JP2619866B2 - 競合的均質検定法 - Google Patents

競合的均質検定法

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は標的分子の検出および定量分析において有用
な方法、試薬、組成物、キツトおよび器具に関する。特
に本発明はデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（R
NA）のハイブリダイゼーシヨン検定を行うための方法、
試薬、組成物およびキツトに関する。
従来技術 本発明は係属中の米国特許出願第738560号（1985年５
月28日付）および同第284469号（1981年７月21日付）の
一部継続出願であり、これらはここに参照により引用さ
れる。
次の定義は本発明の理解を促すために与えられる。本
明細書で用いる“生物学的結合対”という用語は、相互
親和性または結合能を示す分子対を意味する。“リガン
ド”という用語は、本明細書において、生物学的結合対
の一方の分子を意味し、そして“抗リガンド”または
“受容体”は生物学的結合対の他方の分子を意味するだ
ろう。例えば、限定するものでないが、本発明の実施態
様は生物学的結合対が２つの相補的なポリ核酸鎖を含む
核酸ハイブリダイゼーシヨン検定に応用される。これら
の核酸鎖の一方がリガンドと呼ばれ、他方が抗リガンド
と呼ばれる。しかしながら、生物学的結合対は2,3の名
を挙げるならば、抗原および抗体、薬物および薬物受容
部位、ならびに酵素および酵素基質を含む。
“プローブ”という用語は標的リガンドと選択的に結
合できる既知性状のリガンドを意味する。核酸に適用す
るとき、“プローブ”は標的核酸鎖に相補的な塩基配列
を有する核酸鎖を意味する。
“標識”という用語は例えば放射性同位体；酵素；発
光剤または沈殿剤；および色素を含む検出可能な分子成
分を意味する。“剤”という用語は検出可能な応答へ導
く反応に関与する全ての分子成分を含めた広い意味で使
用される。“補助因子”という用語はその剤との反応に
関与する全ての分子成分を含めた広い意味で使用され
る。
遺伝情報は生細胞中に存在する糸状のDNA分子に蓄え
られている。in vivoにおいてDNA分子は二重らせんであ
り、二重らせんの各鎖はヌクレオチド鎖である。各ヌク
レオチドは４種類の塩基：アデニン（Ａ）、グアニン
（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）の一つによ
つて特徴づけられる。塩基は官能基の向きにより一定の
塩基対が互いに引きつけ合つて水素結合により結合する
という意味で相補的である。一方のDNA鎖のアデニンは
他方の相補鎖のチミンと対合する。一方のDNA鎖のグア
ニンは他方の相補鎖のシトシンと対合する。RNAでは、
チミン塩基がウラシル（Ｕ）で置き換えられ、ウラシル
は相補鎖中のアデニンと対合する。
生物の遺伝暗号は塩基対配列のDNA鎖により伝達され
る。DNAは共有結合されたデオキシリボヌクレオチド鎖
から成り、RNAは共有結合されたリボヌクレオチド鎖か
ら成る。それぞれの核酸は１つのヌクレオチドの糖の
５′−ヒドロキシル基と隣接ヌクレオチドの糖の３′−
ヒドロキシル基との間のホスホジエステル結合によつて
結合される。自然界に存在するDNAまたはRNAの各線状鎖
は、遊離５′−ヒドロキシル基をもつ末端と遊離３′−
ヒドロキシル基をもつ末端とを有する。ポリヌクレオチ
ドの各末端はそれぞれの遊離ヒドロキシル基に関連づけ
てしばしば５′末端または３′末端と呼ばれている。自
然界に存在するポリヌクレオチドはその５′末端にホス
フエート基をもち得る。DNAおよびRNAの相補鎖は、一方
の鎖の３′末端が他方の鎖の５′末端と結合する逆平行
複合体を形成する。
核酸ハイブリダイゼーシヨン検定は２本の核酸鎖がそ
れらの相補領域で対合する傾向に基づいている。現在、
核酸ハイブリダイゼーシヨン検定は主に完全なDNA分子
中の、または核酸混合物中の、または核酸フラグメント
混合物中の、特異なDNAもしくはRNA塩基配列あるいは特
定遺伝子を検出して同定するために使用されている。
組織または培養物試料から抽出された全DNAまたはRNA
中の特異なDNAまたはRNA配列もしくは特定遺伝子の同定
は、生理学的または病理学的症状の存在を示すかも知れ
ない。特に、ヒトまたは動物組織から抽出された全DNA
またはRNA中の特異なDNAまたはRNA配列もしくは特定遺
伝子の同定は鎌状赤血球貧血、組織適合性、癌および前
癌状態、または細菌やウイルス感染などの症状もしくは
遺伝病の存在を示唆する。細菌培養物から抽出された全
DNAまたはRNA中の特異なDNAまたはRNA配列もしくは特定
遺伝子の同定は抗生物質耐性、毒物、ウイルスまたはプ
ラスミドに関連した状態の存在を示し、また細菌型の同
定を可能にする。
従つて、核酸ハイブリダイゼーシヨン検定は病気の診
断および検出において大きな可能性を有している。さら
に、その可能性は植物の病因や毒物産生菌を検出するた
めに核酸ハイブリダイゼーシヨン検定を使用する農業や
食品加工の分野にも存在する。
最も広く使用されているポリヌクレオチドハイブリダ
イゼーシヨン検定法の１つは、サザンブロツトフイルタ
ーハイブリダイゼーシヨン法または単にサザン法として
知られているものである（Southern,E.,J.Mol.Biol.,9
8,503,1975を参照）。サザン法は標的DNAまたはRNA配列
を同定するために用いられる。この方法は一般に対象と
なる標的配列を保有する可能性がある生物から単離した
RNAまたはDNA試料を制限エンドヌクレアーゼで消化し
て、DNAフラグメントを形成することによつて実施され
る。その後、DNAフラグメント試料はアガロースやポリ
アクリルアミドのようなゲルで電気泳動を行い、フラグ
メント試料を鎖長により分類する。各フラグメント群は
標的配列の存在について試験される。DNAをニトロセル
ロースシートへ移行させるためにゲル内部で変性する。
DNAフラグメント試料を含むゲルはニトロセルロースフ
イルターシートまたはジアゾ化紙（これにDNAフラグメ
ントが移行して結合または固定される）と接触させる。
次いで、DNAフラグメント試料を含むニトロセルロース
シートを約85℃に加熱してDNAを固定する。その後ニト
ロセルロースシートを変性した（一本鎖の）放射性標識
DNAプローブを含む溶液で処理する。放射性標識プロー
ブは標的配列に相補的な塩基配列と検出可能な放射性成
分を有するDNA鎖を含む。
プローブとDNAフラグメントとのハイブリダイゼーシ
ヨンを行わせる。ハイブリダイゼーシヨン工程の間に固
定化DNA試料と標識DNAプローブとを結合させて、再び二
本鎖構造を形成させる。
ハイブリダイゼーシヨン法はきわめて特異的である。
標識プローブはもしも２つのDNA種が実質的に相補的な
塩基対機構を共有しないならばDNA試料と結合しないで
あろう。ハイブリダイゼーシヨンは所定の条件に応じて
３〜48時間を要する。
続いてハイブリダイズしなかつたプローブを洗い落と
す。次に、ニトロセルロースシートをＸ線フイルムのシ
ート上にのせて感光させる。Ｘ線フイルムは感光面を現
像して、DNAプローブとハイブリダイズしたDNAフラグメ
ント（従つて対象とする塩基対配列を含む）を同定す
る。
核酸ハイブリダイゼーシヨン検定の使用は、Ｘ線フイ
ルム上にバンドを視覚化するための長い感光時間によつ
て幾分か妨げられている。一般的なサザン法は感光のた
めに１〜７日間を要する。さらに、この技法の多くは標
識剤として放射性同位体を必要とする。放射性標識剤を
使用するには特別の実験手段とライセンスが必要であ
る。
放射線標識を使用する検定法に関係した上記の諸問題
は、発光分子のような非放射性標識を使用する免疫検定
法の開発へと導いた。一般的にはスミス（Smith）らのA
nn.Clin.Biochem.18:253-74（1981）を参照されたい。
発光標識は外部エネルギー源によつて励起された際に光
を発し、励起エネルギー源の種類に応じて、例えば高エ
ネルギー粒子からエネルギーを誘発する放射性発光標
識；化学反応からエネルギーを得る化学発光標識；励起
エネルギーが生物学的系に供給される生物発光標識；お
よび赤外線、可視光線または紫外線の電磁線（光子、フ
オトン）の単位によつて励起される光ルミネツセンスま
たは螢光標識；に分類される。上記文献の255頁を参照
されたい。
非放射性エネルギー源によつて励起される標識を使用
する発光検定法は、放射性標識を使用する検定法に伴う
健康上の危険性やライセンスの問題を回避することがで
きる。さらに、発光標識の使用は、標識プローブが検定
試薬と結合したときに結合しなかつたときとは異なる発
光特性を示し、その結果結合した標識プローブと結合し
なかつた標識プローブとを分離する必要がないという点
で“均質な”検定法の開発を可能にする。沈殿、酵素、
発光標識成分を使用する非放射性核酸型検定は信頼でき
るとみなすに足る感度または特異性を与えていない。
発光検定法では、生物学的試料中のタンパク質や他の
分子の存在が励起光線の散乱（“レイリー散乱”）を引
き起こし、その結果励起光線の波長の約50mm以内の波長
で光を発する発光標識との干渉が生じる。内因性の化合
物はまた散乱分子に特徴的な比較的長い波長で励起光線
を散乱させ（“ラマン散乱”）、また発光標識の発光ス
ペクトル中の光線を吸収し、その結果発光プローブの消
光をもたらす。
不均質な発光検定法の感度を改善する試みはいわゆる
“時間分解（time resolved）”検定法の開発へと導い
た。ソニ（Soni）らのClin.Chem.29/1,65-68（1983）；
米国特許第4176007号を参照されたい。時間分解検定法
は一般に試料中に存在する物質の自然螢光の発光寿命１
〜20nsecとは著しく異なる（通常はより長い）発光寿命
をもつ発光標識を使用することを含む。検定の結合工程
を行い、分離された結合標識物質または非結合標識物質
をキセノン放電管または他のパルス化エネルギー源から
発生する一連のエネルギーパルスにより励起する。各パ
ルスから生じる標識の発光は、試料中のバツクグラウン
ド物質の自然螢光の寿命よりも長い時間で測定する。こ
うしてバツクグラウンド散乱および短命の試料螢光から
の干渉が測定発光から排除される。
プローブまたは試料DNAの分離や固定化を必要とする
この技法は非放射性検定の操作を煩雑にしている。発光
標識成分の発光は固体支持体によつて低下される。支持
物質はバツクグラウンド螢光源であり得、また発生光線
を反射もしくは散乱させて検定を妨害する。ハイブリダ
イゼーシヨン工程に要する時間は、相補的DNA鎖が相補
的対合関係にあるDNA鎖対の一方の固定化により完全に
遊離状態でない場合に増大する。標識プローブの固体支
持体への非特異的結合も検定の精度を低下させる。
発明の要約 本発明の目的は、対象とする標的ポリヌクレオチド鎖
の検定を行うための方法、試薬、組成物、キツトおよび
器具を提供することである。その他の目的は以後に示す
であろう。
要約すると、本発明の実施態様は生物学的結合対の構
成員である標的分子について試料を検定する方法を包含
する。本方法は試料とプローブ（プローブリガンドおよ
びプローブ抗リガンドを含む）含有試薬とを結合条件下
で接触させることを含む。プローブリガンドおよびプロ
ーブ抗リガンドは互いに対して第１の結合位置をとるこ
とができ、プローブ構成員の少なくとも一方は標的分子
に対して第２の結合位置をとることができる。プローブ
構成員はプローブリガンド上に位置する第１標識成分お
よびプローブ抗リガンド上に位置する第２標識成分を含
む。第１および第２標識成分はプローブリガンドおよび
抗リガンドが第１結合位置で存在するとき相互作用し
て、２つの位置の一方にある試薬リガンドおよび抗リガ
ンドに特徴的な検出しうる信号を発することができる。
試料は標的分子の存在と関連した信号の存在について監
視される。
本発明の実施態様はさらに標的ポリヌクレオチド鎖に
ついて試料を検定する方法を包含する。本方法は試料と
試薬（第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌ
クレオチドプローブを含む）とを結合条件下で接触させ
ることを含む。第１および第２プローブはプローブ同士
が互いに結合する位置をとることができ、プローブの少
なくとも一方はそのプローブが標的ポリヌクレオチド鎖
と結合する第２位置をとることができる。第１および第
２プローブは一方のプローブに位置する第１標識成分お
よび他方のプローブに位置する第２標識成分を含む。第
１および第２標識成分は第１および第２プローブが互い
に結合したとき相互作用して、２つの位置の一方にある
試薬鎖に特徴的な検出しうる信号を発することができ
る。試薬と接触させた試料は、試料中に標的ポリヌクレ
オチド鎖が存在することと関連する信号の存在について
監視する。本方法は固定化工程を必要とせずに、また放
射性標識技術を使用せずにポリヌクレオチド試料を検定
することができる。
好ましくは、少なくとも１つの標識成分は一方のプロ
ーブの３′末端に存在し、そして第２標識成分は他方の
プローブの５′末端に存在する。各プローブに対して複
数の標識成分を使用することができ、好ましくは２つの
標識成分（各末端に１つずつ）を使用する。例えば、第
１標識成分は３′位置で第１プローブと結合し、第２標
識成分は５′位置で結合する。類似の標識成分の構成
（すなわち３′位置に第１標識成分および５′位置に第
２標識成分）をもつ第２プローブは、相対するプローブ
の第１および第２標識成分がきわめて接近して相互作用
することができるように、第１プローブとハイブリダイ
ズするであろう。
本発明方法の実施態様は、増幅手段中に標的配列と実
質的に同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドセグメ
ントをスプライシングして、試薬ポリヌクレオチドセグ
メントの多数のコピーを形成させることによる追加のプ
ローブ作製工程を含む。好適には、増幅手段は細菌中に
組み込んだときに増殖する高いコピー数のプラスミドま
たはフアージである。標的配列と実質的に同一の塩基配
列を有するポリヌクレオチドセグメントは細胞成分、お
よび望ましくない細菌、プラスミドまたはフアージDNA
から単離し、制限消化してセグメントとなす。その後、
セグメントは標識成分を付加してプローブを作製するた
めに利用される。
さらに、各プラスミドまたはフアージ誘導セクシヨン
は制限酵素で消化して、標識成分を一まとめにして結合
できる多数のサブセクシヨンとする。各サブセクシヨン
は標的鎖の代表的部分とハイブリダイズすることができ
るであろう。プラスミドまたはフアージ源由来の多数の
試薬プローブはより優れた信号発生能をもたらし、効率
よくかつ比較的安価にプローブを提供するであろう。
本発明の実施態様はさらに、DNA鎖の３′末端を非放
射性標識するための方法およびその結果得られる組成物
を包含する。その組成物は核酸のアミノアルキル誘導体
を有するDNA鎖を含む。核酸のアミノ基はアミン反応性
標識成分と反応することができる。好ましくは、そのア
ミノアルキル誘導体は脂肪族の第１アミノ基を含む。よ
り詳細には、好適なアミノアルキル誘導体は酵素ターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（Td
T）によつて試薬鎖に結合し得るアミノヘキシルアミノ
アデノシン三リン酸のようなリボ核酸誘導体を含む。
ターミナルトランスフエラーゼは一本鎖DNAの末端に
１つまたは２つのリボ核酸誘導体を付加して、それによ
り信号強度を標準化するために大きさによつて分類しな
ければならず且つ立体効果に寄与しうるデオキシ誘導体
の尾部に本来備わつている諸問題を取り除くであろう。
尾部上の標識はエネルギー転移のための適当な立体関係
または衝突の相互作用をもはやもたない。しかしなが
ら、尾部は尾部上の標識成分が“サイレント（silen
t）”である場合に良好であり、例えば多くの消光剤は
消光剤のより大きな局部濃度ゆえにより大きな消光活性
をもたらし、しかも消光剤が非螢光性である場合には増
大したバツクグラウンドを示さない。
本発明の実施態様はさらに、生物学的結合対の一部で
ある標的分子の検定を行うためのキツトを包含する。標
的分子が特定の塩基配列を有する核酸のセグメントであ
る場合に、キツトは第１ポリヌクレオチドプローブおよ
び第２ポリヌクレオチドプローブを含む試薬を包含す
る。第１および第２プローブはそれらが結合条件下で互
いに結合する第１の位置をとることができ、これらのプ
ローブの少なくとも一方はそのプローブが標的と結合す
る第２の位置をとることができる。第１および第２プロ
ーブは一方のプローブと結合した少なくとも１つの標識
成分および他方のプローブと結合した第２標識成分を有
する。第１および第２標識成分は第１および第２プロー
ブが第１位置にあるとき相互作用して、２つの位置の一
方にあるプローブに特徴的な検出しうる信号を発するこ
とができる。
本発明の実施態様はさらに、本方法に従つて検定を行
うための器具を包含する。標的がポリヌクレオチドセグ
メントである場合、その器具は試薬と標的を実質的に混
合した均質状態で収容するのに適した反応室を含む。試
薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリヌク
レオチドプローブを含有する。第１および第２プローブ
はそれらが結合条件下で互いに結合する第１の位置をと
ることができ、これらのプローブの少なくとも一方はそ
のプローブが標的と結合する第２の位置をとることがで
きる。第１および第２プローブはこれらのプローブの一
方と結合した少なくとも１つの標識成分および他方のプ
ローブと結合した第２標識成分を有する。第１および第
２標識成分は第１および第２プローブが第１位置にある
とき相互作用して、２つの位置の一方に特徴的な検出し
うる信号を発することができる。器具はさらに信号を検
出するための適当な検出手段（例えば発光剤の場合には
光電増倍管）を含む。
螢光検定において使用するのに適した本器具の態様は
適当な標識励起手段（適切な波長を定めるフイルターを
備えたレーザーまたは光−放射装置、または化学発光剤
や酵素剤の場合には補助因子を注入するための注入装置
など）を含む。
好適な器具は光を反応室へパルス化し、エネルギー転
移により生じた螢光の放出を選択的に読み取つてバツク
グラウンド螢光を減らすための時間分解制御（time res
olved control）を含むであろう。
好適な実施態様の説明 今や本発明の好適な態様を模式図によつて示す図面を
参照すると、特に第１図では、必要な試薬組成物と共
に、標的ポリヌクレオチド鎖の検定方法が模式的に示さ
れている。慣用の検定法において、１つ以上の標的鎖お
よび１つ以上のプローブ鎖を用いて検定が行われる。し
かしながら、単純化して本発明をより理解しやすくする
ために、図面では単一の試薬セグメントと単一の標的セ
グメントのみを示す。
第１図はハイブリダイズした又は相互に結合した第１
位置にある第１および第２ポリヌクレオチド鎖プローブ
（それぞれP1およびP2）を示す。また、対象とする２つ
の相補的な標的鎖から成る二本鎖DNA（それぞれT1およ
びT2）を示す。第１プローブ（P1）は各末端に２つの標
識成分（A1およびD1）を含む。第１標識成分（A1）は第
１プローブ（P1）の５′末端に共有結合されており、そ
して第２標識成分（D1）は第１プローブの３′末端に共
有結合されている。同様に、別の第１標識成分（A2）が
第２プローブ（P2）の５′末端に共有結合されており、
そして別の第２標識成分（D2）が第２プローブの３′末
端に共有結合されている。相対するプローブの第１およ
び第２標識成分（A1とD2）および（A2とD1）は第１およ
び第２プローブが相互に結合した第１の位置にあるとき
相互作用することができる。
当分野で通常の知識を有する者は、標識成分が共有結
合以外の方法、例えば限定するものではないが挿入（in
tercalation）、キレート化、およびイオン的、親水的
または疎水的親和性によりDNAプローブと結合または会
合しうることを認めるであろう。本明細書で使用する
“会合”という用語は標識成分をプローブに結合させる
全ての手段を包含する。
本発明の標識成分はそれらを相互作用させる方法で対
合または集合される。例えば、限定するものではない
が、標識群は第１および第２螢光団を含む標識成分の組
合せ、螢光団および化学発光成分の組合せ、化学発光成
分および補助因子の組合せ、沈殿剤および可溶化剤の組
合せ、酵素および基質の組合せ、ならびに比色定量成分
および補助因子の組合せであり得る。
第１図において、第１標識成分は特定波長（hv1）の
エネルギーまたは光を受信し且つ第２波長（hv2）でエ
ネルギーまたは光を発信し得る螢光団（A1およびA2）で
ある。同様に、第２標識成分は特定波長（hv3）のエネ
ルギーまたは光を受信し且つ第２波長（hv1）でエネル
ギーを発信もしくは転移し得る螢光団（D1およびD2）で
ある。相対するプローブの第１および第２螢光団（A1と
D2）および（A2とD1）は、第１および第２プローブが相
互に結合した第１の位置にあるとき相互作用することが
でき、こうして第２螢光団から放射される光は消去され
る。さらに、通常第１螢光団（A1およびA2）が受信でき
ない波長hv3の光は相互作用により波長hv2の発光をもた
らす。
第１図に示すように、プローブ（P1およびP2）は標的
鎖（T1およびT2）に加えるかまたは組み合わされる。プ
ローブおよび標的鎖は変性して分離させる。次に、プロ
ーブと標的をハイブリダイズさせ、さらにプローブが標
的と結合してプローブ−標的ハイブリツド（PT1およびP
T2）を形成する第２位置へ結合させる。各プローブ鎖の
標識成分は相対するプローブ鎖の標識成分から分離され
て相互作用することができない。
プローブ鎖（P1およびP2）が相互に結合した第１の位
置では、第２螢光団（D1およびD2）を励起するのに適し
た波長（hv3）の光エネルギーの放射が、初期励起波長
（hv3）または第２螢光団（D1およびD2）の通常の放出
波長（hv1）とは異なる波長（hv2）の光エネルギーを第
１螢光団（A1およびA2）から放出させる。プローブ（P1
およびP2）と標的（T1およびT2）との第２位置へのハイ
ブリダイゼーシヨンは、相対するプローブ鎖（A1とD2;
およびA2とD1）の標識成分同士の相互作用の分裂をもた
らし、そして第１螢光団（A1およびA2）の放出波長（hv
2）での光の放出を減少させる。第１標識成分、すなわ
ち螢光団（A1およびA2）、の放出波長（hv2）の光の放
出減少は存在する標的の濃度と逆の関係にある。
第２螢光団（D1およびD2）の発光は通常第１螢光団
（A1およびA2）の存在下で消滅され、その結果放出波長
（hv1）の光エネルギーはほとんど放出されないか又は
全く検出されない。しかしながら、プローブ鎖（P1およ
びP2）と標的鎖（T1およびT2）がハイブリダイズしてプ
ローブ標的ハイブリツド（PT1およびPT2）を形成する
と、相対するプローブ鎖（A1とD2;およびA2とD1）の標
識成分同士の相互作用がこわされて、第２螢光団（D1お
よびD2）から波長（hv1）の検出可能な光エネルギーが
放出され、これは標的（T1およびT2）と結合した第２位
置をとるプローブ（P1およびP2）に特徴的である。第２
標識成分、すなわち螢光団（D1およびD2）、の放出波長
（hv1）の光の放出増加は標的鎖の濃度と関係がある。
２つの波長（hv1）および（hv2）での第１および第２
標識成分、すなわち螢光団（A1とA2;およびD1とD2）、
の発光値は分析的に組み合わされていずれか一方の値の
みよりも優れた感度および精度の標的鎖の濃度に関する
合計値を与えることができる。どちらの信号も標的鎖
（T1およびT2）の存在について監視される。
第１および第２螢光団の選択、光散乱、二次螢光、お
よび光を螢光団に放射する励起装置または発光装置の制
限により、多重信号特にプローブ（P1およびP2）が互い
に結合した位置にあるときの第１螢光団（A1およびA2）
の信号を検出することは難しいかも知れない。さらに、
光放出波長（hv2）は第２螢光団（D1およびD2）の相互
作用により必ずしも第１螢光団（A1およびA2）の通常の
放出波長ではない。光放出（hv2）は第１螢光団（A1お
よびA2）または第２螢光団（D1およびD2）単独とは全く
異なる組合せもしくは群としての標識成分に特徴的であ
り、あるいは消光されるかも知れない。
変性およひ再アニーリング後に、相対するプローブの
標識成分、すなわち第１および第２螢光団（Ａおよび
Ｄ）は分離され、そして標的−プローブハイブリツド
（PT1およびPT2）の形成により離れた状態にある。標的
−プローブハイブリツド（PT1およびPT2）の形成は、第
１標識成分の螢光団（A1およびA2）が第２螢光団（D1お
よびD2）からのエネルギーを受け入れる又は消す能力を
破壊する。エネルギーを受け入れる第１螢光団へエネル
ギーを送る第２螢光団（D1およびD2）の信号発生能は、
一般に検出するのが比較的簡単である。第２螢光団（D1
およびD2）の信号強度の増加は試料中の標的の濃度およ
び存在を示す尺度である。特定試料中の標的の量が多く
なればなるほど、第２螢光団の放出波長（hv1）の信号
強度は大きくなる。
本方法は第２図に示す装置を用いて実施される。この
装置は次の主な手段：すなわち励起手段または光源、収
納容器およびフオトンカウンター（PC）の形の信号検出
器を含む。
収納容器は標的ポリヌクレオチドを含む可能性がある
試料と試薬を収容するのに適している。必要ならば、試
料は当分野で知られた適当な標的捕獲／放出技法により
標的ポリヌクレオチド以外の全ての細胞成分を除くため
に処理される。試料中のタンパク質系物質を溶解するた
めにはカオトロピツク塩が使用される。
試料は第１プローブおよび第２プローブを含む試薬と
混合される。第１および第２プローブはこれらのプロー
ブが互いに結合する第１の位置、およびこれらのプロー
ブの少なくとも一方が標的と結合しうる第２の位置をと
ることができる。各プローブはそれと会合した第１およ
び第２標識成分（例えば螢光団）を含み、第１および第
２標識成分はプローブが互いに結合した第１位置にある
とき相互作用する。試薬はハイブリダイゼーシヨンを促
進する当分野で知られた促進剤を含んでいてもよい。
自動分析用に設計された器具において、第２図に示す
装置は好ましくは複数の収納容器を収めるための手段を
含むであろう。試料を含む収納器は順次分析される。試
料の精製、加熱、混合および再アニーリングは標識信号
が測定されるステーシヨンから離れたステーシヨンで行
うのが好ましい。従つて、収納容器は試料の精製、加熱
および混合を行う第１ステーシヨンまたは一連のステー
シヨンから、プローブおよび標的（存在するならば）を
再アニーリングさせる第２ステーシヨンへ運ばれる。そ
の後、収納容器は標識信号を監視する第３ステーシヨン
へ送られる。
運搬手段は回転可能なターンテーブル、コンベヤーベ
ルトまたは他の手段を含む。病院の臨床設定において
は、運搬手段は手動による移動を含む。従つて、病院の
医員は患者から組織試料を採取し、その試料を収納容器
の中に入れることができる。試料の精製、加熱および試
薬の混合はベツドサイドで開始され、そして収納容器を
信号監視用の第３ステーシヨンに移しながら継続される
だろう。
今や第１ステーシヨンを参照すると、試料とプローブ
を融解温度に加熱するための加熱手段が収納容器にきわ
めて接近して配置されている。標的およびプローブはプ
ローブ同士が互いに結合する第１の位置、または標的が
存在する場合に少なくとも１つのプローブがその後の冷
却の際に標的と結合する第２の位置のいずれかをとるこ
とができる。加熱手段は化学熱源、電気熱源または当分
野で知られた他の熱源を含めた多くの形をとることがで
きる。収納容器は試料とプローブの混合を促すために攪
拌手段を含む。
第１ステーシヨンから、プローブと標的（もし存在す
るならば）を再アニーリングさせる第２ステーシヨンへ
収納容器を運ぶ。融解または変性温度からの収納容器の
冷却を促進するために、第２ステーシヨンは冷却手段を
含む。冷却手段はもしも十分な時間が許されるならば必
要でなく、プローブと標的を再アニーリングさせるため
には周囲温度でも十分に低い。
第２ステーシヨンを去つて、収納容器は信号（２つの
位置の一方をとるプローブに特徴的である）を監視する
第３ステーシヨンへ送られる。
第３ステーシヨンは標識成分の１つを励起する手段を
含む。第１および第２標識成分が螢光団であるこの例で
は、励起手段は第２螢光団の実質的励起を生じさせない
ように適当なフイルターを備えた光源を含む。また、適
当に挾い発光スペクトルをもつレーザーも使用し得る。
標識成分の１つが化学発光剤を含む場合、その励起手
段は発光反応を生じさせるための適当な補助因子を収納
容器の中に注入する手段を含むであろう。
第３の作業ステーシヨンは収納容器からの螢光を受け
るべく配置された信号検出器、フオトンカウンター（P
C）を含む。好ましくは２つのフオトカウンター（PC）
を使用する。１つのフオトンカウンターは第１標識成分
から発せられる信号を受信し、そして第２のフオトンカ
ウンターはフイルターまたは時間分解法の使用により第
２標識成分から発せられる信号を受信する。
フオトンカウンターはアナライザーによつて受信さ
れ、増幅され、処理されるフオトン信号を発する。アナ
ライザーはその結果をオペレーターに送る他の装置に表
示させるように、フオトン信号を処理して図式的に示す
ことができる値に変える。
本装置はパルス化光源またはシヌソイド変調光源と共
にアナログデフエクターを使用することにより、寿命分
解法に適合させることができる。寿命分解法は本発明者
の係属中の米国特許出願第738560号（1985年５月28日
付）に説明されており、これは参照によりここに引用さ
れる。
本発明は合成オリゴヌクレオチドと共に使用するのに
都合がよい。しかしながら、本発明は経済的な方法でプ
ローブ（P1およびP2）を作製する生物学的クローニング
法に容易に適合させることができる。
今や第３図を参照すると、標的配列に相補的であるこ
とが知られている塩基配列を含むDNAの二本鎖セグメン
ト（以後プローブセグメントと呼ぶ）が慣用組換えDNA
法によりプラスミドの中に導入される。例えば、プラス
ミドはプラスミド環を開裂して一本鎖の突出部または接
着末端を生じさせる制限エンドヌクレアーゼで消化す
る。その接着末端はプローブセグメントの接着末端に相
補的であつて、それと結合する。プローブセグメントは
その後のクローンの同定のための選択マーカーと共に挿
入される。
プラスミドはその後プラスミドが複製または増幅され
る大腸菌（Escherichia coli）のような細菌の中に挿入
される。細菌はプローブセグメントと選択マーカーを首
尾よく組み込んだ細菌以外の細菌に対して有毒である培
地上でコロニーへと増殖させる。
細菌コロニーを増殖させてプラスミドを高コピー数へ
と複製させた後、細菌DNAおよびプラスミドDNAは他の細
胞成分から分離し、そのDNAを制限酵素で消化してプラ
スミドDNAからプローブセグメントを切断する。次い
で、プローブセグメントは電気泳動を含めた適当な手段
で単離する。そのプローブセグメントは末端標識化して
プローブを作製するのに適しているか、あるいはプロー
ブとして価値があるサブセクシヨンから成つている。従
つて、大きいプローブセグメントは制限酵素による消化
を数回行つて、大きいプローブセグメントを小さいプロ
ーブサブセグメント（その３′−および５′−末端を標
識化するのに適している）に切断しうる。
プローブセグメントまたはサブセグメントの３′末端
の標識化は、活性化螢光団との反応に利用し得る官能基
をもつヌクレオチドの使用により達成される。官能基を
もつヌクレオチドはターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ（TdT）の使用によりプローブセグ
メントに付加される。酵素TdTはリボヌクレオチドの１
個または２個の塩基をプローブセグメントに付加させる
だけであり、従つてプローブセグメントへのヌクレオチ
ドの尾部または伸長鎖の付加が回避されるだろう。ヌク
レオチドの大きい尾部または伸長鎖は、標識成分間のエ
ネルギー転移を変え、またプローブ鎖の標的鎖へのハイ
ブリダイゼーシヨンを変更もしくは損なう恐れのある立
体効果を有するだろう。プローブセグメントの５′末端
の標識化は、二官能性脂肪族基を使用してプローブセグ
メントに標識成分を結合させることにより達成される。
好ましくは標識成分は脂肪族ジアミンによつてプローブ
セグメントに結合される。
初めに一本鎖DNAの３′末端の標識化について見る
と、酵素TdTの使用によりヌクレオチドをDNA鎖に付加さ
せる反応は次のように表わされる。
上記反応式において、p(dx)mは長さがｍ個の塩基のオリ
ゴデオキシヌクレオチドであり、Ｎはアデニン、グアニ
ン、シチジン、ウリジン、チミンまたはその修飾体のう
ちの１つである。ｎはDNA鎖に付加される単量体の数を
表わす。
好ましくは単量体は核酸のアミノアルキル誘導体を含
むだろう。アミノ基は多数の螢光剤と反応することがで
きる。より好ましくは、アミノアルキル誘導体は第一脂
肪族アミノ基を含む。酵素TdTおよびリボヌクレオチド
単量体の使用は、DNA鎖への単量体塩基の付加を１個ま
たは２個の塩基に制限する。M2+は金属イオン補助因子
を表わす。好適なリボヌクレオチド誘導体の例は８−
（６−アミノヘキシル）−アミノアデノシン−５′−三
リン酸（AHA-ATP）であり、その構造を以下に示す。
化合物AHA-ATPは多種多様の螢光標識の付加を可能に
する種々の化学反応を受けることができる第一脂肪族ア
ミノ基を含有する。
従つて、DNA鎖の３′末端はAHA-ATPおよびターミナル
トランスフエラーゼとpH7において反応し、その反応は
次のように表わされる。
得られる生成物鎖は沈殿剤または可溶化剤、比色定量
剤、発光剤、酵素または補助因子のような標識成分と反
応し得るアミン官能基を含み、それにより標識成分をも
つプローブを製造することができる。例えば、螢光団イ
ソチオシアネートはpH9.3でAHA-ATPのアミン官能基と反
応してプローブ鎖を形成する。その他のアミン反応性螢
光団には例えばフルオレセインイソチオシアネート、ス
ルホローダミン101スルホン酸クロリド（テキサスレツ
ド）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルピレンブタノエ
ート、エオシンイソチオシアネートおよびエリトロシン
イソチオシアネートが含まれるが、これらに限定されな
い。適当な化学発光剤および補助因子にはアミン反応性
ルミノール誘導体、ミクロペルオキシダーゼ、アクリジ
ニウムエステル、ペルオキシダーゼおよびそれらの誘導
体が含まれる。当分野で通常の知識を有する者は、アミ
ン反応性でない螢光剤および化学発光剤をアミン反応性
へと修飾して、本発明の標識成分として適するものにす
ることができることを認めるであろう。
DNA鎖はまたそれらの３′末端に１−N6−エテノアデ
ノシン−５′−三リン酸（EATP）のような螢光ヌクレオ
チド誘導体をターミナルトランスフエラーゼ（TdT）の
媒介により付加して標識化することができる。しかしな
がらDNAへのデオキシヌクレオチドの付加は標準化する
のが困難であり且つ立体効果を生じやすい多くの付加を
含む尾部または伸長鎖をもたらすかも知れない。他の螢
光ヌクレオチド誘導には例えば３′−（ジメチルアミノ
ナフトイル）−ATPまたは−CTPおよび／または螢光性複
素環を含むヌクレオチド三リン酸が含まれる。
一本鎖DNAの５′末端はそのDNA鎖の５′−リン酸を活
性化螢光団に結合させるエチレンジアミンを使用するこ
とによる２段階反応で標識化され、この反応は次のよう
に表わされる。
合成ポリヌクレオチドは５′−ヒドロキシル基をリン酸
化するための追加工程を必要とするだろう。リン酸化は
工程（Ｉ）に先立つて酸素T4キナーゼを用いて行われ
る。
好ましくは、カルボジイミドは水溶性であり、例えば
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）−カルボジイミドメト−ｐ−トルエン−サ
ルフエートおよびそれらの誘導体を含む。
エチレンジアミンポリヌクレオチド誘導体は標識成分
と反応することができる（工程II）反応性アミン官能基
を有する。反応性アミン官能基はpH9.3でイソチオシア
ネートと反応してプローブ鎖を形成するだろう。一方の
末端標識（例えば５′末端標識）のための適当な標識成
分は、他方の末端標識（３′末端標識）成分を補足する
ように選択される。適当な螢光団には例えばフルオレセ
インイソチオシアネート、スルホローダミン101スルホ
ン酸クロリド（テキサスレツド）、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミジルピレンブタノエート、エオシンイソチオシ
アネート、エリトロシンイソチオシアネートおよびそれ
らの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。適当
な化学発光剤および補助因子にはルミノール、ミクロペ
ルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アクリジニ
ウムエステル、ルシゲニンおよびそれらの誘導体が含ま
れる。
今や第４図を参照すると、一本鎖DNAに関して説明さ
れた標識化法は、生物学的源から単離された二本鎖DNA
セグメントにも応用できる。こうして、図示するよう
に、細菌プラスミドから単離された代表的DNAセグメン
トは２本の相補的なDNA鎖（各DNA鎖は３′ヒドロキシル
基と５′−リン酸基を有する）から成る。二本鎖DNAセ
グメントはエチレンジアミンおよび活性化螢光団と反応
させて、両方のDNA鎖の５′−リン酸位置に第１螢光団
（Ａ）を同時に共有結合させることができる。
次に、二本鎖DNAセグメントはTdTの媒介によりAHA-AT
Pと反応させ、そして各DNA鎖の３′−位置に第２螢光団
（Ｄ）を共有結合させる。従つて、一方のプローブ鎖の
第１螢光団（Ａ）はDNAセグメントの両末端で他方のプ
ローブ鎖の第２螢光団（Ｄ）と相互作用するように位置
づけられる。標識成分の第１螢光団（Ａ）および第２螢
光団（Ｄ）は相互作用して、プローブが標的とのハイブ
リダイゼーシヨンの際にとりうる２つの位置の一方に特
徴的な信号を発することができる。
本発明は好適な実施態様の特徴を示す次の実施例によ
りさらに説明される。
実施例 A.物質および方法 次の実施例において、１−N6−エテノアデノシン−
５′−三リン酸（ナトリウム塩）、２′−デオキシアデ
ノシン−５′−三リン酸（ナトリウム塩）、DNAオリゴ
マー、およびセルロースに固定されたオリゴマーはニユ
ージヤージー州ピスカタウエーのフアーマシア・バイオ
ケミカルズ社から購入した。制限酵素はメリーランド州
ガイサースバーグのベセスダリサーチ研究所から購入し
た。低分子量形のターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼ（TdT）はフロリダ州セントピーター
スバーグのライフサイエンス社から購入した。８−（６
−アミノヘキシル）−アミノアデノシン−５′−三リン
酸（AHA-ATP）はミズーリ州セントルイスのシグマケミ
カルズ社から購入した。プラスミドpSP65はウイスコン
シン州マジソンのプロメガ・バイオテクから購入した。
アミン反応性螢光団はオレゴン州ジヤンクシヨンシテイ
ーのモレキユラープローブズ社から購入した。他の全て
の試薬は分析級またはそれ以上のものであつた。合成DN
Aオリゴマーはいくつかの市販源（カリフオルニア州エ
メリービルのアメリカン・バイオヌクレアーを含む）か
らの試薬類および標準ホスホルアマダイト法を用いてバ
イオサーチ・サム・ワン自動DNA合成機（カリフオルニ
ア州サンラフアエル）で製造した。
本実施例において、TdT反応緩衝液（2X）はpH7.1で0.
4Mカコジル酸、0.002Mジチオトレイトール、0.016M塩化
マグネシウムを含む。結合緩衝液はpH7.5で1M塩化ナト
リウム、0.02Mリン酸カリウム、一塩基性（KH2PO4）を
含む。ホウ酸緩衝液は0.05Mホウ酸を含むか、あるいは
塩酸または水酸化ナトリウムの添加によりpH9.3に調整
した0.05Mホウ酸ナトリウム溶液を含む。吸光度測定はD
NAプローブの組成、DNAおよびDNAプローブの濃度、なら
びにDNA融解実験（融解曲線）における塩基対合度を測
定するために行われた。吸光スペクトルはキヤリー17D
吸光度分光光度計（カリフオルニア州パロアルタのバリ
アンアソシエーツ社）を使つて記録した。温度の関数と
してDNAの吸光度の変化を測定するために、サーモスタ
ツト付きのキユベツトホルダーの温度をハークモデルA8
1冷却水浴（ニユージヤージー州、サドル・ブロツク）
を用いて制御した。ホモポリマー濃度の測定において使
用した吸光係数は、フアーマシア・モレキユラー・バイ
オロジカルズのカタログの付録に載つている吸光係数編
集物から得た。同じ付録に載つているホモポリマーおよ
び交互ホモポリマーDNAの吸光係数の平均は混合塩基配
列の吸光係数を概算するために使用され、一本鎖DNAに
ついては8.7×103l/mol/塩基および二本鎖DNAについて
は6.8×103l/mol/塩基であつた。非結合螢光団の吸光係
数は複合DNAプローブ中に存在する螢光団の量を測定す
るために使用した。
螢光スペクトルはSLMモデル4800アナログ分光螢光計
（イリノイ州アーバナ、SLM-AMINCOインスツルメンツ
社）を使つて測定および記録した。より優れた感度を得
るために、アナログ分光螢光計は螢光のフオトン計数検
出を行うように改良した。この改良は通常の検出器の代
わりに、周囲温度ハウジング内にハママツモデルR928光
電増倍管を、そして−30℃付近に保たれた熱電冷却ハウ
ジング（リサーチモデルTE-177RF用の製品）内に同じ型
の光電増倍管を含んでいた。管のアノードの電流パルス
が増幅され、調整され、そしてEG＆G ORTECヌクレアー
・インスツルメンテーシヨン・モジユールを使つて計測
された。このモジユールはモデル9301フアースト前置増
幅器、モデル9302増幅器−弁別器、およびモデル874ク
ワドカウンター／タイマーを含んでいた。光電増幅管の
ダイノード・チエイン（Dynode chain）のための高電圧
はEG＆G ORTECモデル478電力供給器によつて供給した。
カウンターモジユールはヒユーレツト・パツカード98
25コンピユータにIEEE-488インタフエースを介して接続
した。コンピユータおよびインタフエースは螢光光度計
の非改良部分の基準検出器測定およびモノクロメーター
走査と同調させてフオトン計測スペクトルを得られるよ
うにした。
温度制御はハークモデルA81水浴と接続したSLMサーモ
スタツト付きキユベツトホルダーを用いて維持した。
走査しない場合、試料の発光は一般にモノクロメータ
ーの代わりにフイルターを使用した螢光光度計の第２開
口部を通して測定された。フルオレセイン標識DNAを含
む試料からの発光は、520nm（FWHM＝8.2nm）に集中した
ピーク透過率をもつデイトリツク・オプチツクス３キヤ
ビテイ干渉フイルターを通して濾光した。フルオレセイ
ン試料は2nmに設定されたモノクロメーター帯域幅で490
nmにおいて励起させた。時間の関数としてのフルオレセ
イン発光は、データ蓄積および運動学的情報の処理が可
能なヒユーレツト・パツカードモデル9836コンピユータ
にインタフエースで接続されたカウンターモジユールを
使つて記録した。
いろいろな公知のハイブリダイゼーシヨン条件が本方
法において使用された。ハイブリダイゼーシヨン条件の
ための一般基準はメインコス（Meinkoth）およびワール
（Wahl）,Analytical Biochemistry,vol.138,P.267-284
（1984）に開示されている。
当分野で通常の知識を有する者は必要に応じて次の条
件を使用するであろう。ハイブリダイゼーシヨンの最適
速度は一般に融解転移温度より約20°〜25℃低い温度で
得られる。より高いストリンジエンシー（Stringency）
のためには、ハイブリダイゼーシヨンは融解温度の５°
または10℃以内の温度で行われる。ラムダDNAの形のキ
ヤリアーDNAの添加は、低濃度でプローブの安定性を高
めることが判明した。いくつかの場合には、DNAの安定
性を改善するためにEDTAも加えられた。濃縮剤や促進剤
のような他の添加剤は、これらがプローブの作製に使用
されるサイズオリゴマー（size oligomer）に効果的で
あり且つこれらの添加によつて螢光バツクグラウンドが
非常に増加しない限り、ハイブリダイゼーシヨン溶液中
で使用することができる。
実験で使用する一般方法は、まず初めに標的とプロー
ブDNAを一本鎖の形にする第１工程を含む。これは標的
および試料DNAを含む試料を水浴中で加熱することによ
り達成された。長いDNA標的の場合は、一般に試料は沸
騰水浴中で低塩緩衝液（または蒸留水）中約10分間加熱
される。プローブは高温度への長期暴露を避けるため
に、しばしばデハイブリダイゼーシヨン法の終り付近で
標的DNA含有試料に加えられた。デハイブリダイゼーシ
ヨンの最後に、ハイブリダイゼーシヨンのための塩およ
び緩衝剤の所望濃度を達成すべく、濃厚塩緩衝液を加え
た。比較的小さいオリゴマー標的およびプローブは、よ
り低い温度においてより高い塩緩衝液中で融解（変性）
される。通常のハイブリダイゼーシヨンでは1MのNaClが
使用されるが、DNAの融解温度を下げたい場合は100mMの
NaClも使用できる。その後、標的およびプローブの両方
を含む一本鎖試料はハイブリダイゼーシヨン温度まで冷
却させ、そして螢光団標識の相互作用の程度を確かめる
ために螢光測定を行つた。ハイブリダイゼーシヨン時間
の長さは数分（高プローブ濃度の試料の場合）から数時
間（低濃度のプローブDNAを含む試料の場合）まで変化
した。
次の実施例は代表的な実験方法を説明するものであ
り、初めにプローブセグメントの３′末端標識化を示
し、次にプローブセグメントの５′末端標識化を示し、
そして最後に末端標識生成物の競合的均質検定法への応
用について示す。
B.3′−末端標識化 一本鎖DNAの３′末端は２工程反応で標識化した。第
１工程では、反応性官能基をもつ１個のヌクレオチドを
各DNA鎖の３′ヒドロキシル基に結合させるために、酵
素TdTを使用した。第２工程は反応性官能基との反応に
よつて標識成分を各DNA鎖に結合させることを包含して
いた。
次の方法は12塩基長のデオキシチミジン（dT12）の一
本鎖ホモポリマー、それぞれ20塩基長のポリデオキシア
デノシンおよびポリデオキシチミジンの二本鎖ホモポリ
マー（dA20-dT20）、混合塩基合成オリゴマー、および
酵素AluIおよびHaeIIIで消化されたネオマイシンホスホ
トランスフエラーゼ遺伝子フラグメントを含むpSP65の
プラスミドフラグメントを使用して行つた。
今や第１工程をさらに詳しく見てみると、標準円錐形
プラスチツク管の中で約10n molのDNAを3.3mM AHA-ATP
水溶液25.5μｌと混合し、その試料を遠心真空装置（Sp
eed Vac,サバント）で乾燥させた。DNA/AHA-ATP溶液中
のAHA-ATP分子:DNAの３′末端ヒドロキシル基の比は約1
0:1であつた。DNA/AHA-ATP溶液に、TdT反応緩衝液30μ
ｌ、ウシ血清アルブミン20μｌ（水1ml当たりウシ血清
アルブミン500μｇ）、TdT500単位、および水を加えて7
0μｌの反応混合物を得た。この反応混合物を37℃の水
浴中で18〜24時間インキユベートさせた。
セルロース粒子に固定した相補的ホモポリマーに上記
ホモポリマーを10℃で結合させ、続いて結合緩衝液を用
いてそのセルロースを20℃で洗浄することにより、個々
のホモポリマー鎖を未反応のAHA-ATPから分離した。次
に、生成物を溶離して、pH9.3の0.05Mホウ酸緩衝液中に
セルロース粒子から分離した。
ホモポリマー二本鎖、混合塩基オリゴマー、およびpS
P65二本鎖プラスミド制限フラグメントはセフアデツク
スG-25クロマトグラフイー媒質および水またはホウ酸緩
衝液での溶離を使用するゲル透過クロマトグラフイー、
あるいはバイオ−ラツド研究所で製造したNACSイオン交
換カラムのようなイオン交換カラムにより未反応のAHA-
ATPから分離した。
第２工程では、一本鎖ホモポリマー、混合塩基オリゴ
マー、二本鎖ホモポリマー、または二本鎖プラスミドフ
ラグメントを一まとめにして考えると、AHA-ATPと各DNA
鎖の３′末端との反応により形成された末端アミノヘキ
シルアミノ−アデノシンの第一脂肪族アミノ基に、アミ
ン反応性螢光団が共有結合された。アミン反応性螢光団
にはスルホローダミン101（テキサスレツド）、ピレン
ブタノエート、フルオレセイン、エオシンおよびエリト
ロシン、イソチオシアネート誘導体、スルホン酸クロリ
ド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが含
まれる。アミン反応性螢光団は適当な非反応性可溶化溶
剤に溶解され、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルピレン
ブタノエートはアセトンに、スルホローダミン101スル
ホン酸クロリドはジメチルホルムアミドに、そしてフル
オレセインイソチオシアネートはジメチルスルホキシド
にそれぞれ溶解した。0.01モルの螢光団溶液を、AHA-AM
P結合DNA鎖を含む0.05モルのホウ酸／水酸化ナトリウム
緩衝液（pH9.3）に絶えず攪拌しながら滴下した。AHA-A
MP結合DNA鎖に対して20倍〜200倍モル過剰の反応性螢光
団を使用して、この反応を目的生成物へと至らしめた。
反応は16〜24時間続けた。反応時間の終りに、螢光団標
識化一本鎖ホモポリマーをマフイニテイクロマトグラフ
イーにより単離した。螢光団標識化された二本鎖ホモポ
リマー、混合塩基オリゴマー、およびプラスミドpSP65
の制限フラグメントはNACSカラムまたは上記のようなゲ
ル透過クロマトグラフイーにより単離した。螢光団標識
化された一本鎖ホモポリマー、混合塩基オリゴマー、二
本鎖ホモポリマー、および二本鎖プラスミドフラグメン
トは水もしくは結合緩衝液中に単離した。長期貯蔵のた
めに、螢光団標識化DNA溶液は遠心真空濃縮器で濃縮乾
固させ、−20℃で貯蔵した。
上記の２工程３′末端標識法の別法として、ポリヌク
レオチドは酵素TdTを用いて螢光ヌクレオチドにより直
接標識化することができる。例えば、一本鎖ホモポリマ
ー鎖はAHA-ATPを一本鎖DNAの３′末端に付加する方法と
同じ方法を用いて、その３′末端が螢光団、1,N6−エテ
ノアデノシン三リン酸（EATP）、修飾ヌクレオチドで標
識化された。
上記方法は表１に示すように一本鎖および二本鎖オリ
ゴマーの３′末端に位置づけられた螢光標識成分をもた
らした。
C.5′−末端標識化 DNAの一本鎖ホモポリマー、DNAの二本鎖ホモポリマ
ー、およびプラスミドDNAの制限フラグメントの５′末
端は２工程反応で標識化した第１工程では、DNA鎖の末
端５′リン酸基と反応性の二官能性有機分子（５′リン
酸基を標識成分に結合しうる）とをチユー（B.C.F.Ch
u）、ワール（G.M.Wahl）およびオーゲル（L.Orgel）,N
ucleic Acids Research,11（18）,6513-6529（1983）に
記載の方法に従つて縮合させた。第２工程はDNA鎖／反
応性有機分子を標識成分と反応させてプローブ鎖を形成
させることを包含する。
当分野で習熟した者は、多くの形の天然に存在するDN
Aがその５′末端でリン酸化されることを認めるであろ
う。非リン酸化DNAは酵素T4キナーゼを用いる初期リン
酸化工程を必要とし、この方法は当分野でよく知られて
いる。５′−DNA末端標識システムについてのベセスダ
・リサーチ研究所の製品カタログを参照されたい（ここ
に参照により引用される）。
例えば、第１工程を詳細に説明すると、水溶性カルボ
ジイミドの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−カルボジイミドを用いて、エチレンジアミン
と、一本鎖DNA、二本鎖ホモポリマーおよびpSP65プラス
ミドの二本鎖制限フラグメントの末端５′リン酸基とを
縮合させた。反応混合物は50n molのDNAを500μｌの水
に溶解し、0.5Mエチレンジアミン、0.2Mカルボジイミド
および0.2M2−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸
を含有する500μｌの反応溶液（pH6.0に調整）と混合す
ることにより調整した。この反応混合物を室温で16〜24
時間攪拌した。
エチレンジアミンと反応したDNAの一本鎖ホモポリマ
ーは、反応混合物に塩化ナトリウムを１モル濃度になる
まで加え、次にその混合物をセルロースに固定した相補
的ホモポリマーを含むカラムに10℃で通すことにより精
製した。その後カラムは結合緩衝液を用いて10℃で、次
に20℃で洗浄した。エチレンジアミンと反応したDNAホ
モポリマーは50〜65℃の温度でそのカラムに0.05Mホウ
酸緩衝液を通すことにより回収した。
二本鎖ホモポリマー、混合塩基オリゴマーおよびプラ
スミドDNAの制限フラグメントは、エチレンジアミンと
反応したDNAをセフアデツクスG-25カラムに通し、ホウ
酸／水酸化ナトリウム緩衝液で溶離することにより精製
した。別の精製法は低塩緩衝液中でエチレンジアミン反
応DNAをバイオ−ラツドNACSカラムに結合させ、高塩緩
衝液または2.0M酢酸アンモニウムで溶離することを包含
する。2.0M酢酸アンモニウムで溶離した試料は、遠心真
空装置または凍結乾燥器を用いて塩緩衝液を除去すべく
乾燥させた。
第２工程では、反応性有機成分のエチレンジアミンと
結合したDNA鎖を反応性螢光団とさらに反応させてプロ
ーブ鎖を製造した。より詳細には、アミン反応性螢光団
（イソチオシアネート誘導体またはＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル）を適当な非反応性可溶化溶剤に溶
解した。エチレンジアミン反応DNAを含む0.05Mホウ酸緩
衝液にpH9.3で絶えず攪拌しながら0.01M螢光団溶液を滴
下した。反応性螢光団はこの反応を目的生成物へと至ら
せるために20倍〜200倍モル過剰に加えた。反応は攪拌
下に16〜24時間継続した。
反応時間の終りに、５′−螢光団標識化DNAを過し
た。５′−螢光団標識化ホモポリマー一本鎖DNAはアフ
イニテイクロマトグラフイーにより単離した。５′−螢
光団標識化された二本鎖DNA、混合塩基オリゴマー、ま
たは標識プラスミド制限フラグメントはNACSカラムもし
くはゲル透過クロマトグラフイーにより単離した。５′
−螢光団標識化二本鎖ホモポリマーまたはプラスミド制
限フラグメントはその後水もしくは結合緩衝液中に単離
した。５′−螢光団標識化一本鎖DNAは下記の表２に示
される。
５′末端標識化ホモポリマープローブ鎖は相補的な
３′末端ホモポリマー鎖と結合して、二本鎖（一方の鎖
の３′−標識成分が他方の鎖の５′−標識成分と相互作
用する位置にある）を形成することができる。５′−お
よび３′−ホモポリマー二本鎖およびプラスミド制限フ
ラグメントは、２本の末端標識化相補的ポリヌクレオチ
ドプローブ鎖を含む。
多数の二本鎖プローブはまた大腸菌エンテロトキシン
遺伝子の合成DNAから作ることができる。オリゴマーの
相補対を合成して、その後標識した。大腸菌エンテロト
キシン／遺伝子のゲノム上の５つの異なる領域に対応す
る塩基配列をもつ５対のオリゴマーを製造した。４対は
21塩基長のオリゴマーを含み、１対は22塩基長のオリゴ
マーを含んでいた。10の一本鎖オリゴマーは標識するた
めに２群に分けた。１群はそれぞれの相補対の一員を含
み、他群は他の対員を含んでいた。ターミナルトランス
フエラーゼ反応混合物中にハイブリダイズしたDNAを避
けるために、非相補鎖同士を１つの群に集めた。末端ヌ
クレオチドの酵素付加は、平滑末端の二本鎖DNAプライ
マーを使用する場合にあまり効率がよくない。この方法
の標識効率は先の二本鎖プローブ製造のときに得られた
ものほど高くなかつたが、ハイブリダイゼーシヨンに関
連する螢光の変化は相当に低いプローブ濃度でそれを検
出するのに十分なほど大きかつた。
二本鎖ホモポリマー、プラスミド制限フラグメントお
よびトキシン遺伝子プローブは下記の表３に示される。
今や表３を参照すると、ホモポリマー二本鎖、混合塩
基オリゴマー、およびプラスミド制限フラグメントはそ
れぞれの各鎖の３′末端および５′末端の両方に標識を
含む。表１、２および３は二本鎖当たりの標識または一
本鎖当たりの標識を、標識化反応の効率の表示として含
む。プローブ当たりの標識の数は吸光分光分析法により
測定した。
相補的プローブ鎖の標識成分は、それらのプローブが
互いに結合した位置にあるとき、第５図にグラフで示す
ように相互作用することができる。第５図は温度がハイ
ブリダイズしたプローブの融解温度に関して変化すると
きの温度に対する螢光放出の関係を示している。プロー
ブはそれぞれ12塩基長のデオキシアデノシンとデオキシ
チミジンのホモポリマー二本鎖であり、５′−フルオレ
セインと３′−スルホローダミンの標識群を含む。図示
するように、中実の円および三角形はプローブ含有試料
の温度が降下しつつあるときに得られた値を表わす。中
空の円および三角形はプローブ含有試料の温度が上昇し
つつあるときに得られた値を示す。三角形によつて示さ
れた点は螢光放出の温度消光についての補正値を表わ
す。円によつて示された点は実際値を表わす。
より詳細には、第５図の融解曲線データは、1N NaCl
および0.02Nリン酸カリウムからなる緩衝液（pH7.5）中
のDNA試料について記録したものである。第５図にプロ
ツトしたデータは等モル量（0.1μＭ）の５′−フルオ
レセイン−dA12およびdT12−スルホローダミン−３′を
混合し、多くの試料温度での試料の平衡化の後に螢光放
出を測定することにより得た。また螢光放出に対する温
度の影響を調べるために、５′−フルオレセイン−dA12
単独の螢光を同一温度で測定した。５′−フルオレセイ
ン−dA12単独測定からのデータは２種のプローブ試料に
ついて記録された融解曲線を補正するために使用した。
補正データおよび未補正データの両方をプロツトした。
プローブを冷却して再アニーリングするとき、螢光放
出が抑制されて螢光信号強度の減少が生じる。プローブ
を融解温度または変性温度に加熱するとき、プローブは
分離して標識成分同士の相互作用がなくなる。螢光放出
はもはや抑制されず、螢光放出が増大する。
第５図に示す標識成分の相互作用は、DNAハイブリダ
イゼーシヨンを溶液中で測定するための慣用方法で測定
した“非標識”プローブの融解温度データと一致する。
第６図は温度が非標識プローブの融解温度により変化す
るときの温度と、260nMでの光エネルギーの吸光度と、
の関係をグラフによつて示している。第６図に示すプロ
ーブは12塩基長のデオキシアデノシンおよびデオキシチ
ミジンのホモポリマーを含む。中実の円で示したグラフ
の点は試料の温度が降下しつつあるときに読み取つたも
のである。中空の円は試料の温度が上昇しつつあるとき
に読み取つたものである。プローブの温度がプローブの
融解温度により変化するにつれて、260nMでの吸光度は
塩基対合の減少が原因で約0.135から約0.182まで増加し
た。吸光度測定によつて得られた非標識DNAの融解温度
は、螢光団の相互作用により測定した標識DNAの触解温
度と同じであり、このことはDNAの標識化がハイブリダ
イゼーシヨン過程を妨害しないことを示している。
標識成分の相互作用はまた表３および表４に示され
る。表３は非ハイブリツド形に対するハイブリツド形の
標識ホモポリマー複合体およびプラスミド制限フラグメ
ントの螢光強度の比較を含む。ハイブリダイズしたプロ
ーブの信号に対するハイブリダイズしなかつたプローブ
の信号の比は4.1程度に高いこともあり得る。
表４はハイブリダイズした標識プローブに対するハイ
ブリダイズしなかつた標識プローブの螢光強度の比較を
示す。
表３および表４において、螢光の変化はハイブリダイ
ゼーシヨン条件下で観察された螢光に対する非ハイブリ
ツド状態の一方または両方の標識の螢光の比として表わ
される。データはハイブリダイゼーシヨン状態を選択す
るために温度を使用した実験；相補的プローブを一緒
に、その後単独で試験した実験；またはプローブのハイ
ブリダイゼーシヨンを大過剰（通常10倍またはそれ以
上）の非修飾相補DNAの存在または不在下で行つた実
験；のいずれかから得られた。後者の実験において、大
過剰の標的DNAは相補的DNAプローブ同士が互いにハイブ
リダイズすることを妨げる競合的ハイブリダイゼーシヨ
ン反応をもたらす。同じ標識オリゴマーの異なる製法を
試験したプローブ対については、螢光変化の複数の値が
記入されている。表４はオリゴマーの単一標識化によつ
て作られたプローブを使つて得られたデータを含む。こ
れらのプローブの組成は表１および表２に載つている。
表３のデータは第１螢光団が各オリゴマーの５′末端に
あり且つ第２螢光団が３′末端にあるように標識された
プローブから誘導される。ハイブリダイゼーシヨン条件
において、一方の鎖の５′第１螢光団が相補鎖の３′第
２螢光団ときわめて接近する。
表３および表４は２つの標識の少なくとも１つの螢光
に有意な変化が生じる数種の標識の組合せを示す。フオ
ルスター（Forster）型エネルギー転移機構では、比較
的長い波長の光を吸収および放射する標識は、その標識
の励起の際に他の標識（エネルギー供与体）からのエネ
ルギーを受けとることが予期される。その標識が螢光で
ある場合、これはエネルギー受容標識からの発光の増加
に伴つて起こるエネルギー供与標識からの発光の減少を
もたらす。この機構に適合しうる挙動を示す標識の組合
せはフルオレセイン／スルホローダミン101、アクリジ
ン／スルホローダミン101、フルオレセイン／エテノア
デノシン、フルオレセイン／エオシンおよびフルオレセ
イン／エリトロシンである。
しかしながら、表３および表４はフオルスター型機構
に従つて行動しないいくつかの相互作用を示す。フオル
スター型エネルギー転移機構と一致しない挙動を示す標
識の組合せはフルオレセイン／ピレンブタノエートおよ
びフルオレセイン／アクリジンである。
たとえいくつかの標識組合せがフオルスター型エネル
ギー転移の典型的な行動を示すとしても、相互作用のメ
カニズムは２つの標識の一方だけから収集されたデータ
からは確認することができない。試験した標識組合せに
おいて、標識対の他方の一員はDNAに結合したとき本質
的に非螢光性であるか、あるいはハイブリダイゼーシヨ
ンの状態にほとんど影響を受けない螢光を示した。標識
の相互作用の仕方の不確かさは、２つの標識分子を互い
の衝突距離内にもたらす能力の結果である。衝突による
相互作用が可能である場合、動的消光のいろいろな機構
が競合して、観察される相互作用を支配しうる。接近し
た範囲の動的相互作用はまた静的相互作用よりも実際上
顕著であると思われる。
表３および表４に示したいくつかの螢光変化は、タン
パク質分子（すなわち抗体および／またはタンパク質抗
原）のランダム標識化を当てにして両方または一方の標
識物質を作らねばならない消光／エネルギー転位に基づ
くイムノアツセイにおいて観察されたものよりも大き
い。従つて、抗原：抗体複合体では標識のほんの少しの
画分のみが互いとの静的または動的相互作用にとつて適
した位置にあるかも知れない。一方、DNA末端の選択的
標識化は相対する標識の正確な位置づけを可能にし、そ
れ故にハイブリダイズしたプローブ鎖の全ての標識によ
つて衝突の相互作用が可能となり、また静的な相互作用
が強められる。
表３および表４のデータはまた標識をDNAに結合させ
る方法を適切に選択することの必要性を指摘している。
フルオレセインが３′末端にあり且つピレンブタノエー
トが５′末端にある実施例の場合は、標識の相互作用が
たとえあつたとしてもほとんど観察されず、一方フルオ
レセインが５′末端にあり且つピレンが３′末端にある
場合は相当な相互作用が検出される。これは制限酵素で
消化したプラスミドDNAばかりでなくホモポリマーオリ
ゴマーにも観察された。標識の配置の相違は２つの別々
の末端に標識を結合させる際に使用した異なる化学に関
係しており、３′−標識はアミノヘキシルアミノアデノ
シンリンカーを介して結合されるが、５′−標識はエチ
レンジアミンリンカーを介して結合された。
D.競合的検定 本発明の試薬プローブは競合的DNA検定に応用した。
このハイブリダイゼーシヨン法は５′−フルオレセイン
−dA12およびdT12−スルホローダミン−３′ホモポリマ
ーを含むプローブに特徴的である。
第７図を参照されたい。ここではプローブと標的DNA
の溶液が混合された。プローブの濃度は0.1μＭに定
め、標的濃度はゼロから0.5μＭの間で変えた。プロー
ブは標的DNA、十分量の水および緩衝液（pH7.5で1.0M塩
化ナトリウムおよび0.01〜0.02M−塩基性リン酸カリウ
ムの最終濃度を与える）と混合してハイブリダイゼーシ
ヨン溶液を調製した。この溶液を水浴中65℃で15分間加
熱して、標的とプローブDNAの完全なデハイブリダイゼ
ーシヨンを行つた。次に試料を２時間かけて10℃へと冷
却させ、競合的ハイブリダイゼーシヨンを起こさせた。
第７図はフルオレセインイソチオシアネート（フルオ
レセイン）で標識化したデオキシアデノシンホモポリマ
ーおよびスルホローダミンスルホン酸クロリド（スルホ
ローダミン）で標識化したデオキシチミジンホモポリマ
ー（各々12塩基長）からなる一定濃度の10-7モル二本鎖
プローブを含むいろいろな濃度の標的鎖についての、螢
光強度（相対単位）対波長の関係をグラフにより示して
いる。全ての試料は300nmの光エネルギーを照射した。
約520nmの波長でのピーク螢光強度は、12塩基長のデ
オキシアデノシンおよびデオキシチミジンの標的ホモポ
リマーの濃度変化により変化する。
第８図は標的濃度に対する螢光放出の関係を示す。第
８図のグラフの点は一定濃度のプローブを使用した第７
図のグラフのピーク値である。標的濃度が増すにつれ
て、スルホローダミンによる螢光消滅度が低下して螢光
放出が増大する。
５′−フルオレセイン−dA12／dT12−ピレンブタノエ
ート−３′系について先に示したハイブリダイゼーシヨ
ンデータは、相互作用する標識に基づいた競合的DNAハ
イブリダイゼーシヨン検定の概念を説明する上で役に立
つた。しかしながら、有用な検定系であるためには、こ
の方法が特異的であり且つ感度が優れていることを示さ
ねばならない。
第９〜12図のデータは標識の相互作用に基づく検定法
のこれらの面を立証するのに役立つ。標識の特異性は表
３に示した最初のdA20：dT20誘導二本鎖プローブを使つ
て第９図に示される。
この実験では、50nMプローブ溶液といろいろな濃度の
３つの異なる標的DNAとを水中で混合した。１つの標的
は等モル量のdA20およびdT20から成つており、これはプ
ローブとのハイブリダイゼーシヨンにふさわしい標的で
あつた。２つの非相補標的はウシ胸腺DNAとラムダフア
ージDNAであつた。試料は沸騰水浴中で６分間加熱し、
その後室温まで冷却させた。次いで試料を2X濃縮結合緩
衝液で半分に希釈して、pH7.5においてそれぞれ100mMと
10mMの最終NaClおよびリン酸カリウム濃度を得た。その
直後に室温での螢光スペクトルを各試料について記録し
た。
第９図にプロツトした螢光強度データは、正しい標的
DNA（dA20：dT20）を使用した場合に、予測された濃度
依存性の競合的ハイブリダイゼーシヨン挙動を示す。標
的DNA濃度は異なる分子量の標的を使用したので塩基対
に換算してプロツトした。各試料中に含まれる標識二本
鎖プローブの対応する塩基対濃度は１μＭ（50nM二本鎖
プローブ）であつた。約1.2μＭのdA20：dT20（１μＭ
の値に近い）のところで生じた螢光変化の中間点は、相
補標的鎖が相補プローブ鎖に対してもつのと同じ親和性
を互いに対して有する競合的ハイブリダイゼーシヨンを
予期させた。非相補的標的DNA（ウシ胸腺DNAとラムダDN
A）を使つて集めたデータは、過剰の非相補的DNAが相補
的プローブ鎖同志のハイブリダイゼーシヨンを妨げなか
つたので、プローブがdA20：dT20標的DNAに対して特異
的であることを示した。
ハイブリダイゼーシヨンの検定の感度は、比較的低い
プローブ濃度で競合的ハイブリダイゼーシヨンを行うこ
とにより証明した。500pM、50pMおよび5pM濃度の標識dA
20：dT20プローブを用いた競合的ハイブリダイゼーシヨ
ンから得られたデータを第10図に示す。これらの実施で
は、プローブと標的DNAとをpH7.5の100mM NaClおよび10
mMリン酸カリウムを含む緩衝液中で混合した。次いで試
料を80℃で10分間加熱し、その後５度／時間の割合で20
℃まで低下させた。これはコンピユータ制御水浴を使つ
て行つた。螢光放出は20℃で各試料について測定した。
標的濃度の関数としての螢光放出強度の特徴的なＳ字状
依存がそれぞれのプローブ濃度で観察され、そして螢光
強度変化の中間点はより低いプローブ濃度を使用する検
定に対してより低い標的濃度で生じた。最も低いプロー
ブ濃度（5pMプローブ）を使用する検定の場合は、螢光
変化の中間点が約20pM標的だつた。これらの実験で使用
した試料は、標準セミミクロ螢光キユベツトを使用した
ので1mlの容量であつた。これは20fmoleの標的DNAに相
当した。他の技法によるDNAハイブリダイゼーシヨンは
しばしば10μｌ程度の容量を使用して行われる。同様の
容量の使用を可能にする螢光計のために試料用セルを工
夫することができ、その結果螢光変化の中間点について
は200amoleへと約100倍の感度の増加をもたらすであろ
う。この実験では5pMプローブを使用する最大螢光変化
が緩衝液の螢光とほぼ同じ大きさであるので、感度の大
きい増加はプローブ濃度をこれ以上低下させても期待さ
れない。換言すれば、信号対ノイズの比は１に等しかつ
た。緩衝液のバツクグラウンドは第10図に示すデータか
ら差し引かれる。
検定感度の増加を可能にする１つの方法は、対象とす
るゲノムの異なる領域とハイブリダイズする複数のプロ
ーブを使用することである。これに関する２つの手法が
試験された第１の手法では、制限酵素の使用により天然
DNAから複数の二本鎖プローブを作製した。ネオマイシ
ンホスホトランスフエラーゼ遺伝子をpSP65プラスミド
（ウイスコンシン州マジソン，プロメガ・バイオテク
社）に挿入して、このプラスミドを大腸菌内で増殖させ
た。次いで、数ミリグラムのプラスミドDNAを大腸菌培
養物から単離し、このプラスミドDNAを２種類の制限酵
素Alu IおよびHae IIIで処理した。これは大きさが約６
塩基対から600塩基対（DNA配列分析による）までの範囲
の約37の平滑末端二本鎖をプラスミド１つにつきもたら
した。その後二本鎖の集団はdA20：dT20プローブを標識
するときに使用した通常の５′−および３′−標識化法
により標識付けした。ネオマイシンホスホトランスフエ
ラーゼ遺伝子はこの初期実験を単純化するために、一般
には望まれることだが、プラスミドpSP65から遊離の状
態で単離しなかつた。この制限酵素切断プラスミドの数
種の標識化調製物は表３に載つている。
第11図はネオマイシンホスホトランスフエラーゼ遺伝
子を含む種々の濃度の未切断pSP65プラスミドを検索す
るために、表３に記載の第１のプラスミド調製物を用い
て行つた競合的ハイブリダイゼーシヨンからのデータを
示す。プラスミドプローブは2.7pMの完全プラスミドに
対応する濃度で存在していた（標識化二本鎖の合計100p
M）。水中のプローブおよび標的DNAは沸騰水浴中に12分
間置き、次にNaClとリン酸カリウムの最終濃度をそれぞ
れ1Mおよび10mMとするために2X濃縮結合緩衝液を添加し
ながら室温まで冷却させた。
フルオレセイン放出は各試料について異なつた時間で
記録した。第11図にプロツトしたデータは1.5時間およ
び５時間で測定されたフルオレセインに相当する。両方
のフルオレセイン値は予測されたように標的濃度が増加
するにつれて減少することが示されている。
試験した標的濃度範囲は温度に関する螢光変化の全範
囲を示すには十分大きくないが、検定は使用したプロー
ブの対応濃度に相当する少なくとも数ピコモルの感度を
示す。仮説的な10μｌ試料では、数ピコモル標的が約30
amoleに相当する。この実験において、フルオレセイン
放出強度はバツクグラウンドフルオレセインの大きさの
程度よりも大きかつた。
ハイブリダイゼーシヨンはプラスミドのランダム制限
消化から生ずるプローブの長さおよび広範囲の融解温度
に関するプローブの不均一集団のために困難であること
が予測される。それゆえに、出来るだけ均一な大きさの
プローブ集団を作るべく制限酵素を注意深く選択するこ
とが有利であるだろう。クローン化DNAからこのような
均一集団を作るために、ゲノム内に新しい制限部位を遺
伝子操作により加えてもよい。
大腸菌エンテロトキシン遺伝子の検定を示す第12図を
今や参照すると、約100塩基対のエンテロトキシン遺伝
子フラグメントから成る標的DNAがpH7.5の1mM EDTAおよ
び10mMトリスを含む緩衝液700μｌ中でラムダDNA（キヤ
リア−DNA）14μｇと混合された。この溶液を沸騰水浴
中に12分間おき、その後表３に“トキシン”として示し
た二本鎖プローブDNAを加え、この溶液を沸騰水浴に戻
してさらに２分間加熱した。次いで螢光計のサーモスタ
ツト付きキユベツトホルダー内に収容された螢光キユベ
ツト中の２×NaCl/リン酸塩緩衝液700μｌにこの溶液を
加え、42℃（プローブの融解温度より25℃低い温度）に
維持した。ラムダDNA、塩化ナトリウムおよびリン酸カ
リウムの最終試料濃度はそれぞれ10μg/ml、1Mおよび0.
01Mであつた。
螢光強度は前の実験とは異なる方法で測定した。螢光
値は検出用エレクトロニクスにインタフエースで接続し
たコンピユータの使用（物質および方法の部参照）によ
り時間と共に連続して記録した。この方法で集めたデー
タは異なる濃度のエンテロトキシン標的を含む試料につ
いて第12図にプロツトした。初期および最終螢光値を記
録することによつて、試料間で変動するバツクグラウン
ド螢光レベルから独立した螢光変化が得られた。第12図
のデータ記録は各組のデータが同じ初期螢光値を含むよ
うに相殺した。この効果は試料間で変動するバツクグラ
ウンドを取り去ることである。各試料の螢光変化は存在
する標的DNAの量に関係する。検出可能な最も低い標的
濃度は4pMであることがわかつた。従つて、仮説的な10
μｌ試料はこの濃度で40amoleの標的を含むだろう。螢
光強度を時間と共に連続して記録することの２番目の利
点は、螢光変化の時間依存が平衡値へのデータの外挿を
可能にする運動学的方程式にあてはめることができるの
で、より短いハイブリダイゼーシヨン時間を使用し得る
ということである。螢光変化の相対度は第12図に示す実
験について２時間にわたつて時々微分すればよい。
前記実施例は特定の螢光団を記録したものであるが、
本発明は他のアミン反応性螢光団および化学発光剤にも
応用できる。アミン反応性螢光団には例えば前述のフル
オレセイン、ピレン、アクリジン、スルホローダミン、
エオシン、エリトロシンおよびそれらの誘導体が含まれ
る。アミン反応性化学発光剤には例えばミクロペルオキ
シダーゼ、ルミノール、イソルミノール、グルコースオ
キシダーゼ、アクリジニウムエステルおよびそれらの誘
導体が含まれる。
化学発光剤はプローブの化学発光標識成分が第２相補
的プローブの螢光団と相互作用するように、螢光団と関
連して本検定に用いられる。螢光団は標識成分が離れる
まで化学発光剤の発光を抑えるだろう。発光反応を開始
させるために、試料媒体に適当な化学発光補助因子も加
えられるだろう。標的がプローブと結合部位について競
合したとき、標識成分は分離して化学発光剤または化学
発光成分を発光させ、そして検出可能な信号を発生する
ことができる。
化学発光剤はまた化学発光補助因子との組合せで本発
明に用いられる。こうして、第１プローブの化学発光標
識成分は第２相補プローブ上の化学発光補助因子標識成
分と相互作用するであろう。この系は特定強度の光を発
する。標的が存在する場合、標的はプローブと競合し、
それにより第１および第２プローブおよび標識成分を分
離し且つこの系の発光を抑制するだろう。
螢光団標識化プローブはバツクグラウンド螢光を制限
するために時間分解検定法において利用される。従つ
て、光パルスは第１螢光団を励起するのに十分な波長で
導入される。第１螢光団はそのエネルギーを第２螢光団
に転移する。第１螢光団から第２螢光団へのエネルギー
の転移および第２螢光団によるエネルギーの放出は、直
接螢光に比べてゆつくりした過程である。第１螢光団は
エネルギー転位過程を引き延ばすために、長い発光寿命
を有するように選ばれる。試料はパルス後、そのパルス
によつて開始された直接螢光活性が終了した後に、およ
び転移したエネルギーが第２螢光団から発せられる合間
に、第２螢光団からの光エネルギーについて監視するこ
とができる。エネルギーを転移する位置にある螢光群の
みが監視される発光を生ずるだろう。相互作用する位置
にある相補的プローブの標識成分のみが検出可能な信号
をもち、それによりバツクグラウンド発光が抑えられる
だろう。
時間分解検定法の詳しい説明は本発明者の係属中の米
国特許出願第738560号に開示されており、これは参照に
よりここに引用される。
こうして、本発明は均質な非放射性検定を特徴とす
る。本検定の均質性により、比較的短時間で検定を行う
ことができる。非放射性標識を使用すると、特別の許可
がなくても本検定を行うことができ、また検定技術およ
び製造技術が単純化される。
本発明はその好適な実施態様について説明してきた
が、本発明は変更および修飾が可能であり、それゆえに
先に記載の細部に限定されるべきでなく、特許請求の範
囲に含まれる種々の変更および修正を加え得ることを理
解すべきである。
【図面の簡単な説明】 第１図は本発明の競合的DNA検定を示す模式図であり； 第２図は本検定を行うための自動分析装置の略図であ
り； 第３図はクローン化DNA由来の二本鎖プローブの作製を
示す模式図であり； 第４図は二本鎖プローブの末端標識化を示す模式図であ
り； 第５図は相補プローブ鎖の標識成分が相互作用するとき
の螢光放出と温度の関係を示すグラフ（融解曲線）であ
り； 第６図は非標識プローブの融解曲線を示すグラフであ
り； 第７図は一定濃度の二本鎖プローブを含む異なる濃度の
標的鎖についての螢光強度と波長の関係を示すグラフで
あり； 第８図は競合的エネルギー転移DNAハイブリダイゼーシ
ヨンにおける標的濃度と螢光放出の関係を示すグラフで
あり； 第９図はフルオレセイン−dA20：dT20−ピレンプローブ
を用いた競合的検定における各種標的DNAの濃度とフル
オレセイン発光強度の関係を示すグラフであり； 第10図は異なる濃度のフルオレセイン−dA20：dT20−ピ
レンプローブを用いた競合的溶液ハイブリダイゼーシヨ
ンにおける標的DNA濃度と螢光強度の関係を示すグラフ
であり； 第11図はネオマイシンホスホトランスフエラーゼ遺伝子
を含むpSP65プラスミドを検索するために、フルオレセ
イン−プラスミド−ピレンプローブを用いて行つた競合
的ハイブリダイゼーシヨンからのデータを示し；そして 第12図は大腸菌エンテロトキシン遺伝子の競合的検定を
示す。

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】標的ポリヌクレオチドについて試料を検定
    する方法であって、 （ａ）試料と試薬を結合条件下で接触させ、 ここで上記試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび
    第２ポリヌクレオチドプローブを含み、上記第１および
    第２ポリヌクレオチドプローブはそれらが互いに結合す
    る第１の位置をとることができ且つ上記プローブの少な
    くとも１つは上記プローブ鎖が上記標的ポリヌクレオチ
    ドと結合する第２の位置をとることができ、上記第１プ
    ローブおよび第２プローブはこれらのプローブの一方と
    会合した第１標識成分を含みおよび他方のプローブと会
    合した第２標識成分を含み、上記第１および第２標識成
    分は上記第１および第２プローブが互いに結合するとき
    相互作用して上記２つの位置の一方にあるプローブに特
    徴的な検出しうる信号を発することができる；および （ｂ）上記試料中の標的の存在と関連がある信号の存在
    について上記試料を監視する； の各工程を含む方法。
  2. 【請求項２】第１標識成分は上記プローブの一方の３′
    末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５′末
    端に存在する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】各プローブは複数の標識成分を有する、特
    許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】上記標識成分はそれぞれ上記プローブの末
    端に存在する、特許請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】第１標識成分は上記プローブの一方の３′
    末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの５′末
    端に存在する、特許請求の範囲第３項記載の方法。
  6. 【請求項６】第１標識成分は核酸のアミノアルキル誘導
    体により上記プローブと会合している、特許請求の範囲
    第２項記載の方法。
  7. 【請求項７】上記誘導体はアデニンのアミノアルキル誘
    導体を含む、特許請求の範囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】上記誘導体はアデニンのアミノヘキシル誘
    導体を含む、特許請求の範囲第６項記載の方法。
  9. 【請求項９】上記誘導体は８−（６−アミノヘキシル）
    −アミノアデノシン−５′−モノホスフェートを含む、
    特許請求の範囲第６項記載の方法。
  10. 【請求項１０】３′末端にある上記標識成分は核酸の蛍
    光性誘導体である、特許請求の範囲第５項記載の方法。
  11. 【請求項１１】標識成分は１−N6−エテノアデノシン−
    ５′−モノホスフェートの誘導体を含む、特許請求の範
    囲第10項記載の方法。
  12. 【請求項１２】標的ポリヌクレオチドについて試料を検
    定するための試薬を含むキットであって、 上記試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポ
    リヌクレオチドプローブを含み、上記第１および第２プ
    ローブはそれらが互いに結合する第１の位置をとること
    ができ且つ上記プローブの少なくとも１つは上記プロー
    ブ鎖が上記標的と結合する第２の位置をとることがで
    き、上記第１プローブおよび第２プローブはこれらのプ
    ローブの一方と会合した第１標識成分および他方のプロ
    ーブと会合した第２標識成分を含み、上記第１および第
    ２標識成分は上記第１および第２プローブが互いに結合
    するとき相互作用して、上記２つの位置の一方にあるプ
    ローブに特徴的な検出しうる信号を発することができる
    ことを特徴とするキット。
  13. 【請求項１３】第１標識成分は上記プローブの一方の
    ３′末端に存在し、第２標識成分は他方のプローブの
    ５′末端に存在する、特許請求の範囲第12項記載のキッ
    ト。
  14. 【請求項１４】各プローブは複数の標識成分を有する、
    特許請求の範囲第13項記載のキット。
  15. 【請求項１５】上記標識成分はそれぞれ上記プローブの
    末端に存在する、特許請求の範囲第14項記載のキット。
  16. 【請求項１６】第１標識成分は３′末端に存在し、第２
    標識成分は５′末端に存在する、特許請求の範囲第14項
    記載のキット。
  17. 【請求項１７】試料中のポリヌクレオチド標的について
    競合的均質検定を行うための装置であって、 試薬および試料を収容するのに適した容器手段、ここで
    上記試薬は第１プローブおよび第２プローブを含み、上
    記第１および第２プローブは第１プローブが第２プロー
    ブと結合する第１の位置およびこれらのプローブの少な
    くとも１つが上記標的と結合する第２の位置をとること
    ができ、上記プローブは一方のプローブと会合した少な
    くとも１つの標識成分および他方のプローブと会合した
    第２標識成分を有し、上記第１および第２標識成分は上
    記プローブが上記第１の位置にあるとき相互作用して、
    上記標識成分の一方の励起の際に上記位置の一方に特徴
    的な検出しうる信号を発することができる； 上記標識成分の一方を励起する手段；および 上記信号を検出する手段； を含む装置。
  18. 【請求項１８】標識成分は蛍光団であり、標識成分の一
    方を励起する手段が光源を含む、特許請求の範囲第17項
    記載の装置。
  19. 【請求項１９】少なくとも１つの標識成分が化学発光剤
    であり、標識成分の一方を励起する手段が上記容器に化
    学発光補助因子を導入する手段を含む、特許請求の範囲
    第17項記載の装置。
  20. 【請求項２０】検出手段が光検出器を含む、特許請求の
    範囲第17項記載の装置。
  21. 【請求項２１】標的ポリヌクレオチドについて試料を検
    定するためのキットであって、ポリヌクレオチドプロー
    ブの少なくとも一方の末端を介して結合している標識成
    分を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブ
    を含み、標識成分は、ポリヌクレオチドプローブと相補
    的なポリヌクレオチドセグメントの末端に結合した第２
    標識成分と相互作用することができることを特徴とする
    キット。
  22. 【請求項２２】ポリヌクレオチドプローブが、ポリヌク
    レオチドプローブの３′末端および５′末端のそれぞれ
    に結合した標識成分を有する、請求項21記載のキット。
  23. 【請求項２３】標識成分が第１および第２の蛍光団を含
    む、請求項21記載のキット。
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