KR102078756B1 - 폴리펩티드 안정성 및 활성을 증가시키는 조성물 및 관련된 방법 - Google Patents

폴리펩티드 안정성 및 활성을 증가시키는 조성물 및 관련된 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 폴리펩티드(예를 들면, Taq 중합효소(polymerase))의 안정성을 향상시키거나 증가시키는 펩티드, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 펩티드, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 상기 폴리펩티드의 안정성을 향상시키는 펩티드 태그(tag)에 연결된 폴리펩티드를 포함한다. 상기 펩티드, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 반응 혼합물 중의 다른 폴리펩티드의 활성, 특이성 및/또는 정확성(fidelity)을 향상시킬 수도 있다. 본 개시내용은 이러한 펩티드, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 사용 방법도 제공한다.

Description

폴리펩티드 안정성 및 활성을 증가시키는 조성물 및 관련된 방법{COMPOSITIONS FOR INCREASING POLYPEPTIDE STABILITY AND ACTIVITY, AND RELATED METHODS}
관련 출원에 대한 상호-참조
본원은 2009년 11월 19일자로 출원된 미국 가출원 제61/262,919호;, 2010년 6월 1일자로 출원된 미국 가출원 제61/350,457호; 2010년 6월 18일자로 출원된 미국 가출원 제61/356,541호; 및 2010년 10월 7일자로 출원된 미국 가출원 제61/390,857호(이들 출원 모두는 그 전체로 본원에서 참고적으로 인용됨)의 이익을 주장한다.
단백질의 안정성을 향상시키는 방법 및 조성물이 당업계에서 필요하다. 특히, 중합효소, 예컨대, Taq 중합효소가 동결 온도 초과의 온도에 단기간 또는 장기간 노출된 후 효소 활성을 보유할 수 있도록 상기 중합효소의 안정성을 향상시키는 조성물이 필요하다. 또한, 중합효소의 정확성, 감수성 및 수율을 향상시키는 조성물이 당업계에서 필요하다.
본 발명의 요약
본 개시내용은 약 -20℃ 내지 약 35℃의 온도에 단기간 또는 장기간 노출된 후 효소(예를 들면, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 핵산분해효소(nuclease), 역전사효소(reverse transcriptase), DNA 탈아미노효소(deaminase), RNA 탈아미노효소, 단백질분해효소(protease)) 또는 단백질(예를 들면, 에리쓰로포이에틴(erythropoietin), 인간 백혈병 억제 인자(hLIF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인슐린, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 렙틴(leptin), 베바시주맙(bevacizumab))의 활성 보유를 가능하게 하는 펩티드, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 실온에서 효소 또는 단백질의 안정성을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 효소 또는 단백질은 임의의 핵산 결합 단백질, 예를 들면, DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 이들의 단편 또는 이들의 임의의 조합물이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 효소 또는 단백질은 다른 단백질, 예를 들면, 호르몬 수용체에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 활성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 효소 활성 또는 호르몬 활성을 보유한다. 일부 실시양태에서, -20℃ 내지 50℃의 온도에 노출된 후 상기 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 효소 활성 또는 호르몬 활성은 상기 온도에 노출되기 전 상기 폴리펩티드의 효소 활성의 50% 이상이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드 태그는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물을 안정화시킨다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 효소 활성의 상실을 억제한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 분해를 억제한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 1일 이상 동안 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키거나 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 효소 활성의 상실을 억제한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 1주 이상 동안 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키거나 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 효소 활성의 상실을 억제한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 1개월 이상 동안 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키거나 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 효소 활성의 상실을 억제한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 본원에서 제공된 펩티드 태그를 포함하지 않는 유사한 폴리펩티드와 비교될 때 향상된 안정성, 효소 활성 또는 호르몬 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 본원에서 제공된 펩티드 태그를 포함하지 않는 유사한 폴리펩티드의 효소 활성 또는 호르몬 활성의 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 효소 활성 또는 호르몬 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 -20℃ 내지 50℃의 온도에 노출된 후 본원에서 제공된 펩티드 태그를 포함하지 않는 유사한 폴리펩티드의 효소 활성 또는 호르몬 활성의 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 효소 활성 또는 호르몬 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 -20℃ 내지 50℃의 온도에 노출된 후 본원에서 제공된 펩티드 태그를 포함하지 않는 유사한 폴리펩티드의 효소 활성 또는 호르몬 활성보다 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 200% 이상 더 높은 효소 활성 또는 호르몬 활성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 1과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 1과 50% 내지 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 서열번호 1, 서열번호 13 또는 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 서열번호 13 또는 서열번호 14와 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 11과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20 또는 서열번호 22와 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 3 또는 서열번호 15와 70% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 펩티드 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 3 또는 서열번호 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 펩티드 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 12와 70% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 12에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 10과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 이중 가닥 DNA에 결합하는 서열 모티프를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 9와 70% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 서열번호 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 융합 폴리펩티드는 서열번호 1과 50% 내지 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 태그 및 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하고, 이때 상기 펩티드 태그는 상기 하나 이상의 폴리펩티드에 연결되고, 상기 펩티드 태그는 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 상기 융합 폴리펩티드를 안정화시킨다. 한 실시양태에서, 펩티드 태그는 하나 이상의 폴리펩티드에 공유적으로 연결된다. 한 실시양태에서, 펩티드 태그는 하나 이상의 폴리펩티드에 비공유적으로 연결된다. 한 실시양태에서, 펩티드 태그는 하나 이상의 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된다. 한 실시양태에서, 펩티드 태그는 하나 이상의 폴리펩티드의 카르복시 말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 효소이고, 제2 폴리펩티드는 이중 가닥 결합 단백질이다. 한 실시양태에서, 펩티드 태그는 제1 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결되고, 제1 폴리펩티드의 카르복시 말단은 제2 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된다. 한 실시양태에서, 펩티드 태그는 제2 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결되고, 제2 폴리펩티드의 카르복시 말단은 제1 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된다.
한 양태에서, 본 개시내용은 폴리펩티드에 연결된 펩티드 태그를 포함하는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물을 제공하고, 이때 상기 폴리펩티드는 약 -10℃ 내지 약 50℃ 이상의 온도에 노출된 후 효소 활성을 보유하고, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (a) 펩티드에 연결된 제1 폴리펩티드를 포함하고 약 -10℃ 내지 약 50℃ 이상의 온도에 노출된 후 효소 활성을 보유하는 융합 폴리펩티드; 및 (b) 제2 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 상기 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드에 공유적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 상기 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드에 비공유적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 상기 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드의 아미노 말단에서 상기 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 상기 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드의 카르복시 말단에서 상기 폴리펩티드, 상기 제1 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 열안정성 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 열안정성 단백질은 효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 효소는 중합효소, 역전사효소, 핵산분해효소, 피로인산분해효소(pyrophosphatase), 단백질분해효소 또는 탈아미노효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 12에 의해 코딩된 폴리펩티드와 70% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 서열번호 1과 70% 이상 동일하다.
일부 실시양태에서, 본원은 제1 폴리펩티드에 연결된 펩티드 태그 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하고, 이때 상기 펩티드 태그는 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 상기 제1 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드를 안정화시킨다. 한 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 1일 이상 동안 상기 제1 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드를 안정화시킨다. 한 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드는 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 효소 활성 또는 호르몬 활성을 보유한다. 한 실시양태에서, -20℃ 내지 50℃의 온도에 노출된 후 상기 융합 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드의 효소 활성 또는 호르몬 활성은 상기 온도에 노출되기 전 상기 융합 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드의 효소 활성 또는 호르몬 활성의 50% 이상이다. 한 실시양태에서, 상기 제1 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드는 중합효소, 역전사효소, 핵산분해효소, 피로인산분해효소, 탈아미노효소 또는 단백질분해효소이다. 한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 에리쓰로포이에틴, 인간 백혈병 억제 인자(hLIF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인슐린, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 렙틴 또는 베바시주맙이다. 한 실시양태에서, 상기 제1 폴리펩티드 또는 상기 제2 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20 또는 서열번호 22와 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21 또는 서열번호 23에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 조성물은 제3 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 2에 나타낸 서열을 갖고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 6에 나타낸 서열을 갖고, 상기 제3 폴리펩티드는 서열번호 11에 나타낸 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 제2 폴리펩티드는 중합효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 5 또는 서열번호 12에 의해 코딩된 폴리펩티드와 70% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드와 70% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서 상기 융합 폴리펩티드는 효소 또는 중합효소를 포함하고, 상기 펩티드는 서열번호 3, 서열번호 7 또는 서열번호 9에 의해 코딩된 펩티드와 70% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 DNA 중합효소 I, 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) DNA 중합효소 I(Taq) 및 써모코커스 고르고나리우스(Thermococcus gorgonarius) DNA 중합효소(Tgo)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 에리쓰로포이에틴이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 Taq 중합효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 Tgo 중합효소이거나 Tgo 중합효소와 70% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 Taq 중합효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 써모플라스마 애시도필럼(Thermoplasma acidophilum) 피로인산분해효소(TAPP), 피로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii) dCTP 탈아미노효소, 시티딘 탈아미노효소 및 데옥시시티딘 탈아미노효소로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 탈아미노효소는 RNA 탈아미노효소 또는 DNA 탈아미노효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 비열안정성 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 비열안정성 단백질은 인간 백혈병 억제 인자(hLIF) 또는 렙틴이다. 일부 실시양태에서. 상기 온도는 약 20℃ 내지 약 30℃이다.
일부 실시양태에서, 상기 온도에의 노출은 1주 이상 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 상기 효소 활성은 약 -20℃ 내지 약 35℃ 이상의 온도에 노출되기 전 상기 효소의 활성의 약 50% 이상이다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 13의 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 2와 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 서열번호 3, 서열번호 7 또는 서열번호 9인 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 펩티드와 70% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 펩티드에 연결된 폴리펩티드는 서열번호 5 또는 서열번호 12인 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드와 70% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 펩티드에 연결된 폴리펩티드는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 12인 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드와 70% 이상 동일하다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1, 서열번호 8 또는 서열번호 13에 대한 70% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 공유연결 또는 비공유연결을 통해 상기 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 열안정성 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 열안정성 단백질은 효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 효소는 중합효소, 역전사효소, 핵산분해효소, 단백질분해효소, 피로인산분해효소 또는 탈아미노효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 DNA 중합효소 I, 써머스 아쿠아티커스 DNA 중합효소 I(Taq) 또는 써모코커스 고르고나리우스 DNA 중합효소(Tgo)이다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 Taq 중합효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 피로인산분해효소는 써모플라스마 애시도필럼 피로인산분해효소(TAPP)이다. 일부 실시양태에서, 상기 탈아미노효소는 피로코커스 호리코쉬이 dCTP 탈아미노효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 탈아미노효소는 시티딘 탈아미노효소 또는 데옥시시티딘 탈아미노효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 탈아미노효소는 RNA 탈아미노효소 또는 DNA 탈아미노효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 비열안정성 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 써머스 써모필릭스(Thermus thermophilics)(Tth) DNA 중합효소 또는 ZO5 중합효소이다.
일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 인간 백혈병 억제 인자(hLIF) 또는 렙틴이다. 일부 실시양태에서, 펩티드에 연결된 폴리펩티드는 약 -20℃ 내지 약 35℃의 온도에 노출된 후 효소 활성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 약 20 내지 약 30℃의 온도에 노출된 후 효소 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 온도에의 노출은 1일 이상 시간 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 상기 효소 활성은 약 -20℃ 내지 약 35℃ 이상의 온도에 노출되기 전 조성물의 활성의 약 50% 이상이다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 서열번호 3 또는 서열번호 7과 70% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 3에 의해 코딩된 펩티드와 70% 이상 동일한 제1 펩티드, 및 서열번호 9에 의해 코딩된 펩티드와 70% 이상 동일한 제2 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 펩티드 및 제2 펩티드는 제3 펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 펩티드 및 제2 펩티드는 서로 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 연결은 공유연결이다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 펩티드는 폴리펩티드의 N 말단에 연결되고, 이때 상기 제2 펩티드는 상기 폴리펩티드의 C 말단에 연결된다.
일부 실시양태에서, 상기 제2 펩티드는 상기 제1 펩티드의 C 말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 7에 의해 코딩된 펩티드와 70% 이상 동일하다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 중합효소를 포함하는 혼합물을 사용하여 핵산 프라이머를 연장하는 단계를 포함하는 핵산 증폭 방법을 제공하고, 이때 상기 중합효소는 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 15, 서열번호 17 또는 서열번호 19에 의해 코딩된 펩티드와 70% 이상 동일한 펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 그의 N 말단에서 상기 펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 그의 C 말단에서 상기 펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 Taq 중합효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 -20℃ 내지 50℃의 온도에 노출된 후 효소 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 약 -20℃ 내지 약 35℃의 온도에 노출된 후 효소 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 혼합물은 제2 중합효소를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 중합효소는 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 대한 70% 이상의 상동성을 나타내는 펩티드 서열에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에 1일 이상 동안 노출된 후 효소 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 효소 활성은 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에 1일 이상 동안 노출되기 전 조성물의 활성의 약 50% 이상이다.
일부 실시양태에서, 본원은 서열번호 1과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 태그를 제공하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원은 폴리펩티드의 안정성을 증가시키기 위한 펩티드 태그의 용도를 제공하고, 이때 상기 펩티드 태그는 서열번호 1과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 서열번호 1, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 서열번호 3, 서열번호 15, 서열번호 17 또는 서열번호 19에 나타낸 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 1개 내지 6개 이상의 히스티딘 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 단백질분해효소 절단 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질분해효소 절단 부위는 아미노산 서열 DDDDK를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 상기 폴리펩티드의 분해 또는 변성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 상기 폴리펩티드의 단백질 기능의 상실을 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 온도에 노출된 후 상기 폴리펩티드의 단백질 기능은 상기 온도에 노출되기 전 상기 폴리펩티드의 단백질 기능의 50% 이상이다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 1일 이상 동안 상기 폴리펩티드의 안정성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드에 연결된 상기 펩티드 태그는 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 11, 서열번호 20 또는 서열번호 22에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드에 공유적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드에 비공유적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드의 카르복시 말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 에리쓰로포이에틴, 인간 백혈병 억제 인자(hLIF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인슐린, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 렙틴 또는 베바시주맙이다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드에 연결되어 있지 않다.
일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드에 연결된 상기 펩티드 태그는 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 21 또는 서열번호 23에 나타낸 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 열안정성 단백질 또는 효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 효소는 중합효소, 역전사효소, 핵산분해효소, 피로인산분해효소, 탈아미노효소 또는 단백질분해효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 DNA 중합효소 I, 써머스 아쿠아티커스 DNA 중합효소 I(Taq), 써모코커스 고르고나리우스 DNA 중합효소(Tgo), 써머스 써모필릭스(Tth) DNA 중합효소 또는 ZO5 DNA 중합효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 피로인산분해효소는 써모플라스마 액시도필럼 피로인산분해효소(TAPP)이다. 일부 실시양태에서, 상기 탈아미노효소는 피로코커스 호리코쉬이 dCTP 탈아미노효소이다.
일부 실시양태에서, 본원은 서열번호 1과 50 내지 98% 동일한 펩티드 태그를 제공하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 11이 아닌 폴리펩티드를 제공하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 서열번호 1과 50% 내지 98% 동일한 펩티드 태그를 제공하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 효소 활성 또는 호르몬 활성의 상실을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 11이 아닌 폴리펩티드를 제공하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 효소 활성 또는 호르몬 활성의 상실을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 서열번호 1과 50% 내지 98% 동일한 펩티드 태그를 제공하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 분해를 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 11이 아닌 폴리펩티드를 제공하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 분해를 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드는 상기 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드 또는 조성물은 제2 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 이때 상기 폴리펩티드에 연결된 상기 펩티드 태그는 상기 제2 폴리펩티드의 안정성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드 또는 조성물은 제3 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 이때 상기 폴리펩티드에 연결된 상기 펩티드 태그는 상기 제2 폴리펩티드 또는 상기 제3 폴리펩티드의 안정성을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 본원은 서열번호 1과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 태그를 제공하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 방법을 제공하고, 이때 상기 펩티드 태그는 서열번호 1이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원은 폴리펩티드의 안정성을 증가시키기 위한 펩티드 태그의 용도를 제공하고, 이때 상기 펩티드 태그는 서열번호 1과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖되, 서열번호 1이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원은 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키는 방법을 제공하고, 이때 상기 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 폴리펩티드에 연결된 서열번호 1이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원은 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키기 위한 펩티드 태그의 용도를 제공하고, 이때 상기 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 폴리펩티드에 연결된 서열번호 1이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원은 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키는 방법을 제공하고, 이때 상기 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 Taq 중합효소에 연결된 서열번호 1이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원은 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키기 위한 펩티드 태그의 용도를 제공하고, 이때 상기 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 Taq 중합효소에 연결된 서열번호 1이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원은 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키는 방법을 제공하고, 이때 상기 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 Tgo 중합효소에 연결된 서열번호 1이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원은 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물의 안정성을 증가시키기 위한 펩티드 태그의 용도를 제공하고, 이때 상기 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 Tgo 중합효소에 연결된 서열번호 1이 아니다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 펩티드에 연결된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하는 진핵 번역 개시 서열을 포함하는, 박테리아에서 사용하기 위한 핵산 벡터를 제공하고, 이때 상기 폴리펩티드는 약 -20℃ 내지 약 35℃ 또는 20℃ 내지 약 50℃의 온도에서 효소 활성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 짧은 형태 및 긴 형태 둘다로서 번역된다. 일부 실시양태에서, 상기 진핵 번역 개시 서열은 약 -20℃ 내지 약 35℃의 온도에서 효소 활성을 보유하는 폴리펩티드를 적어도 부분적으로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 상기 진핵 번역 개시 서열은 코작(Kozak) 서열(GCCGCCACCATGGTC)이다. 일부 실시양태에서, 상기 진핵 번역 개시 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 13인 폴리펩티드, 또는 이의 변이체, 단편 또는 돌연변이체를 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 본원에 기재된 핵산 벡터를 포함하는 박테리아를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 펩티드에 연결된 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하고, 이때 상기 폴리펩티드는 약 -20℃ 내지 약 35℃의 온도에서 효소 활성을 보유하고, 상기 폴리펩티드는 진핵 번역 개시 서열을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 열안정성 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 열안정성 단백질은 효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 효소는 중합효소, 피로인산분해효소 또는 탈아미노효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 DNA 중합효소 I, 써머스 아쿠아티커스 DNA 중합효소 I(Taq) 또는 써모코커스 고르고나리우스 DNA 중합효소(Tgo)이다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 Taq 중합효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 중합효소는 Taq 중합효소가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 피로인산분해효소는 써모플라스마 애시도필럼 피로인산분해효소(TAPP)이다. 일부 실시양태에서, 상기 탈아미노효소는 피로코커스 호리코쉬이 dCTP 탈아미노효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 탈아미노효소는 시티딘 탈아미노효소 또는 데옥시시티딘 탈아미노효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 탈아미노효소는 RNA 탈아미노효소 또는 DNA 탈아미노효소이다. 일부 실시양태에서, 상기 진핵 번역 개시 서열은 코작 서열(GCCGCCACCATGGTC)이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 상기 폴리펩티드의 짧은 형태 및 긴 형태 둘다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드에 연결된 상기 폴리펩티드는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 12의 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드와 70% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 10과 70% 이상 동일한 펩티드에 연결된다.
일부 경우, 효소(예를 들면, Taq 중합효소, DNA 탈아미노효소, RNA 탈아미노효소)가 펩티드(예를 들면, 서열번호 1과 70% 이상 동일한 펩티드)에 연결되어 있을 경우, 상기 효소는 약 -20℃ 내지 약 35℃의 온도에 단기간 또는 장기간 노출되기 전 그의 활성의 20%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상의 활성을 나타낸다. 일부 경우, 노출은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 또는 10시간 이상, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일 이상, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주 또는 10주 이상, 또는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 10개월 이상 동안 일어난다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌들, 특허들 및 특허출원들은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시되어 있는 것처럼 온전히 그대로 본원에서 참고적으로 인용된다.
본원에서 제공된 실시양태의 신규 특징은 첨부된 특허청구범위에서 구체적으로 기재되어 있다. 본원에서 제공된 실시양태의 특징 및 이점은 실시양태의 원리가 이용된 예시적 실시양태를 기재하는 하기 상세한 설명 및 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 35℃에 노출된 후 펩티드-폴리펩티드 융합 단백질(서열번호 2)의 안정성을 시험하기 위해 수행된 qPCR 증폭을 보여준다. 새로운 qPCR 혼합물의 제1 샘플을 -20℃에서 저장하고(상부 패널), 제2 샘플을 35℃에서 4주 동안 저장한다(하부 패널).
도 2는 42개 아미노산 펩티드 태그의 아미노산 서열(서열번호 1)을 보여준다.
도 3은 야생형 Taq 중합효소의 N 말단에 연결된 도 2의 펩티드 태그(서열번호 1)로 구성된 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호 2)을 보여준다. 42개 아미노산 펩티드 태그의 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
도 4는 42개 아미노산 펩티드 태그(서열번호 1)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)을 보여준다.
도 5는 야생형 Taq 중합효소의 N 말단에 연결된 도 2의 42개 아미노산(a.a.) 펩티드 태그로 구성된 융합 폴리펩티드(서열번호 2)의 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 전체 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4로서 명시되어 있다. 상기 42개 아미노산 펩티드 태그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 밑줄로 표시되어 있다.
도 6은 야생형 Taq 중합효소의 N 말단에 연결된 이중 가닥 결합 단백질(DSP)의 단편(굵은 글자체로 표시되어 있지 않고 밑줄로 표시된 부분)에 상응하는 펩티드에 연결된 도 2의 변형된 펩티드 태그 단편(서열번호 1)(굵은 글자체 및 밑줄로 표시됨)으로 구성된 융합 폴리펩티드(서열번호 6)의 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 전체 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5로서 명시되어 있다.
도 7은 야생형 Taq 중합효소의 N 말단에 연결된 이중 가닥 결합 단백질(DSP)의 단편(굵은 글자체로 표시되어 있지 않고 밑줄로 표시된 부분)에 상응하는 펩티드에 연결된 도 2의 변형된 펩티드 태그 단편(서열번호 1)(굵은 글자체 및 밑줄로 표시됨)으로 구성된 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호 6)을 보여준다.
도 8은 이중 가닥 결합 단백질(DSP)의 단편(굵은 글자체로 표시되어 있지 않고 밑줄로 표시된 부분)에 상응하는 펩티드에 연결된 도 2의 변형된 펩티드 태그 단편(서열번호 1)(굵은 글자체 및 밑줄로 표시됨)으로 구성된 펩티드 태그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 7)을 보여준다.
도 9는 이중 가닥 결합 단백질(DSP)의 단편(굵은 글자체로 표시되어 있지 않고 밑줄로 표시된 부분)에 상응하는 펩티드에 연결된 도 2의 변형된 펩티드 태그 단편(서열번호 1)(굵은 글자체 및 밑줄로 표시됨)으로 구성된 펩티드 태그의 아미노산 서열(서열번호 8)을 보여준다.
도 10은 DSP 태그 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 9)을 보여준다.
도 11은 DSDP 태그의 아미노산 서열(서열번호 10)을 보여준다.
도 12는 DSP 펩티드(굵은 글자체로 표시되어 있지 않고 밑줄로 표시된 부분)에 연결된 Tgo 중합효소 폴리펩티드에 연결된 도 2의 변형된 펩티드 태그 단편(서열번호 1)(굵은 글자체 및 밑줄로 표시됨)으로 구성된 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호 11)을 보여준다.
도 13은 DSP 펩티드(굵은 글자체로 표시되어 있지 않고 밑줄로 표시된 부분)에 연결된 Tgo 중합효소 폴리펩티드에 연결된 도 2의 변형된 펩티드 태그 단편(서열번호 1)(굵은 글자체 및 밑줄로 표시됨)으로 구성된 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 12)을 보여준다.
도 14는 서열번호 1의 펩티드의 단편의 아미노산 서열(서열번호 13)을 보여준다.
도 15는 다양한 중합효소를 사용하여 보리 게놈 DNA로부터 DNA를 증폭시킨 결과를 보여주는 전기영동 겔을 보여준다.
도 16은 서열번호 1의 펩티드의 변형된 단편의 아미노산 서열(서열번호 14)을 보여준다.
도 17은 36개 아미노산 펩티드(서열번호 14)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 15)을 보여준다.
도 18은 서열번호 1의 펩티드의 변형된 단편의 아미노산 서열(서열번호 16)을 보여준다.
도 19는 40개 아미노산 펩티드(서열번호 16)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 17)을 보여준다.
도 20은 서열번호 1의 펩티드의 변형된 단편의 아미노산 서열(서열번호 18)을 보여준다.
도 21은 29개 아미노산 펩티드(서열번호 18)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 19)을 보여준다.
도 22는 인간 에리쓰로포이에틴 폴리펩티드에 연결된 서열번호 1의 펩티드의 변형된 단편의 아미노산 서열(서열번호 20)을 보여준다.
도 23은 서열번호 20의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 21)을 보여준다.
도 24는 인간 백혈병 억제 인자에 연결된 서열번호 1의 펩티드의 변형된 단편의 아미노산 서열(서열번호 22)을 보여준다.
도 25는 서열번호 22의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 23)을 보여준다.
도 26은 펩티드 태그 중합효소 혼합물을 사용하여 마우스 게놈 DNA로부터 DNA를 증폭시킨 결과를 보여주는 전기영동 겔을 보여준다.
개요
본 개시내용은 -20℃ 내지 +50℃의 온도 또는 약 -20℃ 내지 +35℃의 온도에 단기간 또는 장기간 노출된 후 단백질(예를 들면, 열안정성 효소, 비열안정성 효소)의 안정성을 향상시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 펩티드 태그이거나 펩티드 태그를 포함하는 융합 단백질이다. 상기 단백질은 임의의 종류의 단백질일 수 있다. 상기 펩티드 태그는 단백질 구조, 안정성, 효소 활성, 결합 활성 및 임의의 다른 성질의 보유를 도울 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 단백질은 핵산 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 특히, 특정 온도(예를 들면, 실온)에 단기간 또는 장기간 노출된 후 상기 태그를 갖지 않은 유사한 단백질과 비교될 때 향상된 안정성 또는 효소 활성을 나타낸다. 반응 샘플에서 다른 단백질과 함께 혼합되어 있을 때 상기 다른 단백질의 활성(예를 들면, 감수성, 수율, 특이성)을 향상시키는 융합 폴리펩티드도 본원에 개시되어 있다. 본원에 기재된 조성물용 벡터, 키트, 및 상기 조성물의 사용 방법도 제공된다.
펩티드 태그
본원에 개시된 조성물은 폴리펩티드(예를 들면, 효소, Taq 중합효소)의 안정성을 향상시키는 펩티드(예를 들면, 서열번호 1(도 2), 서열번호 8(도 9), 서열번호 10(도 11), 서열번호 13(도 14) 또는 서열번호 14(도 16)의 아미노산 서열을 갖는 펩티드), 및 이의 변이체, 돌연변이체 및 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 안정성을 향상시키거나 증가시키는 것은 예를 들면, 상기 폴리펩티드의 안정성을 유지하는 것, 상기 폴리펩티드의 분해를 억제하는 것, 상기 폴리펩티드의 변성을 억제하는 것, 상기 폴리펩티드의 단백질 활성(예를 들면, 효소 활성 또는 호르몬 활성)의 상실을 억제하는 것, 상기 폴리펩티드의 응집을 억제하는 것, 상기 폴리펩티드의 결정화를 억제하는 것, 상기 폴리펩티드의 흡수를 억제하는 것, 상기 폴리펩티드의 기능을 보존하는 것, 또는 상기 폴리펩티드의 일차, 이차 또는 삼차 구조를 보존하는 것을 의미한다.
서열번호 1(도 2)은 본원에 기재된 펩티드 태그의 긴 형태(42개 아미노산)의 아미노산 서열을 보여준다. 서열번호 13(도 14)은 본원에 개시된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 조성물 및 방법을 위한 펩티드 태그로서 사용될 수도 있는, 서열번호 1의 31개 아미노산 단편을 개시한다. 서열번호 14(도 16)는 본원에 개시된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 조성물 및 방법을 위한 펩티드 태그로서 사용될 수도 있는, 서열번호 1의 36개 아미노산 단편을 개시한다. 서열번호 1, 서열번호 13 및 서열번호 14는 폴리펩티드의 안정성, 결합 친화성, 효소 활성, 수율 또는 다른 성질을 향상시키기 위해 단독으로 사용될 수 있거나, 함께 사용될 수 있거나, 또는 다른 태그와 함께 사용될 수 있다.
서열번호 10은 이중 가닥 DNA 결합 단백질(DSP)의 단편의 서열을 개시한다. 서열번호 10의 펩티드는 단독으로, 또는 서열번호 1의 펩티드 태그 또는 본원에 기재된 다른 펩티드 태그와 함께 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용될 수도 있다. 예를 들면, 도 7(서열번호 6)은 서열번호 1의 단편 및 서열번호 10의 단편에 연결된 중합효소의 한 예를 제공한다. 도 12(서열번호 11)는 서열번호 1의 단편 및 서열번호 10의 DSP 단편(서열번호 11(도 12)에서 굵은 글자체로 표시되어 있지 않고 밑줄로 표시된 서열로서 개시됨) 둘다에 연결된 중합효소의 한 예를 제공한다.
또한, 상기 조성물은 서열번호 1(도 2), 서열번호 8(도 9), 서열번호 10(도 11), 서열번호 13(도 14) 또는 서열번호 14(도 16)와 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 동일한(또는 상동성을 나타내는) 펩티드를 포함한다. 유사하게, 상기 조성물은 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 15에 의해 코딩된 펩티드와 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 동일한 펩티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 50개 아미노산으로 한정된다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 100개 아미노산으로 한정된다.
2개의 아미노산 서열들의% 서열 동일성은 니들만-분슈-셀러스(Needleman-Wunsch-Sellers) 알고리즘(Needleman et al., (1970), J. Mol. Biol. 48:444; Sellers (1974), SIAM J. Appl. Math., 26:787)에 의해 기재된 바와 같이 펩티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이를 고려하는 전반적인 정렬을 이용함으로써 계산된다. FASTA 분석을 위한 예시적 파라미터는 다음과 같다: ktup = 1, 간극(gap) 개방 벌점 = 10, 간극 연장 벌점 = 1, 및 치환 매트릭스 = BLOSUM62.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드 태그는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 20개 이상의 His 잔기를 포함하는 His 펩티드 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드 태그는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 20개 이하의 His 잔기를 포함하는 His 펩티드 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 His 펩티드 태그는 1개 내지 5개, 2개 내지 6개, 3개 내지 7개, 4개 내지 8개, 5개 내지 9개, 6개 내지 10개, 7개 내지 11개, 8개 내지 12개, 9개 내지 13개, 10개 내지 14개, 1개 내지 10개, 2개 내지 11개, 3개 내지 12개, 4개 내지 13개, 5개 내지 14개, 6개 내지 15개, 7개 내지 16개, 8개 내지 17개, 9개 내지 19개, 10개 내지 20개, 1개 내지 20개, 2개 내지 19개, 3개 내지 18개, 4개 내지 17개, 5개 내지 16개, 6개 내지 15개, 7개 내지 14개, 8개 내지 13개, 9개 내지 12개, 10개 또는 11개, 1개 내지 6개, 1개 내지 7개, 1개 내지 8개, 1개 내지 9개, 또는 1개 내지 10개의 His 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드 태그는 단백질분해효소에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 단백질분해효소 절단 부위를 포함한다. 단백질분해효소 및 관련된 절단 잔기(가로 안에 표시됨)의 비제한적 예로는 트립신(Arg 또는 Lys), 키모트립신(Trp, Tyr, Phe, Leu, Met 또는 His), 단백질내부분해효소(endoproteinase) Asp-N(Asp), 단백질내부분해효소 Arg-C(Arg), 단백질내부분해효소 Glu-C(Glu), 단백질내부분해효소 Lys-C(Lys), 프롤린-펩티드내부분해효소(prolin-endopeptidase)(Pro), 펩신(Phe, Tyr, Trp 또는 Leu), 써모라이신(thermolysin)(Ile, Leu, Val, Ala, Met 또는 Phe), 트롬빈(Arg), 엘라스타제(elastase)(Ala 또는 Val), 파파인(papain)(Leu 또는 Gly), 단백질분해효소 K(방향족 아미노산), 서브틸리신(subtilisin)(His, Ser 또는 Asp) 및 클로스트리파인(clostripain)(Arg)이 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 카르복시펩티드분해효소(carboxypeptidase), 카르복시펩티드분해효소 A, 카르복시펩티드분해효소 B, 카르복시펩티드분해효소 P, 카르복시펩티드분해효소 Y, 카텝신(cathepsin) C, 아시클로아미노산 방출 효소 및 피로글루타메이트 아미노펩티드분해효소(aminopeptidase)에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드 태그는 단백질분해효소 절단 부위를 포함하고, 이때 상기 펩티드 태그는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 20개 이상의 단백질분해효소 절단 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드 태그는 단백질분해효소 절단 부위를 포함하고, 이때 상기 펩티드 태그는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 20개 이하의 단백질분해효소 절단 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 1개 내지 5개, 2개 내지 6개, 3개 내지 7개, 4개 내지 8개, 5개 내지 9개, 6개 내지 10개, 7개 내지 11개, 8개 내지 12개, 9개 내지 13개, 10개 내지 14개, 1개 내지 10개, 2개 내지 11개, 3개 내지 12개, 4개 내지 13개, 5개 내지 14개, 6개 내지 15개, 7개 내지 16개, 8개 내지 17개, 9개 내지 19개, 10개 내지 20개, 1개 내지 20개, 2개 내지 19개, 3개 내지 18개, 4개 내지 17개, 5개 내지 16개, 6개 내지 15개, 7개 내지 14개, 8개 내지 13개, 9개 내지 12개, 10개 또는 11개, 1개 내지 6개, 1개 내지 7개, 1개 내지 8개, 1개 내지 9개, 또는 1개 내지 10개의 단백질분해효소 절단 부위를 포함한다. 일부 경우, 단백질분해효소 절단 부위는 서열 DDDDK를 갖는다. 일부 경우, 단백질분해효소 절단 부위는 4개 이상의 "D" 잔기를 갖는다. 단백질분해효소 절단 부위는 서열 DDDDK와 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 동일할 수 있다. 일부 경우, 상기 펩티드 태그는 단백질분해효소 절단 부위와 유사하지만 실제로 단백질분해 절단 부위로서 작용하지 않는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드 태그는 (Asp) D 태그를 포함하고, 이때 상기 펩티드 태그는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 20개 이상의 Asp 잔기, 예를 들면, DD, DDD, DDDD 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Asp 태그는 4개 이상의 Asp 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드 태그는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 20개 이하의 Asp 잔기를 갖는 Asp 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Asp 태그는 1개 내지 5개, 2개 내지 6개, 3개 내지 7개, 4개 내지 8개, 5개 내지 9개, 6개 내지 10개, 7개 내지 11개, 8개 내지 12개, 9개 내지 13개, 10개 내지 14개, 1개 내지 10개, 2개 내지 11개, 3개 내지 12개, 4개 내지 13개, 5개 내지 14개, 6개 내지 15개, 7개 내지 16개, 8개 내지 17개, 9개 내지 19개, 10개 내지 20개, 1개 내지 20개, 2개 내지 19개, 3개 내지 18개, 4개 내지 17개, 5개 내지 16개, 6개 내지 15개, 7개 내지 14개, 8개 내지 13개, 9개 내지 12개, 10개 또는 11개, 1개 내지 6개, 1개 내지 7개, 1개 내지 8개, 1개 내지 9개, 또는 1개 내지 10개의 Asp 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 펩티드 태그는 (본원에 기재된 바와 같은) His 태그 및 Asp 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 Asp 잔기는 또 다른 아미노산(예를 들면, 하나 이상의 Glu 잔기)로 치환된다. 일부 실시양태에서, 상기 His 태그는 하나 이상의 아미노산(예를 들면, Lys 또는 Arg)으로 치환된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드에 대한 모든 언급은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 즉, 폴리펩티드에 대한 설명은 펩티드에 대한 설명 및 단백질에 대한 설명에도 동등하게 적용되고, 펩티드에 대한 설명 및 단백질에 대한 설명은 폴리펩티드에 대한 설명에도 동등하게 적용된다. 상기 용어들은 천연 발생 아미노산 중합체에 적용될 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 발생 아미노산, 예를 들면, 아미노산 유사체(analog)인 아미노산 중합체에도 적용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어들은 전체 길이 단백질(즉, 항원)을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함하고, 이때 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산 및 비천연 발생 아미노산을 의미할 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체(mimetic)도 의미한다. 천연 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린), 피로라이신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학구조를 보유한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비천연 아미노산" 또는 "비천연 코딩된 아미노산"은 20종의 일반 천연 발생 아미노산 중 하나, 셀레노시스테인 또는 피로라이신이 아닌 임의의 아미노산, 변형된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체를 의미한다. 용어 "비천연 코딩된 아미노산" 및 "비천연 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어들은 "비-천연 아미노산", "비천연 발생 아미노산", 및 이들의 다양하게 하이픈으로 연결된 및 하이픈으로 연결되지 않은 형태이다. 또한, 용어 "비천연 코딩된 아미노산"은 (20종의 일반 아미노산 또는 피로라이신 및 셀레노시스테인을 포함하나 이들로 한정되지 않는) 천연 코딩된 아미노산의 변형(예를 들면, 번역 후 변형)에 의해 발생되되 그 자신이 번역 복합체(complex)에 의해 성장하는 폴리펩티드 쇄 내로 천연적으로 도입되지 않는 아미노산들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 비천연 발생 아미노산의 예로는 N-아세틸글루코스아미닐-L-세린, N-아세틸글루코스아미닐-L-쓰레오닌, O-포스포티로신, 아미노아디프산, 베타-알라닌, 베타-아미노프로피온산, 아미노부티르산, 피페리딘산, 아미노카프리오산, 아미노헵타노산, 아미노이소부티르산, 아미노피멜산, 디아미노부티르산, 데스모신(desmosine), 디아미노피멜산, 디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 하이드록시라이신, 알로-하이드록시라이신, 하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸글리신, 사르코신(sarcosine), N-메틸이소류신, N-메틸발린, 노르발린, 노르류신, 오리씬(orithine), 4-하이드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, 엡실론-N,N,N-트리메틸라이신, 엡실론-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, 시그마-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 아미노산(예를 들면, 4-하이드록시프롤린)이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
용어 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 1 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 관련된 천연 발생 구조적 변이체 및 이들의 합성 비천연 발생 유사체로 구성된 중합체를 의미한다.
용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 약 50개 이상의 아미노산 잔기, 관련된 천연 발생 구조적 변이체 및 이들의 합성 비천연 발생 유사체로 구성된 중합체를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있다.
용어 "핵산"은 천연 발생 핵산 및 비천연 발생 핵산을 의미할 뿐만 아니라, 천연 발생 핵산과 유사한 방식으로 작용하는 핵산 유사체도 의미한다. 핵산은 RNA, DNA 및 핵산 유사체 분자, 예컨대, 당 또는 골격 변형된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택될 수 있다. 그러나, 다른 핵산 유사체, 예컨대, 펩티드 핵산(PNA) 또는 잠겨진 핵산(LNA)도 적합하다는 것을 인식해야 한다. 비천연 발생 핵산의 예로는 할로겐으로 치환된 염기, 알킬로 치환된 염기, 하이드록시로 치환된 염기 및 티올로 치환된 염기뿐만 아니라, 5-프로피닐-우라실, 2-티오-5-프로피닐-우라실, 5-메틸시토신, 이소구아닌, 이소시토신, 슈도이소시토신, 4-티오우라실, 2-티오우라실 및 2-티오티민, 이노신, 2-아미노퓨린, N9-(2-아미노-6-클로로퓨린), N9-(2,6-디아미노퓨린), 하이포잔틴, N9-(7-데아자-구아닌), N9-(7-데아자-8-아자-구아닌) 및 N8-(7-데아자-8-아자-아데닌), 2-아미노-6-"h"-퓨린, 6-아미노-2-"h"-퓨린, 6-옥소-2-"h"-퓨린, 2-옥소-4-"h"-피리미딘, 2-옥소-6-"h"-퓨린, 4-옥소-2-"h"-피리미딘도 있다. 이들은 비티올화된 염기 및 티올화된 염기, 즉 각각 2,4-디옥소 및 4-옥소-2-티옥소 피리미딘, 2,4-디옥소 및 2-옥소-4-티옥소 피리미딘, 4-아미노-2-옥소 및 4-아미노-2-티옥소 피리미딘, 6-옥소-2-아미노 및 6-티옥소-2-아미노 퓨린, 2-아미노-4-옥소 및 2-아미노-4-티옥소 피리미딘, 및 6-옥소-2-아미노 및 6-티옥소-2-아미노 퓨린과 2개의 수소 결합 염기쌍을 형성할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 달리 명시되어 있지 않은 한, 상기 용어에 의해 수식되는 값을 10% 이하로 초과하거나 미만인 값을 의미한다. 예를 들면, 용어 "약 -20℃"는 -22℃ 내지 -18℃의 범위를 의미한다. 또 다른 예로서, "약 1시간"은 54분 내지 66분의 범위를 의미한다.
연결
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드 태그는 몇몇 방식으로(예를 들면, 공유연결 또는 비공유연결) 단백질에 연결된 후 상기 단백질(또는 폴리펩티드)의 안정성을 향상시킨다. 일부 경우, 펩티드(예를 들면, 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 13 또는 서열번호 14의 펩티드)는 폴리펩티드 또는 효소(예를 들면, Taq, Tgo, TAPP, CDA, 피로코커스 호리코쉬이 탈아미노효소)에 공유적으로 연결된다. 상기 펩티드는 상기 폴리펩티드 또는 효소(예를 들면, Taq, Tgo, TAPP, CDA, 피로코커스 호리코쉬이 탈아미노효소)의 N 말단에 연결될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 3에 의해 코딩된 펩티드와 70% 이상 동일한 펩티드는 도 3에 나타낸 바와 같이 Taq 중합효소의 N 말단에 연결될 수 있다. 유사하게, 서열번호 7에 의해 코딩된 펩티드와 70% 이상 동일한 펩티드는 도 7에 나타낸 바와 같이 Taq 중합효소의 N 말단에 연결될 수 있다. 다른 경우, 상기 펩티드는 폴리펩티드 또는 효소의 C 말단에 연결된다. 예를 들면, 도 13은 그의 C 말단에서 DSP 펩티드의 단편에 연결된 Tgo 중합효소의 핵산 서열을 보여준다.
일부 경우, 다수의 펩티드 태그가 본원에 기재된 폴리펩티드에 연결된다. 폴리펩티드는 동일한 펩티드 태그의 다수의 카피에 연결될 수 있거나 2개 이상의 상이한 펩티드 태그에 연결될 수 있다. 일부 예에서, 1개의 펩티드 태그는 폴리펩티드의 N 말단에 연결되는 반면, 제2 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드의 C 말단에 연결된다. 예를 들면, 도 12에 나타낸 폴리펩티드(서열번호 11)는 Tgo 중합효소의 N 말단에 연결된 펩티드 태그(서열번호 1)뿐만 아니라 Tgo 중합효소의 C 말단에 융합된 상이한 펩티드 태그(DSP 단편)(서열번호 11의 밑줄로 표시된 부분)도 포함한다. 다른 예에서, 2개 이상의 (동일한 또는 상이한) 태그가 폴리펩티드에 직렬로 연결된다. 예를 들면, 도 7(서열번호 6)은 Taq 중합효소의 N 말단에 연결된 서열번호 1의 또 다른 단편에 연결된 서열번호 10(도 11)의 DSP 펩티드에 연결된 서열번호 1의 단편을 보여준다.
일부 경우, 본원에서 제공된 펩티드 태그는 서로 직접 연결되고/거나 상기 폴리펩티드에 직접 연결된다. 도 7은 서로 직접 연결된 후 폴리펩티드에 직접 연결된 태그의 한 예를 보여준다. 다른 경우, 상기 태그는 연결제(linker)(예를 들면, 펩티드 연결제 또는 본원에 기재된 다른 연결제)에 의해 서로로부터 분리되어 있다. 상기 태그는 연결제에 의해 상기 폴리펩티드에 연결될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 유전공학을 통해 상기 폴리펩티드 또는 효소(예를 들면, 중합효소)에 연결된다. 예를 들면, 효소(예를 들면, Taq 중합효소)에 융합된 펩티드(예를 들면, 서열번호 1의 펩티드)를 포함하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 DNA 구축물이 생성된다. 이러한 구축물의 핵산 서열의 한 부분의 한 예는 도 5(서열번호 4)에 제시되어 있다. 또 다른 예는 도 6(서열번호 5)에 제시되어 있고, 또 다른 예는 도 13(서열번호 12)에 제시되어 있다.
일부 경우, 폴리펩티드(예를 들면, 중합효소, Taq 중합효소 등)는 이중 가닥 결합 단백질(DSP)의 단편(본원에서 "부분"으로도 지칭됨)(서열번호 6, 밑줄로 표시되어 있으나 굵은 글자체로 표시되어 있지 않은 부분)을 포함하는 펩티드, 또는 이의 변이체, 단편 또는 돌연변이체에 연결된다. 일부 경우, 상기 DSP 단편은 펩티드 태그(예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 13의 펩티드, 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체)에 연결된다. 다른 경우, 상기 펩티드(예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 13의 펩티드)는 제2 중합효소에 연결된 중합효소의 단편에 연결된다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 연결제, 예컨대, 펩티드 연결제를 통해 상기 효소에 연결될 수도 있다. 상기 펩티드 서열 연결제의 길이는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 아미노산일 수 있다. 예로는 다수의 아스파르테이트 또는 글루타메이트 잔기를 함유하는 폴리펩티드가 있다. 적절한 펩티드의 서열 및 길이는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 잠재적인 연결제를 확인하기 위한 펩티드 연결제 예측 소프트웨어 프로그램을 이용함으로써 결정할 수 있다. 이러한 연결제 프로그램의 한 예는 문헌(George and Heringa, (2003), Protein Engineering, 15(11):871-879)에 개시되어 있다.
다른 경우, 펩티드(예를 들면, 서열번호 1의 펩티드)는 비공유연결을 통해 효소에 연결된다. 유용할 수 있는 연결제의 예로는 산 불안정성 연결제, 에스테르 연결제, 하이드라존 연결제, 설폰아미드 함유 연결제, 효소적으로 절단가능한 연결제 또는 중합체계 연결제가 있다. 중합체계 연결제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 화학식 VI)은 소분자 약물 및 대분자 약물의 접합에 널리 사용된다. PEG 접합된 폴리펩티드는 펩티드를 치료제에 연결하는 데 사용되는 경우 약물의 보다 높은 가용성, 보다 낮은 면역원성, 개선된 반감기, 표적화된 전달 및 향상된 활성을 포함하는 다수의 바람직한 이점을 제공할 수 있다.
다수의 반응성 기를 갖는 많은 분자들이 유용한 가교 성분으로서 사용될 수 있고 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 또는 피어스(Pierce)와 같은 회사들로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 활성화된 형태로 입수될 수 있고 접합에 직접 사용될 수 있는 가교 성분이 특히 유용하다. 가교 성분은 유사한 또는 동일한 화학구조를 갖는 다수의 반응성 기들을 포함할 수 있다. 이러한 반응성 기들은 동시에 활성화될 수 있고 다수의 동일한 비가교 성분들에 커플링되어 동종다량체성 생성물을 직접 형성할 수 있다. 다수의 유사한 반응성 기들을 갖는 가교 성분의 예로는 시트르산, EDTA 및 TSAT가 있다. 다수의 동일한 반응성 기들을 함유하는 분지된 PEG 분자도 유용할 수 있다.
소수의 염기성 반응식(이들 모두 웹사이트(www.piercenet.com)에 상세히 기재되어 있음)에 기초하여 작용하는 다수의 특정 화학 생성물이 존재한다. 유용한 가교제의 예로는 이미도에스테르, 활성 활로겐, 말레이미드, 피리딜 디설파이드 및 NHS-에스테르가 있다. 동종이작용성 가교제는 2개의 동일한 반응성 기를 갖고 1 단계 화학적 가교 절차에서 종종 사용된다. 예로는 BS3(절단불가능한 DSS 유사체), BSOCOES(염기 가역성), DMA(다이메틸 아디프이미데이트-2HCl), DMP(디메틸 피멜이미데이트-2HCl), DMS(디메틸 수베르이미데이트-2HCl), DSG(DSS의 5-탄소 유사체), DSP(로만트 시약(Lomant's reagent)), DSS(절단불가능함), DST(산화제에 의해 절단가능함), DTBP(디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트-2HCl), DTSSP, EGS, 설포-EGS, THPP, TSAT, DFDNB(1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)(작은 공간적 거리 사이의 가교에 특히 유용함)가 있다(Kornblatt, J.A. and Lake, D.F. (1980). Cross-linking of cytochrome oxidase subunits with difluorodinitrobenzene. Can J. Biochem. 58, 219-224).
설프하이드릴 반응성 동종이작용성 가교제는 설프하이드릴과 반응하고 종종 pH 6.5 내지 7.5에서 -SH 기와 반응하여 안정한 티오에테르 결합을 형성하는 말레이미드를 기재로 하는 동종이작용성 단백질 가교제이다. BM[PEO]3은 설프하이드릴 대 설프하이드릴 가교 적용에서 접합체 침전 잠재력을 감소시키는 8-원자 폴리에테르 스페이서(spacer)이다. BM[PEO]4는 유사하지만 11-원자 스페이서를 갖는다. BMB는 4-탄소 스페이서를 갖는 절단불가능한 가교제이다. BMDB는 페리오데이트에 의해 절단될 수 있는 연결을 만든다. BMH는 널리 사용되는 동종이작용성 설프하이드릴 반응성 가교제이다. BMOE는 특히 짧은 연결제를 갖는다. DPDPB 및 DTME는 절단가능한 가교제이다. HVBS는 말레이미드의 가수분해력을 갖지 않는다. TMEA는 또 다른 대안이다. 이종이작용성 가교제는 2개의 상이한 반응성 기를 갖는다. 예로는 EDC 활성화를 통한 NHS 에스테르 및 아민/하이드라진, AEDP, ASBA(광반응성, 요오드화가능함), 및 EDC(수용성 카르보디이미드)가 있다. 아민-설프하이드릴 반응성 이작용성 가교제는 AMAS, APDP, BMPS, EMCA, EMCS, GMBS, KMUA, LC-SMCC, LC-SPDP, MBS, SBAP, SIA(특별히 짧음), SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, SMPT, SPDP, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-LC-SMPT, 설포-LC-SPDP, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC 및 설포-SMPB이다. 아민 기 반응성 이종이작용성 가교제는 ANB-NOS, MSA, NHS-ASA, SADP, SAED, SAND, SANPAH, SASD, SFAD, 설포-HSAB, 설포-NHS-LC-ASA, 설포-SADP, 설포-SANPAH 및 TFCS이다. 아르기닌 반응성 가교제는 예를 들면, pH 7 내지 8에서 아르기닌과 특이적으로 반응하는 APG이다.
펩티드 태그의 일부 성질
일부 경우, 펩티드는 효소가 상기 펩티드에 연결되지 않은 동일한 또는 유사한 효소의 활성의 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 활성을 나타내게 한다. 일부 경우, 상기 펩티드는 효소가 일정 온도(예를 들면, 실온, -20℃ 초과의 임의의 온도)에 장기간 또는 단기간 노출되기 전 그의 효소 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 활성을 나타내게 한다. 일부 경우, 상기 펩티드는 폴리펩티드가 일정 온도(예를 들면, 실온, -20℃ 초과의 임의의 온도)에 장기간 또는 단기간 노출되기 전 그의 결합 친화성과 비교될 때 그의 결합 친화성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 결합 친화성을 나타내게 한다.
일부 경우, 본원에 기재된 폴리펩티드 융합 단백질은 반응 혼합물 중의 다른 폴리펩티드의 활성을 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 일부 경우, 융합 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 12에 의해 코딩된 융합 폴리펩티드)는 반응의 감수성, 특이성, 정확성 또는 수율을 향상시킨다. 예를 들면, DNA 중합효소 활성을 갖는 융합 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 11)는 제2 (상이한) DNA 중합효소(예를 들면, Taq 중합효소, 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 11의 Taq 융합체)를 함유하는 샘플에 첨가되어 상기 제2 DNA 중합효소의 특이성, 정확성, 감수성 또는 수율을 향상시킬 수 있다. 일부 경우, 향상 수준은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 2500%, 3000%, 4000% 또는 5000% 이상이다. 또한, 일부 경우, 상기 융합 폴리펩티드는 제3 중합효소의 특이성, 정확성 또는 수율, 또는 3개 이상의 중합효소를 함유하는 반응 혼합물의 특이성, 정확성 또는 수율을 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 일정 온도(예를 들면, 실온)에 단기간 또는 장기간 노출된 후 융합 폴리펩티드의 안정성, 효소 활성 또는 다른 성질을 향상시킬 것이다. 예를 들면, 중합효소(예를 들면, Taq 중합효소)는 1주 이상 또는 심지어 1일 이상 또는 3시간 이상의 시간 동안 실온에 노출된 후 그의 활성의 상당한 부분을 상실할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물(예를 들면, 서열번호 1(도 2), 서열번호 8(도 9), 서열번호 10 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 펩티드)은 효소 또는 중합효소(예를 들면, Taq 중합효소, TGO 중합효소)에 연결되어 상기 효소 또는 중합효소가 일정 시간 동안 일정 온도(예를 들면, 실온)에 노출된 후 활성을 보유하게 할 수 있다. 일부 경우, 펩티드는 중합효소(예를 들면, Taq 중합효소)에 연결되어 상기 중합효소가 일정 온도(예를 들면, 약 20℃ 내지 22℃의 실온)에 장기간 또는 단기간 노출된 후에 조차도 그의 활성의 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 활성을 보유하게 한다. 일부 경우, 상기 펩티드는 Taq 중합효소가 아닌 중합효소 또는 효소에 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 폴리펩티드(예를 들면, 중합효소)가 단일 가닥 DNA 및/또는 이중 가닥 DNA에 결합하는 능력도 향상시킬 수 있다. 종종, 이러한 DNA 결합은 비특이적이다. 일부 경우, 상기 향상 수준은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 2500%, 3000%, 4000% 또는 5000% 이상이다. 서열번호 10에 나타낸 DSP 펩티드 태그, 및 이의 단편, 변이체 및 돌연변이체는 폴리펩티드의 비특이적 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 결합 능력을 향상시키기에 특히 적합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 그의 활성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 -15℃ 내지 50℃, -10℃ 내지 50℃, -5℃ 내지 50℃, 0℃ 내지 50℃, 5℃ 내지 50℃, 10℃ 내지 50℃, 15℃ 내지 50℃, 20℃ 내지 50℃, 20℃ 내지 45℃, 20℃ 내지 40℃, 20℃ 내지 35℃, 20℃ 내지 30℃, 20℃ 내지 25℃, 20℃ 내지 22℃, 15℃ 내지 25℃, 10℃ 내지 25℃, 5℃ 내지 25℃, 0℃ 내지 25℃, 0℃ 내지 30℃, 0℃ 내지 35℃, 0℃ 내지 40℃, 0℃ 내지 45℃, 5℃ 내지 10℃, 5℃ 내지 15℃, 5℃ 내지 20℃, 5℃ 내지 25℃, 5℃ 내지 30℃, 5℃ 내지 35℃, 5℃ 내지 40℃, 5℃ 내지 45℃, 10℃ 내지 15℃, 10℃ 내지 20℃, 10℃ 내지 25℃, 10℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 35℃, 10℃ 내지 40℃, 10℃ 내지 45℃, 15℃ 내지 20℃, 15℃ 내지 30℃, 15℃ 내지 35℃, 15℃ 내지 40℃, 또는 15℃ 내지 45℃의 온도에서 그의 활성을 보유한다.
일부 경우, 상기 융합 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 11의 융합 단백질)는 약 -20℃, -19℃, -18℃, -17℃, -16℃, -15℃, -14℃, -13℃, -12℃, -11℃, -10℃, -9℃, -8℃, -7℃, -6℃, -5℃, -4℃, -3℃, -2℃, -1℃, 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃ 또는 50℃ 이상의 온도에 노출된 후 일정 백분율의 그의 안정성, 활성, 감수성, 정확성, 수율 또는 다른 성질을 보유한다. 상기 온도에의 노출은 단기간 또는 장기간 노출일 수 있다. 상기 온도에의 노출은 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분 또는 60분 이상 동안 지속될 수 있다. 상기 온도에의 노출은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간 이상 동안, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일 이상 동안, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 이상 동안, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 이상 동안, 또는 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년 또는 10년 이상 동안 지속될 수 있다. 일부 경우, 상기 온도는 실온(예를 들면, 약 20℃ 내지 22℃)이다. 일부 경우, 중합효소는 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주 이상 동안 실온에 노출된다. 예를 들면, 중합효소(예를 들면, Taq)는 4주 이상, 6주 이상, 10주 이상 또는 15주 이상 동안 실온 또는 35℃ 이상의 온도에 노출될 수 있다.
한 예에서, 도 1은 -20℃에서 저장된 후 또는 +35℃에서 4주 동안 저장된 후 펩티드에 융합된 Taq 중합효소의 활성을 보여준다. 상부 패널은 중합효소가 -20℃에서 저장된 경우 중합효소 활성을 보여주고, 하부 패널은 35℃에서 4주 동안 저장된 후 펩티드-융합 폴리펩티드의 중합효소 활성을 보여준다. 도 1에 나타낸 바와 같이, Taq 중합효소 융합 효소는 두 조건 하에서 저장된 후 유사한 활성을 나타낸다.
폴리펩티드
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물(예를 들면, 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 13의 펩티드, 또는 이의 단편, 변이체 또는 돌연변이체)은 다양한 폴리펩티드, 단백질, 효소 또는 펩티드에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 중합효소 연쇄 반응(PCR); 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호에 기재된 바와 같은 방법(K. B. Mullis); 및 당업계에 공지된 임의의 다른 개선된 방법에 유용한 임의의 효소에 연결될 수 있다. PCR은 클로닝 또는 정제를 이용하지 않으면서 DNA의 혼합물에서 표적 서열의 절편의 농도를 증가시키는 방법이다. 상기 표적 서열을 증폭시키는 이 방법은 전형적으로 과량의 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 원하는 표적 서열이 함유된 DNA 혼합물에 도입한 후 DNA 중합효소의 존재 하에서 정확한 순서의 열적 순환을 수행하는 것으로 구성된다. 상기 2개의 프라이머들은 이중 가닥 표적 서열의 각각의 가닥에 상보적이다. 증폭을 수행하기 위해, 상기 혼합물을 변성시킨 후 상기 프라이머들을 표적 분자 내의 그들의 상보적 서열에 어닐링시킨다. 어닐링 후, 상기 프라이머들은 중합효소에 의해 연장되어 상보적 가닥의 새로운 쌍을 형성한다. 변성 단계, 프라이머 어닐링 단계 및 중합효소 연장 단계를 다회 반복하여(즉, 변성, 어닐링 및 연장은 1주기를 구성함) 원하는 표적 서열의 증폭된 절편을 고농도로 수득할 수 있다.
일부 실시양태에서, 다양한 중합효소가 본원에 기재된 펩티드 태그에 연결될 수 있다. 이러한 중합효소는 Taq 중합효소(예를 들면, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석에서 유용함), DNA 중합효소 I(예를 들면, 닉(nick) 번역 및 프라이머 연장 분석에서 유용함), 클레나우(Klenow) 중합효소(예를 들면, 무작위 프라이머 표지에서 유용함), 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(transferase)(TdT)(예를 들면, 3' 말단 표지에서 유용함), 역전사효소(예를 들면, RNA 주형으로부터 DNA를 합성하는 데에 유용함) 또는 다른 중합효소, 예컨대, 시험관내 전사에 유용한 SP6 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 T7 RNA 중합효소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 뉴클레오티드를 새로 형성되는 가닥의 3' 말단에 부가함으로써 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 카피를 합성하는 효소인 DNA 의존성 DNA 중합효소에 연결될 수 있다. 몇몇 DNA 중합효소는 3'→ 5' 핵산말단분해효소(exonuclease) 활성에 의해 부여된 교정(proo-freading) 능력도 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 DNA 의존성 DNA 중합효소는 박테리아 또는 박테리오파지로부터 단리된 천연 발생 효소일 수 있거나 재조합적으로 발현될 수 있거나, 변형될 수 있거나, 또는 일부 원하는 특성, 예를 들면, 열안정성 또는 다양한 변형된 주형을 인식하거나 다양한 변형된 주형으로부터 DNA 가닥을 합성하는 능력을 보유하도록 개조된 진화된 형태를 가질 수 있다. DNA 의존성 DNA 중합효소는 합성을 개시하기 위해 상보적 프라이머를 요구한다. 적합한 조건 하에서 DNA 의존성 DNA 중합효소가 RNA 주형으로부터 상보적 DNA 카피를 합성할 수 있다는 것은 공지되어 있다. (본원에 기재된) RNA 의존성 DNA 중합효소는 전형적으로 DNA 의존성 DNA 중합효소 활성도 나타낸다.
DNA 중합효소의 비제한적 예로는 써머스 아쿠아티커스(Taq) DNA 중합효소, 이. 콜라이(E. coli) DNA 중합효소 I, 써머스 써모필러스(Tth) DNA 중합효소, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) DNA 중합효소, 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus littoralis) DNA 중합효소, 박테리오파지 T7 DNA 중합효소, 써모코커스 고르고나리우스(Tgo) 중합효소, Pfu 중합효소, 이. 콜라이 DNA 중합효소의 클레나우 단편, Tma DNA 중합효소, 엑소-Tli DNA 중합효소, 엑소-KOD DNA 중합효소, 엑소-JDF-3 DNA 중합효소, 엑소-PGB-D DNA 중합효소, U1 Tma(N 절두된(truncated)) 써마토가 마르티마(Thermatoga martima) DNA 중합효소, 또는 박테리오파지 T4, Phi-29, M2 또는 T5로부터 유래된 DNA 중합효소가 있다.
일부 실시양태에서, 원하는 경우, 온도 안정성 중합효소가 본원에 개시된 펩티드 태그에 연결될 수 있다. 예를 들면, 써머스 아쿠아티커스로부터 단리된 대표적인 열안정성 효소를 개시하는 미국 특허 제4,889,818호를 참조한다. 추가 대표적인 온도 안정성 중합효소는 예를 들면, 박테리아로부터 추출된 중합효소, 예컨대, 써머스 아쿠아티커스 DNA 중합효소 I(Taq), 써모코커스 고르고나리우스 중합효소(Tgo), 피로코커스 호리코쉬이 중합효소, 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus) 중합효소, 피로코커스 오에세이(Pyrococcus woesei) 중합효소, 써머스 필리포르미스(Thermus filiformis) 중합효소, 써머스 플라버스(Thermus flavus) 중합효소, 써머스 루베르(Thermus ruber) 중합효소, 써머스 써모필러스 중합효소, 바실러스 스테아로써모필러스 중합효소(열거된 다른 효소들보다 다소 더 낮은 최적 온도를 가짐), 써머스 락테우스(Thermus lacteus) 중합효소, 써머스 루벤스(Thermus rubens) 중합효소, 써모토가 마리티마 중합효소, 써모코커스 리토랄리스 중합효소 및 메타노써머스 페르비더스(Methanothermus fervidus) 중합효소를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 경우, 본원에 기재된 펩티드 태그는 중합효소 활성을 나타낼 수 있거나 중합효소 활성을 반드시 나타내지 않을 수 있는 열안정성 효소(예를 들면, 써모플라스마 애시도필럼 피로인산분해효소(TAPP), 피로인산분해효소, dCTP 탈아미노효소(CDA), 데옥시시티딘 탈아미노효소, 시티딘 탈아미노효소, RNA 탈아미노효소, DNA 탈아미노효소)에 연결된다. 일부 경우, 펩티드 태그(서열번호 1 또는 서열번호 8의 펩티드)는 비열안정성 폴리펩티드(예를 들면, 인간 백혈병 억제 인자(hLIF), 렙틴)에 연결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 가닥 치환 활성(롤링 서클(rolling circle) 중합으로도 공지되어 있음)을 나타내는 중합효소에 연결될 수 있다. 가닥 치환은 원형 DNA 주형의 직렬 카피의 합성을 야기할 수 있고 등온 PCR 반응에서 특히 유용하다. 본원에서 제공된 적합한 롤링 서클 중합효소의 비제한적 예로는 T5 DNA 중합효소(Chatterjee et al., Gene 97:13-19 (1991)), T4 DNA 중합효소 완전효소(holoenzyme)(Kaboord and Benkovic, Curr. Biol. 5:149-157 (1995)), 파지 M2 DNA 중합효소(Matsumoto et al., Gene 84:247 (1989)), 파지 PRD1 DNA 중합효소(Jung et al., Proc. Natl. Aced. Sci. USA 84:8287 (1987), and Zhu and Ito, Biochim. Biophys. Acta. 1219:267-276 (1994)) 및 DNA 중합효소 I의 클레나우 단편(Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45:623-627 (1974))이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
롤링 서클 중합효소의 한 부류의 한 예는 복제 개시 방식으로서 단백질 프라이밍(priming)을 이용한다. 이 부류의 예시적 중합효소는 파지 y29, PRD1, Cp-1, Cp-5, Cp-7, y15, y1, y21, y25, BS 32 L17, PZE, PZA, Nf, M2Y(또는 M2), PR4, PR5, PR722, B103, SF5, GA-1 및 포도비리대(Podoviridae) 과의 관련 구성원들로부터 선택되거나 유래된 변형된 DNA 중합효소 및 비변형된 DNA 중합효소이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 통상적으로 이중 가닥 서열인 프로모터 서열을 갖는 이중 가닥 또는 부분적 이중 가닥 DNA 분자로부터 다수의 RNA 카피를 합성하는 효소인 DNA 의존성 RNA 중합효소 또는 전사효소에 연결될 수 있다. 상기 RNA 분자는 상기 프로모터의 바로 하류의 특정 위치에서 시작하여 5'→3' 방향으로 합성된다. 전사효소의 예로는 이. 콜라이 및 박테리오파지 T7, T3 및 SP6으로부터 유래된 DNA 의존성 RNA 중합효소가 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 RNA 주형으로부터 상보적 DNA 카피를 합성하는 효소인 RNA 의존성 DNA 중합효소 또는 역전사효소(RT)에 연결될 수 있다. 이 방법에서, 역전사는 예를 들면, 미국 특허 제5,322,770호에 기재된 바와 같이 PCR에 커플링된다. RT-PCR에서, RNA 주형은 효소의 역전사효소 활성으로 인해 cDNA로 전환된 후, 동일한 또는 상이한 효소의 중합 활성에 의해 증폭된다. 모든 공지된 역전사효소들이 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 카피를 제조하는 능력도 가지므로, 이들은 RNA 의존성 DNA 중합효소이자 DNA 의존성 DNA 중합효소이다. RT는 RNA 분해효소(RNAse) H 활성도 나타낼 수 있다. 열안정성 및 열불안정성 역전사효소 및 중합효소 둘다 사용될 수 있다.
통상의 역전사효소는 말로니(Maloney) 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV-RT)로부터 유래될 수 있다. 본원에 기재된 펩티드 태그는 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스(M-MLV) 역전사효소, 라우스 육종 바이러스(RSV) 역전사효소, 조류 골수아세포증(Myeloblastosis) 바이러스(AMV) 역전사효소, 라우스 관련 바이러스(RAV) 역전사효소, 골수아세포증 관련 바이러스(MAV) 역전사효소, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 역전사효소, 조류 육종-백혈증 바이러스(ASLV) 역전사효소, 레트로바이러스 역전사효소, 레트로트랜스포존 역전사효소, 간염 B 역전사효소, 꽃양배추 모자이크 바이러스 역전사효소, 박테리아 역전사효소, 써머스 써모필러스(Tth) DNA 중합효소, 써머스 아쿠아티커스(Taq) DNA 중합효소, 써모토가 네오폴리타나(Thermotoga neopolitana)(Tne) DNA 중합효소, 써모토가 마리티마(Tma) DNA 중합효소, 써모코커스 리토랄리스(Tli 또는 VENTR(상표명)) DNA 중합효소, 피로코커스 푸리오서스(Pfu) DNA 중합효소, DEEPVENT(상표명), 피로코커스 종 GB-D DNA 중합효소, 피로코커스 우시이(Pyrococcus woosii)(Pwo) DNA 중합효소, 바실러스 스테로써모필러스(Bst) DNA 중합효소, 바실러스 칼도필러스(Bacillus caldophilus)(Bca) DNA 중합효소, 설폴로블러스 애시도칼다리우스(Sulfoloblus acidocaldarius)(Sac) DNA 중합효소, 써모플라스마 애시도필러스(Tac) DNA 중합효소, 써머스 플라버스(Tfl/Tub) DNA 중합효소, 써머스 루베르(Tru) DNA 중합효소, 써머스 브룩키아너스(Thermus brockianus)(DYNAZYME(상표명)) DNA 중합효소, 메타노박테리움 써모오토트로피컴(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth) DNA 중합효소, 및 이들의 돌연변이체, 변이체 및 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 역전사효소 활성을 나타내는 폴리펩티드에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 아밀라제(amylase)에 연결될 수 있다. 아밀라제의 비제한적 예로는 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 락토바실러스 매니호티보란스(Lactobacillus manihotivorans), 마이셀리오프쏘라 써모필라(Myceliophthora thermophila), 피로코커스 푸리오서스, 피로코커스 오에세이, 스타필로써머스 마리너스(Staphylothermus marinus), 설폴로버스 솔파타리커스(Sulfolobus solfataricus), 써모코커스 아그레가네스(Thermococcus aggreganes), 써모코커스 푸미콜란스(Thermococcus fumicolans), 써모코커스 하이드로써말리스(Thermococcus hydrothermalis), 써모마이세스 라누기노사스(Thermomyces lanuginosas), 써모코커스 프로파운더스(Thermococcus profoundus), 바실러스 시쿨란스(Bacillus ciculans), 바실러스 세레우스 변이체 마이코이데스(Bacillus cereus var. Mycoides) 및 클로스트리디움 써모설푸로게네스(Clostridium thermosulphurogenes)로부터 유래된 아밀라제가 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 풀루라나제(pullulanase)에 연결될 수 있다. 풀루라나제의 비제한적 예로는 바실러스 종, 피로코커스 푸리오서스, 피로코커스 오에세이, 써모코커스 아그레간스, 써머스 칼도필러스 GK24, 써모코커스 셀레르(Thermococcus celer), 써모코커스 하이드로써말리스, 써모코커스 리토랄리스 및 써모토가 마리티마 MSB8로부터 유래된 풀루라나제가 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 자일라나제(xylanase)에 연결될 수 있다. 자일라나제의 비제한적 예로는 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스, 바실러스 써쿨란스(Bacillus circulans), 바실러스 종 균주 SPS-0, 바실러스 서브틸리스, 클로스트리디움 아보섬(Clostridium abosum), 딕티오글로머스(Dictyoglomus) 종 균주 B1 푸사리움 프로리퍼라텀(Fusarium proliferatum), 피로코커스 푸리오서스, 스시탈리디움 써모필럼(Scytalidium thermophilum), 스트렙토마이세스 종 균주 S38, 설폴로버스 솔파타리커스, 테헤로마이세스 라누기노서스(Teheromyces lanuginosus), 써모아서스 아우란티아커스(Thermoasus aurantiacus), 서모토가 마리티마 MSB8, 써모토가 네아폴리타나, 써모토가 종 균주 FjSS3-B1 및 써모토가 써마럼(Thermotoga thermarum)으로부터 유래된 자일라나제가 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 셀룰라제(cellulase)에 연결될 수 있다. 셀룰라제의 비제한적 예로는 아내로셀루 써모필럼(Anaerocellu thermophilum), 바실러스 서브틸리스, 피로코커스 푸리오서스, 피로코커스 호리코시이(Pyrococcus horicoshi), 로도써머스 마리너스(Rhodothermus marinus), 써모토가 마리테마(Thermotoga maritema) MSB8 및 써모토가 네아폴타나(Thermotoga neapoltana)(엔도셀룰라제 A 또는 B)로부터 유래된 셀룰라제가 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 단백질분해효소에 연결될 수 있다. 단백질분해효소의 비제한적 예로는 바실러스 브레비스(Bacilllus brevis), 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 종 JB-99, 바실러스 스테아로써모필러스 TP26, 바실러스 종 제AH-101호, 바실러스 써모루베르(Bacillus thermoruber), 피로코커스 종 KOD1, 스타필로써머스 마리너스(Staphylothermus marinus), 써모애시도필레스(Thermoacidophiles), 써모코커스 아그레가네스, 써모코커스 셀레르, 써모코커스 리토랄리스 및 써모토가 마리테마로부터 유래된 단백질분해효소가 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그는 지질분해효소(lipase)에 연결될 수 있다. 지질분해효소의 비제한적 예는 바실러스 애시도칼다리우스, 바실러스 종 RSJ-1, 바실러스 균주 J33, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 써모카텐레터스(Bacillus thermocatenletus), 바실러스 써모레오보란스(Bacillus thermoleovorans) ID-1, 게오바실러스(Geobacillus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 피로바큘럼 칼리디폰티스(Pyrobaculum calidifontis), 피로코커스 푸리오서스 및 피로코커스 호리코쉬이로부터 유래된 지질분해효소가 있다.
일부 경우, 하기 중합효소들 중 하나 이상이 서열번호 3, 서열번호 7 또는 서열번호 9에 의해 코딩된 펩티드 태그, 또는 본원에 기재된 다른 펩티드 태그에 연결된다: G46E E678G CS5 DNA 중합효소, G46E L329A E678G CS5 DNA 중합효소, G46E E678G CS6 DNA 중합효소, Δ Z05R DNA 중합효소, ZO5 중합효소, E615G Taq DNA 중합효소, 써머스 플라버스(Tfl) 중합효소(예를 들면, 본원에 기재된 T-종결자(terminator) 뉴클레오티드를 도입하는 변형된 Tfl 중합효소), 써마토가 마리티마-25 또는 Tma-25 중합효소, Tma-30 중합효소, 써머스 써모필릭스(Tth) DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Pfx DNA 중합효소, 써머스 종 SPS-17 중합효소, E615G Taq 중합효소, 써모스 Z05R 중합효소, T7 DNA 중합효소, 코른베르그(Kornberg) DNA 중합효소 I 또는 이. 콜라이 DNA 중합효소 I, 클레나우 DNA 중합효소, Taq DNA 중합효소, 마이크로코커스 DNA 중합효소, 알파 DNA 중합효소, 역전사효소, AMV 역전사효소, M-MuLV 역전사효소, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 이. 콜라이 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, T4 DNA 중합효소, T7 RNA 중합효소, RNA 중합효소 II, 말단 전이효소, 폴리뉴클레오티드 인산화효소(PNP), 리보뉴클레오티드 도입 DNA 중합효소 등. 일부 경우, 교정 효소가 서열번호 3에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 서열번호 7에 의해 코딩된 폴리펩티드에 연결된다. 대안적으로, 임의의 중합효소(예를 들면, 본원에 기재된 중합효소)가 서열번호 7 또는 서열번호 9에 의해 코딩된 폴리펩티드의 단편, 예를 들면, 이중 가닥 결합 단백질(DSP)에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드 태그(또는 구조체)는 중합효소가 아닌 폴리펩티드에 안정성을 제공할 수도 있다. 상기 펩티드 태그는 특히, 폴리펩티드가 일정 시간 동안 일정 온도(예를 들면, 실온)에 노출된 경우 상기 폴리펩티드의 임의의 활성, 예를 들면, 결합 활성 또는 효소 활성의 보유를 도울 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 펩티드 태그는 에리쓰로포이에틴(EPO)(헤마토포이에틴 또는 헤모포이에틴으로도 공지됨)에 연결되어, 예를 들면, 실온에서 EPO의 안정성을 향상시킬 수 있다. EPO는 적혈구형성 또는 적혈 세포 생성을 조절하는 당단백질 호르몬이다. 이것은 골수 내의 적혈구(적혈 세포) 전구체를 위한 사이토카인이다. 정제된 형태의 EPO는 질환, 예컨대, 빈혈 또는 신경 질환(예를 들면, 정신분열증)의 치료에 사용될 수 있다. 상업적으로 입수될 수 있는 EPO의 종류는 에리쓰로포이에틴(에포에이틴(Epoeitin)-알파(상표명)) 및 다르베포이에틴(Darbepoietin)-알파(상표명)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상표명은 에포겐(Epogen)(상표명), 에포에틴(Epoetin)(상표명), 프로크릿(Procrit)(상표명), 에프렉스(Eprex)(상표명), 네오레코르몬(NeoRecormon)(상표명), 다르베포에틴(Darbepoetin)(상표명), 에포에틴 델타(상표명), 피디포에틴(PDpoetin)(상표명), 아라네스프(Aranesp)(상표명) 및 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-에포에틴 베타(미르세라(Mircera)(상표명))를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
EPO는 5개의 엑손을 갖는 단일 카피 유전자에 의해 코딩된다. 인간 EPO 유전자와 마우스 EPO 유전자는 전사 개시 부위의 바로 상류에서 90% 유사한 서열을 갖고 코딩 영역에서 80% 유사한 서열을 갖고 제1 인트론에서 65% 유사한 서열을 갖는다. 인트론, 스플라이스 공여 부위 및 스플라이스 수용 부위의 위치는 인간 EPO 유전자와 마우스 EPO 유전자 사이에 보존되어 있다. EPO에 대한 mRNA는 5' 비번역 영역 및 3' 비번역 영역 둘다를 함유하고 인간 및 마우스의 경우 리더 펩티드 서열 및 166개 아미노산의 예측된 성숙 EPO 단백질을 코딩하고 원숭이의 경우 리더 펩티드 서열 및 168개 아미노산의 예측된 성숙 EPO 단백질을 코딩한다. 분비된 형태의 인간 EPO, 즉 소변으로부터 회수된 천연 발생 EPO(uh-EPO) 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현된 재조합 EPO(rh-EPO)는 번역 후 절단에 의해 제거되는 C 말단 아르기닌을 결여하고 있다. 성숙 인간 EPO 단백질은 165개 아미노산을 포함하고 분자량이 34 kDa이고 분자의 중량의 약 40%를 차지하는 글리코실 잔기를 갖는다. EPO 분자는 그들의 소수성 도메인을 통해 상호작용하여 수성 환경 내에서 주로 구형인 구조를 형성하는 4개의 나선을 포함한다(Cheetham et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5:861-866). 인간 EPO 및 뮤린 EPO는 4개의 시스테인을 갖고, 원숭이 EPO는 5개의 시스테인을 갖는다. 내부 디설파이드 가교는 인간 EPO에서 Cys7과 Cys161 사이 및 Cys29와 Cys33 사이에 존재한다. 이들 디설파이드 가교들 중 하나 이상이 이차 구조에 중요하다.
EPO는 개별 에리쓰로포이에틴 수용체(EPOR) 서브유닛 상의 특정 위치들 사이에서 가교를 형성하는 방식으로 미리 형성된 EPOR 동종이량체(즉, (EPOR)2)의 세포외 부분에 결합함으로써 적혈구형성을 개시한다. EPO가 (EPOR)2에 결합하는 경우, 구형 리간드의 큰 부분이 결합 영역으로부터 멀리 떨어지고 EPO와 (EPOR)2의 복합체로부터 수성 매질 내로 외부를 향하고 있다. 인간 EPO는 4개의 글리코실화 부위를 갖는다: Ser126에서 1개의 O 연결된 부위, 및 Asn24, Asn38 및 Asn83에서 3개의 N 연결된 부위. N 연결된 글리코실화 부위는 뮤린 및 원숭이 EPO에 보존되어 있다. 인간 EPO의 올리고사카라이드 쇄는 퓨코스 함유 시알릴화된 사안테나(tetraantennary) 올리고사카라이드이고, 이들 중 일부는 반복된 N-아세틸락토스아민을 함유한다. 남은 N 연결된 올리고사카라이드는 삼안테나(triantennary) 올리고사카라이드 및 이안테나(biantennary) 올리고사카라이드이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 EPO를 그의 천연 형태로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 하나 이상의 돌연변이를 갖는 EPO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 하기 4개의 글리코실화 부위에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 EPO를 포함한다: Ser126에서 1개의 O 연결된 부위, 및 Asn24, Asn38 및 Asn83에서 3개의 N 연결된 부위. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 4개의 나선에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 EPO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 디설파이드 가교를 형성하는 하기 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 EPO를 포함한다: Cys7, Cys161, Cys29 및 Cys33. 일부 실시양태에서, EPO 돌연변이는 보존된 또는 비보존된 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 임의의 단백질 치료제가 본원에 개시된 펩티드 태그에 연결될 수 있다. 단백질 치료제의 요약은 문헌(Leader et al. (2008) Nature Review/Drug Discovery 7:21-39)에서 발견될 수 있다. 단백질 치료제의 예로는 효소 또는 조절 활성을 나타내는 단백질 치료제, 특별한 표적화 활성을 나타내는 단백질 치료제, 단백질 백신 및 단백질 진단제가 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 조성물은 화장용(cosmetic) 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 화장용 펩티드 또는 폴리펩티드는 표피 성장 인자(EGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 성장 분화 인자 9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간암 유래된 성장 인자(HDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF), 트롬보포이에틴, 형질전이 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전이 성장 인자 베타(TGF-β), 태반 성장 인자, 인간 골 형태형성 단백질(BMP), BMP2, BMP7, 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 콜라겐분해효소, 젤라틴분해효소, 및 매트릭스 금속단백질분해효소(metalloproteinase)-1, 매트릭스 금속단백질분해효소-2, 매트릭스 금속단백질분해효소-3, 매트릭스 금속단백질분해효소-7, 매트릭스 금속단백질분해효소-8, 매트릭스 금속단백질분해효소-9, 매트릭스 금속단백질분해효소-10, 매트릭스 금속단백질분해효소-11, 매트릭스 금속단백질분해효소-12, 매트릭스 금속단백질분해효소-13, 매트릭스 금속단백질분해효소-14, 매트릭스 금속단백질분해효소-15, 매트릭스 금속단백질분해효소-16, 매트릭스 금속단백질분해효소-17, 매트릭스 금속단백질분해효소-18, 매트릭스 금속단백질분해효소-19, 매트릭스 금속단백질분해효소-20, 매트릭스 금속단백질분해효소-21, 매트릭스 금속단백질분해효소-23A, 매트릭스 금속단백질분해효소-23B, 매트릭스 금속단백질분해효소-24, 매트릭스 금속단백질분해효소-25, 매트릭스 금속단백질분해효소-26, 매트릭스 금속단백질분해효소-27 또는 매트릭스 금속단백질분해효소-28을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
효소 또는 조절 활성을 나타내는 단백질 치료제의 예로는 하기 치료제가 있다: 내분비 장애의 치료를 위한 치료제(예를 들면, 인슐린, 성장 호르몬(GH) 소마토트로핀, 연어 칼시토닌, 인간 부갑상선 호르몬 잔기 1-34); 지혈 및 혈전증 장애의 치료를 위한 치료제(예를 들면, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 항트롬빈 III, 단백질 C 농축물, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 유로키나제(urokinase)); 대사 결핍증의 치료를 위한 치료제(예를 들면, 베타-글루코-세레브로시다제(beta-gluco-cerebrosidase), 알파-L 아이두로니다제(iduronidase)); 폐 및 위장관 장애의 치료를 위한 치료제(예를 들면, 알파-1-단백질분해효소 억제제, 젖당분해효소(lactase), 췌장 효소); 면역결핍 장애의 치료를 위한 치료제(예를 들면, 아데노신 탈아미노효소, 혼합된 면역글로불린); 혈액 장애의 치료를 위한 치료제(예를 들면, 인간 알부민, 본원에 기재된 바와 같은 에리쓰로포이에틴); 생식능력을 위한 치료제(인간 여포 자극 호르몬(FSH), 인간 융모 생식샘자극호르몬(HCH), 루트로핀(Lutropin)-알파); 면역조절을 위한 치료제(예를 들면, 인터페론(IFN), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), I형 알파-IFN, IFN-베타, IFN-감마, IFN-감마1베타, 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-8, 인터루킨-9, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-14, 인터루킨-15, 인터루킨-16, 인터루킨-17, 인터루킨-18, 인터루킨-19, 인터루킨-20, 인터루킨-21, 인터루킨-22, 인터루킨-23, 인터루킨-24, 인터루킨-25, 인터루킨-26, 인터루킨-27, 인터루킨-28, 인터루킨-29, 인터루킨-30, 인터루킨-31, 인터루킨-32, 인터루킨-33, 인터루킨-34, 인터루킨-35); 성장 조절을 위한 치료제(예를 들면, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 성장 분화 인자 9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간암 유래된 성장 인자(HDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF), 트롬보포이에틴, 형질전이 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전이 성장 인자 베타(TGF-β), 태반 성장 인자, 인간 골 형태형성 단백질(BMP), BMP2, BMP7, 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF)). 다른 단백질 치료제는 단백질분해성 치료제(예를 들면, 트립신), 네시리티드(Nesiritide), 보툴리늄 독소 A형 또는 B형, 콜라겐분해효소, 인간 데옥시리보핵산분해효소 I, 도르나제(dornase) 알파, 히알루론산분해효소, 파파인, L-아스파라긴분해효소(asparaginase), 인간화된 항체(예를 들면, 베바시주맙(아바스틴)(상표명), 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(trastuzumab)), 엔푸비르티드(enfuvirtide), 애브식시맙(abciximab), 단백질 백신(예를 들면, HBsAg 백신, HPV 백신, OspA) 및 항-붉은털 원숭이 IgG를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 진단제도 본원에 기재된 펩티드 태그에 연결될 수 있다. 예로는 글루카곤, 성장 호르몬 방출 호르몬, 암 및 다른 질환을 위한 조영제, HIV 항원 및 HCV 항원이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그에 연결된 폴리펩티드는 섬유성 단백질 또는 구형 단백질일 수 있다. 상기 펩티드 태그에 연결될 수 있는 단백질의 종류는 하기 단백질들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 세포질골격 단백질(예를 들면, 액틴, Arp2/3, 코로닌(Coronin), 디스트로핀(dystrophin), FtsZ%, 케라틴, 미오신, 스펙트린(Spectrin), 타우(Tau)(단백질), 튜불린); 세포외 매트릭스 단백질(예를 들면, 콜라겐, 엘라스틴, F-스폰딘(spondin), 피카추린(Pikachurin)); 혈장 단백질(예를 들면, 혈청 알부민, 혈청 아밀로이드 P 성분); 응집 인자(예를 들면, 보체 단백질, C1-억제제, C3-전환효소(convertase), 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XIII, 피브린, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z 관련 단백질분해효소 억제제, 트롬빈, 본 빌레브란트(von Willebrand) 인자); 급성기(acute phase) 단백질(예를 들면, C-반응성 단백질); 헤모단백질; 세포 부착 단백질(예를 들면, 캐드헤린, 인테그린, NCAM, 셀렉틴); 경막 수송 단백질(예를 들면, CFTR, 글리코포린(glychophorin) D, 스크램블라제(scramblase)); 이온 채널(예를 들면, 아세틸콜린 수용체); G-단백질 커플링된 수용체; 칼륨 채널; 공동수송(synport)/역수송(antiport) 단백질; 호르몬 및 성장 인자(예를 들면, 표피 성장 인자, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 옥시토신, 여포 자극 호르몬, 황체형성 호르몬); 전사 조절 단백질(예를 들면, MyoD, C-myc); 영양분 저장/수송 단백질(예를 들면, 페리틴(ferritin)); 면역글로불린; 및 트립신.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그에 연결된 폴리펩티드는 핵산 결합 펩티드(예를 들면, DNA, RNA, mRNA, cRNA, miRNA, siRNA 및 cDNA를 포함하는 임의의 핵산에 결합할 수 있는 펩티드)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 펩티드는 제한효소이다. 제한효소의 예로는 AatII, Acc651, AccI, AciI, AclI, AcuI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhdI, AleI, AluI, AlwI, AlwNI, ApaI, ApaLI, ApeKI, ApoI, AscI, AseI, AsiSI, AvaI, AvaII, AvrII, BaeGI, BaeI, BamHI, BanI, BanII, BbsI, BbvCI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BclI, BfaI, BfuAI, BfuCI, BglI, BglII, BlpI, BmgBI, BmrI, BmtI, BpmI, Bpu10I, BpuEI, BsaAI, BsaBI, BsaHI, BsaI, BsaJI, BsaWI, BsaXI, BseRI, BseYI, BsgI, BsiEI, BsiHKAI, BsiW1, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BsoBI, Bsp1286I, BspCNI, BspDI, BspEI, BspHI, BspMI, BspQI, BsrBI, BsrDI, BsrFI, BsrGI, BsrI, BssHII, BssKI, BssSI, BstAPI, BstBI, BstEII, BstNI, BstUI, BstXI, BstYI, BstZ17I, Bsu36I, BtgI, BtgZI, BtsCI, BtsI, Cac8I, ClaI, CspCI, CviAII, CviKI-1, CviQI, DdeI, DpnI, DpnII, DraI, DraIII, DrdI, EaeI, EagI, EarI, EciI, Eco53kI, EcoNI, EcoO109I, EcoP15I, EcoRI, EcoRV, FatI, FauI, Fnu4HI, FokI, FseI, FspI, HaeII, HaeIII, HgaI, HhaI, HincII, HindIII, HinfI, HinPII, HpaI, HpaII, HphI, Hpy166II, Hpy188I, Hpy188III, Hpy99I, HpyAV, HpyCH4III, HpyCH4IV, HpyCH4V, KasI, KpnI, MboI, MboII, MfeI, MluI, MlyI, MmeI, MnlI, MscI, MseI, MslI, MspAII, MspI, MwoI, NaeI, NarI, Nb.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, NciI, NcoI, NdeI, NgoMIV, NheI, NlaIII, NlaIV, NmeAIII, NotI, NruI, NsiI, NspI, Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nt.BstNBI, Nt.CviPII, PacI, PaeR7I, PciI, PflFI, PflMI, PhoI, PleI, PmeI, PmlI, PpuMI, PshAI, PsiI, PspGI, PspOMI, PspXI, PstI, PvuI, PvuII, RsaI, RsrII, SacI, SacII, SalI, SapI, Sau3AI, Sau96I, SbfI, ScaI, ScrFI, SexAI, SfaNI, SfcI, SfiI, SfoI, SgrAI, SmaI, SmlI, SnaBI, SpeI, SphI, SspI, StuI, StyD4I, StyI, SwaI, T, TaqαI, TfiI, TliI, TseI, Tsp45I, Tsp509I, TspMI, TspRI, Tth111I, XbaI, XcmI, XhoI, XmaI, XmnI 및 ZraI이 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 귀소(homing) 핵산내부분해효소(endonuclease)일 수도 있다. 귀소 핵산내부분해효소의 예로는 I-CeuI, I-SceI, PI-PspI 및 Pl-SceI이 있다. 펩티드는 닉형성(nicking) 핵산내부분해효소일 수도 있다. 닉형성 핵산내부분해효소의 예로는 Nb.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nt.BstNBI 및 Nt.CviPII가 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 높은 정확성을 갖는다. 펩티드는 본원에 기재된 임의의 펩티드의 높은 정확성 변이체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 세포 핵산분해효소, 녹두 핵산분해효소, P1 핵산분해효소 또는 S1 핵산분해효소이다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 단일 가닥 특이적(sss) 핵산분해효소이다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 돌연변이 분석 및/또는 단일 뉴클레오티드 다형성(polymorphism) 분석에 유용한 핵산분해효소이다. 세포 핵산분해효소는 이종이중체(heteroduplex) DNA 주형에서 단일 염기쌍 불일치를 절단하기 위한 돌연변이 분석 및/또는 단일 뉴클레오티드 다형성 분석(틸링(TILLING)(게놈 내에서의 표적화 유도된 국소 손상) 불일치 절단 방법)을 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 펩티드는 신속히 분해될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 태그에 연결된 펩티드는 데옥시리보핵산분해효소, 리보핵산분해효소, 핵산말단분해효소, 핵산내부분해효소, 데옥시리보핵산말단분해효소(exodeoxyribonuclease), 리보핵산말단분해효소(exoribonuclease), 데옥시리보핵산내부분해효소(endodeoxyribonuclease), 리보핵산내부분해효소(endoribonuclease), 올리고핵산분해효소, RecBCD, 데옥시리보핵산분해효소 I, 데옥시리보핵산분해효소 II, 데옥시리보핵산분해효소 IV, UvrABC 핵산내부분해효소, 아스퍼길러스(aspergillus) 핵산분해효소 S1 또는 마이크로코커스 핵산분해효소일 수 있다.
변형된 폴리펩티드
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 중합효소는 핫 스타트(Hot Start) PCR 방법에서의 사용을 위해 변형될 수 있다. "핫 스타트 PCR"은 보편적인 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 변형된 형태이다. 본원에 개시된 중합효소도 핫 스타트 PCR 방법에서 사용되도록 변형될 수 있다. 핫 스타트 PCR은 전형적으로 저온 및 주위 온도에서 불활성화되어 있고, 추후에 고온에서, 통상적으로 PCR의 변성 단계 동안(예를 들면, 반응 온도가 90℃ 내지 105℃, 예를 들면, 95℃에 도달하였을 때) 활성화되는 중합효소의 사용을 수반한다. 일부 예에서, 샘플은 특정 온도(예를 들면, 약 85℃, 90℃, 95℃, 100℃, 105℃ 또는 110℃)에서 일정한 시간(예를 들면, 1분, 5분, 7분, 10분, 15분, 20분 또는 30분 이상) 동안 항온처리되어야 한다. 예를 들면, 반응물은 핫 스타트 PCR 중합효소를 활성화시키기 위해 95℃에서 15분 동안 항온처리될 수 있다. 이러한 중합효소의 사용은 PCR 설정 동안 저온에서 형성된 비특이적으로 어닐링된 프라이머 및 프라이머 이량체의 연장을 방해한다. 핫 스타트 PCR 기법은 DNA의 비특이적 증폭을 피하고 감수성 및 수율을 증가시키는 데에 특히 유용하다.
핫 스타트 PCR에 사용되는 중합효소의 억제는 항체, 펩티드 또는 화학적 변형에 의해 야기된다. 상기 변형은 통상적으로 활성 부위 측쇄에서 만들어진다(예를 들면, 에이비진 써모스타트(ABgene Thermostart)). 핫 스타트 PCR에 유용한 화학적으로 변형된 중합효소의 한 예는 알데하이드 변형 시약, 바람직하게는 포름알데하이드에 의해 변형된 중합효소이다(예를 들면, 미국 특허 제6,183,998호 참조). 다른 예로는 다른 화학반응, 예컨대, 무수물 반응, 및 미국 특허 제5,773,258호에 기재된 다른 변형을 통해 변형된 중합효소가 있다. 핫 스타트 PCR에 유용한 중합효소는 중합효소 특이적 항체에의 연결에 의해 변형될 수도 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,338,671호 참조). 일부 경우, 중합효소는 열적 순환이 일어나기 전에 물리적 장벽에 의해 반응 혼합물 중의 다른 시약들로부터 격리된다. 예를 들면, 왁스 장벽 방법에서, 왁스, 예컨대, 파라핀 왁스 또는 파라핀 왁스 비드를 사용하여 반응 혼합물 중의 다른 시약들로부터 중합효소를 격리한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 중합효소는 핫 스타트 PCR 방법을 촉진하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,773,258호 및 제6,183,998호 참조). 일부 경우, 중합효소는 핫 스타트 PCR 방법을 촉진하기 위해 항체 또는 펩티드에 의해 변형된다. 다른 경우, 본원에 기재된 중합효소는 파라핀 왁스(예를 들면, 파라핀 왁스 비드) 내에 격리된다.
핫 스타트 PCR의 수행에 필요한 시약들은 상업적으로 입수가능한 키트 내에 포장되어 있다. 이들은 고온, 예컨대, PCR의 변성 단계에 유용한 고온에서 중합효소를 활성화시킨다.
폴리펩티드 변이체
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 기재된 폴리펩티드(예를 들면, 중합효소)는 (예를 들면, 시험관 내에서) 발생될 수 있고 활성 및 안정성에 대해 스크리닝될 수 있는 상기 폴리펩티드의 막대한 수의 서열 변이체, 돌연변이체 및 단편도 포함한다. 또한, 상기 폴리펩티드는 상업적으로 입수가능한 임의의 변형된 폴리펩티드(예를 들면, 티탄 중합효소(인비트로겐(Invitrogen))); Taq 골드(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)) 등)를 포함한다. 절두된 Taq 중합효소는 종종 활성을 보유한다. 따라서, 본원에 기재된 폴리펩티드 Taq 중합효소의 N' 말단 절두체(truncation) 및 C' 말단 절두체를 포함한다. 실제로, 상기 폴리펩티드는 활성을 보유하는 임의의 Taq 중합효소를 포함한다.
서열 변이체를 단리하기 위해, 특정 도메인에 상응하는 전체 서열 또는 특정 하위서열의 무작위 돌연변이유발을 수행할 수 있다. 대안적으로, 단백질분해효소 기능에 중요한 잔기에 대한 돌연변이를 피하면서 부위 지정된 돌연변이유발을 반복적으로 수행할 수 있다. 돌연변이 내성 예측 프로그램을 이용하여 엄격히 무작위 돌연변이유발에 의해 발생될 비기능성 서열 변이체의 수를 크게 감소시킬 수 있다. 단백질 기능에 대한 단백질 서열의 아미노산 치환의 효과를 예측하는 다양한 프로그램들(예를 들면, SIFT, 폴리펜(PolyPhen), PANTHER PSEC, PMUT 및 토포(Topo) SNP)이 예를 들면, 문헌(Henikoff et al., (2006), Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 7:61-80)에 기재되어 있다.
또한, 본 개시내용은 기재된 폴리펩티드에 대한 상이한 백분율의 서열 동일성을 제공한다. % 서열 동일성은 보편적인 방법에 의해 측정된다. 예를 들면, 문헌(Altschul et al., (1986), Bull. Math. Bio., 48:603) 및 문헌(Henikoff and Henikoff, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915)을 참조한다. 요약하건대, 10의 간극 개방 벌점, 1의 간극 연장 벌점 및 헨니코프(Henikoff) 및 헨니코프(상기)의 "BLOSUM62" 점수화 매트릭스를 이용하여 정렬 점수를 최적화하기 위해 2개의 아미노산 서열들을 정렬시킨다. 그 다음, % 동일성은 다음과 같이 계산된다: ([동일한 일치의 총 수]/[보다 긴 서열의 길이 + 2개의 서열들을 정렬하기 위해 상기 보다 긴 서열 내로 도입된 간극의 수])(100).
2개의 아미노산 서열들을 정렬하는 데에 이용될 수 있는 많은 확립된 알고리즘들이 존재한다. 피어슨(Pearson) 및 립만(Lipman)의 "FASTA" 유사성 검색 알고리즘은 본원에 개시된 아미노산 서열과 또 다른 펩티드의 아미노산 서열에 의해 공유된 동일성 수준을 조사하기에 적합한 단백질 정렬 방법이다. FASTA 알고리즘은 문헌(Pearson et al., (1988), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:2444) 및 문헌(Pearson (1990), Meth. Enzymol. 183:63)에 기재되어 있다. 요약하건대, FASTA는 먼저 보존적 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 고려하지 않으면서 가장 높은 동일성 밀도(ktup 변수가 1인 경우) 또는 동일성 쌍(ktup가 2인 경우)을 갖는, 조회 서열(예를 들면, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 9)과 시험 서열에 의해 공유된 영역들을 확인함으로써 서열 유사성을 특징규명한다. 그 다음, 아미노산 치환 매트릭스를 이용하여 모든 짝을 이룬 아미노산들의 유사성을 비교함으로써 가능 높은 동일성 밀도를 갖는 10개의 영역들의 점수를 다시 매기고, 가장 높은 점수에 기여한 잔기들만을 포함하도록 상기 영역들의 말단을 "다듬(trimming)"는다. (서열의 길이 및 ktup 값에 기초하여 예정된 식에 의해 계산된) "컷오프" 값보다 더 높은 점수를 갖는 여러 영역들이 존재하는 경우, 다듬어진 초기 영역들이 연결되어 간극을 갖는 대략적인 정렬을 형성할 수 있는지를 확인하기 위해 상기 초기 영역들을 조사한다. 마지막으로, 아미노산 삽입 및 결실을 허용하는 니들만-분슈-셀러스 알고리즘(Needleman et al., (1970), J. Mol. Biol. 48:444; Sellers (1974), SIAM J. Appl. Math., 26:787)의 변형된 알고리즘을 이용하여 2개의 아미노산 서열들의 최대 점수 영역들을 정렬한다. FASTA 분석을 위한 예시적 파라미터는 다음과 같다: ktup = 1, 간극 개방 벌점 = 10, 간극 연장 벌점 = 1, 및 치환 매트릭스 = BLOSUM62. 이들 파라미터들은 문헌(Pearson, (1990), Meth. Enzymol., 183:63)의 부록 2에 설명된 바와 같이 점수화 매트릭스 파일("SMATRIX")을 변형시킴으로써 FASTA 프로그램 내로 도입될 수 있다.
본원은 본원에 개시된 아미노산 서열과 비교될 때 보존적 아미노산 변화를 갖는 단백질도 제공한다. 일반 아미노산들 사이에서의 치환, 예를 들면, "보존적 아미노산 치환"은 각각의 하기 군들 내에 있는 아미노산들 사이에서의 치환에 의해 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판, (3) 세린 및 쓰레오닌, (4) 아스파르테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘. BLOSUM62 표는 관련 단백질들로 구성된 500개 이상의 군들의 고도로 보조된 영역들을 대표하는 단백질 서열 절편들의 약 2,000개 국소 다중 정렬로부터 유도된 아미노산 치환 매트릭스이다. 문헌(Henikoff et al., (1992), Proc. Nat'l Acad. Sci., USA, 89:10915)을 참조한다. 따라서, BLOSUM62 치환 빈도를 이용하여 본원에서 제공된 아미노산 서열 내로 도입될 수 있는 보존적 아미노산 치환을 정의할 수 있다. 비록 (상기 논의된 바와 같이) 화학적 성질에만 기초한 아미노산 치환을 디자인할 수 있지만, 표현 "보존적 아미노산 치환"은 바람직하게는 -1보다 더 큰 BLOSUM62 값에 의해 표시되는 치환을 의미한다. 예를 들면, 아미노산 치환은 상기 치환이 0, 1, 2 또는 3의 BLOSUM62 값을 특징으로 하는 경우 보존적이다. 이 시스템에 따르면, 바람직한 보존적 아미노산 치환은 1 이상(예를 들면, 1, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 하는 반면, 보다 바람직한 보존적 아미노산 치환은 2 이상(예를 들면, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 한다.
아미노산 서열이 추가 잔기, 예컨대, 추가 N 말단 또는 C 말단 아미노산을 포함할 수 있고 상기 서열이 본원에서 제공된 조성물 및 방법에서 기능성을 나타내기에 충분한 생물학적 단백질 활성을 보유하는 한 본원에 개시된 서열들 중 하나에 기재된 바와 본질적으로 동일할 수 있다는 것도 이해될 것이다.
일부 경우, 조성물은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 10 또는 서열번호 12에 의해 코딩된 폴리펩티드와 10%, 20%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 동일한 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 돌연변이체 또는 변이체를 포함한다.
약학 조성물
본원에서 제공된 조성물은 경구(협측 및 설하를 포함함), 직장, 비강내, 국소, 경피, 경피 패치, 폐, 질, 좌제 또는 비경구(근육내, 동맥내, 경막내, 피내, 복강내, 피하 및 정맥내를 포함함) 투여에 적합한 약학 제제로서 투여될 수 있거나, 또는 에어로졸화, 흡입 또는 통기에 의한 투여에 적합한 형태로 투여될 수 있다. 약물 전달 시스템에 대한 일반적인 정보는 문헌(Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999))에서 발견될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 약학 조성물은 담체 및 부형제(완충제, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신, 산화방지제, 정균제, 킬레이팅화제, 현탁제, 비후제 및/또는 보존제를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 물, 오일(석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광물유, 참깨유 등을 포함함), 식염수 용액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액, 향미제, 착색제, 탈점착화제(detackifier) 및 다른 허용가능한 첨가제, 보조제 또는 결합제, 생리학적 조건에 근접하기 위해 요구되는 다른 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대, pH 완충제, 긴장성 조절제, 유화제, 습윤화제 등을 포함한다. 부형제의 예로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 모노스테아르산글리세롤, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 보존제를 실질적으로 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서, 약학 제제는 하나 이상의 보존제를 함유할 수 있다. 약학 투여 제형에 대한 일반적인 방법론은 문헌(Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999))에서 발견된다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체를 사용하여 본원에서 제공된 조성물을 투여할 수 있지만, 담체의 종류는 투여 방식에 따라 변경될 것이라는 점이 인식될 것이다. 약학적으로 허용가능한 담체/부형제에 대한 철저한 논의는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, AR, ed., 20th edition, 2000: Williams and Wilkins PA, USA)에서 발견될 수 있다.
화합물은 잘 공지된 기술의 이용을 통해 리포솜(liposome) 내에 캡슐화될 수도 있다. 생체분해성 미세구(microsphere)도 본원에서 제공된 약학 조성물용 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 생체분해성 미세구는 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호, 제5,075,109호, 제5,928,647호, 제5,811,128호, 제5,820,883호, 제5,853,763호, 제5,814,344호 및 제5,942,252호에 개시되어 있다.
리포솜 또는 미세구(또는 미세입자) 내의 화합물을 투여할 수 있다. 환자에게 투여하기 위해 리포솜 및 미세구를 제조하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 미국 특허 제4,789,734호(이의 내용은 본원에 참고로 도입되어 있음)는 생물학적 물질을 리포솜 내에 캡슐화하는 방법을 기술한다. 본질적으로, 상기 물질을 수용액에 용해하고, 적절한 인지질 및 지질을 요구되는 경우 계면활성제와 함께 첨가하고, 필요한 경우 상기 물질을 투석하거나 초음파처리한다. 공지된 방법의 검토는 문헌(G. Gregoriadis, Chapter 14, "Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 2.sup.87-341 (Academic Press, 1979))에 의해 제공된다.
중합체 또는 단백질로 형성된 미세구는 당업자에게 잘 공지되어 있고 위장관을 통과하여 혈류 내로 직접 들어가기에 적합하게 만들어질 수 있다. 대안적으로, 화합물을 도입하고 미세구 또는 미세구의 복합물을 수일 내지 수개월의 시간 동안의 서방출을 위해 이식할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,906,474호, 제4,925,673호 및 제3,625,214호, 및 문헌(Jein, TIPS 19:155-157 (1998))(이들의 내용은 본원에 참고로 도입되어 있음)을 참조한다.
당업계에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 약물의 농도는 조절될 수 있고, 용액의 pH는 완충될 수 있고, 등장성은 정맥내 주사에 적합하도록 조절될 수 있다.
본원에서 제공된 화합물은 당업계에 잘 공지된 적합한 비히클 중의 멸균 용액 또는 현탁액으로서 제제화될 수 있다. 약학 조성물은 보편적인 잘 공지된 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있거나 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그 자체로서 사용되도록 포장될 수 있거나 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 조합된다. 적합한 제제 및 추가 담체는 문헌(Remington "The Science and Practice of Pharmacy" (20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MD))(이의 교시는 온전히 그대로 본원에 참고로 도입되어 있음)에 기재되어 있다.
약제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 단독으로 제공될 수 있거나, 또는 하나 이상의 다른 약제 또는 하나 이상의 다른 제형과 함께 제공될 수 있다. 예를 들면, 제제는 각각의 약제의 상대적인 효능 및 의도된 처방에 따라 특정 비율로 하나 이상의 약제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 2개의 상이한 숙주 표적을 표적화하기 위한 조성물에서 효능이 유사한 경우, 약 1:1 비의 약제들을 사용할 수 있다. 2개의 제형이 동일한 투여 유닛, 예를 들면, 하나의 크림, 좌제, 정제, 캡슐제, 에어로졸 스프레이, 또는 음료에 용해될 산제의 다발로 함께 제제화될 수 있거나, 또는 각각의 형태가 별도의 유닛, 예를 들면, 2개의 크림, 2개의 좌제, 2개의 정제, 2개의 캡슐제, 정제와 이 정제를 용해시키기 위한 액체, 2개의 에어로졸 스프레이, 또는 산제의 다발과 이 산제를 용해시키기 위한 액체 등으로 제제화될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본원에서 제공된 약제의 생물학적 효능 및 성질을 보유하고 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않은 성질을 나타내지 않는 염을 의미한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염은 다중서브유닛 복합체의 형성을 방해하거나, 감소시키거나 불안정화시키거나, 또는 다중서브유닛 복합체의 파괴를 촉진하는 데 있어서 본원에서 제공된 약제의 효능을 방해하지 않는다.
전형적인 염은 무기 이온, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 이온 등의 염이다. 이러한 염은 무기산 또는 유기산, 예컨대, 염화수소산, 브롬화수소산, 인산, 질산, 황산, 메탄설폰산, p 톨루엔설폰산, 아세트산, 푸마르산, 석신산, 락트산, 만델산, 말산, 시트르산, 타르타르산 또는 말레산을 사용하여 형성한 염을 포함한다. 추가로, 약제(들)가 카르복시 기 또는 다른 산성 기를 함유하는 경우, 무기 염기 또는 유기 염기를 사용하여 상기 약제를 약학적으로 허용가능한 부가염으로 전환시킬 수 있다. 적합한 염기의 예로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 시클로헥실아민, 디시클로헥실-아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 등이 있다.
약학적으로 허용가능한 에스테르 또는 아미드는 본원에서 제공된 약제의 생물학적 효능 및 성질을 보유하고 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않은 성질을 나타내지 않는 에스테르 또는 아미드를 의미한다. 예를 들면, 상기 에스테르 또는 아미드는 다중서브유닛 복합체의 조립을 방해하거나, 감소시키거나 불안정화시키거나, 세포에서 다중서브유닛 복합체의 파괴 또는 제거를 촉진하거나, 또는 대상체에서 하나 이상의 다중서브유닛 복합체 또는 불용성 성분에의 노출과 관련된 하나 이상의 징후 또는 병리학적 증상을 예방하거나 완화하는 데 있어서 본원에서 제공된 약제의 유리한 효과를 방해하지 않는다. 전형적인 에스테르는 에틸, 메틸, 이소부틸, 에틸렌 글리콜 등을 포함한다. 전형적인 아미드는 비치환된 아미드, 알킬 아미드, 디알킬 아미드 등을 포함한다.
본원에서 제공된 수성 조성물은 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 매질에 용해될 수 있거나 분산될 수 있는 유효량의 본 발명의 조성물을 포함한다. 본원에서 사용된 약학적으로 허용가능한 담체는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 물질의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 보편적인 매질 또는 물질이 활성 성분과 상용불가능한 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 상기 매질 또는 물질의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분도 조성물 내로 도입될 수 있다.
주사가능한 조성물을 위한 예시적 약학적으로 허용가능한 담체는 칼슘 염, 예를 들면, 염화칼슘, 브롬화칼슘, 황산칼슘 등; 및 유기산의 염, 예컨대, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 액체 형태로 제공될 수 있고, 0.01% 내지 1%의 세제, 예컨대, 폴리소르베이트-80, 또는 탄수화물 첨가제, 예컨대, 만니톨, 소르비톨 또는 트레할로스를 함유하거나 함유하지 않는 다양한 pH(5 내지 8)의 식염수계 수용액으로 제제화될 수 있다. 통상적으로 사용되는 완충제는 히스티딘, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트를 포함한다. 이들 제제는 통상의 저장 및 사용 조건 하에서 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유할 수 있다. 미생물의 작용은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 방지될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제, 예를 들면, 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 상기 조성물에서 사용함으로써 달성될 수 있다.
인간 투여의 경우, 제제는 FDA 및 다른 규제 관청 표준에 의해 요구되는 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시킨다. 활성 화합물은 일반적으로 비경구 투여용으로 제제화, 즉 정맥내, 근육내, 피하, 병소내 또는 복강내 경로를 통한 주사용으로 제제화될 것이다. 활성 구성요소 또는 성분을 함유하는 수성 조성물의 제조는 본 개시내용에 비추어 볼 때 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사가능한 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있고, 주사 전에 액체를 첨가하여 용액 또는 현탁액을 제조하는 데에 사용되기에 적합한 고체 제형도 제조될 수 있고, 제제는 유화될 수도 있다.
멸균 주사가능한 용액은, 요구되는 양의 활성 화합물을 상기 나열된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매에 도입한 후, 요구되는 경우 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 염기성 분산 매질 및 상기 나열된 다른 성분들 중 요구되는 다른 성분들이 함유된 멸균 비히클 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우, 제조 방법은 활성 성분과 임의의 추가 원하는 성분으로 구성된 산제를 이의 미리 멸균 여과된 용액으로부터 생성하는 진공 건조 기법 및 동결 건조 기법을 포함한다.
제제화되었을 경우, 용액은 본원에 기재된 기준에 기초할 때 치료적으로 유요한 양으로 투여 제제에 적합한 방식에 의해 전신 투여될 것이다. 제제는 다양한 투여 제형, 예컨대, 전술된 주사가능한 용액의 형태로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐제 등도 사용될 수 있다.
투여될 약학 조성물의 적절한 양, 치료 횟수 및 유닛 투여량은 치료될 대상체 및 대상체의 질환 상태에 따라 변경될 것이다. 투여를 책임지는 사람은 어떠한 경우에서든 개별 대상체의 적합한 투여량을 결정할 것이다.
비경구 투여, 예컨대, 정맥내 또는 근육내 주사용으로 제제화된 화합물 이외에, 피내 투여(미국 특허 제5,997,501호, 제5,848,991호 및 제5,527,288호 참조), 폐 투여(미국 특허 제6,361,760호, 제6,060,069호 및 제6,041,775호 참조), 협측 투여(미국 특허 제6,375,975호 및 제6,284,262호 참조), 경피 투여(미국 특허 제6,348,210호 및 제6,322,808호 참조) 및 경점막 투여(미국 특허 제5,656,284호 참조)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 본 발명의 다른 대안적 투여 방법도 이용될 수 있다. 이러한 투여 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 또한, 예컨대, 비액(nasal solution) 또는 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제를 사용한 본 발명의 비내(intranasal) 투여를 이용할 수 있다. 비액은 통상적으로 점적 또는 스프레이 형태로 비강에 투여되도록 고안된 수용액이다. 비액은 많은 면에서 코 분비물과 유사하도록 제조된다. 따라서, 수용성 비액은 통상적으로 등장성을 나타내고 pH 5.5 내지 6.5를 유지하도록 다소 완충된다. 추가로, 요구되는 경우, 안(ophthalmic) 제제에서 사용되는 항균 보존제와 유사한 항균 보존제 및 적절한 약물 안정화제가 제제 내에 포함될 수 있다. 다양한 상업적 비(nasal) 제제가 공지되어 있고, 예를 들면, 항생제 및 항히스타민제를 포함하고 천식 예방을 위해 사용된다.
다른 투여 방식에 적합한 추가 제제는 좌제 및 페사리를 포함한다. 직장용 페사리 또는 좌제도 사용될 수 있다. 좌제는 통상적으로 직장 또는 요도 내로 삽입되도록 처방되는, 다양한 중량 및 형태를 갖는 고체 투여 제형이다. 삽입 후, 좌제는 강액(cavity fluid)에서 연화되거나, 용융되거나 또는 용해된다. 좌제의 경우, 전통적인 결합제 및 담체는 일반적으로 예를 들면, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하고, 이러한 좌제는 임의의 적합한 범위, 예를 들면, 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2%의 범위로 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
경구 제제는 통상적으로 사용되는 부형제, 예를 들면, 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐제, 지속 방출 제제 또는 산제의 형태를 취한다. 일부 정의된 실시양태에서, 경구 약학 조성물은 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용성 담체를 포함할 것이거나, 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐 내에 봉입될 수 있거나, 정제로 압축될 수 있거나, 또는 식이 음식과 함께 직접 도입될 수 있다. 경구 치료 투여의 경우, 활성 화합물은 부형제와 함께 도입될 수 있고 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로치, 캡슐제, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 박편(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 0.1% 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 물론, 조성물 및 제제의 백분율은 달라질 수 있고 편리하게는 유닛의 중량의 약 2% 내지 약 75% 또는 약 25% 내지 60%일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물의 양은 적합한 투여량이 수득되게 하는 양이다.
정제, 트로치, 환제, 캡슐제 등은 하기 물질들도 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대, 검 트라가칸쓰, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 인산이칼슘; 붕해제, 예컨대, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대, 스테아르산마그네슘; 감미제, 예컨대, 수크로스, 락토스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대, 페퍼민트, 동록유 또는 체리 향료. 투여량 유닛 제형이 캡슐제인 경우, 상기 제형은 전술된 종류의 물질들 이외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅제로서 존재할 수 있거나 투여량 유닛의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐제는 쉘락(shellac), 당 또는 이들 둘다로 코팅될 수 있다. 엘릭시르의 시럽은 활성 화합물 이외에 감미제로서 수크로스, 보존제로서 메틸렌 및 프로필 파라벤, 염료 및 향미제, 예컨대, 체리 또는 오렌지 향료를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 경구 약학 조성물은 위의 환경으로부터 활성 성분을 보호하기 위해 장코팅될 수 있고, 장코팅 방법 및 제제는 당업계에 잘 공지되어 있다.
키트/혼합물/추가 조성물
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 열안정성 효소의 사용을 요구하는 기법에서 사용될 조성물(예를 들면, 5x 용액 농축), 예컨대, 정량 중합효소 연쇄 반응(qPCR)(예를 들면, 실시간 PCR, RT PCR, RT qPCR, 프로브 qPCR, 에바그린(EvaGreen) qPCR, HRM)을 위한 조성물로 직접 제제화될 수 있다.
본원에 개시된 키트는 DNA 결합 염료, 특히 이중 가닥 DNA에 결합하고 신호, 예컨대, 형광 신호를 방사하는 염료를 포함할 수 있다. DNA 결합 염료의 비제한적 예로는 미국 특허 제7,601,498호에 기재된 에바그린(상표명); LC 그린(Green); SYT09; 크로모파이(Chromofy); BEBO; 및 SYBR 그린이 있다. 이러한 염료는 정량 PCR(qPCR) 적용에 특이 유용하다.
키트는 기준 염료(예를 들면, ROX 염료) 또는 소광제(quencher) 염료(예를 들면, TAMRA)를 포함할 수 있다. 다른 경우, FRET가 사용될 수 있다. FRET는 기준 염료용으로 사용될 수도 있다. 일부 경우, 기준 염료용으로 사용된 FRET 염료는 형광단 염료(예를 들면, FAM), 이어서 핵산 서열 및 이어서 염료(예를 들면, ROX 염료)로 구성된다. 핵산 서열의 예로는 데옥시뉴클레오티드, 예컨대, 반복 dT 요소가 있다. 예로는 6ㅍ, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 이상의 dT 뉴클레오티드가 있다. 다른 뉴클레오티드(반복된 뉴클레오티드 또는 상이한 뉴클레오티드의 혼합물)가 사용될 수 있다. 예를 들면, 반복된 dA, dC, dG 또는 dU 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. FRET 염료의 비제한적 예로는 하기 염료가 있다: 5'FAM-TTTTTTTT-3'ROX(8dT); 5'FAM-TTTTTTTTT-3'ROX(9dT); 또는 5'FAM-TTTTTTTTTT-3'ROX(10dT). FRET 현상은 1 nm 내지 5 nm의 거리에서 10 nM 이하로 작용할 수 있다. T-T 거리는 약 0.24 nm 내지 0.36 nm일 수 있다. 기준 염료와 소광제 염료 사이의 거리는 약 0.24 nm 내지 0.36 nm일 수 있다. 기준 염료는 FRET가 일어나도록 서로로부터 적절한 거리를 두고 FRET 쌍에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍 사이의 예측된 거리는 약 2 nm 내지 6 nm 이하일 수 있다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍 사이의 거리는 약 2.72 nm, 3.06 nm 또는 3.4 nm 이하일 수 있다. 기준 염료와 소광제 염료 사이의 거리는 상이한 수의 반복된 뉴클레오티드, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개 또는 22개의 반복된 A, C, T 또는 G 뉴클레오티드를 선택함으로써 조절될 수 있다. 다른 기준 염료 및 소광제 염료, 예를 들면, 본원에 기재된 염료를 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 언급된 기준 염료는 실시간 정량 PCR을 위한 반응을 포함하는 다양한 반응에서 사용될 수 있다. 이것은 비활성 기준 염료를 설명하는 곡선의 실시간 계산을 허용할 수 있다. 기준 염료는 프로브 혼합물, 에바그린 혼합물, 및 HRM과 에바그린의 혼합물을 포함하는 다양한 혼합물의 형태로 사용될 수 있다. 기준 염료는 상이한 qPCR 기계들, 예를 들면, ABI 7900HT, ABI7500 및 완스텝플러스(OneStepPlus)에서 단일 농도로 사용될 수 있다. 기준 염료의 농도는 사용되는 기계에 기초하여 조절될 필요가 없을 수 있다. 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 기준 염료는 FRET 현상을 이용하기 때문에 다수의 기계에서 단일 농도로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기준 염료는 용융 온도가 약 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃ 또는 23℃ 이하인 임의의 서열을 가질 수 있다. 반복된 뉴클레오티드, 예를 들면, 반복된 티민 뉴클레오티드를 갖는 기준 염료가 기준 염료로서 유용할 수 있는데, 이는 상기 뉴클레오티드 서열의 용융 온도가 낮기 때문이다. 낮은 용융 온도는 기준 염료가 원치 않는 부분(moiety)에 어닐링될 가능성을 감소시킬 수 있다. 이것은 이중 표지된 올리고뉴클레오티드와 DNA 주형 사이의 상호작용을 감소시킬 수 있다. 또한, 이것은 이량체의 형성을 감소시킬 수 있다.
기준 염료는 온도 및 pH 안정성을 나타낼 수 있다. 기준 염료는 약 -80℃, -60℃, -40℃, -30℃, -20℃, -10℃, 0℃, 10℃, 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃ 또는 100℃ 이하 또는 이상에서 1시간, 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 40시간, 50시간, 60시간, 70시간, 80시간, 90시간 또는 100시간 동안 항온처리된 후 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상의 효능을 보유할 수 있다. 기준 염료는 약 pH 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 이하 또는 이상에서 1시간, 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 40시간, 50시간, 60시간, 70시간, 80시간, 90시간 또는 100시간 동안 항온처리된 후 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 효능을 보유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기준 염료는 표백에 대한 내성을 나타낼 수 있다. 기준 염료는 약 1분, 2분, 5분, 10분, 30분, 60분, 90분, 120분, 180분, 240분 또는 360분 이상 동안 주위 광에 노출된 후 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상의 형광 방사 능력을 보유할 수 있다.
키트는 반응 매질 또는 완충제도 포함할 수 있다. 중합효소를 포함하는 키트에 적합한 반응 매질 또는 완충제는 본 발명의 방법에 따른 핵산 증폭을 허용한다. 이러한 매질 및 조건은 당업자에게 공지되어 있고 다양한 공개문헌, 예컨대, 미국 특허 제5,554,516호, 제5,716,785호, 제5,130,238호, 제5,194,370호, 제6,090,591호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 제5,169,766호, 제5,480,784호, 제5,399,491호 및 제5,679,512호; 및 국제 특허공보 제WO 99/42618호에 기재되어 있다. 예를 들면, 완충제는 트리스 완충제일 수 있으나, 완충제 성분이 본 발명의 방법의 효소 성분을 억제하지 않는 한, 다른 완충제도 사용될 수 있다. pH는 약 5 내지 약 11이지만, 약 6 내지 약 10, 약 7 내지 약 9, 또는 약 7.5 내지 약 8.5일 수도 있다. 보다 강한 산성 또는 알칼리성 완충제도 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 반응 매질은 약 0.01 mM 내지 약 15 mM 또는 약 1 mM 내지 10 mM의 범위 내에 있는 자유 이온의 최종 농도로 이가 금속 이온, 예컨대, Mg2+ 또는 Mn2+를 포함할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 반응 매질은 MgCl2(예를 들면, 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 40 mM 또는 50 mM 이상의 MgCl2)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 반응 매질은 이 매질의 총 이온 강도에 기여하는 다른 염, 예컨대, Cl 또는 NaCl도 포함할 수 있다. 예를 들면, 염, 예컨대, KCl의 농도 범위는 바람직하게는 약 0 mM 내지 약 125 mM, 보다 바람직하게는 약 0 mM 내지 약 100 mM, 가장 바람직하게는 약 0 mM 내지 약 75 mM이다. 반응 매질은 증폭 반응의 수행에 영향을 미칠 수 있으나 본 방법의 효소 성분의 활성을 위해 필수적이지 않은 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 첨가제는 단백질, 예컨대, BSA 또는 단일 가닥 결합 단백질(예를 들면, T4 유전자 32 단백질), 및 비이온성 세제, 예컨대, NP40 또는 트리톤을 포함한다. 효소 활성을 유지할 수 있는 시약, 예컨대, DTT도 포함될 수 있다. 이러한 시약들은 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 완충제는 50 mM 내지 80 mM 트리스(pH 8.3 내지 9.0) 및 10 mM 내지 20 mM (NH4)2S04 또는 30 mM 내지 50 mM KCl을 포함할 수 있다. 완충제의 pH는 중합효소에 따라 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표준 중합효소를 위해 보다 높은 pH, 예컨대, 약 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 또는 8.9 이하 또는 이상의 pH가 이용될 수 있고, 핫 스타트 중합효소를 위해 보다 낮은 pH, 예를 들면, 약 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 또는 8.9 이하 또는 이상의 pH가 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 에바그린 기재의 실시간 PCR 혼합물은 3개의 중합효소를 함유할 수 있다. 상기 혼합물은 주(main) 중합효소를 함유할 수 있다. 상기 주 중합효소의 농도는 중량%, 부피% 또는 몰%일 수 있거나 몰, 질량 또는 부피를 기준으로 한 혼합물 중의 총 중합효소의 백분율일 수 있는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 또는 이하일 수 있다. 상기 혼합물은 본 발명의 펩티드 태그와 주 Taq 아미노산 서열의 사이에 삽입된, 이중 가닥 결합 도메인을 갖는 중합효소, 예를 들면, 이중 가닥 결합 도메인을 갖는 주 중합효소를 함유할 수 있다. 이러한 중합효소의 농도는 중량%, 부피% 또는 몰%일 수 있거나 몰, 질량 또는 부피를 기준으로 한 혼합물 중의 총 중합효소의 백분율일 수 있는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 또는 이하일 수 있다. 상기 혼합물은 펩티드 태그가 N 말단에 존재하고 이중 가닥 결합 도메인이 C 말단에 존재하는 교정 중합효소(Tgo 기재 중합효소일 수 있음)도 함유할 수 있다. 이러한 중합효소의 농도는 중량%, 부피% 또는 몰%일 수 있거나 몰, 질량 또는 부피를 기준으로 한 혼합물 중의 총 중합효소의 백분율일 수 있는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 또는 이하일 수 있다. 이러한 중합효소는 이 중합효소의 3'→5' 핵산말단분해효소 활성 또는 교정 활성에 영향을 미치지 않는 펩티드 태그를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로브 혼합물은 2개의 중합효소를 가질 수 있다. 주 중합효소는 5'→3' 핵산말단분해효소 활성을 나타내는 중합효소일 수 있다. 상기 중합효소는 5'→3' 핵산말단분해효소 활성에 영향을 미치지 않는 펩티드 태그를 가질 수 있다. 상기 태그는 N 말단에 위치할 수 있다. 프로브 혼합물은 이중 가닥 결합 도메인을 갖는 중합효소도 포함할 수 있다. 상기 이중 가닥 결합 도메인은 5'→3' 핵산말단분해효소 활성을 감소시킬 수 있다. 활성의 감소는 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이하 또는 이상일 수 있다.
일부 실시양태에서, 종점(end point) PCR을 위한 전형적인 마스터 혼합물은 3개의 중합효소, 첨가제(예를 들면, BSA - 소혈청 알부민), DNA 추적 염료(예를 들면, 브로모페놀 블루) 및 DNA 샘플 적재 성분(예를 들면, 글리세롤)을 함유할 수 있다. 상기 3개의 중합효소는 각각 서열번호 2, 서열번호 6 및 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 혼합물은 주 중합효소를 함유할 수 있다. 상기 주 중합효소의 농도는 중량%, 부피% 또는 몰%일 수 있거나 몰, 질량 또는 부피를 기준으로 한 혼합물 중의 총 중합효소의 백분율일 수 있는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 또는 이하일 수 있다. 상기 혼합물은 본 발명의 펩티드 태그와 주 Taq 아미노산 서열의 사이에 삽입된, 이중 가닥 결합 도메인을 갖는 중합효소, 예를 들면, 이중 가닥 결합 도메인을 갖는 주 중합효소를 함유할 수 있다. 이러한 중합효소의 농도는 중량%, 부피% 또는 몰%일 수 있거나 몰, 질량 또는 부피를 기준으로 한 혼합물 중의 총 중합효소의 백분율일 수 있는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 이상 또는 이하일 수 있다. 상기 혼합물은 펩티드 태그가 N 말단에 존재하고 이중 가닥 결합 도메인이 C 말단에 존재하는 교정 중합효소(Tgo 기재 중합효소일 수 있음)도 함유할 수 있다. 이러한 중합효소의 농도는 중량%, 부피% 또는 몰%일 수 있거나 몰, 질량 또는 부피를 기준으로 한 혼합물 중의 총 중합효소의 백분율일 수 있는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 또는 이하일 수 있다. 이러한 중합효소는 이 중합효소의 3'→5' 핵산말단분해효소 활성 또는 교정 활성에 영향을 미치지 않는 펩티드 태그를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 완충제는 선형 폴리아크릴아미드(LPA)를 포함할 수 있다. LPA는 효소의 특이성 및 감수성을 증가시킬 수 있다. LPA는 에바그린 또는 임의의 프로브, 예를 들면, 본원에 기재된 임의의 프로브를 포함하는 실시간 혼합물을 포함하는 실시간 혼합물에 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 완충제는 저장 완충제 중의 12.5 mM의 농도로 MgCl2를 가질 수 있고, 반응 농도는 2.5 mM MgCl2일 수 있다. 다른 실시양태에서, MgCl2의 반응 농도는 1.5 mM 내지 2.5 mM일 수 있다. DNA 주형의 농도는 1 ng/㎕ 내지 50 ng/㎕일 수 있다.
에바그린 염료를 사용하는 반응에서, 프라이머(정방향 또는 역방향)의 최종 반응 농도는 80 nM 내지 250 nM일 수 있다. 에바그린 염료를 사용하지 않고 프로브를 포함하는 반응에서, 프라이머의 최종 농도는 200 nM 내지 400 nM일 수 있고, 프로브의 최종 농도는 100 nM 내지 250 nM일 수 있다.
교정 효소를 사용하는 반응에서, MgCl2 농도는 1.5 mM일 수 있고, 프라이머(정방향 또는 역방향)의 농도는 100 nM 내지 300 nM일 수 있고, 주형 DNA의 농도는 5 ng/㎕ 내지 50 ng/㎕일 수 있다.
적절한 경우, 본 방법에서 사용되는 RNA 분해효소의 활성을 억제하지 않는 RNA 분해효소 억제제(예컨대, 알엔에이신(Rnasin))도 포함될 수 있다. 본 발명의 방법의 임의의 양태가 동일한 또는 상이한 온도에서 일어날 수 있다. 바람직하게는, 증폭 반응(특히, 제1 가닥 및 제2 가닥 cDNA 합성 단계 이외의 프라이머 연장, 및 가닥 치환)을 등온적으로 수행하여 번거로운 열순환 과정을 피한다. 상기 증폭 반응은 프라이머와 주형 폴리뉴클레오티드 및 프라이머 연장 생성물의 혼성화를 허용하고 사용된 효소의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 온도에서 수행된다. 상기 온도는 약 25℃ 내지 약 85℃, 약 30℃ 내지 약 80℃, 또는 약 37℃ 내지 약 75의 범위 내에 있을 수 있다.
본원에서 제공된 증폭 반응의 올리고뉴클레오티드 성분은 일반적으로 증폭될 표적 핵산 서열의 수를 초과하여 존재한다. 이들 성분은 표적 핵산의 양의 약 10배, 102배, 104배, 106배, 108배, 1010배 또는 1012배 이상의 양으로 제공될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 성분들은 증폭 과정의 개시에서 동시에 첨가된다. 또 다른 실시양태에서, 성분들은 증폭 반응에 의해 요구되고/되거나 허용될 때 증폭 과정 동안 적절한 시점 전 또는 후에 임의의 순서로 첨가된다. 이러한 시점은 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 핵산 증폭을 위해 사용되는 효소들은 이들의 열적 안정성 및/또는 당업자에게 공지된 다른 고려사항에 의해 결정되는 시점인 표적 핵산 변성 단계 전, 상기 변성 단계 후, 또는 프라이머와 표적 RNA 또는 DNA의 혼성화 후에 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.
증폭 과정은 다양한 시점에서 중단될 수 있고 추후에 재개될 수 있다. 상기 시점은 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 조성물은 dNTP(예를 들면, 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 40 mM 또는 50 mM 이상의 dNTP)도 포함할 수 있다. 상기 dNTP는 초고순도의 dNTP일 수 있다. 상기 dNTP는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 조성물은 염료(예를 들면, 청색 또는 황색 염료)를 포함한다. 일부 경우, 완충제는 본원에 기재된 세제를 포함한다. 일부 경우, 완충제는 세제를 포함하지 않는다. 일부 경우, 완충제는 높은 pH를 갖는다. 다른 실시양태에서, 완충제는 낮은 또는 중성 pH를 갖는다. 일부 경우, 완충제는 (NH4)2S04를 함유한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 조성물은 용액 형태로 제공될 수 있다. 상기 용액은 상이한 농도로 제제화될 수 있다. 예를 들면, 상기 용액의 농도는 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 10x 또는 15x 이상의 농도일 수 있다. 상기 조성물의 제제에 대한 추가 설명은 본원에서 제공되어 있다.
일부 키트는 2개의 중합효소를 포함한다. 예를 들면, 키트는 5'→3' 핵산말단분해효소 활성을 나타내는 중합효소(예를 들면, 서열번호 2)를 총 중합효소 농도의 약 10%, 20%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 농도로 포함할 수 있다. 이러한 키트는 제2 중합효소(예를 들면, 서열번호 10의 펩티드 태그로 표지된 중합효소)를 총 중합효소 농도의 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 농도로 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 5'→3' 핵산말단분해효소 활성을 나타내는 중합효소(예를 들면, 서열번호 2)(또는 서열번호 1의 펩티드 태그를 포함하는 임의의 폴리펩티드)는 총 중합효소 농도의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상의 농도로 존재하는 반면, 제2 중합효소는 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 15% 미만의 농도로 존재한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 서열번호 1의 펩티드 태그를 포함하는 융합 폴리펩티드는 총 중합효소 농도의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상의 농도로 존재하는 반면, 제2 폴리펩티드는 DSP 펩티드(서열번호 10) 또는 2개의 펩티드 태그(예를 들면, 서열번호 8 또는 서열번호 11(1개의 중합효소에서 2개의 태그를 보임))를 포함하는 폴리펩티드이고 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 15% 미만의 농도로 존재한다. 다른 경우, 야생형 Taq(또는 임의의 중합효소)는 총 중합효소 농도의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%의 농도로 존재하는 반면, 제2 폴리펩티드는 DSP 펩티드(서열번호 10) 또는 2개의 펩티드 태그(예를 들면, 서열번호 8)를 포함하는 폴리펩티드이거나 중합효소(예를 들면, 서열번호 11)에 의해 분리된 2개의 펩티드 태그를 갖는 중합효소이고 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 15% 미만의 농도로 존재한다.
일부 실시양태에서, 일부 키트는 3개 이상의 중합효소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 중합효소(예를 들면, 서열번호 2의 폴리펩티드, 또는 서열번호 1의 펩티드 태그를 포함하는 임의의 폴리펩티드)를 총 중합효소 농도의 약 10%, 20%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 농도로 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 키트는 제2 중합효소, 예컨대, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 13의 펩티드 태그를 포함하는 중합효소를 포함할 수 있다. 나아가, 이러한 키트는 제3 폴리펩티드, 예컨대, 교정 중합효소(예를 들면, Tgo 중합효소)를 포함할 수 있다. 이러한 교정 중합효소는 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 13의 펩티드 태그를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 교정 중합효소는 서열번호 11(도12)일 수 있다. 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 각각 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 15% 미만의 농도로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 조성물은 열안정성 DNA 중합효소, 예컨대, Taq 또는 Tgo DNA 중합효소, 또는 이들의 돌연변이체, 유도체 또는 단편의 사용을 수반하는 증폭에서도 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 경우, 서열번호 5, 서열번호 4 또는 서열번호 12에 의해 코딩된 폴리펩티드가 증폭에서 중합효소(예를 들면, Taq 중합효소) 또는 교정 중합효소(예를 들면, Tgo DNA 중합효소)와 함께 사용된다. 일부 경우, 서열번호 5에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 단편 또는 돌연변이체, 또는 서열번호 4(또는 서열번호 12)에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 단편 또는 돌연변이체의 양은 증폭에서 사용된 중합효소(예를 들면, Taq 또는 Tgo DNA 중합효소)의 양보다 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 100배, 250배, 500배, 1000배, 5000배, 10,000배, 15,000배, 20,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 106배, 107배, 108배 또는 109배 이상 더 적다. 따라서, 일부 경우, 본원에 개시된 조성물은 서열번호 5에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 단편 또는 돌연변이체, 또는 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 단편 또는 돌연변이체와, 중합효소(예를 들면, Taq 또는 Tgo DNA 중합효소)의 혼합물이고, 이때 서열번호 5에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 돌연변이체 또는 단편, 또는 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 돌연변이체 또는 단편의 양은 상기 중합효소(예를 들면, Taq 또는 Tgo DNA 중합효소)의 양보다 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 100배, 250배, 500배, 1000배, 5000배, 10,000배, 15,000배, 20,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 106배, 107배, 108배 또는 109배 이상 더 적다. 일부 바람직한 예에서, 본 조성물은 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 돌연변이체 또는 단편과, 서열번호 5에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 돌연변이체 또는 단편의 혼합물이고, 이때 상기 혼합물에서 서열번호 5에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 양은 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 양보다 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 100배, 250배, 500배, 1000배, 5000배, 10,000배, 15,000배, 20,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 106배, 107배, 108배 또는 109배 이상 더 적다.
일부 경우, 서열번호 5에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 또는 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 농도는 증폭에서 사용된 중합효소(예를 들면, Taq 또는 Tgo DNA 중합효소)의 농도보다 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 100배, 250배, 500배, 1000배, 5000배, 10,000배, 15,000배, 20,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 106배, 107배, 108배 또는 109배 이상 더 낮다. 따라서, 일부 경우, 본원에 개시된 조성물은 서열번호 5에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 또는 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체와, 중합효소(예를 들면, Taq 또는 Tgo DNA 중합효소)의 혼합물을 포함하고, 이때 서열번호 5에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 또는 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 농도는 상기 중합효소(예를 들면, Taq 또는 Tgo DNA 중합효소)의 농도보다 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 100배, 250배, 500배, 1000배, 5000배, 10,000배, 15,000배, 20,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 106배, 107배, 108배 또는 109배 이상 더 낮다. 또한, 본원에 개시된 모든 실시양태들은 서열번호 7에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 돌연변이체, 변이체 또는 단편, 예컨대, 도면에 나타낸 DSP 단편을 포함하는 폴리펩티드, 및/또는 서열번호 3에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 단편, 돌연변이체 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들을 포함할 수 있다.
일부 경우, 본 조성물은 서열번호 5에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 단편, 돌연변이체 또는 변이체와, 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 돌연변이체 또는 단편의 혼합물이다. 일부 경우, 이러한 혼합물은 교정 효소(예를 들면, Tgo DNA 중합효소)를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 경우, 상기 조성물은 5'→3' 핵산말단분해효소 활성을 나타내는 중합효소뿐만 아니라 3'→5' 교정 활성을 나타내는 효소도 포함한다.
일부 경우, 이러한 조성물에서 서열번호 5에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 돌연변이체, 단편 또는 변이체의 양(또는 서열번호 7에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 단편, 예컨대, DSP를 포함하는 폴리펩티드의 양)은 서열번호 4에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 양 및/또는 교정 효소의 양보다 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 100배, 250배, 500배, 1000배, 5000배, 10,000배, 15,000배, 20,000배, 50,000배, 100,000배, 500,000배, 106배, 107배, 108배 또는 109배 이상 더 적다.
일부 경우, 폴리펩티드는 짧은 형태 및 긴 형태 둘다로서 번역된다. 일부 경우, 폴리펩티드의 번역을 촉진하기 위해 진핵 번역 개시 인자가 사용된다. 일부 경우, 번역은 박테리아에서 일어난다.
키트는 본원에 기재된 하나 이상의 조성물뿐만 아니라 상기 조성물의 사용을 설명하는 설명서도 포함할 수 있다. 상기 설명서는 반응 샘플(관련 농도의 중합효소, 주형, 프라이머(역방향 및 정방향), dNTP, BSA 및 H2O를 포함함)의 제제화에 대한 설명을 포함할 수 있다. 또한, 상기 설명서는 PCR 주기, 특히 변성 기, 어닐링 기 및 연장 기의 실시에 대한 권고를 포함할 수 있다. 이러한 설명서는 각각의 단계에 대한 온도 조건 및 시간, 또는 주기의 수를 포함할 수 있다. 예를 들면, qPCR에 대한 권고는 (예를 들면, 핫 스타트 효소를 활성화시키기 위해) 95℃에서 15분 동안 초기 변성 단계를 수행한 후, 하기 단계들로 구성된 40주기를 수행하도록 하는 권고일 수 있다: 95℃에서 15초 동안 변성; 60℃ 내지 65℃에서 20초 동안 어닐링; 및 72℃에서 20초 동안 연장.
핵산 벡터/세포
본원에 개시된 조성물은 본원에 기재된 폴리펩티드들 중 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 벡터도 포함한다. 이러한 구축물의 비제한적 예로는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 및/또는 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 구축물이 있다. 다른 예로는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 11 및/또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 구축물이 있다. 본 조성물은 전술된 것들의 단편, 변이체 및/또는 돌연변이체도 포함한다.
핵산 구축물은 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, cDNA, RNA 또는 cRNA로 구성될 수 있다. 핵산 벡터는 임의의 공지된 발현 시스템, 예를 들면, 진핵 시스템, 원핵 시스템, 시험관내 시스템 등에서 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산 벡터는 원핵 시스템(예를 들면, 이. 콜라이 박테리아)에서 사용되고, 핵산 벡터는 강한 진핵 번역 신호를 보유한다. 예를 들면, 핵산 벡터는 문헌(Nakagawa et al. (2007) Nuc. Acids Res. 1-11. (doi: 10.1093/nar/gkm1102))에 기재된 바와 같이 강한 진핵 번역 신호, 예컨대, 코작 서열 GCCGCC(A/G)CCAUGG를 보유할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 서열 GCCGCCACCATGGTC를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 리보솜 결합 부위(예를 들면, AGGA와 같은 서열)도 포함할 수 있다. 강한 진핵 번역 신호는 상이한 met 잔기들에서 개시되는 다수의 펩티드의 번역을 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 진핵 번역 신호 및 서열번호 1을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터는 (도 2에 나타낸 바와 같은) 긴 형태의 펩티드 및 짧은 형태의 펩티드(도 14, 서열번호 13) 둘다를 발현할 수 있다. 이 예에서, 상기 짧은 형태의 펩티드는 서열번호 1에 나타낸 원래의 서열의 잔기 MVDDL에서 시작된다.
강한 진핵 신호를 핵산 벡터 내에 포함시킴으로써 단백질의 수율을 보다 더 높일 수 있다. 놀랍게도, 이것은 이러한 벡터가 박테리아 시스템에서 사용될 때, 예컨대, 상기 벡터가 이. 콜라이 박테리아 내에서 발현될 때 일어날 수 있다. 그 결과, 상기 박테리아로부터 단리된 단백질의 수율은 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 7배, 10배, 15배, 20배, 30배 또는 40배 이상까지 증가될 수 있다. 상기 핵산 벡터는 당업계에 공지된 전사 조절 영역(예를 들면, 프로모터, 인핸서(enhancer), 작동자(operator) 등)도 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 하나 이상의 본 발명의 벡터가 도입된 세포를 제공한다. 상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 상기 세포는 박테리아 세포(예를 들면, 이. 콜라이)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 진핵세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 마우스 골수종 하이브리도마 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 기법을 이용하여 상기 벡터를 상기 세포 내로 도입할 수 있다. 핵산 벡터의 도입은 예를 들면, 염색체 핵산 내로의 영구적인 삽입에 의해, 또는 예를 들면, 에피좀성(episomal) 유전 요소의 도입에 의해 달성될 수 있다.
방법
본원에 개시된 조성물은 다수의 방법에서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 많은 펩티드, 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 및 조성물이 승온에서 향상된 안정성을 나타내는 한, 이들은 시약 또는 치료제를 냉동시키거나 동결시킬 수 없는 경우 적용되기에 특히 유용할 수 있다. 따라서, 본 펩티드 태그는 전기를 확실히 이용할 수 없는 원거리 지역에서 사용되도록 고안된 치료제, 시약 또는 진단제에서 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 조성물은 중합효소이고, 핵산 증폭, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 사용된다. PCR에 대한 일반적인 절차는 미국 특허 제4,683,195호(Mullis) 및 제4,683,202호(Mullis et al.)에 교시되어 있고 본원의 다른 부분에도 기재되어 있다. 요약하건대, PCR에 의한 핵산 증폭은 DNA의 열 변성, 2개의 프라이머와 증폭될 표적 핵산 절편의 측면에 있는 서열의 어닐링, 및 중합효소에 의한 상기 어닐링된 프라이머의 연장으로 구성된 반복된 주기를 수반한다. 상기 프라이머는 표적 핵산의 반대 가닥에 혼성화되고 상기 중합효소에 의한 합성이 상기 프라이머 사이의 절편 전체에 걸쳐 진행되어 표적 절편의 양을 효과적으로 배가시키도록 배향된다. 더욱이, 연장 생성물도 프라이머에 상보적이고 상기 프라이머에 결합할 수 있기 때문에, 각각의 연속적인 주기는 이전 주기에서 합성된 표적 핵산의 양을 필수적으로 배가시킨다. 이것은 약 2n(이때, n은 주기의 수임)의 속도로 특이적 표적 핵산을 기하급수적으로 축적시킨다.
전형적이고 보편적인 PCR 열 순환 프로토콜은 (a) 90℃ 내지 95℃의 온도에서 0.5분 내지 1분 동안 변성, (b) 50℃ 내지 65℃의 온도에서 1분 내지 2분 동안 어닐링, 및 (3) 68℃ 내지 75℃에서 1분 이상 동안 연장으로 구성된 30주기를 포함한다. 일반적인 프로토콜 및 신속 순환 프로토콜을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 프로토콜도 본 프로브를 사용하여 수행할 수 있다.
본원에서 제공된 조성물을 사용하여 수행할 수 있는 보편적인 PCR의 또 다른 변경은 네스티드(nested) 프라이머를 사용하는 "네스티드 PCR"이다. 이 방법은 샘플 중의 표적 핵산의 양이 극도로 한정되어 있는 경우, 예를 들면, 기록보관 법의학 샘플이 사용되는 경우 바람직하다. 네스티드 PCR을 수행함에 있어서, 먼저 표적 핵산의 보다 큰 절편의 측면에 있는 서열에 혼성화할 수 있는 외부 프라이머 세트를 사용하여 핵산을 증폭시킨다. 이 증폭 반응 후, 상기 보다 큰 절편 내에 있는 표적 서열에 혼성화하는 내부 프라이머 세트를 사용하여 증폭 주기의 제2 순환을 수행한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 먼저 역전사효소가 RNA 분자를 이중 가닥 cDNA 분자로 전환시킨 후 상기 cDNA 분자가 중합효소 연쇄 반응에서 후속 증폭을 위한 주형으로서 사용되는 역전사효소 PCR 반응(RT-PCR)에서 사용될 수 있다. RT-PCR을 수행함에 있어서, 역전사효소는 일반적으로 표적 핵산이 열 변성된 후 반응 샘플에 첨가된다. 그 다음, 예정된 증폭 주기가 수행되기 전, 반응은 적절한 온도(예를 들면, 30℃ 내지 45℃)에서 cDNA 주형을 발생시키기에 충분한 시간(예를 들면, 5분 내지 60분) 동안 유지된다. 이러한 반응은 유전 정보가 RNA 분자에 저장되어 있는 생물학적 물질을 검출하는 데에 특히 유용하다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 조성물은 결찰효소(ligase) 연쇄 중합효소 연쇄 반응(LCR-PCR)에서도 사용될 수 있다. 상기 방법은 표적 특이적 부분 및 표적 서열과 관련 없는 짧은 고착자(anchor) 서열을 각각 갖는 프라이머 쌍 세트와 표적 핵산을 결찰시키는 단계를 포함한다. 그 다음, 상기 고착자 서열을 함유하는 제2 프라이머 세트를 사용하여 제1 프라이머 세트와 연결된 표적 서열을 증폭시킨다. LCR-PCR을 수행하기 위한 절차는 당업자에게 잘 공지되어 있으므로 본원에서 상세히 기재되어 있지 않다(예를 들면, 미국 특허 제5,494,810호 참조).
추가로, 중합효소 반응의 생성물은 당업계에 공지된 임의의 다른 방법, 예를 들면, HRM, 겔 전기영동, 모세관 전기영동에 의해 분석될 수 있다.
qPCR
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합효소는 정량 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에서도 사용될 수 있다. 실시간 PCR로도 지칭되는 qPCR을 이용하여 표적화된 DNA 분자를 증폭시키고 동시에 정량할 수 있다. qPCR은 증폭된 DNA가 반응의 말기 대신에 반응이 진행됨에 따라 실시간으로 검출된다는 점을 제외하고 보편적인 PCR과 유사하다. 실시간 PCR에서 생성물의 검출을 위한 2종의 통상적인 방법이 존재한다: (1) 임의의 이중 가닥 DNA에 개재삽입되는(intercalate) 비특이적 형광 염료(예를 들면, 에바그린 및 본원에 기재된 다른 염료), 및 (2) 서열 특이적 DNA 프로브와 그의 상보적 DNA 표적의 혼성화 후에만 검출을 허용하는 형광 레포터로 표지된 올리고뉴클레오티드로 구성된 서열 특이적 DNA 프로브. TaqMan 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브의 5' 말단에 공유부착된 형광단 및 3' 말단에 존재하는 소광제로 구성된다. 여러 상이한 형광단(예를 들면, 6-카르복시플루오레세인(약어: FAM) 또는 테트라클로로플루오레신(약어: TET)) 및 소광제(예를 들면, 테트라메틸로다민(약어: TAMRA) 또는 디하이드로시클로피롤로인돌 트리펩티드 작은 홈(minor groove) 결합제(약어: MGB))가 사용될 수 있다. 소광제 분자는 FRET(형광 공명 에너지 전달)를 통해 순환기의 광원에 의해 여기될 때 형광단에 의해 방사된 형광을 소광시킨다. 형광단 및 소광제가 근접하여 위치하는 한, 소광은 임의의 형광 신호를 억제한다.
일부 실시양태에서, 실시간 PCR은 세포 또는 조직에서 메신저 RNA 및 비코딩 RNA를 정량하기 위해 역전사와 병용된다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의한 증폭 과정의 실시간 정량 평가를 제공한다. 증폭 과정의 "실시간" 평가는 반응 혼합물 중의 앰플리콘(amplicon)의 양을 증폭 반응 동안 연속적으로 또는 주기적으로 측정하는 단계를 포함하고, 측정된 값은 샘플에 초기 존재하는 표적 서열의 양을 계산하는 데에 이용된다. 실시간 증폭에 기초하여 샘플에 존재하는 초기 표적 서열의 양을 측정하는 다양한 방법들이 존재한다. 이들은 미국 특허 제6,303,305호(Wittwer et al., "Method for Quantification of an Analyte") 및 미국 특허 제6,541,205호(Yokoyama et al., "Method for Assaying Nucleic Acid")에 개시된 방법을 포함한다. 실시간 증폭에 기초하지 않지만 샘플에 초기 존재하는 표적 서열의 양을 측정하는 또 다른 방법은 미국 특허 제5,710,029호(Ryder et al., "Method for Determining Pre-Amplification Levels of a Nucleic Acid Target Sequence from Post-Amplification Levels of Product")에 개시되어 있다. 본 발명은 부산물의 생성이 감소되거나, 감축되거나 또는 실질적으로 제거되기 때문에 실시간 평가에 특히 적합하다.
증폭 생성물은 다양한 자가 혼성화 프로브들(이들의 대다수는 줄기-고리(stem-loop) 구조를 가짐)의 사용을 통해 실시간으로 검출될 수 있다. 이러한 자가 혼성화 프로브들은 이들이 자가 혼성화된 상태에 있는지 아니면 표적 서열에의 혼성화를 통해 변경된 상태에 있는지에 따라 상이하게 검출될 수 있는 신호를 방사하도록 표지된다.
자가 상보성을 갖는 검출 프로브의 또 다른 예는 "분자 비콘(beacon)"이다. 분자 비콘은 표적 상보체 서열을 갖는 핵산 분자, 증폭 생성물에 존재하는 표적 서열의 부재 하에서 폐쇄된 구조로 상기 프로브를 유지하는 친화성 쌍(또는 핵산 아암(arm)), 및 상기 프로브가 폐쇄된 구조로 존재할 때 상호작용하는 표지 쌍을 포함한다. 표적 서열과 표적 상보체 서열의 혼성화는 상기 친화성 쌍의 구성원들을 분리시킴으로써 상기 프로브를 개방된 구조로 전환시킨다. 상기 개방된 구조로의 전환은 예를 들면, 형광단 및 소광제(예를 들면, DABCYL 및 EDANS)일 수 있는 표지 쌍의 감소된 상호작용으로 인해 검출될 수 있다. 분자 비콘은 미국 특허 제5,925,517호(Tyagi et al., "Detectably Labeled Dual Confirmation Oligonucleotide Probes, Assays and Kits") 및 미국 특허 제6,150,097호(Tyagi et al., "Nucleic Acid Detection Probes Having Non-FRET Fluorescence Quenching and Kits and Assays Including Such Probes")에 개시되어 있다(상기 특허 각각은 온전히 그대로 본원에서 참고적으로 인용됨).
본 발명에서 사용될 수 있는 다른 자가 혼성화 프로브는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 상호작용하는 표지를 갖는 프로브 결합 쌍, 예컨대, 미국 특허 제5,928,862호(Morrison, "Competitive Homogenous Assay")(이의 내용은 본원에 참고로 도입되어 있음)에 개시된 프로브 결합 쌍은 본 발명에서 사용될 수 있도록 개조될 수 있다. 단일 뉴클레오티드 다형성(snps)을 검출하는 데에 사용되는 프로브 시스템도 본 발명에서 사용될 수 있다. 추가 검출 시스템은 본원과 함께 공동 소유권을 향유하며 온전히 그대로 본원에 참고로 도입되어 있는 미국 가출원 제60/467,517호(Arnold et al., "Oligonucleotides Comprising a Molecular Switch")에 개시된 바와 같은 "분자 스위치"를 포함한다. 다른 프로브, 예컨대, 개재삽입 염료 및/또는 형광크롬을 포함하는 프로브도 본 발명에서 증폭 생성물의 검출에 유용할 것이다. 예를 들면, 미국 특허 제5,814,447호(Ishiguro et al., "Method of Detecting Specific Nucleic Acid Sequences")(이의 내용은 본원에 참고로 도입되어 있음)를 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 qPCR 반응에서 생성된 신호는 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 일반적으로, 신호 강도의 변화는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 검출될 수 있고 일반적으로 사용된 형광 기의 선택에 의존한다. 이것은 광학 시스템의 보조에 의해 수행될 수 있다. 이러한 시스템은 전형적으로 2개 이상의 부재, 즉 여기원(excitation source) 및 광자 검출기를 포함한다. 이들 부재의 다수의 예가 당분야에서 사용될 수 있다. 예시적인 여기원은 레이저, 예컨대, 편광 레이저이다. 레이저 광의 선택은 프로브에 부착된 형광 기에 의존할 것이다. 대다수의 형광 기의 경우, 요구되는 여기 광은 약 300 nm 내지 약 1200 nm, 또는 보다 통상적으로 약 350 nm 내지 약 900 nm의 범위 내에 있다. 대안적으로, 예를 들면, 약 300 nm 내지 약 350 nm, 350 nm 내지 400 nm, 400 nm 내지 450 nm, 450 nm 내지 500 nm, 500 nm 내지 550 nm, 550 nm 내지 600 nm, 600 nm 내지 650 nm, 650 nm 내지 700 nm, 750 nm 내지 800 nm 또는 800 nm 내지 850 nm의 여기 파장을 사용하여 본 발명의 화합물을 여기할 수 있다. 당업자는 관용적인 실험을 통해 주어진 형광단을 여기시키기에 적합한 여기 파장을 용이하게 확인할 수 있다(예를 들면, 본원에 이미 참고로 도입되어 있는 문헌(The Handbook - "A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Tenth Edition" (2005)(인비트로겐 인코포레이티드(Invitrogen, Inc.)/몰레큐라 프로브스(Molecular Probes)로부터 입수가능함) 참조). 원하는 경우, 다른 광학 시스템을 사용할 수 있다. 이들 광학 시스템은 부재, 예컨대, 광학 판독기, 고효율 광자 검출 시스템, 광자 증배관(photo multiplier tube), 게이트 감수성 FET, 나노튜브 FET, 광다이오드(예를 들면, 애발란치(avalanche) 광다이오드(APD)), 카메라, 전하 커플링된 소자(CCD), 전자 증배 전하 커플링된 소자(EMCCD), 강화된 전하 커플링된 소자(ICCD) 및 공초점 현미경을 포함할 수 있다. 이들 광학 시스템은 광학 전송 부재, 예컨대, 광학 섬유, 광학 스위치, 거울, 렌즈(마이크로렌즈 및 나노렌즈를 포함함), 조준기(collimator)를 포함할 수도 있다. 다른 예로는 광학 감쇠자(attenuator), 편광 필터(예를 들면, 이색성 필터), 파장 필터(낮은 통과(low-pass), 밴드 통과(band-pass) 또는 높은 통과(high-pass)), 파장판 및 지연선(delay line)이 있다. 일부 실시양태에서, 광학 전송 요소는 정렬된 광학 집중(confinement)과 광학적으로 소통하는 평면 도파관일 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제7,292,742호, 제7,181,122호, 제7,013,054호, 제6,917,726호, 제7,267,673호 및 제7,170,050호를 참조한다. 이들 광학 구성요소들 및 당업계에 공지된 다른 광학 구성요소들은 식별될 수 있는 신호의 검출을 수행하기 위해 다양한 방식으로 조합되고 조립될 수 있다.
고해상 용융(HRM) 분석도 본원에 기재된 중합효소들 임의의 중합효소를 사용한 PCR 반응 후 증폭된 DNA를 검출하고 정량하는 데에 사용될 수 있다. HRM에 대한 용도의 비제한적 예로는 SNP 분류/점 돌연변이 검출; 특정 좌위에서의 접합성(zygosity) 시험; 및 DNA 메틸화 상태의 분석이 있다.
본원에 기재된 중합효소 및 다른 조성물들은 매우 다양한 분자생물학 적용에서 사용될 수 있다. 비제한적 예로는 서열분석(sequencing) 반응; 클로닝; 돌연변이유발; 유전자 검출; 점 돌연변이 검출; 차감(subtractive) 혼성화; 및 마이크로어레이가 있다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 제조 또는 합성 방법
본원에서 제공된 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드는 당업계에 잘 공지된 재조합 또는 합성 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 고체상 단백질 합성은 비교적 짧은 길이의 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드에 매우 적합하고 보다 일관된 결과와 함께 보다 높은 수율을 제공할 수 있다. 또한, 고체상 단백질 합성은 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드의 제조에 대한 추가 유연성을 제공할 수 있다. 예를 들면, 합성 단계에서 원하는 화학적 변형을 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드 내로 도입할 수 있다: 라이신 대신에 호모시트룰린을 펩티드의 합성에서 사용하여 합성 후 펩티드를 카르바밀화할 필요성을 없앨 수 있다.
합성
펩티드의 고체상 합성에서 알파 아미노 기 및 측쇄 보호 둘다를 갖는 아미노산을 수지 상에 고정시킨다. 예를 들면, 문헌(Nilsson, B., Soellner, M., and Raines, R. Chemical Synthesis of Proteins, Annu. Rev. Biomol. Struct. 2005. 34:91-118); 문헌(Meldal M. 1997, Properties of solid supports. Methods Enzymol. 289:83-104); 및 문헌(Songster M F, Barany G. 1997, Handles for solid-phase peptide synthesis, Methods Enzymol. 289:126-74)을 참조한다. 전형적으로, 2종의 알파 아미노 보호기가 사용된다: 산 감수성 tert-부톡시카르보닐(Boc) 기 또는 염기 감수성 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 기. 문헌(Wellings D A, Atherton E. 1997. Standard Fmoc protocols. Methods Enzymol. 289:44-67)을 참조한다. 이들 알파 아미노 보호기의 신속하고 완전한 제거 후, 활성화된 카르복실 기를 갖는 또 다른 보호된 아미노산을 비보호된 수지 결합된 아민에 커플링시킬 수 있다. 과량의 활성화된 가용성 아미노산을 사용함으로써 커플링 반응을 완료시킨다. 서열을 완성하기 위해 탈보호 및 커플링의 주기를 반복한다. 측쇄 탈보호 및 절단을 이용하여 수지로부터 원하는 펩티드를 수득한다. 문헌(Guy C A, Fields G B. 1997, Trifluoroacetic acid cleavage and deprotection of resin-bound peptides following synthesis by Fmoc chemistry, Methods Enzymol. 289:67-83); 및 문헌(Stewart J M. 1997, Cleavage methods following Boc-based solid-phase peptide synthesis, Methods Enzymol. 289:29-44)을 참조한다. 고체상 단백질 합성을 수행하는 추가 방법은 문헌(Bang, D. & Kent, S., 2004, A One-Pot Total Synthesis of Crambin, Angew. Chem. Int. Ed. 43:2534-2538); 문헌(Bang, D., Chopra, N., & Kent, S. 2004, Total Chemical Synthesis of Crambin., J. Am. Chem. Soc. 126:1377-1383); 문헌(Dawson, P. et al., 1994, Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation, Science, 266:776-779); 문헌(Kochendoerfer et al., 2003, Design and Chemical Synthesis of a Homogenous Polymer-Modified Erythropoiesis Protein, Science, 299:884-887)에 개시되어 있다.
필요한 경우, 고체상 펩티드 합성으로부터 유도된 보다 작은 펩티드를 펩티드 결찰, 예컨대, 천연 화학적 결찰을 통해 조합할 수 있다. 이 과정에서, 한 펩티드의 N 말단 시스테인 잔기의 티올레이트는 제2 펩티드의 C 말단 티오에스테르를 공격하여 트랜스티오에스테르화를 일으킨다. 아미드 연결은 신속한 S→N 아실 전이 후 형성된다. 문헌(Dawson, P. et al. 1994, Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation, Science, 266:776-779)을 참조한다.
추가로, 본원에서 제공된 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드는 천연 발생 아미노산 및 비천연 발생 아미노산 둘다를 포함하는 펩티드인 펩티드모사체, 예컨대, 펩토이드(peptoid)를 포함할 수 있다. 펩토이드는 N 치환된 글리신, 글리콜산, 티오프로닌, 사르코신 및 티오르판의 올리고머이다. 이들 구조체는 측쇄로서 작용하는 R 기와 함께 (--(C=0)--CH2--NR--)n의 일반 구조를 갖는 경향을 나타낸다. 이러한 펩토이드는 문헌(Simon et al., Peptoids: A molecular approach to drug discovery, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371 (1992)); 및 문헌(Li et al., Photolithographic Synthesis of Peptoids, J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 4088-4089)의 프로토콜에 따라 고체상 합성을 이용하여 합성할 수 있다. 추가로, 본원은 주형 펩티드의 성질과 유사한 성질을 갖는 비펩티드 약물인 펩티드모사체 또는 펩티드 모사체의 용도를 제공한다(Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Friedinger (1985) TINS p. 32; and Evans et al. (1987) J Med. Chem 30:1229). 다양한 종류의 펩티드모사체의 합성이 예를 들면, 문헌(Methods of Organic Chemistry (Houben-Weyl), Synthesis of Peptides and Peptidomimetics--Workbench Edition Volume E22c (Editor-in-Chief Goodman M.) 2004)에서 검토되었다.
재조합 기법
다양한 숙주 발현 벡터 시스템들을 사용하여 본원에서 제공된 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템들은 관심 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 생성한 후 정제할 수 있는 수단을 대표하지만, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열에 의해 형질전환되거나 형질감염되었을 때 제자리(in situ)에서 변형된 유전자 생성물을 나타낼 수 있는 세포도 대표한다. 이들은 박테리아, 곤충, 식물 및 인간 숙주 시스템, 예컨대, 펩티드, 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 바큘로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)에 의해 감염되었거나 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들면, Ti 플라스미드)에 의해 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터, 예를 들면, 금속티오네인(metallothionein) 프로모터, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터, 예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터, 또는 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 인간 세포 시스템, 예를 들면, HT1080, COS, CHO, BHK, 293 및 3T3을 포함하는 포유동물 세포 시스템을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 유전자 생성물을 원하는 특정 방식으로 변형시키고 가공하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형 및 가공은 단백질의 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 가공 및 변형을 위한 특이적 기작을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하기에 적합한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이를 위해, 일차 전사체의 적절한 가공, 글리코실화 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 인간 숙주 세포를 포함하는 이러한 포유동물 숙주 세포는 HT1080, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 및 WI38을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
재조합 펩티드의 장기간 고수율 생성을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들면, 재조합 조직 보호 사이토카인 관련 분자 유전자 생성물을 안정하게 발현하는 세포주를 개조할 수 있다. 바이러스의 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는 적절한 발현 조절 요소, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등에 의해 조절되는 DNA 및 선택 마커를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 개조된 세포를 농축 배지에서 1 내지 2일 동안 성장시킬 수 있고, 그 후 배지를 선택 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드 내의 선택 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고 세포가 상기 플라스미드를 그의 염색체 내로 안정하게 삽입하고 성장하여 초점(클로닝되어 세포주로 증폭될 수 있음)을 형성할 수 있게 한다. 이 방법은 조직 보호 생성물을 발현하는 세포주를 개조하는 데에 유리하게 이용될 수 있다. 이러한 개조된 세포주는 유전자 생성물의 내인성 활성에 영향을 미치는 화합물의 스크리닝 및 평가에서 특히 유용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 합성
폴리뉴클레오티드를 합성하는 임의의 공지된 방법이 이용될 수 있다. 미국 특허 제4,458,066호(Caruthers et al.)에 개시된 고체상 합성이 이용될 수 있다. 이 기법에서, 성장하는 DNA 쇄는 불용성 지지체를 함유하는 용매에서 상기 성장하는 DNA 쇄가 가용화되게 하는 긴 유기 연결제를 통해 상기 불용성 지지체에 부착된다. 이로써, 가용화되었으나 아직 고정되어 있는 DNA 쇄는 주변 용매 중의 시약과 반응할 수 있고 올리고뉴클레오티드가 부착되어 있는 고체 지지체로부터 상기 시약이 용이하게 세척될 수 있게 한다.
유사한 화학적 성질을 나타내는 여러 부위, 예를 들면, ----OH 또는 하이드록실 기가 뉴클레오시드 상에 존재한다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 합성 동안 단량체 서브유닛은 성장하는 올리고뉴클레오티드 분자에 부위 특이적 방식으로 부착되어야 한다. 이것은 성장하는 쇄 상의 한 부위, 또는 유입 단량체 구축 블록을 성장하는 쇄에 부착시키기 위한 유입 염기 상의 한 부위를 작용기화할 것을 요구한다. 유입 단량체가 부적당한 부위에 부착되는 것을 방지하기 위해, 정확한 부위는 반응하도록 개방된 상태로 두면서 부적당한 부위는 차단되어야 한다. 이것은 잠재적 반응성 부위가 반응하는 것을 방지하도록 상기 잠재적 반응성 부위에 일시적으로 부착되는 화합물인 보호기의 사용을 요구한다. 보호기는 상기 반응 동안 안정해야 하지만 원래의 부위를 노출시키기 위해 궁극적으로 제거되어야 한다. 올리고뉴클레오티드의 합성은 여러 부위가 보호될 것을 요구하고 다른 부위가 보호된 상태로 남아있는 동안 특정 부위가 탈보호되어야 한다. 한 세트로서 함께 분류된 이들 보호기는 오르토고날(orthogonal) 보호기로서 지칭된다.
고체상 올리고뉴클레오티드 합성 프로토콜은 전형적으로 뉴클레오시드의 5' 하이드록실을 위해 디메톡시트리틸 보호기를 사용한다. 포스포르아미다이트 작용기는 3' 하이드록실 위치에서 사용된다. 합성은 일반적으로 한번에 1개의 뉴클레오티드를 성장하는 올리고뉴클레오티드 쇄에 부가하는 합성 주기에서 포스포르아미다이트 뉴클레오시드의 리보스 또는 데옥시리보스 당 성분의 3'부터 5'으로 진행된다. 문헌(Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859)을 참조한다. 합성 주기의 제1 단계인 "커플링" 단계에서, 성장하는 쇄의 5' 말단이 유입 단량체의 3' 포스포르아미다이트와 커플링되어 포스파이트 트리에스테르 중간체를 형성한다(부가된 단량체의 5' 하이드록실은 주기 당 하나의 새로운 단량체만이 성장하는 쇄에 부가되도록 하나의 보호기를 가짐). 문헌(Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185)을 참조한다. 그 다음, 임의적 "캡핑 반응"을 이용하여 비반응된 5' 하이드록실을 갖는 임의의 쇄 상에서의 합성을 중단하는데, 이것은 합성 말기에 하나의 뉴클레오티드 길이만큼 짧아지게 할 것이다. 각각의 커플링 반응 후 포스파이트 트리에스테르 중간체를 산화시켜("산화" 단계) 보다 안정한 포스포트리에스테르 중간체를 생성한다. 산화를 이용하지 않은 경우, 불안정한 포스파이트 트리에스테르 연결이 후속 합성 단계의 산성 조건 하에서 절단될 것이다. 문헌(Letsinger et al. (1976) J. Am. Chem. Soc. 98:3655)을 참조한다. 새로 부가된 단량체의 5' 보호기의 제거("탈보호" 단계)는 전형적으로 산성 용액과 반응시켜 다음에 보호되는 뉴클레오시드 포스포르아미다이트에 커플링될 수 있는 자유 5' 하이드록실 기를 생성함으로써 달성된다. 이 과정은 원하는 서열이 합성될 때까지 부가된 단량체 각각에 대해 반복된다.
일부 프로토콜에 따르면, 캡핑 단계를 누락시킴으로써, 또는 주기의 "외부"에서 산화 단계를 수행하고 완성된 쇄에 대한 단일 산화 반응을 수행함으로써 커플링, 캡핑, 산화 및 탈보호로 구성된 합성 주기를 단축시킨다. 예를 들면, H-포스포네이트 프로토콜에 따른 올리고뉴클레오티드 합성은 합성 주기의 말기에서 단일 산화 단계를 허용할 것이다. 그러나, 커플링 수율은 포스포르아미다이트 화학반응에 대한 커플링 수율보다 덜 효율적이고, 산화는 아미다이트 화학반응보다 더 오랜 시간 및 더 강한 시약을 요구한다.
뉴클레오시드 5'-하이드록실의 보호에 보편적으로 사용되는 화학적 기는 산에 의해 제거될 수 있는 디메톡시트리틸("DMT")이다. 문헌(Khorana (1968) Pure Appl. Chem. 17:349) 및 문헌(Smith et al. (1962) J. Am. Chem. Soc. 84:430)을 참조한다. 이 산 불안정성 보호기는 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드 둘다에서 사용될 수 있을 정도로 많은 이점을 제공한다. 예를 들면, DMT 기는 위치선택적으로 및 높은 수율로 뉴클레오시드 상으로 도입될 수 있다. 문헌(Brown et al. (1979) Methods in Enzymol. 68:109)을 참조한다. 또한, DMT 기의 친유성은 유기 용매 중의 뉴클레오시드의 가용성을 크게 증가시키고, 산성 탈보호로부터 비롯된 탄소양이온(carbocation)은 커플링 효율을 간접적으로 모니터링하는 데에 사용될 수 있는 강한 발색단을 제공한다. 문헌(Matteucci et al. (1980) Tetrahedron Lett. 21:719)을 참조한다. 또한, 상기 기의 소수성은 역상 HPLC 상에서의 분리를 보조하는 데에 사용될 수 있다. 문헌(Becker et al. (1985) J Chromatogr. 326:219)을 참조한다.
질환의 치료, 예방 또는 진단과 관련된 방법
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 중합효소는 유전자 발현의 프로파일링, 서열 변경의 확인, 미생물 검출 및 바이러스 적재 측정을 포함하는 다수의 적용에서 사용될 수 있다. 상기 중합효소가 승온에서 안정성을 나타내는 한, 상기 중합효소는 더운 기후에서 질환을 진단하도록 고안된 키트에서 특히 유용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 중합효소는 대상체의 감염성 질환 상태(예를 들면, HIV-1, HIV-2, 간염 바이러스(예를 들면, hep a, hep b, hep c), 말라리아)의 평가에 사용된다. 본원에 개시된 중합효소는 이러한 병원체를 검출하는 키트뿐만 아니라 바이러스 적재를 확인하도록 고안된 키트에서도 사용될 수 있다. 다른 경우, 상기 중합효소는 유전 질환(예를 들면, 암, 신경 질환, 예컨대, 알츠하이머병)의 진단, 치료 또는 예후에 사용될 수 있다.
상기 중합효소는 하기 바이러스들을 포함하는 다수의 바이러스에 의해 야기된 감염의 평가, 치료 또는 진단에 사용될 수 있다: 아벨슨(Abelson) 백혈병 바이러스, 아벨슨 뮤린 백혈병 바이러스, 아벨슨 바이러스, 급성 후두기관지염 바이러스, 애들레이드 리버(Adelaide River) 바이러스, 아데노 관련 바이러스 군, 아데노바이러스, 아프리카 말병 바이러스, 아프리카 돼지 열 바이러스, AIDS 바이러스, 알류산 밍크병(Aleutian mink disease) 파르보바이러스(parbovirus), 알파레트로바이러스, 알파바이러스, ALV 관련 바이러스, 아마파리(Amapari) 바이러스, 아프토바이러스(Aphthovirus), 아쿠아레오바이러스(Aquareovirus), 아르보바이러스(Arbovirus), 아르보바이러스 C, 아르보바이러스 군 A, 아르보바이러스 군 B, 아레나바이러스(Arenavirus) 군, 아르헨티나 출혈열(Argentine hemorrhagic fever) 바이러스, 아르테리바이러스(Arterivirus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 아텔린(Ateline) 포진바이러스(herpesvirus) 군, 아우제즈키병(Aujezky's disease) 바이러스, 아우라(Aura) 바이러스, 아우스둑병(Ausduk disease) 바이러스, 호주 박쥐 리사바이러스(Australian bat lyssavirus), 아비아데노바이러스(Aviadenovirus), 조류 적모구증(erythroblastosis) 바이러스, 조류 감염성 기관지염 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 조류 림프종증 바이러스, 조류 골수아세포증(myeloblastosis) 바이러스, 조류 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 조류 폐뇌염 바이러스, 조류 망상내피증(reticuloendotheliosis) 바이러스, 조류 육종 바이러스, 조류 C형 레트로바이러스 군, 아비헤파드나바이러스(Avihepadnavirus), 아비폭스바이러스(Avipoxvirus), B 바이러스, B19 바이러스, 바뱅키(Babanki) 바이러스, 비비(baboon) 포진바이러스, 바큘로바이러스(Baculovirus), 바마 포레스트(Barmah Forest) 바이러스, 베바루(Bebaru) 바이러스, 베리마(Berrimah) 바이러스, 베타레트로바이러스(Betaretrovirus), 비르나바이러스(Birnavirus), 비트너(Bittner) 바이러스, BK 바이러스, 블랙 크릭 커낼(Black Creek Canal) 바이러스, 청설 바이러스, 볼리비아 출혈열 바이러스, 보마병(Boma disease) 바이러스, 양 보더병(border disease) 바이러스, 보르나(borna) 바이러스, 소 알파포진바이러스 1, 소 알파포진바이러스 2, 소 코로나바이러스(coronavirus), 소 일시성 열 바이러스, 소 면역결핍 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 소 백혈증 바이러스, 소 유두염 바이러스, 소 파필로마바이러스(papillomavirus), 소 유행성 구내염 바이러스, 소 파르보바이러스, 소 세포융합(syncytial) 바이러스, 소 C형 종양바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스, 버기 크릭(Buggy Creek) 바이러스, 총알 형태 바이러스 군, 부니얌웨라(Bunyamwera) 바이러스 상군(supergroup), 부니야바이러스(Bunyavirus), 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma) 바이러스, 브왐바(Bwamba) 열 바이러스, CA 바이러스, 칼리시바이러스(Calicivirus), 캘리포니아 뇌염 바이러스, 카멜폭스(camelpox) 바이러스, 카나리폭스(canarypox) 바이러스, 개과 동물(canid) 포진바이러스, 개 코로나바이러스, 개 디스템퍼(distemper) 바이러스, 개 포진바이러스, 개 분(minute) 바이러스, 개 파르보바이러스, 카노 델가디토(Cano Delgadito) 바이러스, 염소 관절염 바이러스, 염소 뇌염 바이러스, 염소 포진바이러스, 카프리폭스(Capripox) 바이러스, 카르디오바이러스(Cardiovirus), 카비이드(caviid) 포진바이러스 1, 세르코피쎄시드(Cercopithecid) 포진바이러스 1, 세르코피쎄신(Cercopithecine) 포진바이러스 1, 세르코피쎄신 포진바이러스 2, 찬디푸라(Chandipura) 바이러스, 찬귀놀라(Changuinola) 바이러스, 채널 메기(channel catfish) 바이러스, 샤를르빌(Charleville) 바이러스, 치킨폭스(chickenpox) 바이러스, 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스, 침팬지 포진바이러스, 처브 레오바이러스(chub reovirus), 미끼 연어(chum salmon) 바이러스, 코칼(Cocal) 바이러스, 코호(Coho) 연어 레오바이러스, 성교 발진(coital exanthema) 바이러스, 콜로라도 진드기열 바이러스, 콜티바이러스(Coltivirus), 콜롬비아 SK 바이러스, 일반 감기 바이러스, 접촉전염성 농창(contagious ecthyma) 바이러스, 접촉전염성 농포(pustular) 피부염 바이러스, 코로나바이러스, 코리파르타(Corriparta) 바이러스, 코리자(coryza) 바이러스, 우두 바이러스, 콕사키(coxsackie) 바이러스, CPV(세포질 다면체형성(polyhedrosis) 바이러스), 귀뚜라미 마비 바이러스, 크림-콩고(Crimean-Congo) 출혈열 바이러스, 크룹(croup) 관련 바이러스, 크립토바이러스(Cryptovirus), 사이포바이러스(Cypovirus), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 사이토메갈로바이러스 군, 세포질 다면체형성 바이러스, 사슴 파필로마바이러스, 델타레트로바이러스, 뎅기(dengue) 바이러스, 덴소바이러스(Densovirus), 디펜도바이러스(Dependovirus), 도리(Dhori) 바이러스, 디플로르나(diplorna) 바이러스, 드로소필라(Drosophila) C 바이러스, 오리 간염 B 바이러스, 오리 간염 바이러스 1, 오리 간염 바이러스 2, 듀오바이러스(duovirus), 듀벤헤이즈(Duvenhage) 바이러스, 변형 날개(Deformed wing) 바이러스(DWV), 동부 말 뇌염 바이러스, 동부 말 뇌척수염 바이러스, EB 바이러스, 에볼라(Ebola) 바이러스, 에볼라 유사 바이러스, 에코(echo) 바이러스, 에코바이러스, 에코바이러스 10, 에코바이러스 28, 에코바이러스 9, 사지결손증(ectromelia) 바이러스, EEE 바이러스, EIA 바이러스, 뇌염 바이러스, 뇌심근염 군 바이러스, 뇌심근염 바이러스, 엔테로바이러스(Enterovirus), 효소 상승(enzyme elevating) 바이러스, 효소 상승 바이러스(LDH), 유행성 출혈열 바이러스, 가축 유행성 출혈병 바이러스, 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 말과 동물(equid) 알파포진바이러스 1, 말과 동물 알파포진바이러스 4, 말과 동물 알파포진바이러스 2, 말 유산 바이러스, 말 동맥염 바이러스, 말 뇌병변 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스, 말 모르빌리바이러스(morbillivirus), 말 비폐렴(rhinopneumonitis) 바이러스, 말 리노바이러스(rhinovirus), 유베난구(Eubenangu) 바이러스, 유럽 엘크(elk) 파필로마바이러스, 유럽 돼지열 바이러스, 에버글레이즈(Everglades) 바이러스, 이야크(Eyach) 바이러스, 고양이과 동물(felid) 포진바이러스 1, 고양이 칼리시바이러스, 고양이 섬유육종 바이러스, 고양이 포진바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 고양이 백혈병/육종 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 범백혈구감소증(panleukopenia) 바이러스, 고양이 파르보바이러스, 고양이 육종 바이러스, 고양이 세포융합 바이러스, 필로바이러스(Filovirus), 플란더스(Flanders) 바이러스, 플라비바이러스(Flavivirus), 수족구병 바이러스, 포트 모간(Fort Morgan) 바이러스, 포 코너스 한타바이러스(Four Corners hantavirus), 가금류 아데노바이러스 1, 가금류폭스(fowlpox) 바이러스, 프리엔드(Friend) 바이러스, 감마레트로바이러스, GB 간염 바이러스, GB 바이러스, 풍진 바이러스, 제타(Getah) 바이러스, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스, 선열(glandular fever) 바이러스, 염소폭스 바이러스, 황금잉어 바이러스, 고노메타(Gonometa) 바이러스, 거위 파르보바이러스, 과립증(granulosis) 바이러스, 그로스(Gross) 바이러스, 얼룩 다람쥐 간염 B 바이러스, 군 A 아르보바이러스, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 기니아 피그 사이토메갈로바이러스, 기니아 피그 C형 바이러스, 한타안(Hantaan) 바이러스, 한타바이러스, 대합조개(hard clam) 레오바이러스, 산토끼 섬유종 바이러스, HCMV(인간 사이토메갈로바이러스), 혈구흡착 바이러스 2, 일본 혈구응집 바이러스, 출혈열 바이러스, 헨드라(hendra) 바이러스, 헤니파바이러스(Henipavirus), 헤파드나바이러스, 간염 A 바이러스, 간염 B 바이러스, 간염 C 바이러스, 간염 D 바이러스, 간염 델타 바이러스, 간염 E 바이러스, 간염 F 바이러스, 간염 G 바이러스, 간염 비A 비B(nonA nonB) 바이러스, 간염 바이러스, 간염 바이러스(비인간), 간뇌척수염(hepatoencephalomyelitis) 레오바이러스 3, 헤파토바이러스(Hepatovirus), 왜가리 간염 B 바이러스, 포진 B 바이러스, 단순포진 바이러스, 단순포진 바이러스 1, 단순포진 바이러스 2, 포진바이러스, 포진바이러스 7, 포진바이러스 아텔레스(ateles), 포진바이러스 호미니스(hominis), 포진바이러스 감염, 포진바이러스 사이미리(saimiri), 포진바이러스 수이스(suis), 수두포진바이러스, 하이랜즈 제이(Highlands J) 바이러스, 히람(Hirame) 라브도바이러스(rhabdovirus), 돼지 콜레라 바이러스, 인간 아데노바이러스 2, 인간 알파포진바이러스 1, 인간 알파포진바이러스 2, 인간 알파포진바이러스 3, 인간 B 림프친화성(lymphotropic) 바이러스, 인간 베타포진바이러스 5, 인간 코로나바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스 군, 인간 거품형성(foamy) 바이러스, 인간 감마포진바이러스 4, 인간 감마포진바이러스 6, 인간 간염 A 바이러스, 인간 포진바이러스 1 군, 인간 포진바이러스 2 군, 인간 포진바이러스 3 군, 인간 포진바이러스 4 군, 인간 포진바이러스 6, 인간 포진바이러스 8, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 면역결핍 바이러스 2, 인간 파필로마바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 I, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 II, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 III, 인간 T 세포 림프종 바이러스 I, 인간 T 세포 림프종 바이러스 II, 인간 T 세포 림프친화성 바이러스 1형, 인간 T 세포 림프친화성 바이러스 2형, 인간 T 세포 림프친화성 바이러스 I, 인간 T 세포 림프친화성 바이러스 II, 인간 T 세포 림프친화성 바이러스 III, 이크노바이러스(Ichnovirus), 유아 위장염 바이러스, 감염성 소 비기관염(rhinotracheitis) 바이러스, 감염성 조혈 괴사(haematopoietic necrosis) 바이러스, 감염성 췌장 괴사 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 인플루엔자 바이러스 D, 인플루엔자 바이러스 pr8, 곤충 무지개(iridescent) 바이러스, 곤충 바이러스, 이리도바이러스(iridovirus), 일본 B(Japanese B) 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, JC 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 카포시(Kaposi) 육종 관련 포진바이러스, 케메로보(Kemerovo) 바이러스, 킬햄(Kilham) 래트 바이러스, 클라매쓰(Klamath) 바이러스, 콜롱고(Kolongo) 바이러스, 한국 출혈열 바이러스, 쿰바(kumba) 바이러스, 키사누르 산림병(Kysanur forest disease) 바이러스, 키질아가크(Kyzylagach) 바이러스, 라 크로스(La Crosse) 바이러스, 락트산 탈수소효소(lactic dehydrogenase) 상승 바이러스, 락트산 탈수소효소 바이러스, 라고스(Lagos) 박쥐 바이러스, 랑구르(Langur) 바이러스, 라핀(lapine) 파르보바이러스, 라사(Lassa) 열 바이러스, 라사 바이러스, 잠복 래트 바이러스, LCM 바이러스, 리키(Leaky) 바이러스, 렌티바이러스(Lentivirus), 레포리폭스바이러스(Leporipoxvirus), 백혈병 바이러스, 류코바이러스(leukovirus), 덩어리 피부병(lumpy skin disease) 바이러스, 림프절병증(lymphadenopathy) 관련 바이러스, 림포크립토바이러스(Lymphocryptovirus), 림프구성 맥락수막염(choriomeningitis) 바이러스, 림프증식(lymphoproliferative) 바이러스 군, 마츄포(Machupo) 바이러스, 광 소양증(mad itch) 바이러스, 포유동물 B형 종양바이러스 군, 포유동물 B형 레트로바이러스, 포유동물 C형 레트로바이러스 군, 포유동물 D형 레트로바이러스, 유선 종양 바이러스, 마푸에라(Mapuera) 바이러스, 마르부르그(Marburg) 바이러스, 마르부르그 유사 바이러스, 마손 화이자(Mason Pfizer) 원숭이 바이러스, 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus), 마야로(Mayaro) 바이러스, ME 바이러스, 홍역 바이러스, 멘앵글(Menangle) 바이러스, 멘고(Mengo) 바이러스, 멘고바이러스, 미들부르그(Middelburg) 바이러스, 착유부결절(milkers nodule) 바이러스, 밍크 장염 바이러스, 마우스의 분 바이러스, MLV 관련 바이러스, MM 바이러스, 모콜라(Mokola) 바이러스, 몰루스시폭스바이러스(Molluscipoxvirus), 물사마귀(Molluscum contagiosum) 바이러스, 원숭이 B 바이러스, 원숭이폭스 바이러스, 모노네가비랄레스(Mononegavirales), 모르빌리바이러스(Morbillivirus), 마운트 엘곤(Mount Elgon) 박쥐 바이러스, 마우스 사이토메갈로바이러스, 마우스 뇌척수염 바이러스, 마우스 간염 바이러스, 마우스 K 바이러스, 마우스 백혈병 바이러스, 마우스 유선 종양 바이러스, 마우스 분 마이러스, 마우스 폐렴 바이러스, 마우스 회색질척수염(poliomyelitis) 바이러스, 마우스 폴리오마바이러스(polyomavirus), 마우스 육종 바이러스, 마우스폭스 바이러스, 모잠비크(Mozambique) 바이러스, 무캄보(Mucambo) 바이러스, 점막 질환 바이러스, 볼거리 바이러스, 설치류 베타포진바이러스 1, 설치류 사이토메갈로바이러스 2, 뮤린 사이토메갈로바이러스 군, 뮤린 뇌척수염 바이러스, 뮤린 간염 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 결절 유도 바이러스, 뮤린 폴리오마바이러스, 뮤린 육종 바이러스, 뮤로메갈로바이러스(Muromegalovirus), 뮤레이 발리(Murray Valley) 뇌염 바이러스, 점액종 바이러스, 믹소바이러스(Myxovirus), 다형성 믹소바이러스(Myxovirus multiforme), 볼거리 믹소바이러스(Myxovirus parotitidis), 나이로비(Nairobi) 양 질환 바이러스, 나이로바이러스(Nairovirus), 나니르나바이러스(Nanirnavirus), 나리바(Nariva) 바이러스, 엔듀모(Ndumo) 바이러스, 니틀링(Neethling) 바이러스, 넬슨 베이(Nelson Bay) 바이러스, 신경친화성(neurotropic) 바이러스, 뉴 월드 아레나바이러스((New World Arenavirus), 신생아 폐렴 바이러스, 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스, 니파(Nipah) 바이러스, 비세포병원성(noncytopathogenic) 바이러스, 노르웍(Norwalk) 바이러스, 핵 다면체형성 바이러스(NPV), 유두 목(nipple neck) 바이러스, 오뇽뇽(O'nyong'nyong) 바이러스, 옥켈보(Ockelbo) 바이러스, 종양발생성 바이러스, 종양발생성 바이러스 유사 입자, 온코르나바이러스(oncornavirus), 오르비바이러스(Orbivirus), Orf 바이러스, 오로포우치(Oropouche) 바이러스, 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus), 오르토믹소바이러스(Orthomyxovirus), 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus), 오르토레오바이러스(Orthoreovirus), 오룬고(Orungo), 양과 동물(ovine) 파필로마바이러스, 양과 동물 카타르열(catarrhal fever) 바이러스, 올빼미 원숭이 포진바이러스, 필리얌(Palyam) 바이러스, 파필로마바이러스, 파필로마바이러스 실빌라기(sylvilagi), 파포바바이러스(Papovavirus), 파라인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1형, 파라인플루엔자 바이러스 2형, 파라인플루엔자 바이러스 3형, 파라인플루엔자 바이러스 4형, 파라믹소바이러스, 파라폭스바이러스(Parapoxvirus), 파라백시니아(paravaccinia) 바이러스, 파르보바이러스, 파르보바이러스 B19, 파르보바이러스 군, 페스티바이러스(Pestivirus), 플레보바이러스(Phlebovirus), 포신(phocine) 디스템버 바이러스, 피코드나바이러스(Picodnavirus), 피코르나바이러스, 돼지 사이토메갈로바이러스 - 비둘기폭스(pigeonpox) 바이러스, 피리(Piry) 바이러스, 픽수나(Pixuna) 바이러스, 마우스 폐렴 바이러스, 뉴모바이러스(Pneumovirus), 회색질척수염 바이러스, 폴리오바이러스(poliovirus), 폴리드나바이러스(Polydnavirus), 다면체 바이러스, 폴리오마 바이러스, 폴리오마바이러스, 폴리오마바이러스 보비스(bovis), 폴리오마바이러스 세르코피쎄시(cercopitheci), 폴리오마바이러스 호미니스 2, 폴리오마바이러스 마카캐(maccacae) 1, 폴리오마바이러스 뮤리스(muris) 1, 폴리오마바이러스 뮤리스 2, 폴리오마바이러스 파피오니스(papionis) 1, 폴리오마바이러스 파피오니스 2, 폴리오마바이러스 실빌라기, 폰진(Pongine) 포진바이러스 1, 돼지 유행성 설사 바이러스, 돼지 혈구응집 뇌척수염 바이러스, 돼지 파르보바이러스, 돼지 전염성 위장염 바이러스, 돼지 C형 바이러스, 폭스 바이러스, 폭스바이러스, 두창 폭스바이러스, 프로스펙트 힐(Prospect Hill) 바이러스, 프로바이러스(Provirus), 가성우두(pseudocowpox) 바이러스, 가성광견병(pseudorabies) 바이러스, 앵무새폭스(psittacinepox) 바이러스, 메추라기폭스(quailpox) 바이러스, 토끼 섬유종 바이러스, 토기 신장 공포형성(vacuolating) 바이러스, 토끼 파필로마바이러스, 광견병 바이러스, 미국너구리(raccoon) 파르보바이러스, 미국너구리폭스(raccoonpox) 바이러스, 라닉헷(Ranikhet) 바이러스, 래트 사이토메갈로바이러스, 래트 파르보바이러스, 래트 바이러스, 라우셔(Rauscher) 바이러스, 재조합 백시니아 바이러스, 재조합 바이러스, 레오바이러스, 레오바이러스 1, 레오바이러스 2, 레오바이러스 3, 파충류 C형 바이러스, 호흡기 감염 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 호흡기 바이러스, 망상내피증 바이러스, 라브도바이러스(Rhabdovirus), 라브도바이러스 카르피아(carpia), 라디노바이러스(Rhadinovirus), 리노바이러스(Rhinovirus), 리지디오바이러스(Rhizidiovirus), 리프트 계곡 열(Rift Valley fever) 바이러스, 릴리(Riley) 바이러스, 우역(rinderpest) 바이러스, RNA 종양 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스, 로타바이러스(Rotavirus), 로우게올(rougeole) 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 루벨라(rubella) 바이러스, 루베올라(rubeola) 바이러스, 루비바이러스(Rubivirus), 러시아 가을 뇌염 바이러스, SA 11 원숭이 바이러스, SA2 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스, 사기야마(Sagiyama) 바이러스, 사이미린(Saimirine) 포진바이러스 1, 타액선(salivary gland) 바이러스, 모래파리(sandfly) 열 바이러스 군, 샌드짐바(Sandjimba) 바이러스, SARS 바이러스, SDAV(시알로눈물샘염(sialodacryoadenitis) 바이러스), 물개폭스(sealpox) 바이러스, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스, 서울(Seoul) 바이러스, 양폭스(sheeppox) 바이러스, 숍(Shope) 섬유종 바이러스, 숍 파필로마 바이러스, 원숭이 거품형성 바이러스, 원숭이 간염 A 바이러스, 원숭이 인간 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 원숭이 파라인플루엔자 바이러스, 원숭이 T 세포 림프친화성 바이러스, 원숭이 바이러스, 원숭이 바이러스 40, 심플렉스바이러스(Simplexvirus), 신 놈브레(Sin Nombre) 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 천연두 바이러스, 남아메리카 출혈열 바이러스, 참새폭스(sparrowpox) 바이러스, 스푸마바이러스(Spumavirus), 다람쥐 섬유종 바이러스, 다람쥐 원숭이 레트로바이러스, SSV 1 바이러스 군, STLV(원숭이 T 림프친화성 바이러스) I형, STLV(원숭이 T 림프친화성 바이러스) II형, STLV(원숭이 T 림프친화성 바이러스) III형, 구진성 구내염 바이러스, 상악하(submaxillary) 바이러스, 돼지과 동물(suid) 알파포진바이러스 1, 돼지과 동물 포진바이러스 2, 수이폭스바이러스(Suipoxvirus), 습지열(swamp fever) 바이러스, 돼지폭스(swinepox) 바이러스, 스위스 마우스 백혈병 바이러스, TAC 바이러스, 타카리브 콤플렉스(Tacaribe complex) 바이러스, 타카리브 바이러스, 타나폭스(Tanapox) 바이러스, 타테라폭스(Taterapox) 바이러스, 텐취(Tench) 레오바이러스, 테일러(Theiler) 뇌척수염 바이러스, 테일러 바이러스, 토고토(Thogoto) 바이러스, 토타팔라얌(Thottapalayam) 바이러스, 진드기 유래의 뇌염 바이러스, 티오만(Tioman) 바이러스, 토가바이러스(Togavirus), 토로바이러스(Torovirus), 종양 바이러스, 투파이아(Tupaia) 바이러스, 칠면조 비기관염 바이러스, 칠면조폭스(turkeypox) 바이러스, C형 레트로바이러스, D형 종양바이러스, D형 레트로바이러스 군, 궤양성 질환 라브도바이러스, 유나(Una) 바이러스, 유우쿠니에미(Uukuniemi) 바이러스 군, 백시니아 바이러스, 공포형성 바이러스, 수두대상포진 바이러스, 바리셀로바이러스(Varicellovirus), 바리콜라(Varicola) 바이러스, 대두창(variola major) 바이러스, 두창(variola) 바이러스, 바신 기슈병(Vasin Gishu disease) 바이러스, VEE 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 베네주엘라 말 뇌척수염 바이러스, 베네주엘라 출혈열 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 베지큘로바이러스(Vesiculovirus), 빌리유이스크(Vilyuisk) 바이러스, 살무사(viper) 레트로바이러스, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스, 비스나 매디(Visna Maedi) 바이러스, 비스나 바이러스, 들쥐폭스(volepox) 바이러스, VSV(수포성 구내염 바이러스), 왈랄(Wallal) 바이러스, 와레고(Warrego) 바이러스, 사마귀(wart) 바이러스, WEE 바이러스, 서부 나일강(West Nile) 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌척수염 바이러스, 와타로아(Whataroa) 바이러스, 동계 구토증(Winter Vomiting) 바이러스, 우드척(woodchuck) 간염 B 바이러스, 털원숭이(woolly monkey) 육종 바이러스, 상처 종양 바이러스, WRSV 바이러스, 야바(Yaba) 원숭이 종양 바이러스, 야바 바이러스, 야타폭스바이러스(Yatapoxvirus), 황열(yellow fever) 바이러스 및 유그 보그다노박(Yug Bogdanovac) 바이러스.
실시예
실시예 1: 보리 게놈 DNA의 증폭
도 15는 상업적으로 입수가능한 2개의 중합효소(ABI 골드(Gold)(상표명) 및 로슈 패스트스타트(Roche FastStart)(상표명))와 비교할 때 펩티드 태그-중합효소(서열번호 2의 알데하이드 변형 형태)를 중합효소로서 사용하여 보리 게놈 DNA를 증폭시켜 얻은 결과를 보여준다.
보리 게놈 DNA는 5개의 상이한 게놈으로부터 수득되었다. 레인 7은 100 bp 래더(ladder)를 보여준다.
레인의 설명은 이하에 기재되어 있다:
레인 1 내지 3 - 100 ㎕ PCR 반응 당 2.5 U의 펩티드 태그-중합효소(펩티드 태그-중합효소는 1 ng/㎕로부터 시작하여 10배 희석됨)
레인 4 내지 6 - 100 ㎕ 당 4 U의 펩티드 태그-중합효소
레인 8 내지 10 - 100 ㎕ PCR 반응 당 2.5 U의 ABI 골드(상표명)(ABI 골드(상표명)는 1 ng/㎕로부터 시작하여 10배 희석됨)
레인 11 내지 13 - 100 ㎕ 당 4 U의 ABI 골드(상표명)
레인 14 내지 16 - 100 ㎕ PCR 반응 당 2.5 U의 로슈 패스트스타트(상표명)(로슈 패스트스타트(상표명)는 1 ng/㎕로부터 시작하여 10배 희석됨)
레인 17 내지 19 - 100 ㎕ 당 4 U의 로슈 패스트스타트(상표명)
레인 1 내지 3(펩티드 태그-중합효소) 2.5 U만이 DNA의 증폭을 보여준다.
레인 8(ABI)은 작은 비특이적 생성물(번짐)을 보여준다.
레인 14 내지 16(로슈)은 2.5 U에서 생성물을 보여주지 않는다.
실시예 2: 펩티드 태그-중합효소 혼합물을 사용한 마우스 게놈 DNA의 증폭
도 26은 다양한 중합효소 혼합물을 사용하여 마우스 게놈 DNA를 증폭시켜 얻은 결과를 보여준다. 레인 1은 1 kb DNA 래더를 보여준다. 레인 2 내지 10은 1x PCR에서 1 ng/㎕의 마우스 게놈 DNA의 증폭을 보여준다. 모든 혼합물들이 3838 bp의 정확한 PCR 생성물 길이를 생성하였다. 레인 11 내지 19는 플라스미드 주형 DNA를 사용한 점을 제외하고 레인 2 내지 10에서와 동일한 혼합물에 상응한다. 예측된 PCR 생성물은 약 8.6 kb이고, 하나의 펩티드 태그-중합효소 혼합물(1.5 mM MgCl2)(레인 17)만이 정확한 생성물을 생성하였다. 펩티드 태그-중합효소 혼합물은 서열번호 2, 서열번호 6 및 서열번호 11의 알데하이드 변형 형태를 함유한다. 레인 20 및 21은 생성물을 전혀 생성하지 않는, 펩티드 태그-중합효소만의 PCR을 보여준다. 레인의 설명은 이하에 기재되어 있다.
레인 1 - 1 kb DNA를 보여준다.
레인 2 - 적재될 준비가 되어 있는, 소 혈청 알부민(BSA)을 갖는 펩티드 태그-중합효소 혼합물(1.5 mM MgCl2)
레인 3 - 적재될 준비가 되어 있는, BSA를 갖는 펩티드 태그-중합효소 혼합물(2.0 mM MgCl2)
레인 4 - 적재될 준비가 되어 있는, BSA를 갖는 펩티드 태그-중합효소 혼합물(2.5 mM MgCl2)
레인 5 - BSA를 갖는 펩티드 태그-중합효소 혼합물(1.5 mM MgCl2)
레인 6 - BSA를 갖는 펩티드 태그-중합효소 혼합물(2.0 mM MgCl2)
레인 7 - BSA를 갖는 펩티드 태그-중합효소 혼합물(2.5 mM MgCl2)
레인 8 - 펩티드 태그-중합효소 혼합물(1.5 mM MgCl2)
레인 9 - 펩티드 태그-중합효소 혼합물(2.0 mM MgCl2)
레인 10 - 펩티드 태그-중합효소 혼합물(2.5 mM MgCl2)
레인 20 - 1x PCR에서 1 ng/㎕의 펩티드 태그-중합효소(1.5 mM MgCl2) 마우스 게놈 DNA
레인 21 - 펩티드 태그-중합효소(1.5 mM MgCl2) 플라스미드 DNA
본 발명의 바람직한 실시양태들은 본원에 제시되고 기재되어 있지만, 이러한 실시양태들은 단지 예로서 제공된 것임이 당업자에게 자명할 것이다. 당업자는 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변경, 변화 및 치환을 수행할 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태들에 대한 다양한 대안적 실시양태들이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 하기 특허청구범위는 본 발명의 범위를 정의하기 위한 것이고, 하기 특허청구범위 내의 방법 및 구조, 및 이들의 등가물은 하기 특허청구범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> SOLIS BIODYNE <120> COMPOSITIONS FOR INCREASING POLYPEPTIDE STABILITY AND ACTIVITY, AND RELATED METHODS <130> 39328-701.601 <140> PCT/IB2010/03127 <141> 2010-11-19 <150> 61/390,857 <151> 2010-10-07 <150> 61/356,541 <151> 2010-06-18 <150> 61/350,457 <151> 2010-06-01 <150> 61/262,919 <151> 2009-11-19 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Met Ile Asp Leu Gln Arg Pro Ser Ala Ala Thr Met Val Asp Asp Leu 1 5 10 15 Gln Arg Pro His His His His His His Pro Trp Asp Tyr Lys Asp Asp 20 25 30 Asp Asp Lys Pro Arg Trp Asn Ser Gly Trp 35 40 <210> 2 <211> 870 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Met Ile Asp Leu Gln Arg Pro Ser Ala Ala Thr Met Val Asp Asp Leu 1 5 10 15 Gln Arg Pro His His His His His His Pro Trp Asp Tyr Lys Asp Asp 20 25 30 Asp Asp Lys Pro Arg Trp Asn Ser Gly Trp Leu Pro Leu Phe Glu Pro 35 40 45 Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr 50 55 60 Phe His Ala Leu Lys Gly Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln 65 70 75 80 Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp 85 90 95 Gly Asp Ala Val Ile Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg 100 105 110 His Glu Ala Tyr Gly Gly Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu 115 120 125 Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu 130 135 140 Gly Leu Ala Arg Leu Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu 145 150 155 160 Ala Ser Leu Ala Lys Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile 165 170 175 Leu Thr Ala Asp Lys Asp Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His 180 185 190 Val Leu His Pro Glu Gly Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu 195 200 205 Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr 210 215 220 Gly Asp Glu Ser Asp Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys 225 230 235 240 Thr Ala 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gaaggggcgc gcgttattac ctggaagaat atcgaccttc cctatgtcga cgtcgtttcc 660 accgagaagg agatgataaa gcgcttcctc aaggtcgtca aggaaaagga tcccgacgtc 720 ctcataacct acaacggcga caacttcgac ttcgcctacc tcaagaagcg ctccgagaag 780 ctcggagtca agttcatcct cggaagggaa gggagcgagc cgaaaatcca gcgcatgggc 840 gatcgctttg cggtggaggt caagggaagg attcacttcg acctctaccc cgtcattagg 900 agaacgatta acctccccac ttacaccctt gaggcagtat atgaagccat ctttggacag 960 ccgaaggaga aggtctacgc tgaggagata gcgcaggcct gggaaacggg cgagggatta 1020 gaaagggtgg cccgctactc gatggaggac gcaaaggtaa cctatgaact cggaaaagag 1080 ttcttcccta tggaagccca gctctcgcgc ctcgtaggcc agagcctctg ggatgtatct 1140 cgctcgagta ccggaaacct cgtcgagtgg tttttgctga ggaaggccta cgagaggaat 1200 gaacttgcac caaacaagcc ggacgagagg gagctggcaa gaagaaggga gagctacgcg 1260 ggtggatacg tcaaggagcc cgaaagggga ctgtgggaga acatcgtgta tctggacttc 1320 cgctccctgt atccttcgat aataatcacc cataacgtct cccctgatac actcaacagg 1380 gagggttgtg aggagtacga cgtggctcct caggtaggcc ataagttctg caaggacttc 1440 cccggcttca tcccaagcct cctcggggac ctcttggagg agagacagaa ggtaaagaag 1500 aagatgaagg ccactataga cccaatcgag aagaaactcc tcgattacag gcagcgagca 1560 atcaaaatcc ttgctaatag cttctacggt tactacggct atgcaaaggc ccgctggtac 1620 tgcaaggagt gcgccgagag cgttaccgct tggggcaggc agtacatcga gaccacgata 1680 agggaaatag aggagaaatt tggctttaaa gtcctctacg cggacacaga tggatttttc 1740 gcaacaatac ctggagcgga cgccgaaacc gtcaaaaaga aggcaaagga gttcctggac 1800 tacatcaacg ccaaactgcc cggcctgctc gaactcgaat acgagggctt ctacaagcgc 1860 ggcttcttcg tgacgaagaa gaagtacgcg gttatagacg aggaggacaa gataacgacg 1920 cgcgggcttg aaatagttag gcgtgactgg agcgagatag cgaaggagac gcaggcgagg 1980 gttcttgagg cgatactaaa gcacggtgac gttgaagaag cggtaaggat tgtcaaagag 2040 gttacggaga agctgagcaa gtacgaggtt ccaccggaga agctggtcat ctacgagcag 2100 ataacccgcg acctgaagga ctacaaggcc accgggccgc atgtggctgt tgcaaaacgc 2160 ctcgccgcaa gggggataaa aatccggccc ggaacggtca taagctacat cgtgctcaaa 2220 ggctcgggaa ggattgggga cagggctata ccctttgacg aatttgaccc ggcaaagcac 2280 aagtacaatg cagaatacta catcgagaac caggttcttc cagctgtgga gaggattctg 2340 agggcctttg gttaccgtaa agaagattta aggtatcaga aaacgcggca ggttggcttg 2400 ggggcgtggc taaaacctaa gacaagctgg atctgcgcaa ccgtaaagtt caagtacaaa 2460 ggcgaagaaa aagaggtaga catctccaag atcaagaaag tatggcgtgt gggcaagatg 2520 atctccttca cctacgacga gggcggtggc aagaccggcc gcggtgcggt aagcgaaaag 2580 gacgcgccga aggagctgct gcagatgctg gagaagcaga aaaagattta gtgg 2634 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 13 Met Val Asp Asp Leu Gln Arg Pro His His His His His His Pro Trp 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Pro Arg Trp Asn Ser Gly Trp 20 25 30 <210> 14 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 14 Met Ile Asp Leu Gln Arg Pro Gln Ala Ala Thr Met Asp Ser Arg His 1 5 10 15 His His His His His Pro Trp Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Pro 20 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 18 Met Val Asp Asp Leu Gln Arg Pro His His His His His His Pro Trp 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Pro Arg Trp Asn Ser 20 25 <210> 19 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 19 atggtcgacg acctgcagcg gccgcaccat caccatcacc atccatggga ttacaaggac 60 gacgatgaca agccgcggtg gaattcg 87 <210> 20 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 20 Met Ile Asp Leu Gln Arg Pro Ser Ala Ala Thr Met Val Asp Asp Leu 1 5 10 15 Gln Arg Pro His His His His His His Pro Trp Asp Tyr Lys Asp Asp 20 25 30 Asp Asp Lys Pro Arg Trp Asn Ser Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys 35 40 45 Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile 65 70 75 80 Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu 85 90 95 Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser 100 105 110 Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro 115 120 125 Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg 130 135 140 Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile 145 150 155 160 Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala 165 170 175 Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly 180 185 190 Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg 195 200 205 <210> 21 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 21 atgatcgacc tgcagcggcc atccgccgcc accatggtcg acgacctgca gcggccgcac 60 catcaccatc accatccatg ggattacaag gacgacgatg acaagccgcg gtggaattcg 120 ggggccccac cacgcctcat ctgtgacagc cgagtcctgg agaggtacct cttggaggcc 180 aaggaggccg agaatatcac gacgggctgt gctgaacact gcagcttgaa tgagaatatc 240 actgtcccag acaccaaagt taatttctat gcctggaaga ggatggaggt cgggcagcag 300 gccgtagaag tctggcaggg cctggccctg ctgtcggaag ctgtcctgcg gggccaggcc 360 ctgttggtca actcttccca gccgtgggag cccctgcagc tgcatgtgga taaagccgtc 420 agtggccttc gcagcctcac cactctgctt cgggctctgg gagcccagaa ggaagccatc 480 tcccctccag atgcggcctc agctgctcca ctccgaacaa tcactgctga cactttccgc 540 aaactcttcc gagtctactc caatttcctc cggggaaagc tgaagctgta cacaggggag 600 gcctgcagga caggggacag a 621 <210> 22 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 22 Met Ile Asp Leu Gln Arg Pro Ser Ala Ala Thr Met Val Asp Asp Leu 1 5 10 15 Gln Arg Pro His His His His His His Pro Trp Asp Tyr Lys Asp Asp 20 25 30 Asp Asp Lys Pro Arg Trp Asn Ser Lys Val Leu Ala Ala Gly Val Val 35 40 45 Pro Leu Leu Leu Val Leu His Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu 50 55 60 Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala Thr Cys Ala Ile 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accatggtcg acgacctgca gcggccgcac 60 catcaccatc accatccatg ggattacaag gacgacgatg acaagccgcg gtggaattcg 120 aaagtgctgg cggcgggcgt ggtgccgctg ctgctggtgc tgcattggaa acatggcgcg 180 ggcagcccgc tgccgattac cccggtgaac gcgacctgcg cgattcgcca tccgtgccat 240 aacaacctga tgaaccagat tcgcagccag ctggcgcagc tgaacggcag cgcgaacgcg 300 ctgtttattc tgtattatac cgcgcagggc gaaccgtttc cgaacaacct ggataaactg 360 tgcggcccga acgtgaccga ttttccgccg tttcatgcga acggcaccga aaaagcgaaa 420 ctggtggaac tgtatcgcat tgtggtgtat ctgggcacca gcctgggcaa cattacccgc 480 gatcagaaaa ttctgaaccc gagcgcgctg agcctgcata gcaaactgaa cgcgaccgcg 540 gatattctgc gcggcctgct gagcaacgtg ctgtgccgcc tgtgcagcaa atatcatgtg 600 ggccatgtgg atgtgaccta tggcccggat accagcggca aagatgtgtt tcagaaaaaa 660 aaactgggct gccagctgct gggcaaatat aaacagatta ttgcggtgct ggcgcaggcg 720 ttt 723 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic His tag" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> /note="This sequence may encompass 1-6 His residues" <400> 24 His His His His His His 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 25 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 26 <211> 15 <212> DNA <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Eukaryotic Kozak sequence" <400> 26 gccgccacca tggtc 15 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic His tag" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> /note="This sequence may encompass 1-15 or 20 His residues" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 27 His His His His His His His His His His His His His His His His 1 5 10 15 His His His His 20 <210> 28 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> /note="This sequence may encompass 6-12 dT nucleotides" <400> 28 tttttttttt tt 12 <210> 29 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 29 tttttttttt 10 <210> 30 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 30 gccgccrcca ugg 13 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Eukaryotic translation signal sequence" <400> 31 Met Val Asp Asp Leu 1 5

Claims (25)

  1. 서열번호 1의 20 내지 40번째 아미노산을 모두 순서대로 포함하면서 서열번호 1 또는 서열번호 14와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 태그(tag)를 제공하는 단계, 및
    역전사효소 폴리펩티드를 상기 펩티드 태그에 연결하는 단계
    를 포함하는, 역전사효소 폴리펩티드의 열안정성을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 태그는 서열번호 1 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 태그는 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 상기 폴리펩티드의 분해 또는 변성을 억제하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 태그는 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 상기 폴리펩티드의 단백질 기능의 상실을 억제하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 온도에 노출된 후 상기 폴리펩티드의 단백질 기능은 상기 온도에 노출되기 전 상기 폴리펩티드의 단백질 기능의 50% 이상인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 태그는 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 1일 이상 동안 상기 폴리펩티드의 안정성을 유지하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드에 공유적으로 연결되는 것인 방법
  8. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드에 비공유적으로 연결되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 태그는 상기 폴리펩티드의 카르복시 말단에 연결되는 것인 방법.
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