JPH0643159A - 固定化ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法 - Google Patents
固定化ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法Info
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- JPH0643159A JPH0643159A JP4920591A JP4920591A JPH0643159A JP H0643159 A JPH0643159 A JP H0643159A JP 4920591 A JP4920591 A JP 4920591A JP 4920591 A JP4920591 A JP 4920591A JP H0643159 A JPH0643159 A JP H0643159A
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片
の測定法において、測定感度および信頼性の向上を計
る。 【構成】 （１）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡと
（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡと相同な塩基配列を
有するＤＮＡまたはＲＮＡを担体に結合させた固定化試
薬を、（３）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩
基配列を有する蛍光標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプロ
ーブと競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形
成させ、２本鎖形成前の蛍光偏光度と２本鎖形成後の蛍
光偏光度との変化を測定して、検体中のＤＮＡまたはＲ
ＮＡに存在する該ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対応す
る塩基配列を測定する。 【効果】 測定対象と相補的な塩基配列を含む蛍光標
識されたＤＮＡまたはＲＮＡと固定化ＤＮＡまたはＲＮ
Ａとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大き
いため、蛍光偏光度の変化が大きくなり、測定感度およ
び信頼性が向上する。
の測定法において、測定感度および信頼性の向上を計
る。 【構成】 （１）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡと
（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡと相同な塩基配列を
有するＤＮＡまたはＲＮＡを担体に結合させた固定化試
薬を、（３）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩
基配列を有する蛍光標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプロ
ーブと競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形
成させ、２本鎖形成前の蛍光偏光度と２本鎖形成後の蛍
光偏光度との変化を測定して、検体中のＤＮＡまたはＲ
ＮＡに存在する該ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対応す
る塩基配列を測定する。 【効果】 測定対象と相補的な塩基配列を含む蛍光標
識されたＤＮＡまたはＲＮＡと固定化ＤＮＡまたはＲＮ
Ａとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大き
いため、蛍光偏光度の変化が大きくなり、測定感度およ
び信頼性が向上する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、蛍光偏光法によるＤＮ
ＡまたはＲＮＡ断片の測定方法に関する。
ＡまたはＲＮＡ断片の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断
片の測定法においては、測定のための試薬として、蛍光
標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡまた
はＲＮＡおよび測定対象に対して相補的な塩基配列を含
むＤＮＡまたはＲＮＡを用いる競合方法がある（特開昭
２−７５９５８号公報参照）。この方法においては、蛍
光標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡま
たはＲＮＡ（蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）、測
定対象に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲ
ＮＡ（相補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）および測定対象
ＤＮＡまたはＲＮＡを混合させ、蛍光標識ＤＮＡまたは
ＲＮＡと相補ＤＮＡまたはＲＮＡとが、相補的に結合す
る際の蛍光偏光度の変化を測定することにより、測定対
象ＤＮＡまたはＲＮＡを測定する。（図２参照）
片の測定法においては、測定のための試薬として、蛍光
標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡまた
はＲＮＡおよび測定対象に対して相補的な塩基配列を含
むＤＮＡまたはＲＮＡを用いる競合方法がある（特開昭
２−７５９５８号公報参照）。この方法においては、蛍
光標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡま
たはＲＮＡ（蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）、測
定対象に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲ
ＮＡ（相補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）および測定対象
ＤＮＡまたはＲＮＡを混合させ、蛍光標識ＤＮＡまたは
ＲＮＡと相補ＤＮＡまたはＲＮＡとが、相補的に結合す
る際の蛍光偏光度の変化を測定することにより、測定対
象ＤＮＡまたはＲＮＡを測定する。（図２参照）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】この方法では、蛍光偏
光度の変化は、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡが相補ＤＮ
ＡまたはＲＮＡと結合する際の実効的な分子量の変化に
対応している。したがって、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮ
Ａと相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に大きな差がない
場合には、蛍光偏光度の変化は小さい。そのために、こ
の測定法の感度および信頼性は低いものとなる。この問
題を解決するためには蛍光偏光度の変化を大きくすれば
よいが、このためには相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量
を蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して充分に
大きくする必要がある。すなわち、相補ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを長鎖にする必要がある。しかし、このような相補
ＤＮＡまたはＲＮＡを準備することは、通常、困難であ
る。
光度の変化は、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡが相補ＤＮ
ＡまたはＲＮＡと結合する際の実効的な分子量の変化に
対応している。したがって、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮ
Ａと相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に大きな差がない
場合には、蛍光偏光度の変化は小さい。そのために、こ
の測定法の感度および信頼性は低いものとなる。この問
題を解決するためには蛍光偏光度の変化を大きくすれば
よいが、このためには相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量
を蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して充分に
大きくする必要がある。すなわち、相補ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを長鎖にする必要がある。しかし、このような相補
ＤＮＡまたはＲＮＡを準備することは、通常、困難であ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）検体中
のＤＮＡまたはＲＮＡおよび（２）検体中のＤＮＡまた
はＲＮＡと相同な塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ
を固定化担体に結合させた固定化試薬を、（３）検体中
のＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を有する蛍光
標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブと競合反応させ
て、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成させ、２本鎖形成
前の蛍光偏光度と２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を
測定して、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する該Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡプローブに相補的に対応する塩基配列
を測定することを特徴とする固定化ＤＮＡまたはＲＮＡ
を用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法である。
のＤＮＡまたはＲＮＡおよび（２）検体中のＤＮＡまた
はＲＮＡと相同な塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ
を固定化担体に結合させた固定化試薬を、（３）検体中
のＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を有する蛍光
標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブと競合反応させ
て、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成させ、２本鎖形成
前の蛍光偏光度と２本鎖形成後の蛍光偏光度との変化を
測定して、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する該Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡプローブに相補的に対応する塩基配列
を測定することを特徴とする固定化ＤＮＡまたはＲＮＡ
を用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法である。
【０００５】本発明における（１）検体中のＤＮＡまた
はＲＮＡとは、例えば血清、尿、各種培養液などの測定
検体のおける細菌、ウイルスなどのＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、また組織細胞やそれらの遊離ＤＮＡまたはＲＮＡな
どがある。
はＲＮＡとは、例えば血清、尿、各種培養液などの測定
検体のおける細菌、ウイルスなどのＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、また組織細胞やそれらの遊離ＤＮＡまたはＲＮＡな
どがある。
【０００６】本発明における（２）検体中のＤＮＡまた
はＲＮＡと相同な塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ
を担体に結合させた固定化試薬（以下、固定化ＤＮＡま
たはＲＮＡと呼ぶ）とは、固定化担体に測定対象と同一
の塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化すること
により用意される。固定化担体としては、ポリスチレ
ン、ナイロンなどの合成樹脂のビーズ、ラテックス粒
子、ガラスビーズやＡｕ，Ａｇなどの金属微粒子などを
用いることができる。またタンパク質などの高分子物質
を用いることもできる。本発明の固定化担体の分子量
は、上述の蛍光偏光法の原理に基づき、相補ＤＮＡまた
はＲＮＡの分子量が蛍光標識された相補ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの分子量に対して充分に大きくなるように選択され
る。固定化担体の分子量は蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ
の分子量より５倍以上であることが好ましい。粒子など
の固定化担体の分子量は、厳密には定義できないが、こ
の場合には粒子の担体１個の平均質量にアボガドロ数を
かけたものと定義する。また、担体の形状は必ずしも球
状でなくてもよく、線状や板状でもよい。
はＲＮＡと相同な塩基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ
を担体に結合させた固定化試薬（以下、固定化ＤＮＡま
たはＲＮＡと呼ぶ）とは、固定化担体に測定対象と同一
の塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化すること
により用意される。固定化担体としては、ポリスチレ
ン、ナイロンなどの合成樹脂のビーズ、ラテックス粒
子、ガラスビーズやＡｕ，Ａｇなどの金属微粒子などを
用いることができる。またタンパク質などの高分子物質
を用いることもできる。本発明の固定化担体の分子量
は、上述の蛍光偏光法の原理に基づき、相補ＤＮＡまた
はＲＮＡの分子量が蛍光標識された相補ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの分子量に対して充分に大きくなるように選択され
る。固定化担体の分子量は蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ
の分子量より５倍以上であることが好ましい。粒子など
の固定化担体の分子量は、厳密には定義できないが、こ
の場合には粒子の担体１個の平均質量にアボガドロ数を
かけたものと定義する。また、担体の形状は必ずしも球
状でなくてもよく、線状や板状でもよい。
【０００７】例えば、粒径１５ｎｍの銀微粒子は、分子
量に換算するとおよそ１×１０7 の物質であり、例えば
３００塩基対を有する測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの分
子量（約９万）に対して約１００倍である。したがっ
て、この測定対象と過不足なく相補的な塩基配列をもつ
蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡと上記担体を用いた固
定化ＤＮＡまたはＲＮＡが相補的に結合した場合、実効
的な分子量変化は、約１００倍である。これは蛍光偏光
法によって測定を行う場合に充分な値である。
量に換算するとおよそ１×１０7 の物質であり、例えば
３００塩基対を有する測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの分
子量（約９万）に対して約１００倍である。したがっ
て、この測定対象と過不足なく相補的な塩基配列をもつ
蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡと上記担体を用いた固
定化ＤＮＡまたはＲＮＡが相補的に結合した場合、実効
的な分子量変化は、約１００倍である。これは蛍光偏光
法によって測定を行う場合に充分な値である。
【０００８】ＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合す
る方法としては、吸着法、共有結合法やアビジンとビオ
チンとの特異的結合を利用する方法などがある。
る方法としては、吸着法、共有結合法やアビジンとビオ
チンとの特異的結合を利用する方法などがある。
【０００９】本発明の（３）検体中のＤＮＡまたはＲＮ
Ａと相補的な塩基配列を有する蛍光標識されたＤＮＡま
たはＲＮＡプローブとは、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡ
の測定対象となる塩基配列と相補的な塩基配列を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡに、蛍光物質を標識したＤＮＡまた
はＲＮＡ（以下、蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼
ぶ）である。蛍光物質としては、例えばフルオレセイン
イソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオ
シアネートなどがある。相補ＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光
物質を結合する方法としては、例えばチオカルバミド結
合やペプチド結合などの共有結合によるものがある。
Ａと相補的な塩基配列を有する蛍光標識されたＤＮＡま
たはＲＮＡプローブとは、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡ
の測定対象となる塩基配列と相補的な塩基配列を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡに、蛍光物質を標識したＤＮＡまた
はＲＮＡ（以下、蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼
ぶ）である。蛍光物質としては、例えばフルオレセイン
イソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオ
シアネートなどがある。相補ＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光
物質を結合する方法としては、例えばチオカルバミド結
合やペプチド結合などの共有結合によるものがある。
【００１０】本発明の測定法に使用する蛍光偏光測定装
置の一例を図３に示す。ここで測定の原理について簡単
に説明すると、図３において、光源１１から出る光はフ
ィルター１２によって試薬に含まれる蛍光物質の励起波
長に濾光され、偏光板１３によって偏光される。この励
起波長の偏光は、測定物質（サンプル）を入れたセル１
４に投射され、サンプル中の蛍光物質を励起する。励起
された蛍光物質は、物質に応じた波長の蛍光を発する
が、この際ブラウン運動の激しさに対応して、該蛍光
は、偏光の分散を起こす。該蛍光は、その波長を透過す
るフィルター１５を透過し、偏光板１６を透過し、光検
知器１７によって電気信号に変換される。偏光板１６を
回転することにより、サンプルの蛍光に対して、励起偏
光と同じ向きの偏光成分Ｉａとこれと垂直の偏光成分Ｉ
ｂを求める。これらの値を用いて、次の示すサンプルの
蛍光偏光度Ｐが求められる。
置の一例を図３に示す。ここで測定の原理について簡単
に説明すると、図３において、光源１１から出る光はフ
ィルター１２によって試薬に含まれる蛍光物質の励起波
長に濾光され、偏光板１３によって偏光される。この励
起波長の偏光は、測定物質（サンプル）を入れたセル１
４に投射され、サンプル中の蛍光物質を励起する。励起
された蛍光物質は、物質に応じた波長の蛍光を発する
が、この際ブラウン運動の激しさに対応して、該蛍光
は、偏光の分散を起こす。該蛍光は、その波長を透過す
るフィルター１５を透過し、偏光板１６を透過し、光検
知器１７によって電気信号に変換される。偏光板１６を
回転することにより、サンプルの蛍光に対して、励起偏
光と同じ向きの偏光成分Ｉａとこれと垂直の偏光成分Ｉ
ｂを求める。これらの値を用いて、次の示すサンプルの
蛍光偏光度Ｐが求められる。
【００１１】
【数１】
【００１２】この場合、蛍光物質または蛍光物質を結合
している物質のブラウン運動が激しいほど、励起偏光と
垂直な偏光成分Ｉｂは、これと平行な偏光成分Ｉａに比
して大きくなり、すなわちＰは小さくなる。
している物質のブラウン運動が激しいほど、励起偏光と
垂直な偏光成分Ｉｂは、これと平行な偏光成分Ｉａに比
して大きくなり、すなわちＰは小さくなる。
【００１３】本発明では、サンプルセル（図３の１４）
に蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を入れ、
測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む溶液を加え、続
いて固定化ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を加える。た
だし、これらの３種の溶液を加える順序は限定しない。
加える蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡおよび固定化Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡの濃度は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの測定濃度範囲に応じて適切に選定される。
に蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を入れ、
測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む溶液を加え、続
いて固定化ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を加える。た
だし、これらの３種の溶液を加える順序は限定しない。
加える蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡおよび固定化Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡの濃度は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの測定濃度範囲に応じて適切に選定される。
【００１４】本発明では、固定化ＤＮＡまたはＲＮＡ
は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡと競合しつつ、相補的
結合反応により蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合
する。蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡが固定化ＤＮＡ
またはＲＮＡと結合する際、見掛け上大きな分子量変化
が生じるので、結合した量に対応して上述した蛍光偏光
度Ｐの値が求められる。測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの
濃度に対応して固定化ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する蛍
光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡの量が決定される。した
がって、偏光度Ｐが求められれば、測定対象ＤＮＡまた
はＲＮＡの濃度が求められる。
は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡと競合しつつ、相補的
結合反応により蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合
する。蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡが固定化ＤＮＡ
またはＲＮＡと結合する際、見掛け上大きな分子量変化
が生じるので、結合した量に対応して上述した蛍光偏光
度Ｐの値が求められる。測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの
濃度に対応して固定化ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する蛍
光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡの量が決定される。した
がって、偏光度Ｐが求められれば、測定対象ＤＮＡまた
はＲＮＡの濃度が求められる。
【００１５】
【実施例】以下に本発明の実施例を例示することによっ
て、本発明の効果をより一層明確なものとするが、これ
ら実施例によって本発明の範囲は限定されない。 （実施例１） 各種ＤＮＡ試薬の調製 コントロールＤＮＡ断片の調製法 ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製、３９１型）を用い
て、ホスホアミダイト法により、チミン塩基からなる２
５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成した。精製はＦＰ
ＬＣ（ファルマシア社製）で逆相カラムにて行った。こ
れを希釈用緩衝液（１×ＳＳＣ，ｐＨ７．０，０．１％
ＳＤＳ、これを希釈バッファーと呼ぶ）によって８×１
０-10 〜１０-7ｍｏｌ／ｌの範囲の７通りの濃度の溶液
に希釈し、これをコントロールＤＮＡ断片試薬とした。
て、本発明の効果をより一層明確なものとするが、これ
ら実施例によって本発明の範囲は限定されない。 （実施例１） 各種ＤＮＡ試薬の調製 コントロールＤＮＡ断片の調製法 ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製、３９１型）を用い
て、ホスホアミダイト法により、チミン塩基からなる２
５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成した。精製はＦＰ
ＬＣ（ファルマシア社製）で逆相カラムにて行った。こ
れを希釈用緩衝液（１×ＳＳＣ，ｐＨ７．０，０．１％
ＳＤＳ、これを希釈バッファーと呼ぶ）によって８×１
０-10 〜１０-7ｍｏｌ／ｌの範囲の７通りの濃度の溶液
に希釈し、これをコントロールＤＮＡ断片試薬とした。
【００１６】固定化ＤＮＡの調製法 の場合と同様に、シンセサイザーによって、チミン塩
基からなる２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成し、
さらに末端に以下の式に示すｄＵ誘導体を付加した。こ
れをと同様に精製した。
基からなる２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成し、
さらに末端に以下の式に示すｄＵ誘導体を付加した。こ
れをと同様に精製した。
【００１７】
【化１】
【００１８】このオリゴヌクレオチドを希釈バッファー
によって１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度に調製し、この溶液１
ｍｌに炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ８．５）１００μｌ
を加えた。この溶液に、スクシニミジルＤ−ビオチン
（モレキュラー・プローブ社製、Ｓ−１５１３）１０μ
ｇを加え、室温にて３時間攪拌の後、ＦＰＬＣにて精製
した。この操作によって、上記オリゴヌクレオチドはビ
オチン標識された。このビオチン標識オリゴヌクレオチ
ドに希釈バッファーを加え１ｍｌとし、こてにストレプ
トアビジン固定化シルバーコロイド（Ｅ・Ｙラボラトリ
ーズ社製），０．０２％，０．５ｍｌを加え、室温にて
３時間攪拌した。さらに１％ＢＳＡ，１００μｌを加え
室温にて３０分間インキュベートした。この溶液を２０
０００×ｇで４分間遠心して上清を除去し、再び希釈バ
ッファーにて溶解し１ｍｌとした。これを１０倍希釈し
たものを固定化ＤＮＡ試薬とした。
によって１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度に調製し、この溶液１
ｍｌに炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ８．５）１００μｌ
を加えた。この溶液に、スクシニミジルＤ−ビオチン
（モレキュラー・プローブ社製、Ｓ−１５１３）１０μ
ｇを加え、室温にて３時間攪拌の後、ＦＰＬＣにて精製
した。この操作によって、上記オリゴヌクレオチドはビ
オチン標識された。このビオチン標識オリゴヌクレオチ
ドに希釈バッファーを加え１ｍｌとし、こてにストレプ
トアビジン固定化シルバーコロイド（Ｅ・Ｙラボラトリ
ーズ社製），０．０２％，０．５ｍｌを加え、室温にて
３時間攪拌した。さらに１％ＢＳＡ，１００μｌを加え
室温にて３０分間インキュベートした。この溶液を２０
０００×ｇで４分間遠心して上清を除去し、再び希釈バ
ッファーにて溶解し１ｍｌとした。これを１０倍希釈し
たものを固定化ＤＮＡ試薬とした。
【００１９】ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシア
ネート）標識相補ＤＮＡ断片の調製法 の場合と同様に、シンセサイザーによって、アデニン
塩基からなる２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成
し、さらに末端にの場合と同じくｄＵ誘導体を付加し
た。これをＦＰＬＣにて精製した。このオリゴヌクレオ
チドを希釈バッファーによって１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度
に調製し、この溶液１ｍｌに炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐ
Ｈ９．３）１００μｌを加えた。この溶液に、ＦＩＴＣ
（カッペル社製）１０μｇを加え、室温にて６時間攪拌
の後、ＦＰＬＣにて精製した。この操作によって、上記
オリゴヌクレオチドはＦＩＴＣ標識とされた。これを希
釈バッファーによって３×１０-9 ｍｏｌ／ｌの濃度と
し、これをＦＩＴＣ標識相補ＤＮＡ断片試薬とした。濃
度の測定は、２６０ｎｍＵＶ光における吸光度法に従っ
た。
ネート）標識相補ＤＮＡ断片の調製法 の場合と同様に、シンセサイザーによって、アデニン
塩基からなる２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成
し、さらに末端にの場合と同じくｄＵ誘導体を付加し
た。これをＦＰＬＣにて精製した。このオリゴヌクレオ
チドを希釈バッファーによって１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度
に調製し、この溶液１ｍｌに炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐ
Ｈ９．３）１００μｌを加えた。この溶液に、ＦＩＴＣ
（カッペル社製）１０μｇを加え、室温にて６時間攪拌
の後、ＦＰＬＣにて精製した。この操作によって、上記
オリゴヌクレオチドはＦＩＴＣ標識とされた。これを希
釈バッファーによって３×１０-9 ｍｏｌ／ｌの濃度と
し、これをＦＩＴＣ標識相補ＤＮＡ断片試薬とした。濃
度の測定は、２６０ｎｍＵＶ光における吸光度法に従っ
た。
【００２０】（実施例２） 測定装置および検量線の作成 測定装置の構成は、図３を用いて説明したものである。
蛍光励起波長は４８５ｎｍ、蛍光の受光波長は５２５ｎ
ｍとした。装置の励起側、蛍光側の波長フィルターの分
光バンド幅はともに半値幅１０ｎｍとした。反応用セル
は５０℃に加温・保持した。
蛍光励起波長は４８５ｎｍ、蛍光の受光波長は５２５ｎ
ｍとした。装置の励起側、蛍光側の波長フィルターの分
光バンド幅はともに半値幅１０ｎｍとした。反応用セル
は５０℃に加温・保持した。
【００２１】次に、コントロールＤＮＡ断片の検量線
（校正曲線）を得るための手続きを示す。実施例１の
〜に示した３種の試薬、コントロールＤＮＡ断片、固
定化ＤＮＡ、ＦＩＴＣ標識相補ＤＮＡ断片試薬はすべて
５０℃に加温・保持した。また反応用緩衝液（１５×Ｓ
ＳＣ，ｐＨ７．０，０．５％ＢＳＣ、これをハイブリダ
イゼーションバッファーと呼ぶ）を用意し、同じく５０
℃に保持した。まず、反応用セルにハイブリダイゼーシ
ョンバッファー１ｍｌ、続いてコントロールＤＮＡ断片
試薬１ｍｌ、続いてＦＩＴＣ標識相補ＤＮＡ試薬１ｍｌ
を加え、５０℃にて１０分間インキュベートした。その
後、固定化ＤＮＡ断片試薬１ｍｌを加え、５０℃にて５
分間インキュベートした後、偏光度を４回測定し、平均
値をプロットした。この操作を、実施例１のに示した
７通りの濃度のコントロールＤＮＡ断片試薬に対して行
った。このようにして得られたコントロールＤＮＡ断片
の検量線を図４に示す。同図におけるコントロールＤＮ
Ａ断片の濃度は上記４種の試薬溶液混合後の濃度であ
る。この例により、本発明に基づく測定法によるチミン
塩基からなる２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの測定が
可能であることが明らかとなった。
（校正曲線）を得るための手続きを示す。実施例１の
〜に示した３種の試薬、コントロールＤＮＡ断片、固
定化ＤＮＡ、ＦＩＴＣ標識相補ＤＮＡ断片試薬はすべて
５０℃に加温・保持した。また反応用緩衝液（１５×Ｓ
ＳＣ，ｐＨ７．０，０．５％ＢＳＣ、これをハイブリダ
イゼーションバッファーと呼ぶ）を用意し、同じく５０
℃に保持した。まず、反応用セルにハイブリダイゼーシ
ョンバッファー１ｍｌ、続いてコントロールＤＮＡ断片
試薬１ｍｌ、続いてＦＩＴＣ標識相補ＤＮＡ試薬１ｍｌ
を加え、５０℃にて１０分間インキュベートした。その
後、固定化ＤＮＡ断片試薬１ｍｌを加え、５０℃にて５
分間インキュベートした後、偏光度を４回測定し、平均
値をプロットした。この操作を、実施例１のに示した
７通りの濃度のコントロールＤＮＡ断片試薬に対して行
った。このようにして得られたコントロールＤＮＡ断片
の検量線を図４に示す。同図におけるコントロールＤＮ
Ａ断片の濃度は上記４種の試薬溶液混合後の濃度であ
る。この例により、本発明に基づく測定法によるチミン
塩基からなる２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの測定が
可能であることが明らかとなった。
【００２２】
【発明の効果】実施例から明かなように、本発明では蛍
光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡと固定化ＤＮＡまたはＲ
ＮＡとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大
きいので、測定の感度および信頼性が向上できる。ま
た、固定化ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬および蛍光標識相補
ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬の作成において、長鎖の相補Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ試薬を用意する必要がないので、従来
技術よりも簡単に測定を行うことができる。
光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡと固定化ＤＮＡまたはＲ
ＮＡとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大
きいので、測定の感度および信頼性が向上できる。ま
た、固定化ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬および蛍光標識相補
ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬の作成において、長鎖の相補Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ試薬を用意する必要がないので、従来
技術よりも簡単に測定を行うことができる。
【図１】本発明の蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ
断片測定法の一例を示す。
断片測定法の一例を示す。
【図２】従来法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片測定法の
一例を示す。
一例を示す。
【図３】蛍光偏光測定装置の構成例を示す。
【符号の説明】 １．測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡ ２．蛍光標識相補ＤＮＡまたはＲＮＡ ３．固定化ＤＮＡまたはＲＮＡ ４．蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ ５．相補ＤＮＡまたはＲＮＡ １１．光源 １２．フィルター １３．偏光板 １４．セル １５．フィルター １６．偏光板 １７．光検知器
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１２月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ
断片測定法の一例を示す図である。
断片測定法の一例を示す図である。
【図２】従来法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片測定法の
一例を示す図である。
一例を示す図である。
【図３】蛍光偏光測定装置の構成例を示す図である。
【図４】コントロールＤＮＡ断片の検量線を示す図であ
る。
る。
Claims (2)
- 【請求項１】 （１）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡおよ
び（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡと相同な塩基配列
を有するＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させた
固定化試薬を、（３）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡと相
補的な塩基配列を有する蛍光標識されたＤＮＡまたはＲ
ＮＡプローブと競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを形成させ、２本鎖形成前の蛍光偏光度と２本鎖形
成後の蛍光偏光度との変化を測定して、検体中のＤＮＡ
またはＲＮＡに存在する、該ＤＮＡまたはＲＮＡプロー
ブに相補的に対応する塩基配列を測定することを特徴と
する固定化ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲ
ＮＡ断片の測定方法。 - 【請求項２】 固定化試薬の担体の分子量が、蛍光標
識させた１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの少なくと
も５倍であることを特徴とする請求項１記載の固定化Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測
定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4920591A JPH0643159A (ja) | 1991-02-20 | 1991-02-20 | 固定化ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4920591A JPH0643159A (ja) | 1991-02-20 | 1991-02-20 | 固定化ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0643159A true JPH0643159A (ja) | 1994-02-18 |
Family
ID=12824488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4920591A Pending JPH0643159A (ja) | 1991-02-20 | 1991-02-20 | 固定化ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0643159A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0838199A (ja) * | 1994-04-18 | 1996-02-13 | Becton Dickinson & Co | 核酸増幅の蛍光偏光検出方法 |
| WO1999060158A1 (fr) * | 1998-05-19 | 1999-11-25 | Laboratory Of Molecular Biophotonics | Phase solide utilisee pour detecter de l'acide nucleique et procede de detection d'acide nucleique |
| JP2007529752A (ja) * | 2004-03-18 | 2007-10-25 | トランス テック ファーマ，インコーポレイテッド | 蛍光偏光アッセイ |
-
1991
- 1991-02-20 JP JP4920591A patent/JPH0643159A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0838199A (ja) * | 1994-04-18 | 1996-02-13 | Becton Dickinson & Co | 核酸増幅の蛍光偏光検出方法 |
| WO1999060158A1 (fr) * | 1998-05-19 | 1999-11-25 | Laboratory Of Molecular Biophotonics | Phase solide utilisee pour detecter de l'acide nucleique et procede de detection d'acide nucleique |
| EP1008658A4 (en) * | 1998-05-19 | 2002-08-28 | Lab Molecular Biophotonics | SOLID PHASE FOR THE DETECTION OF NUCLEIC ACIDS AND METHOD FOR THE DETECTION THEREOF |
| JP2007529752A (ja) * | 2004-03-18 | 2007-10-25 | トランス テック ファーマ，インコーポレイテッド | 蛍光偏光アッセイ |
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