JP2790448B2 - サーマス サーモフィルス ｄｎａポリメレース酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、サーマス サーモ
フィルス（Thermus thermophilus）より精製された耐熱
性ＤＮＡポリメレースの精製方法と、本酵素を生成する
ための遺伝子転換技術に関して記したものである。耐熱
性ＤＮＡポリメレースは数多くの組換ＤＮＡ技術、特に
ポリメレース連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の増幅に有
用である。

【０００２】

【従来の技術】大腸菌E. coli のような中温性細菌から
のＤＮＡポリメレースの分離に関しては、数多くの研究
がなされている。これらについては、以下の文献を参照
されたい。Bassman ら。１９５７年 J. Biol. Chem.２
３３巻、１７１−１７７。及びButtin and Kornberg 、
１９６６年 J. Biol. Chem.２４１巻、５４１９−５２
４７。

【０００３】これに比べると、Thermus thermophilusの
ような好熱性細菌よりＤＮＡポリメレースを分離、精製
する試みは、それほど行なわれていない。Kaledin らが
１９８０年 Biokhymiya４５巻６４４−６５１にT. aqu
aticusのＹＴ−１株よりＤＮＡポリメレースを分離、精
製する６ステップの方法を発表している。このステップ
には、粗抽出物の分離、ＤＥＡＥセルロースクロマトグ
ラフィー、ハイドロキシアパタイトによる分画、ＤＥＡ
Ｅセルロースによる分画及びＤＮＡセルロースクロマト
グラフィーから成っている。それぞれのステップでの回
収産物でのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアー
ゼの混入は調べられていない。精製された酵素の分子量
は１モノマー当たり約６2,０００ダルトンと報告されて
いる。

【０００４】T. aquaticusよりポリメレースを精製する
第二の方法がChien らによって１９７６年J. Bacterio
l. １２７巻１５５０−１５５７に記載されている。こ
の方法では、粗抽出物をＤＥＡＥセファデックスカラム
にかけている。透析後の回収画分は次にフォスフォセル
ロースカラムにかけられる。回収画分は透析後にポリメ
レース活性が失活しないように牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）が加えられる。次にこれをＤＮＡセルロースカラム
にかける。回収物は再び透析を行ない、ゲル濾過法によ
り、分子量約６3,０００ダルトン、ショ糖密度勾配遠心
法によって約６8,０００ダルトンと決定された。

【０００５】Chien ら及びKaledin らによって精製され
た耐熱性酵素を用いて、特定の核酸の配列を、反応前に
存在する量に比較して大量に増幅させる方法が米国特許
第4,６８3,１９５号及び4,９６5,１８８号にＰＣＲ法と
して記載されている。プライマー、テンプレート（鋳
型）、ヌクレオチド、適当な反応バッファ（緩衝液）、
反応条件及びポリメレースがＰＣＲ反応に用いられる。
この反応とは、ターゲットとなるＤＮＡの変性、変性タ
ーゲットＤＮＡとプライマー間でのハイブリダイゼーシ
ョン（雑種形成）、そして相補鎖の生成である。それぞ
れのプライマーからの伸長物は、次には目的となる核酸
配列を生成するためのテンプレートとなる。特許では次
の点が公表されている、即ち、もし用いられるポリメレ
ースが熱にたいして安定であるならば、それぞれの熱変
性ステップ毎に新たにポリメレースを加える必要がなく
なること、すなわち加熱によってポリメレースが変性あ
るいは失活することがなくなる。

【０００６】欧州特許公報第２５8,０１７号、ＰＣＴ出
版第８９／０６６９１号及び米国特許第４，８８９，８
１８号でT. aquaticusより耐熱性ＤＮＡポリメレース
（分子量９４KDa)の精製、その組換体の発現及びこの酵
素のＰＣＲ法への応用について記載されている。T. aqu
aticus ＤＮＡポリメレースはＰＣＲ法及び他の組換Ｄ
ＮＡ技術への応用に有用であるが、他の種の耐熱性ポリ
メレースの必要も要求されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、前述したＰＣ
Ｒ法を更に改良できるような耐熱性ポリメレース、ある
いはＤＮＡ塩基配列決定、ニックトランスレーション
法、更に逆転写反応に用いてよりよい結果を引き出せる
ような耐熱性ポリメレースの精製が技術界で望まれてい
る。本出願の発明は、Thermus thermophilus ＤＮＡポ
リメレースの発現ベクターと精製プロトコルを提示して
その要求に答えようとするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】従って本出願の発明は、
与えられたテンプレートの核酸鎖よりヌクレオチドを組
み合わせて、テンプレートに相補的な核酸を合成する反
応を触媒する耐熱性酵素を精製する方法について述べて
いる。精製酵素は、Thermus thermophilus由来のＤＮＡ
ポリメレースで遺伝子の塩基配列より予想される分子量
は約９４Ｋダルトンである。この精製物は、温度循環式
増幅反応に使われ、この反応で、予め与えられた塩基配
列をもつ核酸が反応前に存在する量より増幅されて、大
量に作り出される。その結果、この増幅された核酸の配
列を、それ以後の反応に利用したりあるいはその解析を
行なうことが容易に成る。Thermus thermophilus由来の
Ｔth ＤＮＡポリメレース酵素をコードする遺伝子の同
定とクローニングを行ない耐熱性酵素を調製するあたら
しい方法も実現した。

【０００９】本発明ではまた、前述の精製した耐熱性Ｔ
th酵素が、非イオン性ポリマー変性剤を含むバッファー
中で安定な酵素活性を保つことを明らかにした。

【００１０】結局、本発明は、耐熱性ポリメレースの精
製法について提示している。精製は以下の過程から成っ
ていて、すなわちThermus thermophilus細胞から粗抽出
物の調製、粗抽出物中の核酸とＤＮＡポリメレースが解
離するようにイオン強度を調製すること、抽出物を疎水
結合性クロマトグラフィにかけ、つぎにＤＮＡ結合蛋白
アフィニティクロマトグラフィにかけ、最後に抽出物を
陽イオン、陰イオン交換カラムあるいはハイドロキシア
パタイトカラムにかける操作から成っている。実際に
は、これらのステップは前述した順序で連続的に行なう
ことが望ましく、ＤＮＡ結合蛋白アフィニティクロマト
グラフィにかける前に抽出物に非イオン性変性剤を加え
ておくのが望ましい。核酸結合蛋白アフィニティクロマ
トグラフィは、ＤＮＡポリメレースとエンドヌクレース
の分離をおこなうために望ましいステップである。

【００１１】本発明ではＴth ＤＮＡポリメレースとそ
の発現ベクターのＤＮＡシーケンスを提示している。本
発明の理解の手助けとして、いくつかの用語を以下のよ
うに定義する "細胞" 、 "細胞株" 、 "細胞培養" はそ
れぞれ同義で互いに変換可能であり前駆細胞の意味も含
めるとする。従って、 "形質転換体" 、 "形質転換細
胞" は初期の形質転換細胞及び、それからの由来株を含
めることとし、その継代数は考慮しないこととする。す
べての前駆細胞は、由来株あるいは変異によって、その
ＤＮＡの内容が全く同一であることはない。変異体であ
ってもオリジナルの形質転換株と機能的に同一であるも
のは同じ "形質転換株" にふくめることとする。

【００１２】"制御配列" とは、特定の宿主器官で、機
能的に結合したコーディング配列が発現するうえで必要
とされるＤＮＡ配列である。原核生物に必要な制御配列
としては、プロモーターあるいはオペレータ配列、リボ
ソーム結合サイト、またその他の配列が上げられる。真
核生物では、プロモーター、ポリアデニル化シグナル配
列、エンハンサー配列が使われることが知られてい
る。"発現系" とは、要求されるコーディング配列と制
御配列が機能的に結合したＤＮＡシーケンスで、このＤ
ＮＡシーケンスで形質転換された宿主細胞がそのコード
された蛋白を生産しうるようなＤＮＡシーケンスであ
る。形質転換を実現するためには発現系はベクター上に
組み込まれた形となるが、このＤＮＡシーケンスは宿主
細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる可能性もある。

【００１３】"遺伝子" とは生理活性を持つポリペプタ
イドあるいはその前駆体をコードするＤＮＡシーケンス
をさす。ポリペプタイドは、遺伝子の全長あるいはその
遺伝子のうち酵素活性を保ちうるような部分のＤＮＡシ
ーケンスからコードされる。

【００１４】"機能的に結合した" とは、コーディング
配列によってコードされた蛋白が発現するとき、制御配
列が機能するようにコーディング配列が配置されている
ことを意味する。すなわちあるコーディング配列が "機
能的に制御配列と結合している" こととは、コーディン
グ配列が制御配列の下で発現しうるような構成となって
いる状態を示す。

【００１５】"混合物" とは、Ｔthポリメレースを含ん
だ混合物を示し、Ｔthポリメレース及び他の蛋白を含む
集合体を示す。Ｔthポリメレースが組換宿主細胞由来で
あれば、他の蛋白とは、通常宿主に関連した蛋白質であ
る。宿主がバクテリアであれば、混ざっている蛋白と
は、もちろんバクテリアの蛋白である。

【００１６】"オリゴヌクレオタイド" とはここではデ
オキシリボ核酸あるいはリボ核酸が２ないしそれ以上つ
ながったものをさすが、現実には３以上、普通１０以上
の場合を指している。実際必要とされる長さは、多くの
要因に左右されるが、オリゴヌクレオタイド自身の機能
あるいはその利用法によって決定される。オリゴヌクレ
オタイドは合成あるいはクローニングで求めることがで
きる。

【００１７】"プライマー" とはここではオリゴヌクレ
オタイドを指し、制限酵素消化物の精製あるいは合成す
ることで得られる。プライマーはある塩基配列に相補的
なプライマー伸張産物が合成されるような条件で、その
合成の開始点として働く。このような条件とはすなわち
４種のヌクレオチドと耐熱性Ｔth酵素が、適切なバッフ
ァ（バッファには至適PH、至適イオン強度、補助因子等
が実現されている）、適切な反応温度にあることを指
す。Ｔthポリメレースの場合、バッファーには１−３mM
のマグネシウム塩、MgCl₂ 、５０−２００μＭ各ヌクレ
オチド、0.５−１μＭ各プライマー、５０mM KCl 、１
０mMトリスバッファー、PH８−8.４、そして１００μｇ
／mlのゼラチンからなる。（ゼラチンは必ずしも必要で
なく、またＤＮＡシーケンスなどの場合はむしろ必要と
しない。）

【００１８】プライマーは増幅反応では一本鎖の場合最
も有効だが、二本鎖である場合もある。二本鎖の場合、
伸張反応に先だって一本鎖に分ける処理が必要となる。
プライマーは通常オリゴヌクレオタイドである。プライ
マーはポリメレース酵素存在下で伸長物合成反応を開始
させうるに十分な長さをもっている必要がある。必要と
されるプライマーの長さは多くのファクターに左右され
るが、プライマーのソースあるいは要求される結果の内
容で決まる。プライマーがテンプレートとアニールする
ためにはプライマーの長さに依存しているため、それに
よって反応温度も調節する必要がある。ターゲットとな
るシーケンスは多様なためオリゴヌクレオチドプライマ
ーは通常１５−３５ヌクレオチド長にわたっている。短
いプライマー長の場合、テンプレートと安定なコンプレ
ックスを形成するためにはより低い温度条件が要求され
る。

【００１９】プライマーは、テンプレートのシーケンス
と "本質的には" 相補的となるように選ばれる。プライ
マーはプライマー伸張が起こるようにテンプレートとハ
イブリダイズするために十分にテンプレートと相補的で
ある必要がある。しかし完全な相補性をそなえている必
要はない。例えば、プライマーの残りの部分が十分テン
プレートに対して相補的であれば、プライマーの５′端
に非相補的な塩基断片が付加されても良い。またプライ
マーがテンプレートとハイブリダイズするのに十分な相
補性をそなえていてプライマーとテンプレートがコンプ
レックスを形成し、プライマーから伸張産物を合成する
のであれば、非相補的な塩基あるいはそれより長い配列
がプライマー内部に存在しても差しつかえない。

【００２０】"制限エンドヌクレアーゼ" あるいは "制
限酵素" とは二本鎖ＤＮＡの特定のシーケンス部あるい
はその近傍を特異的に切断するバクテリアの酵素であ
る。

【００２１】"耐熱性酵素" とは、熱に対して安定もし
くは熱に対して抵抗性をしめし、核酸配列に相補的なプ
ライマー伸長産物を（基質となる）ヌクレオチドを組み
合わせて合成する反応を触媒する酵素である。即ち、プ
ライマーの３′端よりプライマー伸長産物の合成を、テ
ンプレート鎖にそって５′端方向へ合成が停止するまで
すすめる反応である。

【００２２】本出願発明のＴth耐熱性酵素は、ポリメレ
ース連鎖反応として知られる増幅反応を有効に行なうの
に必要とされる条件を満たす酵素である。Ｔth酵素はＰ
ＣＲ反応でキーステップとなる、二本鎖核酸の熱変性に
十分な時間高温下にさらされても、酵素の不可逆的な変
性（あるいは失活）をおこさない。不可逆的な変性と
は、恒久にあるいは完全に酵素活性をうしなうことをさ
す。核酸を変性させるに必要な加熱条件はバッファの塩
濃度、変性される核酸の塩基構成、長さによるが、温度
は通常９０−１０５℃の間で、時間はその温度、核酸の
長さに依存し、数秒から４分位までの間となっている。
バッファの塩濃度および核酸内のＧＣ塩基成分が増すに
従って、より高い温度が必要となる。Ｔth酵素は９０−
１００℃の温度範囲内で比較的短時間さらされる限り、
不可逆的な変性は受けない。

【００２３】Ｔth耐熱性酵素はそれが機能する至適温度
は５０℃より上である。プライマーのテンプレートへの
ハイブリダイゼーションは５０℃以下でより促進され
る。しかし塩の成分、濃度、プライマーの塩基構成、長
さにもよるがプライマーのテンプレートへのハイブリダ
イゼーションはより高い温度でも進み（４５−７５
℃）、その結果プライマーの伸長反応の特異性は促進さ
れ、酵素の至適温度が高いほど、プライマー伸長反応の
特異性、選択性が上がる。Ｔth耐熱性酵素の酵素活性の
至適温度は５０−９０℃にわたっている。

【００２４】本出願では、Thermus thermophilus耐熱性
ＤＮＡポリメレースの全長をコードするＤＮＡ塩基配列
を提示した。このＤＮＡ塩基配列とこれより予想される
アミノ酸残基配列を以下に示す。便宜を図ってＴthポリ
メレースのアミノ酸配列の番号付けを行なってある。こ
れより別の形の耐熱性酵素のデザインを本来のシーケン
ス全長をもとにして行なった。

【００２５】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

【００２６】うえに示したＤＮＡ配列、アミノ酸配列お
よびこれらシーケンスをコードするＤＮＡ化合物が広い
宿主細胞にわたってＴth ＤＮＡポリメレース活性を発
現しうるような、組換発現ベクターの設計、構築をする
ために利用された。うえに示したＤＮＡ配列の全長ある
いはその一部分をコードするＤＮＡ化合物は他種の生物
より耐熱性ポリメレースをコードするＤＮＡの同定の目
的に使用されるし、アミノ酸配列は耐熱性ポリメレース
を同定し精製するときに使われる抗体をつくるための抗
原として利用される。

【００２７】うえのアミノ酸配列をコードする組換ベク
ターあるいは本来のThermus thermophilus細胞から用意
するにしても、Ｔth ＤＮＡポリメレースを組換ＤＮＡ
技術に応用するためにはまずＴth ＤＮＡポリメレース
を精製しなければならない。本発明ではこの精製方法に
ついて提示する。生の蛋白を回収するために、細胞はそ
れに適した方法で増殖させた。簡単に述べれば細胞を以
下の組性の１リッターの培地中で繁殖させた。ニトリロ
トリアセティクアシッド（１００mg）、トリプトン（３
ｇ）、イースト抽出物（３ｇ）、コハク酸（５ｇ）、亜
硫酸ナトリウム（５０mg）、リボフラビン（１mg）、K₂
HPO₄（５２２mg）、MgSO₄ （４８０mg）、CaCl₂ （２２
２mg）、NaCl（２０mg）、および他の微量元素。培地の
pHはKOHで8.０±0.２に調製した。７０℃で激しく振と
うして培養した場合１リッターあたり２０ｇ以上の細胞
が得られた。後期対数増殖期（５５０nmの吸光度で判
定）の細胞を集めてバッファーであらい−２０℃で保存
した。

【００２８】細胞増殖の他の方法としては、ミネラル濃
度を定めた0.３％グルタミン、0.１mg／１ビオチン、0.
１mg／１チアミン入り培地を用いる方法がある。この塩
にはニトリロトリアセティクアシッド、CaSO₄ 、MgS
O₄ 、NaCl、KNO₃、NaNO₃ 、ZnSO ₄ 、H₃BO₄ 、CuSO₄ 、N
aMoO₄、CoCl₂ 、FeCl₃ 、MnSO₄ とNa₂HPO₄ である。培
地のpHはNaOHで8.０に調製した。細胞は最初７５℃の温
浴ちゅうで振とうしながら培養した。一定の細胞濃度に
達したとき、１４Ｌのファーメンターに移す。滅菌空気
を吹き込んで７５℃でさらに培養を続けた。８時間後遠
心して回収した。

【００２９】細胞培養後、酵素の分離精製を６段階のス
テップで行なった、これらのステップは、室温より低い
温度、実際は４℃付近でおこなわれるのが望ましい。最
初に、細胞は、凍結されている場合は、溶解後、Aminco
French pressure cell（１８，０００psi ）つぶした
のちpH7.５のバッファーにサスペンドし遠心した。つぎ
に上清を回収し、乾燥硫安のような塩と核酸をのぞくた
めにポリミンＰを加えて画分化した。沈殿物（0.２Ｍ濃
度硫安）は廃棄した。

【００３０】第２ステップで得られた上清は続いて、0.
２Ｍ（NH₄)₂SO₄ ５０mM Tris−HCl 、pH7.５、0.５mM
ＤＴＴを含むバッファーで平衡化したフェニールセフ
ァロースカラムにかけた。つぎにカラムをバッファー
１：0.5 mM ＤＴＴ、0.２Ｍ（NH₄)₂SO₄を含むＴＥバッ
ファー、で洗いさらにバッファー２：0.５mM ＤＴＴを
含むＴＥバッファー、で洗いさらにバッファー３：２０
％エチレングリコールを含むバッファー２で洗った。最
後に蛋白をバッファー４：２Ｍ尿素を含むバッファー３
で流出させた。

【００３１】第４ステップでは、第３ステップで得られ
た流出回収物を0.１５Ｍ KCl で平衡化したヘパリンセ
ファロースカラムにかけた。カラムは同じバッファーで
洗ったのち、蛋白を0.１５Ｍから0.７５Ｍ KCl の線形
濃度勾配バッファーを用いて流出させた。活性を示すピ
ークは0.３１Ｍから0.３５５Ｍ KCl のあいだにあっ
た。

【００３２】第５ステップでは、前ステップの流出画分
を集め、アフィゲルブルーバッファーで濾過透析を行な
った。沈殿物は遠心によって取り除き、上清を0.１Ｍ K
Clで平衡化したアフィゲルブルーカラムにかけた。カラ
ムを0.１Ｍ KCl で洗ったのち0.１−0.５Ｍ KCl 線形
勾配のバッファーで酵素の流出を行なった。この画分に
は耐熱性酵素活性があり、ＤＮＡse（エンドヌクレアー
ゼ、エキソヌクレアーゼ）の混入を適当な方法を用いて
調べた。即ち、エンドヌクレアーゼ活性はλＤＮＡ あ
るいはスーパーコイルプラスミドＤＮＡと過剰量のＤＮ
Ａポリメレースをミックスしてインキュベート後、その
分子量の変化を電気泳動で確かめた。同様に、エキソヌ
クレアーゼ活性は予め制限酵素で数箇所切断したＤＮＡ
を基質としてその分子量の変化を調べた。この画分に
はＤＮＡse活性がないことが確かめられ、（ポリメレー
ス活性のピークは0.２８Ｍ−0.４５５Ｍ KCl にあっ
た）この画分を回収しＣＭ−トリスアクリルバッファー
中で透析した。沈殿物は遠心によって取り除いた。

【００３３】第６ステップで上清を５０mM NaClで平衡
化したＣＭ−トリスアクリルカラムにかけた。カラムを
５０mM NaClで洗ったのち、酵素を0.０５−0.４Ｍ
NaCl線形勾配のバッファーで流出させた。ポリメレース
活性をもちＤＮＡse活性を持たない画分が0.１６−0.２
０Ｍ NaClの部分に流出されてきた。

【００３４】透析を行なったのち蛋白分子量マーカーを
使ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ法などで分子量の解析を行なっ
た。Thermus thermophilus由来のＤＮＡポリメレースの
分子量は上の方法などで約９４KDa と決定された。同じ
ＤＮＡポリメレースの予想されるアミノ酸配列より計算
された分子量は、おおよそ９4,０１６ダルトンであっ
た。

【００３５】Ｔth ＤＮＡポリメレース生蛋白の精製プ
ロトコルの詳細は例１に示した。本発明中の組換Ｔthポ
リメレースの精製も同様の方法で行なわれた。

【００３６】本発明における重要な点は組換Ｔthポリメ
レースを作ることにある。前に述べたように、この酵素
をコードする遺伝子をThermus thermophilus遺伝子ＤＮ
Ａよりクローニングを行なった。2.５Kb長のＴthポリメ
レースの完全なコーディングシーケンスはｐＢＳＭ：Tt
h １０の3.７Kb ＨＩnd III−ＢstＥII制限酵素断片中
より容易に得られたが、この3.７Kb断片内部にはＨＩnd
IIIの認識サイトが含まれていた。このプラスミドは宿
主細胞大腸菌E. coli Ｋ12株ＤＧ１０１に感染させたか
たちで登録番号６８１９５として１９８９年、１２月２
１日AmericannType Culture Collection ( ＡＴＣＣ）
に預け入れた。

【００３７】この耐熱性Ｔthポリメレース酵素をコード
する遺伝子の完全なコーディングシーケンスとアミノ酸
シーケンスを前に述べた。しかし、ＤＮＡポリメレース
としての生理活性をたもった遺伝子産物を得るために
は、Ｔthポリメレース酵素をコードする遺伝子全部が必
要であるわけではない。Ｔthポリメレース酵素をコード
する遺伝子シーケンスを使って、ＤＮＡポリメレース活
性をもつ変異蛋白をつくるようにコーディングシーケン
スに修飾を加えることも可能となる。３分の１以上のア
ミノ末端の蛋白を欠失させても残りの部分にポリメレー
ス活性を持つとされていて、実際アミノ末端より１０分
の１の欠失させてつくった組換蛋白はポリメレース活性
を保っていた。このようにアミノ末端を欠失させたポリ
メレース活性を保っていることより、これらのポリメレ
ースを発現する遺伝子構築物としてコーディングシーケ
ンスを短縮した形のものも含められる。

【００３８】Ｎ末端の欠失に加え、Ｔthポリメレースの
ペプチドチェーンの個々のアミノ酸残基に、酸化還元そ
の他の修飾によって蛋白が切断されるが、活性を保持し
た断片も得られる。活性を失わないような修飾は、Ｔth
ポリメレース活性を有する蛋白という定義から外れず、
したがって、これらの修飾も本出願発明に含まれるとい
える。その蛋白の高温度でのＤＮＡポリメレース活性を
失わない様にＴthポリメレース遺伝子の一次構造を欠
失、付加あるいは翻訳時に取り込まれるアミノ酸がかわ
るように変更を加えることが可能である。ＤＮＡにコー
ドされるアミノ酸配列をもつ蛋白の産生の結果生じるこ
れらの置換あるいは他の修飾も本発明に含まれるものと
思われる。また、Ｔthポリメレース遺伝子の、クローニ
ングされた遺伝子配列あるいは、相同な合成された配列
はＴth ＤＮＡポリメレース活性をもつ融合蛋白を発現
させるために利用されたり、本来のＴth ＤＮＡポリメ
レースとアミノ酸配列が完全に一致した蛋白を発現させ
るために利用することもできる。さらに、この発現の制
御も、Ｔth ＤＮＡポリメレース遺伝子の制御シーケン
スによるか、宿主内で機能するような制御シーケンスに
よるかを選択することも可能である。

【００３９】本発明では、多くの種の宿主細胞で利用可
能な発現ベクターの構築およびそのコーディングシーケ
ンスの発現をさせるためのＴth ＤＮＡポリメレース遺
伝子の完全なシーケンスを提示した。Ｔth ＤＮＡポリ
メレース遺伝子の一部分も種々の生物種より耐熱性ポリ
メレースをコードしているシーケンスを取り出すための
プローブとして、有用である。即ち、少なくとも、４−
６個のアミノ酸をコードしている遺伝子ＤＮＡの一部分
は大腸菌E.coliのなかで複製できて、それを変性させて
プローブとして使うことも可能であるし、少なくとも４
−６個のアミノ酸をコードするオリゴデオキシヌクレオ
チドプローブを化学合成して、耐熱性ポリメレースをコ
ードしているほかのＤＮＡシーケンスを得ることも可能
である。Thermus thermophilusの耐熱性ポリメレース遺
伝子と他の種の相当する遺伝子の核酸配列は完全に一致
していることはおそらくありえないので、約１２−１８
塩基からなるオリゴマー（４−６個のアミノ酸をコー
ド）を、十分なストリンジェンシーの条件で使えば、偽
陽性のないハイブリダイゼーションを行なうことが可能
であろう。６個のアミノ酸をコードする配列があれば、
プローブ（を設計するため）の十分な情報が得られる。

【００４０】本発明では、Ｔth ＤＮＡポリメレースの
コーディング配列とアミノ酸配列を提示し、他の種の耐
熱性ポリメレース酵素を分離しそのコーディング配列を
同定することを可能にする。ＴaqおよびＴth ＤＮＡポ
リメレース遺伝子のコーディングシーケンスは非常に類
似していて、この類似性によってＴth ＤＮＡポリメレ
ース遺伝子を同定、分離することが容易になった。しか
しながら、ＴaqおよびＴth ＤＮＡポリメレース遺伝子
のコーディングシーケンスの間で類似性のない部分も、
プローブとして、Ｔaqポリメレースとは全く異なるが、
Ｔth ＤＮＡポリメレースとは相同性を示すような他の
種の耐熱性ポリメレースを同定する目的に使える。

【００４１】ＴaqおよびＴth ＤＮＡポリメレース遺伝
子の間の異なっている領域がいくつかある。これらの領
域はシーケンスコドンの２２５−２３０；２３８−２４
６；２４１−２４９；３３５−３４３；３３６−３４
４；３３７−３４５；３３８−３４６；３３９−３４７
の部分にある。９コドン長を持っているような領域に対
しては、これらの領域に対応するプローブは、そのプロ
ーブと連続して最低５個のコドンが一致（あるいはそれ
に相補的な）するような耐熱性ポリメレースをコードす
るＤＮＡシーケンスを同定、あるいは分離に用いること
が可能であろう。６コドン長を持っているような領域に
対しては、これらの領域に対応するプローブは、そのプ
ローブと連続して最低４個のコドンが一致（あるいはそ
れに相補的な）するような耐熱性ポリメレースをコード
するＤＮＡシーケンスを同定、あるいは分離に用いるこ
とが可能であろう。

【００４２】このような耐熱性ポリメレースをコードす
るＤＮＡ配列はその相同性が保たれているかぎり分離す
る種は、Thermus thermophilus種由来である必要はな
く、さらにThermus 属である必要もない。

【００４３】本来のＴth ＤＮＡポリメレース酵素、あ
るいはその酵素の誘導体、相同体いずれかを生産するに
しても、Ｔth ＤＮＡポリメレースの組換え、すなわち
発現ベクターを構築し、宿主細胞をそのベクターで形質
転換し、発現がおこるような条件でその形質転換した宿
主を培養するといった操作を行なうことになる。発現ベ
クターを構築するには、マチュアーな蛋白をコードして
いるＤＮＡシーケンスあるいは活性を失わないようなシ
ーケンスがＴth ＤＮＡポリメレースに加わった融合Ｄ
ＮＡシーケンスあるいは適当な条件で切断されて（ペプ
チダーゼ処理など）活性を生じさせるようなシーケンス
が付け加わったＤＮＡシーケンスを得る必要がある。こ
のコーディングシーケンスを、発現ベクター内で適当な
制御配列と機能的にリンクした形となるように配置す
る。またベクターは、宿主細胞内で、自律的に複製した
り、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるようにデザ
インすることもできる。ベクターは、そのベクター系に
適切な宿主を形質転換するために用い、形質転換体は組
換Ｔth ＤＮＡポリメレースが発現するように適当な条
件で培養される。Ｔth ＤＮＡポリメレースは培地中あ
るいは細胞自身から分離する、しかし蛋白の回収および
精製は、いくらかの不純物が含まれても構わないような
場合は、必ずしも必要でない。

【００４４】これから述べるそれぞれのステップには様
々な方法で行なわれる。例えば、必要とするコーディン
グシーケンスは遺伝子ＤＮＡより取り出して直接に適当
な宿主内に導入して使う場合もありうる。様々な種の宿
主内で機能するような発現ベクターを構築するには、後
に概略で述べるような、適切なレプリコンおよび制御配
列を使う。目的とするコーディング配列と制御配列をも
つベクターを構築するためには技術界で良くしられた標
準的なテクニックであるライゲーションと制限酵素切断
によって行なう。分離したプラスミド、ＤＮＡ、合成オ
リゴヌクレオチドは切断され、修飾され目的の形に再び
連結される。発現ベクターの構築を容易におこなうため
に、適当な制限酵素認識サイトを、常に可能な訳ではな
いが、コーディングシーケンスの末端に付け加えること
も、のちに例示するように可能である。

【００４５】特定のサイトでＤＮＡを切断することは、
適当な制限酵素で適当な条件で反応を行なってなされ、
この条件は技術界で一般にしられている方法かあるいは
使用する制限酵素の供給先の推奨する方法にしたがって
行なう。New England Biolabs 社の製品カタログを見て
いただきたい。一般には、約１μｇのプラスミドあるい
はＤＮＡは２０μｌの反応液中で１ユニット量の制限酵
素で切断されるが、後に示すように完全にＤＮＡを切断
するためには、より過剰量の酵素が使われる。反応イン
キュベートの時間は普通３７℃で１−２時間であるが、
場合により変わることもありうる。反応終了後、蛋白
（酵素）はフェノール、クロロホルム抽出により取り除
かれ、この抽出物は続いてエーテルで抽出され、水相中
のＤＮＡはエタノール沈殿操作によって回収される。も
し必要ならば、切断断片の大きさによる分離が、標準的
なポリアクリルアミドゲルあるいはアガロースゲル電気
泳動法によって行なわれる。これについては、Methods
in Enzymology １９８０年、６５巻、４９９−５６０ペ
ージを参照されたい。

【００４６】一本鎖突出末端を持った制限酵素切断断片
は、４種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）
存在下で、大腸菌E. coli ＤＮＡポリメレースＩラージ
フラグメント（クレノーフラグメント）を使って、５０
mM Ｔris-HCl pH7.６、５０mM NaCl、１０mM MgC
l₂ 、１０mMＤＴＴ、５−１０μＭ ｄＮＴＰの組性の
反応液で１５−２５分２０−２５℃インキュベートし
て、平滑末端（二本鎖末端）に変えることができる。ク
レノー酵素は４種のｄＮＴＰ存在下でも、５′突出末端
は埋めて、３′突出末端は削る性質がある。したがっ
て、突出末端の性質により制限はあるが、ｄＮＴＰのう
ちただひとつあるいは（２−３種）選んで使うことによ
って、修復を選択的に行なうことができる。クレノー酵
素処理の後、反応液はフェノール／クロロホルム抽出を
行ない、エタノール沈殿する。Ｓｌヌクレースで適当な
条件で処理すると核酸の一本鎖の部分が加水分解されて
切断されるので、同様の結果がＳｌヌクレースを使って
も行なえる。

【００４７】合成オリゴヌクレオタイドは１９８１年の
J. Am.Chem. Soc.１０３巻３１８５−３１９１ページに
記載されているMatteuchi らのトリエステル法か、自動
合成法によって作ることが可能である。アニーリングに
先だって、あるいは標識の目的で一本鎖核酸のリン酸化
を行なうには過剰量即ち約１０ユニットのポリヌクレオ
タイドキナーゼと0.５μＭの基質ＤＮＡを５０mM Ｔri
s −HCl 、pH7.６、１０mM MgCl₂ 、５mM ＤＴＴ、１
−２μＭ ＡＴＰの組性の反応液インキュベートする。
もし標識を目的としたリン酸化であれば、ＡＴＰは高比
活性のγ−³²Ｐを含んでいるものを使用する。

【００４８】ライゲーションは１５−３０μｌ容積中で
以下の標準的な条件と温度で行なう：２０mM Ｔris −
HCl pH7.５、１０mM MgCl₂ 、１０mM ＤＴＴ、３３μ
ｇ／ml ＢＳＡ、１０−５０mM NaClと、一本鎖末端が
互いに相補的である場合は４０μＭ ＡＴＰ、0.０１−
0.02(weiss) ユニットＴ４ＤＮＡライゲースを０℃で、
平滑末端の場合は１mM ＡＴＰ、0.３−0.６（weiss ）
ユニットＴＤ４ＮＡライゲースを１４℃で行なう。相補
末端を持つ断片での分子間ライゲーションには３３−１
００μｇ／mlＤＮＡ濃度（５−１００nM末端濃度）、平
滑末端の分子間ライゲーションには（普通１０−３０倍
リンカーの分子数が過剰となるように）１μＭ末端濃度
で行なう。

【００４９】ベクターの構築にあたっては、ベクター断
片は普通バクテリア由来あるいは牛小腸由来のアルカリ
フォスファターゼ（ＢＡＰ、ＣＩＡＰ）で、ベクター自
身の再凍結を防ぐために５′端の脱リン酸化を行なう。
ＢＡＰおよびＣＩＡＰ消化の条件は技術界でよくしられ
ているが、入手できるＢＡＰ、ＣＩＡＰ酵素にプロトコ
ルが付属してくる。核酸断片を回収するにはフェノール
クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿を行なって、ア
ルカリフォスファターゼを取り除きＤＮＡを精製する。
そのほかに再凍結を防ぐ方法として、必要とするベクタ
ーのライゲーション反応の前後に、不要なベクター断片
の制限酵素消化を行なう方法もある。

【００５０】ベクターあるいはコーディングシーケンス
の部分で塩基配列の修飾が必要な部分に対しては、種々
のサイト特異的なプライマーによる変異導入法（site-s
pecific primer-directed mutagenesis ）が利用でき
る。ポリメレース連鎖反応法（ＰＣＲ法）はサイト特異
的変異導入にも応用される。技術界で標準となっている
ほかのテクニックとして、必要とする変異をコードした
合成オリゴヌクレオタイドをプライマーとして、ｐＢＳ
１３＋のような一本鎖ＤＮＡベクターを鋳型として、変
異プライマーからの伸長産物を構築する方法がある。変
異ＤＮＡは宿主バクテリアに形質導入され、形質転換し
たバクテリアを培養し、プレートにまいて同定を行な
う。修飾したベクターを同定するためには、選択された
形質転換体からのＤＮＡをニトロセルロースフィルター
あるいは他のメンブランに移し、その"リフト" をリン
酸化した合成プライマーを使って修飾したシーケンスと
は完全に一致してハイブリダイズし、もとのシーケンス
の配列とはハイブリダイズしないような温度条件でハイ
ブリダイゼーション反応を行なう。プローブとハイブリ
ダイズするシーケンスを含む形質転換体を培養し、修飾
ＤＮＡのリザーバーとする。

【００５１】以下で述べる構築について、プラスミドの
構築が正しく行なわれたかについては、最初にライゲー
ション反応液で大腸菌E. coli ＤＧ１０１株あるいは他
の適当な宿主の形質転換を行なうことによって確認され
る。形質転換されたものは、プラスミドの構築の様式に
よるが、アンピシリン、テトラサイクリン、あるいはそ
の他の抗生物質に対する抵抗性感受性あるいは他の選択
マーカーで選択され、これは技術界で良くしられている
ことである。次に形質転換体からのプラスミドの調製は
１９６９年 Proc. Natl. Acad. Sci. USA６２巻、１１
５９ページのClewell の方法に従い、場合により、クロ
ラムフェニコールによる増幅を加える(Clewell、１９７
２年、J. Bacteriol. １１０巻、６６７）。プラスミド
ＤＮＡを得る他の方法はBethesda Research Laboratori
esで出版しているFocus 第５巻、２号の１１ページに報
告されている“Base-Acid ”抽出法で、このステップ１
２から１７をセシウムクロライド／エチジウムブロマイ
ドＤＮＡ超遠心法に置き換えると非常に純度の高いプラ
スミドＤＮＡが得られる。分離されたＤＮＡは制限酵素
消化あるいはシーケンスを行なって解析される、ここで
シーケンスは、Sangerらによる１９７７年、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA７４巻、５４６３記載のダイデオキ
シ法、より詳細には１９８１年Nucl. Acids. Res. ９巻
３０９、あるいは１９８０年Methods. in Enzymology６
５巻４９９のマキサム法などで行なう。

【００５２】制御配列、発現ベクター、形質転換法は遺
伝子を発現させるために使用する宿主細胞の種類に依存
する。一般に原核細胞、酵母、昆虫あるいは哺乳類の細
胞が宿主として用いられる。原核生物の宿主が一般に、
組換蛋白の産生に最も有効で便利であり、The ポリメレ
ースの発現の目的で好んで用いられた。

【００５３】組換蛋白の発現のためにもっとも多く使わ
れる原核生物種は大腸菌 E. Coliである。クローニン
グ、シーケンスさらに多くのバクテリアのプロモータの
制御の下で発現するベクターの構築のために、大腸菌
E. Coli Ｋ１２株ＭＭ２９４、（請求番号）ＧＣＳＣ
＃６１３５で大腸菌 Genetic Stock Center より入手可
能、を宿主体として使用する。Ｐ_L Ｎ_RBS 制御配列を持
つ発現ベクターを使う場合は大腸菌 E. Coli Ｋ１２株
ＭＣ１０００ラムダラインジェン、N₇N₅₃cI ８５７SusP
８０, ＡＴＣＣ３９５３１，を宿主として使用する。大
腸菌 E. Coli ＤＧ１１６株はＡＴＣＣよりＡＴＣＣ５
３６０６として１９８７年４月７日より供給されてい
て、大腸菌 E. Coli ＫＢ２株もＡＴＣＣよりＡＴＣＣ
５３０７５として１９８５年３月２９日より供給されて
いてどちらも宿主細胞として利用できる。Ｍ１３ファー
ジ組換体には、大腸菌 E. Coli Ｋ１２株ＤＧ１８のよ
うなファージ感染を受ける株を使用する。ＤＧ１８株は
ＡＴＣＣよりＡＴＣＣ３９７６８として１９８４年６月
１３日より供給されている。

【００５４】しかしながら、大腸菌以外の微生物株も使
用されていて、たとえばバチルス属のBacillus subtili
s や、種々のPseudomonas 属、その他の微生物株が組換
Tthポリメレース発現のために使用されている。このよ
うな原核生物の系では、複製サイトや制御配列は宿主由
来のものあるいは宿主と互換性のある種由来のものを含
むプラスミドベクターを使うのが普通である。

【００５５】例えば、大腸菌 E. Coliは、Bolivar らに
よる１９７７年Gene２巻９５ページに記載されている方
法によって、普通プラスミドｐＢＲ３２２の誘導体を使
って形質転換される。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピ
シリンとテトラサイクリン耐性遺伝子を持っている。こ
れらの薬剤耐性マーカーは目的のベクターを構築する際
に保存したままあるいは破壊することによって目的の組
換体の存在をしることができる。普通使われる原核生物
の制御配列は、転写開始のプロモーターで、場合によっ
てオペレータも付随し、リボソーム結合サイトが続き、
ベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース
（lac)プロモーターシステム(Changら１９７７年Nature
１９８巻１０５６ページ）、トリプトファン（trp)プロ
モータシステム(Goeddelら、１９８０年Nuc. Acids Re
s. ８巻４０５７ページ）、λ由来Ｐ_L プロモータシス
テム(Shimatakeら１９８１年Nature２９２巻１２８ペー
ジ）、Ｎ遺伝子リボソーム結合サイト（Ｎ_RBS ）が含ま
れる。ポータブルな制御配列のカセットが米国特許第4,
７１1,８４５号で１９８７年１２月８日付けで発表され
ている。このカセットはＰ_L プロモータシステムがＮ
_RBS と機能的に連結して、その下流に第３のＤＮＡシー
ケンスでＮ_RBS ３′端より６ＢＰ以内の位置で切断され
るような制限酵素認識サイトをもつものが配置されてい
る。欧州特許公報第１９6,８６４号１９８６年１０月８
日出版にChabg らが記載しているフォスファターゼＡ
（phoA) システムも有用である。しかしながら原核生物
に互換性をもつプロモータシステムであればどれでもTt
h 発現ベクターの構築に使えるだろう。

【００５６】バクテリアに加えて、酵母のような微小な
真核生物も組換宿主細胞として使える。多くの種類の株
が利用できるが、実験系の株Saccharomyces cerevisia
e、パン酵母が最も多く使われている。２μｍ複製開始
点をもつ、ベクターが最も普通に使用されるが(Broch、
１９８３年 Meth.Enz. １０１巻３０７ページ）、酵母
で発現させるに適した他のプラスミドベクターもしられ
ている（Stincombら、１９７９年Nature２８２巻３９ペ
ージ、Tschempeら、１９８０年Gene１０巻１５７ペー
ジ、Clarkeら、１９８３年Neth. Enz.１０１巻、３００
ページなどを参考されたい。）

【００５７】酵母ベクターの制御配列には糖分解酵素の
合成を制御するプロモータが含まれている（Hessら、１
９６８年 J. Adv.Enzyme Reg.７巻、１４９ページ、Ho
lland ら、１９７８年Biotechnology １７巻、４９００
ページ）。その他の技術界でしられたプロモーターとし
ては、３−phosphoglycerate kinase のプロモータ(Hit
zemaら、１９８０年、J.Biol.Chem.２５５巻、２０７３
ページ）や他の糖分解酵素すなわち、glyceraldehyde-3
-phosphatedehydrogenase,hexokinase,pyruvate decarb
oxylase, phosphofructokinase,glucose-6-phosphate
isoerase,3-phosphoglycerate mutase,pyryvaate kinas
e,triose-phosphate isomerase, phosphoglucose isome
rase,glu-kokinase などのプロモータ配列がある。培養
の条件で転写を制御できる利点をそなえている他のプロ
モーターとして、alchol dehydrogenase 2 , isocytoch
rome C , acid phosphatase、窒素代謝と関係した分解
酵素、マルトース、ガラクトースの利用に関係した酵素
のプロモーターがある。(Holland,supra)

【００５８】転写終了配列（ターミネータ配列）もコー
ディング配列の３′端に配置されたとき発現を増強させ
る作用を利用される。このようなターミネーターは、酵
母由来の遺伝子でコーディング配列の３′側の非翻訳領
域に見いだされる。多くのベクターでは、プラスミドpe
no４６（Holland ら、１９８１年、J.Biol.Chem.２５６
巻、１３８ページ）のエノラーゼ遺伝子由来の制御配列
や、ＹＥｐ１３(Broach ら、１９７８年 Gene８巻、１
２１ページのＬＥＵ２遺伝子を含んでいるが、しかしな
がら酵母に互換性をもつプロモータシステム、複製開始
点、その他の制御配列が酵母に互換性をもつものであれ
ばどれでもTth 発現ベクターの構築に使えるだろう。

【００５９】Tth 遺伝子はまた多細胞系の真核細胞を宿
主として発現させることも可能である。このような例と
して、CruzとPatterson 編集のAcademic出版社のTissue
Culture（１９７３年）を参考にされたい。有用な宿主
細胞株として、ＣＯＳ−７、ＣＯＳ−Ａ２、ＣＶ−１、
齧歯類の細胞としてマウス骨髄腫細胞Ｎ５１，ＶＥＲ
Ｏ，ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞
（ＣＨＯ）などがある。このような細胞にたいする発現
ベクターには普通哺乳類細胞に共通なプロモーターと制
御配列が含まれていて、例えばシミアンウィルス４０
（ＳＶ４０）のアーリープロモータ（Fiers ら、１９７
８年Nature、２７３巻、１１３ページ）、レイトプロモ
ータ、あるいは他のウィルス由来のプロモータすなわち
ポリオーマ、アデノウィルス２型、牛パピローマウィル
ス（ＢＰＶ）、トリ肉腫ウィルスなど、また免疫グロブ
リンのプロモータや熱ショックプロモータが使われる。

【００６０】ＢＰＶプロモータを使った哺乳類細胞中で
ＤＮＡを発現させる系については、米国特許第4,４１9,
４４６号に発表されている。またこの系の修飾を加えた
ものについても、米国特許第4,６０1,９７８号に発表さ
れている。哺乳類細胞系での形質転換に関する概論は米
国特許第4,３９9,２１６号にAxelが発表している。“エ
ンハンサ ー”の領域もまた発現を最適化するものとし
て重要であり；これは普通プロモーターの上流に位置し
ている。もし必要であれば、ウィルスより複製開始点を
得ることも可能である。しかしながら、真核細胞ではＤ
ＮＡの複製機構としては染色体へ組み込まれて行なわれ
ることが普通である。

【００６１】植物細胞も宿主細胞として利用可能であ
り、植物細胞で共通な制御配列すなわちノパリン合成酵
素のプロモータやポリアデニル化シグナル配列(Depicke
r ら、１９８２年、J.Mol.Appl.Gen. １巻、５６１ペー
ジ）が使われる。バキュロウィルスベクターの制御配列
を使用した昆虫細胞での発現系についても報告されてい
る（Millerら、Plenum出版社、Stelowら編集Genetic En
gineering ８巻、２７７−２９７ページ）。昆虫細胞を
ベースにした発現系はSpodoptera frugipeida を用いて
行なわれている。これらの系でも組換Tth ポリメレース
の産生に成功している。

【００６２】使う宿主細胞によるが、形質転換はその宿
主に適した標準的な方法で行なわれる。Cohen らによる
１９７２年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA６９巻２１１０ペ
ージに記載されている、塩化カルシウムによるカルシウ
ム処理法が、原核生物その他の細胞膜をもっている細胞
に対して行なわれる。ある種の植物細胞に対しては Agr
obacterium tumefaciens(Shawら、１９８３年、Gene、
２３巻、３１５ページ）を用いた感染法も行なわれてい
る。哺乳類細胞に対しては、Grahamとvan derEbによ
る、１９７８年Virology、５２巻５４６ページのリン酸
カルシウム沈殿法が好んで用いられている。酵母での形
質転換は、Van Solingenらの、１９７７年J.Bact. 、１
３０巻９４６ページとHsiao らの、１９７９年Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA、７６巻３８２９ページ、の方法に従っ
て行なわれる。

【００６３】宿主細胞内でのTth ポリメレース遺伝子が
発現できるようになると、その蛋白の精製が必要にな
る。前述した精製方法により組換耐熱性ポリメレースの
精製を行なえるが、疎水結合性クロマトグラフィによる
精製が望ましい。疎水結合性クロマトグラフィは、疎水
性のグループを含んだ電荷をもたないカラムベッド材を
使用して、疎水結合力の差に基づいて物質を分離する方
法である。普通、カラムは最初疎水結合がおきるような
条件すなわち高イオン強度の条件で平衡化される。塩濃
度を下降させることによってサンプルの流出を行なう。

【００６４】本発明では、水性の混合物( 元々の、ある
いは組換たTtＤＮＡ ポリメレースを含んでいる) を、
フェニールセファロース（ファルマシア社より購入）や
フェニールＴＳＫ（東洋ソーダ社より購入）などの比較
的疎水性の強いゲルをつめたカラムにのせる。フェニー
ルセファロースカラムとの疎水結合を促進するために、
0.２Ｍ以上（0.２Ｍが望ましいが）の硫安を含む溶媒を
使用する。カラムとサンプルを、１mM ＤＴＴを含む５
０mM Tris-HCl,pH7.５、１mM ＥＤＴＡバッファー（Ｔ
Ｅバッファー）中で0.２Ｍ硫安濃度に調節し、サンプル
をカラムにかける。次にカラムを0.２Ｍ硫安バッファー
で洗う。次に、疎水結合を弱めるような溶媒系即ち、塩
濃度を下降させたり、エチレン、プロピレングリコー
ル、尿素などで洗いだすことで酵素が流出されてくる。
組換TtＤＮＡ ポリメレースに対しては、カラムをTris
-EDTA バッファーと２０％エチレングリコール入りTris
-EDTA バッファーで連続して洗うのが望ましい。TtＤＮ
Ａ ポリメレースは続いて、カラムを０−４Ｍ濃度勾配
のTris-EDTA エチレングリコールバッファーで流出され
てくる。

【００６５】長期間にわたって安定させるためには、Tt
ＤＮＡ ポリメレースを一種ないしそれ以上の非イオン
性ポリマー性の変性剤の入ったバッファー内に保存す
る。このような変性剤としては分子量が１００から２５
0,０００ダルトン位、好ましくは4,０００から２０0,０
００ダルトンくらいでpHが3.５から9.５、好ましくは４
から8.５くらいで酵素を安定化させるものが一般に使わ
れている。このような変性剤は１９８３年ＭＣ出版社
（１７５Rock Road,Glen Rock,NJ(USA)McCutheon部門）
より出版されたMcCut-heon's Emulsifiers & deterge
nts 北米版の２９５−２９８ページに特集が組まれてい
る、ここにすべて参考書類として付属してある。変性剤
は以下のようなグループから選ぶのが良い、エトキシ化
脂肪酸アルコールエーテル、ラウリルエーテル、エトキ
シ化アルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエト
キシエタノール複合物、オキシエチル化直鎖アルコール
あるいはオキシプロピル化直鎖アルコール、ポリエチレ
ングリコールモノオレート複合物、ポリソルベート複合
物、フェノリック脂肪酸アルコールエーテルなど。さら
に推奨するものとして、Tween ２０、ポリオキシエチル
化（２０) ソルビタンモノラウリエート(ICI Americas
社、Wilmington,D.E.)とＮＰ４０、エトキシル化アルキ
ルフェノール（ノニル）(BASF Wyandotte 社 Parsippan
y, NJ ) がある。

【００６６】本発明のTtＤＮＡ ポリメレースは、この
酵素の活性が必要あるいは望まれるような目的にたいし
て使用することが可能である。特にこの酵素はＰＣＲと
して良く知られている核酸の増幅反応を触媒する。この
核酸のシーケンスを増幅させるプロセスは米国特許第4,
６８3,２０２号、１９８７年７月２８日付けに、発表請
求がされていて、これは参考として付随してある。ＰＣ
Ｒ核酸増幅法は、核酸あるいは核酸の混合物中の少なく
とも一種以上の核酸配列を増幅して二本鎖ＤＮＡを作り
出す方法である。わかりやすくするために、以下で述べ
るプロトコルでは、増幅される特定のシーケンスとは二
本鎖核酸であるとする。しかしながら、この方法は、ｍ
ＲＮＡのような一本鎖核酸を増幅するにも同様に有効な
方法である、ただ最終的な産物は二本鎖ＤＮＡである
が。一本鎖核酸の増幅では、最初のステップはその相補
鎖の合成で（２つの増幅用プライマーのうちの１つがこ
の目的で使われる）、続いていかに述べる二本鎖核酸の
増幅過程が連続して行なわれる。

【００６７】この増幅の過程は以下のステップから構成
される； (a) 各々の核酸鎖と、４種のヌクレオシド３リン酸と、
各々の核酸鎖の特定の増幅させるシーケンスに対するオ
リゴヌクレオチドプライマーとを接触させる過程で、こ
こでそれぞれのプライマーは特定のシーケンスに対して
十分相補性をもっていて、プライマーより伸長産物が合
成され、伸長産物がその相補鎖より離れると、次に別の
プライマーからの伸長産物合成の鋳型となり、ここで接
触とは各々のプライマーとそれの相補鎖がハイブリダイ
ゼーションを行ないえるような温度であって、 (b) 各々の核酸鎖とThermus thermophilus由来のＤＮＡ
ポリメレースとを、同時にあるいはステップ(a) のあと
で、接触させ各々の核酸鎖の特定のシーケンスに相補的
なプライマー伸長産物を４種のヌクレオシド３リン酸の
組み合わせで産生し； (c) ステップ(b) の混合物を、各々の核酸鎖に相補的な
プライマーからの伸長産物すなわち増幅されるシーケン
スを合成するように酵素活性を高めるために、有効な温
度に有効な時間、ただし各々の伸長産物が鋳型鎖より離
れてしまうほどの高温にはせず、保って、； (d) ステップ(c) の混合物を、鋳型鎖とその伸長産物と
が離れて一本鎖分子となるように十分な時間十分な温度
で、ただし酵素が不可逆的に変性を起こさないほどの温
度で、加熱し； (e) ステップ(d) の混合物を、プライマーとステップ
(d) の一本鎖分子とがハイブリダイゼーションを形成す
るのに必要な温度に必要な時間冷却し； (f) ステップ(e) の混合物を、ステップ(d) でつくられ
た鋳型鎖に相補的なプライマーからの伸長産物すなわち
増幅されるシーケンスを合成するように酵素活性を高め
るために、有効な温度に有効な時間、ただし各々の伸長
産物が鋳型鎖より離れてしまうほどの高温にはせず、保
つ。ステップ(e) 、(f) にある有効な温度、時間とは同
じ値であって、したがってステップ(e) 、(f) は同時に
行なえるものである。ステップ(d) −(f) は必要とされ
る増幅レベルに達するまで反復して行なわれる。

【００６８】増幅反応は、シーケンスのわかっている特
定の核酸を大量に増殖させるだけでなく、存在すること
はわかっているが、まだ完全に明らかになっていない核
酸シーケンスを増やすのに有効である。特定の核酸の両
端のシーケンスのある程度の塩基配列が、ある程度の正
確さでわかっていれば、各々の核酸鎖の目的のシーケン
スで必要な位置にハイブリダイズする２本のプライマー
が用意できて、プライマーからの伸長産物が合成され、
その伸長産物が鋳型鎖より分離すると別のプライマーか
らの伸長産物の鋳型鎖となって決められた長さの核酸シ
ーケンスとなる。シーケンス両端の塩基配列に関する情
報が多いほど、ターゲットとなる核酸に対する特異性は
増加し反応の効率も高くなる。いずれにしても、増幅す
べきシーケンスの最初のコピー（複製物）は得られるの
で、核酸シーケンスは精製あるいはある一定の分子量が
必要とされることはない。一般的に、増幅反応は反応ス
テップ数に応じて指数的に産生する連鎖反応であり、そ
の反応は最低１つの特定の核酸シーケンスが与えられ、
(a) その両端のシーケンスの情報がそれとハイブリダイ
ズするプライマーを合成するにじゅうぶんな程度わかっ
ていて、(b) その連鎖反応を開始するための小量の核酸
があつて引き起こされる。連鎖反応の産生物は、その両
端に使用した特異的プライマーの構造を反映したシーケ
ンスを持った特定の二本鎖核酸である。

【００６９】反応開始における核酸としては、その核酸
が含まれているものあるいは含まれていると思われるも
のであれば、精製されていても精製されていなくても構
わない。増幅するための核酸は任意の材料が使用可能
で、例えばプラスミドｐＢＲ３２２や、クローン化した
ＤＮＡ，ＲＮＡ、バクテリア、酵母、ウィルス、微生
物、より高等な植物、動物など任意の原材料からのＤＮ
Ａ，ＲＮＡから得ることができる。ＤＮＡ，ＲＮＡは血
液あるいは絨毛、羊水細胞などの組織から種々の技術を
用いて抽出することも可能である。これについては、Ma
niatisらのsupra ２８０−２８１頁を参照されたい。こ
のようにこの過程はＤＮＡあるいはメッセンジャーＲＮ
ＡをふくむＲＮＡを取り扱うもので、ＤＮＡ，ＲＮＡは
一本鎖あるいは二本鎖いずれの構造でも良い。あるいは
ＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドでも利用可能である。こ
れらの任意の核酸がミックスされたものでも増幅反応に
よって核酸が産生される（プライマーは同じであって
も、異なってもよい）。増幅される特定の核酸配列は、
出発材料のほんの一部分であっても良いし、最初からあ
る一定の量、出発材料全部であっても良い。

【００７０】増幅されるシーケンスは反応開始時精製さ
れた形である必要はなく、混合物中小量あればよく、全
ヒトＤＮＡ中のベータグロビン遺伝子（Saiki ら、１９
８５年Science 、２３０巻、１５３０−１５３４ペー
ジ）やある微生物の一部分の核酸配列でその微生物が生
物材料中に極く一部しか含まれていないような場合が例
にあげられる。細胞は低張バッファーに浮遊させ９０−
１００℃の熱処理を、細胞が溶解し細胞内成分が一様に
とけるまで（普通１−１５分）行なうことによって、直
接に増幅反応に使用できる。熱処理の後、増幅反応のた
めの試薬を直接細胞溶解液中に加える。反応開始時の核
酸は目的の核酸配列以外のものが加わっていても構わな
い。増幅反応は一種の核酸シーケンスを大量に増幅させ
るだけでなく、同じ核酸上あるいは別の核酸にのってい
る一種以上の異なった核酸シーケンスを同時に増幅させ
ることも可能である。

【００７１】ＰＣＲ反応ではプライマーが重要な役割を
担っている。“プライマー”という語はこの増幅反応の
記述においては一つ以上のプライマーの集まりを指すこ
ととし、とくに増幅される核酸断片の端部に関する情報
に曖昧さがあるとき適応される。例えば、核酸シーケン
スが蛋白シーケンスの情報より類推されるような場合、
ＤＮＡ遺伝子コードの縮退によるすべての可能性のコド
ンの組み合わせをふくむプライマーのセットを各々の鎖
に使うことを指す。これらのセットのうちの一つが目的
の核酸シーケンスの端部と十分なホモロジーを持ってい
れば、このプライマーの増幅反応で有効に働くことにな
る。

【００７２】更に適当な数の異なったプライマーを使え
ば、数種の核酸シーケンスが、最初の反応開始液中の核
酸あるいは核酸のミックスされたものから増幅されてく
る。例えば、２種類の異なった核酸シーケンスを増幅さ
せようとすれば、４つのプライマーを使用すれば良い。
このようにして、２種類の異なった核酸シーケンスがこ
の方法で指数的に産生される。

【００７３】より反応の特異性を増すために、あるシー
ケンス内の特定のシーケンスを、一定の反応サイクル後
に増幅することも行なわれ、すなわち少なくとも１回以
上の反応サイクルを行なった後、増幅させるべき内部シ
ーケンス（最初の増幅反応での端部のシーケンスとは異
なる）に相補的なプライマーの組を加えて行なわれる。
このようなプライマーは任意の反応のステージで加えて
も良く、その結果より短い増幅断片が産生される。これ
とは別に、前に使用したプライマーとオーバーラップす
る部分をもつが５′端では非相補的なシーケンスを持つ
プライマーを使用した場合は、より長い断片が増幅され
てくる。

【００７４】プライマーはまた、増幅反応をインビトロ
変異導入法（in vitro mutagenesis）に応用するときも
重要な役割を果たす。使われるプライマーが完全にオリ
ジナルの鋳型と相補性を持っていないとき、増幅反応で
できる産物は、鋳型ではなくプライマーのシーケンスを
含んでいて従って、in vitroの変異が導入されたことに
なる。この先のサイクルになると、ミスマッチをおこし
たプライミング反応はもはや起きないので、導入された
変異が効率を下げることなく増幅されてくる。上述した
ＤＮＡシーケンスを変えるプロセスは、プライマーを変
えることによって、変わったＤＮＡシーケンスにたいし
繰り返し行なって、さらにＤＮＡシーケンスに変更を加
えることができる。このようにして、一連の変異シーケ
ンスを、それぞれ新たな変更を加えることによって、一
つ前のプロセスと比べると微小な変化だがもとのＤＮＡ
シーケンスとくらべると大きな違いとなるように、段階
的に作り出すことができる。

【００７５】プライマーは、増幅させる鎖に対する相補
性をある程度含んでいれば、一部分に非相補性の部分を
含んでいてもよいので、ほかの有益な応用も達成でき
る。例えば、鋳型鎖とは非相補的な塩基配列（プロモー
タ、リンカー、コーディング配列など）をプライマーの
片方あるいは両方の５′端に加えて、増幅反応で生産物
にそのシーケンスを付け加えることができる。伸長プラ
イマーを加えた後、十分な反応サイクルをおこなって、
非相補的な挿入配列をもった新しい鋳型を必要な量つく
ることができる。この結果、簡単な方法で比較的短時間
に（２時間あるいはそれ以内）、組み合わされた断片を
大量に作ることができる。

【００７６】オリゴヌクレオタイドプライマーは適当な
方法を用いて用意することができるが、たとえば前述し
たようなフォスフォトリエステル、フォスフォダイエス
テル法や、あるいはそれを自動化した方法で作られる。
自動化した方法の一つとして、ジエチルフォスフォアミ
ダイトを材料として、合成する方法がBeaucageら、１９
８１年Tet-rahedron Letters２２巻、１８５９−１８６
２ページに記載されている。また、改良した固相支持体
を使ってオリゴヌクレオタイドを合成する方法が米国特
許第4,４５8,０６６号に発表されている。またプライマ
ーは生物材料より分離することもできる（制限酵素消化
による断片など）

【００７７】どのようなプライマーを使うにしろ、反応
液中にはＰＣＲ反応が起きるために鋳型が入っていなく
てはならない、というのは特定のシーケンスは、その特
定のシーケンスを含む核酸を鋳型として増幅されてくる
からである。最初のステップでは各々の核酸鎖が４種の
ヌクレオシド３リン酸と増幅されるそれぞれの核酸鎖に
対するオリゴヌクレオタイドプライマーとの接触が起こ
る。もし増幅されてくる核酸がＤＮＡであるならば、ヌ
クレオシド３リン酸は普通ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，ｄＴＴＰであるが、種々の誘導体もこの反応で使用
可能である。ヌクレオシド３リン酸の濃度は広い範囲に
わたって選べる。普通、５０−２００μＭ各ｄＮＴＰ濃
度が増幅反応として選ばれ、１−３ｍＭ ＭｇＣｌ_２が
反応の効率と精度を上げるためにバッファーに加えられ
る。しかしながらＤＮＡシーケンスのような場合はｄＮ
ＴＴ濃度は１−２０μＭが望ましい場合もある。

【００７８】ターゲットとなる核酸鎖は、さらに核酸を
合成する際の鋳型として働く。この合成は適した方法に
よって行なえるが、普通緩衝化した水性の溶液中で行な
われ、pHは７−９が好ましいが、約８付近が最も望まし
い。合成を行なうにはモル数過剰の（クローン化した核
酸の場合１０００：１＝プライマー：テンプレート、遺
伝子核酸の場合１０⁸ ：１＝プライマー：テンプレー
ト）２つのオリゴヌクレオタイドプライマーを鋳型鎖が
含まれているバッファー中に加える。実際には、加える
プライマー量は、増幅されるシーケンスが種々の長い核
酸のミックスされたもののなかにあるような場合は鋳型
鎖にくらべモル数過剰とする。反応を効率良く進めるに
は大モル数過剰とするのが望ましい。

【００７９】鋳型、プライマー、ヌクレオシド３リン酸
の混合物は、増幅あるいは検出する核酸が一本鎖か二本
鎖かによって、それぞれ処理される。もし核酸が一本鎖
であるならば熱変性のステップは必要でなく、反応液は
プライマーと鋳型とがハイブリダイゼーションを形成す
るような温度条件にされる。この温度とは普通３５−６
５℃あるいはそれ以上であるが、３７−６０℃位が好ま
しく、有効な時間は普通２、３秒から５分であるが３０
秒から１分が望ましい。Tth ＤＮＡポリメレースではハ
イブリダイゼーション温度は４５−５８℃で行なわれ、
１５mer あるいはそれ以上の長さのプライマーがハイブ
リダイゼーションの正確さをあげるために使われる。よ
り短いプライマーを使う際には、ハイブリダイゼーショ
ン温度を、より低くする必要がある。もとの一本鎖核酸
の相補鎖を合成するには、適当なバッファー、ｄＮＴ
Ｐ、１種以上のプライマーにTth ＤＮＡポリメレースを
加えればよい。適当な１種のプライマーが加えられる
と、一本鎖核酸に相補的なプライマー伸長物ができ、核
酸鎖とハイブリダイズして同じ長さあるいは異なったな
がさのデュプレックスを形成し（プライマーが鋳型鎖の
どこにハイブリダイズしたかによるが）、つぎに前述し
たように２本の分離した、互いに相補的な一本鎖とな
る。変法として、２ないしそれ以上のプライマー（ひと
つを、他のプライマーからの伸長産物を鋳型として、プ
ライム合成用に使用する）を一本鎖核酸に加えて反応を
行なうこともできる。

【００８０】もし核酸中に２つの鎖が含まれていると
き、すなわちターゲットが二本鎖か、ターゲットが一本
鎖で二回目の増幅反応の時、核酸鎖はプライマーとのハ
イブリダイゼーションに先立って、その鎖（ストラン
ド）の分離（セパレーション）を行なわなければならな
い。このストランドセパレーションは、物理的、化学的
あるいは酵素的な方法を含む任意の適切な変性方法で行
なえる。核酸の鎖を分離する物理的な方法の一つで薦め
られる方法は、核酸を加熱して完全に（９９％以上）変
性させる方法である。熱変性の典型的な方法は、核酸の
サイズ構成によるが、温度は９０−１０５℃、時間は
２、３秒から５分かけて行なう。有効な変性温度は９０
−１００℃で１０秒から３分が望ましい。ストランドセ
パレーションは、ヘリカーゼとしてしられる酵素群ある
いはリボＡＴＰの存在下でヘリカーゼ活性をしめしＤＮ
Ａを変性するＲｅｃＡによっても行なうことが可能であ
る。ヘリカーゼによるストランドセパレーションの最適
な反応条件はKuhnHoffmann-Berling、１９７８年、CSH-
Quantitaive Bio-logy、４３巻、６３ページに記載され
ていて、ＲｅｃＡを使った技術はRadding 、１９８２年
Genetics、１６巻、４０５−４３７ページにレビューと
して記載されている。変性されてできた２本の相補鎖は
長さが等しい場合と等しくない場合がある。

【００８１】二本鎖核酸が熱で変性されると、反応液は
プライマーとそれに対する相補的な鋳型鎖がハイブリダ
イズするような温度まで冷却される。この温度とは、試
薬にもよるが、普通３５−６５℃あるいはそれ以上であ
るが、３７−６０℃位が好ましく、有効な時間は普通３
０秒から５分であるが、１分から３分が望ましい。実際
は、単に温度を９５℃から３７℃付近まで下げる間にハ
イブリダイゼーションが起こる。

【００８２】核酸が一本鎖か二本鎖いずれでも、Thermu
s thermop-hilus 由来のＤＮＡポリメレースを、変性ス
テップ、温度を下げているとき、あるいはハイブリダイ
ゼーションを促進しているとき、いずれのときにも反応
液に加えることができる。耐熱性Tth ＤＮＡポリメレー
スは反応液にいつでも加えることが可能であるが、厳し
い条件で(stri-ngent)でハイブリダイゼーションをさせ
るに必要な温度より低い温度に反応液があるときはポリ
メレースを加えないほうが、非特異的な増幅反応を防止
できる。ハイブリダイゼーション後、反応液は、酵素が
プライマーとテンプレートのハイブリダイズしたものか
ら伸長物を合成する酵素活性を促進し最適にするような
温度に上げられて、その温度に維持される。温度はそれ
ぞれの核酸鎖に相補的なプライマーからの伸長産物が合
成されるような温度でなくてはならないが、それぞれの
伸長産物がその相補鎖より変性されて離れてしまうほど
高い温度であってはならない( 即ち、温度は普通８０−
９０℃よりは低い）。

【００８３】使われる核酸によるが、合成反応に対する
有効な温度は４０−８０℃で、５０−７５℃が好ましい
温度である。Thermus thermophilus ＤＮＡポリメレー
スでは、６５−７５℃がより望ましい。この合成に必要
とされる時間は0.５−４０分あるいはそれ以上である
が、それは温度、核酸の長さ、酵素、核酸混合物の複雑
さに主に依存する。伸長に要する時間は普通３０秒から
３分である。もし核酸長が長ければ、相補鎖の合成には
より長い時間が必要となる。

【００８４】新たに合成された鎖と相補鎖は二重鎖分子
を形成し、次の増幅過程で使われることになる。次のス
テップで、二本鎖分子の鎖は、変性させるに十分な温度
と時間で、しかし耐熱性酵素を不可逆的に変性あるいは
失活させるほどの高温、長時間でなく、熱変性され、分
けられる。鋳型鎖の変性後、プライマーと相補的な一本
鎖分子（鋳型）とのハイブリダイゼーションが進むよう
な温度に、前述したように下げられる。

【００８５】ハイブリダイゼーションのステップの後、
あるいはハイブリダイゼーションのステップと同時に、
新たに合成された鎖と、もとからある鎖の両方を鋳型と
して使って、プライマー伸長物を合成できるに耐熱性酵
素の活性が促進するように温度を調節する。温度は前述
したように、伸長産物がその相補鎖より変性されて離れ
てしまうほど高い温度であってはならない。このような
場合、同時に反応を起こさせるステップでは、５０−７
０℃の温度範囲が適当である。

【００８６】加熱と冷却のステップ中には、１サイクル
のストランドセパレーション、ハイブリダイゼーショ
ン、伸長産物の合成が含まれていて、特定の核酸シーケ
ンスを目的の量まで増やすまで繰り返すことができる。
制限を与えるのは、プライマー、耐熱性酵素、ヌクレオ
シド３リン酸の量である。普通、１５から３０サイクル
が行なわれる。増幅したＤＮＡを診断の目的に検出しよ
うとするなら、必要とするサイクル数はサンプルの性質
に依存する。例えば、増幅されるサンプルが精製された
ものであれば、サイクル数は少なくてすむ。もしサンプ
ルが核酸の混合物であるならば、検出に必要なシグナル
をえるにはより多くのサイクル数を必要とする。一般的
な増幅および検出には約１５回のサイクルを繰り返す。
増幅されたシーケンスを、標識したシーケンス特異的な
プローブで検出し、ヒトの遺伝子ＤＮＡが増幅のターゲ
ットの場合、明瞭なシグナルを検出可能な、すなわちバ
ックグラウンドノイズが検出の妨げとならないためには
１５−３０回のサイクルの反復が必要である。

【００８７】ヌクレオタイド、プライマー、耐熱性酵素
は反応開始時に加えられれば、消費されたり、酵素が不
可逆的に変性したり失活しないかぎり、更に加える必要
はなく、もしそのような場合は、反応を続けるためにポ
リメレースあるいは他の試薬を加えればよい。しかしな
がら、各ステップでそのような材料を加えても、それほ
ど反応を進めるわけではない。適当な数の反応サイクル
が実行され、必要な量の特定の核酸シーケンスが産生さ
れれば、反応は普通に行なわれている方法、すなわちＥ
ＤＴＡ、フェノール、ＳＤＳ、クロロホルムなどを加え
て酵素を失活させるか、反応の成分を分けることによっ
て、停止する。

【００８８】増幅反応は連続して行なわれるべきであ
る。自動化を実現したものの一つとして、反応溶液を、
温度が一定のレベルで一定の時間制御するようにプログ
ラム化して、温度循環を行なう方法がある。この目的の
ための機械として、増幅反応を自動的に行なう機械がPe
rkin-ElmerCetus 社によって開発、販売されている。こ
の装置でＰＣＲを行なうための詳細なインストラクショ
ンは装置を購入すると入手できる。

【００８９】Tth ＤＮＡ ポリメレースは、ポリメレー
ス連鎖反応による核酸シーケンスの増幅が有用な様々な
反応を実行するに際して、非常に有用である。増幅反応
は特定の核酸シーケンスをクローン化して適当な発現ベ
クターに挿入するのに利用され、米国特許第4,８０0,１
５９号に記載されている。ベクターは標準的な組換ＤＮ
Ａ技術によって適当な宿主に形質転換されシーケンスに
対応する遺伝子産物の生産が行なわれる。このようなク
ローニングには、平滑末端ライゲーションによって直接
ベクターに連結させる方法と、制限酵素を使ってプライ
マー内のサイトを切断して行なう方法がある。他の、Tt
h ＤＮＡ ポリメレースに適した方法としては、米国特
許第４, ６８３, １９４号、４, ６８３, １９５号、
４, ６８３, ２０２号、欧州特許公報第２２９，７０１
号、２３７，３６２号、２５８，０１７号に記載されて
おり、参考として付けてある。さらに本出願の酵素は非
対称ＰＣＲ(Gyllensten dnd Erlich ,１９８８年、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, ８５巻、７６５２−７６５
６ページ、参考として付けてある）、反転ＰＣＲ(Ochma
n ら、１９８８年 Genetics 、１２０巻、６２１ペー
ジ、参考として付けてある）、ＤＮＡシーケンシング(I
nns ら、１９８８年 Proc. Natl.Acad. Sci.USA 、８５
巻、９４３６−９４４０ページ、MaConlogueら、１９８
８年、Nuc. Acids.Res.、１６巻（２０号）、９８６９
ページ）に有用である。Tth ＤＮＡ ポリメレースはま
た逆転写酵素活性を持っている。

【００９０】

【実施例】いかに示す例は、単に説明するために提示し
ているもので、本発明の出願範囲に制限を加えようとし
ているものではない。これらの例の中で使われている用
語は特に断わりがないかぎり、パーセントは固体の場合
は重量パーセント、溶液の場合は体積パーセント、温度
は摂氏である。

【００９１】例１Thermus thermophilus Ｄ ＮＡポリメレースの精製 本例では、Thermus themophilus よりTth ＤＮＡ ポリ
メレースを分離することについて述べている。Tth ＤＮ
Ａ ポリメレースは、精製の各段階で、LawyerらにJ.Bi
ol. Chem. １９８９年、２６４巻（１１号）６４２７
−６４３７に、Taq ポリメレースについて記載されてい
る方法にしたがってその活性のアッセイを行なった。こ
の文献は参考文献としてつけてある。

【００９２】定型的には、このアッセイは以下の組性か
らなる反応混合液中で行なわれる。：２５mM TAPS−HC
l 、pH9.５（２０℃）；５０mM KCl；２mM MgCl₂；１mM
βメルカプトエタノール；２００μM 各ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰ；１００μMα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（0.０
３−0.０７μCi/nmol)；１2.５μg サケ精子ＤＮＡ；お
よびポリメレース。反応は希釈液中の酵素を入れて開始
し、７４℃で行なわれる（希釈液の組性は１０mM Tris
−HCl 、pH8.０、５０mM KCl、0.１mM EDTA 、１mg/ ml
滅菌ゼラチン、0.５％NP−４０、0.５％ TWEEN２０、１
mMβメルカプトエタノール) 。１０分間の反応後、６０
mM EDTA を１０μl 加えて、反応を停止する。遠心後、
５０μl の反応液を、１Mlの５０μg/ml、２mM EDTA 溶
液中に移す（０℃）。等量（１Ml）の２０％ＴＣＡ溶液
と２％ピロリン酸ナトリウム液を加え混ぜる。混合液を
０℃で１５−２０分反応させ、ワットマンＧＦ／Ｃフィ
ルターで濾過し５％ＴＣＡ溶液と１％ピロリン酸ナトリ
ウム混合液で十分に洗い（５ml×６回）、さらに９５％
冷エタノールで洗う。フィルターを乾燥後放射能活性を
計測する。バックグランド（酵素なしで行なった反応）
は通常最初に加えた放射活性の0.００１％から0.０１％
以内である。ユニットの計算のため、スタンダードとし
て５０−２５０pmolの³²Ｐ−ｄＣＴＰをスポットする。
１ユニットは７４℃３０分の反応で１０ｎmol のｄＣＴ
Ｐが取り込まれたとき１ユニットとする。ユニットは次
式に従って計算する。

【００９３】

【数１】

【００９４】酵素活性は反応時間と完全に比例関係にあ
るわけではない。精製した酵素の場合、３０分のアッセ
イでは１０分のアッセイの2.５倍の活性を示す。

【００９５】約２０２g の凍結したThermus themophilu
s のHB８株（ＡＴＣＣ、２７、６３４）を１００mlの３
×TE−DTT バッファー（１５０mM Tris −HCl 、pH7.
５、３mM EDTA、３mM DTT．、2.４mM PMSF (PMSF は１
４４ｍM 濃度でDMF に溶解したストック溶液より使
用））で溶かし、ブレンダーで低速でホモジェナイズす
る。全ての操作はことわらないかぎり０℃−４℃で行な
う。ガラス器具は全て乾熱滅菌し、精製に使う溶液はオ
ートクレーブ可能なものは全てオートクレーブする。溶
解した細胞はAminco French pressure cell （１8,００
０psi ) で溶菌し、等量の2.４mM PMSF を含む１×TE−
DTT バッファーで希釈し、次に、粘性が低下するまで超
音波処理で行なう（アリコット１／３、８０％出力、１
０分間、デューティーサイクル５０％）。ライゼートを
2.４mM PMSF を含む１×TE−DTT バッファーで湿重量の
５．５倍となるように希釈する。得られた分画、分画Ｉ
（１、１００ml) には、１5.６g の蛋白が含まれていて
活性は４6.8 ×１０⁴ ユニットであった。

【００９６】0.２M （２9.０７g)となるように硫安を加
え、氷上で３０分攪拌した。硫安を加えることで沈殿が
形成されるが、この沈殿はのちにのべるＰＥＩ沈殿操作
まで取り除かないでおく。硫安を加えることにより粗溶
液中でポリメレースとＤＮＡが結合すること及びポリメ
レースと他の蛋白間でのイオン相互作用を減少させる。
精製操作を迅速に行なうこと（フェニール−セファロー
スカラムにサンプルをのせ、流出すること）と、蛋白分
解酵素阻止剤（2.４mM PMSF)をくわえることはＤＮＡポ
リメレースの蛋白分解を防ぐうえで重要である。さらに
良い結果を望むなら、硫安沈殿後、沈殿物を遠心で除く
装置の前に、大部分の核酸を取り除くためにポリミンＰ
（ＢＯＨより購入）沈殿操作を行なうのがよい。同様
に、ポリミンＰ／硫安ペレットのうえの柔らかい、粘凋
なペレットもこれには核酸を含んでいないので、画分II
に含めて構わない。アガロースゲル電気泳動とエチジウ
ムブロマイド染色によって、ポリミンＰ上清には、大分
子量のＤＮＡ、ＲＮＡは９０％以上除かれていることが
わかる。粘凋なペレットをくわえた場合は、その蛋白量
が増した分、フェニール−セファロースカラムを、後述
するより１０％程度のスケールアップするのが望まし
い。

【００９７】経験的に、0.２％ポリミンＰ（ポリエチレ
ニミン、ＰＥＩ）沈殿中には全核酸の９０％以上が沈殿
している。ポリミンＰ（pH7.５）を0.２％となるように
ゆっくりと加え（１０％ＰＥＩ２２ml）スラリーを氷上
でゆっくり攪拌し、３0,０００g ４℃で４５分遠心す
る。９２０mlの上清をすてたのち、PEI ペレット上の柔
らかい、粘凋なペレットを再度遠心する。粘凋物を１８
6,０００g ２℃で１時間遠心すると４０mlの上清と非常
に大きなゼラチン状のペレットが得られる。このペレッ
ト中には画分Ｉで見られる活性の２％以下が認められ、
1.９６g あるいは画分Ｉの１2.５％の蛋白が含まれてい
る。上清を回収し（画分II、９６０ml）ここには１0.５
g の蛋白と４2.６×１０⁴ ユニットの活性が認められ
た。

【００９８】画分IIを3.２×6.５cm（５２ml）のフェニ
ール−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（ロット番号MIO
２５４７、Pharmacia-LKB より購入)(0.２M 硫安、0.５
mM DTTを含むTEバッファーで平衡化）にのせ８０ml／hr
（１０ml/cm² /hr) で流した。レジンは全て推奨されて
いる方法にしたがって平衡化、再生した。カラムを同じ
バッファー２４０mlで洗ったのち（Ａ２８０がベースラ
インにおちるまで）、２２０mlの0.５mM DTTを含むTEバ
ッファー（硫安は含まない）であらいＴthポリメレース
以外の蛋白を外した。次にカラムを２７０mlの２０％エ
チレングリコール（0.５mM DTT、TEバッファー）で洗っ
てその他の混入蛋白を洗い、２M 尿素を含む２０％エチ
レングリコール（0.５mM DTT、TEバッファー）洗って、
ポリメレース活性を流出させた。ポリメレース活性を示
す画分（５ml）を回収した。（画分IIIa、８４ml) 。活
性試験でフロースルー画分と洗いだし画分を調べた結
果、カラムのキャパシティを越えた場合、のせたポリメ
レース活性の５０％程度しかカラムに結合しなかったこ
とがわかった。カラムのキャパシティを越えないように
するために、より大きいカラム（最低２倍以上の）を使
用すべきである。同じ程度の活性を持ったフロースルー
画分と洗いだし画分を回収し、（画分IIb 、６８５ml)
、0.２M 硫安濃度に調製後、平衡化、再生したカラム
に再度かけた。

【００９９】ポリミンＰを含む画分（フェニール−セフ
ァロースカラムのフロースルー画分）ちゅうの低レベル
のポリメレース活性の定量は１０mM EDTA 存在化、比存
在化両条件で行なうべきである。ＥＤＴＡが存在するこ
とで、ポリミンＰに結合しているヌクレオチド基質によ
る放射活性のバックグランドの上昇を是正できる可能性
があるからである。

【０１００】前述したように、Ｔthポリメレース活性は
２M 尿素と共に流出されてくる。（画分IIIa) 。画分II
b を再度フェニール−セファロースカラムにかけている
間、この２M 尿素流出画分はヘパリンセファロースロー
ディングバッファーで透析し、尿素に長時間さらさない
ようにすべきである（カルバミル化をふせぐため）。透
析画分IIIaには４２％の活性を示し（１７９、２１３ユ
ニット）、3.５％の蛋白が存在し（３５１mg) 、したが
って精製度は１２倍であった。回収したフロースルー画
分と２M 尿素流出画分中にはカラムにかけた量の４2.６
％（１８１、５５５ユニット）の活性と４0.８％（４、
１１０mg )の蛋白が、結合しなかったＴthポリメレース
（画分IIb)として見られた。最初のバッファーで平衡
化、再生したカラムに画分IIb を再度かけた。

【０１０１】画分IIb を、フェニール−セファロースカ
ラムに１１時間７８mlの速度でのせた。カラムを２７０
mlの0.２M 硫安、0.５mM DTT、をふくむTEバッファーで
洗い、次に１７０mlの0.５mM DTTを含むTEバッファー
（硫安を含まず）で洗い、最後に２６０ｍｌの２０％エ
チレングリコール、0.５mM DTTを含むTEバッファーで洗
った。Ｔthポリメレースを再度、２０％エチレングリコ
ール、0.５mM DTT、２M尿素を含むTEバッファーで流出
させた。このポリメレース活性を含む画分（4.３ml) を
回収した。（画分IIIb)

【０１０２】２M 尿素流出画分（画分IIIb) にはカラム
にのせたうちの、８７％の活性が認められ（１５９、１
３２ユニット）、8.３％の蛋白が含まれていた、したが
って精製度は9.７倍であった。

【０１０３】画分IIIb（１１6.４ml）は、0.１５M KCl
濃度に調節され画分IIIaと共に回収され、５０mMトリ
ス、pH7.５、0.１mM EDTA 、0.２％Tween ２０、0.５mM
DTT、0.１５M KCl で活性を保ったまま透析し、４℃に
て、貯留した。この画分III(２４３ml) の中には特異的
あるいは非特異的なＴthエンドヌクレース、エキソヌク
レースのかなりの量の混入を認めた。この合わせた画分
III には３２６、００９ユニットの活性と７２５mgの蛋
白が存在していた。画分III を2.２×１２cm（４５ml)
ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂカラム（Pharmacia-LK
B より購入) にのせ、0.１５M KCl 、５０mMトリス、pH
7.５、0.１mM EDTA 、0.２％Tween ２０、0.５mM DTTで
４５ml/hr の速度で平衡化した。のせたうち全ての活性
がカラムに捕捉された。カラムは最初１７５mlの同じバ
ッファーで洗われ（吸光度Ａ₂₈₀ がベースラインに落ち
るまで）、次に６７０mlの１５０−７５０mM KCl線形濃
度勾配バッファーで流出した。0.３１−0.３５５mM KCl
濃度勾配部に流出されてきた画分（5.２５ml) を回収し
た（画分IV、１４９ml) 。Taq ＤＮＡ ポリメレースは
0.３３M KCl 濃度の流出ピークを示すが、同様にTth Ｄ
ＮＡ ポリメレースは0.３３M KCl 濃度でTth HB81 エ
ンドヌクレース（Taq I エンドヌクレース〔ＴＣＣＡ〕
とイソシゾマーの関係）と共に流出されてくる。

【０１０４】画分IVはアミコンYM３０メンブランで約１
０倍に濃縮され、続いて２５mMトリス、pH7.５、0.１mM
EDTA 、0.２％Tween ２０、0.５mM DTT、１００mM KCl
バッファーで透析を行なった。透析ちゅうに形成された
沈殿物は遠心によって取り除いた。（１２，０００g 、
１０分、４℃）が活性は失われなかった。ヘパリンセフ
ァロースカラムを含むこれら一連のステップで２７倍の
濃縮度すなわちヘパリンセファロースカラムにのせたう
ちの９５％の活性をリカバーすることができた。

【０１０５】Tth ＤＮＡ ポリメレースはそのシーケン
スがTaq ＤＮＡ ポリメレースと８８％の一致（９３％
の類似性）を示すにもかかわらず、これら蛋白間の１０
％の違いがフォスフォセルロースによる精製の特性に重
大な差を生じさせている。Taq ＤＮＡ ポリメレースで
は、pH7.５のトリスバッファーでカラムの流出を行なう
と、フォスフォセルロースより0.２M KCl のときに流出
してきて、混在するエンドヌクレースは0.６−0.８M KC
l の濃度で流出してくるのに対し、Tth ＤＮＡポリメレ
ースと混在するエンドヌクレースはフォスフォセルロー
スカラムでは容易に分離しえない。Tth ＤＮＡ ポリメ
レースは約0.４５M KCl の濃度ピーク付近に流出される
のに対し、Ｔthエンドヌクレースは0.５８M KCl 濃度ピ
ークで流出される。アフィゲルブルー（Biorad Laborat
ories)はTth ＤＮＡ ポリメレースとＴthエンドヌクレ
ースを分離するのに有効なレジンである。アフィゲルブ
ルーは塩基結合サイトを有する酵素をアフィニティ精製
するために用いられる色素結合レジンである。

【０１０６】画分IVの遠心後の上清（１6.８ml) を、1.
６×１０cm（２０ml）アフィゲルブルーカラム（２５mM
トリス、pH7.５、0.１mM EDTA 、0.２％Tween ２０、0.
５mMDTT、１００mM KClバッファーで平衡化）に２０ml
／hrの速度でのせた。カラムにかけたTth ＤＮＡ ポリ
メレース活性の全てがレジンに結合した。カラムを３０
mlの同じバッファーで洗ったのち（吸光度Ａ₂₈₀ がベー
スラインに落ちるまで）、３００mlの0.１M −0.５M KC
l 線形勾配濃度のバッファーで流出した。0.２８−0.４
５５M KCl 濃度間に流出した画分（3.０５ml) で二本鎖
あるいは一本鎖ＤＮＡエンドヌクレース混入のないこと
を確かめた、すなわち５−２０ユニットのTth ＤＮＡ
ポリメレース活性と６００ng共役閉環プラスミドｐＬＳ
Ｇｌあるいは８５０ngM １３mp１８一本鎖ＤＮＡを６０
℃で１時間から１１時間反応させ、特異的あるいは非特
異的なＤＮＡ断片の低分子化がないことを確かめた。KC
l濃度勾配を加えると、Tth ＤＮＡ ポリメレースは約
0.３５M KCl 付近にややひろがったピークで流出され、
エンドヌクレースは0.５M KCl 以上の濃度で流出されて
くる。アフィゲルブルーカラムを0.１５M KCl で洗い、
0.１５M −0.６M KCl の濃度勾配バッファーで流出を行
なうとより良い分離が行なえるであろう。

【０１０７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動パターンにもとずい
て、二通りのプールを行なった。画分Ｖa はピーク画分
（６１ml) から、画分Ｖb はその両脇の画分から（７
２．５ml) プールした。画分Ｖa には２2.２×１０⁴ ユ
ニットの活性と蛋白で5.５mgが、画分Ｖb には、5.２×
１０⁴ ユニットの酵素活性と蛋白が3.５mg含まれてい
た。それぞれの回収物は別々にＹＭ３０メンブランで濃
縮、透析濾過された。画分Ｖb はアミコンＹＭ３０メン
ブランで約１０倍に濃縮され５０mM NaCl を含むＣＭ−
トリスアクリルバッファー（２５mM酢酸ナトリウム、pH
５．0 、0.５mM DTT 、0.１mM EDTA 、0.２％Tween ２
０）で透析した。透析中に形成された沈殿物は再度遠心
して取り除いたが（１2,０００g 、１０分、４℃）わず
かな活性を失ったにすぎず（２％以下）1.４倍の精製度
が得られた。上清（8.６ml、5.１×１０⁴ ユニット活
性、2.３mg蛋白）を１×3.８cm（３ml）ＣＭ−トリスア
クリルカラム（ＣＭ−トリスアクリルバッファーで平衡
化）に３ml/hr の速度でかけた。カラムにのせた活性は
全てカラムに捕捉された。カラムを１７mlの同じバッフ
ァーで洗ったのち５０mlの0.０５−0.７M NaClの線形段
階状の濃度勾配バッファーで流出を行なった。0.１７５
−0.２５M 濃度で流出された画分（１ml) を、画分Ｖa
と共にプールする前にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動での解
析を行なった。TthＤＮＡポリメレース活性は0.２１M N
aCl濃度に鋭いピークを持って流出されてきた。この画
分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動解析より、ポリメレース
は高度に濃縮されているがなお３５ＫDa、２５ＫDa、１
８ＫDa付近に混在するバンドが認められた。画分Ｖ（１
1.４ml) 、画分Ｖa と画分Ｖb をＣＭ−トリスアクリル
カラム処理したピーク画分をミックスしたもの、を５０
mM NaCl wo含むＣＭ−トリスアクリルバッファーで透析
した。形成した沈殿物は遠心によって取り除いたが（１
2,０００g 、１０分、４℃) 活性はほとんど失われなか
った。沈殿物には0.９１mgの蛋白と（約２０％）、２、
２２７ユニットの活性が認められた（１％以下）。

【０１０８】得られた上清（１2.８ml、5.１８mg蛋白、
２4.８× １０⁴ ユニット活性）を1.６×６０cm（１２
ml）のＣＭ−トリスアクリルカラム（５０mM NaCl を含
むＣＭ−トリスアクリルバッファーで平衡化）１２ml/h
r でのせた。カラムを２０ｍｌの同じバッファーで洗っ
たのち、２７mlの１００mM NaCl を含むＣＭ−トリスア
クリルバッファーで洗った。フロースルー画分にはポリ
メレース活性は検出されなかった。技術上の問題より
（カラムアダプターの破損）１００−４００mM NaCl 線
形濃度勾配をかけたとき、４００mM NaCl 濃度ですぐに
流出が始まった。カラムにのせたうちの２８％の活性
（１9.４×１０⁴ ユニット、４９mg蛋白）を回収し、同
じ大きさのＣＭ−トリスアクリルカラムに再度かけた。

【０１０９】カラムにのせる画分（３５ml) を、50mM N
aCl 濃度に調製した結果、2.７倍希釈された。カラムを
３３mlの同じバッファーで洗ったのち、１８０mlの５０
−４００mM NaCl線形濃度勾配バッファーで流出した。
0.１６−0.２M NaCl濃度に流出されてきた画分（1.４m
l）をセントリコン３０メンブレンで2.５×ストレージ
バッファー（５０mMトリス、pH7.５、0.２５mM EDTA 、
2.５mM DTT、0.５％Tween ２０（ピアース社、Surfact-
Amps）濃縮、透析濾過を行なった。Tth ＤＮＡポリメレ
ース活性は0.１８３M NaCl濃度に流出ピークを示した
が、トライアルにくらべ若干早く流出されてきた。Taq
ＤＮＡ ポリメレース活性の場合は、ＣＭ−トリスアク
リルカラムに同じ酢酸ナトリウムバッファーpH5.０で流
出すると、0.１９−0.２０５M NaCl濃度に流出されてく
る。濃縮、透析濾過を行なったサンプルは1.５倍の８０
％グリセロール（フィッシャー社、スペクトル分析グレ
ード、オートクレーブ滅菌）で希釈後、−２０℃に保存
し、それぞれの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による
解析を行なった。Tth ＤＮＡ ポリメレースを含む画分
はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による解析で約８５−９０
％の純度であった。主要なバンドは約９０ＫDa蛋白とし
て泳動されていたが、若干の混入物のバンドもあった。
実際、観察された分子量約９０ＫDaと計算による分子量
９４ＫDa（遺伝子配列より）の差は、泳動ゲル内の異常
な移動によるか、精製過程での分解によるものと考えら
れる。それぞれの画分の染色のパターンは同じであり、
全ての画分を一つにまとめた（画分VI、２1.５ml）。

【０１１０】画分VIを更にアミコンＹＭ３０メンブレン
で2.５×ストレージバッファー中で濃縮、透析濾過を行
なった。このとき容積は７mlで、内２mlをアミノ酸成分
と配列の解析に使用した。残りの6.８mlを1.６mlに濃縮
し８０％グリセロール2.４mlで希釈した。最終産物（４
ml）中には、蛋白が2.１７mg、活性が１６２、７８９ユ
ニット（３4.８％産出）で、比活性は７５、０１８ユニ
ット／mg蛋白であった。精製の各ステップの結果をテー
ブルにして次に示す。

【０１１１】

【表１】

【０１１２】例２Thermus themophilus Tth ＤＮＡ ポリメレースＩ遺伝
子のクローニング 本例では、Thermus themophilus のTth ＤＮＡ ポリメ
レースＩ（Tth Pol I遺伝子クローニングのすすめか
た、方法についてのべる。T. aquaticus ＤＮＡポリメ
レースＩ（Taq Pol I ) 遺伝子からＰＣＲ増幅したＤＮ
Ａ断片をプローブとしてTth Pol I 遺伝子の制限酵素認
識サイトとそれをはさむ領域についてジェノミックＤＮ
Ａブロットを行なった。Taq Pol I 遺伝子特異的なプラ
イマーを使ってTth Pol I 遺伝子のＰＣＲ増幅を行なう
と、Tth Pol I 遺伝子についてより詳しい制限酵素認識
サイトと核酸配列の情報が得られた。この情報にもとず
いて、Tth Pol I 遺伝子をプラスミドｐＢＳ１３＋（ス
トラタジーン社、このプラスミドはＢＳＭ１３＋として
もしられている）に２段階でクローニングした。

【０１１３】Ａ．プローブの用意 ４種類の標識プローブを、T. aquaticus ＤＮＡとビオ
チン化dUTP（ビオチン−１１−dUTP、Bethesda Researc
h Laboratories) とのＰＣＲでつくり、Thermus themop
hilus ＤＮＡ のサザンブロットのプローブとして使用
した。プローブＡはＣＭＯ７とＥＫ１９４から作り、Ta
q Pol Ｉ遺伝子５′端の−２３０から＋２０７塩基部の
４３８ｂｐを覆う。プローブＢはMK１３８とMK１２４か
ら作り、Ｔaq Pol I遺伝子のＨｉｎｄ／III サイトをま
たがって＋５５５から＋８７９をおおう３５５ｂｐ長の
プローブである。プローブＣはMK１４３とMK１３１から
作り、Taq Pol I 遺伝子のテンプレート- プライマー結
合部位のコーディング配列とBam HIサイトの＋１３１３
から＋１８１９をおおう５７９ｂｐ長のプローブであ
る。プローブＤはMK１３０とMK１５１から作り、Taq Po
l I 遺伝子の３′端＋２１０８から＋３３８４塩基部を
おおう４７３ｂｐ長のプローブである。

【０１１４】これらプローブを作成するのに使用したプ
ライマーの配列を以下に示す。

【０１１５】

【化６】

【０１１６】Taq Pol I 遺伝子の配列はLawyerらの論文
および米国特許出願第１４３，４４１号、１９８８年１
月１２日出願、で発表されていて、両者とも参考資料と
して付けられている。

【０１１７】プローブはおのおの以下の組性からなる１
００μl の反応混合液で作制された：１０mM Tris −HC
l 、pH9.０（pHは混合液中のビオチン化ｄＵＴＰのpHと
中和するように9.０に設定されている；ビオチン化ｄＵ
ＴＰは１００mM Tris −HCl 、pH7.４内に溶解）、５０
mM KCl、1.０mM MgCl2、１００μg ／mgゼラチン、２ユ
ニット Taq Pol I (Perkin-Elmer Cetus社より市販）、
５０μM dATP、５０μMdCTP、５０μM dGTP、３7.５μM
dTTP、１2.５μM biotin−１１−dTUP、５０pmol各プ
ライマー、および鋳型ＤＮＡ。鋳型ＤＮＡは同じプライ
マーを使って２５サイクルのＰＣＲ産物を１００倍希釈
したものの１μl を用いていて、このときの反応混合液
は次の組性からなっている；、１０mM Tris −HCl 、pH
8.３、５０mM KCl、1.５mM MgCl2、２００μM 各dNTP、
M biotin−１１−dUTPはふくまず、1.０ngのTaq ＤＮＡ
は３分間ボイルして氷上で冷やして用いた。ＰＣＲは
Perkin-ElmerCetus 社のサーマルサイクラーを使用し
た。プローブを作製するために、プローブとテンプレー
ト以下の１５回のサイクルで作った；９８℃まで１分４
５秒で到達、９８℃で１５秒（チューブ内の温度は９6.
５℃）、５５℃まで４５秒で到達、５５℃で２０秒、４
５秒で７２℃で到達、７２℃で３０秒、そして最後のサ
イクル終了後７２℃で５分間反応を行なった。

【０１１８】Lawyerらが記述しているように、プローブ
とハイブリダイズしたジェノミックＤＮＡを分離し、Ma
niatisの記述にしたがってサザンブロットを行なったが
ニトロセルロースフィルタのかわりにMSI Magnagraph^TM
ナイロンメンブランフィルターを用い、ＤＮＡの固定も
熱固定の替わりに紫外線固定を行なった。（UV. Strata
linker^TM１８００、Stratagene社より販売)

【０１１９】フィルターブロットは４２℃２時間で以下
の組性の溶液中でプレハイブリダイゼーションを行なっ
た；５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、0.５％ＳＤ
Ｓ、５％デキストランサルフェート、１５０μg ／mlキ
ャリアーＤＮＡ、５０％フォルマミド。フィルターブロ
ットに対するプローブのハイブリダイゼーションは同じ
溶液中に１０ng/ml のプローブを入れて４２℃１晩で行
なった。ハイブリダイゼーション後、メンブランフィル
ターを洗って、結合していないプローブを取り除いた。

【０１２０】４種類のプローブはそれぞれThermus ther
mophilus ＤＮＡ とハイブリダイズした。Tth Pol I
遺伝子領域の制限酵素切断地図はTth ＤＮＡ を制限酵
素ＰstＩ、BamHI 、SacII 、Asp ７１８でそれぞれ切断
してサザンブロットをおこない作製した。さらにTth Ｄ
ＮＡ をHindIII/Asp ７１８、HidIII/BstEII 、HindII
I/NheI、BamHI/Asp ７１８、BamHI/BstEII、BamHI/Sph
I、BamHI/NheIの組み合わせで二重消化を行ない、その
サザンブロットを行なった。この結果、Tth PolI 遺伝
子のクローニングに利用する制限酵素地図の作製が行な
えた。

【０１２１】Ｂ．Tth Pol I 遺伝子のテンプレート−プ
ライマー結合部位のＰＣＲ増幅 Ｔth遺伝子ＤＮＡを鋳型として、Taq Pol I 遺伝子のテ
ンプレート−プライマー結合部位をコードする領域に一
致するプライマーを使って、一連のＰＣＲ増幅反応を行
なった。数種のプライマーをさまざまな組み合わせでＰ
ＣＲ反応に用い、Taq Pol I 遺伝子の２９３−１８９１
塩基に相当するＴaq ＰolＩ遺伝子の種々の領域を増幅
しようと試みた。１つのプライマーの組み合わせ、ＭＫ
１４３とＭＫ１３１が増幅物を合成した。

【０１２２】増幅反応は１０mM Tris-HCl 、pH8.３、５
０mM KCl、1.５mM MgCl₂、２ユニットTaq Pol I （Perk
in-Elmer Cetus 社より市販）、２００μM 各ｄＮＴ
Ｐ、１ng熱変性Tth ＤＮＡ 、５０pmol各プライマーち
ゅうで行なわれた。増幅は前述したのと同じ熱サイクル
プログラムを２５回行ない、ＰＣＲ産物はポリアクリル
アミトゲルで解析した。

【０１２３】満足のいく増幅ができなかったプライマー
の多くは、のちにシーケンスされたTth Pol I 遺伝子と
比較した結果多くのミスマッチを持っていたり、あるい
はプライマーの３′端に戦略上のミスマッチがあった。
プライマーＭＫ１４３はTthPol I 遺伝子と比較し３つ
のミスマッチがあったがそれは５′端にあって続く１５
ベースは一致していた。プライマーＭＫ１３１は２つの
ミスマッチがあったが、そのミスマッチはプライマーの
なかほどにあった。

【０１２４】プライマーＭＫ１４３／ＭＫ１３１による
Ｔth遺伝子からの増幅物は、ポリアクリルアミトゲルで
泳動するとＴaq遺伝子を鋳型とした反応でつくられたも
のと同じ移動度を示した。ＴaqとＴth遺伝子からの増幅
物の制限酵素地図を作製すると、BamHI 、SacI、XhoIに
関しては同じであったが、SacII 、PstIでは異なってい
た。プライマーＭＫ１４３／ＭＫ１３１によるＴth遺伝
子からの増幅物はさらに同じプライマーを使いGyllnest
enとEhlichの１９８８年Proc. Natl. Acad. Sci. USA８
５巻（２０号）７６５２−７６５６あるいはInnis らの
１９８８年Proc. Natl. Acad. Sci. USA８５巻（２０
号）９４３６−９４４０に記載している非対称ＰＣＲ法
を用いてＤＮＡのシーケンス解析を行なった。

【０１２５】Ｃ．Tth Pol I 遺伝子５′端のクローニン
グ サザンブロット法およびＰＣＲ法の解析によりTth Po
l I 遺伝子クローニングを２ステップで進める方法を開
発した。Tth ＤＮＡ の約３Ｋb 長のHindIII断片がプ
ローブＡ、Ｂ、ＣとはハイブリダイズしてプローブＤと
はハイブリダイズしなかったことからこの３Ｋb 長のHi
ndIII 断片BamHI 認識サイトを含んでいて、この遺伝子
の5 ′端のクローニングに有用であることがわかった。

【０１２６】Tth Pol I 遺伝子５′端のクローニングの
ため、HindIII 消化Tth ＤＮＡ を0.５インチ円筒ゲル
で泳動中に５分毎に２５０μl ずつ分画化して、約３Ｋ
b の長さの断片をゲルより流出させて回収した。プロー
ブとのドットブロットの結果この分画には目的とするＤ
ＮＡ断片が含まれていた。このＤＮＡ断片をBamHI 制限
酵素で消化したのち、小牛小腸アルカリフォスファター
ゼ（ＣＩＡＰ）処理を行なった。ＣＩＡＰはBoehringer
Mannheim 社より入手し、指定の方法で使用した。これ
らの実験で使用した制限酵素、E. coli ＤＮＡ ポリメ
レース、ライゲースの酵素はNew England Biolabs 、Bo
eringer Mannheim (Asp７１８）、Promega(Csp ４５；
AsuII のイソシゾマー) より入手でき、指定の方法で用
いる。

【０１２７】プラスミドｐＢＳ１３＋（Stratagene社よ
り入手) 同様に制限こうそBamHI とHindIII で消化し、
つぎにBamHI 消化CIAP処理３Ｋb 長HindIII 断片とライ
ゲーション反応を行なった。ライゲーション反応後の混
合液をHanahan らの方法にしたがって、大腸菌E. coli
Ｋ１２株DG９８（thi-１、endA１、hsdR１７，lacIQ、l
acZΔM １５、proC::Tn１０、supE４４／F ′、lacZΔM
１５、proC＋、：登録番号３９、７６８としてＡＴＣ
Ｃより入手可能）の形質転換に用いた。アンピシリン耐
性形質転換体（AmpR) から、X-gal 寒天プレート上で青
色示さないコロニーを選択し、形質転換細胞のＤＮＡと
３２Ｐ標識した（γ−３２Ｐ−ＡＴＰによるリン酸化反
応）プライマーＭＫ１４３でハイブリダイゼーションを
行なった。（Woodらの１９８２年Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA７９巻５６６１によるレプリカプレーテイング法
とレプリカされた細胞の溶解法したがって）。１つのコ
ロニーがプラスミドを含んでいて、それをｐＢＳＭ：Ｔ
th５′と命名した。これは約2.５Ｋｂ長のHindIII-BamH
I 制限酵素断片がｐＢＳ１３＋のHindIII-BamHI 断片と
連結してできたものである。

【０１２８】Ｄ．Tth Pol I 遺伝子３′端のクローニン
グ Tth Pol I 遺伝子の3 ′端をプラスミドｐＢＳＭ： Ｔ
th５に挿入しベクターｐＢＳＭ：Ｔthを作製した、これ
には完全なTth Pol I 遺伝子コーディング配列を含んで
いる。サザンブロットおよびＤＮＡシーケンス解析によ
りＴth遺伝子の１２Ｋｂ長のBamHI 断片はＡsp７１８で
切断されて5.６Ｋb 長断片がつくられそれはプローブＤ
とハイブリダイズする（この断片はプローブＣともハイ
ブリダイズするはずである）。5.６Ｋb BamHI −Ａsp７
１８制限酵素断片を作り出すBamHI サイトはプラスミド
ｐＢＳＭ：Ｔth５′作製に用いられた2.５Ｋb HindIII
−BamHI をつくりだすBamHI サイトと同一のものである
こともわかっていた。

【０１２９】Tth ＤＮＡ はBamHI で完全消化され、前
述した方法でサイズによって分画し、１２Ｋb 長を含む
画分を同定し集めた。ビオチン化したプローブＤとＣと
のドットブロットでハイブリダイズする画分を回収しＡ
sp７１８で消化し、ＣＩＡＰ処理を行ない、BamHI −Ａ
sp７１８で消化したプラスミドｐＢＳＭ：Ｔth５′とラ
イゲーション反応を行なった。連結されたＤＮＡは大腸
菌 E. coli Ｋ１２株DG1Ol(thi −１、endAl 、hsdR１
７、lacIQ 、lacZΔM １５、proC::Tn１０）の形質転換
を行なった。

【０１３０】アンピシリン耐性形質転換体（ＡｍｐＲ）
より上述した方法で３２−Ｐ標識したプライマーＭＫ１
３２を用いプラスミドを含む形質転換体を得、ｐＢＳ
Ｍ：Ｔthと名付けた。これには5.６Ｋb BamHI −Ａsp７
１８断片と2.５Ｋb HindIII −BamHI 断片が正規の向き
で配列し完全なTth Pol I 遺伝子を構成していた。オリ
ゴヌクレオタイドＭＫ１３２のシーケンスは完全にTth
Pol I 遺伝子と一致していた。プローブとハイブリダイ
ズするコロニーで制限酵素消化により予想される断片が
生じるいくかのコロニーを選んでＩＰＴＧで誘導を行な
い、Taq Pol I に対するポリクローナル抗体で、誘導を
おこなったサンプルと誘導を行なわなかったサンプルの
ウェスタンブロッティングを行ないＩＰＴＧによって発
現が誘導される蛋白はTaq Pol I とおなじ分子量であっ
た。（約９４ ＫDa）このうちの１つのコロニーをＡＴ
ＣＣへ登録したので承認番号ＡＴＣＣ６８１９５で入手
が可能である。この株を維持するに際しては、プラスミ
ドＤＮＡの逸失をふせぐためアンピシリンを使用し続け
るべきである。ＡＴＣＣ６８１９５はしたがって非形質
転換体ＤＧ１０１細胞を得るために使用することが可能
である。

【０１３１】例３プラスミドｐＬＳＧ２１の構築 ３′非コーディング領域（“下流”）配列をけずると大
腸菌E. coli 内で組換Thermus ＤＮＡ ポリメレースの
発現が増強されることが報告されている。pBSM：Tth を
BstEIIとKpnIで二重消化を行ない、４種のｄＮＴＰ存在
下でクレノー酵素による修復を行なったのち、分子間内
のライゲーション反応がおこるのに適した希釈した条件
でライゲーション反応をさせると３′非コーディング領
域配列がけずられたTth ＤＮＡ ポリメレースが作られ
る。制限酵素BstEIIはプラスミドpBSM：Tth のTth ＤＮ
Ａ ポリメレース３′非コーディング領域内を切断し、
KpnIはベクターのポリリンカー領域を切断する。上の欠
失を行ない作られたプラスミドをプラスミドpLSG２１と
命名した。欠失操作によって制限酵素BestEII サイトは
なくなった。しかしながら、プラスミドpLSG２１はプラ
スミドpBSM:Tthで形質転換した大腸菌宿主細胞で発現し
ているTth ＤＮＡ ポリメレース量をさらに増強させる
わけではなかった。

【０１３２】例 ４プラスミドpLSG２２、pLSG２３、pLSG２４の構築 Tth PolI遺伝子にはその５′端、３′端に都合の良い制
限酵素のサイトがない。このような制限酵素サイトは多
くの種類の発現ベクターを構築するうえで役立つ。更
に、５′端のコドンは高度にＧＣに富んだ配列で、大腸
菌E.coli内で発現および蛋白の翻訳を効率的に開始する
のを阻止する作用がある。オリゴヌクレオタイドを使っ
た、サイトダイレクテッドミュータジェネシス（Site-
directed mutagenesis) 法によりTth PolI遺伝子のコー
ディングシーケンス内および、５′３′非コーディング
領域内、に多くの有用な変更を加えることができる。

【０１３３】プラスミドｐＢＳ１３＋の誘導体、すなわ
ちpBSM:Tthは、LawyerらおよびプラスミドｐＢＳ１３＋
の供給社であるStratagene社のプロトコルにしたがっ
て、一本鎖ＤＮＡのかたちで取り出すことができる。プ
ラスミドｐＢＳ１３＋およびプラスミドｐＢＳ１３＋の
誘導体の一本鎖ＤＮＡを作り出すには、プラスミドで形
質転換されている宿主細胞をヘルパーファージ（Ｒ４０
８など）で感染させて、ファージＤＮＡが生産されるよ
うな条件で培養を行えば良い。ファージＤＮＡを回収す
れば目的の一本鎖ＤＮＡと小量のヘルパーファージ由来
のファージＤＮＡが得られる。目的の一本鎖ＤＮＡは、
そのサイズの違いより、電気流出法などでヘルパーファ
ージＤＮＡを取り除くことができる。

【０１３４】次に示すプラスミドの構築を行なうについ
て、ｐＢＳＭΔＰvuIIの使用が便利である。ｐＢＳＭΔ
ＰvuIIはｐＢＳ１３＋より３８２ｂｐのＰvuII断片を欠
失させたものである。サイトダイレクテッドミュータジ
ェネシスのプロトコルは以下のステップからなってい
る。：(1) 一本鎖ＤＮＡpBSM:Tth（あるいは他のｐＢＳ
１３＋誘導体）と二本鎖ＰvuII消化プラスミドｐＢＳＭ
ΔＰvuIIを分子比１−2.５（pBSM:Tth／ｐＢＳＭΔＰvu
II）でクレノーバッファー中で３分間沸騰させてアニー
リングを行ない、さらに６５℃で５分間インキュベート
する；(2) ミューテーションを導入したオリゴヌクレオ
チドを燐酸化し、オリゴヌクレオチドを９５℃１分で熱
変性後、分子量５−１の割合でギャップ形成デュプレッ
クスにくわえて７５℃に保ち、ギャップ形成デュプレッ
クスとアニーリングを行なう。；(3) この反応ミックス
チュアを７５℃２分間インキュベートし室温まで徐々に
冷却する。；(4) このアニールしたミックスチュアを４
種のdNTP（各２００μＭ）存在下でクレノウ酵素で３７
℃１５分間伸張させ、次に４０μＭ ATPとライゲースを
加える。この反応物をE.coli Ｋ１２ ＤＧ１０１株の
形質転換に使用する。

【０１３５】アンピシリン耐性株を適当なプライマーで
スクリーニングする。プラスミドＤＮＡを保持してい
て、プローブとハイブリダイズするコロニーをＲ６６培
地（0.６％牛肉抽出物、0.６％酵母抽出物、２％ペプト
ン、0.５％NaCl、４０mM KPO₄、pH7.２、0.２％ブドウ
糖、１００μｇ／mlアンピシリン）３mlに入れて、３７
℃８時間インキュベートし、BrinboimとDolyの方法にし
たがって、プラスミドＤＮＡを調製して使用する。得ら
れたプラスミドＤＮＡは制限酵素消化とシーケンシング
を行なって、目的とするプラスミドが得られたか確認す
る。

【０１３６】Ａ．プラスミドpLSG２２の構築 オリゴヌクレオチドＤＧ１２２を用いて、前述の方法で
Tth Pol Ｉ遺伝子コーディングシーケンスのＴＧＡスト
ップコドンの下流にEcoRV 、BglII 制限酵素認識サイト
をプラスミドpBSM:Tth内に変異を加えて作り出し、オリ
ゴヌクレオチドＤＧ１２３でプローブハイブリダイゼー
ションによってかくにんした。これらオリゴヌクレオチ
ドのシーケンスは下の通りである。

【０１３７】

【化７】

【０１３８】得られたプラスミドはpLSG２２と命名し
た。 Ｂ．プラスミドpLSG２３の構築 プラスミドpLSG２２に変異を導入して、Tth Pol Ｉ遺伝
子コーディングシーケンスのＡＴＧスタートコドン部に
BstXI 、AseI(Csp451)制限酵素認識サイトを導入した。
これに加え、コドン２、３及び５−７をアミノ酸残基を
替えないようによりＡＴに富んだシーケンスとなるよう
に変異させた。変異生成に用いたオリゴヌクレオチドＤ
Ｇ１８９は次に示す。

【０１３９】

【化８】

【０１４０】得られたプラスミドをpLSG２３と命名し
た。プラスミドpLSG２３を持った形質転換体は、アンピ
シリン耐性の形質（AmpR）およびオリゴヌクレオチドＤ
Ｇ１１８とのハイブリダイゼーションによって同定し
た。オリゴヌクレオチドＤＧ１１８は次の通りである。

【化９】

【０１４１】Ｃ．プラスミドpLSG２４の構築 プラスミドpLSG２２に変異を導入して、Tth Pol Ｉ遺伝
子コーディングシーケンスのＡＴＧスタートコドン部に
BstXI 、NdeI制限酵素認識サイトを導入した。これに加
え、コドン２、３及び５−７をアミノ酸残基を替えない
ようによりＡＴに富んだシーケンスとなるように変異さ
せた。変異生成に用いたオリゴヌクレオチドＤＧ１９０
は次に示す。

【０１４２】

【化１０】

【０１４３】得られたプラスミドをpLSG２４と命名し
た。プラスミドpLSG２４を持った形質転換体は、アンピ
シリン耐性の形質（AmpR）およびオリゴヌクレオチドＤ
Ｇ１１８とのハイブリダイゼーションによって同定し
た。

【０１４４】例 ５ プラスミドpLSG２７およびpLSG２８の構築 Ａ．プラスミドpBSM:TthΔStuI/HindIIIの構築 プラスミドpLSG２７、pLSG２８は一部が欠失したTth Po
l Ｉ遺伝子を発現させるためのベクターである。欠失は
Tth Pol Ｉ遺伝子コーディングシーケンスのアミノ末端
より約８０コドンをけずってつくられた。このベクター
を構築するため、最初プラスミドpBSM:Tth５′を制限酵
素StuIとHindIII で完全消化された。消化後、プラスミ
ドは４種のdNTP存在下でクレノー酵素処理され、次にラ
イゲーション反応によって環状プラスミドに戻された。
この処理で、Tth Pol Ｉ遺伝子の5 ′非コーディング領
域からコドン７８まで（StuIサイトはコドン７７−７９
にまたがっている）欠失された。pBSM:Tth５′はまたTt
h Pol Ｉ遺伝子コーディングシーケンスの３′端の部分
を欠失している。得られたプラスミドをpBSM:TthΔStuI
／HindIII と命名した。

【０１４５】Ｂ．プラスミドpLSG２５の構築 プラスミドpBSM:TthΔStuI/HindIIIに、オリゴヌクレオ
チドＤＧ１９１を用いて、前述の方法で変異を導入しプ
ラスミドpLSG２５を作った。プラスミドpLSG２５では、
一部が欠失したTth Pol Ｉ遺伝子を、lac プロモータよ
り発現するように、その位置を変えている。更に、lac
Ｚαコーディングシーケンスをけずり、AseI制限酵素認
識サイトをＡＴＧスタートコドンに作製した。変異を導
入するオリゴヌクレオチドＤＧ１９１は次の通りのシー
ケンスである。

【０１４６】

【化１１】

【０１４７】プラスミドpLSG２５を持った形質転換体
は、アンピシリン耐性の形質（AmpR）およびオリゴヌク
レオチドＤＧ１９３とのハイブリダイゼーションによっ
て同定した。オリゴヌクレオチドＤＧ１９３は次の通り
である。

【化１２】

【０１４８】Ｃ．プラスミドpLSG２６の構築 プラスミドpLSG２６の構築は、pLSG２５と同様にＤＧ１
９１の代わりにＤＧ１９２を変異導入のリンカーとして
用いて行なった。ＤＧ１９２のシーケンスは次の通りで
ある。

【０１４９】

【化１３】

【０１５０】プラスミドpLSG２６は、プラスミドpLSG２
５でＡＴＧスタートコドンに作製したAseI制限酵素認識
サイトがNdeIサイトである以外はプラスミドpLSG２５と
同じである。プラスミドpLSG２６を持った形質転換体
は、アンピシリン耐性の形質（AmpR）およびオリゴヌク
レオチドＤＧ１９３とのハイブリダイゼーションによっ
て同定した。

【０１５１】Ｄ．プラスミドpLSG２７とプラスミドpLSG
２８の最終構築 前述したように、pBSM:Tth５′はTth Pol Ｉ遺伝子コー
ディングシーケンスの３′端の部分を欠失しているの
で、プラスミドpLSG２５とプラスミドpLSG２６も同様に
この部分のシーケンスを欠いている。Tth Pol Ｉ遺伝子
コーディングシーケンスの３′端の部分をプラスミドpL
SG２５とプラスミドpLSG２６内に正しいリーディングフ
レームで入れるために、それぞれのプラスミドをBamHI
、EcoRI で完全に消化した。次にプラスミドpLSG２５
のBamHI-EcoRI 断片の大きい断片とプラスミドpLSG２２
の約1.２ＫｂBamHI-EcoRI 断片とをライゲーションさせ
てpLSG２７を作った。プラスミドpLSG２２の約1.２Ｋｂ
BamHI-EcoRI 断片にはTth PolＩ遺伝子コーディングシ
ーケンスの３′端の部分が含まれている。同じようにし
て、プラスミドpLSG２６をBamHI 、EcoRI で完全消化し
プラスミドpLSG２２の約1.２ＫｂBamHI-EcoRI 断片とを
ライゲーションさせてpLSG２８を作った。プラスミドpL
SG２７とプラスミドpLSG２８の大腸菌内での、活性をも
った欠失型Tth Pol Ｉ酵素の発現量は低かった。

【０１５２】例 ６プラスミドpLSG２９からpLSG３４までの構築 pBSM:Tth５、pLSG２１、pLSG２２、pLSG２３、pLSG２
４、pLSG２７、pLSG２８は大腸菌内でTth Pol Ｉ酵素活
性を発現させるために、lac プロモータを持っている
が、lac プロモータより強力なプロモータを使用するこ
とで、Tth Pol Ｉ酵素活性の発現のレベルを上げること
が期待できるのは、技術界では良く知られたことであ
る。有名な強力なプロモータの１つは、ラムダファージ
由来のＰＬプロモータである。更により高いレベルの発
現あるいはより効率的な産生は、Tth Pol Ｉ酵素発現ベ
クターのリボソーム結合サイト、転写終了シーケンス、
複製開始点（あるいは、それに関係したエレメント）に
変更を加えることによって可能である。本例ではTth Po
l Ｉ酵素発現のため、発現ベクター内にどのようにして
ラムダＰＬプロモータ、バクテリオファージＴ７遺伝子
１０、ラムダ遺伝子のＮリボソーム結合サイトを配置し
たかを示した。

【０１５３】Ａ．発現ベクターｐＤＧ１６０およびｐＤ
Ｇ１６１の構築 プラスミドｐＤＧ１６０は以下の性質を備えたλＰ_L ク
ローニング用および発現ベクターである：ラムダＰＬプ
ロモータ、ラムダ遺伝子のＮリボソーム結合サイト（米
国特許第4,７１1,８４５号を参照されたい。参考書類と
して付属）を持つ、ポリリンカー内にクローニングされ
たシーケンスがラムダＰＬ−Ｎ_RBS の制御のもとで発現
できるように制限酵素認識配列サイトポリリンカーを配
置している、Bacillus thuringensis の転写終結配列
（米国特許第4,６６6,８４８号を参照されたい。参考書
類として付属）を持つ。プラスミドｐＤＧ１６０はまた
変異ＲＮＡ II 遺伝子を有し、このプラスミドをコピー
数に対して温度感受性としている（米国特許第4,６３1,
２５７号を参照）。これらのエレメントは共同で働い
て、プラスミドｐＤＧ１６０を非常に有用で強力な発現
ベクターとしている。３０−３２℃では、このプラスミ
ドのコピー数は低く、温度感受性のλリプレッサー遺伝
子（ＣＩ８５７など）を持っている宿主細胞内では、Ｐ
Ｌプロモータは機能していない。３７−４１℃ではプラ
スミドのコピー数は２５−５０倍となり、ＣＩ８５７リ
プレッサーは不活性化し、ＰＬプロモータが機能するよ
うになる。プラスシドｐＤＧ１６０はアンピシリン耐性
マーカ（AmpR）を持っている。プラスミドｐＤＧ１６１
はプラスミドｐＤＧ１６０と同じであるが、アンピシリ
ン耐性マーカー（AmpR）の代わりにテトラサイクリン耐
性マーカ（TetR) を持っている。

【０１５４】このようにして、プラスミドｐＤＧ１６０
とプラスミドｐＤＧ１６１はColEIcop ^tsベクター内
に、AmpR、TetRマーカー、ラムダＰＬプロモータ、ラム
ダ遺伝子のＮリボソーム結合サイト、ポリリンカー、BT
cry PRE （ＢＴポジティブレトロウィルス調節エレメ
ント、米国特許第4,６６6,８４８号）をもった発現ベク
ターである。これらのプラスミドは、前述したプラスミ
ドと合成二本鎖オリゴヌクレオタイドＤＧ３１、ＤＧ３
２から構築された。ＤＧ３１／ＤＧ３２合成二本鎖オリ
ゴヌクレオタイドはその５′端にHind IIIの突出末端を
持ち、続いてSacI、NcoI、KpnI/Asp７１８、XmaI/SmaI
サイトがあり３′端にBamHI の突出末端を持つ。この二
本鎖リンカーのシーケンスを下に示す。

【０１５５】

【化１４】

【０１５６】この二本鎖リンカーとプラスミドｐＦＣ５
4.ｔをプラスミドｐＤＧ１６０の構築に用いた。

【０１５７】プラスミドｐＦＣ５4.ｔは5.９６Ｋｂ長の
プラスミドで米国特許第4,６６6,８４８号に発表されて
いて、承認番号ＡＴＣＣ３９７８９でＡＴＣＣより入手
可能な大腸菌、プロファージλN₇N₅₃cI ８５７をもった
E.coli Ｋ１２株ＤＧ９５を宿主として利用可能であ
り、Hind IIIとBamHＩで消化したのち、分離したベクタ
ー断片を、分子数で５倍以上の脱リン酸化したＤＧ３１
／ＤＧ３２合成二本鎖とライゲーションを行なった。

【０１５８】ライゲーション後、ＤＮＡをXbaIで消化し
( ベクターｐＦＣ５4.ｔ ＤＮＡ断片を不活化するた
め）E.coli Ｋ１２株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ５３、６０
６）をアンピシリン耐性株にするために用いた。コロニ
ーのスクリーニングは制限酵素消化を行なってdes-ala-
ser １２５ＩＬ−２変異蛋白シーケンスがなくなりＤＧ
３１／ＤＧ３２ポリリンカーシーケンスが生じたものを
選んだ。アンピシリン耐性株のひとつのプラスミド（ｐ
ＤＧ１６０と命名した）のポリリンカー部分のシーケン
ス決定を行なって、望んだ構築が達成されていることを
確認した。

【０１５９】プラスミドｐＡＷ７４０ＣＨＢ（承認番号
ＡＴＣＣ６７、６０５としてＡＴＣＣより大腸菌E.coli
Ｋ１２ ＤＧ１１６として入手可能）はBamHI 、Hind
IIIサイトのなくなったテトラサイクリン耐性遺伝子の
供給源として使われるが、これにはColEl cop ^tsベクタ
ー内にラムダＰＬプロモータ、ラムダ遺伝子のＮリボソ
ーム結合サイト、ＢＴ cry ＰＲＥを持っているが、Hi
nd IIIと BamHＩで完全に消化され、4.１９Ｋｂのベク
ター断片をアガロース電気泳動で精製した。精製したベ
クターＤＮＡ断片は分子数で５倍以上の脱リン酸化した
ＤＧ３１／ＤＧ３２合成二本鎖とライゲーションを行な
った。大腸菌E.coli Ｋ１２ ＤＧ１１６株をこのＤＮ
Ａで形質転換し、4.２Ｋｂプラスミドを持つものをテト
ラサイクリン耐性のコロニーから選択した。いくつかの
形質転換体をさらに制限酵素消化あるいはサンガー法に
よるシーケンス決定を行なって、スクリーニングを行な
った。いくつかの形質転換体は望んだシーケンスを持つ
プラスミドを含んでいて、そのプラスミドをｐＤＧ１６
１と命名した。

【０１６０】Ｂ．発現プラスミドｐＤＧ１６４からｐＤ
Ｇ１８１までの構築 Tth の発現を容易にし、翻訳開始の効率をあげるために
ｐＤＧ１６０とｐＤＧ１６１のラムダＰＬプロモータ、
ラムダ遺伝子のＮリボソーム結合サイト（ＲＢＳ）に変
更を加えた。この変更のため、プラスミドｐＤＧ１６０
とｐＤＧ１６１をBspMIIとSacIで消化し、短い合成リン
カーでプラスミド内のBspMII-SacI 断片部をこの合成リ
ンカーで置き換えた。ここで使用したいくつかの二本鎖
リンカーは異なった構造と性質を持ったものである。合
成二本鎖ＤＧ１０６／ＤＧ１０７はバクテリオファージ
Ｔ７遺伝子１０のＲＢＳとＡＴＧスタートコドン内に制
限酵素NdeIサイトをコードするようになっていて、次の
構造となっている。

【０１６１】

【化１５】

【０１６２】合成二本鎖ＤＧ１０８／ＤＧ１０９は修飾
されたＴ７遺伝子１０のＲＢＳとＡＴＧスタートコドン
内に制限酵素AseIサイトをコードするようになってい
て、次の構造となっている。

【０１６３】

【化１６】

【０１６４】合成二本鎖ＤＧ１１０／ＤＧ１１１はλＮ
_RBS とＡＴＧスタートコドン内に制限酵素NdeIサイトを
コードするようになっていて、次の構造となっている。

【０１６５】

【化１７】

【０１６６】合成二本鎖ＤＧ１１２／ＤＧ１１３はλＮ
_RBS とＡＴＧスタートコドン内に制限酵素AseIサイトを
コードするようになっていて、次の構造となっている。

【０１６７】

【化１８】

【０１６８】これらの合成二本鎖とBspMII-SacI で消化
したプラスミドｐＤＧ１６０とｐＤＧ１６１をしたのテ
ーブルの組み合わせでライゲーションし、プラスミドｐ
ＤＧ１６４からｐＤＧ１７１まで作成した。

【０１６９】

【表２】 BspMII-SacI消化ベクター 二本鎖 構築プラスミド pDG160 DG106/DG107 pDG164 pDG160 DG108/DG109 pDG166 pDG160 DG110/DG111 pDG168 pDG160 DG112/DG113 pDG170 pDG161 DG106/DG107 pDG165 pDG161 DG108/DG109 pDG167 pDG161 DG110/DG111 pDG169 pDG161 DG112/DG113 pDG171

【０１７０】これらのプラスミドは、プラスミドｐＤＧ
１６０とｐＤＧ１６１と共にTth PolI遺伝子コーディン
グシーケンスに挿入する前にさらに修飾を加えて、プラ
スミドｐＤＧ１７２からｐＤＧ１８１まで作成した。

【０１７１】この修飾により、プラスミドｐＤＧ１６０
とｐＤＧ１６１およびプラスミドｐＤＧ１６４からｐＤ
Ｇ１７１までのCsp ４５１（AsuII ）制限酵素認識サイ
トが破壊された。本発明中の多くのベクターはTth PolI
遺伝子コーディングシーケンスの５′端にCsp ４５１
（AsuII ）制限酵素認識サイトを持っている。これらの
Csp ４５１欠失ベクターは制限酵素Csp ４５１（AsuII
）で作成した断片のクローニングベクターとして有用
である。Csp ４５１はプラスミドのコリシン^IMM 遺伝子
内にありCsp ４５１で消化して、４種のdNTP存在下で、
クレノー酵素により平滑末端二本鎖ＤＮＡとして、ライ
ゲーションして再び環状プラスミドにして、Csp ４５１
サイトを削った。得られたプラスミドをｐＤＧ１７２か
らｐＤＧ１８１と命名し次のテーブルに示す。

【０１７２】

【表３】出発プラスミド Csp45I部位除去後の命名 ｐＤＧ１６０ ｐＤＧ１７２ ｐＤＧ１６１ ｐＤＧ１７３ ｐＤＧ１６４ ｐＤＧ１７４ ｐＤＧ１６５ ｐＤＧ１７５ ｐＤＧ１６６ ｐＤＧ１７６ ｐＤＧ１６７ ｐＤＧ１７７ ｐＤＧ１６８ ｐＤＧ１７８ ｐＤＧ１６９ ｐＤＧ１７９ ｐＤＧ１７０ ｐＤＧ１８０ ｐＤＧ１７１ ｐＤＧ１８１

【０１７３】ｐＤＧ１７２からｐＤＧ１８１は次に、本
発明のTth PolI遺伝子がλＰ_L プロモータの制御の下で
発現するためのベクターの作成に使われた。

【０１７４】Ｃ．Tth PolI発現ベクターpLSG２９からpL
SG３６までの構築Tth PolI遺伝子を発現ベクターｐＤＧ
１７２からｐＤＧ１８１内にクローニングすればTth Po
lI発現ベクターを作成することができる。いくつかのプ
ラスミドの構築を次のテーブルに示す。

【０１７５】

【表４】 Tth PolIコーディング Tth PolI出発プラスミド シーケンスの供給源 プラスミド発現 pDG174 pLSG24のNde I-Bam HI pLSG31 制限フラグメント pDG174 pLSG28のNde I-Bam HI pLSG35 制限フラグメント pDG175 pLSG24のNde I-Bam HI pLSG32 制限フラグメント pDG177 pLSG23のAse I-Bam HI pLSG29 制限フラグメント pDG178 pLSG24のNde I-Bam HI pLSG33 制限フラグメント pDG178 pLSG28のNde I-Bam HI pLSG36 制限フラグメント pDG179 pLSG24のNde I-Bam HI pLSG34 制限フラグメント pDG181 pLSG23のAse I-Bam HI pLSG30 制限フラグメント

【０１７６】発現ベクターpLSG２９からpLSG３６までを
大腸菌Ｋ１２株ＤＧ１１６に導入し、Tth PolI遺伝子が
発現するような条件で培養した。すべての形質転換体は
ほぼ同程度のポリメレース活性を産生したが、Ｔ７ＲＢ
Ｓをもつベクターに比べ、ＮＲＢＳを持つベクターのほ
うが若干産生が多いようであった。λＰ_L プロモータを
持つベクターもTth PolIを産生しそのレベルはlac プロ
モータを持つ発現ベクターよりすくなくとも１オーダー
高かった。

【０１７７】例 ７大腸菌での組換Tth PolI活性の産生 λＰ_L プロモータを持つTth PolI発現プラスミドを持つ
大腸菌Ｋ１２株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ５３，６０６）
を、0.５％ブドウ糖、１０μｇ／mlチアミン、0.２５％
（Ｗ／Ｖ）Difco 社カゼイン、アンピシリン（１００μ
ｇ／ml）あるいはテトラサイクリン（１００μｇ／ml）
の入ったBonner-Vogel最小塩培地で３２℃で培養した。
細胞は吸光度Ａ_{60 0} が0.８に達したところでλＰ_L プロ
モータを抑制するため（ｃＩ８５７リプレッサを不活性
化）温度を３７℃に変えベクタープラスミドのColEl co
p ^tsのコピー数を増加させた。３７℃で増殖後６時間か
ら９時間後、細胞を回収し、遠心してペレットを−７０
℃に保存した。

【０１７８】別の方法として、大腸菌Ｋ１２株ＫＢ２
（ＡＴＣＣ５３，０７５）をtrp （トリプトファン）プ
ロモータ／オペレータの制御の下でTth PolIを発現する
プラスミドを導入して、その大腸菌を0.５％ブドウ糖、
５μｇ／mlトリプトファン、１０μｇ／mlチアミン、0.
２５％（Ｗ／Ｖ）Difco 社カゼイン、アンピシリン（１
００μｇ／ ml）あるいはテトラサイクリン（１００μ
ｇ／ml）の入ったBonner-Vogel最小塩培地で３２℃で培
養し、吸光度Ａ₆₀₀ が3.０に達するまで培養する方法も
ある。細胞はこのあと前述した方法で回収する。

【０１７９】細胞のペレットは５０mM Tris-HCl pH7.
５ １mM EDTA, 2.４mM PMSF ，0.５μｇ／mlリュウペ
プチンでＯ．Ｄ．が５から１０となるように再浮遊させ
超音波で細胞を溶解する。超音波処理した抽出物をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにかけクーマシー染色あるいはラビット抗
Taq ポリメレース抗体によるウェスタン免疫ブロッティ
ング法で解析した。

【０１８０】ウェスタン免疫ブロッティング法により、
Tth 発現プラスミドを導入された細胞で約９４ＫＤａの
Tth ＤＮＡポリメレースが顕著に合成されていることが
わかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した細胞蛋白のクー
マシー染色でも、細胞中で約９４ＫＤａの新たなポリペ
プチドが誘導発現されていることがわかった。最終的
に、高温下での活性のアッセイにより顕著な量の組換Tt
h ＤＮＡポリメレースが大腸菌で産生されていることが
確かめられた。

【０１８１】例 ８Tth ＤＮＡポリメレースによるＰＣＲ反応 例１で示された、約1.２５ユニットの精製したTth ＤＮ
Ａポリメレースをつかって、Tth 遺伝子内にコードされ
ているTth のrRNAシーケンスの増幅を行なった。反応液
の容積は５０μｌで、反応ミックスには５０pmolのプラ
イマーＤＧ７３、１０⁵ から１０コピーのTth 遺伝子
（約２×１０⁵ 遺伝子コピー／ｎｇＤＮＡ）、５０pmol
のプライマーＤＧ７4,２００μＭ各dNTP，２mM MgCl₂,
１０mM Tris-HCl，pH8.３，５０mM KCl,１００μｇ／
mlゼラチン（入れなくてもよい）が入っている。

【０１８２】反応はPerkin-Elmer Cetus社のＤＮＡ Th
ermal Cyclerで行なった。９６℃１５秒、５０℃３０
秒、７５℃３０秒を１サイクルとして２５−３０サイク
ル行なった。２０サイクルの反応でゲルのエチヂウムブ
ロマイド染色でかすかなバンドが認められ、３０サイク
ルではエチヂウムブロマイド染色したゲルを紫外線で照
らして生産物をはっきりと見ることができた。

【０１８３】Tth ＤＮＡポリメレースのユニット数が少
ないときは（0.３１ユニット／５０μｌ）小量の非特異
的な産物が作られていた。また、laureth −１２のよう
な非イオン性の界面活性を反応混合液中に最終濃度１％
となるように加えておくと、ＰＣＲ産物が増える。プラ
イマーＤＧ７３とプライマーＤＧ７４を下に示す。

【化１９】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ロイヤー，フランセス，シー. アメリカ合衆国94611 カリフォルニア 州オークランド，サロニ ドライブ 6641 (72)発明者 ストッフェル，スザンヌ アメリカ合衆国94530 カリフォルニア 州エル セリト，ガルビン ドライブ 935 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/54 C12N 9/12 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (23)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヌクレオシド三リン酸の結合について触
   媒作用をし、核酸テンプレート鎖に対して相補的な核酸
   鎖を形成する精製された熱安定性ＤＮＡポリメレース酵
   素であって、 サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒ
   ｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来し； ５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有し； 単一のポリペプチド鎖を有し； 約１〜３ｍＭのマグネシウム濃度において、至適ポリメ
   レース活性を示し； 約９４ｋＤａの分子量を有し；そして約５０〜９０℃の
   活性至適温度を有する； 精製熱安定性ＤＮＡポリメレース酵素。
2. 【請求項２】 約６５〜７５℃のより好ましい活性至適
   温度を有する請求項１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメレ
   ース酵素。
3. 【請求項３】 ヌクレオシド三リン酸の結合について触
   媒作用をし、核酸テンプレート鎖に対して相補的な核酸
   鎖を形成する熱安定性ＤＮＡポリメレース酵素であっ
   て、アミノ末端からカルボキシ末端までの下記アミノ酸
   配列： 【表１】 又は上記全配列中のおよそ７９位のアミノ酸からおよそ
   ７００位のアミノ酸までのアミノ酸配列、又は上記全配
   列のＮ−末端から約３分の１までが除去されたアミノ酸
   配列、を有する熱安定性ＤＮＡポリメレース酵素。
4. 【請求項４】 サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍ
   ｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来である請求の範
   囲第３項に記載の酵素。
5. 【請求項５】 ５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有
   する、請求の範囲第３項又は第４項に記載の酵素。
6. 【請求項６】 逆転写酵素活性を有する、請求の範囲第
   ３項〜第５項の何れか１項に記載の酵素。
7. 【請求項７】 単一ポリペプチド鎖を有してなる請求の
   範囲第３項〜第６項の何れか１項に記載の酵素。
8. 【請求項８】 約９４ｋＤａの分子量を有する請求の範
   囲第３項〜第７項の何れか１項に記載の酵素。
9. 【請求項９】 熱安定性ＤＮＡポリメレース活性を有
   し、サーマス・サーモフィルス ポリメレースの一次構
   造に対して蛋白質のアミノ酸配列を変化させるべく、欠
   失、付加又は変更等の修飾を含む蛋白質であって、該蛋
   白質が、請求の範囲第３項に定義されるアミノ酸配列中
   の９個のアミノ酸の少なくとも５個の連続配列に対して
   １００％の相同性を有し、前記９個のアミノ酸の連続配
   列が、アミノ酸位置２３８−２４６，２４１−２４９，
   ３３５−３４３，３３６−３４４，３３７−３４５，３
   ３８−３４６，３３９−３４７からなる群から選択され
   る請求の範囲第３項〜第８項の何れか１項に記載の酵素
   の修飾型酵素。
10. 【請求項１０】 熱安定性ＤＮＡポリメレース活性を有
    し、サーマス・サーモフィルス ポリメレースの一次構
    造に対して蛋白質のアミノ酸配列を変化させるべく、欠
    失、付加又は変更等の修飾を含む蛋白質であって、該蛋
    白質が、請求の範囲第３項に定義されるアミノ酸配列中
    の６個のアミノ酸の少なくとも４個の連続配列に対して
    １００％の相同性を有し、前記６個のアミノ酸の連続配
    列が、アミノ酸位置２２５−２３０である請求の範囲第
    ３項〜第８項の何れか１項に記載の酵素の修飾型酵素。
11. 【請求項１１】 約９０〜１００℃の温度への比較的短
    時間の曝露に対して不可逆的には変性されない請求の範
    囲第３項〜第１０項のいずれか１項に記載の酵素。
12. 【請求項１２】 活性について約５０〜９０℃、より好
    ましくは約６５〜７５℃の至適温度を有する請求の範囲
    第３項〜第１１項のいずれか１項に記載の酵素。
13. 【請求項１３】 酸化、還元又は他の誘導により修飾さ
    れる請求の範囲第３項〜第１２項に記載の酵素。
14. 【請求項１４】 請求の範囲第３項〜第１２項のいずれ
    か１項に記載の熱安定性ＤＮＡポリメレース酵素の製造
    に際し、該酵素をコードするＤＮＡを含んで成る組換え
    ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、そし
    て培地または該細胞から組換えＤＮＡポリメレースを単
    離することを含んでなる熱安定性ＤＮＡポリメレース酵
    素の製造方法。
15. 【請求項１５】 前記組換えベクターが寄託株ＡＴＣＣ
    Ｎｏ．６８１９５から得ることができるプラスミドｐ
    ＢＳＭ：Ｔｔｈである請求の範囲第１４項に記載の方
    法。
16. 【請求項１６】 前記宿主が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で
    ある請求の範囲第１４項又は第１５項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記大腸菌がＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２／
    ｐＢＳＭ：Ｔｔｈ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６８１９５）であ
    る請求の範囲第１６項に記載の方法。
18. 【請求項１８】 請求の範囲第１項、第２項又は第３項
    〜第１３項の何れか一つに記載の熱安定性ＤＮＡポリメ
    レース酵素の精製方法であって、 （ａ）前記細胞由来の粗製細胞抽出物を調製し； （ｂ）前記抽出物のイオン強度を、前記抽出物中のいず
    れの核酸からも前記ポリメレースが解離するように調製
    し； （ｃ）該抽出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに
    かけ； （ｄ）該抽出物を、ＤＮＡ結合蛋白質アフィニティクロ
    マトグラフィーにかけ； （ｅ）該抽出物を、ヌクレオチド結合蛋白質アフィニテ
    ィクロマトグラフィーにかけ；および （ｆ）該抽出物を、陰イオン交換、陽イオン交換および
    ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーからなる群か
    ら選択されるクロマトグラフィーにかけること、 を含んでなる熱安定性ＤＮＡポリメレース酵素の精製方
    法。
19. 【請求項１９】 請求の範囲第１４項〜第１７項のいず
    れか１項に記載の方法により調製され、そして請求の範
    囲第１８項に記載の方法により精製された熱安定性ＤＮ
    Ａポリメレース酵素。
20. 【請求項２０】 緩衝剤および非イオン性界面活性剤中
    に、請求の範囲第１項、第２項、第３項〜１６項または
    １９項のいずれか一つに記載の熱安定性ＤＮＡポリメレ
    ース酵素を含有してなる、鋳型依存的にＤＮＡを合成す
    るための組成物。
21. 【請求項２１】 請求の範囲第１項、第２項、第３〜１
    ３項もしくは１９項のいずれか一つに記載の熱安定性Ｄ
    ＮＡポリメレース酵素または請求の範囲第２３項に記載
    の組成物と、核酸増幅に要する他の試薬とを含んでなる
    キット。
22. 【請求項２２】 緩衝剤中における核酸増幅方法であっ
    て、請求の範囲第１項、第２項、第３項〜１３項もしく
    は１９項のいずれか一つに記載の熱安定性ＤＮＡポリメ
    レース酵素、または請求の範囲第２３項に記載の組成物
    を使用することを特徴とする核酸増幅方法。
23. 【請求項２３】 増幅用緩衝剤中に１〜３ｍＭの量をも
    ってＭｇＣｌ_２が存在する請求の範囲第２２項に記載の
    方法。