРР с получением Ав-42 (более длинная липкая форма пептида, 8ЕЦ ГО N0:2, остатки 673-714), так как пациенты с АО с мутациями в пресенилине имеют повышенные уровни данного пептида. Играют ли также пресенилины роль при индукции образования ΝΤΡ, неясно. Некоторые данные позволяют предположить, что пресенилины также могут обладать более непосредственной ролью в дегенерации и смерти нейронов. Пресенилин-1 расположен на хромосоме 14, в то время как пресенилин-2 сцеплен с хромосомой 1. Если субъект несет мутированную версию хотя бы одного из этих генов, у него или у нее почти достоверно разовьется АО с ранним началом.

- 3 007533

Несколько неясно, является ли пресенилин-1 идентичным гипотетической γ-секретазе, вовлеченной в процессинг АРР (Ыагиве с1 а1., 1998).

Аполипопротеин Е

Аполипопротеин Е обычно ассоциирован с холестерином, но его также находят в бляшках и клубках в головном мозге при АО. Несмотря на то, что аллели 1-3 представляются не вовлеченными в АО, существует значимая корреляции между присутствием аллеля ΑΡΟΕ-ε4 и развитием АО с поздним началом (81г|Цша11ег е1 а1., 1993). Однако это представляет собой фактор риска, а не прямую причину как в случае мутаций пресенилина и АРР, и это не ограничено семейной АО.

Пути, при которых в связи с белком АРОЕ-е4 увеличивается вероятность развития АО, достоверно не известны, но одна возможная теория состоит в том, что он облегчает накопление Ав, и это способствует уменьшению возраста начала АО, или присутствие или отсутствие конкретных аллелей АРОЕ может влиять на способ, которым нейроны отвечают на повреждение (ΒιιΙΙίπί е1 а1., 1999).

Показано, что Аро А1 также является амилоидогенным. Интактный аро А1 ίη νΐίτο самостоятельно может формировать фибриллы, подобные амилоиду, окрашивающиеся конго красным (Ат 1 Ра11ю1 147 (2): 238-244 (Аид 1995), А18П1е^8к1 Т, Оо1аЬек АА, К1ба Ε, А18П1е^8к1 ΚΕ, Етапдюпе В).

По-видимому, существуют противоречивые результаты, указывающие на то, что имеют место положительные эффекты аллеля АРОЕ-е4 в отношении уменьшения симптомов ментальной потери по сравнению с другими аллелями (§1етп, Втапб!, 1997, Аппак οί №ито1оду 41).

Нейрофибриллярные клубки

Этот второй признак АО заключается в аномальном накоплении перекрученных нитей, обнаруживаемых внутри нервных клеток. Главный компонент клубков представляет собой одну из форм белка, называемого тау (τ). В центральной нервной системе тау-белки наиболее известны своей способностью связываться с микротрубочками, представляющими собой одну из составляющих внутренней поддерживающей структуры клетки, или цитоскелет, и помогать им стабилизироваться. Однако при АО тау-белки изменены химически, и такие измененные тау-белки больше не способны стабилизировать микротрубочки, являясь причиной их дезинтеграции. Такое разрушение транспортной системы может вначале привести к нарушению связей между нервными клетками, а позже может привести к смерти нейронов.

При АО химически измененные тау-белки переплетаются в парные спиральные филаменты, представляющие собой две нити тау-белков, накрученных одна вокруг другой. Эти филаменты представляют собой основное вещество, обнаруживаемое в нейрофибриллярных клубках. В одном недавнем исследовании были обнаружены нейрофибриллярные изменения менее чем в 6% нейронов в определенной части гиппокампа в головном мозге здоровых, более чем в 43% этих нейронов у людей, умерших от умеренной АО, и в 71% этих нейронов у людей, умерших от тяжелой АО. Когда изучали гибель нейронов, обнаружили сходную прогрессию. Доказательства такого типа поддерживают идею о том, что формирование клубков и гибель нейронов прогрессируют вместе в процессе АО (Иайопа1 1п8111и(е оп Адшд Ртодтезв Верой оп А1/11еппег'5 О18еа8е, 1999).

Таупатии и клубки

Тяжелые нейродегенеративные заболевания, отличающиеся от АО, характеризуются агрегацией тау-белков в нерастворимые филаменты в нейронах и глии, приводящие к дисфункции и смерти. Совсем недавно несколько групп исследователей, изучавших семьи с различными видами наследуемого слабоумия, отличающегося от АО, обнаружили первую мутацию в гене тау-белка на хромосоме 17 (С1агк е1 а1., 1998; Нийоп е! а1., 1998; Роотка.) е! а1., 1998; 8рШапйш е! а1., 1998). В этих семьях мутации в гене таубелка вызывают смерть нейронов и слабоумие. Такие расстройства, разделяющие некоторые из характеристик с АО, но отличающиеся в некоторых важных аспектах, собирательно называют «фронтотемпоральное слабоумие и паркинсонизм, сцепленные с хромосомой 17» (ΕΊΌΡ-17). Они представляют собой заболевания, такие как болезнь Паркинсона, некоторые формы амиотрофического бокового склероза (АЬЗ), кортикобазальную дегенерацию, прогрессирующие супрануклеарный паралич и болезнь Пика, все из которых характеризуются аномальным накопление тау-белка.

Другие неврологические заболевания, подобные Αϋ

Существуют важные параллели между АО и другими неврологическими заболеваниями, включая прионные заболевания (такие как куру, болезнь Крейцфельдта-Якоба и бычий губчатый энцефалит), болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона и фронто-темпоральную деменцию. Все они связаны с накоплением в головном мозге аномальных белков. И АО, и прионные заболевания вызывают слабоумие и смерть и ассоциированы с формированием нерастворимых фибрилл амилоида, но из мембранных белков, отличающихся друг от друга.

Ученые, изучающие болезнь Паркинсона, второе наиболее частое расстройство после АО, выявили первый ген, сцепленный с данным заболеванием. Этот ген кодирует белок, называемый синуклеин, который, что интересно, также обнаружен в амилоидных бляшках головного мозга пациентов с АО (Батебап С, 1998, Оепоте Вее. 8 (9): 871-80). Исследователи также выявили, что генетические дефекты при болезни Гентингтона, в другом прогрессирующем нейродегенеративном заболевании, вызывающем слабоумие, служат причиной того, что белок Гентингтона образует нерастворимые фибриллы, очень сходные с

- 4 007533 фибриллами Αβ при АО и белковыми фибриллами при прионном заболевании (Зсйегаидег Е, с1 а1., 1999, ΡΝΑ8 И.8.А. 96 (8): 4604-9).

Ученые также выявили новый ген, который в мутантной форме отвечает за семейное слабоумие англичан (ΕΒΏ), редкое наследственное заболевание, вызывающее тяжелые двигательные нарушения и прогрессирующее слабоумие, подобное наблюдаемому при АО. При биохимическом анализе фибрилл амилоида, обнаруженных в бляшках при ΕΒΟ, найден новый пептид, названный АЬп (У1ба1 с1 а1., 1999). Мутация в особой точке в данном гене приводит к продукции более длинного, чем обычный, белка Βτί. Пептид АЬт1, который отрезается от мутантного конца белка Βτί, откладывается в виде фибрилл амилоида. Полагают, что такие бляшки ведут к нейрональной дисфункции и слабоумию, характеризующему ΕΒΟ.

Иммунизация Αβ

Иммунная система обычно принимает участие в очистке от чужеродных белков и белковых частиц в организме, но накопления, ассоциированные с указанными выше заболеваниями, главным образом, состоят из собственных белков, следовательно, интерпретация роли иммунной в контроле данных заболеваний менее очевидна. Кроме того, накопления расположены в отделах (ЦНС), обычно отделенных от иммунной системы, оба этих факта позволяют предположить, что любая вакцина или иммунотерапевтический подход окажутся безуспешными.

Тем не менее, ученые недавно попытались иммунизировать мышей вакциной, состоящей из гетерологического человеческого Ав и вещества, известного как стимулятор иммунной системы (8сйепк с1 а1., 1999 и \νϋ 99/27944). Вакцину тестировали в конкретной модели АО у трансгенных мышей с мутантным геном АРР человека, вставленным в ДНК мыши. У мышей по мере их старения продуцировался модифицированный белок АРР и развивались амилоидные бляшки. Данную мышиную модель использовали для тестирования возможного эффекта вакцинации против модифицированного трансгенного АРР человека на формирование бляшек. В первом эксперименте одной группе трансгенных мышей ежемесячно вводили инъекции вакцины, начиная с возраста в 6 недель и заканчивая в возрасте 11 недель. Вторая группа мышей не получала инъекций и служила контрольной группой. К возрасту 13 месяцев у мышей в контрольной группе наличествовали бляшки, охватывающие от 2 до 6% их головного мозга. Напротив, у иммунизированных мышей практически не было бляшек.

Во втором эксперименте ученые начинали проводить инъекции на 11 месяцев, когда некоторые бляшки уже развились. Через 7 месяцев контрольные трансгенные мыши имели в 17 раз большее количество бляшек в головном мозге, тогда как у мышей, получавших вакцину, происходило 99% уменьшение количества бляшек по сравнению с 18-месячными контрольными трансгенными мышами. Было обнаружено, что у некоторых мышей некоторые из предсуществующих отложений бляшек удалялись в результате лечения. Также обнаружили, что другие повреждения, ассоциированные с бляшками, такие как воспаление и аномальные процессы в нервных клетках, в результате иммунизации уменьшались.

Таким образом, указанное выше представляет собой предварительное исследование на мышах, и, например, ученым необходимо выяснить, остаются ли вакцинированные мыши здоровыми в других аспектах и нормально ли сохраняется память у вакцинированных мышей. Более того, так как мышиная модель не полностью отображает АО (у животных не развиваетсянейрофибриллярных клубков, и при этом многие из их нейронов не погибают), необходимы дополнительные исследования для определения того, обладает ли человек схожей с мышиной реакцией или реакцией, отличной от мышиной. Другая проблема для рассмотрения состоит в том, что способ, возможно, может «лечить» накопления амилоида, но не останавливать развитие слабоумия.

Технические проблемы также представляют собой большие сложности. Например, маловероятно, если вообще возможно, применение данного способа для создания вакцины, дающей возможность повысить у человека уровень антител против его собственных белков. Таким образом, перед тем как можно будет рассматривать какие-либо испытания на человеке, необходимо решить многочисленные проблемы безопасности и эффективности.

Таким образом, работа 8сйеик е1 а1. показывает, что если возможно вызывать сильный иммунный ответ к собственным белкам в белковых отложениях в центральной нервной системе, таких как бляшки, формирующиеся при АО, возможно и предотвратить формирование накоплений, и возможно также устранить уже сформированные бляшки.

В последнее время клинические попытки с применением обсуждаемых выше вакцин Ав ограничивались вследствие неблагоприятных эффектов: у ряда вакцинированных субъектов развивался хронический энцефалит, который мог возникать вследствие неуправляемого аутоиммунитета против Ав в ЦНС.

Цель изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление новых способов лечения состояний, таких как АО, характеризующихся накоплением амилоида. Дополнительная цель представляет собой разработку аутовакцины против амилоида для разработки нового способа лечения АО и других патологических расстройств, ассоциированных с отложением амилоида.

- 5 007533

Сущность изобретения

Здесь описано применение способа аутовакцинации для выработки сильных иммунных ответов против иначе неиммуногенных АРР и Ар. Также описано получение таких вакцин для профилактики, возможного лечения или ослабления симптомов заболеваний, ассоциированных с отложениями амилоида.

Таким образом, в своем широком и наиболее полном объеме, настоящее изобретение относится к способу понижающей регуляции белка-предшественника амилоида (АРР) или бета-амилоида (Ар) ίη νίνο у животных, включая человека, где способ включает в себя эффективную презентацию иммунной системе животного иммуногенно эффективного количества по меньшей мере одного аналога АРР или Ар, содержащего в одной молекуле по меньшей мере один В-клеточный эпитоп АРР и/или Ар и по меньшей мере один чужеродный Т-хелперный эпитоп (Т_н-эпитоп), так что иммунизация животного данным аналогом вызывает продукцию антител против аналогов АРР или Ар животного, где аналог

a) представляет собой полиаминокислоту, состоящую по меньшей мере из одной копии подпоследовательности остатков 672-714 в 8Еф ГО N0:2, где чужеродный Т_н-эпитоп вводят посредством добавления и/или вставки, и/или делеции, и/или замены аминокислот, где подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из остатков 1-42, остатков 1-40, остатков 1-39, остатков 1-35, остатков 1-34, остатков 1-28, остатков 1-12, остатков 1-5, остатков 13-28, остатков 13-35, остатков 17-28, остатков 25-35, остатков 35-40, остатков 36-42 и остатков 35-42 аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 673-714 8Еф ГО N0:2; и/или

b) представляет собой полиаминокислоту, содержащую чужеродный Т_н-эпитоп и разорванную последовательность АРР или Ар, так что аналог не содержит никакой подпоследовательности 8Еф ГО N0:2, продуктивно связывающейся с молекулами МНС класса II, инициируя Т-клеточный ответ; и/или

c) представляет собой полиаминокислоту, включающую в себя чужеродный Т_н-эпитоп и полученные из АРР или Ар аминокислоты, и включает в себя 1 единственный остаток метионина, расположенный на С-конце аналога, причем другие остатки метионина в АРР или Ар и в чужеродном Т_н-эпитопе замещены или удалены и предпочтительно замещены лейцином или изолейцином; и/или

к) представляет собой конъюгат, включающий в себя полигидроксиполимерный остов, к которому отдельно присоединена полиаминокислота, как определено в а), и/или полиаминокислота, как определено в Ь), и/или полиаминокислота, как определено в с); и/или

е) представляет собой конъюгат, включающий в себя полигидроксиполимерный остов, к которому отдельно присоединены 1) чужеродный Тн-эпитоп и 2) полиаминокислота, выбранная из группы, состоящей из подпоследовательностей, как определено в а), разорванной последовательности АРР или Ар, как определено в Ь), и полученную из АРР или Ар аминокислотную последовательность, включающую в себя 1 единственный остаток метионина, расположенный на С-конце, причем другие остатки метионина в АРР или Ар и в чужеродном Тн-эпитопе замещены или удалены и предпочтительно замещены лейцином или изолейцином.

Правопреемником настоящего изобретения ранее была подана международная патентная заявка, относящаяся к безопасным стратегиям вакцинации против амилоидогенных пептидов, таких как АРР или Ар, ср. Ш0 01/62284. Данная заявка не была опубликована на момент даты подачи настоящей заявки и, кроме того, не содержит деталей, относящихся к указанным выше пригодным аналогам АРР и Ар.

Изобретение также относится к аналогам АРР и Ар, также как к фрагментам нуклеиновых кислот, кодирующих их подмножество. Также изобретение относится к иммуногенным композициям, включающим в себя аналоги или фрагменты нуклеиновых кислот.

Описание фигур

Фиг. 1: Схематическое изображение вариантов АЩотас, извлеченных из белка-предшественника амилоида с целью вызова ответов с помощью антител против белка Ар Ар-43 (или С-100). АРР схематически показан вверху фигуры, а оставшиеся схематические конструкции показывают, что модельные эпитопы Р2 и Р30 замещают различные укороченные продукты АРР или вставлены в них. На фигуре черный блок означает сигнальную последовательность АРР, косая штриховка в двух направлениях означает экстрацеллюлярный участок АРР, темная вертикальная штриховка соответствует трансмембранному домену АРР, светлая вертикальная штриховка соответствует внутриклеточному домену АРР, жирная косая штриховка означает эпитоп Р30 и тонкая косая штриховка означает эпитоп Р2. Рамка из сплошных линий означает Ар-42/43, а рамка из сплошных линий совместно с рамкой из пунктирных линий означают С-100. «АЬе1а» обозначает Ар.

Фиг. 2: Схематическое изображение осуществления синтеза применяемых в большинстве случаев иммуногенных конъюгатов. Синтезируют и смешивают пептид А (любая антигенная последовательность, например, последовательность Ар, описанная здесь) и пептид В (аминокислотная последовательность, включающая в себя Т-хелперный эпитоп). После того, как они приходят в контакт с подходящим активированным полигидроксиполимером, пептиды А и В присоединяются посредством активной группы в соотношении, соответствующем начальному соотношению между данными двумя веществами в

- 6 007533 смеси пептидов. Для подробностей см. пример 4.

Подробное описание изобретения

Определения

Далее будет определен и подробно объяснен ряд терминов, применяющихся в данном описании и формуле изобретения, для прояснения границ и пределов изобретения.

Термины амилоид и амилоидный белок, применяемые здесь, являются взаимозаменяющими и означают класс белковых неразветвленных фибрилл неопределенной длины. Фибриллы амилоида обнаруживают способность к окраске конго красным и обладают складчатой β-структурой, в которой полипептидные цепи организованы β-слои. Амилоид, как правило, происходит из амилоидогенных белков, которые обладают сильно различающимися структурами предшественников, но все из которых могут подвергаться структурной конверсии в аномально уложенную форму, представляющую собой строительный блок протофиламента спирали β-слоя. Обычно диаметр фибрилл амилоида изменяется примерно от 70 до 120 А.

Термин «амилоидогенный белок» предназначен для обозначения полипептида, вовлеченного в образование отложений амилоида, или, по существу, являющегося частью отложений или являющегося частью биосинтетического пути, приводящего к образованию отложений. Итак, примерами амилоидогенных белков являются АРР и Ав, но амилоидогенными белками также могут считаться и белки, вовлеченные в их метаболизм.

«Амилоидный полипептид» здесь предназначен для обозначения полипептидов, включающих в себя аминокислотную последовательность обсуждаемых выше амилоидогенных белков, происходящих от человека или других млекопитающих (или их укороченные варианты, разделяющие с интактным амилоидогенным белком существенное количество В-клеточных эпитопов), следовательно, амилоидогенный полипептид может, например, включать в себя существенный участок предшественника амилоидогенного полипептида (в случае Ав один из возможных амилоидных полипептидов может происходить из АРР). Также данный термин включает в себя негликозилированные формы амилоидогенных полипептидов, получаемых в прокариотических системах, а также формы с различными профилями гликозилирования из-за применения, например, дрожжей или других эукариотических зкспрессирующих систем, не принадлежащих к млекопитающим. Однако необходимо отметить, что когда применяют термин амилоидогенный полипептид, это означает, что рассматриваемый полипептид при презентации животным, подвергаемым воздействию, обычно является неиммуногенным. Другими словами, амилоидогенный полипептид представляет собой собственный белок или аналог такого собственного белка, который обычно не дает начало иммунному ответу против амилоидогенного белка рассматриваемого животного.

«Аналог» представляет собой молекулу, полученную из АРР или Ав, содержащую одно или несколько изменений в своей молекулярной структуре. Такое изменение, например, можно произвести при слиянии полиаминокислот АРР или Ав с подходящим для слияния партнером (т.е. изменение в первичной структуре, исключительно включающее в себя С- и/или Ν-концевые добавки аминокислотных остатков) и/или можно производить в виде вставок и/или делеций и/или замен аминокислотной последовательности полипептида. Также в термин включены дериватизированные молекулы, полученные из АРР или Ав, ср. обсуждение модификаций АРР или Ав ниже. В некоторых случаях аналог можно сконструировать с тем, чтобы уменьшить или даже исключить способность вызывать появление антител против нормального белка(ов)-предшественника(ов) амилоида, таким образом избегая нежелательного взаимодействия с (физиологически нормальной) неагрегированной формой полипептида, являющегося предшественником амилоидного белка.

Необходимо отметить, что, как предполагается, применение в качестве вакцины для человека чужеродного аналога (например, собачьего или свиного аналога) АРР или Ав человека создаст желательный иммунитет против АРР или Ав. Такое применение чужеродного аналога также рассматривается как часть изобретения.

Термин «полипептид» в настоящем контексте предназначен для обозначения и коротких пептидов от 2 до 10 аминокислотных остатков, и олигопептидов от 11 до 100 аминокислотных остатков, и полипептидов из более чем 100 аминокислотных остатков. Более того, также предполагается, что данный термин охватывает белки, т. е. функциональные биологические молекулы, включающие в себя по меньшей мере один полипептид; когда такие биологические молекулы содержат по меньшей мере два полипептида, последние могут формировать комплексы, быть ковалентно связанными или могут быть связанными нековалентно. Полипептид(ы) в белке могут быть гликозилированными и/или липоилированными, и/или включать в себя простетические группы. Термин «полиаминокислота» также эквивалентен термину «полипептид».

Термины «Т-лимфоцит» и «Т-клетка» применяют попеременно для лимфоцитов, происходящих из тимуса, отвечающих за различные виды иммунного ответа, опосредованного клетками, а также за хелперную активность в гуморальном иммунном ответе. Подобным образом термины В-лимфоцит и Вклетка применяют попеременно для лимфоцитов, продуцирующих антитела.

Термин «подпоследовательность» означает любой непрерывный отрезок по меньшей мере из 3 ами

- 7 007533 нокислот или, когда уместно по меньшей мере из 3 нуклеотидов, непосредственно полученной из природных аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновых кислот амилоида, соответственно.

Термин «животное» в настоящем контексте, как правило, предназначен для обозначения вида животного (предпочтительно млекопитающего), такого, как Ното харюпх. Сашк ботсхбсих и т.п., а не только одного-единственного животного. Однако этот термин также означает популяцию такого вида животных, поскольку важно, чтобы все индивиды, иммунизированные способом согласно настоящему изобретению, обладали, по существу, одинаковыми АРР или Ав, если принять во внимание иммунизацию животных одним и тем же иммуногенным(ми) средством(ами). Специалистам ясно, что животное в настоящем контексте представляет собой живое существо с иммунной системой. Предпочтительно, чтобы животное являлось позвоночным, таким как млекопитающее.

Под термином «понижающая регуляция АРР или Ав ίη νίνο» здесь подразумевают уменьшение в живом организме общего количества накопленного амилоидного белка (или амилоида как такового) подходящего типа. Понижающую регуляцию можно получить посредством нескольких механизмов, из которых простое взаимодействие с амилоидом посредством связывания антител, так, чтобы предотвратить аномальную агрегацию, представляет собой наиболее простой. Однако в объем настоящего изобретения также входит то, что связывание антител приводит к удалению амилоида поглощающими клетками (такими как макрофаги и другие фагоцитирующие клетки) и что антитела взаимодействуют с другими амилоидогенными полипептидами, приводящими к образованию амилоида. Дополнительной возможностью является то, что антитела связывают Ав вне ЦНС, таким образом удаляя Ав из ЦНС посредством простого принципа действия масс.

Выражение «эффективная презентация . . . иммунной системе» предназначено для обозначения того, что иммунная система животных в контролируемом режиме подвергается иммуногенной провокации иммунного ответа. Как станет ясно из описания ниже, такую провокацию ответа иммунной системы можно провести рядом способов, наиболее важные из которых представляют собой вакцинацию полипептидом, содержащим «фармацины» (т.е. вакцину, которую вводят для лечения текущей болезни или улучшения состояния при этой болезни) или вакцинацию нуклеиновой кислотой, содержащей «фармацины». Важным результатом для достижения является то, чтобы иммунокомпетентные клетки животного противостояли антигену иммунологически эффективным способом, тогда как точный способ достижения такого результата является менее важным для идеи согласно изобретению, лежащей в основе настоящего изобретения.

Термин «иммуногенно эффективное количество» имеет смысл, обычно принятый в данной области, т.е. он означает количество иммуногена, которого достаточно для индукции иммунного ответа, значимо охватывающего патогенные вещества, разделяющие общие иммунологические свойства с иммуногеном.

Когда говорят, что АРР или Ав «модифицированы», здесь это означает, что проводили химическую модификацию полипептида АРР или Ав. Такая модификация может представлять собой получение производных (например, алкилирование) определенных аминокислотных остатков в последовательности, но как можно будет понять из описания ниже, предпочтительные модификации включают в себя изменения первичной структуры аминокислотной последовательности.

Когда обсуждают аутотолерантность к АРР или Ав, понятно, что так как полипептид представляет собой собственный белок популяции, подлежащей вакцинации, у обычных индивидов в популяции не возникает иммунного ответа против полипептида; однако это нельзя исключить, так как редко встречающиеся в популяции животных индивиды могут быть способны продуцировать антитела к нативному полипептиду, например, как часть аутоиммунного расстройства. Во всяком случае, животное обычно аутотолерантно только к своему собственному АРР или Ав, однако нельзя исключать, что данное животное также явится толерантным к аналогам, полученным от другого вида животных или из популяции с другим фенотипом.

«Чужеродный Т-клеточный эпитоп (или «Чужеродный Т-лимфоцитарный эпитоп») представляет собой пептид, способный связываться с молекулой МНС и стимулирующий Т-клетки у вида животных. Предпочтительные чужеродные Т-клеточные эпитопы представляют собой смешанные эпитопы, т.е. эпитопы, связывающиеся основной частью молекул МНС конкретного класса у вида животных или популяции. Известно только очень ограниченное количество таких смешанных Т-клеточных эпитопов, и они подробно обсуждаются ниже. Смешанные Т-клеточные эпитопы также обозначают как универсальные Т-клеточные эпитопы. Необходимо отметить, что для иммуногенов, применяемых согласно настоящему изобретению, чтобы являться эффективными как можно в большей части популяции животных, могут быть необходимы 1) вставка нескольких чужеродных Т-клеточных эпитопов в один и тот же аналог или 2) получение нескольких аналогов, где каждый из аналогов обладает различным вставленным смешанным эпитопом. Необходимо также отметить, что идея о чужеродных Т-клеточных эпитопах также включает в себя применение скрытых Т-клеточных эпитопов, т. е. эпитопов, полученных из собственных белков и вызывающих иммунологическую реакцию только тогда, когда они существуют в изолированной форме, не являясь частью рассматриваемого собственного белка.

- 8 007533 «Чужеродный Т-хелперный лимфоцитарный эпитоп» (чужеродный Т_н-эпитоп) представляет собой чужеродный Т-клеточный эпитоп, который связывается с молекулой МНС класса II и который может быть представлен на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АРС) в связанном с молекулой МНС класса II виде.

«Функциональный участок» (биологической) молекулы в настоящем контексте означает участок молекулы, отвечающий по меньшей мере за один из биохимических или физиологических эффектов, вызываемых молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы обладают активным участком, отвечающим за эффекты, вызываемые рассматриваемой молекулой. Другие участки молекулы могут служить для целей стабилизации или улучшения растворимости, и поэтому их можно удалить, если данные цели не имеют значения в контексте определенного осуществления настоящего изобретения. Например, в АРР или Ав возможно применение определенных цитокинов как модифицирующих групп (ср. подробную дискуссию ниже), и в таком случае проблема стабильности может являться несущественной, так как связывание с АРР или Ав может обеспечивать необходимую стабильность.

Термин «адъювант» имеет то же значение, которое является общепринятым в области технологии вакцин, т.е. вещество или композиция веществ, которая 1) не способна самостоятельно вызвать специфический иммунный ответ против иммуногена вакцины, но которая, 2) тем не менее, способна усилить иммунный ответ против иммуногена. Или, другими словами, вакцинация одним адъювантом не обеспечивает иммунный ответ против иммуногена, вакцинация иммуногеном может или не может дать начало иммунному ответу против иммуногена, но комбинированная вакцинация иммуногеном и адъювантом вызывает иммунный ответ на иммуноген, который сильнее, чем вызванный одним иммуногеном.

«Позиционирование, или нацеливание» молекулы в настоящем контексте предназначено для обозначения ситуации, когда молекула при введении животному предпочтительно появляется в определенной(ых) ткани(ях) или предпочтительно ассоциирована с определенными клетками или клеточными типами. Эффекта можно достичь рядом способов, включая формирование молекулы в композицию, облегчающую позиционирование, или введением в молекулу групп, облегчающих позиционирование. Данные проблемы подробно обсуждаются ниже.

Стимуляция иммунной системы означает, что вещество или композиция веществ проявляет общий, неспецифический иммунностимулирующий эффект. Ряд адъювантов и предполагаемые адъюванты (такие как определенные цитокины) обладают способностью стимулировать иммунную систему. Результат применения иммуностимулирующих средств представляет собой повышенную «готовность» иммунной системы, означающую, что совместная или последующая иммунизация иммуногеном вызывает значительно более эффективный иммунный ответ в сравнении с отдельным применением иммуногена.

«Продуктивное связывание» означает связывание пептида с молекулой МНС (класса I или II), чтобы было возможно стимулировать Т-клетки, которые связываются с клетками, презентирующими пептид, связанный с молекулой МНС. Например, пептид, связанный с молекулой МНС класса II на поверхности АРС, является продуктивно связанным, если данная АРС стимулирует Тн-клетки, связывающиеся с комплексом презентированный пептид-МНС класса II.

Предпочтительные осуществления понижающей регуляции амилоида

Предпочтительно, чтобы применяемый в качестве иммуногена в способе согласно изобретению аналог представлял собой модифицированную молекулу АРР или Ав, где присутствует по меньшей мере одно изменение в аминокислотной последовательности АРР или Ав, так как в данном случае шансы получения очень значительного нарушения аутотолерантности сильно облегчены, что очевидно, например, из результатов, представленных здесь в примере 2, где иммунизацию диким типом Ав сравнивают с иммунизацией вариантной молекулой Ав. Показано (у Эа1ит I с1 а1., 1996, I. Тштипо! 157: 4796-4804), что потенциально аутоиммунные В-лимфоциты, распознающие собственные белки, физиологически присутствуют у нормальных индивидов. Однако для индукции этих В-лимфоцитов для фактической продукции антител, реагирующих с подходящими собственными белками, необходимо содействие продуцирующих цитокины Т-хелперных лимфоцитов (Тн-клетки, или Тн-лимфоциты). Обычно такая помощь не обеспечивается, т. к. Т-лимфоциты, как правило, не распознают Т-клеточные эпитопы, полученные из собственных белков, когда они представлены антигенпрезентирующими клетками (АРС). Однако, если обеспечить элемент чужеродности в собственном белке (т.е. ввести иммунологически значимую модификацию), Т-клетки, распознающие чужеродный элемент, активируются при распознавании чужеродного эпитопа на АРС (прежде всего, такой, как мононуклеарная клетка). Поликлональные В-лимфоциты (также являющиеся АРС), способные к распознаванию собственных эпитопов на модифицированных собственных белках, также интернализуют антиген и впоследствии представляют чужеродный(е) Т-эпитоп(ы) из него, а активированные Т-лимфоциты таким аутоиммунным поликлональным В-лимфоцитам впоследствии обеспечивают помощь цитокинами. Так как антитела, продуцируемые данными поликлональными В-лимфоцитами, реагируют с различными эпитопами на модифицированном полипептиде, включая те, которые также представлены на нативном полипептиде, индуцируется антитело, перекрестно реагирующее с немодифицированным собственным белком. В заключение, Т-лимфоциты могут быть при

- 9 007533 ведены в действие так, как если бы популяция поликлональных В-лимфоцитов распознавала бы полностью чужеродный антиген, тогда как фактически только встроенный(е) эпитоп(ы) является(ются) чужеродным(и) для хозяина. Таким образом, индуцируются антитела, способные к перекрестной реакции с немодифицированными собственными антигенами.

В данной области известно несколько путей модификации собственного антигена пептида для достижения нарушения аутотолерантности. Но все-таки предпочтительно, чтобы аналог согласно настоящему изобретению включал в себя по меньшей мере одну первую введенную группу, нацеливающую модифицированную молекулу на антигенпрезентирующую клетку (АРС), и/или по меньшей мере одну вторую введенную группу, стимулирующую иммунную систему, и/или по меньшей мере одну третью введенную группу, оптимизирующую представление аналога иммунной системе.

Однако все эти модификации следует производить пока в АРР или Аβ сохраняется существенная часть исходных В-клеточных эпитопов, так как распознавание В-лимфоцитами нативной молекулы, таким образом усиливается.

В одном из предпочтительных осуществлений ковалентно или нековалентно введены боковые группы (в виде чужеродных Т-клеточных эпитопов или указанных выше первой, второй и третьей групп). Это означает, что ответвления из аминокислотных остатков, полученные из АРР или Аβ, дериватизированы без изменения первичной аминокислотной последовательности или, по меньшей мере, без внесения изменений в пептидных связях между индивидуальными аминокислотами в цепи.

В альтернативном и предпочтительном осуществлении применяют аминокислотную замену и/или делецию, и/или вставку, и/или добавление (которые можно провести посредством рекомбинантных способов или посредством пептидного синтеза; модификации, включающие в себя более длинные участки из аминокислот, могут приводить к образованию гибридных полипептидов). Одну из особенно предпочтительных версий данного осуществления представляет собой технология, описанная в \УО 95/05849, где описан способ понижающей регуляции собственных белков путем иммунизации аналогами собственных белков, где участок аминокислотной последовательности (ряд последовательностей) заменен соответствующим участком аминокислотной последовательности(ей), каждый из которых содержит чужеродный иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп, тогда как одновременно в аналоге сохраняется полная третичная структура собственного белка. Однако для целей настоящего изобретения существенно, если модификация (будь она вставкой, добавлением, делецией или заменой) приводит к образованию чужеродного Т-клеточного эпитопа и одновременно сохраняет значительное количество В-клеточных эпитопов в АРР или Аβ. Однако для получения максимальной эффективности в индукции иммунного ответа предпочтительно, чтобы в модифицированной молекуле сохранялась полная третичная структура АРР или Λβ.

В некоторых случаях предпочтительно, чтобы АРР или Аβ, или их фрагменты являлись мутантными. Особенно предпочтительными являются варианты замен, где метионин в положении 35 в Аβ-43 замещен, предпочтительно лизином или изолейцином или просто делетирован. Особенно предпочтительные аналоги содержат один-единственный метионин, расположенный на С-конце, или потому, что он встречается в амилоидогенном полипептиде или чужеродном Т_н-эпитопе от природы, или потому, что его туда вставили или добавили. Следовательно, также предпочтительно, чтобы участок аналога, включающий Тн-эпитоп, также не содержал метионина, исключая возможное С-концевое расположение метионина.

Основная причина для удаления всех метионинов, кроме одного, состоит в том, что становится возможным рекомбинантно получать полимерные аналоги, которые можно последовательно отщеплять бромцианом с выходом отдельного аналога. Преимущество состоит в том, что рекомбинантная продукция облегчает данный путь.

Фактически, как правило, предпочтительно, чтобы все аналоги АРР или Аβ, применяемые согласно настоящему изобретению, обладали характерной чертой простого включения в себя одногоединственного метионина, расположенного в аналоге как С-концевая аминокислота, и чтобы все остальные метионины или в амилоидогенном полипептиде, или в чужеродном Т_н-эпитопе были удалены или замещены другой аминокислотой.

Дополнительная интересная мутация представляет собой делецию или замещение фенилаланина в положении 19 Аβ-43, а особенно предпочтительно, чтобы мутация представляла собой замену фенилаланинового остатка на пролин.

Другие интересные полиаминокислоты для применения в аналогах представляют собой укороченные части белка Аβ-43. Их можно применять в иммуногенных аналогах согласно настоящему изобретению. Особенно предпочтительными являются укороченные части Аβ (1-42), Аβ (1-40), Аβ (1-39), Аβ (135), Аβ (1-34), Аβ (1-34), Аβ (1-28), Аβ (1-12), Аβ (1-5), Аβ (13-28), Аβ (13-35), Аβ (17-28), Аβ (25-35), Аβ (35-40), Аβ (36-42) и Аβ (35-42) (где числа в скобках означают отрезки аминокислот Аβ-43, составляющие соответствующий фрагмент, например Аβ (35-40) идентичен аминокислотам 706-711 в 8Еф ГО N0:2). Все эти варианты с укороченными частями Аβ-43 можно получить с описанными здесь фрагментами Аβ, конкретно с вариантами 9, 10, 11, 12, и 13, указанными в примере 1.

- 10 007533

Следующая формула описывает молекулярные конструкции, относящиеся к изобретению: (ΜΟϋχ ) 81 (аМИЛОИДе1) ηΐ (ΜΟϋ₂) 82 (амилоид_в2) п2 · . . . (ΜΟϋχ) _8Х (амилоидах) пх (I) где амилоид_е1-амилоид_ех представляют собой х В-клеточный эпитоп, содержащий подпоследовательности АРР или Ав, которые независимо являются идентичными или неидентичными и которые могут содержать чужеродные боковые группы, х представляет собой число >3, ηΐ-ηχ представляют собой х чисел >0 (по меньшей мере одно >1), Μ0^₁-Μ0^_x представляют собой х модификаций, внесенных между представленными В-клеточными эпитопами, и δΐ-δχ представляют собой х чисел >0 (по меньшей мере одно >1, если в последовательности амилоид_ех не внесена ни одна боковая группа). Таким образом, учитывая общие функциональные ограничения на иммуногенность конструкции, изобретение допускает все виды перестановок оригинальной последовательности АРР или Ав и все виды модификаций в ней. Таким образом, в изобретение включены модифицированный АРР или Ав, полученные посредством пропуска частей последовательности, которые, например, обнаруживают ίη νίνο неблагоприятные эффекты, или пропуска частей, которые обычно являются внутриклеточными и, таким образом, могут дать начало нежелательным иммунологическим реакциям.

Одна предпочтительная версия конструкций, очерченных выше, когда применима, представляет собой конструкции, где подпоследовательность, содержащая В-клеточный эпитоп амилоидного белка, не экспонирована экстрацеллюлярно в предшествующем полипептиде, из которого получен амилоид. Такой выбор эпитопов служит гарантией того, что не образуются антитела, которые могли бы реагировать с клетками, продуцирующими предшественник, и следовательно, вырабатываемый иммунный ответ становится ограниченно направленным иммунным ответом против нежелательных накоплений амилоида. Например, в данном случае можно индуцировать иммунитет против эпитопов АРР или Ав, экспонированных в экстрацеллюлярную фазу, только когда они свободны от любой связи с продуцирующими их клетками.

Сохранения существенной части В-клеточных эпитопов или даже всей третичной структуры белка, подвергаемого модификации, как здесь желательно, можно достичь несколькими путями. Один из них представляет собой простое получение поликлональной антисыворотки, направленной против рассматриваемого полипептида (например, антисыворотка, полученная от кролика), и применение данной антисыворотки впоследствии в качестве тестового реагента (например, конкурентной ΕΠ8Α) против полученных модифицированных белков. Модифицированные версии (аналоги), реагирующие с антисывороткой в том же объеме, что и АРР или Ав необходимо рассматривать как обладающие полностью одинаковой третичной структурой, что и АРР или Ав, тогда как аналоги, проявляющие ограниченную (но все еще значительную и специфичную) реактивность с такой антисывороткой рассматривают как сохранившие существенную часть исходных В-клеточных эпитопов.

Альтернативно, можно провести отбор моноклональных антител, реагирующих с различными эпитопами на АРР или Ав, и использовать их как тестовую панель. Данный подход обладает преимуществом, позволяющим 1) картирование эпитопов АРР или Ав и 2) картирование эпитопов, сохраненных в полученных аналогах.

Конечно, в третьем приближении следовало бы определить 3-мерную структуру АРР или Ав или их биологически активного укороченного продукта (ср. выше) и сравнить их с определенной трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерную структуру можно разрешить при помощи изучения дифракции рентгеновских лучей и ЯМР-спектроскопии. Дополнительную информацию относительно третичной структуры до некоторой степени можно получить при изучении циркулярного дихроизма, обладающего тем преимуществом, что единственно необходимым для получения полезной информации о третичной структуре данной молекулы является очищенный полипептид (тогда как при дифракции рентгеновских лучей необходимо обеспечить кристаллизованный полипептид, а для ЯМР необходимо обеспечить изотопные варианты полипептида). Однако в конечном счете дифракция рентгеновских лучей и ЯМР необходимы для получения убедительных данных, так как циркулярный дихроизм может предоставить только непрямые доказательства корректности 3-мерной структуры посредством информации об элементах вторичной структуры.

В одном из предпочтительных осуществлений изобретения применяют множественные представления В-лимфоцитарных эпитопов АРР или Ав (например, формула I, где по меньшей мере один Вклеточный эпитоп представлен в двух положениях). Данного эффекта можно достичь различными путями, например, путем простого получения гибридных полипептидов, содержащих структуру (полученный из АРР или Ав полипептид)_т, где т представляет собой число >2, и затем ввести обсуждаемые здесь модификации по меньшей мере в одну из последовательностей АРР или Ав. Предпочтительно, чтобы вводимые модификации включали в себя по меньшей мере одну дупликацию эпитопа В-лимфоцита и/или введение гаптена. Данные осуществления, включая множественные представления выбранных эпитопов, особенно предпочтительны в ситуациях, где в качестве компонентов средств для вакцин пригодны просто небольшие части АРР или Ав.

Как указано выше, введения чужеродного Т-клеточного эпитопа можно достичь по меньшей мере

- 11 007533 вставкой, добавлением, делецией или заменой одной аминокислоты. Конечно, в обычной ситуации происходит введение более чем одного изменения в аминокислотную последовательность (например, вставка или замена целого Т-клеточного зпитопа), но важной целью для достижения является то, что аналог при процессировании антигенпредставляющей клеткой (АРС) даст начало такому чужеродному иммунодоминантному Т-клеточному эпитопу, представленному в связи с молекулой МНС класса II на поверхности АРС. Таким образом, если аминокислотная последовательность АРР или Ар в соответствующих положениях содержит ряд аминокислотных остатков, которые можно обнаружить в чужеродном Т_нэпитопе, тогда введение чужеродного Т_н-эпитопа может быть достигнуто путем обеспечения оставшихся аминокислот чужеродного эпитопа посредством вставки, добавления, делеции или замены аминокислот. Другими словами, введение полного Т_н-эпитопа посредством вставки или замены для удовлетворения целей настоящего изобретения не является необходимым. Предпочтительно, чтобы число вставок, делеций, замен или добавлений аминокислот представляло собой по меньшей мере 2, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 25 вставок, замен, добавлений или делеций. Кроме того, предпочтительно, чтобы число вставок, замен, добавлений или делеций аминокислот не превышало 150, например, не более 100, не более 90, не более 80 и не более 70. Особенно предпочтительно, чтобы число замен, вставок делеций или дополнений не превышало 60 и, в частности, данное число не должно превышать 50 или даже 40. Наиболее предпочтительное число не превосходит 30. По отношению к добавлениям аминокислот необходимо заметить, что когда получающаяся конструкция находится в форме гибридного полипептида, их зачастую значительно больше, чем 150.

Предпочтительные осуществления данного изобретения включают в себя модификацию посредством введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного Т-клеточного эпитопа. Необходимо понять, что вопрос об иммунодоминантности Т-клеточного эпитопа зависит от вида рассматриваемого животного. Здесь термин иммунодоминирование буквально относится к эпитопам, которые у вакцинированных индивидов/популяции дают начало значительному иммунному ответу, но хорошо известным фактом является то, что Т-клеточный эпитоп, являющийся иммунодоминантным у одного индивида/популяции, не обязательно иммунодоминантен у другого индивида того же вида, даже несмотря на то, что он способен к связыванию с молекулами МНС-П у последнего индивида. Отсюда для целей настоящего изобретения иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп представляет собой Т-клеточный эпитоп, который, когда представлен в антигене, эффективно обеспечит помощь Т-клеток. Обычно иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы обладают такой природной способностью, что они, по существу, всегда представлены связанными с молекулами МНС класса II, независимо от полипептида, в котором они находятся.

Другим важным вопросом является проблема рестрикции МНС Т-клеточных эпитопов. Как правило, природные Т-клеточные эпитопы рестрицированы по МНС, т.е. определенные пептиды, составляющие Т-клеточный эпитоп, будут эффективно связываться только с подмножеством молекул МНС класса II. Это, в свою очередь, обладает тем эффектом, что в большинстве случаев применение одного специфического Т-клеточного эпитопа приведет к компоненту вакцины, эффективному только для части популяции, и, в зависимости от размера этой части, может оказаться необходимым включать больше Тклеточных эпитопов в одну и ту же молекулу или, альтернативно, готовить многокомпонентную вакцину, где компоненты представляют собой варианты АРР или Ар, отличающиеся друг от друга природой введенного Т-клеточного эпитопа.

Если МНС-рестрикция применяемых Т-клеток неизвестна (например, в ситуации, когда вакцинируемое животное обладает плохо определенным составом МНС), часть популяции, охватываемой конкретной композицией вакцины, можно аппроксимировать посредством следующей формулы:

Α^,’ΐ-Πο-Α) <>

ί=1 где ρί представляет собой частоту реагирующих в популяции на ί-й чужеродный Т-клеточный эпитоп, представленный в композиции вакцины, а η представляет общее число чужеродных Т-клеточных эпитетов. Таким образом, композиция вакцины, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, обладающих частотами ответа в популяции в размере 0,8, 0,7 и 0,6, соответственно, должна дать

1-0,2x0,3x0,4=0,976

т.е. у 97,6% популяции статистически будет повышаться опосредованный МНС-П ответ на вакцину.

Формулу выше не применяют в ситуациях, где более или менее точно известен профиль МНСрестрикции применяемых пептидов. Если, например, определенный пептид связывается только с молекулами МНС-П человека, кодируемыми аллелями ΌΚ1, ΌΚ3, ΌΚ5 и ΌΚ7 НЬА-ΌΚ, тогда применение данного пептида вместе с другим пептидом, связывающимся с оставшимися молекулами МНС-П, кодируемыми аллелями НЬА-ΌΚ, завершит 100% охват в рассматриваемой популяции. Подобным образом, если второй пептид связывается только с ΌΚ3 и ΌΚ5, добавление данного пептида совершенно не увеличит охват. Если основывать расчет ответа популяции только на МНС-рестрикции Т-клеточных эпитопов в вакцине, минимальную часть популяции, охватываемую конкретной композицией вакцины, можно определить посредством следующей формулы:

- 12 007533

7=1 где φ, представляет собой сумму частот аллельных гаплотипов, кодируемых молекулами МНС, связывающими любой из Т-клеточных эпитопов в вакцине и принадлежащими _|-му из 3 известных локусов НЬА (ЭР, ЭК и 1)0) в популяции; на практике вначале определяют, какие молекулы МНС распознают каждый Т-клеточный эпитоп в вакцине, а потом их сортируют по типу (ЭР, ЭК и ЭО); далее для каждого типа суммируют индивидуальные частоты различных отсортированных аллельных гаплотипов, таким образом, получая φ1, φ2 и φ3.

Может случиться, что значение [у в формуле II превзойдет соответствующее теоретическому значению π

где ν, представляет собой сумму частот аллельного гаплотипа, кодируемого молекулами МНС, связывающими ΐ-й Т-клеточный эпитоп в вакцине и принадлежащими Ему из 3 известных локусов НЬА (ЭР, 1)1К и 1)0) в популяции. Это означает, что в 1-Л) популяции частота отвечающих составляет 1'_остагочн_{ая -}ί⁼ (ρί-π)) / (Ι-π). Следовательно, формулу III можно преобразовать так, чтобы получить формулу V

^.=1-110-^^+ 1-По-л остаточная _ι / /

7=1 где член 1‘_остагочн_ая-1 устанавливают в ноль, если он отрицателен. Необходимо отметить, что формула V требует, чтобы все эпитопы являлись картированными по идентичным наборам гаплотипов.

Следовательно, при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналог важно учитывать всю доступную информацию об эпитопах: 1) частоту отвечающих в популяции на каждый эпитоп, 2) данные об МНС-рестрикции и 3) частоту соответствующих гаплотипов в популяции.

Существует ряд природных смешанных Т-клеточных эпитопов, активных у большой части индивидов вида животных или популяции животных, и их предпочтительно вводить в вакцину, таким образом, уменьшая необходимость большого числа различных аналогов в одной вакцине.

Смешанный эпитоп согласно изобретению может представлять собой природный Т-клеточный эпитоп человека, такой как эпитопы из анатоксина столбняка (например, эпитопы Р2 и Р30), анатоксина дифтерии, гемагглютинина вируса гриппа (НА) и СБ-антигена Р. 1а1с1рагит.

На протяжении несколько лет идентифицировали ряд других смешанных Т-клеточных эпитопов. Главным образом, идентифицировали пептиды, способные к связыванию с большой частью молекул НЬА-ЭК, кодируемых различными аллелями НЕЛ-ЭК, и они все являются Т-клеточными эпитопами, допустимыми для введения в аналоги, применяемые согласно настоящему изобретению. Ср. также эпитопы, рассматриваемые в следующих ссылках, которые, таким образом, все включены сюда посредством ссылки: АО 98/23635 (Ега/ег ЕН е! а1., переуступленный Т11е Ишуегзбу о£ Риееи81аиб); Бонбтооб 8 е! а1., 1998, I. ТттииоГ 160: 3363-3373; Бтщадка Р е! а1., 1988, №Шге 336: 778-780; СОс/ КМ е! а1., 1993, I. Ехр. Меб 178: 27-47; Наттег I е! а1., 1993, Се11 74: 197-203; апб Ра1к К е! а1., 1994, ^тиио^ие!^ 39: 230-242. Последняя ссылка также касается лигандов НЕА-ЭЕ) и ЭР. Все эпитопы, перечисленные в данных 5 ссылках, являются подходящими в качестве природных эпитопов-кандидатов для применения согласно настоящему изобретению как эпитопы, разделяющие общие с ними мотивы.

Альтернативно, эпитоп может представлять собой любой искусственный Т-клеточный эпитоп, способный связываться с большой частью молекул МНС класса II. В данном контексте пептиды, представляющие собой общий эпитопы для всех ЭК (РАЭКЕ), описанные в АО 95/07707 и в соответствующей статье А1ехаибег I е! а1., 1994, ^тии^у 1: 751-761 (оба описания включены сюда посредством ссылки), представляют собой интересных кандидатов для эпитопов для применения согласно настоящему изобретению. Необходимо отметить, что наиболее эффективные пептиды РАЭКЕ, описанные в данных документах, несут Э-аминокислоты на С- и Ν-концах для увеличения стабильности при введении. Однако в настоящем изобретении главным образом стремятся к введению соответствующих эпитопов как части аналога, который впоследствии ферментативно разрушается внутри лизосомного компартмента АРС, чтобы позволить последующую презентацию в связи с молекулой МНС-П, и следовательно, введение Эаминокислот в применяемые согласно изобретению эпитопы является нецелесообразным.

Один из особенно предпочтительных пептидов РАЭКЕ представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность ЛΚΕVЛЛАΤΕΚЛЛЛ (БЕР ГО N0:17) или ее иммунологически эффективную подпоследовательность. Данный и другие эпитопы, обладающие таким же отсутствием МНСрестрикции, представляют собой предпочтительные Т-клеточные эпитопы, которые должны присутствовать в аналогах, применяемых в способе согласно изобретению. Такой сверхсмешанный эпитоп допустим для большинства простых осуществлений изобретения, где вакцинированной иммунной системе животного представлен только один-единственный аналог.

Как указано выше, модификация АРР или Ав может также включать в себя введение первой груп

- 13 007533 пы, нацеливающей модифицированный амилоидогенный полипептид на АРС или В-лимфоцит. Например, первая группа может представлять собой специфически связывающийся партнер для специфического антигена поверхности В-лимфоцита или для специфического антигена поверхности АРС. В данной области известно много таких поверхностно-специфических антигенов. Например, группа может представлять собой углевод, для которого существует рецептор на В-лимфоците или АРС (например, маннан или манноза). Альтернативно, вторая группа может представлять собой гаптен. Также в качестве первой группы можно применять фрагмент антитела, специфически распознающий поверхностную молекулу на АРС или лимфоцитах (например, поверхностная молекула может представлять собой рецептор РСу макрофагов или моноцитов, такой как РсуК!, или, альтернативно, любой другой поверхностноспецифический маркер, такой как ί.Ό40 или СТЬА-4). Необходимо отметить, что все эти приведенные для примера молекулы также можно применять в качестве части адъюванта, сравнение ниже.

В качестве альтернативы или дополнительно для нацеливания аналога на определенный тип клеток для достижения усиленного иммунного ответа можно увеличить уровень реактивности иммунной системы посредством включения указанной выше второй группы, стимулирующей иммунную систему. Типичные примеры таких вторых групп представляют собой цитокины и белки теплового шока или молекулы шаперонов, а также их эффективные части.

Подходящие для применения согласно настоящему изобретению цитокины представляют собой цитокины, которые будут также нормально функционировать в композиции вакцины в качестве адъювантов, т.е. например, интерферон γ (ΙΡΝ-γ), интерлейкин 1 (1Ь-1), интерлейкин 2 (1Ь-2), интерлейкин 4 (1Ь4), интерлейкин 6 (1Ь-6), интерлейкин 12 (1Ь-12), интерлейкин 13 (1Ь-13), интерлейкин 15 (1Ь-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (6М-С8Р); альтернативно, в качестве второй группы может хватить функциональной части молекулы цитокина. Что касается применения таких цитокинов в качестве средств для адъювантов, сравните обсуждение ниже.

Подходящие согласно данному изобретению белки теплового шока или молекулярные шапероны, применяемые в качестве второй группы, могут представлять собой Н8Р70, Н8Р90, Н8С70, СКР94 (также известный как др96, ср. ^еагкей РА с! а1. 1998, ВюсйетЫгу 37: 5709-19) и СКТ (калретикулин).

Альтернативно, вторая группа может представлять собой токсин, такой как листериолизин (ЬЬО), липид А и термолабильный энтеротоксин. Интересные возможности также связаны с микобактериальными производными, такими как МЭР (мурамилдипептид), СРА (полный адъювант Фрейнда) и сложные эфиры трегалозы ТОМ и ΤΌΕ.

Важное осуществление данного изобретения представляет собой также возможность введения третьей группы, усиливающей презентацию аналога иммунной системе. В данной области показано несколько примеров данного принципа. Например, известно, что якорь липоилирования пальмитиновой кислотой в белке ОкрА у Воггейа ЬигдбогГеп можно применять так, что предоставляются полипептиды, сами по себе являющиеся адъювантами (ср., например, XVО 96/40718) - кажется, что липоилированные белки формируют структуры, подобные мицеллам, с ядром, состоящим из частей якорей липоилирования полипептидов, а оставшиеся части молекулы, выступающие оттуда, приводят к множественной презентации антигенных детерминант. Следовательно, применение таких подобных подходов, связанных с применением различных якорей липоилирования (например, миристиловую группу, миристиловую группу, фарнезиловую группу, геранил-гераниловую группу, 6Р1-якорь и Ν-ацилдиглицеридную группу), представляют собой предпочтительные осуществления данного изобретения, так как, как правило, обеспечение таких якорей липоилирования в полученном рекомбинантным способом белке достаточно просто и единственно требует в случае аналога применения, например, природной сигнальной последовательности в качестве партнера слияния. Другая возможность представляет собой применение фрагмента С3б фактора С3 комплемента или самого фактора С3 (ср. Оетркеу е! а1., 1996, 8с1еисе 271, 348-350 апб Ьои & КоЫег, 1998, №1Ц1ге Вю1ес11по1оду 16, 458-462).

Альтернативное осуществление изобретения, которое также приводит к предпочтительной презентации иммунной системе множественных (например, по меньшей мере 2) копий важных регионов АРР или Ав с эпитопами, представляет собой ковалентное связывание аналога с определенными молекулами, т.е. варианты б и е, указанные выше. Например, можно применять полимеры, например, углеводы, такие как декстрин, ср., например, Ьеек А е! а1., 1994, Уассше 12: 1160-1166; Ьеек А е! а1., 1990, I 1ттипо1. 145: 3594-3600, но манноза и маннан также представляют собой пригодные альтернативы. Интегральные мембранные белки, например, из Е. со11 и других бактерий, также являются пригодными для конъюгации партнерами. Традиционные молекулы-носители, такие как гемоцианин морского блюдца (КЕН), анатоксин столбняка, дифтерийный анатоксин и бычий сывороточный альбумин (В8А) также являются предпочтительными и пригодными для конъюгации партнеров.

Предпочтительные осуществления ковалентного связывания вещества, полученного из АРР или Ав, с полигидроксиполимерами, такими как углеводы, включают в себя применение по меньшей мере одного пептида, полученного из АРР или Ав, и по меньшей мере одного чужеродного Т-хелперного эпитопа, которые раздельно связываются с полигидроксиполимером (т.е. чужеродный Т-хелперный эпитоп и полученная из АРР или Ав аминокислотная последовательность не сливаются друг другом, но в значитель- 14 007533 ной степени связываются с полигидроксиполимером, служащим в качестве несущего каркаса). С другой стороны, наиболее предпочтительным является такое осуществление, когда подходящие районы полученных из АРР или Ав пептидов, несущие В-клеточный эпитоп, составлены посредством коротких отрезков пептидов, потому что данный подход представляет собой очень удобный путь для достижения множественной презентации выбранных эпитопов в конечном иммуногене. Однако можно также просто связывать аналоги, уже описанные здесь, с полигидроксиполимерным остовом, т. е. чтобы вещество, полученное из АРР или Ав, не соединялось с остовом отдельно от чужеродных Т_н-эпитопов.

Особенно предпочтительно, чтобы связывание чужеродного Т-хелперного эпитопа и полученного из АРР или Ав (поли) пептида происходило посредством амидной связи, которую можно расщепить пептидазой. Данная стратегия обладает тем эффектом, что АРС смогут захватывать конъюгат и впоследствии осуществлять презентацию чужеродного Т-клеточного эпитопа в связи с МНС класса II.

Одним из путей достижения связывания пептидов (и полученных из АРР или Ав представляющих интерес пептидов, также как и чужеродного эпитопа) является активация подходящего полигидроксиполимера трезильными (трифторэтилсульфонильными) группами или другими подходящими активирующими группами, такими как малеимид, паранитрофенилхлороформ (для активации ОН-групп и формирования пептидной связи между пептидом и полигидроксиполимером) и тозил (паратолуолсульфонил). Например, можно получить активированные полисахариды, как описано в νθ 00/05316 и И8 5874469 (оба включены сюда посредством ссылки) и связать их с пептидами или полиаминокислотами, полученными из АРР или Ав, а также с Т-клеточными эпитопами, полученными посредством стандартных способов пептидного синтеза в жидкой или твердой фазе. Полученный продукт состоит из полигидроксиполимерного остова (например, декстранового остова), которая своими Ν-концами или другими азотными группами связана с полиаминокислотами, полученными из АРР или Ав и из чужеродных Т-клеточных эпитопов. Если желательно, можно синтезировать пептиды АРР или Ав так, чтобы защитить все доступные аминогруппы, кроме одной на Ν-конце, впоследствии связывая полученные защищенные пептиды с трезилированными группами декстрана и, в заключение, снимая защиту с полученного конъюгата. Конкретный пример такого подхода описан в примерах ниже.

Вместо применения водорастворимых молекул полисахарида, как изложено в νθ 00/05316 и И8 5874469, в равной степени можно применять молекулы перекрестносвязанных полисахаридов, получая, таким образом, корпускулярные конъюгаты между полипептидами и полисахаридами, что, как полагают, ведет к улучшенной презентации полипептидов иммунной системе, так как достигаются две цели, а именно, получение эффекта локального накопления при инъекции конъюгата и получение частиц, являющихся более привлекательными мишенями для АРС. Данный подход с использованием таких систем также подробно рассматривается в примерах.

Рассуждения, лежащие в основе выбора областей для введения модификаций в АРР или Ав, подразумевают а) сохранение известных и предсказанных В-клеточных эпитопов, Ь) сохранение третичной структуры, с) избежание презентации В-клеточных зпитопов на клетках-продуцентах и т.п. Во всяком случае, как обсуждалось выше, скрининг набора аналогов, все из которых были подвергнуты внесению Т-клеточного эпитопа в различные положения, является довольно простым.

Так как наиболее предпочтительные осуществления настоящего изобретения включают в себя понижающую регуляцию Ав человека, следовательно, предпочтительно, чтобы полипептид АРР или Ав, обсуждаемый выше, представлял собой полипептид Ав человека. В данном осуществлении особенно предпочтительно, чтобы полипептиды АРР или Ав являлись модифицированными путем замены по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в 8ЕО ГО N0:2, одной аминокислотной последовательностью с эквивалентной или отличной длинной и содержащей чужеродный Тн-эпитоп. Предпочтительные примеры модифицированных амилоидогенных АРР и Ав схематически показаны на фигуре 1, с применением в качестве примеров эпитопов Р2 и Р30. Логическое обоснование таких конструкций подробно обсуждается в примерах.

Более конкретно, содержащую Т_н аминокислотную последовательность, которую вносят в 8ЕО ГО N0:2, можно вносить с любой аминокислоты в 8Е0 ГО N0:2. То есть внесение возможно после любой из аминокислот в положениях 1-770, но предпочтительно после любой из аминокислот в положениях 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 в 5ЕО ГО N0:2. Это можно комбинировать с делецией любой или всех из аминокислот в положениях 1-671 или любой или всех из аминокислот в положениях 715-770. Кроме того, при применении способа замены любую из аминокислот в положениях 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 в 8ЕО ГО N0:2 можно удалить вместе с данным внесением.

Другое осуществление настоящего изобретения связано с представлением аналогов, не содержащих никакой из подпоследовательностей 8Е0 ГО N0:2, которые продуктивно связываются с молекулами МНС класса II, инициируя Т-клеточный ответ.

Логическое обоснование такой стратегии для конструирования иммуногена, вовлекающего иммун

- 15 007533 ную систему в индукцию, например, иммунного ответа против Ав, состоит в следующем: отмечено, что при иммунизации многочисленными аутологичными белками, такими как Ав, составленными с адъювантом, которые достаточно сильны для нарушения толерантности организма к аутологичным белкам, существует опасность, что у тех же вакцинированных индивидов индуцированный иммунный ответ не сможет прекратиться просто в результате прекращения иммунизации. Это происходит потому, что индуцированный иммунный ответ у таких индивидов наиболее вероятно приводит в движение нативный Т_нэпитоп аутологичного белка, а это обладает тем неблагоприятным эффектом, что собственный белок вакцинированного индивида будет способен функционировать как иммуноген, таким образом, установится аутоиммунное состояние.

В предпочтительных способах, включая применение чужеродных Тн-эпитопов, являющихся лучшими по сведениям авторов данного изобретения, никогда не наблюдали получение данного эффекта, так как иммунный ответ против «своего» направляется чужеродным Т_н-эпитопом, а авторы настоящего изобретения неоднократно показывали, что индуцированный иммунный ответ, вызванный путем применения предпочтительной технологии, действительно уменьшался после прекращения иммунизации. Однако в теории у немногих индивидов может произойти так, что иммунный ответ также будет направляться аутологичным Т_н-эпитопом соответствующего собственного белка, против которого иммунизировали, что особенно значимо, когда рассматривают собственные белки, являющиеся относительно многочисленными, такими как Ав, тогда как другие терапевтически значимые собственные белки присутствуют в организме только локально или в таких малых количествах, что эффект самоиммунизации невозможен. Одним из очень простых путей избежать этого является, следовательно, совершенный отказ от включения в иммуноген пептидных последовательностей, которые могут служить в качестве Тн-эпитопов (и так как пептиды короче примерно 9 аминокислот не могут служить Тн-эпитопами, использование более коротких фрагментов является одним из простых и выполнимых подходов). Следовательно, данное осуществление изобретения также служит для того, чтобы убедиться, что иммуноген не включает в себя пептидные последовательности целевых АРР или Ав, которые могут служить в качестве самостимулирующих Т_н-эпитопов, включая последовательности, которые просто содержат консервативные замены в последовательности целевого белка, который иначе может функционировать как Тн-эпитоп.

Предпочтительные осуществления презентации иммунной системе аналогов АРР или Ав включают в себя применение химерного пептида, содержащего по меньшей мере один полученный из АРР или Ав пептид, который продуктивно не связывается с молекулами МНС класса II, и по меньшей мере один чужеродный Т-хелперный эпитоп. Более того, предпочтительно, чтобы полученный из АРР или Ав пептид нес В-клеточный эпитоп. Особенно предпочтительно, если иммуногенный аналог представляет собой аналог, где аминокислотные последовательности включают в себя один или несколько В-клеточных эпитопов, представленных либо как непрерывная последовательность, либо как содержащая вставки последовательность, где вставки включают в себя чужеродные Т-хелперные эпитопы.

С другой стороны, наиболее предпочтительным является такое осуществление, когда подходящие районы, полученные из пептидов АРР или Ав, несущие В-клеточный эпитоп, составлены посредством коротких пептидных отрезков, которые никак не способны продуктивно связаться с молекулой МНС класса II. Выбранный В-клеточный эпитоп или эпитопы амилоидогенного полипептида должны, следовательно, включать в себя не более 9 последовательных аминокислот 8Е0 ГО N0:2. Предпочтительными являются более короткие пептиды, такие как пептиды, имеющие не более 8, 7, 6, 5, 4 или 3 последовательных аминокислот аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида.

Предпочтительно, чтобы аналог включал в себя по меньшей мере одну подпоследовательность 8Е0 ГО N0:2 так, чтобы каждая из таких по меньшей мере одной подпоследовательностей независимо состояла из аминокислотных отрезков АРР или Ав, выбранных из группы, состоящей из 9 последовательных аминокислот, 8 последовательных аминокислот, 7 последовательных аминокислот, 6 последовательных аминокислот, 5 последовательных аминокислот, 4 последовательных аминокислот и 3 последовательных аминокислот.

Особенно предпочтительно, чтобы последовательные аминокислоты начинались с аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из остатков 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 8Ер ГО N0:2.

Вакцинация белком/пептидом; препараты и введение аналогов

Когда осуществляют презентацию аналога иммунной системе животного посредством его введения животному, препараты полипептида отвечают требованиям, общепринятым в данной области.

Получение вакцин, содержащих в качестве активных ингредиентов последовательности пептидов, в общих чертах хорошо разработаны в данной области, как проиллюстрировано патентами США 4608251, 4601903, 4599231, 4599230, 4596792 и 4578770, которые все включены сюда посредством ссылки. Обычно такие вакцины получают как препараты для инъекций или как жидкие растворы или суспензии; также можно получить твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препараты также можно эмульгировать. Активный иммуногенный ингредиент часто смеши

- 16 007533 вают с наполнителями, являющимися фармацевтически допустимыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящие наполнители представляют собой, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., и их комбинации. Кроме того, если желательно, вакцина может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как увлажнители или эмульгаторы, буферные средства для стабилизации рН или адъюванты, увеличивающие эффективность вакцин; ср. подробное обсуждение адъювантов ниже.

Обычно вакцины вводят парентерально, посредством инъекции, например, или подкожно, или внутривенно, или внутримышечно. Дополнительные препараты, которые подходят для других способов введения, включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, оральные, буккальные, сублингвальные, интраперитонеальные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и интракраниальные препараты. Для суппозиториев стандартные связывающие средства и носители могут включать в себя, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории можно формировать из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне от 0,5 до 10%, предпочтительно - 1-2%. Оральные препараты включают в себя такие обычно применяемые наполнители, как, например, маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия, целлюлозу, карбонат магния фармацевтических степеней очистки и т. п. Данные композиции принимают формы растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов с замедленным высвобождением или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно - 20-70%. Для оральных препаратов подходящим компонентом для составления композиции (и также возможным компонентом для конъюгации) является холерный токсин.

Полипептиды можно формировать в вакцины в виде нейтральных форм или в виде солей. Фармацевтически допустимые соли включают в себя кислые аддитивные соли (образуемые со свободными аминогруппами пептида) и те соли, которые образуются с неорганическими кислотами, такими, например, как соляная или фосфорная кислоты, или с такими органическими солями как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образуемые со свободными карбоксильными группами, также можно получить при помощи неорганических оснований, например, таких как гидроксиды, натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований как изопропиламин, триметиламин, 2этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т. п.

Вакцины вводят способом, совместимым с дозировкой препарата, и в таком количестве, которое терапевтически эффективно и иммуногенно. Количество для введения зависит от субъекта, подлежащего лечению, включая, например, способность иммунной системы индивида устанавливать иммунный ответ и степень необходимой защиты. Подходящие диапазоны дозировок находятся в пределах примерно нескольких сотен микрограммов активного ингредиента на вакцинацию, с предпочтительным диапазоном примерно от 0,1 до 2000 мкг (хотя рассматривают и большие количества в диапазоне 1-10 мг), например в диапазоне примерно от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в диапазоне от 1 до 500 мкг и, особенно в диапазоне примерно от 10 до 100 мкг. Подходящие режимы для начального введения и поддерживающих доз также варьируют, но определяются начальным введением с последующими дальнейшими прививками или другими видами введения.

Способ применения может широко варьировать. Применим любой из традиционных способов введения вакцины. Они включают в себя оральное применение на твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентерально, посредством инъекции и т. п. Дозировка вакцины будет зависеть от способа введения и будет варьировать в зависимости от возраста субъекта, подвергающегося вакцинации, и состава антигена.

Некоторые из полипептидов вакцины достаточно иммуногенны в вакцине, но для некоторых других иммунный ответ усилится, если вакцина будет дополнительно содержать активизирующее вещество.

Для вакцин известны различные способы достижения активизирующего эффекта. Основные принципы и способы хорошо разработаны в ТНе ТЕеогу аиб Ргасбса1 Аррбсабоп о£ АбщгапЦ. 1995, Эипсап Е.8. 81е\\'аг1-Ти11 (еб.), 1обп ^беу & 8оик Ь!б, !8ΒΝ 0-471-95170-6, а также в Уассшек: Ыете Сеиегабоии бпшипо1од1са1 Аб_)иуаи!к, 1995, СгедопабЕ С е! а1. (ебк.), Р1еиит Ргекк, №\ν Уогк, [8ΒΝ 0-306-45283-9, включенных сюда посредством ссылки.

Особенно предпочтительно применять адъювант, который, как может быть показано, способствует нарушению аутотолерантности к аутоантигенам; фактически это существенно в случаях, когда в качестве активного ингредиента в аутовакцине применяют немодифицированный амилоидогенный полипептид. В качестве неограничивающих примеров подходящие адъюванты выбирают из группы, состоящей из адъюванта, нацеливающего иммунитет; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и производные микобактерий; масляного состава; полимера; адъюванта, формирующего мицеллы; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикс КСОМ); частицы; ΌΌΑ; адъювантов на основе алюминия; адъювантов на основе ДНК; γ-инулина и инкапсулирующего адъюванта. В общих чертах необходимо отметить, что описания выше, которые относились к соединениям и средствам, пригодным как первая, вторая и третья группы в аналогах, с соответствующими изменениями также относятся к их использованию в адъюванте вакцины согласно изобретению.

Возможное использование адъювантов включает в себя применение таких средств как гидроксид или фосфат алюминия (квасцы), обычно применяемым как 0,05-0,1%-ный раствор в забуференном соле

- 17 007533 вом растворе, примесь с синтетическими полимерами сахаров (например, СагЬоро1®), применяемая как 0,25%-ный раствор, агрегацию белков в вакцине посредством воздействия тепла с температурным диапазоном от 70 до 101°С в течение периода от 30 с до 2 мин, соответственно, а также агрегацию посредством структурирующих веществ. Также можно применять агрегацию альбумина посредством реактивации обработанных пепсином антител (РаЬ-фрагментов), смесь с бактериальными клетками, такими как С. рагуит, или эндотоксинами, или компонентами липополисахаридов грамотрицательных бактерий, эмульсию в физиологически допустимых масляных носителях, таких как маннидмоноолеат (Агасе1 А) или эмульсию с 20%-ным раствором перфторуглерода (Р1иохо1-ЭА), применяемым как блокирующий заместитель. Смесь с маслами, такими как сквален и 1РА, также предпочтительна.

Согласно данному изобретению, ΌΌΑ (бромид диметилдиоктадециламмония) является интересующим кандидатом для адъюванта, как и ДНК и γ-инулин, но полный и неполный адъюванты Фрейнда, а также сапонины килайи, такие как 0ш1А и 0821, также интересны, как и ΡΙΒΙ. Дополнительными возможностями являются монофосфолипид А (МРЬ), указанные выше С3 и С3б и мурамилдипептид (МЭР).

Известно, что препараты липосом дают эффекты адъювантов, и следовательно, адъюванты в виде липосом предпочтительны согласно изобретению.

Предпочтительными альтернативами согласно изобретению также являются адъюванты в виде иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикс 18СОМ®), особенно потому, что показано, что данный тип адъювантов способен к повышающей регуляции экспрессии МНС класса ΙΙ АРС. Матрикс 18СОМ® состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов (тритерпеноиды) из 0ш11а_)а харопапа, холестерина и фосфолипида. Когда это смешивают с иммуногенным белком, получающийся препарат из частиц представляет собой то, что известно как частица 18СОМ, где сапонин составляет 6070% мас./мас, холестерин и фосфолипид составляют 10-15% мас./мас. и белок составляет 10-15% мас./мас. Подробности, относящиеся к композиции и применению иммуностимулирующих комплексов, можно найти, например, в указанных выше учебниках, посвященных адъювантом, но у Могеш В е! а1., 1995, Сйп. 1ттипо!йег. 3: 461-475, также как и у Вагг Ю апб Мйсйе11 ОР, 1996, 1ттипо1 апб Се11 Вю1. 74: 8-25 (включенных сюда посредством ссылки) также предоставлены пригодные инструкции для получения полных иммуностимулирующих комплексов.

Другая очень интересная (а значит, предпочтительная) возможность достижения эффекта адъюванта связана с применением способа, описанного у Соххейп е! а1., 1992 (что, таким образом, включено сюда посредством ссылки). Кратко, презентацию соответствующего антигена, такого как антиген согласно настоящему изобретению можно усилить посредством конъюгации антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против рецепторов Рсγ на моноцитах/макрофагах. Показано, что иммуногенность для целей вакцинации особенно усиливают конъюгаты между антигеном и анти-РсуВГ

Другие возможности включают в себя применение нацеливающих и иммуномодулирующих веществ (например, цитокинов), указанных выше как кандидаты для первой и второй групп в модифицированных версиях амилоидогенных полипептидов. В связи с этим возможностями также являются синтетические индукторы цитокинов, такие как поли 1:С.

Подходящие производные микобактерий выбраны из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фрейнда, ΒΙΒΙ и сложные диэфиры трегалозы, такие как ТОМ или ΤΌΕ.

Походящие нацеливающие иммунитет адъюванты выбирают из группы, состоящей из лиганда ί.Ό40 и антител к СЭ40 или их специфически связывающихся фрагментов (ср. обсуждение выше), маннозы, РаЬ-фрагмента и СТЬА-4.

Походящие полимерные адъюванты выбирают из группы, состоящей из углеводов, таких как декстран, ΡΕΟ, крахмал, маннан и манноза; пластических полимеров, таких как латекс и латексные гранулы.

Еще один интересный путь модуляции иммунного ответа представляет собой включение иммуногена (необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически допустимыми носителями) в виртуальный лимфатический узел (УЬИ) (патентованное медицинское устройство разработано в 1ттипоТйегару, 1пс., 360 ЬехтдФп Ауепие, Νονν Уогк, ΝΥ 10017-6501). Уй® (тонкое трубчатое устройство) имитирует структуру и функцию лимфатического узла. Внесение νΕΝ под кожу создает участок стерильного воспаления с повышением уровня цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, также как и АРС, быстро отвечают на сигналы о повреждении, направляются к участку воспаления и накапливаются внутри пористого матрикса νΕΝ. Показано, что необходимая доза антигена, требуемая для установления иммунного ответа на антиген при применении νΕΝ, уменьшена и что иммунопротекция, вызванная иммунизацией с применением ΥΕΝ, превышает стандартную иммунизацию с применением в качестве адъюванта ΡΙΒΙ. Технология кратко описана у Ое1Ьег С е! а1., 1998, Ейсйайоп ок РоЬих! Се11и1аг апб Нитога1 1ттипе Рехропхех !о 8та11 Атоип!х ок 1ттиподепх Ихтд а №\^ге1 Мебюа1 Ое\асе Оехщпа1еб 1Не Упкиа1 Ьутрй Лобе, ш: Ргот Фе ЬаЬогаФгу 1о 1Не СНшс, Воок ок АЬх!гас!х, ОсЮЬег 12^Н|-15' 1998, 8еахсаре Вехой, Ар!ох, Са11когта.

Показано, что препараты вакцин в виде микрочастиц во многих случаях увеличивают иммуногенность белковых антигенов, а следовательно, представляют собой другое предпочтительно осуществление изобретения. Микрочастицы изготавливают либо как композиции вместе с полимером, липидом, углево

- 18 007533 дом или другими молекулами, подходящими для изготовления частиц, либо микрочастицы могут представлять собой гомогенные частицы, состоящие только из самого антигена.

Примеры микрочастиц, основанных на полимерах, представляют собой частицы, основанные на РБСА и РУР (Сир1а. В. К. е!. а1., 1998), где полимер и антиген конденсируют в твердую частицу. Частицы на основе липидов можно изготовить как мицеллы из липида (так называемые липосомы), захватывая антиген в мицеллу (Р1е!гоЬоп, Р. 1. 1995). Частицы на основе углевода, обычно изготавливают из подходящего распадающегося углевода, такого, как крахмал или хитозан. Углевод и антиген смешивают и конденсируют в частицы в процессе, подобном тому, что применяют для полимерных частиц (Как, Н. 8. е! а1., 1997).

Частицы, состоящие только из антигена, можно изготавливать различными способами распыления или сушки вымораживанием. Для целей настоящего изобретения особенно подходит способ сверхкритической жидкости, который применяют для изготовления очень однородных частиц контролируемого размера (Уогк, Р., 1999 & 8Ьекппоу, В. е! а1., 1999).

Ожидается, что вакцину следует вводить 1-6 раз в год, т.е. 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз в год, нуждающемуся в этом индивиду. Ранее показано, что иммунологическая память, индуцированная применением предпочтительных аутовакцин согласно данному изобретению, не является постоянной, и следовательно, иммунная система нуждается в периодической провокации иммунного ответа амилоидогенным полипептидом или модифицированными амилоидогенными полипептидами.

Вследствие генетического разнообразия различные индивиды могут реагировать на один и тот же полипептид иммунным ответом различной силы. Следовательно, вакцина согласно изобретению может содержать несколько различных полипептидов для увеличения иммунного ответа, ср. также обсуждение выше, касающееся выбора введений чужеродного Т-клеточного эпитопа. Вакцина может включать в себя два или несколько полипептидов, где все полипептиды представляют собой такие, как определено выше.

Следовательно, вакцина может включать в себя 3-20 различных модифицированных или немодифицированных полипептидов, например 3-10 различных пептидов.

Вакцинация нуклеиновой кислотой

В качестве альтернативы классическому введению вакцины на основе белка технология вакцинации нуклеиновой кислотой (также известная как иммунизация нуклеиновой кислотой, генетическая иммунизация и генная иммунизация) предлагает ряд привлекательных особенностей.

Прежде всего, в противоположность традиционному подходу к вакцинации, вакцинация нуклеиновой кислотой не нуждается в ресурсах, требующих широкомасштабного производства иммуногена (например, в промышленном масштабе ферментации микроорганизмов, продуцирующих амилоидогенные полипептиды). Более того, нет необходимости в устройствах по очистке и схемах рефолдинга иммуногена. И, наконец, так как при вакцинации нуклеиновой кислотой для продукта экспрессии внесенной нуклеиновой кислоты полагаются на биохимический аппарат вакцинируемого индивида, ожидается, что произойдет оптимальный посттрансляционный процессинг экспрессируемого продукта; это особенно важно в случае аутовакцинации, так как, как указано выше, в модифицированной молекуле необходимо сохранить значительную часть исходных В-клеточных эпитопов и так как В-клеточные эпитопы в принципе можно составить из частей любой (биологической) молекулы (например, углевода, липида, белка и т.п.). Следовательно, естественные профили гликозилирования и липоилирования иммуногена могут быть очень важным для общей иммуногенности, а это лучше всего обеспечить, если в качестве продуцента иммуногена использовать хозяина.

Следовательно, предпочтительное осуществление вариантов а-с согласно изобретению включает в себя эффективную презентацию аналога иммунной системе посредством внесения нуклеиновых(ой) кислот(ы), кодирующих(ей) аналог, в клетки животного и таким образом получения экспрессии введенный(ой) нуклеиновых(ой) кислот(ы) клетками ш νί\Ό.

В данном осуществлении введенная нуклеиновая кислота предпочтительно представляет собой ДНК, которая может находиться в форме чистой ДНК, ДНК, объединенной с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, помещенной в липосомы, ДНК, включенной в вирусный вектор, ДНК, объединенной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, объединенной с нацеливающим белком или полипептидом, ДНК, объединенной с осаждающими кальций агентами, ДНК, связанной с инертной молекулой-носителем, ДНК, инкапсулированной в полимер, например в РБСА (сравните способ микроинкапсуляции, описанный в АО 98/31398), или хитин, или хитозан и ДНК, объединенной с адъювантом. В данном контексте следует отметить, что практически все рассмотренные варианты, имеющие отношение к применению адъювантов в препаратах традиционных вакцин, применяются и в препаратах вакцин из ДНК. Следовательно, все описания, которые здесь относятся к применению адъювантов, в контексте вакцин на основе полипептидов, с необходимыми изменениями применяют для использования в способе вакцинации нуклеиновыми кислотами.

Пути введения и схемы введения вакцин на основе полипептидов, детализированные выше, также применимы для вакцин на основе нуклеиновых кислот согласно изобретению, и все обсуждения выше, имеющие отношение к путям и схемам введения полипептидов, с соответствующими изменениями применяют к нуклеиновым кислотам. К этому необходимо добавить, что вакцины на основе нуклеиновых

- 19 007533 кислот можно соответствующим образом вводить внутривенно и внутриартериально. Более того, в данной области хорошо известно, что вакцины на основе нуклеиновых кислот можно вводить посредством применения так называемой генной пушки, и следовательно, данный и эквивалентные способы введения рассматривают как часть настоящего изобретения. Наконец, как сообщалось, применение для введения нуклеиновых кислот ΎΈΝ также дает хорошие результаты, и следовательно, данный конкретный способ введения является особенно предпочтительным.

Кроме того, нуклеиновая(ые) кислота(ы), применяемые как средства для иммунизации, могут содержать области, кодирующие 1-, 2- и/или 3-ю группы, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, рассмотренные в качестве пригодных адъювантов. Предпочтительная версия данного осуществления связана с кодирующим районом для аналога и кодирующим районом для иммуномодулятора в различных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем различных промоторов. Таким образом, избегают того, чтобы аналог или эпитоп продуцировались как партнеры слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, можно использовать два отдельных нуклеотидных фрагмента, но это менее предпочтительно ввиду преимущества, обеспечиваемого совместной экспрессией, когда оба кодирующих района включены в одну молекулу.

Таким образом, изобретение также относится к композиции для индуцирования продукции антител против АРР или Аβ, где композиция включает в себя фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор согласно изобретению (ср. обсуждение векторов ниже) и фармацевтически и иммунологически допустимый носитель и/или адъювант, как обсуждалось выше.

В нормальных условиях кодирующую вариант нуклеиновую кислоту вносят в виде вектора, где экспрессия находится под контролем вирусного промотора. Более детальное обсуждение векторов согласно изобретению ср. обсуждение ниже. Также подробные описания, относящиеся к формированию и применению вакцин на основе нуклеиновых кислот, сравните ОоппеПу 1.1. еί а1., 1997, Аппи. Кет. 1ттипо1. 15: 617-648 и ОоппеПу 1.1. еί а1., 1997, ЫГе 8с1епсек 60: 163-172. Обе данные ссылки включены сюда посредством ссылки.

Живые вакцины

Третья альтернатива для эффективной презентации аналогов иммунной системе, как определено в вариантах а-с, представляет собой применение способа живых вакцин. В вакцинации живыми вакцинами презентацию иммунной системе осуществляют посредством введения животному непатогенных микроорганизмов, которые можно трансформировать фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим аналог, или вектором, включающем в себя такой фрагмент нуклеиновой кислоты. Непатогенный микроорганизм может представлять собой любой подходящий аттенуированный бактериальный штамм (аттенуированный посредством пассажей или путем удаления экспрессирующихся патогенных продуктов посредством технологии рекомбинантных ДНК), например, ВСС. МусоЬас1епит Ьот® непатогенные 81гер1ососсик крр., Е. сой, 8а1топе11а крр., У1Ьпо сйо1егае, 81иде11а и т.п. Обзоры, посвященные получению реальных живых вакцин, можно, например, найти у 8айои Р, 1995, Кет. Рга1. 45: 1492-1496 и \Уа1кег ΡΌ, 1992, Уассше 10: 977-990, оба из которых включены сюда посредством ссылки.

Для подробностей о фрагментах нуклеиновой кислоты и векторах, применяемых в таких живых вакцинах, сравните обсуждение ниже.

В виде альтернативы бактериальным живым вакцинам, фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению, обсуждаемый ниже, можно ввести в невирулентный вектор вирусной вакцины, такой как штамм коровьей оспы или любой другой подходящий вирус оспы.

Обычно непатогенный микроорганизм или вирус животному вводят только однажды, но в некоторых случаях может быть необходимо введение микроорганизма более одного раза в течение жизни для сохранения защитного иммунитета. Даже предполагают, что детализованные выше схемы иммунизации для вакцинации полипептидами будут пригодны для применения живых или вирусных вакцин.

Альтернативно, вакцинацию живыми вакцинами или вирусами комбинируют с предыдущей или последующей вакцинацией полипептидами и/или нуклеиновыми кислотами. Например, можно произвести первичную иммунизацию живой или вирусной вакциной с последующей поддерживающей иммунизацией с применением подхода на основе полипептида или нуклеиновой кислоты.

Микроорганизм или вирус можно трансформировать нуклеиновой(ыми) кислотой(ами), содержащей районы, кодирующие 1-, 2- и/или 3-ю группы, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, рассмотренные в качестве пригодных адъювантов. Предпочтительная версия данного осуществления связана с кодирующим районом для аналога и кодирующим районом для иммуномодулятора в различных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем различных промоторов. Таким образом, избегают того, чтобы аналог или эпитоп продуцировался как партнер слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, в качестве трансформирующих средств можно использовать два отдельных нуклеотидных фрагмента. Конечно, наличие 1-, и/или 2-, и/или 3-й групп в одной и той же рамке считывания может обеспечить аналог согласно изобретению как продукт экспрессии, и такое осуществление особенно предпочтительно в настоящем изобретении.

- 20 007533

Применение способа согласно изобретению для лечения заболевания

Как можно понять из обсуждения выше, предоставление способа согласно изобретению позволяет контролировать заболевания, характеризующиеся накоплениями амилоида. В данном контексте ΆΌ представляет собой ключевую цель способа согласно изобретению, но другие заболевания, характеризующиеся отложениями амилоида, содержащими Ав, также являются достижимыми целями.

Следовательно, важное осуществление способа согласно изобретению для понижающей регуляции амилоидной активности включает в себя лечение и/или профилактику, и/или улучшение состояния АО или других заболеваний, характеризующихся накоплением амилоида, способ включает в себя понижающую регуляцию АРР или Ав способом согласно изобретению, до такой степени, чтобы значительно уменьшалось количество амилоида.

Особенно предпочтительно, чтобы уменьшение амилоида приводило к изменению баланса между формированием и деградацией/удалением амилоида, т.е., что скорость деградации/удаления амилоида доведена до степени, когда она превышает скорость формирования амилоида. Посредством тщательного контроля количества и иммунологического воздействия иммунизации нуждающегося в этом индивида можно со временем достичь баланса, приводящего к уменьшению нетто накоплений амилоида без избыточных неблагоприятных эффектов.

Альтернативно, если способ согласно изобретению не эффективен в удалении или уменьшении существующих отложений амилоида у индивида, его можно применять для получения клинически значимого уменьшения формирования нового амилоида, таким образом значительно удлиняя период, до которого состояние болезни не ухудшится. Следует иметь возможность контролировать скорость накопления амилоида или путем измерения сывороточной концентрации амилоида (которая, как полагают, находится в равновесии с веществом в накоплениях), или с помощью позитронно-эмисионного томографического (РЕТ) сканирования, ср. 8та11 С\¥. е! а1., 1996, Апп Ν Υ Асаб 8с1 802: 70-78.

Другие заболевания и состояния, где можно применять настоящие средства и способы для лечения или облегчения состояния аналогичным способом, упомянуты выше в предпосылках изобретения или перечислены ниже в разделе, озаглавленном другие амилоидные заболевания и белки, ассоциированные с ними.

Пептиды, полипептиды и композиции согласно изобретению

Как видно из указанного выше, настоящее изобретение основано на концепции иммунизации индивидов против антигена АРР или Ав для получения уменьшенного количества связанных с патологией накоплений амилоида. Предпочтительный путь достижения такой иммунизации представляет собой применение описанных здесь аналогов с предоставлением, таким образом, молекул, ранее не описанных в данной области.

Полагают, что обсуждаемые здесь аналоги являются объектом изобретения сами по себе, и следовательно, важная часть изобретения относится к описанным выше аналогам. Следовательно, любое представленное здесь описание, относящееся к модифицированному АРР или Ав, является релевантным для целей описания амилоидогенных аналогов согласно изобретению, также как и любые такие описания, наоборот, применимы к описанию указанных аналогов.

Необходимо отметить, что предпочтительные модифицированные молекулы АРР или Ав включают в себя модификации, приводящие к образованию полипептида, обладающего степенью идентичности последовательности с АРР или Ав, составляющей по меньшей мере 70%, или с их подпоследовательностью длиной по меньшей мере в 10 аминокислот. Более высокая степень идентичности последовательности, например по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% являются предпочтительными. Идентичность последовательности для белков и нуклеиновых кислот можно вычислить как (Ν^_£-Ν_6ί£·)·100/Ν^_£·, где Ν_Λ£ представляет собой общее число неидентичных остатков в двух последовательностях при выравнивании и где Ν_Γ(._£ представляет собой число всех остатков в одной из последовательностей. Так, последовательность ДНК АСТСАСТС имеет степень идентичности с последовательностью ААТСААТС, составляющую 75% (Ν_61ί=2 и Ν_Γ(!ί=8).

Изобретение также относится к композициям, которые можно использовать при реализации способа согласно изобретению. Следовательно, изобретение также относится к иммуногенной композиции, включающей в себя иммуногенно эффективное количество описанного выше аналога, причем указанная композиция дополнительно включает в себя фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или носитель, и/или наполнитель и, необязательно, адъювант. Иными словами, эта часть изобретения относится к композициям аналогов, в основном как описано выше. Таким образом, когда выбор адъювантов и носителей относится к композиции модифицированного или немодифицированного амилоидогенного полипептида для применения в способе согласно изобретению для понижающей регуляции АРР или Ав, он находится в соответствии с тем, что обсуждалось выше.

Полипептиды получают в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Более протяженные полипептиды обычно получают посредством технологии рекомбинантных генов, включающей в себя введение последовательности аминокислот, кодирующей аналог, в подходящий вектор, трансформацию данным вектором подходящей клетки-хозяина, экспрессию данной клеткой-хозяином

- 21 007533 последовательности нуклеиновых кислот, извлечение продукта экспрессии из клеток-хозяев или их супернатанта и последующую очистку, и, необязательно, дополнительную модификацию, например, рефолдинг или дериватизацию.

Более короткие пептиды предпочтительно получают посредством хорошо известных способов твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза. Однако недавние достижения в данной технологии создали возможность получения посредством данных способов полноразмерных полипептидов и белков и, следовательно, получение длинных конструкций посредством синтетических способов также не выходит за рамки настоящего изобретения.

Фрагменты нуклеиновой кислоты и векторы согласно изобретению

Из предыдущего описания понятно, что аналоги полиаминокислот можно получить посредством технологии рекомбинантных генов, а также посредством химического синтеза или полусинтеза; последние две альтернативы особенно значимы, когда модификация заключается в связывании с белковыми носителями (такими, как КЬН, дифтерийный анатоксин, анатоксин столбняка и В8Л) и небелковыми молекулами, такими как углеводные полимеры, а также, конечно, когда модификация включает в себя добавление боковых цепей или боковых групп к пептидной цепи, полученной из АРР или Ав.

Для цели технологии рекомбинантных генов, а также, конечно, для цели иммунизации нуклеиновой кислотой фрагменты нуклеиновой кислоты, кодирующие аналоги, представляют собой важные химические продукты. Следовательно, важная часть изобретения относится к фрагментам нуклеиновой кислоты, кодирующим аналог согласно изобретению, т.е. полипептид, полученный из АРР или Ав, включающий в себя или природную последовательность, к которой добавляют или в которую вставляют партнер слияния, или, предпочтительно, полученный из АРР или Ав полипептид, в который посредством вставки и/или добавления, предпочтительно посредством замены и/или делеции, ввели чужеродный Т-клеточный эпитоп. Фрагменты нуклеиновой кислоты согласно изобретению представляют собой фрагменты ДНК или РНК.

Фрагменты нуклеиновой кислоты согласно изобретению обычно вставляют в подходящие векторы для образования клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих фрагменты нуклеиновой кислоты согласно изобретению; такие новые векторы также представляют собой часть изобретения. Подробности, относящиеся к конструированию таких векторов согласно изобретению, будут обсуждаться ниже в связи с трансформированными клетками и микроорганизмами. Векторы, в зависимости от цели и типа применения, могут существовать в виде плазмид, фагов, космид, минихромосом или вируса, но «оголенная» ДНК, которая транзитно экспрессируется только в определенных клетках, также является важным вектором. Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы согласно изобретению способны к автономной репликации, таким образом создавая возможность получения большого числа копий для целей высокоуровневой экспрессии или высокоуровневой репликации для последующего клонирования.

Основная схема вектора согласно изобретению включает в себя следующие элементы в направлении 5'^3' и в функциональном соединении: промотор для управления экспрессией фрагмента нуклеиновой кислоты согласно изобретению, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, делающий возможной секрецию (в экстрацеллюлярную фазу или, когда применимо, в периплазму) полипептидного фрагмента или его интеграцию в мембрану, фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению и, необязательно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая терминатор. При оперировании экспрессирующими векторами в штаммах-продуцентах или клеточных линиях в целях генетической стабильности трансформированной клетки предпочтительно, чтобы вектор при введении в клетку-хозяина интегрировался в геном клетки-хозяина. Напротив, при работе с векторами, применяющимися для осуществления экспрессии у животного ίη νίνο (например, при применении вектора в вакцинации ДНК), по соображениям безопасности предпочтительно, чтобы вектор был неспособен к интеграции в геном клетки-хозяина; обычно применяют «оголенную» ДНК или неинтегрирующиеся векторы, выбор которых хорошо известен специалистам в данной области.

Векторы согласно изобретению применяют для трансформации клеток-хозяев для получения аналога согласно изобретению. Такие трансформированные клетки могут представлять собой культивируемые клетки или клеточные линии, применяемые для размножения фрагментов нуклеиновой кислоты и векторов согласно изобретению или применяемые для рекомбинантного получения аналогов согласно изобретению. Альтернативно, трансформированные клетки могут представлять собой штаммы живых вакцин, где фрагмент нуклеиновой кислоты (одна единственная или несколько копий) вставлен так, что осуществляет секрецию или интеграцию аналога в бактериальную мембрану или клеточную стенку.

Предпочтительные трансформированные клетки согласно изобретению представляют собой микроорганизмы, такие как бактерии (такие как виды Εδοίιοποίιίη [например, Е. οοΐί], Βααΐΐιΐδ [например, Васй1и8 δΐ.ιόίί1ίδ|. §а1тонс11а или МусоЬас1спит [предпочтительно непатогенные, например, ВС6 М. ϋονίδ]), дрожжи (например, Бассйаготу^ се^еν^δ^ае) и простейшие животные. Альтернативно, трансформированные клетки получают из многоклеточного организма, например гриба, клетки насекомого, клетки растения или клетки млекопитающего. Наиболее предпочтительными являются клетки, полученные от

- 22 007533 человека, сравните обсуждение клеточных линий и векторов ниже. Последние результаты в лаборатории авторов свидетельствуют о перспективах применения для рекомбинантного получения полипептидов коммерчески доступной линии ΌΐΌ5ορ1ιί1;·ι шектодаЦег (клеточная линия и векторная система 8сЬпе1кег 2 (8₂), доступная в ИтсЦгодеп) и, следовательно, данная экспрессирующая система особенно предпочтительна.

Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированные клетки были способны реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Клетки, экспрессирующие фрагмент нуклеиновой кислоты, являются предпочтительно полезными осуществлениями данного изобретения; их можно использовать для ограниченного или широкомасштабного получения аналога согласно изобретению или, в случае непатогенных бактерий, в качестве вакцинных составляющих в живой вакцине.

При получении аналогов согласно изобретению посредством трансформированных клеток, удобно, хоть это и отдаляет от сути, чтобы продукты экспрессии или экспортировались наружу в среду культивирования, или находились на поверхности трансформированной клетки.

Когда эффективные клетки-продуценты идентифицированы, на их основе предпочтительно создать стабильную клеточную линию, несущую вектор согласно изобретению и экспрессирующую фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный амилоидогенный полипептид. Предпочтительно, чтобы данная стабильная клеточная линия секретировала или несла аналог согласно изобретению, таким образом облегчая его очистку.

Как правило, плазмидные векторы, содержащие репликон и контрольные последовательности, полученные из видов, совместимых с клеткой-хозяином, применяют в связи с хозяевами. Вектор обычно несет сайт репликации, а также маркерные последовательности, способные обеспечить селекцию трансформированных клеток по фенотипу. Например, Е. сой обычно трансформируют с применением ρΒΚ322, плазмиды, полученной из вида Е. со11 (например, см. Βοϊίνατ е1 а1., 1977). Плазмида ρΒΚ322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину и таким образом обеспечивает простые средства для идентификации трансформированных клеток. Плазмида ρΒΚ или другая плазмида микроорганизмов или фаг должна также содержать - или же ее необходимо модифицировать так, чтобы она содержала - промоторы, которые прокариотический микроорганизм может использовать для экспрессии.

Такие промоторы, чаще всего применяемые для конструирования рекомбинантной ДНК, включают в себя системы В-лактамазного и лактозного промоторов (СЕапд е1 а1., 1978; Иакига е1 а1., 1977; Соекке1 е1 а1., 1979) и систему триптофанового (Рр) промотора (Соекке1 е1 а1., 1979; ЕР-А-0 036 776). Хотя они и являются наиболее часто применяемыми, обнаружены и применяются также и другие промоторы микроорганизмов, и опубликованы детали, относящиеся к их нуклеотидным последовательностям, позволяя специалистам функционально лигировать их с плазмидными векторами (81еЬ^еп1181 е1 а1., 1980). Определенные гены прокариот могут эффективно экспрессироваться в Е. со11 с ее собственной промоторной последовательности, предотвращая необходимость добавления другого промотора искусственными способами.

Кроме прокариотических, можно применять и эукариотические микроорганизмы, такие как дрожжевые культуры, и здесь промотор должен быть способен направлять экспрессию. 8ассЕаготусе§ сегеуыахе. или обыкновенные пекарские дрожжи, из эукариотических микроорганизмов применяют наиболее часто, хотя также доступен и ряд других штаммов. Для экспрессии в 8ассЕаготусе§ обычно применяют, например, плазмиду УКр7 (8РпсЕсотЬ е1 а1., 1979; Ктдктап е1 а1., 1979; ТксЕетрег е1 а1., 1980). Данная плазмида уже содержит ген 1грк являющийся селективным маркером для мутантного штамма дрожжей, лишенных способности расти на триптофане, например, АТСС № 44076 или РЕР4-1 (1опе§, 1977). Наличие повреждения 1гр1 как характеристики генома дрожжевой клетки-хозяина, предоставляет эффективное условие для обнаружения трансформации посредством роста в отсутствие триптофана.

Подходящие промоторные последовательности у дрожжевых векторов включают в себя промоторы для 3-фосфоглицераткиназы (НЦ/шап е1 а1., 1980) или других гликолитических ферментов (Не§8 е1 а1., 1968; НоПапк е1 а1., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. Для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации желательно, чтобы при конструировании подходящих экспрессирующих плазмид экспрессировались терминирующие последовательности, ассоциированные с данными генами, также лигированные в 3'-конец последовательности экспрессирующего вектора.

Другие промоторы, обладающие дополнительным преимуществом транскрипции, контролируемой условиями роста, представляют собой промоторные регионы алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов деградации, ассоциированных с метаболизмом азота и указанной выше глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящим является любой плазмидный вектор, содержащий промотор, подходящий для дрожжей, участок начала репликации и последовательности терминатора.

Кроме микроорганизмов, в качестве хозяев можно применять культуры клеток, полученных из многоклеточных организмов. В принципе любая такая клеточная культура является возможной, будь то

- 23 007533 культура из позвоночных или беспозвоночных. Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, а размножение клеток позвоночных в культуре (тканевая культура) в последние годы стало обычным способом (Т188ие Си11иге. 1973). Примерами таких пригодных линий клеток-хозяев являются клетки УЕК0 и НеЬа, линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) и ν138, ВНК, С08-7 293, клетки 8робор1ега £гид1регба(8Р) (коммерчески доступные как завершенные экспрессирующие системы, кроме прочего, в Рго1еш 8с1еисе8, 1000 КезеагсЬ Рагк^ау, Мепбеп, СТ 06450, И.8.А. и в [пубгодеп) и клеточные линии МОСК. Наиболее предпочтительная клеточная линия согласно настоящему изобретению представляет собой линию 82, доступную в Iην^ί^οдеη, Р0 Βοχ 2312, 9704 СН Сгошпдеп, Тбе №1Ьег1апб8.

Экспрессирующие векторы для таких клеток обычно включают в себя (если необходимо) участок начала репликации, промотор, расположенный перед геном для экспрессии, вместе с любыми необходимыми участками связывания рибосом, участками сплайсинга РНК, участком полиаденилирования и последовательности терминатора транскрипции.

Для применения в клетках млекопитающих функции управления на экспрессирующих векторах часто обеспечиваются материалом вируса. Например, применяемые обычно промоторы получают из вируса полиомы, аденовируса 2 и, наиболее часто, обезьяньего вируса 40 (8У40). Ранние и поздние промоторы вируса 8У40 особенно полезны ввиду того, что их легко получить из вируса как фрагмент, также содержащий участок начала репликации вируса 8У40 (Р1егз е1 а1., 1978). Также можно использовать меньший и больший фрагменты 8У40, при условии, что туда включена последовательность длиной примерно 250 п.н., продолжающаяся от участка распознавания НшбШ до участка распознавания Β§Ή, расположенная в вирусном участке начала репликации. Кроме того, также возможно и часто желательно использовать промотор или контрольные последовательности, обычно ассоциированные с желательной генной последовательностью, при условии, что данные контрольные последовательности совестимы с системами клеток-хозяев.

Участок начала репликации можно обеспечить или посредством конструирования такого вектора, чтобы он включал в себя экзогенный участок начала репликации, например, который можно получить из 8У40 или других вирусов (например, вируса полиомы, аденовирусов, У8У, БРУ), или посредством механизма хромосомной репликации клетки-хозяина. Если вектор интегрирован в хромосому клеткихозяина, ее часто достаточно.

Идентификация пригодных аналогов

Специалистам понятно, что не все возможные варианты или модификации природных АРР или Ав обладают способностью вызывать у животного образование антител, которые являются перекрестнореагирующими с природной формой. Однако нетрудно произвести эффективный стандартный скрининг модифицированных амилоидогенных молекул, удовлетворяющих минимальным требованиям иммунологической реактивности, обсуждаемым здесь. Следовательно, можно применять способ для идентификации модифицированных амилоидогенных полипептидов, способных индуцировать образование антител против немодифицированного амилоидогенного полипептида у видов животных, где немодифицированный амилоидогенный полипептид представляет собой (неиммуногенный) собственный белок, причем этот способ включает в себя получение посредством пептидного синтеза или способов генной инженерии набора взаимно простых аналогов согласно изобретению, где в аминокислотную последовательность АРР или Ав вида животных добавлены, в нее вставлены, из нее удалены или в ней замещены аминокислоты, таким образом приводя к аминокислотным последовательностям в наборе, которые включают в себя Т-клеточные эпитопы, чужеродные для вида животных, или получение набора фрагментов нуклеиновой кислоты, кодирующих набор взаимно простых аналогов, тестирование элементов набора аналогов или фрагментов нуклеиновой кислоты на их способность вызывать продукцию антител у вида животных против немодифицированного АРР или Ав, и идентификацию и, необязательно, выделение элемент(а) набора аналогов, который(е) значимо индуцирует у вида продукцию антител против немодифицированных АРР и Ав или идентификацию или, необязательно, выделение продуктов, экспрессирующих полипептид, кодируемых элементами набора фрагментов нуклеиновой кислоты, которые значимо индуцируют у вида животных продукцию антител против немодифицированных АРР и Ав.

В данном контексте, набор взаимнопростых модифицированных амилоидогенных полипептидов представляет собой коллекцию неидентичных аналогов, выбранных на базе обсуждаемых выше критериев (например, в комбинации с исследованием циркулярного дихроизма, спектров ЯМР и/или профилей дифракции рентгеновских лучей). Набор может состоять только из малого количества элементов, но полагают, что набор может содержать и несколько сотен элементов.

Тестирование элементов набора, в конечном счете, можно провести ίη νίνο, но можно применять ряд тестов ίη νίίτο, которые уменьшают количество модифицированных молекул, служащих целью данного изобретения.

Так как цель внесения чужеродных Т-клеточных эпитопов представляет собой поддержку Вклеточного ответа с помощью Т-клеток, необходимое условие состоит в том, чтобы аналог индуцировал

- 24 007533 пролиферацию Т-клеток. Пролиферацию Т-клеток можно тестировать при помощи стандартизированных анализов пролиферации ίη νίίτο. Кратко, от субъекта получают образец, обогащенный Т-клетками, и впоследствии поддерживают в культуре.

Культивируемые Т-клетки приводят в контакт с АРС субъекта, ранее захватившими модифицированную молекулу и преобразовавшими ее для презентации Т-клеточным эпитопам. Наблюдают за пролиферацией Т-клеток и сравнивают с подходящим контролем (например, Т-клетки в культуре, контактировавшие с АРС, преобразовавшие интактный нативный амилоидогенный полипептид). Альтернативно пролиферацию можно измерить посредством измерения концентрации высвобождения соответствующих цитокинов Т-клетками в ответ на распознавание ими чужеродных Т-клеток.

Представляется весьма вероятным, что так как по меньшей мере один аналог каждого типа набора способен вызывать продукцию антител против АРР или Ав, можно получить иммуногенную композицию, включающую в себя по меньшей мере один аналог, способный индуцировать образование антител против немодифицированных АРР или Ав у вида животных, где немодифицированные АРР или Ав представляют собой собственные белки, способом, включающим в себя смешивание элемента(ов) набора, который(е) значимо индуцирует продукцию антител у вида животных, которые реагируют с АРР или Ав с фармацевтически и иммунологически приемлемыми носителями и/или растворителями, и/или разбавителями, и/или наполнителями, необязательно в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически и иммунологически приемлемым адъювантом.

Обсуждаемые выше тесты наборов полипептидов легко выполнить посредством начального получения ряда взаимно простых последовательностей нуклеиновой кислоты или векторов согласно изобретению, вставкой их в соответствующие экспрессирующие векторы, трансформацией векторами подходящих клеток-хозяев (или животных-хозяев) и осуществлением экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты согласно изобретению. После этих стадий может следовать выделение продуктов экспрессии. Предпочтительно, чтобы последовательности нуклеиновой кислоты и/или векторы получали способами, включающими в себя применение способов молекулярной амплификации, такой как ПЦР или посредством синтеза нуклеиновой кислоты.

Специфические амилоидогенные мишени

Кроме наиболее часто ассоциированных с болезнью Альцгеймера белков АРР, АроЕ4 и Таи существует длинный список других белков, тем или иным образом связанных с АО или ввиду их непосредственного присутствия в бляшках и клубках в головном мозге при АО или ввиду их выраженной генетической ассоциацией с увеличенным риском развития АО. Большинство из данных антигенов, если не все, вместе с обсуждаемыми выше Ав, АРР, пресенилином и АроЕ4, в определенных осуществлениях настоящего изобретения представляют собой возможные белки-мишени. Эти возможные мишени уже всесторонне обсуждались в \νϋ 01/62284. Следовательно, эти возможные мишени здесь будут только кратко упомянуты, тогда как более подробное основательное обсуждение можно найти в νθ 01/62282, включенной сюда посредством ссылки:

альфа 1-антихимотрипсин (АСТ); альфа2-макроглобулин; АВАО (Ав-пептид связывающая алкогольдегидрогеназа); АРЬР1 и -2 (белок, подобный белку-предшественнику амилоида 1 и 2); АМУ117; Вах; Вс1-2; гидролаза блеомицина; ВВ1/АВВ1; хромогранин А; кластерин/аро1; белок, связывающий СВР (фактор высвобождения кортикотропина); ЕОТР (токсический фактор, происходящий из эндотелия); гепарансульфатпротеогликаны; белок-медиатор ответа на коллапсин человека 2; гентингтин (белок болезни Гентингтона); 1САМ-1; 1Ь-6; антиген СО68, ассоциированный с лизосомами; Р21 гак; РЬС-дельта 1 (изофермент дельта 1 фосфолипазы С); компонент сывороточного амилоида Р (8АР); синаптофизин; синуклеин (альфа-синуклеин или ЫАСР) и ТСР-в 1 (трансформирующий фактор роста в1).

Описанные в настоящем документе средства и способы понижающей регуляции АРР или Ав можно комбинировать с лечением, например, активной специфической иммунотерапией против любого из данных других амилоидогенных полипептидов.

Кроме болезни Альцгеймера, церебральная амилоидная ангиопатия также представляет собой болезнь, которая может быть подходящей мишенью для предоставленного в настоящем документе способа.

Предполагают, что большинство способов иммунизации против АРР или Ав следует ограничить иммунизацией, приводящей к образованию антител перекрестно реагирующих с нативными АРР или Ав. Тем не менее, в некоторых случаях представляет интерес индуцировать клеточный иммунитет в форме СТЬ-ответа против клеток, презентирующих эпитопы МНС класса I из амилоидогенных полипептидов это может быть целесообразным в тех случаях, когда снижение количества клеток, продуцирующих АРР или Ав не приносит серьезного неблагоприятного эффекта. В тех случаях, когда желателен СТЬ-ответ, предпочтительно использовать рекомендации авторов публикации νθ 00/20027. Описания указанных двух документов, таким образом, включены сюда посредством ссылки.

Иммуногенные носители

Можно получить молекулы, включающие в себя Т-хелперный эпитоп и пептиды АРР или Ав, представляющие собой или включающие В-клеточные эпитопы, ковалентно связанные с неиммуногенной полимерной молекулой, действующей как носитель, например, поливалентный активированный поли

- 25 007533 гидроксиполимер, которые будут, как указано выше, функционировать как молекулы вакцины, которые содержат только иммунологически значимые части, и они представляют собой интересующие осуществления в обсуждаемых выше вариантах б и е. Можно применять смешанные или так называемые универсальные Т-хелперные эпитопы, например, если мишень для вакцины представляет собой собственный белок АРР или Ав. Кроме того, элементы, усиливающие иммунологический ответ, можно также связать совместно с носителем и таким образом они будут действовать как адъювант. Такие элементы могут представлять собой маннозу, тафтсин, мурамилдипептид, мотивы СрС и т.п. В данном случае дальнейшая адъювантная композиция вакцинного продукта может не быть необходимой, и продукт можно вводить в чистой воде или физиологическом растворе.

Путем связывания эпитопов цитотоксических Т-клеток (СТЬ) с Т-хелперными эпитопами можно генерировать СТЬ, специфические в отношении антигена, из которого получен СТЬ-эпитоп. Элементы, облегчающие захват продукта в цитозоль АРС, например, макрофагов, такие как манноза, также можно связывать с носителем, вместе с СТЬ- и Т-хелперными эпитопами, и усилить ответ СТЬ.

Соотношение В-клеточных и Т-хелперных эпитопов (Р2 и Р30) в конечном продукте можно варьировать путем изменения концентрации данных пептидов на стадии синтеза. Как указано выше, иммуногенную молекулу можно пометить, например, маннозой, тафтсином, СрС-мотивами или другими иммуностимулирующими веществами (описанными здесь) путем их добавления, если необходимо, с помощью, например, аминированных производных этих веществ, к карбонатному буферу на стадии синтеза.

Если для комбинирования пептидов, содержащих В-клеточные и Т-хелперные эпитопы АРР или Ав, применяют нерастворимый активированный полигидроксиполимер, то это можно, как указано выше, провести в виде твердофазного синтеза, а конечные продукты можно собрать и очистить путем промывки и фильтрации. Элементы для связывания с активированным трезилом полигидроксиполимером (пептиды, метки и т.п.) можно добавлять к полигидроксиполимеру при низких рН, например при рН 4-5, и позволяя им равномерно перераспределиться в геле посредством пассивной диффузии. Далее, рН можно поднять до рН 9-10 для запуска реакции основных аминогрупп на пептидах и меток с трезильными группами на полигидроксиполимере. После связывания пептидов и, например, иммуностимулирующих элементов гель измельчают с формированием частиц подходящего для иммунизации размера.

Такой иммуноген, таким образом, включает в себя:

a) по меньшей мере одну первую аминокислотную последовательность, полученную из АРР или Ав, где по меньшей мере одна первая аминокислотная последовательность содержит в себе по меньшей мере один В-клеточный и/или по меньшей мере один СТЬ-эпитоп, и

b) по меньшей мере одну вторую аминокислотную последовательность, включающую в себя чужеродный эпитоп Т-хелперных клеток, где каждая из по меньшей мере первой и по меньшей мере второй аминокислотных последовательностей связаны с фармацевтически приемлемым активированным гидроксиполимерным носителем.

Для связывания аминокислотных последовательностей с полигидроксиполимером обычно необходимо активировать полигидроксиполимер подходящей реакционной группой, которая может формировать необходимую связь с аминокислотными последовательностями.

Подразумевается, что термин полигидроксиполимер имеет то же значение, что и в \УО 00/05316, т.е. полигидроксиполимер может иметь точно такие же характеристики, какие конкретно указаны в данной заявке. Следовательно, полигидроксиполимер может быть водорастворимым или водонерастворимым (таким образом, требуя различных стадий синтеза в процессе получения иммуногена). Полигидроксиполимер можно выбрать из природных полигидроксисоединений и синтетических полигидроксисоединений.

Конкретные и предпочтительные полигидроксиполимеры представляют собой полисахариды, выбранные из ацетана, амилопектина, камеди агар-агара, агарозы, альгинатов, гуммиарабика, каррагенана, целлюлозы, циклодекстринов, декстрана, фурцелларана, галактоманнана, желатина, дЬай, глюкана, гликогена, гуара, кагауа, кои)ас/А, смолы плодов рожкового дерева, маннана, пектина, ркуШиш, ри11и1аи, крахмала, !ашапие, трагаканта, ксантана, ксилана и ксилоглюкана. Особенно предпочтительным является декстран.

Однако полигидроксиполимер можно также выбрать из сильноразветвленного поли(этиленимина) (РЕЦ тетратиениленвинилена, кевлара (длинные цепи полипарафенилтерефталамида), поли(уретанов), поли(силоксанов), полидиметилсилоксана, силикона, поли(метилметакрилата)(РММА), поли(винилового спирта), поли(винилпирролидона), поли(2-гидроксиэтилметакрилата), полиЩ-винилпирролидона), поливинилового спирта), поли(акриловой кислоты), политетрафторэтилена (РТЕЕ), полиакриламида, поли(этиленковинилацетата), поли(этиленгликоля) и производных, поли(метакриловой кислоты), полилактидов (РЬА), полигликолидов (РСА), поли(лактидкогликолидов) (РЬСА), полиангидридов и сложных полиортоэфиров.

Средняя молекулярная масса рассматриваемого полигидроксиполимера (например, перед активацией) обычно составляет по меньшей мере 1000, например по меньшей мере 2000, предпочтительно - в диапазоне 2500-2000000, более предпочтительно - в диапазоне 3000-1000000, в особенности -5000

- 26 007533

500000. В примерах показано, что полигидроксиполимеры со средней массой в диапазоне 10000-200000 являются особенно выгодными.

Полигидроксиполимер предпочтительно является растворимым в воде в концентрации по меньшей мере 10 мг/мл, предпочтительно по меньшей мере 25 мг/мл, например, по меньшей мере 50 мг/мл, в особенности по меньшей мере 100 мг/мл, например, по меньшей мере 150 мг/мл при комнатной температуре. Известно, что декстран, даже когда активирован, как здесь описано, удовлетворяет требованиям растворимости в воде.

Для некоторых из наиболее интересных полигидроксиполимеров отношение между группами С (атомы углерода) и ОН (гидроксильные группы) неактивированных полигидроксиполимеров (т. е. нативные полигидроксиполимеры до активации) находится в диапазоне от 1,3 до 2,5, например, 1,5-2,3, предпочтительно 1,6-2,1, в особенности 1,85-2,05. Вне связи с какой-либо конкретной теорией полагают, что такое отношение С/ОН неактивированного полигидроксиполимера представляет собой наиболее выгодный уровень гидрофильности. Поливиниловый спирт и полисахариды представляют собой примеры полигидроксиполимеров, удовлетворяющих данному требованию. Полагают, что указанное выше отношение должно оставаться примерно таким же для активированного полигидроксиполимера, тогда как отношение активации должно являться существенно более низким.

Термин полигидроксиполимерный носитель предназначен для обозначения участка иммуногена, несущего аминокислотные последовательности. В качестве общего правила, полигидроксиполимерный носитель имеет свои внешние границы, где аминокислотные последовательности могут расщепляться пептидазами, например, в антигенпредставляющей клетке, процессирующей иммуноген. Следовательно, полигидроксиполимерный носитель может представлять собой полигидроксиполимер с активационной группой, где связь между активационной группой и аминокислотной последовательностью расщепляется пептидазами в АРС или гидроксиполимерный носитель может представлять собой гидроксиполимер с активационной группой и, например, мостиком, таким как одиночная Ь-аминокислота или ряд Όаминокислот, где последняя часть мостика может связывать аминокислотные последовательности и расщепляться пептидазами в АРС.

Как указано выше, полигидроксиполимеры несут функциональные группы (активационные группы), облегчающие закрепление пептидов на носителе. В данной области известно обширное множество применимых функциональных групп, например, трезиловая (трифторэтилсульфониловая), малеимидная, паранитрофенилхлороформная, бромциановая, тозиловая (пара-толуолсульфониловая), трифлиловая (трифторметансульфониловая), пентафторбензолсульфониловая и винилсульфоновая группы.

Предпочтительные примеры функциональных групп согласно настоящему изобретению представляют собой трезиловые, малеимидные, тозиловые, трифлиловые, пентафторбензолсульфонильные, паранитрофенилхлороформная и винилсульфоновые группы, в числе которых трезиловые, малеимидные и тозиловые группы особенно значимы.

Активированные трезилом полигидроксиполимеры можно получать с применением трезилхлорида, как описано для активации декстрана в примере 1 и АО 00/05316 или как описано у Сгедогшк е! а1., 1. 1ттипо1. МеШ. 181 (1995) 65-73.

Активированные малеимидом полигидроксиполимеры можно получать с применением парамалеимидофенилизоцианата, как описано для активации декстрана в примере 3 в АО 00/05316. Альтернативно, малеимидные группы можно ввести в полигидроксиполимер, например декстран, посредством дериватизации активированного трезилом полигидроксиполимера (например, активированного трезилом декстрана (ΊΆΌ)) избытком диаминового соединения (как правило, Н₂М-С_пН_2п ^-ИН₂, где п составляет 120, предпочтительно 1-8), например, 1,3-диаминопропана, и, впоследствии, реакцией введенных в ТАО аминогрупп с реагентами, такими как сукцинимидил-4-(Ы-малеимидометил)циклогексан-1-карбокислат (8МСС), сульфосукцинимидил-4-(М-малеимидометил)циклогексан-1-карбокислат (сульфо 8МСС), сукцинимидил-4-(пара-малеимидофенил)бутират (8МРВ), сульфосукцинимидил-4-(пара-малеимидофенил)бутират (сульфо8МРВ), Ν-γ-малеимидобутирилоксисукцинимидные сложные эфиры (СМВ8) или Ν-γ-малеимидобутирилоксисульфосукцинмимидные сложные эфиры. Несмотря на то, что различные реагенты и пути активации формально приводят к немного различающимся продуктам, активированным малеимидом в отношении связи между функциональностью малеимида и остаточной исходной гидроксильной группой, на которой проводили активацию, все их вместе и порознь можно рассматривать как активированные малеимидом полигидроксиполимеры.

Активированные тозилом полигидроксиполимеры можно получать с применением тозилхлорида, как описано для активации декстрана в примере 2 в АО 00/05316. Полигидроксиполимеры, активированные трифлилом и пентафторбензолсульфонилом, получают как аналоги, активированные тозилом или трезилом, например, с применением соответствующих кислых хлоридов.

Активированные бромцианом полигидроксиполимеры можно получать путем реакции полигидроксиполимера с бромцианом с применением традиционных способов. Получающиеся функциональные группы обычно представляют собой сложные эфиры циановой кислоты с двумя гидроксильными группами полигидроксиполимера.

- 27 007533

Степень активации можно выразить как соотношение между свободными гидроксильными группами и активационными группами (т.е. гидроксильными группами, ставшими функциональными). Полагают, что соотношение между свободными гидроксильными группами полигидроксиполимера и активационными группами для получения выгодного баланса между гидрофильностью и реактивностью полигидроксиполимера должно составлять от 250:1 до 4:1. Предпочтительно соотношение составляет от 100:1 до 6:1, более предпочтительно от 60:1 до 8:1, в особенности от 40:1 до 10:1.

Особенно интересные активированные полигидроксиполимеры для применения в способе для получения применимого в большинстве случаев иммуногена согласно изобретению представляют собой активированные трезилом, тозилом и малеимидо полисахариды, особенно активированный трезилом декстран (ТАО), активированный тозилом декстран (ТокАО) и активированный малеимидо декстран (МАО).

Предпочтительно, чтобы связь между полигидроксиполимерным носителем и связанными с ним аминокислотными последовательностями расщеплялась пептидазами, например, такими как пептидазы, активные при процессинге антигенов в АРС. Следовательно, предпочтительно, чтобы по меньшей мере первая и по меньшей мере вторая аминокислотные последовательности связывались с активированным полигидроксиполимерным носителем посредством амидной или пептидной связи. Особенно предпочтительно, чтобы каждая из по меньшей мере первой и по меньшей мере второй аминокислотных последовательностей предоставляла азотную группу для соответствующей ей амидной связи.

Полигидроксиполимерный носитель может не содержать аминокислотные остатки, если нужно, чтобы активационная группа предоставляла часть расщепляемой пептидазой связи, но, как указано выше, носитель может просто включать в себя спейсер, включая в себя по меньшей мере одну Ьаминокислоту. Тем не менее по меньшей мере первая и по меньшей мере вторая аминокислотные последовательности обычно связываются с активированным вариантом полигидроксиполимера посредством азота на Ν-конце аминокислотной последовательности.

Описанный выше применяемый в большинстве случаев иммуноген согласно настоящему изобретению можно применять в способах иммунизации, по существу, как здесь описано, для полипептидных вакцин. То есть все обсуждаемые здесь описания, относящиеся к дозам, способам введения и составу полипептидных вакцин для понижающей регуляции амилоидогенных полипептидов с соответствующими изменениями используют для обычно применяемых иммуногенов.

Обычно применяемый безопасный способ вакцинации

Как обсуждалось выше, одно из предпочтительных осуществлений настоящего изобретения влечет за собой применение вариантов амилоидогенных пептидов, не способных предоставить собственные Т_нэпитопы, способные управлять иммунным ответом против амилоидогенного полипептида.

Однако авторы настоящего изобретения полагают, что данная стратегия для разработки аутовакцин и для вызова аутоиммунитета представляет собой применимую в большинстве случаев технологию, которая является объектом изобретения сама по себе. Следует считать особенно удобным случаи, когда искомый для понижающей регуляции аутоантиген находится в организме в существенном избытке, так что возможно, что может произойти аутостимуляция иммунного ответа. Следовательно, все приведенные выше описания данного осуществления, поскольку это относится к обеспечению аутоиммунного ответа против АРР или Ав, с соответствующими изменениями, применимы к иммунизации против собственных полипептидов, особенно тех, которые представлены в существенных количествах, чтобы поддерживать иммунный ответ в форме неконтролируемого аутоиммунного состояния ввиду того, что Тнэпитопы соответствующих собственных белков направляют иммунный ответ.

Пример 1. Подход аутовакцинации для иммунизации против ΆΌ.

Тот факт, что мыши, характеризующиеся нокаутом гена белка Ав, не обнаруживают никаких отклонений или неблагоприятных побочных эффектов, указывает на то, что устранение или уменьшение количеств Ав является безопасным, Ζ1κη§ Н. (1996).

Опубликованные экспериментальные данные, где трансгенных животных иммунизировали против трансгенного белка Ав человека, указывают на то, что если возможно нарушить аутотолерантность, то понижающую регуляцию Ав можно получить посредством аутореактивных антител. Данные эксперименты, кроме того, указывают на то, что такая понижающая регуляция Ав потенциально могла бы как предотвращать формирование бляшек, так и очищать головной мозг от уже сформировавшихся Авбляшек, ср. 8сйепк е! а1. (1999). Однако обычно невозможно получить антитела против собственных белков.

Таким образом, опубликованные данные не предоставляют способов нарушения истинной аутотолерантности по отношению к истинным собственным белкам. Данные не дают также информации о том, как можно удостовериться в случае необходимости, что иммунная реакция направлена исключительно или преимущественно против отложений Ав, а не против связанного с клеточной мембраной белкапредшественника Ав (АРР). Иммунный ответ, получаемый с помощью существующей технологии, будет преимущественно вызывать иммунный ответ по отношению к собственным белкам нерегулируемым образом, так что можно получить нежелательную или избыточную аутореактивность по отношению к уча

- 28 007533 сткам белка Άβ. Следовательно, с применением существующих стратегий иммунизации, скорее всего, невозможно получить сильные иммунные ответы по отношению к собственным белкам; более того, это небезопасно из-за потенциальной сильной перекрестной реактивности по отношению к связанному с клеточной мембраной АРР, который присутствует в большом количестве клеток ЦНС.

В настоящем изобретении предоставлены способы эффективной выработки сильного иммунного ответа по отношению к истинным собственным белкам, которые потенциально могут формировать бляшки и вызывать серьезное заболевание ЦНС или других частей организма. С применением данной технологии будет разработана безопасная и эффективная терапевтическая вакцина на основе белка Άβ для лечения АО.

В свете этого можно ожидать, что АО заболевание, которое по предсказаниям могло нанести ущерб системе здравоохранения в следующем столетии, можно вылечить; или такие описанные вакцины могут, по меньшей мере, создавать эффективный терапевтический подход к лечению симптомов и прогрессии данного заболевания. Данный способ представляет собой совершенно новый иммунологический подход к блокированию накопления амилоида при АЭ, а также при других неврологических заболеваниях.

В таблице ниже указаны 35 рассматриваемых конструкций. Все позиции даны в таблице относительно стартового метионина АРР (первая аминокислота в 8ЕР ΙΌ N0:2) и включают как стартовую, так и конечную аминокислоты, например, фрагмент 672-714 включает как аминокислоту 672, так и 714. Стартовые и конечные положения для Р2 и Р30 показывают, что эпитоп замещает часть фрагмента АРР в указанных положениях (оба положения включены в замену), в большинстве конструкций введенные эпитопы замещают фрагмент, равный по длине эпитопу. Звездочки в таблице означают следующее:

*) Только одно положение для Р2 и Р30 указывает на то, что в данном положении эпитоп вставляли в производное АРР (эпитоп начинается с аминокислоты, примыкающей к указанному положению со стороны С-конца).

**) Конструкция 34 содержит три идентичных фрагмента АРР, разделенных посредством Р30 и Р2, соответственно.

***) Конструкция 35 содержит девять идентичных фрагментов АРР, разделенных посредством чередующихся эпитопов Р30 и Р2.

Конструкции АРР АЩоУас

№ варианта	Начало фрагмента АРР относительно 1 ак АРР	Конец фрагмента АРР относительно 1 ак АРР	Положение эпитопа Р2 относительно 1 ак АРР	Положение эпитопа РЗО относительно 1 ак АРР	Длина молекулы
1	630	770	656-670	635-655	141
2	630	714	656-670	635-655	85
3	672	770	735-749	714-728	99
4	672	770		714-728	99
5	672	770	714-728		99
6	672	770	723*	723*	135
7	672	770		723*	120
8	672	770	723*		114
9	672	714		672*	64
10	672	714		714*	64
11	672	714	672*		58
12	672	714	714*		58
13	672	714	714*	672*	79
14	672	714	680-694		43
14	672	714	685-799		43
16	672	714	690-704		43
17	672	714	695-709		43
18	672	714		675-695	43

- 29 007533

19	672	714		680-700	43
20	672	714		685-705	43
21	672	714		690-710	43
22	672	714	680*	680*	79
23	672	714	690*	690*	79
24	672	714	700*	700*	79
25	672	714	710*	710*	79
26	672	714		680*	64
27	672	714		690*	64
28	,672	714		700*	64
29	672	714		710*	64
30	672	714	680*		58
31	672.	714	690*		58
' 32	672	714	700*		58
33	672	714	710*		58
34	672	714	После повтора 1**	После повтора 2**	165
35	672	714	34χ3	34x3***	165

Участок АРР, против которого наиболее интересно получить ответ, составляет 43 аминокислоты корового пептида Ав (Ав-43, соответствующий 8ЕР ГО Ν0:2, остатки 672-714), который является основной составляющей амилоидных бляшек в головном мозге при АО. Данный фрагмент АРР является частью всех перечисленных выше конструкций.

Варианты 1 и 2 содержат участок АРР против хода транскрипции от Ав-43, где поместили модельные эпитопы Р2 и Р30. Все варианты 1 и 3-8 содержат фрагмент С-100, являющийся, как показано, нейротоксичным - фрагмент С-100 соответствует аминокислотным остаткам 714-770 из 8ЕР ГО Ν0:2. В вариантах 3-5 эпитопы замещают часть фрагмента С-100, в то время как в вариантах 6-8 эпитопы вставляли в С-100.

Варианты 9-35 содержат только коровый белок Ав-43. В вариантах 9-13 Р2 и Р30 слиты с тем или другим концом Ав-43; в 14-21 Р2 и Р30 замещают часть Ав-43; в 22-33 Р2 и Р30 вставляли в Ав-43; 34 содержит три идентичных фрагмента Ав-43, разделенных Р30 и Р2, соответственно; 35 содержит 9 повторов Ав-43, разделенных чередующимися эпитопами Р2 и Р30.

Согласно настоящему изобретению, в иммуногенных аналогах можно также применять укороченные части обсуждаемого выше белка Ав-43. Особенно предпочтительными являются укороченные части Ав(1-42), Ав(1-40), Ав(1-39), Ав(1-35), Ав(1-34), Ав(1-34), Ав (1-28), Ар(1-12), Ав(1-5), Ав(13-28), Ав(13-35), Ав(17-28), Ав (25-35), Ав(35-40), Ав(36-42), и Ав(35-42) (где номера в скобках указывают аминокислотные участки Ав-43, которые составляют соответствующий фрагмент, например, Ав(35-40) идентичен аминокислотам 706-711 в 8ЕР ГО Ν0:2). Все данные варианты с укороченными частями Ав43 можно получить с фрагментами Ав, описанными здесь, в особенности с вариантами 9,10, 11,12, и 13.

В некоторых случаях предпочтительно, чтобы Ав-43 или его фрагменты были мутантными. Особенно предпочтительными являются варианты замены, в которых метионин в положении 35 Ав-43 замещен предпочтительно на лейцин или изолейцин или просто удален. Особенно предпочтительные аналоги содержат одиночный метионин, расположенный на С-конце, либо ввиду того, что он является природным в амилоидогенном полипептиде или чужеродном эпитопе Т_н, либо ввиду того, что его вставили или добавили. Следовательно, также предпочтительно, чтобы тот участок аналога, который включает в себя чужеродный эпитоп Тн, являлся свободным от метионина, за исключением возможного С-концевого расположения метионина.

Фактически, как правило, предпочтительно, чтобы все аналоги АРР или Ав, которые применяют согласно настоящему изобретению, обладали общей характеристикой простого включения одногоединственного метионина, расположенного в аналоге как С-концевая аминокислота, а все остальные метионины как в амилоидогенном полипептиде, так и в чужеродном эпитопе Тн, были удалены или замещены другой аминокислотой.

Интересной дополнительной мутацией является делеция или замещение фенилаланина в положении 19 в Ав-43, и особенно предпочтительно, чтобы данная мутация представляла собой замену этого остатка фенилаланина на пролин.

Следующая таблица определяет группу особенно предпочтительных конструкций, функционирующих с укороченными формами или мутациями Ав-43:

- 30 007533

№ варианта	Сегмент Αβ, применяемый в молекуле, относительно 1 ак Αβ (1-42/43)	Положение сегмента Αβ относительно 1 ак молекулы	Положение эпитопа Р2 относительно 1 ак молекулы	Положение эпитопа РЗО относительно 1 ак молекулы	Общая длина молекулы (ак)
36	1-28	22-49	50-64	1-21	64
37	1-12 (а) + 13-28 (Ь)	1-12 (а) + 49-64 (Ь)	34-48	13-33	64
38	1-12 (х 3)	1-12, 34-45, 61-72	46-60	13-33	72
39	13-28 (х 3)	1-16, 38-53, 69-84	54-68	17-37	84
40	1-12 (а) + 13-35(Ь) +36-42 (с)	1-12 (а) + 34-56 (Ь) + 72-78 (с)	57-71	13-33	78
41	1-28 (х 3)	1-28, 50-77, 93-120	78-92	29-49	120
42	1-43 (Г19Р/М35К)	1-43	65-79	44-64	79

В данной таблице сегмент Ав, используемый в молекуле, указан посредством номеров аминокислот относительно 1 ак молекулы Ав (1-42/43), т.е. 1-28 означает, что в молекуле использовали фрагмент Ав (1-42/43) 1-28. Если использовали два или более различных фрагментов, в таблице указаны оба, т.е. 112 (а) + 13-28 (Ь) означает, что в молекуле использован как фрагмент Ав (1-42/43) 1-12, так и фрагмент 13-28.

Также если один и тот же сегмент присутствует в конструкции более чем в одной копии, это указано в таблице, т.е. 1-12 (х3) указывает на то, что фрагмент Ав (1-42/43) 1-12 присутствует в конструкции в трех копиях.

Далее, положение сегмента Ав в молекуле указана посредством позиций аминокислот относительно первой аминокислоты в молекуле, т.е. 22-49 указывает на то, что рассматриваемый фрагмент Ав расположен в молекуле от 22 аминокислоты до 49 аминокислоты, включая оба положения. Положения эпитопов Р2 и Р30 обозначены таким же образом. Если в молекуле использовали два или более различных фрагмента Ар, все их положения указаны, т.е. 1-12 (а) + 49-64 (Ь) означает, что фрагмент (а) располагается в молекуле от ак 1 до ак 12, и фрагмент (Ь) - от ак 49 до 64.

Более того, если в молекуле присутствует более одной копии одного и того же фрагмента, указаны положения всех копий, т.е. 1-12, 34-45, 61-72 показывает, что три копии фрагмента Ав размещаются в молекуле в положениях 1-12, 34-45 и 61-72, соответственно.

Наконец, указание суммарной длины каждой молекулы включает и фрагмент(ы) Ав, и эпитопы Р2 и Р30.

Вариант 42 содержит две аминокислотные замены в положениях 19 (рГе на рго) и 35 (те! на ^δ), как это указано в столбце, представляющем фрагменты Ав.

См. фиг. 1 и таблицы выше относительно деталей конкретных точек введения чужеродных Тклеточных эпитопов.

Один из дополнительных типов конструкций является особенно предпочтительным. Так как одной из задач настоящего изобретения является избежание разрушения клеток, продуцирующих АРР, в то время как устранение Ав является желательным, представляется подходящим получить конструкции аутовакцин, включающие в себя только те части Ав, которые, когда присутствуют в АРР, не экспонируются во внеклеточной фазе. Таким образом, подобные конструкции должны содержать по меньшей мере один В-клеточный эпитоп, полученный из аминокислотного фрагмента, определяемого аминокислотами 700-714 в 8ΕΡ ΙΌ N0:2. Так как предсказано, что такой короткий полипептидный фрагмент будет только слабо иммуногенным, предпочтительно, чтобы такая конструкция аутовакцины состояла из нескольких копий В-клеточного эпитопа, например, в виде конструкции, обладающей структурой, показанной в формуле 1 в подробном описании настоящего изобретения, ср. выше. В данной версии формулы 1 термины амилоид_е1-амилоид_ех представляют х В-клеточный эпитоп, содержащий последовательность аминокислот, полученную из аминокислот 700-714 8Ερ II) N0:2. Предпочтительная альтернатива представляет собой подробно описанную выше возможность связывания амилоидогенного (поли)пептида с выбранным Т-хелперным эпитопом посредством амидной связи с полисахаридной молекулой-носителем, таким способом становятся возможными множественные презентации слабого эпитопа, сконструированного аминокислотами 700-714 8Ερ П) N0:2, а также становится возможным выбор оптимального соотношения между В-клеточными и Т-клеточными эпитопами.

Пример 2. Иммунизация трансгенных мышей Ав и модифицированными белками согласно изобретению.

Конструирование ДНК, кодирующей ГЛВ43+-34. Ген ГЛВ43+-34 конструировали в несколько стадий. Сначала получали фрагмент ПЦР с праймерами МЕ№801 (8Ερ П) N0:10) и МЕ№802 (8Ερ П) N0:11), применяя в качестве матрицы праймер МЕ№800 (8Ερ ΙΙ) N0:9). МЕ№800 кодирует фрагмент аЬе!а-43 человека с оптимизированными для Е. гоН кодонами. МЕ№801 и 802 добавляют к фрагменту

- 31 007533 подходящие участки рестрикции.

Фрагмент ПЦР очищали, расщепляли \со! и Н1ибIII, снова очищали и клонировали в расщепленном ^оЬНшбШ и очищенном векторе для экспрессии в Е. сой рЕТ28Ъ+. Полученную плазмиду, кодирующую Ав-43 дикого типа человека, назвали рАВ 1.

На следующей стадии к С-концу молекулы добавляли Т-хелперный эпитоп Р2. Праймер МЕ№806 (8Е() II) N0:12) содержит последовательность, кодирующую эпитоп Р2, таким образом, продукт слияния Р2 и аЪе!а-43 получают посредством реакции ПЦР.

Клонирование проводили посредством получения фрагмента ПЦР с праймерами МЕ№178 (8ЕО II) N0:8) и МЕ№806, применяя в качестве матрицы рАВ1. Фрагмент очищали, расщепляли NсоI и НшбШ, снова очищали и клонировали в расщепленном ^оШибИ и очищенном векторе рЕТ28Ъ+. Полученную плазмиду назвали рАВ2.

Аналогичным способом получали другую плазмиду, несущую кодирующую последовательность Ав-43 с другим Т-хелперным эпитопом, Р30, добавленным к \-концу. Это выполняли посредством получения фрагмента ПЦР с праймерами МЕ№105 (8ЕР ГО N0:7) и МЕ№807 (8ЕР ГО N0:13), применяя в качестве матрицы рАВ1.

Фрагмент очищали, расщепляли Хссй и НшбШ, снова очищали и клонировали в расщепленном ^оЬНшбШ и очищенном векторе рЕТ28Ъ+. Полученную плазмиду назвали рАВ3.

На третьей стадии второй повтор Ав-43 с С-конца добавляли к эпитопу Р2 плазмиды рАВ2 посредством праймера МЕ№809 (8ЕР ГО N0:14). В то же время МЕ№809 создает сайт Ват1 II непосредственно после повтора Ав-43. Фрагмент ПЦР получали с праймерами МЕ№178 и МЕ№809, применяя в качестве матрицы рАВ2. Фрагмент расщепляли Хссй и НтбШ, очищали и клонировали в расщепленном \соЕ НшбШ и очищенном векторе рЕТ28Ъ+. Данную плазмиду назвали рАВ4.

Наконец, последовательность эпитоп Р30 - повтор Ав-43 из рАВ3 клонировали в плазмиду рАВ4. Это выполняли посредством получения фрагмента ПЦР с праймерами МЕ№811 (8 ЕС) ГО N0:16) и МЕ№105, применяя в качестве матрицы рАВ3. Фрагмент очищали и использовали в качестве праймера в последующей ПЦР с МЕ№810 (8Е() II) N0:15), применяя в качестве матрицы рАВ3. Подученный фрагмент очищали, расщепляли Ват1 II и НтбШ и клонировали в расщепленную ВатН-Нтб!II и очищенную плазмиду рАВ4. Полученная плазмида, рАВ5, кодирует молекулу ЙАВ43+-34.

Все способы ПЦР и клонирования, по существу, выполняли, как описано в БатЪгоок, I., Ргйзсй, Е.Р. & Матайз, Т. 1989 Мо1еси1аг с1оитд: а 1аЪога!огу таииа1. 2иб. Еб. Со1б 8ргтд НагЪог ЬаЪога!огу, КУ.

Для всех способов клонирования применяли клетки Е. сой К-12, штамм Тор-10 Р' (8!га!адеие, и8А). Вектор рЕТ28Ъ+ получали в Ходаце'и, и8А. Все праймеры синтезировали в ОКА Тесйио1оду, Эеитагк.

Экспрессия и очистка ЙАВ43+-34. Белок ЙАВ43+-34, кодируемый рАВ5, экспрессировали в клетках Е. сой ВЬ21-Оо1б (Коданее]) как описано производителями системы рЕТ28Ъ+ (АодацееС).

Экспрессированный белок ЙАВ43+-34 очищали до более чем 85% чистоты посредством промывания телец включения с последующей катионообменной хроматографией в присутствии 6 М мочевины с применением автоматизированного рабочего места для очистки ВюСаб (Рег8ер!1уе Вю8у§!еш8, и8А). Затем мочевину удаляли посредством ступенчатого диализа против раствора, содержащего уменьшающиеся количества мочевины. Конечный буфер представлял собой 10 мМ Тпз, рН 8,5.

Исследование иммунизации. Для исследования использовали мышей, трансгенных по АРР (белокпредшественник болезни Альцгеймера) человека. Данные мыши, названные ТдК\1)8·, экспрессируют мутантную форму АРР, что приводит к высоким концентрациям Ав-40 и Ав-42 в головном мозге мышей (Заинз, С. е! а1.).

Мышей (8-10 мышей в группе) иммунизировали или АЪе!а-42 (8ЕС) II) N0:2, остатки 673-714, синтезированным посредством стандартного способа с Ртос), или вариантом ЙАВ43+-34 (конструкция 34 в таблице в примере 1, полученная рекомбинантным способом) четыре раза с двухнедельными интервалами. Дозы составляли 100 мг для Ав или 50 мг для ЙАВ43+-34. У мышей забирали кровь на 43 сутки (после трех инъекций) и после 52 суток (после четырех инъекций), и для определения уровня специфических титров антител против Ав-42 с применением прямого Е1 Д8/\ Ав-42 использовали сыворотку.

Следующая таблица показывает средние относительные титры антител против АЪе!а-42.

Иммуноген	43 сутки (после 3 иммуниз аций)	52 сутки (после 4 иммунизаций)
Αβ-42	4000	3000
ЙАВ43+-34	16000	23000

Как становится ясно, титры антител, полученные при иммунизации вариантом Ав ЙАВ43+-34, выше приблизительно в 4 раза и в 7,5 раз после 3 и 4 иммунизаций, соответственно, чем титры, полученные с применением в качестве иммуногена неизмененного Ав-42 дикого типа. Данный факт в перспективе можно оценить дополнительно, если принять во внимание тот факт, что количество применяемого для

- 32 007533 иммунизации варианта составляет только 50% от количества применяемой для иммунизации последовательности дикого типа.

Пример 3. Синтез Ав сополимерной пептидной вакцины с применением активированного полигидроксиполимера в качестве структурирующего агента.

Введение. Традиционная конъюгированная вакцина состоит из (поли)пептида, ковалентно связанного с белком-носителем. Пептид содержит В-клеточный(е) эпитоп(ы), а белок-носитель предоставляет Т-хелперные эпитопы. Однако большинство белков-носителей в норме являются неподходящими в качестве источников Т-хелперных эпитопов, так как только незначительная часть всей последовательности содержит подходящие Т-хелперные эпитопы. Такие эпитопы можно определить и синтезировать как пептиды, например, по 12-15 аминокислот. Если данные пептиды ковалентно связаны с пептидами, содержащими В-клеточные эпитопы, например, посредством поливалентного активированного полигидроксиполимера, можно получить молекулу вакцины, которая содержит только значимые участки. В дальнейшем можно получить вакцинный конъюгат, который содержит оптимизированное соотношение между В-клеточными и Т-клеточными эпитопами.

Синтез активированного полигидроксиполимера

Полигидроксиполимеры, такие как декстран, крахмал, агароза и т.д. можно активировать 2,2,2трифторэтансульфонилхлоридом (трезилхлоридом) или посредством гомогенного синтеза (декстран), растворенным в №метилпирролидоне (NМΡ) или способом гетерогенного синтеза (крахмал, агароза, структурированный декстран), например, в ацетоне.

В сухих условиях в 500 мл круглодонную колбу, снабженную магнитом для перемешивания, к высушенному вымораживанием, водорастворимому декстрану (4,5 г, 83 ммоль, очищенный до степени, пригодной для клинического применения, М\г (средн.) 78000) добавляли 225 мл сухого N метилпирролидона (NМΡ). Колбу помещали в масляную баню с температурой 60°С с магнитным перемешиванием. Температуру поднимали до 92°С на период более 20 мин. При растворении декстрана колбу немедленно удаляли из масляной бани, и температуру в бане понижали до 40°С. Колбу снова помещали в масляную баню, все еще с магнитным перемешиванием, и капельно добавляли трезилхлорид (2,764 мл, 25 ммоль). Через 15 мин по каплям добавляли сухой пиридин (безводный, 2,020 мл, 25 ммоль). Колбу удаляли из масляной бани и проводили перемешивание в течение 1 ч при комнатной температуре. Продукт (декстран, активированный трезилом, ТАЭ) осаждали в 1200 мл холодного этанола (99,9%). Супернатант сливали, и осадок собирали в 50 мл полипропиленовые пробирки в центрифуге при 2000 об/мин. Осадок растворяли в 50 мл 0,5% уксусной кислоты, 2 раза диализовали против 5000 мл 0,5% уксусной кислоты и сушили вымораживанием. ТАЭ можно хранить при -20°С в виде высушенного вымораживанием порошка.

Нерастворимый полигидроксиполимер, такой как агароза или структурированный декстран, можно активировать трезилом посредством приготовления суспензии полигидроксиполимера, например, в ацетоне, и проведения синтеза в виде твердофазного синтеза. Активированный полигидроксиполимер можно собрать посредством фильтрации. Подходящие способы опубликованы, например, у №1ккоп К. апб МокЬасН К. (1987), Мебюбк ίη Епхушокду 135, р.67, и в Негтапккоп С.Т. е1 а1. (1992), ίη 'ТттоЬПкеб АГПпбу Ыдапб ТесЬпк[иек, Асабетк Ргекк, Шс., р.87.

Синтез сополикерных пептидных вакцин Α Бе1а

ТАЭ (10 мг) растворяли в 100 мкл Н₂О и 1000 мкл карбонатного буфера, рН 9,6, содержащего 5 мг Ав-42 (8ЕО ГО N0:2, остатки 673-714), 2,5 мг Р2 (8ЕО ГО N0:4) и добавляли 2,5 мг Р30 (8ЕО ГО N0:6). Все пептиды, Ав-42, Р2 и Р30, содержали защищенные лизиновые группы: они находились в форме лизиновых групп, защищенных 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этилом (Обе). Пептиды получали стандартным способом с Етос, где стандартный Етос-Ьук(Вос)-ОН замещали на Етос-Ьук(Эбе)ОН (получено в Ш^лЬксНет, кат. № 04-12-1121), т.е. ε-аминогруппу лизина защищали Обе вместо Вос.

Измеряли величину рН и доводили до 9,6 с помощью 1 М НС1. Через 2,5 ч при комнатной температуре добавляли гидразин из 80% раствора до конечной концентрации гидразина 8%, инкубировали раствор еще 30 мин при комнатной температуре, и немедленно после этого сушили вымораживанием. Высушенный вымораживанием продукт растворяли в Н2О и диализовали в значительной степени против Н20 перед конечной сушкой вымораживанием.

Соотношение между В-клеточными эпитопами (Ав) и Т-хелперными эпитопами (Р2 и Р30) в конечном продукте можно варьировать, применяя различные концентрации этих пептидов на стадии синтеза. Более того, в конечный продукт можно ввести метку, например, маннозу (как мишень для конъюгации с АРС) посредством добавления аминированной маннозы к карбонатному буферу на стадии синтеза.

Если применяют нерастворимый активированный полигидроксиполимер, чтобы связывать пептиды, содержащие В-клеточный эпитоп и Т-хелперные эпитопы, связывание с полимером можно проводить как твердофазный синтез, а конечный продукт собирают и очищают путем промывки и фильтрации.

Как указано в основном описании, описанный в настоящем документе подход для получения вакцины на основе пептидов можно применять для любого другого полипептидного антигена, где будет удобно получать чистую синтетическую пептидную вакцину, и где рассматриваемый полипептидный

- 33 007533 антиген обеспечивает достаточную иммуногенность в одном отдельном пептиде.

Пример 4. Синтетические сополимерные пептидные вакцины.

ТАО (10 мг) растворяли в 100 мкл Н₂О и 1000 мкл карбонатного буфера, рН 9,6, содержащего 1-5 мг пептида А (любого представляющего интерес иммуногенного пептида!), добавляли 1-5 мг Р2 (эпитопа Р2 дифтерийного анатоксина) и 1-5 мг Р30 (эпитопа Р30 дифтерийного анатоксина). Измеряли величину рН и доводили до 9,6, используя 0,1 М НС1.

После 2,5 ч при комнатной температуре раствор затем немедленно высушивали вымораживанием. Высушенный вымораживанием продукт растворяли в Н2О, и перед конечной сушкой вымораживанием в значительной степени диализовали против Н2О или удаляли соли гель-фильтрацией на колонке. В случае наличия лизина в последовательности пептидов, ε-амин в боковой цепи лизина следует защитить посредством Обе с применением в синтезе производного Ртос-Ьух(Обе)-ОН (предложен Сгедогшх апб Тйе1хеп 2001). После связывания добавляли гидразин из 80% раствора до конечной концентрации гидразина в пределах 1-20%, и инкубировали раствор еще 30 мин при комнатной температуре, после этого немедленно проводили сушку вымораживанием, и перед конечной сушкой вымораживанием в значительной степени диализовали против Н₂О или удаляли соли путем гель-фильтрации на колонке. Принцип в схематической форме изложен на фиг. 2.

В качестве пептида А авторы настоящего изобретения использовали такие иммуногены как иммуногены с коротким С-концевым фрагментом белка ОхрС из Воггейа Ьигдбогкеп, а в качестве пептида В - с эпитопом дифтерийного анатоксина (Р2 или Р30). Результаты исследований иммунизации этим антигеном выявили, что только иммуноген согласно изобретению, включающий в себя фрагмент ОхрС и чужеродный дифтерийный эпитоп, соответствующий гаплотипу МНС вакцинированных мышей, был способен индуцировать у этих мышей антитела, реагирующие с ОхрС. Напротив, молекула, содержащая только пептид ОхрС, была неспособна индуцировать продукцию антител, и то же самое являлось справедливым для смеси 2 иммуногенов, где один содержал ОхрС, а другой - эпитоп. Поэтому сделано заключение, что включение в один и тот же полигидроксиполимерный носитель является лучшим, если не неотъемлемым, для индукции продукции антител против короткого пептидного гаптена, подобного ОхрС.

Список ссылок

Вгооктеуег, К., Сгау, 8., Катах, С. (1998). Рго)есРопх ок АОйейпег'х Э|хеахе ш 1Не Ипйеб 8(а(ех апб !йе РиЬИс Неайй 1трас! ок Ое1аутд Э|хеахе Опхе!. Атепсап 1оигпа1 ок РиЬйс Неайй, 88(9), 1337-1342.

Вий1ш, М., Ог1й, М., Ве11ох!а, 8., Акееке, Н., Рйах, Κ.Ε., ^ухх-Согау, Т., Миске, Ь., Май1еу, К.XV. (1999). Ехргеххюп ок Нитап АройроргсИет Ε3 ог Ε4 ш !йе Вгашх ок Арое-/- М1се: 1хокогт-8ресШс Еккес!х оп №игобедепега!кп. 1оигпа1 ок №игохскпсе, 19, 4867-4880.

С1агк, Ь.К, Роогка.), Р., ^х/о1ек, Ζ., СехсйМпб, О.Н., №1хгеббй1е, Ζ.8., М111ег, В., Ы, Ό., Рауат1, Н., Атаг!, Р., Магкорои1ои, К., Апбгеаб1х, А., Э^ои/а, I., Ьее, У.М., Кееб, Ь., Тго_)апотак1, 1.Ц., Ζйика^еνа, V., В1гб, Т., 8сйе11епЬегд, С., ^11йе1тхеп, К.С. (1998). Ра!йодешс 1тр1ка!кпх ок Ми!а!кпх ш !йе Таи Сепе ш Ра111бо-Роп!о-№дга1 Оедепегайоп апб Ке1а!еб №игобедепегайсе Й1хогбегх Ыпкеб 1о Сйготохоте 17. Ргосеебтдх ок !йе №11кпа1 Асабету ок 8скпсех И.8.А., 95(22), 13103-13107.

Сир!а, К. К. е! а1. (1998), Ое\ Вю1 8!апб. 92: 63-78.

Нх1ао К. е! а1. (1998) «Тгапхдешс тке ехргеххтд А1хйейпег атуШб ргесигхог рго!етх», Εxр. Сегоп!о1. 33(7-8), 883-889.

Ни!!оп, М., Ьепбоп, С.Ь., Κίζζυ, Р., Вакег, М., Ргоейсй, 8., Нои1беп, Н., Рккегтд-Вгота, 8., Сйакгауейу, 8., 1хаасх, А., Сгоуег, А., Наскей, 1., Абатхоп, 1., Ьшсо1п, 8., Оккхоп, Ό., Оа\кх, Р., Ре!егхеп, К.С., 8!еуепх, М., бе Сгаакк, Ε., ^аи!егх, Ε., уап Вагеп, 1., НШеЬгапб, М., коххе, М., Ктап, 1.М., ^таШу, Р., Сйе, Ь.К., ^поп, 1., Мотх, 1.С., Кееб, ΠΕ., Тго_)апотак1, 1., Вахип, Н., ЬаппкеЙ, Ь., №ух!а!, М., Райп, 8., Оагк, Р., ТаппепЬегд, Т., Ообб, Р., Наутагб, Ν., Ктак, кВ.к; 8сйоПе1б, Р.К., Апбгеаб1х, А., 8по^беп, 1., Сгаикигб, Ό., №агу, Ό., Отап, Р., Оох!га, В.А., Нагбу, 1., Соа!е, А., уап 8тае!еп, 1., Мапп, Ό., Ьупск, Т., НеиИпк, Р. (1998).

Аххошайоп ок М1ххепхе апб 5'-8р1ке-8йе Ми!а!кпх т Таи \νί11ι !йе 1пйегйеб Оетепйа РТЭР-17. №!иге, 393, 702-705.

1апих, С. е! а1. (2000), КаШге 408: 979-982.

Ках, Н.8. (1997) 1 Мкгоепсархи1 14: 689-711.

Ьеоп, 1., Сйепд, С.К., №итапп, Р.1. (1998).

Акйейпег'х Э|хеахе Саге:Сох!х апб Ро!епйа1 8а\апдх. Неайй АГГайх, 17(6), 206-216.

Ырра С. Р. е! а1. (1998) АЬ-42 берохйкп ргесебех о!йег сйапдех т Р8-1 Акйеипег'х б1хеахе. Ьапсе! 352, 1117-1118.

Ьио, 1.-1., ХУайасе, ^., Ккскш, Т., 1пдгат, О.К., Ко!й, С.8., Ких1ак, кХУ. (1999). Эеа1й ок РС12 Се11х апб Н1рросатра1 №игопх 1пбисеб Ьу Абепо-У1га1-Меб1а!еб РАО Нитап АтуШб Ргесигхог Рго!ет Сепе Εxр^ехх^οη. 1оигпа1 ок №игохскпсе Кехеагсй, 55(5), 629-642.

№1гихе, 8., ТЫпакагап, С., Ьио, 1.-1., Ких1ак, 1ЛУ., Тотйа, Т., 1та!хиЬо, Т., 01ап, X., Сш1у, Ο.Ώ., Расе, О.Ь., ВогсйеИ, Ώ.Κ., ХУопд, Р.С., 81хоб1а, 8.8. (1998). Εккес!х ок Р81 Оекккпсу оп МетЬгапе Рго!еш ТгаГкккшд т №игопх. №игоп, 21(5), 1213-1231.

- 34 007533

МЛоп-Н ЛкЛи!е ои Адшд Ргодгекк Керой ои Аккетег'к Оценке, 1999, МН РиЬНсайои № 99-4664.

Р1е!гоЬои, Р.1. (1995), Ркагш ВЮесНиоН 6: 347-61 Роогка.), Р., В1гб, Т.О., ^укшаи, Е., №шеик, Е., Сагги!о, К.М., Аибегкои Ь., Аибгеаб1к, А., ^1ебеЛо1б, ^.С., Какктб, М., 8ске11еиЬегд, С.Э. (1998). Таи Н а Саиб1ба!е Сеие £ог Скгошокоше 17 Егои!о!ешрога1 Оешеийа. Аииа1к о£ №иго1оду, 43, 815-825.

^сбеик, Ό., ВагЬоиг, К., 0111-111 ^., Согбои, С., Сга_)еба, Н., Сшбо, Т., Ни, К., Ниаид, I., .Гокикои-^ооб, К., КНаи, К., КМобеико, Ό., Ьее, М., Ыао, Ζ., ЫеЬегЬигд, I., Мойег, К., Мийег, Ь., 8опаио, Е., 8Норр, С., Уакдие/, Ν., Уаибеуей, С., ^а1кег, 8., ^одиНк, М., Уебиоск, Т., Сашек, Ό., 8еиЬей, Р. (1999). [11111111111/3йои \νί11ι А-Ье!а Айеииа!ек АОНениег'к О1кеаке-Ыке РаЛо1оду 1и [Не РОАРР Мойке. Манге, 400 (6740), 173177.

8Некииоу, В. е[ а1. (1999), I. Сгук!а1 СгозгЛ 198/199: 1345-1351.

813111111111111 М.С., Мште11, 1.К., Соебей, М., Гайоте, М.К., К1ид, А., СНеЛ, В. (1998). МЛайои 1и Фе Таи Сеие ш ЕашЛа1 МиШр1е 8ук!еш ТаиораЛу \νί11ι Ргекеш1е Оешеийа. Ргосеебтдк о£ Ле МаюшН Асабешу о£ 8с1еисек И.8.А., 95(13), 7737-7741.

81ййшайег, ^.1., 8аиибегк, А.М., 8сЬшеске1, Ό., Рейсак-Уаисе, М., ЕидЫ1б, I., 8а1уекеи, С.8., Кокек, А.О. (1993). АроНроргсИет Е:Н1дН-Ау1бйу Вшбшд 1о Ар аиб Лсгеакеб Егедиеису о£ Туре 4 А11е1е ш Ьа!еОике! ЕашЛа1 АОНениег О1кеаке. Ргосеебтдк о£ Ле №!юиа1 Асабешу о£ 8с1еисек И.8.А., 90, 1977-1981.

У1ба1, К., Егаидтие, В., Койадио, А., Меаб, 8., Кеуек/, Т., Р1аи!, С., СЫко, I. (1999). А 8!ор-Собои МЛайои ш Ле ВШ Сеие Аккоаа!еб \νίΛ ЕашЛа1 ВгЛкН Оешеийа. Манге, 399: 776-781.

Ζ^^ Н. (1996). М1се бейтеи! £ог Ле ашу1о1б ргесигког ргсИет деие. Анн Ν Υ Асаб. 8ск, 777, 421426.

Υο^к, Р. (1999), Р8ТТ 11: 430-440.

Claims

1. Способ понижающей регуляции белка-предшественника амилоида (АРР) или бета-амилоида (Αβ) ίη νΐνο у животных, включая человека, предусматривающий эффективную презентацию иммунной системе животного иммуногенно эффективного количества по меньшей мере одного аналога АРР или Ав, который содержит существенную часть В-клеточных эпитопов АРР и/или Ав и в той же степени, что и нативный АРР или Ав, реагирует с поликлональной сывороткой, полученной против АРР или Ав, а также по меньшей мере один чужеродный Т-хелперный эпитоп (Т_н-эпитоп), причем иммунизация животного указанным аналогом вызывает продукцию антител против аутологичных АРР или Ав животного, и аналог

a) представляет собой полиаминокислоту, которая включает в себя по меньшей мере один чужеродный Тн-эпитоп и разбитую на части последовательность АРР или Ав, так что аналог не содержит фрагмента последовательности ЗЕО ГО N0:2, которая продуктивно связывается с молекулами МНС класса II, вызывая Т-клеточный ответ; и/или

b) представляет собой конъюгат, содержащий полигидроксиполимерный остов, с которым раздельно связана полиаминокислота, как определено в (а); и/или

c) представляет собой конъюгат, содержащий полигидроксиполимерный остов, с которым раздельно связаны (1) по меньшей мере один чужеродный Тн-эпитоп и (2) разбитая на части последовательность АРР или Ав, так что конъюгат не содержит фрагмента последовательности ЗЕО ГО N0:2, которая продуктивно связывается с молекулами МНС класса II, инициирующими Т-клеточный ответ.

2. Способ по п.1, согласно которому в аналог введена по меньшей мере одна первая группа, осуществляющая его нацеливание на антигенпредставляющую клетку (АРС) или В-лимфоцит, и/или введена по меньшей мере одна вторая группа, стимулирующая иммунную систему, и/или введена по меньшей мере одна третья группа, оптимизирующая презентацию аналога иммунной системе.

3. Способ по п.2, согласно которому первая, и/или вторая, и/или третья группа присоединяется(ются) как боковые группы посредством ковалентных или нековалентных связей к соответствующим химическим группам в последовательности аналога АРР или Ав.

- 45 007533

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому аналог представляет собой гибридный белок.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому аналог содержит по меньшей мере один дуплицированный В-клеточный эпитоп АРР или Ав и/или гаптен.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому чужеродный Т-клеточный эпитоп является иммунодоминантным у данного животного.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому чужеродный Т-клеточный эпитоп является смешанным, например чужеродным Т-клеточным эпитопом, который выбран из природного смешанного Т-клеточного зпитопа и искусственной связывающей МНС-ΙΙ пептидной последовательности.

8. Способ по п.7, согласно которому природный Т-клеточный эпитоп выбран из эпитопа анатоксина столбняка, такого как Р2 или Р30, эпитопа дифтерийного анатоксина, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа С8 Р. Га1арагит.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому аналог содержит Вклеточные эпитопы, не экспонированные во внеклеточную фазу, когда он представлен в связанной с клеткой форме полипептида-предшественника Ав.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому аналог не содержит по меньшей мере одного В-клеточного эпитопа, экспонированного во внеклеточную фазу, когда он представлен в связанной с клеткой форме полипептида-предшественника Ав.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому аналог содержит не более 9 последовательно расположенных аминокислот последовательности 8Ε0 ΙΌ N0:2, например не более 8, не более 7, не более 6, не более 5, не более 4 и не более 3.

12. Способ по п.11, согласно которому аналог содержит по меньшей мере один фрагмент последовательности 8Ε0 ΙΌ N0:2, независимо состоящей из 9 последовательно расположенных аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0:2, 8 последовательно расположенных аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0:2, 7 последовательно расположенных аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0:2, 6 последовательно расположенных аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0:2, 5 последовательно расположенных аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0:2, 4 последовательно расположенных аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0:2 и 3 последовательно расположенных аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0:2.

13. Способ по п.11 или 12, согласно которому последовательно расположенные аминокислоты начинаются с аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из остатков 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому осуществляют презентацию иммунной системе по меньшей мере двух копий аналога АРР или Ав, ковалентно или нековалентно связанных с молекулой-носителем, способной к эффективной презентации множественных копий антигенных детерминант.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому в аналоге АРР или Ав, представляющем собой конъюгат, полиаминокислота и Тн-эпитоп связаны с полигидроксиполимером посредством амидной связи.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому в аналоге АРР или Ав, представляющем собой конъюгат, полигидроксиполимерный остов представляет собой полисахарид.

17. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому аналог вводят совместно с адъювантом, облегчающим нарушение аутотолерантности к аутоантигенам.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому эффективное количество аналога вводят животному внутрикожно, подкожно и внутримышечно; перитонеально, перорально, буккально, сублингвально, эпидурально, спинально, анально и интракраниально.

19. Способ по п.18, согласно которому эффективное количество аналога составляет от 0,5 до 2000 мкг.

20. Способ по любому из пп.1-13, согласно которому презентацию иммунной системе аналога АРР или Ав, представляющего собой полиаминокислоту, осуществляют посредством введения в клетки животного нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог, и, таким образом, обеспечивают его экспрессию ш У1уо в клетках.

21. Способ по п.20, согласно которому введенная нуклеиновая кислота выбрана из «голой» ДНК; ДНК, объединенной с заряженными или незаряженными липидами; ДНК, заключенной в липосомы; ДНК, встроенной в вирусный вектор; ДНК, объединенной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом; ДНК, объединенной с нацеливающим белком или полипептидом; ДНК, объединенной со средством, осаждающим кальций; ДНК, связанной с инертной молекулой-носителем; ДНК, инкапсулированной в хитин или хитозан, и ДНК, объединенной с адъювантом.

22. Способ по любому из пп.18-21, предусматривающий по меньшей мере одно введение аналога в год, например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений.

- 46 007533

23. Применение способа по любому из предшествующих пунктов для лечения, и/или профилактики, и/или улучшения течения болезни Альцгеймера или других заболеваний и состояний, характеризующихся отложениями амилоида, согласно которому АРР или Ав подвергают понижающей регуляции до такой степени, что общее количество амилоида уменьшается или скорость формирования амилоида уменьшается с клинической значимостью.

24. Аналог АРР или Ав, полученный из АРР или Ав животного путем введения модификации, приводящей к тому, что иммунизация животного указанным аналогом вызывает продукцию антител против аутологичных АРР или Ав животного, охарактеризованный в любом из пп.1-16.

25. Иммуногенная композиция, содержащая иммуногенно эффективное количество аналога по п.24 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель и/или наполнитель и, необязательно, адъювант.

26. Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий аналог по п.24.

27. Вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты по п.26, в том числе способный к автономной репликации.

28. Вектор по п.27, выбранный из группы, состоящей из плазмиды, фага, космиды, минихромосомы и вирусного вектора.

29. Вектор по п.27 или 28, содержащий в направлении 5'^ 3' промотор, функционально связанный с фрагментом нуклеиновой кислоты по п.26 и направляющий его экспрессию, и, необязательно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, обеспечивающий секрецию полипептидного фрагмента или его интеграцию в мембрану, и, необязательно, терминатор.

30. Вектор по любому из пп.27-29, который при введении в клетку хозяина необязательно интегрируется в геном.

31. Вектор по любому из пп.29 или 30, в котором промотор направляет экспрессию фрагмента нуклеиновой кислоты по п.26 в эукариотической клетке и/или в прокариотической клетке.

32. Трансформированная клетка, содержащая вектор по любому из пп.27-31, например трансформированная клетка, способная к репликации фрагмента нуклеиновой кислоты по п.26.

33. Трансформированная клетка по п.32, являющаяся клеткой микроорганизма, выбранного из бактерий, дрожжей, простейших, или клеткой многоклеточного организма, выбранного из грибов, насекомых, например клеткой §₂ или 8Р, растений или млекопитающих.

34. Трансформированная клетка по п.32 или 33, экспрессирующая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.26, секретирующая или экспонирующая на своей поверхности аналог АРР или Ав по п.24.

35. Способ по любому из пп.1-13, согласно которому презентацию иммунной системе аналога АРР или Ав, представляющего собой полиаминокислоту, осуществляют посредством введения в клетки животного непатогенного микроорганизма или вируса, содержащего фрагмент нуклеиновой кислоты по п.26, способный обеспечивать экспрессию аналога в клетках.

36. Композиция для индуцирования образования антител против амилоида, содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.26 или вектор по любому из пп.27-31 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант.

37. Стабильная клеточная линия, содержащая вектор по любому из пп.7-31, экспрессирующая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.26 и необязательно секретирующая или экспонирующая на поверхности клеток аналог по п.24.