ES2238049T3 - Peptidos sinteticos inmunogenicos pero no amiloidogenicos homologos a los beta amiloides para la induccion de una respuesta inmunitaria a los depositos amiloides y beta-amiloides. - Google Patents
Peptidos sinteticos inmunogenicos pero no amiloidogenicos homologos a los beta amiloides para la induccion de una respuesta inmunitaria a los depositos amiloides y beta-amiloides.Info
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Abstract
Un péptido aislado representado por la fórmula (A)m ¿ (N-Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5-C)n- (B)p donde: m es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10; p es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10; A es Lys o Asp; B es Lys o Asp; n es 1 ó 2 N es residuos 1-16 de ID SEC NRO.:1; C es residuos 22-30 de ID SEC NRO.:1; Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 y Xaa5 son Leu, Val, Phe, Phe, y Ala, respectivamente, en la que ninguno, uno o dos de los residuos Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 y Xaa5 se sustituyen por Lys, Asp, o Glu; y cuando cero residuos se sustituyen, o bien m o bien p, o ambos, no son cero.
Description
Péptidos sintéticos inmunogénicos pero no
amiloidogénicos homólogos a los beta amiloides para la inducción de
una respuesta inmunitaria a los depósitos amiloides y
beta-amiloides.
La presente invención se relaciona con el campo
de los péptidos beta-amiloides y con un método para
inducir una respuesta inmunitaria a los péptidos
beta-amiloides y a los depósitos amiloides.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más
frecuente de demencia senil (Soto et alt., 1994), y
constituye la cuarta causa de muerte en Estados Unidos.
Aproximadamente el 10% de la población de más de 65 años está
afectada por este trastorno degenerativo progresivo que se
caracteriza por pérdida de la memoria, confusión, y una serie de
discapacidades cognitivas. Neuropatológicamente, la EA se
caracteriza por cuatro lesiones importantes: a) depósito
intraneuronal, citoplasmático, de ovillos neurofibrilares (ONF), b)
depósitos amiloides parenquimatosos denominados placas neuríticas,
c) amiloidosis cerebrovascular, y d) pérdida neuronal y de sinapsis.
Uno de los acontecimientos clave en la EA es el depósito de
amiloides en forma de masas fibrosas insolubles (amiloidogénesis),
lo que da lugar a la formación de placas neuríticas extracelulares y
depósitos alrededor de las paredes de los vasos sanguíneos
cerebrales. El componente principal de las placas neuríticas y la
angiopatía congofílica es el beta-amiloide
(\betaA), aunque estos depósitos también contienen otras proteínas
como los glucosaminoglicanos y las apolipoproteínas.
El \betaA es un péptido hidrofóbico
4.1-4.3 kDa codificado en el cromosoma 21 como parte
de una proteína precursora del amiloide mucho más grande (PPA)
(Muller-Hill et alt., 1989). La PPA comienza
con una secuencia líder (péptido de señal), seguida de una región
rica en cisteína, un dominio altamente acídico, un motivo inhibidor
de la proteasa, una región putativa N-glicosilatada,
un dominio de transmembrana, y, finalmente, una región
citoplasmática pequeña. La secuencia \betaA comienza cerca de la
membrana en la parte extracelular y termina dentro de la membrana.
Dos tercios de \betaA dan al espacio extracelular y el otro tercio
está insertado en la membrana (Kang et alt., 1987 y Dyrks
et alt., 1988). Varios hechos indicativos sugieren que el
amiloide pudiera jugar un papel central en la patogénesis precoz de
la EA.
La evidencia de que el amiloide pueda jugar un
papel importante en la patogénesis precoz de la EA proviene,
fundamentalmente, de estudios de personas afectadas por la forma
familiar de la EA (EAF) o por el síndrome de Down. Los pacientes con
síndrome de Down tienen tres copias del gen PPA y desarrollan
neuropatología de EA a una edad temprana (Wisniewski et alt.,
1985). El análisis genético de las familias con EA hereditaria
reveló mutaciones en el cromosoma 21, cerca o dentro de la secuencia
\betaA (Forsell et alt., 1995), además de mutaciones dentro
de los genes de la presenilina 1 y 2. Más aún, se reportó que los
ratones transgénicos que expresaban niveles elevados de PPA mutante
humana desarrollaban progresivamente amiloidosis cerebral (Games
et alt., 1995). Estos hallazgos parecen implicar a la
amiloidogénesis en la fisiopatología de la EA. Además, las fibrillas
de \betaA son tóxicas en cultivos neuronales (Yankner et
alt., 1989) y, hasta cierto punto, cuando se inyectan en los
cerebros de animales (Sigurdsson et alt., 1996 y 1997).
Además, otros hechos indicativos sugieren que el
depósito de \betaA es el factor desencadenante principal en la
patogénesis de la EA, lo que subsecuentemente origina la formación
de ONF y la pérdida neuronal. Los depósitos amiloides en la EA
comparten una serie de propiedades con las demás amiloidosis
cerebrales, como las amiloidosis relacionadas con el prión, así como
las amiloidosis sistémicas. Estas características son: 1) ser
relativamente insolubles; 2) poseer una estructura secundaria de
hoja-\beta, que se asocia con una tendencia a la
agregación o la polimerización; 3) ultraestructuralmente, los
depósitos son fundamentalmente fibrilares; 4) la presencia de
ciertas proteínas asociadas con el amiloide, como el componente
P-amiloide, los proteoglicanos y las
apolipoproteínas; 5) los depósitos muestran una típica
birrefringencia verde manzana cuando se observan bajo luz polarizada
después de su tinción con rojo Congo.
Se halló el mismo péptido que forma los depósitos
amiloides en el cerebro afectado por la EA en una forma soluble
(\betaAs) que, por regla general, circula por los líquidos del
cuerpo humano (Seubert et alt., 1992 y Shoji et alt.,
1992). Zlokovic et alt. (1994) reportaron que la barrera
hematoencefálica (BHE) tiene la capacidad de controlar el secuestro
y el transporte cerebrovascular de la \betaAs circulante, y que el
transporte de dicha \betaAs a través de la BHE se elevó
significativamente cuando se perfundió \betaAs en cobayas en forma
de complejo con apolipoproteína J (apoJ). Se halló complejo
\betaAs-apoJ en el líquido cefalorraquídeo normal
(LCR; Ghiso et alt., 1994), y estudios in vivo
revelaron que la \betaAs se transportaba con la apoJ como un
componente de las lipoproteínas de alta densidad (LAD) en el plasma
humano normal (Koudinov et alt., 1994). Zlokovic et
alt. (1996) reportaron, asimismo, que el transporte de la
\betaAs a través de la BHE casi se abolía cuando se bloqueaba el
receptor apoJ gp330. Se cree que la conversión de la \betaAs en
fibrillas insolubles se inicia por una modificación conformacional
de la forma soluble más larga del aminoácido 2-3. Se
ha sugerido que la formación de amiloide es un fenómeno dependiente
de la nucleación, en el que la "semilla" inicial insoluble
permite el depósito selectivo de amiloide (Jarrett et alt.,
1993).
Los péptidos que contienen la secuencia
1-40 ó 1-42 de \betaA y los
derivados más cortos pueden formar fibrillas de tipo amiloidal en
ausencia de otras proteínas (Soto et alt., 1994), lo que
sugiere que el potencial para formar amiloide reside
fundamentalmente en la estructura de \betaA. Se analizó la
relación entre la estructura primaria de \betaA y su capacidad
para formar fibrillas de tipo amiloidal alterando la secuencia del
péptido. La substitución de los residuos hidrofílicos por unos
hidrofóbicos en las regiones hidrofóbicas internas de \betaA
(aminoácidos 17-21) dificulta la formación de
fibrillas (Hilbich et alt., 1992), lo que sugiere que el
ensamblaje de \betaA está guiado en parte por interacciones
hidrofóbicas. De hecho, los péptidos \betaA más grandes
(\betaA1-42/43) que constan de dos o tres residuos
C-terminal hidrofóbicos adicionales son más
amiloidogénicos (Jarrett et alt., 1993).
En segundo lugar, la conformación adoptada por
los péptidos \betaA es crucial en la formación de amiloide. Los
péptidos \betaA incubados a diferentes concentraciones de pH y
disolventes pueden tener o bien una estructura en su mayor parte de
\alpha-hélice, de espiral aleatoria o una
estructura secundaria de hoja-\beta (Barrow et
alt., 1992; Burdick et alt., 1992 y Zagorski et
alt., 1992). El péptido \betaA con estructura en
\alpha-hélice o espiral aleatoria se agrega
lentamente; el \betaA con conformación de estructura
hoja-\beta se agrega rápidamente (Zagorski et
alt., 1992; Soto et alt., 1995 y Soto et alt.,
1996). Se ha sugerido también la importancia de la hidrofobicidad y
la estructura secundaria de hoja-\beta en la
formación de amiloide mediante la comparación de la secuencia de
otras proteínas amiloidogénicas.
El análisis de la agregación de \betaA por
determinación de turbidez indica que la longitud del dominio
C-terminal de \betaA influye en la tasa de
ensamblaje de \betaA al acelerar la formación del núcleo (Jarrett
et alt., 1993). Por consiguiente, el dominio
C-terminal de \betaA podría regular la
fibrilogénesis. Sin embargo, moduladores in vitro de la
formación de \betaA, como cationes metálicos (Zn, Al) (Bush et
alt., 1994 y Exley et alt., 1993), sulfato de heparina,
proteoglicanos, y apolipoproteína E (Strittmatter et alt.,
1993) interactúan con la región 12-28 de \betaA.
Más aún, las mutaciones del gen PPA dentro del dominio
N-terminal de \betaA producen análogos más
fibrilogénicos (Soto et alt., 1995 y Wisniewski et
alt., 1991). Finalmente, mientras que el dominio
C-terminal de \betaA adopta invariablemente una
estructura de filamento-\beta en soluciones
acuosas, los parámetros medioambientales determinan la existencia de
una conformación alternativa en el dominio
N-terminal de \betaA (Barrow et alt., 1992;
Soto et alt., 1995 y Burdick et alt., 1992). Por lo
tanto, el N-terminal podría constituir un objetivo
potencial para la inhibición de la espiral aleatoria inicial a un
cambio conformacional de hoja-\beta.
La idea que surge de los estudios con péptidos
sintéticos es que la formación de \betaA depende de las
interacciones hidrofóbicas de los péptidos \betaA que adoptan una
conformación antiparalela de hoja-\beta, y que
tanto los dominios de N-terminal como los de
C-terminal son importantes para la formación de
amiloide. La unidad básica de la formación fibrilar parece ser la
conformación antiparalela de hoja-\beta compuesta
de filamentos que abarcan las regiones 10-24 y
29-40/42 del péptido (Soto et alt., 1994). La
formación de amiloide progresa por medio de interacciones
intermoleculares entre los filamentos-\beta de
varios monómeros para formar una estructura oligomérica de
hoja-\beta precursora de la conformación
entrecruzada-\beta fibrilar. Wood et alt.,
(1995) reportaron la inserción de prolinas bloqueadoras de la
agregación en proteínas amiloides y péptidos a fin de prevenir la
agregación de dichas proteínas y péptidos. De esta manera, los
autores sugieren que se pueden diseñar proteínas nuevas para evitar
el problema de la agregación como una barrera a su producción, sin
afectar la estructura o función de la proteína nativa. Por
consiguiente, Wood et alt., tratan de producir proteínas
nuevas que no se agregarían durante la producción y purificación de
proteínas recombinantes, mediante la inserción de prolinas
bloqueadores de la agregación en estos péptidos nuevos.
Hasta el presente, no existe ni cura ni terapia
eficaz para reducir la carga amiloide de un paciente o prevenir el
depósito de amiloide en la EA, e incluso el diagnóstico de EA sólo
se puede hacer tras examen postmortem del tejido cerebral para
hallar los ovillos neurofibrilares (ONF) característicos y las
placas neuríticas. Sin embargo, va en aumento el número de
publicaciones que delinean las estrategias para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer. Las estrategias terapéuticas relacionadas
con el amiloide contemplan el uso de compuestos que afectan el
procesamiento de la proteína precursora del
\beta-amiloide (PPA; Dovey et alt., 2001),
que interfieren con la formación de fibrillas o que promueve el
desacople de las fibrillas (Soto et alt., 1998; Sigurdsson
et alt., 2000, y Findels, 2000).
Se ha identificado el sulfato de heparina
(glucosaminoglicano) o el sulfato de heparina proteoglicano,
perlecano, como componentes de todos los amiloides, y se les ha
implicado en las fases precoces de la inflamación asociada a la
inducción amiloide. Kisilevsky et alt. (1995) describen el
uso de compuestos de sulfonato o sulfato aniónico de bajo peso
molecular (135-1000 Da) que interfieren con la
interacción del sulfato de heparina con el precursor amiloide
asociado a la inflamación y el péptido-\beta de la
EA. El sulfato de heparina influye específicamente en el precursor
amiloide soluble (PAS2) para adoptar una estructura mayor de
hoja-\beta característica del patrón de proteína
plegada de los amiloides. Se demostró que estos compuestos de
sulfonatos o sulfatos aniónicos inhibían la formación de fibrillas
\betaA acelerada por heparina de la enfermedad de Alzheimer y eran
capaces de desacoplar las fibrillas preformadas in vitro tal
como reveló el control mediante micrografía de electrones. Además,
al administrarse por vía oral en concentraciones relativamente altas
(20 ó 50 mM), estos compuestos detenían de forma importante la
inflamación esplénica en murinos asociada con la progresión amiloide
in vivo en modelos agudos y crónicos. Sin embargo, el
compuesto más potente, poli-(vinilsulfonato), produjo una toxicidad
aguda.
Se ha observado clínicamente que la antraciclina
4'-iodo-4'deoxidoxorrubicina (IDOX)
induce la resorción amiloide en los pacientes con amiloidosis de
inmunoglobulina de cadena ligera (AL). Merlini et alt.
(1995), elucidaron este mecanismo de acción. Se halló que IDOX se
unía estrechamente por medio de interacciones hidrofóbicas a dos
lugares de unión diferentes (análisis Scatchard) en cinco fibrillas
amiloides distintas de prueba, inhibiendo la fibrilogénesis y la
subsiguiente formación de depósitos amiloides in vitro. La
preincubación de IDOX con factor potenciador de amiloide (FPA)
también redujo la formación de depósitos amiloides. Se confirmó
in vivo la selección específica de los depósitos amiloides
por parte de IDOX en los modelos agudos en murinos. Esta unión es
diferente de la unión del sulfato de heparina puesto que la
extracción de los glucosaminoglicanos de las fibrillas de amiloide
extraídas con heparinasas no modificaron la unión de IDOX. La
característica estructural común de todos los amiloides es la
conformación de hoja-\beta plegada. Sin embargo,
IDOX no se une con las cadenas ligeras del precursor de amiloide
nativo, lo que sugiere que la hoja-\beta plegada
por sí sola no es suficiente para formar la estructura óptima para
la unión de IDOX, y que es la estructura cuaternaria de la fibrilla
de la hoja-\beta entrecruzada la que se requiere
para una máxima unión de IDOX. Se ha descubierto que la cantidad de
IDOX extraída de los bazos está correlacionada con la carga amiloide
y los niveles de precursor de amiloide circulantes en el suero. Sin
embargo, IDOX es también extremadamente tóxico.
Se ha investigado en la patente de EE.UU.
5.385.915 y WO 9427603 la regulación y el procesamiento de la
proteína precursora de amiloide (PPA) mediante la inhibición o
modulación de la fosforilación de las proteínas de control de la
PPA. Se ha examinado también en AU 9338358 y EP569777 la modulación
del procesamiento proteolítico de la PPA a formas nucleantes de la
EA. WO 95046477 revela péptidos sintéticos de composición
X-X-N-X (ID SEC
NRO.:69) unidos a un portador, donde X es un aminoácido catiónico y
N es un aminoácido neutro, que inhibe el emparejamiento de \betaA
al glucosaminoglicano. En WO 9203474 se revelan los péptidos con
secuencias \betaA de la enfermedad de Alzheimer que inhiben el
emparejamiento de
\alpha-1-antiquimotripsina y
\betaA.
A partir de experimentos realizados en el
laboratorio de los presentes inventores, WO 96/39834 revela que se
pueden usar los péptidos capaces de interactuar con una porción
hidrofóbica en una proteína o péptido, como \betaA, involucrada en
la formación de depósitos similares a los amiloides, para inhibir y
bloquear estructuralmente el plegado anómalo de dichas proteínas y
péptidos en depósitos amiloides o de tipo amiloidal. Los péptidos
que bloquean el plegado anómalo de \betaA en depósitos amiloides
poseen una porción hidrofóbica que contiene residuo o residuos
aminoácidos que desestructuran la hoja-\beta, como
la prolina, y que reducen la propensión del péptido a adoptar una
conformación en hoja-\beta. El laboratorio de los
presentes inventores, en informes posteriores, ha demostrado que
LeuProPhePheAsp (ID SEC NRO.:14), un péptido no amiloidogénico con
secuencia homóloga a \betaA, bloquea la formación de fibrillas
(Soto et alt., 1998) e induce el desacople in vivo de
los depósitos \betaA fibrilares (Sigurdsson et alt.,
2000).
Pallitto et alt. (1999) propusieron
recientemente el emparejamiento de residuos de lisina con péptidos
para el diseño de péptidos anti hoja-\beta o
inhibidores de la fibrilogénesis de \betaA que posean una
secuencia de reconocimiento de unión-\betaA y un
elemento hexamérico perturbador de la agregación de lisina.
Estudios in vitro han revelado que los
anticuerpos monoclonales formados contra la región
N-terminal de \betaA pueden desagregar las
fibrillas \betaA, conservar la solubilidad de \betaA y prevenir
la toxicidad de \betaA en cultivos celulares (Solomon et
alt., 1996 y 1997).
WO 96/25435 revela el potencial para usar un
anticuerpo monoclonal, que es específico de terminación para la
C-terminal libre del péptido
\betaA1-42, pero no para el péptido
\betaA1-43, a fin de prevenir la agregación de
\betaA1-42. Se revela posteriormente que la
administración de dicho anticuerpo monoclonal específico de
terminación de \betaA interactúa con el residuo libre
C-terminal de \betaA1-42,
afectando e interfiriendo con la agregación que pudiera ser
patogénica en la EA.
WO 98/44955 adopta un enfoque diferente para
evitar los problemas asociados con la administración repetida de una
substancia farmacológica, y presenta un método para prevenir el
comienzo de la enfermedad de Alzheimer o para inhibir la progresión
de la enfermedad de Alzheimer a través de una expresión ectópica
estable en el cerebro de anticuerpos recombinantes específicos de
terminación para los péptidos \beta-amiloides.
Recientemente, Schenk et alt. (1999)
demostraron que la inmunización con \beta-amiloide
atenuaba la patología similar a la enfermedad de Alzheimer en los
ratones transgénicos PDPPA que sirven como modelos animales para los
depósitos de \beta-amiloides y las neuropatologías
del tipo de la enfermedad de Alzheimer. Los autores reportaron que
la inmunización de animales jóvenes antes del comienzo de las
neuropatologías del tipo de la enfermedad de Alzheimer prevenía,
fundamentalmente, el desarrollo de la formación de placa
\beta-amiloide, distrofia neurítica y
astrogliosis, mientras que se observó que el tratamiento en animales
más viejos después del comienzo de neuropatologías del tipo de la
enfermedad de Alzheimer disminuía el alcance y la progresión de
estas neuropatologías. Se piensa que este efecto está mediado por
anticuerpos, puesto que se ha mostrado que anticuerpos
anti-\betaA administrados por vía periférica
reducen la carga amiloide del parénquima cerebral (Bard et
alt., 2000). Además, la inmunización intranasal con
\betaA1-40 recién solubilizado disminuye la carga
amiloide en el cerebro (Weiner et alt., 2000). Dos estudios
recientes demostraron que una disminución inducida por la vacunación
en los depósitos amiloides cerebrales dio lugar a una mejoría
cognitiva (Morgan et alt., 2000; Janus et alt.,
2000).
Aunque los resultados reportados por Schenk y
cols. son prometedores de cara al uso de la inmunomodulación como
enfoque general para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer,
la inmunización con \beta-amiloide intacto, según
Schenk y cols. presenta problemas que lo hacen inapropiado para el
uso humano. En primer lugar, los experimentos de Schenk y cols.
utilizaron ratones transgénicos que expresan una proteína humana
mutada que les es extraña y que no tiene ninguna función fisiológica
en los ratones (las secuencias del péptido \betaA en el ratón y el
ser humano son significativamente diferentes). Sin embargo, en los
humanos, la proteína precursora (PP\betaA) es una proteína
endógena que cumple una función normal. De ahí que la utilización de
este enfoque en los seres humanos con un péptido \betaA humano
podría muy bien llevar al desarrollo de un trastorno o enfermedad
autoinmunitaria que podría empeorar las cosas en vez de mejorarlas.
En segundo lugar, B. Zlokovic (1997) y los presentes inventores han
logrado resultados que demuestran que los péptidos \betaA,
\betaA1-42 y \betaA1-40 pueden
cruzar la barrera hematoencefálica en animales de experimentación.
Por consiguiente, se espera que, en los seres humanos, el péptido
\betaA1-42, usado para inmunización por Schenk y
cols. pueda cruzar la barrera hematoencefálica y codepositarse en
alguna de las placas de amiloide existentes aumentando la toxicidad,
y podría, de hecho, inducir la formación de placas. Esto no ha
constituido un problema en el modelo de ratón transgénico PDPPA para
la EA porque el péptido humano \betaA1-42 es menos
tóxico para el ratón; incluso si hubiera un depósito masivo de
péptido \betaA1-42 humano, ninguno de los ratones
transgénicos mostrarían una pérdida neuronal significativa. En
tercer lugar, Schenk y cols. usan una sustancia tóxica como
coadyuvante para inducir una respuesta inmunitaria.
La presente invención proporciona un péptido
sintético inmunogénico, pero no amiloidogénico, homólogo al
\beta-amiloide que puede usarse para inducir una
respuesta inmunitaria a los péptidos
\beta-amiloides y a los depósitos amiloides, y que
superaría o evitaría las complicaciones y los problemas encontrados
en las investigaciones hasta la fecha.
El péptido sintético inmunogénico, pero no
amiloidogénico, homólogo al beta-amiloide abarca los
primeros treinta residuos aminoácidos de
\betaA1-42 (ID SEC NRO.:1), en la que se
sustituyen cero, uno, o dos residuos 17-21 con Lys,
Asp, o Glu, e incluye, de preferencia, un segmento
N-terminal y/o C-terminal de
residuos 4-10 de Lys o Asp.
La presente invención también proporciona un
conjugado en el que el péptido se entrecruza con una molécula
polimérica inmunoestimuladora.
Otro aspecto de la presente invención está
dirigido a una substancia inmunizadora/vacuna que contiene una
cantidad eficaz inmunizante del péptido sintético inmunogénico, pero
no amiloidogénico, homólogo al \beta-amiloide o un
conjugado derivado.
Un aspecto posterior de la presente invención
está enfocado a un método para la inmunoterapia a fin de inducir una
respuesta inmunitaria a los péptidos
\beta-amiloides y a los depósitos amiloides.
Otro aspecto de la invención está dirigido a las
moléculas que incluyen la porción de unión al antígeno de un
anticuerpo contra el péptido sintético inmunogénico, pero no
amiloidogénico, de acuerdo con la presente invención. Se
proporcionan, asimismo, compuestos farmacéuticos que contienen esta
molécula de unión al péptido y un método para reducir la formación
de fibrillas amiloides y depósitos.
La figura 1 muestra los resultados de un ensayo
fluorométrico de tioflavina T. La formación de fibrillas de
\betaA1-42,
\betaA1-30-NH_{2}, y
K6\betaA1-30-NH_{2} (ID SEC
NRO.:6) se determinó in vitro tras la incubación a 37ºC.
K6\betaA1-30-NH^{2} fue el único
péptido que no formó fibrillas en ninguno de los tiempos
determinados.
Las figuras 2A y 2B muestran que \betaA40 y
\betaA42 son tóxicos para las células del neuroblastoma humano
(SK-N-SH) en cultivos, tal y como se
determinó en el ensayo MTT, mientras que el
K6A\betaA30-NH_{2} no tiene efecto a los 2 días
(Fig. 2A) y es ligeramente trófico a los 6 días (Fig. 2B). *p
< 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001
comparado con el grupo VEH (ANOVA de un factor).
Las figuras 3A-3D muestran
secciones coronales (X50; aumento original) teñidas con 6E10 anti
\betaA, a través del hipocampo y corteza cerebral en un ratón de
control Tg (Fig. 3A) y en un ratón Tg tratado con
K6\betaA1-30 (Fig. 3B). Las figs. 3C y 3D son
secciones adyacentes (X100) doblemente teñidas para la
interleucina-1 que identifica la microglía y
\betaA. Cabe notar la disminución de la carga amiloide en el ratón
imunizado (Fig. 3B), y la carencia de microglía ramificada (Fig. 3D)
rodeando a la placa \betaA en el mismo ratón, comparado con el
ratón de control (Fig. 3A, 3C). Las barras en las figs. 3A y 3C son
de 100\mum. Abreviaciones: hip = hipocampo; cx = corteza; cc =
cuerpo calloso.
Las figuras 4A-4C muestran la
disminución en la carga amiloide de la corteza (Fig. 4A) y del
hipocampo (Fig. 4B) carga amiloide (6E10) tras 7 meses de
tratamiento con K6\betaA130-NH_{2}. Se observa
una disminución del 89% de la carga amiloide cortical (*p =
0,0002; prueba-t; n = 4 por grupo) y una disminución
del 81% en la carga amiloide del hipocampo (*p = 0,0001). Los
niveles de \betaA1-42 soluble (Fig. 4C) bajan a un
57% en los cerebros de los ratones vacunados (*p =
0,0019).
La figura 5 muestra los resultados del ensayo
fluorométrico de tioflavina T. La formación de fibillas de
\betaA1-42, \betaA1-40,
\betaA1-30-NH_{2} n,
\betaA1-30K6,
\betaA1-30-NH_{2}
(EE_{18,19}) y
\betaA1-30-NH_{2}(DD_{18,19})
se determinó in vitro tras incubación a 37ºC.
Las figuras 6A y 6B muestran los resultados del
ensayo de toxicidad celular MTT. Se determinó la neurotoxicidad de
\betaA1-42, \betaA1-40,
\betaA1-30-NH_{2}, K6\betaA
1-30-NH_{2},
\betaA1-30K6,
\betaA1-30-NH_{2}(EE_{18,19})
y
\betaA1-30-NH_{2}(DD_{18,19})
tras el tratamiento de las células del neuroblastoma humano
(SK-N-SH) durante 2 (Fig. 6A) y 6
(Fig. 6B) días. *p < 0,05; **p < 0,01;
***p < 0,001 comparado con el grupo VEH (ANOVA de un
factor).
Los presentes inventores han diseñado péptidos
sintéticos no amiloidogénicos homólogos al
beta-amiloide (\betaA) que poseen no sólo una
menor capacidad de adoptar una conformación de
hoja-\beta como fuente antigénica sino que también
ofrecerían un riesgo mucho menor de producir efectos tóxicos en los
seres humanos. Al usar los péptidos sintéticos no amiloidogénicos, o
conjugados derivados, en un compuesto inmunizante, la presente
invención proporciona un medio para lograr que los péptidos \betaA
y los depósitos amiloides se conviertan en blanco del sistema
inmunitario. Un objetivo importante de la presente invención es, por
consiguiente, proporcionar un método de inmunización que minimice la
toxicidad asociada con la inyección de péptidos \betaA al mismo
tiempo que maximice la respuesta inmunitaria a los péptidos \betaA
y a los depósitos amiloides.
Los péptidos sintéticos inmugénicos, pero no
amiloidogénicos, homólogos al \betaA, según la presente invención,
han sido diseñados para reducir el potencial fibrilogénico y, al
mismo tiempo, mantener los dos lugares principales inmunogénicos de
los péptidos \betaA, que son los residuos 1-11 y
22-28 de \betaA1-42 basados en el
índice antigénico de Jameson et alt. (1988) y los
resultados/observaciones obtenidos en el laboratorio de los
presentes inventores. En consecuencia, los presentes inventores han
basado el diseño del péptido sintético no amiloidogénico en los
primeros treinta residuos de aminoácidos (ID SEC NRO.:1) de
\betaA1-42, en el que uno o dos de los residuos
hidrofóbicos en posición 17-21 de la ID SEC NRO.:1
se han sustituido por residuos cargados de Lys, Asp, o Glu. Los
primeros treinta residuos de \betaA carecen de la
C-terminal hidrofóbica de
\betaA1-42, pero conservan las dos regiones
inmunogénicas correspondientes a los residuos 1-11 y
22-28 de la ID SEC NRO.:1.
Al modificar uno o dos de los residuos en las
posiciones 17-21 de \betaA1-30 (ID
SEC NRO.:1) con Lys, Asp, o Glu, que son residuos hidrofílicos que
presentan una baja probabilidad de adoptar una conformación de
hoja-\beta, se reduce en gran manera el potencial
fibrilogénico del péptido. Los ID SEC NRO.: 12 y 13 son ejemplos de
los \betaA1-30 modificados. Además, la presencia
de una serie de residuos de Lys o Asp en la
N-terminal y/o en la C-terminal del
péptido sintético de la presente invención, potenciaría aún más la
inmunogenicidad (Werdelin, 1981) y reduciría la propensión del
péptido sintético a adoptar una conformación de
hoja-\beta y de formar depósitos o fibrillas de
amiloide. Pallitto et alt. (1999) han propuesto el
emparejamiento de residuos de lisina con péptidos \betaA de 4 a 8
residuos de longitud para el diseño de péptidos
anti-hoja-\beta o de inhibidores
de la fibrilogénesis de \betaA, pero nunca se ha propuesto el uso
de los péptidos de Pallitto como inmunógenos. Se han usado
previamente los aminoácidos policatiónicos para potenciar el
transporte de proteínas a las células por procesos de
endocitosis/fagocitosis (Martinez-Fong et
alt., 1994; Wang et alt., 1989; Shen et alt.,
1985; Peterson et alt., 1984; Deierkauf et alt., 1977;
DiNicola et alt., 2000). Buschle et alt. (1997)
reportaron que los aminoácidos policatiónicos potenciaban la
captación de los péptidos por células presentadoras de antígenos,
iniciando así una respuesta inmunitaria. Los autores también
reportaron que mientras que la captación del péptido mediado por
polilisina parece deberse a una permeabilización, al menos pasajera,
de las membranas celulares, la producción de péptidos en presencia
de poliarginina podría depender de los procesos endocíticos.
El péptido sintético inmugénico, pero no
amiloidogénico, homólogo al \betaA de acuerdo con la presente
invención, que no se considera un péptido inhibidor de la
fibrilogénesis \betaA, está representado en la fórmula
(A)_{m} -
(N-Xaa_{1}Xaa_{2}Xaa_{3}Xaa_{4}Xaa_{5}-C)_{n}-(B)_{p}
donde: m es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó
10;
p es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10;
A es Lys o Asp;;
B es Lys o Asp;;
N es 1 ó 2
N es residuos 1-16 de ID SEC
NRO.:1;
C es residuos 22-30 de ID SEC
NRO.:1;
Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4},
Xaa_{5} son Leu, Val, Phe, Phe, y Ala, respectivamente, en el que
ninguno, uno o dos residuos de Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3},
Xaa_{4}, Xaa_{5} se sustituyen con Lys, Asp, o Glu; y
cuando se sustituyen cero residuos, alguno o
ambos de m o p, no son nulos.
Las secuencias de aminoácidos del péptido
representadas por la fórmula anterior se presentan e identifican
como ID SEC NRO.:2-5.
La secuencia básica de treinta aminoácidos
(\betaA1-30) en la que ninguno, uno o dos de los
residuos 17-21 se sustituyen está representada en la
fórmula precedente por
N-Xaa_{1}Xaa_{2}Xaa_{3}Xaa_{4}Xaa_{5}-C.
Este segmento de residuo de treinta aminoácidos se puede repetir (n
es 2) en el péptido sintético de acuerdo con la presente invención.
Preferiblemente, un segmento de polilisina o poliaspartato de 4 a 10
residuos está presente en el N-terminal y/o
C-terminal del péptido. Cuando no se sustituyen
residuos en los residuos 17-21 de
\betaA1-30, el péptido tiene un segmento de
polilisina o poliaspartato de 4 a 10 residuos en el
N-terminal y/o C-terminal. Si un
segmento de polilisina o poliaspartato no está presente en el
C-terminal, entonces se amida preferentemente el
C-terminal tal y como se indica en el ejemplo de la
ID SEC NRO.:6 que se muestra como materialización preferente. La ID
SEC NRO.:11 es una materialización de un péptido
\betaA1-30, sin sustituir, con un segmento de
polilisina o poliaspartato de 4 a 10 residuos en el
C-terminal.
Además, cuando m es 0, el segmento de polilisina
o poliaspartato N-terminal de 4 a 10 residuos está
ausente y, entonces, es preferible o bien amidar el
C-terminal del péptido para reducir la posibilidad
de que la carga C-terminal del péptido reduzca la
inmunogenicidad de la zona de residuos 22-28 de
\betaA o que el segmento de polilisina o poliaspartato de 4 a 10
residuos esté presente en el C-terminal. Otra
materialización preferida del péptido, de acuerdo con la presente
invención, es la siguiente:
cuando m no es cero, p es cero;
cuando p no es cero, m es cero; y
Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4},
Xaa_{5} son Leu, Val, Phe, Phe, y Ala, respectivamente, en donde
uno o dos residuos de Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4},
Xaa_{5} se sustituyen con Lys, Asp, o Glu (ID SEC
NRO.:2-5).
Los expertos en la materia apreciarán también que
se puede usar la peptidomimética del péptido sintético de la
presente invención, reemplazando las uniones peptídicas con uniones
no peptídicas.
Como es bien conocido en el sector, se puede
determinar fácilmente el potencial de reducción fibrilogénico de los
péptidos sintéticos amparados por la presente invención determinando
la conformación de hoja-\beta de los péptidos
mediante el uso de técnicas convencionales como el espectrodicroísmo
circular, FT-IR y microscopía electrónica de
suspensiones peptídicas.
Es bien conocido, asimismo, que se deben
presentar los inmunógenos conjuntamente con antígenos de
histocompatibilidad mayor (MHC) de clase II a fin de evocar una
respuesta eficaz de anticuerpos. Los antígenos MHC de clase II
producidos por las células presentadoras de antígenos (CPA) se unen
a los epitopos de los linfocitos T presentes en el inmunógeno bajo
una forma específica de secuencia. Este complejo de inmunógeno MHC
de clase II es reconocido por los linfocitos CD4+ (linfocitos
T_{h}), lo que causa la proliferación de linfocitos B específicos
capaces de reconocer un epitopo de linfocitos B del inmunógeno
presentado y la producción de anticuerpos específicos de epitopo de
linfocitos B por dichos linfocitos B. Un enfoque adicional para
aumentar aún más la inmunogenicidad de los péptidos sintéticos de la
presente invención es formar un conjugado con una molécula
polimérica inmunoestimuladora como el manan (polímero de manosa),
glucan (polímero de \beta1-2 glucosa),
tripalmitoil-S-glicerina-cisteína,
y péptidos que han sido ya aprobados para su uso en vacunas para los
seres humanos. Dichos péptidos aprobados para su uso en vacunas para
los seres humanos proporcionan epitopos potentes de linfocitos T
cooperadores (T_{h}) a partir de inmunógenos potentes como la
toxina tetánica, tosferínica, la proteína F del virus del sarampión,
y el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (AgsHB). Los
epitopos de T_{h} seleccionados para su conjugación con el péptido
sintético son, de preferencia, capaces de provocar una respuesta de
los linfocitos T colaboradores en un gran número de personas que
expresan diversos haplotipos MHC. Estos epitopos funcionan en muchas
personas diferentes dentro de una población heterogénea, y se
consideran epitopos T_{h} promiscuos. Los epitopos T_{h}
promiscuos ofrecen la ventaja de provocar respuestas potentes de
anticuerpos en la mayoría de los miembros de grupos de población
genéticamente diferentes.
Aún más, los epitopos del linfocito T colaborador
conjugados/entrecruzados al péptido sintético de la presente
invención son seleccionados de forma preferente no sólo por su
capacidad de originar una respuesta inmunitaria en la mayoría de los
miembros de una población dada, sino también por su capacidad de
producir respuestas de memoria/recuerdo. Cuando un mamífero es del
género humano, la gran mayoría de los seres humanos/pacientes que
reciben inmunoterapia con el péptido sintético de la presente
invención habrán sido ya inmunizados, con toda probabilidad, con las
vacunas pediátricas (a saber, vacunas contra el
sarampión+paperas+rubéola y difteria+tosferina+tétanos), y,
posiblemente, con la vacuna contra el virus de la hepatitis B. Estos
pacientes, por consiguiente, han estado expuestos con anterioridad
al menos a uno de los epitopos de los linfocitos T_{h} presentes
en las vacunas pediátricas. La exposición previa al epitopo del
linfocito T_{h} a través de la inmunización con las vacunas
estándares debería establecer clones celulares T_{h} que pueden
proliferar inmediatamente tras la administración del péptido
sintético (esto es, una respuesta de recuerdo), estimulando, en
consecuencia, una rápida respuesta de los linfocitos B a los
péptidos \betaA y a los depósitos amiloides.
Aunque los epitopos T_{h} que se pueden usar en
el conjugado con el péptido sintético de la invención son
promiscuos, no son universales. Esta característica significa que
los epitopos T_{h} reaccionan en un amplio segmento de una
población abierta que expresa diferentes antígenos MHC (reactivos en
el 50 al 90% de la población), pero no en todos los miembros de
dicha población. Para ofrecer una reactividad inmunitaria integral,
cuasi universal, para el péptido sintético no amiloidogénico de
acuerdo con la presente invención, se puede preparar una mezcla de
conjugados con diferentes epitopos T_{h} entrecruzados a un
péptido sintético. Por ejemplo, podría ser más eficaz una
combinación de cuatro conjugados con epitopos T_{h} promiscuos de
las toxinas del tétanos y tosferina, la proteína F del virus del
sarampión y el AgsHB.
Los epitopos T_{h} en el péptido
inmunoestimulador entrecruzado con el péptido sintético no
amiloidogénico de acuerdo con la presente invención, incluyen los
epitopos del linfocito T cooperador del antígeno de superficie de la
hepatitis B, los epitopos del linfocito T cooperador de la toxina
tosferínica, los epitopos del linfocito T cooperador de la toxina
tetánica, el epitopo del linfocito T cooperador de la proteína F del
virus del sarampión, los epitopos de la membrana exterior de
Chlamydia trachomitis, los epitopos del linfocito T
cooperador de la toxina diftérica, los epitopos del linfocito T
cooperador del Plasmodium falciparum circumsporozoite, los
epitopos del linfocito T cooperador de la triosa fosfato isomerasa
del Schistosoma mansoni, los epitopos del linfocito T
cooperador del Escherichia coli TraT que están revelados en
la Patente de EE.UU. 5.843.446.
Los expertos en la materia apreciarán que el
término "sintético", tal y como se usa para el péptido de la
presente invención, significa que o bien se sintetiza químicamente o
se produce en un organismo siempre y cuando el organismo huésped
esté transformado genéticamente a partir de su estado original para
producir el péptido. Los péptidos sintéticos de la presente
invención pueden producirse por métodos químicos sintéticos bien
conocidos por los fabricantes ordinarios. En consecuencia, se pueden
sintetizar los péptidos sintéticos usando las técnicas automáticas
Merrifield de síntesis de fase sólida o bien con química
t-Boc o F-moc sobre sintetizadores
de péptidos como en el Sintetizador de Péptidos de Applied
Byosistems.
Como alternativa, se pueden sintetizar péptidos
más largos por medio de técnicas bien conocidas de ADN recombinante.
Cualquier manual estándar sobre tecnología de ADN proporciona
protocolos detallados para producir los péptidos sintéticos de la
invención. Para construir una secuencia nucleótida codificando un
péptido sintético de la presente invención, la secuencia aminoácida
pasa mediante una transcripción inversa a una secuencia de ácido
nucleico, y, de preferencia, utilizando el uso de codón optimizado
para el organismo en el que se expresará el péptido. A continuación,
se produce un gen sintético, típicamente por medio de la síntesis de
oligonucleótidos superpuestos que codifican el péptido y cualquier
otro elemento regulador, de ser necesario. El gen sintético se
inserta en un vector de clonación apropiado y se obtienen y
caracterizan los clones recombinantes. El péptido sintético de la
presente invención es, a continuación, expresado bajo las
condiciones apropiadas para el sistema de selección seleccionado y
anfitrión, y el péptido deseado se purifica y caracteriza por
métodos estándares.
Se puede asimismo obtener un péptido
inmunoestimulador que se puede entrecruzar al péptido sintético no
amiloidogénico de la invención, a partir de la proteína invasina de
la especie Yersinia. Las invasinas de la bacteria patogénica
Yersinia spp. son proteínas de membrana exterior mediadoras
de la entrada de la bacteria en las células de los mamíferos (Isberg
et alt., 1990). Se demostró que la invasión de las células de
los mamíferos por la bacteria requería la interacción entre la
molécula invasina de Yersinia y varias especies de la familia de
integrinas \beta1 presentes en las células en cultivo (Tran Van
Nhieu et alt., 1991). Puesto que los linfocitos T son ricos
en integrinas \beta1 (linfocitos T de memoria o inmunitarios
especialmente activados), se han venido investigando los efectos de
la invasina en los linfocitos T humanos (Brett et alt.,1993).
Se piensa que las integrinas facilitan la migración de los
linfocitos T inmunitarios fuera de los vasos sanguíneos y a través
del tejido conjuntivo a los sitios de estímulos antigénicos a través
de su interacción con proteínas de la matriz extracelular, entre las
que se encuentran la fibronectina, laminina y colágeno. Se halló que
el terminal carboxi de la molécula invasina coestimulaba el
linfocito T CD4+ humano en presencia del mitógeno no específico,
anticuerpo CD3, causando una marcada proliferación y expresión de
las citocinas. Se identificó, asimismo, el dominio específico de la
invasina que interactúa con las integrinas \beta1 para causar esta
estimulación (Brett et alt., 1993). Debido a las propiedades
coestimuladoras demostradas de los linfocitos T asociadas con este
dominio, se puede entrecruzar con el péptido sintético de la
presente invención para potenciar su inmunogenicidad.
Muchas de las proteínas de la membrana exterior
de las bacterias Gram negativas son de lípidos modificados y muy
inmunogénicas. Debido a la aparente correlación entre el vínculo del
lípido covalente y la inmunogenicidad, se puede emparejar en un
conjugado el lípido
tripalmitoil-S-glicerina cisteína
(Pam_{3}Cys), muy frecuente en las proteínas de membrana
bacterianas, con los péptidos sintéticos, a fin de potenciar la
inmunogenicidad.
Se puede mejorar de modo más significativo la
inmunogenicidad si se coadministran péptidos sintéticos con
adyuvantes. Los adyuvantes potencian la inmunogenicidad de un
antígeno, pero no son en sí mismos inmunogénicos. Los adyuvantes
pueden reaccionar reteniendo el antígeno localmente cerca del sitio
de administración a fin de producir un efecto de depósito que
facilite una liberación lenta y sostenida del antígeno a las células
del sistema inmunitario. Los adyuvantes pueden también atraer
células del sistema inmunitario a un depósito de antígeno y
estimular dichas células para provocar una respuesta
inmunitaria.
Se han venido usando sustancias
inmunoestimuladoras o adyuvantes desde hace muchos años para mejorar
la respuesta inmunitaria del anfitrión, p. ej., a las vacunas. Los
adyuvantes intrínsecos, como los lipopolisacáridos, son componentes
normales de las bacterias inactivadas o atenuadas. Los adyuvantes
extrínsecos son inmunomoduladores que no están unidos por enlaces
covalentes a los antígenos y están formulados de forma tal que
potencien las respuestas inmunitarias del anfitrión. Por lo tanto,
se han identificado adyuvantes que potencian la respuesta
inmunitaria a antígenos administrados por vía parenteral. Sin
embargo, algunos de estos adyuvantes son tóxicos y pueden causar
efectos secundarios indeseables, lo que los haría inapropiados para
su uso en seres humanos y en muchos animales. De hecho, sólo el
hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (por lo general
conocidos colectivamente como alumbre) se usan de forma habitual
como adyuvantes en las vacunas para uso en seres humanos y en
animales. Está bien establecida la eficacia del alumbre para
aumentar la respuesta de los anticuerpos a los toxoides de la
difteria y el tétanos, y existe asimismo una vacuna AgsHB con
adyuvante con alumbre.
Un amplio margen de adyuvantes extrínsecos pueden
provocar una respuesta inmunitaria potente a los antígenos. Estos
incluyen las saponinas en complejo con los antígenos de proteína de
membrana (complejos estimulantes del sistema inmunitario), polímeros
Pluronic con aceite mineral, micobacteria inactivada en aceite
mineral, adyuvante completo de Freund, productos bacteriales, como
el muramil dipéptido (MDP) y lipopolisacáridos (LPS), así como el
lípido A y los liposomas. Para inducir de manera eficaz una
respuesta inmunitaria humoral (RIH) y una inmunidad mediada por
células (IMC), se emulsifican inmunógenos en los adyuvantes. Muchos
adyuvantes son tóxicos, provocando granulomas, inflamaciones agudas
y crónicas (adyuvante completo de Freund, FCA), citolisis (saponinas
y polímeros Pluronic) y pirogenicidad, artritis y uveítis anterior
(LPS y MDP) . A pesar de que FCA es un adyuvante excelente
ampliamente usado en investigación, no está aprobado en las vacunas
para los seres humanos o animales debido a su toxicidad.
La patente de EE.UU. NRO. 4.855.283 ampara
glucolípidos análogos, incluidos las N-glucosamidas,
N-glucosilureas y
N-glucosilcarbamatos, cada uno de los cuales es
sustituido en el residuo del azúcar por un aminoácido, como
inmunomoduladores o adyuvantes. La patente de EE.UU. NRO. 4.258.029
revela que el hidrocloruro de octadecil tirosina (OTH) funciona como
un adyuvante cuando forma un complejo con el toxoide del tétanos y
con la formalina inactivada de tipo I, II y III de la vacuna del
virus de la poliomielitis. Además, Nixon-George
et alt., 1990, reportaron que los ésteres de octadecil de los
aminoácidos aromáticos que forman complejos con un antígeno de
superficie recombinante de la hepatitis B potencian la respuesta
inmunitaria del anfitrión contra el virus de la hepa-
titis B.
titis B.
Se prefiere la adición de formulaciones de
emulsiones/adyuvantes exógenos que maximizan la respuesta
inmunitaria a los péptidos \betaA y a los depósitos de amiloide.
Los adyuvantes y portadores apropiados son aquellos que: (1) se han
usado con éxito en los estudios humanos de Fase I; (2) dada su
carencia de reactogenicidad en estudios preclínicos de inocuidad, es
posible que se aprueben para su uso en seres humanos; o (3) se han
aprobado para su uso en los alimentos y en los animales domésticos.
Aguado et alt. (1999) han mencionado algunos de los
adyuvantes que se encuentran sometidos en la actualidad a estudios
clínicos.
Resultan altamente deseables los regímenes de
inmunoterapia que producen una respuesta máxima tras la
administración del número menor de dosis, idealmente una sola dosis.
Se puede llegar a este resultado mediante el atrapamiento de
inmunógenos en micropartículas. Por ejemplo, el material de sutura
absorbible
poli(lactide-co-glicolide)
copolímero puede adoptar la forma de micropartículas que contienen
inmunógeno. Después de la administración oral o parenteral, la
hidrólisis in vivo de las micropartículas produce productos
derivados no tóxicos, ácido láctico y ácido glicólico, y libera
inmunógeno prácticamente inalterado por el proceso de atrapamiento.
El índice de degradación de la micropartícula y la liberación del
inmunógeno atrapado se puede controlar mediante varios parámetros
entre los que cabe citar (1) el índice de polímeros usados en la
formación de partículas (partículas con altas concentraciones de
coglicolide se degradan más rápidamente); (2) el tamaño de la
partícula (las partículas más pequeñas se degradan más rápidamente
que las grandes); y (3) la eficacia del atrapamiento (las partículas
con altas concentraciones de antígeno atrapado se degradan más
rápidamente que las que tienen cargas menores). Las formulaciones de
micropartículas también pueden proporcionar una inmunización
primaria y de refuerzo en una sola administración mediante la
combinación de micropartículas con inmunógeno atrapado con
diferentes tiempos de liberación. Se puede lograr fácilmente
formulaciones de una sola dosis capaces de liberar antígeno en un
rango que varía desde menos de una semana a más de seis meses. Más
aún, la administración del péptido sintético de acuerdo con la
presente invención, atrapado en micropartículas, puede mejorar la
eficacia cuando se mezcla el inmunógeno de las micropartículas con
formulaciones de emulsiones/adyuvantes exógenos.
Se puede establecer y analizar la eficacia de los
péptidos sintéticos si se inyecta un animal, p. ej., un ratón o
rata, con el péptido sintético formulado con alumbre y, a
continuación, se sigue la respuesta inmunitaria a los péptidos
beta-amiloides.
Otro aspecto de la presente invención proporciona
una composición inmunizante que incluye una cantidad eficaz
inmunizante de uno o más de los péptidos sintéticos de la invención,
o conjugados derivados, y un portador aceptable farmacéuticamente,
excipiente, diluyente, o sustancia auxiliar, incluidos los
adyuvantes. Por consiguiente, se pueden formular los péptidos
sintéticos, o conjugados derivados, como un compuesto inmunizante
usando adyuvantes, portadores aceptables farmacéuticamente,
excipientes, diluyentes, sustancias auxiliares u otros ingredientes
que forman parte de forma habitual de los compuestos inmunizantes.
Se pueden determinar fácilmente dichas formulaciones por uno de los
métodos habituales en la profesión, e incluir formulaciones de
liberación inmediata y prolongada, p. ej., la microencapsulación.
Asimismo, se pueden administrar los actuales compuestos inmunizantes
por la vía más conveniente, incluida la vía subcutánea, oral,
intramuscular u otra vía parenteral o interna. De forma análoga, se
pueden administrar las vacunas en una sola dosis o divididas en
dosis múltiples. Cualquier profesional capacitado puede programar
fácilmente las inmunizaciones. Por ejemplo, los adyuvantes o
emulsionantes que se pueden usar en esta invención incluyen:
alumbre, adyuvante incompleto de Freund, liposina, saponina,
esqualeno, L121, emulsígeno e ISA720. En las materializaciones
preferidas, los adyuvantes/emulsionantes son: alumbre, adyuvante
incompleto de Freund, una combinación de liposina y saponina, una
combinación de esqualeno y L121 o una combinación de emulsígeno y
saponina.
Los compuestos inmunizantes de la presente
invención contienen una cantidad inmunoeficaz de uno o más de los
péptidos sintéticos o conjugados derivados, y un portador aceptable
farmacéuticamente. Dichos compuestos en forma de unidad de dosis,
pueden contener aproximadamente de 0,5 \mug a alrededor de 1 mg de
cada péptido o conjugado por kilo de peso corporal. Cuando se
administran en múltiples dosis, la forma de unidad de dosis se
divide convenientemente en las cantidades apropiadas para cada
dosis.
Los compuestos inmunizantes que contienen
cócteles de dos o más de los péptidos sintéticos, o conjugados
derivados, de la presente invención potencian la inmunoeficacia en
una población más amplia y, por lo tanto, proporcionan una respuesta
mejor a los péptidos beta-amiloides y a los
depósitos amiloides. Se han conseguido otros péptidos sintéticos
inmunógenos inmunoestimuladores a través de su modificación en
lipopéptidos a fin de proporcionar unos adyuvantes internos para las
vacunas potentes.
Se puede mejorar la respuesta inmunitaria a los
péptidos sintéticos inmunógenos de la presente invención mediante la
administración por medio de atrapamiento en o dentro de
micropartículas biodegradables del tipo descrito por O'Hagan et
alt. (1991). Se pueden encapsular los inmunógenos con o sin
adyuvantes, incluido el fragmento lipídico unido por enlaces
covalentes como Pam_{3}Cys, y se pueden administrar dichas
partículas con un adyuvante inmunoestimulador como el adyuvante
incompleto de Freund o el alumbre. La función de las micropartículas
es potenciar la respuesta inmunitaria a un inmunógeno y proporcionar
la liberación temporal controlada para respuestas prolongadas o
periódicas mediante administración oral o por administración tópica
(O'Hagan et alt., 1991).
Un aspecto ulterior de la presente invención es
un método para la inmunización con el péptido sintético o conjugados
derivados de la presente invención. Este método de acuerdo con la
presente invención involucra la administración a los mamíferos, de
preferencia a los seres humanos, que necesiten un compuesto
inmunizante que contenga uno o varios péptidos sintéticos o
conjugados derivados. Se comprobará la eficacia, en primer lugar, en
los modelos de ratón transgénico o AD, como el modelo de ratón usado
en Schenk et alt. (1999) u otros modelos de ratón transgénico
AD pública o comercialmente disponibles.
Otro aspecto de la presente invención afecta a
los anticuerpos formados contra los péptidos inmunogénicos de la
presente invención y las moléculas, que incluye la porción de unión
al antígeno de dichos anticuerpos.
Cabe considerar que, cuando se usa el término
"anticuerpos" en relación con la materialización de anticuerpos
de la presente invención, se pretende con ello incluir los
anticuerpos intactos, como los anticuerpos policlonales o
monoclonales (Absm), así como los fragmentos proteolíticos
derivados, como los fragmentos Fab o F(ab')^{2}. Además, se
puede insertar el ADN que codifica la región variable del anticuerpo
en otros anticuerpos para producir anticuerpos híbridos (véase, por
ejemplo, la Patente de EE.UU. 4.816.567) o en linfocitos T
receptores para producir linfocitos T con la misma amplia
especificidad (véase Eshhar et alt. (1990) y Gross et
alt. (1989). Se pueden producir y emplear también anticuerpos de
cadena única. Los anticuerpos de cadena única pueden ser de cadena
única compuesta de polipéptidos con capacidades de unión al antígeno
y con un par de secuencias homólogas de aminoácidos, o análogos a
las regiones variables de una inmunoglobulina de cadena ligera y
pesada (unida V_{H}-V_{L} o de cadena única
F_{V}). Tanto V_{H} como V_{L} pueden copiar las secuencias
naturales de los anticuerpos monoclonales o una o ambas de las
cadenas que puedan estar comprendidas en la construcción de
CDR-FR del tipo descrito en la Patente de EE.UU.
5.091.513. Los polipéptidos separados análogos a las regiones
variables de las cadenas ligera y pesada se mantienen juntos por un
polipéptido de enlace. Se pueden lograr métodos para producir dichos
anticuerpos de cadena única, en particular en los casos en que se
conoce el ADN que codifica las estructuras polipeptídicas de las
cadenas V_{H} y V_{L}, de acuerdo con los métodos descritos, por
ejemplo, en las Patentes de EE.UU. 4.946.778, 5.091.513 y
5.096.815.
Se dice que un anticuerpo es "capaz de
unirse" a una molécula, si puede reaccionar específicamente con
la molécula para, así, unir la molécula al anticuerpo. El término
"epitopo" se refiere a la porción de cualquier molécula a la
que pueda unirse un anticuerpo y que también pueda ser reconocida
por ese anticuerpo. Los epitopos o "determinantes antigénicos"
consisten, por lo general, de grupos de moléculas de superficie
químicamente activas, como aminoácidos o cadenas de azúcar, y tienen
tres características estructurales dimensionales específicas así
como características específicas de carga.
Los anticuerpos policlonales son poblaciones
heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas del suero de
animales inmunizados con un antígeno.
Los anticuerpos monoclonales (Absm) son
poblaciones homogéneas, considerablemente más numerosas, de
anticuerpos contra antígenos específicos. Se puede obtener Absm por
los métodos habituales a los profesionales de la materia. Véase, por
ejemplo, Kohler et alt. (1975); Patente de EE.UU. NRO.
4.376.110; Harlow et alt. (1988); y Colligan et alt.
(1993). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier tipo de
inmunoglobulina, incluida la IgG, IgM, IgE, IgA y cualquier subclase
de ellas. Se puede cultivar el hibridoma que produce los Absm de
esta invención in vitro o in vivo. Se pueden obtener
valores altos de Absm por medio de la producción in vivo, en
la cual se inyectan células de los hibridomas individuales
intraperitonealmente a los ratones Balb/c sensibilizados con
pristano, a fin de producir fluido ascítico con elevadas
concentraciones de los Absm deseados. Se pueden purificar los Absm
de isotipo IgM o IgG de dichos fluidos ascíticos o del cultivo
sobrenadante por métodos de cromatografía de columna familiares a
los profesionales capacitados.
Los anticuerpos híbridos son moléculas, cuyos
fragmentos se obtienen de diferentes especies animales, como
aquellas que poseen una región variable derivada de un murino Abm y
una región constante de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos
híbridos se usan, principalmente, para reducir la inmunogenicidad
durante la aplicación y para aumentar la producción; por ejemplo, en
aquellos casos en los que los hibridomas producen más Absm murinos,
pero mayor inmunogenicidad en los seres humanos, tal como los Absm
híbridos humanos/murinos o humanizados. Son bien conocidos en la
profesión los métodos para la producción de anticuerpos híbridos y
humanizados, como en Cabilly et alt., 1984; Morrison et
alt., 1984; Boulianne et alt., 1984; Cabilly et
alt., 1984; Neuberger et alt., 1985; Taniguchi et
alt., 1985; Morrison et alt., 1986; Neuberger et
alt., 1986; Kudo et alt., 1986; Morrison et alt.,
1986; Sahagan et alt., 1986; Robinson et alt., 1987;
Liu et alt., 1987; Sun et alt., 1987; Better et
alt., 1988; y Harlow et alt., 1988.
Una "molécula que incluye la porción de unión
al antígeno de un anticuerpo" se supone que debe incluir no sólo
las moléculas intactas de inmunoglobulinas de cualquier isotipo y
generadas por cualquier línea celular animal o microorganismo, sino
también el fragmento reactivo de unión al antígeno, incluyendo,
entre otros, el fragmento Fab, el fragmento Fab', el fragmento
F(ab')_{2}, la porción variable de las cadenas pesadas y/o
ligeras, y los anticuerpos híbridos o de cadena única que poseen ese
fragmento reactivo, así como cualquier otro tipo de molécula o
célula en la que se ha insertado físicamente dicho fragmento
reactivo de anticuerpo, como el linfocito T receptor híbrido o un
linfocito T que posea dicho receptor, o moléculas desarrolladas para
suministrar fragmentos terapéuticos mediante una porción de la
molécula que contenga dicho fragmento reactivo. Se pueden lograr
esas moléculas por cualquier técnica conocida, entre las que cabe
citar, sin por ello limitarse, la descomposición enzimática, la
síntesis peptídica o las técnicas recombinantes.
La presente invención proporciona también un
compuesto farmacéutico que contiene una molécula que incluye la
porción de unión al antígeno de un anticuerpo formado contra un
péptido de la presente invención, y un portador aceptable
farmacéuticamente, diluyente, excipiente o sustancia auxiliar.
Cualquier profesional capacitado en el oficio puede desarrollar
sencillamente, mediante un experimento rutinario, la fórmula de los
compuestos farmacéuticos, la de uso tradicional en medios altamente
especializados y los compuestos adecuados para uso terapéutico en la
reducción de la formulación de fibrillas y depósitos de
amiloides.
De acuerdo con la presente invención, se puede
administrar la molécula que incluye la porción de unión al antígeno
de un anticuerpo formado contra los péptidos inmunogénicos de la
presente invención, a una persona que lo necesite para reducir la
formación de fibrillas y depósitos de amiloide. Los profesionales
capacitados deben determinar el sitio de administración, la dosis y
el horario de administración de acuerdo con los procedimientos
normales de la profesión.
Después de haber descrito de modo general la
invención, se entenderá más fácilmente la misma cuando la
explicación se base en los ejemplos que siguen, que se ofrecen a
título ilustrativo y sin que ello constituya una limitación de la
presente invención.
Los experimentos en este ejemplo demuestran que
la inmunización en ratones transgénicos PPA (Tg2576) durante 7 meses
con un péptido homólogo de \betaA no amiloidogénico y no tóxico
redujeron la carga de amiloide en la corteza cerebral y el hipocampo
en un 89% (p = 0,0002) y en un 81% (p = 0,0001)
respectivamente. Simultáneamente, los niveles cerebrales de
\betaA1-42 soluble se redujeron en un 57%
(p = 0,0019). En los ratones inmunizados, no se halló
microglía ramificada que expresara la
interleucina-\beta1 asociada con las placas
\betaA, lo que indicó una disminución de la inflamación en estos
animales. A continuación, se presentan los materiales y métodos
usados en el experimento en este ejemplo, así como los resultados
experimentales.
Los péptidos usados
(\betaA1-40, \betaA1-42,
\betaA1-30-NH_{2} (ID SEC
NRO.:1), y
K6\betaA1-30-NH_{2}(ID
SEC NRO.:6) fueron sintetizados en la Keck Foundation (Yale
University, New Haven, CT) de la forma anteriormente descrita
(Sigurdsson et alt., 2000). Los péptidos no amiloidogénicos
de acuerdo con la presente invención se sintetizaron usando el
proceso químico tBOC
(N-tert-butiloxicarbonil) de fase
sólida, purificados por HPLC y caracterizados por HPLC y por
espectroscopía láser de desorpción de masas.
El péptido usado para las inmunizaciones,
K6\betaA1-30-NH_{2}, mantiene
los dos sitios inmunogénicos principales de los péptidos \betaA,
que son los residuos 1-11 y 22-28,
del \betaA1-42 basados en el índice antigénico de
Jameson et alt. (1998) y en los resultados preliminares
obtenidos en el laboratorio de los presentes inventores. Los
péptidos \betaA1-30-NH_{2} y
K6\betaA1-30-NH_{2} fueron
amidados en la C-terminal para preservar su
antigenicidad ulterior.
Se evaluó la estructura secundaria
(\alpha-hélice, hoja-\beta y
espiral aleatoria) de los péptidos por dicroísmo circular (DC) tal y
como se describió previamente (Soto et alt., 1998 y Soto
et alt., 1996). Los resultados se expresan como elipticidad
molar en unidades de grad cm^{2}dmol^{-1}, y los datos se
analizaron mediante los algoritmos de Lincomb y CCA (Perczel et
alt., 1992) para obtener los porcentajes de los diferentes tipos
de estructura secundaria.
Aunque se evaluó la estructura secundaria de los
péptidos sintetizados por dicroísmo circular (DC), se puede evaluar,
asimismo, por espectroscopía de infrarrojos con transformada de
Fourier (ITF), usando protocolos publicados de Aucouturier et
alt. (1999). Aunque el DC es sensible a la conformación básica y
la ITF es sensible al grado y a la fuerza de unión del hidrógeno de
los grupos amidas (dependiente de la estructura), estas dos técnicas
ofrecen, en última instancia, información similar: los porcentajes
de diferentes diseños de la estructura secundaria, p. ej.,
\alpha-hélice, hoja-\beta,
barril-\beta y espiral aleatoria (Surewicz et
alt., 1993). El DC es una técnica bien establecida para el
estudio de la estructura secundaria de las proteínas y péptidos en
solución, proporcionando cálculos bastante exactos del contenido de
los diferentes diseños estructurales. Una gran ventaja de la
espectroscopía ITF para la caracterización estructural es que no
depende del estado físico de la muestra. Se pueden examinar las
muestras como soluciones acuosas u orgánicas, películas hidratadas,
dispersiones no homogéneas, materiales agregados o incluso proteínas
en estado sólido. Por consiguiente, las técnicas de DC e ITF son
complementarias para el estudio de la estructura secundaria de los
péptidos.
El procedimiento experimental para el dicroísmo
circular se llevó a cabo de acuerdo con Golabek et alt.
(1996) y Soto et alt. (1996 y 1998) de la siguiente forma: se
registró un espectro DC de soluciones con péptidos sintéticos
(1-5 \muM en 300 \mul de 10 mM de fosfato
sódico, pH 7,2) en un espectropolarímetro Jasco
J-720 a 25ºC usando un paso de luz de célula de 0,1
cm con agua doblemente destilada y deionizada y TFE (grado
espectroscópico) como disolventes. Se realizó la calibración del
instrumento con una solución acuosa de
d-(+)-10-ácido alcanforsulfónico. Se registró el
espectro a intervalos de 1 nm sobre el intervalo de longitud de onda
de 180 a 260 nm, y se sustrajo el espectro tampón obtenido bajo
idénticas condiciones.
El procedimiento experimental para la
espectroscopía de infrarrojos con transformada de Fourier según
Aucourier et alt. (1999) es el siguiente: Se preparan
soluciones o suspensiones que contengan péptidos sintéticos solubles
o agregados (5-10 mg/ml) en H_{2}O y D_{2}O
tampón a un pH neutro, y 10 \mum se carga en la célula infrarroja
con placas de CaF_{2} y un retículo de 6 \mum. Se registra el
espectro con un espectrofotómetro ITF Perkin Elmer modelo 2000 a
25ºC, tal como se describió (Aucouturier et alt., 1999; Soto
et alt., 1995). Para cada espectro, se recogen 1000 barridos
en el modo de haz único con 2 cm^{-1} de resolución y a 1
cm^{-1} de intervalo de 4000 a 1000 cm^{-1}. Se aplica un
alisado y una autodeconvolución de Fourier para aumentar la
resolución del espectro en la región de amida I
(1700-1600 cm^{-1}) y se efectúa un ajuste
iterativo a las formas lineales de Lorentzian para calcular la
proporción de cada elemento de la estructura secundaria.
Se pueden llevar a cabo estudios in vitro
sobre la formación de las fibrillas amiloides usando protocolos
publicados del laboratorio de los presentes inventores (Castaño
et alt., 1995; Wisniewski et alt., 1991, Wisniewski
et alt., 1993 y Wisniewski et alt., 1994). Se pueden
incubar partes iguales de los péptidos sintéticos a una
concentración en un intervalo de 25-250 \muM,
preparado en 0,1M Tris, pH 7,4, durante tiempos diferentes, y
comparar su formación fibrilar con la de
\betaA1-28, \betaA1-40 y
\betaA1-42. En este ejemplo, se incubaron partes
iguales de los péptidos preparados en 0,1M Tris, pH 7,4 durante
tiempos diferentes, y se comparó su formación fibrilar a la de
\betaA1-30-NH_{2} y
\betaA1-42. Se evaluó la fibrilogénesis in
vitro mediante un ensayo fluorométrico basado en la emisión de
fluorescencia por la tioflavina T, tal como se describió previamente
por el laboratorio de los presentes inventores (Soto et alt.,
1998 y Jameson et alt., 1998). La tioflavina T se une
específicamente al amiloide y esta unión provoca un cambio en la
emisión de su espectro y un aumento de la fluorescencia proporcional
a la cantidad de amiloide formado (LeVine et alt., 1993).
Aunque no se llevaron a cabo en este ejemplo, se
puede también evaluar in vitro la fibrilogénesis por otros
tres métodos diferentes:
(A) Un ensayo espectrofotométrico basado en la
interacción específica del rojo Congo con las fibrillas amiloides.
Tras el período de incubación, se añadirán 2 \mul de rojo Congo
(1,5 mg/ml) a cada muestra, y se incubarán en la oscuridad durante 1
hora. A continuación, se centrifugarán las muestras a 15.000 rpm
durante 10 min y se determinará la absorbancia del supernadante a
490 nm. La cantidad de amiloide formada es directamente proporcional
a la disminución de la absorbancia del sobrenadante (Castaño et
alt., 1986).
(B) Se usará un ensayo de sedimentación como ya
se ha descrito (Soto et alt., 1995). En resumen, se
centrifugarán las muestras a 15.000 rpm durante 10 min para separar
el péptido soluble y el agregado. Se analizará la cantidad de
material en solución por microbore HPLC usando una columna Vidac C4
de fase inversa y un gradiente lineal de 3-70% de
acetonitrilo. Se calculará el porcentaje de péptido agregado por
comparación del área del pico que corresponde al péptido soluble en
cada muestra incubada con una muestra idéntica de control no
incubada.
(C) Se llevará a cabo una caracterización
adicional de la fibrilogénesis por medio de la tinción de rojo Congo
y el examen por microscopía electrónica después de una tinción
negativa (Castaño et alt., 1995; Wisniewsi et alt.,
1991; Wisniewski et alt., 1993 y Wisniewski et alt.,
1994). Para la microscopía electrónica, las muestras de péptidos
incubadas se colocarán en tamices de níquel de 300 de malla
recubierto de carbón y se teñirán durante 60 segundos con 2% de
acetato de uranil bajo un vapor de 2% de glutaraldehido. Se
visualizará la rejilla a 80 kV en un microscopio electrónico Zeiss
EM 10. Para la tinción con rojo Congo, los péptidos incubados se
colocarán en un portaobjetos de cristal recubierto de gelatina y se
secarán al aire a 37ºC. A continuación, se sumergirán los cortes en
0,2% de rojo Congo disuelto en 80% de etanol acuoso saturado con
NaCl durante 60 min a temperatura ambiente, se lavará tres veces y
se observará con un microscopio de luz polarizada.
Se evaluó la posible neurotoxicidad de
K6\betaA1-30NH_{2} (1-100
\muM) a los 2 y 6 días en una línea celular de neuroblastoma
humano (SK-N-SH) usando el ensayo
MTT estándar tal y como lo describe el fabricante (Roche Molecular
Biomedicals, Indianapolis, IN). Se usaron
\betaA1-30-NH_{2},
\betaA1-40 y \betaA-42 como
péptidos de control. En resumen, se colocaron las células en placas,
10.000 células/100 \mul de medio de cultivo por pocillo en un
fondo plano, en placas de titulación con 96 pocillos. Se permitió
que las células se adhirieran a las placas durante la noche en una
incubadora (37ºC, 5,0% CO_{2}), y, a continuación, se añadieron 10
\mul de solución de péptido recién preparada (en H_{2}O
nanopura). \betaA1-42 fue sólo parcialmente
soluble a 100 \muM y, por lo tanto, se añadió como suspensión a
esa concentración. Los pasos subsiguientes sucedieron tal y como se
describió en el protocolo del ensayo.
Se llevó a cabo la vacunación en el modelo de
ratón Tg2576 PPA desarrollado por Karen Hsiao y cols. (1996). Estos
ratones desarrollaron placas \betaA a la temprana edad de
11-13 meses. Se escogió este modelo en vez del
modelo doble TgPPA/PS1 (Holcomb et alt., 1998) porque la edad
de comienzo y la progresión de los depósitos de \betaA en el único
ratón TgPPA se asemeja más a la EA. Se usaron como control ratones
Tg emparejados por edad y tratados sólo con el vehículo y crías
no-Tg que recibieron
K6\betaA1-30-NH_{2}, y los
animales recibieron la primera inyección a los 11-13
meses, un momento en el que sólo debería de haber unas pocas placas.
Había cuatro ratones en cada grupo. Se mantuvo a los ratones en un
ciclo de 12 horas de luz-oscuridad y tuvieron acceso
libre al agua y a los alimentos. El cuidado de los animales siguió
las pautas institucionales.
Administración de la vacuna: Se
proporcionó K6\betaA1-30-NH_{2}
como sal de ácido trifluoroacético (ATF). El procedimiento de
inmunización se llevó a cabo según lo previamente descrito por
Schenk y cols. (1999), con la excepción de que no se incubó el
péptido durante la noche a 37ºC antes de la inyección. En resumen,
el péptido se disolvió en BPS a una concentración de 2 mg/ml y, a
continuación, se mezcló en una proporción de 1:1 (v/v) con el
adyuvante o PBS. Se utilizó un adyuvante completo de Freund para la
primera inyección, un adyuvante incompleto de Freund para las tres
inyecciones siguientes, y PBS a partir de la quinta inyección en
adelante. Los ratones recibieron una inyección subcutánea de 100
\mul de la mezcla (a saber, 100 \mug/100 \mul), seguida de una
segunda inyección a las dos semanas y, a continuación, cada mes.
Titulación de anticuerpos: Se determinaron
los títulos de anticuerpos mediante diluciones seriadas de suero
usando el ensayo ELISA según ha sido descrito previamente
(Jiménez-Huete et alt., 1998), en donde se
recubre el \betaA o su derivado en los pocillos de
microtitulación. La titulación, definida como la dilución que
proporciona el 50% de señal máxima, fue detectada por medio de una
IgG de cabra anti-ratón unida a una peroxidasa del
rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), y
tetrametil benzidina (Pierce, Rockford, IL) sirvió como
sustrato.
Histología: Se anestesió a los ratones con
sodiopentobarbital (150 mg/kg, i.p.), perfundido transaórticamente
con tampón fosfato, y se procesaron los cerebros de acuerdo a lo
descrito previamente (Sigurdsson et alt., 1996). Se fijó el
hemisferio derecho por inmersión en
periodato-lisina-paraformaldehido,
mientras que el hemisferio izquierdo se congeló de golpe para
determinar los niveles de \betaA usando métodos establecidos ELISA
(Mehta et alt., 1998 y Mehta et alt., 2000). Se
realizaron cortes en secciones coronales seriadas (40 \mum) y se
guardaron cinco series de secciones a intervalos de 0,2 mm para el
análisis histológico de 1) 6E10, 2) rojo Congo, 3)
interleucina-\beta1/OX42/lectina del tomate, 4)
GFAP, y 5) secciones teñidas con violeta de cresilo. El 6E10
reconoce \betaA y tiñe tanto las placas
pre-amiloides como al \betaA (Kim et alt.,
1990). Se realizó una tinción con rojo Congo para identificar las
lesiones amiloides en esos animales. GFAP es un componente de los
filamentos intermedios gliales que forman parte del citoesqueleto y
se encuentra predominantemente en los astrocitos. La microglía
parece ser el origen principal de la interleucina-1
(IL-1) en el SNC (Schobitz et alt., 1994), y
el OX-42 reconoce al CD11b en la microglía, un
equivalente en la rata del receptor humano C3bi (Robinson et
lat., 1986). La lectina del tomate se une a los residuos
poli-N-acetil-lactosamina
y presenta en el tejido neural una afinidad específica por las
células de la microglía (Acarin et alt., 1994). Tanto los
astrocitos como la microglía se asocian con los depósitos \betaA.
Se llevó a cabo la tinción con violeta de cresilo para determinar si
la inmunización estaba causando una reducción neuronal y/o pérdida
celular en estos animales. Después del corte, se colocó la serie en
etilenglicol crioprotector y se almacenó a -20ºC hasta
su uso.
su uso.
Violeta de cresilo y rojo Congo: Se
eliminó con xileno la grasa de las secciones montadas y se
hidrataron en un gradiente de series de alcohol etílico y agua. Se
llevó a cabo la tinción según lo ya descrito (Sigurdsson et
alt., 1996 y 1997 y Soto et alt., 1998).
6E10, GFAP, IL-\beta1 y
OX-42: Se llevó a cabo la tinción según lo
descrito antes (Sigurdsson et alt., 1996 y Soto et
alt., 1998). En resumen, se incubaron las secciones en 6E10
(amablemente proporcionado por Richard Kascsak, Institute for Basic
Research), anticuerpo primario que se une selectivamente al \betaA
humano a una dilución de 1:1000. Se usó un ratón de un conjunto de
inmunodetección del ratón (Vector Laboratories, Burlingame, CA)
donde un anticuerpo secundario IgG anti-ratón se
diluyó al 1:2000. La tinción GFAP (1:500; Dako, Dinamarca),
IL-\beta1 (1:250; Endogen, Rockford, IL) y
OX-42 (1:250; Biosource Int., Camarillo, CA) se
realizó del mismo modo que para el 6E10, salvo en que se diluyó a
1:1300 el anticuerpo secundario. Se hizo reaccionar a las secciones
en 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) con
o sin intensificación de sulfato de amonio y níquel (Ni). Para el
doble etiquetado de las placas de IL-\beta1 y
\betaA, se tiñeron las secciones en primer lugar con
IL-\beta1 (DAB/Ni; negro) siendo la enzima la
peroxidasa. A continuación, se tiñeron las placas (6E10) con el
conjunto de sustrato I de fosfatasa alcalina Vector Red
(Vector).
Lectina del tomate: Se lavaron las
secciones retiradas del crioprotector en PBS, 0,3%
Tritón-X-100 en PBS
(PBS-Tx) y, a continuación, se incubaron durante 30
minutos en 0,3% de peróxido de hidrógeno en PBS para eliminar la
actividad de la peroxidasa endógena. Tras 2 horas de incubación con
lectina del tomate (10 \mug/ml PBS; Vector), se lavaron las
secciones en PBS-Tx y se las hizo reaccionar con
avidina-peroxidasa de rábano picante (Vector)
durante una hora. Los pasos subsiguientes fueron los mismos que los
que se usaron para la tinción del anti-
cuerpo.
cuerpo.
Análisis de imagen: Se cuantificó la
inmunohistoquímica de las secciones de tejido con un sistema de
análisis de imagen Bioquant, y se usaron muestras objetivas (West
et alt., 1999). Una persona desconocedora de la condición
experimental del estudio realizó todos los procedimientos. El área
cortical analizada fue la dorsomedial de la corteza cingulada y se
extendió a la cisura rinal dentro del hemisferio derecho. El área de
la cuadrícula fue de 800 x 800 \mum^{2} y se midió la carga
amiloide en 10 fotografías por ratón (640 x 480 \mum^{2} cada
una) elegidas al azar. Se tomaron medidas de todo el hipocampo de
forma similar al análisis cortical. La carga \betaA se define como
el porcentaje de área en el campo de medida ocupado por el producto
de reacción.
Ensayo "sándwich" ELISA para las
concentraciones de \betaA soluble: Antes de la extracción de
\betaA del tejido cerebral, se preparó un 10% (p/v) de homogenados
en tejido homogeneizado tampón (20 mM Tris pH 7,4, 250 mM sucrosa, 1
mM EDTA, 1 mM EGTA). Justo antes de su uso, se añadió 1/100 volumen
de 100 mM de stock de solución de fenilmetilsulfonilfluoruro (en
etanol) y 1/1000 volumen de LAP (5 mg, respectivamente, de
leupeptina, antipain y pepstatina \betaA por ml de
N-N-dimetilformamida) al tampón de
homogenización. Se mezcló completamente el homogenado con un volumen
de 0,4% dietilamina/100 mM NaCl, a continuación centrifugado a
135.000 x g durante una hora a 4ºC y posteriormente neutralizado con
1/10 volumen de 0,5 M Tris, H 6,8. Se dividieron las muestras en
partes iguales, se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80ºC
hasta que se las cargó en las placas. Se midieron las
concentraciones de \betaA soluble en el hemisferio izquierdo
usando anticuerpo monoclonal 6E10 (específico dea un epitopo
presente en los residuos de aminoácidos 1-16 de
\betaA), antisuero de conejo R162 (específico para \betaA40) y
antisuero de conejo 165 (específico para \betaA42) en un ensayo de
doble anticuerpo de tipo "sándwich" ELISA, como se describió
previamente (Mehta et alt., 1998 y 2000). Se midió la
densidad óptica (DO) a 450 nm en un lector microELISA. Se determinó
la relación entre la DO y las concentraciones de \betaA40 o
\betaA42 mediante una función logarítmica logística de cuatro
parámetros. Se llevó a cabo un ajuste no lineal con el programa
KlinetiCalc (Biotek Instruments, Inc. Winooski, VT) para convertir
la DO del plasma a concentraciones calculadas. Se codificaron todas
las muestras y los investigadores desconocieron la asignación a cada
grupo hasta que se midieron y registraron las concentraciones. El
límite de detección del ensayo es 10 pg/ml para \betaA40 y
\betaA42. El porcentaje de coeficiente de variación generalmente
se mueve entre el 8 al 14% (interensayo) y de 10 a 18%
(intra-
ensayo).
ensayo).
Análisis de los datos: Se analizaron los
datos del cultivo celular por un análisis de varianza ANOVA de un
factor, seguido de un ensayo de Dunnett para análisis posteriores
(GraphPad Prism 3.0). Se usó un sistema objetivo de análisis
estereológico de imagen (Bioquant, R&M Biometics Inc.,
Nashville, TN) para determinar la carga amiloide en las secciones
6E10 del cerebro teñidas. Se analizaron los datos de la carga
amiloide y las concentraciones de \betaA soluble dentro del
cerebro mediante una prueba-t de Student, de dos
colas.
Antes de realizar el estudio de vacunación, fue
necesario confirmar que el péptido prototipo
KKKKKK-\betaA1-30-NH_{2}
tenía, de hecho, menos estructura de hoja-\beta y
una fibrilogenicidad menor comparado con
\betaA1-42, y que no era tóxico en el cultivo
neuronal. Se determinó la estructura secundaria de estos péptidos
por dicroísmo circular (DC), y su capacidad de formar fibrillas
amiloides mediante un ensayo fluorométrico con tioflavina T. El
péptido adicional de control fue
\betaA1-30-NH_{2}.
Ensayo de DC: Los compuestos con contenido
elevado de hoja-\beta son más tóxicos y es más
probable que formen fibrillas que los compuestos con un contenido
bajo de hoja-\beta (Pike et alt., 1991). El
péptido con polilisina en la N-terminal poseía un
contenido mucho menor de hoja-\beta que el amidado
\betaA1-30 o \betaA1-42 (Tabla
1).
El péptido
(K)_{6}-\betaA1-30-NH_{2}
tampoco forma fibrillas tras la incubación a 37ºC al menos durante
15 días. Estos datos muestran claramente que la adición de
polilisina al N-terminal altera el péptido de tal
forma que el contenido de hoja-\beta es mucho
menor que el de \betaA1-42 o
\betaA1-30. Además, el contenido de
hoja-\beta del péptido
(K)_{6}-\betaA1-30-NH_{2}
tampoco se incrementa con el paso del tiempo. El contenido de
hoja-\beta de \betaA1-42 aumentó
a 55% después de 96 horas, mientras que el de
(K)_{6}-\betaA1-30-NH_{2}
permaneció en el intervalo 16-18%.
Ensayo de tioflavina T:
\betaA1-42 ya era fibrilar a t = 0, mientras que
\betaA1-30-NH_{2} formó
fibrillas de forma gradual con el paso del tiempo (Figura 1). El
grado relativamente alto de tinción de tioflavina T de
\betaA1-30-NH_{2} en relación
con \betaA1-42 después de 6 días, refleja la
conocida variabilidad lote a lote de la formación de fibrillas del
péptido \betaA (Soto et alt., 1995), así como un cierto
grado de formación de miniesferas por la incubación prolongada de
\betaA1-42.
K6-\betaA1-30-NH_{2}
no formó fibrillas tras la incubación a 37ºC al menos durante 15
días.
Neurotoxicidad: Para evaluar más la
inocuidad de este enfoque de vacunación, se determinó la
neurotoxicidad de
K6-\betaA1-30-NH_{2}.
K6-\betaA1-30-NH_{2}
no ejerció ningún efecto en la viabilidad celular a los 2 días y fue
ligeramente trófico a los 6 días (p < 0,05), mientras que
\betaA1-40 y \betaA1-42 fueron
tóxicos (p < 0,05-0,001) a las células del
neuroblastoma humano (SK-N-SH),
comparado con el grupo del tratamiento con vehículo, tal y como se
determinó por el ensayo MTT (Figura 2A y B). Durante el período de
incubación, los agregados fueron visibles bajo el microscopio sólo
en los pocillos de cultivo que contenían
\betaA1-42 (10-100 \muM).
Titulación de anticuerpos: Se vacunó a
Tg2576 y a sus compañeros de cría no-Tg con
K6\betaA1-30-NH_{2} o vehículo.
Casi todos los ratones desarrollaron anticuerpos contra el
inmunógeno
(K6-\betaA1-30-NH_{2}),
que tuvo reacción cruzada con \betaA1-40 y
\betaA1-42. La titulación, definida como una
dilución que proporcionaba un 50% de señal máxima, osciló en un
intervalo desde unos pocos cientos a varios miles (no se muestran
los datos). Los animales tratados con vehículo inyectados con el
adyuvante y PBS no desarrollaron anticuerpo contra estos tres
péptidos (no se muestran los datos). Los ratones no transgénicos
tuvieron, por lo general, titulaciones más altas contra los 3
péptidos, y los anticuerpos policlonales presentaron una avidez
mayor por el inmunógeno comparada con \betaA1-40 y
\betaA1-42. Se esperaban estos hallazgos, puesto
que el inmunógeno está basado en la secuencia humana de \betaA que
difiere en 3 aminoácidos de la del ratón \betaA (Johnstone et
alt., 1991) y
K6-\betaA1-30-NH_{2}
síntoma de que la respuesta inmunitaria debería tener más diseños de
unión para los anticuerpos que los péptidos \betaA intactos.
Carga amiloide e histopatología asociada:
Se sacrificaron los ratones a los 18-20 meses, tras
7 meses de tratamiento, y se procesó su hemisferio derecho
histológicamente como ya se ha descrito (Sigurdsson et alt.,
1996). Se tiñeron las secciones cerebrales con violeta de cresilo,
rojo Congo, lectina del tomate y anticuerpos contra: 1) \betaA
humano (6E10); microglía (OX-42;
IL-1\beta) y GFAP (anti-GFAP).
Tras la vacunación con
K6-\betaA1-30-NH_{2}
se redujo la carga amiloide en la corteza y el hipocampo de los
ratones Tg en un 89% y en un 81% respectivamente (Figuras 3A, 3B;
4A, 4B), determinada por técnicas estereológicas. El número total de
depósitos amiloides positivos al rojo Congo se redujo en los
animales inmunizados; sin embargo, el porcentaje de lesiones
inmunorreactivas-\betaA positivas al rojo Congo
pareció ser el mismo que el de los ratones Tg no inmunizados. La
eliminación de los depósitos de amiloide pareció ser similar en
otras regiones cerebrales. Se tiñeron secciones cerebrales
seleccionadas de un ratón control con una gran carga amiloide y un
ratón inmunizado con una carga amiloide reducida con suero
procedente de varios ratones inmunizados y de control, cuyos títulos
de anticuerpos estaban en un rango de cero a tres mil. Tal y como se
esperaba, a medida que aumentaba la titulación, se teñían más
placas, y el patrón fue similar en ambos ratones (no se muestran los
datos). No hubo una diferencia obvia entre los grupos de tratamiento
de Tg en tinción de violeta de cresilo. Se observaron astrocitos
reactivos asociados con todas las placas de amiloide. Puesto que los
ratones tratados con vehículo presentaron una carga mayor de placas
amiloides, también presentaron más agrupaciones de astrocitos que
los ratones Tg inmunizados. Se observó, por tinción con
OX-42, y de modo predominante, en asociación con las
placas, microglía ramificada, en vez de fagocítica (ameboide). Para
verificar que esta falta de fagocitos microgliales no se debía a la
regulación decreciente del receptor CD11b, se tiñó el diseño de
unión de OX-42 (Robinson et alt., 1986) de
las secciones de todos los grupos de tratamiento con lectina del
tomate. Esta lectina específica se une a residuos de
poli-N-acetil-lactosamina
hallados predominantemente en las células microgliales ramificadas y
fagocíticas, además de las células endoteliales y ependimales
(Acarin et alt., 1994). Se tiñeron estos dos últimos tipos de
célula en todos los ratones. La microglía teñida con lectina se
asemejaba a la teñida con OX-42. En otras palabras,
tanto en los grupos de ratones Tg inmunizados como en los grupos
control, la microglía no presentó morfología fagocítica, y el número
de procesos de microglía ramificada por placa pareció ser similar
entre los ratones inmunizados y no inmunizados (no se muestran los
datos). Por otra parte, la tinción con IL-\beta1
de las células de microglía ramificadas estuvo en gran parte
rodeando las placas \betaA en los ratones Tg de control (Figura
3C), mientras que prácticamente no se observó ninguna tinción con
IL-\beta1 en los ratones inmunizados (Figura 3D).
Cabe notar de manera especial que no hubo indicación de
glomerulonefritis en las secciones renales teñidas con
hematoxilina/eosina de los ratones
K6\betaA1-30-NH_{2} tratados, lo
que sugiere que los ratones no habían desarrollado un trastorno
autoinmunitario.
\beta1 soluble por ELISA: Las
determinaciones de las concentraciones de \betaA soluble se
llevaron a cabo en el hemisferio izquierdo de los ratones cuyo
hemisferio derecho fue usado para estudios histológicos. El
\betaA1-42 soluble se redujo en un 57% tras la
vacunación con
K6\betaA1-30-NH_{2} durante 7
meses (p = 0,0019), en comparación con el grupo de control
(Figura 4C). Aunque existió una tendencia a concentraciones
reducidas del \betaA soluble total y del
\betaA1-40 en el grupo tratado con
K6\betaA1-30, los valores no resultaron
significativamente diferentes de los del grupo tratado con
vehículo.
En general, la inmunización en los ratones Tg PPA
con péptido \betaA homólogo, no amiloidogénico/no tóxico (de bajo
contenido en hoja-\beta) produjo una reducción
similar en la carga amiloide, tal y como observaron Schenk y cols.
(1999) allí donde se usó un \betaA1-42
fibrilar/tóxico (con alto contenido en
hoja-\beta).
Estos hallazgos demuestran que no son necesarios
los agregados/fibrillas de \betaA para provocar una respuesta
inmunitaria suficiente que origine la eliminación de las placas de
\betaA. El uso de péptidos homólogos de \betaA no fibrilares/no
tóxicos, como el
K6\betaA1-30-NH_{2}, constituye
un enfoque de vacunación más inocuo para los seres humanos.
No se conoce del todo el mecanismo de la
reducción, inducida por la vacunación, de la carga amiloide en los
seres humanos. Sin embargo, basados en el estudio de vacunación
pasiva de Bard y cols. (2000), es probable que los anticuerpos
jueguen un papel fundamental. Cabe destacar que los autores
demostraron que no existía una correlación entre la eficacia de los
anticuerpos y la afinidad por el \betaA soluble o por la unión al
péptido agregado sintético \betaA. Los anticuerpos eficaces
pudieron, sin embargo, unirse a las placas en secciones del cerebro
no fijadas. Janus y cols. (2000), utilizando el mismo protocolo que
Schenk y cols. (1999), observaron que el suero de los ratones
inmunizados contra el \betaA teñía, de forma preferente, las
placas de centro denso en vez de los depósitos \betaA difusos, lo
que sugería que los anticuerpos podrían tener una afinidad más
elevada por el \betaA en hoja-\beta. Basados en
esos hallazgos, en cierta forma contradictorios, se necesitan más
estudios sobre las interacciones
anticuerpos-\betaA que puedan ofrecer una
comprensión mayor sobre el mecanismo de la eliminación de \betaA
mediada por anticuerpos. No es probable que estos anticuerpos estén
afectando la producción de \betaA, ya que no reconocen a PPA
(Weiner et alt., 2000). Es más probable que los anticuerpos
potencien la eliminación de \betaA por medio de la activación de
la microglía después de que el anticuerpo se haya unido a las placas
\betaA (Schenk et alt., 1999 y Bard et alt., 2000).
Su efecto podría, en parte, deberse a la unión al \betaA soluble
dentro del cerebro, lo que alteraría el equilibrio entre el \betaA
depositado en comparación con el \betaA soluble. Dado el gran
número de informes que muestran que el \betaA puede cruzar la
barrera hematoencefálica bidireccionalmente (Zlokovic et
alt., 1993; Maness et alt., 1994; Martel et alt.,
1996; Podusio et alt., 1997 y 1999; Mackic et alt.,
1998; Shibata et alt., 2000 y Ji et alt., 2001), el
efecto de la vacunación pudiera estar mediado, en parte, por la
unión de los anticuerpos al \betaA soluble en los líquidos
periféricos. Una reducción posterior en las concentraciones
periféricas de \betaA podría alterar el equilibrio entre el
\betaA hallado dentro y fuera del SNC lo que daría lugar a una
salida del \betaA fuera del SNC. Un informe reciente muestra que
en los ratones Tg2576, la concentración plasmática de \betaA
disminuye a medida que aumenta la carga de la placa amiloide en el
cerebro (Kawarabayashi et alt., 2001). Esto sugiere una
interacción entre estos dos compartimentos, que pueden ser
manipulados.
Cabe destacar que, en el estudio conductual de
vacunación de Morgan y cols. (2000), los autores observaron una
inversión parcial del déficit cognitivo en los ratones PPA/PS1,
aunque la carga de amiloide cerebral, medida por inmunohistoquímica,
no se había reducido de forma significativa. Tal y como apuntaron
Morgan y cols. (2000), se ha propuesto que el \betaA soluble
origina la pérdida de sinapsis en los ratones Tg PPA, puesto que
algunas líneas de Tg mostraban una tinción reducida de sinaptofisina
en la circunvolución dentada sin depósitos de \betaA (Mucke et
alt., 2000). Por consiguiente, una posible explicación de la
mejoría cognitiva en los ratones inmunizados en ausencia de una
disminución de la carga de placas \betaA, consistiría en la
disminución del \betaA soluble, aunque no se determinó esta
posible conexión en su estudio (Morgan et alt., 2000). Los
resultados obtenidos en el laboratorio de los presentes inventores
muestran que tras 7 meses de tratamiento, la reducción del
81-89% en la carga de placa amiloide está asociada a
una reducción del 57% en el \betaA1-42 soluble
dentro del cerebro, mientras que la reducción en el \betaA soluble
total y \betaA1-40 no fue significativamente
diferente de la del grupo control. En otras palabras, el \betaA
disminuye menos que la placa \betaA. Sin embargo, se deben llevar
a cabo estudios detallados de tiempo para determinar posteriormente
la existencia de algún cambio en el equilibrio entre el \betaA
soluble y la placa \betaA. Estos hallazgos demuestran
indirectamente la importancia de \betaA1-42 para
la persistencia de la placa amiloide. En general, es posible que
intervengan varios mecanismos diferentes en la disminución de la
placa amiloide cerebral, dependiendo del modelo animal y las
propiedades del péptido usado para la inmunización.
Numerosos estudios han sugerido que el depósito
amiloide puede activar reacciones inflamatorias en cascada en el
cerebro, como el aumento de la producción de IL-1
asociado con el daño neuronal y la muerte (Sigurdsson et alt.
1996 y Akiyama et alt., 2000). Es posible que nuestra
inmunización con péptidos \betaA homólogos pudiera estimular
también esas vías inflamatorias nocivas, al mismo tiempo que reduce
el amiloide. Sin embargo, se observó sólo poca microglía fagocítica
en nuestros animales inmunizados, tal y como se identificó por
inmunorreactividad a OX-42 o a la lectina del
tomate. Esto no resulta sorprendente, porque después de 7 meses de
tratamiento, habían desaparecido la mayoría de las placas. Más aún,
la microglía IL-\beta1 teñida estuvo prácticamente
ausente en el grupo de ratones inmunizados, mientras que se asoció
un gran número de microglía ramificada positiva a
IL-\beta1 con las placas en el grupo Tg de
control. El laboratorio de los presentes inventores había informado
de una carencia similar de teñido IL-\beta1 en un
modelo de amiloidosis cerebral en la rata después de un tratamiento
con un péptido desestructurador de la hoja-\beta
(Sigurdssone et alt., 2000). Sin embargo, en este estudio de
proceso agudo (16 días), este efecto se asoció con un gran aumento
en la tinción fagocítica OX-42 lo que indicaba que
los fagocitos no expresaban IL-\beta1. Las
presentes observaciones de los experimentos en este ejemplo podrían
sugerir que un efecto importante de la inmunización es la reducción
de la inflamación dentro del cerebro.
Los péptidos usados
(\betaA1-40, \betaA1-42,
\betaA1-30-NH_{2},
K6\betaA1-30-NH_{2},
\betaA1-30-K6 (ID SEC NRO.:11),
\betaA1-30-NH_{2} (EE_{18,19})
(ID SEC NRO.:12),
\betaA1-30-NH_{2} (DD_{18,19})
(ID SEC NRO.:13) fueron sintetizados en la Keck Foundation (Yale
University, New Haven, CT) como se ha descrito previamente
(Sigurdsson et al., 2000). Los péptidos \betaA homólogos
mantienen los dos sitios inmunogénicos principales de los péptidos
\betaA (residuos 1-11 y 22-28 de
\betaA1-42 basados en el índice antigénico de
Jameson y cols. (1998) y en resultados preliminares obtenidos en el
laboratorio de los presentes inventores), al mismo tiempo que son no
fibrilares y no tóxicos.
Los experimentos se realizaron tal y como se
describe en el ejemplo 1.
Análisis de los datos: Los datos del
cultivo celular se analizaron mediante análisis de varianza ANOVA de
un factor, seguido de una prueba de Newman Keul para análisis
posterior (GraphPad Prism 3.0).
Ensayo de tioflavina T:
\betaA1-42 se mantenía fibrilar a t = 0, mientras
que \betaA1-30-NH_{2} y
\betaA1-40 formaron gradualmente fibrillas con el
paso del tiempo (Figura 5). \betaA1-30K6 fue
significativamente fibrilogénico, pero
\betaA1-30-NH_{2} (EE_{18,19})
y \betaA1-30-NH_{2}
(DD_{18,19}) no formaron fibrillas tras la incubación a 37ºC al
menos durante 15 días.
Neurotoxicidad: Para evaluar con
posterioridad la inocuidad de este enfoque de vacunación, se
determinó la neurotoxicidad de los péptidos (Figuras 6A y 6B). El
efecto del tratamiento se observó a los 2 y a los 6 días (p
< 0,0001). Los péptidos de control \betaA1-40 y
\betaA1-42 fueron tóxicos (p <
0,01-0,001) para las células del neuroblastoma
humano (SK-N-SH), comparado con el
grupo de tratamiento con vehículo, tal y como se determinó por el
ensayo MTT. K6\betaA-30-NH_{2}
no tuvo ningún efecto en la viabilidad celular a los 2 días pero fue
ligeramente trófico a los 6 días (p < 0,001) y la dosis
más alta (100 \muM) de \betaA1-30K6 fue
ligeramente tóxica a los 2 días del tratamiento, pero no a los 6
días. Durante el período de incubación, los agregados fueron
visibles al microscopio sólo en los pocillos de cultivo que
contenían \betaA1-42 (10-100
\muM). Estos péptidos \betaA homólogos, de acuerdo con la
presente invención, no forman fibrillas y no son tóxicos en el
cultivo neuronal humano.
En general, este enfoque ofrece un riesgo mucho
menor de producción de efectos tóxicos en los seres humanos que el
uso de \betaA1-40/42.
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<110> FRANGIONE, Bias
\hskip1cmWISNIEWSKI, Thomas
\hskip1cmSIGURDSSON, Einar
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDOS SINTÉTICOS INMUNOGÉNICOS
PERO NO AMILOIDOGÉNICOS HOMÓLOGOS AL BETA-AMILOIDE
PARA LA INDUCCIÓN DE UNA RESPUESTA INMUNITARIA AL
BETA-AMILOIDE Y A LOS DEPÓSITOS AMILOIDES
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FRANGIONE=2A PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140> AÚN NO ASIGNADO
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-05-22
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/016.233
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-05-22
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patentin versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu
Val His His Gln Lys}
\sac{Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn
Lys Gly Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
7-10 se encuentran o bien presentes, todos como Lys
o Asp, o están todos ausentes. Cuando los residuos
7-10 están presentes, cualquiera o todos los
residuos 1-6 pueden estar ausentes o presentes como
Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos
7-10, un segmento N-terminal de
polilisina o poliaspartato de 4-10 residuos de
longitud.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
27-31 son LeuValPhePheAla en los que uno o dos de
los residuos 27-31 se han sustituido por Lys, Asp, o
Glu. El residuo C-terminal de Ala puede estar
amidado.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
7-10 son o bien todos Lys o Asp o están todos
ausentes. Cuando los residuos 7-10 están presentes,
cualquiera o todos los residuos aminoácidos 1-6
pueden estar ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en
combinación con los residuos 7-10, un segmento
N-terminal de polilisina o poliaspartato de
4-10 residuos de longitud.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
27-31 y 57-61 son los mismos y son
LeuValPhePheAla en los que uno o dos de los residuos
27-31 y el mismo uno o dos de los residuos
57-61 se han sustituido por Lys, Asp, o Glu. El
residuo C-terminal de Ala puede estar amidado.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
31-34 se encuentran o bien presentes, todos como Lys
o Asp, o están todos ausentes. Cuando todos los residuos
31-34 están presentes, cualquiera o todos los
residuos 35-40 pueden estar ausentes o presentes
como Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos
31-34, un segmento C-terminal de
polilisina o de poliaspartato de 4-10 residuos de
longitud.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
17-21 son LeuValPhePheAla en los que uno o dos de
los residuos 17-21 se han sustituido por Lys, Asp, o
Glu.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
61-64 son todos Lys o todos Asp, o bien están todos
ausentes. Cuando todos los residuos 61-64 están
presentes, cualquiera o todos los residuos 65-70
pueden ser o bien Lys o Asp para formar, en combinación con los
residuos 61-64, un segmento
C-terminal de polilisina o poliaspartato de
4-10 residuos de longitud.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
17-21 y 47-51 son LeuValPhePheAla en
los que uno o dos de los residuos 17-21 y
47-51 son el mismo uno o dos residuos sustituidos
por Lys, Asp, o Glu.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 36
C-terminal puede estar amidado.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
1-6 pueden o bien estar ausentes o presentes como
Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos
7-10, un segmento N-terminal de
polilisina o poliaspartato de 4-10 residuos de
longitud.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El residuo 36
C-terminal de Ala puede estar amidado.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
35-40 pueden estar ausentes o presentes como Lys o
Asp, para formar, en combinación con los residuos
31-34, un segmento C-terminal de
polilisina o de poliaspartato de 4-10 residuos de
longitud.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
7-10 están o bien presentes, todos juntos como Lys o
Asp o están todos ausentes. Cuando los residuos 7-10
están presentes, cualquiera o todos los residuos 1-6
pueden estar ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en
combinación con los residuos 7-10, un segmento
N-terminal de polilisina o de poliaspartato de
4-10 residuos de longitud.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
27-31 son LeuValPhePheAla en los que uno o dos de
los residuos 27-31 se han sustituido por Lys, Asp, o
Glu.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
45-50 pueden estar ausentes o presentes como Lys o
Asp para formar, en combinación con los residuos
41-44, un segmento C-terminal de
polilisina o de poliaspartato de 4-10 residuos de
longitud.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
7-10 son todos o bien Lys o Asp o están todos
ausentes. Cuando los residuos 7-10 están presentes,
cualquiera o todos los residuos 1-6 pueden estar
ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en combinación con
los residuos 7-10, un segmento
N-terminal de polilisina o de poliaspartato de
4-10 residuos de longitud.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
75-80 pueden estar ausentes o presentes como Lys o
Asp para formar, en combinación con los residuos
71-74, un segmento C-terminal de
polilisina o de poliaspartato de 4-10 residuos.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los residuos aminoácidos
27-31 y 57-61 son los mismos y son
LeuValPhePheAla en los cuales uno o dos de los residuos
27-31 y el mismo uno o dos residuos de los residuos
57-61 se han sustituido por Lys, Asp, o Glu.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu
Val His His Gln Lys}
\sac{Leu Glu Glu Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn
Lys Gly Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu
Val His His Gln Lys}
\sac{Leu Asp Asp Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn
Lys Gly Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
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<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Phe Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (32)
1. Un péptido aislado representado por la
fórmula
(A)_{m} -
(N-Xaa_{1}Xaa_{2}Xaa_{3}Xaa_{4}Xaa_{5}-C)_{n}-
(B)_{p}
donde: m es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó
10;
p es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10;
A es Lys o Asp;
B es Lys o Asp;
n es 1 ó 2
N es residuos 1-16 de ID SEC
NRO.:1;
C es residuos 22-30 de ID SEC
NRO.:1;
Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3},Xaa_{4} y
Xaa_{5} son Leu,Val, Phe, Phe, y Ala, respectivamente, en la que
ninguno, uno o dos de los residuos Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3},
Xaa_{4} y Xaa_{5} se sustituyen por Lys, Asp, o Glu; y cuando
cero residuos se sustituyen, o bien m o bien p, o ambos, no son
cero.
2. El péptido de la reivindicación 1, donde:
cuando m no es 0, p es 0;
cuando p no es 0, m es 0; y
Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4} y
Xaa_{5} son Leu, Val, Phe, Phe, y Ala, respectivamente, en la que
cero, uno o dos de los residuos Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3},
Xaa_{4} y Xaa_{5} se sustituyen por Lys, Asp, o Glu.
3. El péptido de la reivindicación 2, donde p es
0.
4. El péptido de la reivindicación 3, donde la
C-terminal de dicho péptido está amidada.
5. El péptido de la reivindicación 3, donde A es
Lys.
6. El péptido de la reivindicación 3, donde A es
Asp.
7. El péptido de la reivindicación 3, donde la
secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:2.
8. El péptido de la reivindicación 3, donde la
secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:3.
9. El péptido de la reivindicación 2, donde m es
0.
10. El péptido de la reivindicación 9, donde B es
Lys.
11. El péptido de la reivindicación 9, donde B es
Asp.
12. El péptido de la reivindicación 9, donde la
secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:4.
13. El péptido de la reivindicación 9, donde la
secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:5.
14. El péptido de la reivindicación 1, donde m no
es cero y p no es cero.
15. El péptido de la reivindicación 1, donde la
secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:7 y el residuo
C-terminal puede estar amidado.
16. El péptido de la reivindicación 1, donde la
secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:6 y el residuo
C-terminal puede estar amidado.
17. El péptido de la reivindicación 1, donde la
secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:8.
18. El péptido de la reivindicación 1, donde la
secuencia aminoácida de dicho péptido se ha seleccionado de un grupo
que consta de las ID SEC NRO.:9 y ID SEC NRO.:10.
19. El péptido de la reivindicación 1, donde la
secuencia aminoácida de dicho péptido se ha seleccionado de un grupo
que consta de las ID SEC NRO.:11, ID SEC NRO.:12 y. ID SEC
NRO.:13.
20. Un conjugado del péptido de la reivindicación
1 ó 2 entrecruzado con una molécula polimérica.
21. El conjugado de acuerdo con la reivindicación
20, donde dicha molécula polimérica es un péptido que consta de un
epítopo de linfocito T cooperador promiscuo.
22. El conjugado de acuerdo con la reivindicación
21, donde dicho péptido es un péptido que consta de un epítopo de
linfocito T cooperador de toxina tetánica, toxina tosferínica,
toxina diftérica, virus del sarampión, antígeno de superficie del
virus de la hepatitis B, proteína de la membrana exterior de
Chlamydia trachomitis, Plasmodium falciparum circumsporozoite,
Schistosoma mansoni, fosfato isomerasas, o Escherichia
coli TraT.
23. El conjugado de acuerdo con la reivindicación
20, donde dicho polímero se selecciona del grupo que consta de
manan, glucan,
tripalmitolil-5-glicerin-cisteína,
y
poli(lactido-co-glicolide).
24. Un compuesto inmunizante, que consta de una
cantidad eficaz inmunizante del péptido aislado de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, o un conjugado derivado, y un portador
farmacéuticamente aceptable, excipiente, diluyente o agente
auxiliar.
25. El compuesto inmunizante de acuerdo con la
reivindicación 24, donde dicho agente auxiliar farmacéuticamente
aceptable es un adyuvante.
26. El compuesto inmunizante de acuerdo con la
reivindicación 25, donde dicho adyuvante es alumbre.
27. Uso del péptido aislado de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, o un conjugado derivado, para la preparación
de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria a los
péptidos beta-amiloides y los depósitos
amiloides.
28. Uso de la reivindicación 27, donde dicho
péptido es para la administración a los seres humanos.
29. Una molécula que incluye la porción de unión
antigénica de un anticuerpo formado contra el péptido de la
reivindicación 1 ó 2, donde dicho anticuerpo es específico para
dicho péptido.
30. Una molécula de acuerdo con la reivindicación
29, donde dicha molécula es un anticuerpo monoclonal.
31. Una molécula de acuerdo con la reivindicación
29, donde dicha molécula es un anticuerpo híbrido o humanizado.
32. Un compuesto farmacéutico, que consta de una
molécula de acuerdo con la reivindicación 29 y un portador
farmacéuticamente aceptable, diluyente, excipiente o agente
auxiliar.
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