ES2238049T3

ES2238049T3 - Peptidos sinteticos inmunogenicos pero no amiloidogenicos homologos a los beta amiloides para la induccion de una respuesta inmunitaria a los depositos amiloides y beta-amiloides.

Info

Publication number: ES2238049T3
Application number: ES01941526T
Authority: ES
Inventors: Blas Frangione; Thomas Wisniewski; Einar M. Sigurdsson
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 2000-05-22
Filing date: 2001-05-22
Publication date: 2005-08-16
Anticipated expiration: 2021-05-22
Also published as: EP1284998A2; NZ521939A; CN1444598A; AU2001274873B2; WO2001090182A3; US6713450B2; US20020077288A1; US7427655B2; CA2408925A1; AU7487301A; DE60108111D1; ZA200207992B; IL152625A; WO2001090182A2; PT1284998E; IL152625A0; CN1249085C; JP2003534351A; DE60108111T2; US20040043935A1

Abstract

Un péptido aislado representado por la fórmula (A)m ¿ (N-Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5-C)n- (B)p donde: m es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10; p es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10; A es Lys o Asp; B es Lys o Asp; n es 1 ó 2 N es residuos 1-16 de ID SEC NRO.:1; C es residuos 22-30 de ID SEC NRO.:1; Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 y Xaa5 son Leu, Val, Phe, Phe, y Ala, respectivamente, en la que ninguno, uno o dos de los residuos Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 y Xaa5 se sustituyen por Lys, Asp, o Glu; y cuando cero residuos se sustituyen, o bien m o bien p, o ambos, no son cero.

Description

Péptidos sintéticos inmunogénicos pero no amiloidogénicos homólogos a los beta amiloides para la inducción de una respuesta inmunitaria a los depósitos amiloides y beta-amiloides.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo de los péptidos beta-amiloides y con un método para inducir una respuesta inmunitaria a los péptidos beta-amiloides y a los depósitos amiloides.

Descripción de los antecedentes

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más frecuente de demencia senil (Soto et alt., 1994), y constituye la cuarta causa de muerte en Estados Unidos. Aproximadamente el 10% de la población de más de 65 años está afectada por este trastorno degenerativo progresivo que se caracteriza por pérdida de la memoria, confusión, y una serie de discapacidades cognitivas. Neuropatológicamente, la EA se caracteriza por cuatro lesiones importantes: a) depósito intraneuronal, citoplasmático, de ovillos neurofibrilares (ONF), b) depósitos amiloides parenquimatosos denominados placas neuríticas, c) amiloidosis cerebrovascular, y d) pérdida neuronal y de sinapsis. Uno de los acontecimientos clave en la EA es el depósito de amiloides en forma de masas fibrosas insolubles (amiloidogénesis), lo que da lugar a la formación de placas neuríticas extracelulares y depósitos alrededor de las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales. El componente principal de las placas neuríticas y la angiopatía congofílica es el beta-amiloide (\betaA), aunque estos depósitos también contienen otras proteínas como los glucosaminoglicanos y las apolipoproteínas.

El \betaA es un péptido hidrofóbico 4.1-4.3 kDa codificado en el cromosoma 21 como parte de una proteína precursora del amiloide mucho más grande (PPA) (Muller-Hill et alt., 1989). La PPA comienza con una secuencia líder (péptido de señal), seguida de una región rica en cisteína, un dominio altamente acídico, un motivo inhibidor de la proteasa, una región putativa N-glicosilatada, un dominio de transmembrana, y, finalmente, una región citoplasmática pequeña. La secuencia \betaA comienza cerca de la membrana en la parte extracelular y termina dentro de la membrana. Dos tercios de \betaA dan al espacio extracelular y el otro tercio está insertado en la membrana (Kang et alt., 1987 y Dyrks et alt., 1988). Varios hechos indicativos sugieren que el amiloide pudiera jugar un papel central en la patogénesis precoz de la EA.

La evidencia de que el amiloide pueda jugar un papel importante en la patogénesis precoz de la EA proviene, fundamentalmente, de estudios de personas afectadas por la forma familiar de la EA (EAF) o por el síndrome de Down. Los pacientes con síndrome de Down tienen tres copias del gen PPA y desarrollan neuropatología de EA a una edad temprana (Wisniewski et alt., 1985). El análisis genético de las familias con EA hereditaria reveló mutaciones en el cromosoma 21, cerca o dentro de la secuencia \betaA (Forsell et alt., 1995), además de mutaciones dentro de los genes de la presenilina 1 y 2. Más aún, se reportó que los ratones transgénicos que expresaban niveles elevados de PPA mutante humana desarrollaban progresivamente amiloidosis cerebral (Games et alt., 1995). Estos hallazgos parecen implicar a la amiloidogénesis en la fisiopatología de la EA. Además, las fibrillas de \betaA son tóxicas en cultivos neuronales (Yankner et alt., 1989) y, hasta cierto punto, cuando se inyectan en los cerebros de animales (Sigurdsson et alt., 1996 y 1997).

Además, otros hechos indicativos sugieren que el depósito de \betaA es el factor desencadenante principal en la patogénesis de la EA, lo que subsecuentemente origina la formación de ONF y la pérdida neuronal. Los depósitos amiloides en la EA comparten una serie de propiedades con las demás amiloidosis cerebrales, como las amiloidosis relacionadas con el prión, así como las amiloidosis sistémicas. Estas características son: 1) ser relativamente insolubles; 2) poseer una estructura secundaria de hoja-\beta, que se asocia con una tendencia a la agregación o la polimerización; 3) ultraestructuralmente, los depósitos son fundamentalmente fibrilares; 4) la presencia de ciertas proteínas asociadas con el amiloide, como el componente P-amiloide, los proteoglicanos y las apolipoproteínas; 5) los depósitos muestran una típica birrefringencia verde manzana cuando se observan bajo luz polarizada después de su tinción con rojo Congo.

Se halló el mismo péptido que forma los depósitos amiloides en el cerebro afectado por la EA en una forma soluble (\betaAs) que, por regla general, circula por los líquidos del cuerpo humano (Seubert et alt., 1992 y Shoji et alt., 1992). Zlokovic et alt. (1994) reportaron que la barrera hematoencefálica (BHE) tiene la capacidad de controlar el secuestro y el transporte cerebrovascular de la \betaAs circulante, y que el transporte de dicha \betaAs a través de la BHE se elevó significativamente cuando se perfundió \betaAs en cobayas en forma de complejo con apolipoproteína J (apoJ). Se halló complejo \betaAs-apoJ en el líquido cefalorraquídeo normal (LCR; Ghiso et alt., 1994), y estudios in vivo revelaron que la \betaAs se transportaba con la apoJ como un componente de las lipoproteínas de alta densidad (LAD) en el plasma humano normal (Koudinov et alt., 1994). Zlokovic et alt. (1996) reportaron, asimismo, que el transporte de la \betaAs a través de la BHE casi se abolía cuando se bloqueaba el receptor apoJ gp330. Se cree que la conversión de la \betaAs en fibrillas insolubles se inicia por una modificación conformacional de la forma soluble más larga del aminoácido 2-3. Se ha sugerido que la formación de amiloide es un fenómeno dependiente de la nucleación, en el que la "semilla" inicial insoluble permite el depósito selectivo de amiloide (Jarrett et alt., 1993).

Los péptidos que contienen la secuencia 1-40 ó 1-42 de \betaA y los derivados más cortos pueden formar fibrillas de tipo amiloidal en ausencia de otras proteínas (Soto et alt., 1994), lo que sugiere que el potencial para formar amiloide reside fundamentalmente en la estructura de \betaA. Se analizó la relación entre la estructura primaria de \betaA y su capacidad para formar fibrillas de tipo amiloidal alterando la secuencia del péptido. La substitución de los residuos hidrofílicos por unos hidrofóbicos en las regiones hidrofóbicas internas de \betaA (aminoácidos 17-21) dificulta la formación de fibrillas (Hilbich et alt., 1992), lo que sugiere que el ensamblaje de \betaA está guiado en parte por interacciones hidrofóbicas. De hecho, los péptidos \betaA más grandes (\betaA1-42/43) que constan de dos o tres residuos C-terminal hidrofóbicos adicionales son más amiloidogénicos (Jarrett et alt., 1993).

En segundo lugar, la conformación adoptada por los péptidos \betaA es crucial en la formación de amiloide. Los péptidos \betaA incubados a diferentes concentraciones de pH y disolventes pueden tener o bien una estructura en su mayor parte de \alpha-hélice, de espiral aleatoria o una estructura secundaria de hoja-\beta (Barrow et alt., 1992; Burdick et alt., 1992 y Zagorski et alt., 1992). El péptido \betaA con estructura en \alpha-hélice o espiral aleatoria se agrega lentamente; el \betaA con conformación de estructura hoja-\beta se agrega rápidamente (Zagorski et alt., 1992; Soto et alt., 1995 y Soto et alt., 1996). Se ha sugerido también la importancia de la hidrofobicidad y la estructura secundaria de hoja-\beta en la formación de amiloide mediante la comparación de la secuencia de otras proteínas amiloidogénicas.

El análisis de la agregación de \betaA por determinación de turbidez indica que la longitud del dominio C-terminal de \betaA influye en la tasa de ensamblaje de \betaA al acelerar la formación del núcleo (Jarrett et alt., 1993). Por consiguiente, el dominio C-terminal de \betaA podría regular la fibrilogénesis. Sin embargo, moduladores in vitro de la formación de \betaA, como cationes metálicos (Zn, Al) (Bush et alt., 1994 y Exley et alt., 1993), sulfato de heparina, proteoglicanos, y apolipoproteína E (Strittmatter et alt., 1993) interactúan con la región 12-28 de \betaA. Más aún, las mutaciones del gen PPA dentro del dominio N-terminal de \betaA producen análogos más fibrilogénicos (Soto et alt., 1995 y Wisniewski et alt., 1991). Finalmente, mientras que el dominio C-terminal de \betaA adopta invariablemente una estructura de filamento-\beta en soluciones acuosas, los parámetros medioambientales determinan la existencia de una conformación alternativa en el dominio N-terminal de \betaA (Barrow et alt., 1992; Soto et alt., 1995 y Burdick et alt., 1992). Por lo tanto, el N-terminal podría constituir un objetivo potencial para la inhibición de la espiral aleatoria inicial a un cambio conformacional de hoja-\beta.

La idea que surge de los estudios con péptidos sintéticos es que la formación de \betaA depende de las interacciones hidrofóbicas de los péptidos \betaA que adoptan una conformación antiparalela de hoja-\beta, y que tanto los dominios de N-terminal como los de C-terminal son importantes para la formación de amiloide. La unidad básica de la formación fibrilar parece ser la conformación antiparalela de hoja-\beta compuesta de filamentos que abarcan las regiones 10-24 y 29-40/42 del péptido (Soto et alt., 1994). La formación de amiloide progresa por medio de interacciones intermoleculares entre los filamentos-\beta de varios monómeros para formar una estructura oligomérica de hoja-\beta precursora de la conformación entrecruzada-\beta fibrilar. Wood et alt., (1995) reportaron la inserción de prolinas bloqueadoras de la agregación en proteínas amiloides y péptidos a fin de prevenir la agregación de dichas proteínas y péptidos. De esta manera, los autores sugieren que se pueden diseñar proteínas nuevas para evitar el problema de la agregación como una barrera a su producción, sin afectar la estructura o función de la proteína nativa. Por consiguiente, Wood et alt., tratan de producir proteínas nuevas que no se agregarían durante la producción y purificación de proteínas recombinantes, mediante la inserción de prolinas bloqueadores de la agregación en estos péptidos nuevos.

Hasta el presente, no existe ni cura ni terapia eficaz para reducir la carga amiloide de un paciente o prevenir el depósito de amiloide en la EA, e incluso el diagnóstico de EA sólo se puede hacer tras examen postmortem del tejido cerebral para hallar los ovillos neurofibrilares (ONF) característicos y las placas neuríticas. Sin embargo, va en aumento el número de publicaciones que delinean las estrategias para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Las estrategias terapéuticas relacionadas con el amiloide contemplan el uso de compuestos que afectan el procesamiento de la proteína precursora del \beta-amiloide (PPA; Dovey et alt., 2001), que interfieren con la formación de fibrillas o que promueve el desacople de las fibrillas (Soto et alt., 1998; Sigurdsson et alt., 2000, y Findels, 2000).

Se ha identificado el sulfato de heparina (glucosaminoglicano) o el sulfato de heparina proteoglicano, perlecano, como componentes de todos los amiloides, y se les ha implicado en las fases precoces de la inflamación asociada a la inducción amiloide. Kisilevsky et alt. (1995) describen el uso de compuestos de sulfonato o sulfato aniónico de bajo peso molecular (135-1000 Da) que interfieren con la interacción del sulfato de heparina con el precursor amiloide asociado a la inflamación y el péptido-\beta de la EA. El sulfato de heparina influye específicamente en el precursor amiloide soluble (PAS2) para adoptar una estructura mayor de hoja-\beta característica del patrón de proteína plegada de los amiloides. Se demostró que estos compuestos de sulfonatos o sulfatos aniónicos inhibían la formación de fibrillas \betaA acelerada por heparina de la enfermedad de Alzheimer y eran capaces de desacoplar las fibrillas preformadas in vitro tal como reveló el control mediante micrografía de electrones. Además, al administrarse por vía oral en concentraciones relativamente altas (20 ó 50 mM), estos compuestos detenían de forma importante la inflamación esplénica en murinos asociada con la progresión amiloide in vivo en modelos agudos y crónicos. Sin embargo, el compuesto más potente, poli-(vinilsulfonato), produjo una toxicidad aguda.

Se ha observado clínicamente que la antraciclina 4'-iodo-4'deoxidoxorrubicina (IDOX) induce la resorción amiloide en los pacientes con amiloidosis de inmunoglobulina de cadena ligera (AL). Merlini et alt. (1995), elucidaron este mecanismo de acción. Se halló que IDOX se unía estrechamente por medio de interacciones hidrofóbicas a dos lugares de unión diferentes (análisis Scatchard) en cinco fibrillas amiloides distintas de prueba, inhibiendo la fibrilogénesis y la subsiguiente formación de depósitos amiloides in vitro. La preincubación de IDOX con factor potenciador de amiloide (FPA) también redujo la formación de depósitos amiloides. Se confirmó in vivo la selección específica de los depósitos amiloides por parte de IDOX en los modelos agudos en murinos. Esta unión es diferente de la unión del sulfato de heparina puesto que la extracción de los glucosaminoglicanos de las fibrillas de amiloide extraídas con heparinasas no modificaron la unión de IDOX. La característica estructural común de todos los amiloides es la conformación de hoja-\beta plegada. Sin embargo, IDOX no se une con las cadenas ligeras del precursor de amiloide nativo, lo que sugiere que la hoja-\beta plegada por sí sola no es suficiente para formar la estructura óptima para la unión de IDOX, y que es la estructura cuaternaria de la fibrilla de la hoja-\beta entrecruzada la que se requiere para una máxima unión de IDOX. Se ha descubierto que la cantidad de IDOX extraída de los bazos está correlacionada con la carga amiloide y los niveles de precursor de amiloide circulantes en el suero. Sin embargo, IDOX es también extremadamente tóxico.

Se ha investigado en la patente de EE.UU. 5.385.915 y WO 9427603 la regulación y el procesamiento de la proteína precursora de amiloide (PPA) mediante la inhibición o modulación de la fosforilación de las proteínas de control de la PPA. Se ha examinado también en AU 9338358 y EP569777 la modulación del procesamiento proteolítico de la PPA a formas nucleantes de la EA. WO 95046477 revela péptidos sintéticos de composición X-X-N-X (ID SEC NRO.:69) unidos a un portador, donde X es un aminoácido catiónico y N es un aminoácido neutro, que inhibe el emparejamiento de \betaA al glucosaminoglicano. En WO 9203474 se revelan los péptidos con secuencias \betaA de la enfermedad de Alzheimer que inhiben el emparejamiento de \alpha-1-antiquimotripsina y \betaA.

A partir de experimentos realizados en el laboratorio de los presentes inventores, WO 96/39834 revela que se pueden usar los péptidos capaces de interactuar con una porción hidrofóbica en una proteína o péptido, como \betaA, involucrada en la formación de depósitos similares a los amiloides, para inhibir y bloquear estructuralmente el plegado anómalo de dichas proteínas y péptidos en depósitos amiloides o de tipo amiloidal. Los péptidos que bloquean el plegado anómalo de \betaA en depósitos amiloides poseen una porción hidrofóbica que contiene residuo o residuos aminoácidos que desestructuran la hoja-\beta, como la prolina, y que reducen la propensión del péptido a adoptar una conformación en hoja-\beta. El laboratorio de los presentes inventores, en informes posteriores, ha demostrado que LeuProPhePheAsp (ID SEC NRO.:14), un péptido no amiloidogénico con secuencia homóloga a \betaA, bloquea la formación de fibrillas (Soto et alt., 1998) e induce el desacople in vivo de los depósitos \betaA fibrilares (Sigurdsson et alt., 2000).

Pallitto et alt. (1999) propusieron recientemente el emparejamiento de residuos de lisina con péptidos para el diseño de péptidos anti hoja-\beta o inhibidores de la fibrilogénesis de \betaA que posean una secuencia de reconocimiento de unión-\betaA y un elemento hexamérico perturbador de la agregación de lisina.

Estudios in vitro han revelado que los anticuerpos monoclonales formados contra la región N-terminal de \betaA pueden desagregar las fibrillas \betaA, conservar la solubilidad de \betaA y prevenir la toxicidad de \betaA en cultivos celulares (Solomon et alt., 1996 y 1997).

WO 96/25435 revela el potencial para usar un anticuerpo monoclonal, que es específico de terminación para la C-terminal libre del péptido \betaA1-42, pero no para el péptido \betaA1-43, a fin de prevenir la agregación de \betaA1-42. Se revela posteriormente que la administración de dicho anticuerpo monoclonal específico de terminación de \betaA interactúa con el residuo libre C-terminal de \betaA1-42, afectando e interfiriendo con la agregación que pudiera ser patogénica en la EA.

WO 98/44955 adopta un enfoque diferente para evitar los problemas asociados con la administración repetida de una substancia farmacológica, y presenta un método para prevenir el comienzo de la enfermedad de Alzheimer o para inhibir la progresión de la enfermedad de Alzheimer a través de una expresión ectópica estable en el cerebro de anticuerpos recombinantes específicos de terminación para los péptidos \beta-amiloides.

Recientemente, Schenk et alt. (1999) demostraron que la inmunización con \beta-amiloide atenuaba la patología similar a la enfermedad de Alzheimer en los ratones transgénicos PDPPA que sirven como modelos animales para los depósitos de \beta-amiloides y las neuropatologías del tipo de la enfermedad de Alzheimer. Los autores reportaron que la inmunización de animales jóvenes antes del comienzo de las neuropatologías del tipo de la enfermedad de Alzheimer prevenía, fundamentalmente, el desarrollo de la formación de placa \beta-amiloide, distrofia neurítica y astrogliosis, mientras que se observó que el tratamiento en animales más viejos después del comienzo de neuropatologías del tipo de la enfermedad de Alzheimer disminuía el alcance y la progresión de estas neuropatologías. Se piensa que este efecto está mediado por anticuerpos, puesto que se ha mostrado que anticuerpos anti-\betaA administrados por vía periférica reducen la carga amiloide del parénquima cerebral (Bard et alt., 2000). Además, la inmunización intranasal con \betaA1-40 recién solubilizado disminuye la carga amiloide en el cerebro (Weiner et alt., 2000). Dos estudios recientes demostraron que una disminución inducida por la vacunación en los depósitos amiloides cerebrales dio lugar a una mejoría cognitiva (Morgan et alt., 2000; Janus et alt., 2000).

Aunque los resultados reportados por Schenk y cols. son prometedores de cara al uso de la inmunomodulación como enfoque general para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, la inmunización con \beta-amiloide intacto, según Schenk y cols. presenta problemas que lo hacen inapropiado para el uso humano. En primer lugar, los experimentos de Schenk y cols. utilizaron ratones transgénicos que expresan una proteína humana mutada que les es extraña y que no tiene ninguna función fisiológica en los ratones (las secuencias del péptido \betaA en el ratón y el ser humano son significativamente diferentes). Sin embargo, en los humanos, la proteína precursora (PP\betaA) es una proteína endógena que cumple una función normal. De ahí que la utilización de este enfoque en los seres humanos con un péptido \betaA humano podría muy bien llevar al desarrollo de un trastorno o enfermedad autoinmunitaria que podría empeorar las cosas en vez de mejorarlas. En segundo lugar, B. Zlokovic (1997) y los presentes inventores han logrado resultados que demuestran que los péptidos \betaA, \betaA1-42 y \betaA1-40 pueden cruzar la barrera hematoencefálica en animales de experimentación. Por consiguiente, se espera que, en los seres humanos, el péptido \betaA1-42, usado para inmunización por Schenk y cols. pueda cruzar la barrera hematoencefálica y codepositarse en alguna de las placas de amiloide existentes aumentando la toxicidad, y podría, de hecho, inducir la formación de placas. Esto no ha constituido un problema en el modelo de ratón transgénico PDPPA para la EA porque el péptido humano \betaA1-42 es menos tóxico para el ratón; incluso si hubiera un depósito masivo de péptido \betaA1-42 humano, ninguno de los ratones transgénicos mostrarían una pérdida neuronal significativa. En tercer lugar, Schenk y cols. usan una sustancia tóxica como coadyuvante para inducir una respuesta inmunitaria.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un péptido sintético inmunogénico, pero no amiloidogénico, homólogo al \beta-amiloide que puede usarse para inducir una respuesta inmunitaria a los péptidos \beta-amiloides y a los depósitos amiloides, y que superaría o evitaría las complicaciones y los problemas encontrados en las investigaciones hasta la fecha.

El péptido sintético inmunogénico, pero no amiloidogénico, homólogo al beta-amiloide abarca los primeros treinta residuos aminoácidos de \betaA1-42 (ID SEC NRO.:1), en la que se sustituyen cero, uno, o dos residuos 17-21 con Lys, Asp, o Glu, e incluye, de preferencia, un segmento N-terminal y/o C-terminal de residuos 4-10 de Lys o Asp.

La presente invención también proporciona un conjugado en el que el péptido se entrecruza con una molécula polimérica inmunoestimuladora.

Otro aspecto de la presente invención está dirigido a una substancia inmunizadora/vacuna que contiene una cantidad eficaz inmunizante del péptido sintético inmunogénico, pero no amiloidogénico, homólogo al \beta-amiloide o un conjugado derivado.

Un aspecto posterior de la presente invención está enfocado a un método para la inmunoterapia a fin de inducir una respuesta inmunitaria a los péptidos \beta-amiloides y a los depósitos amiloides.

Otro aspecto de la invención está dirigido a las moléculas que incluyen la porción de unión al antígeno de un anticuerpo contra el péptido sintético inmunogénico, pero no amiloidogénico, de acuerdo con la presente invención. Se proporcionan, asimismo, compuestos farmacéuticos que contienen esta molécula de unión al péptido y un método para reducir la formación de fibrillas amiloides y depósitos.

Breve descripción de los gráficos

La figura 1 muestra los resultados de un ensayo fluorométrico de tioflavina T. La formación de fibrillas de \betaA1-42, \betaA1-30-NH_{2}, y K6\betaA1-30-NH_{2} (ID SEC NRO.:6) se determinó in vitro tras la incubación a 37ºC. K6\betaA1-30-NH^{2} fue el único péptido que no formó fibrillas en ninguno de los tiempos determinados.

Las figuras 2A y 2B muestran que \betaA40 y \betaA42 son tóxicos para las células del neuroblastoma humano (SK-N-SH) en cultivos, tal y como se determinó en el ensayo MTT, mientras que el K6A\betaA30-NH_{2} no tiene efecto a los 2 días (Fig. 2A) y es ligeramente trófico a los 6 días (Fig. 2B). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 comparado con el grupo VEH (ANOVA de un factor).

Las figuras 3A-3D muestran secciones coronales (X50; aumento original) teñidas con 6E10 anti \betaA, a través del hipocampo y corteza cerebral en un ratón de control Tg (Fig. 3A) y en un ratón Tg tratado con K6\betaA1-30 (Fig. 3B). Las figs. 3C y 3D son secciones adyacentes (X100) doblemente teñidas para la interleucina-1 que identifica la microglía y \betaA. Cabe notar la disminución de la carga amiloide en el ratón imunizado (Fig. 3B), y la carencia de microglía ramificada (Fig. 3D) rodeando a la placa \betaA en el mismo ratón, comparado con el ratón de control (Fig. 3A, 3C). Las barras en las figs. 3A y 3C son de 100\mum. Abreviaciones: hip = hipocampo; cx = corteza; cc = cuerpo calloso.

Las figuras 4A-4C muestran la disminución en la carga amiloide de la corteza (Fig. 4A) y del hipocampo (Fig. 4B) carga amiloide (6E10) tras 7 meses de tratamiento con K6\betaA130-NH_{2}. Se observa una disminución del 89% de la carga amiloide cortical (*p = 0,0002; prueba-t; n = 4 por grupo) y una disminución del 81% en la carga amiloide del hipocampo (*p = 0,0001). Los niveles de \betaA1-42 soluble (Fig. 4C) bajan a un 57% en los cerebros de los ratones vacunados (*p = 0,0019).

La figura 5 muestra los resultados del ensayo fluorométrico de tioflavina T. La formación de fibillas de \betaA1-42, \betaA1-40, \betaA1-30-NH_{2} n, \betaA1-30K6, \betaA1-30-NH_{2} (EE_{18,19}) y \betaA1-30-NH_{2}(DD_{18,19}) se determinó in vitro tras incubación a 37ºC.

Las figuras 6A y 6B muestran los resultados del ensayo de toxicidad celular MTT. Se determinó la neurotoxicidad de \betaA1-42, \betaA1-40, \betaA1-30-NH_{2}, K6\betaA 1-30-NH_{2}, \betaA1-30K6, \betaA1-30-NH_{2}(EE_{18,19}) y \betaA1-30-NH_{2}(DD_{18,19}) tras el tratamiento de las células del neuroblastoma humano (SK-N-SH) durante 2 (Fig. 6A) y 6 (Fig. 6B) días. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 comparado con el grupo VEH (ANOVA de un factor).

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores han diseñado péptidos sintéticos no amiloidogénicos homólogos al beta-amiloide (\betaA) que poseen no sólo una menor capacidad de adoptar una conformación de hoja-\beta como fuente antigénica sino que también ofrecerían un riesgo mucho menor de producir efectos tóxicos en los seres humanos. Al usar los péptidos sintéticos no amiloidogénicos, o conjugados derivados, en un compuesto inmunizante, la presente invención proporciona un medio para lograr que los péptidos \betaA y los depósitos amiloides se conviertan en blanco del sistema inmunitario. Un objetivo importante de la presente invención es, por consiguiente, proporcionar un método de inmunización que minimice la toxicidad asociada con la inyección de péptidos \betaA al mismo tiempo que maximice la respuesta inmunitaria a los péptidos \betaA y a los depósitos amiloides.

Los péptidos sintéticos inmugénicos, pero no amiloidogénicos, homólogos al \betaA, según la presente invención, han sido diseñados para reducir el potencial fibrilogénico y, al mismo tiempo, mantener los dos lugares principales inmunogénicos de los péptidos \betaA, que son los residuos 1-11 y 22-28 de \betaA1-42 basados en el índice antigénico de Jameson et alt. (1988) y los resultados/observaciones obtenidos en el laboratorio de los presentes inventores. En consecuencia, los presentes inventores han basado el diseño del péptido sintético no amiloidogénico en los primeros treinta residuos de aminoácidos (ID SEC NRO.:1) de \betaA1-42, en el que uno o dos de los residuos hidrofóbicos en posición 17-21 de la ID SEC NRO.:1 se han sustituido por residuos cargados de Lys, Asp, o Glu. Los primeros treinta residuos de \betaA carecen de la C-terminal hidrofóbica de \betaA1-42, pero conservan las dos regiones inmunogénicas correspondientes a los residuos 1-11 y 22-28 de la ID SEC NRO.:1.

Al modificar uno o dos de los residuos en las posiciones 17-21 de \betaA1-30 (ID SEC NRO.:1) con Lys, Asp, o Glu, que son residuos hidrofílicos que presentan una baja probabilidad de adoptar una conformación de hoja-\beta, se reduce en gran manera el potencial fibrilogénico del péptido. Los ID SEC NRO.: 12 y 13 son ejemplos de los \betaA1-30 modificados. Además, la presencia de una serie de residuos de Lys o Asp en la N-terminal y/o en la C-terminal del péptido sintético de la presente invención, potenciaría aún más la inmunogenicidad (Werdelin, 1981) y reduciría la propensión del péptido sintético a adoptar una conformación de hoja-\beta y de formar depósitos o fibrillas de amiloide. Pallitto et alt. (1999) han propuesto el emparejamiento de residuos de lisina con péptidos \betaA de 4 a 8 residuos de longitud para el diseño de péptidos anti-hoja-\beta o de inhibidores de la fibrilogénesis de \betaA, pero nunca se ha propuesto el uso de los péptidos de Pallitto como inmunógenos. Se han usado previamente los aminoácidos policatiónicos para potenciar el transporte de proteínas a las células por procesos de endocitosis/fagocitosis (Martinez-Fong et alt., 1994; Wang et alt., 1989; Shen et alt., 1985; Peterson et alt., 1984; Deierkauf et alt., 1977; DiNicola et alt., 2000). Buschle et alt. (1997) reportaron que los aminoácidos policatiónicos potenciaban la captación de los péptidos por células presentadoras de antígenos, iniciando así una respuesta inmunitaria. Los autores también reportaron que mientras que la captación del péptido mediado por polilisina parece deberse a una permeabilización, al menos pasajera, de las membranas celulares, la producción de péptidos en presencia de poliarginina podría depender de los procesos endocíticos.

El péptido sintético inmugénico, pero no amiloidogénico, homólogo al \betaA de acuerdo con la presente invención, que no se considera un péptido inhibidor de la fibrilogénesis \betaA, está representado en la fórmula

(A)_{m} - (N-Xaa_{1}Xaa_{2}Xaa_{3}Xaa_{4}Xaa_{5}-C)_{n}-(B)_{p}

donde: m es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10;

p es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10;

A es Lys o Asp;;

B es Lys o Asp;;

N es 1 ó 2

N es residuos 1-16 de ID SEC NRO.:1;

C es residuos 22-30 de ID SEC NRO.:1;

Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4}, Xaa_{5} son Leu, Val, Phe, Phe, y Ala, respectivamente, en el que ninguno, uno o dos residuos de Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4}, Xaa_{5} se sustituyen con Lys, Asp, o Glu; y

cuando se sustituyen cero residuos, alguno o ambos de m o p, no son nulos.

Las secuencias de aminoácidos del péptido representadas por la fórmula anterior se presentan e identifican como ID SEC NRO.:2-5.

La secuencia básica de treinta aminoácidos (\betaA1-30) en la que ninguno, uno o dos de los residuos 17-21 se sustituyen está representada en la fórmula precedente por N-Xaa_{1}Xaa_{2}Xaa_{3}Xaa_{4}Xaa_{5}-C. Este segmento de residuo de treinta aminoácidos se puede repetir (n es 2) en el péptido sintético de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, un segmento de polilisina o poliaspartato de 4 a 10 residuos está presente en el N-terminal y/o C-terminal del péptido. Cuando no se sustituyen residuos en los residuos 17-21 de \betaA1-30, el péptido tiene un segmento de polilisina o poliaspartato de 4 a 10 residuos en el N-terminal y/o C-terminal. Si un segmento de polilisina o poliaspartato no está presente en el C-terminal, entonces se amida preferentemente el C-terminal tal y como se indica en el ejemplo de la ID SEC NRO.:6 que se muestra como materialización preferente. La ID SEC NRO.:11 es una materialización de un péptido \betaA1-30, sin sustituir, con un segmento de polilisina o poliaspartato de 4 a 10 residuos en el C-terminal.

Además, cuando m es 0, el segmento de polilisina o poliaspartato N-terminal de 4 a 10 residuos está ausente y, entonces, es preferible o bien amidar el C-terminal del péptido para reducir la posibilidad de que la carga C-terminal del péptido reduzca la inmunogenicidad de la zona de residuos 22-28 de \betaA o que el segmento de polilisina o poliaspartato de 4 a 10 residuos esté presente en el C-terminal. Otra materialización preferida del péptido, de acuerdo con la presente invención, es la siguiente:

cuando m no es cero, p es cero;

cuando p no es cero, m es cero; y

Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4}, Xaa_{5} son Leu, Val, Phe, Phe, y Ala, respectivamente, en donde uno o dos residuos de Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4}, Xaa_{5} se sustituyen con Lys, Asp, o Glu (ID SEC NRO.:2-5).

Los expertos en la materia apreciarán también que se puede usar la peptidomimética del péptido sintético de la presente invención, reemplazando las uniones peptídicas con uniones no peptídicas.

Como es bien conocido en el sector, se puede determinar fácilmente el potencial de reducción fibrilogénico de los péptidos sintéticos amparados por la presente invención determinando la conformación de hoja-\beta de los péptidos mediante el uso de técnicas convencionales como el espectrodicroísmo circular, FT-IR y microscopía electrónica de suspensiones peptídicas.

Es bien conocido, asimismo, que se deben presentar los inmunógenos conjuntamente con antígenos de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase II a fin de evocar una respuesta eficaz de anticuerpos. Los antígenos MHC de clase II producidos por las células presentadoras de antígenos (CPA) se unen a los epitopos de los linfocitos T presentes en el inmunógeno bajo una forma específica de secuencia. Este complejo de inmunógeno MHC de clase II es reconocido por los linfocitos CD4+ (linfocitos T_{h}), lo que causa la proliferación de linfocitos B específicos capaces de reconocer un epitopo de linfocitos B del inmunógeno presentado y la producción de anticuerpos específicos de epitopo de linfocitos B por dichos linfocitos B. Un enfoque adicional para aumentar aún más la inmunogenicidad de los péptidos sintéticos de la presente invención es formar un conjugado con una molécula polimérica inmunoestimuladora como el manan (polímero de manosa), glucan (polímero de \beta1-2 glucosa), tripalmitoil-S-glicerina-cisteína, y péptidos que han sido ya aprobados para su uso en vacunas para los seres humanos. Dichos péptidos aprobados para su uso en vacunas para los seres humanos proporcionan epitopos potentes de linfocitos T cooperadores (T_{h}) a partir de inmunógenos potentes como la toxina tetánica, tosferínica, la proteína F del virus del sarampión, y el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (AgsHB). Los epitopos de T_{h} seleccionados para su conjugación con el péptido sintético son, de preferencia, capaces de provocar una respuesta de los linfocitos T colaboradores en un gran número de personas que expresan diversos haplotipos MHC. Estos epitopos funcionan en muchas personas diferentes dentro de una población heterogénea, y se consideran epitopos T_{h} promiscuos. Los epitopos T_{h} promiscuos ofrecen la ventaja de provocar respuestas potentes de anticuerpos en la mayoría de los miembros de grupos de población genéticamente diferentes.

Aún más, los epitopos del linfocito T colaborador conjugados/entrecruzados al péptido sintético de la presente invención son seleccionados de forma preferente no sólo por su capacidad de originar una respuesta inmunitaria en la mayoría de los miembros de una población dada, sino también por su capacidad de producir respuestas de memoria/recuerdo. Cuando un mamífero es del género humano, la gran mayoría de los seres humanos/pacientes que reciben inmunoterapia con el péptido sintético de la presente invención habrán sido ya inmunizados, con toda probabilidad, con las vacunas pediátricas (a saber, vacunas contra el sarampión+paperas+rubéola y difteria+tosferina+tétanos), y, posiblemente, con la vacuna contra el virus de la hepatitis B. Estos pacientes, por consiguiente, han estado expuestos con anterioridad al menos a uno de los epitopos de los linfocitos T_{h} presentes en las vacunas pediátricas. La exposición previa al epitopo del linfocito T_{h} a través de la inmunización con las vacunas estándares debería establecer clones celulares T_{h} que pueden proliferar inmediatamente tras la administración del péptido sintético (esto es, una respuesta de recuerdo), estimulando, en consecuencia, una rápida respuesta de los linfocitos B a los péptidos \betaA y a los depósitos amiloides.

Aunque los epitopos T_{h} que se pueden usar en el conjugado con el péptido sintético de la invención son promiscuos, no son universales. Esta característica significa que los epitopos T_{h} reaccionan en un amplio segmento de una población abierta que expresa diferentes antígenos MHC (reactivos en el 50 al 90% de la población), pero no en todos los miembros de dicha población. Para ofrecer una reactividad inmunitaria integral, cuasi universal, para el péptido sintético no amiloidogénico de acuerdo con la presente invención, se puede preparar una mezcla de conjugados con diferentes epitopos T_{h} entrecruzados a un péptido sintético. Por ejemplo, podría ser más eficaz una combinación de cuatro conjugados con epitopos T_{h} promiscuos de las toxinas del tétanos y tosferina, la proteína F del virus del sarampión y el AgsHB.

Los epitopos T_{h} en el péptido inmunoestimulador entrecruzado con el péptido sintético no amiloidogénico de acuerdo con la presente invención, incluyen los epitopos del linfocito T cooperador del antígeno de superficie de la hepatitis B, los epitopos del linfocito T cooperador de la toxina tosferínica, los epitopos del linfocito T cooperador de la toxina tetánica, el epitopo del linfocito T cooperador de la proteína F del virus del sarampión, los epitopos de la membrana exterior de Chlamydia trachomitis, los epitopos del linfocito T cooperador de la toxina diftérica, los epitopos del linfocito T cooperador del Plasmodium falciparum circumsporozoite, los epitopos del linfocito T cooperador de la triosa fosfato isomerasa del Schistosoma mansoni, los epitopos del linfocito T cooperador del Escherichia coli TraT que están revelados en la Patente de EE.UU. 5.843.446.

Los expertos en la materia apreciarán que el término "sintético", tal y como se usa para el péptido de la presente invención, significa que o bien se sintetiza químicamente o se produce en un organismo siempre y cuando el organismo huésped esté transformado genéticamente a partir de su estado original para producir el péptido. Los péptidos sintéticos de la presente invención pueden producirse por métodos químicos sintéticos bien conocidos por los fabricantes ordinarios. En consecuencia, se pueden sintetizar los péptidos sintéticos usando las técnicas automáticas Merrifield de síntesis de fase sólida o bien con química t-Boc o F-moc sobre sintetizadores de péptidos como en el Sintetizador de Péptidos de Applied Byosistems.

Como alternativa, se pueden sintetizar péptidos más largos por medio de técnicas bien conocidas de ADN recombinante. Cualquier manual estándar sobre tecnología de ADN proporciona protocolos detallados para producir los péptidos sintéticos de la invención. Para construir una secuencia nucleótida codificando un péptido sintético de la presente invención, la secuencia aminoácida pasa mediante una transcripción inversa a una secuencia de ácido nucleico, y, de preferencia, utilizando el uso de codón optimizado para el organismo en el que se expresará el péptido. A continuación, se produce un gen sintético, típicamente por medio de la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que codifican el péptido y cualquier otro elemento regulador, de ser necesario. El gen sintético se inserta en un vector de clonación apropiado y se obtienen y caracterizan los clones recombinantes. El péptido sintético de la presente invención es, a continuación, expresado bajo las condiciones apropiadas para el sistema de selección seleccionado y anfitrión, y el péptido deseado se purifica y caracteriza por métodos estándares.

Se puede asimismo obtener un péptido inmunoestimulador que se puede entrecruzar al péptido sintético no amiloidogénico de la invención, a partir de la proteína invasina de la especie Yersinia. Las invasinas de la bacteria patogénica Yersinia spp. son proteínas de membrana exterior mediadoras de la entrada de la bacteria en las células de los mamíferos (Isberg et alt., 1990). Se demostró que la invasión de las células de los mamíferos por la bacteria requería la interacción entre la molécula invasina de Yersinia y varias especies de la familia de integrinas \beta1 presentes en las células en cultivo (Tran Van Nhieu et alt., 1991). Puesto que los linfocitos T son ricos en integrinas \beta1 (linfocitos T de memoria o inmunitarios especialmente activados), se han venido investigando los efectos de la invasina en los linfocitos T humanos (Brett et alt.,1993). Se piensa que las integrinas facilitan la migración de los linfocitos T inmunitarios fuera de los vasos sanguíneos y a través del tejido conjuntivo a los sitios de estímulos antigénicos a través de su interacción con proteínas de la matriz extracelular, entre las que se encuentran la fibronectina, laminina y colágeno. Se halló que el terminal carboxi de la molécula invasina coestimulaba el linfocito T CD4+ humano en presencia del mitógeno no específico, anticuerpo CD3, causando una marcada proliferación y expresión de las citocinas. Se identificó, asimismo, el dominio específico de la invasina que interactúa con las integrinas \beta1 para causar esta estimulación (Brett et alt., 1993). Debido a las propiedades coestimuladoras demostradas de los linfocitos T asociadas con este dominio, se puede entrecruzar con el péptido sintético de la presente invención para potenciar su inmunogenicidad.

Muchas de las proteínas de la membrana exterior de las bacterias Gram negativas son de lípidos modificados y muy inmunogénicas. Debido a la aparente correlación entre el vínculo del lípido covalente y la inmunogenicidad, se puede emparejar en un conjugado el lípido tripalmitoil-S-glicerina cisteína (Pam_{3}Cys), muy frecuente en las proteínas de membrana bacterianas, con los péptidos sintéticos, a fin de potenciar la inmunogenicidad.

Se puede mejorar de modo más significativo la inmunogenicidad si se coadministran péptidos sintéticos con adyuvantes. Los adyuvantes potencian la inmunogenicidad de un antígeno, pero no son en sí mismos inmunogénicos. Los adyuvantes pueden reaccionar reteniendo el antígeno localmente cerca del sitio de administración a fin de producir un efecto de depósito que facilite una liberación lenta y sostenida del antígeno a las células del sistema inmunitario. Los adyuvantes pueden también atraer células del sistema inmunitario a un depósito de antígeno y estimular dichas células para provocar una respuesta inmunitaria.

Se han venido usando sustancias inmunoestimuladoras o adyuvantes desde hace muchos años para mejorar la respuesta inmunitaria del anfitrión, p. ej., a las vacunas. Los adyuvantes intrínsecos, como los lipopolisacáridos, son componentes normales de las bacterias inactivadas o atenuadas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que no están unidos por enlaces covalentes a los antígenos y están formulados de forma tal que potencien las respuestas inmunitarias del anfitrión. Por lo tanto, se han identificado adyuvantes que potencian la respuesta inmunitaria a antígenos administrados por vía parenteral. Sin embargo, algunos de estos adyuvantes son tóxicos y pueden causar efectos secundarios indeseables, lo que los haría inapropiados para su uso en seres humanos y en muchos animales. De hecho, sólo el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (por lo general conocidos colectivamente como alumbre) se usan de forma habitual como adyuvantes en las vacunas para uso en seres humanos y en animales. Está bien establecida la eficacia del alumbre para aumentar la respuesta de los anticuerpos a los toxoides de la difteria y el tétanos, y existe asimismo una vacuna AgsHB con adyuvante con alumbre.

Un amplio margen de adyuvantes extrínsecos pueden provocar una respuesta inmunitaria potente a los antígenos. Estos incluyen las saponinas en complejo con los antígenos de proteína de membrana (complejos estimulantes del sistema inmunitario), polímeros Pluronic con aceite mineral, micobacteria inactivada en aceite mineral, adyuvante completo de Freund, productos bacteriales, como el muramil dipéptido (MDP) y lipopolisacáridos (LPS), así como el lípido A y los liposomas. Para inducir de manera eficaz una respuesta inmunitaria humoral (RIH) y una inmunidad mediada por células (IMC), se emulsifican inmunógenos en los adyuvantes. Muchos adyuvantes son tóxicos, provocando granulomas, inflamaciones agudas y crónicas (adyuvante completo de Freund, FCA), citolisis (saponinas y polímeros Pluronic) y pirogenicidad, artritis y uveítis anterior (LPS y MDP) . A pesar de que FCA es un adyuvante excelente ampliamente usado en investigación, no está aprobado en las vacunas para los seres humanos o animales debido a su toxicidad.

La patente de EE.UU. NRO. 4.855.283 ampara glucolípidos análogos, incluidos las N-glucosamidas, N-glucosilureas y N-glucosilcarbamatos, cada uno de los cuales es sustituido en el residuo del azúcar por un aminoácido, como inmunomoduladores o adyuvantes. La patente de EE.UU. NRO. 4.258.029 revela que el hidrocloruro de octadecil tirosina (OTH) funciona como un adyuvante cuando forma un complejo con el toxoide del tétanos y con la formalina inactivada de tipo I, II y III de la vacuna del virus de la poliomielitis. Además, Nixon-George et alt., 1990, reportaron que los ésteres de octadecil de los aminoácidos aromáticos que forman complejos con un antígeno de superficie recombinante de la hepatitis B potencian la respuesta inmunitaria del anfitrión contra el virus de la hepa-
titis B.

Se prefiere la adición de formulaciones de emulsiones/adyuvantes exógenos que maximizan la respuesta inmunitaria a los péptidos \betaA y a los depósitos de amiloide. Los adyuvantes y portadores apropiados son aquellos que: (1) se han usado con éxito en los estudios humanos de Fase I; (2) dada su carencia de reactogenicidad en estudios preclínicos de inocuidad, es posible que se aprueben para su uso en seres humanos; o (3) se han aprobado para su uso en los alimentos y en los animales domésticos. Aguado et alt. (1999) han mencionado algunos de los adyuvantes que se encuentran sometidos en la actualidad a estudios clínicos.

Resultan altamente deseables los regímenes de inmunoterapia que producen una respuesta máxima tras la administración del número menor de dosis, idealmente una sola dosis. Se puede llegar a este resultado mediante el atrapamiento de inmunógenos en micropartículas. Por ejemplo, el material de sutura absorbible poli(lactide-co-glicolide) copolímero puede adoptar la forma de micropartículas que contienen inmunógeno. Después de la administración oral o parenteral, la hidrólisis in vivo de las micropartículas produce productos derivados no tóxicos, ácido láctico y ácido glicólico, y libera inmunógeno prácticamente inalterado por el proceso de atrapamiento. El índice de degradación de la micropartícula y la liberación del inmunógeno atrapado se puede controlar mediante varios parámetros entre los que cabe citar (1) el índice de polímeros usados en la formación de partículas (partículas con altas concentraciones de coglicolide se degradan más rápidamente); (2) el tamaño de la partícula (las partículas más pequeñas se degradan más rápidamente que las grandes); y (3) la eficacia del atrapamiento (las partículas con altas concentraciones de antígeno atrapado se degradan más rápidamente que las que tienen cargas menores). Las formulaciones de micropartículas también pueden proporcionar una inmunización primaria y de refuerzo en una sola administración mediante la combinación de micropartículas con inmunógeno atrapado con diferentes tiempos de liberación. Se puede lograr fácilmente formulaciones de una sola dosis capaces de liberar antígeno en un rango que varía desde menos de una semana a más de seis meses. Más aún, la administración del péptido sintético de acuerdo con la presente invención, atrapado en micropartículas, puede mejorar la eficacia cuando se mezcla el inmunógeno de las micropartículas con formulaciones de emulsiones/adyuvantes exógenos.

Se puede establecer y analizar la eficacia de los péptidos sintéticos si se inyecta un animal, p. ej., un ratón o rata, con el péptido sintético formulado con alumbre y, a continuación, se sigue la respuesta inmunitaria a los péptidos beta-amiloides.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición inmunizante que incluye una cantidad eficaz inmunizante de uno o más de los péptidos sintéticos de la invención, o conjugados derivados, y un portador aceptable farmacéuticamente, excipiente, diluyente, o sustancia auxiliar, incluidos los adyuvantes. Por consiguiente, se pueden formular los péptidos sintéticos, o conjugados derivados, como un compuesto inmunizante usando adyuvantes, portadores aceptables farmacéuticamente, excipientes, diluyentes, sustancias auxiliares u otros ingredientes que forman parte de forma habitual de los compuestos inmunizantes. Se pueden determinar fácilmente dichas formulaciones por uno de los métodos habituales en la profesión, e incluir formulaciones de liberación inmediata y prolongada, p. ej., la microencapsulación. Asimismo, se pueden administrar los actuales compuestos inmunizantes por la vía más conveniente, incluida la vía subcutánea, oral, intramuscular u otra vía parenteral o interna. De forma análoga, se pueden administrar las vacunas en una sola dosis o divididas en dosis múltiples. Cualquier profesional capacitado puede programar fácilmente las inmunizaciones. Por ejemplo, los adyuvantes o emulsionantes que se pueden usar en esta invención incluyen: alumbre, adyuvante incompleto de Freund, liposina, saponina, esqualeno, L121, emulsígeno e ISA720. En las materializaciones preferidas, los adyuvantes/emulsionantes son: alumbre, adyuvante incompleto de Freund, una combinación de liposina y saponina, una combinación de esqualeno y L121 o una combinación de emulsígeno y saponina.

Los compuestos inmunizantes de la presente invención contienen una cantidad inmunoeficaz de uno o más de los péptidos sintéticos o conjugados derivados, y un portador aceptable farmacéuticamente. Dichos compuestos en forma de unidad de dosis, pueden contener aproximadamente de 0,5 \mug a alrededor de 1 mg de cada péptido o conjugado por kilo de peso corporal. Cuando se administran en múltiples dosis, la forma de unidad de dosis se divide convenientemente en las cantidades apropiadas para cada dosis.

Los compuestos inmunizantes que contienen cócteles de dos o más de los péptidos sintéticos, o conjugados derivados, de la presente invención potencian la inmunoeficacia en una población más amplia y, por lo tanto, proporcionan una respuesta mejor a los péptidos beta-amiloides y a los depósitos amiloides. Se han conseguido otros péptidos sintéticos inmunógenos inmunoestimuladores a través de su modificación en lipopéptidos a fin de proporcionar unos adyuvantes internos para las vacunas potentes.

Se puede mejorar la respuesta inmunitaria a los péptidos sintéticos inmunógenos de la presente invención mediante la administración por medio de atrapamiento en o dentro de micropartículas biodegradables del tipo descrito por O'Hagan et alt. (1991). Se pueden encapsular los inmunógenos con o sin adyuvantes, incluido el fragmento lipídico unido por enlaces covalentes como Pam_{3}Cys, y se pueden administrar dichas partículas con un adyuvante inmunoestimulador como el adyuvante incompleto de Freund o el alumbre. La función de las micropartículas es potenciar la respuesta inmunitaria a un inmunógeno y proporcionar la liberación temporal controlada para respuestas prolongadas o periódicas mediante administración oral o por administración tópica (O'Hagan et alt., 1991).

Un aspecto ulterior de la presente invención es un método para la inmunización con el péptido sintético o conjugados derivados de la presente invención. Este método de acuerdo con la presente invención involucra la administración a los mamíferos, de preferencia a los seres humanos, que necesiten un compuesto inmunizante que contenga uno o varios péptidos sintéticos o conjugados derivados. Se comprobará la eficacia, en primer lugar, en los modelos de ratón transgénico o AD, como el modelo de ratón usado en Schenk et alt. (1999) u otros modelos de ratón transgénico AD pública o comercialmente disponibles.

Otro aspecto de la presente invención afecta a los anticuerpos formados contra los péptidos inmunogénicos de la presente invención y las moléculas, que incluye la porción de unión al antígeno de dichos anticuerpos.

Cabe considerar que, cuando se usa el término "anticuerpos" en relación con la materialización de anticuerpos de la presente invención, se pretende con ello incluir los anticuerpos intactos, como los anticuerpos policlonales o monoclonales (Absm), así como los fragmentos proteolíticos derivados, como los fragmentos Fab o F(ab')^{2}. Además, se puede insertar el ADN que codifica la región variable del anticuerpo en otros anticuerpos para producir anticuerpos híbridos (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 4.816.567) o en linfocitos T receptores para producir linfocitos T con la misma amplia especificidad (véase Eshhar et alt. (1990) y Gross et alt. (1989). Se pueden producir y emplear también anticuerpos de cadena única. Los anticuerpos de cadena única pueden ser de cadena única compuesta de polipéptidos con capacidades de unión al antígeno y con un par de secuencias homólogas de aminoácidos, o análogos a las regiones variables de una inmunoglobulina de cadena ligera y pesada (unida V_{H}-V_{L} o de cadena única F_{V}). Tanto V_{H} como V_{L} pueden copiar las secuencias naturales de los anticuerpos monoclonales o una o ambas de las cadenas que puedan estar comprendidas en la construcción de CDR-FR del tipo descrito en la Patente de EE.UU. 5.091.513. Los polipéptidos separados análogos a las regiones variables de las cadenas ligera y pesada se mantienen juntos por un polipéptido de enlace. Se pueden lograr métodos para producir dichos anticuerpos de cadena única, en particular en los casos en que se conoce el ADN que codifica las estructuras polipeptídicas de las cadenas V_{H} y V_{L}, de acuerdo con los métodos descritos, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. 4.946.778, 5.091.513 y 5.096.815.

Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula, si puede reaccionar específicamente con la molécula para, así, unir la molécula al anticuerpo. El término "epitopo" se refiere a la porción de cualquier molécula a la que pueda unirse un anticuerpo y que también pueda ser reconocida por ese anticuerpo. Los epitopos o "determinantes antigénicos" consisten, por lo general, de grupos de moléculas de superficie químicamente activas, como aminoácidos o cadenas de azúcar, y tienen tres características estructurales dimensionales específicas así como características específicas de carga.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas del suero de animales inmunizados con un antígeno.

Los anticuerpos monoclonales (Absm) son poblaciones homogéneas, considerablemente más numerosas, de anticuerpos contra antígenos específicos. Se puede obtener Absm por los métodos habituales a los profesionales de la materia. Véase, por ejemplo, Kohler et alt. (1975); Patente de EE.UU. NRO. 4.376.110; Harlow et alt. (1988); y Colligan et alt. (1993). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier tipo de inmunoglobulina, incluida la IgG, IgM, IgE, IgA y cualquier subclase de ellas. Se puede cultivar el hibridoma que produce los Absm de esta invención in vitro o in vivo. Se pueden obtener valores altos de Absm por medio de la producción in vivo, en la cual se inyectan células de los hibridomas individuales intraperitonealmente a los ratones Balb/c sensibilizados con pristano, a fin de producir fluido ascítico con elevadas concentraciones de los Absm deseados. Se pueden purificar los Absm de isotipo IgM o IgG de dichos fluidos ascíticos o del cultivo sobrenadante por métodos de cromatografía de columna familiares a los profesionales capacitados.

Los anticuerpos híbridos son moléculas, cuyos fragmentos se obtienen de diferentes especies animales, como aquellas que poseen una región variable derivada de un murino Abm y una región constante de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos híbridos se usan, principalmente, para reducir la inmunogenicidad durante la aplicación y para aumentar la producción; por ejemplo, en aquellos casos en los que los hibridomas producen más Absm murinos, pero mayor inmunogenicidad en los seres humanos, tal como los Absm híbridos humanos/murinos o humanizados. Son bien conocidos en la profesión los métodos para la producción de anticuerpos híbridos y humanizados, como en Cabilly et alt., 1984; Morrison et alt., 1984; Boulianne et alt., 1984; Cabilly et alt., 1984; Neuberger et alt., 1985; Taniguchi et alt., 1985; Morrison et alt., 1986; Neuberger et alt., 1986; Kudo et alt., 1986; Morrison et alt., 1986; Sahagan et alt., 1986; Robinson et alt., 1987; Liu et alt., 1987; Sun et alt., 1987; Better et alt., 1988; y Harlow et alt., 1988.

Una "molécula que incluye la porción de unión al antígeno de un anticuerpo" se supone que debe incluir no sólo las moléculas intactas de inmunoglobulinas de cualquier isotipo y generadas por cualquier línea celular animal o microorganismo, sino también el fragmento reactivo de unión al antígeno, incluyendo, entre otros, el fragmento Fab, el fragmento Fab', el fragmento F(ab')_{2}, la porción variable de las cadenas pesadas y/o ligeras, y los anticuerpos híbridos o de cadena única que poseen ese fragmento reactivo, así como cualquier otro tipo de molécula o célula en la que se ha insertado físicamente dicho fragmento reactivo de anticuerpo, como el linfocito T receptor híbrido o un linfocito T que posea dicho receptor, o moléculas desarrolladas para suministrar fragmentos terapéuticos mediante una porción de la molécula que contenga dicho fragmento reactivo. Se pueden lograr esas moléculas por cualquier técnica conocida, entre las que cabe citar, sin por ello limitarse, la descomposición enzimática, la síntesis peptídica o las técnicas recombinantes.

La presente invención proporciona también un compuesto farmacéutico que contiene una molécula que incluye la porción de unión al antígeno de un anticuerpo formado contra un péptido de la presente invención, y un portador aceptable farmacéuticamente, diluyente, excipiente o sustancia auxiliar. Cualquier profesional capacitado en el oficio puede desarrollar sencillamente, mediante un experimento rutinario, la fórmula de los compuestos farmacéuticos, la de uso tradicional en medios altamente especializados y los compuestos adecuados para uso terapéutico en la reducción de la formulación de fibrillas y depósitos de amiloides.

De acuerdo con la presente invención, se puede administrar la molécula que incluye la porción de unión al antígeno de un anticuerpo formado contra los péptidos inmunogénicos de la presente invención, a una persona que lo necesite para reducir la formación de fibrillas y depósitos de amiloide. Los profesionales capacitados deben determinar el sitio de administración, la dosis y el horario de administración de acuerdo con los procedimientos normales de la profesión.

Después de haber descrito de modo general la invención, se entenderá más fácilmente la misma cuando la explicación se base en los ejemplos que siguen, que se ofrecen a título ilustrativo y sin que ello constituya una limitación de la presente invención.

Ejemplo 1

Los experimentos en este ejemplo demuestran que la inmunización en ratones transgénicos PPA (Tg2576) durante 7 meses con un péptido homólogo de \betaA no amiloidogénico y no tóxico redujeron la carga de amiloide en la corteza cerebral y el hipocampo en un 89% (p = 0,0002) y en un 81% (p = 0,0001) respectivamente. Simultáneamente, los niveles cerebrales de \betaA1-42 soluble se redujeron en un 57% (p = 0,0019). En los ratones inmunizados, no se halló microglía ramificada que expresara la interleucina-\beta1 asociada con las placas \betaA, lo que indicó una disminución de la inflamación en estos animales. A continuación, se presentan los materiales y métodos usados en el experimento en este ejemplo, así como los resultados experimentales.

Materiales y métodos Péptidos

Los péptidos usados (\betaA1-40, \betaA1-42, \betaA1-30-NH_{2} (ID SEC NRO.:1), y K6\betaA1-30-NH_{2}(ID SEC NRO.:6) fueron sintetizados en la Keck Foundation (Yale University, New Haven, CT) de la forma anteriormente descrita (Sigurdsson et alt., 2000). Los péptidos no amiloidogénicos de acuerdo con la presente invención se sintetizaron usando el proceso químico tBOC (N-tert-butiloxicarbonil) de fase sólida, purificados por HPLC y caracterizados por HPLC y por espectroscopía láser de desorpción de masas.

El péptido usado para las inmunizaciones, K6\betaA1-30-NH_{2}, mantiene los dos sitios inmunogénicos principales de los péptidos \betaA, que son los residuos 1-11 y 22-28, del \betaA1-42 basados en el índice antigénico de Jameson et alt. (1998) y en los resultados preliminares obtenidos en el laboratorio de los presentes inventores. Los péptidos \betaA1-30-NH_{2} y K6\betaA1-30-NH_{2} fueron amidados en la C-terminal para preservar su antigenicidad ulterior.

Estudios sobre la estructura secundaria

Se evaluó la estructura secundaria (\alpha-hélice, hoja-\beta y espiral aleatoria) de los péptidos por dicroísmo circular (DC) tal y como se describió previamente (Soto et alt., 1998 y Soto et alt., 1996). Los resultados se expresan como elipticidad molar en unidades de grad cm^{2}dmol^{-1}, y los datos se analizaron mediante los algoritmos de Lincomb y CCA (Perczel et alt., 1992) para obtener los porcentajes de los diferentes tipos de estructura secundaria.

Aunque se evaluó la estructura secundaria de los péptidos sintetizados por dicroísmo circular (DC), se puede evaluar, asimismo, por espectroscopía de infrarrojos con transformada de Fourier (ITF), usando protocolos publicados de Aucouturier et alt. (1999). Aunque el DC es sensible a la conformación básica y la ITF es sensible al grado y a la fuerza de unión del hidrógeno de los grupos amidas (dependiente de la estructura), estas dos técnicas ofrecen, en última instancia, información similar: los porcentajes de diferentes diseños de la estructura secundaria, p. ej., \alpha-hélice, hoja-\beta, barril-\beta y espiral aleatoria (Surewicz et alt., 1993). El DC es una técnica bien establecida para el estudio de la estructura secundaria de las proteínas y péptidos en solución, proporcionando cálculos bastante exactos del contenido de los diferentes diseños estructurales. Una gran ventaja de la espectroscopía ITF para la caracterización estructural es que no depende del estado físico de la muestra. Se pueden examinar las muestras como soluciones acuosas u orgánicas, películas hidratadas, dispersiones no homogéneas, materiales agregados o incluso proteínas en estado sólido. Por consiguiente, las técnicas de DC e ITF son complementarias para el estudio de la estructura secundaria de los péptidos.

El procedimiento experimental para el dicroísmo circular se llevó a cabo de acuerdo con Golabek et alt. (1996) y Soto et alt. (1996 y 1998) de la siguiente forma: se registró un espectro DC de soluciones con péptidos sintéticos (1-5 \muM en 300 \mul de 10 mM de fosfato sódico, pH 7,2) en un espectropolarímetro Jasco J-720 a 25ºC usando un paso de luz de célula de 0,1 cm con agua doblemente destilada y deionizada y TFE (grado espectroscópico) como disolventes. Se realizó la calibración del instrumento con una solución acuosa de d-(+)-10-ácido alcanforsulfónico. Se registró el espectro a intervalos de 1 nm sobre el intervalo de longitud de onda de 180 a 260 nm, y se sustrajo el espectro tampón obtenido bajo idénticas condiciones.

El procedimiento experimental para la espectroscopía de infrarrojos con transformada de Fourier según Aucourier et alt. (1999) es el siguiente: Se preparan soluciones o suspensiones que contengan péptidos sintéticos solubles o agregados (5-10 mg/ml) en H_{2}O y D_{2}O tampón a un pH neutro, y 10 \mum se carga en la célula infrarroja con placas de CaF_{2} y un retículo de 6 \mum. Se registra el espectro con un espectrofotómetro ITF Perkin Elmer modelo 2000 a 25ºC, tal como se describió (Aucouturier et alt., 1999; Soto et alt., 1995). Para cada espectro, se recogen 1000 barridos en el modo de haz único con 2 cm^{-1} de resolución y a 1 cm^{-1} de intervalo de 4000 a 1000 cm^{-1}. Se aplica un alisado y una autodeconvolución de Fourier para aumentar la resolución del espectro en la región de amida I (1700-1600 cm^{-1}) y se efectúa un ajuste iterativo a las formas lineales de Lorentzian para calcular la proporción de cada elemento de la estructura secundaria.

Estudios in vitro sobre la formación de las fibrillas amiloides

Se pueden llevar a cabo estudios in vitro sobre la formación de las fibrillas amiloides usando protocolos publicados del laboratorio de los presentes inventores (Castaño et alt., 1995; Wisniewski et alt., 1991, Wisniewski et alt., 1993 y Wisniewski et alt., 1994). Se pueden incubar partes iguales de los péptidos sintéticos a una concentración en un intervalo de 25-250 \muM, preparado en 0,1M Tris, pH 7,4, durante tiempos diferentes, y comparar su formación fibrilar con la de \betaA1-28, \betaA1-40 y \betaA1-42. En este ejemplo, se incubaron partes iguales de los péptidos preparados en 0,1M Tris, pH 7,4 durante tiempos diferentes, y se comparó su formación fibrilar a la de \betaA1-30-NH_{2} y \betaA1-42. Se evaluó la fibrilogénesis in vitro mediante un ensayo fluorométrico basado en la emisión de fluorescencia por la tioflavina T, tal como se describió previamente por el laboratorio de los presentes inventores (Soto et alt., 1998 y Jameson et alt., 1998). La tioflavina T se une específicamente al amiloide y esta unión provoca un cambio en la emisión de su espectro y un aumento de la fluorescencia proporcional a la cantidad de amiloide formado (LeVine et alt., 1993).

Aunque no se llevaron a cabo en este ejemplo, se puede también evaluar in vitro la fibrilogénesis por otros tres métodos diferentes:

(A) Un ensayo espectrofotométrico basado en la interacción específica del rojo Congo con las fibrillas amiloides. Tras el período de incubación, se añadirán 2 \mul de rojo Congo (1,5 mg/ml) a cada muestra, y se incubarán en la oscuridad durante 1 hora. A continuación, se centrifugarán las muestras a 15.000 rpm durante 10 min y se determinará la absorbancia del supernadante a 490 nm. La cantidad de amiloide formada es directamente proporcional a la disminución de la absorbancia del sobrenadante (Castaño et alt., 1986).

(B) Se usará un ensayo de sedimentación como ya se ha descrito (Soto et alt., 1995). En resumen, se centrifugarán las muestras a 15.000 rpm durante 10 min para separar el péptido soluble y el agregado. Se analizará la cantidad de material en solución por microbore HPLC usando una columna Vidac C4 de fase inversa y un gradiente lineal de 3-70% de acetonitrilo. Se calculará el porcentaje de péptido agregado por comparación del área del pico que corresponde al péptido soluble en cada muestra incubada con una muestra idéntica de control no incubada.

(C) Se llevará a cabo una caracterización adicional de la fibrilogénesis por medio de la tinción de rojo Congo y el examen por microscopía electrónica después de una tinción negativa (Castaño et alt., 1995; Wisniewsi et alt., 1991; Wisniewski et alt., 1993 y Wisniewski et alt., 1994). Para la microscopía electrónica, las muestras de péptidos incubadas se colocarán en tamices de níquel de 300 de malla recubierto de carbón y se teñirán durante 60 segundos con 2% de acetato de uranil bajo un vapor de 2% de glutaraldehido. Se visualizará la rejilla a 80 kV en un microscopio electrónico Zeiss EM 10. Para la tinción con rojo Congo, los péptidos incubados se colocarán en un portaobjetos de cristal recubierto de gelatina y se secarán al aire a 37ºC. A continuación, se sumergirán los cortes en 0,2% de rojo Congo disuelto en 80% de etanol acuoso saturado con NaCl durante 60 min a temperatura ambiente, se lavará tres veces y se observará con un microscopio de luz polarizada.

Neurotoxicidad

Se evaluó la posible neurotoxicidad de K6\betaA1-30NH_{2} (1-100 \muM) a los 2 y 6 días en una línea celular de neuroblastoma humano (SK-N-SH) usando el ensayo MTT estándar tal y como lo describe el fabricante (Roche Molecular Biomedicals, Indianapolis, IN). Se usaron \betaA1-30-NH_{2}, \betaA1-40 y \betaA-42 como péptidos de control. En resumen, se colocaron las células en placas, 10.000 células/100 \mul de medio de cultivo por pocillo en un fondo plano, en placas de titulación con 96 pocillos. Se permitió que las células se adhirieran a las placas durante la noche en una incubadora (37ºC, 5,0% CO_{2}), y, a continuación, se añadieron 10 \mul de solución de péptido recién preparada (en H_{2}O nanopura). \betaA1-42 fue sólo parcialmente soluble a 100 \muM y, por lo tanto, se añadió como suspensión a esa concentración. Los pasos subsiguientes sucedieron tal y como se describió en el protocolo del ensayo.

Animales

Se llevó a cabo la vacunación en el modelo de ratón Tg2576 PPA desarrollado por Karen Hsiao y cols. (1996). Estos ratones desarrollaron placas \betaA a la temprana edad de 11-13 meses. Se escogió este modelo en vez del modelo doble TgPPA/PS1 (Holcomb et alt., 1998) porque la edad de comienzo y la progresión de los depósitos de \betaA en el único ratón TgPPA se asemeja más a la EA. Se usaron como control ratones Tg emparejados por edad y tratados sólo con el vehículo y crías no-Tg que recibieron K6\betaA1-30-NH_{2}, y los animales recibieron la primera inyección a los 11-13 meses, un momento en el que sólo debería de haber unas pocas placas. Había cuatro ratones en cada grupo. Se mantuvo a los ratones en un ciclo de 12 horas de luz-oscuridad y tuvieron acceso libre al agua y a los alimentos. El cuidado de los animales siguió las pautas institucionales.

Administración de la vacuna: Se proporcionó K6\betaA1-30-NH_{2} como sal de ácido trifluoroacético (ATF). El procedimiento de inmunización se llevó a cabo según lo previamente descrito por Schenk y cols. (1999), con la excepción de que no se incubó el péptido durante la noche a 37ºC antes de la inyección. En resumen, el péptido se disolvió en BPS a una concentración de 2 mg/ml y, a continuación, se mezcló en una proporción de 1:1 (v/v) con el adyuvante o PBS. Se utilizó un adyuvante completo de Freund para la primera inyección, un adyuvante incompleto de Freund para las tres inyecciones siguientes, y PBS a partir de la quinta inyección en adelante. Los ratones recibieron una inyección subcutánea de 100 \mul de la mezcla (a saber, 100 \mug/100 \mul), seguida de una segunda inyección a las dos semanas y, a continuación, cada mes.

Titulación de anticuerpos: Se determinaron los títulos de anticuerpos mediante diluciones seriadas de suero usando el ensayo ELISA según ha sido descrito previamente (Jiménez-Huete et alt., 1998), en donde se recubre el \betaA o su derivado en los pocillos de microtitulación. La titulación, definida como la dilución que proporciona el 50% de señal máxima, fue detectada por medio de una IgG de cabra anti-ratón unida a una peroxidasa del rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), y tetrametil benzidina (Pierce, Rockford, IL) sirvió como sustrato.

Histología: Se anestesió a los ratones con sodiopentobarbital (150 mg/kg, i.p.), perfundido transaórticamente con tampón fosfato, y se procesaron los cerebros de acuerdo a lo descrito previamente (Sigurdsson et alt., 1996). Se fijó el hemisferio derecho por inmersión en periodato-lisina-paraformaldehido, mientras que el hemisferio izquierdo se congeló de golpe para determinar los niveles de \betaA usando métodos establecidos ELISA (Mehta et alt., 1998 y Mehta et alt., 2000). Se realizaron cortes en secciones coronales seriadas (40 \mum) y se guardaron cinco series de secciones a intervalos de 0,2 mm para el análisis histológico de 1) 6E10, 2) rojo Congo, 3) interleucina-\beta1/OX42/lectina del tomate, 4) GFAP, y 5) secciones teñidas con violeta de cresilo. El 6E10 reconoce \betaA y tiñe tanto las placas pre-amiloides como al \betaA (Kim et alt., 1990). Se realizó una tinción con rojo Congo para identificar las lesiones amiloides en esos animales. GFAP es un componente de los filamentos intermedios gliales que forman parte del citoesqueleto y se encuentra predominantemente en los astrocitos. La microglía parece ser el origen principal de la interleucina-1 (IL-1) en el SNC (Schobitz et alt., 1994), y el OX-42 reconoce al CD11b en la microglía, un equivalente en la rata del receptor humano C3bi (Robinson et lat., 1986). La lectina del tomate se une a los residuos poli-N-acetil-lactosamina y presenta en el tejido neural una afinidad específica por las células de la microglía (Acarin et alt., 1994). Tanto los astrocitos como la microglía se asocian con los depósitos \betaA. Se llevó a cabo la tinción con violeta de cresilo para determinar si la inmunización estaba causando una reducción neuronal y/o pérdida celular en estos animales. Después del corte, se colocó la serie en etilenglicol crioprotector y se almacenó a -20ºC hasta
su uso.

Violeta de cresilo y rojo Congo: Se eliminó con xileno la grasa de las secciones montadas y se hidrataron en un gradiente de series de alcohol etílico y agua. Se llevó a cabo la tinción según lo ya descrito (Sigurdsson et alt., 1996 y 1997 y Soto et alt., 1998).

6E10, GFAP, IL-\beta1 y OX-42: Se llevó a cabo la tinción según lo descrito antes (Sigurdsson et alt., 1996 y Soto et alt., 1998). En resumen, se incubaron las secciones en 6E10 (amablemente proporcionado por Richard Kascsak, Institute for Basic Research), anticuerpo primario que se une selectivamente al \betaA humano a una dilución de 1:1000. Se usó un ratón de un conjunto de inmunodetección del ratón (Vector Laboratories, Burlingame, CA) donde un anticuerpo secundario IgG anti-ratón se diluyó al 1:2000. La tinción GFAP (1:500; Dako, Dinamarca), IL-\beta1 (1:250; Endogen, Rockford, IL) y OX-42 (1:250; Biosource Int., Camarillo, CA) se realizó del mismo modo que para el 6E10, salvo en que se diluyó a 1:1300 el anticuerpo secundario. Se hizo reaccionar a las secciones en 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) con o sin intensificación de sulfato de amonio y níquel (Ni). Para el doble etiquetado de las placas de IL-\beta1 y \betaA, se tiñeron las secciones en primer lugar con IL-\beta1 (DAB/Ni; negro) siendo la enzima la peroxidasa. A continuación, se tiñeron las placas (6E10) con el conjunto de sustrato I de fosfatasa alcalina Vector Red (Vector).

Lectina del tomate: Se lavaron las secciones retiradas del crioprotector en PBS, 0,3% Tritón-X-100 en PBS (PBS-Tx) y, a continuación, se incubaron durante 30 minutos en 0,3% de peróxido de hidrógeno en PBS para eliminar la actividad de la peroxidasa endógena. Tras 2 horas de incubación con lectina del tomate (10 \mug/ml PBS; Vector), se lavaron las secciones en PBS-Tx y se las hizo reaccionar con avidina-peroxidasa de rábano picante (Vector) durante una hora. Los pasos subsiguientes fueron los mismos que los que se usaron para la tinción del anti-
cuerpo.

Análisis de imagen: Se cuantificó la inmunohistoquímica de las secciones de tejido con un sistema de análisis de imagen Bioquant, y se usaron muestras objetivas (West et alt., 1999). Una persona desconocedora de la condición experimental del estudio realizó todos los procedimientos. El área cortical analizada fue la dorsomedial de la corteza cingulada y se extendió a la cisura rinal dentro del hemisferio derecho. El área de la cuadrícula fue de 800 x 800 \mum^{2} y se midió la carga amiloide en 10 fotografías por ratón (640 x 480 \mum^{2} cada una) elegidas al azar. Se tomaron medidas de todo el hipocampo de forma similar al análisis cortical. La carga \betaA se define como el porcentaje de área en el campo de medida ocupado por el producto de reacción.

Ensayo "sándwich" ELISA para las concentraciones de \betaA soluble: Antes de la extracción de \betaA del tejido cerebral, se preparó un 10% (p/v) de homogenados en tejido homogeneizado tampón (20 mM Tris pH 7,4, 250 mM sucrosa, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA). Justo antes de su uso, se añadió 1/100 volumen de 100 mM de stock de solución de fenilmetilsulfonilfluoruro (en etanol) y 1/1000 volumen de LAP (5 mg, respectivamente, de leupeptina, antipain y pepstatina \betaA por ml de N-N-dimetilformamida) al tampón de homogenización. Se mezcló completamente el homogenado con un volumen de 0,4% dietilamina/100 mM NaCl, a continuación centrifugado a 135.000 x g durante una hora a 4ºC y posteriormente neutralizado con 1/10 volumen de 0,5 M Tris, H 6,8. Se dividieron las muestras en partes iguales, se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80ºC hasta que se las cargó en las placas. Se midieron las concentraciones de \betaA soluble en el hemisferio izquierdo usando anticuerpo monoclonal 6E10 (específico dea un epitopo presente en los residuos de aminoácidos 1-16 de \betaA), antisuero de conejo R162 (específico para \betaA40) y antisuero de conejo 165 (específico para \betaA42) en un ensayo de doble anticuerpo de tipo "sándwich" ELISA, como se describió previamente (Mehta et alt., 1998 y 2000). Se midió la densidad óptica (DO) a 450 nm en un lector microELISA. Se determinó la relación entre la DO y las concentraciones de \betaA40 o \betaA42 mediante una función logarítmica logística de cuatro parámetros. Se llevó a cabo un ajuste no lineal con el programa KlinetiCalc (Biotek Instruments, Inc. Winooski, VT) para convertir la DO del plasma a concentraciones calculadas. Se codificaron todas las muestras y los investigadores desconocieron la asignación a cada grupo hasta que se midieron y registraron las concentraciones. El límite de detección del ensayo es 10 pg/ml para \betaA40 y \betaA42. El porcentaje de coeficiente de variación generalmente se mueve entre el 8 al 14% (interensayo) y de 10 a 18% (intra-
ensayo).

Análisis de los datos: Se analizaron los datos del cultivo celular por un análisis de varianza ANOVA de un factor, seguido de un ensayo de Dunnett para análisis posteriores (GraphPad Prism 3.0). Se usó un sistema objetivo de análisis estereológico de imagen (Bioquant, R&M Biometics Inc., Nashville, TN) para determinar la carga amiloide en las secciones 6E10 del cerebro teñidas. Se analizaron los datos de la carga amiloide y las concentraciones de \betaA soluble dentro del cerebro mediante una prueba-t de Student, de dos colas.

Resultados

Antes de realizar el estudio de vacunación, fue necesario confirmar que el péptido prototipo KKKKKK-\betaA1-30-NH_{2} tenía, de hecho, menos estructura de hoja-\beta y una fibrilogenicidad menor comparado con \betaA1-42, y que no era tóxico en el cultivo neuronal. Se determinó la estructura secundaria de estos péptidos por dicroísmo circular (DC), y su capacidad de formar fibrillas amiloides mediante un ensayo fluorométrico con tioflavina T. El péptido adicional de control fue \betaA1-30-NH_{2}.

Ensayo de DC: Los compuestos con contenido elevado de hoja-\beta son más tóxicos y es más probable que formen fibrillas que los compuestos con un contenido bajo de hoja-\beta (Pike et alt., 1991). El péptido con polilisina en la N-terminal poseía un contenido mucho menor de hoja-\beta que el amidado \betaA1-30 o \betaA1-42 (Tabla 1).

El péptido (K)_{6}-\betaA1-30-NH_{2} tampoco forma fibrillas tras la incubación a 37ºC al menos durante 15 días. Estos datos muestran claramente que la adición de polilisina al N-terminal altera el péptido de tal forma que el contenido de hoja-\beta es mucho menor que el de \betaA1-42 o \betaA1-30. Además, el contenido de hoja-\beta del péptido (K)_{6}-\betaA1-30-NH_{2} tampoco se incrementa con el paso del tiempo. El contenido de hoja-\beta de \betaA1-42 aumentó a 55% después de 96 horas, mientras que el de (K)_{6}-\betaA1-30-NH_{2} permaneció en el intervalo 16-18%.

TABLA 1

20

Ensayo de tioflavina T: \betaA1-42 ya era fibrilar a t = 0, mientras que \betaA1-30-NH_{2} formó fibrillas de forma gradual con el paso del tiempo (Figura 1). El grado relativamente alto de tinción de tioflavina T de \betaA1-30-NH_{2} en relación con \betaA1-42 después de 6 días, refleja la conocida variabilidad lote a lote de la formación de fibrillas del péptido \betaA (Soto et alt., 1995), así como un cierto grado de formación de miniesferas por la incubación prolongada de \betaA1-42. K6-\betaA1-30-NH_{2} no formó fibrillas tras la incubación a 37ºC al menos durante 15 días.

Neurotoxicidad: Para evaluar más la inocuidad de este enfoque de vacunación, se determinó la neurotoxicidad de K6-\betaA1-30-NH_{2}. K6-\betaA1-30-NH_{2} no ejerció ningún efecto en la viabilidad celular a los 2 días y fue ligeramente trófico a los 6 días (p < 0,05), mientras que \betaA1-40 y \betaA1-42 fueron tóxicos (p < 0,05-0,001) a las células del neuroblastoma humano (SK-N-SH), comparado con el grupo del tratamiento con vehículo, tal y como se determinó por el ensayo MTT (Figura 2A y B). Durante el período de incubación, los agregados fueron visibles bajo el microscopio sólo en los pocillos de cultivo que contenían \betaA1-42 (10-100 \muM).

Titulación de anticuerpos: Se vacunó a Tg2576 y a sus compañeros de cría no-Tg con K6\betaA1-30-NH_{2} o vehículo. Casi todos los ratones desarrollaron anticuerpos contra el inmunógeno (K6-\betaA1-30-NH_{2}), que tuvo reacción cruzada con \betaA1-40 y \betaA1-42. La titulación, definida como una dilución que proporcionaba un 50% de señal máxima, osciló en un intervalo desde unos pocos cientos a varios miles (no se muestran los datos). Los animales tratados con vehículo inyectados con el adyuvante y PBS no desarrollaron anticuerpo contra estos tres péptidos (no se muestran los datos). Los ratones no transgénicos tuvieron, por lo general, titulaciones más altas contra los 3 péptidos, y los anticuerpos policlonales presentaron una avidez mayor por el inmunógeno comparada con \betaA1-40 y \betaA1-42. Se esperaban estos hallazgos, puesto que el inmunógeno está basado en la secuencia humana de \betaA que difiere en 3 aminoácidos de la del ratón \betaA (Johnstone et alt., 1991) y K6-\betaA1-30-NH_{2} síntoma de que la respuesta inmunitaria debería tener más diseños de unión para los anticuerpos que los péptidos \betaA intactos.

Carga amiloide e histopatología asociada: Se sacrificaron los ratones a los 18-20 meses, tras 7 meses de tratamiento, y se procesó su hemisferio derecho histológicamente como ya se ha descrito (Sigurdsson et alt., 1996). Se tiñeron las secciones cerebrales con violeta de cresilo, rojo Congo, lectina del tomate y anticuerpos contra: 1) \betaA humano (6E10); microglía (OX-42; IL-1\beta) y GFAP (anti-GFAP). Tras la vacunación con K6-\betaA1-30-NH_{2} se redujo la carga amiloide en la corteza y el hipocampo de los ratones Tg en un 89% y en un 81% respectivamente (Figuras 3A, 3B; 4A, 4B), determinada por técnicas estereológicas. El número total de depósitos amiloides positivos al rojo Congo se redujo en los animales inmunizados; sin embargo, el porcentaje de lesiones inmunorreactivas-\betaA positivas al rojo Congo pareció ser el mismo que el de los ratones Tg no inmunizados. La eliminación de los depósitos de amiloide pareció ser similar en otras regiones cerebrales. Se tiñeron secciones cerebrales seleccionadas de un ratón control con una gran carga amiloide y un ratón inmunizado con una carga amiloide reducida con suero procedente de varios ratones inmunizados y de control, cuyos títulos de anticuerpos estaban en un rango de cero a tres mil. Tal y como se esperaba, a medida que aumentaba la titulación, se teñían más placas, y el patrón fue similar en ambos ratones (no se muestran los datos). No hubo una diferencia obvia entre los grupos de tratamiento de Tg en tinción de violeta de cresilo. Se observaron astrocitos reactivos asociados con todas las placas de amiloide. Puesto que los ratones tratados con vehículo presentaron una carga mayor de placas amiloides, también presentaron más agrupaciones de astrocitos que los ratones Tg inmunizados. Se observó, por tinción con OX-42, y de modo predominante, en asociación con las placas, microglía ramificada, en vez de fagocítica (ameboide). Para verificar que esta falta de fagocitos microgliales no se debía a la regulación decreciente del receptor CD11b, se tiñó el diseño de unión de OX-42 (Robinson et alt., 1986) de las secciones de todos los grupos de tratamiento con lectina del tomate. Esta lectina específica se une a residuos de poli-N-acetil-lactosamina hallados predominantemente en las células microgliales ramificadas y fagocíticas, además de las células endoteliales y ependimales (Acarin et alt., 1994). Se tiñeron estos dos últimos tipos de célula en todos los ratones. La microglía teñida con lectina se asemejaba a la teñida con OX-42. En otras palabras, tanto en los grupos de ratones Tg inmunizados como en los grupos control, la microglía no presentó morfología fagocítica, y el número de procesos de microglía ramificada por placa pareció ser similar entre los ratones inmunizados y no inmunizados (no se muestran los datos). Por otra parte, la tinción con IL-\beta1 de las células de microglía ramificadas estuvo en gran parte rodeando las placas \betaA en los ratones Tg de control (Figura 3C), mientras que prácticamente no se observó ninguna tinción con IL-\beta1 en los ratones inmunizados (Figura 3D). Cabe notar de manera especial que no hubo indicación de glomerulonefritis en las secciones renales teñidas con hematoxilina/eosina de los ratones K6\betaA1-30-NH_{2} tratados, lo que sugiere que los ratones no habían desarrollado un trastorno autoinmunitario.

\beta1 soluble por ELISA: Las determinaciones de las concentraciones de \betaA soluble se llevaron a cabo en el hemisferio izquierdo de los ratones cuyo hemisferio derecho fue usado para estudios histológicos. El \betaA1-42 soluble se redujo en un 57% tras la vacunación con K6\betaA1-30-NH_{2} durante 7 meses (p = 0,0019), en comparación con el grupo de control (Figura 4C). Aunque existió una tendencia a concentraciones reducidas del \betaA soluble total y del \betaA1-40 en el grupo tratado con K6\betaA1-30, los valores no resultaron significativamente diferentes de los del grupo tratado con vehículo.

En general, la inmunización en los ratones Tg PPA con péptido \betaA homólogo, no amiloidogénico/no tóxico (de bajo contenido en hoja-\beta) produjo una reducción similar en la carga amiloide, tal y como observaron Schenk y cols. (1999) allí donde se usó un \betaA1-42 fibrilar/tóxico (con alto contenido en hoja-\beta).

Discusión

Estos hallazgos demuestran que no son necesarios los agregados/fibrillas de \betaA para provocar una respuesta inmunitaria suficiente que origine la eliminación de las placas de \betaA. El uso de péptidos homólogos de \betaA no fibrilares/no tóxicos, como el K6\betaA1-30-NH_{2}, constituye un enfoque de vacunación más inocuo para los seres humanos.

No se conoce del todo el mecanismo de la reducción, inducida por la vacunación, de la carga amiloide en los seres humanos. Sin embargo, basados en el estudio de vacunación pasiva de Bard y cols. (2000), es probable que los anticuerpos jueguen un papel fundamental. Cabe destacar que los autores demostraron que no existía una correlación entre la eficacia de los anticuerpos y la afinidad por el \betaA soluble o por la unión al péptido agregado sintético \betaA. Los anticuerpos eficaces pudieron, sin embargo, unirse a las placas en secciones del cerebro no fijadas. Janus y cols. (2000), utilizando el mismo protocolo que Schenk y cols. (1999), observaron que el suero de los ratones inmunizados contra el \betaA teñía, de forma preferente, las placas de centro denso en vez de los depósitos \betaA difusos, lo que sugería que los anticuerpos podrían tener una afinidad más elevada por el \betaA en hoja-\beta. Basados en esos hallazgos, en cierta forma contradictorios, se necesitan más estudios sobre las interacciones anticuerpos-\betaA que puedan ofrecer una comprensión mayor sobre el mecanismo de la eliminación de \betaA mediada por anticuerpos. No es probable que estos anticuerpos estén afectando la producción de \betaA, ya que no reconocen a PPA (Weiner et alt., 2000). Es más probable que los anticuerpos potencien la eliminación de \betaA por medio de la activación de la microglía después de que el anticuerpo se haya unido a las placas \betaA (Schenk et alt., 1999 y Bard et alt., 2000). Su efecto podría, en parte, deberse a la unión al \betaA soluble dentro del cerebro, lo que alteraría el equilibrio entre el \betaA depositado en comparación con el \betaA soluble. Dado el gran número de informes que muestran que el \betaA puede cruzar la barrera hematoencefálica bidireccionalmente (Zlokovic et alt., 1993; Maness et alt., 1994; Martel et alt., 1996; Podusio et alt., 1997 y 1999; Mackic et alt., 1998; Shibata et alt., 2000 y Ji et alt., 2001), el efecto de la vacunación pudiera estar mediado, en parte, por la unión de los anticuerpos al \betaA soluble en los líquidos periféricos. Una reducción posterior en las concentraciones periféricas de \betaA podría alterar el equilibrio entre el \betaA hallado dentro y fuera del SNC lo que daría lugar a una salida del \betaA fuera del SNC. Un informe reciente muestra que en los ratones Tg2576, la concentración plasmática de \betaA disminuye a medida que aumenta la carga de la placa amiloide en el cerebro (Kawarabayashi et alt., 2001). Esto sugiere una interacción entre estos dos compartimentos, que pueden ser manipulados.

Cabe destacar que, en el estudio conductual de vacunación de Morgan y cols. (2000), los autores observaron una inversión parcial del déficit cognitivo en los ratones PPA/PS1, aunque la carga de amiloide cerebral, medida por inmunohistoquímica, no se había reducido de forma significativa. Tal y como apuntaron Morgan y cols. (2000), se ha propuesto que el \betaA soluble origina la pérdida de sinapsis en los ratones Tg PPA, puesto que algunas líneas de Tg mostraban una tinción reducida de sinaptofisina en la circunvolución dentada sin depósitos de \betaA (Mucke et alt., 2000). Por consiguiente, una posible explicación de la mejoría cognitiva en los ratones inmunizados en ausencia de una disminución de la carga de placas \betaA, consistiría en la disminución del \betaA soluble, aunque no se determinó esta posible conexión en su estudio (Morgan et alt., 2000). Los resultados obtenidos en el laboratorio de los presentes inventores muestran que tras 7 meses de tratamiento, la reducción del 81-89% en la carga de placa amiloide está asociada a una reducción del 57% en el \betaA1-42 soluble dentro del cerebro, mientras que la reducción en el \betaA soluble total y \betaA1-40 no fue significativamente diferente de la del grupo control. En otras palabras, el \betaA disminuye menos que la placa \betaA. Sin embargo, se deben llevar a cabo estudios detallados de tiempo para determinar posteriormente la existencia de algún cambio en el equilibrio entre el \betaA soluble y la placa \betaA. Estos hallazgos demuestran indirectamente la importancia de \betaA1-42 para la persistencia de la placa amiloide. En general, es posible que intervengan varios mecanismos diferentes en la disminución de la placa amiloide cerebral, dependiendo del modelo animal y las propiedades del péptido usado para la inmunización.

Numerosos estudios han sugerido que el depósito amiloide puede activar reacciones inflamatorias en cascada en el cerebro, como el aumento de la producción de IL-1 asociado con el daño neuronal y la muerte (Sigurdsson et alt. 1996 y Akiyama et alt., 2000). Es posible que nuestra inmunización con péptidos \betaA homólogos pudiera estimular también esas vías inflamatorias nocivas, al mismo tiempo que reduce el amiloide. Sin embargo, se observó sólo poca microglía fagocítica en nuestros animales inmunizados, tal y como se identificó por inmunorreactividad a OX-42 o a la lectina del tomate. Esto no resulta sorprendente, porque después de 7 meses de tratamiento, habían desaparecido la mayoría de las placas. Más aún, la microglía IL-\beta1 teñida estuvo prácticamente ausente en el grupo de ratones inmunizados, mientras que se asoció un gran número de microglía ramificada positiva a IL-\beta1 con las placas en el grupo Tg de control. El laboratorio de los presentes inventores había informado de una carencia similar de teñido IL-\beta1 en un modelo de amiloidosis cerebral en la rata después de un tratamiento con un péptido desestructurador de la hoja-\beta (Sigurdssone et alt., 2000). Sin embargo, en este estudio de proceso agudo (16 días), este efecto se asoció con un gran aumento en la tinción fagocítica OX-42 lo que indicaba que los fagocitos no expresaban IL-\beta1. Las presentes observaciones de los experimentos en este ejemplo podrían sugerir que un efecto importante de la inmunización es la reducción de la inflamación dentro del cerebro.

Ejemplo 2 Materiales y métodos Péptidos

Los péptidos usados (\betaA1-40, \betaA1-42, \betaA1-30-NH_{2}, K6\betaA1-30-NH_{2}, \betaA1-30-K6 (ID SEC NRO.:11), \betaA1-30-NH_{2} (EE_{18,19}) (ID SEC NRO.:12), \betaA1-30-NH_{2} (DD_{18,19}) (ID SEC NRO.:13) fueron sintetizados en la Keck Foundation (Yale University, New Haven, CT) como se ha descrito previamente (Sigurdsson et al., 2000). Los péptidos \betaA homólogos mantienen los dos sitios inmunogénicos principales de los péptidos \betaA (residuos 1-11 y 22-28 de \betaA1-42 basados en el índice antigénico de Jameson y cols. (1998) y en resultados preliminares obtenidos en el laboratorio de los presentes inventores), al mismo tiempo que son no fibrilares y no tóxicos.

Estudio de formación fibrilar de amiloide in vitro y de neurotoxicidad

Los experimentos se realizaron tal y como se describe en el ejemplo 1.

Análisis de los datos

Análisis de los datos: Los datos del cultivo celular se analizaron mediante análisis de varianza ANOVA de un factor, seguido de una prueba de Newman Keul para análisis posterior (GraphPad Prism 3.0).

Resultados

Ensayo de tioflavina T: \betaA1-42 se mantenía fibrilar a t = 0, mientras que \betaA1-30-NH_{2} y \betaA1-40 formaron gradualmente fibrillas con el paso del tiempo (Figura 5). \betaA1-30K6 fue significativamente fibrilogénico, pero \betaA1-30-NH_{2} (EE_{18,19}) y \betaA1-30-NH_{2} (DD_{18,19}) no formaron fibrillas tras la incubación a 37ºC al menos durante 15 días.

Neurotoxicidad: Para evaluar con posterioridad la inocuidad de este enfoque de vacunación, se determinó la neurotoxicidad de los péptidos (Figuras 6A y 6B). El efecto del tratamiento se observó a los 2 y a los 6 días (p < 0,0001). Los péptidos de control \betaA1-40 y \betaA1-42 fueron tóxicos (p < 0,01-0,001) para las células del neuroblastoma humano (SK-N-SH), comparado con el grupo de tratamiento con vehículo, tal y como se determinó por el ensayo MTT. K6\betaA-30-NH_{2} no tuvo ningún efecto en la viabilidad celular a los 2 días pero fue ligeramente trófico a los 6 días (p < 0,001) y la dosis más alta (100 \muM) de \betaA1-30K6 fue ligeramente tóxica a los 2 días del tratamiento, pero no a los 6 días. Durante el período de incubación, los agregados fueron visibles al microscopio sólo en los pocillos de cultivo que contenían \betaA1-42 (10-100 \muM). Estos péptidos \betaA homólogos, de acuerdo con la presente invención, no forman fibrillas y no son tóxicos en el cultivo neuronal humano.

En general, este enfoque ofrece un riesgo mucho menor de producción de efectos tóxicos en los seres humanos que el uso de \betaA1-40/42.

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<110> FRANGIONE, Bias

\hskip1cm

WISNIEWSKI, Thomas

\hskip1cm

SIGURDSSON, Einar

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<120> PÉPTIDOS SINTÉTICOS INMUNOGÉNICOS PERO NO AMILOIDOGÉNICOS HOMÓLOGOS AL BETA-AMILOIDE PARA LA INDUCCIÓN DE UNA RESPUESTA INMUNITARIA AL BETA-AMILOIDE Y A LOS DEPÓSITOS AMILOIDES

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<130> FRANGIONE=2A PCT

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<140> AÚN NO ASIGNADO

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<141> 2001-05-22

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<150> 60/016.233

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<151> 2000-05-22

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<160> 14

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<170> Patentin versión 3.0

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<210> 1

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintético

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<400> 1

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\sa{Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys}

\sac{Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala}

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<210> 2

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintético

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<220>

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<221> característica_misc

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<223> Los residuos aminoácidos 7-10 se encuentran o bien presentes, todos como Lys o Asp, o están todos ausentes. Cuando los residuos 7-10 están presentes, cualquiera o todos los residuos 1-6 pueden estar ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos 7-10, un segmento N-terminal de polilisina o poliaspartato de 4-10 residuos de longitud.

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<220>

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<221> característica_misc

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<223> Los residuos aminoácidos 27-31 son LeuValPhePheAla en los que uno o dos de los residuos 27-31 se han sustituido por Lys, Asp, o Glu. El residuo C-terminal de Ala puede estar amidado.

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<400> 2

1

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<210> 3

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<211> 70

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sintético

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<220>

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<221> característica_misc

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<223> Los residuos aminoácidos 7-10 son o bien todos Lys o Asp o están todos ausentes. Cuando los residuos 7-10 están presentes, cualquiera o todos los residuos aminoácidos 1-6 pueden estar ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos 7-10, un segmento N-terminal de polilisina o poliaspartato de 4-10 residuos de longitud.

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<220>

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<221> característica_misc

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<223> Los residuos aminoácidos 27-31 y 57-61 son los mismos y son LeuValPhePheAla en los que uno o dos de los residuos 27-31 y el mismo uno o dos de los residuos 57-61 se han sustituido por Lys, Asp, o Glu. El residuo C-terminal de Ala puede estar amidado.

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 31-34 se encuentran o bien presentes, todos como Lys o Asp, o están todos ausentes. Cuando todos los residuos 31-34 están presentes, cualquiera o todos los residuos 35-40 pueden estar ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos 31-34, un segmento C-terminal de polilisina o de poliaspartato de 4-10 residuos de longitud.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 17-21 son LeuValPhePheAla en los que uno o dos de los residuos 17-21 se han sustituido por Lys, Asp, o Glu.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 61-64 son todos Lys o todos Asp, o bien están todos ausentes. Cuando todos los residuos 61-64 están presentes, cualquiera o todos los residuos 65-70 pueden ser o bien Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos 61-64, un segmento C-terminal de polilisina o poliaspartato de 4-10 residuos de longitud.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 17-21 y 47-51 son LeuValPhePheAla en los que uno o dos de los residuos 17-21 y 47-51 son el mismo uno o dos residuos sustituidos por Lys, Asp, o Glu.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El residuo 36 C-terminal puede estar amidado.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 1-6 pueden o bien estar ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos 7-10, un segmento N-terminal de polilisina o poliaspartato de 4-10 residuos de longitud.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> El residuo 36 C-terminal de Ala puede estar amidado.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

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<220>

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<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 35-40 pueden estar ausentes o presentes como Lys o Asp, para formar, en combinación con los residuos 31-34, un segmento C-terminal de polilisina o de poliaspartato de 4-10 residuos de longitud.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 7-10 están o bien presentes, todos juntos como Lys o Asp o están todos ausentes. Cuando los residuos 7-10 están presentes, cualquiera o todos los residuos 1-6 pueden estar ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos 7-10, un segmento N-terminal de polilisina o de poliaspartato de 4-10 residuos de longitud.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 27-31 son LeuValPhePheAla en los que uno o dos de los residuos 27-31 se han sustituido por Lys, Asp, o Glu.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 45-50 pueden estar ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos 41-44, un segmento C-terminal de polilisina o de poliaspartato de 4-10 residuos de longitud.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

9

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 7-10 son todos o bien Lys o Asp o están todos ausentes. Cuando los residuos 7-10 están presentes, cualquiera o todos los residuos 1-6 pueden estar ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos 7-10, un segmento N-terminal de polilisina o de poliaspartato de 4-10 residuos de longitud.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 75-80 pueden estar ausentes o presentes como Lys o Asp para formar, en combinación con los residuos 71-74, un segmento C-terminal de polilisina o de poliaspartato de 4-10 residuos.

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los residuos aminoácidos 27-31 y 57-61 son los mismos y son LeuValPhePheAla en los cuales uno o dos de los residuos 27-31 y el mismo uno o dos residuos de los residuos 57-61 se han sustituido por Lys, Asp, o Glu.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

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<212> PRT

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<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys}

\sac{Leu Glu Glu Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys}

\sac{Leu Asp Asp Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Pro Phe Phe Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Un péptido aislado representado por la fórmula

(A)_{m} - (N-Xaa_{1}Xaa_{2}Xaa_{3}Xaa_{4}Xaa_{5}-C)_{n}- (B)_{p}

donde: m es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10;

p es 0, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10;

A es Lys o Asp;

B es Lys o Asp;

n es 1 ó 2

N es residuos 1-16 de ID SEC NRO.:1;

C es residuos 22-30 de ID SEC NRO.:1;

Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3},Xaa_{4} y Xaa_{5} son Leu,Val, Phe, Phe, y Ala, respectivamente, en la que ninguno, uno o dos de los residuos Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4} y Xaa_{5} se sustituyen por Lys, Asp, o Glu; y cuando cero residuos se sustituyen, o bien m o bien p, o ambos, no son cero.

2. El péptido de la reivindicación 1, donde:

cuando m no es 0, p es 0;

cuando p no es 0, m es 0; y

Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4} y Xaa_{5} son Leu, Val, Phe, Phe, y Ala, respectivamente, en la que cero, uno o dos de los residuos Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4} y Xaa_{5} se sustituyen por Lys, Asp, o Glu.

3. El péptido de la reivindicación 2, donde p es 0.

4. El péptido de la reivindicación 3, donde la C-terminal de dicho péptido está amidada.

5. El péptido de la reivindicación 3, donde A es Lys.

6. El péptido de la reivindicación 3, donde A es Asp.

7. El péptido de la reivindicación 3, donde la secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:2.

8. El péptido de la reivindicación 3, donde la secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:3.

9. El péptido de la reivindicación 2, donde m es 0.

10. El péptido de la reivindicación 9, donde B es Lys.

11. El péptido de la reivindicación 9, donde B es Asp.

12. El péptido de la reivindicación 9, donde la secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:4.

13. El péptido de la reivindicación 9, donde la secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:5.

14. El péptido de la reivindicación 1, donde m no es cero y p no es cero.

15. El péptido de la reivindicación 1, donde la secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:7 y el residuo C-terminal puede estar amidado.

16. El péptido de la reivindicación 1, donde la secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:6 y el residuo C-terminal puede estar amidado.

17. El péptido de la reivindicación 1, donde la secuencia aminoácida de dicho péptido es ID SEC NRO.:8.

18. El péptido de la reivindicación 1, donde la secuencia aminoácida de dicho péptido se ha seleccionado de un grupo que consta de las ID SEC NRO.:9 y ID SEC NRO.:10.

19. El péptido de la reivindicación 1, donde la secuencia aminoácida de dicho péptido se ha seleccionado de un grupo que consta de las ID SEC NRO.:11, ID SEC NRO.:12 y. ID SEC NRO.:13.

20. Un conjugado del péptido de la reivindicación 1 ó 2 entrecruzado con una molécula polimérica.

21. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 20, donde dicha molécula polimérica es un péptido que consta de un epítopo de linfocito T cooperador promiscuo.

22. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 21, donde dicho péptido es un péptido que consta de un epítopo de linfocito T cooperador de toxina tetánica, toxina tosferínica, toxina diftérica, virus del sarampión, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, proteína de la membrana exterior de Chlamydia trachomitis, Plasmodium falciparum circumsporozoite, Schistosoma mansoni, fosfato isomerasas, o Escherichia coli TraT.

23. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 20, donde dicho polímero se selecciona del grupo que consta de manan, glucan, tripalmitolil-5-glicerin-cisteína, y poli(lactido-co-glicolide).

24. Un compuesto inmunizante, que consta de una cantidad eficaz inmunizante del péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o un conjugado derivado, y un portador farmacéuticamente aceptable, excipiente, diluyente o agente auxiliar.

25. El compuesto inmunizante de acuerdo con la reivindicación 24, donde dicho agente auxiliar farmacéuticamente aceptable es un adyuvante.

26. El compuesto inmunizante de acuerdo con la reivindicación 25, donde dicho adyuvante es alumbre.

27. Uso del péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o un conjugado derivado, para la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria a los péptidos beta-amiloides y los depósitos amiloides.

28. Uso de la reivindicación 27, donde dicho péptido es para la administración a los seres humanos.

29. Una molécula que incluye la porción de unión antigénica de un anticuerpo formado contra el péptido de la reivindicación 1 ó 2, donde dicho anticuerpo es específico para dicho péptido.

30. Una molécula de acuerdo con la reivindicación 29, donde dicha molécula es un anticuerpo monoclonal.

31. Una molécula de acuerdo con la reivindicación 29, donde dicha molécula es un anticuerpo híbrido o humanizado.

32. Un compuesto farmacéutico, que consta de una molécula de acuerdo con la reivindicación 29 y un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente, excipiente o agente auxiliar.