JPH05123196A - 固定化相補ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法 - Google Patents
固定化相補ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法Info
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- JPH05123196A JPH05123196A JP4920491A JP4920491A JPH05123196A JP H05123196 A JPH05123196 A JP H05123196A JP 4920491 A JP4920491 A JP 4920491A JP 4920491 A JP4920491 A JP 4920491A JP H05123196 A JPH05123196 A JP H05123196A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片
の測定法において、測定感度および信頼性の向上を計
る。 【構成】 （１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたは
ＲＮＡプローブと（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡ
を、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基
配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させ
た固定化試薬と競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを形成させ、２本鎖形成前の蛍光偏光度と２本鎖形
成後の蛍光偏光度との変位を測定して、検体中のＤＮＡ
またはＲＮＡに存在する該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプ
ローブに対応する塩基配列を測定する。 【効果】 蛍光標識されたＤＮＡまたはＲＮＡと測定
対象と相補的な塩基配列を含む固定化ＤＮＡまたはＲＮ
Ａとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大き
いため、蛍光偏光度の変化が大きくなり、測定感度およ
び信頼性が向上する。
の測定法において、測定感度および信頼性の向上を計
る。 【構成】 （１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまたは
ＲＮＡプローブと（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡ
を、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基
配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させ
た固定化試薬と競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを形成させ、２本鎖形成前の蛍光偏光度と２本鎖形
成後の蛍光偏光度との変位を測定して、検体中のＤＮＡ
またはＲＮＡに存在する該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプ
ローブに対応する塩基配列を測定する。 【効果】 蛍光標識されたＤＮＡまたはＲＮＡと測定
対象と相補的な塩基配列を含む固定化ＤＮＡまたはＲＮ
Ａとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大き
いため、蛍光偏光度の変化が大きくなり、測定感度およ
び信頼性が向上する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、蛍光偏光法によるＤＮ
ＡまたはＲＮＡ断片の測定方法に関する。
ＡまたはＲＮＡ断片の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断
片の測定法においては、測定のための試薬として、蛍光
標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡまた
はＲＮＡおよび測定対象に対して相補的な塩基配列を含
むＤＮＡまたはＲＮＡを用いる競合方法がある（特開昭
２−７５９５８号公報参照）。この方法においては、蛍
光標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡま
たはＲＮＡ（蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）、測
定対象に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲ
ＮＡ（相補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）および測定対象
ＤＮＡまたはＲＮＡを混合させ、蛍光標識ＤＮＡまたは
ＲＮＡと相補ＤＮＡまたはＲＮＡとが、相補的に結合す
る際の蛍光偏光度の変化を測定することにより、測定対
象ＤＮＡまたはＲＮＡを測定する。（図２参照）
片の測定法においては、測定のための試薬として、蛍光
標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡまた
はＲＮＡおよび測定対象に対して相補的な塩基配列を含
むＤＮＡまたはＲＮＡを用いる競合方法がある（特開昭
２−７５９５８号公報参照）。この方法においては、蛍
光標識された測定対象と同一の塩基配列を含むＤＮＡま
たはＲＮＡ（蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）、測
定対象に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲ
ＮＡ（相補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）および測定対象
ＤＮＡまたはＲＮＡを混合させ、蛍光標識ＤＮＡまたは
ＲＮＡと相補ＤＮＡまたはＲＮＡとが、相補的に結合す
る際の蛍光偏光度の変化を測定することにより、測定対
象ＤＮＡまたはＲＮＡを測定する。（図２参照）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】この方法では、蛍光偏
光度の変化は、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡが相補ＤＮ
ＡまたはＲＮＡと結合する際の実効的な分子量の変化に
対応している。したがって、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮ
Ａと相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に大きな差がない
場合には、蛍光偏光度の変化は小さい。そのために、こ
の測定法の感度および信頼性は低いものとなる。この問
題を解決するためには蛍光偏光度の変化を大きくすれば
よいが、このためには相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量
を蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して充分に
大きくする必要がある。すなわち、相補ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを長鎖にする必要がある。しかし、このような相補
ＤＮＡまたはＲＮＡを準備することは、通常、困難であ
る。
光度の変化は、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡが相補ＤＮ
ＡまたはＲＮＡと結合する際の実効的な分子量の変化に
対応している。したがって、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮ
Ａと相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に大きな差がない
場合には、蛍光偏光度の変化は小さい。そのために、こ
の測定法の感度および信頼性は低いものとなる。この問
題を解決するためには蛍光偏光度の変化を大きくすれば
よいが、このためには相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量
を蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して充分に
大きくする必要がある。すなわち、相補ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを長鎖にする必要がある。しかし、このような相補
ＤＮＡまたはＲＮＡを準備することは、通常、困難であ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）蛍光標
識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと（２）検
体中のＤＮＡまたはＲＮＡを、（３）該１本鎖ＤＮＡま
たはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮ
Ａを固定化担体に結合させた固定化試薬と競合反応させ
て、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成させ、該２本鎖形
成前の蛍光偏光度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変
化を測定することにより、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡ
に存在する、上記１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに
対応する塩基配列を測定することを特徴とする固定化相
補ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片
の測定方法である。
識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブと（２）検
体中のＤＮＡまたはＲＮＡを、（３）該１本鎖ＤＮＡま
たはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮ
Ａを固定化担体に結合させた固定化試薬と競合反応させ
て、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを形成させ、該２本鎖形
成前の蛍光偏光度と該２本鎖形成後の蛍光偏光度との変
化を測定することにより、検体中のＤＮＡまたはＲＮＡ
に存在する、上記１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに
対応する塩基配列を測定することを特徴とする固定化相
補ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片
の測定方法である。
【０００５】本発明における（１）蛍光標識された１本
鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブとは、測定対象のＤＮＡ
またはＲＮＡと同一の塩基配列を有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡに標識物質として蛍光物質を結合させたＤＮＡまた
はＲＮＡ（以下、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）
である。蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソ
チオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシア
ネートなどがある。ＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光物質を結
合させる方法としては、例えばチオカルバミド結合など
の共有結合によるものがある。
鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブとは、測定対象のＤＮＡ
またはＲＮＡと同一の塩基配列を有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡに標識物質として蛍光物質を結合させたＤＮＡまた
はＲＮＡ（以下、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）
である。蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソ
チオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシア
ネートなどがある。ＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光物質を結
合させる方法としては、例えばチオカルバミド結合など
の共有結合によるものがある。
【０００６】本発明における（２）検体中のＤＮＡまた
はＲＮＡとは、例えば血清、尿、各種培養液などの測定
検体における細菌、ウイルスなどのＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、また組織細胞やそれらの遊離ＤＮＡまたはＲＮＡな
どがある。
はＲＮＡとは、例えば血清、尿、各種培養液などの測定
検体における細菌、ウイルスなどのＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、また組織細胞やそれらの遊離ＤＮＡまたはＲＮＡな
どがある。
【０００７】本発明における（３）該１本鎖ＤＮＡまた
はＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ
を固定化担体に結合させた固定化試薬（以下、固定化相
補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）とは、上記（１）蛍光標
識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにおける１本鎖ＤＮ
ＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたは
ＲＮＡを固定化担体に固定化することにより用意され
る。固定化担体としては、ポリスチレン、ナイロンなど
の合成樹脂のビーズ、ラテックス粒子、ガラスビーズや
Ａｕ，Ａｇなどの金属微粒子などを用いることができ
る。またタンパク質などの高分子物質を用いることもで
きる。本発明の固定化担体の分子量は、上述の蛍光偏光
法の原理に基づき、相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量が
蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して充分に大
きくなるように選択される。固定化担体の分子量は蛍光
標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量より５倍以上であるこ
とが好ましい。粒子などの固定化担体の分子量は、厳密
には定義できないが、この場合には粒子の担体１個の平
均質量にアボガドロ数をかけたものと定義する。また、
固定化担体は必ずしも球状でなくてもよく、線状や板状
でもよい。
はＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ
を固定化担体に結合させた固定化試薬（以下、固定化相
補ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ぶ）とは、上記（１）蛍光標
識された１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにおける１本鎖ＤＮ
ＡまたはＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡまたは
ＲＮＡを固定化担体に固定化することにより用意され
る。固定化担体としては、ポリスチレン、ナイロンなど
の合成樹脂のビーズ、ラテックス粒子、ガラスビーズや
Ａｕ，Ａｇなどの金属微粒子などを用いることができ
る。またタンパク質などの高分子物質を用いることもで
きる。本発明の固定化担体の分子量は、上述の蛍光偏光
法の原理に基づき、相補ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量が
蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量に対して充分に大
きくなるように選択される。固定化担体の分子量は蛍光
標識ＤＮＡまたはＲＮＡの分子量より５倍以上であるこ
とが好ましい。粒子などの固定化担体の分子量は、厳密
には定義できないが、この場合には粒子の担体１個の平
均質量にアボガドロ数をかけたものと定義する。また、
固定化担体は必ずしも球状でなくてもよく、線状や板状
でもよい。
【０００８】例えば、粒径１５ｎｍの銀微粒子は、分子
量に換算するとおよそ１×１０7 の物質であり、例えば
３００塩基対を有する測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの分
子量（約９万）に対して約１００倍である。したがっ
て、この測定対象と全く同一の塩基配列をもつ蛍光標識
ＤＮＡまたはＲＮＡと上記担体を用いた固定化相補ＤＮ
ＡまたはＲＮＡが相補的に結合した場合、実効的な分子
量の変化は、約１００倍である。これは蛍光偏光法によ
って測定を行う場合に充分な値である。
量に換算するとおよそ１×１０7 の物質であり、例えば
３００塩基対を有する測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの分
子量（約９万）に対して約１００倍である。したがっ
て、この測定対象と全く同一の塩基配列をもつ蛍光標識
ＤＮＡまたはＲＮＡと上記担体を用いた固定化相補ＤＮ
ＡまたはＲＮＡが相補的に結合した場合、実効的な分子
量の変化は、約１００倍である。これは蛍光偏光法によ
って測定を行う場合に充分な値である。
【０００９】ＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合さ
せる方法としては、吸着法、共有結合法、アビジンとビ
オチンとの特異的結合を利用する方法などがある。
せる方法としては、吸着法、共有結合法、アビジンとビ
オチンとの特異的結合を利用する方法などがある。
【００１０】本発明の測定法に使用する蛍光偏光測定装
置の一例を図３に示す。ここで測定の原理について簡単
に説明すると、図３において、光源１１から出る光はフ
ィルター１２によって試薬に含まれる蛍光物質の励起波
長に濾光され、偏光板１３によって偏光される。この励
起波長の偏光は、測定物質（サンプル）を入れたセル１
４に投射され、サンプル中の蛍光物質を励起する。励起
された蛍光物質は、物質に応じた波長の蛍光を発する
が、この際ブラウン運動の激しさに対応して、該蛍光は
偏光の分散を起こす。該蛍光はその波長を透過するフィ
ルター１５を透過し、偏光板１６を透過し、光検知器１
７によって電気信号に変換される。偏光板１６を回転す
ることにより、サンプルの蛍光に対して励起偏光と同じ
向きの偏光成分Ｉａとこれと垂直の偏光成分Ｉｂを求め
る。これらの値を用いて、次の示すサンプルの蛍光偏光
度Ｐが求められる。
置の一例を図３に示す。ここで測定の原理について簡単
に説明すると、図３において、光源１１から出る光はフ
ィルター１２によって試薬に含まれる蛍光物質の励起波
長に濾光され、偏光板１３によって偏光される。この励
起波長の偏光は、測定物質（サンプル）を入れたセル１
４に投射され、サンプル中の蛍光物質を励起する。励起
された蛍光物質は、物質に応じた波長の蛍光を発する
が、この際ブラウン運動の激しさに対応して、該蛍光は
偏光の分散を起こす。該蛍光はその波長を透過するフィ
ルター１５を透過し、偏光板１６を透過し、光検知器１
７によって電気信号に変換される。偏光板１６を回転す
ることにより、サンプルの蛍光に対して励起偏光と同じ
向きの偏光成分Ｉａとこれと垂直の偏光成分Ｉｂを求め
る。これらの値を用いて、次の示すサンプルの蛍光偏光
度Ｐが求められる。
【００１１】
【数１】
【００１２】この場合、蛍光物質または蛍光物質を結合
している物質のブラウン運動が激しいほど、励起偏光と
垂直な向きの偏光成分Ｉｂは、これと平行の偏光成分Ｉ
ａに比して大きくなり、すなわちＰは小さくなる。
している物質のブラウン運動が激しいほど、励起偏光と
垂直な向きの偏光成分Ｉｂは、これと平行の偏光成分Ｉ
ａに比して大きくなり、すなわちＰは小さくなる。
【００１３】本発明では、サンプルセル（図３の１４）
に蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を入れ、測定
対象ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む溶液を加え、続いて
固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を加える。た
だし、これらの３種の溶液を加える順序は限定しない。
加える蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡおよび固定化相補Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡの濃度は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの測定濃度範囲に応じて適切に選定される。
に蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を入れ、測定
対象ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を含む溶液を加え、続いて
固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを含む溶液を加える。た
だし、これらの３種の溶液を加える順序は限定しない。
加える蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡおよび固定化相補Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡの濃度は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの測定濃度範囲に応じて適切に選定される。
【００１４】本発明では、蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ
は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡと競合しつつ、相補的
結合反応により固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合す
る。蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡが固定化相補ＤＮＡま
たはＲＮＡと結合する際、見掛け上大きな分子量変化が
生じるので、結合した量に対応して上述した蛍光偏光度
Ｐの値が求められる。測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの濃
度に対応して固定化ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する蛍光
標識ＤＮＡまたはＲＮＡの量が決定される。したがっ
て、偏光度Ｐが求められれば、測定対象ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの濃度が求められる。
は、測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡと競合しつつ、相補的
結合反応により固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡと結合す
る。蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡが固定化相補ＤＮＡま
たはＲＮＡと結合する際、見掛け上大きな分子量変化が
生じるので、結合した量に対応して上述した蛍光偏光度
Ｐの値が求められる。測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡの濃
度に対応して固定化ＤＮＡまたはＲＮＡと結合する蛍光
標識ＤＮＡまたはＲＮＡの量が決定される。したがっ
て、偏光度Ｐが求められれば、測定対象ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの濃度が求められる。
【００１５】
【実施例】以下に本発明の実施例を例示することによっ
て、本発明の効果をより一層明確なものとするが、これ
ら実施例によって本発明の範囲は限定されない。 （実施例１） 各種ＤＮＡ試薬の調製 コントロールＤＮＡ断片の調製法 ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製、３９１型）を用い
て、ホスホアミダイト法により、チミン塩基からなる２
５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成した。精製はＦＰ
ＬＣ（ファルマシア社製）で逆相カラムにて行った。こ
れを希釈用緩衝液（１×ＳＳＣ，ｐＨ７．０，０．１％
ＳＤＳ、これを希釈バッファーと呼ぶ）によって８×１
０-10 〜１０-7ｍｏｌ／ｌの範囲の７通りの濃度の溶液
に希釈し、これをコントロールＤＮＡ断片試薬とした。
て、本発明の効果をより一層明確なものとするが、これ
ら実施例によって本発明の範囲は限定されない。 （実施例１） 各種ＤＮＡ試薬の調製 コントロールＤＮＡ断片の調製法 ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製、３９１型）を用い
て、ホスホアミダイト法により、チミン塩基からなる２
５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成した。精製はＦＰ
ＬＣ（ファルマシア社製）で逆相カラムにて行った。こ
れを希釈用緩衝液（１×ＳＳＣ，ｐＨ７．０，０．１％
ＳＤＳ、これを希釈バッファーと呼ぶ）によって８×１
０-10 〜１０-7ｍｏｌ／ｌの範囲の７通りの濃度の溶液
に希釈し、これをコントロールＤＮＡ断片試薬とした。
【００１６】固定化相補ＤＮＡの調製法 の場合と同様に、シンセサイザーによって、アデニン
塩基からなる２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成
し、さらに末端に以下の式に示すｄＵ誘導体を付加し
た。これをと同様に精製した。
塩基からなる２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成
し、さらに末端に以下の式に示すｄＵ誘導体を付加し
た。これをと同様に精製した。
【００１７】
【化１】
【００１８】このオリゴヌクレオチドを希釈バッファー
によって１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度に調製し、この溶液１
ｍｌに炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ８．５）１００μｌ
を加えた。この溶液に、スクシニミジルＤ−ビオチン
（モレキュラー・プローブ社製、Ｓ−１５１３）１０μ
ｇを加え、室温にて３時間攪拌の後、ＦＰＬＣにて精製
した。この操作によって、上記オリゴヌクレオチドはビ
オチン標識された。このビオチン標識オリゴヌクレオチ
ドに希釈バッファーを加え１ｍｌとし、こてにストレプ
トアビジン固定化シルバーコロイド（Ｅ・Ｙラボラトリ
ーズ社製），０．０２％，０．５ｍｌを加え、室温にて
３時間攪拌した。さらに１％ＢＳＡ，１００μｌを加え
室温にて３０分間インキュベートした。この溶液を２０
０００×ｇで４分間遠心して上清を除去し、再び希釈バ
ッファーにて溶解し１ｍｌとした。これを１０倍希釈し
たものを固定化相補ＤＮＡ試薬とした。
によって１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度に調製し、この溶液１
ｍｌに炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ８．５）１００μｌ
を加えた。この溶液に、スクシニミジルＤ−ビオチン
（モレキュラー・プローブ社製、Ｓ−１５１３）１０μ
ｇを加え、室温にて３時間攪拌の後、ＦＰＬＣにて精製
した。この操作によって、上記オリゴヌクレオチドはビ
オチン標識された。このビオチン標識オリゴヌクレオチ
ドに希釈バッファーを加え１ｍｌとし、こてにストレプ
トアビジン固定化シルバーコロイド（Ｅ・Ｙラボラトリ
ーズ社製），０．０２％，０．５ｍｌを加え、室温にて
３時間攪拌した。さらに１％ＢＳＡ，１００μｌを加え
室温にて３０分間インキュベートした。この溶液を２０
０００×ｇで４分間遠心して上清を除去し、再び希釈バ
ッファーにて溶解し１ｍｌとした。これを１０倍希釈し
たものを固定化相補ＤＮＡ試薬とした。
【００１９】ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシア
ネート）標識ＤＮＡ断片の調製法の場合と同様に、シ
ンセサイザーによって、チミン塩基からなる２７ｍｅｒ
のオリゴヌクレオチドを合成し、さらに末端にの場合
と同じくｄＵ誘導体を付加した。これをＦＰＬＣにて精
製した。このオリゴヌクレオチドを希釈バッファーによ
って１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度に調製し、この溶液１ｍｌ
に炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ９．３）１００μｌを加
えた。この溶液に、ＦＩＴＣ（カッペル社製）１０μｇ
を加え、室温にて６時間攪拌の後、ＦＰＬＣにて精製し
た。この操作によって、上記オリゴヌクレオチドはＦＩ
ＴＣ標識とされた。これを希釈バッファーによって４×
１０-9 ｍｏｌ／ｌの濃度とし、これをＦＩＴＣ標識Ｄ
ＮＡ断片試薬とした。濃度の測定は、２６０ｎｍＵＶ光
における吸光度法に従った。
ネート）標識ＤＮＡ断片の調製法の場合と同様に、シ
ンセサイザーによって、チミン塩基からなる２７ｍｅｒ
のオリゴヌクレオチドを合成し、さらに末端にの場合
と同じくｄＵ誘導体を付加した。これをＦＰＬＣにて精
製した。このオリゴヌクレオチドを希釈バッファーによ
って１０-6ｍｏｌ／ｌの濃度に調製し、この溶液１ｍｌ
に炭酸緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ９．３）１００μｌを加
えた。この溶液に、ＦＩＴＣ（カッペル社製）１０μｇ
を加え、室温にて６時間攪拌の後、ＦＰＬＣにて精製し
た。この操作によって、上記オリゴヌクレオチドはＦＩ
ＴＣ標識とされた。これを希釈バッファーによって４×
１０-9 ｍｏｌ／ｌの濃度とし、これをＦＩＴＣ標識Ｄ
ＮＡ断片試薬とした。濃度の測定は、２６０ｎｍＵＶ光
における吸光度法に従った。
【００２０】（実施例２） 測定装置および検量線の作成 測定装置の構成は、図３を用いて説明したものである。
蛍光励起波長は４８５ｎｍ、蛍光の受光波長は５２５ｎ
ｍとした。装置の励起側、蛍光側の波長フィルターの分
光バンド幅はともに半値幅１０ｎｍとした。反応用セル
は５０℃に加温・保持した。
蛍光励起波長は４８５ｎｍ、蛍光の受光波長は５２５ｎ
ｍとした。装置の励起側、蛍光側の波長フィルターの分
光バンド幅はともに半値幅１０ｎｍとした。反応用セル
は５０℃に加温・保持した。
【００２１】次に、コントロールＤＮＡ断片の検量線
（校正曲線）を得るための手続きを示す。実施例１の
〜に示した３種の試薬、コントロールＤＮＡ断片、固
定化相補ＤＮＡ、ＦＩＴＣ標識ＤＮＡ断片試薬はすべて
５０℃に加温・保持した。また反応用緩衝液（１５×Ｓ
ＳＣ，ｐＨ７．０，０．５％ＢＳＣ、これをハイブリダ
イゼーションバッファーと呼ぶ）を用意し、同じく５０
℃に保持した。まず、反応用セルにハイブリダイゼーシ
ョンバッファー１ｍｌ、続いてコントロールＤＮＡ断片
試薬１ｍｌ、続いて固定化相補ＤＮＡ試薬１ｍｌを加
え、５０℃にて１０分間インキュベートした。その後、
ＦＩＴＣ標識ＤＮＡ断片試薬１ｍｌを加え、５０℃にて
５分間インキュベートした後、偏光度を４回測定し、平
均値をプロットした。この操作を、実施例１のに示し
た７通りの濃度のコントロールＤＮＡ断片試薬に対して
行った。このようにして得られたコントロールＤＮＡ断
片の検量線を図４に示す。同図におけるコントロールＤ
ＮＡ断片の濃度は上記４種の試薬溶液混合後の濃度であ
る。この例により、本発明に基づく測定法によるチミン
塩基からなる２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの測定が
可能であることが明らかとなった。
（校正曲線）を得るための手続きを示す。実施例１の
〜に示した３種の試薬、コントロールＤＮＡ断片、固
定化相補ＤＮＡ、ＦＩＴＣ標識ＤＮＡ断片試薬はすべて
５０℃に加温・保持した。また反応用緩衝液（１５×Ｓ
ＳＣ，ｐＨ７．０，０．５％ＢＳＣ、これをハイブリダ
イゼーションバッファーと呼ぶ）を用意し、同じく５０
℃に保持した。まず、反応用セルにハイブリダイゼーシ
ョンバッファー１ｍｌ、続いてコントロールＤＮＡ断片
試薬１ｍｌ、続いて固定化相補ＤＮＡ試薬１ｍｌを加
え、５０℃にて１０分間インキュベートした。その後、
ＦＩＴＣ標識ＤＮＡ断片試薬１ｍｌを加え、５０℃にて
５分間インキュベートした後、偏光度を４回測定し、平
均値をプロットした。この操作を、実施例１のに示し
た７通りの濃度のコントロールＤＮＡ断片試薬に対して
行った。このようにして得られたコントロールＤＮＡ断
片の検量線を図４に示す。同図におけるコントロールＤ
ＮＡ断片の濃度は上記４種の試薬溶液混合後の濃度であ
る。この例により、本発明に基づく測定法によるチミン
塩基からなる２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの測定が
可能であることが明らかとなった。
【００２２】
【発明の効果】実施例から明かなように、本発明では蛍
光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと固定化相補ＤＮＡまたはＲ
ＮＡとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大
きいので、測定の感度および信頼性が向上できる。ま
た、固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬および蛍光標識
ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬の作成において、長鎖の相補Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ試薬を用意する必要がないので、従来
技術よりも簡単に測定を行うことができる。
光標識ＤＮＡまたはＲＮＡと固定化相補ＤＮＡまたはＲ
ＮＡとの相補的結合反応による実効的な分子量変化が大
きいので、測定の感度および信頼性が向上できる。ま
た、固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬および蛍光標識
ＤＮＡまたはＲＮＡ試薬の作成において、長鎖の相補Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ試薬を用意する必要がないので、従来
技術よりも簡単に測定を行うことができる。
【図１】本発明の蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ
断片測定法の一例を示す。
断片測定法の一例を示す。
【図２】従来法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片測定法の
一例を示す。
一例を示す。
【図３】蛍光偏光測定装置の構成例を示す。
１．測定対象ＤＮＡまたはＲＮＡ ２．蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ ３．固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡ ４．蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡ ５．相補ＤＮＡまたはＲＮＡ １１．光源 １２．フィルター １３．偏光板 １４．セル １５．フィルター １６．偏光板 １７．光検知器
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１２月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛍光偏光法によるＤＮＡまたはＲＮＡ
断片測定法の一例を示す図である。
断片測定法の一例を示す図である。
【図２】従来法によるＤＮＡまたはＲＮＡ断片測定法の
一例を示す図である。
一例を示す図である。
【図３】蛍光偏光測定装置の構成例を示す図である。
【図４】コントロールＤＮＡ断片の検量線を示す図であ
る。
る。
Claims (2)
- 【請求項１】 （１）蛍光標識された１本鎖ＤＮＡまた
はＲＮＡプローブと（２）検体中のＤＮＡまたはＲＮＡ
を、（３）該１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な塩基
配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡを固定化担体に結合させ
た固定化試薬と競合反応させて、２本鎖ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを形成させ、該２本鎖形成前の蛍光偏光度と該２本
鎖形成後の蛍光偏光度との変化を測定することにより、
検体中のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する、上記１本鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡプローブに対応する塩基配列を測定す
ることを特徴とする固定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを用
いるＤＮＡまたはＲＮＡ断片の測定方法。 - 【請求項２】 固定化試薬の固定化担体の分子量が、
蛍光標識させた一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの少
なくとも５倍であることを特徴とする請求項１記載の固
定化相補ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるＤＮＡまたはＲＮ
Ａ断片の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4920491A JPH05123196A (ja) | 1991-02-20 | 1991-02-20 | 固定化相補ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4920491A JPH05123196A (ja) | 1991-02-20 | 1991-02-20 | 固定化相補ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05123196A true JPH05123196A (ja) | 1993-05-21 |
Family
ID=12824463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4920491A Pending JPH05123196A (ja) | 1991-02-20 | 1991-02-20 | 固定化相補ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05123196A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0667398A2 (en) * | 1994-02-14 | 1995-08-16 | Kyoto Dai-ichi Kagaku Co., Ltd. | Method of and apparatus for detecting specific base sequence of DNA |
| WO1999060158A1 (fr) * | 1998-05-19 | 1999-11-25 | Laboratory Of Molecular Biophotonics | Phase solide utilisee pour detecter de l'acide nucleique et procede de detection d'acide nucleique |
-
1991
- 1991-02-20 JP JP4920491A patent/JPH05123196A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0667398A2 (en) * | 1994-02-14 | 1995-08-16 | Kyoto Dai-ichi Kagaku Co., Ltd. | Method of and apparatus for detecting specific base sequence of DNA |
| EP0667398A3 (en) * | 1994-02-14 | 1996-03-06 | Kyoto Daiichi Kagaku Kk | Method and device for the detection of the specific base sequence of the DNA. |
| WO1999060158A1 (fr) * | 1998-05-19 | 1999-11-25 | Laboratory Of Molecular Biophotonics | Phase solide utilisee pour detecter de l'acide nucleique et procede de detection d'acide nucleique |
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