ES2533536T3 - Composiciones para aumentar la estabilidad y actividad de polipéptidos, y métodos relacionados - Google Patents

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Abstract

Un método para aumentar la estabilidad de un polipéptido, que comprende unir dicho polipéptido a una marca peptídica que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la SEC ID Nº 1.

Description

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En algunos casos, cuando la enzima (por ejemplo, polimerasa Taq, ADN desaminasa, ARN desaminasa) se une al péptido (por ejemplo, un péptido al menos un 70 % idéntico a la SEC ID Nº 1) muestra al menos un 20 %, 50 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 100 % de su actividad antes de su exposición a corto plazo o largo plazo a temperaturas de aproximadamente -20 ºC a aproximadamente 35 ºC. En algunos casos, la exposición sucede durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 10 horas, al menos 1, 2, 3, 4, 5, o 6 días, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 10 semanas, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 10 meses.
Breve descripción de los dibujos
Las nuevas características de las realizaciones se proporcionan en este documento expuesto con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de las realizaciones proporcionadas en este documento por referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos que exponen realizaciones ilustrativas, en que se utilizan los principios de las realizaciones.
La Figura 1 representa una amplificación por qPCR que se realiza para ensayar la estabilidad de una proteína de fusión péptido-polipéptido (SEC ID Nº 2) después de exposición a 35 ºC. La primera muestra de mezcla fresca de qPCR se almacena a -20 ºC (panel superior) y La segunda muestra se almacena a 35 ºC durante 4 semanas (panel inferior). La Figura 2 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 1) de una marca peptídica de 42 aminoácidos. La Figura 3 representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión (SEC ID Nº 2) que consiste en la marca peptídica de la Figura 2 (SEC ID Nº 1) unida al extremo N-terminal de polimerasa Taq de tipo silvestre. La secuencia de la marca peptídica de 42 aminoácidos está subrayada. La Figura 4 representa una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 3) que codifica la marca peptídica de 42 aminoácidos (SEC ID Nº 1). La Figura 5 representa la secuencia de nucleótidos de un polipéptido de fusión (SEC ID Nº 2) que consiste en la marca peptídica de 42 aminoácidos (a.a.) de la Figura 2 (SEC ID Nº 1) unida al extremo N-terminal de polimerasa Taq de tipo silvestre. La secuencia de nucleótidos completa se denomina SEC ID Nº 4. La secuencia de nucleótidos que codifica la marca peptídica de 42 aminoácidos está subrayada. La Figura 6 representa la secuencia de nucleótidos de un polipéptido de fusión (SEC ID Nº 6) que consiste en el fragmento modificado de marca peptídica de la Figura 2 (SEC ID Nº 1) (negrita y subrayado) unida a un péptido correspondiente a un fragmento de proteína de unión a doble hebra (DSP) (parte subrayada, sin negrita), unido al extremo N-terminal de polimerasa Taq de tipo silvestre. La secuencia de nucleótidos completa se denomina SEC ID Nº 5. La Figura 7 representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión (SEC ID Nº 6) que consiste en el fragmento modificado de marca peptídica de la Figura 2 (SEC ID Nº 1) (negrita y subrayado) unido a un péptido correspondiente a un fragmento de proteína de unión a doble hebra (DSP) (parte subrayada, sin negrita), unido al extremo N-terminal de polimerasa Taq de tipo silvestre. La Figura 8 representa la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 7) que codifica una marca peptídica que consiste en el fragmento modificado de marca peptídica de la Figura 2 (SEC ID Nº 1) (negrita y subrayado) unido a un péptido correspondiente a un fragmento de proteína de unión a doble hebra (DSP) (parte subrayada, sin negrita). La Figura 9 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 8) de un péptido marca que consiste en el fragmento modificado de marca peptídica de la Figura 2 (SEC ID Nº 1) (negrita y subrayado) unido a un péptido correspondiente a un fragmento de proteína de unión a doble hebra (DSP) (parte subrayada, sin negrita). La Figura 10 representa la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 9) que codifica un péptido marca DSP. La Figura 11 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 10) de la marca DSP. La Figura 12 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 11) de un polipéptido de fusión del fragmento modificado de marca peptídica de la Figura 2 (SEC ID Nº 1) (negrita y subrayado) unido a un polipéptido de polimerasa Tgo unido a un péptido DSP (parte subrayada, sin negrita). La Figura 13 representa la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 12) que codifica un polipéptido de fusión del fragmento modificado de marca peptídica de la Figura 2 (SEC ID Nº 1) (negrita y subrayado) unido a un polipéptido de polimerasa Tgo, que está unido a un péptido DSP (parte subrayada, sin negrita). La Figura 14 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 13) de un fragmento del péptido de la SEC ID Nº 1. La Figura 15 representa un gel de electroforesis que muestra la amplificación de ADN a partir de ADN genómico de cebada usando una diversidad de polimerasas. La Figura 16 representa una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 14) de un fragmento modificado del péptido de laSEC ID Nº 1. La Figura 17 representa una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 15) que codifica el péptido de 36 aminoácidos (SEC ID Nº 14). La Figura 18 representa una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 16) de un fragmento modificado del péptido de laSEC ID Nº 1. La Figura 19 representa una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 17) que codifica el péptido de 40 aminoácidos (SEC ID Nº 16). La Figura 20 representa una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 18) de un fragmento modificado del péptido de laSEC ID Nº 1. La Figura 21 representa una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 19) que codifica el péptido de 29 aminoácidos
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La marca peptídica puede estar limitada a 50 aminoácidos. El péptido puede estar limitado a 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 aminoácidos.
El porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de aminoácidos se alinean usando una alineación global que tiene en cuenta la longitud completa del péptido o polipéptido, como se describe por el algoritmo de NeedlemanWunsch-Sellers (Needleman et al., (1970), J. Mol. Biol. 48:444; Sellers (1974), SIAM J. Appl. Math., 26:787). Parámetros ilustrativos para el análisis FASTA son: ktup=1, penalización por abertura de hueco=10, penalización por extensión de hueco=1, y matriz de sustitución=BLOSUM62.
En algunas realizaciones, las marcas peptídicas proporcionadas en este documento comprenden una marca peptídica His, donde la marca peptídica His comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20 restos His. En algunas realizaciones, las marcas peptídicas proporcionadas en este documento comprenden una marca peptídica His, donde la marca peptídica His comprende no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20 restos His. En algunas realizaciones, la marca peptídica His comprende de 1 a 5, de 2 a 6, de 3 a 7, de 4 a 8, de 5 a 9, de 6 a 10, de 7 a 11, de 8 a 12, de 9 a 13, de 10 a 14, de 1 a 10, de 2 a 11, de 3 a 12, de 4 a 13, de 5 a 14, de 6 a 15, de 7 a 16, de 8a 17, de 9 a 19, de 10 a 20, de 1 a 20, de 2 a 19, de 3 a 18, de 4 a 17, de 5 a 16, de 6 a 15,de 7a 14, de8 a13,de9 a 12, de10a 11,de1 a 6, de 1 a7, de 1 a8, de 1a 9,o de 1 a10 restos His.
En algunas realizaciones, las marcas peptídicas proporcionadas en este documento comprenden una secuencia que puede escindirse por una proteasa. En algunas realizaciones, la marca peptídica comprende un sitio de escisión por proteasa. Ejemplos no limitantes de proteasas y restos de escisión asociados (en paréntesis) incluyen tripsina (Arg o Lys), quimotripsina (Trp, Tyr, Phe, Leu, Met, o His), endoproteinasa Asp-N (Asp), endoproteinasa Arg-C (Arg), endoproteinasa Glu-C (Glu), endoproteinasa Lys-C (Lys), prolina-endopeptidasa (Pro), pepsina (Phe, Tyr, Trp, o Leu), termolisina (Ile, Leu, Val, Ala, Met, o Phe), trombina (Arg), elastasa (Ala o Val), papaína (Leu o Gly), proteinasa K (aminoácidos aromáticos), subtilisina (His, Ser, Asp), y clostripaína (Arg). En algunas realizaciones, las marcas peptídicas comprenden una secuencia que puede escindirse por una carboxipeptidasa, carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B, carboxipeptidasa P, carboxipeptidasa Y, catepsina C, enzima liberadora de acicloaminoácido, y piroglutamato aminopeptidasa. En algunas realizaciones, las marcas peptídicas proporcionadas en este documento comprenden un sitio de escisión por proteasa, donde la marca peptídica comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20 sitios de escisión por proteasa. En algunas realizaciones, las marcas peptídicas proporcionadas en este documento comprenden un sitio de escisión por proteasa, donde el sitio de escisión por proteasa comprende no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20 sitios de escisión por proteasa. En algunas realizaciones, la marca peptídica comprende de 1 a 5, de 2 a 6, de 3 a 7, de 4 a 8, de 5 a 9, de 6 a 10, de 7 a 11, de 8 a 12, de 9 a 13, de10 a 14, de 1 a 10, de 2 a 11,de 3 a 12, de 4 a 13, de 5 a 14, de 6 a 15, de 7 a 16, de 8 a 17, de 9 a 19, de 10 a 20, de 1 a 20, de 2 a 19, de 3 a 18, de 4 a 17, de 5 a 16, de 6 a 15, de 7 a 14, de 8 a 13, de 9 a 12, de 10 a 11, de 1 a 6, de 1 a 7, de 1 a 8, de 1 a 9, o de 1 a 10 sitios de escisión por proteasa. En algunos casos el sitio de escisión por proteasa tiene la secuencia: DDDDK. En algunos casos, el sitio de escisión por proteasa tiene al menos cuatro restos "D". El sitio de escisión por proteasa puede ser al menos un 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % idéntico a la secuencia DDDDK. En algunos casos, la marca peptídica puede comprender una secuencia que se parece a un sitio de escisión por proteasa, pero no servir realmente como un sitio de escisión proteolítica. En algunas realizaciones, las marcas peptídicas proporcionadas en este documento comprenden una marca D (Asp), donde la marca peptídica comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20 restos Asp, por ejemplo, DD, DDD, DDDD, etc. En algunas realizaciones, la marca Asp comprende al menos 4 restos Asp. En algunas realizaciones, las marcas peptídicas proporcionadas en este documento comprenden una marca Asp con no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 20 restos Asp. En algunas realizaciones, la marca Asp comprende de 1 a 5, de 2 a 5, de 3 a 7, de 4 a 8, de 5 a 9, de 6 a 10, de 7 a 11, de 8 a 12, de 9 a 13, de 10 a 14, de 1 a 10, de 2 a 11, de 3 a 12, de 4 a 13, de 5 a 14, de 6 a 15, de 7 a 16, de 8 a 17, de 9 a 19, de 10 a 20, de 1 a 20, de 2 a 19, de 3 a 18, de 4 a 17, de 5 a 16, de 6 a 15, de 7 a 14, de 8 a 13, de 9 a 12, de 10 a 11, de 1 a 6, de 1 a 7, de 1 a 8, de 1 a 9, o de 1 a 10 restos Asp. En algunas realizaciones, la marca peptídica comprende una marca His (como se describe en este documento) y una marca Asp. En algunas realizaciones, uno o más restos Asp está sustituido con otro aminoácido (por ejemplo, uno o más restos Glu). En algunas realizaciones, la marca His está sustituida con uno o más aminoácidos (por ejemplo, Lys o Arg).
Todas las referencias a polipéptidos, proteínas y péptidos, como se usa en este documento, se refieren a un polímero de restos de aminoácido. Es decir, una descripción referida a un polipéptido se aplica igualmente a una descripción de un péptido y una descripción de una proteína, y viceversa. Las expresiones se aplican a polímeros de aminoácidos de origen natural así como polímeros de aminoácidos en que uno o más restos de aminoácido es un aminoácido de origen no natural, por ejemplo, un análogo de aminoácido. Como se usa en este documento, los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa (es decir, antígenos), donde los restos de aminoácido están unidos por enlaces peptídicos covalentes.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y de origen no natural, así como análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan de un modo similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos codificados de forma natural son los 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, y valina) y pirolisina y selenocisteína. Análogos de aminoácido se refiere
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cebador), polimerasa Klenow (útil por ejemplo en marcaje de cebador aleatorio), desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (útil por ejemplo para marcaje de extremo 3'), transcriptasa inversa (por ejemplo, para sintetizar ADN a partir de moldes de ARN) u otras polimerasas tales como ARN polimerasa SP6, ARN polimerasa T3 y ARN polimerasa T7 para transcripción in vitro.
En algunas realizaciones, una marca peptídica de acuerdo con las reivindicaciones puede unirse a ADN polimerasa dependiente de ADN, que es una enzima que sinteriza una copia complementaria de ADN a partir de un molde de ADN añadiendo un nucleótido al extremo 3' de una hebra de reciente formación. Algunas ADN polimerasas también tienen capacidad de corrección de errores, que se confiere por la actividad 3' a 5' exonucleasa.
En algunas realizaciones, las ADN polimerasas dependientes de ADN proporcionadas en este documento pueden ser enzimas de origen natural aisladas de bacterias o bacteriófagos o expresadas de forma recombinante, o pueden estar modificadas o tener formas desarrolladas que se han modificado por ingeniería para poseer ciertas características deseables, por ejemplo, termoestabilidad, o la capacidad de reconocer o sintetizar una hebra de ADN a partir de diversos moldes modificados. Las ADN polimerasas dependientes de ADN requieren un cebador complementario para iniciar la síntesis. Se sabe que en condiciones adecuadas una ADN polimerasa dependiente de ADN puede sintetizar una copia complementaria de ADN a partir de un molde de ARN. Las ADN polimerasas dependientes de ARN (descritas en este documento) normalmente tienen también actividad ADN polimerasa dependiente de ADN.
Ejemplos no limitantes de ADN polimerasas incluyen ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus, ADN polimerasa de Thermococcus littoralis, ADN polimerasa de bacteriófago T7, polimerasa de Thermococcus gorgonarius (Tgo), polimerasa Pfu, fragmento Klenow de ADN polimerasa de E. coli, ADN polimerasa Tma, ADN polimerasa exo-Tli, ADN polimerasa exo-KOD, ADN polimerasa exo-JDF-3, ADN polimerasa exo-PGB-D, ADN polimerasa U1Tma (N-truncada) de Thermatoga martima, o ADN polimerasas de bacteriófagos T4, Phi-29, M2, o T5.
En algunas realizaciones, donde sea deseado, pueden unirse polimerasas estables a temperatura a una marca peptídica de acuerdo con las reivindicaciones. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 4.889.818 que describe una enzima termoestable representativa aislada de Thermus aquaticus. Polimerasas estables a temperatura representativas adicionales incluyen sin limitación, por ejemplo, polimerasas extraídas de bacterias tales como ADN polimerasa I de Thermus aquaticus (Taq), Thermococcus gorgonarius (Tgo), Pirococcus horikoshii, Pirococcus furiosus, Pirococcus woesei, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus (que tiene temperatura óptima algo inferior que las otras enumeradas), Thermus lacteus, Thermus rubens, Thermotoga maritima, Thermococcus littoralis, y Metanothermus fervidus.
En algunos casos, una marca peptídica de acuerdo con las reivindicaciones se une a una enzima termoestable que puede tener o no necesariamente actividad polimerasa (por ejemplo, pirofosfatasa de Thermoplasma acidophilum (TAPP), pirofosfatasa, dCTP desaminasa (CDA), desoxicitidina desaminasa, citidina desaminasa, ARN desaminasa, ADN desaminasa). En algunos casos, una marca peptídica (por ejemplo, el péptido de la SEC ID Nº 1 o 8), se une a un polipéptido no termoestable (por ejemplo, factor inhibidor de leucemia humana (hLIF), leptina).
En algunas realizaciones, una marca peptídica de acuerdo con las reivindicaciones puede unirse a polimerasas que muestran actividad de desplazamiento de hebra (también conocida como polimerización en círculo rodante). El desplazamiento de hebra puede provocar la síntesis de copias en tándem de un molde de ADN circular, y es particularmente útil en reacción isotérmica de PCR. Ejemplos no limitantes de polimerasas adecuadas de círculo rodante proporcionadas en este documento incluyen aunque sin limitación ADN polimerasa T5 (Chatterjee et al., Gene 97:13-19 (1991)), y holoenzima ADN polimerasa T4 (Kaboord y Benkovic, Curr. Biol. 5:149-157 (1995)), ADN polimerasa de fago M2 (Matsumoto et al., Gene 84:247 (1989)), ADN polimerasa de fago PRD1 (Jung et al., Proc. Natl. Aced Sci. USA 84:8287 (1987), y Zhu e Ito, Biochim. Biophys. Acta. 1219:267-276 (1994)), fragmento Klenow de ADN polimerasa I (Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45:623-627 (1974)).
Un ejemplo de una clase de polimerasas de círculo rodante utiliza cebado de proteína como modo para iniciar la replicación. Polimerasas ejemplares de esta clase son ADN polimerasas modificadas y no modificadas, elegidas o derivadas de los fagos ÿ29, PRD1, Cp-1, Cp-5, Cp-7, ÿ15, ÿ1, ÿ21, ÿ25, BS 32 L17, PZE, PZA, Nf, M2Y (o M2), PR4, PR5, PR722, B103, SF5, GA-1, y miembros relacionados de la familia Podoviridae.
En algunas realizaciones, una marca peptídica de acuerdo con las reivindicaciones puede unirse a una ARN polimerasa dependiente de ADN o transcriptasa, que es una enzima que sintetiza múltiples copias de ARN a partir de una molécula de ADN bicatenaria o parcialmente bicatenaria que tiene una secuencia promotora que es habitualmente bicatenaria. Las moléculas de ARN se sintetizan en la dirección 5'-a-3' empezando en una posición específica justo cadena abajo del promotor. Ejemplos de transcriptasas son la ARN polimerasa dependiente de ADN de E. coli y bacteriófagos T7, T3, y SP6.
En algunas realizaciones, una marca peptídica descrita en este documento puede unirse a una ADN polimerasa dependiente de ARN o transcriptasa inversa (RT), que es una enzima que sintetiza una copia complementaria de
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facilitar los métodos de PCR Hot Start, por cualquier método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.773.258, la patente de Estados Unidos Nº 6.183.998). En algunos casos, las polimerasas se modifican con un anticuerpo o péptido para facilitar los métodos de PCR Hot Start. En otros casos más, una polimerasa descrita en este documento se secuestra en cera de parafina (por ejemplo, perla de cera de parafina).
Los reactivos necesarios para realizar PCR Hot Start se envasan en kits que están disponibles en el mercado. Esta activación de la polimerasa es a temperaturas mayores, tales como temperaturas altas útiles para la etapa de desnaturalización de PCR.
Variantes polipeptídicas
En algunas realizaciones, los polipéptidos descritos en la presente descripción (por ejemplo, polimerasas) también incluyen una gran cantidad de variaciones de secuencia, mutantes, y fragmentos de los mismos, que pueden generarse (por ejemplo, in vitro) y seleccionarse para la actividad y estabilidad. También incluyen cualquier polipéptido modificado que esté disponible en el mercado (por ejemplo, polimerasa titanium (Invitrogen); Taq Gold (Applied Biosystems), etc.). Las polimerasas Taq que están truncadas a menudo retienen la actividad. Por tanto, los polipéptidos descritos en este documento incluyen truncamientos N' y C'-terminales de polimerasas Taq. De hecho, incluyen cualquier polimerasa Taq que retenga la actividad.
Para aislar variantes de secuencia, puede realizarse mutagénesis aleatoria de la secuencia completa o subsecuencias específicas correspondientes de dominios particulares. Como alternativa, puede realizarse mutagénesis dirigida al sitio de forma reiterativa evitando al mismo tiempo mutaciones en restos críticos para la función proteasa. Pueden usarse programas de predicción de tolerancia a mutaciones para reducir enormemente la cantidad de variantes de secuencia no funcionales que se generarían estrictamente por mutagénesis aleatoria. Se describen diversos programas para predecir los efectos de sustituciones de aminoácidos en una secuencia proteica sobre la función proteica (por ejemplo, SIFT, PolyPhen, PANTHER PSEC, PMUT, y TopoSNP) en, por ejemplo, Henikoff et al., (2006), Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 7:61-80.
Además, la presente descripción proporciona diferentes porcentajes de identidad de secuencia para los polipéptidos descritos. El porcentaje de identidad de secuencia se determina por métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul et al., (1986), Bull. Math. Bio., 48:603, y Henikoff y Henikoff, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915. En resumen, se alinean dos secuencias de aminoácidos para optimizar los valores de alineación usando una penalización por abertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de 1, y la matriz de valores "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (supra). El porcentaje de identidad entonces se calcula como: ([Cantidad total de coincidencias idénticas]/[longitud de la secuencia más larga más la cantidad de huecos introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias])(100).
Existen muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineación de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos descrita en este documento y la secuencia de aminoácidos de otro péptido. El algoritmo FASTA se describe por Pearson et al., (1988), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:2444, y por Pearson (1990), Meth. Enzymol. 183:63. En resumen, FASTA caracteriza primero la similitud de secuencia identificando regiones compartidas por la secuencia de consulta (por ejemplo, SEC ID Nº4 o SEC ID Nº 6 o SEC ID Nº 9) y una secuencia de ensayo que tienen la mayor densidad de identidades (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2), sin considerar sustituciones conservativas de aminoácidos, inserciones, o deleciones. Las diez regiones con la mayor densidad de identidades después se vuelven a valorar comparando la similitud de todos los aminoácidos emparejados usando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones se "recortan" para incluir solamente aquellos restos que contribuyan al mayor valor. Si hay varias regiones con valores mayores que el valor de "corte" (calculado por una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor ktup), entonces las regiones iniciales recortadas se examinan para determinar si las regiones pueden unirse para formar una alineación aproximada con huecos. Finalmente, las regiones de mayor valoración de las dos secuencias de aminoácidos se alinean usando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman et al., (1970), J. Mol. Biol. 48:444; Sellers (1974), SIAM J. Appl. Math., 26:787), que permite inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros ilustrativos para el análisis FASTA son: ktup=1, penalización por abertura de hueco=10, penalización por extensión de hueco=1, y matriz de sustitución=BLOSUM62. Estos parámetros pueden introducirse en un programa FASTA modificando el archivo de matriz de valores ("SMATRIX"), como se explica en el Apéndice 2 de Pearson, (1990), Meth. Enzymol.,
183:63.
También se proporcionan en este documento proteínas que tienen un cambio conservativo de aminoácido, en comparación con una secuencia de aminoácidos descrita en este documento. Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, una "sustitución conservativa de aminoácido" se ilustra por una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2.000 alineaciones múltiples locales de segmentos de secuencias proteicas, que representan regiones altamente
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