EA011610B1

EA011610B1 - Способ понижающей регуляции белка-предшественника амилоида

Info

Publication number: EA011610B1
Application number: EA200600974A
Authority: EA
Inventors: Петер Бирк Расмуссен; Мартин Роланд Енсен; Клаус Грегориус Нильсен; Петер Кофод; Флоранс Даль Деган
Original assignee: Х. Лундбекк А/С
Priority date: 2001-08-20
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2009-04-28
Also published as: US20030157117A1; IS7133A; HUP0400669A3; HRP20040218A2; DE60213615D1; DE60213615T2; ES2269749T5; KR20090074830A; WO2003015812A2; AU2010212381A1; EA007533B1; AU2002325199B2; ES2269749T3; CA2457140A1; CA2457140C; HK1064934A1; YU13304A; CO5560581A2; CN101675992A; JP2004538332A

Abstract

Раскрыты новые способы лечения заболеваний, характеризующихся накоплением амилоида. Способы в основном основаны на иммунизации против белка-предшественника амилоида (АРР) или β-амилоида (Aβ). Предпочтительно иммунизацию осуществляют посредством введения аналогов аутологичных АРР или Aβ, где указанные аналоги способны вызывать продукцию антител против аутологичных амилоидогенных полипептидов. В качестве иммуногена особенно предпочтителен Aβ, который модифицируют путем введения одного или нескольких чужеродных Т-клеточных эпитопов. Также раскрыта вакцинация нуклеиновой кислотой против АРР или Aβ и вакцинация с применением живых вакцин, а также способы и средства, пригодные для вакцинации. Такие способы и средства включают в себя способы получения аналогов и фармацевтических препаратов, а также фрагментов нуклеиновой кислоты, векторов, трансформированных клеток, полипептидов и фармацевтических препаратов.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к усовершенствованиям в лечении и профилактике болезни Альцгеймера (АО) и других заболеваний, характеризующихся накоплением амилоида, например характеризующихся накоплением амилоида в центральной нервной системе (ЦНС). Более конкретно, в настоящем изобретении представлен способ для понижающей регуляции (нежелательного) накопления амилоида посредством включения продукции антител против соответствующего белка (АРР или Ав) или их компонентов у субъектов, страдающих от заболеваний с патологией, включающей в себя отложение амилоида, или рискующих пострадать от данных заболеваний. Изобретение также относится к способам получения полипептидов, которые можно использовать в указанном способе, а также к модифицированным пептидам, как таковым. Также в настоящее изобретение включены фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированные полипептиды, а также векторы, включающие в себя указанные фрагменты нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева и клеточные линии, трансформированные ими. Наконец, в данном изобретении предоставлен новый тип иммуногена на основе конъюгированных пептидов.

Предпосылки изобретения

Амилоидоз представляет собой внеклеточное накопление нерастворимых пептидных фибрилл, приводящее к повреждению тканей и заболеванию (Рерук, 1996; Тап с1 а1., 1995; Ке11у, 1996). Фибриллы формируются, когда растворимые в норме белки и пептиды самопроизвольно ассоциируются аномальным образом (Ке11у, 1997).

Амилоид ассоциирован с серьезными заболеваниями, включая системный амилоидоз, АО, диабет взрослых, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, фронто-темпоральную деменцию и связанные с прионами передающиеся губчатые энцефалопатии (куру и болезнь Крейцфельда-Якоба у человека и скрэпи и В8Е у овец и крупного рогатого скота соответственно), и формирование амилоидных бляшек, например, при болезни Альцгеймера, по-видимому, тесно связано с прогрессированием заболевания у человека. На животных моделях показано, что избыточная экспрессия или экспрессия модифицированных форм белков, обнаруженных в отложениях, таких как белок β-амилоид, вызывают различные симптомы заболевания, например подобные симптомам при болезни Альцгеймера. Специфического лечения накопления амилоида не существует, и такие заболевания, как правило, приводят к смертельному исходу.

Субъединицы фибрилл амилоида могут представлять собой белки дикого типа, измененные или укороченные белки, и подобные фибриллы можно формировать ίη νίίτο из олигопептидов и денатурированных белков (ВгайЬшу е1 а1., 1960; ЕПк1ие е1 а1., 1964; Вигке&Во1Щ\зе. 1972). Характер амилоидоза определяет природа полипептидного компонента фибрилл. Несмотря на большие различия в размере, нативной структуре и функции амилоидных белков, все амилоидные фибриллы представляют собой фибриллы неопределенной длины, неразветвленные, имеющие в диаметре от 70 до 120 А и характерно окрашивающиеся конго красным (Рерук, 1996). Они представляют собой характерную складчатую β-структуру, в которой полипептидная цепь уложена в β-слои. Хотя амилоидные белки обладают чрезвычайно разнообразными структурами предшественников, все они могут подвергаться структурной конверсии, возможно, по сходному пути, в неправильно уложенную форму, которая представляет собой строительный блок протофиламента спирали β-слоя.

Данная характерная фибриллярная форма приводила к амилоидозам, называемым β-фибриллезами (61еппег, 1980 а, Ь), а фибриллярный белок АО, до того как узнали его вторичную структуру, называли β-белком (61еппег&Аопд, 1984). Характерная дифракционная картина перекрестных β-структур, вместе с появлением фибрилл и свойствами при окраске, в настоящее время представляет собой общепринятые диагностические признаки амилоида и означает, что фибриллы, хотя и сформированы из совершенно разных белковых предшественников, обладают определенным структурным сходством и составляют структурное надсемейство, безотносительно к природе их белков-предшественников (8ипйе М., 8егре11 Ь.С., Вагйаш М., Егакег Р.Е., Рерук М.В., В1аке ССЕ1 Мо1. Вю1. 1997, Θεί. 31; 273 (3): 729-739).

Одно из наиболее широко распространенных и хорошо известных заболеваний представляет собой АО, где, как предполагают, центральной ролью в развитии заболевания является отложение амилоида в центральной нервной системе.

АО.

Болезнь Альцгеймера (АО) представляет собой необратимое, прогрессирующее расстройство головного мозга, которое происходит постепенно и приводит к потере памяти, изменениям в поведении и личности и снижению умственных способностей. Такие потери связаны с гибелью клеток головного мозга и разрушению связей между ними. Течение заболевания, как и степень деградации варьируют от человека к человеку. В среднем пациенты с АО после установления диагноза живут от 8 до 10 лет, хотя болезнь может длиться и до 20 лет.

АО прогрессирует по стадиям: от ранней, умеренной забывчивости до тяжелой потери умственной деятельности. Такая потеря известна как деменция. У большинства людей с АО первые симптомы появляются после 60 лет, но не редки более ранние возрасты начала. Самые ранние симптомы часто включают в себя потерю кратковременной памяти, ложное суждение и личностные изменения. Часто люди на начальных стадиях АО мыслят менее ясно и забывают имена близких родственников и названия обыч

- 1 011610 ных вещей. Позже, при развитии болезни, они могут забывать, как выполнять даже простые задачи. В итоге, люди с АО полностью теряют способность к мышлению и становятся зависимыми от других людей из-за необходимости ежедневного ухода за ними. В конечном счете, болезнь так ослабляет силы, что пациенты становятся прикованными к постели, и возрастает вероятность развития других заболеваний и инфекции. Как правило, люди, страдающие АО, умирают от пневмонии.

Несмотря на то что риск развития АО увеличивается с возрастом, симптомы АО и деменции не являются частью нормального старения. АО и другие приводящие к слабоумию заболевания вызываются заболеваниями, влияющими на мозг. При нормальном старении нервные клетки головного мозга в большом количестве не разрушаются. В отличие от этого при АО разрушаются три ключевых процесса: связь, метаболизм и восстановление нервных клеток. Такое разрушение, в конечном счете, вызывает остановку функционирования многих нервных клеток, потерю связей с другими нервными клетками и смерть.

Вначале АО разрушает нейроны в частях головного мозга, контролирующих память, главным образом в гиппокампе и связанных структурах. По мере того как клетки в гиппокампе, по существу, прекращают функционирование, ослабевает краткосрочная память, и зачастую способность субъекта выполнять простые и привычные задачи начинает снижаться. АО также воздействует на кору головного мозга, особенно в областях, отвечающих за речь и мышление. В конечном счете, вовлекаются и другие области головного мозга, все эти области головного мозга атрофируются (сокращаются), и пациенты с АО становятся прикованными к постели, неспособными к самоконтролю, полностью беспомощными и невосприимчивыми к окружающему миру (источник: Νηΐίοηηΐ 1пкШи1е оп Адтд Ргодгекк Верой оп А1х11еипег'к Океане, 1999).

Влияние АО.

АО представляет собой наиболее общую причину деменции у человека в возрасте 65 лет и старше. Она представляет собой большую проблему для здоровья по причине ее огромного влияния на индивидов, семьи, систему здравоохранения и общество в целом. Ученые подсчитали, что в настоящее время свыше 4 млн людей страдают от данного заболевания, и частота заболевания у тех индивидов, кому более 65 лет, удваивается каждые 5 лет. Также предполагают, что каждый год возникнет примерно 360000 новых случаев (инцидент), хотя эта цифра будет увеличиваться по мере старения населения (Вгооктеуег е! а1., 1998).

АО накладывает тяжелое экономическое бремя на общество. В последнем исследовании в Соединенных Штатах рассчитали, что ежегодная стоимость лечения одного пациента с АО представляет собой $18408 для пациента со слабой АО, $30096 - для пациента с умеренной АО и $36132 - для пациента с тяжелой АО. Подсчитано, что ежегодные государственные расходы в США на лечение пациентов с АО составляют немногим больше $50 млрд (Беоп е! а1., 1998).

Примерно 4 млн американцев находятся в возрасте 85 лет или более и в наиболее индустриализованных странах эта возрастная группа представляет собой одну из наиболее быстро растущих частей населения. Рассчитано, что данная группа к 2030 году в США составит приблизительно 8,5 млн; некоторые эксперты, изучающие изменения населения, предполагают, что данное число может даже являться большим. Так как все больше и больше людей живет дольше, число людей, пораженных заболеваниями, связанными с возрастом, включая АО, будет продолжать увеличиваться. Например, некоторые исследования показывают, что приблизительно половина из всех людей в возрасте 85 лет и старше обладают какой-либо формой слабоумия (№1Еопа1 1пкй1и1е оп Адтд Ргодгекк Верой оп Аййеипег'к О1кеаке, 1999).

Основные характеристики АО.

Признаками АО являются две аномальные структуры в головном мозге: амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки (ΝΡΤ). Бляшки представляют собой плотные, почти совершенно нерастворимые накопления белка и клеточного вещества вне и вокруг нейронов головного мозга. Клубки представляют собой нерастворимые переплетенные волокна, накапливающиеся внутри нейронов.

Существует две формы АО: семейная АО (РАО), которая подчиняется определенному типу наследования, и спорадическая АО, для которой не наблюдается очевидного типа наследования. По причине различий в начале заболевания АО дополнительно описывают как заболевание с ранним началом (возникающее у человека моложе 65 лет) и с поздним началом (возникающее у человека 65 лет и старше). АО с ранним началом случается редко (примерно 10% случаев) и, как правило, поражает людей в возрасте от 30 до 60 лет. Некоторые формы АО с ранним началом являются наследственными и поражают членов семей. АО с ранним началом также часто прогрессирует быстрее, чем более частая форма с поздним началом.

Все РАО, известные до настоящего времени, характеризуются ранним началом, а в настоящее время известно, что до 50% случаев РАО вызваны дефектами в трех генах, расположенных на трех разных хромосомах. Они представляют собой мутации в гене АРР на хромосоме 21; мутации в гене, называемом пресенилин-1, на хромосоме 14 и мутации в гене, называемом пресенилин-2, на хромосоме 1. Однако пока нет доказательств того, что какая-либо из этих мутаций играет основную роль в более частой, спорадической или несемейной форме АО с поздним началом (№1Еопа1 1пкй1и1е оп Адтд Ргодгекк Верой оп Акйетет'к Океаке, 1999).

- 2 011610

Амилоидные бляшки.

При АО амилоидные бляшки вначале развиваются в областях головного мозга, связанных с памятью и другими когнитивными функциями. Они состоят из почти совершенно нерастворимых накоплений бета-амилоида (в дальнейшем обозначаемом Ав), представляющего собой белковые фрагменты большего белка, называемого белком-предшественником амилоида (АРР, аминокислотная последовательность которого приведена далее в 8ЕО ΙΌ N0:2), смешанного с частями нейронов и клеток, не являющихся нейронами, таких как микроглия и астроциты. Неизвестно, являются ли амилоидные бляшки, как таковые, основной причиной АО или они представляют собой побочный продукт процесса АО. Безусловно, как показано для наследуемой формы АО, вызываемой мутациями в гене АРР, изменения белка АРР могут вызывать ЛЭ. а формирование бляшек Ав представляется тесно ассоциированным с прогрессией заболевания у человека (Б1рра С.Р. е1 а1. 1998).

АРР.

АРР представляет собой один из многих белков, связанных с клеточными мембранами. После его образования АРР встраивается в мембрану нервной клетки, располагаясь частично внутри и частично снаружи клетки. Последние исследования с использованием трансгенных мышей показали, что, повидимому, АРР играет важную роль в росте и выживании нейронов. Например, определенные формы и количества АРР могут защитить нейроны и от краткосрочного, и от длительного повреждения, а также могут приводить поврежденные нейроны в состояние с лучшей способностью к самовосстановлению и помогают частям нейронов расти после травмы головного мозга.

Пока АРР встроен в клеточную мембрану, на особые участки АРР действуют протеазы, расщепляя его на белковые фрагменты. Одна протеаза помогает расщепить АРР, с образованием Ав, а другая протеаза расщепляет АРР посередине амилоидного фрагмента, так что Ав не может сформироваться. Фрагмент Ав сформирован из двух различных частей: более короткого Ав длиной 40 (или 41) аминокислот, который является относительно растворимым и медленно агрегирует, и немного более длинного липкого Ав длиной 42 аминокислоты, который быстро образует нерастворимые агрегаты. Пока Ав формируется, еще точно неизвестно, как он движется - через нервные клетки или вокруг них. На финальной стадии процесса липкий Ав агрегирует в длинные филаменты снаружи клетки и вместе с фрагментами отмерших или отмирающих нейронов и микроглией с астроцитами формирует бляшки, характеризующие АО в ткани головного мозга.

Существуют некоторые доказательства, что мутации в АРР становятся более вероятными, когда от предшественника АРР отрежется Ав, таким образом вызывая образование или больших количеств общего Ав, или относительно больших количеств «липкой» формы. Также обнаружили, что мутации в генах пресенилина могут вносить вклад в дегенерацию нейронов по меньшей мере двумя путями: посредством модификации продукции Ав или посредством запуска клеточной смерти более непосредственно. Другие исследования наводят на мысль, что мутированные пресенилины 1 и 2 могут быть вовлечены в возрастающую скорость апоптоза.

Полагают, что Ав токсичен для нейронов. В исследованиях на культуре ткани исследователи обнаружили увеличение смерти нейрональных клеток гиппокампа, сконструированных для повышенной экспрессии мутантных форм АРР человека по сравнению с нейронами с повышенной экспрессией нормального АРР человека (Био е1 а1., 1999).

Кроме того, повышенная экспрессия или экспрессия модифицированных форм белка Ав, как показано на животных моделях, вызывает симптомы, подобные симптомам при болезни Альцгеймера (Нмао К. е1 а1., 1998).

На основании данных о том, что увеличенное образование Ав, его агрегация в бляшки и результирующая нейротоксичность могут вести к АО, исследование состояний, в которых агрегацию Ав в бляшки можно снизить или даже блокировать, представляет интерес для лечения.

Пресенилины.

Мутации в пресенилине-1 (8-180) отвечают почти за 50% всех случаев семейной АО с ранним началом (РАО). Идентифицировано около 30 мутаций, приводящих к АО. Начало АО варьирует в зависимости от мутаций. Мутации в пресенилине-2 отвечают за гораздо меньшую часть случаев РАО, но тем не менее представляют собой значимый фактор. Вовлечены ли пресенилины в спорадическую несемейную АЭ, неизвестно. Функция пресенилинов неизвестна, но они оказываются вовлечены в процессинг АРР с получением Ав-42 (более длинная липкая форма пептида, 8ЕО ΙΌ N0:2, остатки 673-714), так как пациенты с АО с мутациями в пресенилине имеют повышенные уровни данного пептида. Играют ли также пресенилины роль при индукции образования ΝΤΡ, неясно. Некоторые данные позволяют предположить, что пресенилины также могут обладать более непосредственной ролью в дегенерации и смерти нейронов. Пресенилин-1 расположен на хромосоме 14, в то время как пресенилин-2 сцеплен с хромосомой 1. Если субъект несет мутированную версию хотя бы одного из этих генов, у него или у нее почти достоверно разовьется АО с ранним началом.

Несколько неясно, является ли пресенилин-1 идентичным гипотетической γ-секретазе, вовлеченной в процессинг АРР (№т.15е е1 а1., 1998).

- 3 011610

Аполипопротеин Е.

Аполипопротеин Е обычно ассоциирован с холестерином, но его также находят в бляшках и клубках в головном мозге при АО. Несмотря на то что аллели 1-3 представляются не вовлеченными в АО, существует значимая корреляции между присутствием аллеля АРОЕ-е4 и развитием АО с поздним началом (Зйтйтайег с1 а1., 1993). Однако это представляет собой фактор риска, а не прямую причину, как в случае мутаций пресенилина и АРР, и это не ограничено семейной АО.

Пути, при которых в связи с белком АРОЕ-е4 увеличивается вероятность развития АО, достоверно не известны, но одна возможная теория состоит в том, что он облегчает накопление Ав, и это способствует уменьшению возраста начала АО, или присутствие или отсутствие конкретных аллелей АРОЕ может влиять на способ, которым нейроны отвечают на повреждение (ΒιιΙΙίπί е1 а1., 1999).

Показано, что Аро А1 также является амилоидогенным. Интактный Аро А1 ίη νίίτο самостоятельно может формировать фибриллы, подобные амилоиду, окрашивающиеся конго красным (Ат. 1. Ра11ю1. 147 (2): 238-244 (Аид. 1995), \У1Кше\гкк| Т., Со1аЬек А.А., К1йа Е., \У1Кше\гкк| К.Е., Гтапдюпе В.).

По-видимому, существуют противоречивые результаты, указывающие на то, что имеют место положительные эффекты аллеля АРОЕ-е4 в отношении уменьшения симптомов ментальной потери по сравнению с другими аллелями (81егп. ВгапйС 1997, Аппа1к οί №иго1оду 41).

Нейрофибриллярные клубки.

Этот второй признак АО заключается в аномальном накоплении перекрученных нитей, обнаруживаемых внутри нервных клеток. Главный компонент клубков представляет собой одну из форм белка, называемого тау (τ). В центральной нервной системе τ-белки наиболее известны своей способностью связываться с микротрубочками, представляющими собой одну из составляющих внутренней поддерживающей структуры клетки или цитоскелет, и помогать им стабилизироваться. Однако при АО τ-белки изменены химически, и такие измененные τ-белки больше не способны стабилизировать микротрубочки, являясь причиной их дезинтеграции. Такое разрушение транспортной системы может вначале привести к нарушению связей между нервными клетками, а позже может привести к смерти нейронов.

При АО химически измененные τ-белки переплетаются в парные спиральные филаменты, представляющие собой две нити τ-белков, накрученных одна вокруг другой. Эти филаменты представляют собой основное вещество, обнаруживаемое в нейрофибриллярных клубках. В одном недавнем исследовании были обнаружены нейрофибриллярные изменения менее чем в 6% нейронов в определенной части гиппокампа в головном мозге здоровых, более чем в 43% этих нейронов у людей, умерших от умеренной АО, и в 71% этих нейронов у людей, умерших от тяжелой АО. Когда изучали гибель нейронов, обнаружили сходную прогрессию. Доказательства такого типа поддерживают идею о том, что формирование клубков и гибель нейронов прогрессируют вместе в процессе АО (Иайопа1 1п8111и(е оп Адшд Ргодгекк Верой оп А1х11еппег'к Ощеаке, 1999).

Таупатии и клубки.

Тяжелые нейродегенеративные заболевания, отличающиеся от АО, характеризуются агрегацией τ-белков в нерастворимые филаменты в нейронах и глии, приводящие к дисфункции и смерти. Совсем недавно несколько групп исследователей, изучавших семьи с различными видами наследуемого слабоумия, отличающегося от АО, обнаружили первую мутацию в гене τ-белка на хромосоме 17 (С1агк е! а1., 1998; Нийоп е! а1., 1998; Роотка.) е! а1., 1998; 8рй1апйш е! а1., 1998). В этих семьях мутации в гене τ-белка вызывают смерть нейронов и слабоумие. Такие расстройства, разделяющие некоторые из характеристик с АО, но отличающиеся в некоторых важных аспектах, собирательно называют «фронто-темпоральное слабоумие и паркинсонизм, сцепленные с хромосомой 17» (ГТОР-17). Они представляют собой заболевания, такие как болезнь Паркинсона, некоторые формы амиотрофического бокового склероза (АЕ8), кортикобазальную дегенерацию, прогрессирующие супрануклеарный паралич и болезнь Пика, все из которых характеризуются аномальным накопление τ-белка.

Другие неврологические заболевания, подобные АО.

Существуют важные параллели между АО и другими неврологическими заболеваниями, включая прионные заболевания (такие как куру, болезнь Крейцфельдта-Якоба и бычий губчатый энцефалит), болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона и фронто-темпоральную деменцию. Все они связаны с накоплением в головном мозге аномальных белков. И АО, и прионные заболевания вызывают слабоумие и смерть и ассоциированы с формированием нерастворимых фибрилл амилоида, но из мембранных белков, отличающихся друг от друга.

Ученые, изучающие болезнь Паркинсона, второе наиболее частое расстройство после АО выявили первый ген, сцепленный с данным заболеванием. Этот ген кодирует белок, называемый синуклеин, который, что интересно, также обнаружен в амилоидных бляшках головного мозга пациентов с АО (Ьатейап С., 1998, Сепоте Век. 8 (9): 871-80). Исследователи также выявили, что генетические дефекты при болезни Гентингтона, в другом прогрессирующем нейродегенеративном заболевании, вызывающем слабоумие, служат причиной того, что белок Гентингтона образует нерастворимые фибриллы, очень сходные с фибриллами Ав при АО и белковыми фибриллами при прионном заболевании (8с11егхшдег Е, с! а1., 1999, РЫА8 И.8.А. 96 (8): 4604-9).

- 4 011610

Ученые также выявили новый ген, который в мутантной форме отвечает за семейное слабоумие англичан (ΡΒΌ), редкое наследственное заболевание, вызывающее тяжелые двигательные нарушения и прогрессирующее слабоумие, подобное наблюдаемому при ΆΌ. При биохимическом анализе фибрилл амилоида, обнаруженных в бляшках при ΡΒΌ, найден новый пептид, названный ЛЬп (У1ба1 с1 а1., 1999). Мутация в особой точке в данном гене приводит к продукции более длинного, чем обычный, белка Вп. Пептид ЛЬп, который отрезается от мутантного конца белка Вп, откладывается в виде фибрилл амилоида. Полагают, что такие бляшки ведут к нейрональной дисфункции и слабоумию, характеризующему ΡΒΌ.

Иммунизация Αβ.

Иммунная система обычно принимает участие в очистке от чужеродных белков и белковых частиц в организме, но накопления, ассоциированные с указанными выше заболеваниями, главным образом состоят из собственных белков, следовательно, интерпретация роли иммунной в контроле данных заболеваний менее очевидна. Кроме того, накопления расположены в отделах (ЦНС), обычно отделенных от иммунной системы, оба этих факта позволяют предположить, что любая вакцина или иммунотерапевтический подход окажутся безуспешными.

Тем не менее, ученые недавно попытались иммунизировать мышей вакциной, состоящей из гетерологического человеческого Ав и вещества, известного как стимулятор иммунной системы (8сйепк с1 а1., 1999 и \νϋ 99/27944). Вакцину тестировали в конкретной модели ΑΌ у трансгенных мышей с мутантным геном АРР человека, вставленным в ДНК мыши. У мышей по мере их старения продуцировался модифицированный белок АРР и развивались амилоидные бляшки. Данную мышиную модель использовали для тестирования возможного эффекта вакцинации против модифицированного трансгенного АРР человека на формирование бляшек. В первом эксперименте одной группе трансгенных мышей ежемесячно вводили инъекции вакцины начиная с возраста 6 недель и заканчивая в возрасте 11 недель. Вторая группа мышей не получала инъекций и служила контрольной группой. К возрасту 13 месяцев у мышей в контрольной группе наличествовали бляшки, охватывающие от 2 до 6% их головного мозга. Напротив, у иммунизированных мышей практически не было бляшек.

Во втором эксперименте ученые начинали проводить инъекции на 11 месяце, когда некоторые бляшки уже развились. Через 7 месяцев контрольные трансгенные мыши имели в 17 раз большее количество бляшек в головном мозге, тогда как у мышей, получавших вакцину, происходило 99%-ное уменьшение количества бляшек по сравнению с 18-месячными контрольными трансгенными мышами. Было обнаружено, что у некоторых мышей некоторые из предсуществующих отложений бляшек удалялись в результате лечения. Также обнаружили, что другие повреждения, ассоциированные с бляшками, такие как воспаление и аномальные процессы в нервных клетках, в результате иммунизации уменьшались.

Таким образом, указанное выше представляет собой предварительное исследование на мышах, и, например, ученым необходимо выяснить, остаются ли вакцинированные мыши здоровыми в других аспектах и нормально ли сохраняется память у вакцинированных мышей. Более того, так как мышиная модель не полностью отображает ΑΌ (у животных не развиваются нейрофибриллярные клубки, и при этом многие из их нейронов не погибают), необходимы дополнительные исследования для определения того, обладает ли человек схожей с мышиной реакцией или реакцией, отличной от мышиной. Другая проблема для рассмотрения состоит в том, что способ, возможно, может «лечить» накопления амилоида, но не останавливать развитие слабоумия.

Технические проблемы также представляют собой большие сложности. Например, маловероятно, если вообще возможно, применение данного способа для создания вакцины, дающей возможность повысить у человека уровень антител против его собственных белков. Таким образом, перед тем как можно будет рассматривать какие-либо испытания на человеке, необходимо решить многочисленные проблемы безопасности и эффективности.

Таким образом, работа 8с11епк е1 а1. показывает, что если возможно вызывать сильный иммунный ответ к собственным белкам в белковых отложениях в центральной нервной системе, таких как бляшки, формирующиеся при ΑΌ, возможно и предотвратить формирование накоплений и возможно также устранить уже сформированные бляшки.

В последнее время клинические попытки с применением обсуждаемых выше вакцин Αβ ограничивались вследствие неблагоприятных эффектов: у ряда вакцинированных субъектов развивался хронический энцефалит, который мог возникать вследствие неуправляемого аутоиммунитета против Ав в ЦНС.

Цель изобретения

Целью настоящего изобретения является представление новых способов лечения состояний, таких как ΑΌ, характеризующихся накоплением амилоида. Дополнительная цель представляет собой разработку аутовакцины против амилоида для разработки нового способа лечения ΑΌ и других патологических расстройств, ассоциированных с отложением амилоида.

- 5 011610

Сущность изобретения

Здесь описано применение способа аутовакцинации для выработки сильных иммунных ответов против иначе неиммуногенных АРР и Ав. Также описано получение таких вакцин для профилактики, возможного лечения или ослабления симптомов заболеваний, ассоциированных с отложениями амилоида.

Таким образом, в своем широком и наиболее полном объеме настоящее изобретение относится к способу понижающей регуляции белка-предшественника амилоида (АРР) или бета-амилоида (Ав) ίη νίνο у животных, включая человека, где способ включает в себя эффективную презентацию иммунной системе животного иммуногенно эффективного количества по меньшей мере одного аналога АРР или Ав, содержащего в одной молекуле по меньшей мере один В-клеточный эпитоп АРР и/или Ав и по меньшей мере один чужеродный Т-хелперный эпитоп (Т_н-эпитоп), так что иммунизация животного данным аналогом вызывает продукцию антител против аналогов АРР или Ав животного, где аналог:

a) представляет собой полиаминокислоту, состоящую по меньшей мере из одной копии подпоследовательности остатков 672-714 в 8ЕО Ш N0:2, где чужеродный Т_н-эпитоп вводят посредством добавления, и/или вставки, и/или делеции, и/или замены аминокислот, где подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из остатков 1-42, остатков 1-40, остатков 1-39, остатков 1-35, остатков 1-34, остатков 1-28, остатков 1-12, остатков 1-5, остатков 13-28, остатков 13-35, остатков 17-28, остатков 25-35, остатков 35-40, остатков 36-42 и остатков 35-42 аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 673-714 8Е0 Ш N0:2; и/или

b) представляет собой полиаминокислоту, содержащую чужеродный Т_н-эпитоп и разорванную последовательность АРР или Ав, так что аналог не содержит никакой подпоследовательности 8Е0 Ш N0:2, продуктивно связывающейся с молекулами МНС класса II, инициируя Т-клеточный ответ; и/или

c) представляет собой полиаминокислоту, включающую в себя чужеродный Т_н-эпитоп и полученные из АРР или Ав аминокислоты, и содержит один-единственный остаток метионина, расположенный на С-конце аналога, причем другие остатки метионина в АРР или Ав и в чужеродном Т_н-эпитопе замещены или удалены и предпочтительно замещены лейцином или изолейцином; и/или

б) представляет собой конъюгат, включающий в себя полигидроксиполимерный остов, к которому отдельно присоединена полиаминокислота, как определено в а), и/или полиаминокислота, как определено в Ь), и/или полиаминокислота, как определено в с); и/или

е) представляет собой конъюгат, включающий в себя полигидроксиполимерный остов, к которому отдельно присоединены 1) чужеродный Т_н-эпитоп и 2) полиаминокислота, выбранная из группы, состоящей из подпоследовательностей, как определено в а), разорванной последовательности АРР или Ав, как определено в Ь), и полученную из АРР или Ав аминокислотную последовательность, включающую в себя один-единственный остаток метионина, расположенный на С-конце, причем другие остатки метионина в АРР или Ав и в чужеродном Т_н-эпитопе замещены или удалены и предпочтительно замещены лейцином или изолейцином.

Правопреемником настоящего изобретения ранее была подана международная патентная заявка, относящаяся к безопасным стратегиям вакцинации против амилоидогенных пептидов, таких как АРР или Ав, сравните \¥0 01/62284. Данная заявка не была опубликована на момент даты подачи заявки на данное изобретение и, кроме того, не содержит деталей, относящихся к указанным выше пригодным аналогам АРР и Ав.

Изобретение также относится к аналогам АРР и Ав, также как к фрагментам нуклеиновых кислот, кодирующих их подмножество. Также изобретение относится к иммуногенным композициям, включающим в себя аналоги или фрагменты нуклеиновых кислот.

Описание чертежей

Фиг. 1. Схематическое изображение вариантов АЩотас, извлеченных из белка-предшественника амилоида с целью вызова ответов с помощью антител против белка Ав-43 (или С-100).

АРР схематически показан вверху фигуры, а оставшиеся схематические конструкции показывают, что модельные эпитопы Р2 и Р30 замещают различные укороченные продукты АРР или вставлены в них. На фигуре черный блок означает сигнальную последовательность АРР, косая штриховка в двух направлениях означает экстрацеллюлярный участок АРР, темная вертикальная штриховка соответствует трансмембранному домену АРР, светлая вертикальная штриховка соответствует внутриклеточному домену АРР, жирная косая штриховка означает эпитоп Р30 и тонкая косая штриховка означает эпитоп Р2. Рамка из сплошных линий означает Ав-42/43, а рамка из сплошных линий совместно с рамкой из пунктирных линий означает С-100. «АЬе1а» обозначает Ав.

Фиг. 2. Схематическое изображение осуществления синтеза применяемых в большинстве случаев иммуногенных конъюгатов.

Синтезируют и смешивают пептид А (любая антигенная последовательность, например последовательность Ав, описанная здесь) и пептид В (аминокислотная последовательность, включающая в себя Т-хелперный эпитоп). После того как они приходят в контакт с подходящим активированным полигид

- 6 011610 роксиполимером, пептиды А и В присоединяются посредством активной группы в соотношении, соответствующем начальному соотношению между данными двумя веществами в смеси пептидов. Для подробностей см. пример 4.

Подробное описание изобретения

Определения.

Далее будет определен и подробно объяснен ряд терминов, применяющихся в данном описании и формуле изобретения, для прояснения границ и пределов изобретения.

Термины амилоид и амилоидный белок, применяемые здесь, являются взаимозаменяющими и означают класс белковых неразветвленных фибрилл неопределенной длины. Фибриллы амилоида обнаруживают способность к окраске конго красным и обладают складчатой β-структурой, в которой полипептидные цепи организованы в β-слои. Амилоид, как правило, происходит из амилоидогенных белков, которые обладают сильно различающимися структурами предшественников, но все из которых могут подвергаться структурной конверсии в аномально уложенную форму, представляющую собой строительный блок протофиламента спирали β-слоя. Обычно диаметр фибрилл амилоида изменяется примерно от 70 до 120 А.

Термин «амилоидогенный белок» предназначен для обозначения полипептида, вовлеченного в образование отложений амилоида, или, по существу, являющегося частью отложений, или являющегося частью биосинтетического пути, приводящего к образованию отложений. Итак, примерами амилоидогенных белков являются АРР и Ав, но амилоидогенными белками также могут считаться и белки, вовлеченные в их метаболизм.

«Амилоидный полипептид» здесь предназначен для обозначения полипептидов, включающих в себя аминокислотную последовательность обсуждаемых выше амилоидогенных белков, происходящих от человека или других млекопитающих (или их укороченные варианты, разделяющие с интактным амилоидогенным белком существенное количество В-клеточных эпитопов), следовательно, амилоидогенный полипептид может, например, включать в себя существенный участок предшественника амилоидогенного полипептида (в случае Ав один из возможных амилоидных полипептидов может происходить из АРР). Также данный термин включает в себя негликозилированные формы амилоидогенных полипептидов, получаемых в прокариотических системах, а также формы с различными профилями гликозилирования из-за применения, например, дрожжей или других эукариотических экспрессирующих систем, не принадлежащих к млекопитающим. Однако необходимо отметить, что, когда применяют термин амилоидогенный полипептид, это означает, что рассматриваемый полипептид при презентации животным, подвергаемым воздействию, обычно является неиммуногенным. Другими словами, амилоидогенный полипептид представляет собой собственный белок или аналог такого собственного белка, который обычно не дает начало иммунному ответу против амилоидогенного белка рассматриваемого животного.

«Аналог» представляет собой молекулу, полученную из АРР или Ав, содержащую одно или несколько изменений в своей молекулярной структуре. Такое изменение, например, можно производить при слиянии полиаминокислот АРР или Ав с подходящим для слияния партнером (т.е. изменение в первичной структуре, исключительно включающее в себя С- и/или Ν-концевые добавки аминокислотных остатков) и/или можно производить в виде вставок, и/или делеций, и/или замен аминокислотной последовательности полипептида. Также в термин включены дериватизированные молекулы, полученные из АРР или Ав (сравните обсуждение модификаций АРР или Ав ниже). В некоторых случаях аналог можно сконструировать с тем, чтобы уменьшить или даже исключить способность вызывать появление антител против нормального белка(ов)-предшественника(ов) амилоида, таким образом избегая нежелательного взаимодействия с (физиологически нормальной) неагрегированной формой полипептида, являющегося предшественником амилоидного белка.

Необходимо отметить, что, как предполагается, применение в качестве вакцины для человека чужеродного аналога (например, собачьего или свиного аналога) АРР или Ав человека создаст желательный иммунитет против АРР или Ав. Такое применение чужеродного аналога также рассматривается как часть изобретения.

Термин «полипептид» в настоящем контексте предназначен для обозначения и коротких пептидов от 2 до 10 аминокислотных остатков, и олигопептидов от 11 до 100 аминокислотных остатков, и полипептидов из более чем 100 аминокислотных остатков. Более того, также предполагается, что данный термин охватывает белки, т. е. функциональные биологические молекулы, включающие в себя по меньшей мере один полипептид; когда такие биологические молекулы содержат по меньшей мере два полипептида, последние могут формировать комплексы, быть ковалентно связанными или могут быть связанными нековалентно. Полипептид(ы) в белке могут быть гликозилированными и/или липоилированными и/или включать в себя простетические группы. Термин «полиаминокислота» также эквивалентен термину «полипептид».

Термины «Т-лимфоцит» и «Т-клетка» применяют попеременно для лимфоцитов, происходящих из тимуса, отвечающих за различные виды иммунного ответа, опосредованного клетками, а также за хелперную активность в гуморальном иммунном ответе. Подобным образом термины В-лимфоцит и

- 7 011610

В-клетка применяют попеременно для лимфоцитов, продуцирующих антитела.

Термин «подпоследовательность» означает любой непрерывный отрезок по меньше мере из 3 аминокислот или, когда уместно, по меньшей мере из 3 нуклеотидов, непосредственно полученных из природных аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновых кислот амилоида соответственно.

Термин «животное» в настоящем контексте, как правило, предназначен для обозначения вида животного (предпочтительно млекопитающего), такого как Ното 8ар1еи8, Саше ботезйсиз и т.п., а не только одного-единственного животного. Однако этот термин также означает популяцию такого вида животных, поскольку важно, чтобы все индивиды, иммунизированные способом согласно настоящему изобретению, обладали, по существу, одинаковыми АРР или Αβ, если принять во внимание иммунизацию животных одним и тем же иммуногенным(ми) средством(ами). Специалистам ясно, что животное в настоящем контексте представляет собой живое существо с иммунной системой. Предпочтительно, чтобы животное являлось позвоночным, таким как млекопитающее.

Под термином «понижающая регуляция АРР или Αβ ίη νίνο» здесь подразумевают уменьшение в живом организме общего количества накопленного амилоидного белка (или амилоида как такового) подходящего типа. Понижающую регуляцию можно получить посредством нескольких механизмов, из которых простое взаимодействие с амилоидом посредством связывания антител, так, чтобы предотвратить аномальную агрегацию, представляет собой наиболее простой. Однако в объем настоящего изобретения также входит то, что связывание антител приводит к удалению амилоида поглощающими клетками (такими как макрофаги и другие фагоцитирующие клетки) и что антитела взаимодействуют с другими амилоидогенными полипептидами, приводящими к образованию амилоида. Дополнительной возможностью является то, что антитела связывают Ав вне ЦНС, таким образом удаляя Αβ из ЦНС посредством простого принципа действия масс.

Выражение «эффективная презентация... иммунной системе» предназначено для обозначения того, что иммунная система животных в контролируемом режиме подвергается иммуногенной провокации иммунного ответа. Как станет ясно из описания ниже, такую провокацию ответа иммунной системы можно провести рядом способов, наиболее важные из которых представляют собой вакцинацию полипептидом, содержащим «фармацины» (т.е. вакцину, которую вводят для лечения текущей болезни или улучшения состояния при этой болезни), или вакцинацию нуклеиновой кислотой, содержащей «фармацины». Важным результатом для достижения является то, чтобы иммунокомпетентные клетки животного противостояли антигену иммунологически эффективным способом, тогда как точный способ достижения такого результата является менее важным для идеи согласно изобретению, лежащей в основе настоящего изобретения.

Термин «иммуногенно эффективное количество» имеет смысл, обычно принятый в данной области, т.е. он означает количество иммуногена, которого достаточно для индукции иммунного ответа, значимо охватывающего патогенные вещества, разделяющие общие иммунологические свойства с иммуногеном.

Когда говорят, что АРР или Ав «модифицированы», здесь это означает, что проводили химическую модификацию полипептида АРР или Αβ. Такая модификация может представлять собой получение производных (например, алкилирование) определенных аминокислотных остатков в последовательности, но как можно будет понять из описания ниже, предпочтительные модификации включают в себя изменения первичной структуры аминокислотной последовательности.

Когда обсуждают аутотолерантность к АРР или Ав, понятно, что, так как полипептид представляет собой собственный белок популяции, подлежащей вакцинации, у обычных индивидов в популяции не возникает иммунного ответа против полипептида; однако это нельзя исключить, так как редко встречающиеся в популяции животных индивиды могут быть способны продуцировать антитела к нативному полипептиду, например, как часть аутоиммунного расстройства. Во всяком случае, животное обычно аутотолерантно только к своему собственному АРР или Αβ, однако нельзя исключать, что данное животное также явится толерантным к аналогам, полученным от другого вида животных или из популяции с другим фенотипом.

«Чужеродный Т-клеточный эпитоп (или «чужеродный Т-лимфоцитарный эпитоп») представляет собой пептид, способный связываться с молекулой МНС и стимулирующий Т-клетки у вида животных. Предпочтительные чужеродные Т-клеточные эпитопы представляют собой смешанные эпитопы, т.е. эпитопы, связывающиеся основной частью молекул МНС конкретного класса у вида животных или популяции. Известно только очень ограниченное количество таких смешанных Т-клеточных эпитопов, и они подробно обсуждаются ниже. Смешанные Т-клеточные эпитопы также обозначают как универсальные Т-клеточные эпитопы. Необходимо отметить, что для иммуногенов, применяемых согласно настоящему изобретению, чтобы являться эффективными как можно в большей части популяции животных, могут быть необходимы 1) вставка нескольких чужеродных Т-клеточных эпитопов в один и тот же аналог или 2) получение нескольких аналогов, где каждый из аналогов обладает различным вставленным смешанным эпитопом. Необходимо также отметить, что идея о чужеродных Т-клеточных эпитопах также включает в себя применение скрытых Т-клеточных эпитопов, т.е. эпитопов, полученных из собствен

- 8 011610 ных белков и вызывающих иммунологическую реакцию только тогда, когда они существуют в изолированной форме, не являясь частью рассматриваемого собственного белка.

«Чужеродный Т-хелперный лимфоцитарный эпитоп» (чужеродный Т_н-эпитоп) представляет собой чужеродный Т-клеточный эпитоп, который связывается с молекулой МНС класса II и который может быть представлен на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АРС) в связанном с молекулой МНС класса II виде.

«Функциональный участок» (биологической) молекулы в настоящем контексте означает участок молекулы, отвечающий по меньшей мере за один из биохимических или физиологических эффектов, вызываемых молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы обладают активным участком, отвечающим за эффекты, вызываемые рассматриваемой молекулой. Другие участки молекулы могут служить для целей стабилизации или улучшения растворимости, и поэтому их можно удалить, если данные цели не имеют значения в контексте определенного осуществления настоящего изобретения. Например, в АРР или Ав возможно применение определенных цитокинов как модифицирующих групп (сравните подробную дискуссию ниже), и в таком случае проблема стабильности может являться несущественной, так как связывание с АРР или Αβ может обеспечивать необходимую стабильность.

Термин «адъювант» имеет то же значение, которое является общепринятым в области технологии вакцин, т.е. вещество или композиция веществ, которая 1) не способна самостоятельно вызвать специфический иммунный ответ против иммуногена вакцины, но которая 2), тем не менее, способна усилить иммунный ответ против иммуногена. Или, другими словами, вакцинация одним адъювантом не обеспечивает иммунный ответ против иммуногена, вакцинация иммуногеном может или не может дать начало иммунному ответу против иммуногена, но комбинированная вакцинация иммуногеном и адъювантом вызывает иммунный ответ на иммуноген, который сильнее, чем вызванный одним иммуногеном.

«Позиционирование, или нацеливание» молекулы в настоящем контексте предназначено для обозначения ситуации, когда молекула при введении животному предпочтительно появляется в определенной(ых) ткани(ях) или предпочтительно ассоциирована с определенными клетками или клеточными типами. Эффекта можно достичь рядом способов, включая формирование молекулы в композицию, облегчающую позиционирование, или введение в молекулу групп, облегчающих позиционирование. Данные проблемы подробно обсуждаются ниже.

Стимуляция иммунной системы означает, что вещество или композиция веществ проявляет общий, неспецифический иммунностимулирующий эффект. Ряд адъювантов и предполагаемые адъюванты (такие как определенные цитокины) обладают способностью стимулировать иммунную систему. Результат применения иммуностимулирующих средств представляет собой повышенную «готовность» иммунной системы, означающую, что совместная или последующая иммунизация иммуногеном вызывает значительно более эффективный иммунный ответ в сравнении с отдельным применением иммуногена.

«Продуктивное связывание» означает связывание пептида с молекулой МНС (класса I или II), чтобы было возможно стимулировать Т-клетки, которые связываются с клетками, презентирующими пептид, связанный с молекулой МНС. Например, пептид, связанный с молекулой МНС класса II на поверхности АРС, является продуктивно связанным, если данная АРС стимулирует Т_н-клетки, связывающиеся с комплексом презентированный пептид-МНС класса II.

Предпочтительные осуществления понижающей регуляции амилоида.

Предпочтительно, чтобы применяемый в качестве иммуногена в способе согласно изобретению аналог представлял собой модифицированную молекулу АРР или Αβ, где присутствует по меньшей мере одно изменение в аминокислотной последовательности АРР или Αβ, так как в данном случае шансы получения очень значительного нарушения аутотолерантности сильно облегчены, что очевидно, например, из результатов, представленных в примере 2, где иммунизацию диким типом Αβ сравнивают с иммунизацией вариантной молекулой Аβ. Показано (Όηΐιιιη I. с1 а1., 1996, I. Iттиηο1. 157: 4796-4804), что потенциально аутоиммунные В-лимфоциты, распознающие собственные белки, физиологически присутствуют у нормальных индивидов. Однако для индукции этих В-лимфоцитов для фактической продукции антител, реагирующих с подходящими собственными белками, необходимо содействие продуцирующих цитокины Т-хелперных лимфоцитов (Тн-клетки, или Тн-лимфоциты). Обычно такая помощь не обеспечивается, так как Т-лимфоциты, как правило, не распознают Т-клеточные эпитопы, полученные из собственных белков, когда они представлены антигенпрезентирующими клетками (АРС). Однако если обеспечить элемент чужеродности в собственном белке (т.е. ввести иммунологически значимую модификацию), Т-клетки, распознающие чужеродный элемент, активируются при распознавании чужеродного эпитопа на АРС (прежде всего, такой как мононуклеарная клетка). Поликлональные В-лимфоциты (также являющиеся АРС), способные к распознаванию собственных эпитопов на модифицированных собственных белках, также интернализуют антиген и впоследствии представляют чужеродный(е) Т-эпитоп(ы) из него, а активированные Т-лимфоциты таким аутоиммунным поликлональным В-лимфоцитам впоследствии обеспечивают помощь цитокинами. Так как антитела, продуцируемые данными поликлональными В-лимфоцитами, реагируют с различными эпитопами на модифицированном полипептиде, вклю

- 9 011610 чая те, которые также представлены на нативном полипептиде, индуцируется антитело, перекрестно реагирующее с немодифицированным собственным белком. В заключение Т-лимфоциты могут быть приведены в действие так, как если бы популяция поликлональных В-лимфоцитов распознавала бы полностью чужеродный антиген, тогда как фактически только встроенный(е) эпитоп(ы) является(ются) чужеродным^) для хозяина. Таким образом, индуцируются антитела, способные к перекрестной реакции с немодифицированными собственными антигенами.

В данной области известно несколько путей модификации собственного антигена пептида для достижения нарушения аутотолерантности. Но все-таки предпочтительно, чтобы аналог согласно настоящему изобретению включал в себя по меньшей мере одну первую введенную группу, нацеливающую модифицированную молекулу на антигенпрезентирующую клетку (АРС); и/или по меньшей мере одну вторую введенную группу, стимулирующую иммунную систему; и/или по меньшей мере одну третью введенную группу, оптимизирующую представление аналога иммунной системе.

Однако все эти модификации следует производить пока в АРР или Ав сохраняется существенная часть исходных В-клеточных эпитопов, так как распознавание В-лимфоцитами нативной молекулы таким образом усиливается.

В одном из предпочтительных осуществлений ковалентно или нековалентно введены боковые группы (в виде чужеродных Т-клеточных эпитопов или указанных выше первой, второй и третьей групп). Это означает, что ответвления из аминокислотных остатков, полученные из АРР или Ав, дериватизированы без изменения первичной аминокислотной последовательности или, по меньшей мере, без внесения изменений в пептидных связях между индивидуальными аминокислотами в цепи.

В альтернативном и предпочтительном осуществлении применяют аминокислотную замену, и/или делецию, и/или вставку, и/или добавление (которые можно провести посредством рекомбинантных способов или посредством пептидного синтеза; модификации, включающие в себя более длинные участки из аминокислот, могут приводить к образованию гибридных полипептидов). Одну из особенно предпочтительных версий данного осуществления представляет собой технология, описанная в νΟ 95/05849, где описан способ понижающей регуляции собственных белков путем иммунизации аналогами собственных белков, где участок аминокислотной последовательности (ряд последовательностей) заменен соответствующим участком аминокислотной последовательности(ей), каждый из которых содержит чужеродный иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп, тогда как одновременно в аналоге сохраняется полная третичная структура собственного белка. Однако для целей настоящего изобретения существенно, если модификация (будь она вставкой, добавлением, делецией или заменой) приводит к образованию чужеродного Т-клеточного эпитопа и одновременно сохраняет значительное количество В-клеточных эпитопов в АРР или Ав. Однако для получения максимальной эффективности в индукции иммунного ответа предпочтительно, чтобы в модифицированной молекуле сохранялась полная третичная структура АРР или Ав.

В некоторых случаях предпочтительно, чтобы АРР или Ав или их фрагменты являлись мутантными. Особенно предпочтительными являются варианты замен, где метионин в положении 35 в Ав-43 замещен предпочтительно лизином или изолейцином или просто делетирован. Особенно предпочтительные аналоги содержат один-единственный метионин, расположенный на С-конце, или потому, что он встречается в амилоидогенном полипептиде или чужеродном Т_н-эпитопе от природы, или потому, что его туда вставили или добавили. Следовательно, также предпочтительно, чтобы участок аналога, включающий Т_н-эпитоп, также не содержал метионина, исключая возможное С-концевое расположение метионина.

Основная причина для удаления всех метионинов, кроме одного, состоит в том, что становится возможным рекомбинантно получать полимерные аналоги, которые можно последовательно отщеплять бромцианом с выходом отдельного аналога. Преимущество состоит в том, что рекомбинантная продукция облегчает данный путь.

Фактически, как правило, предпочтительно, чтобы все аналоги АРР или Ав, применяемые согласно настоящему изобретению, обладали характерной чертой простого включения в себя одногоединственного метионина, расположенного в аналоге как С-концевая аминокислота, и чтобы все остальные метионины или в амилоидогенном полипептиде, или в чужеродном Т_н-эпитопе были удалены или замещены другой аминокислотой.

Дополнительная интересная мутация представляет собой делецию или замещение фенилаланина в положении 19 Ав-43, а особенно предпочтительно, чтобы мутация представляла собой замену фенилаланинового остатка на пролин.

Другие интересные полиаминокислоты для применения в аналогах представляют собой укороченные части белка Ав-43. Их можно применять в иммуногенных аналогах согласно настоящему изобретению. Особенно предпочтительными являются укороченные части Ав (1-42), Ав (1-40), Ав (1-39), Ав (1-35), Ав (1-34), Ав (1-34), Ав (1-28), Ав (1-12), Ав (1-5), Ав (13-28), Ав (13-35), Ав (17-28),

- 10 011610

Αβ (25-35), Αβ (35-40), Αβ (36-42) и Αβ (35-42) (где числа в скобках означают отрезки аминокислот Αβ-43, составляющие соответствующий фрагмент: например, Αβ (35-40) идентичен аминокислотам 706-711 в 8ЕО Ш N0:2). Все эти варианты с укороченными частями Αβ-43 можно получить с описанными здесь фрагментами Αβ, конкретно с вариантами 9, 10, 11, 12 и 13, указанными в примере 1.

Следующая формула описывает молекулярные конструкции, относящиеся к изобретению:

(ΜΟΟχ) ах (амилоид·!) _η1 (ΜΟϋ₂) _ε2 (амилоид^) ρ>2 · · (ΜΟϋ_χ) „ (амилоид_вх) _ηχ {I) где амилоид_е1-амилоид_ех представляют собой х В-клеточный эпитоп, содержащий подпоследовательности АРР или Αβ, которые независимо являются идентичными или неидентичными и которые могут содержать чужеродные боковые группы;

х представляет собой число >3;

п1-пх представляют собой х чисел >0 (по меньшей мере одно >1);

ΜΌΌι-ΜΌΌ_χ представляют собой х модификаций, внесенных между представленными В-клеточными эпитопами, и

81-8х представляют собой х чисел >0 (по меньшей мере одно >1, если в последовательности амилоидех не внесена ни одна боковая группа).

Таким образом, с учетом общих функциональных ограничений на иммуногенность конструкции изобретение допускает все виды перестановок оригинальной последовательности АРР или Αβ и все виды модификаций в ней. Таким образом, в изобретение включены модифицированный АРР или Αβ, полученные посредством пропуска частей последовательности, которые, например, обнаруживают ίη νίνο неблагоприятные эффекты, или пропуска частей, которые обычно являются внутриклеточными и, таким образом, могут дать начало нежелательным иммунологическим реакциям.

Одна предпочтительная версия конструкций, рассмотренных выше, когда применима, представляет собой конструкции, где подпоследовательность, содержащая В-клеточный эпитоп амилоидного белка, не экспонирована экстрацеллюлярно в предшествующем полипептиде, из которого получен амилоид. Такой выбор эпитопов служит гарантией того, что не образуются антитела, которые могли бы реагировать с клетками, продуцирующими предшественник, и, следовательно, вырабатываемый иммунный ответ становится ограниченно направленным иммунным ответом против нежелательных накоплений амилоида. Например, в данном случае можно индуцировать иммунитет против эпитопов АРР или Αβ, экспонированных в экстрацеллюлярную фазу, только когда они свободны от любой связи с продуцирующими их клетками.

Сохранения существенной части В-клеточных эпитопов или даже всей третичной структуры белка, подвергаемого модификации, как здесь желательно, можно достичь несколькими путями. Один из них представляет собой простое получение поликлональной антисыворотки, направленной против рассматриваемого полипептида (например, антисыворотка, полученная от кролика), и применение данной антисыворотки впоследствии в качестве тестового реагента (например, конкурентной ЕЬ18А) против полученных модифицированных белков. Модифицированные версии (аналоги), реагирующие с антисывороткой в том же объеме, что и АРР или Αβ, необходимо рассматривать как обладающие полностью одинаковой третичной структурой, что и АРР или Αβ, тогда как аналоги, проявляющие ограниченную (но все еще значительную и специфичную) реактивность с такой антисывороткой, рассматривают как сохранившие существенную часть исходных В-клеточных эпитопов.

Альтернативно, можно провести отбор моноклональных антител, реагирующих с различными эпитопами на АРР или Αβ, и использовать их как тестовую панель. Данный подход обладает преимуществом, позволяющим 1) картирование эпитопов АРР или Αβ и 2) картирование эпитопов, сохраненных в полученных аналогах.

Конечно, в третьем приближении следовало бы определить 3-мерную структуру АРР или Αβ или их биологически активного укороченного продукта (сравните выше) и сравнить их с определенной трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерную структуру можно разрешить при помощи изучения дифракции рентгеновских лучей и ЯМР-спектроскопии. Дополнительную информацию относительно третичной структуры до некоторой степени можно получить при изучении циркулярного дихроизма, обладающего тем преимуществом, что единственно необходимым для получения полезной информации о третичной структуре данной молекулы является очищенный полипептид (тогда как при дифракции рентгеновских лучей необходимо обеспечить кристаллизованный полипептид, а для ЯМР необходимо обеспечить изотопные варианты полипептида). Однако в конечном счете дифракция рентгеновских лучей и ЯМР необходимы для получения убедительных данных, так как циркулярный дихроизм может предоставить только непрямые доказательства корректности 3-мерной структуры посредством информации об элементах вторичной структуры.

В одном из предпочтительных осуществлений изобретения применяют множественные представления В-лимфоцитарных эпитопов АРР или Αβ (например, формула (I), где по меньшей мере один В-клеточный эпитоп представлен в двух положениях). Данного эффекта можно достичь различными путями, например путем простого получения гибридных полипептидов, содержащих структуру (получен

- 11 011610 ный из АРР или Αβ полипептид)_т, где т представляет собой число >2, и затем ввести обсуждаемые здесь модификации по меньшей мере в одну из последовательностей АРР или Ав. Предпочтительно, чтобы вводимые модификации включали в себя по меньшей мере одну дупликацию эпитопа В-лимфоцита и/или введение гаптена. Данные осуществления, включая множественные представления выбранных эпитопов, особенно предпочтительны в ситуациях, где в качестве компонентов средств для вакцин пригодны просто небольшие части АРР или Αβ.

Как указано выше, введения чужеродного Т-клеточного эпитопа можно достичь, по меньшей мере, вставкой, добавлением, делецией или заменой одной аминокислоты. Конечно, в обычной ситуации происходит введение более чем одного изменения в аминокислотную последовательность (например, вставка или замена целого Т-клеточного эпитопа), но важной целью для достижения является то, что аналог при процессировании антигенпредставляющей клеткой (АРС) даст начало такому чужеродному иммунодоминантному Т-клеточному эпитопу, представленному в связи с молекулой МНС класса II на поверхности АРС. Таким образом, если аминокислотная последовательность АРР или Ав в соответствующих положениях содержит ряд аминокислотных остатков, которые можно обнаружить в чужеродном Т_Н-эпитопе, тогда введение чужеродного Т_Н-эпитопа может быть достигнуто путем обеспечения оставшихся аминокислот чужеродного эпитопа посредством вставки, добавления, делеции или замены аминокислот. Другими словами, введение полного ТН-эпитопа посредством вставки или замены для удовлетворения целей настоящего изобретения не является необходимым.

Предпочтительно, чтобы число вставок, делеций, замен или добавлений аминокислот представляло собой по меньшей мере 2, например 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 25 вставок, замен, добавлений или делеций. Кроме того, предпочтительно, чтобы число вставок, замен, добавлений или делеций аминокислот не превышало 150, например не более 100, не более 90, не более 80 и не более 70. Особенно предпочтительно, чтобы число замен, вставок делеций или дополнений не превышало 60 и в частности, данное число не должно превышать 50 или даже 40. Наиболее предпочтительное число не превышает 30. По отношению к добавлениям аминокислот необходимо заметить, что когда получающаяся конструкция находится в форме гибридного полипептида, их зачастую значительно больше чем 150.

Предпочтительные осуществления данного изобретения включают в себя модификацию посредством введения по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного Т-клеточного эпитопа. Необходимо понять, что вопрос об иммунодоминантности Т-клеточного эпитопа зависит от вида рассматриваемого животного. Здесь термин иммунодоминирование буквально относится к эпитопам, которые у вакцинированных индивидов/популяции дают начало значительному иммунному ответу, но хорошо известным фактом является то, что Т-клеточный эпитоп, являющийся иммунодоминантным у одного индивида/популяции, не обязательно иммунодоминантен у другого индивида того же вида, даже несмотря на то, что он способен к связыванию с молекулами МНС-ΙΙ у последнего индивида. Отсюда для целей настоящего изобретения иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп представляет собой Т-клеточный эпитоп, который, когда представлен в антигене, эффективно обеспечит помощь Т-клеток. Обычно иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы обладают такой природной способностью, что они, по существу, всегда представлены связанными с молекулами МНС класса II, независимо от полипептида, в котором они находятся.

Другим важным вопросом является проблема рестрикции МНС Т-клеточных эпитопов. Как правило, природные Т-клеточные эпитопы рестрицированы по МНС, т.е. определенные пептиды, составляющие Т-клеточный эпитоп, будут эффективно связываться только с подмножеством молекул МНС класса II. Это, в свою очередь, обладает тем эффектом, что в большинстве случаев применение одного специфического Т-клеточного эпитопа приведет к компоненту вакцины, эффективному только для части популяции, и, в зависимости от размера этой части, может оказаться необходимым включать больше Т-клеточных эпитопов в одну и ту же молекулу или, альтернативно, готовить многокомпонентную вакцину, где компоненты представляют собой варианты АРР или Αβ, отличающиеся друг от друга природой введенного Т-клеточного эпитопа.

Если МНС-рестрикция применяемых Т-клеток неизвестна (например, в ситуации, когда вакцинируемое животное обладает плохо определенным составом МНС), часть популяции, охватываемой конкретной композицией вакцины, можно аппроксимировать посредством следующей формулы:

Л λ^ι-ΓΊα-Λ) (ю <-1 где ρ₁ представляет собой частоту реагирующих в популяции на ί-й чужеродный Т-клеточный эпитоп, представленный в композиции вакцины;

η представляет общее число чужеродных Т-клеточных эпитетов.

Таким образом, композиция вакцины, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, обладающих частотами ответа в популяции в размере 0,8, 0,7 и 0,6 соответственно, должна дать

1-0,2x0,3x0,4=0,976

т.е. у 97,6% популяции статистически будет повышаться опосредованный МНС-П ответ на вакцину.

Формулу выше не применяют в ситуациях, где более или менее точно известен профиль

- 12 011610

МНС-рестрикции применяемых пептидов. Если, например, определенный пептид связывается только с молекулами МНС-11 человека, кодируемыми аллелями ΌΡ.1, ΌΡ.3, ΌΚ.5 и ΌΚ.7 НЕЛ-ОК, тогда применение данного пептида вместе с другим пептидом, связывающимся с оставшимися молекулами МНС-11, кодируемыми аллелями НЬЛ-ЭК, завершит 100% охват в рассматриваемой популяции. Подобным образом, если второй пептид связывается только с ΌΡ.3 и ЭК5. добавление данного пептида совершенно не увеличит охват. Если основывать расчет ответа популяции только на МНС-рестрикции Т-клеточных эпитопов в вакцине, минимальную часть популяции, охватываемую конкретной композицией вакцины, можно определить посредством следующей формулы:

7-1 где φ, представляет собой сумму частот аллельных гаплотипов, кодируемых молекулами МНС, связывающими любой из Т-клеточных эпитопов в вакцине и принадлежащими Дму из 3 известных локусов НЬЛ (ΌΡ, ΌΚ и ЭР) в популяции; на практике вначале определяют, какие молекулы МНС распознают каждый Т-клеточный эпитоп в вакцине, а потом их сортируют по типу (ΌΡ, ΌΡ. и ЭР); далее для каждого типа суммируют индивидуальные частоты различных отсортированных аллельных гаплотипов, таким образом получая φ₁, φ₂ и φ₃.

Может случиться, что значение ρ₁ в формуле (II) превысит соответствующее теоретическое значение π₁ з ^ι-Πα-κ,)² (ίν) у=1 где ν представляет собой сумму частот аллельного гаплотипа, кодируемого молекулами МНС, связывающими ί-й Т-клеточный эпитоп в вакцине и принадлежащими |-му из 3 известных локусов НЬЛ (ΌΡ, ΌΡ. и ЭР) в популяции.

Это означает, что в 1-π₁ популяции частота отвечающих составляет 1_{остаточная 1}=(ρ₁-π₁)/(1-π₁). Следовательно, формулу (III) можно преобразовать так, чтобы получить формулу

где член !_{остаточная}_1 устанавливают в 0, если он отрицателен.

Необходимо отметить, что формула (V) требует, чтобы все эпитопы являлись картированными по идентичным наборам гаплотипов.

Следовательно, при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналог важно учитывать всю доступную информацию об эпитопах:

1) частоту отвечающих в популяции на каждый эпитоп;

2) данные об МНС-рестрикции и

3) частоту соответствующих гаплотипов в популяции.

Существует ряд природных смешанных Т-клеточных эпитопов, активных у большой части индивидов вида животных или популяции животных, и их предпочтительно вводить в вакцину, таким образом уменьшая необходимость большого числа различных аналогов в одной вакцине.

Смешанный эпитоп согласно изобретению может представлять собой природный Т-клеточный эпитоп человека, такой как эпитопы из анатоксина столбняка (например, эпитопы Р2 и Р30), анатоксина дифтерии, гемагглютинина вируса гриппа (НА) и С8-антигена Ρ. Га1с1рагит.

На протяжении нескольких лет идентифицировали ряд других смешанных Т-клеточных эпитопов. Главным образом идентифицировали пептиды, способные к связыванию с большой частью молекул НЬА-ЭК, кодируемых различными аллелями НЬА-ЭК, и они все являются Т-клеточными эпитопами, допустимыми для введения в аналоги, применяемые согласно настоящему изобретению. Ср. также эпитопы, рассматриваемые в следующих ссылках, которые таким образом все включены сюда посредством ссылки:

\νϋ 98/23635 (Егахсг ГН. е! а1., переуступленный Т11С Ишуегкйу о! РнеегМапб);

8ои111\\'ооб 8. е! а1., 1998, I. Iттиηо1. 160: 3363-3373;

8тщадПа Е е! а1., 1988, №11иге 336: 778-780;

С1ис/ К.М. е! а1., 1993, I. Ехр. Меб 178: 27-47;

Наттег I. е! а1., 1993, Се11 74: 197-203 и

Еа1к К. е! а1., 1994, [ттиподепейск 39: 230-242.

Последняя ссылка также касается лигандов НЬА-Эр и ΌΡ. Все эпитопы, перечисленные в данных ссылках, являются подходящими в качестве природных эпитопов-кандидатов для применения согласно настоящему изобретению как эпитопы, разделяющие общие с ними мотивы.

Альтернативно, эпитоп может представлять собой любой искусственный Т-клеточный эпитоп, способный связываться с большой частью молекул МНС класса II. В данном контексте пептиды, представляющие собой общие эпитопы для всех ЭК (ΡΑΌΚΕ), описанные в νθ 95/07707 и в соответствующей статье А1ехапбег I. е! а1., 1994, !ттип11у. 1: 751-761 (оба описания включены сюда посредством ссылки),

- 13 011610 представляют собой интересные кандидаты для эпитопов для применения согласно настоящему изобретению. Необходимо отметить, что наиболее эффективные пептиды ΡΆΌΚΕ, описанные в данных документах, несут Ό-аминокислоты на С- и Ν-концах для увеличения стабильности при введении. Однако в настоящем изобретении, главным образом, стремятся к введению соответствующих эпитопов как части аналога, который впоследствии ферментативно разрушается внутри лизосомного компартмента АРС, чтобы позволить последующую презентацию в связи с молекулой МНС-11, и, следовательно, введение Ό-аминокислот в применяемые согласно изобретению эпитопы является нецелесообразным.

Один из особенно предпочтительных пептидов ΡΑΌΚΕ представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность АКРУАА^ТЬКААА (8ΕΟ ΙΌ N0:17) или ее иммунологически эффективную подпоследовательность. Данный и другие эпитопы, обладающие таким же отсутствием МНС-рестрикции, представляют собой предпочтительные Т-клеточные эпитопы, которые должны присутствовать в аналогах, применяемых в способе согласно изобретению. Такой сверхсмешанный эпитоп допустим для большинства простых осуществлений изобретения, где вакцинированной иммунной системе животного представлен только один-единственный аналог.

Как указано выше, модификация АРР или Ав может также включать в себя введение первой группы, нацеливающей модифицированный амилоидогенный полипептид на АРС или В-лимфоцит. Например, первая группа может представлять собой специфически связывающийся партнер для специфического антигена поверхности В-лимфоцита или для специфического антигена поверхности АРС. В данной области известно много таких поверхностно-специфических антигенов. Например, группа может представлять собой углевод, для которого существует рецептор на В-лимфоците или АРС (например, маннан или манноза). Альтернативно, вторая группа может представлять собой гаптен. Также в качестве первой группы можно применять фрагмент антитела, специфически распознающий поверхностную молекулу на АРС или лимфоцитах (например, поверхностная молекула может представлять собой рецептор РСу макрофагов или моноцитов, такой как РсуК!, или, альтернативно, любой другой поверхностноспецифический маркер, такой как СЭ40 или СТЬА-4). Необходимо отметить, что все эти приведенные для примера молекулы также можно применять в качестве части адъюванта, сравнение ниже.

В качестве альтернативы или дополнительно для нацеливания аналога на определенный тип клеток для достижения усиленного иммунного ответа можно увеличить уровень реактивности иммунной системы посредством включения указанной выше второй группы, стимулирующей иммунную систему. Типичные примеры таких вторых групп представляют собой цитокины и белки теплового шока или молекулы шаперонов, а также их эффективные части.

Подходящие для применения согласно настоящему изобретению цитокины представляют собой цитокины, которые будут также нормально функционировать в композиции вакцины в качестве адъювантов, т.е. например, интерферон γ (ΙΝΡ-γ), интерлейкин 1 (1Ь-1), интерлейкин 2 (1Ь-2), интерлейкин 4 (1Ь-4), интерлейкин 6 (ГЕ-6), интерлейкин 12 (ГЕ-12), интерлейкин 13 (ГЕ-13), интерлейкин 15 (ГЕ-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Р); альтернативно, в качестве второй группы может хватить функциональной части молекулы цитокина. Что касается применения таких цитокинов в качестве средств для адъювантов, сравните обсуждение ниже.

Подходящие согласно данному изобретению белки теплового шока или молекулярные шапероны, применяемые в качестве второй группы, могут представлять собой Н8Р70, Н8Р90, Н8С70, ОКР94 (также известный как др96, сравните ХУеагесЕ Р.А. с1 а1. 1998, ВюсЕетМгу/ 37: 5709-19) и СРТ (калретикулин).

Альтернативно, вторая группа может представлять собой токсин, такой как листериолизин (ЬЬ0), липид А и термолабильный энтеротоксин. Интересные возможности также связаны с микобактериальными производными, такими как МЭР (мурамилдипептид), СРА (полный адъювант Фрейнда) и сложные эфиры трегалозы ТОМ и ΤΌΕ.

Важное осуществление данного изобретения представляет собой также возможность введения третьей группы, усиливающей презентацию аналога иммунной системе. В данной области показано несколько примеров данного принципа. Например, известно, что якорь липоилирования пальмитиновой кислотой в белке 0§рА у ВоггеНа ЬигдбогГеп можно применять так, что предоставляются полипептиды, сами по себе являющиеся адъювантами (сравните, например, \¥0 96/40718), кажется, что липоилированные белки формируют структуры, подобные мицеллам, с ядром, состоящим из частей якорей липоилирования полипептидов, а оставшиеся части молекулы, выступающие оттуда, приводят к множественной презентации антигенных детерминант. Следовательно, применение таких подобных подходов, связанных с использованием различных якорей липоилирования (например, миристиловая группа, миристиловая группа, фарнезиловая группа, геранилгераниловая группа, ОРГ-якорь и Ν-ацилдиглицеридная группа), представляют собой предпочтительные осуществления данного изобретения, поскольку, как правило, обеспечение таких якорей липоилирования в полученном рекомбинантным способом белке достаточно просто и единственно требует в случае аналога применения, например, природной сигнальной последовательности в качестве партнера слияния. Другая возможность представляет собой применение фрагмента С3б фактора С3 комплемента или самого фактора С3 (сравните Эетр^еу е1 а1., 1996, 8с1еисе 271, 348350 и Ьои&КоЫег, 1998, МПиге Вю1есйио1о§у. 16, 458-462).

- 14 011610

Альтернативное осуществление изобретения, которое также приводит к предпочтительной презентации иммунной системе множественных (например, по меньшей мере 2) копий важных регионов АРР или Аβ с эпитопами, представляет собой ковалентное связывание аналога с определенными молекулами, т.е. варианты й и е, указанные выше. Например, можно применять полимеры, например углеводы, такие как декстрин, сравните, например, Ьеек А. еХ а1., 1994, Уассте 12: 1160-1166; Ьеек А еХ а1., 1990, I. 1ттипо1. 145: 3594-3600, но манноза и маннан также представляют собой пригодные альтернативы. Интегральные мембранные белки, например, из Е.со11 и других бактерий также являются пригодными для конъюгации партнерами. Традиционные молекулы-носители, такие как гемоцианин морского блюдца (КЬН), анатоксин столбняка, дифтерийный анатоксин и бычий сывороточный альбумин (В8А), также являются предпочтительными и пригодными для конъюгации партнеров.

Предпочтительные осуществления ковалентного связывания вещества, полученного из АРР или Аβ, с полигидроксиполимерами, такими как углеводы, включают в себя применение по меньшей мере одного пептида, полученного из АРР или Аβ, и по меньшей мере одного чужеродного Т-хелперного эпитопа, которые раздельно связываются с полигидроксиполимером (т.е. чужеродный Т-хелперный эпитоп и полученная из АРР или Аβ аминокислотная последовательность не сливаются друг другом, но в значительной степени связываются с полигидроксиполимером, служащим в качестве несущего каркаса). С другой стороны, наиболее предпочтительным является такое осуществление, когда подходящие районы полученных из АРР или Аβ пептидов, несущие В-клеточный эпитоп, составлены посредством коротких отрезков пептидов, потому что данный подход представляет собой очень удобный путь для достижения множественной презентации выбранных эпитопов в конечном иммуногене. Однако можно также просто связывать аналоги, уже описанные здесь, с полигидроксиполимерным остовом, т.е. чтобы вещество, полученное из АРР или Аβ, не соединялось с остовом отдельно от чужеродных Т_Н-эпитопов.

Особенно предпочтительно, чтобы связывание чужеродного Т-хелперного эпитопа и полученного из АРР или Аβ (поли)пептида происходило посредством амидной связи, которую можно расщепить пептидазой. Данная стратегия обладает тем эффектом, что АРС смогут захватывать конъюгат и впоследствии осуществлять презентацию чужеродного Т-клеточного эпитопа в связи с МНС класса II.

Одним из путей достижения связывания пептидов (и полученных из АРР или Аβ представляющих интерес пептидов, также как и чужеродного эпитопа) является активация подходящего полигидроксиполимера трезильными (трифторэтилсульфонильными) группами или другими подходящими активирующими группами, такими как малеимид, паранитрофенилхлороформ (для активации ОН-групп и формирования пептидной связи между пептидом и полигидроксиполимером) и тозил (паратолуолсульфонил). Например, можно получить активированные полисахариды, как описано в АО 00/05316 и И8 5874469 (оба включены сюда посредством ссылки), и связать их с пептидами или полиаминокислотами, полученными из АРР или Аβ, а также с Т-клеточными эпитопами, полученными посредством стандартных способов пептидного синтеза в жидкой или твердой фазе. Полученный продукт состоит из полигидроксиполимерного остова (например, декстранового остова), который своими Ν-концами или другими азотными группами связан с полиаминокислотами, полученными из АРР или Аβ и из чужеродных Т-клеточных эпитопов. Если желательно, можно синтезировать пептиды АРР или Аβ так, чтобы защитить все доступные аминогруппы, кроме одной на Ν-конце, впоследствии связывая полученные защищенные пептиды с трезилированными группами декстрана и, в заключение, снимая защиту с полученного конъюгата. Конкретный пример такого подхода описан в примерах ниже.

Вместо применения водорастворимых молекул полисахарида, как изложено в АО 00/05316 и И8 5874469, в равной степени можно применять молекулы перекрестно-связанных полисахаридов, получая таким образом корпускулярные конъюгаты между полипептидами и полисахаридами, что, как полагают, ведет к улучшенной презентации полипептидов иммунной системе, так как достигаются две цели, а именно: получение эффекта локального накопления при инъекции конъюгата и получение частиц, являющихся более привлекательными мишенями для АРС. Данный подход с использованием таких систем также подробно рассматривается в примерах.

Рассуждения, лежащие в основе выбора областей для введения модификаций в АРР или Аβ, подразумевают а) сохранение известных и предсказанных В-клеточных эпитопов; Ь) сохранение третичной структуры; с) избежание презентации В-клеточных эпитопов на клетках-продуцентах и т.п. Во всяком случае, как обсуждалось выше, скрининг набора аналогов, все из которых были подвергнуты внесению Т-клеточного эпитопа в различные положения, является довольно простым.

Так как наиболее предпочтительные осуществления настоящего изобретения включают в себя понижающую регуляцию Аβ человека, следовательно, предпочтительно, чтобы полипептид АРР или Аβ, обсуждаемый выше, представлял собой полипептид Аβ человека. В данном осуществлении особенно предпочтительно, чтобы полипептиды АРР или Аβ являлись модифицированными путем замены по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в 8ЕЦ Ш N0:2, одной аминокислотной последовательностью с эквивалентной или отличной длиной и содержащей чужеродный Т_Н-эпитоп. Предпочтительные примеры модифицированных амилоидогенных АРР и Аβ схематически показаны на фиг. 1 с применением в качестве примеров эпитопов Р2 и Р30. Логическое обоснование таких конструк

- 15 011610 ций подробно обсуждается в примерах.

Более конкретно, содержащую Т_н аминокислотную последовательность, которую вносят в 8ЕЦ ГО N0:2, можно вносить с любой аминокислоты в 8ЕЦ ГО N0:2. То есть внесение возможно после любой из аминокислот в положениях 1-770, но предпочтительно после любой из аминокислот в положениях 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 в 8ЕО ГО N0:2. Это можно комбинировать с делецией любой или всех из аминокислот в положениях 1-671 или любой или всех из аминокислот в положениях 715-770. Кроме того, при использовании способа замены любую из аминокислот в положениях 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 в 8ЕЦ ГО N0:2 можно удалить вместе с данным внесением.

Другое осуществление настоящего изобретения связано с представлением аналогов, не содержащих никакой из подпоследовательностей 8ЕЦ ГО N0:2, которые продуктивно связываются с молекулами МНС класса II, инициируя Т-клеточный ответ.

Логическое обоснование такой стратегии для конструирования иммуногена, вовлекающего иммунную систему в индукцию, например иммунного ответа против Ав, состоит в следующем: отмечено, что при иммунизации многочисленными аутологичными белками, такими как Ав, составленными с адъювантом, которые достаточно сильны для нарушения толерантности организма к аутологичным белкам, существует опасность, что у тех же вакцинированных индивидов индуцированный иммунный ответ не сможет прекратиться просто в результате прекращения иммунизации. Это происходит потому, что индуцированный иммунный ответ у таких индивидов наиболее вероятно приводит в движение нативный Тн-эпитоп аутологичного белка, а это обладает тем неблагоприятным эффектом, что собственный белок вакцинированного индивида будет способен функционировать как иммуноген, таким образом установится аутоиммунное состояние.

В предпочтительных способах, включая применение чужеродных Т_н-эпитопов, являющихся лучшими по сведениям авторов данного изобретения, никогда не наблюдали получение данного эффекта, так как иммунный ответ против «своего» направляется чужеродным Т_н-эпитопом, а авторы настоящего изобретения неоднократно показывали, что индуцированный иммунный ответ, вызванный путем применения предпочтительной технологии, действительно уменьшался после прекращения иммунизации. Однако в теории у немногих индивидов может произойти так, что иммунный ответ также будет направляться аутологичным Тн-эпитопом соответствующего собственного белка, против которого иммунизировали, что особенно значимо, когда рассматривают собственные белки, являющиеся относительно многочисленными, такими как Ав, тогда как другие терапевтически значимые собственные белки присутствуют в организме только локально или в таких малых количествах, что эффект самоиммунизации невозможен. Одним из очень простых путей избежать этого является, следовательно, совершенный отказ от включения в иммуноген пептидных последовательностей, которые могут служить в качестве Тн-эпитопов (и так как пептиды короче примерно 9 аминокислот не могут служить Тн-эпитопами, использование более коротких фрагментов является одним из простых и выполнимых подходов). Следовательно, данное осуществление изобретения также служит для того, чтобы убедиться, что иммуноген не включает в себя пептидные последовательности целевых АРР или Ав, которые могут служить в качестве самостимулирующих Т_н-эпитопов, включая последовательности, которые просто содержат консервативные замены в последовательности целевого белка, который иначе может функционировать как Т_н-эпитоп.

Предпочтительные осуществления презентации иммунной системе аналогов АРР или Ав включают в себя применение химерного пептида, содержащего по меньшей мере один полученный из АРР или Ав пептид, который продуктивно не связывается с молекулами МНС класса II, и по меньшей мере один чужеродный Т-хелперный эпитоп. Более того, предпочтительно, чтобы полученный из АРР или Ав пептид нес В-клеточный эпитоп. Особенно предпочтительно, если иммуногенный аналог представляет собой аналог, где аминокислотные последовательности включают в себя один или несколько В-клеточных эпитопов, представленных либо как непрерывная последовательность, либо как содержащая вставки последовательность, где вставки включают в себя чужеродные Т-хелперные эпитопы.

С другой стороны, наиболее предпочтительным является такое осуществление, когда подходящие районы, полученные из пептидов АРР или Ав, несущие В-клеточный эпитоп, составлены посредством коротких пептидных отрезков, которые никак не способны продуктивно связаться с молекулой МНС класса II. Выбранный В-клеточный эпитоп или эпитопы амилоидогенного полипептида должны, следовательно, включать в себя не более 9 последовательных аминокислот 8ЕЦ ГО N0:2. Предпочтительными являются более короткие пептиды, такие как пептиды, имеющие не более 8, 7, 6, 5, 4 или 3 последовательных аминокислот аминокислотной последовательности амилоидогенного полипептида.

- 16 011610

Предпочтительно, чтобы аналог включал в себя по меньшей мере одну подпоследовательность 8>Е0 ΙΌ N0:2, так, чтобы каждая из таких по меньшей мере одной подпоследовательностей независимо состояла из аминокислотных отрезков АРР или Ав, выбранных из группы, состоящей из 9, 8, 7, 6, 5, 4 и 3 последовательных аминокислот.

Особенно предпочтительно, чтобы последовательные аминокислоты начинались с аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из остатков 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713 и 714 8Ер ГО N0:2.

Вакцинация белком/пептидом; препараты и введение аналогов.

Когда осуществляют презентацию аналога иммунной системе животного посредством его введения животному, препараты полипептида отвечают требованиям, общепринятым в данной области.

Получение вакцин, содержащих в качестве активных ингредиентов последовательности пептидов, в общих чертах хорошо разработаны в данной области, как проиллюстрировано патентами США 4608251, 4601903, 4599231, 4599230, 4596792 и 4578770, которые все включены сюда посредством ссылки. Обычно такие вакцины получают как препараты для инъекций или как жидкие растворы или суспензии; также можно получить твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препараты также можно эмульгировать. Активный иммуногенный ингредиент часто смешивают с наполнителями, являющимися фармацевтически допустимыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящие наполнители представляют собой, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин, этанол и т.п. и их комбинации. Кроме того, если желательно, вакцина может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как увлажнители или эмульгаторы, буферные средства для стабилизации рН или адъюванты, увеличивающие эффективность вакцин; сравните подробное обсуждение адъювантов ниже.

Обычно вакцины вводят парентерально, посредством инъекции, например или подкожно, или внутривенно, или внутримышечно. Дополнительные препараты, которые подходят для других способов введения, включают в себя суппозитории и в некоторых случаях оральные, буккальные, сублингвальные, интраперитонеальные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и интракраниальные препараты. Для суппозиториев стандартные связывающие средства и носители могут включать в себя, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории можно формировать из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне от 0,5 до 10%, предпочтительно 1-2%. Оральные препараты включают в себя такие обычно применяемые наполнители, как, например, маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия, целлюлозу, карбонат магния фармацевтических степеней очистки и т.п. Данные композиции принимают формы растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов с замедленным высвобождением или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 20-70%. Для оральных препаратов подходящим компонентом для составления композиции (и также возможным компонентом для конъюгации) является холерный токсин.

Полипептиды можно формировать в вакцины в виде нейтральных форм или в виде солей. Фармацевтически допустимые соли включают в себя кислые аддитивные соли (образуемые со свободными аминогруппами пептида) и те соли, которые образуются с неорганическими кислотами, такими, например, как соляная или фосфорная кислоты, или с такими органическими солями, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образуемые со свободными карбоксильными группами, также можно получить при помощи неорганических оснований, например, таких как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т. п.

Вакцины вводят способом, совместимым с дозировкой препарата, и в таком количестве, которое терапевтически эффективно и иммуногенно. Количество для введения зависит от субъекта, подлежащего лечению, включая, например, способность иммунной системы индивида устанавливать иммунный ответ и степень необходимой защиты. Подходящие диапазоны дозировок находятся в пределах примерно нескольких сотен микрограммов активного ингредиента на вакцинацию с предпочтительным диапазоном примерно от 0,1 до 2000 мкг (хотя рассматривают и большие количества в диапазоне 1-10 мг), например в диапазоне примерно от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в диапазоне от 1 до 500 мкг и особенно в диапазоне примерно от 10 до 100 мкг. Подходящие режимы для начального введения и поддерживающих доз также варьируют, но определяются начальным введением с последующими дальнейшими прививками или другими видами введения.

Способ применения может широко варьировать. Применим любой из традиционных способов введения вакцины. Они включают в себя оральное применение на твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентерально, посредством инъекции и т. п. Дозировка вакцины будет зависеть от способа введения и будет варьировать в зависимости от возраста субъекта, подвергающегося вакцинации, и состава антигена.

Некоторые из полипептидов вакцины достаточно иммуногенны в вакцине, но для некоторых других иммунный ответ усилится, если вакцина будет дополнительно содержать активизирующее вещество.

- 17 011610

Для вакцин известны различные способы достижения активизирующего эффекта. Основные принципы и способы хорошо разработаны в ТНе Тйеогу апб РгасОса1 Лрр11са11оп о£ ЛбщуагИк. 1995, Эппсам Е.8. 81е\\'аг1-Ти11 (еб.), бо11п ЭД11еу&8оп5 Иб., Ι8ΒΝ 0-471-95170-6, а также в Уассшек: Ν™ Оепегабопп 1штипо1од1са1 Αб^иνапΐк, 1995, Огедопабк О. е! а1. (ебк.), Р1епит Ргекк, №\ν Уогк, Ι8ΒΝ 0-306-45283-9, включенных сюда посредством ссылки.

Особенно предпочтительно применять адъювант, который, как может быть показано, способствует нарушению аутотолерантности к аутоантигенам; фактически это существенно в случаях, когда в качестве активного ингредиента в аутовакцине применяют немодифицированный амилоидогенный полипептид. В качестве неограничивающих примеров подходящие адъюванты выбирают из группы, состоящей из адъюванта, нацеливающего иммунитет; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и производные микобактерий; масляного состава; полимера; адъюванта, формирующего мицеллы; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикс 18СОМ); частицы; ΌΌΑ; адъювантов на основе алюминия; адъювантов на основе ДНК; γ-инулина и инкапсулирующего адъюванта. В общих чертах необходимо отметить, что описания выше, которые относились к соединениям и средствам, пригодным как первая, вторая и третья группы в аналогах, с соответствующими изменениями также относятся к их использованию в адъюванте вакцины согласно изобретению.

Возможное использование адъювантов включает в себя применение таких средств, как гидроксид или фосфат алюминия (квасцы), обычно применяемый как 0,05-0,1%-ный раствор в забуференном солевом растворе, примесь с синтетическими полимерами сахаров (например, СаГЬоро1®), применяемая как 0,25%-ный раствор, агрегацию белков в вакцине посредством воздействия тепла с температурным диапазоном от 70 до 101°С в течение периода от 30 с до 2 мин соответственно, а также агрегацию посредством структурирующих веществ. Также можно применять агрегацию альбумина посредством реактивации обработанных пепсином антител (РаЬ-фрагментов), смесь с бактериальными клетками, такими как

С.рагуит, или эндотоксинами, или компонентами липополисахаридов грамотрицательных бактерий, эмульсию в физиологически допустимых масляных носителях, таких как маннидмоноолеат (Απ^1 А) или эмульсию с 20%-ным раствором перфторуглерода (Р1иοкο1-^Α), применяемым как блокирующий заместитель. Смесь с маслами, такими как сквален и ΙΡΑ, также предпочтительна.

Согласно данному изобретению ΌΌΑ (бромид диметилдиоктадециламмония) является интересующим кандидатом для адъюванта, как и ДНК и γ-инулин, но полный и неполный адъюванты Фрейнда, а также сапонины килайи, такие как Οηί1Α и 0821, также интересны, как и ΡΙΒΙ. Дополнительными возможностями являются монофосфолипид Α (МРЬ), указанные выше С3 и С3б и мурамилдипептид (МЭР).

Известно, что препараты липосом дают эффекты адъювантов, следовательно, адъюванты в виде липосом предпочтительны согласно изобретению.

Предпочтительными альтернативами согласно изобретению также являются адъюванты в виде иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикс 18СОМ®), особенно потому, что показано, что данный тип адъювантов способен к повышающей регуляции экспрессии МНС класса II ЛРС. Матрикс 18СОМ® состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов (тритерпеноиды) из Ош11а)а каропапа, холестерина и фосфолипида. Когда это смешивают с иммуногенным белком, получающийся препарат из частиц представляет собой то, что известно как частица 18СОМ, где сапонин составляет 60-70% (мас./мас.), холестерин и фосфолипид составляют 10-15% (мас./мас.) и белок составляет 10-15% (мас./мас.) Подробности, относящиеся к композиции и применению иммуностимулирующих комплексов, можно найти, например, в указанных выше учебниках, посвященных адъювантам, но у Могеш В. е! а1., 1995, С1ш. 1ттипо1йег. 3: 461-475, также как и у Βπγγ Ι.Ο. апб Мйсйе11 О.Р., 1996, 1ттипо1., апб Се11. ΒώΡ 74: 8-25 (включенных сюда посредством ссылки) также предоставлены пригодные инструкции для получения полных иммуностимулирующих комплексов.

Другая очень интересная (а значит, предпочтительная) возможность достижения эффекта адъюванта связана с применением способа, описанного Ооккейп е! а1., 1992 (что, таким образом, включено сюда посредством ссылки). Кратко, презентацию соответствующего антигена, такого как антиген согласно настоящему изобретению, можно усилить посредством конъюгации антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против рецепторов Ρсγ на моноцитах/макрофагах. Показано, что иммуногенность для целей вакцинации особенно усиливают конъюгаты между антигеном и анти-Рс^Ш.

Другие возможности включают в себя применение нацеливающих и иммуномодулирующих веществ (например, цитокинов), указанных выше как кандидаты для первой и второй групп в модифицированных версиях амилоидогенных полипептидов. В связи с этим возможностями также являются синтетические индукторы цитокинов, такие как поли 1:С.

Подходящие производные микобактерий выбраны из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фрейнда, Κ1ΒΙ и сложных диэфиров трегалозы, таких как ТОМ или ТЭЕ.

Походящие нацеливающие иммунитет адъюванты выбирают из группы, состоящей из лиганда СЭ40 и антител к СЭ40 или их специфически связывающихся фрагментов (сравните обсуждение выше), маннозы, РаЬ-фрагмента и ΟΈΑ- 18 011610

Походящие полимерные адъюванты выбирают из группы, состоящей из углеводов, таких как декстран, РЕС, крахмал, маннан и манноза; пластических полимеров и латекса, такого как латексные гранулы.

Еще один интересный путь модуляции иммунного ответа представляет собой включение иммуногена (необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически допустимыми носителями) в виртуальный лимфатический узел (ΥΕΝ) (патентованное медицинское устройство разработано в 1штипоТйегару, 1пс., 360 Ьех1пд!оп Ауепие, Νονν Уогк, ΝΥ 10017-6501). ΥΕΝ (тонкое трубчатое устройство) имитирует структуру и функцию лимфатического узла. Внесение ΥΕΝ под кожу создает участок стерильного воспаления с повышением уровня цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, также как и АРС, быстро отвечают на сигналы о повреждении, направляются к участку воспаления и накапливаются внутри пористого матрикса ΥΕΝ. Показано, что необходимая доза антигена, требуемая для установления иммунного ответа на антиген при применении ΥΕΝ, уменьшена и что иммунопротекция, вызванная иммунизацией с применением ΥΕΝ, превышает стандартную иммунизацию с применением в качестве адъюванта К1В1. Технология кратко описана Се1Ьег С. е! а1., 1998, Ейсйайоп о£ КоЬик! Се11и1аг апб Нитога1 1ттипе Кекропкек !о 8та11 Атоип!к о£ 1ттиподепк Икшд а №уе1 Меб1са1 Эеу1се Оекщпа1еб 11;е У1йиа1 Ьутрй №бе. Егот Не ЬаЬога!огу !о Не Сйшс, Воок о£ АЬк!гас!к, ОсЮЬег 12-15'¹', 1998, 8еаксаре Некой, Ар!ок, СаШогша.

Показано, что препараты вакцин в виде микрочастиц во многих случаях увеличивают иммуногенность белковых антигенов, а следовательно, представляют собой другое предпочтительно осуществление изобретения. Микрочастицы изготавливают либо как композиции вместе с полимером, липидом, углеводом или другими молекулами, подходящими для изготовления частиц, либо микрочастицы могут представлять собой гомогенные частицы, состоящие только из самого антигена.

Примеры микрочастиц, основанных на полимерах, представляют собой частицы, основанные на РЬСА и РУР (6ир!а, К.К. е!. а1. 1998), где полимер и антиген конденсируют в твердую частицу.

Частицы на основе липидов можно изготовить как мицеллы из липида (так называемые липосомы), захватывая антиген в мицеллу (Р1е!гоЬоп, Р.1. 1995). Частицы на основе углевода обычно изготавливают из подходящего распадающегося углевода, такого как крахмал или хитозан. Углевод и антиген смешивают и конденсируют в частицы в процессе, подобном тому, что применяют для полимерных частиц (Как, Н.8. е! а1. 1997).

Частицы, состоящие только из антигена, можно изготавливать различными способами распыления или сушки вымораживанием. Для целей настоящего изобретения особенно подходит способ сверхкритической жидкости, который применяют для изготовления очень однородных частиц контролируемого размера (Уогк, Р. & 8йекипоу, В. е! а1., 1999).

Ожидается, что вакцину следует вводить 1-6 раз в год, т.е. 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз в год, нуждающемуся в этом индивиду. Ранее показано, что иммунологическая память, индуцированная применением предпочтительных аутовакцин согласно данному изобретению, не является постоянной, и, следовательно, иммунная система нуждается в периодической провокации иммунного ответа амилоидогенным полипептидом или модифицированными амилоидогенными полипептидами.

Вследствие генетического разнообразия различные индивиды могут реагировать на один и тот же полипептид иммунным ответом различной силы. Следовательно, вакцина согласно изобретению может содержать несколько различных полипептидов для увеличения иммунного ответа, сравните также обсуждение выше, касающееся выбора введений чужеродного Т-клеточного эпитопа. Вакцина может включать в себя два или несколько полипептидов, где все полипептиды представляют собой такие, как определено выше.

Следовательно, вакцина может включать в себя 3-20 различных модифицированных или немодифицированных полипептидов, например 3-10 различных пептидов.

Вакцинация нуклеиновой кислотой.

В качестве альтернативы классическому введению вакцины на основе белка технология вакцинации нуклеиновой кислотой (также известная как иммунизация нуклеиновой кислотой, генетическая иммунизация и генная иммунизация) предлагается ряд привлекательных особенностей.

Прежде всего, в противоположность традиционному подходу к вакцинации, вакцинация нуклеиновой кислотой не нуждается в ресурсах, требующих широкомасштабного производства иммуногена (например, в промышленном масштабе ферментации микроорганизмов, продуцирующих амилоидогенные полипептиды). Более того, нет необходимости в устройствах по очистке и схемах рефолдинга иммуногена. И, наконец, так как при вакцинации нуклеиновой кислотой для продукта экспрессии внесенной нуклеиновой кислоты полагаются на биохимический аппарат вакцинируемого индивида, ожидается, что произойдет оптимальный посттрансляционный процессинг экспрессируемого продукта; это особенно важно в случае аутовакцинации, поскольку, как указано выше, в модифицированной молекуле необходимо сохранить значительную часть исходных В-клеточных эпитопов и поскольку В-клеточные эпитопы в принципе можно составить из частей любой (биологической) молекулы (например, углевода, липида, белка и т. п.). Следовательно, естественные профили гликозилирования и липоилирования иммуногена могут быть очень важным для общей иммуногенности, а это лучше всего обеспечить, если в качестве продуцента иммуногена использовать хозяина.

- 19 011610

Следовательно, предпочтительное осуществление вариантов а)-с) согласно изобретению включает в себя эффективную презентацию аналога иммунной системе посредством внесения нуклеиновых(ой) кислот(ы), кодирующих(ей) аналог, в клетки животного и таким образом получения экспрессии введенных(ой) нуклеиновых(ой) кислот(ы) клетками ίη νίνο.

В данном осуществлении введенная нуклеиновая кислота предпочтительно представляет собой ДНК, которая может находиться в форме чистой ДНК; ДНК, объединенной с заряженными или незаряженными липидами; ДНК, помещенной в липосомы; ДНК, включенной в вирусный вектор; ДНК, объединенной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом; ДНК, объединенной с нацеливающим белком или полипептидом; ДНК, объединенной с осаждающими кальций агентами; ДНК, связанной с инертной молекулой-носителем; ДНК, инкапсулированной в полимер, например в РЬСА (сравните способ микроинкапсуляции, описанный в νΟ 98/31398), или хитин, или хитозан; и ДНК, объединенной с адъювантом. В данном контексте следует отметить, что практически все рассмотренные варианты, имеющие отношение к применению адъювантов в препаратах традиционных вакцин, применяются и в препаратах вакцин из ДНК. Следовательно, все описания, которые здесь относятся к применению адъювантов, в контексте вакцин на основе полипептидов с необходимыми изменениями применяют для использования в способе вакцинации нуклеиновыми кислотами.

Пути введения и схемы введения вакцин на основе полипептидов, детализированные выше, также применимы для вакцин на основе нуклеиновых кислот согласно изобретению и все обсуждения выше, имеющие отношение к путям и схемам введения полипептидов, с соответствующими изменениями применяют к нуклеиновым кислотам. К этому необходимо добавить, что вакцины на основе нуклеиновых кислот можно соответствующим образом вводить внутривенно и внутриартериально. Более того, в данной области хорошо известно, что вакцины на основе нуклеиновых кислот можно вводить посредством применения так называемой генной пушки и, следовательно, данный и эквивалентные способы введения рассматривают как часть настоящего изобретения. Наконец, как сообщалось, применение для введения нуклеиновых кислот УБЫ также дает хорошие результаты, и, следовательно, данный конкретный способ введения является особенно предпочтительным.

Кроме того, нуклеиновая(ые) кислота(ы), применяемая(ые) как средства для иммунизации, могут содержать области, кодирующие 1-, 2- и/или 3-ю группы, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, рассмотренные в качестве пригодных адъювантов. Предпочтительная версия данного осуществления связана с кодирующим районом для аналога и кодирующим районом для иммуномодулятора в различных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем различных промоторов. Таким образом, избегают того, чтобы аналог или эпитоп продуцировались как партнеры слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, можно использовать два отдельных нуклеотидных фрагмента, но это менее предпочтительно ввиду преимущества, обеспечиваемого совместной экспрессией, когда оба кодирующих района включены в одну молекулу.

Таким образом, изобретение также относится к композиции для индуцирования продукции антител против АРР или Аβ, которая включает в себя фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор согласно изобретению (сравните обсуждение векторов ниже) и фармацевтически и иммунологически допустимый носитель и/или адъювант, как обсуждалось выше.

В нормальных условиях кодирующую вариант нуклеиновую кислоту вносят в виде вектора, где экспрессия находится под контролем вирусного промотора. Более детальное обсуждение векторов согласно изобретению будет проведено ниже. Также подробные описания, относящиеся к формированию и применению вакцин на основе нуклеиновых кислот, сравните Эоппе11у ί.ί. с1 а1., 1997, Аппи. Вет. Iттиηο1. 15: 617-648 и ЭоппеПу И е1 а1., 1997, ЫГе Заепсез 60: 163-172. Обе данные ссылки включены сюда посредством ссылки.

Живые вакцины.

Третья альтернатива для эффективной презентации аналогов иммунной системе, как определено в вариантах а)-с), представляет собой применение способа живых вакцин. В вакцинации живыми вакцинами презентацию иммунной системе осуществляют посредством введения животному непатогенных микроорганизмов, которые можно трансформировать фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим аналог, или вектором, включающим в себя такой фрагмент нуклеиновой кислоты. Непатогенный микроорганизм может представлять собой любой подходящий аттенуированный бактериальный штамм (аттенуированный посредством пассажей или путем удаления экспрессирующихся патогенных продуктов посредством технологии рекомбинантных ДНК), например ВСС, МусоЬас1егшт Βονίδ, непатогенные 81гер1ососсиз зрр., Е.соБ, 8а1топе11а зрр., У1Ьпо с1ю1егае. 8Ыде11а и т.п. Обзоры, посвященные получению реальных живых вакцин, можно, например, найти у 8а1юи Р., 1995, Вет. Рга1. 45: 1492-1496 и Vа1ке^Р.Э., 1992, Уассте 10: 977-990, оба из которых включены сюда посредством ссылки.

Для подробностей о фрагментах нуклеиновой кислоты и векторах, применяемых в таких живых вакцинах, сравните обсуждение ниже.

В виде альтернативы бактериальным живым вакцинам фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению, обсуждаемый ниже, можно ввести в невирулентный вектор вирусной вакцины, такой как

- 20 011610 штамм коровьей оспы, или любой другой подходящий вирус оспы.

Обычно непатогенный микроорганизм или вирус животному вводят только однажды, но в некоторых случаях может быть необходимо введение микроорганизма более одного раза в течение жизни для сохранения защитного иммунитета. Даже предполагают, что детализованные выше схемы иммунизации для вакцинации полипептидами будут пригодны для применения живых или вирусных вакцин.

Альтернативно, вакцинацию живыми вакцинами или вирусами комбинируют с предыдущей или последующей вакцинацией полипептидами и/или нуклеиновыми кислотами. Например, можно произвести первичную иммунизацию живой или вирусной вакциной с последующей поддерживающей иммунизацией с применением подхода на основе полипептида или нуклеиновой кислоты.

Микроорганизм или вирус можно трансформировать нуклеиновой(ыми) кислотой(ами), содержащей районы, кодирующие 1-, 2- и/или 3-ю группы, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, рассмотренные в качестве пригодных адъювантов. Предпочтительная версия данного осуществления связана с кодирующим районом для аналога и кодирующим районом для иммуномодулятора в различных рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем различных промоторов. Таким образом, избегают того, чтобы аналог или эпитоп продуцировался как партнер слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, в качестве трансформирующих средств можно использовать два отдельных нуклеотидных фрагмента. Конечно, наличие 1-, и/или 2-, и/или 3-й групп в одной и той же рамке считывания может обеспечить аналог согласно изобретению как продукт экспрессии и такое осуществление особенно предпочтительно в настоящем изобретении.

Применение способа согласно изобретению для лечения заболевания.

Как можно понять из обсуждения выше, предоставление способа согласно изобретению позволяет контролировать заболевания, характеризующиеся накоплениями амилоида. В данном контексте АО представляет собой ключевую цель способа согласно изобретению, но другие заболевания, характеризующиеся отложениями амилоида, содержащими Ав, также являются достижимыми целями. Следовательно, важное осуществление способа согласно изобретению для понижающей регуляции амилоидной активности включает в себя лечение, и/или профилактику, и/или улучшение состояния АО или других заболеваний, характеризующихся накоплением амилоида, способ включает в себя понижающую регуляцию АРР или Ав способом согласно изобретению до такой степени, чтобы значительно уменьшалось количество амилоида.

Особенно предпочтительно, чтобы уменьшение амилоида приводило к изменению баланса между формированием и деградацией/удалением амилоида, т.е. скорость деградации/удаления амилоида доведена до степени, когда она превышает скорость формирования амилоида. Посредством тщательного контроля количества и иммунологического воздействия иммунизаций нуждающегося в этом индивида можно со временем достичь баланса, приводящего к уменьшению нетто накоплений амилоида без избыточных неблагоприятных эффектов.

Альтернативно, если способ согласно изобретению не эффективен в удалении или уменьшении существующих отложений амилоида у индивида, его можно применять для получения клинически значимого уменьшения формирования нового амилоида, таким образом значительно удлиняя период, до которого состояние болезни не ухудшится. Следует иметь возможность контролировать скорость накопления амилоида или путем измерения сывороточной концентрации амилоида (которая, как полагают, находится в равновесии с веществом в накоплениях), или с помощью позитронно-эмиссионного томографического (РЕТ) сканирования, сравните 8та11 С.\У.. е! а1., 1996, Апп. Ν.Υ. Асай. 8с1. 802: 70-78.

Другие заболевания и состояния, где можно применять настоящие средства и способы для лечения или облегчения состояния аналогичным способом, упомянуты выше в предпосылках изобретения или перечислены ниже в разделе Другие амилоидные заболевания и белки, ассоциированные с ними.

Пептиды, полипептиды и композиции согласно изобретению.

Как видно из указанного выше, настоящее изобретение основано на концепции иммунизации индивидов против антигена АРР или Ав для получения уменьшенного количества связанных с патологией накоплений амилоида. Предпочтительный путь достижения такой иммунизации представляет собой применение описанных здесь аналогов с предоставлением, таким образом, молекул, ранее не описанных в данной области.

Полагают, что обсуждаемые здесь аналоги являются объектом изобретения сами по себе, и, следовательно, важная часть изобретения относится к описанным выше аналогам. Следовательно, любое представленное здесь описание, относящееся к модифицированному АРР или Ав, является релевантным для целей описания амилоидогенных аналогов согласно изобретению, также как и любые такие описания, наоборот, применимы к описанию указанных аналогов.

Необходимо отметить, что предпочтительные модифицированные молекулы АРР или Ав включают в себя модификации, приводящие к образованию полипептида, обладающего степенью идентичности последовательности с АРР или Ав, составляющей по меньшей мере 70%, или с их подпоследовательностью длиной по меньшей мере 10 аминокислот. Более высокая степень идентичности последовательности, например по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80, 85, 90 или 95%, является предпочти- 21 011610 тельной. Идентичность последовательности для белков и нуклеиновых кислот можно вычислить как (Н._е[-Н|,г)· 100/Ы_ге£, где Ν,_||Γ представляет собой общее число неидентичных остатков в двух последовательностях при выравнивании и Ν_Γ(,_£ представляет собой число всех остатков в одной из последовательностей. Так, последовательность ДНК ΑΟΊΌΑΟΊΌ имеет степень идентичности с последовательностью ААТСААТС, составляющую 75% (Ν_|1ί=2 и Ν_κί=8).

Изобретение также относится к композициям, которые можно использовать при реализации способа согласно изобретению. Следовательно, изобретение также относится к иммуногенной композиции, включающей в себя иммуногенно эффективное количество описанного выше аналога, причем указанная композиция дополнительно включает в себя фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или носитель, и/или наполнитель и, необязательно, адъювант. Иными словами, эта часть изобретения относится к композициям аналогов, в основном как описано выше. Таким образом, когда выбор адъювантов и носителей относится к композиции модифицированного или немодифицированного амилоидогенного полипептида для применения в способе согласно изобретению для понижающей регуляции АРР или Аβ, он находится в соответствии с тем, что обсуждалось выше.

Полипептиды получают в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Более протяженные полипептиды обычно получают посредством технологии рекомбинантных генов, включающей в себя введение последовательности аминокислот, кодирующей аналог, в подходящий вектор, трансформацию данным вектором подходящей клетки-хозяина, экспрессию данной клеткой-хозяином последовательности нуклеиновых кислот, извлечение продукта экспрессии из клеток-хозяев или их супернатанта и последующую очистку и, необязательно, дополнительную модификацию, например рефолдинг или дериватизацию.

Более короткие пептиды предпочтительно получают посредством хорошо известных способов твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза. Однако недавние достижения в данной технологии создали возможность получения посредством данных способов полноразмерных полипептидов и белков, и, следовательно, получение длинных конструкций посредством синтетических способов также не выходит за рамки настоящего изобретения.

Фрагменты нуклеиновой кислоты и векторы согласно изобретению.

Из предыдущего описания понятно, что аналоги полиаминокислот можно получить посредством технологии рекомбинантных генов, а также посредством химического синтеза или полусинтеза; последние две альтернативы особенно значимы, когда модификация заключается в связывании с белковыми носителями (такими как КЬН, дифтерийный анатоксин, анатоксин столбняка и Β8Α) и небелковыми молекулами, такими как углеводные полимеры, а также, конечно, когда модификация включает в себя добавление боковых цепей или боковых групп к пептидной цепи, полученной из АРР или Аβ.

Для цели технологии рекомбинантных генов, а также, конечно, для цели иммунизации нуклеиновой кислотой фрагменты нуклеиновой кислоты, кодирующие аналоги, представляют собой важные химические продукты. Следовательно, важная часть изобретения относится к фрагментам нуклеиновой кислоты, кодирующим аналог согласно изобретению, т.е. полипептид, полученный из АРР или Аβ, включающий в себя или природную последовательность, к которой добавляют или в которую вставляют партнер слияния, или предпочтительно полученный из АРР или Αβ полипептид, в который посредством вставки и/или добавления, предпочтительно посредством замены и/или делеции, ввели чужеродный Т-клеточный эпитоп. Фрагменты нуклеиновой кислоты согласно изобретению представляют собой фрагменты ДНК или РНК.

Фрагменты нуклеиновой кислоты согласно изобретению обычно вставляют в подходящие векторы для образования клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих фрагменты нуклеиновой кислоты согласно изобретению; такие новые векторы также представляют собой часть изобретения. Подробности, относящиеся к конструированию таких векторов согласно изобретению, будут обсуждаться ниже в связи с трансформированными клетками и микроорганизмами. Векторы, в зависимости от цели и типа применения, могут существовать в виде плазмид, фагов, космид, минихромосом или вируса, но «оголенная» ДНК, которая транзитно экспрессируется только в определенных клетках, также является важным вектором. Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы согласно изобретению способны к автономной репликации, таким образом создавая возможность получения большого числа копий для целей высокоуровневой экспрессии или высокоуровневой репликации для последующего клонирования.

Основная схема вектора согласно изобретению включает в себя следующие элементы в направлении 5^3' и в функциональном соединении: промотор для управления экспрессией фрагмента нуклеиновой кислоты согласно изобретению; необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, делающий возможной секрецию (в экстрацеллюлярную фазу или, когда применимо, в периплазму) полипептидного фрагмента или его интеграцию в мембрану; фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению и, необязательно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая терминатор. При оперировании экспрессирующими векторами в штаммах-продуцентах или клеточных линиях в целях генетической стабильности трансформированной клетки предпочтительно, чтобы

- 22 011610 вектор при введении в клетку-хозяина интегрировался в геном клетки-хозяина. Напротив, при работе с векторами, применяющимися для осуществления экспрессии у животного ίη νίνο (например, при применении вектора в вакцинации ДНК), по соображениям безопасности предпочтительно, чтобы вектор был неспособен к интеграции в геном клетки-хозяина; обычно применяют «оголенную» ДНК или неинтегрирующиеся векторы, выбор которых хорошо известен специалистам в данной области.

Векторы согласно изобретению применяют для трансформации клеток-хозяев для получения аналога согласно изобретению. Такие трансформированные клетки могут представлять собой культивируемые клетки или клеточные линии, применяемые для размножения фрагментов нуклеиновой кислоты и векторов согласно изобретению или применяемые для рекомбинантного получения аналогов согласно изобретению. Альтернативно, трансформированные клетки могут представлять собой штаммы живых вакцин, где фрагмент нуклеиновой кислоты (одна единственная или несколько копий) вставлен так, что осуществляет секрецию или интеграцию аналога в бактериальную мембрану или клеточную стенку.

Предпочтительные трансформированные клетки согласно изобретению представляют собой микроорганизмы, такие как бактерии (такие как виды ЕксйепсЫа [например, Е.со11], ВасШик [например, Вас111и8 киЬййк], 8а1топе11а или МусоЬас1епит [предпочтительно непатогенные, например, ВС6 М.Ьо\'15|). дрожжи (например, 8ассНаготусе5 сегеуыае) и простейшие животные. Альтернативно, трансформированные клетки получают из многоклеточного организма, например гриба, клетки насекомого, клетки растения или клетки млекопитающего. Наиболее предпочтительными являются клетки, полученные от человека, сравните обсуждение клеточных линий и векторов ниже. Последние результаты в лаборатории авторов свидетельствуют о перспективах применения для рекомбинантного получения полипептидов коммерчески доступной линии Бгокорййа те1апода51ег (клеточная линия и векторная система 8сЬпе1бег 2 (82), доступная в 1№Йгодеп), и, следовательно, данная экспрессирующая система особенно предпочтительна.

Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированные клетки были способны реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Клетки, экспрессирующие фрагмент нуклеиновой кислоты, являются предпочтительно полезными осуществлениями данного изобретения; их можно использовать для ограниченного или широкомасштабного получения аналога согласно изобретению или, в случае непатогенных бактерий, в качестве вакцинных составляющих в живой вакцине.

При получении аналогов согласно изобретению посредством трансформированных клеток удобно, хоть это и отдаляет от сути, чтобы продукты экспрессии или экспортировались наружу в среду культивирования, или находились на поверхности трансформированной клетки.

Когда эффективные клетки-продуценты идентифицированы, на их основе предпочтительно создать стабильную клеточную линию, несущую вектор согласно изобретению и экспрессирующую фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный амилоидогенный полипептид. Предпочтительно, чтобы данная стабильная клеточная линия секретировала или несла аналог согласно изобретению, таким образом облегчая его очистку.

Как правило, плазмидные векторы, содержащие репликон и контрольные последовательности, полученные из видов, совместимых с клеткой-хозяином, применяют в связи с хозяевами. Вектор обычно несет сайт репликации, а также маркерные последовательности, способные обеспечить селекцию трансформированных клеток по фенотипу. Например, Е.сой обычно трансформируют с применением рВК.322, плазмиды, полученной из вида Е.сой (например, см. Войуат е1 а1., 1977). Плазмида рВК.322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину и таким образом обеспечивает простые средства для идентификации трансформированных клеток. Плазмида рВВ или другая плазмида микроорганизмов или фаг должна также содержать - или же ее необходимо модифицировать так, чтобы она содержала - промоторы, которые прокариотический микроорганизм может использовать для экспрессии.

Такие промоторы, чаще всего применяемые для конструирования рекомбинантной ДНК, включают в себя системы В-лактамазного и лактозного промоторов (Сйапд е1 а1., 1978; Никита е1 а1., 1977; Соеббе1 е1 а1., 1979) и систему триптофанового (Пр) промотора (Соеббе1 е1 а1., 1979; ЕР-А-0036776). Хотя они и являются наиболее часто применяемыми, обнаружены и применяются также и другие промоторы микроорганизмов и опубликованы детали, относящиеся к их нуклеотидным последовательностям, позволяя специалистам функционально лигировать их с плазмидными векторами (81еЬ\теп115( е1 а1., 1980). Определенные гены прокариот могут эффективно экспрессироваться в Е.сой с ее собственной промоторной последовательности, предотвращая необходимость добавления другого промотора искусственными способами.

Кроме прокариотических, можно применять и эукариотические микроорганизмы, такие как дрожжевые культуры, и здесь промотор должен быть способен направлять экспрессию. 8ассйаготусе§ сегеνίδίΒ^, или обыкновенные пекарские дрожжи, из эукариотических микроорганизмов применяют наиболее часто, хотя также доступен и ряд других штаммов. Для экспрессии в 8ассйаготусе§ обычно применяют, например, плазмиду УНр7 (8йпсйсотЬ е1 а1., 1979; Ктдктап е1 а1., 1979; Тксйетрег е1 а1., 1980). Данная плазмида уже содержит ген 1гр 1, являющийся селективным маркером для мутантного штамма дрожжей, лишенных способности расти на триптофане, например, АТСС № 44076 или РЕР4-1 (1опе§, 1977). Наличие повреждения 1гр1, как характеристики генома дрожжевой клетки-хозяина, предоставляет

- 23 011610 эффективное условие для обнаружения трансформации посредством роста в отсутствие триптофана.

Подходящие промоторные последовательности у дрожжевых векторов включают в себя промоторы для 3-фосфоглицераткиназы (Нйхшап с1 а1., 1980) или других гликолитических ферментов (Незз с1 а1., 1968; Но11апб с1 а1., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. Для обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации желательно, чтобы при конструировании подходящих экспрессирующих плазмид экспрессировались терминирующие последовательности, ассоциированные с данными генами, также лигированные в З'-конец последовательности экспрессирующего вектора.

Другие промоторы, обладающие дополнительным преимуществом транскрипции, контролируемой условиями роста, представляют собой промоторные регионы алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов деградации, ассоциированных с метаболизмом азота и указанной выше глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящим является любой плазмидный вектор, содержащий промотор, подходящий для дрожжей, участок начала репликации и последовательности терминатора.

Кроме микроорганизмов, в качестве хозяев можно применять культуры клеток, полученных из многоклеточных организмов. В принципе любая такая клеточная культура является возможной, будь то культура из позвоночных или беспозвоночных. Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, а размножение клеток позвоночных в культуре (тканевая культура) в последние годы стало обычным способом (Т1ззие СиНигс. 1973). Примерами таких пригодных линий клеток-хозяев являются клетки УЕКО и НеЬа, линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) и А138, ВНК, СОЗ-7 293, клетки 8робор1ега Ггидрегба (8Е) (коммерчески доступные как завершенные экспрессирующие системы, кроме прочего, в Рто1еш Заепсез, 1000 Везеатсй Ратк^ау, Мепбеп, СТ 06450, И.8.Л. и в ΙηνίίΓΟβοη) и клеточные линии МОСК. Наиболее предпочтительная клеточная линия согласно настоящему изобретению представляет собой линию 82, доступную в 1пуйтодеп, РО Вох 2312, 9704 СН Отошпдеп, Тйе №!йет1апбз.

Экспрессирующие векторы для таких клеток обычно включают в себя (если необходимо) участок начала репликации, промотор, расположенный перед геном для экспрессии, вместе с любыми необходимыми участками связывания рибосом, участками сплайсинга РНК, участком полиаденилирования и последовательности терминатора транскрипции.

Для применения в клетках млекопитающих, функции управления на экспрессирующих векторах часто обеспечиваются материалом вируса. Например, применяемые обычно промоторы получают из вируса полиомы, аденовируса 2 и наиболее часто из обезьяньего вируса 40 (8У40). Ранние и поздние промоторы вируса 8У40 особенно полезны ввиду того, что их легко получить из вируса как фрагмент, также содержащий участок начала репликации вируса 8У40 (Иетз е1 а1., 1978). Также можно использовать меньший и больший фрагменты 8У40 при условии, что туда включена последовательность длиной примерно 250 п.н., продолжающаяся от участка распознавания НшбШ до участка распознавания Вд11, расположенная в вирусном участке начала репликации. Кроме того, также возможно и часто желательно использовать промотор или контрольные последовательности, обычно ассоциированные с желательной генной последовательностью, при условии, что данные контрольные последовательности совестимы с системами клеток-хозяев.

Участок начала репликации можно обеспечить или посредством конструирования такого вектора, чтобы он включал в себя экзогенный участок начала репликации, например, который можно получить из 8У40 или других вирусов (например, вируса полиомы, аденовирусов, У8У, ВРУ), или посредством механизма хромосомной репликации клетки-хозяина. Если вектор интегрирован в хромосому клеткихозяина, ее часто достаточно.

Идентификация пригодных аналогов.

Специалистам понятно, что не все возможные варианты или модификации природных АРР или Ав обладают способностью вызывать у животного образование антител, которые являются перекрестнореагирующими с природной формой. Однако нетрудно произвести эффективный стандартный скрининг модифицированных амилоидогенных молекул, удовлетворяющих минимальным требованиям иммунологической реактивности, обсуждаемым здесь. Следовательно, можно применять способ для идентификации модифицированных амилоидогенных полипептидов, способных индуцировать образование антител против немодифицированного амилоидогенного полипептида у видов животных, где немодифицированный амилоидогенный полипептид представляет собой (неиммуногенный) собственный белок, причем этот способ включает в себя получение посредством пептидного синтеза или способов генной инженерии набора взаимно простых аналогов согласно изобретению, где в аминокислотную последовательность АРР или Ав вида животных добавлены, в нее вставлены, из нее удалены или в ней замещены аминокислоты, таким образом приводя к аминокислотным последовательностям в наборе, которые включают в себя Т-клеточные эпитопы, чужеродные для вида животных, или получение набора фрагментов нуклеиновой кислоты, кодирующих набор взаимно простых аналогов;

- 24 011610 тестирование элементов набора аналогов или фрагментов нуклеиновой кислоты на их способность вызывать продукцию антител у вида животных против немодифицированного АРР или Ав и идентификацию и, необязательно, выделение элемента(ов) набора аналогов, который(е) значимо индуцирует у вида продукцию антител против немодифицированных АРР и Ав, или идентификацию или, необязательно, выделение продуктов, экспрессирующих полипептид, кодируемых элементами набора фрагментов нуклеиновой кислоты, которые значимо индуцируют у вида животных продукцию антител против немодифицированных АРР и Ав.

В данном контексте набор взаимно простых модифицированных амилоидогенных полипептидов представляет собой коллекцию неидентичных аналогов, выбранных на базе обсуждаемых выше критериев (например, в комбинации с исследованием циркулярного дихроизма, спектров ЯМР и/или профилей дифракции рентгеновских лучей). Набор может состоять только из малого количества элементов, но полагают, что набор может содержать и несколько сотен элементов.

Тестирование элементов набора, в конечном счете, можно провести ш νί\Ό. но можно применять ряд тестов 1п νίΙΐΌ. которые уменьшают количество модифицированных молекул, служащих целью данного изобретения.

Так как цель внесения чужеродных Т-клеточных эпитопов представляет собой поддержку Вклеточного ответа с помощью Т-клеток, необходимое условие состоит в том, чтобы аналог индуцировал пролиферацию Т-клеток. Пролиферацию Т-клеток можно тестировать при помощи стандартизированных анализов пролиферации ш νίΙΐΌ. Кратко, от субъекта получают образец, обогащенный Т-клетками, и впоследствии поддерживают в культуре. Культивируемые Т-клетки приводят в контакт с АРС субъекта, ранее захватившими модифицированную молекулу и преобразовавшими ее для презентации Т-клеточным эпитопам. Наблюдают за пролиферацией Т-клеток и сравнивают с подходящим контролем (например, Т-клетки в культуре, контактировавшие с АРС, преобразовавшие интактный нативный амилоидогенный полипептид). Альтернативно, пролиферацию можно измерить посредством измерения концентрации высвобождения соответствующих цитокинов Т-клетками в ответ на распознавание ими чужеродных Т-клеток.

Представляется весьма вероятным, что, так как по меньшей мере один аналог каждого типа набора способен вызывать продукцию антител против АРР или Ав, можно получить иммуногенную композицию, включающую в себя по меньшей мере один аналог, способный индуцировать образование антител против немодифицированных АРР или Ав у вида животных, где немодифицированные АРР или Ав представляют собой собственные белки, способом, включающим в себя смешивание элемента(ов) набора, который(е) значимо индуцирует продукцию антител у вида животных, которые реагируют с АРР или Ав с фармацевтически и иммунологически приемлемыми носителями, и/или растворителями, и/или разбавителями, и/или наполнителями, необязательно в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически и иммунологически приемлемым адъювантом.

Обсуждаемые выше тесты наборов полипептидов легко выполнить посредством начального получения ряда взаимно простых последовательностей нуклеиновой кислоты или векторов согласно изобретению, вставкой их в соответствующие экспрессирующие векторы, трансформацией векторами подходящих клеткок-хозяев (или животных-хозяев) и осуществлением экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты согласно изобретению. После этих стадий может следовать выделение продуктов экспрессии. Предпочтительно, чтобы последовательности нуклеиновой кислоты и/или векторы получали способами, включающими в себя применение способов молекулярной амплификации, такой как ПЦР, или посредством синтеза нуклеиновой кислоты.

Специфические амилоидогенные мишени.

Кроме наиболее часто ассоциированных с болезнью Альцгеймера белков АРР, АроЕ4 и Таи, существует длинный список других белков, тем или иным образом связанных с АО или ввиду их непосредственного присутствия в бляшках и клубках в головном мозге при АО, или ввиду их выраженной генетической ассоциацией с увеличенным риском развития АО. Большинство из данных антигенов, если не все, вместе с обсуждаемыми выше Ав, АРР, пресенилином и АроЕ4, в определенных осуществлениях настоящего изобретения представляют собой возможные белки-мишени. Эти возможные мишени уже всесторонне обсуждались в νΟ 01/62284. Следовательно, эти возможные мишени здесь будут только кратко упомянуты, тогда как более подробное основательное обсуждение можно найти в νθ 01/62282, включенной сюда посредством ссылки: альфа 1-антихимотрипсин (АСТ); альфа 2-макроглобулин; АВАО (Ав-пептидсвязывающая алкогольдегидрогеназа); АРБР1 и 2 (белок, подобный белку-предшественнику амилоида 1 и 2); АМУ117; Вах; Вс1-2; гидролаза блеомицина; ВВ1/АВВ1; хромогранин А; кластерин/аро1; белок, связывающий СВР (фактор высвобождения кортикотропина); ЕОТР (токсический фактор, происходящий из эндотелия); гепарансульфатпротеогликаны; белок-медиатор ответа на коллапсин человека 2; гентингтин (белок болезни Гентингтона); 1САМ-1; 1Ь-6; антиген СО68, ассоциированный с лизосомами; Р21 гак; РЬС-дельта 1 (изофермент дельта 1 фосфолипазы С); компонент сывороточного амилоида Р (8АР); синаптофизин; синуклеин (альфа-синуклеин или ЫАСР) и ТСР-в1 (трансформирующий фактор роста в1).

- 25 011610

Описанные в настоящем документе средства и способы понижающей регуляции АРР или Ав можно комбинировать с лечением, например активной специфической иммунотерапией против любого из данных других амилоидогенных полипептидов.

Кроме болезни Альцгеймера, церебральная амилоидная ангиопатия также представляет собой болезнь, которая может быть подходящей мишенью для предоставленного в настоящем документе способа.

Предполагают, что большинство способов иммунизации против АРР или Ав следует ограничить иммунизацией, приводящей к образованию антител, перекрестно реагирующих с нативными АРР или Ав. Тем не менее, в некоторых случаях представляет интерес индуцировать клеточный иммунитет в форме СТЬ-ответа против клеток, презентирующих эпитопы МНС класса I из амилоидогенных полипептидов - это может быть целесообразным в тех случаях, когда снижение количества клеток, продуцирующих АРР или Ав, не приносит серьезного неблагоприятного эффекта. В тех случаях, когда желателен СТЬ-ответ, предпочтительно использовать рекомендации авторов публикации XV0 00/20027. Описания указанных двух документов, таким образом, включены сюда посредством ссылки.

Иммуногенные носители.

Можно получить молекулы, включающие в себя Т-хелперный эпитоп и пептиды АРР или Ав, представляющие собой или включающие В-клеточные эпитопы, ковалентно связанные с неиммуногенной полимерной молекулой, действующей как носитель, например поливалентный активированный полигидроксиполимер, которые будут, как указано выше, функционировать как молекулы вакцины, которые содержат только иммунологически значимые части, и они представляют собой интересующие осуществления в обсуждаемых выше вариантах б) и е). Можно применять смешанные или так называемые универсальные Т-хелперные эпитопы, например, если мишень для вакцины представляет собой собственный белок АРР или Ав. Кроме того, элементы, усиливающие иммунологический ответ, можно также связать совместно с носителем, и таким образом они будут действовать как адъювант. Такие элементы могут представлять собой маннозу, тафтсин, мурамилдипептид, мотивы СрС и т.п. В данном случае дальнейшая адъювантная композиция вакцинного продукта может не быть необходимой, и продукт можно вводить в чистой воде или физиологическом растворе.

Путем связывания эпитопов цитотоксических Т-клеток (СТЬ) с Т-хелперными эпитопами можно генерировать СТЬ, специфические в отношении антигена, из которого получен СТЬ-эпитоп. Элементы, облегчающие захват продукта в цитозоль АРС, например макрофагов, такие как манноза, также можно связывать с носителем, вместе с СТЬ- и Т-хелперными эпитопами, и усилить ответ СТЬ.

Соотношение В-клеточных и Т-хелперных эпитопов (Р2 и Р30) в конечном продукте можно варьировать путем изменения концентрации данных пептидов на стадии синтеза. Как указано выше, иммуногенную молекулу можно пометить, например, маннозой, тафтсином, Срб-мотивами или другими иммуностимулирующими веществами (описанными здесь) путем их добавления, если необходимо, с помощью, например, аминированных производных этих веществ, к карбонатному буферу на стадии синтеза.

Если для комбинирования пептидов, содержащих В-клеточные и Т-хелперные эпитопы АРР или Ав, применяют нерастворимый активированный полигидроксиполимер, то это можно, как указано выше, провести в виде твердофазного синтеза, а конечные продукты можно собрать и очистить путем промывки и фильтрации. Элементы для связывания с активированным трезилом полигидроксиполимером (пептиды, метки и т.п.) можно добавлять к полигидроксиполимеру при низких рН, например при рН 4-5, и позволяя им равномерно перераспределиться в геле посредством пассивной диффузии. Далее, рН можно поднять до рН 9-10 для запуска реакции основных аминогрупп на пептидах и меток с трезильными группами на полигидроксиполимере. После связывания пептидов и, например, иммуностимулирующих элементов гель измельчают с формированием частиц подходящего для иммунизации размера.

Такой иммуноген, таким образом, включает в себя:

a) по меньшей мере одну первую аминокислотную последовательность, полученную из АРР или Ав, где по меньшей мере одна первая аминокислотная последовательность содержит в себе по меньшей мере один В-клеточный и/или по меньшей мере один СТЬ-эпитоп; и

b) по меньшей мере одну вторую аминокислотную последовательность, включающую в себя чужеродный эпитоп Т-хелперных клеток, где каждая по меньшей мере из первой и по меньшей мере второй аминокислотных последовательностей связана с фармацевтически приемлемым активированным гидроксиполимерным носителем.

Для связывания аминокислотных последовательностей с полигидроксиполимером обычно необходимо активировать полигидроксиполимер подходящей реакционной группой, которая может формировать необходимую связь с аминокислотными последовательностями.

Подразумевается, что термин полигидроксиполимер имеет то же значение, что и в ν0 00/05316, т.е. полигидроксиполимер может иметь точно такие же характеристики, которые конкретно указаны в данном изобретении. Следовательно, полигидроксиполимер может быть водорастворимым или водонерастворимым (таким образом, требуя различных стадий синтеза в процессе получения иммуногена). Полигидроксиполимер можно выбрать из природных и синтетических полигидроксисоединений.

- 26 011610

Конкретные и предпочтительные полигидроксиполимеры представляют собой полисахариды, выбранные из ацетана, амилопектина, камеди агар-агара, агарозы, альгинатов, гуммиарабика, каррагенана, целлюлозы, циклодекстринов, декстрана, фурцелларана, галактоманнана, желатина, βΐιαίΐί. глюкана, гликогена, гуара, кагауа, кощас/А, смолы плодов рожкового дерева, маннана, пектина, ркуШит, ри11и1ап, крахмала, !атаппе, трагаканта, ксантана, ксилана и ксилоглюкана. Особенно предпочтительным является декстран.

Однако полигидроксиполимер можно также выбрать из сильноразветвленного поли(этиленимина) (РЕЦ тетратиениленвинилена, кевлара (длинные цепи полипарафенилтерефталамида), поли(уретанов), поли(силоксанов), полидиметилсилоксана, силикона, поли(метилметакрилата)(РММА), поли(винилового спирта), поли(винилпирролидона), поли(2-гидроксиэтилметакрилата), поли(Ы-винилпирролидона), поли(винилового спирта), поли(акриловой кислоты), политетрафторэтилена (РТЕЕ), полиакриламида, поли(этиленковинилацетата), поли(этиленгликоля) и производных, поли(метакриловой кислоты), полилактидов (РЬА), полигликолидов (РОА), поли(лактидкогликолидов) (РЬСА), полиангидридов и сложных полиортоэфиров.

Средняя молекулярная масса рассматриваемого полигидроксиполимера (например, перед активацией) обычно составляет по меньшей мере 1000, например, по меньшей мере 2000, предпочтительно 25002000000, более предпочтительно 3000-1000000, в особенности 5000-500000. В примерах показано, что полигидроксиполимеры со средней массой в диапазоне 10000-200000 являются особенно выгодными.

Полигидроксиполимер предпочтительно является растворимым в воде в концентрации по меньшей мере 10 мг/мл, предпочтительно по меньшей мере 25 мг/мл, например, по меньшей мере 50 мг/мл, в особенности по меньшей мере 100 мг/мл, например, по меньшей мере 150 мг/мл при комнатной температуре. Известно, что декстран, даже когда активирован, как здесь описано, удовлетворяет требованиям растворимости в воде.

Для некоторых из наиболее интересных полигидроксиполимеров отношение между группами С (атомы углерода) и ОН (гидроксильные группы) неактивированных полигидроксиполимеров (т. е. нативные полигидроксиполимеры до активации) находится от 1,3 до 2,5, например 1,5-2,3, предпочтительно 1,6-2,1, в особенности 1,85-2,05. Вне связи с какой-либо конкретной теорией полагают, что такое отношение С/ОН неактивированного полигидроксиполимера представляет собой наиболее выгодный уровень гидрофильности. Поливиниловый спирт и полисахариды представляют собой примеры полигидроксиполимеров, удовлетворяющих данному требованию. Полагают, что указанное выше отношение должно оставаться примерно таким же для активированного полигидроксиполимера, тогда как отношение активации должно являться существенно более низким.

Термин полигидроксиполимерный носитель предназначен для обозначения участка иммуногена, несущего аминокислотные последовательности. В качестве общего правила полигидроксиполимерный носитель имеет свои внешние границы, где аминокислотные последовательности могут расщепляться пептидазами, например, в антигенпредставляющей клетке, процессирующей иммуноген. Следовательно, полигидроксиполимерный носитель может представлять собой полигидроксиполимер с активационной группой, где связь между активационной группой и аминокислотной последовательностью расщепляется пептидазами в АРС, или гидроксиполимерный носитель может представлять собой гидроксиполимер с активационной группой и, например, мостиком, таким как одиночная Ь-аминокислота или ряд Ό-аминокислот, где последняя часть мостика может связывать аминокислотные последовательности и расщепляться пептидазами в АРС.

Как указано выше, полигидроксиполимеры несут функциональные группы (активационные группы), облегчающие закрепление пептидов на носителе. В данной области известно обширное множество применимых функциональных групп, например трезиловая (трифторэтилсульфониловая), малеимидная, паранитрофенилхлороформная, бромциановая, тозиловая (паратолуолсульфониловая), трифлиловая (трифторметансульфониловая), пентафторбензолсульфониловая и винилсульфоновая группы.

Предпочтительные примеры функциональных групп согласно настоящему изобретению представляют собой трезиловые, малеимидные, тозиловые, трифлиловые, пентафторбензолсульфонильные, паранитрофенилхлороформная и винилсульфоновые группы, в числе которых трезиловые, малеимидные и тозиловые группы особенно значимы.

Активированные трезилом полигидроксиполимеры можно получать с применением трезилхлорида, как описано для активации декстрана в примере 1 и XVО 00/05316 или как описано у Сгедотшк е! а1., Σ. Iттиηо1. МеШ. 181 (1995) 65-73.

Активированные малеимидом полигидроксиполимеры можно получать с применением парамалеимидофенилизоцианата, как описано для активации декстрана в примере 3 в νθ 00/05316. Альтернативно, малеимидные группы можно ввести в полигидроксиполимер, например декстран, посредством дериватизации активированного трезилом полигидроксиполимера (например, активированного трезилом декстрана (ТАИ)) избытком диаминового соединения (как правило, Н₂Ы-С_пН_2п-ИН₂, где η составляет 1-20, предпочтительно 1-8), например 1,3-диаминопропана, и впоследствии - реакцией введенных в ТАИ аминогрупп с реагентами, такими как сукцинимидил-4-(Ы-малеимидометил)циклогексан-1карбокислат (8МСС), сульфосукцинимидил-4-(И-малеимидометил)циклогексан-1-карбокислат (сульфо- 27 011610

8МСС), сукцинимидил-4-(парамалеимидофенил)бутират (8ΜΡΒ), сульфосукцинимидил-4(парамалеимидофенил)бутират (сульфо-δΜΡΒ), Ν-γ-малеимидобутирилоксисукцинимидные сложные эфиры (ΟΜΒ8) или Ν-γ-малеимидобутирилоксисульфосукцинмимидные сложные эфиры. Несмотря на то что различные реагенты и пути активации формально приводят к немного различающимся продуктам, активированным малеимидом в отношении связи между функциональностью малеимида и остаточной исходной гидроксильной группой, на которой проводили активацию, все их вместе и порознь можно рассматривать как активированные малеимидом полигидроксиполимеры.

Активированные тозилом полигидроксиполимеры можно получать с применением тозилхлорида, как описано для активации декстрана в примере 2 в XV О 00/05316. Полигидроксиполимеры, активированные трифлилом и пентафторбензолсульфонилом, получают как аналоги, активированные тозилом или трезилом, например, с применением соответствующих кислых хлоридов.

Активированные бромцианом полигидроксиполимеры можно получать путем реакции полигидроксиполимера с бромцианом с применением традиционных способов. Получающиеся функциональные группы обычно представляют собой сложные эфиры циановой кислоты с двумя гидроксильными группами полигидроксиполимера.

Степень активации можно выразить как соотношение между свободными гидроксильными группами и активационными группами (т.е. гидроксильными группами, ставшими функциональными). Полагают, что соотношение между свободными гидроксильными группами полигидроксиполимера и активационными группами для получения выгодного баланса между гидрофильностью и реактивностью полигидроксиполимера должно составлять от 250:1 до 4:1. Предпочтительно соотношение составляет от 100:1 до 6:1, более предпочтительно от 60:1 до 8:1, в особенности от 40:1 до 10:1.

Особенно интересные активированные полигидроксиполимеры для применения в способе для получения применимого в большинстве случаев иммуногена согласно изобретению представляют собой активированные трезилом, тозилом и малеимидо полисахариды, особенно активированный трезилом декстран (ΤΑΌ), активированный тозилом декстран (ΤοκΑΌ) и активированный малеимидом декстран (МАО).

Предпочтительно, чтобы связь между полигидроксиполимерным носителем и связанными с ним аминокислотными последовательностями расщеплялась пептидазами, например, такими как пептидазы, активные при процессинге антигенов в АРС. Следовательно, предпочтительно, чтобы по меньшей мере первая и по меньшей мере вторая аминокислотные последовательности связывались с активированным полигидроксиполимерным носителем посредством амидной или пептидной связи. Особенно предпочтительно, чтобы каждая по меньшей мере из первой и по меньшей мере второй аминокислотных последовательностей представляла азотную группу для соответствующей ей амидной связи.

Полигидроксиполимерный носитель может не содержать аминокислотные остатки, если нужно, чтобы активационная группа представляла часть расщепляемой пептидазой связи, но, как указано выше, носитель может просто содержать спейсер, включая в себя по меньшей мере одну Ь-амино кислоту. Тем не менее по меньшей мере первая и по меньшей мере вторая аминокислотные последовательности обычно связываются с активированным вариантом полигидроксиполимера посредством азота на Ν-конце аминокислотной последовательности.

Описанный выше применяемый в большинстве случаев иммуноген согласно настоящему изобретению можно применять в способах иммунизации, по существу, как здесь описано, для полипептидных вакцин. То есть все обсуждаемые здесь описания, относящиеся к дозам, способам введения и составу полипептидных вакцин для понижающей регуляции амилоидогенных полипептидов с соответствующими изменениями используют для обычно применяемых иммуногенов.

Обычно применяемый безопасный способ вакцинации.

Как обсуждалось выше, одно из предпочтительных осуществлений настоящего изобретения влечет за собой применение вариантов амилоидогенных пептидов, неспособных предоставить собственные Т_н-эпитопы, способные управлять иммунным ответом против амилоидогенного полипептида.

Однако авторы настоящего изобретения полагают, что данная стратегия для разработки аутовакцин и для вызова аутоиммунитета представляет собой применимую в большинстве случаев технологию, которая является объектом изобретения сама по себе. Следует считать особенно удобными случаи, когда искомый для понижающей регуляции аутоантиген находится в организме в существенном избытке, так что возможно, что может произойти аутостимуляция иммунного ответа. Следовательно, все приведенные выше описания данного осуществления, поскольку это относится к обеспечению аутоиммунного ответа против АРР или Αβ, с соответствующими изменениями применимы к иммунизации против собственных полипептидов, особенно тех, которые представлены в существенных количествах, чтобы поддерживать иммунный ответ в форме неконтролируемого аутоиммунного состояния ввиду того, что Т_н-эпитопы соответствующих собственных белков направляют иммунный ответ.

- 28 011610

Пример 1. Подход аутовакцинации для иммунизации против АО.

Тот факт, что мыши, характеризующиеся нокаутом гена белка Ав, не обнаруживают никаких отклонений или неблагоприятных побочных эффектов, указывает на то, что устранение или уменьшение количеств Ав является безопасным, Ζ1ιοη§ н. (1996).

Опубликованные экспериментальные данные, где трансгенных животных иммунизировали против трансгенного белка Ав человека, указывают на то, что если возможно нарушить аутотолерантность, то понижающую регуляцию Ав можно получить посредством аутореактивных антител. Данные эксперименты, кроме того, указывают на то, что такая понижающая регуляция Ав потенциально могла бы как предотвращать формирование бляшек, так и очищать головной мозг от уже сформировавшихся Ав-бляшек, сравните ЗеНспк с1 а1. (1999). Однако обычно невозможно получить антитела против собственных белков.

Таким образом, опубликованные данные не предоставляют способов нарушения истинной аутотолерантности по отношению к истинным собственным белкам. Данные не дают также информации о том, как можно удостовериться в случае необходимости, что иммунная реакция направлена исключительно или преимущественно против отложений Ав, а не против связанного с клеточной мембраной белкапредшественника Ав (АРР). Иммунный ответ, получаемый с помощью существующей технологии, будет преимущественно вызывать иммунный ответ по отношению к собственным белкам нерегулируемым образом, так что можно получить нежелательную или избыточную аутореактивность по отношению к участкам белка Ав. Следовательно, с применением существующих стратегий иммунизации, скорее всего, невозможно получить сильные иммунные ответы по отношению к собственным белкам; более того, это небезопасно из-за потенциальной сильной перекрестной реактивности по отношению к связанному с клеточной мембраной АРР, который присутствует в большом количестве клеток ЦНС.

В настоящем изобретении предоставлены способы эффективной выработки сильного иммунного ответа по отношению к истинным собственным белкам, которые потенциально могут формировать бляшки и вызывать серьезное заболевание ЦНС или других частей организма. С применением данной технологии будет разработана безопасная и эффективная терапевтическая вакцина на основе белка Ав для лечения АО.

В свете этого можно ожидать, что АО - заболевание, которое по предсказаниям могло нанести ущерб системе здравоохранения в следующем столетии, можно вылечить; или такие описанные вакцины могут, по меньшей мере, создавать эффективный терапевтический подход к лечению симптомов и прогрессии данного заболевания. Данный способ представляет собой совершенно новый иммунологический подход к блокированию накопления амилоида при АО, а также при других неврологических заболеваниях.

В таблице ниже указаны 35 рассматриваемых конструкций. Все позиции даны в таблице относительно стартового метионина АРР (первая аминокислота в 8ЕЦ ГО N0:2) и включают как стартовую, так и конечную аминокислоты, например фрагмент 672-714 включает как аминокислоту 672, так и 714. Стартовые и конечные положения для Р2 и Р30 показывают, что эпитоп замещает часть фрагмента АРР в указанных положениях (оба положения включены в замену), в большинстве конструкций введенные эпитопы замещают фрагмент, равный по длине эпитопу. Звездочки в таблице означают следующее:

*Только одно положение для Р2 и Р30 указывает на то, что в данном положении эпитоп вставляли в производное АРР (эпитоп начинается с аминокислоты, примыкающей к указанному положению со стороны С-конца).

**Конструкция 34 содержит три идентичных фрагмента АРР, разделенных посредством Р30 и Р2 соответственно.

***Конструкция 35 содержит девять идентичных фрагментов АРР, разделенных посредством чередующихся эпитопов Р30 и Р2.

- 29 011610

Конструкции АРР АиШУас

№ варианта	Начало фрагмента АРР относительно 1 ак АРР	Конец фрагмента АРР относительно 1 ак АРР	Положение эпитопа Р2 относительно 1 ак АРР	Положение эпитопа РЗО относительно 1 ак АРР	Длина молекулы
1	630	770	656-670	635-655	141
2	630	714	656-670	635-655	85
3	672	770	735-749	714-728	99
4	672	770		714-728	99
5	672	770	714-728		99
6	672	770	723*	723*	135
7	672	770		723*	120
8	672	770	723*		114
9	672	714		672*	64
10	672	714		714*	64
11	672	714	672*		58
12	672	714	714*		58
13	672	714	714*	672*	79
14	672	714	680-694		43
14	672	714	685-799		43
16	672	714	690-704		43
17	672	714	695-709		43
18	672	714		675-695	43

19	672	714		680-700	43
20	672	714		685-705	43
21	672	714		690-710	43
22	672	714	680*	680*	79
23	672	714	690*	690*	79
24	672	714	700*	700*	79
25	672	714	710*	710*	79
26	672	714		680*	64
27	672	714		690*	64
28	672	714		700*	64
29	672	714		710*	64
30	672	714	680*		58
31	672	714	690*		58
32	672	714	700*		58
33	672	714	710*		58
34	672	714	После повтора 1**	После повтора 2**	165
35	672	714	34*3	34«3***	165

Участок АРР, против которого наиболее интересно получить ответ, составляет 43 аминокислоты корового пептида Ав (Ав-43, соответствующий 8ЕЦ ΙΌ N0:2, остатки 672-714), который является основной составляющей амилоидных бляшек в головном мозге при АО. Данный фрагмент АРР является частью всех перечисленных выше конструкций.

Варианты 1 и 2 содержат участок АРР против хода транскрипции от Ав-43, где поместили модельные эпитопы Р2 и Р30. Все варианты 1 и 3-8 содержат фрагмент С-100, являющийся, как показано, нейротоксичным - фрагмент С-100 соответствует аминокислотным остаткам 714-770 из 8Е0 Ш N0:2. В вариантах 3-5 эпитопы замещают часть фрагмента С-100, в то время как в вариантах 6-8 эпитопы вставляли в С-100.

Варианты 9-35 содержат только коровый белок Ав-43. В вариантах 9-13 Р2 и Р30 слиты с тем или другим концом Ав-43; в 14-21 Р2 и Р30 замещают часть Ав-43; в 22-33 Р2 и Р30 вставляли в Ав-43; 34 содержит три идентичных фрагмента Ав-43, разделенных Р30 и Р2 соответственно; 35 содержит 9 повторов Ав-43, разделенных чередующимися эпитопами Р2 и Р30.

Согласно настоящему изобретению в иммуногенных аналогах можно также применять укороченные части обсуждаемого выше белка Ав-43. Особенно предпочтительными являются укороченные части Ав (1-42), Ав (1-40), Ав (1-39), Ав (1-35), Ав (1-34), Ав (1-34), Ав (1-28), Ав (1-12), Ав (1-5), Ав (13-28), Ав (13-35), Ав (17-28), Ав (25-35), Ав (35-40), Ав (36-42) и Ав (35-42) (где номера в скобках указывают аминокислотные участки Ав-43, которые составляют соответствующий фрагмент, например Ав (35-40)

- 30 011610 идентичен аминокислотам 706-711 в 8ЕО Ш N0:2). Все данные варианты с укороченными частями Аβ-43 можно получить с фрагментами Аβ, описанными здесь, в особенности с вариантами 9, 10, 11, 12 и 13.

В некоторых случаях предпочтительно, чтобы Аβ-43 или его фрагменты были мутантными. Особенно предпочтительными являются варианты замены, в которых метионин в положении 35 Аβ-43 замещен предпочтительно на лейцин или изолейцин или просто удален. Особенно предпочтительные аналоги содержат одиночный метионин, расположенный на С-конце, либо ввиду того, что он является природным в амилоидогенном полипептиде или чужеродном эпитопе Т_Н, либо ввиду того, что его вставили или добавили. Следовательно, также предпочтительно, чтобы тот участок аналога, который включает в себя чужеродный эпитоп ТН, являлся свободным от метионина, за исключением возможного С-концевого расположения метионина.

Фактически, как правило, предпочтительно, чтобы все аналоги АРР или Аβ, которые применяют согласно настоящему изобретению, обладали общей характеристикой простого включения одногоединственного метионина, расположенного в аналоге как С-концевая аминокислота, а все остальные метионины как в амилоидогенном полипептиде, так и в чужеродном эпитопе ТН были удалены или замещены другой аминокислотой.

Интересной дополнительной мутацией является делеция или замещение фенилаланина в положении 19 в Аβ-43 и особенно предпочтительно, чтобы данная мутация представляла собой замену этого остатка фенилаланина на пролин.

Следующая таблица определяет группу особенно предпочтительных конструкций, функционирующих с укороченными формами или мутациями Аβ-43.__

№ варианта	Сегмент Αβ, применяемый в молекуле, относительно 1 ак Αβ (1-42/43)	Положение сегмента Αβ относительно 1 ак молекулы	Положение эпитопа ₽2 относительно 1 ак молекулы	Положение эпитопа РЗО относительно 1 ак молекулы	Общая длина молекулы (ак)
36	1-28	22-49	50-64	1-21	64
37	1-12 (а) + 13-28 (Ь)	1-12 (а) + 49-64 (Ь)	34-48	13-33	64
38	1-12 (х 3)	1-12, 34-45, 61-72	46-60	13-33	72
39	13-28 (х 3)	1-16, 38-53, 69-84	54-68	17-37	84
40	1-12 (а) + 13-35(Ь) +36-42 (с)	1-12 (а) + 34-56 (Ь) + 72-78 (с)	57-71	13-33	78
41	1-28 (х 3)	1-28, 50-77, 93-120	79-92	29-49	120
42	1-43 (ΕΊ9Ρ/Μ35Κ)	1-43	65-79	44-64	79

В данной таблице сегмент Аβ, используемый в молекуле, указан посредством номеров аминокислот относительно 1 ак молекулы Аβ (1-42/43), т.е. 1-28 означает, что в молекуле использовали фрагмент Аβ (1-42/43) 1-28. Если использовали два или более различных фрагментов, в таблице указаны оба, т.е. 1-12 (а) + 13-28 (Ь) означает, что в молекуле использован как фрагмент Аβ (1-42/43) 1-12, так и фрагмент 13-28.

Также если один и тот же сегмент присутствует в конструкции более чем в одной копии, это указано в таблице, т.е. 1-12 (х3) указывает на то, что фрагмент Аβ (1-42/43) 1-12 присутствует в конструкции в трех копиях.

Далее, положение сегмента Аβ в молекуле указано посредством позиций аминокислот относительно первой аминокислоты в молекуле, т.е. 22-49 указывает на то, что рассматриваемый фрагмент Аβ расположен в молекуле от 22 аминокислоты до 49 аминокислоты, включая оба положения. Положения эпитопов Р2 и Р30 обозначены таким же образом. Если в молекуле использовали два или более различных фрагментов Аβ, все их положения указаны, т.е. 1-12 (а) + 49-64 (Ь) означает, что фрагмент (а) располагается в молекуле от 1 до 12 ак и фрагмент (Ь) - от 49 до 64 ак.

Более того, если в молекуле присутствует более одной копии одного и того же фрагмента, указаны положения всех копий, т.е. 1-12, 34-45, 61-72 показывает, что три копии фрагмента Аβ размещаются в молекуле в положениях 1-12, 34-45 и 61-72 соответственно.

Наконец, указание суммарной длины каждой молекулы включает и фрагмент(ы) Аβ и эпитопы Р2 и Р30.

Вариант 42 содержит две аминокислотные замены в положениях 19 (рйе на рго) и 35 (теХ на 1ук), как это указано в столбце, представляющем фрагменты Аβ.

См. фиг. 1 и таблицы выше относительно деталей конкретных точек введения чужеродных Т-клеточных эпитопов.

Один из дополнительных типов конструкций является особенно предпочтительным. Так как одной из задач настоящего изобретения является избежание разрушения клеток, продуцирующих АРР, в то время как устранение Аβ является желательным, представляется подходящим получить конструкции

- 31 011610 аутовакцин, включающие в себя только те части Ав, которые, когда присутствуют в АРР, не экспонируются во внеклеточной фазе. Таким образом, подобные конструкции должны содержать по меньшей мере один В-клеточный эпитоп, полученный из аминокислотного фрагмента, определяемого аминокислотами 700-714 в 8ЕО ГО N0:2. Так как предсказано, что такой короткий полипептидный фрагмент будет только слабо иммуногенным, предпочтительно, чтобы такая конструкция аутовакцины состояла из нескольких копий В-клеточного эпитопа, например в виде конструкции, обладающей структурой, показанной в формуле (Г), в подробном описании настоящего изобретения, выше. В данной версии формулы (Г) термины амилоид_е1-амилоид_ех представляют х В-клеточный эпитоп, содержащий последовательность аминокислот, полученную из аминокислот 700-714 8ЕО ГО N0:2. Предпочтительная альтернатива представляет собой подробно описанную выше возможность связывания амилоидогенного (поли)пептида с выбранным Т-хелперным эпитопом посредством амидной связи с полисахаридной молекулой-носителем, таким способом становятся возможными множественные презентации слабого эпитопа, сконструированного аминокислотами 700-714 8Е0 ГО N0:2, а также становится возможным выбор оптимального соотношения между В-клеточными и Т-клеточными эпитопами.

Пример 2. Иммунизация трансгенных мышей Ав и модифицированными белками согласно изобретению.

Конструирование ДНК, кодирующей 11АВ43+-34.

Ген 11АВ43+-34 конструировали в несколько стадий. Сначала получали фрагмент ПЦР с праймерами МЕ № 801 (8Е0 ГО N0:10) и МЕ № 802 (8Е0 ГО N0:11), применяя в качестве матрицы праймер МЕ № 800 (8Е0 ГО N0:9). МЕ № 800 кодирует фрагмент Ав-43 человека с оптимизированными для Е.сой кодонами. МЕ № 801 и 802 добавляют к фрагменту подходящие участки рестрикции.

Фрагмент ПЦР очищали, расщепляли №оГ и НтйШ, снова очищали и клонировали в расщепленном ^оГ-НшйШ и очищенном векторе для экспрессии в Е.сой рЕТ28Ь+. Полученную плазмиду, кодирующую Ав-43 дикого типа человека, назвали рАВ1.

На следующей стадии к С-концу молекулы добавляли Т-хелперный эпитоп Р2. Праймер МЕ № 806 (8Е0 ГО N0:12) содержит последовательность, кодирующую эпитоп Р2, таким образом, продукт слияния Р2 и Ав-43 получают посредством реакции ПЦР.

Клонирование проводили посредством получения фрагмента ПЦР с праймерами МЕ № 178 (8Е0 ГО N0:8) и МЕ № 806, применяя в качестве матрицы рАВ1. Фрагмент очищали, расщепляли №оГ и НтйШ, снова очищали и клонировали в расщепленном ЖойНтбШ и очищенном векторе рЕТ28Ь+. Полученную плазмиду назвали рАВ2.

Аналогичным способом получали другую плазмиду, несущую кодирующую последовательность Ав-43 с другим Т-хелперным эпитопом, Р30, добавленным к Кконцу. Это выполняли посредством получения фрагмента ПЦР с праймерами МЕ № 105 (8Е0 ГО N0:7) и МЕ № 807 (8Е0 ГО N0:13), применяя в качестве матрицы рАВ1.

Фрагмент очищали, расщепляли №оГ и НтйШ, снова очищали и клонировали в расщепленном ^оГ-НтйШ и очищенном векторе рЕТ28Ь+. Полученную плазмиду назвали рАВ3.

На третьей стадии второй повтор Ав-43 с С-конца добавляли к эпитопу Р2 плазмиды рАВ2 посредством праймера МЕ № 809 (8Е0 ГО N0:14). В то же время МЕ № 809 создает сайт ВатНГ непосредственно после повтора Ав-43. Фрагмент ПЦР получали с праймерами МЕ № 178 и МЕ № 809, применяя в качестве матрицы рАВ2. Фрагмент расщепляли №оГ и НтйШ, очищали и клонировали в расщепленном ^оГ-НтйШ и очищенном векторе рЕТ28Ь+. Данную плазмиду назвали рАВ4.

Наконец, последовательность эпитоп Р30 - повтор Ав-43 из рАВ3 клонировали в плазмиду рАВ4. Это выполняли посредством получения фрагмента ПЦР с праймерами МЕ № 811 (8Е0 ГО N0:16) и МЕ № 105, применяя в качестве матрицы рАВ3. Фрагмент очищали и использовали в качестве праймера в последующей ПЦР с МЕ № 810 (8Е0 ГО N0:15), применяя в качестве матрицы рАВ3. Полученный фрагмент очищали, расщепляли ВатНГ и НтйШ и клонировали в расщепленную ВатНГ-НтйШ и очищенную плазмиду рАВ4. Полученная плазмида, рАВ5, кодирует молекулу 11АВ43+-34.

Все способы ПЦР и клонирования, по существу, выполняли, как описано в 8атЬгоок, I.. Ргйксй, Е.Р.&Матайк, Т. 1989 Мо1еси1аг с1ошпд: а 1аЬога!огу тапиа1. 2^пй Ей. Со1й 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу, КУ.

Для всех способов клонирования применяли клетки Е.сой К-12, штамм Тор-10 Р' (81га1адепе, И8А). Вектор рЕТ28Ь+ получали в №уадеп, И8А. Все праймеры синтезировали в ^NΑ Тесйпо1о§у, Эептагк.

Экспрессия и очистка 11АВ43+-34.

Белок ЙАВ43+-34, кодируемый рАВ5, экспрессировали в клетках Е.сой ВБ21-Со1б (№уадеп), как описано производителями системы рЕТ28Ь+ (№уадеп).

Экспрессированный белок 11АВ43+-34 очищали более чем до 85% чистоты посредством промывания телец включения с последующей катионообменной хроматографией в присутствии 6 М мочевины с применением автоматизированного рабочего места для очистки ВюСай (Рег8ерйуе Вюкуйетк, И8А). Затем мочевину удаляли посредством ступенчатого диализа против раствора, содержащего уменьшающиеся количества мочевины. Конечный буфер представлял собой 10 мМ Тпк, рН 8,5.

- 32 011610

Исследование иммунизации.

Для исследования использовали мышей, трансгенных по АРР (белок-предшественник болезни Альцгеймера) человека. Данные мыши, названные Τ§ΚΝΏ8+, экспрессируют мутантную форму АРР, что приводит к высоким концентрациям Аβ-40 и Аβ-42 в головном мозге мышей (Тапик, С. е1 а1.)

Мышей (8-10 мышей в группе) иммунизировали или Αβ-42 (8ЕО ΙΌ N0:2, остатки 673-714, синтезированным посредством стандартного способа с Ртос), или вариантом 11ΑΒ43+-34 (конструкция 34 в таблице в примере 1, полученная рекомбинантным способом) 4 раза с двухнедельными интервалами. Дозы составляли 100 мг для Аβ или 50 мг для 11ΑΒ43+-34. У мышей забирали кровь на 43 сутки (после трех инъекций) и после 52 суток (после четырех инъекций) и для определения уровня специфических титров антител против Αβ-42 с применением прямого ΕΟδΑ Αβ-42 использовали сыворотку.

Следующая таблица показывает средние относительные титры антител против Αβ-42.

Иммуноген	43 сутки (после 3 иммунизаций)	52 сутки (после 4 иммунизаций)
Αβ-42	4000	3000
ЙАВ43+-34	16000	23000

Как становится ясно, титры антител, полученные при иммунизации вариантом Аβ ΕΑΒ43+-34, выше приблизительно в 4 раза и в 7,5 раз после 3 и 4 иммунизации соответственно, чем титры, полученные с применением в качестве иммуногена неизмененного Аβ-42 дикого типа. Данный факт в перспективе можно оценить дополнительно, если принять во внимание тот факт, что количество применяемого для иммунизации варианта составляет только 50% от количества применяемой для иммунизации последовательности дикого типа.

Пример 3.

Синтез Аβ сополимерной пептидной вакцины с применением активированного полигидроксиполимера в качестве структурирующего агента.

Введение.

Традиционная конъюгированная вакцина состоит из (поли)пептида, ковалентно связанного с белком-носителем. Пептид содержит В-клеточный(е) эпитоп(ы), а белок-носитель предоставляет Т-хелперные эпитопы. Однако большинство белков-носителей в норме являются неподходящими в качестве источников Т-хелперных эпитопов, так как только незначительная часть всей последовательности содержит подходящие Т-хелперные эпитопы. Такие эпитопы можно определить и синтезировать как пептиды, например по 12-15 аминокислот. Если данные пептиды ковалентно связаны с пептидами, содержащими В-клеточные эпитопы, например, посредством поливалентного активированного полигидроксиполимера, можно получить молекулу вакцины, которая содержит только значимые участки. В дальнейшем можно получить вакцинный конъюгат, который содержит оптимизированное соотношение между В- и Т-клеточными эпитопами.

Синтез активированного полигидроксиполимера.

Полигидроксиполимеры, такие как декстран, крахмал, агароза и т.д., можно активировать 2,2,2-трифторэтансульфонилхлоридом (трезилхлоридом) или посредством гомогенного синтеза (декстран), растворенным в Ν-метилпирролидоне (ΝΜΡ), или способом гетерогенного синтеза (крахмал, агароза, структурированный декстран), например в ацетоне.

В сухих условиях в 500 мл круглодонную колбу, снабженную магнитом для перемешивания, к высушенному вымораживанием, водорастворимому декстрану (4,5 г, 83 ммоль, очищенный до степени, пригодной для клинического применения, Μν (средн.) 78000) добавляли 225 мл сухого

Ν-метилпирролидона (ΝΜΡ). Колбу помещали в масляную баню с температурой 60°С с магнитным перемешиванием. Температуру поднимали до 92°С на период более 20 мин. При растворении декстрана колбу немедленно удаляли из масляной бани и температуру в бане понижали до 40°С. Колбу снова помещали в масляную баню, все еще с магнитным перемешиванием, и капельно добавляли трезилхлорид (2,764 мл, 25 ммоль). Через 15 мин по каплям добавляли сухой пиридин (безводный, 2,020 мл, 25 ммоль). Колбу удаляли из масляной бани и проводили перемешивание в течение 1 ч при комнатной температуре. Продукт (декстран, активированный трезилом, ΤΑΌ) осаждали в 1200 мл холодного этанола (99,9%). Супернатант сливали и осадок собирали в 50 мл полипропиленовые пробирки в центрифуге при 2000 об/мин. Осадок растворяли в 50 мл 0,5% уксусной кислоты, 2 раза диализовали против 5000 мл 0,5% уксусной кислоты и сушили вымораживанием. ΤΑΌ можно хранить при -20°С в виде высушенного вымораживанием порошка.

Нерастворимый полигидроксиполимер, такой как агароза или структурированный декстран, можно активировать трезилом посредством приготовления суспензии полигидроксиполимера, например в ацетоне, и проведения синтеза в виде твердофазного синтеза. Активированный полигидроксиполимер можно собрать посредством фильтрации. Подходящие способы опубликованы, например, у №к§оп К. и МокЬасЕ К. (1987), МеШобк ίη Еп/уто1оду 135, р. 67 и в Негтапккоп Ο.Τ. е1 а1. (1992), ίη 'ЧттоЫНхеб

- 33 011610

АГГику Ыдапб Тес11пк.|иек. Асабетк бгекк, Шс., р. 87.

Синтез сополимерных пептидных вакцин Ав.

ТАЭ (10 мг) растворяли в 100 мкл Н₂О и 1000 мкл карбонатного буфера, рН 9,6, содержащего 5 мг Ав-42 (8Ер ГО N0:2, остатки 673-714), 2,5 мг Р2 (8Ер ГО N0:4) и добавляли 2,5 мг Р30 (8Ер ГО N0:6). Все пептиды, Ав-42, Р2 и Р30, содержали защищенные лизиновые группы: они находились в форме лизиновых групп, защищенных 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиден)этилом (Обе). Пептиды получали стандартным способом с Бтос, где стандартный Бтос-Ьук(Вос)-ОН замещали на Бтос-Ьук(Пбе)ОН (получено в №уаЬюсйет, кат. № 04-12-1121), т.е. ε-аминогруппу лизина защищали Обе вместо Вос.

Измеряли величину рН и доводили до 9,6 с помощью 1 М НС1. Через 2,5 ч при комнатной температуре добавляли гидразин из 80% раствора до конечной концентрации гидразина 8%, инкубировали раствор еще 30 мин при комнатной температуре и немедленно после этого сушили вымораживанием. Высушенный вымораживанием продукт растворяли в Н₂О и диализовали в значительной степени против Н2О перед конечной сушкой вымораживанием.

Соотношение между В-клеточными эпитопами (Ав) и Т-хелперными эпитопами (Р2 и Р30) в конечном продукте можно варьировать, применяя различные концентрации этих пептидов на стадии синтеза. Более того, в конечный продукт можно ввести метку, например маннозу (как мишень для конъюгации с АБС), посредством добавления аминированной маннозы к карбонатному буферу на стадии синтеза.

Если применяют нерастворимый активированный полигидроксиполимер, чтобы связывать пептиды, содержащие В-клеточный эпитоп и Т-хелперные эпитопы, связывание с полимером можно проводить как твердофазный синтез, а конечный продукт собирают и очищают путем промывки и фильтрации.

Как указано в основном описании, рассмотренный в настоящем документе подход для получения вакцины на основе пептидов можно применять для любого другого полипептидного антигена, где будет удобно получать чистую синтетическую пептидную вакцину и где рассматриваемый полипептидный антиген обеспечивает достаточную иммуногенность в одном отдельном пептиде.

Пример 4.

Синтетические сополимерные пептидные вакцины.

ТАИ (10 мг) растворяли в 100 мкл Н₂О и 1000 мкл карбонатного буфера, рН 9,6, содержащего 1-5 мг пептида А (любого представляющего интерес иммуногенного пептида!), добавляли 1-5 мг Р2 (эпитопа Р2 дифтерийного анатоксина) и 1-5 мг Р30 (эпитопа Р30 дифтерийного анатоксина). Измеряли величину рН и доводили до 9,6, используя 0,1 М НС1.

После 2,5 ч при комнатной температуре раствор затем немедленно высушивали вымораживанием. Высушенный вымораживанием продукт растворяли в Н₂О и перед конечной сушкой вымораживанием в значительной степени диализовали против Н₂О или удаляли соли гель-фильтрацией на колонке. В случае наличия лизина в последовательности пептидов ε-амин в боковой цепи лизина следует защитить посредством Эбе с применением в синтезе производного Бтос-Ьук(Пбе)-ОН (предложен Огедогшк апб ТБе1кеп 2001). После связывания добавляли гидразин из 80% раствора до конечной концентрации гидразина в пределах 1-20% и инкубировали раствор еще 30 мин при комнатной температуре, после этого немедленно проводили сушку вымораживанием, и перед конечной сушкой вымораживанием в значительной степени диализовали против Н2О или удаляли соли путем гель-фильтрации на колонке. Принцип в схематической форме изложен на фиг. 2.

В качестве пептида А авторы настоящего изобретения использовали такие иммуногены, как иммуногены с коротким С-концевым фрагментом белка ОкрС из Воггеба ЬигдбогГеп, а в качестве пептида В - с эпитопом дифтерийного анатоксина (Р2 или Р30). Результаты исследований иммунизации этим антигеном выявили, что только иммуноген согласно изобретению, включающий в себя фрагмент ОкрС и чужеродный дифтерийный эпитоп, соответствующий гаплотипу МНС вакцинированных мышей, был способен индуцировать у этих мышей антитела, реагирующие с ОкрС. Напротив, молекула, содержащая только пептид ОкрС, была неспособна индуцировать продукцию антител, и то же самое являлось справедливым для смеси 2 иммуногенов, где один содержал ОкрС, а другой - эпитоп. Поэтому сделано заключение, что включение в один и тот же полигидроксиполимерный носитель является лучшим, если не неотъемлемым для индукции продукции антител против короткого пептидного гаптена, подобного ОкрС.

Список ссылок

Вгооктеуег К.; Сгау 8.; Ка\уак С. (1998). Ρ^о^есйоηк оГ АМюппег'к Икеаке ίη 1бе Ишкб 81а1ек апб 1бе бнЫк НеаНй бпрас! оГ Ие1аушд Икеаке Опке!. Атегкап 1оигпа1 оГ биЬбс Неайй, 88 (9), 1337-1342.

Вий1ш М.; Ойй М.; Ве11ок1а 8.; АкееГе Н.; Ρйак К.Е.; Д^'кк-Согау, Т.; Миске, Ь.; МаБ1еу, Κ.ν. (1999). Ехргеккюп оГ Нитап Аройроргокт Е3 ог Е4 т 1бе Вгабъ оГ Арое-/- Мке: !коГогт-8рес|Пс ЕГГес!к оп №игобедепегайоп. 1оита1 оГ №игокскпсе, 19, 4867-4880.

С1агк, Ь.К; Ρоо^ка^, Ρ.; νκζϋΐο^ Ζ.; Секскеттб, И.Н.; №кгеббше, Ζ.8.; МШег, В.; Ь1, Ό.; бауать Н.; Атей, Б.; Магкорои1ои, К; Апбгеабк, А.; И'8о^а, I.; Бее, \^;'.М.; Кееб, Ь.; Тго)апо\\'ккг кр.; Ζйика^еνа, V.; В1гб, Т.; 8сйе11епЬегд, О.; V^Ше1тκеη, К.С. (1998). бабюдешс бпрбсабопк оГ Ми1айопк ш 1йе Таи Репе т Ρа11^бо-Ρоηΐо-N^д^а1 Иедепегайоп апб Ке1а1еб №игобедепегайуе Икогбегк Ыпкеб Ю СБготокоте 17. бгосеебтдк оГ И1е №1бопа1 Асабету оГ 8скпсек И.8.А., 95 (22), 13103-13107.

- 34 011610

Сир!а, К.К. е! а1. (1998), Эе\. Вю1. 8!апб. 92: 63-78.

Нз1ао К. е! а1. (1998) «Тгапздешс писе ехргеззшд Аккешег атуЫб ргесигзог рго!етз», Ехр. Сегоп1о1. 33 (7-8), 883-889.

Ни!!оп, М.; Бепбоп, С.Ь.; Κίζζπ, Р.; Вакег, М.; Егоекск, 8.; Нои1беп, Н.; Рккегтд-Вготеп, 8.; СкакгатеПу, 8.; каасз, А.; Сготег, А.; НаскеР, I.; Абатзоп, I.; Ыпсо1п, 8.; Эккзоп, Ό.; Баттез, Р.; Ре!егзеп, К.С.; 8!етепз, М.; бе Сгаакк, Е.; Vаи!е^з, Е.; тап Вагеп, I.; НШеЬгапб, М.; 1ооззе, М.; Ктеоп, !М.; Ыотео!пу, Р.; Ске, Ь.К.; ЫоРоп, I.; Мотз, ЕС.; Кееб, Ь.Е.; Тго_)апотезк1, I.; Вазип, Н.; Баппке1!, Ь.; Ыеуз!а!, М.; Еакп, 8.; Багк, Е.; ТаппепЬегд, Т.; Бобб, Р.; Наутеагб, Ν.; Ктеок, БВ.Б; 8скойе1б, Р.К.; Апбгеаб1з, А.; 8потебеп, I.; Сгаикигб, Б.; Ыеагу, Б.; Отееп, Е.; ОозРа, В.А.; Нагбу, I.; Соа!е, А.; тап 8те1е!еп, I.; Мапп, Б.; Ьупск, Т.; НеиРпк, Р. (1998). Аззоаакоп ок М1ззепзе апб 5'-8рксе-8ке Ми1аРопз 1п Таи текк !ке [пкегкеб Бетепба ЕТБР-17. Ыа!иге, 393, 702-705.

1апиз, С. е! а1. (2000), Ыа!иге. 408: 979-982.

Каз, Н.8. (1997). к Мкгоепсарзи.1 14: 689-711.

Ьеоп, к; Скепд, С.К.; Ыеитапп, Р.1. (1998). Аккетег'з Б1зеазе Саге:Соз!з апб Ро!епйа1 8атшдз. Неакк Аккапз, 17 (6), 206-216.

Б1рра С.Е. е! а1. (1998) Αβ-42 берозкюп ргесебез о!кег скапдез т Р8-1 Аккетег'з б1зеазе. Ьапсе! 352, 1117-1118.

Био, Б-Б; Vа11асе, V.; Ккссюш, Т.; Шдгат, Б.К.; Ко!к, С.8.; Киз1ак, Εν. (1999). Беа!к ок РС12 Се11з апб Н1рросатра1 Ыеигопз Шбисеб Ьу Абепо-т1га1-Меб1а1еб ЕАБ Нитап Ату1о1б Ргесигзог Рго!ет Сепе Ехргеззюп. 1оигпа1 ок Ыеигозаепсе Кезеагск, 55 (5), 629-642.

Ыагизе, 8.; ТЫпакагап, С.; Био, к-к; Киз1ак, IV.; Тотка, Т.; ИгаРико, Т.; О|ап, X.; Сш!у, Б.Б.; Рпсе, Б.Б.; Вогскек, Б.В.; Vοηд, Р.С.; 81зоб1а, 8.8. (1998). Еккес!з ок Р81 Бейаепсу оп МетЬгапе Рго!еш Тгакйскшд ш Ыеигопз. Ыеигоп, 21 (5), 1213-1231.

ЫаРопа1 ШзРШе оп Адшд Ргодгезз Керой оп Аккетег'з Б1зеазе, 1999, МН РиЬксаРоп № 99-4664.

Р1е!гоЬоп, Р.1 (1995), Ркагт Вю!ескпо1. 6: 347-61 Роогка.), Р.; В1гб, Т.Б.; V^^зтаη, Е.; Ыетепз, Е.; Сагги!о, К.М.; Апбегзоп, Б.; Апбгеаб1з, А.; V^ебе^кο1б, ν.Ο; Казктб, М.; 8ске11епЬегд, С.Б. (1998). Таи к а Сапб1ба!е Сепе ког Скготозоте 17 Егоп!о!етрога1 Бетепба. Аппа1з ок Ыеиго1оду, 43, 815-825.

8скепк, Б.; ВагЬоиг, К.; Бипп, V.; Согбоп, С.; Сга_)еба, Н.; Сшбо, Т.; Ни, К.; Ниапд, к; .Гокпзоп^ооб, К.; Ккап, К.; Кко1обепко, Б.; Бее, М.; Б1ао, Ζ.; Б1еЬеГЬигд, I.; Мокег, К.; МиРег, Б.; 8опапо, Е.; 8корр, С.; Уаздиеζ, Ν.; Уапбетегк С; Vа1ке^, 8.; Vοди1^з, М.; Уебпоск, Т.; Сатез, Б.; 8еиЬеР, Р. (1999). Iттиη^ζаΡοη текк А-Ье!а Акепиа!ез Аккетег'з Б1зеазе-Б1ке Ра!ко1оду ш !ке РБАРР Моизе. Ыа!иге, 400 (6740), 173-177.

8кекипот, В. е! а1. (1999), к Сгуз!а1 Сготе!к 198/199: 1345-1351.

8рШап!1ш, М.С.; Мигге11, кВ.; СоебеР, М.; Еаг1оте, М.К.; К1ид, А.; Ске!Р, В. (1998). Ми!а!юп т !ке Таи Сепе т Еаш1ка1 Ми1Рр1е 8уз!ет Таиора!ку текк Ргезеш1е Бетепйа.

Ргосеебшдз ок !ке Ыа!юпа1 Асабету ок 8аепсез И.8.А., 95 (13), 7737-7741.

8!гк!та!!ег, V.!; 8аипбегз, А.М.; 8сктеске1, Б.; Репсак-Уапсе, М.; Епдкбб, к; 8а1тезеп, С.8.; Козез, А.Б. (1993). Арокрорго!еш Е:Н1дк-Ат1бку Втбшд !о Ар апб кюгеазеб кгедиепсу ок Туре 4 А11е1е т Ба!е-Опзе! Еат1ка1 Аккетег Б1зеазе. Ргосеебшдз ок !ке №йопа1 Асабету ок 8с1епсез И.8.А., 90, 19771981.

У1ба1, К.; Егапдюпе, В.; Коз!адпо, А.; Меаб, 8.; Кеνезζ, Т.; Р1ап!, С.; СЫзо, к (1999). А 8!ор-Собоп Ми!аРоп ш !ке ВК1 Сепе Аззос1а!еб текк Еат1ка1 Впбзк Бетепйа. Ыа!иге, 399: 776-781.

Ζ1ιοι·ι§ Н. (1996). М1се бейшеп! ког !ке ату1о1б ргесигзог рго!ет депе. Апп. Ν Υ Асаб. 8ск, 777, 421426.

Υο^к, Р. (1999), Р8ТТ 11: 430-440.

- 35 011610

Список последовательностей <110> РЬагшеха А/3 <120> Новый способ понижающей регуляции амилоида <130> Р1О14РС1 <14 0>

<141>

<160> 16 <170> Ра-ЬепЫп Уег. 3.1 <210> 1 <211> 2313 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(2313) <220>

<221> разные свойства <222> (2098)..(2169) <223> нуклеотиды, кодирующие трансмембранную область <220>

<221> разные свойства <222> (2014)..(2313) <223> нуклеотиды, кодирующие С-100 <220>

<221> разные свойства <222> (2016)..(2144) <223> АЬеТа 42/43 <22О>

<221> разнь·* свойства <222> (2014)..(2142) <223> АЬеЬа 42/43 <400> 1

а!д с!д ссс дд! !!д дса с!д с!с с!д с!д дсс дсс !дд асд дс! сдд

Ме! 1

Ьеи Рго Е1у

Ьеи 5

А1а Ьеи

Ьеи

Ьеи Ьеи А1а А1а Тгр ТЬг А1а Агд

10

15

дед

с!д

дад

д!а

ссс

ас!

да!

дд!

аа!

дс!

ддс

с!д

дс!

даа

ссс

А1а

Ьеи

С1и

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

61у

Азп

А1а

С1у

Ьеи

А1а

61и

Рго

20

25

30

сад

а!!

дсс

а!д

!!с

!д!

ддс

ада

с!д

аас

а!д

сас

а!д

аа!

д!с

сад

С1п

Не

А1а

Ме!

РНе

Суз

61у Агд

Ьеи

АЗП

Ме!

ΗΪ3

Ме!

Азп

νβΐ

<31п

35

40

45

аа! ддд Аал 61у 50

аад !дд да! !са да! сса кеа ддд асе ааа

асе кде а!!

да! Азр

192

Ьуз Тгр

Азр

Вег

Азр 55

Рго

Вег

б1у

ТЫ Ьуз 60

ТЬг

Суз

11е

асе

аад

даа

ддс

а!с

с!д

сад

!а!

!дс

саа

даа

дке

кас

сс!

даа

с!д

240

ТЬг

Ьуз

61и

61у

Не

Ьеи

Е1л

Туг

Суз

61η

61и

Ча1

Туг

Рго

61 и

Ьеи

65

70

75

80

сад

а!с

асе

аа!

дЬд

д!а

даа

дсс

аас

саа

сса

д!д

асе

а! с

сад

аас

288

<31п

Не

ТЬг

Азп

Ча1

С1и

А1а

АЗП

С1п

Рго

Ча!

ТЬг

11е

С1п

Азп

85

90

95

кдд

Еде

аад

едд

ддс

еде

аад

сад

!дс

аад

асе

са!

ссс

сас

!!!

д*д

336

Тгр

Суз

Ьуз

Агд

61у

Агд

Ьуз

С1п

Суз

Ьуз

ТЬг

Н1з

Рго

Н1з

РЬе

Ча1

100

105

но

а!к

ссс

!ас

еде

к де

!!а

д!!

дд!

дад

кП

дка

ад!

да!

дсс

екк

скс

384

Не

Рго

Туг

Агд

Суз

Ьеи

Ча1

61у

61 и

РЬе

Ча1

Зег

Азр

А1а

Ьеи

115

120

125

д!к

сс!

дас

аад

!дс

ааа

ккс

!!а

сас

сад

дад

адд

а!д

да!

д!!

!дс

432

Ча1

Рго

Азр

Ьуз

Суз

Ьуз

РЬе

Ьеи

ΗΪ3

61 п

61и

Агд

Ме!

Азр

Ча1

Суз

130

135

140

даа

ас!

сак

с!!

сас

’Ьдд

сас

асе

дке

дсс

ааа

дад

аса

кде

ад!

дад

480

61и

ТЫ

Н1з

Ьеи

Н1з

Тгр

Н13

ТЬг

Ча1

А1а

Ьуз

С1и

ТЬг

Суз

Вег

С1и

145

150

155

160

аад

ад!

асе

аас

!!д

са!

дас

!ас

ддс

акд

!!д

с!д

ссс

кде

дда

а!!

528

Ьуз

Зег

ТЬг

Азп

Ьеи

Н1з

Авр

Туг

<31у

Мек

Ьеи

Рго

Суз

61у

11е

165

170

175

дас

аад

!!с

еда

ддд

д!а

дад

!!!

д!д

!д!

кд с

сса

скд

де!

даа

576

Аар Ьуз

РЬе

Агд

б1у

Ча1

61и

РЬе

Ча1

Суз

Рго

Ьеи

А1а

61и

180

185

190

ад!

дас

аа!

д!д

да!

!с!

де!

да!

дед

дад

да!

дас

кед

да!

дке

624

Вег

Азр

Азп

Ча1

Азр

Вег

А1а

Азр

А1а

С1и

б1и

Азр

Вег

Азр

Ча1

195

200

205

Ьдд

!дд

ддс

дда

дса

дае

аса

дас

как

дса

да!

ддд

ад!

даа

дас

ааа

672

Тгр

<31у

й1у

А. 1а

Азр

ТЬг

Азр

Туг

А1а

Азр

61у

Вег

61и

Азр

Ьуз

210

215

220

д!а

дка

даа

дка

дса

дад

даа

д!д

де!

дад

д!д

даа

720

4*1

Ча1

61и

Уа1

А1а

<31и

С1и

Е1и

51и

Ча1

А1а

61 и

Ча1

61и

61 и

225

230

235

240

даа

дсс

да!

дас

дад

дас

да!

дад

да!

дд!

да!

дад

дка

9ад

даа

768

61 и

А1а

Азр

В1и

Азр

61и

Азр

61у Азр

61и

4*1

61и

245

250

255

дад

де!

дад

даа

ссс

!ас

даа

дсс

аса

дад

ада

асе

аде

а!!

816

61и

А1а

Е1и

С1и

Рго

Туг

61и

А1а

ТЬг

61и

Агд

ТЬг

Вег

Не

260

265

270

дсс

асе

аса

дад

кек

дьд

даа

дад

дкд

д!!

еда

864

А1а

ТЫ

ТЬг

Е1и

Вег

Ча1

61и

Ча!

ча!

Агд

275 280 285

- 37 011610

дад дЕд Еде ЕсЕ даа

саа 61п

дес дад асд ддд сед Еде еда дса аЕд

аЕс 11е

912

61«

Уа1 Суз 290

Зег

61«

А1а 61« 295

ТЬг С1у

Рго

Суз 300

Агд

А1а

МеЕ

Есс

еде

Едд

Еас

ЕЕЕ

даЕ

дЕд

асЕ

даа

ддд

аад

ЕдЕ

дес

сса

ЕЕс

ЕЕЕ

960

Зег 305

Агд

ТГР

Туг

РЬе

Азр 310

ν«ι

ТЬг

61«

61у

Ьуз 315

Суз

А1а

Рго

РЬе

РЬе 320

Еас

ддс

дда

ЕдЕ

ддс

аве

едд

аас

ЕЕЕ

дас

аса

даа

дад

Еас

1008

Туг

61у С1у Суз

61у С1у 325

Азп

Агд

Азп

Азп 330

РЬе

Азр

ТЬг

61«

61и 335

Туг

Еде

аЕд

дес

дЕд

ЕдЕ

ддс

аде

дес

аЕд

Есс

саа

адЕ

ЕЕа

СЕС

аад

асЕ

1056

Суа

МеЕ

А1а

νβΐ 340

Суа

С1у

Зег

А1а

МеЕ 345

Зег

61п

Зег

Ьеи

Ьеи 350

Ьуз

ТЬг

асе

сад

даа

ссЕ

сЕЕ

дес

еда

даЕ

ссЕ

дЕЕ

ааа

сЕЕ

ссЕ

аса

дса

1104

ТЬг

61п

61и 355

Рго

Ьеи

А1а

Агд

Азр 360

Рго

Уа1

Ьуз

Ьеи

Рго 365

ТЬг

А1а

дес

адЕ

вес

ссЕ

даЕ

дес

дЕЕ

две

аад

ЕаЕ

СЕС

дад

вса

ССЕ

ддд

даЕ

1152

А1а

Зег 370

ТЬг

Рго

Азр

А1а

νβΐ 375

Азр

Ьуз

Туг

Ьеи

61и 380

ТЬг

Рго

61 у Азр

дад

ааЕ

даа

саЕ

дес

саЕ

ЕЕс

сад

ааа

дес

ааа

дад

адд

сЕЕ

дад

дес

1200

61« 385

Азп

61«

Н1з

А1а

Ηίβ 390

РЬе

61η

Ьуз

А1а

Ьуз 395

61и

Агд

Ьеи

61«

А1а 400

аад

сас

еда

дад

ада

аЕд

Есе

сад

дЕс

аЕд

ада

даа

1дд

даа

дад

дса

1248

Ьуз

Ηί3

Агд

61и

Агд 405

МеЕ

Зег

С1п

Уа1

МеЕ 410

Агд

61и

Тгр

61и

61и 415

А1а

даа

сдЕ

саа

дев

аад

а ас

ЕЕд

ссЕ

ааа

дсЕ

даЕ

аад

дса

дЕЕ

аЕс

1296

61«

Агд

61п

А1а 420

Ьуз

Азп

Ьеи

Рго

Ьуз 425

А1а

Азр

Ьуз

А1а 430

Уа1

11е

сад

саЕ

ЕЕс

сад

дад

ааа

д*д

даа

•ЕсЕ

ЕЕд

даа

сад

даа

дев

дес

аас

1344

61л

Н1з

РЬе 435

61л

61 и

Ьув

Уа1

61и 440

Зег

Ьеи

61 и

61л

61и 445

Айа

А1а

Азп

дад

ада

сад

сЕд

дЕд

дад

аса

сас

аЕд

дес

ада

дЕд даа

дес

аЕд

1392

61«

Агд 450

61п

61 п

Ьеи

7а1

61и 455

ТЬг

Н1з

МеЕ

А1а

Агд 460

Уа1

61«

А1а

МеЕ

сЕс

ааЕ

дас

еде

сЕд

дес

сЕд

дад

аас

Еас

аЕс

асе

дсЕ

сЕд

1440

Ьеи 465

Азп

Азр

Агд

Агд 470

Ье«

А1а

Ьеи

61«

Азп 475

Туг

Не

ТЬг

А1а

Ьеи 480

сад

дсЕ

дЕЕ

ссЕ

едд

ссЕ

сдЕ

сас

дЕд

ЕЕс

ааЕ

аЕд

сЕа

аад

1488

61п

А1а

Уа1

Рго

Рго 485

Агд

Рго

Аид

Н15

Уа1 490

РЬе

Азп

МеЕ

Ьеи

Ьуз 495

Ьуз

ЕаЕ

дЕс

еде

дса

даа

сад

аад

дас

ада

сад

сас

асе

сЕа

аад

саЕ

ЕЕс

1536

Туг

Уа1

Агд

А1а

61«

С1п

Ьуа

Азр

Агд

61п

Ηίβ

ТЬг

Ьеи

Ьуа

Н1в

РЬе

500 505 510

- 38 011610

дад сак дкд

сдс акд дкд дак

ссс аад ааа дсс дек сад акс едд ксс

1584

С1и Н1з

Уа1 515

Агд Мек

Уа1 Азр

Рго 520

Ьуз Ьуз

А1а

А1а 61п Не 525

Агд

Зег

сад

дкк

акд

аса

сас

скс

едк

9*9

акк

как

дад

сдс

акд

аак

сад

кек

1632

61 η

Уа1 530

мек

ТЬг

Н13

Ьеи

Агд 535

Уа1

Не

Тух

£1и

Ахд 540

Мек

Азл

61п

Зех

скс

ксс

скд

скс

кас

аас

дкд

сск

дса

д*д

дсс

дад

акк

сад

дак

1680

Ьеи 545

Зех

Ьеи

Туг

Азп 550

Уа1

Рго

А1а

Уа1

А1а 555

61и

Не

61п

Азр 560

даа

дкк

дак

дад

скд

екк

сад

ааа

дад

саа

аас

как

кса

дак

дас

дке

1728

61и

Уа1

Азр

61 и

Ьеи 565

Ьеи

С1п

Ьуз

61и

61 п 570

Азп

Туг

Зег

Азр

Азр 575

Уа1

Пд

дсс

аас

акд

акк

адк

даа

сса

адд

акс

адк

кас

дда

аас

дак

дек

1776

Ьеи

А1а

Азп

Мек 5В0

Не

Зег

С1и

Рго

Агд 585

Не

Зег

Туг

61у

Азп 590

Азр

А1а

скс

акд

ССа

кек

ккд

асе

даа

асд

ааа

асе

д*д

дад

скс

екк

ссс

1824

Ьеи

Мек

Рго 595

Зег

Ьеи

ТЬг

61и

ТЬг 600

Ьуз

ТЬх

ТЬг

Уа1

61и 605

Ьеи

Рго

9*9

аак

99«

дад

ккс

аде

скд

дас

дак

скс

сад

ссд

кдд

сак

кек

ккк

1872

Уа1

Азп 610

61у

61и

РЬе

Зег

Ьеи 615

Азр

Ьеи

61п

Рхо 620

Тгр

Ηίβ

Зег

РЬе

399

дик

дас

кек

дкд

сса

дсс

аас

аса

даа

аас

даа

дкк

дад

сск

дкк

1920

61у 625

А1а

Азр

Зег

Уа1

Рго 630

А1а

Азп

ТЬг

61и

Азп 635

61и

Уа1

61и

Рго

Уа1 640

да к

дсс

сдс

сск

дек

дсс

дас

еда

дд»

скд

асе

аск

еда

сса

ддк

кек

1968

Азр

А1а

Агд

Рго

А1а 645

А1а

Азр

Агд

61у

Ьеи 650

ТЬг

Ахд

Рхо

61у 655

Зег

999

**д

аса

аак

акс

аад

асд

дад

акс

кек

даа

дкд

аад

акд

дак

2016

61у

Ьеи

ТЬг

Азп 660

Не

Ьуз

ТЬг

61и

С1и 665

Не

Зег

61 и

Уа1

Ьуз 670

Мек

Азр

дса

даа

ккс

еда

сак

дас

кса

дда

как

даа

дкк

сак

саа

ааа

ккд

2064

А1а

С1и

РЬе 675

Ахд

Н1з

Азр

Зег

<51у 680

Тух

61и

Уа1

ΗΪ3

Н1з 685

61п

Ьуз

Ьеи

дкд

ккс

ккк

дса

даа

дак

9*9

ддк

кса

аас

ааа

99*

дса

акс

акк

дда

2112

Уа1

РЬе 690

РЬе

А1а

61и

Азр

Уа1 695

С1у

Зег

Азп

Ьуз

61у 700

А1а

Не

61у

скс

акд

дкд

ддс

ддк

д**

дке

ака

дед

аса

дкд

акс

дке

акс

асе

ккд

2160

Ьеи 705

Мек

Уа1

С1у

Уа1 710

Уа1

Не

А1а

ТЬг

Уа1 715

Не

Уа1

11е

ТЬг

Ьеи 720

д*д

акд

скд

аад

ааа

сад

кас

аса

ксс

акк

сак

ддк

дкд

2208

Уа1

Мек

Ьеи

Ьуз

Ьуз 725

Ьуз

61п

Тух

ТЬг

Зех 730

Не

ΗΪ3

Ηίβ

61у

Уа1 735

УаХ

дад

д**

дас

дсс

дек

дке

асе

сса

дад

сдс

сас

скд

ксс

аад

акд

2256

61и

Уа1

Азр

А1а

Уа1

ТЬг

Рхо

61и

С1и

Агд

Н15

Ьеи

Зег

Ьуз

Мек

740 745 750

- 39 011610

сад

аас ддс кас

даа

аак

сса

асе

к ас

аад

ккс

ккк

дад

сад

акд

2304

С1п

Ляп 61у Туг

С1п

Азп

Рго

ТЬг

Туг

Ьу5

РЬе

61и

С1 п

Мек

755

760

765

сад

аас

кад

2313

С1п Αβη

770 <210> 2 <211> 770 <212> РАТ <213> Ното зарХепз <400> 2

Мек Ьеи Рго С1у Ьеи

А1а

Ьеи Ьеи

Ьеи

Ьеи А1а 10

А1а Тгр

ТЬг

А1а 15

Агд

1

5

А1а

Ьеи

С1и

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

61у

Азп

А1а

С1у

Ьеи

А1а

61 и

Рго

20

25

30

С1п

11е

А 1а

Мек

РЬе

Суз

С1у

Агд

Ьеи

Азп

Мек

Ηί3

Мек

Азп

Уа1

61п

35

40

45

Ляп

61у

Ьуз

Тгр

Азр

Зег

Азр

Рго

Зег

С1у

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Суз

11е

Азр

50

55

60

ТЬг

Ьуз

С1и

61у

11е

Ьеи

61п

Туг

Суз

61п

61 и

Уа1

Туг

Рго

61и

Ьеи

65

70

75

80

51п

Не

ТЬг

Азп

ν»ι

Уа1

С1и

А1а

Азл

С1п

Рго

Уа1

ТЬг

Не

61п

Азп

85

90

95

Тгр

Суз

Ьуз

Агд

61у

Агд

Ьуз

61п

Суз

Ьуз

ТЬг

Н1з

Рго

Шз

РЬе

Уа1

100

105

110

Не

Рго

Туг

Агд

Суз

Ьеи

Уа1

б1у

61и

РЬе

Уа1

Зег

Азр

А1а

Ьеи

115

120

125

Уа1

Рго

Азр

Ьуз

Суз

Ьуз

РЬе

Ьеи

Н1з

С1п

61 и

Агд

Мек

Азр

Уа1

Суз

130

135

140

61и

ТЬг

Н1з

Ьеи

Н13

Тгр

Н1з

ТЬг

Уа1

А1а

Ьуз

61и

ТЬг

Суз

Зег

61и

145

150

155

160

Ьуз

Зег

ТЬг

Азп

Ьеи

Н1з

Азр

Туг

С1у

Мек

Ьеи

Рго

Суз

СХу

Не

165

170

175

Азр

Ьуз

РЬе

Агд

61у

Уа1

С1и

РЬе

Уа1

Суз

Рго

Ьеи

А1а

61и

180

185

190

Зег

Азр

Азп

ν»ι

Азр

Зег

А1а

Азр

А1а

61 и

С1и

Азр

Зег

Азр

УаХ

195

200

205

Тгр

61 у

31у

А1а

Азр

ТЬг

Азр

Туг

А1а

Азр

С1у

Зег

61и

Азр

Ьуз

210

215

220

- 40 011610

Уа1 225

νβΐ

61 и Уа1 А1а 61и 61и 61и 61и 230

7а1

А1а 61и 235

Уа1

61 и

61и

61и 240

61υ

А1а

Азр Азр Азр 245

61а

Азр

61и

Азр 250

61у

Азр

61и

νβΐ

61 и 255

61и

61 и

А1а

61 и

61 и 260

Рго

Туг

С1и

61и

А1а 265

ТЫ

61и

Агд

ТЬг

ТЬг 270

Зег

Не

А1а

ТЬг

ТЬг 275

ТЬг

ТЬг 280

61 и

Зег

νβΐ

61и

61 и 285

Уа1

Агд

С1и

Уа1 290

Суз

Зег

61 и

61п

А1а 295

61 и

ТЬг

С1у

Рго

Суз 300

Агд

А1а

Мек

Не

Зег 305

Агд

Тгр

Туг

РЬе

Азр 310

νβΐ

ТЬг

61и

С1у

Ьуз 315

Суз

А1а

Рго

РЬе

РЬе 320

Туг

61у

Суз

61у 325

61у

Азп

Агд

Азп

Азп 330

РЬе

Азр

ТЬг

61и

61и 335

Туг

Суз

Мек

А1а

νβΐ 340

Суз

61у

Зег

А1а

Мек 345

Зег

61п

Зег

Ьеи

Ьеи 350

Ьуз

ТЬх

ТЬг

61 η

61 и 355

Рго

Ьеи

А1а

Агд

Азр 360

Рго

7а1

Ьуз

Ьеи

Рго 365

ТЬг

ТЫ

А1а

Зег 370

ТЬг

Рго

Азр

А1а

Уа1 375

Азр Ьуз

Туг

Ьеи

61и 380

ТЬг

Рго

61у

Азр

С1и 385

Азп

С1и

Н1з

АЗ а

Н15 390

РЬе

61п

Ьуз

А1а

Ьуз 395

61а

Агд

Ьеи

61и

А1а 400

Ьуз

Н1з

Агд

С1и

Агд 405

Мек

Зег

61п

Уа1

Мек 410

Агд

61и

Тгр

61и

61и 415

А1а

61и

Агд

61п

А1а 420

Ьуз

Азп

Ьеи

Рго

Ьуз 425

А1а

Азр

Ьуз

А1а 430

νβΐ

Не

61п

И1з

РЬе 435

61п

С1и

Ьуз

ν»ι

С1и 440

Зег

Ьеи

С1и

61п

61и 445

А1а

Азп

61 и

Агд 450

61п

Ьеи

ν»1

61и 455

ТЬг

Н±3

Мек

А1а

Агд 460

ν»ι·

61 и

А1а

Мек

Ьеи 4 65

Азп

Азр

Агд Ахд

Агд 470

Ьеи

А1а

Ьеи

61и

Азп 475

Туг

Не

ТЫ

А1а

Ьеи 480

61п

А1а

Уа1

Рго

Рго 485

Агд

Рго

Агд

ΗΪ3

Уа1 490

РЬе

Азп

Мек

Ьеи

Ьуз 495

Ьуз

Тух

Уа1

Агд

А1а 500

61и

61п

Ьуз

Азр

Агд 505

61п

Ηίε

ТЬг

Ьеи

Ьуз 510

Н1з

РЬе

61и

Н1з

Уа1 515

Агд

Мек

7а1

Азр

Рго 520

Ьуз

А1а

61п 525

Не

Агд

Зег

61п

νβΐ 530

Мек

ТЬг

Н1з

Ьеи

Агд 535

Уа1

Не

Туг

61и

Агд 540

Мек

Азп

С1п

Зег

- 41 011610

Ьеи Зег Ьеи Ьеи Туг 545

Азп Уа1 550

Рго А1а

Уа1 А1а 61и 61и 11е 61п Азр

555

560

61и

Уа1

Азр

С1и

Ьеи 565

Ьеи

61п

Ьуз

61и

61п 570

Азп

Туг

Зег

Азр

Азр 575

Уа1

Ьеи

А1а

Азп

Мег 580

Не

Зег

61и

Рго

Агд 585

11е

Зег

Туг 61у

Азп 590

Азр

А1а

Ьеи

МеС

Рго 595

Зег

Ьеи

ТЬг

61и

ТЫ 600

Ьуз

ГЫ

ТЬг

Уа1

61 и 605

Ьеи

Рго

ν»ι

Азп 610

С1у

61 и

РЬе

Зег

Ьеи 615

Азр Азр

Ьеи

61П

Рго 620

Тгр

ΗΪ3

Зег

РЬе

61у 625

А1а

Азр

Зег

νβΐ

Рго 630

А1а

Азп

ТЬг

61и

Азп 635

61и

Уа1

61и

Рго

Уа1 640

Азр

А1а

Агд

Рго

А1а 645

А1а

Азр

Агд

61у

Ьеи 650

ТЬг

Агд

Рго

61у 655

Зег

61у

Ьеи

ТЫ

Азп 660

11е

Ьуз

ТЬг

61и

61и 665

11е

Зег

61и

Уа1

Ьуз 670

мег

Азр

А1а

С1и

РЬе 675

Агд

К1з

Азр

Зег

61у 680

Туг

61и

Уа1

Ηίβ

Н1з 685

61п

Ьуз

Ьеи

Уа1

РЬе 690

РЬе

А1а

61и

Азр

Уа1 695

61у

Зег

Азп

Ьуз

61у 700

А1а

Не

11е

61у

Ьеи 705

МеС

νβΐ

61у 61у

Уа1 710

Уа1

Не

А1а

ТЬг

Уа1 715

11е. Уа1

Не

ТЬг

Ьеи 720

Уа1

Мег

Ьеи

Ьуз

Ьуз 725

Ьуз

61п

Туг

ТЬг

Зег 730

11е

Н1з

Нхз

б1у

Уа1 735

νβΐ

С1и

7а1

Азр

А1а 740

А1а

Уа1

ТЫ

Рго

61 и 745

61и

Агд

ΗΪ3

Ьеи

Зег 750

Ьуз

мег

61п

С1п

Азп 755

61у

Туг

61и

Азп

Рго 760

ТЬг

Туг

Ьуа

РЬе

РЬе 765

61и

61п

Мег

61п Азп

770 <210> 3 <211> 45 <212> ДНК <213> С1озСг1с11ит гегап!

<220>

<221> С05 <222> (1)..(45) <22 3> ДНК, кодирующая эпитоп Ρ2

- 42 011610 <400 3

сад бас

абс

ааа дсб

аас

бсс

ааа

ббс

абс

ддб

абс

асе

дад

ебд

45

С1п Туг

Не

Ьуз А1а

Азп

Зег

Ьуз

РЬе

Не

С1у

Не

ТЬг

С1и

Ьеи

1

5

10

15

<210> 4 <211> 15 <212> РМ <213> С1озбг1сПит бебап!
<400	4
(31п Туг Не Ьуз А1а Азп Зег	Ьуз РЬе Не С1у Не ТЬг <31и	Ьеи
1	5	10	15

<210> 5 <211> 63 <212> ДНК <213> СХозбНкНит бе баш <220>

<221> СОЗ <222> ¢1),.(63) <223> ДНК, кодирующая эпитоп РЗО

<400 5

ебд едб дбб ссд ааа дбб

аде Зег

48

ббс РЬе 1

аас Азп

ббс асе РЬе ТЬг 5

дба аде ббс бдд

Уа1

Зег

РЬе Тгр

Ьеи 10

Агд

Уа1

Рго

Ьуз

ν»ι 15

дсб

аде

сас

ебд

даа

63

А1а

Зег

Н13

Ьеи

С1и

20

<210 6 <211> 21 <212> РКТ <213> С1озбг1с1хит бебапх <400 6

РЬе Азп Азп РЬе ТЬг Уа1 Зег РЬе Тгр Ьеи Агд Уа1 Рго Ьуз Уа1 Бег

1	5	10	15
А1а Бег Н1з Ьеи 61и 20
<210> <211> <212> <213> <223>	7 21 ДНК Синтетическая Синтетический праймер для ПЦР
<400> 7 саасбсадсб беебббеддд С			21
<210	8

- 43 011610

<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Синтетическая
<223>	Синтетический праймер для ПЦР
<400>	8
адаЕсксда! сссдсдаааЕ Ъ				21
<210>	9
<211>	135
<212>	ДНК
<213>	Синтетическая
<223>	Синтетический праймер для ПЦР
<400>	9
аЕддакдсад аакЪссдЬса сдасЬссдд!	^асдаадбЬс	ассассадаа	ас^ддЪНХс	60
СЕсдсадаад аРдЕЬддккс саасаааддС	дсааСсаЬсд	дксГдакддк	ЕддсддЪдЬк	120
д±±а£сдсда сскад				135
<210>	10
<211>	31
<212>	ДНК
<213>	Синтетическая
<223>	Синтетический праймер для ПЦР
<400>	10
дссддссаЬд даЪдсадааЪ Сссд1сасда	с			31
<210>	11
<211>	39
<212>	ДНК
<213>	Синтетическая
<223>	Синтетический праймер для ПЦР
<4 00>	11
дссддаадсЕ ЪсЪаддгСсдс даЕаасааса	ссдссаасс			39
<210>	12
<211>	84
<212>	ДНК
<213>	Синтетическая
<223>	Синтетический праймер для ПЦР
<400>	12
ссддсаадск ЕсЬасадсЬс ддкдакассд	аЬдааЕШдд	адЕЕадсССк	да£д£ас£дд	60
дЕсдсдаЪаа саасассдсс аасс				84
<210>	13
<211>	101
<212>	ДНК
<213>	Синтетическая
<223>	Синтетический праймер для ПЦР
<400>	13
дссддсса'Ьд ддР1£сааса ас£1сассд£	ЪадсЪЪсЪдд	сЪдсдЪдбБс	сдааадМад	60
едсдадссас сЕддаадаЕд садааЪБссд	Ъсасдас1сс	9		101
<210	14

- 44 011610

<211>	172
<212>	ДНК
<213>	Синтетическая
<223>	Синтетический праймер для ПЦР
<400>	14
дддссаадсЪ ЪддаЪссдд!: сдсдаЬааса	асассдссаа	ссаЬсадасс	даЪдаЪСдса	60
ссЪЪЬдЪЪдд аассаасаЬс ЕЬсЬдсдаад	аааассадЬб	ксЬддбддбд	аасЬЬсдЬаа	120
ссддадЬсд£ дасддаасЬс ЪдсаЬссадс	ЬсддСдаЬас	сдаЬдааЕСЬ	99	172
<210>	15
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Синтетическая
<223>	Синтетический праймер для ПЦР
<400	15
сЬддаадаЬд сададЬЕссд ЬсасдасЬсс				30
<210>	16
<211>	35
<212>	ДНК
<213>	Синтетическая
<223>	Синтетический праймер для ПЦР
<400	16
дсдссддаЬс сЪЕсаасаас ЬЬсассдЬ'Ьа	дсЪЕс			35

<21017 <211>13 <212> РАТ <213> Синтетическая <223> Синтетическая последовательность, связывающая Н1А ОК <400>17

А1а Ьуз РЪе Уа1 А1а А1а Тгр ТЬг Ьеи Ьуз А1а А1а А1а

15Ю

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения, профилактики или улучшения состояния у животного, пораженного болезнью Альцгеймера или другими заболеваниями, характеризующимися отложением амилоида, предусматривающий введение фармацевтического препарата, содержащего иммуноген, который:

a) представляет собой полиаминокислоту, полученную из АРР или Аβ, которая состоит по меньшей мере из одной копии подпоследовательности в пределах остатков 673-714 последовательности ЗЕО ΙΌ Ν0:2, в которую введен по меньшей мере один чужеродный Т-хелперный (Τ_Η) эпитоп посредством добавления, и/или вставки, и/или делеции, и/или замены аминокислот, где подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из остатков 1-40, остатков 1-39, остатков 1-35, остатков 1-34, остатков 1-28, остатков 1-12, остатков 1-5, остатков 13-28, остатков 13-35, остатков 17-28, остатков 25-35, остатков 35-40, остатков 36-42 и остатков 35-42 аминокислотной последовательности 673-714 ЗЕО ΙΌ Ν0:2, где РЬе в положении 19 аминокислотных остатков 673-714 ЗЕО ΙΌ Ν0:2 при необходимости может быть замещен предпочтительно Рго; или

b) представляет собой конъюгат, содержащий полигидроксиполимерный остов, к которому присоединена указанная полиаминокислота а); или

c) представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует указанную полиаминокислоту а); или

б) представляет собой непатогенный микроорганизм или вирус, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты, который кодирует и экспрессирует указанную полиаминокислоту а).
2. Способ по п.1, где полиаминокислота или конъюгат содержит по меньшей мере одну первую группу, которая осуществляет нацеливание полиаминокислоты на антигенпредставляющую клетку (ΑΡС) или В-лимфоцит, и/или по меньшей мере одну вторую группу, которая стимулирует иммунную систему, и/или по меньшей мере одну третью группу, которая оптимизирует презентацию полиаминокислоты иммунной системе.
3. Способ по п.2, где первая, и/или вторая, и/или третья группа присоединяется(ются) в качестве

- 45 011610 боковых групп посредством ковалентного или нековалентного связывания к соответствующим химическим группам в последовательности АРР или Аβ.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полиаминокислота или конъюгат содержат несколько копий подпоследовательности, указанной в п.1(а).
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полиаминокислота или конъюгат содержат по меньшей мере один дуплицированный В-клеточный эпитоп АРР или Аβ и/или гаптен.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где чужеродный Т-клеточный эпитоп является иммунодоминантным у животного.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где чужеродный Т-клеточный эпитоп является смешанным, таким как Т-клеточный эпитоп, который выбран из природного смешанного Т-клеточного эпитопа и искусственной связывающей МНС-11 пептидной последовательности.
8. Способ по п.7, где природный Т-клеточный эпитоп выбран из эпитопа анатоксина столбняка, такого как Р2 или Р30, эпитопа дифтерийного анатоксина, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа С8 Р.£а1с1рагит.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полиаминокислота или конъюгат содержат В-клеточные эпитопы, которые не экспонированы во внеклеточную фазу, когда они представлены в связанной с клеткой форме полипептида-предшественника Аβ.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полиаминокислота или конъюгат не содержат по меньшей мере одного В-клеточного эпитопа, который экспонирован во внеклеточную фазу, когда они представлены в связанной с клеткой форме полипептида-предшественника Аβ.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где иммуноген имеет следующую структуру: аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р2, за которыми следуют аминокислотные остатки 1-28 Аβ, затем аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р30, аминокислотные остатки 1-12 Аβ, за которыми следуют аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р30, затем аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р2 и затем аминокислотные остатки 13-28 Аβ, аминокислотные остатки 1-12 Аβ, за которыми следуют аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р30, затем аминокислотные остатки 1-12 Аβ, затем аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р2 и затем аминокислотные остатки 1-12 Аβ, аминокислотные остатки 13-28 Аβ, за которыми следуют аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р30, затем аминокислотные остатки 13-28 Аβ, затем аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р2 и затем аминокислотные остатки 13-28 Аβ, аминокислотные остатки 1-12 Аβ, за которыми следуют аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р30, затем аминокислотные остатки 13-35 Аβ, затем аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р2 и затем аминокислотные остатки 36-42 Аβ, аминокислотные остатки 1-28 Аβ, за которыми следуют аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р30, затем аминокислотные остатки 1-28 Аβ, затем аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р2 и затем аминокислотные остатки 1-28 Аβ и аминокислотные остатки 1-43 Аβ, где Рйе-19 замещен пролином (Рго), а МеХ-35 замещен лизином (Ьук), после чего следуют аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р30, затем аминокислотные остатки эпитопа анатоксина столбняка Р2, при этом все указанные аминокислотные последовательности указаны в направлении от Ν-конца к С-концу.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере две копии полиаминокислоты или конъюгата ковалентно или нековалентно связаны с молекулой-носителем, способной к эффективной презентации множественных копий антигенных детерминант.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полиаминокислота в составе конъюгата прикреплена к полигидроксиполимерному остову посредством амидной связи.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полигидроксиполимерный остов представляет собой полисахарид.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полиаминокислота или конъюгат объединены с адъювантом, который облегчает нарушение аутотолерантности к аутоантигенам.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому фармацевтический препарат вводят путем, выбранным из парентерального пути, такого как внутрикожный, подкожный и внутримышечный пути; перитонеального пути; перорального пути; буккального пути; сублингвального пути; эпидурального пути; спинального пути; анального пути и интракраниального пути.
17. Способ по п.16, где эффективное количество полиаминокислоты или конъюгата в составе фармацевтического препарата составляет от 0,5 до 2000 мкг.
18. Способ по любому из пп.1-11, согласно которому животному вводят нуклеиновую кислоту, кодирующую полиаминокислоту, и таким образом обеспечивают ш νί\Ό экспрессию введенной нуклеино

- 46 011610 вой кислоты.
19. Способ по п.18, где указанная нуклеиновая кислота выбрана из «голой» ДНК; ДНК, объединенной с заряженными или незаряженными липидами; ДНК, помещенной в липосомы; ДНК, включенной в вирусный вектор; ДНК, объединенной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом; ДНК, объединенной с нацеливающим белком или полипептидом; ДНК, объединенной со средством, осаждающим кальций; ДНК, связанной с инертной молекулой-носителем; ДНК, инкапсулированной в хитин или хитозан; и ДНК, объединенной с адъювантом.
20. Способ по любому из пп.16-19, согласно которому фармацевтический препарат вводят по меньшей мере один раз в год, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 раз в год.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, согласно которому АРР или Ав подвергаются понижающей регуляции до такой степени, что общее количество амилоида уменьшается или скорость образования амилоида уменьшается с клинической значимостью.
22. Полиаминокислота или конъюгат, полученный из АРР или Ав животного путем введения модификации, приводящей к тому, что иммунизация животного указанными полиаминокислотой или конъюгатом вызывает продукцию антител против аутологичных АРР или Ав животного, охарактеризованные в любом из пп.1-14.
23. Иммуногенная композиция, содержащая иммуногенно эффективное количество полиаминокислоты или конъюгата по п.22 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель и/или наполнитель и, при необходимости, адъювант.
24. Фрагмент нуклеиновой кислоты, который кодирует полиаминокислоту по п.22.
25. Вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты по п.24, в том числе способный к автономной репликации.
26. Вектор по п.25, который выбран из группы, состоящей из плазмиды, фага, космиды, минихромосомы и вирусного вектора.
27. Вектор по п.25 или 26, содержащий в направлении 5' 3' промотор, функционально связанный с фрагментом нуклеиновой кислоты по п.24 и направляющий его экспрессию, и, при необходимости, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, обеспечивающий секрецию полипептидного фрагмента или его интеграцию в мембрану, и, при необходимости, терминатор.
28. Вектор по любому из пп.25-27, который при введении в клетку хозяина необязательно интегрируется в геном.
29. Вектор по любому из пп.27 или 28, в котором промотор направляет экспрессию фрагмента нуклеиновой кислоты по п.24 в эукариотической клетке и/или в прокариотической клетке.
30. Трансформированная клетка, содержащая вектор по любому из пп.25-29, например трансформированная клетка, способная к репликации фрагмента нуклеиновой кислоты по п.24.
31. Трансформированная клетка по п.30, которая является клеткой микроорганизма, выбранного из бактерий, дрожжей, простейших, или клеткой многоклеточного организма, выбранного из грибов, насекомых, например клеткой §₂ или 8Е, растений или млекопитающих.
32. Трансформированная клетка по п.30 или 31, которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты по п.24, секретирующая или экспонирующая на своей поверхности полиаминокислоту по п.22.
33. Способ по любому из пп.1-11, согласно которому животному вводят непатогенный микроорганизм или вирус, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты, который кодирует и экспрессирует полиаминокислоту.
34. Композиция для индуцирования продукции антител против амилоида, содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.24 или вектор по любому из пп.25-29 и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант.
35. Стабильная клеточная линия, содержащая вектор по любому из пп.25-29, экспрессирующая фрагмент нуклеиновой кислоты по п.24 и необязательно секретирующая или экспонирующая на поверхности клеток полиаминокислоту по п.22.