CN108728397A - 对昆虫蛋白或昆虫表达系统表达的外源蛋白进行标记的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对昆虫来源的蛋白进行标记的方法。所述方法借助昆虫自身代谢通路将叠氮修饰的全乙酰化N‑乙酰氨基葡萄糖掺入至昆虫表达的蛋白的糖基，随后通过点击化学反应，将可检测标记物偶联至蛋白，从而实现对昆虫来源的蛋白的标记。所述方法可用于原位标记昆虫细胞或标记昆虫表达系统所表达的外源蛋白。

Description

对昆虫蛋白或昆虫表达系统表达的外源蛋白进行标记的方法
技术领域
本发明涉及通过生物正交反应对昆虫来源的蛋白进行标记的方法。该方法可实现昆虫细胞中的蛋白的原位标记，也可实现对昆虫杆状病毒表达系统所表达的外源蛋白进行标记。
背景技术
蛋白是细胞内最丰富的生物大分子，它几乎参与所有的生命过程。因此，对蛋白的结构、功能和相互作用的研究是生命科学领域的一项重要任务。在很多情况下，需要对蛋白进行标记来实现实时和/或定量的观测。目前最常用的标记蛋白的方法包括荧光蛋白(fluorescent protein)、放射性同位素以及通过化学反应将荧光基团非特异性地修饰至蛋白中的赖氨酸或酪氨酸。然而，这些方法往往操作复杂，还可能对蛋白的结构、功能和定位产生影响。针对传统方法的上述缺陷，近十几年来发展的生物正交反应为蛋白的标记或修饰提供了新的可能。
生物正交反应是指具有如下特征的化学反应：在生理条件下进行，不干扰同时发生的其它生化反应或各种生物内源过程，且不会对生物体及生物内源分子造成损伤。就借助生物正交反应实现蛋白标记而言，首先将生物正交反应基团引入蛋白，借助该正交反应基团与带有互补反应基团的标记物进行反应，将不同的标记物(例如荧光或免疫印迹标记物)偶联至蛋白，从而实现蛋白定位和功能的检测。目前最常用的生物正交反应基团对包括能够发生点击化学(Click Chemistry)反应的叠氮基-炔基以及叠氮基-三芳基膦。其中，叠氮基与三芳基膦发生的施陶丁格反应(Staudinger Ligation)或与炔基发生的环加成反应均能将与该生物正交反应基团对中的一个成员相连的蛋白偶联至与该生物正交反应基团对中的另一成员相连的可检测标记物，实现将可检测标记物修饰至蛋白的目的。其中，叠氮基团与高张力炔烃的环加成反应(Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC)因其不需要添加催化剂而成为研究和应用热点。
最近发展了借助生物糖代谢途径将化学探针引入蛋白的策略。其以化学生物学方法为切入点，通过对非天然糖进行设计，在蛋白的糖链中引入生物正交反应基团，并借助生理条件下的生物正交反应引入探针分子。该方法能够在分子水平上揭示糖蛋白的定位与功能。然而，这种方法多用于哺乳动物细胞蛋白的标记。目前还未有利用非天然糖的生物正交反应对昆虫细胞或昆虫表达系统表达的蛋白进行标记的报道。
昆虫杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector Systems，BEVS)是目前应用广泛的蛋白表达体系，具有效率高、周期短、成本低等优点。此外，宿主昆虫细胞能够以多种复杂方式对合成的蛋白进行翻译后修饰，表达的重组蛋白在细胞内被折叠、修饰、运输、组装成最终的功能蛋白。其中，蛋白N-糖基化修饰是昆虫杆状病毒表达系统的重要特征，这对很多蛋白的正确折叠和发挥生物功能具有重要意义。然而，目前对昆虫蛋白进行标记的方法极少。最近报道了通过对宿主细胞进行遗传工程操作，使得宿主细胞能够表达将带有生物正交基团的非天然氨基酸插入肽链的氨酰tRNA合成酶；进而对目的蛋白的编码序列进行改造，将特定位点的核苷酸序列突变为琥珀终止子(UAG)，从而将该非天然氨基酸插入到目标蛋白的该特定位点，由此实现利用该非天然氨基酸对目标蛋白进行标记。然而，该方法操作复杂，实施周期长，不利于推广。
因此，仍存在对用于昆虫细胞和昆虫杆状病毒表达系统表达的蛋白进行标记的简捷方法的需求。
发明内容
针对本领域的上述问题，一方面，本发明提供了一种对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的方法，所述方法包含如下步骤：
(i)在昆虫细胞培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液；
(ii)收集步骤(i)得到的细胞悬液，离心，得到所述细胞的沉淀；
(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀中的细胞进行固定；
(iv)向步骤(iii)的经固定的细胞中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白；
(v)对所述可检测标记物进行检测。
另一方面，本发明提供了一种对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记的方法，所述方法包含如下步骤：
(a)将昆虫细胞在培养基中培养至对数期，随后在新鲜培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，并加入杆状病毒进行培养得到昆虫细胞悬液，其中，所述杆状病毒的基因组携带表达所述目的蛋白的核酸序列；
(b)收集步骤(a)得到的昆虫细胞悬液，离心、过滤，收集上清液；
(c)对步骤(b)收集的上清液实施目的蛋白的纯化；
(d)向步骤(c)的经纯化的蛋白添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述蛋白；
(e)对所述可检测标记物进行检测。
又一方面，本发明提供了叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖用于对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的用途，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖被掺入至所述糖蛋白的糖基；并且其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖的叠氮基与炔基或三芳基膦的生物正交反应而实现对昆虫细胞中的糖蛋白的原位标记。
另一方面，本发明提供了叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖用于对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记的用途，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖被掺入至所述目的蛋白的糖基；并且其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖的叠氮基与炔基或三芳基膦的生物正交反应而实现对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白的标记。
附图说明
图1为根据实施例1，利用不同浓度的Ac4GlcNAz、DBCO-PEG4-biotin和FITC-链霉亲和素对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的荧光结果图。第一行显示FITC通道；第二行显示DAPI通道；第三行显示明场、FITC通道和DAPI通道叠加的图。
图2为根据比较例1，利用不同浓度的Ac4ManNAz、DBCO-PEG4-biotin和FITC-链霉亲和素对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的荧光结果图。第一行显示FITC通道；第二行显示DAPI通道；第三行显示明场、FITC通道和DAPI通道叠加的图。
图3为根据实施例2，利用Ac4GlcNAz、DBCO-PEG4-biotin和HRP-链霉亲和素对昆虫杆状病毒表达系统所表达的N8蛋白和N8-N3蛋白(即，掺入了非天然糖的N8蛋白)进行标记的免疫印迹结果。
具体实施方式
本发明通过糖生物代谢途径将非天然糖引入昆虫细胞和昆虫杆状病毒表达系统表达的蛋白的糖链中，随后利用叠氮基与炔基或三芳基膦的生物正交反应，在温和的生理条件下将可检测标记物偶联至昆虫来源的蛋白，实现对昆虫细胞表达的蛋白进行标记(例如对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记)或对昆虫杆状病毒表达系统表达的外源蛋白进行标记。本发明的方法无需改造宿主昆虫细胞或目的蛋白的氨基酸序列，具有操作简便、不影响外源蛋白的功能和结构以及表达量等优点，有助于实现对目的蛋白的快速、便捷标记。
不希望被理论所限地，本发明选取叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖来掺入蛋白的糖基是基于如下的考虑：在利用生物正交反应对哺乳动物细胞进行标记时，因为哺乳动物细胞表面以及其表达的外泌蛋白的糖链主要为末端唾液酸化的N-糖链，因此常使用经叠氮基修饰的全乙酰化N-乙酰氨基甘露糖(唾液酸的生物合成前体)进行标记。而昆虫杆状病毒系统表达的糖蛋白为高甘露糖型(Man9-5GlcNAc2)或寡甘露糖型(Man3-2GlcNAc2)糖蛋白，糖链末端极少带有唾液酸残基。考虑到上述糖基化过程的差异，因此，在对昆虫细胞或昆虫来源蛋白进行检测时，本发明采用叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，而非在哺乳动物标记中常见的连接有叠氮基的全乙酰化N-乙酰氨基甘露糖或全乙酰化N-乙酰氨基半乳糖。
本发明中的叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖的四个游离羟基全部被乙酰化，从而该非天然糖被转运过膜的效率较高。事实上，所述叠氮基可通过任意方式被连接至全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖的吡喃糖六元环中的任一个碳原子。通过使非天然糖的叠氮基与带有可检测标记物的炔基或三芳基膦进行生物正交反应，将可检测标记物(即，探针)偶联至昆虫来源的蛋白。
优选地，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖可为1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖(Ac4GlcNAz)，其结构如式(I)所示。Ac4GlcNAz的合成方法已为本领域所知晓，且可商购获得。
其中，所述Ac为乙酰基，所述N3为叠氮基团。
在本发明的方法中，叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖能够与连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物发生反应，从而将可检测标记物偶联至掺入蛋白糖基的非天然糖(即，叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖)。
本文所述的可检测标记物包括但不限于放射性同位素、发色团、抗体、化学发光化合物、光谱比色标记物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
本文所述的方法中使用的可检测标记物可以是一级标记物(其中，标记物包含可被直接测定的部分或产生可被直接测定的信号的部分)或二级标记物(其中，可检测标记物结合至另一试剂以产生可测定的信号)。可检测标记物可通过共价或非共价的手段连接至炔基/三芳基膦部分。例如，可检测标记物可直接连接至炔基/三芳基膦部分；或者，可检测标记物通过配体-受体结合对、生物素-亲和素(例如链霉亲和素或卵亲和素)配偶体对或其它的此类特异性识别分子来实现与炔基或三芳基膦部分的连接。
在一些实施方式中，可检测标记物可以是荧光化合物，如荧光染料分子或荧光团，包括但不限于：荧光素，例如6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)；罗丹明及其衍生物，例如N,N,N’,N’-四甲基-6羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)、罗丹明110、四罗丹明异硫氰酸酯(tetrarhodimine isothiocynate，TRITC)；青色素染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮等。
在一些实施方式中，可检测标记物可以是酶，用作标记物的酶可以产生例如化学发光信号、有色信号或荧光信号。用于可检测地标记抗体试剂的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异源性酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。优选，酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
在一些实施方式中，可检测标记物是化学发光化合物，包括但不限于：光泽精、鲁米诺、(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、异鲁米诺、咪唑、吖啶酯、吖啶酰胺、三联吡啶钌和草酸酯。
在一些实施方式中，可测定标记物可以是光谱比色标记物，包括但不限于：胶体金或者有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯和乳胶)珠。
在一些实施方式中，可检测标记物可以是放射性同位素，包括但不限于：3H、125I、35S、14C、32P和33P。
在一些实施方式中，可检测标记物包括可通过如下测定的任意标记物：光谱手段；光化学手段；生物化学手段；免疫化学手段；电磁手段；放射化学手段；或化学手段，例如荧光手段、化学荧光手段、或化学发光手段、或任何其它适当的手段。
在优选的实施方式中，可检测标记物经由生物素-亲和素配偶体对连接至炔基或三芳基膦，所述炔基或三芳基膦与叠氮基形成生物正交反应基团对。
优选地，所述连接有炔基的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述是直接或间接连接至炔基部分的可检测标记物。
优选地，所述连接有三芳基膦的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述是直接或间接连接至三芳基膦部分的可检测标记物。
上述化合物的合成方法均为本领域所知晓、或商购可得。
优选地，所述连接有炔基/三芳基膦的可检测标记物为通过含高张力炔烃的二苯并氮杂环辛烯-PEG4-生物素(Dibenzocyclooctyne-PEG4-biotin conjugate(DBCO-PEG4-biotin))与链霉亲和素-可检测标记物(即，连接有链霉亲和素的可检测标记物)缀合获得。所述二苯并氮杂环辛烯-PEG4-生物素的结构如式(II-7)所示：
上述全部化合物以及修饰有链霉亲和素的多种可检测标记物(放射性同位素、发色团、抗体、化学发光化合物、光谱比色标记物、荧光化合物、金属螯合物和酶)均可商购得到。
本发明的方法可实现对昆虫细胞内的糖蛋白的标记，并且还可用于对昆虫杆状病毒表达系统表达的外源蛋白进行标记。
一方面，本发明提供了一种对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的方法，所述方法包含如下步骤：
(i)在昆虫细胞培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液；
(ii)收集步骤(i)得到的细胞悬液，离心，得到所述细胞的沉淀；
(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀中的细胞进行固定；
(iv)向步骤(iii)的经固定的细胞中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白；
(v)对所述可检测标记物进行检测。
步骤(i)的昆虫细胞的接种浓度、培养条件、培养时间等均为本领域用于昆虫细胞培养的常规条件或参数。
优选地，步骤(i)的所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖为式(I)的化合物。优选地，所述式(I)的化合物以处于二甲亚砜(DMSO)中的溶液的形式提供。优选地，所述式(I)的化合物以终浓度150-250μM添加至昆虫细胞培养基。
优选地，步骤(ii)中，在所述离心后，利用含牛血清蛋白(BSA)的PBS溶液洗涤细胞的沉淀，洗去未被利用的非天然糖(即，叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖)。另外，所述离心为本领域的常规操作，本领域技术人员可以根据其掌握的本领域普通技术知识而针对不同的昆虫细胞选择适宜的离心转速等。
优选地，步骤(iii)中，利用多聚甲醛对所述细胞进行固定。进一步优选，在细胞固定后进行离心，得到细胞沉淀并用含牛血清蛋白的PBS溶液进行洗涤，洗去所述固定液。
优选地，步骤(iv)的所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物选自于由式(II-1)至式(II-6)的化合物所组成的组。优选地，所述连接有炔基的可检测标记物为由式(II-7)的化合物与链霉亲和素-可检测标记物缀合获得。优选地，所述式(II-7)的化合物和所述链霉亲和素-可检测标记物以PBS溶液的形式提供。可先将式(II-7)的化合物与链霉亲和素-可检测标记物缀合，再进行叠氮-炔环加成反应；或在叠氮-炔环加成反应后，将链霉亲和素-可检测标记物缀合至式(II-7)的化合物的生物素部分。
优选地，步骤(iv)中，首先向所述经固定的细胞添加所述式(II-7)的化合物的PBS溶液，孵育、离心并用含牛血清蛋白的PBS溶液洗涤细胞后加入所述链霉亲和素-可检测标记物。其中，所述离心为本领域的常规操作，本领域技术人员可以根据其掌握的本领域普通技术知识而针对不同的昆虫细胞选择适宜的离心转速等。
在优选的实施方式中，所述对昆虫细胞中的糖蛋白进行标记的方法包含如下步骤：
(1)在昆虫细胞培养基中添加式(I)的化合物，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液，其中，所述式(I)的化合物以二甲亚砜溶液的形式提供，添加至所述昆虫细胞培养基中的终浓度为150-250μM。
(2)收集步骤(1)得到的细胞悬液，离心，得到细胞沉淀，然后用含牛血清蛋白的PBS溶液洗涤所述细胞沉淀，洗去未被利用的式(I)的化合物；
(3)用多聚甲醛对步骤(2)获得的所述沉淀中的细胞进行重悬和固定，随后离心，得到细胞沉淀并用含牛血清蛋白的PBS溶液进行洗涤；
(4)向步骤(3)的经固定的细胞中添加式(II-7)化合物的PBS溶液，孵育、离心；
随后，用含牛血清蛋白的PBS溶液洗涤细胞，加入链霉亲和素-荧光化合物，从而将所述荧光化合物偶联至所述细胞内的糖蛋白；
(5)利用荧光显微镜成像进行检测。
不希望被理论所限地，在上述反应中，被掺入蛋白的叠氮基浓度决定了能够被结合的式(II-7)化合物和链霉亲和素-可检测标记物的量，因此，只要保证这两者的用量能够满足对叠氮基进行标记即可，而没有特别限制。优选地，所述式(II-7)化合物的用量大于10μM。优选地，所述链霉亲和素-可检测标记物的用量大于0.1g/mL。
另一方面，本发明提供了一种对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记的方法，所述方法包含如下步骤：
(a)将昆虫细胞在培养基中培养至对数期，随后在新鲜培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，并加入杆状病毒进行培养得到昆虫细胞悬液，其中，所述杆状病毒的基因组携带表达所述目的蛋白的核酸序列；
(b)收集步骤(a)得到的昆虫细胞悬液，离心、过滤，收集上清液；
(c)对步骤(b)收集的上清液实施目的蛋白的纯化；
(d)向步骤(c)的经纯化的蛋白添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述蛋白；
(e)对所述可检测标记物进行检测。
步骤(a)即为利用叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖实施的常规的培养昆虫杆状病毒表达系统的步骤。本领域熟知昆虫杆状病毒表达系统的操作方法和蛋白表达方案。例如，可采用Bac-to-杆状病毒表达系统。使用Bac-to-pFastBacTM载体的表达盒在DH10BacTME.coli感受态细胞中与亲代杆状病毒质粒重组形成杆状病毒表达质粒。然后，将该杆状病毒质粒转染进用于扩毒的昆虫细胞，产生重组杆状病毒颗粒，再进一步感染用于蛋白表达的昆虫细胞，从而能够在昆虫细胞中表达目的蛋白。该系统的构建、细胞培养和蛋白表达方案例如参见制造商的说明(https://tools.thermofisher.com/content/ sfs/manuals/bactobac_man.pdf)。
优选地，步骤(a)的昆虫细胞的培养基可为适用于相应的昆虫细胞培养的可商购或者可由本领域技术人员根据其掌握的本领域普通知识配制得到的任何培养基。另外，昆虫细胞的接种浓度、培养条件、培养时间等均为本领域用于昆虫细胞培养的常规条件或参数。
优选地，步骤(a)的所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖为式(I)的化合物。优选地，所述式(a)的化合物以二甲亚砜(DMSO)溶液的形式提供。优选地，所述式(a)的化合物以终浓度150-250μM添加至昆虫细胞培养基。
步骤(b)所述的离心过滤为本领域的常规操作，本领域技术人员可以根据其掌握的本领域普通技术知识而针对不同的昆虫细胞选择适宜的离心转速等。
优选地，步骤(c)中，所述目的蛋白的纯化通过镍柱亲和层析或分子筛纯化进行。
优选地，步骤(d)的所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物选自于由式(II-1)至式(II-6)的化合物所组成的组。优选地，所述连接有炔基的可检测标记物为由式(II-7)的化合物与链霉亲和素-可检测标记物缀合获得。优选地，所述式(II-7)的化合物和所述链霉亲和素-可检测标记物以PBS溶液的形式提供。可先将式(II-7)的化合物与链霉亲和素-可检测标记物缀合，再进行叠氮-炔环加成反应；或在叠氮-炔环加成反应后，将链霉亲和素-可检测标记物缀合至式(II-7)的化合物的生物素部分。
在优选的实施方式中，所述对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记的方法包含如下步骤：
(a’)将昆虫细胞在培养基中培养至对数期，随后在新鲜培养基中添加式(I)的化合物，并加入杆状病毒进行培养得到昆虫细胞悬液，其中，所述杆状病毒的基因组携带表达所述目的蛋白的核酸序列；其中，所述式(I)的化合物以二甲亚砜溶液的形式提供，添加至所述昆虫细胞培养基中的终浓度为150-250μM；
(b’)收集步骤(a’)得到的昆虫细胞悬液，离心、过滤，收集上清液；
(c’)对步骤(b’)收集的上清液进行镍柱亲和层析，从而纯化所述目的蛋白；
(d’)向步骤(c’)的经纯化的蛋白添加式(II-7)化合物的PBS溶液，进行SDS-PAGE，转膜(例如PVDF膜等)并经牛血清蛋白封闭后，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶，从而将所述辣根过氧化物酶偶联至所述蛋白；
(e’)加入辣根过氧化物酶显色底物，实施免疫印迹检测。
不希望被理论所限地，在上述反应中，被掺入蛋白的叠氮基浓度决定了能够被结合的式(II-7)化合物和链霉亲和素-可检测标记物的量，因此，只要保证这两者的用量能够满足对叠氮基进行标记即可，而没有特别限制。优选地，所述式(II-7)化合物的用量大于10μM。优选地，所述链霉亲和素-可检测标记物的用量大于0.1g/mL。
不希望被理论所限地，上述步骤(d’)中，除了向经纯化的蛋白添加式(II-7)化合物的PBS溶液外，与一般的western blot方法并无差别。本领域技术人员可根据其知晓的常规方法实施SDS-PAGE、转膜(例如PVDF膜等)并经牛血清蛋白封闭的步骤。
本文涉及的PBS缓冲液为本领域所熟知的，其中的溶剂为水，溶质为NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl，所述溶质NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0.24g/L、1.42g/L、0.2g/L及8.0g/L；所述PBS缓冲液的pH值为约7.4。
在本文中，提到的“含牛血清蛋白的PBS溶液”中牛血清白蛋白(BSA)的浓度并无特别的限制，可由本领域技术人员根据实际需要而进行调整。例如，本文涉及的含BSA的PBS缓冲液为本领域常用的缓冲液，一般而言BSA的浓度为约1wt％，然而也可采用其它的浓度。
本文涉及的昆虫细胞培养基为本领域所熟知的，可为适用于相应的昆虫细胞培养的可商购或者可由本领域技术人员根据其掌握的本领域普通知识配制得到的任何培养基，例如为购自Lonza的Insect-Xpress medium。
本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：
1.一种对昆虫细胞中糖蛋白进行原位标记的方法，所述方法包含如下步骤：
(i)在昆虫细胞培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液；
(ii)收集步骤(i)得到的细胞悬液，离心，得到所述细胞的沉淀；
(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀中的细胞进行固定；
(iv)向步骤(iii)的经固定的细胞中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白；
(v)对所述可检测标记物进行检测。
2.如段落1所述的方法，其中，步骤(i)中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖为1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖。
3.如段落1或2所述的方法，其中，步骤(iv)中，所述连接有炔基的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述连接有三芳基膦的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述是直接或间接连接至炔基部分或三芳基膦部分的可检测标记物。
4.如段落1-3所述中任一项所述的方法，其中，步骤(iv)中，所述可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：放射性同位素、发色团、抗体、化学发光化合物、光谱比色标记物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
5.如段落4所述的方法，其中，所述放射性同位素选自于由如下物质所组成的组：
3H、125I、35S、14C、32P和33P。
6.如段落4所述的方法，其中，所述荧光化合物选自于由如下物质所组成的组：
荧光素，例如6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、异硫氰酸荧光素)；罗丹明及其衍生物，例如N,N,N’,N’-四甲基-6羧基罗丹明、6-羧基-X-罗丹明、5-羧基罗丹明-6G、6-羧基罗丹明-6G、罗丹明110、四罗丹明异硫氰酸酯；青色素染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮等。
7.如段落4所述的方法，其中，所述酶选自于萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶。
8.如段落4所述的方法，其中，所述酶选自于由如下物质所组成的组：
苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异源性酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
9.如段落4所述的方法，其中，所述化学发光化合物选自于由如下物质所组成的组：
光泽精、鲁米诺、(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、异鲁米诺、咪唑、吖啶酯、吖啶酰胺、三联吡啶钌和草酸酯。
10.如段落4所述的方法，其中，所述光谱比色标记物选自于由如下物质所组成的组：
胶体金或者有色玻璃或塑料珠。
11.如段落4所述的方法，其中，所述可检测标记物直接连接至炔基部分或三芳基膦部分，从而形成所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
12.如段落4所述的方法，其中，所述可检测标记物经由配体-受体结合对或生物素-亲和素配偶体对连接至炔基部分或三芳基膦部分，从而形成所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
13.如段落12所述的方法，其中，所述生物素-亲和素配偶体对中的亲和素为链霉亲和素或卵亲和素。
14.如段落13所述的方法，其中，在进行步骤(iv)之前，将生物素-炔基部分或生物素-三芳基膦部分与链霉亲和素-可检测标记物偶联，形成所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
15.如段落13所述的方法，其中，在进行步骤(iv)时，向步骤(iii)的经固定的细胞中添加生物素-炔基部分或生物素-三芳基膦部分，随后添加链霉亲和素-可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白。
16.如段落14或15所述的方法，其中，所述生物素-炔基部分为二苯并氮杂环辛烯-PEG4-生物素。
17.如段落1-16中任一项所述的方法，其中，步骤(ii)中，在所述离心后，利用含牛血清蛋白的PBS溶液洗涤细胞的沉淀。
18.如段落1-17中任一项所述的方法，其中，步骤(iii)中，利用多聚甲醛对所述细胞进行固定，在细胞固定后离心，得到细胞沉淀并用含牛血清蛋白的PBS溶液洗涤进行洗涤。
19.如段落2-18中任一项所述的方法，其中，步骤(i)中，所述1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖以终浓度150-250μM添加至昆虫细胞培养基。
20.如段落1-19中任一项所述的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)在昆虫细胞培养基中添加1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液，其中，所述1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖以二甲亚砜溶液的形式提供，添加至所述昆虫细胞培养基中的终浓度为150-250μM；
(2)收集步骤(1)得到的细胞悬液，离心，得到细胞沉淀，然后用含牛血清蛋白的PBS溶液洗涤所述细胞沉淀，洗去未被利用的式(I)的化合物；
(3)用多聚甲醛对步骤(2)获得的所述沉淀中的细胞进行重悬和固定，随后离心，得到细胞沉淀并用含牛血清蛋白的PBS溶液进行洗涤；
(4)向步骤(3)的经固定的细胞中添加二苯并氮杂环辛烯-PEG4-生物素的PBS溶液，孵育、离心；
随后，用含牛血清蛋白的PBS溶液洗涤细胞，加入链霉亲和素-荧光化合物，从而将所述荧光化合物偶联至所述细胞内的糖蛋白；
(5)利用荧光显微镜成像进行检测。
21.一种对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记的方法，所述方法包含如下步骤：
(a)将昆虫细胞在培养基中培养至对数期，随后在新鲜培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，并加入杆状病毒进行培养得到昆虫细胞悬液，其中，所述杆状病毒的基因组携带表达所述目的蛋白的核酸序列；
(b)收集步骤(a)得到的昆虫细胞悬液，离心、过滤，收集上清液；
(c)对步骤(b)收集的上清液实施目的蛋白的纯化；
(d)向步骤(c)的经纯化的蛋白添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述蛋白；
(e)对所述可检测标记物进行检测。
22.如段落21所述的方法，其中，步骤(a)中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖为1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖。
23.如段落21或22所述的方法，其中，步骤(d)中，所述连接有炔基的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述连接有三芳基膦的可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：
其中，所述是直接或间接连接至炔基或三芳基膦部分的可检测标记物。
24.如段落21-23所述中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中，所述可检测标记物选自于由如下物质所组成的组：放射性同位素、、发色团、抗体、化学发光化合物、光谱比色标记物、荧光化合物、金属螯合物和酶。
25.如段落24所述的方法，其中，所述放射性同位素选自于由如下物质所组成的组：
3H、125I、35S、14C、32P和33P。
26.如段落24所述的方法，其中，所述荧光化合物选自于由如下物质所组成的组：
荧光素，例如6-羧基荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、异硫氰酸荧光素)；罗丹明及其衍生物，例如N,N,N’,N’-四甲基-6羧基罗丹明、6-羧基-X-罗丹明、5-羧基罗丹明-6G、6-羧基罗丹明-6G、罗丹明110、四罗丹明异硫氰酸酯；青色素染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮等。
27.如段落24所述的方法，其中，所述酶选自于萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶。
28.如段落24所述的方法，其中，所述酶选自于由如下物质所组成的组：
苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异源性酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
29.如段落24所述的方法，其中，所述化学发光化合物选自于由如下物质所组成的组：
光泽精、鲁米诺、(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、异鲁米诺、咪唑、吖啶酯、吖啶酰胺、三联吡啶钌和草酸酯。
30.如段落24所述的方法，其中，所述光谱比色标记物选自于由如下物质所组成的组：
胶体金或者有色玻璃或塑料珠。
31.如段落24所述的方法，其中，所述可检测标记物直接连接至炔基部分或三芳基膦部分，从而形成所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
32.如段落24所述的方法，其中，所述可检测标记物经由配体-受体结合对或生物素-亲和素配偶体对连接至炔基部分或三芳基膦部分，从而形成所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
33.如段落32所述的方法，其中，所述生物素-亲和素配偶体对中的亲和素为链霉亲和素或卵亲和素。
34.如段落33所述的方法，其中，在进行步骤(d)之前，将生物素-炔基部分或生物素-三芳基膦部分与链霉亲和素-可检测标记物偶联，形成所述连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。
35.如段落33所述的方法，其中，在进行步骤(d)时，向步骤(c)的经固定的细胞中添加生物素-炔基部分或生物素-三芳基膦部分，随后添加链霉亲和素-可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白。
36.如段落34或35所述的方法，其中，所述生物素-炔基部分为二苯并氮杂环辛烯-PEG4-生物素。
37.如段落22-36中任一项所述的方法，其中，步骤(a)中，所述1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖以终浓度150-250μM添加至昆虫细胞培养基。
38.如段落21-37中任一项所述的方法，其中，步骤(c)中，所述目的蛋白的纯化通过镍柱亲和层析进行。
39.如段落21-38中任一项所述的方法，所述方法包含如下步骤：
(a’)将昆虫细胞在培养基中培养至对数期，随后在新鲜培养基中添加1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖，并加入杆状病毒进行培养得到昆虫细胞悬液，其中，所述杆状病毒的基因组携带表达所述目的蛋白的核酸序列；其中，所述1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖以二甲亚砜溶液的形式提供，添加至所述昆虫细胞培养基中的终浓度为150-250μM；
(b’)收集步骤(a’)得到的昆虫细胞悬液，离心、过滤，收集上清液；
(c’)对步骤(b’)收集的上清液进行镍柱亲和层析，从而纯化所述目的蛋白；
(d’)向步骤(c’)的经纯化的蛋白添加二苯并氮杂环辛烯-PEG4-生物素的PBS溶液，进行SDS-PAGE，转膜并经牛血清蛋白封闭后，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶，从而将所述辣根过氧化物酶偶联至所述蛋白；
(e’)加入辣根过氧化物酶显色底物，实施免疫印迹检测。
40.如段落39所述的方法，其中，步骤(e’)中，所述辣根过氧化物酶显色底物选自于由如下的化合物所组成的组：
3,3,5,5-四甲基联苯胺、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐、邻苯二胺、4-氯乙萘酚；10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪或试卤灵。
41.叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖在对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记方面的用途，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖被掺入至所述糖蛋白的糖基；并且其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖的叠氮基与炔基或三芳基膦的生物正交反应而实现对昆虫细胞中的糖蛋白的原位标记。
42.叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖在对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记方面的用途，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖被掺入至所述目的蛋白的糖基；并且其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖的叠氮基与炔基或三芳基膦的生物正交反应而实现对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白的标记。
43.如段落41或42所述的用途，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖为1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖。
实施例
下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试剂
昆虫细胞培养基：Insect-Xpress medium，购自Lonza。
PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)：溶剂为水，溶质为NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl，所述溶质NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0.24g/L、1.42g/L、0.2g/L和8.0g/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.4。
TBST缓冲液(10mM，pH 7.4)：溶剂为水，溶质为Tris、KCl、NaCl和吐温20，所述溶质Tris、KCl、NaCl和吐温20在所述TBST缓冲液中的浓度分别为3g/L、0.2g/L、8.0g/L和0.5ml/L；所述TBST缓冲液的pH值为7.4。
结合缓冲液(pH 8.0)：溶剂为水，溶质为Tris、NaCl。所述溶质Tris和NaCl在所述结合缓冲液中的浓度分别为2.4g/L，2.9g/L；所述结合缓冲液的pH值为8.0。
洗脱缓冲液1(pH 8.0)：溶剂为水，溶质为Tris、NaCl、咪唑。所述溶质Tris、NaCl和咪唑在所述洗脱缓冲液1中的浓度分别为2.4g/L、2.9g/L和2.0g/L；所述洗脱缓冲液1的pH值为8.0。
洗脱缓冲液2(pH 8.0)：溶剂为水，溶质为Tris、NaCl、咪唑。所述溶质Tris、NaCl和咪唑在所述洗脱缓冲液2中的浓度分别为2.4g/L、2.9g/L和20.1g/L；所述洗脱缓冲液2的pH值为8.0。
洗脱缓冲液3(pH 8.0)：溶剂为水，溶质为Tris、NaCl、咪唑。所述溶质Tris、NaCl和咪唑在所述洗脱缓冲液3中的浓度分别为2.4g/L、2.9g/L和68.1g/L；所述洗脱缓冲液3的pH值为8.0。
1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖(Ac4GlcNAz)和1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基甘露糖(Ac4ManNAz)购自sigma aldrich，CAS No.分别为A7355和A7605，预先溶解于二甲亚砜(DMSO)中。
二苯并氮杂环辛烯-PEG4-生物素(DBCO-PEG4-biotin)购自sigma aldrich，CASNo.为1255942-07-4。
FITC-链霉亲和素购自北京华奥正生科技有限公司，CAS No.为SF068。
4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，CASNo.为28718-90-3。
链霉亲和素-辣根过氧化物酶购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
实施例1利用Ac4GlcNAz、DBCO-PEG4-biotin和FITC-链霉亲和素标记昆虫细胞中的糖蛋白
(i)向处于5个125mL培养瓶中的昆虫细胞培养基中以0mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM和0.4mM的终浓度添加Ac4GlcNAz的DMSO溶液，将SF9细胞(购自武汉翰林博生物技术有限公司)以2×105细胞/mL的浓度接种至该培养基中。使细胞以120rpm/min、27℃摇瓶培养72小时得到细胞悬液，从而使得非天然糖Ac4GlcNAz代谢整合入细胞中。
(ii)分别收集步骤(i)得到的细胞悬液，1000rpm下离心10分钟，去除上清获得细胞沉淀。用含1wt％牛血清白蛋白的PBS溶液将该细胞沉淀洗涤两次，1000rpm下离心10min，以移除未被利用的Ac4GlcNAz，获得待处理的细胞。
(iii)用4v/v％的多聚甲醛对步骤(ii)获得的所述待处理的细胞进行重悬并在常温下固定1小时，随后1000rpm下离心10min，用含1wt％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液洗涤两次，以洗去所述固定液。
(iv)将步骤(iii)的经固定的细胞在DBCO-PEG4-biotin的PBS溶液(含1wt％BSA)中重悬，其中，DBCO-PEG4-biotin在PBS溶液中的终浓度为20μM。在室温下震荡1h，使得被引入蛋白糖基的叠氮基团与DBCO-PEG4-biotin发生SPAAC反应。1000rpm下离心10min，用含1wt％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤两次。用浓度为1mg/L的FITC-链霉亲和素的PBS溶液(含1wt％BSA)重悬细胞，在室温下震荡30分钟，通过链霉亲和素与生物素之间的亲和作用使FITC-链霉亲和素标记到细胞表面，然后1000rpm下离心10min，用PBS溶液(含1％BSA)洗涤两次。
为便于观测，利用DAPI在室温下染色10min标记细胞核，1000rpm离心10min，PBS(含1％BSA)洗涤两次。
(v)将细胞用抗荧光淬灭封片剂(购买自翊胜生物)重悬，取5μL滴于载玻片上，盖上盖玻片后用滤纸条吸去多余的液体，用指甲油封好盖玻片，将制好的样本用荧光共聚焦显微镜观察。FITC通道的激发波长和发射波长分别为488nm和525nm。DAPI通道的激发波长和发射波长分别为358nm和461nm。
结果如图1所示。根据实施例1的方法使得细胞被整体标记上绿色荧光。在Ac4GlcNAz的浓度为0-200μM范围内，荧光强度随非天然糖浓度的升高而增大。Ac4GlcNAz的浓度超过200μM后荧光强度改变不明显。该结果表明，可用本发明的方法标记昆虫细胞中的糖蛋白，且本实施例使用的Ac4GlcNAz的最佳浓度约为200μM。
比较例1利用Ac4ManNAz、DBCO-PEG4-biotin和FITC-链霉亲和素标记昆虫细胞中的糖蛋白
如上所述，哺乳动物中常用叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基甘露糖作为非天然糖进行标记。在本例中，用1,3,5,6-四-O-乙酰基-N-叠氮乙酰氨基甘露糖(Ac4ManNAz)代替Ac4GlcNAz，利用与实施例1相同的步骤进行昆虫细胞中糖蛋白的标记。Ac4ManNAz的结构如式(III)所示。
利用Ac4ManNAz标记的结果如图2所示。可以看出，即便Ac4ManNAz的浓度高达0.4mM，仍难以实现对昆虫细胞中的糖蛋白的有效标记。
实施例2昆虫杆状病毒系统表达的N8蛋白的标记
(a)准备两瓶各600mL、在HF培养基中悬浮培养至对数生长期、密度约1.5-2.5×106个细胞/ml的High five细胞(购自武汉翰林博生物技术有限公司)的液体培养物。在50ml新鲜的HF培养基中加入非天然糖Ac4GlcNAz的DMSO溶液，使得非天然糖的终浓度为200μM，用0.22μM滤膜过滤除菌。对照为不加Ac4GlcNAz的HF培养基。将添加或不添加Ac4GlcNAz的HF培养基分别加入上述High five细胞的液体培养物中，并分别加入准备好的杆状病毒，27℃、120rpm摇床培养。该杆状病毒采用Bac-to-表达系统，根据thermofisher提供的制造商的说明构建，其基因组携带能够表达带有histag的N8蛋白(PDB序列号为2HT5)的基因。
(b)镜检，在昆虫细胞死亡率约50％时收集细胞昆虫细胞悬液，将收集的细胞悬液倒入离心桶，6500rpm下离心60min，收集上清并经0.22μm滤膜抽滤，得到抽滤后的上清液，其中，所述抽滤后的上清液包含目的蛋白。
(c)用HisTrap(镍柱)亲和层析对所述抽滤后的上清液进行蛋白纯化。对于HisTrap预装柱或散装His beads，使用前先用去离子水把柱子中的乙醇洗掉，再用结合缓冲液平衡。使得抽滤后的N8蛋白上清液流过HisTrap，利用蠕动泵将流速控制为2ml/min，使蛋白结合到HisTrap上。随后，用结合缓冲液洗涤50ml以上，除去杂蛋白；再用洗脱缓冲液1洗涤约50ml进一步除去杂蛋白，然后用洗脱缓冲液2洗脱得到目的蛋白(N8蛋白)。最后用洗脱缓冲液3洗涤约50ml，除去镍柱中剩余的杂蛋白。
在40μL蛋白洗脱液中加入10μL 5×蛋白上样缓冲液，混匀，煮沸5分钟待上样用。制备10％的分离胶和5％的浓缩胶，待浓缩胶聚合后，加入1×电泳缓冲液，小心拔出梳子，并用缓冲液清洗上样孔，用加样器缓慢上样。电泳时，首先将电压调整至80V，当样品进入分离胶后，调整电压至120V继续电泳。当溴酚蓝到达底部时结束电泳。电泳结束取出凝胶，用考马斯亮蓝溶液染色。
收集含有目的蛋白的洗脱液，其中含有N8蛋白和整合了非天然糖的N8(N8-N3)蛋白。
(d)向步骤(c)的经纯化的N8蛋白和N8-N3蛋白添加DBCO-PEG4-biotin的PBS溶液，使DBCO-PEG4-biotin的浓度为100μM，27℃下孵育1小时。作为空白对照，向步骤(c)的经纯化的N8蛋白和N8-N3蛋白添加PBS缓冲液。
(e)分别取上述四种样品各40μL，加入10μL上样缓冲液，沸水煮5分钟，然后按与上述相同的步骤进行电泳。电泳完成后，根据目的蛋白的位置对凝胶进行切割，裁剪合适尺寸的滤纸和PVDF膜。将凝胶和滤纸放入转膜缓冲液中进行平衡，PVDF膜先用甲醇处理2min后再放入转膜缓冲液中平衡；从正极到负极的顺序依次为三层滤纸、PVDF膜、胶和三层滤纸，安装转移装置，小心除去气泡；接通电源，100V恒压转移70min；转移结束后，将PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭2小时，将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素用5％脱脂奶粉稀释并添加至PVDF膜，室温孵育1小时，随后用1×TBST缓冲液漂洗三次；进行显影，用纸巾小心吸干PVDF膜上的液体，与胶接触的一面朝上放在保鲜膜上，将A、B发光液(DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒，购自Leagene)按1：1比例混合后均匀加于PVDF膜上，反应1分钟后吸去反应液，进行曝光。
电泳方案和各缓冲液请参见《分子克隆实验指南(第三版)》，科学出版社2002，黄培堂等译。
结果如图3所示。三个对照样品没有或基本没有出现条带，而以昆虫表达系统表达的N8-N3蛋白样品加样的泳道则出现条带。这一数据证明可以通过上述方法方便地对昆虫杆状病毒系统表达的外源蛋白进行标记。

Claims (4)

1.一种对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的方法，所述方法包含如下步骤：
(i)在昆虫细胞培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液；
(ii)收集步骤(i)得到的细胞悬液，离心，得到所述细胞的沉淀；
(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀中的细胞进行固定；
(iv)向步骤(iii)的经固定的细胞中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白；
(v)对所述可检测标记物进行检测。
2.一种对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记的方法，所述方法包含如下步骤：
(a)将昆虫细胞在培养基中培养至对数期，随后在新鲜培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，并加入杆状病毒进行培养得到昆虫细胞悬液，其中，所述杆状病毒的基因组携带表达所述目的蛋白的核酸序列；
(b)收集步骤(a)得到的昆虫细胞悬液，离心、过滤，收集上清液；
(c)对步骤(b)收集的上清液实施目的蛋白的纯化；
(d)向步骤(c)的经纯化的蛋白添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述蛋白；
(e)对所述可检测标记物进行检测。
3.叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖用于对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的用途，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖被掺入至所述糖蛋白的糖基；并且其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖的叠氮基与炔基或三芳基膦的生物正交反应而实现对昆虫细胞中的糖蛋白的原位标记。
4.叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖用于对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记的用途，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖被掺入至所述目的蛋白的糖基；并且其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖的叠氮基与炔基或三芳基膦的生物正交反应而实现对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白的标记。
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