KR20100086520A - 베타-아밀로이드-유사체 - ｔ-세포 에피토프 백신 - Google Patents

베타-아밀로이드-유사체 - ｔ-세포 에피토프 백신 Download PDF

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마틴 롤란드 젠센
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Abstract

본 발명은 아밀로이드의 침적을 특징으로 하는 질병에 대항하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 일반적으로 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 또는 베타 아밀로이드 (A-베타)에 대한 면역화에 의존한다. 면역화는 자기유래의 APP 또는 A 베타의 유사체를 투요함으로써 바람직하게 유발되고, 상기 유사체는 자기유래 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 유도한다. 면역원이 하나의 싱글 또는 수 개의 외래 면역결정자 및 무차별 T-세포 에피토프의 도입에 의하여 변형된 자기유래 A 베타인 것이 특히 바람직하다. 또한, APP 또는 A 베타에 대한 핵산 면역화 및 생백신 및 백신화에 유용한 방법과 수단을 이용하는 백신화가 기재되어 있다. 이러한 방법과 수단은 유사체 및 약학적 제제 및 핵산 단편, 벡터, 형질전환 세포, 폴리펩타이드 및 약학적 제제의 제조 방법을 포함한다.

Description

베타-아밀로이드-유사체 - Ｔ-세포 에피토프 백신{BETA-AMYLOID-ANALOGUE - T-CEL EPITOP VACCINE}
본 발명은 알츠하이머병 (Alzheimer's disease, AD) 과 아밀로이드의 침적(deposition)을 특징으로 하는, 예컨대, 중추신경계(CNS)의 아밀로이드 침적을 특징으로 하는 다른 질병의 예방 및 치료의 개선과 관련된 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아밀로이드 침적을 포함하는 병변을 갖는 질병을 앓고 있거나 이러한 질병을 앓을 위험이 있는 환자에서의 아밀로이드 침적 관련 단백질 (APP 또는 Aβ) 또는 이들의 구성성분에 대한 항체의 생산을 가능하게 함으로써 아밀로이드의 (바람직하지 않은) 침적을 하향-조절(down-regulating)하는 방법을 제공한다. 보 발명은 또한 이러한 방법에 유용한 폴리펩타이드를 생산하는 방법 뿐 아니라 상기 변형된 폴리펩타이드 자체를 제공한다. 상기 변형된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 단편 뿐 아니라 이들 핵산 단편을 포함하는 벡터 및 이들로 형질전환된 세포주 및 숙주 세포들 또한 본 발명에 포함된다. 마지막으로, 본 발명은 또한 새로운 타입의 접합(conjugate) 펩타이드 면역원을 제공한다.
아밀로이도시스(Amyloidosis)는 조직 손상과 질병을 야기하는 불용성 단백질 피브릴(fibrils)의 세포외 침적이다 (Pepys, 1996; Tan et al., 1995; Kelly, 1996). 피브릴는 정상적인 가용성 단백질 및 펩타이드가 비정상적인 방법으로 자기-결합(self-associate)할 때 형성된다 (Kelly, 1997).
아밀로이드는 전신성 아밀로이도시스, AD, 성인형 당뇨병(maturity onset diabetes), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 전두엽-측두엽 치매(fronto-temporal dementia) 및 프리온-관련 전파성 해면성 뇌증(prion-related transmissible spongiform encephalopathies) (인간의 쿠루병(kuru)와 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob disease) 및 양과 소에서의 각각 스크래피(scrapie)와 BSE)를 포함하는 심각한 질병과 관련있으며, 예컨대, 알츠하이머병에서의 아밀로이드 플라크 형성은 인간 질병의 진행과 밀접한 관련이 있는 것으로 보인다. β-아밀로이드 단백질과 같이, 침적에서 발견되는 단백질의 변형된 형태의 동물 모델에서의 발현 또는 과-발현이 예컨대 알츠하이머 유사 증상과 같은 다양한 증상의 질병을 유발시키는 것으로 나타났다. 아밀로이드 침적에 대한 특별한 치료법이 없으며 이들 질병은 일반적으로 치명적이다.
아밀로이드 피브릴의 서브유니트에는 야생형, 변형 또는 절단형(truncated) 단백질이 있으며, 올리고펩타이드 및 변성 단백질로부터 유사한 피브릴를 생체외적으로 형성할 수 있다 (Bradbury et al., 1960; Filshie et al.,1964 ; Burke & Rougvie, 1972). 피브릴의 폴리펩타이드 구성성분의 성질은 아밀로도시스의 특성을 규정한다. 아미로이드 단백질들간의 기능, 본질적인 구조 및 크기에 큰 차이가 있음에도 불구하고, 모든 아밀로이드 피브릴는 지름 70 내지 120 Å의 불확정적 길이의 비분지(unbranched)형이고, 콩고 레드(Congo Red)로 염색되는 특성을 보인다 (Pepys, 1996). 이들은 폴리펩타이드 체인이 β-시트로 조직화되어 있는 교차-β-구조 (Pauling & Corey, 1951)의 특징을 갖는다. 아밀로이드 단백질들은 매우 상이한 전구체 구조를 갖지만, 이들 모두는 유사할 수 도 있는경로를 따라 β-시트 헬릭스 프로토필라멘트의 빌딩 블록인 미스폴딩(misfolded)된 형태로의 구조 전환을 거칠 수 있다.
이러한 특유한 섬유질(fiber) 패턴은 β-피브릴로세스(β-fibrilloses)라고 칭해지는 아밀로도세스(amyloidoses)를 유발하고, AD의 피브릴 단백질은 그의 이차 구조가 알려지기 전에 β-단백질이라 명명되었다 (Glenner & Wong, 1984). 피브릴의 형상 및 염색 특성과 함께 특징적인 크로스-β 회절 패턴은 현재 아밀로이드의 진단 특성으로 받아들여지며, 피브릴이, 비록 매우 상이한 단백질 전구체로부터 형성되지만, 이들 전구체 단백질의 성질에 관계 없이, 구조적 상과(superfamily)를 포함하고 어느 정도의 구조적 유사성을 공유한다는 것을 제시한다 (Sunde M, Serpell LC, Bartlam M, Fraser PE, Pepys MB, Blake CCFJ Mol Biol 1997 Oct 31; 273 (3): 729-739).
중추신경계의 아밀로이드의 침적이 질병 진행에 있어서 중추적 역할을 하는 것으로 생각되는 가장 일반적이고 잘 알려진 질병 중 하나가 AD이다.
AD
알츠하이머병 (AD)은 점진적으로 발병하여 기억력 손상, 행동 및 성격 변화 및 정신 능력의 감퇴를 야기하는 비가역적, 진행성 뇌 질환이다. 이러한 손상들은 뇌세포의 사멸 및 이들간 연결의 파괴과 관련있다. 이러한 질병의 과정은 감퇴의 속도에 따라 개인 간 차이가 있다. AD는 20 년까지 지속될 수 있지만, AD 환자는 평균적으로 진단 후 8 내지 10년 정도 생존한다.
AD 초기의 가벼운 건망증으로부터 정신 기능의 심각한 손상으로 서서히 진행한다. 이러한 손상은 치매라고 알려져 있다. AD를 앓고 있는 사람들 대부분에 있어서, 증상은 60세 이후에 처음으로 나타나지만, 그 이전에 발병하는 것도 드문 일이 아니다. 가장 초기의 증상은 종종 최근 기억의 손상, 잘못된 판단 및 성격의 변화를 포함한다. 종종, AD의 초기 단계의 사람들은 덜 명료하게 생각하고 친근한 사람들 및 일상적인 물건의 이름을 잊어버린다. 나중에는, 이 질병의 환자들은 매우 단순한 과제의 수행 방법도 잊어버릴 수 있다. 마지막에는, AD를 앓는 사람들은 모든 이성적인 능력을 상실하고 매일 매일을 다른 사람의 보살핌에 의존하게 된다. 결국, 이 질병은 환자를 누워서 일어나지 못할 정도로 쇠약하게 만들고, 다른 병과 감염을 일으키게 할 수도 있다. 가장 일반적으로, AD 환자는 폐렴으로 사망한다.
AD 발병 위험이 연령에 따라서 증가하지만, AD와 치매의 증상은 정상적인 노화의 일부분이 아니다. AD 및 다른 치매 질환은 뇌에 영향을 미치는 질병에 의하여 야기된다. 정상적인 노화에 있어서, 뇌의 신경세포는 다량으로 손상되지 않는다. 반면, AD는 3 가지 주요 프로세스를 파괴시킨다: 신경세포 커뮤니케이션, 대사(metabolism), 및 회복(repair). 이러한 파괴는 궁극적으로 많은 신경세포들의 작용 중단시키고, 다른 신경세포와의 연결 손상 및 사멸을 야기한다.
우선, AD는 뇌의 기억을 제어하는 부분, 특히 해마(hippocampus)와 관련조직의 뉴런을 파괴한다. 해마의 신경세포가 적절하게 기능을 중단하면, 단-기간 기억이 손상되고, 종종 쉽고 친숙한 과제를 수행하는 개인의 능력이 감퇴하기 시작한다. AD는 또한 대뇌 피질, 특히 언어와 추리를 관장하는 영역을 공격한다. 결국에는, 뇌의 많은 다른 영역이 수반되고, 이들 모든 뇌 부위가 감퇴(위축)되고, AD 환자는 누워서 지내게 되고(bedridden), 대소변을 가리지 못하며(incontinent) 전적으로 무기력하고, 외부에 무반응하게 된다 (출처: National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's disease,1999).
AD 의 영향
AD는 65세 이상의 사람들에 있어서의 가장 흔한 치매의 원인이다. 이는 개인, 가족, 건강 관리 시스템 및 사회 전체에 미치는 막대한 영향 때문에 주요한 건강 문제를 일으킨다. 과학자들은 현재 4 백만에 달하는 사람들이 치매를 앓고 있으며, 65 세 이상에서는 매 5년마다 빈도가 두 배로 증가한다고 추정한다. 또한, 매 년 약 360,000의 새로운 사례 (발병률)이 매년 발생한다고 추정되며, 이러한 수치는 인구의 연령에 따라 증가할 것이다 (Brookmeyer etal., 1998).
AD는 사회에 무거운 경제적 부담을 안긴다. 미국 내의 최근 연구는 한 명의 AD 환자에 대한 연간 치료 비용이 가벼운 AD 환자의 경우에는 $18,408, 중간정도의 AD 환자의 경우에는 $30,096, 중증 AD 환자의 경우에는 $36,132 인 것으로 추정하였다. 미국 내의 AD 환자 치료를 위한 연간 국가 비용은 500억 달러를 조금 넘는 것으로 추정된다 (Leon et al., 1998).
약 4 백만의 미국인이 85세 이상이며, 대부분의 산업화된 국가에 있어서, 이러한 연령군은 가장 빠르게 증가하는 인구 부분중 하나이다. 미국에서 이러한 그룹은 2030년까지 거의 850만에 달할 것으로 추정되고; 인구 동향을 연구하는 일부 전문가들은 그 수가 보다 많아질 것이라고 제안한다. 보다 많은 사람들의 수명이 연장될수록, AD를 포함하여 노화의 질병에 영향을 받는 사람들의 수가 지속적으로 증가할 것이다. 예컨대, 몇 몇 연구는 85 세 이상의 인구 중 거의 절반이 몇 몇 유형의 치매를 앓는다는 것을 보여준다 (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's disease, 1999).
AD 의 주요한 특징
뇌의 두 개의 비정상적 구조가 AD의 특징이다: 아밀로이드 플라크와 신경섬유 다발성 병변(neurofibrillary tangles, NFT). 플라크는 뇌의 뉴런 외부 및 주위의 단백질 및 세포 물질의 밀집된 거대한 불용성 침적이다. 다발성 병변은 뉴런 내부를 확립하는 불용성의 꼬인 섬유이다.
두 가지 유형의 AD가 있다: 일정한 유전 패턴을 따르는 가족성 AD(familial AD, FAD), 및 명확한 유전 패턴이 나타나지 않는 돌발성 AD(sporadic AD). 발병시의 연령에 있어서의 차이 때문에, AD를 또한 초기-발병 (early-onset, 65 세보다 어린 사람에게 발생) 또는 후기-발병 (late-onset, 65세 이상에서 발생)으로 설명한다. 초기-발병 AD은 드물며 (환자의 약 10 %), 일반적으로 30 내지 60세의 사람들한테 영향을 미친다. 초기-발병 AD의 몇 몇 유형은 유전되며, 가족들에게 전달된다. 또한, 초기-발병 AD는 종종 보다 일반적인 후기-발병 유형보다 빠르게 진행된다.
지금까지 알려진 모든 FAD는 초기 발병하며, 현재, FAD 환자 중 50% 정도가 3 개의 다른 염색체에 위치하는 3 개의 유전자의 결함에 의하여 야기된다고 알려져 있다. 이들은 21번 염색체 상의 APP 유전자에서의 돌연변이; 프리시닐린(presenilin) 1이라고 불리는 14번 염색체 상의 유전자에서의 돌연변이; 및 프리시닐린 2라고 불리는 1번 염색체 상의 유전자에서의 돌연변이이다. 그러나, 이들 돌연변이 중 어떤 것이 보다 일반적인 돌발성 또는 비-가족성 형태의 후기-발병 AD에 주요한 역할을 한다는 증거는 아직 없다 (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's disease, 1999)
아밀로이드 플라크
AD에 있어서, 아밀로이드 플라크는 처음에 기억 및 다른 지적 작용에 사용되는 뇌 영역에서 발생한다. 이들은 뉴런 부분 또는 마이크로글리아(microglia) 및 성상세포(astrocytes)와 같은 비-신경 세포와 혼합된 베타 아밀로이드 (이하 Aβ라 칭함)-아밀로이드 전구체 단백질 (APP, 아미노산 서열이 SEQ ID NO:2에 설명됨)이라 불리는 보다 큰 단백질의 단백질 단편-의 대체적으로 불용성인 침적으로 구성된다. 아밀로이드 플라크 자체가 AD의 주요한 원인을 구성하는지 여부 또는 이들이 AD 프로세스의 부산물인지 여부가 알려지지 않았다. 확실히, APP 유전자에서의 돌연변이에 의해서 유발되는 AD의 유전된 형태에서 보여지는 바와 같이, APP 단백질의 변화는 AD를 유발할 수 있으며, Aβ 플라그 형성은 인간 질병의 진행과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 보인다 (Lippa C. F. etal. 1998).
APP
APP는 세포 멤브레인과 결합되어 있는 많은 단백질 중 하나이다. APP는 생성된 후, 신경세포 멤브레인에, 부분적으로는 세포 내부에, 부분적으로는 세포 외부에 함입된다. 트랜스제닉 마우스를 사용하는 최근 연구는 APP가 뉴런의 성장 및 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다는 것을 보여준다. 예컨대, 특정 형태 및 양의 APP가 단-기간 및 장-기간 손상에 대하여 뉴런을 보호할 수 있고, 손상된 뉴런이 보다 잘 자신을 회복하고 뇌 손상 이후 일부 뉴런을 보다 잘 원조할 수 있도록 한다.
APP이 세포 멤브레인에 함입되는 동안, 프로테아제가 APP의 특정 부위에 작용하여 이를 단백질 단편으로 절단한다. 한 프로테아제는 APP를 절단하여 Aβ를 형성하도록 도와주며, 또 다른 프로테아제는 APP를 아밀로이드 단편의 중앙에서 절단하여 Aβ가 형성되지 못하도록 한다. 형성된 Aβ는 상이한 2 가지의 길이의, 상대적으로 가용성이고 천천히 응집(aggregate)하는 보다 짧은 40 (또는 41) 아미노산 Aβ 및 신속하게 상대적으로 불용성인 덩어리를 형성하는 약간 긴 42 아미노산 "점착성(sticky)" Aβ이다. Aβ가 형성되는 동안, 이것이 세포를 가로지르거나 세포 주위를 이동하는 방법이 아직 정확하게 알려지지 않았다. 이러한 프로세스의 마지막 단계에서, "점착성" Aβ가 세포 외부에서 긴 필라멘트로 응집하고, 사멸한 및 사멸 중인 뉴런과 마이크로글리아와 성상세포를 함께, 뇌 조직에서 AD 특성을 나타내는 플라크를 형성한다.
APP에서의 돌연변이가 보다 가능성있게 Aβ가 APP 전구체를 잘라내어, 보다 많은 총 Aβ 또는 상대적으로 보다 많은 "점착성" 형태를 형성하도록 한다는 몇 가지 증거가 있다. 또한, 프리시닐린 유전자의 돌연변이가 적어도 두 가지 방법으로 뉴런의 퇴화(degeneration)에 기여할 수 있는 것으로 보인다: Aβ 생산의 변형에 의하여 또는 세포 사멸을 보다 직접적으로 유발함으로써. 다른 연구들은 돌연변이된 프리시닐린 1 및 2가 아폽토시스(apoptosis)의 속도를 가속시키는데 수반될 수 있음을 암시한다.
질병이 진행함에 따라 더욱 많은 플라크가 형성되고 더욱 많이 뇌를 채우게 될 것이라고 예측된다. 연구들은 일종의 동적 평형(dynamic equilibrium)에서 Aβ가 동시에 응집하고 분해하는 것이 있을 수 있다고 제안한다. 이는 플라크가 형성된 후에도 플라크를 파괴할 가능성이 있을 수 있다는 희망을 일으킨다 (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's disease,1999).
Aβ가 뉴런에 대하여 독성이 있다고 생각된다. 조직 배양 연구에 있어서, 정상적인 인간 APP를 과발현하는 뉴런과 비교하여 돌연변이된 형태의 인간 APP를 과발현하도록 엔지니어링된 해마 뉴런 세포의 사멸의 증가가 관찰되었다 (Luo et al., 1999).
게다가, 변형된 형태의 Aβ 단백질의 과발현 또는 발현이 동물 모델에서 알츠하이머-유사 증상을 유발한다는 것이 입증되었다 (Hsiao K. etal., 1998).
증가된 Aβ 생성, 이의 플라크로의 응집, 및 얻어진 신경독성 (neurotoxicity)이 AD를 유발할 수 있다면, Aβ의 플라크로의 응집이 늦추어지고 심지어 차단될 수 있는 조건을 조사하는 것이 치료적으로 중요하다.
프리시닐린( Presenilins )
프리시닐린-1 (S-180)에서의 돌연변이는 초기-발병 가족성 AD(FAD)의 모든 사례 중에서 거의 50 %를 차지한다. AD를 발생시키는 약 30 돌연변이가 확인되었다. AD의 발병은 돌연변이에 의하여 변한다. 프리시닐린-2의 돌연변이는 FAD 사례들 중 매우 적은 부분을 차지하지만, 여전히 중요한 인자이다. 스리시닐린이 돌방성 비-가족성 AD에 수반되는지 여부는 알려지지 않았다. 프리시닐린의 기능은 알려지지 않았지만, 프리시닐린 돌연변이를 갖는 AD 환자들에서 Aβ-42 펩타이드의 레벨이 증가하기 때문에, 이들은 APP의 프로세싱에 수반되어 Aβ-42 (SEQ ID NO:2, 잔기 673-714 펩타이드의 보다 긴 점착성 형태)를 생성하는 것으로 보인다. I프리시닐린이 또한 NFT's의 발생을 유발하는데 역할을 하는지 여부는 불분명하다. 몇 몇은 프리시닐린 역시 뉴런의 퇴화 및 뉴런 사멸에 보다 직접적인 역할을 할 수 있다고 제안한다. 프리시닐린-1은 14번 염색체에 위치하는 반면, 프리시닐린-2는 1번 염색체에 연결되어 있다. 어떤 사람이 이들 유전자 중 단지 하나의 변이된 버젼을 포함한다면, 그는 초기 발병 AD를 발생시킴이 거의 확실하다.
프리시닐린-1이 APP의 프로세싱에 수반되는 가설적 감마-세크레타제(gamma-secretase)와 동일한지 여부가 조금 불확실하다 (Naruse et al. , 1998).
아포리포프로테인 ( Apolipoprotein ) E
아포리포프로테인 E는 통상적으로 콜레스테롤과 결합되어 있지만, AD 뇌의 다발성 병변 및 플라크에서 또한 발견된다. 대립유전자 1-3이 AD에 수반되는 것으로 보이지 않지만, APOE-ε4 대립유전자의 존재와 후기 AD의 발생 간에 중요한 관련이 있다 (Strittmatter et al. , 1993). 그러나, 이는 위험 인자이고 프리시닐린 및 APP 돌연변이에 대한 사례이고 직접적 원인이 아니고 이는 가족성 AD로 한정되지 않는다.
ApoE-ε4 단백질이 AD 발생 가능성을 증가시키는 방법은 정확하게 알려지지 않았지만, 하나의 가능한 학설은 ApoE-ε4 단백질이 Aβ의 확립을 촉진시키고 이것이 AD 발병 연령을 낮추는데 기여하거나, 특정 APOE 대립유전자의 존재 또는 부재가 뉴런이 손상에 반응하는 방법에 영향을 미칠 수 있다는 것이다 (Buttini et al. , 1999).
또한, Apo A1은 아밀로이제닉(amyloigenic)하다고 나타났다. 손상되지 않은 apo A1는 그 자체가 생체외에서 콩고 레드 양성인 아밀로이드-유사 피브릴을 형성할 수 있다 (Am J Pathol 147 (2): 238-244 (Aug 1995),Wisniewski T, Golabek AA, Kida E, WisniewskiKE, Frangione B).
다른 대립유전자와 비교하여, APOE-E4 대립유전자의 정신적 손상 증상의 감소에 있어서의 긍정적 효과과 있다는 것을 보여주는 몇 가지 모순된 결과가 나타난다 (Stern, Brandt, 1997, Annals of Neurology 41).
신경섬유 다발성 병변( Neurofibrillary Tangles )
AD의 두 번째 특성은 신경세포 내부에서 발견되는 꼬인 실(twisted threads)의 비정상적 수집(collections)으로 구성된다. 다발성 병변의 주요한 구성성분은 타우(τ)라 불리는 단백질의 한 형태이다. 중추신경계에 있어서, 타우 단백질은 세포의 내부 지지 구조 또는 골격의 한 성분인 미세소관(microtubule)에 결합하고 안정화를 도와주는 그들의 능력으로 가장 잘 알려져 있다. 그러나, AD에 있어서 타우는 화학적으로 변형되며 이러한 변형된 타우는 더 이상 미세소관을 안정화시킬 수 없으며 이들의 붕괴를 야기한다. 이러한 수송시스템의 붕괴는 우선 신경 세포 간의 커뮤니케이션에서의 기능부전을 초래하고 나중에는 뉴런의 사멸을 일으킬 수 있다.
AD에 있어서, 타우의 짝진 나선형 필라멘트-두 가닥으로으로의 화학적으로 변형된 타우 꼬임이 서로의 주위에 감겨있다. 이들 필라멘트는 신경섬유 다발성 병변에서 발견되는 주요한 기질이다. 최근의 한 연구에 있어서, 신경섬유의 변화가 건강한 뇌의 해마의 특정 부분의 뉴런의 경우 6 %보다 낮게, 가벼운 AD로 사망한 사람의 이러한 뉴런의 경우에는 43 %보다 높게, 심한 AD로 사망한 사람의 이러한 뉴런의 경우에는 71 %인 것으로 나타났다. 뉴런의 손상 연구시, 유사한 진행이 발견되었다. 이러한 유형의 증거는 다발성 병변의 형성과 뉴런의 손상이 AD 과정에 걸쳐서 함께 진행한다는 생각을 지지한다 (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's disease, 1999).
타우요법 ( Tauopathies ) 및 다발성 병변
AD 이외의 몇 가지 신경퇴행성 질병(neurodegenerative diseases)은 뉴런 및 글리아에서의 타우의 불용성 필라멘트로의 응집에 의하여 특징화되며, 이는 기능장애와 사망을 야기한다. 최근, AD 이외의 다양한 유전적 치매를 갖는 가계를 연구하는 몇 몇 그룹의 연구자들은 17번 염색체 상의 타우 유전자에서 첫 번째 돌연변이를 발견하였다 (Clark et al., 1998; Hutton et al., 1998; Poorkaj et al., 1998; Spillantini et al., 1998). 이들 가계에 있어서, 타우 유전자에서의 돌연변이는 뉴런 세포 사멸 및 치매를 유발한다. AD와 몇 가지 특성을 공유하지만 몇 가지 중요한 측면에 있어서 상이한 이러한 질환을 집합적으로 “17번 염색체와 관련된 전두엽 측두엽 치매 및 파킨슨병”(FTDT-17)이라 칭한다. 이들은 파킨슨병, 몇 가지 형태의 근위축성축색경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 피질기저핵 변성(corticobasal degeneration), 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy), 및 피크병(Pick's disease)과 같은 질병들이고, 모두 타우 단백질의 비정상적 응집의 특성을 갖는다.
다른 AD -유사 신경학적 질병
AD와, 프리온 질병 (예컨대, 쿠루, 크로이츠펠트-야콥 병과 광우병(bovine spongiform encephalitis)), 파킨슨병, 헌팅턴병, 및 전두엽-측두엽 치매를 포함하는, 다른 신경학적 질병 간의 중요한 비교점이 있다. 이들은 모두 뇌에서의 비정상적 단백질의 침적을 수반한다. AD와 프리온 질병은 치매와 죽음을 야기하고, 이들 모두는 불용성 아밀로이드 피브릴의 형성과 관련되어 있지만 서로 다른 멤브레인 단백질로부터 유래한다.
AD 다음으로 두 번째로 일반적인 신경퇴행성 질병인 파킨슨병의 연구자들이 이 병과 관련된 첫 번째 유전자를 발견하였다. 이 유전자는, 흥미롭게도 AD 환자의 뇌의 아밀로이드 플라크에서 또한 발견되는 시뉴클레인(synuclein)이라 칭해지는 단백질을 코딩한다 (Lavedan C, 1998, Genome Res. 8 (9): 871-80). 치매를 야기하는 또 다른 진행성 신경퇴행성 질병인 헌팅턴병에서의 유전자 결함이 헌팅톤 단백질이 AD의 Aβ 피브릴 및 프리온 질병의 단백질 피브릴과 매우 유사한 불용성 피브릴로 형성되도록 한다는 것이 또한 발견되었다 (Scherzinger E, et al., 1999, PNAS U. S. A. 96 (8):4604-9).
돌연변이시, AD에서 보여지는 것과 유사한 진행성 치매 및 심각한 운동장애를 유발하는 희귀 유전 질병인, 가족성 영국 치매(familial British dementia, FBD)를 초래하는 신규한 유전자가 발견되었다. FBD 플라크에서 발견되는 아밀로이드 피브릴의 생화학적 분석에 있어서, ABri라고 불리는 특유한 펩타이드가 발견되었다 (Vidal et al., 1999). 이 유전자를 따라서 특정 지점에서의 돌연변이가 정상-보다-긴 Bri 단백질의 생산을 초래한다. Bri 단백질의 돌연변이된 말단으로부터 잘라진 ABri 펩타이드가 아밀로이드 피브릴로서 침적된다. 이들 플라크가 FBD를 특징화하는 치매와 뉴런의 기능장애를 야기하는 것으로 생각된다.
Aβ 으로의 면역화
면역 시스템은 생물체 내의 단백질성 입자(proteinaceous particles)와 외래 단백질의 클리어링에 정상적으로 참여할 것이지만, 상기한 질병들과 연관된 침적은 주로 자기-단백질로 구성되고, 그럼으로써 이들 질병의 제어에 있어서의 면역 시스템의 역할을 보다 덜 명확하게 한다. 또한, 상기 침적은 면역 시스템으로부터 정상적으로 분리된 구획(compartment, CNS)에 위치하며, 두 사실 모두 모든 백신 또는 면역치료적 접근이 성공적이지 못할 것이라는 것을 암시한다.
그럼에도 불구하고, 최근, 면역 시스템을 자극한다고 알려진 물질과 이종기원의 인간 Aβ로 구성된 백신으로 마우스를 면역화시키는 것이 시도되었다 (Schenk et al., 1999 and WO 99/27944). 상기 백신을 마우스의 DNA에 삽입된 APP에 대한 인간 돌연변이 유전자를 갖는 부분적 트랜스제닉 AD 마우스 모델에서 테스트하였다. 상기 마우스는 변형된 APP 단백질을 생산하였고 성장함에 따라 아밀로이드 플라크를 발달시켰다. 이 마우스 모델을 변형된 트랜스제닉 인간 APP에 대한 백신화가 플라크 확립에 효과를 갖는지 여부를 테스트하기 위하여 사용하였다. 첫 번째 실험에 있어서, 트랜스제닉 마우스의 한 그룹은 한달에 한 번씩 백신을 주사하였으며 6 주령째에 시작하여 11 개월째에 끝마쳤다. 트랜스제닉 마우스의 두 번째 그룹은 주사를 맞지 않았으며 대조군으로서 사용되었다. 13 월령까지, 대조군의 마우스는 그들의 뇌의 2 내지 6%를 덮는 플라크를 생성하였다. 반면, 면역화된 마우스는 실질적으로 플라크를 생성하지 않았다.
두 번째 실험에 있어서, 몇 몇 플라크가 이미 발생된 11 개월째에 주사를 시작하였다. 7-개월의 기간 동안, 대조군 트랜스제닉 마우스는 그들의 뇌에 있어서 17배 증가한 양의 플라크 나타낸 반면, 백신을 투여받은 트랜스제닉 마우스는 18 월령 대조군 트랜스제닉 마우스와 비교하여 99% 감소를 나타냈다. 몇 몇 마우스에 있어서, 일부 미리-존재하는 플라크 침적이 처치에 의하여 제거되는 것으로 나타났다. 또한, 비정상적 신경세포 프로세스 및 염증과 같은 다른 플라크-관련 손상이 면역화의 결과 감소된다는 것이 발견되었다.
따라서, 상기한 바는 마우스에 있어서의 예비적인 연구이고, 예컨대, 면역화된 마우스가 다른 측면에서 건강하게 남아있는지 여부와 이들 면역화된 마우스의 기억력이 정상적으로 남아있는지 여부를 밝힐 필요가 있다. 게다가, 마우스 모델이 AD의 완벽한 대표가 아니기 때문에(동물은 신경섬유 다발성 병변을 발생시키지 않으며 많은 뉴런을 사멸시키지도 않는다), 인간이 마우스와 유사한 반응을 보이는지상이한 반응을 보이는지를 결정하기 위하여 추가적인 연구가 필요하다. 고려해야할 또 다른 논점은 상기 방법이 어쩌면 아밀로이드 침적을 “치료(cure)"할 수 있지만 치매의 발생을 중단시킬 수 없다는 것이다.
기술적 논점은 또한 주요한 도전을 제시한다. 예컨대, 이 기술을 사용하여 인간이 자신의 단백질에 대한 항체를 발생시키도록 하는 백신을 제작하는 것 조차도 가능할 것 같아 보이지 않는다. 따라서, 안정성과 유효성의 많은 논점들은 인간에서의 모든 테스트가 고려될 수 있기 전에 해결될 필요가 있을 것이다.
따라서 Schenk 등에 의한 연구는 AD에서 형성되는 플라크와 같은 중추신경계에서의 단백질성 침적의 자기-단백질에 대한 강력한 면역 반응을 발생시키는 것이 가능하다면, 침적의 형성을 방지 및 어쩌면 또한 이미 형성된 플라크의 제거 모두가 가능하다는 것을 보여준다.
최근, 상기-논의된 Aβ 백신을 사용하는 임성적 시도가 부작용에 의하여 종결되었다: 많은 면역화된 개체가 CNS의 Aβ에 대한 저어되지 않은 자가면역에 기인할 수 있는 만성적 뇌증을 발생시켰다.
발명의 목적
본 발명의 목적은, AD와 같이, 아밀로이드의 침적에 의하여 특징화되는 조건에 대한 신규한 치료법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 AD 및 아밀로이드 침적을 수반하는 병리학적 질환에 대한 신구한 치료를 구현하기 위한 아밀로이드에 대한 자가백신(autovaccine)을 개발하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 다른 비면역성 APP와 Aβ에 대한 강력한 면역 반응을 발생시키기 위한 자가면역화 기술의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 아밀로이드 침적과 관련된 질병들의 증상의 예방, 가능한 치료 또는 완화를 위한 상기 백신의 제조에 관한 것이다.
따라서, 가장 광범위하고 가장 포괄적인 범위에 있어서, 본 발명은 인간을 포함하는 동물에서의 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 또는 베타 아밀로이드 (Aβ)의 생체내 하향-조절 (down-regulation) 방법으로, 하나 이상의 APP 및/또는 Aβ의 B-세포 에피토프 및 하나 이상의 외래 T-헬퍼 에피토프 (TH 에피토프)를 동일분자내로 포함시키는 APP 또는 Aβ의 하나 이상의 유사체의 면역원적 유효량의 동물의 면역계로 효과적으로 제시하여 상기 유사체를 사용하는 동물의 면역화가 동물의 자기유래 APP 또는 Aβ에 대한 항체의 생산을 유도하도록 하는 것을 포함하고, 상기 유사체가
a) SEQ ID NO:2의 잔기 672-714의 아서열(subsequence)의 복제본을 하나 이상 포함하는 폴리아미노산으로, 상기 외래 TH 에피토프는 아미노산 부가 및/또는 삽입 및/또는 결실 및/또는 치환에 의하여 포함되어 있고, 상기 아서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 673-714으로 구성된 아미노산 서열의 잔기 1-42, 잔기 1-40, 잔기 1-39, 잔기 1-35, 잔기 1-34, 잔기 1-28, 잔기 1-12, 잔기 1-5, 잔기 13-28, 잔기 13-35, 잔기 17-28, 잔기 25-35, 잔기 35-40, 잔기 36-42 및 잔기 35-42로 이루어진 군 중에선 선택된 것인 폴리아미노산; 및/또는
b) 외래 TH 에피토프와 붕괴된 APP 또는 Aβ 서열을 포함하여 상기 유사체가 T-세포 반응을 개시하는 MHC 클래스 II 분자에 생산적으로 결합하는 SEQ ID NO:2의 어떠한 아서열도 포함하지 않도록 하는 폴리아미노산; 및/또는
c) 외래 TH 에피토프와 APP 또는 Aβ 유래 아미노산을 포함하고, 유사체의 C-말단에 위치하는 1 싱글 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리아미노산으로, APP 또는 Aβ 및 상기 외래 TH 에피토프 내의 다른 메티오닌 잔기가 치환되거나 결실되어 있고 바람직하게는 루신 또는 이소루신으로 치환되어 있는 폴리아미노산; 및/또는
d) a)에서 정의된 바와 같은 폴리아미노산 및/또는 b)에서 정의된 바와 같은 폴리아미노산 및/또는 c)에서 정의된 바와 같은 폴리아미노산이 개별적으로 커플링된 폴리하이드록시폴리머 백본을 포함하는 접합체(conjugate); 및/또는
*e) 1) 외래 TH 에피토프 및 2) a)에서 정의된 바와 같은 아서열, b)에서 정의된 바와 같은 APP 또는 Aβ의 붕괴된 서열, 및 C-말단에 위치하는 1 싱글 메티오닌 잔기를 포함하는 APP 또는 Aβ 유래 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리아미노산으로, APP 또는 Aβ 및 외래 TH 에피토프 내의 다른 메티오닌 잔기는 치환되거나 결실되어 있고, 바람직하게는 루신 또는 이소루신으로 치환되어 있는 폴리아미노산이다.
*본 출원인은 APP 및 Aβ과 같은 아밀로이드생성(amyloidogenic) 폴리펩타이드에 대한 안전한 백신화 방법에 관한 국제특허출원을 이미 제출하였다 (cf. WO 01/62284). 이 출원은 본 출원의 출원일까지 공개되지 아니하였으며, 또한 상기한 유용한 APP 및 Aβ 유사체에 관한 세부사항을 포함하지 않는다.
본 발명은 또한 APP 및 Aβ의 유사체 뿐 아니라 이들의 아집단(subset)을 코딩하는 핵산 단편에 관한 것이다. 또한, 상기 유시체 또는 핵산 단편을 포함하는 면역원성 조성물도 본 발명의 일부분이다.
[과제의 해결 수단]
정의
본 발명의 경계와 범위를 명확하게 하기 위하여 본 명세서와 청구범위에 사용된 많은 용어를 하기에서 상세히 정의하고 설명할 것이다.
본 명세서에서 호환성 있게 사용되는 "아밀로이드(amyloid)" 및 "아밀로이드 단백질"이라는 용어는 길이가 정해지지 않은 단백질성 비분지 피브릴의 한 클래스를 의미한다. 아밀로이드 피브릴은 콩고 래드에 염색되는 특성을 보이며 폴리펩타이드 체인이 β-시트로 조직화되어 있는 크로스-β 구조를 공유한다. 아밀로이드는 일반적으로 매우 상이한 전구체 구조를 갖지만 모두 β-시트 헬릭스 프로토필라멘트의 빌딩 블록인 미스폴딩 형태로 구저적 변환을 거칠 수 있는 아밀로이드생성 단백질로부터 유래한다. 정상적으로, 아밀로이드 피브릴의 지름은 약 70 내지 약 120 Å 사이의 다양한 값을 갖는다.
"아밀로이드생성 단백질(amyloidogenic protein)"이라는 용어는 그 자체로 아밀로이드 침적의 일부가 되거나 또는 침적을 형성하도록 하는 생합성 경로의 일부가 됨으로써 아밀로이드 침적의 형성에 수반되는 폴리펩타이드를 나타내고자 하는 것이다. 따라서, 아밀로이드생성 단백질의 예에는 APP 및 Aβ가 있으며, 이들의 대사에 수반되는 단백질 또한 아밀로이드생성 단백질이 될 수 있다.
"아밀로이드 폴리펩타이드(amyloid polypeptide)"는 본 명세서에서 인간 또는 다른 포유류로부터 유래된 상기한 아밀로이드생성 단백질 (또는 본래의 아밀로이드생성 단백질의 B-세포 에피토프의 실질적인 양을 공유하는 이들의 절단체)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 나타내고자 하는 것이다. 따라서, 아밀로이드생성 폴리펩타이드는 예컨대 아밀로이드생성 폴리펩타이드에 대한 전구체의 실질적 부분을 포함할 수 있다 (Aβ의 경우, 하나의 가능한 아밀로이드 펩타이드는 APP 유래일 수 있다). 원핵생물계에서 생산되는 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 비글리코실화 형태도 예컨대 효모 또는 다른 비-포유류 진핵생물 발현 시스템의 사용으로 인하여 다양한 글리코실화 패턴을 갖는 형태이기 때문에 역시 상기 용어의 범주내에 포함된다. 그러나, "아밀로이드생성 폴리펩타이드"를 사용하는 경우, 이는 본 폴리펩타이드가 처리될 동물에 제시될 때 정상적으로 비-면역원성임을 의도하는 것임을 주의하여야 한다. 다시 말해서, 상기 아밀로이드생성 폴리펩타이드는 자기-단백질 또는 처리될 동물의 아밀로이드생성에 대한 면역 반응을 정상적으로 발생시키지 않는 상기 자기-단백질의 유사체이다.
"유사체(analogue)"는 하나 또는 수 개의 변화를 자신의 분자구조 내에 포함하는 APP 또는 Aβ 유래 분자이다. 이러한 변화는 예컨대 APP 또는 Aβ 폴리아미노산의 적절한 융합 파트너로의 융합 형태 (즉, 아미노산 잔기의 C- 및/또는 N-말단 부가를 배타적으로 수반하는 이차구조에서의 변화)일 수 있으며, 및/또는 이는 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 있어서의 삽입 및/또는 결실 및/또는 치환의 형태일 수 있다. 또한, 유도된 APP 또는 Aβ 유래 분자도 상기 용어에 포함된다 (하기하는 APP 또는 Aβ의 변형 설명 참조). 몇 가지 경우에 있어서, 유사체를 아밀로이드의 정상적인 전구체 단백질(들)에 대한 항체를 잘 유도하지 못하거나 유도할 수 없도록 제작하여, 아밀로이드 단백질의 전구체인 폴리펩타이드의 (생리학적으로 정상인) 비-응집 형태와의 바람직하지 못한 간섭을 피할 수 있다.
인간에게 인간 APP 또는 Aβ의 이종-유사체(xeno-analogue)(예컨대, 개 또는 돼지 유사체)를 백신으로서 사용하여 APP 또는 Aβ에 대한 원하는 면역성을 생산한다고 추측할 수 있다. 이러한 면역화를 위한 이종-유사체의 사용 또한 본 발명의 일부로 간주된다.
본 명세서에서 "폴리펩타이드(polypeptide)"라는 용어는 2 내지 10 아미노산 잔기의 짧은 펩타이드, 11 내지 100 아미노산 잔기의 올리고펩타이드, 및 100 이상의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드 모두를 의미하는 것으로 의도된다. 게다가, 상기 용어는 또한 단백질, 즉, 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 기능적 생분자를 포함하는 것으로 의도된다; 두 개 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 이들은 복합체를 형성할 수 있고, 공유적으로 연결되거나, 또는 비-공유적으로 연결될 수 있다. 단백질 내의 폴리펩타이드(들)은 글리코실화 및/또는 리피데이션될(lipidated) 수 있고 및/또는 보결분자단 (prosthetic groups)을 포함할 수 있다. 또한, "폴리아미노산"이라는 용어는 "폴리펩타이드"라는 용어에 상응하는 것이다.
"T-림프구" 및 "T-세포"라는 용어는 다양한 세포 매개 면역 반응 뿐 아니라 체액성 면역 반응에 있어서의 헬퍼 활성을 관장하는 흉선 기원의 림프구에 대하여 호환성있게 사용될 것이다. 마찬가지로, "B-림프구" 및 "B-세포"는 항체-생산 림프구에 대하여 호환성 있게 사용될 것이다.
"아서열(subsequence)"이라는 용어는 자연적으로 발생한 아밀로이드 아미노산 서열 또는 핵산 서열로부터 각각 직접적으로 유래된, 3 이상의 아미노산 또는, 관련있는 경우, 3 이상의 핵산의 모든 연속적인 스트레치를 의미한다.
본 명세서에서 "동물(animal)"이라는 용어는 일반적으로 인간(Homo sapiens), 개(Canis domesticus) 등과 같은 동물 종(바람직하게는 포유류)을 나타내기 위한 것이며, 단지 하나의 단독 동물만을 의미하는 것은 아니다. 그러나, 상기 용어는 또한, 본 발명의 방법에 따라서 면역화된 개체가 모두 동일한 면역원(들)을 사용하는 동물의 면역화를 가능하게 하는 동일한 APP 또는 Aβ를 실질적으로 포함하기 때문에, 이러한 동물 종의 집단(population)을 나타낸다. 본 명세서에서의 동물이 면역 시스템을 가진 생명체라는 것은 본 발명의 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다. 상기 동물은 포유류와 같이 척추동물인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 "APP 또는 Aβ의 생체 내 하향-조절(in vivo down-regulation)"이라는 용어는 살아있는 생물체 내에서의 관련된 유형의 침적된 아밀로이드 단백질 (또는 아밀로이드 자체)의 총 양의 감소를 의미하는 것이다. 하향-조절은 몇 가지 메카니즘에 의하여 달성될 수 있다: 물론, 잘못된 응집을 예방하기 위한 항체 결합에 의한 아밀로이드의 단순 방해가 가장 단순한 것이다. 그러나, 항체 결합이 소거(scavenger) 세포 (예컨대, 대식세포(macrophages) 및 다른 식세포들) 에 의한 아밀로이드의 제거를 유발한다는 것과 항체가 아밀로이드 형성을 유도하는 다른 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 방해한다는 것 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 항체가 CNS 외부의 Aβ와 결합하여, 단순한 질량 작용 이론(mass action principle)을 통하여 CNS로부터 Aβ를 효과적으로 제거하는 것이 또한 가능하다.
"...의 면역계로의 효과적인 제시하는(effecting presentation... to the immune system)"이라는 표현은 동물 면역계를 제어된 방법으로 면역원 공격(immunogenic challenge) 시키는 것을 의미하고자 하는 것이다. 하기하는 바에 나타나는 바와 같이, 이러한 면역계의 공격(challenge)은 "파맥신(pharmaccines)"(즉, 진행중인 질병을 치료하거나 완화시키기 위하여 투여되는 백신)을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 백시화하거나 또는 핵산 "파맥신" 백신화하는 것이 가장 중요한 많은 방법으로 달성 가능하다. 달성할 중요한 결과는 동물의 항체반응 가능한(competent) 세포를 면역학적으로 유효한 방법으로 항원과 직면시키는 것이지만, 이러한 결과를 달성하기 위한 세부적 방법은 본 발명의 기초를 이루는 발명적 사상에 있어서 보다 덜 중요하다.
"면역원적 유효량(immunogenically effective amount)"이라는 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서의 통상적인 의미, 즉, 면역원과 면역학적 특성을 공유하는 병원성 작용제를 상당히 채용하는 면역 반응을 유도할 수 있는, 면역원의 양을 의미한다.
본 명세서에서 APP 또는 Aβ가 "변형(modified)"되었다는 표현을 사용하는 경우, 이는 폴리펩타이드의 화학적 변형이 APP 또는 Aβ에서 수행되었음을 의미하는 것이다. 이러한 변형은 예컨대 서열 내의 특정 아미노산 잔기의 유도체화 (예컨대, 알킬화)일 수 있지만, 하기의 기재에 의하여 인식될 있는 바와 같이, 바람직한 변영은 아미노산 서열의 일차적 구조의 변화를 포함한다.
"APP 또는 Aβ에 대한 자기관용(autotolerance)"을 논의하는 경우, 폴리펩타이드가 백신화될 집단의 자기-단백질이기 때문에, 집단 내의 정상적인 개체는 상기 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 마운팅하지 않는다고 이해된다; 그럼에도, 동물 집단 내의 몇 몇 개체는 예컨대 자기면역 질환 부분으로서 천연 폴리펩타이드에 대한 항체를 생산할 수 있다는 가능성이 배제될 수 없다. 하여튼, 모든 동물은 자신의 APP 또는 Aβ에 대하여 자기관용적이지만, 다른 동물종 또는 상이한 표현형을 갖는 집단으로부터 유래된 유사체 또한 상기 동물에 의하여 관용될 수 있다는 것을 배제할 수 없다.
"외래 T-세포 에피토프(foreign T-cell epitope)" (또는 "외래 T-림프구 에피토프(foreign T-lymphocyte epitope)")는 MHC 분자에 결합할 수 있고 동물 종에서 T-세포를 자극하는 펩타이드이다. 본 발명에서의 바람직한 외래 T-세포 에피토프는 "무차별(promiscuous)" 에피토프, 즉, 동물 종 또는 집단에서 MHC 분자의 특정 클래스의 실질적 부분에 결합하는 에피토프이다. 이러한 무차별 T-세포 에피토프는 매우 한정된 수 만이 알려져 있고, 이들은 아래에서 상세히 설명될 것이다. 무차별 T-세포 에피토프는 또한 "보편적(universal)" T-세포 에피토프이다. 본 발명에 따라서 사용되는 면역원이 가능한 한 큰 부위의 동물 집단에 유효하도록 하기 위하여, 1) 몇 가지 외래 T-세포 에피토프를 동일한 유사체에 삽입하거나 또는 2) 각각의 유사체가 삽입된 상이한 무차별 에피토프를 갖는 몇 가지 유사체를 제작하는 것이 필요할 것이라는 것을 유의하여야 한다. 외래 T-세포 에피토프의 개념이 암호적(cryptic) T-세포 에피토프, 즉, 자기-단백질로부터 유래하고 상기 자기-단백질 부분이 되지 않는 분리된 형태로 존재하는 경우에만 면역원성 거동을 나타내는 에피토프의 사용도 포함하는 것이라는 것을 또한 유의하여야 한다.
"외래 T 헬퍼 림프구 에피토프(foreign T helper lymphocyte epitope)" (외래 TH 에피토프)는 외래 T-세포 에피토프이며, MHC 클래스 II 분자에 결합하고, MHC 클래스 II 분자에 결합되어 있는 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)의 표현에 제시될 수 있다.
본 명세서에서 (생)분자의 "기능적 부분(functional part)"은 상기 분자에 의하여 나타나는 생리학적 또는 생화학적 효과 중 한 가지 이상을 일으키는 분자의 부분을 의미하기 위한 것이다. 많은 효소와 다른 효과인자 분자가 상기 분자에 의하여 나타나는 효과를 일으키는 활성 부위를 갖는다는 것은 이 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있다. 분자의 다른 부분은 안정화 또는 용해성 증진 용도에 도움이 될 수 있으며, 따라서 이러한 용도가 본 발명의 특정 구체예의 문맥상 관련이 없는 경우에 제외될 수 있다. 예컨대, 특정 사이토카인을 APP 또는 Aβ의 변형 모이어티로서 사용하는 것이 가능하고(보다 상세한 설명은 하기의 기재 참조), 이러한 경우, APP 또는 Aβ에의 커플링이 요구되는 안정성을 제공할 수 있기 때문에 안정성의 논쟁은 의미없을 것이다.
"아쥬반트(adjuvant)"라는 용어는 백신 기술 분야에서 1) 그 자체로는 백신의 면역원에 대한 특이적 면역 반응을 마운팅 할 수 없지만 2) 그럼에도 불구하고 면역원에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있는 물질 또는 조성물이라는 일반적인 의미를 갖는다. 또는, 바꾸어 말해서, 아쥬반트만 사용하는 백신화는 면역원에 대한 면역 반응을 제공하지 않고, 면역원을 사용하는 백신화는 면역원에 대한 면역 반응을 발생시키거나 발생시키지 않을 수 있니만, 면역원과 아쥬반트를 사용하는 복합 백신화는 면역원 단독으로 유도되는 것보다 강력한 면역원에 대한 면역반응을 유도한다.
본 명세서에서 분자의 "표적화(Targeting)"는 동물에서 도입중인 분자가 특정 조직(들)에서 바람직하게 출현하거나 특정 세포 또는 세포유형과 바람직하게 관련되어 있는 상황을 나타내는 것이다. 이러한 효과는 표적화를 촉진시키는 주성물 내에 분자를 제제화시키는 것을 포함하는 많은 방법 또는 표적화를 촉진하는 작용기를 분자에 도입시킴으로써 달성할 수 있다. 이러한 문제는 하기에서 상세하게 논의될 것이다.
"면역계의 자극(Stimulation of the immune system)"은 어떤 물질 또는 조성물이 일반적인 비-특이적 면역자극 효과를 나타냄을 의미한다. 많은 아쥬반트와 추정(putative) 아쥬반트 (예컨대, 특정 사이토카인)가 면역계를 자극하는 능력을 공유한다. 면역자극제의 사용 결과 면역계의 "경계(alertness)"가 증가하며, 이는 동시의 또는 후속하는 면역원으로의 면역화가 면역원을 분리하여 사용하는 경우와 비교하여 보다 더 상당히 효과적으로 면역 반응을 유도한다는 것을 의미한다.
"생산적 결합(Productive binding)"은 펩타이드의 MHC 분자에 결합된 펩타이드를 제시하는 세포인 T-세포를 자극할 수 있도록 하는 MHC 분자 (클래스 I 또는 II)와의 결합을 의미한다. 예컨대, APC 표면의 MHC 클래스 II 분자와 결합된 펩타이드는, 상기 APC가 제시된 펩타이드-MHC 클래스 II 복합체에 결합하는 TH 세포를 자극하는 경우, 생산적이라고 할 수 있다.
아밀로이드 하향-조절의 바람직한 구체예
본 발명의 방법에서 면역원으로 사용되는 유사체는 APP 또는 Aβ의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 변화가 존재하는 변형된 APP 또는 Aβ 분자인 것이 바람직하며, 이는 모든-중요한 자기관용의 파괴를 얻을 수 있는 기회가 이러한 방법을 매우 용이하게 하기 때문이다 - 이는, 예컨대, 야생형 Aβ를 사용하는 면역화를 Aβ 변이체 분자를 사용하는 면역화와 비교하는 본 명세서의 실시예 2에 나타난 결과로부터 입증된다. 자기-단백질을 인식하는 잠재적으로 자기-반응성 B-림프구가 정상 개체 내에 생리학적으로 존재한다는 것이 나타났다 ( Dalum et al., 1996, J. Immunol. 157:4796-4804). 그러나, 이들 B-림프구가 관련 자기-단백질과 반응하는 항체를 실제적으로 생산하도록 유도되기 위하여, T-헬퍼 림프구(TH-세포 또는 TH-림프구)를 생산하는 사이토카인로부터 원조가 필요하다. 일반적으로 T-림프구는, 항원제시세포 (APCs)에 의하여 제시되는 경우, 자기-단백질로부터 유래하는 T-세포 에피토프를 인식하지 않으므로, 정상적으로 이러한 원조가 제공되지 않는다. 그러나, 자기-단백질에서의 “외래성(foreignness)”의 요소의 제공 (즉, 면역학적으로 상당한 변형의 도입)에 의하여 외래 요소를 인식하는 T-세포가 APC (예컨대, 처음에, 단핵세포) 상의 외래 에피토프를 인식하는 동안 활성화된다. 변형된 자기-단백질 상의 자기-에피토프를 인식할 수 있는 폴리클로날 B-림프구(역시 APCs인) 또한 항원을 자기화(internalise)하고 이어서 이들의 외래 T-세포 에피토프를 제시하며, 이어서 활성화된 T-림프구가 이들 자기-반응성 폴리클로날 B-림프구로 사이토카인 원조를 제공한다. 이들 폴리클로날 B-림프구에 의하여 생산되는 항체는, 천연 폴리펩타이드에도 역시 존재하는 것들을 포함하여, 변형된 폴리펩티드 상의 상이한 에피토프와 반응하기 때문에, 비-변형 자기-단백질과 교차반응하는 항체가 유도된다. 결론적으로, T-림프구는 폴리클로날 B-림프구 집단이 전체 외래 항원을 인식하는 것 처럼 작용하도록 유도될 수 있는 반면, 실제로는 삽입된 에피토프(들)만이 숙주에 대항 외래이다. 이러한 방법으로, 비-변형 자기-항원과 교차-반응할 수 있는 항체가 유도된다.
자기관용의 파괴를 달성하기 위한 몇 가지 펩타이드 자기-항원의 변형 방법이 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있다. 그럼에도, 본 발명에 따른 유사체가 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- 변형된 분자를 항원제시세포 (APC)로 표적화시키는 첫 번째 모이어티가 하나 이상 도입되고, 및/또는
- 면역게를 자극하는 두 번째 모이어티가 하나 이상 도입되고, 및/또는
- 면역계로의 유사체의 제시를 최적화하는 세 번째 모이어티가 하나 이상 도입된다.
그러나, 이들 변형은 모두 APP 또는 Aβ에 원래 B-림프구 에피토프의 실질적 부분을 남겨두면서 수행되며, 이는 천연 분자의 B-림프구 인식이 이에 의하여 증진되기 때문이다.
하나의 바람직한 구체예에 있어서, 사이드 그룹 (외래 T-세포 에피토프 또는 상기한 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 모이어티의 형태)을 공유적 또는 비공유적으로 도입한다. 이는 APP 또는 Aβ로부터 유래하는 아미노산 잔기의 스트레치가 일차 아미노산 서열의 변경 없이 또는 적어도 체인 내의 각각의 아미노산 간의 펩타이드 결합 내에 변화를 유도 없이 유도체화됨을 의미한다.
또 다른 바람직한 구체예는 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 부가를 사용한다 (재조합 수단 또는 펩타이드 합성에 의하여 수행될 수 있으며; 보다 긴 아미노산 스트레치를 수반하는 변형은 융합 폴리펩타이드를 발생시킬 수 있다). 이러한 구체예의 특히 바람직한 하나의 버젼은 WO 95/05849에 개시된 기술이며, 여기에는 유사체 내의 자가-단백질의 전체적인 3차 구조를 유지하면서 동시에 많은 아미노산 서열(들)이 각각 외래 면역우성 T-세포 에피토프를 포함하는 상응하는 수의 아미노산 서열(들)로 치환되어 있는 자기-단백질 유사체를 사용하는 면역화에 의한 자기-단백질의 하향-조절 방법이 개시되어 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위하여, 상기 변형(삽입, 부가, 결실 또는 치환)이 외래 T-세포 에피토프를 발생시키고 동시에 APP 또는 Aβ 내의 실질적으로 많은 B-세포 에피토프를 유지시킨다면 충분하다. 그러나, 유도된 면역 반응의 최대 효과를 얻기 위하여, APP 또는 Aβ의 전체적인 3차 구조가 변형된 분자에서 유지되는 것이 바람직하다.
몇 가지 경우에 있어서, APP 또는 Aβ 또는 이들의 단편이 돌연변이 되는 것이 바람직하다. Aβ-43의 35번 위치의 메티오닌이, 바람직하게는 루신 또는 이소루신으로 치환되거나, 또는 단순히 결실된, 치환 변이체가 특히 바람직하다. 유사체가 C-말단에 위치하는 하나의 싱글 메티오닌을 포함하는 것이 특히 바람직하며, 이는 그것이 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 외래 TH 에피토프에서 자연적으로 발생한 것이기 때문이거나, 그것이 삽입 또는 부가된 것이기 때문이다. 따라서, 외래 TH 에피토프를 포함하는 유사체 부분이, 가능한 C-말단 위치의 메티오닌을 제외하고, 메티오닌을 포함하지 않는 것 또한 바람직하다.
하나의 메티오닌을 제외한 모든 것을 제거하는 주요 이유는 시아노겐브로마이드(cyanogenbromide)에 의하여 연속적으로 절단되어 단일 유사체로 잔존할 수 있는 다중결합(multimeric) 유사체를 재조합적으로 제조하는 것이 가능해진다는 것이다. 재조합 생산이 이러한 방법을 촉진하게 된다는 것이 이점이다.
실제로, 본 발명에 따라서 사용되는 APP 또는 Aβ의 모든 유사체가 유사체 내의 C-말단 아미노산으로서 위치하는 하나의 싱글 메티오닌을 단지 포함하고 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 외래 TH 에피토프 내의 다른 메티오닌은 결실되거나 다른 아미노산으로 치환된 특성을 공유하는 것이 일반적으로 바람직하다.
또 다른 하나의 중요한 돌연변이는 Aβ-43 내의 19번 위치의 페닐알라닌의 결실 또는 치환이며, 상기 돌연변이는 이 페닐알라닌 잔기가 프롤린으로 치환된 것이 특히 바람직하다.
유사체에 사용될 다른 중요한 폴리아미노산은 Aβ-43 단백질의 절단된 부분이다. 이들은 또한 본 발명에 따른 면역원성 유사체로 사용 가능하다. 절단체 Aβ(1-42), Aβ(1-40), Aβ(1-39), Aβ(1-35), Aβ(1-34), Aβ(1-34), Aβ(1-28), Aβ(1-12), Aβ(1-5), Aβ(13-28), Aβ(13-35), Aβ(17-28), Aβ(25-35), Aβ(35-40), AP(36-42), 및 Aβ(35-42) (괄호 안의 수는 관련 단편 - Aβ(35-40)이, 예컨대, SEQ ID NO:2의 아미노산 706-711와 동일한 - 을 구성하는 Aβ-43의 아미노산 스트레치를 나타냄)가 특히 바람직하다. Aβ-43의 절단된 부분을 갖는 이들 변이체는 모두 본 명세서에 개시된 Aβ 단편, 특히 실시예 1에 기재된 변이체 9, 10, 11, 12, 및 13을 사용하여 제작할 수 있다.
다음의 식은 본 발명에 의하여 포괄적으로 포함되는 분자 구조를 설명한다:
(MOD1)S1(아밀로이드e1)n1(MOD2)S2(아밀로이드e2)n2...(MODX)sx(아밀로이드ex)nx (I)
- 상기 식 중, 아미로이드e1-아밀로이드ex는 독립적으로 동일하거나 동일하지 않고 외래 사이드 그룹을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 APP 또는 Aβ의 아서열(subsequences)을 포함하는 x B-세포 에피토프이고, x는 3 이상의 정수이고, n1-nx는 0 이상의 x 정수(적어도 하나는 1 이상임)이고, MOD1-MODx는 보존된 B-세포 에피토프들 간에 도입된 x 변형이고, S1-Sx는 0 이상의 x 정수(어떠한 사이드 그룹도 아밀로이드ex 서열 내로 도입되지 않는다면 적어도 하나는 1 이상임)이다. 따라서, 구조체의 면역원성에 대한 일반적 기능적 억제가 주어지면, 본 발명은 APP 또는 Aβ의 원래 서열의 모든 종류의 변경(permutation) 및 거기의 모든 종류의 변형을 고려한다. 따라서, 예컨대, 생체내에서 부작용을 보이는 서열 부분의 누락 또는 정상적으로 세포내적이어서 바람직하지 못한 면역학적 반응을 일으키는 부분의 누락에 의하여 얻어지는 변형된 APP 또는 Aβ이 본 발명에 포함된다.
상기에 약술된 구조체의 바람직한 하나의 버젼은, 적용가능한 경우에, 아밀로이드 단백질의 아서열을 포함하는 B-세포 에피토프가 아밀로이드가 유래된 전구체 폴리펩타이드에서 세포외적으로 노출되지 않는 것들이다. 이러한 에피토프를 선택함으로써, 전구체를 생산하는 세포와 반응하는 항체가 생성되지 않고, 이로 인하여, 발생된 면역 반응이 바람직하지 못한 아밀로이드 침적에 대한 면역 반응으로 제한되게 된다는 것을 확인한다. 이러한 경우, 그들이 생산된 세포와의 어떠한 커플링도 없는 때, 세포외 상태에만 노출되어 있는 APP 또는 Aβ의 에피토프에 대한 면역성을 유도하는 것이 가능하다.
B-세포 에피토프의 실질적 부분의 유지 또는 심지어 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형이 가해진 단백질의 전체적인 3차 구조의 유지는 몇 가지 방법으로 달성될 수 있다. 한 가지는 사용될 폴리펩타이드에 대하여 유도된 폴리클로날 항혈청(예컨대, 토끼에서 제조된 항혈청)을 단순히 제작한 후 이 항혈청을 생산된 변형 단백질에 대한 테스트 시약(예컨대, 경쟁적 ELISA에서)으로 사용하는 것이다. APP 또는 Aβ가 반응하는 것과 동일한 정도로 항혈청과 반응하는 변형된 버젼 (유사체)는 APP 또는 Aβ와 동일한 전체적인 3차 구조를 갖는 것으로 간주되어야 하는 반면, 이러한 항혈청에 대하여 제한된 (그러나 여전히 중요하고 특이적인) 반응성을 보이는 유사체는 원래 B-세포 에피토프의 실질적인 부분을 보존하는 것으로 간주된다.
대안적으로, APP 또는 Aβ 상의 독특한 에피토프와 반응하는 모노클로날 항체의 선택을 테스트 패널로서 제조하고 사용할 수 있다. 이러한 접근은 1) APP 또는 Aβ의 에피토프 지도화(mapping) 및 2) 제조된 유사체에서 보존되는 에피토프의 지도화를 가능하게 한다는 이점을 갖는다.
당연히, 세 번째 접근은 APP 또는 Aβ 또는 이들의 생물학적으로 활성인 절단체의 3-차원적 구조를 밝히고 (상기 참조), 이를 제조된 유사체의 밝혀진 3-차원적 구조와 비교하는 것이다. 3-차원적 구조는 X-선 회절 연구 및 NMR-스펙트로스코피의 도움으로 밝힐 수 있다. 주어진 분자의 3차 구조에 대한 유용한 정보를 제공하기 위하여, 단지 폴리펩타이드를 순수한 형태로 필요로 한다는 이점을 갖는 순환 이색성(circular dichroism) 연구(반면, X-선 회절이 결정화된 폴리펩타이드의 제공을 필요로 하고, NMR이 폴리펩타이드의 동위원소 변형체의 제공을 필요로 함)로부터 3차 구조와 관련된 추가적인 정보를 어느 정도 얻을 수 있다.
본 발명의 한 바람직한 구체예는 APP 또는 Aβ의 B-림프구 에피토프(즉, 식 (1)에 있어서 하나 이상의 B-세포 에피토프가 두 개의 위치에 존재)의 다중적 제시를 이용한다. 이러한 효과는 다양한 방법으로, 예컨대, 단순히 (APP 또는 Aβ 유래 폴리펩타이드)m 구조(여기서, m은 2 이상의 정수를 의미함)를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제조한 후 본 명세서에 논의된 변형을 하나 이상의 APP 또는 Aβ 서열에 도입함으로써 얻을 수 있다. 도입된 변형이 B-림프구 에피토프의 중복을 하나 이상 포함하거나 및/또는 합텐의 도입을 포함하는 것이 바람직하다. 선택된 에피토프의 다중적 제시를 포함하는 이들 구체예는 APP 또는 Aβ의 단지 소수 부분이 백신 제제의 구성성분으로서 사용되는 상황에 있어서 특히 바람직하다.
상기에 기재된 바와 같이, 외래 T-세포 에피토프의 도입은 하나 이상의 아미노산 삽입, 부가, 결실 또는 치환의 도입에 의하여 달성될 수 있다. 물론, 정상적인 상황은 아미노산 서열 내로 하나 이상의 변화(예컨대, 완전한 T-세포 에피토프의 삽입 또는 이에 의한 치환)를 도입하는 것이지만, 달성하고자 하는 중요한 목적은 유사체가, 항원제시세포(APC)에 의하여 프로세싱되는 경우, APC의 표면 상의 MCH 클래스 II 분자 환경에 제시되는 이러한 외래 면역우성 T-세포 에피토프를 발생시킬 것이라는 것이다. 따라서, 적절한 위치의 APP 또는 Aβ의 아미노산 서열이 외래 TH 에피토프에서도 발견되는 많은 아미노산 잔기를 포함한다면, 아미노산 삽입, 부가, 결실 및 치환에 의하여 외래 에피토프의 잔존하는 아미노산을 제공함으로써 외래 TH 에피토프의 도입을 달성할 수 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 삽입 또는 치환에 의하여 완전한 TH 에피토프를 도입하는 것이 필요하지 않다.
아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 부가의 수가 적어도 2 이상, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 및 25 삽입, 치환, 부가 또는 결실인 것이 바람직하다. 아미노산 삽입, 치환, 부가 또는 결실의 수가 150을 넘지 않는 것, 예컨대, 100 이하, 90 이하, 80 이하 및 70 이하인 것이 보다더 바람직하다. 치환, 삽입, 결실 또는 부가의 수가 60을 넘지 않는 것이 특히 바람직하고, 특히, 상기 수가 50 또는 심지어 40을 넘지 않아야 한다. 가장 바람직한 것은 상기 수가 30을 넘지 않는 것이다. 아미노산와 관련하여, 이들은, 얻어진 구조체가 융합 폴리펩타이드 형태인 경우, 종종 150 보다 상당히 높다는 것을 유의하여야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예는 하나 이상의 외래 면역우성 T-세포 에피토프의 도입에 의한 변형을 포함한다. T-세포 에피토프의 면역우성의 문제가 당해 동물 종에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 사용된 바에 따르면, "면역우성(immunodominance)"은 단순히 백신화된 개체/집단에서 중요한 면역반응을 일으키는 에피토프를 의미하지만, 하나의 개체/집단에서 면역우성인 T-세포 에피토프가, 비록 동일 종의 다른 개체에서 MHC-II 분자에 결합할 수 있다고 하더라도, 반드시 상기 동일 종의 다른 개체에서 면역우성인 것은 아니라는 것은 잘-알려진 사실이다. 따라서, 본 발명의 목적을 위하여, 면역우성 T-세포 에피토프는 항원에 존재시 T-세포 원조를 제공하는데 효과적일 수 있는 T-세포 에피토프이다. 통상적으로, 면역우성 T-세포 에피토프는, 그들이 출현하는 펩타이드와 관계없이, 실질적으로 언제나 MHC 클래스 II 분자와 결합하여 제시될 것이라는 유전적 특성을 갖는다.
또 다른 중요한 점은 T-세포 에피토프의 MHC(에 의한) 구속(MHC restriction)의 논의이다. 일반적으로, 자연적으로 발생하는 T-세포 에피토프는 MHC 구속적이다. 즉, 하나의 T-세포 에피토프를 구성하는 특정 펩타이드는 오직 MHC 클래스 II 분자의 아집단에 효과적으로 결합할 것이다. 이는 대부분의 경우 하나의 특정 T-세포 에피토프의 사용이 집단의 분획에만 효과적인 백신 성분을 초래하고, 상기 분획의 크기에 따라서 동일한 분자에 보다 많은 T-세포 에피토프를 포함하거나, 또는 성분이 도입된 T-세포 에피토프의 성질에 의하여 서로 구별되는 APP 또는 Aβ의 변이체인 다-성분 백신을 제조하는 것이 필요할 수 있다는 효과를 번갈아 갖는다.
사용된 T-세포의 MHC 구속이 완전하게 알려지지 않았다면 (예컨대, 백신화된 동물이 잘 정의되지 않은 MHC 조성을 갖는 상황), 특정 백신 조성물에 의하여 커버되는 집단의 일부분을 다음의 식에 의하여 접근할 수 있다
Figure pat00001
- 상기 식중 pi는 백신 조성에 존재하는 ith 외래 T-세포 에피토프에 대한 응답(responder)의 집단 내에서의 빈도이고, n은 백신 조성 내의 외래 T-세포 에피토프의 총 수이다. 따라서, 각각 0.8, 0.7 및 0.6의 집단 내 반응빈도를 갖는 3 개의 외래 T-세포 에피토프를 포함하는 백신 조성은
1 - 0.2 x 0.3 x 0.4 = 0.976이다.
- 즉, 집단의 97.6 %가 통계상으로 백신에 대한 MHC-매개 반응을 마운팅할 것이다.
상기 식은 사용된 펩타이드의 다소간의 정확한 MHC 구속 페턴이 알려진 상황에는 적용하지 않는다. 예컨대, 특정 펩타이드가 HLA-DR 대립유전자 DR1, DR3, DR5, 및 DR7에 의하여 코딩되는 인간 MHC-II 분자에만 결합한다면, HLA-DR 대립유전자에 의하여 코딩되는 잔존하는 MHC-II 분자와 결합하는 다른 펩타이드와 함께 이 펩타이드를 사용하여 당해 집단에서 100 % 적용범위를 달성할 것이다. 마찬가지로, 두 번째 펩타이드가 DR3 및 DR5에만 결합한다면, 이러한 펩타이드의 부가는 적용범위를 전혀 증가시키지 않을 것이다. 만약 집단 반응(population response)의 계산 근거를 순수하게 백신 내의 T-세포 에피토프의 MHC 구속에 둔다면, 특정 백신 조성에 의하여 커버되는 집단의 최소 부분을 다음과 같은 식에 의하여 결정할 수 있다:
Figure pat00002
- 상기 식 중, φ j는 백신 내의 T-세포 에피토프 중 어느 하나에 결합하고 3 개의 알려진 HLA 자리(DP, DR 및 DQ)의 j th에 속하는 MHC 분자를 코딩하는 대립유전자 단상형의 집단 내에서의 빈도의 합이고; 실제로, 우선 어떠한 MHC 분자가 백신내의 각각의 T-세포 에피토프를 인식할 것인지를 결정한 후, 이들을 유형(DP, DR 또는 DQ) 별로 열거한다.
- 그리고 나서, 열거된 서로 다른 대립유전자 단상형의 각각의 빈도를 각각의 유형에 대하여 합산하여 φ 1, φ 2, 및 φ 3을 산정한다.
식 II의 p i 값이 상응하는 이론값 π i를 넘는 경우가 발생할 수도 있다:
Figure pat00003
상기 식 중, υj는 백신 내의 i th T-세포 에피토프에 결합하고 3 개의 알려진 HLA 자리(DP, DR 및 DQ)의 j th에 속하는 MHC 분자를 코딩하는 대립유전자 단상형의 집단 내에서의 빈도의 합이다. 이는 집단의 1-π i가 fresidual _i = (pi-πi)/(1-πi)의 반응 빈도라는 것을 의미한다. 따라서, 식 V를 얻기 위하여 식 III를 조정할 수 있다.
Figure pat00004
- 상기 식 중, 1-fresidual -i는 음수인 경우에는 0으로 한다. 식 V는 모든 에피토프가 동일한 세트의 단상형에 대하여 지도화된 단상형을 가져야 한다는 것을 유의하여야 한다.
따라서, 유사체내로 도입될 T-세포 에피토프의 선택시, 사용 가능한 에피토프의 모든 정보를 포함하는 것이 중요하다: 1) 각각의 에피토프에 대한 집단 내의 반응 빈도, 2) MHC 구속 데이터, 및 3) 관련 단상형의 집단 내 빈도.
한 동물 종의 개체들의 대규모 집단 또는 동물 집단에서 활성인 많은 자연 발생적 "무차별" T-세포 에피토프가 존재하고, 이들은 백신에 바람직하게 도입되어 동일한 백신에 매우 많은 수의 상이한 유사체가 있어야 한다는 필요성을 감소시킨다.
본 발명에 따른 무차별 에피토프는 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid, 예컨대, P2 및 P30 에피토프), 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid), 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소 (Influenza virus hemagluttinin, HA), 및 P. falciparum CS 항원에서 유래하는 에피토프와 같은 자연 발생적 인간 T-세포 에피토프이다.
수 년에 걸쳐서 많은 다른 무차별 T-세포 에피토프가 동정되었다. 특히, 상이한 HLA-DR 대립유전자에 의하여 코딩되는 HLA-DR 분자의 큰 부위에 결합할 수 있는 펩타이드가 동정되었고, 이들은 모두 본 발명에 있어서 사용되는 유사체 내로 도입 가능한 T-세포 에피토프들이다. 모두 본 명세서에 참조로서 포함되는 다음의 참고문헌에 논의된 에피토프들 또한 참조하라: WO 98/23635 (Frazer IH et al., University of Queensland로 양도); Southwood S et al, 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F et al., 1988, Nature 336:778-780; Chicz RM et al., 1993, J. Exp. Med 178:27-47; Hammer J et al., 1993, Cell 74: 197-203; 및 Falk K et al., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. 후자 참조문헌은 또한 HLA-DQ 및 -DP 리간드를 취급한다. 이들 5 개의 참조문헌에 열거된 모든 에피토프들은, 이들과 공통된 모티프를 공유하는 에피토프들이기 때문에, 본 발명에서 사용하기 위한 후보자 천연 에피토프로서 적절하다.
선택적으로, 에피토프는 MHC 클래스 II의 큰 부위에 결합할 수 있는 모든 인공 T-세포 에피토프일 수 있다. 이러한 경우, WO 95/07707 및 대응 문헌 Alexander J et al., 1994, Immunity 1:751-761 (두 기재 모두 본 명세서에 참조로서 포함됨)에 개시된 팬 DR 에피토프 펩타이드 ("PADRE")가 본 발명에서 사용될 에피토프에 대한 중요한 후보자이다. 이들 문헌에 개시된 가장 효과적인 PADRE 펩타이드는, 투여시 안정성을 향상시키기 위하여, C- 및 N-말단에 D-아미노산을 운반한다는 것을 유의하여야 한다. 그러나, 본 발명은 관련된 에피토프들을 유사체의 일부로서 포함시키는 것을 주요 목적으로 하고 있으며, 이들은 나중에 APC의 리소좀 성분 내부에서 효소적으로 파괴되어 MHC-II 분자 환경에 후속적인 제시를 가능하게 하기 때문에 본 발명에서 사용되는 에피토프 내에 D-아미노산을 포함시키는 것은 적절하지 않다.
특히 바람직한 한 PADRE 펩타이드는 아미노산 서열 AKFVAAWTLKAAA(SEQ ID NO:17) 또는 이의 면역학적으로 유효한 아서열을 갖는 것이다. 이러한 에피토프, 및 동일한 MHC 구속 결함을 갖는 다른 에피토프가 본 발명의 방법에서 사용되는 유사체에 존재하는 바람직한 T-세포 에피토프이다. 이러한 초-무차별(super-promiscuous) 에피토프는 단지 하나의 싱글 유사체만이 백신화된 동물 면역계에 존재하는 본 발명의 가장 단순한 구체예를 가능하게 할 것이다.
상기한 바와 같이, APP 또는 Aβ의 변형은 또한 변형된 아밀로이드 생성 폴리펩타이드를 APC 또는 B-림프구로 표적화하는 첫 번째 모이어티의 도입을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 첫 번째 모이어티는 B-림프구 특이적 표면 항원 또는 APC 특이적 표면 항원에 대한 특이적 결합 파트너일 수 있다. 이러한 특이적 표면 항원들이 본 발명이 속하는 기술분야에 많이 알려져 있다. 예컨대, 상기 모이어티는 B-림프구 또는 APC 상에 이에대한 수용체가 있는 탄수화물일 수 있다 (예컨대, 만난 또는 만노오스). 선택적으로, 두 번째 모이어티는 합텐일 수 있다. 또한, APCs 또는 림프구 상의 표면 분자를 특이적으로 인식하는 항원 필라멘트를 첫 번째 모이어티로서 사용할 수 있다 (상기 표면 분자는 예컨대, FCγRI와 같은 대식세포 및 단핵세포의 FCγ 수용체, 또는 선택적으로 CD40 또는 CTLA-4와 같은 다른 특이적 표면 마커일 수 있다). 이들 대표적인 표적화 분자들은 모두 아쥬반트의 일부로서도 사용가능 하다는 것을 유의하여야 한다 (하기 참조).
면역 반응을 증진시키기 위한 유사체의 특정 세포 유형으로의 표적화에 대한 대안 또는 보완으로서, 면역계를 자극하는 상기 두 번째 모이어티를 포함함으로써 면역계의 반응성(responsiveness) 수준을 증가시키는 것이 가능하다. 두 번째 모이어티의 대표적 예로서 사이토카인, 및 열-쇼크 단백질 또는 분자 샤프롱(chaperone) 뿐 아니라 이들의 유효 부분이 있다.
본 발명에 따라서 사용되는 적절한 사이토카인은 백신 조성물에 있어서 아쥬반트로서 또한 정상적으로 작용하는 것들, 즉, 예컨대, 인터페론 γ(IFN-γ), 인터루킨 1 (IL-1), 인터루킨 2 (IL-2), 인터루킨 4(IL- 4), 인터루킨 6 (IL-6), 인터루킨 12 (IL-12), 인터루킨 13 (IL-13), 인터루킨 15 (IL-15), 및 과립구-매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)이며; 선택적으로, 사이토카인 분자의 기능적 부분이 두 번째 모이어티로서 충분할 수 있다. 이러한 사이토카인의 아쥬반트 물질로서의 사용에 대해서는 하기의 논의를 참조하라.
본 발명에 있어서, 두 번째 모이어티로 사용되는 적절한 열-쇼크 단백질 또는 분자 샤프롱은 HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (gp96이라고도 알려짐, Wearsch PA et al. 1998, Biochemistry 37: 5709-19 참조), 및 CRT (칼레티큘린, calreticulin)일 수 있다.
선택적으로, 두 번째 모이어티는 리스테리오라이신(listeriolycin, LLO), 지질 A 및 열-불안정성 장독소(heat-labile enterotoxin)와 같은 독소일 수 있다. 또한, MDP(뮤라밀 디펩타이드, muramyl dipeptide), CFAβ(완전 프로인트 아쥬반트) 및 트레할로스 디에스테르(trehalose diesters) TDM 및 TDE와 같은 많은 미코박테리아 유도체(mycobacterial derivatives)가 흥미있는 가능성을 갖는다.
또한, 유사체의 면역계로의 제시를 증진시키는 세 번째 모이어티의 도입 가능성이 본 발명의 중요한 구체예이다. 이러한 원리의 몇 가지 예가 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있다. 예컨대, 자기-아쥬반팅 폴리펩타이드(예컨대, WO 96/40718)를 제공하기 위하여, Borrelia burgdorferi 단백질 OspA내의 팔미토일 리피데이션 앵커(palmitoyl lipidation anchor)를 이용할 수 있다 - 리피데이션된 단백질이 폴리펩타이드의 리피데이션 앵커 부분과 이로부터 뻗어나온 분자의 잔존부분으로 이루어진 중심부를 갖는 미셀-유사 구조를 형성하여, 항원 결정자(antigenic determinants)의 다중 제시를 유발하는 것으로 보인다. 따라서, 상이한 리피데이션 앵커(예컨대, 미리스틸기, 미리스틸기, 파네실기, 제라닐-제라닐기, GPI-앵커, 및 N-아실 디글리세라이드기)를 사용하는 이러한 접근 및 관련된 접근을 사용하는 것이 본 발명의 바람직한 구체예이며, 그 이유는, 특히, 재조합적으로 생산된 단백질 내에 이러한 리피데이션 앵커을 제공하는 것이 상당히 간편하고 예컨대 단순히 자연적으로 발생하는 신호 서열의 유사체에 대한 융합 파트너로서의 사용을 필요로 하기 때문이다. 다른 가능성은 보체 인자 C3의 C3d 필라멘트 또는 C3 자체를 사용하는 것이다 (Dempsey et al., 1996, Science 271,348-350 및 Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16,458-462 참조).
또한 면역계로의 APP 또는 Aβ의 중요한 에피토프 부위의 여러 개(예컨대, 적어도 2)의 복제본의 바람직한 제시를 유발하는 본 발명의 또 다른 구체예는 유사체를 특정 분자, 즉, 상기한 변이체 d 및 e와 공유적으로 커플링 시키는 것이다. 예컨대, 덱스트란과 같은 탄수화물을 사용할 수 있으며 (예컨대, Lees A et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al. , 1990, J Immunol. 145: 3594-3600 참조), 만노오스와 만난 역시 유용한 대체물이다. 예컨대 E. coli 및 다른 박테리아로부터 유래하는 멤브레인 관통 단백질(Integral membrane proteins) 또한 ㅇㅍ용한 접합 파트너이다. 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH), 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 및 소의 혈청 알부민(BSA)과 같은 통상적인 캐리어 분자 또한 바람직하고 유용한 접합 파트너이다.
APP 또는 Aβ 유래 물질을 탄수화물과 같은 폴리하이드록시폴리머에 공유적으로 커플링시키는 바람직한 구체예는 폴리하이드록시폴리머에 개별적으로 커플링하는 하나 이상의 APP 또는 Aβ 유래 펩타이드 및 하나 이상의 T-세포 에피토프(즉, 외래 T-헬퍼 에피토프 및 APP 또는 Aβ 유래 아미노산 서열은 서로 융합하지 않지만, 나중에 캐리어 백본으로서 사용되는 폴리하이드록시폴리머에 결합한다)의 사용을 포함한다. 또한, 이러한 구체예는 APP 또는 Aβ 유래 펩타이드의 적절한 B-세포 운반 부위가 짧은 펩타이드 스트레치에 의하여 구성될 때 가장 바람직하다 - 이는 이러한 접근이 얻어진 면역원제 내의 선택된 에피토프의 다중 제시를 달성하는 매우 간편한 방법 중 하나이기 때문이다. 그러나, 본 명세서에 이미 기재된 유사체를 폴리하이드록시폴리머 백본에 단순히 커플링시키는 것 또한 가능하다. 즉, APP 또는 Aβ 유래 물질은 외래 TH 에피토프로부터 개별적으로 유래하는 백본에 부착하지 않는다.
펩타다아제에 의하여 절단 가능한 아마이드 결합에 의하여 외래 T-헬퍼 에피토프와 APP 또는 Aβ 유래 (폴리)펩타이드를 커플링시키는 것이 특히 바람직하다. 이러한 방법은 APC가 접합체를 흡수할 수 있고 동시에 접합체를 프로세싱하고 이어서 MHC 클래스 II 환경에서 외래 T-세포 에피토프를 제시할 수 있다는 효과를 갖는다.
펩타이드(중요한 APP 또는 Aβ 유래 펩타이드 뿐 아니라 외래 에피토프 모두)를 커플링시키는 한 가지 방법은트레실(트리플루오로에틸설포닐)기 또는 말레이미도(maleimido), p-니트로페닐 클로로포르메이트(OH기의 활성화 및 펩타이드와 폴리하이드록시폴리머 간의 펩타이드 결합 형성을 위하여), 및 토실(p-톨루엔술포닐)과 같은 다른 적절한 활성화기로 적절한 폴리하이드록시폴리머를 활성화시키는 것이다. 예컨대, WO 00/05316 및 US 5,874,469 (둘 다 본 명세서에 참조로서 포함됨)에 개시되어 있는 바와 같이 활성화된 폴리사카라이드를 제조하고 이들을 APP 또는 Aβ 유래 펩타이드 또는 폴리아미노산 뿐 아니라 통상적인 고상 또는 액상 펩타이드 합성 기술에 의하여 제조된 T-세포 에피토프에 커플링시키는 것이 가능하다. 얻어진 산물은 자신의 N-말단 또는 다른 사용가능한 질소 모이어티에 의하여 부착된 폴리하이드록시폴리머 백본(예컨대, 덱스트란 백본), APP 또는 Aβ 및 외래 T-세포 에피토프로부터 유래하는 폴리아미노산으로 구성된다. 원하는 경우, N-말단의 것을 제외한 모든 이용가능한 아미노기를 보호하도록 APP 또는 Aβ 펩타이드를 합성한 후, 얻어진 보호된 펩타이드를 트레실화된 덱스트란 모이어티에 커플링시키고 마지막으로 얻어진 접합체를 탈-보호시키는 것이 가능하다. 이러한 접근의 특정한 예를 하기의 실시예에 기재하였다.
WO 00/05316 및 US 5,874,469에 기재된 바와 같이 수용성 폴리사카라이드 분자를 사용하는 대신, 크로스-링킹된 폴리사카라이드 분자를 사용하여 폴리펩타이드와 폴리사카라이드 간의 미립자 접합을 얻는 것이 동등하게 가능하다 - 이는, 두 가지 목적이 달성되어, 즉, 접합체를 주입하는 경우 국부적 침적 효과를 얻고 APC에 대한 강력한 표적인 입자를 얻기 때문에, 면역계로의 폴리펩타이드 제시를 증진시킬 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 미립자 시스템을 사용하는 접근 또한 실시예에 상세하게 기재되어 있다.
APP 또는 Aβ 내 변형 도입 영역 선택의 기초가 되는 고려는 a) 공지되고 예측된 B-세포 에피토프의 보존, b) 3차 구조의 보존, c) "생산자 세포(producer cells)" 상에 존재하는 B-세포 에피토프의 회피 등이다.
상기한 바와 같이, 모두 상이한 위치에 T-세포 에피토프가 도입된 유사체 세트를 스크리닝 하는 것은 매우 용이하다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예가 인간 Aβ의 하향-조절을 수반하기 때문에, 그 결과로 상기한 APP 또는 Aβ 폴리펩타이드가 인간 Aβ 폴리펩타이드인 것이 바람직하다. 이러한 구체예에 있어서, APP 또는 Aβ 폴리펩타이드가 SEQ ID NO:2의 하나 이상의 아미노산 서열을 동일하거나 상이한 길이의 외래 TH 에피토프를 포함하는 하나 이상의 아미노산 서열로 치환시킴으로써 변형되는 것이 특히 바람직하다. 변형된 아밀로이드생성 APP 및 Aβ의 바람직한 예를 예시로서 P2와 P30 에피토프를 사용하는 도 1에 개략적으로 나타내었다. 이러한 구조체의 이론적 근거를 실시예에 상세하게 설명하였다.
보다 상세하게, SEQ ID NO:2 내로 도입되는 아미노산 서열을 함유하는(또는 완성하는) TH를 SEQ ID NO:2의 모든 아미노산에 도입할 수 있다. 즉, 상기 도입은 모든 아미노산 1-770의 다음에 가능하며, SEQ ID NO:2의 아미노산 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 및 714 중 어느 하나의 뒤에 도입하는 것이 바람직하다. 이는 아미노산 1-671 중 어느 하나 또는 이들 모두, 또는 아미노산 715-770 중 어느 하나 또는 이들 모두의 결실과 조합될 수 있다. 게다가, 치환 기술을 사용하는 경우, SEQ ID NO:2의 아미노산 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 및 714 중 어느 하나를 도입과 함께 결실시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 T-세포 반응을 개시하는 MHC 클래스 II 분자에 생산적으로 결합하는 어떠한 SEQ ID NO:2의 아서열도 포함하지 않는 유사체를 제시하는 것이다.
면역계가 항-Aβ 면역 반응을 유발하게 하는 이러한 면역원의 설계 방법의 이론적 근거는 다음과 같다: 자기유래(autologous) 단백질에 대한 생체 관용을 파괴하기에 충분히 강력한 아쥬반트에서 제제화된 Aβ와 같은 풍부한 자기유래 단백질을 사용하여 면역화하는 경우, 일부 백신화된 개체에서 유발된 면역반응을 단순히 면역화를 중단시킴으로써 중단시킬 수 없다는 위험이 있다. 이는 이러한 개체에 유발된 면역반응이 자기유래 단백질의 천연 TH 에피토프에 의하여 유도었기 때문인 것으로 보이고, 이는 백신화된 개체 자신의 단백질이 본래적으로 면역화제로서 작용을 할 수 있을 것이라는 부작용을 갖는다: 따라서, 자기면역 조건이 확립된다.
외래 TH 에피토프의 사용을 포함하는 바람직한 방법은, 본 발명자가 아는 바로는, 항-자기 면역 반응이 외래 TH 에피토프에 의하여 유도되기 때문에, 이러한 효과를 생산한다고 관찰된 바가 없으며, 바람직한 기술에 의하여 발생된 유도된 면역반응이 실제로 면역화의 중단 후에 감퇴한다는 것을 본 발명자들이 반복하여 입증하였다. 그러나, 이론적으로, 면역 반응이 또한 관련 자기-단백질 (이에 대하여 면역화 함)의 자기유래 TH 에피토프에 의하여 유도되는 것이 소수의 개체에서 발생할 수 있다 - 이는 자기-단백질이 Aβ와 같이 상대적으로 풍부한 경우 특히 적절한 반면, 다른 치료적 관련 자기-단백질은 단지 국부적으로 또는 체내에 매우 적은 양으로 존재하여 "자기-면역화 효과"가 가능하지 않다. 따라서, 이를 피하는 가장 다순한 방법 중 하나는 TH 에피토프로서 사용할 수 있는 펩타이드 서열이 면역원 내에 포함되는 것을 전적으로 회피하는 것이다 (그리고, 약 9 아미노산보다 짧은 펩타이드는 TH 에피토프로서 사용할 수 없기 때문에, 짧은 단편의 사용은 하나의 다순하고 용이한 접근이다). 따라서, 본 발명의 이러한 구체예는 또한 면역원이, TH 에피토프로서 다르게 작용할 수 있는 표적 단백질의 서열 내 단순한 보존적 치환을 포함하는 서열을 포함하는 "자기-자극 TH 에피토프"로서 이용가능한 표적 APP 또는 Aβ의 펩타이드 서열을 포함하지 않는다는 것을 확인할 수 있게 한다. .
APP 또는 Aβ 유사체를 면역계에 제시하는 바람직한 구체예는 MHC 클래스 II 분자에 생산적으로 결합하지 않는 하나 이상의 APP 또는 Aβ 유래 펩타이드 및 하나 이상의 T-헬퍼 에피토프를 포함하는 키메릭 펩타이드의 사용을 수반한다. 게다가, APP 또는 Aβ 유래 펩타이드가 B-세포 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 면역원 유사체가 하나 이상의 B-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열이 연속된 서열로서 또는 삽입을 포함하는 서열 중 어느 하나로 표현되는 것이고 상기 삽입이 외래 T-헬퍼 에피토프를 포함하는 경우 특히 유리하다.
또한, 이러한 구체예는 APP 또는 Aβ의 적절한 B-세포 에피토프 운반 부위가 MHC 클래스 II 분자에 생산적으로 결합할 수 없는 짧은 펩타이드 스트레치로 구성되는 경우 가장 바람직하다. 따라서, 선택된 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 B-세포 에피토프 또는 -에피토프들은 SEQ ID NO:2의 9 개 이하의 연속적 아미노산을 포함하여야 한다. 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 아미노산 서열로부터 유래하는 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3 이하의 연속적인 아미노산을 포함하는 것과 같이, 짧은 펩타이드들이 바람직하다.
유사체가 하나 이상의 SEQ ID NO:2의 아서열을 포함하여 각각의 이러한 하나 이상의 아서열이 9 개의 연속적 아미노산, 8 개의 연속적 아미노산, 7 개의 연속적 아미노산, 6 개의 연속적 아미노산, 5 개의 연속적 아미노산, 4 개의 연속적 아미노산, 및 3 개의 연속적 아미노산으로 구성된 군 중에서 선택되는 APP 또는 Aβ 유래의 아미노산 스트레치로 독립적으로 이루어지는 것이 바람직하다.
연속적 아미노산이 SEQ ID NO:2의 잔기 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 및 714로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 잔기로부터 시작하는 것이 특히 바람직하다.
단백질/ 펩타이드 백신화 ; 유사체의 제제화 및 투여
유도체를 동물에 투여하여 동물 면역계에 유사체를 제시하는 경우, 폴리펩타이드 제제화는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 이론을 따른다.
펩타이드 서열을 유효성분으로서 포함하는 백신의 제조는 미국특허 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; 및 4,578,770(모두 본 명세서에 참조로서 포함됨)에 예시된 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술 분야에 일반적으로 잘 알려져 있다. 통상적으로, 이러한 백신은 액체 용액 또는 현탁액 중 하나로서 주입가능한 물질로 제조하며; 주입시 용액용으로 적합한, 또는 주입시 현탁액용으로 적합한 또는 주입 전 액체용으로 적합한 고체 제형 또한 제조할 수 있다. 상기 제제는 또한 에멀젼화될 수도 있다. 활성 면역원 성분은 종종 약학적으로 허용가능하고 활성 성분과 친화적인 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제에는, 예컨대, 물, 살린, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합이 있다. 또한, 원하는 경우, 백신이 습윤제(wetting agent) 또는 유화제, pH 완충제 또는 백신의 효과를 증진시키는 아쥬반트와 같은 보조 물질을 소량으로 포함할 수 있다; 하기의 아쥬반트에 대한 상세한 논의 참조.
백신을 통상적으로 주사에 의하여, 비경구(parenterally) 투여하며, 예컨대 피하, 피내 또는 근육내 투여한다. 다른 투여 방식에 적합한 추가적인 제제는 좌약및, 어떤 경우에는, 경구(oral), 구강(buccal), 설하(sublinqual), 복막내(intraperitoneal), 질내(intravaginal), 항문(anal), 경막외(epidural), 척수(spinal), 및 두개내(intracranial) 제제를 포함한다. 좌약의 경우, 통상적인 결합제 및 캐리어는, 예컨대, 폴리알칼렌 글리콜(polyalkalene glycols) 또는 트리글리세라이드를 포함하고; 이러한 좌약은 활성 성분을 0.5 % 내지 10 %, 바람직하게는 1 - 2 % 범위로 포함하는 혼합물로부터 제조할 수 있다. 경구용 제제는, 예컨대, 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 정상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 타블렛, 환약, 캡슐, 지속적 방출 제제 또는 분말의 형태를 취하며, 활성성분을 10 - 95 %, 바람직하게는 25 - 70 % 함유한다. 경구용 제제의 경우, 콜레라 독소(cholera toxin)가 중요한 제제화 파트너 (또한 가능한 접합 파트너)이다.
폴리펩타이드는 중성 또는 염 형태로 백신으로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 산 부가 염(펩타이드의 유리 아미노기로 형성되고)을 포함하며, 이는 예컨대, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산(mandelic acid) 등과 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카르복시기로 형성된 염은 또한, 예컨대, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘 또는 수산화 철과 같은 무기염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인(procaine) 등과 같은 유기염기로부터 유래할 수 있다.
백신은 제제 투여량과 모순되지 않는 방법으로 투여하고, 이러한 양은 치료적으로 유효하고 면역원성인 것이다. 투여될 양은 치료될 환자에 따라, 예컨대, 개개인의 면역계의 면역 반응을 마운팅하는 능력 및 원하는 보호의 정도에 따라 달라진다. 적절한 투여량 범위는 백신당 활성성분 약 수 백 마이크로그램이고, 바람직한 범위는 약 0.1 μg 내지 2,000 μg (비록 1-10 mg 범위가 예상된다고 해도)이고, 예컨대, 약 0.5 μg 내지 1,000 μg 범위이고, 바람직하게는 1 μg 내지 500 μg 범위이고, 특히 바람직하게는 10 μg 내지 100 μg 범위이다. 초기 투여 및 2차 면역 주사(booster shots)를 위하여 적절한 처방은 또한 다양하지만 초기 투여에 이어지는 후속 접종 또는 다른 투여에 의하여 전형화된다.
적용 방법은 광범위하게 다양하다. 백신 투여를 위한 모든 통상적인 방법이 적용 가능하다. 이들은 고체 생리학적으로 허용가능한 베이스 상에서의 또는 생리학적으로 허용가능한 분산물 내에서의 경구적 적용, 주사 등에 의한 비경구적 적용을 포함한다. 백신의 투여량은 투여 경로에 따라 달라질 것이며, 백신화될 개인의 연령 및 항원의 제제에 따라서 달라질 것이다.
백신의 몇 가지 폴리펩타이드는 백신 내에서 충분히 면역원성이지만, 다른 몇 몇 경우에 면역반응은 백신이 아쥬반트 물질을 추가적으로 포함할 때 증진될 것이다.
백신에 대한 아쥬반트 효과를 달성하는 다양한 방법들이 알려져 있다. 일반적 이론 및 방법이 다음의 문헌에 상세히 나타나 있다: "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, 및 "Vaccines: New Generationn Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9 (모두 본 명세서에 참조로서 포함됨).
자기항원에 대한 자기관용의 파괴를 촉진하는 것으로 증명될 수 있는 아쥬반트를 사용하는 것이 특히 바람직하다; 실제로, 이는 자기백신(autovaccine)의 활성성분으로서 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 사용하는 경우에 필수적이다. 적절한 아쥬반트의 비-제한적 예로서 면역 표적화 아쥬반트; 독소, 사이토카인, 및 미코박테리아와 같은 면역 조절 아쥬반트; 기름제제; 폴리머 ; 미셀 형성 아쥬반트; 사포닌; 면역자극 복합체 매트릭스 (ISCOM
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매트릭스); 입자; DDA ; 알루미늄 아쥬반트; DNA 아쥬반트; γ-이눌린; 및 인캡슐레이팅 아쥬반트로 이루어진 군 중에서 선택된 것이 있다. 일반적으로, 유사체 내에서 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 모이어티로서 사용가능한 화합물 및 작용제와 관련된 상기 기재가 또한 필요한 변경을 가하여(mutatis mutandis) 본 발명의 백신의 아쥬반트에서의 이들의 용도를 의미할 수 있다는 것을 유의하여야 한다.
아쥬반트의 적용은일반적인 완충 살린에 용해된 0.05 내지 0.1 % 용액으로 사용되는 수산화 알루미늄 또는 포스페이트(alum)와 같은 작용제의 사용을 포함하고, 0.25 % 용액으로 사용되는 당의 합성 폴리머(예컨대, Carbopol
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)와의 혼합, 각각 70 내지 101 ℃ 사이의 온도 범위에서의 30초 내지 2 분동안 열처리에 의한 백신내 단백질 응집 및 크로스-링킹제에 의한 응집 또한 가능하다. 펩신 처리된 알부민에 대한 항체(Fab 단편)으로 재활성화된 응집체, C. parvum과 같은 박테리아 세포 또는 그람음성 박테리아의 리포폴리사카라이드 또는 장독소 성분과의 혼합물, 만니드 모노-올리에이트 (Aracel A)와 같은 생리학적으로 허용가능한 기름 비히클 내의 에멀젼 또는 블록 치환기로서 사용되는 퍼플루오로카본 (Fluosol-DA)의 20 % 용액을 사용하는 에멀젼 도한 사용가능하다. 스쿠알렌 및 IFA와 같은 오일과의 혼합물 도한 바람직하다.
본 발명에 있어서, DDA(디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드)는, DNA 및 γ-이눌린의 경우 중요한 후보자이며, 또한, 완전 및 불완전 프로인트 아주반트 뿐 아니라 QuilA 및 QS21과 같은 quillaja 사포닌이, RIBI의 경우, 중요하다. 또 다른 가능성은 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 상기한 C3 및 C3d, 및 뮤라밀 디펩타이드(MDP)이다.
리포좀 제제 또한 아쥬반트 효과를 부여한다고 알려져 있으며, 따라서 리포좀 아쥬반트는 본 발명에 있어서 바람직하다.
또한, 면역자극 복합체 매트릭스 유형(ISCOMO
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매트릭스) 아쥬반트는, 특히, 이러한 유형의 아쥬반트가 APC에 의한 MHC 클래스 II 발현을 상향-조절하는 것으로 나타나 있기 때문에, 본 발명에 있어서 바람직한 선택이다. ISCOM 매트릭스는 Quillaja saponaria 유래 사포닌(트리테르페노이드), 콜레스테롤 및 인지질로 구성된다 (임의적으로 분류된다). 면역원성 단백질과 혼합되는 경우, 얻어지는 미립자 제제는 사포닌이 60 내지 70 %를 구성하고, 콜레스테롤 및 인지질이 10 내지 15 %를 구성하고 단백질이 10 내지 15 %를 구성하는 ISCOM 입자로서 알려진 것이다. 면역자극 복합체의 사용 및 조성에 관한 세부사항은, 예컨대, 아쥬반트를 취급하는 상기한 문헌에서 찾을 수 있으며, 또한, Morein B et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 및 Barr IG and Mitchell GF, 1996, Immunol. 및 Cell Biol. 74: 8-25 (모두 본 명세서에 참조로서 포함됨) 역시 완전 면역자극 복합체의 제조를 위한 유용한 지시를 제공한다.
아쥬반트 효과를 달성하는 또 다른 매우 중요한 (따라서, 바람직한) 가능성은 Gosselin et al., 1992 (본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 기술을 사용하는 것이다. 간단히 말해서, 본 발명의 항원과 같은 관련 항원의 제시는 항원을 단핵세포/매크로파아지 상의 Fcγ 수용체에 대한 항체 (또는 항원 결합 항체 단편)에 접합시킴으로써 증진시킬 수 있다. 특히, 항원과 항-Fcγ RI 간의 접합체는 백신화의 목적을 위한 면역원성을 증진시키는 것으로 입증되었다.
다른 가능성은 아밀로이드생성 폴리펩타이드의 변형된 버전에서의 첫 번째 및 두 번째 모이어티에 대한 후보자로서 상기된 표적화 및 면역 조절 물질 (사이토카인)의 사용을 수반한다. 이와 관련하여, 폴리 I:C와 같은 사이토카인의 합성 유도 인자 또한 가능하다.
적절한 미코박테리아 유도체는 뮤라밀 디펩타이드, 완전 프로인트 아쥬반트, RIBI, 및 TDM 및 TDE와 같은 트레할로오스의 디에스테르로 이루어진 군 중에서 선택된다.
적절한 면역 표적화 아쥬반트는 CD40 리간드 및 CD40 항체 또는 특이적으로 결합하는 이들의 단편(상기의 기재 참조), 만노오스, Fab 단편 및 CTLA-4로 이루어진 군 중에서 선택된다.
적절한 폴리머 아쥬반트는 덱스트란, PEG, 전분, 만난 및 만노오스와 같은 탄수화물; 플라스틱 폴리머; 및 라텍스 비드와 같은 라텍스로 이루어진 군 중에서 선택된다.
면역 반응을 조절하는 또 다른 중요한 방법은 "가상 림프절(virtual lymph node)"(VLN)(사유 의료 기구, ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501에 의해서 개발) 내에 면역원을 (임의적으로 아쥬반트 및 약학적으로 허용가능한 캐리어 및 비히클과 함께) 포함한다. VLN (얇은 관상 기구)는 림프절의 구조와 기능을 모방한 것이다. 피부 아래에 VLN를 삽입하면 사이토카인 및 케모카인이 급증된 무균 염증 부위가 생긴다. T- 및 B-세포 뿐 아니라 APCs는 위험 신호에 대하여 신속하게 반응하고, 염증 부위로 향하고 VLN의 다공성 매트릭스 내부에 축적된다. 항원에 대하여 면역 반응을 마운팅하기 위하여 요구되는 항원 필요량은 VLN을 사용하는 경우 감소하고, VLN을 사용하는 백신화에 의하여 부여된 면역 보호는 아쥬반트로서 Ribi를 사용하는 통상적인 백신화를 초월하는 것으로 나타났다. 이러한 기술은 Gelber C et al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts ofImmunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual LymphNode", 및 "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th-15th 1998, Seascape Resort, Aptos, Calfornia"에 간략하게 개시되어 있다.
백신의 미세입자(microparticle) 제제가 많은 경우에 있어서 단백질 항원의 면역원성을 증가시키는 것으로 나타났으며, 따라서 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예이다. 미세입자는 항원과 폴리머, 지질, 탄수화물 또는 입자를 만들기에 적합한 다른 분자와의 공-제제로서 제조되고, 미세입자는 항원 자체만으로 구성된 균질한 입자일 수 있다.
폴리머 기재의 미세입자의 예에는 폴리머와 항원이 고체 입자내에 농축되어 있는 PLGA 및 PVP 기재 입자가 있다 (Gupta, R. K. et. al. 1998). 지질 기재의 입자는 미셀 내에 항원을 에워싸는 지질의 미셀 (소위 리포좀)로서 제조할 수 있다(Pietrobon, P. J. 1995). 탄수화물 기재의 입자는 통상적으로 전분 또는 키토산과 같은 적절한 분해성 탄수화물로 제조한다. 폴리머 입자에 사용된 것과 유사한 과정으로 탄수화물과 항원을 혼합하고 입자내에 농축한다 (Kas, H. S. et. al. 1997).
항원으로만 구성된 입자를 다양한 분사 및 동결-건조 기술에 의하여 제조할 수 있다. 특히 본 발명의 목적에 적합한 것은 제어된 크기의 매우 균일한 입자를 제조하기 위하여 사용되는 초임계 유체 기술이다 (York, P. 1999 & Shekunov, B. et. al. 1999).
백신을 이를 필요로 하는 환자에 1 년에 1 내지 6회, 예컨대 1 년에 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6회 투여할 것을 예상하였다. 본 발명에 따른 바람직한 자기백신의 사용에 의하여 유도된 기억 면역은 영구적이지 않으며, 따라서 면역계는 아밀로이드생성 폴리펩타이드 또는 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드로 정기적으로 공격될 것을 필요로 한다.
유전적 변이에 의하여, 상이한 개체는 동일한 폴리펩타이드에 대하여 다양한 강도의 면역 반응을 나타낼 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 백신은 면역반응을 증가시키기 위하여 몇 가지 상이한 폴리펩타이드를 포함할 수 있다 (외래 T-세포 에피토프 도입의 선택과 관련된 상기 기재를 참조하라). 백신은 두 개 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 모두 상기에 정의된 바와 같다.
결론적으로, 백신은 3 내지 20 개의 상이한 변형되거나 변형되지 아니한 폴리펩타이드, 예컨대 3 내지 10 개의 상이한 폴리펩타이드를 포함한다.
핵산 백신
펩타이드-기재 백신의 통상적인 투여에 대한 대안으로서, 핵산 백신화 (또한 “핵산 면역화”, “유전적 면역화” 및 “유전자 면역화”라고도 알려짐)가 많은 중요한 특성을 제공한다.
우선, 통상적인 백신 접근과 대조적으로, 핵산 백신화는 면역원제의 대규모 생산(예컨대, 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 생산하는 미생물의 산업적 규모의 발효의 형태로)을 소모하는 리소스를 필요로하지 않는다. 게다가, 면역원을 위한 리폴딩 계획 및 기구 정화도 필요 없다. 그리고, 마지막으로, 도입된 핵산의 발현 산물을 생산하기 위하여 핵산 백신화가 백신화된 개체의 생화학적 기관(apparatus)에 의존하기 때문에, 발현 산물의 최적 번역-후 프로세싱이 일어날 것으로 예측되고; 이는, 상기한 바와 같이, 본래 B-세포 에피토프의 상당한 부분이 변형된 분자에서 보존되고 원칙적으로 B-세포 에피토프가 모든 (생)분자(예컨대, 탄수화물, 지질, 단백질 등) 부분에 의하여 구성될 수 있기 때문에, 자기백신화의 경우에 특히 중요하다. 따라서, 면역원의 천연 글리코실화 및 리피데이션 패턴은 전체적인 면역원성에 대하여 매우 중요하고, 이는 면역원을 생산하는 숙주를 가짐으로써 가장 잘 확인된다.
따라서, 본 발명의 변이체 a-c의 바람직한 구체예는 동물 세포내로 유사체를 코딩하는 핵산(들)을 도입함으로써 면역계에 유사체를 효과적으로 제시를 포함하고, 이로 인하여 도입된 핵산(들)의 세포에 의한 생체내 발현을 얻을 수 있다.
이러한 구체예에서, 도입된 핵산은 노출(naked) DNA, 하전되거나 하전되지 않은 지질로 제제화된 NA, 리포좀 내에 제제화된 DNA, 바이러스 백터 내에 포함된 DNA, 트랜스펙션-촉진 단백질 또는 폴리펩타이드로 제제화된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드로 제제화된 DNA, 칼슘 침전제로 제제화된 DNA, 비활성 캐리어 분자에 커플링된 DNA, 예컨대 PLGA (WO 98/31398에 개시된 마이크로인캡슐레이션 기술 참조) 또는 키틴 또는 키토산 내에 인캡슐레이션된 DNA, 및 아쥬반트로 제제화된 DNA의 형태로 존재할 수 있는 DNA가 바람직하다. 이러한 경우에, 통상적인 백신 제제에서으 아쥬반트의 용도에 포함되는 모든 실질적 고려는 DNA 백신에 적용됨을 유의하여야 한다. 따라서, 폴리펩타이드 기재 백신 환경에서의 아쥬반트의 용도와 관련된 본 명세서의 기재는 필요한 변경을 가하여 핵산 백신화 기술에서의 이의 용도에 적용된다.
상기한 바와 같은 폴리펩타이드 기재 백신의 투여 계획 및 투여 경로와 관련하여, 이들은 또한 본 발명의 핵산 백신에 대하여도 적용가능하고, 폴리펩타이드의 투여 계획 및 투여 경로에 속하는 모든 기재는 필요한 변경을 가하여 핵산에도 적용된다. 여기에 핵산 백신을 정맥내 및 동맥내적으로 적절하게 투여할 수 있다는 것이 추가되어야 할 것이다. 게다가, 소위 유전자 총을 사용하여 핵산 백신을 투여할 수 있음이 이 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있으며, 따라서, 이러한 투여 방식 또는 동등한 투여 방식 또한 본 발명의 일부로 간주된다. 마지막으로, 핵산 투여에 있어서의 VLN의 사용이 또한 우수한 결과를 일으키는 것으로 보고되어 있고, 따라서, 이러한 특정 투여 방식은 특히 바람직하다.
또한, 면역화제로서 사용된 핵산(들)은, 예컨대, 유용한 아쥬반트로서 기재된 사이토카인과 같은 상기된 면역조절 물질의 형태의, 첫 번째, 두 번째 및/또는 3 번째 모이어티를 코딩하는 부위를 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 바람직한 버젼은 유사체에 대한 코딩 부위 및 상이한 리딩 프레임 또는 적어도 상이한 프로모터의 조절하에 있는 면역 조절물질(immunomodulator)의 코딩 부위를 갖는 것을 포함한다. 이로써, 유사체 또는 에피토프가 면역조절물질의 융합 파트너로서 생산되는 것을 피할 수 있다. 다른 방안으로서, 두 개의 구별되는 뉴클레오타이드 단편을 사용할 수 있지만, 이는, 동일한 분자내에 포함된 두 코딩 부위를 모두 갖는 경우 공-발현을 보증한다는 이점 때문에 보다 덜 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 APP 또는 Aβ에 대한 항체의 생산을 유도하는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 다음을 포함한다:
- 본 발명의 핵산 단편 또는 벡터 (하기의 벡터 부분 참조), 및
- 상기한 바와 같은 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 캐리어 및/또는 아쥬반트.
정상적인 상황 하에서, 변이체-코딩 핵산을 바이러스 프로모터의 조절하에서 발현이 일어나는 벡터 형태로 도입시킨다. 본 발명의 벡터에 대한 보다 상세한 설명은 하기의 설명을 참조하라. 또한, 핵산 백신의 용도 및 제제화에 관한 상세한 설명은 다음을 참조하라: Donnelly JJ et al, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 및 Donnelly JJ et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172 (이들은 모두 본 명세서에 참조로서 포함됨).
생백신( Live vaccines )
변이체 a-c에서 정의된 바와 같은 유사체를 면역계에 효과적으로 제시하기 위한 세 번째 대안은 생백신 기술을 사용하는 것이다. 생백신에 있어서, 동물, 즉, 유사체를 코딩하는 핵산 단편 또는 이러한 핵산 단편을 포함하는 벡터로 형질전환된 비-병원성 미생물에 투여함으로써 변역계로의 제시가 유발된다. 비-병원성 미생물은, 예컨대, Mycobacterium bovis BCG., 비-병원성 Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, 등과 같은, 모든 적절한 약독화된(attenuated) 박테리아 균주 (재조합 DNA 기술에 의한 병원성 발현 산물의 제거 또는 패시징(passaging)에 의하여 약독화됨). 최신식 생백신의 제조에 대한 검토를, 예컨대, 다음의 문헌에서 찾을 수 있다: Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 및 Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990 (이들은 모두 본 명세서에 참조로서 포함됨). 이러한 생백신에 사용되는 벡터 및 핵산 단편에 대한 상세한 사항은 하기의 설명을 참조하라.
박테리아 생백신에 대한 대안으로서, 하기에 논의되는 본 발명의 핵산 단편을 백시니아 계통(vaccinia strain) 또는 다른 모든 적절한 폭스바이러스(poxvirus)와 같은 비-독성(non-virulent) 바이러스 백신 벡터 내에 포함시킬 수 있다.
정상적으로, 비병원성 미생물 또는 바이러스를 동물에 단 한 번 투여할 수 있지만, 어떤 경우에는, 보호 면역을 유지하기 위하여 일생 동안 한 번 이상 미생믈을 투여하는 것이 필요할 수 있다. 펩타이드 백신화에 대하여 앞에서 상세히 설명한 바와 같은 면역화 계획은 생백신 또는 바이러스 백신을 사용하는 경우 유용할 것이다.
대안적으로, 생백신 또는 바이러스 백신은 선행하는 또는 후속하는 폴리펩타이드 및/또는 핵산 백신화와 결합된다. 예컨대, 생백신 또는 바이러스 백신을 사용하여 일차 면역화를 유발하고 이어서 폴리펩타이드 또는 핵산 접근을 사용하여 부스터 면역화(booster immunizations)시키는 것이 가능하다.
미생물 또는 바이러스를, 예컨대, 유용한 아쥬반트로서 기재된 사이토카인과 같은 상기된 면역조절물질의 형태의, 첫 번째, 두 번째 및/또는 세 번째 모이어티를 코딩하는 부위를 포함하는 핵산으로 형질전환시킬 수 있다. 이러한 구체예의 바람직한 버젼은 유사체에 대한 코딩 부위 및 상이한 리딩 프레임 내 또는 적어도 서로 다른 프로모터의 조절하에 면역조절물질에 대한 코딩 부위를 갖는것을 포함한다. 이로써, 유사체 또는 에피토프가 면역조절물질의 융합 파트너로서 생산되는 것을 피한다. 이와 다른 방안으로서, 두 개의 구별되는 핵산 단편을 형질전환제(transforming agents)로서 사용하는 것이다. 물론, 동일 리딩프레임 내에 첫 번째 및/또는 두 번째 및/또는 세 번재 모이어티를 갖는 것은 발현산물로서 본 발명의 유사체를 제공할 수 있으며, 이러한 구체예는 본 발명에 있어서 특히 바람직하다.
질병 치료에 있어서의 본 발명의 방법의 용도
상기의 기재로부터 인식되는 바와 같이, 본 발명의 방법의 제공은 아밀로이드 침적의 특성을 갖는 질병의 제어를 가능하게 한다. 이러한 경우에 있어서, AD는 본 발명의 방법의 주요한 표적이지만 Aβ 함유 아밀로이드 침적의 특징을 갖는 다른 질병 또한 가능한 표적이다. 따라서, 아밀로이드 활성을 하향-조절하기 위한 본 발명의 방법의 중요한 구체예는 AD 또는 아밀로이드 침적의 특징을 갖는 다른 질병을 치료 및/또는 예방 및/또는 완화시키는 것을 포함하며, 상기 방법은 본 발명의 방법에 따라 APP 또는 Aβ를 아밀로이드의 양이 현저하게 감소하는 정도로 하향-조절하는 것을 포함한다.
아밀로이드의 감소가 아밀로이드 생성 및 아밀로이드 분해/제거 간의 균형을 역전시키는 결과를 가져오는 것, 즉, 아밀로이드 분해/제거 속도가 아밀로이드 생성 속도를 초과하는 것이 특히 바람직하다. 면역화를 필요로 하는 환자의 면역화의 면역학적 충격 및 수를 섬세하게 조절함으로써, 과다한 부작용 없이 아밀로이드 침적의 순수한 감소를 야기하는 시간에 대한 균형을 얻는 것이 가능할 것이다.
대안적으로, 본 발명의 방법이 환자 내의 존재하는 아밀로이드 침적을 제거 또는 감소시킬 수 없는 경우, 본 발명의 방법을 사용하여 새로운 아밀로이드의 생성을 임상적으로 의미있게 감소시켜서 질병 증상이 쇠약해지지 않는(non-debilitating) 기간을 상당히 연장시킬 수 있다. 아밀로이드의 혈청 농도(침적된 물질과 평형을 이룰 것으로 생각됨)를 측정하거나 양전자-방출 토모그라피 (positron-emission tomography, PET) 스캐닝의 사용 의하여 아밀로이드 침적 속도를 모니터링 하는 것이 가능하다. Small GW, et al., 1996, Ann N Y Acad Sci 802: 70-78 참조.
치료 또는 완화에 유사한 방법으로 본 발명의 수단 및 방법을 사용할 수 있는 다른 질병 및 증상을 상기 “발명의 배경”에서 기재되어 있고 또한 하기의 “다른 아밀로이드 질병 및 이와 관련된 단백질”이라는 제목의 섹션에 열거되어 있다.
본 발명의 펩타이드 , 폴리펩타이드 및 조성물
상기에서 나타낸 바와 같이, 본 발명은 병리학적 관련 아밀로이드 침적양을 감소기키기 위하여 APP 또는 Aβ 항원에 대하여 환자를 면역화시키는 개념을 기초로 한다. 이렇게 면역화시키는 바람직한 방법은 본 명세서에 기재된 유사체를 사용하여 이전에 이 발명이 속하는 기술분야에서 개시된 바 없는 분자를 제공하는 것이다.
본 명세서에 기재된 유사체는 그 자체로 발명적 가치가 있으며, 따라서, 본 발명의 중요한 한 부분은 상기한 유사체와 관련된 것이다. 따라서, 변형된 APP 또는 Aβ와 관련된 본 명세서에 제시된 모든 기재는 본 발명의 아밀로이드생성 유사체을 설명하기 위한 것이고, 이러한 모든 기재는 필요한 변경을 가하여 이들 유사체에 적용할 수 있다.
바람직한 변형 APP 또는 Aβ 분자가 APP 또는 Aβ 또는 10 개 이상의 아미노산 길이를 갖는 이들의 아서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 서열 동일성이 높을수록 바람직하며, 예컨대, 75 % 이상 또는 심지어 80, 85, 90 또는 95 % 이상인 것이 바람직하다. 단백질 및 핵산에 대한 서열 동일성을 (Nref - Ndif)x100/Nref로 계산할 수 있고, 식 중, Ndif는 정렬시 두 서열에서의 비-동일 잔기의 총 수이고, Nref는 서열 중 하나의 잔기 수이다. 따라서, 상기 DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC와 75 %의 서열 동일성을 갖는다 (Ndif=2 및 Nref=8).
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 상기된 바와 같은 유사체의 면역원적 유효량을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 희석제 및/또는 비히클 및/또는 캐리어 및/또는 부형제 및 임의적으로 아쥬반트를 추가적으로 포함한다. 환언하면, 이러한 본 발명의 부분은, 특히 상기한 바와 같은, 유사체 제제에 관한 것이다. 따라서, 아쥬반트, 캐리어 및 비히클의 선택은 본 발명의 APP 또는 Aβ의 하향-조절 방법에 사용하기 위한 변형 및 비변형 아밀로이드생성 폴리펩타이드 제제를 의미하는 경우 상기한 바를 따른다.
폴리펩타이드는 이 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법을 따라서 제조한다. 유사체를 코딩하는 핵산 서열의 적절한 벡터로의 도입, 상기 벡터를 사용하는 적절한 숙주의 형질전환, 숙주세포에 의한 상기 핵산 서열의 발현, 숙주 세포 또는 이들의 배양 상청액으로부터 얻은 발현 산물, 및 후속하는 정제 및 임의적으로 리폴딩 또는 유도체화와 같은 추가적인 변형을 포함하는 재조합 유전자 기술에 의하여 긴 폴리펩타이드를 정상적으로 제조한다.
잘 알려진 고상 또는 액상 펩타이드 합성 기술에 의하여 짧은 폴리펩타이드를 바람직하게 제조한다. 그러나, 이러한 기술의 최근의 진보는 이러한 방법에 의하여 전장 폴리펩타이드 및 단백질을 생산하는 것이며, 따라서 합성 방법에 의하여 긴 구조체를 제작하는 것 또한 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 핵산 단편 및 벡터
재조합 유전자 기술뿐 아니라 화학적 합성 또는 반합성(semisynthesis)에 의하여 폴리아미노산 유사체를 제조할 수 있다는 것이 상기된 기재로부터 알 수 있으며; 후자의 두 가지 옵션은 상기 변형이 단백질 캐리어(예컨대, KLH, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 및 BSA) 및 탄수화물 폴리머와 같은 비-단백질성 분자와의 커플링에 있는 경우 및 상기 변형이 사이드 체인 또는 사이드기를 APP 또는 Aβ 유래 펩타이것 체인에 부가하는 것을 포함하는 경우에도 물론 특히 적절하다.
재조합 유전자 기술 및 물론 핵산 면역화를 또한 위하여, 유사체를 코딩하는 핵산 단편이 중요한 산물이다, 따라서, 본 발명의 중요한 부분은 본 발명의 유사체, 즉, 융합 파트너가 부가 또는 삽입된 천연 서열을 포함하는 APP 또는 Aβ 유래 폴리펩타이드 또는 바람직하게는 삽입 및/또는 부가, 바람직하게는 치환 및/또는 결실에 의하여 외래 T-세포 에피토프가 도입된 APP 또는 Aβ 유래 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 단편과 관련된 것이다. 상기 본 발명의 핵산 단편은 DNA 또는 RNA 단편 중 하나이다.
본 발명의 핵산 단편을 적절한 벡터에 정상적으로 삽입하여 본 발명의 핵산 단편을 운반하는 클로닝 또는 발현 벡터를 형성할 것이다; 이러한 신규한 벡터 또한 본 발명의 일부분이다. 이러한 본 발명의 벡터의 구축(construction)에 관련된 세부내용은 하기의 형질전환 세포 및 미생물 관련부분에서 설명될 것이다. 상기 벡터는, 적용 목절 또는 유형에 따라서, 플라스미드, 파이지, 코스미드, 미니-염색체 또는 바이러스의 형태일 수 있으며, 특정 세포에서만 일시적으로 발현하는 노출 DNA 또한 본 발명의 중요한 벡터이다. 본 발명의 바람직한 클로닝 및 발현 벡터는 자율복제(autonomous replication) 할 수 있으며, 이로 인하여 후속하는 클로닝을 위한 높은 수준의 발현 또는 높은 수준의 복제를 위하여 많은 복제수를 가능하게 한다.
본 발명의 벡터의 일반적인 개요는 다음의 5'-3' 방향 및 작동가능한(operable) 연결 특성을 포함한다: 본 발명의 핵산 단편의 발현을 이끄는 프로모터, 임의적으로 폴리펩타이드 단편의 멤브레인으로의 통합(integration) 또는 분비(세포외 상(extracellular phase), 또는 적용가능한 경우 플라즈마 주변(periplasma)으로)를 가능하게 하는 리더 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열, 본 발명의 핵산 단편 및 임의적으로 종결자(terminator)를 코딩하는 핵산 서열. 생산자 균주 또는 세포주에서 발현벡터와 작동시, 형질전환 세포의 유전적 안정성을 위하여 숙주세포에 도입시 벡터가 숙주 세포 게놈에 통합되는 것이 바람직하다. 반면, 동불에서의 생체내 발현을 유발하기 위하여 사용되는 벡터를 이용하여 작업시 (즉, DNA 백신화에 벡터를 사용하는 경우), 벡터가 숙주 세포 게놈내로 통합될 수 없는 것이 안전성 이유를 위하여 바람직하다; 통상적으로, 노출(naked) DNA 또는 비-통합 바아러스 벡터를 사용하고, 그의 선택은 본 발명의 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 벡터는 숙주 세포를 형질전환시켜 본 발명의 유사체를 생산하는데 사용하다. 역시 본 발명의 일부인 이러한 형질전환 세포는 본 발명의 벡터 또는 핵산 단편을 증식시키기 위하여 사용되는, 또는 본 발명의 유사체의 재조합 생산을 위하여 사용되는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다. 또는, 상기 형질전환 세포는 핵신 단편(하나의 싱글 또는 다수 복제본)을 삽입하여 유사체를 멤브레인 또는 세포벽으로 통합 또는 분비시키는 적절한 생백신 균주일 수 있다.
본 발명의 바람직한 형질전환 세포는 박테리아(Escherichia 종[예컨대, E. coli], Bacillus 종[예컨대, Bacillus subtilis], Salmonella 종, 또는 Mycobacterium 종[바람직하게는 비병원성, 예컨대 M. bovis BCG]), 효모 (예컨대, Saccharomyces cerevisiae), 및 원생생물과 같은 미생물들이다. 대안적으로, 상기 형질전환 세포는 진균, 곤충세포, 식물 세포 또는 포유류 세포와 같은 다세포 생물체로부터 유래할 수 있다. 인간에서 유래한 세포가 가장 바람직하다 (하기의 세포주 및 벡터 설명 참조). 최근 결과는 적용자의 실험실에서 폴리펩타이드를 재조합적으로 생산하기 위하여 상업적으로 입수가능한 Drosophila melanogaster 세포주 (Schneider 2(S2) 세포주 및 벡터 시스템, Invitrogen에서 입수)를 사용하는데 있어서 큰 가능성을 보여주었으며, 따라서, 이러한 발현시스템이 특히 바람직하다.
클로닝 또는 최적화된 발현을 위하여, 상기 형질전환 세포는 본 발명의 핵산 단편을 발현할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 핵산 단편을 발현하는 세포는 본 발명의 구체예에 바람직하게 유용하다; 이들을 본 발명의 유사체의 소규모 또는 대규모 제조를 위하여 사용할 수 있으며, 비-병원성 박테리아의 경우, 생백신의 백신 성분으로서 사용할 수 있다.
형질전환 세포에 의하여 본 발명의 유사체를 생산할 때, 발현 산물을 배양 배지로 배출시키거나 형질전환 세포 표면상으로 운반하는 것이 편리하지만 필수적이지는 않다.
생산자 세포를 동정할 때, 거기에 기초하여 본 발명의 벡터를 운반하고 상기 변형된 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 단편을 발현하는 안정한 세포주를 확립하는 것이 바람직하다. 이 안정한 세포주가 본 발명의 유사체를 분비 또는 운반하여 이들의 정제를 용이하게 하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 리플리콘(replicon)과 숙주 세포와 친화적인 종으로부터 유래하는 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 숙주와 함께 사용한다. 상기 벡터는 통상 복제 부위 뿐 아니라 형질전환 세포에 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 운반한다. 예컨대, E. coli는 통상적으로 E. coli 종에서 유래하는 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환시킨다 (예컨대, Bolivar et al., 1977 참조). pBR322 플라스미드는 암피실린 및 테트라사이클린 내성을 위한 유전자를 포함하기 때문에 형질전환 세포를 동정하는 손쉬운 수단을 제공한다. pBR 플라스미드 또는 미생물 플라스미드 또는 파아지는 또한 발현을 위하여 원핵 미생물에 의하여 사용되는 프로모터를 포함하거나 포함하도록 변형되어야 한다.
재조합 DNA 구축에 가장 일반적으로 사용되는 이러한 프로모터는 B-락타마제 (페니실리나아제) 및 락토오스 프로모터 시스템 (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) 및 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776)을 포함한다. 이들이 가장 일반적으로 사용되지만, 다른 미생물 프로모터들을 발견하여 사용하고 있으며, 이들의 핵산 서열과 관련된 세부 내용이 공개되어 있고, 당업자가 이들을 기능적으로 플라스미드와 연결시키는 것을 가능하게 한다 (Siebwenlist et al., 1980). 원핵 생물에서 유래하는 특정 유전자를 E. coli에서 이들 자신의 프로모터 서열로부터 발현시켜, 인공적 방법에 의하여 다른 프로모터를 부가할 필요가 없도록 할 수 있다.
원핵생물 외에도, 효모 배양물과 같은 진핵 미생물을 또한 사용할 수 있으며, 여기서 프로모터는 발현을 유도할 수 있어야 한다. 많은 다른 균주를 일반적으로 사용할 수 있지만, Saccharomyces cerevisiase, 또는 일반적인 빵효모(baker's yeast )가 진핵 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. Saccharomyces에서의 발현을 위하여, 예컨대, 플라스미드 YRp7를 일반적으로 사용한다 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979 ; Tschemper etal., 1980). 이러한 플라스미드는 트립토판에서 성장하는 능력을 결여한 효모(예컨대, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1, Jones, 1977)의 돌연변이 균주에 대하여 선별 마커를 제공하는 trp1 유전자를 이미 포함한다. 그리고 나면, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp1의 존재는 트립토판을 결핍시킨 성장에 의하여 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
효모 벡터의 적절한 프로모팅 서열은 3-포스포글리세레이트 키나아제 (Hitzman et al., 1980) 또는 다른 당분해 효소 (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), 예컨대, 에놀라아제 (enolase), 글리세르알데하이드-3-포스페이트디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphatedehydro-genase), 헥소키나아제 (hexokinase), 피루베이트 디카르복실레이트 (pyruvate decarboxylase), 포스포프룩토키나아제 (phosphofructokinase), 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제 (glucose-6-phosphate isomerase), 3-포스포글리세레이트 뮤타아제 (3-phosphoglycerate mutase), 피루베이트 키나아제 (pyruvate kinase), 트리오스포스페이트 이소머라아제 (triosephosphate isomerase), 포스포글루코오스 이소머라아제 (phosphoglucose isomerase), 및 글루코키나아제 (glucokinase)에 대한 프로모터를 포함한다. 적절한 발현 플라스미드의 구축에 있어서, 이들 유전자와 연결된 종결 서열을 또한 발현시키고자 하는 발현 벡터 서열의 3'에 연결시켜서 mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공한다. .
전사(transcription)가 성장 조건에 의하여 조절된다는 추가적 이점을 갖는 다른 프로모터는 알코올 디하이드로게나아제 2 (alcohol dehydrogenase 2), 이소사이토크롬 C (isocytochrome C), 산 포스파타아제 (acid phosphatase), 질소 대사와 관련된 분해효소, 및 상기된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제, 및 말토오스 및 갈락토오스의 사용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 부위이다. 효모-친화적 프로모터, 복제원점 및 종결 서열를 포함하는 모든 플라스미드 벡터가 적절하다.
미생물 외에도, 다세포 생물로부터 유래하는 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 원칙적으로, 모든 이러한 세포 배양물은 척추동물 배양물이건 무척추동물 배양물이건 상관 없이 작업가능하다. 그러나, 척추동물 세포의 경우 큰 이점이 있으며, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 최근 몇년에 있어서 통상적인 과정이다 (Tissue Culture, 1973). 이러한 유용한 숙주 세포주의 예로서 VERO 및 HeLa 세포, 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary, CHO) 세포주, 및 W138, BHK, COS-7 293, Spodoptera frugiperda (SF) 세포 (예컨대, Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U. S. A. 및 Invitrogen로부터 완전한 발현 시스템으로서 상업적으로 입수가능함), 및 MDCK 세포주가 있다. 본 발명에 있어서, "Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Netherlands"로부터 입수한 S2가 특히 바람직한 세포주이다.
이러한 세포에 대한 발현 벡터는 통상적으로 (필요한 경우) 복제원점, 발현될 유전자 앞에 위치하는 프로모터를 모든 필요한 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열과 함께 포함한다.
포유류 세포에서의 사용을 위하여, 발현 벡터에 대한 조절 작용을 바이러스 물질에 의하여 종종 제공받을 수 있다. 예컨대, 일반적으로 사용되는 프로모터들은 아데노바이러스 2, 및 가장 빈번하게는 원숭이 바이러스 40 (Simian Virus 40, SV40)으로부터 유도된 것이다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는, 모두 바이러스로부터 SV 복제 원점을 또한 갖는 단편으로서 용이하게 얻을 수 있기 때문에 특히 유용하다 (Fiers et al., 1978). 바이러스 복제 원점에 위치하는 HindIII 부위로부터 BglI까지 신장된 약 250 bp 서열을 포함한다면, 부위 작은 또는 큰 SV40 단편을 또한 사용할 수 있다. 또한, 원하는 유전자 서열과 정상적으로 결합되어 있는 프로모터 또는 조절 서열을 사용하는 것이, 이러한 조절 서열이 숙주 세포 시스템과 친화적이라면, 가능하고 때로는 바람직하다.
SV40 또는 다른 바이러스 (예컨대, 폴리오마, 아데노, VSV, BPV)로뷰터 유도될 수 있는 것과 같은 외래 원점을 포함하는 벡터를 구축하거나 또는 숙주 세포 염색체 복제 메카니즘에 의하여 복제원점을 제공할 수 있다. 상기 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 통합된다면, 대게 후자로 충분하다.
유용한 유사체의 동정
숙련된 사람에게는 자연발생적인 APP 또는 Aβ의 가능한 변이체나 변형체 모두가 자연형과 교차-반응하는 동물에서 항체를 이끌어낼 수 있는 능력을 갖는 것은 아니라는 것이 자명할 것이다. 그러나, 본 명세서에서 논의된 면역학적 반응성에 대한 최소한의 요구사항을 만족시키는 변형된 아밀로이드 생성 (amyloidogenic) 분자에 대한 효과적인 표준 스크린을 설정하는 것은 어렵지 않다. 따라서, 비변형 아밀로이드 생성 폴리펩타이드가 (비-면역원성) 자기-단백질인 동물 종에서 비변형 아밀로이드 생성 폴리펩타이드에 대한 항체를 유도할 수 있는 변형된 아밀로이드 생성 폴리펩타이드를 동정하는 방법을 사용할 수 있으며, 여기서 이 방법은:
- 펩타이드 합성 또는 유전공학 기법에 의해 동물의 APP 또는 Aβ의 아미노산 서열 내로 아미노산들이 부가, 삽입, 결실 또는 치환된 상호 구별가능한 본 발명의 유사체 세트를 제조함으로써, 상기 세트에 상기 동물 종에 외래인 T-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 결과시키거나, 또는 상호 구별되는 유사체 세트를 코딩하는 핵산 단편 세트를 제조하고,
- 비변형 APP 또는 Aβ에 대한 동물 종에 의한 항체 생산을 유도하는 능력에 대해 핵산 단편 또는 유사체 세트의 멤버를 테스트한 다음,
- 상기 종에서 비변형 APP 또는 Aβ에 대한 항체 생산을 유의적으로 유도하는 유사체 세트의 멤버들을 동정 및 임의로 분리하거나, 그 동물 중에서 비변형 APP 또는 Aβ에 대한 항체 생산을 유의적으로 유도하는 핵산 단편 세트의 멤버에 의해 코딩된 폴리펩타이드 발현 산물을 동정 및 임의로 분리하는 것
을 포함하여 이루어진다.
여기서 "상호 구별되는 변형된 아밀로이드 생성 폴리펩타이드의 세트 (set of mutually distinct modified amyloidogenic polypeptides)"는 예컨대 상술한 기준 (예컨대 원편광 이색성, NMR 스펙트럼, 및/또는 X-선 회전 패턴)에 기초해서 선택된 비-동일성 유사체의 집합체이다. 이 세트는 몇몇 멤버만으로 구성될 수도 있으나, 수백개의 멤버로 이루어질 수도 있다.
세트의 멤버들을 테스트하는 것은 궁극적으로 생체내에서 할 수 있으나, 본 발명의 목적에 부합하는 변형된 분자들의 숫자를 좁혀주는 몇 종류의 시험관내 테스트도 적용가능하다.
외래 T-세포 에피토프의 도입 목적은 T-세포 헬프에 의한 B-세포 응답을 지지하기 위한 것이므로, T-세포 증식이 유사체에 의해 유도된다는 것을 전제조건으로 한다. T-세포 증식은 시험관내 표준화 증식 분석법에 의해 테스트될 수 있다. 요약하면, T-세포로 충만한 샘플을 대상자로부터 수득한 다음 배양시킨다. 변형된 분자를 미리 테이크업 하여 그의 T-세포 에피토프를 산생하도록 프로세스된 대상자의 APC들과 상기 배양된 T-세포를 접촉시킨다. T-세포 증식을 모니터링하여 적절한 대조군 (예컨대, 고유의 자연적인 아밀로이드 생성 폴리펩타이드를 프로세싱한 APC들과 접촉된 배양 중의 T-세포)과 비교한다. 또는, 외래 T-세포 인식에 대한 응답으로 T-세포에 의해 방출된 해당 시토카인의 농도를 결정함으로써 증식을 측정할 수 있다.
어떤 유형의 세트이건 하나 이상의 유사체가 APP 또는 Aβ에 대한 항체 생산을 유도할 수 있는 가능성이 상당히 높은 상황에서, 비변형 APP 또는 Aβ가 자기-단백질인 동물 종에서 비변형 APP 또는 Aβ에 대한 항체를 유도할 수 있는 하나 이상의 유사체를 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 것이 가능하며, 그 방법은 APP 또는 Aβ와 반응성인 동물 종에서 항체 생산을 유의적으로 유도하는 세트의 멤버(들)을 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 캐리어 및/또는 비히클 및/또는 희석제 및/또는 부형제와, 임의로 적어도 하나의 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 어쥬번트와 조합하여 한데 혼합하는 것을 포함한다.
상술한 폴리펩타이드 세트의 테스트는 먼저 본 발명의 상호 구별되는 몇가지 핵산 서열 또는 벡터들을 준비하고 이들을 적절한 발현 벡터 내로 삽입하여 적절한 숙주 세포 (또는 숙주 동물)을 이들 벡터로 형질전환시켜 본 발며의 핵산 서열을 발현시킴으로써 간편하게 수행된다. 이러한 단계에 이어 발현 산물을 분리할 수 있다. 핵산 서열 및/또는 벡터들을 PCR이나 핵산 합성과 같은 분자 증폭기술을 실시하는 방법에 의해 준비한다.
특이적인 아밀로이드 생성 표적
대부분 알츠하이머병, APP, APoE4 및 Tau와 연관된 단백질에 더해, AD 뇌의 플라크나 탱글의 직접적인 존재에 의하건 AD를 일으킬 위험성 증과와 연관된 명백한 유전학적 관련성에 의하건, 어떻게든 AD와 연관된 다른 단백질들이 매우 많다. 전부는 아니라 해도 이들 항원들 대부분은 상술한 Aβ, APP, 프레제닐린 (presenilin) 및 ApoE4, 본 발명의 특정 구체예 중의 추정적인 표적 단백질과 함께이다. 이들 추정적인 표적들은 WO 01/62284를 통해 충분히 논의된 바 있다. 따라서, 본 명세서에서는 이들 추정적 표적들을 간단하게만 언급하며, 이에 관한 보다 상세한 설명은 본 명세서에 참조된 WO 01/62282에서 찾아볼 수 있다.
알파1-안티키모트립신 (ACT): 알파2-마크로글로불린; ABAD (Aβ-펩타이드 결합 알코올 데히드로게나제); APLP1 및 -2 (아밀로이드 전구체 유사 단백질 1 및 -2); AMY117; Bax; Bcl-2; 블레오마이신 하이드롤라제; BRI/ABRI; 크로모그라닌 A; 클러스테린/apoJ; CRF (코르티코트로핀 방출 인자) 결합 단백질; EDTF (상피-유도된 독성 인자); 헤파란 설페이트 프로테오글리칸; 인간 콜랩신 응답 매개 단백질-2; 헌팅틴 (헌팅턴씨병 단백질); ICAM-I; IL-6; 리소좀-관련 항원 CD68; P21 ras; PLC-델타 1 (포스포리파제 C 이소엔자임 델타 1); 혈청 아밀로이드 P 성분 (SAP); 시납토피신; 시뉴클레인 (알파-시뉴클레인 또는 NACP); 및 TGF-b1 (형질전환 성장 인자 b1).
APP 또는 Aβ를 다운-조절하기 위한 본 명세서에 설명된 수단과 방법은 이들 기타 아밀로이드 생성 폴리펩타이드에 대한 활성 특이적 면역요법과 같은 요법과 조합될 수 있다.
알츠하이머병 외에도, 대뇌의 아밀로이드 혈관장해 역시 본 명세서에 기재된 기술의 적절한 표적이 될만한 질병이다.
APP 또는 Aβ에 대한 면역화를 위한 대부분의 방법은 천연의 APP 또는 Aβ와 교차-반응성인 항체를 일으키는 면역화로 한정되어야 할 것이다. 그럼에도 불구하고, 몇몇 경우 아밀로이드 생성 폴리펩타이드로부터 MHC 클래스 I 에피토프를 산생하는 세포에 대한 CTL 응답 형식으로 세포성 면역을 유도하는 것이 흥미로울 것이다 - 이것은 APP 또는 Aβ를 생성하는 세포수의 감소가 심각한 부작용을 구성하지 않을 경우 적당할 수 있다. CTL 응답이 요구되는 이러한 경우, 본 출원인의 WO 00/20027의 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 이들 두 문헌의 개시내용은 본 발명에 참조되었다.
면역원 캐리어
예컨대 다가 활성화 폴리-히드록시폴리머와 같은 비히클로서 작용하는 비-면역원성 폴리머 분자에 공유적으로 링크된 B-세포 에피토프를 나타내거나 그것을 포함하는 APP 또는 Aβ펩타이드 및 T 헬퍼 에피토프를 포함하는 분자들은 상기한 바와 같이, 면역학적으로 타당한 부분만을 함유하는 백신 분자로서 기능할 것이며, 얻을 수 있고, 상술한 변수 d 및 e에서 흥미로운 구체예이다. 예컨대 백신의 표적이 APP 또는 Aβ와 같은 자기-항원이라면 난잡성 (promiscuous) 또는 소위 범 (unversal) T-헬퍼 에피토프가 이용될 수 있다. 또한, 면역학적 반응을 증강시키는 요소들을 비히클에 함께-커플링시킴으로써 어쥬번트로서 작용할 수 있다. 이러한 요소들로는 만노스, 터프트신, 뮤라밀 디펩타이드, CpG 모티프 등을 들 수 있다. 그 경우, 비히클 산물의 후속적인 어쥬번트 형성은 불필요할 수 있으며 생성물은 순수한 물이나 염수와 함께 투여될 수 있다.
세포독성 T 세포 (CTL) 에피토프를 T-헬퍼 에피토프와 커플링시킴으로써, CTL 에피토프가 유래된 항원에 특이적인 CTL's를 생성하는 것도 가능할 것이다. 세포질에 대한 생성물의 업테이크를 촉진시키는 요소들 (예컨대 마크로파지에 대한 APC의 업테이크를 촉진시키는 만노스) 역시 CTL- 및 T 헬퍼 에피토프와 함께 비히클에 공동-커플링시킴으로써 CTL 응답을 증강시킬 수 있다.
최종 생성물에 있어서 B-세포 에피토프와 T-헬퍼 에피토프 (P2 및 P30)의 비율은 합성 단계에서 이들 펩타이드의 농도를 변화시킴으로써 변화시킬 수 있다. 상기한 바와 같이, 면역원성 분자에는 만노스, 터프트신, CpG-모티프 또는 다른 면역 자극 물질 (본문에 설명된)을 첨가함으로써 이들을 태그시킬 수 있으며, 필요에 따라, 예컨대 이들 물질들의 아민화 유도체 (aminated derivatives)를 이용하여 합성 단계에서 카보네이트 완충액에 첨가할 수 있다.
APP 또는 AβB-세포 에피토프 및 T-헬퍼 에피토프를 함유하는 펩타이드들을 결합시키는데 불용성 활성화 폴리히드록시 폴리머가 사용되는 경우, 상기한 바와 같이, 고체상 합성으로서 수행될 수 있으며 최종 생성물을 수확하여 세척 및 여과에 의해 정제할 수 있다. 트레실 활성화 폴리히드록시폴리머 (펩타이드, 태그 등)에 커플링될 요소들을 pH 4-5와 같은 낮은 pH에서 폴리히드록시폴리머에 부가하여 수동 확산에 의해 "젤" 내로 동등하게 분포시킬 수 있다. 이어서, pH를 pH 9-10으로 상승시켜 폴리히드록시 폴리머 상의 트레실기에 대한 태그와 펩타이드 상의 일차 아미노기와의 반응을 개시시킬 수 있다. 펩타이드와 예컨대 면역 자극 요소를 커플링시킨 후 젤을 분쇄하여 면역화에 적절한 크기를 갖는 입자를 형성시킨다.
이러한 면역원은 따라서 다음을 포함하여 이루어진다:
a) APP 또는 Aβ로부터 유래된 하나 이상의 제 1 아미노산 서열: 여기서 적어도 하나의 제 1 아미노산 서열은 하나 이상의 B-세포 및/또는 하나 이상의 CTL 에피토프를 함유하는 것임, 및
b) 외래 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하는 하나 이상의 제 2 아미노산 서열
여기서 하나 이상의 제 1 및 제 2 아미노산 서열 각각은 약학적으로 허용가능한 활성화된 폴리히드록시폴리머 캐리어에 커플링되어 있음.
아미노산 서열을 폴리히드록시폴리머에 커플링시키기 위해서는 보통 폴리히드록시폴리머를 그 아미노산 서열에 대한 필요한 링크를 형성할 수 있는 적절한 반응성기로 "활성화"시킬 필요가 있다.
"폴리히드록시폴리머"라는 용어는 WO 00/05316에서와 동일한 의미를 갖는 것으로, 즉, 폴리히드록시폴리머가 그 출원에서 특이적으로 교시된 것과 완전히 동일한 특성을 가질 수 있음을 의미한다. 따라서, 폴리히드록시폴리머는 수용성 또는 비수용성 일 수 있다 (따라서 면역원 제조시 상이한 합성 단계를 요함). 폴리히드록시폴리머는 자연발생적인 폴리히드록시 화합물 및 합성 폴리히드록시 화합물로부터 선택될 수 있다.
특이적 및 바람직한 폴리히드록시폴리머로는 아세탄, 아밀로펙틴, 검 한천-한천, 아가로스, 알지네이트, 아라비아검, 카라기난, 셀룰로스, 시클로덱스트린, 덱스트란, 푸르셀라란, 갈락토만난, 젤라틴, 가티, 글루칸, 글리코겐, 구아, 카라야, 곤약/A, 로커스트 빈 검, 만난, 펙틴, 사일리움, 풀룰란, 전분, 타마린, 트라가칸트, 잔탄, 자일란, 및 자일로글루칸을 들 수 있다. 덱스트란이 특히 바람직하다.
*그러나, 폴리히드록시폴리머는 고분지성 (highly branched) 폴리 (에틸렌이민) (PEI), 테트라티에닐렌 비닐렌, 케블라 (폴리-파라페닐 테레프탈아미드의 장쇄), 폴리(우레탄), 폴리(실록산), 폴리디메틸실록산, 실리콘, 폴리(메틸 메타크릴레이트) (PMMA), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(2-히드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리(아크릴산), 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(에틸렌 글리콜) 및 유도체, 폴리(메타크릴산), 폴리락타이드 (PLA), 폴리글리콜리드 (PGA), 폴리 (락타이드-코-글리콜리드) (PLA), 폴리안하이드라이드, 및 폴리오르쏘에스테르 중에서 선택될 수도 있다.
문제의 폴리히드록시폴리머의 (중량)평균 분자량 (즉, 활성화 전)은 일반적으로 적어도 1,000, 예컨대 적어도 2,000, 바람직하게는 2,500-2,000,000 범위, 더욱 바람직하게는 3,000-1,000,000 범위, 특히 5,000-500,000 범위이다. 실시예를 통해 평균 분자량이 10,000-200,000 dls 폴리히드록시폴리머가 특히 유리한 것으로 나타났다.
폴리히드록시폴리머는 실온에서 적어도 10 mg/ml, 바람직하게는 적어도 25 mg/ml, 예컨대 50mg/ml, 특히 적어도 100 mg/ml, 예컨대 적어도 150 mg/ml 정도로 수용성인 것이 좋다. 덱스트란은 상술한 바와 같이 활성화된 경우조차 수용성과 관련한 요구사항을 만족시키는 것으로 알려져 있다.
가장 흥미로운 몇가지 폴리히드록시폴리머에 있어서, 활성화되지 않은 폴리히드록시폴리머 (즉, 활성화 이전의 천연 폴리히드록시폴리머)의 C (탄소 원자)와 OH기 (히드록시기) 간의 비율은 1.3 내지 2.5 범위, 예컨대, 1.5-2.3, 바람직하게는 1.6-2.1, 특히 1.85-2.05인 것이 좋다. 어떠한 특정 이론에 구애됨이 없이, 불활성화 폴리히드록시폴리머의 이러한 C/OH 비율은 매우 유리한 친수성 수준을 나타내는 것으로 믿어진다. 폴리비닐알코올과 폴리사카라이드는 이러한 요구사항을 만족시키는 폴리히드록시폴리머의 예이다. 상기 비율은 활성화된 폴리히드록시폴리머의 경우와 대략 같아야만 하는데, 이는 활성화 비율은 다소 낮아야 하기 때문이다.
"폴리히드록시폴리머 캐리어"라는 용어는 아미노산 서열을 운반하는 면역원의 일부를 지칭하기 위한 용어이다. 일반적으로, 폴리히드록시폴리머 캐리어는 외부 리밋을 갖는데 여기서 아미노산 서열은 예컨대, 면역원을 가공하는 항원산생 세포에서처럼 펩티다제에 의해 절단될 수 있다. 따라서, 폴리히드록시폴리머 캐리어는 활성화기와 아미노산 서열 간의 결합이 APC 중 펩티다제에 의해 절단되는, 활성화기를 갖는 폴리히드록시폴리머이거나 또는 폴리히드록시폴리머 캐리어는 활성화기와 예컨대 하나의 L-아미노산 또는 몇가지 D-아미노산과 같은 링커 (여기서 링커의 마지막 부분이 아미노산 서열에 결합하여 APC 중의 펩티다제에 의해 절단될 수 있음)를 갖는 폴리히드록시폴리머일 수 있다.
상기한 바와 같이, 폴리히드록시폴리머는 펩타이드가 캐리어에 부착되는 것을 용이하게 해주는 관능기 (활성화기)를 지닌다. 기술분야에는 적용가능한 관능기가 광범위하게 알려져 있으며 예컨대, 트레실 (트리플루오로에틸설포닐), 말레이미도, p-니트로페닐 클로로포르메이트, 시아노겐브로마이드, 토실 (p-톨루엔설포닐), 트리플릴 (트리플루오로메탄설포닐), 펜타플루오로벤젠설포닐, 및 비닐 설폰기를 들 수 있다. 본 발명에 따른 관능기의 바람직한 예로는 트레실, 말레이미도, 토실, 트리플릴, 펜타플루오로벤젠설포닐, p-니트로페닐 클로로포르메이트, 및 비닐설폰기를 들 수 있으며, 그 중에서도 트레실, 말레이미도 및 토실기가 특히 바람직하다.
트레실 활성화된 폴리히드록시폴리머는 WO 00/05316의 실시예 1에서 덱스트란 활성화에 대해 설명된 바와 같이 또는 Gregorius 등의 J. Immunol. Meth. 181 (1995) 65-73에 설명된 바와 같이 제조할 수 있다.
말레이미도 활성화된 폴리히드록시폴리머는 WO 00/05316의 실시예 3에서 덱스트란의 활성화에 대해 설명된 p-말레이미도페닐 이소시아네이트를 이용하여 제조될 수 있다. 다른 한편, 트레실 활성화된 폴리히드록시폴리머 (예컨대 트레실 활성화된 덱스트란 (TAD))를 예컨대 1,3-디아미노프로판과 같은 과량의 디아민 화합물 (일반적으로 H2N-CnH2n-NH2, 여기서 n은 1-20, 바람직하게는 1-8임)로 유도화시킨 다음 TAD내로 도입된 아미노기를 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 설포-석신이미딜 4- (N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (설포-SMCC), 석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB), 설포-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (설포-SMPB), N-γ-말레이미도부티릴옥시석신이미드 에스테르 (BMBS) 또는 N-γ-말레이미도부티릴옥시-설포석신이미드 에스테르와 같은 시약과 반응시킴으로써, 말레이미도기를 덱스트란과 같은 폴리히드록시폴리머에 도입시킬 수 있다. 활성화를 위해 비록 다른 시약과 다른 경로를 사용할 경우 일반적으로 말레이미드 관능기와 활성화가 수행되는 모(parent) 히드록시기 나머지 부분간의 결합과 관련해서 약간 상이한 말레이미드 활성화 생성물이 결과되지는 하나, 이들 모두 "말레이미드 활성화 폴리히드록시폴리머"로 간주한다.
WO 00/05316의 실시예 2에서 덱스트란의 활성화에 관해 설명된 바와 같이 토실 클로라이드를 이용하여 토시 활성화 폴리히드록시폴리머를 제조할 수 있다. 트리플릴 및 펜타플루오로벤젠설포닐 활성화 폴리히드록시폴리머는 예컨대 대응하는 산 클로라이드를 이용함으로써 토실 또는 트레실 활성화 유사체로서 제조된다.
시아노겐브로마이드 활성화 폴리히드록시폴리머는 상법을 이용하여 폴리히드록시폴리머를 시아노겐브로마이드와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 얻어진 관능기는 대체로 폴리히드록시폴리머의 2개의 히드록시기를 갖는 시아네이트 에스테르이다.
활성화도는 유리 히드록시기와 활성화기 (즉, 관능화된 히드록시기) 사이의 비율로서 표현될 수 있다. 폴리히드록시폴리머의 친수성과 반응성 간에 유리한 균형을 확보하기 위해서는, 폴리히드록시폴리머의 유리 히드록시기와 활성화기 간의 비율이 250:1 내지 4:1이 되어야 하는 것으로 믿어지고 있다. 바람직하게는, 이 비율이 100:1 내지 6:1, 더욱 바람직하게는 60:1 내지 8:1, 특히 40:1 내지 10:1인 것이 좋다.
본 발명에 따른 일반적으로 적용가능한 면역원의 제조방법에 사용하기 위해 특히 바람직한 활성화 폴리히드록시폴리머는 트레실, 토실 및 말레이미도 활성화 폴리사카라이드로서, 특히 트레실 활성화 덱스트란 (TAD), 토실 활성화 덱스트란 (TosAD) 및 말레이미도 활성화 덱스트란 (MAD)이다.
폴리히드록시폴리머 캐리어와 그에 부착된 아미노산 서열 사이의 결합은 펩티다제, 예컨대 APC에서 항원을 가공하는데 활성적인 펩티다제에 의해 절단되는 것이 바람직하다. 따라서, 적어도 제 1 및 적어도 제 2의 아미노산 서열은 아미드 결합이나 펩타이드 결합을 통해 활성화 폴리히드록시폴리머 캐리어에 커플링되는 것이 바람직하다. 적어도 제 1 및 적어도 제 2 아미노산 서열이 각각 그에 대응하는 아미드 결합의 질소 분자를 제공하는 것이 특히 바람직하다.
폴리히드록시폴리머 캐리어는 아미노산 잔기가 실제로 없을수도 있어서, 활성화기가 펩티다제 절단성 결합의 일부를 제공해야 할 필요가 있을 수 있으나, 상기한 바와 같이, 캐리어가 단순히 적어도 하나의 L-아미노산을 비롯한 스페이서를 함유할 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 적어도 제 1 및 적어도 제 2 아미노산 서열은 일반적으로 아미노산 서열의 N-말단의 질소를 통해 폴리히드록시폴리머의 활성화 버젼에 결합된다.
상기 일반적으로 적용되는 본 발명의 면역원은 기본적으로 폴리펩타이드 백신에 대해 설명된 바와 같이 면역화에 이용될 수 있다. 즉, 본 명세서에서 논의된 아밀로이드생성 폴리펩타이드를 다운-조절하기 위한 폴리펩타이드 백신 배합물 및 투여방법, 투여량과 관련한 모든 기재는 일반적으로 적용가능한 면역원의 경우를 준용한다.
일반적으로 적용가능한 안전한 백신화 기술
상술한 바와 같이, 본 발명의 한가지 바람직한 구체예는 아밀로이드 생성 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 추진할 수 있는 자기-유도된 TH 에피토프를 제공하지 못하는 아밀로이드 생성 폴리펩타이드의 변이체의 이용을 수반한다.
그러나, 본 발명자들은 항-자기 백신을 디자인하고 항-자기 면역성을 발효시키기 위한 이러한 전략이 그 자체로 진보성을 가지며, 일반적으로 적용가능한 기술이라고 믿는다. 이 기술은, 다운-조절시키고자 하는 자기-항원이 체내에 충분한 양으로 존재함으로 해서 면역 반응의 자기-촉진이 일어날 수 있는 경우 특히 적합하다. 따라서, 이 구체예의 상기한 모든 기재내용은 그것이 APP 또는 Aβ에 대한 항-자기 면역 반응의 내용에 관한 한, 다른 자기-폴리펩타이드에 대한 면역화, 특히 조절되지 않은 자기면역 조건의 형태로 면역 반응을 그들이 유지하는데 충분한 양으로 존재하는 것들에 대해 준용되며, 이는, 타당한 자기-폴리펩타이드의 동종 (autologous) TH 에피토프가 면역 반응을 추진하기 때문임.
실시예 1
AD 에 대한 면역화를 위한 자기 백신화 접근
Aβ단백질 녹아웃 마우스가 어떠한 비정상성이나 부작용도 나타내지 않는다는 사실은 Aβ의 양을 저하시키거나 제거하는 것이 안전함을 시사하는 것이다, Zheng H. (1996).
트랜스제닉 동물이 트랜스제닉 인간 Aβ단백질에 대해 면역화된다는 공개된 실험결과는 자기 관용성을 파괴하는 것이 가능했다면, Aβ의 다운-조절이 자기-반응성 항체에 의해 얻어질 수 있었음을 시사하는 것이다. 이러한 실험은 나아가 Aβ의 다운 조절이 플라크 형성을 방지하고, 심지어는 뇌로부터 이미 형성된 Aβ플라크까지도 일소함을 시사하는 것이다. 참조. Schenk외 (1999). 그러나, 전통적으로 자기-단백질에 대한 항체를 일으킬수는 없다.
이제까지 공개된 데이타는 따라서 진정한 자기-단백질에 대한 진정한 자기-관용성을 파괴하기 위한 수단을 제공하는 것이 아니다. 뿐만 아니라, 여태까지 공개된 데이타는 면역 반응이 세포막 결합된 Aβ 전구체 단백질 (APP)에 대해서가 아니라 오직 Aβ디포짓으로만 지향되었는지 또는 주로 지향되었는지를 확인할 수 있는 정보 (이러한 정보가 필요하다고 여겨지는 경우)도 제공해주지 않는다. 기존의 기술을 이용하여 얻어진 면역 반응은 아마도 조절되지 않은 방식으로 자기-단백질에 대한 면역 반응을 일으킬 것이기 때문에 Aβ 단백질 부분에 대한 원치 않는 과도한 자기-반응성이 나타날 수 있을 것이다. 따라서, 기존의 면역화 전략을 이용하는 것은 자기-단백질에 대한 강력한 면역 반응을 일으키지 못할 것이고 나아가 CNS 중의 대다수의 세포 상에 존재하는 막 결합 APP에 대한 잠재적인 강력한 교차-반응성으로 인해 안전하지도 않을 것이다.
본 발명은 잠재적으로 CNS 또는 신체의 다른 부분에서 심각한 질병을 일으키고 플라크를 형성할 수 있는 진정한 자기-단백질에 대한 강력하게 조절된 면역 반응을 효과적으로 일으키기 위한 수단을 제공한다. AD를 치료하기 위한 이 기술을 이용함으로써 안전하고 효과적인 인간의 Aβ단백질 치료용 백신이 개발될 것이다.
전술한 내용에 비추어, 다음 세기에 건강관리 시스템을 마비시킬 것으로 예상되는 질병인 AD를 치료할 수 있으리라는, 또는 상기한 이러한 백신이 적어도 이러한 질병의 증상과 진전을 치료하기 위한 효과적인 치료적 접근을 구성하리라고 예측하는 것이 가능하다. 이 기술은 AD 뿐만 아니라 다른 신경질환에서도 아밀로이드 침착을 차단하기 위한 완전히 새로운 면역학적 접근법을 나타내는 것이다.
*다음 표에, 심사숙고된 35 가지 구조물을 나타냈다. 표에 주어진 모든 위치는 APP의 개시 메티오닌 (SEQ ID NO: 2에서 최초 아미노산)에 상대적인 것으로 개시 아미노산과 종결 아미노산을 모두 포함하는 것이다. 예컨대, 672-714 단편은 아미노산 672와 아미노산 714 두가지를 모두 포함한다. P2 와 P30의 개시 및 종결 위치는 에피토프가 표시된 위치에서 APP 단편의 일부를 대체 (치환에 포함된 두가지 위치 모두)함을 가리키는 것이다 - 대부분의 구조물에서, 도입된 에피토프는 에피토프 길이의 단편을 치환한다. 표에 나타난 별표는 다음 의미를 갖는다:
*) P2와 P30 중 오직 하나의 위치만이 표시된 위치에서 에피토프가 APP 유도체 내로 삽입되었음을 가리킨다 (에피토프는 주어진 위치에 C-말단적으로 인접한 아미노산에서 시작된다).
**) 구조물 34는 각각 P30과 P32에 의해 분리된 세개의 동일한 APP 단편을 함유한다.
***) 구조물 35는 P30 에피토프와 P32 에피토프에 의해 교대로 분리된 9개의 동일한 APP 단편을 함유한다.
표 1
Figure pat00008
반응을 일으키고자 하는 가장 흥미로운 APP 부분은 AD 뇌에서 아밀로이드 플라크의 중요 구성요소인 43 아미노산 Aβ코어 펩타이드 (Aβ-43, SEQ ID NO: 2, 잔기 672-714에 대응)이다. 이 APP 단편은 상기 수록된 모든 구조물의 일부이다.
변이체 1 및 2는 모델 에피토프인 P2와 P30이 위치하고 있는 Aβ-43의 APP 업스트림의 일부를 포함한다. 변이체 1 및 3-8 모두는 신경독성으로 나타난 바 있는 C-100 단편을 포함한다 - C-100 단편은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 714-770에 대응한다. 변이체 3-5에서 에피토프는 C-100 단편의 일부를 대체하는 반면 변이체 6-8에서는 C-100 내로 삽입되었다.
변이체 9-35는 코어 Aβ-43 단백질만을 함유한다. 변이체 9-13에서, P2와 P30은 Aβ-43의 어느 한쪽 말단에 융합된다: 14-21 P2 및 P30은 Aβ-43의 일부를 치환한다; 22-33에서 P2와 P30은 Aβ-43 내로 삽입되며; 34는 P30과 P2에 의해 각각 분리된 3개의 동일한 Aβ-43 단편을 함유하고; 35는 P2 에피토프와 P30 에피토프에 의해 교대로 분리된 9개의 Aβ-43 반복체를 함유한다.
상기-논의된 Aβ-43 단백질의 트렁케이트화된 단편은 본 발명에 따라 면역원성 유사체에 사용될 수도 있다. 특히, 바람직한 것은 트렁케이트 Aβ(1-42), Aβ(1-40), Aβ(1-39), Aβ(1-35), Aβ(1-34), Aβ(1-34), Aβ(1-28), Aβ(1-412, Aβ(1-52), Aβ(13-28), Aβ(13-35), Aβ(17-28), Aβ(25-35), Aβ(35-40), Aβ(36-42), 및 Aβ(35-42)이다 (여기서 괄호 안의 숫자는 타당한 단편을 구성하는 Aβ-43의 아미노산 스트레치를 나타낸다 - Aβ(35-42)는 예컨대 SEQ ID NO: 2에서 아미노산 706-711과 동일하다. Aβ-43의 트렁케이트된 부분을 갖는 이들 변이체 모두는 본 명세서에 설명된 Aβ 단편, 특히 변이체 9, 10, 11, 12 및 13을 이용하여 만들 수 있다.
몇몇 경우, Aβ-43 또는 그의 단편이 변이되는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 것은 Aβ-43의 위치 35의 메티오닌이 바람직하게는 류신이나 이소류신으로 치환된 것과 같은 치환 변이체이거나, 단순히 결실된 것이다. 특히 바람직한 유사체는 C-말단에 위치한 하나의 단일 메티오닌을 함유하는 것으로, 그 이유는 이것이 아밀로이드 생성 폴리펩타이드 또는 외래 Th 에피토프에서 자연발생적이거나 또는 삽입 또는 부가된 것이기 때문이다. 따라서, 외래 TH 에피토프를 포함하는 유사체의 일부는 가능한 C-말단 위치의 메티오닌을 제외하고는, 메티오닌을 갖지 않는 것도 바람직하다.
실제로, 본 발명에서 사용되는 APP 또는 Aβ의 모든 유사체는, 유사체의 C-말단 아미노산으로서 위치하는 하나의 단일 메티오닌만을 포함하고 아밀로이드 생성 폴리펩타이드나 외래 TH 에피토프 중의 다른 메티오닌은 결실되거나 다른 아미노산으로 치환된다는 특징을 공유하는 것이 일반적으로 바람직하다.
또 다른 흥미로운 변이는 Aβ-43의 위치 19에서의 페닐알라닌의 결실 또는 치환으로서, 페닐알라닌 잔기가 프롤린으로 치환되는 것이 특히 바람직한 변이이다.
다음 표에 Aβ-43의 트렁케이트 또는 변이체로 작동하는 특히 바람직한 구조물들을 제시하였다.
표 2
Figure pat00009
상기 표에서, 분자에 사용된 Aβ세그먼트는 Aβ(1-42/43) 분자의 aa 1에 상대적인 아미노산 번로로 표시된다. 즉, 1-28은 Aβ(1-42/43)의 단편 1-28이 분자에 사용됨을 의미한다. 두가지 이상의 상이한 세그먼트들이 사용될 경우, 두가지 모두 표에 나타내었다. 즉, 1-12(a) + 13-28 (b)는 Aβ(1-42/43)의 단편 1-12와 단편 13-28 모두가 분자 내에 사용됨을 의미하는 것이다.
또한, 구조물의 1개를 초과하는 복제본 (copy)에 동일한 세그먼트가 존재할 경우, 표에 표시하였다. 즉, 1-12 (x3)은 Aβ(1-42/43)의 단편 1-12가 구조물 중 3개 의 복제본에 존재함을 나타내는 것이다.
또한, 분자 중 Aβ 세그먼트의 위치는 분자의 제 1 아미노산에 상대적인 아미노산 위치로 표시되며, 즉, 22-49는 문제의 Aβ단편이 분자 중 아미노산 22 내지 아미노산 49 (두 위치 모두 포함된다)에 위치함을 나타낸다. P2와 P30 에피토프의 위치는 동등하게 표시한다. 분자에 두가지 이상의 상이한 Aβ 단편이 사용되면, 그들의 위치를 모두 나타내었다. 즉, 1-12 (a) + 49-64 (b)는 단편 (a)는 분자 중 aa 1-12에 위치하고 단편 (b)는 aa 49-64에 존재함을 의미한다.
또한, 동일 단편의 하나 보다 많은 복제본이 분자에 존재하면, 모든 복제본들의 위치를 나타내었다. 즉, 1-12, 34-35, 61-72는 Aβ단편의 3 복제본이 분자 중 위치 1-12, 34-35, 및 61-72에 각각 존재함을 가리킨다.
마지막으로, 각 분자의 총 길이 표시는 Aβ 단편(들)과 P2 및 P30 에피토프 두가지 모두를 포함한다.
변이체 42는 Aβ 단편을 나타내는 컬럼에 표시된 바와 같이 위치 19 (phe로부터 pro로) 및 위치 35 (met로부터 lys로)에서의 두가지 아미노산 치환을 포함한다.
외래 T-세포 에피토프의 도입에 관한 특정 포인트의 상세에 관해서는 도 1과 상기 표들을 참조하면 된다.
한가지 추가적인 구조물 유형이 특히 바람직하다. 본 발명의 한가지 목적은 APP를 생성하는 세포의 파괴는 피하면서 Aβ를 제거하는 것이므로, APP에 존재할 경우 세포외 상 (extracellular phase)에 노출되지 않는 Aβ부분만을 포함하는 자기백신 구조물을 제조하는 것이 바람직해 보인다. 따라서, 이러한 구조물은 SEQ ID NO: 2에서 아미노산 700-714에 의해 정의된 아미노산 단편으로부터 유도된 하나 이상의 B-세포 에피토프를 함유할 필요가 있을 것이다. 이러한 짧은 폴리펩타이드 단편은 단지 약하게 면역원성일 것으로 예상되기 때문에 이러한 자기백신 구조물은 예컨대, 본 발명의 상세한 설명에서 식 I로 나타낸 구조를 갖는 구조물 형태와 같이 B-세포 에피토프의 복제본들 몇가지로 구성되는 것이 바람직하다. 상기 참조. 식 I의 그 버젼에서, 아밀로이드e1-아밀로이드ex라는 용어는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 700-714로부터 유도된 아미노산 서열을 함유하는 x B-세포 에피토프이다. 바람직한 대안은 상기-설명된 가능성인 아밀로이드 생성 (폴리)펩타이드와 선택된 외래 T-헬퍼 에피토프를 아미드 결합을 통해 폴리사카라이드 캐리어 분자에 커플링시키는 것으로 - 이러한 방식으로 SEQ ID NO: 2의 아미노산 700-714에 의해 구성되는 "약한" 에피토프의 멀티플 프레젠테이션을 가능하게 할 수 있고, B-세포와 T-세포 에피토프 사이의 최적 비율을 선택하는 것도 가능해진다.
실시예 2
본 발명에 따른 Aβ및 변형된 단백질을 이용한 트랜스제닉 마우스의 면역화
*hAB43 +-34 코딩 DNA 의 제작. 몇가지 단계를 통해 hAB43+-34 유전자를 제작하였다. 먼저, 템플레이트로서 프라이머 ME#800 (SEQ ID NO: 9)를 이용하여 프라이머 ME#801 (SEQ ID NO: 10) 및 ME#802 (SEQ ID NO: 11)로 PCR 단편을 만들었다. ME#800은 E. coli 최적화 코돈을 갖는 인간의 Aβ-43 단편을 코딩한다. ME#801과 802는 이 단편에 적절한 제한효소 자리를 부가해준다.
PCR 단편을 정제하여, NcoI와 HindIII로 절단하고, 다시 정제한 다음 NcoI -HindIII 절단 및 정제된 pET28b+ E. coli 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 야생형 인간 Aβ-43을 코딩하는 얻어진 플라스미드를 pAB1이라 명명하였다.
다음 단계에서 T-헬퍼 에피토프 P2를 분자의 C-말단에 첨가한다. 프라이머 ME#806 (SEQ ID NO: 12)은 P2 에피토프를 코딩하는 서열을 함유하기 때문에, PCR 반응에 의한 P2 및 Aβ-43의 융합체 (fusion)을 생성한다.
프라이머 ME#178 (SEQ ID NO: 8)을 이용하고 템플레이트로서 pAB1을 이용하여 PCR 단편을 만듦으로써 클로닝을 수행하였다. 단편을 정제하고, NcoI와 HindIII로 절단한 다음 다시 정제하고 NcoI - HindIII 절단 및 정제된 pET28b+ 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 얻어진 플라스미드를 pAB2라 명명하였다.
유사한 방식으로, N-말단에 부가된 또 다른 T 헬퍼 에피토프인 P30을 이용하여 Aβ-43 코딩 서열을 갖도록 또 다른 플라스미드를 만들었다. 이것은 템플레이트로서 pAB1을 이용하여 프라이머 ME#105 (SEQ ID NO: 7)과 ME#807 (SEQ ID NO: 13)을 이용하여 PCR 단편을 만듦으로써 수행하였다.
단편을 정제하고, NcoI와 HindIII로 절단한 다음 다시 정제하고 NcoI -HindIII 절단 및 정제된 pET28b+ 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 얻어진 플라스미드를 pAB3라 명명하였다.
세번째 단계에서는, 두번째 Aβ-43 반복체를 프라이머 ME#809 (SEQ ID NO: 14)에 의해 플라스미드 pAB2의 P2 에피토프에 C-말단적으로 부가한다. 이와 동시에 ME#809는 Aβ-43 반복체 바로 다음에 BamHI 자리를 만들어낸다. 템플레이트로서 pAB2을 이용하여 프라이머 ME#178과 ME#809를 이용하여 PCR 단편을 만들었다. 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단, 정제하여 NcoI - HindIII로 절단 및 정제된 pET28b+ 벡터 내로 클로닝시켰다. 이 플라스미드를 pAB4라 명명하였다.
마지막으로, pAB3으로부터의 P30 에피토프 - Aβ-43 반복 서열을 pAB4 플라스미드 내로 클로닝시켰다. 이것은 템플레이트로서 pAB3을 이용하고 프라이머 ME#811 (SEQ ID NO: 16)과 ME#105를 이용하여 PCR 단편을 만듦으로써 수행하였다. 이 단편을 정제하고 템플레이트로서 pAB3을 이용하여 ME#810 (SEQ ID NO: 15)를 이용하는 후속적인 PCR에서 프라이머로서 사용하였다. 얻어진 단편을 정제하고 BamHI과 HindIII로 절단하여 BamHI - HindIII 절단 및 정제된 pAB4 플라스미드 내로 클로닝시켰다. 얻어진 플라스미드, pAB5는 hAB43+-34 분자를 코딩한다.
모든 PCR 및 클로닝 공정은 기본적으로 Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. 1989 "Molecular cloning; a laboratory manual" 제 2판, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.에 설명된 바에 따라 수행하였다.
모든 클로닝 공정에 E. coli K-12 세포, 스트레인 Top-10 F' (Stratagene, USA)를 사용하였다. pET28b+ 벡터는 Novagen, USA로부터 구입하였다. 모든 프라이머들은 DNA Technology, Denmark에서 합성하였다.
hAB43 +-34의 발현 및 정제. pET28b+ 시스템 공급업체 (Novagen)의 설명에 따라 pAB5에 의해 코딩된 hAB43+-34 단백질을 BL21-Gold (Novagen) E. coli에서 발현시켰다.
발현된 hAB43+-34 단백질을 봉입체 세정에 이어 BioCad 정제 워크스테이션 (PerSeptive Biosystems, USA)를 이용하여 6M 우레아 존재 하에서 양이온-교환 크로마토그래피 처리함으로써 세정시켜 85%를 초과하는 순도가 되도록 정제하였다. 그 후 우레아를 점차 적은 양으로 함유하는 용액에 대해 단계별로 투석함으로써 우레아를 제거하였다. 최종 완충액은 10 mM Tris, pH 8.5였다.
면역화 연구. 인간 APP (알츠하이머 전구체 단백질: Alzheimer's precursor protein)에 대한 트랜스제닉 마우스를 이 연구에 이용하였다. TgRND8+로 명명된 이 마우스들은 마우스 뇌에서 고농도의 Aβ-40 및 Aβ-42를 결과시키는 APP의 변이형을 발현시킨다 (Janus, C. 외).
Aβ-42 (SEQ ID NO:2, wksrl 673-714, 표준 Fmoc 전략에 의해 합성됨) 또는 hAB43+-34 변이체 (실시예 1의 표에서 구조물 34, 재조합적으로 제조됨)로 마우스들을 2주일 간격으로 4회 면역시켰다. 투여량은 Aβ의 경우 100 mg, hAB43+-34의 경우 50 mg이었다. 마우스들을 제 43일에 채혈하고 (3회 주사 후) 52일 후 (4회 주사 후)에 혈청을 이용하여 항-Aβ-42 특이적 역가 수준을 직접 Aβ-42 ELISA에 의해 측정하였다.
다음 표는 상대평균 항-Aβ-42 역가를 보여준다.
Figure pat00010
명백하겠지만, hAB43+-34 Aβ 변이체로 면역화시킨 경우 얻어진 항체 역가는 면역원으로서 변형되지 않은 야생형 Aβ-42를 이용하여 얻어진 역가에 비해 3회 면역 및 4회 면역 후 각각 약 4배 및 7.5배 더 높다. 이 사실은 면역화에 사용된 변이체의 양이 면역화에 사용된 야생형 서열의 양의 50%에 불과하다는 점을 고려하면 더욱 뚜렷한 것이다.
실시예 3
교차- 결합제제로서 활성화된 폴리 - 히드록시폴리머를 이용한 Aβ 펩타이드 코폴리머의 합성.
서론. 전통적인 컨쥬게이트 백신은 캐리어 단백질에 공유적으로 커플링된 (폴리)펩타이드로 이루어진다. 이 펩타이드는 B-세포 에피토프(들)을 함유하며 캐리어 단백질은 T-헬퍼 에피토프를 제공한다. 그러나, 대부분의 캐리어 단백질은 T-헬퍼 에피토프의 소스로서는 적합하지 않을 것인데, 그 이유는 전체 서열의 단지 적은 부분만이 적절한 T-헬퍼 에피토프를 함유하기 때문이다. 이러한 에피토프는 예컨대 12-15 아미노산의 펩타이드로서 정의 및 합성될 수 있다. 이들 펩타이드가 B-세포 에피토프를 함유하는 펩타이드에 예컨대 다가 활성화 폴리-히드록시폴리머를 경유하여 공유적으로 링크되면, 해당 부분만을 함유하는 백신 분자를 얻을 수 있다. 또한, B-세포와 T-세포 에피토프를 최적 비율로 함유하는 백신 컨쥬게이터도 제공할 수 있다.
활성화 폴리 - 히드록시폴리머의 합성. 덱스트란, 전분, 아가로스 등과 같은 폴리-히드록시폴리머는 N-메틸피롤리돈 (NMP)에 용해된 상태에서 균질한 합성 (덱스트란)에 의해, 또는 예컨대 아세톤 중에서 이종 합성 (전분, 아가로스, 가교된 덱스트란) 수단에 의해 2,2,2-트리플루오로에탄설포닐 클로라이드 (트레실 클로라이드)를 이용하여 활성화될 수 있다.
건조 조건 하에 225 ml의 건조한 N-메틸 피롤리돈 (NMP)을 자석 교반된 500 ml 둥근바닥 플라스크 중의 동결건조된 수용성 덱스트란 (4.5g, 83 mmol, 임상등급, Mw (avg) 78000)에 첨가한다. 이 플라스크를 60℃의 오일 배쓰에 자석 교반시키면서 넣는다. 온도를 20분에 걸쳐 92℃로 상승시킨다. 덱스트란이 용해되면 플라스크를 즉시 오일 배쓰에서 꺼내고 배쓰 온도를 40℃로 저하시킨다. 플라스크를 여전히 자석 교반시키면서 오일 배쓰에 다시 넣고, 트레실 클로라이드 (2.764ml, 25 mmol)를 적가한다. 15분 후, 건조 피리딘 (무수, 2.020 ml, 25 mmol)을 적가한다. 오일 배쓰로부터 플라스크를 꺼내고 실온에서 1시간 교반한다. 생성물 (TAD: Tresyl Activated Dextran: 트레실 활성화된 덱스트란)을 1200 ml의 차가운 에탄올 (99.9%)에서 석출시킨다.
상등액을 따라내고 2000 rpm으로 원심분리되는 50 ml의 폴리프로필렌 튜브 중에서 침전물을 수확한다. 침전물을 50 ml의 0.5% 아세트산에 용해시키고, 5000 ml의 0.5% 아세트산에 대해 2배 투석하고 동결건조시킨다. TAD를 동결건조된 분말로스 -20℃에서 보관할 수 있다.
아가로스 또는 가교된 덱스트란과 같은 불용성 폴리-히드록시폴리머는 예컨대 아세톤 중에서 폴리-히드록시폴리머의 현탁액을 만듦으로써 트레실 활성화될 수 있으며 고체상 합성으로서 합성을 수행한다. 활성화 폴리-히드록시포릴머는 여과에 의해 수확될 수 있다. 적절한 방법이 예컨대 Nilsson K 및 Mosbach K (1987), Methods in Enzymology 135, p. 67, 및 Hermansson GT 외, (1992)dp "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, Inc., p. 87에 보고되어 있다.
Aβ 펩타이드 코폴리머 백신의 합성. TAD (10 mg)을 100μl H2O에 용해시키고, 5 mg Aβ-42 (SEQ ID NO: 2, 잔기 673-714), 2.5 mg P2 (SEQ ID NO: 4) 및 2.5 mg P30 (SEQ ID NO: 6)를 함유하는 1000 μl 카보네이트 완충액, pH 9.6을 첨가한다. Aβ-42와 P2 및 P30 펩타이드는 모두 보호된 라이신기를 함유한다: 이들은 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥-1-실리덴)에틸(Dde) 보호된 라이신기의 형태이다. 통상적인 Fmoc-Lys(Boc)-OH를 Fmoc-Lys(Dde)-OH (Novabiochem, cat. no. 04-12-1121) (즉, 라이신의 ε-아미노기가 Boc 대신 Dde에 의해 보호된)에 의해 치환시킨 표준 Fmoc 전략을 이용함으로써 펩타이드들을 합성한다.
pH값을 측정하고 1M HCl을 이용하여 9.6으로 조정한다. 실온에서 2.5 시간 후, 80% 용액으로부터의 히드라진을 최종 히드라진 농도 8%가 되도록 첨가하고 용액을 실온에서 30분간 더 인큐베이션시킨 다음 그 직후 동결건조시킨다. 동결건조된 생성물을 H2O에 용해시키고 최종 동결건조 전에 H2O에 대해 집중적으로 투석한다.
최종 생성물 중 B-세포 에피토프 (Aβ)와 T-헬퍼 에피토프 (P2 및 P30)의 비율은 합성 단계 중 이들 펩타이드의 농도를 달리함으로써 변화시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 최종 생성물은, 합성 단계 중 카보네이트 완충액에 아민화 만노스를 첨가함으로써 예컨대 만노스 (컨쥬게이트를 APC에 표적화시키도록)로 태그시킬 수 있다.
B-세포 에피토프와 T-헬퍼 에피토프를 함유하는 펩타이드를 결합시키기 위해 불용성 활성화 폴리-히드록시폴리머를 사용할 경우, 폴리머에 대한 커플링은 고체상 합성으로서 수행할 수 있으며 최종 생성물을 세척 및 여과에 의해 수확 및 정제한다.
일반적인 설명을 통해 언급한 바와 같이, 본 명세서에 설명된 펩타이드 기재 백신의 제조접근법은 순수하게 합성적인 펩타이드 백신을 제조하는데 편리할 경우, 그리고 문제의 폴리펩타이드 항원이 하나의 단일 펩타이드에서 충분한 면역원성을 제공하는 경우 여하한 다른 폴리펩타이드 항원에 대해서도 적용가능하다.
실시예 4
합성 펩타이드 코폴리머 백신
TAD (10 mg)을 100μl H2O에 용해시키고, 1-5 mg 펩타이드 A (관심 대상인 어떤 면역원성 펩타이드라도 무방함), 1-5 mg P2 (디프테리아 톡소이드 P2 에피토프) 및 1-5 mg P30 (디프테리아 톡소이드 P30 에피토프)을 함유하는 1000 μl 카보네이트 완충액, pH 9.6을 첨가한다. pH 값을 측정하고 0.1M HCl을 이용하여 pH를 9.6으로 조정한다. 실온에서 2.5시간 경과 후 용액을 즉시 동결건조시킨다. 동결건조된 생성물을 H2O에 용해시키고 최종 동결건조에 앞서 H2O에 대해 집중적으로 투석시키거나 젤 여과 컬럼상에서 탈염시킨다. 펩타이드가 서열 중에 라이신을 함유하는 경우 라이신 측쇄 중의 ε-아민은 합성시 Fmoc-Lys(Dde)-OH 유도체를 이용하여 Dde로 보호시켜야 한다 (Gregorius 및 Theisen 2001, 제출됨). 커플링 후, 80% 용액으로부터의 히드라진을 최종 히드라진 농도가 1-20%가 되도록 첨가하고 이 용액을 실온에서 다시 30분간 인큐베이션시킨 후 즉시 동결건조시키고, 최종 동결건조 전에 H2O에 대해 집중적으로 투석하거나 젤여과 컬럼 상에서 탈염시킨다. 이 원리 개념을 도 2에 개략적 형태로 나타내었다.
이러한 면역원은 "펩타이드 A"로서 Borrelia burgdorferi 단백질 OspC의 짧은 C-말단 단편과 펩타이드 B로서 디프테리아 톡소이드 에피토프 (P2 또는 P30)를 가지며 본 발명자들에 의해 이용되었다. 이들 항원을 이용한 면역화 연구 결과 백신화 마우스의 MHC 하플로타잎과 맷치되는 외래 디프테리아 에피토프와 OspC 단편을 포함하는 본 발명의 면역원만이 이들 마우스에서 OspC와 반응성인 항체를 유도할 수 있었던 것으로 나타났다. 이와 대조적으로, OspC 펩타이드만을 함유하는 분자들은 항체 생성을 유도하지 못하였으며 하나는 OspC를 함유하고 다른 하나는 에피토프를 함유한 2가지 면역원의 혼합물도 마찬가지였다. 따라서, OspC와 같은 짧은 펩타이드 합텐에 대한 항체 생산을 유도하기 위해서는, 반드시는 아니라 해도, 동일한 폴리히드록시폴리머 캐리어내로 봉입하는 것이 더 우수한 것으로 결론지어진다.
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도 1: Aβ 단백질 Aβ-43 (또는 C-100)에 대한 항체 반응을 발생시키기 위하여 아밀로이드 전구체 단백질로부터 유래된 오토백(Autovac) 변이체의 개략도. 도 상단에 APP를 개략적으로 나타내며 나머지 개략적인 구조체는 에피토프 모델 P2 및 P30이 치환되거나 APP의 다양한 절단체 내로 삽입된다는 것을 보여준다. 본 도에서, 검은색 패턴은 APP 신호 서열을 나타내며, 두 줄 크로스-해칭(cross-hatching)은 APP의 세포외 부분이며, 어두운 수직 해칭은 APP의 트랜스멤브레인 도메인이며, 밝은 수직 해칭은 APP의 세포내 도메인이며, 굵은 크로스-해칭은 P30 에피토프를 나타내고 가는 크로스-해칭은 P2 에피토프를 나타낸다. 풀 라인 박스는 Aβ-42/43을 나타내며 풀-라인 박스와 도트 라인 박스는 모두 C-100을 나타낸다. "Abeta"는 Aβ를 나타낸다.
도 2: 일반적으로 적용가능한 면역원성 접합체 합성의 한 구체예의 개략도. 펩타이드 Aβ(예컨대, 본 명세서에 개시된 Aβ 서열과 같은 모든 항원성 서열) 및 펩타이드 B (외래 T-헬퍼 에피토프를 포함하는 아미노산 서열)를 합성하고 혼합한다. 그리고 나서, 이들을 적절한 활성화된 폴리하이드록시폴리머와 접촉시키고, 펩타이드 A 및 B를 활성화기를 통하여 펩타이드 혼합물 내의 이들 두 물질 간의 개시 비율에 상응하는 양으로 접착시킨다. 상세한 사항은 실시예 4 참조.
SEQUENCE LISTING <110> Pharmexa A/S <120> Novel Method For Down-Regulation Of Amyloid <130> P1014PC1 <140> <141> <160> 16 <170> PatentIn Ver. 3.1 <210> 1 <211> 2313 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2313) <220> <221> misc_feature <222> (2098)..(2169) <223> nucleotides encoding transmembrane region <220> <221> misc_feature <222> (2014)..(2313) <223> Nucleotides encoding C-100 <220> <221> misc_feature <222> (2016)..(2144) <223> Abeta 42/43 <220> <221> misc_feature <222> (2014)..(2142) <223> Abeta 42/43 <400> 1 atg ctg ccc ggt ttg gca ctg ctc ctg ctg gcc gcc tgg acg gct cgg 48 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 gcg ctg gag gta ccc act gat ggt aat gct ggc ctg ctg gct gaa ccc 96 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 cag att gcc atg ttc tgt ggc aga ctg aac atg cac atg aat gtc cag 144 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 aat ggg aag tgg gat tca gat cca tca ggg acc aaa acc tgc att gat 192 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 acc aag gaa ggc atc ctg cag tat tgc caa gaa gtc tac cct gaa ctg 240 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 cag atc acc aat gtg gta gaa gcc aac caa cca gtg acc atc cag aac 288 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 tgg tgc aag cgg ggc cgc aag cag tgc aag acc cat ccc cac ttt gtg 336 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 att ccc tac cgc tgc tta gtt ggt gag ttt gta agt gat gcc ctt ctc 384 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 gtt cct gac aag tgc aaa ttc tta cac cag gag agg atg gat gtt tgc 432 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 gaa act cat ctt cac tgg cac acc gtc gcc aaa gag aca tgc agt gag 480 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 aag agt acc aac ttg cat gac tac ggc atg ttg ctg ccc tgc gga att 528 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 gac aag ttc cga ggg gta gag ttt gtg tgt tgc cca ctg gct gaa gaa 576 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 agt gac aat gtg gat tct gct gat gcg gag gag gat gac tcg gat gtc 624 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 tgg tgg ggc gga gca gac aca gac tat gca gat ggg agt gaa gac aaa 672 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 gta gta gaa gta gca gag gag gaa gaa gtg gct gag gtg gaa gaa gaa 720 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 gaa gcc gat gat gac gag gac gat gag gat ggt gat gag gta gag gaa 768 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 gag gct gag gaa ccc tac gaa gaa gcc aca gag aga acc acc agc att 816 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 gcc acc acc acc acc acc acc aca gag tct gtg gaa gag gtg gtt cga 864 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 gag gtg tgc tct gaa caa gcc gag acg ggg ccg tgc cga gca atg atc 912 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 tcc cgc tgg tac ttt gat gtg act gaa ggg aag tgt gcc cca ttc ttt 960 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 tac ggc gga tgt ggc ggc aac cgg aac aac ttt gac aca gaa gag tac 1008 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 tgc atg gcc gtg tgt ggc agc gcc atg tcc caa agt tta ctc aag act 1056 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 acc cag gaa cct ctt gcc cga gat cct gtt aaa ctt cct aca aca gca 1104 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 gcc agt acc cct gat gcc gtt gac aag tat ctc gag aca cct ggg gat 1152 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 gag aat gaa cat gcc cat ttc cag aaa gcc aaa gag agg ctt gag gcc 1200 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 aag cac cga gag aga atg tcc cag gtc atg aga gaa tgg gaa gag gca 1248 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 gaa cgt caa gca aag aac ttg cct aaa gct gat aag aag gca gtt atc 1296 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 cag cat ttc cag gag aaa gtg gaa tct ttg gaa cag gaa gca gcc aac 1344 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 gag aga cag cag ctg gtg gag aca cac atg gcc aga gtg gaa gcc atg 1392 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 ctc aat gac cgc cgc cgc ctg gcc ctg gag aac tac atc acc gct ctg 1440 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 cag gct gtt cct cct cgg cct cgt cac gtg ttc aat atg cta aag aag 1488 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 tat gtc cgc gca gaa cag aag gac aga cag cac acc cta aag cat ttc 1536 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 gag cat gtg cgc atg gtg gat ccc aag aaa gcc gct cag atc cgg tcc 1584 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 cag gtt atg aca cac ctc cgt gtg att tat gag cgc atg aat cag tct 1632 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 ctc tcc ctg ctc tac aac gtg cct gca gtg gcc gag gag att cag gat 1680 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 gaa gtt gat gag ctg ctt cag aaa gag caa aac tat tca gat gac gtc 1728 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 ttg gcc aac atg att agt gaa cca agg atc agt tac gga aac gat gct 1776 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 ctc atg cca tct ttg acc gaa acg aaa acc acc gtg gag ctc ctt ccc 1824 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 gtg aat gga gag ttc agc ctg gac gat ctc cag ccg tgg cat tct ttt 1872 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 ggg gct gac tct gtg cca gcc aac aca gaa aac gaa gtt gag cct gtt 1920 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 gat gcc cgc cct gct gcc gac cga gga ctg acc act cga cca ggt tct 1968 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 ggg ttg aca aat atc aag acg gag gag atc tct gaa gtg aag atg gat 2016 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt cat cat caa aaa ttg 2064 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa ggt gca atc att gga 2112 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 ctc atg gtg ggc ggt gtt gtc ata gcg aca gtg atc gtc atc acc ttg 2160 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 gtg atg ctg aag aag aaa cag tac aca tcc att cat cat ggt gtg gtg 2208 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 gag gtt gac gcc gct gtc acc cca gag gag cgc cac ctg tcc aag atg 2256 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag ttc ttt gag cag atg 2304 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 cag aac tag 2313 Gln Asn 770 <210> 2 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Clostridium tetani <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <223> DNA encoding P2 epitope <400> 3 cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg 45 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 4 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 63 <212> DNA <213> Clostridium tetani <220> <221> CDS <222> (1)..(63) <223> DNA encoding P30 epitope <400> 5 ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt agc 48 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 gct agc cac ctg gaa 63 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 6 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic <223> Synthetic PCR primer <400> 7 caactcagct tcctttcggg c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic <223> Synthetic PCR primer <400> 8 agatctcgat cccgcgaaat t 21 <210> 9 <211> 135 <212> DNA <213> Synthetic <223> Synthetic PCR primer <400> 9 atggatgcag aattccgtca cgactccggt tacgaagttc accaccagaa actggttttc 60 ttcgcagaag atgttggttc caacaaaggt gcaatcatcg gtctgatggt tggcggtgtt 120 gttatcgcga cctag 135 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Synthetic <223> Synthetic PCR primer <400> 10 gccggccatg gatgcagaat tccgtcacga c 31 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic <223> Synthetic PCR primer <400> 11 gccggaagct tctaggtcgc gataacaaca ccgccaacc 39 <210> 12 <211> 84 <212> DNA <213> Synthetic <223> Synthetic PCR primer <400> 12 ccggcaagct tctacagctc ggtgataccg atgaatttgg agttagcttt gatgtactgg 60 gtcgcgataa caacaccgcc aacc 84 <210> 13 <211> 101 <212> DNA <213> Synthetic <223> Synthetic PCR primer <400> 13 gccggccatg ggtttcaaca acttcaccgt tagcttctgg ctgcgtgttc cgaaagttag 60 cgcgagccac ctggaagatg cagaattccg tcacgactcc g 101 <210> 14 <211> 172 <212> DNA <213> Synthetic <223> Synthetic PCR primer <400> 14 gggccaagct tggatccggt cgcgataaca acaccgccaa ccatcagacc gatgattgca 60 cctttgttgg aaccaacatc ttctgcgaag aaaaccagtt tctggtggtg aacttcgtaa 120 ccggagtcgt gacggaactc tgcatccagc tcggtgatac cgatgaattt gg 172 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Synthetic <223> Synthetic PCR primer <400> 15 ctggaagatg cagagttccg tcacgactcc 30 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Synthetic <223> Synthetic PCR primer <400> 16 gcgccggatc cttcaacaac ttcaccgtta gcttc 35 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Synthetic <223> Synthetic HLA DR binding sequence <400> 17 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10

Claims (4)

  1. SEQ ID NO: 2의 잔기 672-714의 아서열(subsequence)의 1개 이상의 복제본과, 1개 이상의 외래 T-헬퍼(TH) 에피토프가 아미노산의 첨가, 삽입, 결실, 치환 중 하나 이상의 방법으로 통합되어 구성된 폴리아미노산으로서, 여기서 상기 아서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 673-714으로 구성되는 아미노산 서열의 잔기 1-40, 잔기 1-39, 잔기 1-35, 잔기 1-34, 잔기 1-28, 잔기 1-12, 잔기 1-5, 잔기 13-28, 잔기 13-35, 잔기 17-28, 잔기 25-35, 잔기 35-40, 잔기 36-42 및 잔기 35-42로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 외래 T-헬퍼 에피토프는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 17 중에서 선택되는 것인 폴리아미노산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리아미노산은 P30 (SEQ ID NO: 6)과 P2 (SEQ ID NO:4)에 의하여 각각 분리된 3개의 동일한 Aβ-43 단편으로 구성되는데, 상기 Aβ-43 단편은 SEQ ID NO: 2의 잔기 672-714인 것인 폴리아미노산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리아미노산은 Aβ의 1-12 아미노산 잔기가 이어지는 SEQ ID NO: 4이 이어지는 Aβ의 1-12 아미노산 잔기가 이어지는 SEQ ID NO: 6이 이어지는 Aβ의 1-12 아미노산 잔기로 구성되는 것인 폴리아미노산.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리아미노산은 Aβ의 1-28 아미노산 잔기가 이어지는 SEQ ID NO: 4이 이어지는 Aβ의 1-28 아미노산 잔기가 이어지는 SEQ ID NO: 6이 이어지는 Aβ의 1-28 아미노산 잔기로 구성되는 것인 폴리아미노산.
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