CN104880441B - β‑分泌酶特异性抑制剂的筛选方法及其筛选系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β‑分泌酶特异性抑制剂的筛选体系,该体系为微胶束溶液包裹带有荧光标记的APP蛋白形成的微胶束‑APP体系;所述APP蛋白为淀粉样前体蛋白;所述微胶束溶液采用经过两亲性聚合物分子修饰的量子点制得;所述带有荧光标记的APP蛋白是利用正交反应体系,对APP蛋白进行定点荧光标记制得。此外,本发明还公开了一种β‑分泌酶特异性抑制剂的筛选方法。本发明以BACE天然底物分子作为靶标,保证了筛选到的药物前导分子具有更精确的底物特异性,可实现灵敏的实时监测。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制剂的筛选方法及其筛选系统,特别是涉及一种β-分泌酶(BACE)特异性抑制剂的筛选方法及其筛选系统。
背景技术
已有大量证据表明淀粉样蛋白(Aβ)在中枢系统的异常聚集和沉积有神经毒性,并可导致阿尔兹海默(Alzheimer’s)病的发生。Aβ是通过β-分泌酶(BACE)和γ-分泌酶对淀粉样前体蛋白(APP蛋白)的逐步水解作用形成的。其中,BACE是Aβ生成的限速步骤。针对BACE的抑制剂被认为是最有希望成为治疗和预防Alzheimer’s病的药物。全球多家制药公司正围绕BACE抑制剂的筛选开展激烈的竞争。人们通过结构分析以及分子设计,已经获得了数以万计的有希望成为BACE抑制剂的化合物分子。但如何从中筛选到能有效抑制BACE水解APP产生Aβ的活性,又不影响BACE的其他正常生理活性的真正有意义的前导药物,成为困扰BACE抑制剂研究的难点。
目前BACE抑制剂的筛选方法,基本都是利用BACE酶切位点的多肽序列为底物。在酶切位点的中间引入荧光淬灭基团,多肽的一端引入荧光基团,根据荧光共振能量转移原理,荧光基团的发射光被淬灭基团吸收。多肽在BACE酶切作用下两种基团分离,荧光基团的发射光可被检测到。
然而由于多肽不具有空间结构,不能完全反应蛋白底物与蛋白酶相互作用时的选择性。因此,以多肽为底物筛选到的BACE抑制剂,往往不具备选择性,它们会对BACE的蛋白酶活性不加区别地抑制。这势必造成这些抑制剂在阻断Aβ产生的同时,影响了BACE对其它底物的正常加工作用。或者会影响BACE同一家族的其它蛋白酶的活性。这些都会导致严重的副作用。
Chengquan Zhang等人报道(Chengquan Zhang,Li Zheng,et al.Cleavage ofpro-tumor necrosis factor alpha by ADAM metallopeptidase domain 17:A f;iprescemce-based protease assay cleaves its natural proteinsubstrate.Analytical Biochemistry,2014445:14-19;)利用TACE的天然底物TNFα为靶标,可以筛选到通过抑制TNFα三聚体形成而阻断TACE-TNFα加工途径的化合物,这种化合物并不影响TACE对其多肽底物的酶切活性。证明了用蛋白质做底物可以提高化合物筛选的精确度。
因此,对β-分泌酶特异性抑制剂的筛选方法有待进一步研究的价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种β-分泌酶特异性抑制剂的筛选体系。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种β-分泌酶特异性抑制剂的筛选方法。
该筛选方法是根据荧光共振能量转移原理,用带有量子点标记的微胶束包装带有荧光定点标记的淀粉样前体蛋白(APP蛋白)。微胶束一方面可以维持APP蛋白空间构象,另一方面又可以对APP蛋白起拘束作用,从而使得量子点和APP蛋白之间可形成荧光共振能量转移。这种能量转移将会由于BACE对APP蛋白的酶切,APP蛋白带有荧光标记的部分与胶束的分离而消失。因此,可以通过记录荧光信号,实时定量检测各种化合物对BACE作用的影响。本发明的特征是,以BACE天然底物分子作为靶标,保证了筛选到的药物前导分子具有更精确的底物特异性。
为解决上述技术问题,本发明提供如下技术方案:
在本发明的一方面,提供一种β-分泌酶特异性抑制剂的筛选体系,该体系为微胶束溶液包裹带有荧光标记的APP蛋白形成的微胶束-APP体系;所述APP蛋白为淀粉样前体蛋白;所述微胶束溶液采用经过两亲性聚合物分子修饰的量子点制得;所述带有荧光标记的APP蛋白是利用正交反应体系,对APP蛋白进行定点荧光标记制得。
进一步地,所述两亲性聚合物分子,是以C18长烷烃链为骨架,接枝上带有亲水性头部的两亲性分子;亲水性头部包括:多巴胺,聚丙烯酸,短链多聚极性氨基酸,乳糖,甘露醇;所述量子点是一种荧光纳米颗粒,包括II-VI族油相合成量子点,该量子点的粒径为5nm~10nm,发射波长控制在490nm~510nm。
进一步地,所述微胶束溶液中的微胶束的粒径范围为100~200nm;;所述带有荧光标记的APP蛋白与所述微胶束溶液以表面活性剂分子计算的摩尔比为1:1~1:10;所述荧光标记包括激发波长范围与量子点发射波长范围重叠的荧光核。
在本发明的另一方面,提供一种β-分泌酶特异性抑制剂的筛选方法,包括如下步骤:
1)用经过两亲性聚合物分子修饰的量子点制备微胶束溶液(即量子点微胶束溶液);
2)利用正交反应体系,对淀粉样前体蛋白(APP蛋白)进行定点荧光标记;
3)用步骤1)的微胶束溶液包裹步骤2)的带有荧光标记的APP蛋白,以形成微胶束-APP体系;
4)利用微胶束-APP体系筛选具有BACE活性抑制作用的化合物。
进一步地,所述步骤1)中,量子点是一种荧光纳米颗粒,本发明采用易于制备,且荧光效率高的II-VI族油相合成量子点,如CdTe、CdSe、CaS、CaSe、BaS、BaTe等;该量子点的制备方法,可根据常规的方法进行制备。另外,本发明中的量子点的粒径优选为5nm~10nm,发射波长控制在490nm~510nm。
步骤1)中,量子点表面修饰所使用的两亲性聚合物分子,是以C18长烷烃链,如脑磷脂等为骨架,接枝上带有亲水性头部的两亲性分子。亲水性头部包括:多巴胺,聚丙烯酸,短链多聚极性氨基酸,乳糖,甘露醇等。接枝方法:取长烷烃链分子1mM-5mM溶于二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰氨(DMF)中,加入8mM的N,N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)和8mM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0℃下反应12hr,使长烷烃分子活化。取0.02mM~0.74mM的极性分子如聚丙烯酸,半乳糖,甘露糖等溶于氯仿-甲醇溶液(V氯仿:V甲醇=3:1)中,缓慢加热至35℃,逐渐滴加入到上述0.04mM~1mM已活化好的烷烃分子溶液中,并加入3mM三乙胺,保持体系在35℃下反应12hr,即得到可用于量子点表面修饰的两亲性化合物分子。
步骤1)中,量子点标记的微胶束的合成具体操作可包括步骤:
将1μmol的量子点溶于氯仿-甲醇(V氯仿:V甲醇=3:1)的溶剂中,加入100~900倍摩尔数量的两亲性聚合物分子,在50~80℃下混合,并蒸发除去多余的有机溶剂。将得到的固体分散到超纯水中,高速离心,取上清,除去团聚的、未被修饰的量子点。过滤上清。
所述过滤中的滤膜包括:孔径为100~200nm的聚碳酸酯滤膜;
微胶束溶液中的微胶束的粒径范围优选为100~200nm。
进一步地,所述步骤2)中,带有荧光定点标记的淀粉样前体蛋白,是通过基于密码子拓展的生物正交标记系统完成的。如图4所示,具体的合成方法包括:
a)构建含琥珀抑制型tRNAlys CUA基因的质粒
提取嗜热古细菌基因组DNA,通过PCR的方法扩增获得琥珀抑制型MjtRNAlys CUA的基因,并将其克隆至含有大肠杆菌谷氨酰胺-tRNA启动子的且带有卡那霉素抗性的表达质粒pAC123中(通过EocRI/PstI位点插入到pAC123质粒)。
其中,嗜热古细菌琥珀抑制型tRNAlys CUA的基因扩增引物为:
5’端上游引物序列:5’-GGAATTCCCGGCGGTAGTTCAG-3’,如SEQ ID No.1所示;
3’端下游引物序列:5’-AAACTGCAGTGGTCCGGC-3’,如SEQ ID No.2所示;
b)构建tRNApyrlysCUA-pyrlysRS(氨酰tRNA合成酶)体系,其中,步骤b)的具体操作可包括步骤:
b1)以嗜热古细菌的lys氨酰tRNA合成酶基因为模板,针对lys-tRNA合成酶上参与催化氨基酸-tRNA合成的关键位点41A、268N,通过设计兼并引物,以及反向PCR,获得pyrlysRS的突变质粒文库;
其中,PCR扩增中的兼并引物序列如下:
5’端上游引物序列:5’-aagtggtaaa nnncatttag ggc-3’,如SEQ ID No.3所示;
3’端下游引物序列:5’-atttgacagt tnnnagctat ga-3’,如SEQ ID No.4所示
该质粒文库理论上,可编码在上述两个位点上含所有氨基酸插入可能的,lys氨酰tRNA合成酶。
b2)步骤b1)的文库、与tRNAlysCUA基因同时转化至步骤a)大肠杆菌中,同时转入M1,Q107位点带有TGA琥珀突变的绿色荧光蛋白表达质粒pREP2-AKtRNACUA(lifetechnology公司),该质粒含有氯霉素抗性。
获得的转化子同时接种在含有或不含0.5~1mM吡咯赖氨酸的GLMM平板上。当lys-tRNA合成酶能够识别吡咯赖氨酸并将其附加在tRNACUA上,通读带有UAG的绿色荧光蛋白基因时,大肠杆菌母体会发出绿色荧光,而在不含有吡咯赖氨酸的平板上,因为嗜热古细菌的MjtRNACUA与大肠杆菌的氨酰tRNA合成酶成正交反应,无法正常合成绿色荧光蛋白的克隆,菌体为白色。通过3~4轮筛选过程,可获得MjpyrlystRNAlysCUA-pyrlysRS(氨酰tRNA合成酶)体系。
c)将APP蛋白的突变基因克隆至pE-sumo表达质粒中。
APP蛋白的定点突变:选择BACE酶切位点附近的氨基酸644Tyr,将其密码子突变为琥珀型终止密码子TAG。
APP含有644位酪氨酸琥珀突变基因序列如下(如SEQ ID No.5所示):通过全基因合成方法获得,并通过BSaI/XbaI位点克隆至pE-sumo(clonetech公司)载体中。
核苷酸序列(366位氨基酸开始)TGCACCACGGCGGCAAGCACCCCGGATGCGGTTGATAAGTATCTGGAAACGCCGGGTGATGAAAACGAACACGCGCACTTTCAGAAGGCCAAGGAGCGTCTGGAAGCAAAACATCGTGAGCGTATGAGCCAAGTGATGCGTGAGTGGGAAGAGGCGGAACGCCAGGCAAAGAATCTGCCGAAAGCGGATAAGAAAGCCGTTATCCAACACTTCCAGGAAAAGGTGGAAAGCCTGGAGCAGGAAGCGGCGAACGAGCGTCAACAGCTGGTTGAGACGCACATGGCCCGTGTTGAAGCGATGCTGAACGACCGTCGTCGTCTGGCGCTGGAAAATTACATTACCGCGCTGCAAGCGGTTCCACCGCGTCCGCGTCACGTGTTCAACATGCTGAAGAAATATGTTCGTGCGGAACAAAAAGATCGCCAGCATACCCTGAAACATTTTGAACATGTGCGTATGGTGGATCCGAAAAAGGCCGCACAAATCCGTAGCCAGGTTATGACCCATCTGCGTGTGATTTACGAACGCATGAATCAGAGCCTGAGCCTGCTGTATAATGTGCCAGCCGTGGCGGAGGAAATTCAGGATGAAGTTGATGAGCTGCTGCAGAAAGAACAGAATTATAGCGATGATGTTCTGGCCAATATGATCAGCGAACCGCGTATTAGCTATGGCAATGACGCGCTGATGCCAAGCCTGACGGAAACCAAAACCACCGTGGAACTGCTGCCGGTGAACGGCGAGTTTAGCCTGGATGATCTGCAACCGTGGCATAGCTTTGGCGCGGATAGCGTTCCAGCAAATACCGAAAATGAAGTGGAGCCGGTGGACGCACGTCCAGCGGCGGATCGTGGTCTGACCACCCGTCCGGGCAGCGGCCTGACCAACATT(AAA)TAGACCGAAGAGATTAGCGAGGTTAAAATGGATGCCGAATTTCGTCATGATAGCGGCTACGAAGTTCACCATCAAAAGCTGGTGTTTTTCGCCGAAGATGTGGGCAGCAACAAAGGTGCGATTATCGGTCTGATGGTTGGCGGCGTGGTGATTGCGACCGTGATTGTGATTACCCTGGTTATGCTGAAAAAGAAGCAGTATACCAGCATTCATCATTAA
突变后氨基酸序列如SEQ ID No.6所示:
d)将步骤c)所得质粒转化至步骤b2)所构建的带有MjpyrlystRNACUA-pyrlysRS(氨酰tRNA合成酶)体系的大肠杆菌感受态细胞中。通过抗性筛选以及目的蛋白的表达筛选,获得能够正确表达带有突变的APP蛋白的菌株。
f)对步骤d)的菌株进行诱导,收集,纯化,得到带有突变的APP蛋白。
所述步骤2)中,荧光标记采用lifetechnology公司的点击化学试剂如AlexaFluor 488 azide或Alexa Fluor 555 azide或Alexa Fluor 594 azide。
标记的方法,可包括步骤:定点突变蛋白ACPK-APP蛋白与Alexa Fluor 488 azide或Alexa Fluor 555 azide或Alexa Fluor 594 azide或其他有相似激发波长,并且带有炔烃基团的荧光分子,按照摩尔数1:1~1:10混合,反应体系为H2O与正叔醇的1:1混合物,其中加入催化剂0.5M CuSO4,以及抗氧化剂6M抗坏血酸Na。室温下反应6-12hr.过滤除去不溶物,即得到荧光标记的APP蛋白。
进一步地,所述步骤3)中,带有荧光标记的APP蛋白与微胶束溶液(以表面活性剂分子计算)的摩尔比1:1~1:10。包裹的温度为25℃~37℃、时间为2~4hr。
进一步地,所述步骤4)中,筛选的方法为:根据荧光信号监测反应体系中的BACE活性,以筛选化合物。
本发明中,要阻断Aβ多肽的产生又不影响BACE以及其它蛋白酶的其他生理活性,需要改变筛选策略。利用Aβ的前体蛋白APP在与BACE相互作用时蛋白质空间构象的特异性,筛选出更有针对性的抑制剂。作为靶标,除选择天然蛋白作为底物,同时还必须保持其完整的空间结构。APP是一种膜蛋白,只有恢复膜定位结构,才能真正模拟其天然构象。因此本发明中采用具有近似于膜双层结构的微胶束包裹APP蛋白,使底物蛋白的构象更接近于天然结构。
另外,为建立高通量筛选平台,必须有灵敏且易于检测的方法。本发明根据荧光共振能量转移原理(FRET),分别在底物蛋白BACE酶切位点附近,以及微胶束中分别引入两种可发射荧光的基团。微胶束中荧光来自于经过两亲性修饰的量子点,其发射波长(λEmi1)与在底物蛋白上标记基团的激发波长(λEex2)重叠。又因为底物蛋白分子被微胶束包裹,两个基团之间的距离足够接近,量子点发射的荧光被APP蛋白上标记的荧光基团吸收,因此在初始状下检测不到量子点的发射光。加入BACE后,随着BACE对APP蛋白的酶切,APP蛋白上将与微胶束分子分离,共振消失。量子点发出的荧光强度(Emi1)将与BACE的酶切作用成正比。因此可以通过荧光信号,实时监测反应体系中的酶活性。且因为不需要分离纯化酶切产物,可实现高通量筛选。
本发明的荧光共振能量转移体系中,荧光供体基团选择量子点标记。量子点与有机荧光基团相比具有稳定,荧光寿命长,不易光漂白,发射波峰窄的特点,便于检测。更重要的一点是,量子点为半导体材料,具有磁性,便于固定和分离纯化。
APP蛋白为大肠杆菌表达纯化产品,在纯化过程中采用了去污剂溶解,实现了纯化与复性的同步进行。同时纯化中所用去污剂与形成微胶束的两亲性分子通过微乳液法,实现胶束分子间的交换,通过简单的混合,可实现量子点标记微胶束对APP蛋白的包裹。
APP蛋白的定点标记采用的是基于密码子拓展的蛋白质定点突变以及点击化学反应。用与大肠杆菌的翻译体系正交的,嗜热古细菌的酪氨酸-tRNA合成酶(PhKRΔS)为骨架,构建PhKRΔS上与氨基酸结合位点的随机突变表达质粒文库,并与其相对应的嗜热古细菌的琥珀型抑制tRNA(AKtRNACUA)基因,同时转入大肠杆菌。限定培养基中加入或不加叠氮-酪氨酸,以带有TGA密码子突变的绿色荧光蛋白作为报导基因,通过正负克隆的颜色对比进行筛选。获得到能识别琥珀型终止密码子TAG,并将其翻译为吡咯赖氨酸的翻译体系。随后将APP蛋白上靠近酶切位点的Tyr的密码子突变为TGA。利用上述翻译体系,可以表达出指定位点带有吡咯赖氨酸的突变体APP蛋白。纯化后的突变蛋白在Cu2+催化下,与含有炔烃基团的荧光分子发生加成反应。蛋白被标记上荧光基团。本方法的特点是特异性强,可实现蛋白定点标记的精确控制。
本发明的具体有益效果如下:
一、选择性更强:本发明的主要出发点在于:以BACE的蛋白底物为靶标。同多肽底物比较起来,全长的蛋白底物在药物筛选过程中,有显而易见的优势:蛋白底物分析提供了更好的方向选择性。蛋白酶与其底物之间的相互作用的特异性、反应速率等,是由酶和底物的构象决定的。由于多肽没有空间构象,在以多肽为底物的分析中,选择性很难实现。得到的抑制剂性化合物往往是直接针对酶的活性中心的。实际上机体中有许多具有相似结构和机制的蛋白酶,它们归属于同一蛋白酶家族。针对某种蛋白酶活性中心的抑制剂,往往表现出较宽的抑制谱,即它能够抑制该家族其他成员的活性。这种选择性的缺乏会导致非预想的结果,有些是非常严重的。另一方面,一个蛋白酶又常常作用于多个底物。作用于蛋白酶活性中心的抑制剂不可避免的会阻断被该酶调节的其他功能。基于蛋白底物的药物分析,可以避免上述两种问题。
二、可实现灵敏的实时监测。使用合成的多肽代替全长蛋白作为底物的主要原因之一是可以将荧光染料和猝灭基团选择性地结合到酶切位点的两侧,当多肽被蛋白酶水解,荧光染料与其猝灭基团分离,这将导致荧光强度的增加。这就在不用分离出反应产物的情况下,为反应进程提供了一个灵敏而方便的连续监测分析方法。然而对于蛋白而言,位点特异性标记很难实现。这样,为了分析反应速率,必须在反应结束后,利用电泳、色谱或其他方法将产物从反应体系中分离出来。这种方法效率低且花费高。本发明方法采用基于密码子拓展的蛋白定点突变和点击化学方法实现对蛋白的定点标记,同样利用荧光共振能量转移原理,通过测量荧光信号可实时检测蛋白酶活性。由于不需要将反应产物从反应体系中分离出来,因此这种方法能够较容易地应用于高通量的化合物筛选。
三、微胶束(bicelle)对APP的包裹保证了其膜定位结构的正确性。微胶束是去污剂与磷脂分子混合形成的扁平状膜状结构,Bicelles比由纯脂质体组成的micelle更接近于膜的磷脂双层结构,在这层薄膜状结果中间为疏水区,薄膜外层为亲水表面。APP蛋白C端可插入bicelle疏水区内,胞外区则暴露在水相中。控制蛋白与微胶束的混合比例,可以实现一个微胶束包裹一个APP蛋白。如此的组织可以防止APP分子间相互聚集而沉淀,又可以保证其正确的空间构象。微胶束对目的蛋白的包裹还有利于拉近目的蛋白上的荧光标记基团与微胶束中的量子点之间的距离,构成有效的FRET对。
四、微胶束中使用的量子点为FRET体系提供了稳定、荧光强度高的供体。量子点荧光明亮、稳定,激发光谱宽。发射波长可通过改变材料的粒径大小和组成来调控,因此可以通过控制量子点的大小获得理想的荧光供体发射波长。量子点的发射波谱范围窄,能有效避免干扰荧光吸收基团的发射光信号检测。量子点与有机荧光基团相比更有稳定性高,受溶液体系影响小的优点。
五、基于密码子扩展的方法可实现对目的蛋白进行特异性定点标记,解决了以蛋白质为底物检测方法的局限性。使蛋白质底物与多肽底物同样,可以通过检测反应体系中的实时荧光信号变化,获得蛋白酶活性数据。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明:
图1是本发明实施例中用带有量子点的微胶束,包装荧光基团标记的APP分子示意图。并且在合成过程中,选择量子点的发射波长与APP分子上的荧光基团的激发波长重叠。根据荧光共振能量转移(FRET)原理量子点的发射光将被荧光基团吸收,整个体系中只能检测到荧光基团的发射光。在BAEC的作用下APP分子释放出胞外区,荧光基团与量子点间的距离变大,共振消失。可检测到体系中量子点的发射光。BACE抑制剂的加入将阻断这种变化。在α-分泌酶的作用下释放出s-APPα,同样共振消失,可以检测到量子点的发射光。而只针对BACE的特异性抑制剂应该不会影响α-分泌酶的作用。因此通过体系中荧光光谱的变化,可以筛选到BACE的特异性抑制剂。
图2是本发明实施例中两亲性修饰的量子点示意图。
图3是本发明实施例中由两亲性量子点与脂质体混合组成的微胶束示意图。
图4是本发明实施例中利用与大肠杆菌正交的MjpyrlystRNACUA-pyrlysRS(氨酰tRNA合成酶)对,将吡咯赖氨酸插入目的蛋白的示意图。
图5是本发明实施例中利用点击化学的方法实现蛋白质的荧光定点标记的示意图。
图6是本发明实施例中APP定点标记位点示意图。
图7是本发明实施例中大肠杆菌表达的APP蛋白在去污剂分子的包装下,可以被BACE蛋白酶识别并发生特异性切割反应示意图,图7(a)为紫外灯下的照片,图7(b)为考马斯亮蓝染色后的照片。其中,1:FITC-标记的APP蛋白溶于500mM DDM溶液中;2:泳道1的样品经过500ng BACE酶切后;3:FITC-标记的APP蛋白溶于500mM DPC溶液中;4:泳道3的样品经过 500ng BACE酶切后;左边为荧光照片,右边为考马斯亮蓝染色结果;
图8是本发明实施例中抑制剂对BACE作用的影响示意图;
图9是本发明实施例中在不同抑制剂浓度下,酶切产物浓度与时间的关系示意图;
图10是本发明实施例中抑制剂浓度与酶相对活性的关系示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如J.Sambrook等在《分子克隆实验指南》(科学出版社,1992)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
本发明实施例的总体实施方案如图1所示:利用两性量子点与脂质体混合形成微胶束体系。并对荧光定点标记APP蛋白进行包装。APP蛋白的荧光标记基团与量子点之间可形成荧光共振能量转移,这种共振会随着BACE对APP蛋白的酶切作用而消失。因此通过体系中荧光强度的变化可检测化合物对BACE活性的影响。具体步骤包括如下:
(一)、用带有两亲性聚合物分子修饰的量子点合成微胶束溶液;参照文献(YKLee,JM Jeong,et al,Nanoparticles Modified by Encapsulation of Ligands with aLong Alkyl Chain to Affect Multispecific andMultimodal Imaging J Nucl Med2012;53:1462–1470)
1、油相合成带有表面修饰的量子点(粒径控制在4.5nm左右,发射波长控制在490nm)
a、Se前驱体的合成:称取3.6mM硒粉加入1ml十八烯,和1ml TOP,超声溶解;
b、CdSe量子点的制备:称取0.6mM氧化镉,加入0.8ml油酸和十八烯,在三颈瓶中,通惰性气体如氮气或氩气,保护30min,加热至澄清。冷却至室温加入1.5gTOP和4.5g十八烯,通惰性气体45min,快速注入Se前体。控制反应时间,使得到的量子点的粒径控制在4.5nm以内。
2、量子点表面修饰所使用的两亲性聚合物分子的合成,如图2所示,将极性分子如多糖(半乳糖或甘露糖)或极性多肽分子等与活化后的长链烷烃发生聚合反应,并通过长链烷烃与量子点表面的三辛基膦(TOP)形成共价键或疏水相互作用,对量子点进行修饰。
取长烷烃分子1mM~5mM溶于二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰氨(DMF)或氯仿中,加入8mM的N,N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)和8mM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS),0℃下反应12hr,使长烷烃分子活化。取0.02mM~0.74mM的极性分子如聚丙烯酸,半乳糖,甘露糖等溶于氯仿-甲醇溶液(V氯仿:V甲醇=3:1)中,缓慢加热至35℃,逐渐滴加入到上述0.04mM~1mM已活化好的烷烃分子溶液中,并加入3mM三乙胺,保持体系在35℃下反应12hr,即得到两亲性量子点。
进一步利用两亲性修饰的量子点与脂质体体混合,可得到能发射一定波长荧光的与生物膜结构相似的微胶束体系,如图3所示。两亲性量子点通过与脂质体混合,亲水性修饰表面与脂质体的极性头部一起排列在微胶束的外侧,而疏水的量子点则镶嵌在微胶束的内侧,也相当于细胞膜的疏水区。
微胶束的合成具体操作可包括步骤:将1μmol的量子点溶于氯仿-甲醇(V氯仿:V甲醇=3:1)的溶剂中,加入摩尔数量为其100~900倍的脂质体分子,在50~80℃下混合,并蒸发除去多余的有机溶剂。将得到的固体分散到超纯水中,高速离心,取上清,除去团聚的、未被修饰的量子点。过滤上清。
将溶解物通过孔径为100nM的聚碳酸酯滤膜,即可得到直径均为100nM的扁形微胶束:用31pNMR检测所得产物的各项均一性。
(二)利用正交反应体系对APP蛋白进行定点荧光标记(如图4-6所示)
1)如图4所示,利用密码子拓展技术,构建可识别琥珀型终止密码子,并可将叠氮吡咯赖氨酸定点插入目的蛋白相应位点的phplystRNACUA-pylRS(氨酰tRNA合成酶)体系,可以将目的蛋白的特定氨基酸突变为带有叠氮基团的非天然氨基酸,参照文献(J.CAnderson,N Wu,etal,An epanded genetic code with a functional quadrupletcodon,PNAS,2004(101)7566-7571)。
a、琥珀抑制型tRNAlysCUA基因的表达:
用细菌基因组提取试剂盒(生工试剂)提取嗜热古细菌基因组DNA,并进行PCR扩增。其中,PCR扩增中的引物如下:
5’-GGAATTCCCGGCGGTAGTTCAG-3’,如SEQ ID No.1所示;
5’-AAACTGCAGTGGTCCGGC-3’,如SEQ ID No.2所示。
通过PCR扩增获得大约80bp的扩增产物,胶回收(康维试剂),加入EocRI/PvuII酶切(Fermentas),并连接到pAC123(lifetechnology公司)质粒中。转化大肠杆菌DE3(BL21)感受态细胞。通过含有50μg/ml卡那霉素的LB平板进行筛选,并提取阳性克隆的质粒,做酶切鉴定。保留含有正确质粒的菌株。
b、通过带有琥珀突变的绿色荧光蛋白的表达,筛选出能特异性识别吡咯赖氨酸并催化合成吡咯赖氨酸-tRNACUA的tRNA合成酶。
嗜热古细菌的lys氨酰tRNA合成酶基因Gene bank MJ-0389(如SEQ ID No.7所示):
以克隆至质粒pBK(Aligent technology公司)中的嗜热古细菌lys氨酰tRNA合成酶基因作为模板,对其中催化氨基酸-tRNA合成的关键位点41A、268N,利用兼并引物进行随机突变。pBK质粒带有四环素抗性。
5’端上游引物序列:5’-aagtggtaaa nnncatttag ggc-3’,如SEQ ID No.3所示;
3’端下游引物序列:5’-atttgacagt tnnnagctat ga-3’,如SEQ ID No.4所示
通过两轮反向PCR扩增,PCR产物重新环化后,构成大小为106~107的质粒文库。与上述带有MjtRNAlysCUA基因的质粒同时转入大肠杆菌BL21(DE3)内。
在上述转化细菌中,再转入在M1,Q107位点带有TGA突变的绿色荧光蛋白基因。该基因位于含有氯霉素抗性的表达质粒pREP2-AKtRNACUA中。获得的转化子接种在含有1mM吡咯赖氨酸的GLMM平板上。挑取菌体呈绿色的克隆,接种至含有卡那霉素,四环素,以及氯霉素三种抗性的LB培养基种,培养至OD600=0.1左右,涂含有三种抗性的LB平板。挑取单克隆,同时接种至含有或不含1mM吡咯赖氨酸的GLMM平板上。挑取只在1mM吡咯赖氨酸的GLMM平板上呈现绿色的菌落。重复以上筛选过程。通过三轮筛选过程,取阳性克隆,提取质粒。通过凝胶分离三种不同的质粒,回收带有吡咯酪氨酸氨酰tRNA合成酶的质粒。将含有吡咯酪氨酸氨酰tRNA合成酶的质粒、琥珀抑制型tRNAlysCUA基因的质粒同时转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中,构成能识别琥珀型终止密码子,并可将叠氮吡咯赖氨酸插入目的蛋白相应位点的表达体系。
2)将APP突变基因克隆至pE-sumo表达质粒中。
APP蛋白的定点突变:APP蛋白的定点突变位点选择在BACE酶切位点附近,并且位于APP蛋白的跨膜区,选择BACE酶切位点附近的Tyr644,将其密码子突变为琥珀型终止密码子TAG,如图6所示。
APP含有644位酪氨酸琥珀突变基因序列如下(如SEQ ID No.5所示):通过全基因合成方法获得,并通过BSaI/XbaI位点克隆至pE-sumo(clonetech公司)载体中。
核苷酸序列(366位氨基酸开始)TGCACCACGGCGGCAAGCACCCCGGATGCGGTTGATAAGTATCTGGAAACGCCGGGTGATGAAAACGAACACGCGCACTTTCAGAAGGCCAAGGAGCGTCTGGAAGCAAAACATCGTGAGCGTATGAGCCAAGTGATGCGTGAGTGGGAAGAGGCGGAACGCCAGGCAAAGAATCTGCCGAAAGCGGATAAGAAAGCCGTTATCCAACACTTCCAGGAAAAGGTGGAAAGCCTGGAGCAGGAAGCGGCGAACGAGCGTCAACAGCTGGTTGAGACGCACATGGCCCGTGTTGAAGCGATGCTGAACGACCGTCGTCGTCTGGCGCTGGAAAATTACATTACCGCGCTGCAAGCGGTTCCACCGCGTCCGCGTCACGTGTTCAACATGCTGAAGAAATATGTTCGTGCGGAACAAAAAGATCGCCAGCATACCCTGAAACATTTTGAACATGTGCGTATGGTGGATCCGAAAAAGGCCGCACAAATCCGTAGCCAGGTTATGACCCATCTGCGTGTGATTTACGAACGCATGAATCAGAGCCTGAGCCTGCTGTATAATGTGCCAGCCGTGGCGGAGGAAATTCAGGATGAAGTTGATGAGCTGCTGCAGAAAGAACAGAATTATAGCGATGATGTTCTGGCCAATATGATCAGCGAACCGCGTATTAGCTATGGCAATGACGCGCTGATGCCAAGCCTGACGGAAACCAAAACCACCGTGGAACTGCTGCCGGTGAACGGCGAGTTTAGCCTGGATGATCTGCAACCGTGGCATAGCTTTGGCGCGGATAGCGTTCCAGCAAATACCGAAAATGAAGTGGAGCCGGTGGACGCACGTCCAGCGGCGGATCGTGGTCTGACCACCCGTCCGGGCAGCGGCCTGACCAACATT(AAA)TAG ACCGAAGAGATTAGCGAGGTTAAAATGGATGCCGAATTTCGTCATGATAGCGGCTACGAAGTTCACCATCAAAAGCTGGTGTTTTTCGCCGAAGATGTGGGCAGCAACAAAGGTGCGATTATCGGTCTGATGGTTGGCGGCGTGGTGATTGCGACCGTGATTGTGATTACCCTGGTTATGCTGAAAAAGAAGCAGTATACCAGCATTCATCATTAA
突变后氨基酸序列如SEQ ID No.6所示:
将上述质粒转入所述步骤1)中含有pyltRNAlysCUA-pylRS(氨酰tRNA合成酶)对的大肠杆菌中,经小量诱导表达后,筛选出可正确表达目的蛋白的克隆。将阳性克隆接种于含有三种相应的抗生素以及10mM N3-pyl(ACPK)的GMML培养基中。OD600=1.0后,加入0.5mMIPTG诱导表达4hr。
收集菌体,加入裂解液25mM Tris-HCL,150mM NaCL,2mMEDTA,0.5%Triton X-100,pH8.0超声破菌。离心13000rpm 10min,收集沉淀。沉淀用8MUrea 0.1%NLS(月桂酰基磺酸钠)(质量体积百分比),溶解。与Ni-柱结合(事先用25mM Tris-HCL,10mM imidazole,150mMNaCL平衡)过夜,Ni-柱用2M Urea 500mM NaCl,25mM Tris-HCl,pH8.0缓冲液洗涤10个柱积后,用10mM DDM,500mM咪唑,25mMTris-HCL,150mM NaCl缓冲液洗脱,可得到纯化的、带有吡咯赖氨酸定点突变的蛋白APP蛋白------ACPK-APP。
3)如图5所示,用点击化学的方法将荧光基团标记在ACPK-APP蛋白上。通过突变的目的蛋白的非天然氨基酸在铜离子的催化下与带有炔烃基团的荧光核物质发生加成反应,目的蛋白ACPK-APP蛋白被标记上荧光基团。
将纯化得到的定点突变蛋白ACPK-APP蛋白与Oregon 488alkyne(λex=496λem=524)或具有类似激发波长并含有炔烃基团的荧光分子。按照摩尔数1:1~1:10混合,反应体系为H2O与正叔醇的1:1(体积比)混合物,其中加入催化剂0.5M CuSO4,以及6M抗坏血酸Na作为抗氧化剂。室温下反应6-12hr,过滤除去不溶物,即可得到荧光标记的APP蛋白,如图7所示。带有荧光定点标记的APP蛋白,在BACE的酶切作用下可以产生50Kda的胞外区和15Kda的胞内区,释放出带有荧光的大约10KDa的多肽片段(如图7中的泳道2和泳道4),相对于未经过酶切的蛋白(泳道1和泳道3)分子量变小。图7(a)为紫外灯下的照片,图7(b)为考马斯亮蓝染色后的照片。通过SDS-PAGE电泳可以清楚地观察到酶切的效果。证明标记正确。
(三)用微胶束溶液包裹带有荧光标记的APP蛋白,以形成微胶束-APP体系。将荧光标记的APP蛋白与量子点标记的微胶束溶液按照摩尔比1:1~1:10的比例混合,37℃轻柔混合2~4hr,1000rpm离心40min,小心吸出上清,用20%乙醇洗涤两次,沉淀即为被微胶束包裹的APP蛋白。用pH7.0~pH7.4的磷酸缓冲液重新悬浮包装蛋白。用波长490nm激发光,测定510nm和540nm处的发射光强度,分别即为Emit510和Emit540。当Emit540/Emit510>50,则说明包装成功。
(四)检测荧光标记APP蛋白与量子点之间可形成荧光共振能量转移,用量子点的发射光会被APP蛋白上的荧光基团吸收,这种共振会随BACE的作用而消失,可以逐渐检测到量子点的发射光。BACE抑制剂的加入将阻断这一过程,随着抑制剂浓度的增加,BACE-APP酶切作用逐渐被抑制,量子点的发射光强度将逐渐减弱,如图8所示。
在波长为490nm处测定微胶束-APP蛋白溶液的光吸收值,参考量子点的荧光吸收系数,计算包装蛋白的浓度。用pH4.0~pH4.5醋酸缓冲溶液稀释样品至1~10nM/50μl,加入到黑色不透明的96孔板中,50μl/孔。24℃平衡30min。每种浓度作三个平行孔。三个平行孔中分别加入50μl pH4.0~pH4.5醋酸缓冲溶液,50μl含有50μM BACE的pH4.0~pH4.5醋酸缓冲溶液,以及含有不同浓度的待筛选的目标化合物+100ngBACE的pH4.0~pH4.5醋酸缓。24℃下反应,并读取每个孔510nm处的发射光强度随时间的变化。
(五)计算
抑制剂对BACE作用的影响可根据以下公式计算:
公式(1):P=[S]*(F-Fs)/(Fp-Fs)
其中P为产物浓度,[S]为底物浓度,F、Fs、Fp分别为某个时间点下体系中的荧光强度,底物的初始荧光强度,以及底物完全转化为产物时的荧光强度。
不同抑制剂浓度下的P的变化与时间作图,如图9所示,体系中量子点的发射光强度可转化为产物的相对摩尔浓度,并计算出反应速度。
再求每条直线的斜率,也是在该抑制剂浓度下的反应速度。以不加抑制剂时的反应速度为100%,计算各抑制剂浓度下的相对速度,并对抑制剂的浓度作图,如图10所示,通过曲线拟合便可计算出抑制剂的IC50。
用酶抑制剂反应公式:
公式(2):Y=a/(1+exp(b+(X-c)))+d
对上述图10中的曲线进行非线性拟合,
当Y=50时,求X值,即为此抑制剂的IC50。
Claims (11)
1.一种β-分泌酶特异性抑制剂的筛选体系,其特征在于:该体系为微胶束溶液包裹带有荧光标记的APP蛋白形成的微胶束-APP体系;所述APP蛋白为淀粉样前体蛋白;所述微胶束溶液采用经过两亲性聚合物分子修饰的量子点制得;所述带有荧光标记的APP蛋白是利用正交反应体系,对APP蛋白进行定点荧光标记制得;所述量子点发射荧光波长范围与APP蛋白荧光标记的激发波长范围重叠。
2.如权利要求1所述的筛选体系,其特征在于:所述两亲性聚合物分子,是以C18长烷烃链为骨架,接枝上带有亲水性头部的两亲性分子;亲水性头部包括:多巴胺,聚丙烯酸,短链多聚极性氨基酸,乳糖,甘露醇;所述量子点是一种荧光纳米颗粒,包括II-VI族油相合成量子点,该量子点的粒径为5nm~10nm,发射波长控制在490nm~510nm。
3.如权利要求1所述的筛选体系,其特征在于:所述微胶束溶液中的微胶束的粒径范围为100~200nm;所述带有荧光标记的APP蛋白与所述微胶束溶液以表面活性剂分子计算的摩尔比为1:1~1:10;所述荧光标记包括激发波长范围与量子点发射波长范围重叠的荧光核。
4.一种β-分泌酶特异性抑制剂的筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)用经过两亲性聚合物分子修饰的量子点制备微胶束溶液;
2)利用正交反应体系,对APP蛋白进行定点荧光标记;
3)用步骤1)的微胶束溶液包裹步骤2)的带有荧光标记的APP蛋白,以形成微胶束-APP体系;
4)利用微胶束-APP体系筛选具有BACE活性抑制作用的化合物。
5.如权利要求4所述的筛选方法,其特征在于,步骤1)中,所述量子点是一种荧光纳米颗粒,包括II-VI族油相合成量子点;该量子点的粒径为5nm~10nm,发射波长控制在490nm~510nm;所述两亲性聚合物分子,是以C18长烷烃链为骨架,接枝上带有亲水性头部的两亲性分子;所述亲水性头部包括:多巴胺,聚丙烯酸,短链多聚极性氨基酸,乳糖,甘露醇。
6.如权利要求5所述的筛选方法,其特征在于,步骤1)中,所述接枝方法具体为:取长烷烃链分子溶于二甲基亚砜或二甲基甲酰氨中,加入N,N’-二环己基碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺反应,使长烷烃分子活化;取极性分子溶于氯仿-甲醇溶液中,缓慢加热至35℃,逐渐滴加入到上述已活化好的烷烃分子溶液中,并加入三乙胺,保持体系在35℃下反应12hr,即得到可用于量子点表面修饰的两亲性化合物分子。
7.如权利要求4所述的筛选方法,其特征在于,步骤1)中,所述微胶束溶液的制备具体包括如下步骤:将量子点溶于氯仿-甲醇的溶剂中,加入100~900倍摩尔数量的两亲性聚合物分子,在50~80℃下混合,并蒸发除去多余的有机溶剂;将得到的固体分散到超纯水中,高速离心,取上清,除去团聚的、未被修饰的量子点;过滤上清;所述过滤中的滤膜包括:孔径为100~200nm的聚碳酸酯滤膜;所述微胶束溶液中的微胶束的粒径范围为100~200nm。
8.如权利要求4所述的筛选方法,其特征在于,步骤2)中,所述对APP蛋白进行定点荧光标记是通过基于密码子拓展的生物正交标记系统完成的,具体的合成方法包括如下步骤:
a)构建含琥珀抑制型tRNAlys CUA基因的质粒:
提取嗜热古细菌基因组DNA,通过PCR的方法扩增获得琥珀抑制型tRNAlys CUA的基因,并将其克隆至含有大肠杆菌谷氨酰胺-tRNA启动子的且带有卡那霉素抗性的表达质粒pAC123中;
其中,嗜热古细菌琥珀抑制型tRNAlys CUA的基因扩增引物为:
5’端上游引物序列:5’-GGAATTCCCGGCGGTAGTTCAG-3’,如SEQ ID No.1所示;
3’端下游引物序列:5’-AAACTGCAGTGGTCCGGC-3’,如SEQ ID No.2所示;
b)构建tRNApyrlysCUA-pyrlysRS体系,其中,步骤b)的具体操作包括步骤:
b1)以嗜热古细菌的lys氨酰tRNA合成酶基因为模板,针对lys-tRNA合成酶上参与催化氨基酸-tRNA合成的关键位点41A、268N,通过设计简并引物,以及反向PCR,获得pyrlysRS的突变质粒文库;
其中,PCR扩增中的兼并引物序列如下:
5’端上游引物序列:5’-aagtggtaaa nnncatttag ggc-3’,如SEQ ID No.3所示;
3’端下游引物序列:5’-atttgacagt tnnnagctat ga-3’,如SEQ ID No.4所示;
b2)步骤b1)的文库、与tRNAlysCUA基因同时转化至步骤a)大肠杆菌中,同时转入M1,Q107位点带有TGA琥珀突变的绿色荧光蛋白表达质粒pREP2-AKtRNACUA,该质粒含有氯霉素抗性;
获得的转化子同时接种在含有或不含0.5~1mM吡咯赖氨酸的GLMM平板上;通过3~4轮筛选过程,获得pyrlystRNAlysCUA-pyrlysRS体系;
c)将APP蛋白的突变基因克隆至pE-sumo表达质粒中:
APP蛋白的定点突变:选择BACE酶切位点附近的氨基酸644Tyr,将其密码子突变为琥珀型终止密码子TAG,APP含有644位酪氨酸琥珀突变基因序列如SEQ ID No.5所示:通过全基因合成方法获得,并通过BSaI/XbaI位点克隆至pE-sumo载体中;突变后氨基酸序列如SEQID No.6所示;
d)将步骤c)所得质粒转化至步骤b2)所构建的pyrlystRNACUA-pyrlysRS体系的大肠杆菌感受态细胞中;
f)对步骤d)的菌株进行诱导,收集,纯化,得到带有突变的APP蛋白。
9.如权利要求4所述的筛选方法,其特征在于,步骤2)中,所述对APP蛋白进行定点荧光标记的具体方法包括如下步骤:定点突变蛋白ACPK-APP蛋白与荧光分子,按照摩尔数1:1~1:10混合,反应体系为H2O与正叔醇的1:1混合物,其中加入催化剂以及抗氧化剂,室温下反应6-12hr,过滤除去不溶物,即得到荧光标记的APP蛋白。
10.如权利要求4所述的筛选方法,其特征在于,步骤3)中,所述带有荧光标记的APP蛋白与微胶束溶液以表面活性剂分子计算的摩尔比1:1~1:10;所述包裹的温度为25℃~37℃,时间为2~4hr。
11.如权利要求4所述的筛选方法,其特征在于,步骤4)中,筛选的方法为:根据荧光信号监测反应体系中的BACE活性,以筛选化合物。
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