JPH05504887A - サーマス サーモフィルス ｄｎａポリメレースの発現ベクターと精製に関する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

１４、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ、２／ｐＢｓＭ：Ｔｔｈである請求の範囲第１２項の 組換宿主細胞 １５、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼＩをＴ 、　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞より精製する方法であって、（ａ）前述の細 胞より細胞粗抽出物を調整し、（ｂ）ポリメラーゼが抽出物中の核酸より解離す るように抽出物のイオン強度を調整し、 （Ｃ）抽出物を疎水反応クロマトグラフィにかけ、（ｄ）抽出物をＤＮＡ結合蛋 白アフィニティークロマトグラフィにかけ、 （ｅ）抽出物をヌクレオチド結合蛋白アフィニティークロマトグラフィにかけ、 そして （ｆ）抽出物を陰イオン交換、陽イオン交換、および１１イドロキシアパタイト クロマトグラフイからなる群より選別されたクロマトグラフィにかけることから なる方法明　細　書 寸−マ入　カーー七フィルス 桿鉢→は軸舒儒←４−　ＤＮＡボリメレースの発現ベクターと精製に関する方法 本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓより精製された耐熱性Ｄ ＮＡポリメレースの精製方法と、本酵素を生成するための組換法に関して記した ものである。耐熱性ＤＮＡボリメレースは数多くの組換ＤＮＡ技術、特にポリメ レース連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の増幅に有用である。 大腸菌ε、　ｃｏｌｉのような中温性細菌からのＤＮＡポリメレースの分離に間 しては、数多くの研究がなされている。これらについては、以下の文献を参照さ れたい。 Ｂａｓｓｍａｎら。１９５７年Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２３３巻、１７ １−１７７゜及びＢｕｔｔｉｎ　ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ　、　１９６６年Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４１巻、５４１９−５２４７゜これに比べると 、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのような好熱性細菌よりＤＮＡポ リメレースを分離、精製する試みは、それほど行なわれていない。Ｋａｌｅｄｉ ｎらが１９８０年Ｂｉｏｋｈｙｍｉｙａ　４５巻６４４−６５１にＴ、　ａｑｕ ａｔｉｃｕｓのＹＴ−１株よりＤＮＡボリメレースを分離、精製する６ステツプ の方法を発表している。このステップには、粗抽出物の分離、ＤＥＡＥセルロー スクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトによる分画、ＤＥＡＥセルロー スによる分画及びＤＮＡセルロースクロマトグラフィーから成っている。それぞ れのステップでの回収産物でのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの 混入は調べられていない。精製された酵素の分子量は１モノマー当たり約６２． ０００ダルトンと報告されている。 Ｔ、　ａｑｕａｔｉｃｕｓよりポリメレースを精製する第二の方法がＣｈｉｅｎ らによって１９７６年Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１２７巻１５５０−１５５７ に記載されている。この方法では、粗抽出物をＤＥＡＥセファデックスカラムに かけている。 透析後の回収画分は次にフォスフォセルロース力ラムにかけられる。回収画分は 透析後にポリメレース活性が失活しないように牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が加 えられる。次にこれをＤＮＡセルロースカラムにかける。回収物は再び透析を行 ない、ゲル濾過法により、分子量約６３、０００ダルトン、ショ糖密度勾配遠心 法によって約６ａ、ｏｏｏダルトンと決定された。 Ｃｈｉｅｎら及びＫａｌｅｄｉｎらによって精製された耐熱性酵素を用いて、特 定の核酸の配列を、反応前に存在する量に比較して大量に増幅させる方法が米国 特許第４．６８３゜１９５号及び４，９６５．１８８号にＰＣＲ法として記載さ れている。プライマー、テンプレート（鋳型）、ヌクレオチド、適当な反応バッ ファ（緩衝液）、反応条件及びポリメレースかＰＣＲ反応に用いられる。この反 応とは、ターゲットとなるＤＮＡの変性、変性ターゲットＤＮＡとプライマー間 でのハイブリダイゼーション（雑種形成）、そして相補鎖の生成である。それぞ れのプライマーからの伸長物は、次には目的となる核酸配列を生成するためのテ ンプレートとなる。特許では次の点が公表されている、即ち、もし用いられるポ リメレースが熱にたいして安定であるならば、それぞれの熱変性ステップ毎に新 たにボリメレースを加える必要がなくなること、すなわち加熱によってポリメレ ースが変性あるいは失活することがなくなる。 欧州特許公報第２５８．０１７号、ＰＣＴ出版第８９１０６６．９１号及び米国 特許第４．８８９．８１８号でＴ、　ａｑ−ＫＤａ）のｒＩＩＫ！、その組換体 の発現及びこの酵素のＰＣＲ法への応用について記載されている。Ｔ、　ａｑｕ ａｔｉｃｕｓ　ＤＮＡポリメレースはＰＣ，Ｒ法及び他の組換ＤＮＡ技術への応 用に有用であるが、他の種の耐熱性ポリメレースの必要も要求されている。 従って、前述したＰＣＲ法を更に改良できるような耐熱性ポリメレース、あるい はＤＮＡ塩基配列決定、ニックトランスレーション法、更に逆転写反応に用いて よりよい結果を引き出せるような耐熱性ポリメレースの精製が技術界で望まれて いる。本出願の発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ ポリメレースの発現ベクターと精製プロトコルを提示してその要求に答えようと するものである。 従って本出願の発明は、与えられたテンプレートの核酸鎖よりヌクレオチドを組 み合わせて、テンプレートに相補的な核酸を合成する反応を触媒する耐熱性酵素 を精製する方法について述べている。精製酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏ ｐｈｉ　Ｉｕｓ由来のＤＮＡポリメレースで遺伝子の塩基配列より予想される分 子量は約９４にダルトンである。 このｍ製物は、温度循環式増幅反応に使われ、この反応で、予め与えられた塩基 配列をもつ核酸が反応前に存在する量より増幅されて、大量に作り出される。そ の結果、この増幅された核酸の配列を、それ以後の反応に利用したりあるいはそ の解析を行なうことが容易に成る。 Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｔｈ　ＤＮＡポリメレース 酵素をコードする遺伝子の同定とクローニングを行ない耐熱性酵素を調製するあ たらしい方法も実現した。 本発明ではまた、前述の精製した耐熱性７ｔｈ酵素が、非イオン性ポリマー変性 剤を含むバッファー中で安定な酵素活性を保つことを明らかにした。 結局、本発明は、耐熱性ポリメレースの精製法について提示している。精製は以 下の過程から成っていて、すなわちＴｈｅｒｔｎｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉＩｕ ｓｍ胞から粗抽出物の調製、粗抽出物中の核酸とＤＮＡボリメレースが解離する ようにイオン強度を調製すること、抽出物を疎水結合性クロマトグラフィにかけ 、つぎにＤＮＡ結合蛋白アフィニティクロマトグラフィにかけ、最後に抽出物を 陽イオン、陰イオン交換カラムあるいはハイドロキシアパタイトカラムにかける 操作から成っている。・実際には、これらのステップは前述した順序で連続的に 行なうことが望ましく、ＤＮＡ結合蛋白アフィニティクロマトグラフィにがける 前に抽出物に非イオン性変性剤を加えておくのが望ましい。核酸結合蛋白アフィ ニティクロマトグラフィは、ＤＮＡポリメレースとエンドヌクレースの分離をお こなうために望ましいステップである。 本発明ではＴｔｈ　ＤＮＡボリメレースとその発現ベクターのＤＮＡシーケンス を提示している。本発明の理解の手助けとして、いくつかの用語を以下のように 定義する　“細胞′、　“細胞株”、　“細胞培養″はそれぞれ同義で互いに変 換可能であり前駆細胞の意味も含めるとする。 従って、　“形質転換体”、　“形質転換細胞”は初期の形質転換細胞及び、そ れからの由来法を含めることとし、その縦代数は考慮しないこととする。すべて の前駆細胞は、由来法あるいは変異によって、そのＤＮＡの内容が全く同一であ ることはない。変異体であってもオリジナルの形質転換株と機能的に同一である ものは同じ“形質転換株′にふくめるユととする。 ”制御配列”とは、特定の宿主器官で、機能的に結合したコーディング配列が発 現するうえで必要とされるＤＮＡ配列である。原核生物に必要な制御配列として は、プロモーターあるいはオペレータ配列、リポソーム結合サイト、またその他 の配列が上げられる。真核生物では、プロモーター、ポリアデニル化シグナル配 列、エンハンサ−配列が使われることが知られている。 “発現系”とは、要求されるコーディング配列と制御配列が機能的に結合したＤ ＮＡシーケンスで、このＤＮＡソーケンスで形質転換された宿主細胞がそのコー ドされた蛋白を生産しうるようなりＮＡノン−ンスである。形質転換を実現する ためには発現系はベクター上に組み込まれた形となるが、このＤＮＡシーケンス は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる可能性もある。 “遺伝子”とは生理活性を持つポリペブタイドあるいはその前駆体をコードする ＤＮＡシーケンスをさす。ポリペブタイドは、遺伝子の全長あるいはその遺伝子 のうち酵素活性を保ちつるような部分のＤＮＡシーケンスか“機能的に結合した “とは、コーディング配列によってコードされた蛋白が発現するとき、制御配列 が機能するようにコーディング配列が配置されていることを意味する。すなわち あるコーディング配列が“機能的に制御配列と結合している゛こととは、コーデ ィング配列が制御配列の下で発現しうるような構成となっている状態を示す。 “混合物″とは、Ｔｔｈボリメレースを含んだ混合物を示し、Ｔｔｈボリメレー ス及び他の蛋白を含む集合体を示す。Ｔｔｈボリメレースが組換宿主細胞由来で あれば、他の蛋白とは、通常宿主に関連した蛋白質である。宿主がバクテリアで あれば、混ざっている蛋白とは、もちろんバクテリアの蛋白である。 “オリゴヌクレオタイド′とはここではデオキシリボ核酸あるいはリホ核酸が２ ないしそれ以上つながったものをさすか、現実には３以上、普通１０以上の場合 を指している。実際必要とされる長さは、多くの要因に左右されるが、オリゴヌ クレオタイド自身の機能あるいはその利用法によって決定される。オリゴヌクレ オタイドは合成あるいはクローニングでめることかできる。 “プライマー′とはここではオリゴヌクレオタイトを指し、制限酵素消化物の精 製あるいは合成することで得られる。プライマーはある塩基配列に相補的なプラ イマー伸張産物が合成されるような条件で、その合成の開始点として働く。この ような条件とはすなわち４種のヌクレオチドと耐熱性Ｔｔｈ酵素か、適切なバッ ファ（バッファには至適ＰＨ１至適イオン強度、補助因子等が実現されている） 、適切な反応温度にあることを指す。Ｔｔｈポリメレースの場合、バッファーに はｌ−３ｍＭのマグネシウム塩、ＭｇＣｌ２．５０　２００μＭ各ヌクレオチド 、０．５５−１ｕ各プライマー、５０ｍＭ　ＫＣＩ　、１０ｍＭトリスバッファ ー、ＰＨ８−８，４、そしてｌ　００　ｕ　ｇ／ｍｌのゼラチンからなる。（ゼ ラチンは必ずしも必要でなく、またＤＮＡシーケンスなどの場合はむしろ必要と しない。）プライマーは増幅反応では一本鎖の場合最も在勤だが、二本鎖である 場合もある。二本鎖の場合、伸張反応に先だって一本鎖に分ける処理が必要とな る。プライマーは通常オリゴヌクレオタ・イドである。プライマーはボリメレー ス酵素存在下で伸長物合成反応を開始させつるに十分な長さをもっている必要が ある。必要とされるプライマーの長さは多くのファクターに左右されるが、プラ イマーのソースあるいは要求される結果の内容で決まる。 プライマーがテンプレートとアニールするためにはプライマーの長さに依存して いるため、それによって反応温度も調節する必要がある。ターゲットとなるシー ケンスは多様なためオリゴヌクレオチドブライマーは通常１５−３５ヌクレオチ ド長にわたっている。短いプライマー長の場合、テンプレートと安定なコンプレ ックスを形成するためにはより低い温度条件が要求される。 プライマーは、テンプレートのシーケンスと　“本質的には“相補的となるよう に選ばれる。プライマーはプライマー伸張が起こるようにテンプレートとハイブ リダイズするために十分にテンプレートと相補的である必要がある。しかし完全 な相補性をそなえている必要はない。 例えば、プライマーの残りの部分が十分テンプレートにな塩基断片が付加されて も良い。またプライマーがテンプレートとハイブリダイズするのに十分な相補性 をそなえていてプライマーとテンプレートがコンプレックスを形成し、プライマ ーから伸張産物を合成するのであれば、非相補的な塩基あるいはそれより長い配 列がプライマー内部に存在しても差しつかえない。 ”制限エンドヌクレアーゼ″あるいは′制限酵素”とは二本ｊＪＩＤＮＡの特定 のシーケンス部あるいはその近傍を特異的に切断するバクテリアの酵素である。 “耐熱性酵素“とは、熱に対して安定もしくは熱に対して抵抗性をしめし、核酸 配列に相補的なプライマー伸長産物を（基質となる）ヌクレオチドを組み合わせ て合成する反応を触媒する酵素である。即ち、プライマーの３′端よりプライマ ー伸長産物の合成を、テンプレート鎖にそって５′端方向へ合成か停止するまで すすめる反応である。 本出願発明の７ｔｈ耐熱性酵素は、ポリメレース連鎖反応として知られる増幅反 応を有効に行なうのに必要とされる条件を満たす酵素′である。Ｔｔｊ酵素はＰ ＣＲ反応でキーステップとなる、二本Ｍ核酸の熱変性に十分な時間高温下にさら されても、酵素の不可逆的な変性（あるいは失活）をおこさない。不可逆的な変 性とは、恒久にあるいは完全に酵素活性をうしなうことをさす。核酸を変性させ るに必要な加熱条件はバッファの塩濃度、変性される核酸の塩基構成、長さによ るが、温度は通常９〇−１０５°Ｃの間で、時間はその温度、核酸の長さに依存 し、数秒から４分位までの間となっている。バッファの塩濃度および核酸内のＧ Ｃ塩基成分が増すに従って、より高い温度が必要となる。Ｔｔｈ酵素は９０−１ ００°Ｃの温度範囲内で比較的短時間さらされる限り、不可逆的な変性は受けな い。 ７ｔｈ耐熱性酵素はそれが機能する至適温度は５０°Ｃより上である。プライマ ーのテンプレートへのハイブリダイゼーションは５０°Ｃ以下でより促進される 。しかし塩の成分、濃度、プライマーの塩基構成、長さにもよるがプライマーの テンプレートへのハイブリダイゼーションはより高い温度でも進み（４５−７５ °Ｃ）、その結果プライマーの伸長反応の特異性は促進され、酵素の至適温度が 高いほど、プライマー伸長反応の特異性、選択性が上がる。Ｔｔｈ耐熱性酵素の 酵素活性の至適温度は５０−９０℃にわたっている。 本出願では、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ耐熱性ＤＮＡポリメレ ースの全長をコードするＤＮＡ塩基配列を提示した。 このＤＮＡ塩基配列とこれより予想されるアミノ酸残基配列を以下に示す。便宜 を図ってＴｔｈボリメレースのアミノ酸配列の番号付けを行なっである。これよ り別の形の耐熱性酵素のデザインを本来のシーケンス全長をもとにして行なった 。 ＣＣＧＡＧαＩＷＡＣＣ？　７１ｅＡＣＣＣＣＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＣＧＣＴ？ ＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣ（ＪｆｆＯズ１ＡＧＣロー’ｃ ｃτＣ献に心ＣＣＣτＣαにＣＡＣＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＧＡＣ＾ｑπαχ℃Ｃ 世ＡＧ丁麿＾ＡＧＧＣＣσ頁コ１℃ＧＴＧＧコア門一つＮズ℃Ｃ譚シ尤ｃｃｃｃ ｃ’ｒｃσ門工℃ＧＣα献石λαズエテＮズ逮ΩＬｙｓＡｌａＶａ　１２　ｈｅ 　Ｖａｎ　ＶａｌＰ　ｈｅＡｓｐＡｌａＬｙａｋｌａ　Ｐ　ｒｏｓｅ　ｒＰｈａ ＡｒｇＨ１ａＱａｌｕａＴｙ窒fｌｕ 〜１４Ｎχ！ＧＡＣＣＴαｒＩＣαＸ：ＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＣＣＧＧＣＴＡＣ ＧＡＧＧＣＧＱＡＣＬｙｓＧｌｕＬｓｕＶａｌＡｇｐＬｅｕＬｅｕＧｌｙＰＭτ 胎窮ｘｑＬ＠　ｕＧｌ　ｕＶａ　ＬＰ　ｒｏＧｌｙ’ｒｙｒＧｌｕＡｌａＡｓＰ ＴＧＧ＾ｍシＬＣＣＧＧＧＧ？Ａ１：ＧＧＣ？ＧＧ＾ＣＧテＧＧＣＣ？ｍＣＡｒ ｇＶａＬＬｅｕＡ１ａｌｕａＭａセＧ１ｕＡｌａＴｈｒＧｌｙＶａ　１ＪＬＨＬ ｅｕＡａｐＶａ　１ｉｌａｃｒＬｅｕＧｌａＡｌａＣゴτニー３詰αテに＠刀入 力Ｎ込παにαにけＣＧぶ詰σ１ｔπテにαｔｉ９にＧＬｅｔ＋ｊｌｅｒＬａｕ ＧｌｕｔａｕＪｕａＧｌｕＧｌｕ　Ｉ　ＬａＡｒｇＡｒｇＬａｕＧｌｕＧＬｕＧ Ｘｕ　ＶａｌＦｈａｉＬｒｇｒａ　≠`Ｌｍ ＧＧＣＣＡＣＧＣＹ！ ＧｌｙｆｌｌｓＰｒｏＰｈａＪ１ａｎＩａ田−ｎ５　ｅｔンηＡｓｐＧ　１ａＬ ｃ　ｕＧｌｕｋｑＶ　ａ　ＬＬｅｕＰｈｅＡＩＩＰＧ１ｕＬ■■ λＧＧＣＴＴＣα℃αテπｔαｖｙ論　ＱχコｃｃＡｃＣＡＧαｔαＸＷＡｒｇ Ｔ−ｅａＰｒｏＡｌａＬｅｕＧｌｙＬｙａＴｈｒＧｌａ！、ｙｇＴｈｒＧｌｙＩ ｒｙａＡｒｇ！３ｅコーＳｓ誌藷＆ＬａＶａ１Ｃ電スαχ＝σＡα℃ω−９℃り ＣαｎＴｃＧ１にｉ４Ａ品ｙ講寡でに０αスα京℃ＭｃにＬｅｕＧｌｕＡｌａＬ ｅｔａｒｇＧｌｕＡ山１１ｓＰｒｏ工１ｅＶａｌＧｌｕＬｙｓＩｌｅ−＋１；ｌ ｎｆＬｉｓＡｒｇＧｌｔｔｒ＜ｕ４Ｇ ｒｃｃｃｘａｚｃａｉ℃Ｃｌ：ｊＷｆｉｄ：ＧＭ；ＧｋＧＧＣｍχＣＴＴｒＡＴ 　ロー！１ｅｒＧｌｎＧ１ｕ＋、＋ｅｕｌｕａ工１ａＰｒｏτｙｒＧＬｕＧｌｕ ＪｕａＶａ１人Ｌａｌ’ｈａ工１ｅＧｉｕＡｒｇｉｒ２ｈｅＧｌｎＣＴＧＧＡＴ Ｎシリ講λＣＡＣＣＣゴ Ｓｅ

【ＰｈｅＰｒ：ｏＬｙｍＶａ話■λＬａ　ＴｒｐＸｌａＧｌ　ｕＬｙｚＴｈ ｘＬａｕＧ１６１ｕＧ　ｌｙｋｇＬｙｓｋｑＧ　１ｙｎｃＧ’２’ＧＧ　Ｃ？Ａ ＣＧ’ＴＧＣＣＣＧＡαゴＱ１αｔαｍτｙｅＶａｌＧｌｕＴｈｒＬａｕＰ　ｈ ｅＧｌｙＪＬｅｇＡｒｇｋｇｇ？ｙｒＶａ　１２　ｒｏｋｓｐＬａｕｋｓｒａＬ ａｋｑ　Ｖａｌｌ、凾■ ５ＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＣＧＣＡ　ＴＧＣＣα’ｎ’ｃａ−ｑズ３αＸ℃ｏχ ℃５ｅｒＶａｕノーｐ７σ１ｕ１」」ｕ−１ｍにｌｕ＾ｘｑｔ４ａヒＡｌａＰｈ ａＡｓｎｊ４−虹ＰｒｏＶａＬＧＬｎＧＩＹτｈｒＡλａＪｕ■ １ｉ０ ＱにＣπスＴＧ丸νにテ四αス賀４↑刀込α］Ｃ−℃工α℃α＝ロエα−庇＆’ ［其Ｇχ℃αにＡａｐＬｅｕＭａｔＬｙａ−田ｕａｇｅｔ　Ｖａ　ＬＬｙｓＬｅ ｔ＋ＰｈａＰ　ｒｏＡｒｇｕｖｓｋｑＧ　ｌｕｓｅｔＧＬｙＡ１ｍｕｇＡ　ＣＧ 　λχテＣＣ’ｌ’Ｃ２ＣＣＣＡＡＧＣｍＪＩＩＧＨａｔＬ−ｕＧシｖａｕｕｓ 入５ｐＧｌｕｊｓｕＬｅｕシｕＧＬ−１−ｒｏＧＩ上記五ｋｇＩｕａＧｌｏＧＬ ｕうえに示したＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびこれらシーケンスをコードする ＤＮＡ化合物が広い宿主細胞にわたってＴｔｈ　ＤＮＡボリメレース活性を発現 しうるような、組換発現ベクターの設計、構築をするために利用された。うえに 示したＤＮＡ配列の全長あるいはその一部分をコートするＤＮＡ化合物は他種の 生物より耐熱性ポリメレースをコートするＤＮＡの同定の目的に使用されるし、 アミノ酸配列は耐熱性ボリメレースを同定し精製するときに使われる抗体をつく るための抗原として利用される。 うえのアミノ酸配列をフードする組換ベクターあるいは本来のＴｈｅｒｍｕｓ　 ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞から用意するにしても、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメレ ースを組換ＤＮＡ技術に応用するためにはまずＴｔｈ　ＤＮＡボリメレースを精 製しなければならない。本発明ではこの精製方法について提示する。生の蛋白を 回収するために、細胞はそれに適した方法で増殖させた。簡単に述へれば細胞を 以下の粗性の１リツターの培地中で繁殖させた。ニトリロトリアセティクアシッ ド（１００’ｍｇ＞、トリプトン（３ｇ）、イースト抽出物（３ｇ）、コハク酸 （５ｇ）、亜硫酸ナトリウム（５０ｍｇ）、リボフラビン（ｌ　ｍｇ）　、Ｋ、 ＨＰＯ，（５２２ｍｇ）　、　Ｍｇ５Ｏ，（４８’ＯＩＩＩｇ）　、ＣａＣｌ２ （２２２ｍｇ）　、ＮａＣＩ（２０ｆｆＩｇ）、および他の微量元素。培地のｐ ＨはＫＯＨで８゜０±０．２に調製した。７０°Ｃで激しく振とうして培養した 場合Ｉリッターあたり２０ｇ以上の細胞が得られた。 後期対数増殖期（５５０ｒ＋ｍの吸光度で判定）の細胞を集めてバッファーてあ らい一２０°Ｃで保存した。 細胞増殖の池の方法としては、ミネラル濃度を定めた０、３％グルタミン、０． １　ｍｇ／　Ｉビオチン、Ｏ，Ｉ　ｍｇ／　ｆチアミン入り培地を用いる方法が ある。この塩にはニトリロトリアセティクアシッド、ＣａＳＯ４、Ｍｇ５ｏ４　 、ＮａＣｌ。 ＫＮＯ，、ＮａＮＯ２、Ｚｎ５Ｏｔ　、　Ｈ＊Ｂ０４、ＣＵＳ’０４　、Ｎａ！ Ｊｏ１４、ＣｏＣＩｘ　、ＦｅＣＩｚ　、ＭＩＩＳＯ４とＮａ２ＨＰＯ４である 。培地のｐＨはＮａＯＨで８．０に調製した。細胞は最初７５°Ｃの温浴ちゅう て振とうしながら培養した。一定の細胞濃度に達したとき、１４Ｌのファーメン タ−に移す。滅菌空気を吹き込んで７５°Ｃでさらに培養を続けた。８時間後遠 心して回収した。 細胞培養後、酵素の分離ｍ製を６段階のステップで行なった、これらのステップ は、室温より低い温度、実際は４°Ｃ付近でおこなわれるのが望ましい。最初に 、細胞は、凍結されている場合は、溶解後、Ａｍｊｎｃｏ　Ｆｒｅｎｃｈｐｒｅ ｓｓｕｒｅ　ｃｅｌｌ　（１８，ＯＯＯｐｓｉ　）　−１ぶしたのち９Ｈ７，５ のバッファーにサスペンドし遠心した。つぎに上溝を回収し、乾燥硫安のような 塩と核酸をのぞくためにボリミンＰを加えて画分化した。沈殿物（０，２Ｍ濃度 硫安）は廃棄した。 第２ステツプで得られた上滑は続いて、０．２Ｍ（ＮＨａ）２ｓＯ＜　５０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ７，５，０，５ｍＭ　ＤＴＴを含むバッファーで 平衡化したフェニールセファロースカラムにかけた。つぎにカラムをバッファー １：０．５ｍＭＤＴＴ、ｏ、　２　Ｍ　（ＮＨ，）ｚｓＯ，を含むＴＥバッファ ー、で洗いさらにバッファー２・０．５ｍＭ　ＤＴＴを含むＴＥバッファー、で 洗いさらにバッファー３：２０％エチレングリコールを含むバッファー２て洗っ た。最後に蛋白をバッファー４：２Ｍ尿素を含むバッファー３で流出させた。 第４ステツプでは、第３ステツプで得られた流出回収物を０．１５ＭＫＣｌで平 衡化したヘパリンセファロースカラムにかけた。カラムは同じバッファーで洗っ たのち、蛋白をＯ，１５Ｍから０．７５　Ｍ　ＫＣＩの線形濃度勾配バッファー を用いて流出させた。活性を示すピークは０．３１Ｍから０．３５５Ｍ　ＫＣＩ のあいだにあった。 第５ステツプでは、前ステップの流出画分を集め、アフィゲルブルーバッファー で濾過透析を行なった。沈殿物は遠心によって取り除き、上溝を０．１　Ｍ　Ｋ ＣＩで平衡化したアフィゲルブルーカラムにかけた。カラムを０．１ＭＫＣｌで 洗ったのち０．１−０．５Ｍ　ＫＣＩ線形勾配のバッファーで酵素の流出を行な った。この画分には耐熱性酵素活性があり、ＤＮＡ５ｅ　（エンドヌクレアーゼ 、エキソヌクレアーゼ）の混入を適当な方法を用いて調べた。即ち、エンドヌク レアーゼ活性はλＤＮＡあるいはスーパーコイルプラスミドＤＮＡと過剰量のＤ ＮＡポリメレースをミックスしてインキュベート後、その分子量の変化を電気泳 動で確かめた。同様に、エキソヌクレアーゼ活性は予め制限酵素で数箇所切断し たＤＮＡを基質としてその分子量の変化を調べた。この両分にはＤ　Ｎ　Ａ　ｓ ｅ活性がないことが確かめられ、（ポリメレース活性のピークは０．２８Ｍ−０ ，４５５Ｍ　ＫＣＩにあった）この画分を回収しＣＭ−トリスアクリルバッファ ー中で透析した。沈殿物は還−Ｃ，−によって取り除いた。 第６ステツプで上溝を５０ｍＭＮａＣｌで平衡化したＣＭ−トリスアクリルカラ ムにかけた。カラムを５０ｍＭＮａＣＩで洗ったのち、酵素を０．０５−０．４ Ｍ　ＮａＣ１線形勾配のバッファーで流出させた。ボリメレース活性をもちＤ　 Ｎ　Ａ　ｓｅ活性を持たない画分が０．１６−０．２０Ｍ　ＮａＣ１の部分に流 出されてきた。 透析を行なったのち蛋白分子量マーカーを使って５ＤＳ−ＰＡＧＥ法なとて分子 量の解析を行なった。 Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメレースの分子量 は上の方法などで約９４ＫＤａと決定された。同じＤＮＡポリメレースの予想さ れるアミノ酸配列より計算された分子量は、おおよそ９４．０１６ダルトンであ った。 ７ｔｈ　ＤＮＡポリメレース生蛋白の精製プロトコルの詳細は例１に示した。本 発明中の組換Ｔｔｈボリメレースの精製も同様の方法で行なわれた。 本発明における重要な点は組換Ｔｔｈポリメレースを作ることにある。前に述べ たように、この酵素をコードする遺伝子をＴｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ｌｕｓ遺伝子ＤＮＡよりクローニングを行なった。２．５　Ｋｂ長の７ｔｈポリ メレースの完全なコーディングシーケンスはｐＢＳＭ：Ｔｔｈ　１０の３゜７Ｋ ｂ　ＨＩｎｄ　ＩＩＩ−ＢｓｔＥＩＩ制限酵素断片中より容易に得られたが、こ の３．７Ｋｂ断片内部にはＨＩｎｄ［Ｉ［の認識サイトが含まれていた。このプ ラスミドは宿主細胞大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２株ＤＧＩＯ＋に感染させたか たちで登録番号６８１９５として１９８９年、１２月２１日Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ）に預 は入れた。 この耐熱性Ｔｔｈボリメレース酵素をコードする遺伝子の完全なコーディングシ ーケンスとアミノ酸ソーケンスを前に述べた。しかし、ＤＮＡボリメレースとし ての生理活性をたもった遺伝′子産物を得るためには、７ｔｈポリメレース酵素 をコードする遺伝子全部が必要であるわけではない。７ｔｈポリメレース酵素を コードする遺伝子シーケンスを使って、ＤＮＡボリメレース活性をもつ変異蛋白 をつくるようにコーディングシーケンスに修飾を加えることも可能となる。３分 の１以上のアミノ末端の蛋白を欠失させても残りの部分にポリメレース活性を持 つとされていて、実際了ミノ末端より１０分の１の欠失させてつくった組換蛋白 はポリメレース活性を保っていた。 このようにアミノ末端を欠失させたボリメレース活性を保っていることより、こ れらのポリメレースを発現する遺伝子構築物としてコーディングシーケンスを短 縮した形のものも含められる。 Ｎ末端の欠失に加え、７ｔｈポリメレースのペプチドチェーンの個々のアミノ酸 残基に、酸化還元その他の修飾によって蛋白が切断されるが、活性を保持した断 片も得られる。活性を失わないような修飾は、Ｔｔｈポリメレース活性を存する 蛋白という定義から外れず、したがって、これらの修飾も本出願発明に含まれる といえる。その蛋白の高温度でのＤＮＡポリメレース活性を失わない様に７ｔｈ ポリメレース遺伝子の一次構造を欠失、付加あるいは翻訳時に取り込まれるアミ ノ酸がかわるように変更を加えることが可能である。ＤＮＡにコードされるアミ ノ酸配列をもつ蛋白の産生の結果生じるこれらの置換あるいは他の修飾も本発明 に含まれるものと思われる。また、Ｔｔｈボリメレース遺伝子の、クローニング された遺伝子配列あるいは、相同な合成された配列はＴｔｈ　ＤＮＡポリメレー ス活性をもつ融合蛋白を発現させるために利用されたり、本来のＴｔｈ　ＤＮＡ ボリメレースとアミノ酸配列が完全に一致した蛋白を発現させるために利用する こともてきる。さらに、この発現の制御も、７ｔｈ　ＤＮＡポリメレース遺伝子 の制御シーケンスによるが、宿主内で機能するような制御シーケンスによるかを 選択することも可能である。 本発明では、多くの種の宿主細胞で利用可能な発現ベクターの構築およびそのコ ーディングシーケンスの発現をさせるためのＴｔｈ　ＤＮＡポリメレース遺伝子 の完全なシーケンスを提示した。７ｔｈ　ＤＮＡボリメレース遺コードしている シーケンスを取り出すためのプローブとして、存用である。即ち、少なくとも、 ４−６個のアミノ酸をコードしている遺伝子ＤＮＡの一部分は大腸菌Ｂ。 ｃｏｌｉのなかで複製できて、それを変性させてプローブとして使うことも可能 であるし、少なくとも４−６個のアミノ酸をコードするオリゴデオキシヌクレオ チドプローブを化学合成して、耐熱性ポリメレースをコードしているほかのＤＮ Ａシーケンスを得ることも可能である。 Ｔｈｅｒ＋ｎｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの耐熱性ポリメレース遺伝子と他 の撞の相当する遺伝子の核酸配列は完全に一致していることはおそらくありえな いので、約１２−１８塩基からなるオリゴマー（４−６個のアミノ酸をコード） を、十分なストリンジエンシーの条件で使えば、偽陽性のないハイブリダイゼー ションを行なうことが可能であろう。 ６個のアミノ酸をコードする配列があれば、プローブ（を設計するため）の十分 な情報が得られる。 本発明では、Ｔｔｈ　ＤＮＡボリメレースのコーディング配列とアミノ酸配列を 提示し、他の種の耐熱性ボリメレース酵素を分離しそ′のコーディング配列を同 定することを可能にする。ＴａｑおよびＴｔｈ　ＤＮＡボリメレース遺伝子のコ ーディングシーケンスは非常に類似していて、この類似性によってＴｔｈ　ＤＮ Ａボリメレース遺伝子を同定、分離することが容易になった。しかしながら、Ｔ ａｑおよびＴｔｈ　ＤＮＡボリメレース遺伝子のコーディングシーケンスの間で 類似性のない部分も、プローブとして、Ｔａｑボリメレースとは全く異なるが、 ７ｔｈ　ＤＮＡポリメレースとは相同性を示すような他の種の耐熱性ポリメレー スを同定する目的に使える。 ＴａｑおよびＴｔｈ　ＤＮＡボリメレース遺伝子の間の異なっている領域がいく つかある。これらの領域はシーケンスコドンの２２５−２３０；２３８−２４６ ；２４＋−２４９；３３５−３４３；３３６−３４４；３３７−３４５　：３３ ８−３４６　；３３９−３４７の部分にある。 ９コドン長を持っているような領域に対しては、これらの領域に対応するプロー ブは、そのプローブと連続して最低５個のコドンが一致（あるいはそれに相補的 な）するような耐熱性ポリメレースをコートするＤＮＡシーケンスを同定、ある いは分離に用いることが可能であろう。 ６コドン長を持っているような領域に対しては、これらの領域に対応するプロー ブは、そのプローブと連続して最低４個のコドンが一致（あるいはそれに相補的 な）するような耐熱性ボリメレースをコードするＤＮＡシーケンスを同定、ある いは分離に用いることが可能であろう。 このような耐熱性ポリメレースをコードするＤＮＡ配列はその相同性が保たれて いるかぎり分離する種は、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ種由来で ある必要はなく、さらにＴｈｅｒｍｕｓ属である必要もない。 本来のＴｔｈ　ＤＮＡボリメレース酵素、あるいはその酵素の誘導体、相同体い ずれかを生産するにしても、Ｔｔｈ　ＤＮＡボリメレースの組換え、すなわち発 現ベクターを構築し、宿主細胞をそのベクターで形質転換し、発現がおこるよう な条件でその形質転換した宿主を培養するといった操作を行なうことになる。発 現ベクターを構築するには、マチュアーな蛋白をコードしているＤＮＡシーケン スあるいは活性を失わないようなシーケンスがＴｔｈ　ＤＮＡポリメレースに加 わった融合ＤＮＡシーケンスあるいは適当な条件で切断されて（ペプチダーゼ処 理なと）活性を生しさせるようなシーケンスが付は加わったＤＮＡノーケンスを 得る必要がある。このコーディングシーケンスを、発現ベクター内で適当な制御 配列と機能的にリンクした形となるように配置する。またベクターは、宿主細胞 内で、自律的に複製したり、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるようにデザ インすることもてきる。ベクターは、そのベクター系に適切な宿主を形質転換す るために用い、形質転換体は組換Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメレースが発現するように 適当な条件で培養される。Ｔｔｈ　ＤＮＡボリメレースは培地中あるいは細胞自 身から分離する、しかし蛋白の回収およびｍ製は、いくらかの不純物が含まれて も構わなジ）ような場合は、必ずしも必要でない。 これから述へるそれぞれのステップには様々な方法で行なわれる。例えば、必要 とするコーディングシーケンスは遺伝子ＤＮＡより取り出して直接に適当な宿主 内に導入して使う場合もありうる。様々な種の宿主内で機能するような発現ベク ターを構築するには、後に概略で述・＼るような、適切なレプリコンおよび制御 配列を使う。 目的とするコーディング配列と創部配列をもつベクターを構築するためには技術 界で良くしられた標準的なテクニックであるライゲーションと制限酵素切断によ って行なう。分離したプラスミド、ＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドは切断され 、修飾され目的の形に再び連結される。 発現ベクターの構築を容易におこなうために、適当な制限酵素認識サイトを、常 に可能な訳ではないが、コーディングシーケンスの末端に付は加えることも、の ちに例示するように可能である。 特定のサイトでＤＮＡを切断することは、適当な制限酵素で適当な条件で反応を 行なってなされ、この条件は技術界で一般にしられている方法かあるいは使用す る制限酵素の供給先の推奨する方法にしたがって行なう。 Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社の製品カタログを見ていただきたい 。一般には、約ｌμｇのプラスミドあるいはＤＮＡは２０μｍの反応液中で１ユ ニツト量の制限酵素で切断されるが、後に示すように完全にＤＮＡを切断するた めには、より過剰量の酵素が使われる。反応インキュベートの時間は普通３７° Ｃで１−２時間であるが、場合により変わることもありうる。反応終了後、蛋白 （酵素）はフェノール、クロロホルム抽出により取り除かれ、この抽出物は続い てエーテルで抽出され、水相中のＤＮＡはエタノール沈殿操作によって回収され る。もし必要ならば、切断断片の大きさによる分離が、標準的なポリアクリルア ミドゲルあるいはアガロースゲル電気泳動法によって行なわれる。これについて は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ−＋ｏｇｙ１９８０年、６５巻、４９ ９−５６０ページを参照されたい。 一本鎖突出末端を持・っな制限酵素切断断片は、４種のチオキンヌクレオシド３ リン酸（ｄＮＴＰ）存在下で、大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメレースＩラ ージフラグメント（クレノーフラグメント）を使って、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ　ｐＨ７，６，５０ｍＭ　ＮａＣ１，］　ＯｍＭ　ＭｇＣｌ２、ＩＯ［ＩＩ ＭＤＴＴ、５−１０μＭ　ｄＮＴＰの粗性の反応液で１５＝２５分２０−２５° Ｃインキュベートして、平滑末端（二本鎖末端）に変えることができる。クレノ ー酵素は４種のｄＮＴＰ存在下でも、５′突出末端は埋めて、３′突出末端は削 る性質がある。したがって、突出末端の性質により制限はあるが、ｄＮＴＰのう ちただひとつあるいは（２−３種）選んで使うことによって、修復を選択的に行 なうことができる。クレノー酵素処理の後、反応液はフェノール／クロロホルム 抽出を行ない、エタノール沈殿する。Ｓ１ヌクレースで適当な条件で処理すると 核酸の一本鎖の部分が加水分解されて切断されるので、同様の結果が３１ヌクレ ースを使っても行なえる。 合成オリゴヌクレオタイドは１９８１年のＪ、　ＡＯＩ。 Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０３巻３１８５−３１９１ページに記載されているＭ ａｔｔｅｕｃｈｉ　らのトリエステル法か、自動合成法によって作ることが可能 である。アニーリングに先だって、あるいは標識の目的で一本鎖核酸のリン酸化 を行なうには過剰量即ち約１０ユニツトのポリヌクレオタイドキナーゼと０．５ μＭの基質ＤＮＡを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、　ｐＨ７，６、Ｉ　Ｏｍ Ｍ　ＭｇＣ１ｚ　、５ｍＭ　ＤＴＴ、Ｉ−２μＭ　ＡＴＰの粗性の反応液インキ ュベートする。もし標識を目的としたリン酸化であれば、ＡＴＰは高比活性のγ −１２ｐを含んでいるものを使用する。 ライゲーションは＋５−３０μｍ容積中で以下の標準的な条件と温度で行なう　 ２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＩＪｇｃＩ２．１０ｄ 　ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１０−５０ｍＭ　ＮａＣ１と、一本鎖末端 が互いに相補的である場合は４０μＭ　ＡＴＰ、０．０１−０．０２（ｗｅｉｓ ｓ）ユニットＴ４ＤＮＡライゲースを０°Ｃて、平滑末端の場合は１ｍＭ　ＡＴ Ｐ、０．３−０．６　（ｗｅｉｓｓ　）　：Ｌニー　ットＴＤ４ＮＡライゲース を１４℃で行なう。相補末端を持つ断片での分子間ライゲーションには３３−１ ００μｇＺｍｌＤＮＡａ度（５−１００ｎＭ末端濃度）、平滑末端の分子間ライ ゲーションには（普通１０−３０倍リンカ−の分子数が過剰となるように）１μ Ｍ末端濃度で行なう。 ベクターの構築にあたっては、ベクター断片は普通バクテリア由来あるいは牛小 腸由来のアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ、ＣＩＡＰ）で、ベクター自身の再 凍結を防ぐために５′端の脱リン酸化を行なう。ＢＡＰおよびＣＩＡＰ消化の条 件は技術界でよくしられているが、入手できるＢＡＰ、ＣＩＡＰ酵素にプロトコ ルが付属してくる。核酸断片を回収するにはフェノールクロロホルムで抽出し、 エタノール沈殿を行なって、アルカリフォスファターゼを取り除きＤＮＡを精製 する。そのほかに再凍結を防ぐ方法として、必要とするベクターのライゲーショ ン反応の前後に、不要なベクター断片の制限酵素消化を行なう方法もある。 ベクターあるいはコープインゲン−ケンスの部分て塩基配列の修飾が必要な部分 に対しては、種々のサイト特異的なプライマーによる変異導入法（ｓｉｔｅ−ｓ ｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　） が利用できる。ボリメレース連鎖反応法（ＰＣＲ法）はサイト特異的変異導入に も応用される。技術界て漂準となっているほかのテクニックとして、必要とする 変異をコードした合成オリゴヌクレオタイドをプライマーとして、ｐＢｓＩ３十 のような一本ｊＪｉＤＮＡベクターを鋳型として、変異プライマーからの伸長産 物を構築する方法がある。変異ＤＮＡは宿主バクテリアに形質導入され、形質転 換したバクテリアはを培養し、プレートにまいて同定を行なう。修飾したベクタ ーを同定するためには、選択された形質転換体からのＤＮＡをニトロセルロース フィルターあるいは池のメンプランに移し、その“リフト”をリン酸化した合成 プライマーを使って修飾したシーケンスとは完全に一致してハイブリダイズし、 もとのシーケンスの配列とはハイブリダイズしないような温度条件でハイブリダ イゼーション反応を行なう。プローブとハイブリダイズするシーケンスを含む形 質転換体を培養し、修飾ＤＮＡのりザーバーとする。 以下で述べる構築について、プラスミドの構築が正しく行なわれたかについては 、最初にライゲージ３ン反応液で大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＧ　Ｉ　０１株ある いは他の適当な宿主の形質転換を行なうことによって確認される。形質転換され たものは、プラスミドの構築の様式によるが、アンピノリン、テトラサイクリン 、あるいはその他の抗生物質に対する抵抗性感受性あるいは他の選択マーカーで 選択され、これは技術界で良くしられていることである。 次に形質転換体からのプラスミドの調製は１９６９年Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ６２巻、１１５９ページのＣｌｅｗｅｌｌの方法 に従い、場合により、クロラムフェニコールによる増幅を加える（Ｃｌｅｗｅｌ Ｌ　１９７２年、Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｉ　ｌ　０巻、６６７）　、プラスミドＤＮＡを得る他 の方法はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで出 版しているＦｏｃｕｓ第５巻、２号の１１ページに報告されている“Ｂａ５ｅ− Ａｃｉｄ　”抽出法で、このステップ１２から１７をセシウムクロライド／エチ ジウムブロマイドＤＮＡ超遠心法に置き換えると非常に純度の高いプラスミドＤ ＮＡが得られる。分離されたＤＮＡは制限酵素消化あるいはシーケンスを行なっ て解析される、ここでシーケンスＳｃｉ、　ＵＳＡ７４巻、５４６３記載のダイ デオキシ法、より詳細には１９８１年Ｎｕｃ１．　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、９巻 ３０９、あるいはｌ９８０年Ｍｅｔｈｏｄｓ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６ ５巻４９９のマキサム法などで行なう。 制御配列、発現ベクター、形質転換法は遺伝子を発現させるために使用する宿主 細胞の種類に依存する。一般に原核細胞、酵母、昆虫あるいは哺乳類の細胞が宿 主として用いられる。原核生物の宿主が一般に、組換蛋白の産生に最も有効で便 利であり、Ｔｈｅポリメレースの発現の目的で好んで用いられた。 組換蛋白の発現のためにもっとも多く使われる原核生物種は大腸菌Ｅ、　Ｃｏ１ １である。クローニング、シーケンスさらに多くのバクテリアのプロモータの制 御の下て発現するベクターの構築のために、大腸菌Ｅ、Ｃｏ１１Ｋ１２株ＭＭ２ ９４、請求番号）ＧＣ３Ｃ＃６１３５で大腸菌Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃ ｅｒ＋ｔｅｒより入手可能、を宿主体として使用する。ＰＬＮ１８１制御配列を 持つ発現ベクターを使う場合は大腸菌Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２株ＭＣＩ　００ ０ラムダラインジエン、Ｎ７’Ｎ５ｓＣ［８５７５ｕＳＰ８０　、　Ａ　Ｔ　Ｃ Ｃ３９５３１、を宿主として使用する。大腸菌ε、　Ｃｏ１１ＤＧＩ！６株はＡ ＴＣＣよりＡＴＣＣ５３６０６として１９８７年４月７日より供給されていて、 大腸菌Ｅ。 Ｃｏ１１　Ｋ８２株もＡＴＣＣよりＡＴＣＣ５３０７５として１９８５年３月２ ９日より供給されていてどちらも宿主細胞として利用できる。Ｍ１３ファージ組 換体には、大腸菌Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｋ　ｌ　２株ＤＧ１８のようなファージ感染 を受ける株を使用する。ＤＣ１８株はＡＴＣＣよりＡＴＣＣ３９７６８として１ ９８４年６月１３日より供給されている。 しかしながら、大腸菌以外の微生物株も使用されていて、たとえばバチルス属の Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂＮＨｓや、種々のＰｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓ属、その 他の微生物株が組換Ｔｔｈボリメレース発現のために使用されている。このよう な原核生物の系では、複製サイトや制御配列は宿主由来のものあるいは宿主と互 換性のある種由来のものを含むプラスミドベクターを使うのが普通である。 例えば、大腸菌Ｅ、　Ｃｏ１１は、Ｂｏｌｉｖａｒらによる１９７７年Ｇｅｎｅ 　２巻９５ページに記載されている方法によって、普通プラスミドｐＢＲ３２２ の誘導体を使って形質転換される。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンとテ トラサイクリン耐性遺伝子を持っている。これらの薬剤耐性マーカーは目的のベ クターを構築する際に保存したままあるいは破壊することによって目的の組換体 の存在をしることができる。普通便われる原核生物の制御配列は、転写開始のプ ロモーターで、場合によってオペレータも付随し、リポソーム結合サイトが続き 、ベーターラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）、ラクトース（Ｉａｃ）プロモータ ーシステム（Ｃｈａｎｇら１９７７年Ｎａｔｕｒｅｌ　９８巻１０５６ページ） 、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９８０ 年Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８巻４０５７ページ）、λ由来ＰＬプロモー タシステム（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら１９８１年Ｎａｔｕｒｅ２９２巻１２８ペー ジ）、Ｎ遺伝子リポソーム結合サイト（Ｎ、、、）が含まれる。ポータプルな制 御配列のカセットが米国特許第４．７１１．８４５号で１９８７年１２月８日付 けで発表されている。このカセントはＰ、プロモータシステムがＮ０３と機能的 に連結して、その下流に第３のＤＮＡシーケンスでＮ□、３′端より６８ＰＬ） 、内の位置で切断されるような制限酵素認識サイトをもつものが配置されている 。欧州特許公￥Ｆ！第１９６．８６４号１９８６年ｌＯ月８日出版にＣｈａｂｇ らか記載しているフすスファターゼＡ　（ｐｈｏＡ）システムも有用である。し かしながら原核生物に互換性をもつプロモータシステムであればとれてもＴｔｈ 発現ベクターの構築に使えるだろう。 バクテリアに加えて、酵母のような微小な真核生物も組換宿主細胞として使える 。多くの種類の株が利用できるが、実験系の株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ、パン酵母が最も多く使われている。２μｍ複製開始点をも つ、ベクターが最も普通に使用されるが（Ｂｒｏｃｈ、１９８３年Ｍｅｔｈ、Ｅ ｎｚ、１０１巻３０７ページ）、酵母で発現させるに適した他のプラスミドベク ターもしられている（　５ｔｉ−ｎｃｏ＋ｎｂら、１９７９年Ｎａｔｕｒｅ２８ ２巻３９ページ、Ｔｓｃ−ｈｅｍｐｅら、１９８０年ＧｅｎｅｌＯ巻１５７ペー ジ、ＣＩａｒｋｅら、１９８３年Ｎｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　Ｉ　０１巻、３００ペ ージなどを参考されたい。） 酵母ベクターの制御配列には糖分解酵素の合成を制御するプロモータが含まれて いる（Ｈｅｓｓら、１９６８年Ｊ、　Ａｄｖ、ＥｎｚＹｍｅ　Ｒｅｇ、　７巻、 １４９ページ、Ｈｏ１ｌａｎｄ　ら、１９７８年Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　 １７巻、４９００ページ）。 その他の技術界でしられたプロモーターとしては、３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃ ｅｒａｔｅ　ｋｉｎａｓｅのプロモータ（Ｈｉｔｚｅｍａら、１９８０年、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５５巻、２０７３ページ）や他の糖分解酵素すなわち 、ｇ＋ｙｃｅｒａｉｄｅｈｙａｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅ ｎａｓｅ、ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ、ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａ ｓｅ。 ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ、ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈ ａｔｅ　１ｓｏｅｒａｓｅ。 ３−ｐｈａｓｐｈｏｇＩｙｃｅｒａｔｅ　ｍｕｔａｓｅ、　ｐｙｒｙｖａａｔｅ 　ｋ】ｎａｓｅ、　ｔｒｉｏｓｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、 ｐｈａｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ　１ｓｏｔｎｅｒａｓｅ、ｇＩｕ−ｋｏｋｉｎａ ｓｅなとのプロモータ配列がある。培養の条件で転写を制御できる利点をそなえ ている他のプロモーターとして、ａｌｃｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　 ２　、ｉｓｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ。 ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、窒素代謝と関係した分解酵素、マルトース 、ガラクトースの利用に関係した酵素のプロモーターがある。（Ｈｏ１ｌａｎｄ ’、５ｕｐｒａ）　。 転写終了配列（ターミネータ配列）もコーディング配列の３′端に配置されたと き発現を増強させる作用を利用される。このようなターミネータ−は、酵母由来 の遺伝子でコーディング配列の３′側の非翻訳領域に見いだされる。多くのベク ターでは、プラスミドｐｅｎｏ４６（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９８１年、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６巻、１３８ページ）のエノラーゼ遺伝子由来の制御配列 や、Ｙ　Ｅ　ｐＩ　３　（Ｂｒｏａｃｈら、１９７８年　Ｇｅｎｅ　８巻、１２ １ページのＬＥＵ２遺伝子を含んでいるが、しかしながら酵母に互換性をもつプ ロモータシステム、復製開始点、その他の制御配列が酵母に互換性をもつもので あればどれでもＴｔｈ発現ベクターの構築に使えるだろう。 Ｔｔｉ遺伝子はまた多細胞系の真核細胞を宿主として発現させることも可能であ る。このような例として、ＣｒｕｚとＰａｊｔｅｒｓｏｎ　Ｊｌ集のＡｃａｄｅ ｍｉｃ出版社のＴｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＮ９７３年）を参考にされたい。 有用な宿主細胞株として、ＣＯ３−７、ＣＯ３−Ａ２、ＣＶ−１，！歯頚の細胞 としてマウス骨髄腫細胞Ｎ５１．ＶＥＲＯ，ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムス ター卵巣細胞（ＣＨＯ）なとかある。このような細胞にだいする発現ベクターに は普通哺乳類細胞に共通なプロモーターと制御配列が含まれていて、例えばシミ アンウィルス４０（ＳＶ４０）のアーリープロモータ（Ｆｉｅｒｓ　ら、１９７ ８年Ｎａｔｕｒｅ、２７３巻、１１３ページ）、レイトプロモータ、あるいは他 のウィルス由来のプロモータすなわちポリオーマ、アデノウィルス２盟、牛パピ ローマウィルス（ＢＰＶ）、トリ肉腫ウィルスなど、また免疫グロブリンのプロ モータや熱ショックブＯモータが使われる。 ＢＰＶプロモータを使った哺乳類細胞系でＤＮＡを発現させる系については、米 国特許第４．４１９．４４６号に発表されている。またこの系の修飾を加えたも のについても、米国特許第４．６０１．９７８号に発表されている。 哺乳類細胞系での形質転換に関する概論は米国特許第４゜３９９．２１６号にＡ ｘｅ　ｌが発表している。“エンハンサ−”の領域もまた発現を最適化するもの として重要であり；これは普通プロモーターの上流に位置している。もし必要で あれば、ウィルスより複製開始点を得ることも可能である。しかしながら、真核 細胞ではＤＮＡの複製機構としては染色体へ組み込まれて行なわれることが普通 である。 植物細胞も宿主細胞として利用可能であり、植物細胞で共通な制御配列すなわち ツバリン合成酵素のプロモータやポリアデニル化シグナル配列（Ｄｅｐｉｃｋｅ ｒら、１９８２年、Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、１巻、５６１ページ）か使 われる。バキュロウィルスベクターの制御配列を使用した昆虫細胞での発現系に ついても報告されている（Ｍｉ　Ｉ　ｌｅｒら、Ｐｌｅｎｕｍ出版社、Ｓｔｅｌ ｏｗら編集Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　８巻、２７７−２９７ペ ージ）。昆虫細胞をベースにした発現系は５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐ ｅｉｄａを用いて行なわれティる。 これらの系でも組換ｒｔｈボリメレースの産生に成功している。 使う宿主細胞によるが、形質転換はその宿主に適した標準的な方法で行なわれる 。Ｃｏｈｅｎらによる１９７２年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ６９巻２１１０ページに記載されている、塩化カルシ・ラムによるカルシウ ム処理法が、原核生物その他の細胞膜をもっている細胞に対して行なわれる。あ る種の植物細胞に対してはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕＩｌｌｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓ（Ｓｈａｗら、１９８３年、Ｇｅｎｅ、　２３巻、３１５ページ）を用いた 感染法も行なわれている。哺乳類細胞に対しては、ＧｒａｈａｍとＶａｎ　ｄｅ ｒ　Ｅｂによる、１９７８年Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５２巻５４６ページのリン酸 カルシウム沈殿法が好んで用いられている。酵母での形質転換は、ＶａｎＳｏｌ ｉｎｇｅｎらの、１９７７年Ｊ、Ｂａｃｔ、　、１３０巻９４６ページとＨｓｉ ａｏらの、１９７９年Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ。 ７６巻３８２９ページ、の方法に従って行なわれる。 宿主細胞内でのＴｔｈポリメレース遺伝子が発現できるようになると、その蛋白 の精製が必要になる。前述した精製方法により組換耐熱性ポリレメースの精製を 行なえるが、疎水結合性クロマトグラフィによる精製が望ましい。疎水結合性ク ロマトグラフィは、疎水性のグループを含んだ電荷をもたないカラムベッド材を 使用して、疎水結合力の差に基づいて物質を分離する方法である。普通、カラム は最初疎水結合がおきるような条件すなわち高イオン強度の条件で平衡化される 。塩濃度を下降させることによってサンプルの流出を行なう。 本発明では、水性の混合物（元々の、あるいは組換たＴｔＤＮＡポリメレースを 含んでいる）を、フェニールセファロース（ファルマンア社より購入）やフェニ ールＴＳＫ（東洋ソーダ社より購入）などの比較的疎水性の強いゲルをつめたカ ラムにのせる。フェニールセファロースカラムとの疎水結合を促進するために、 ０．２Ｍ以上（０゜２Ｍが望ましいが）の硫安を含む溶媒を使用する。カラムと サンプルを、ＩｍＭ　ＤＴＴを含む５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。 ｐＨ７，５、Ｉ　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａバッファー（ＴＥバッファー）中で０． ２Ｍ硫安濃度に調節し、サンプルをカラムにかける。次にカラムを０．２Ｍ硫安 バッファーで洗う。次に、疎水結合を弱めるような溶媒系即ち、塩濃度を下降さ せたり、エチレン、プロピレングリコール、尿素なとで洗いだすことで酵素が流 出されてくる。組換ＴｔＤＮＡボリメレースに対しては、カラムをＴｒｉｓ−Ｅ ＤＴＡバッファーと２０％エチレングリコール入りＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファ ーで連続して洗うのか望ましい。ＴｔＤＮＡボリメレースは続いて、カラムを０ −４　Ｍａ度勾配のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡエチレングリコールバッファーで流出さ れてくる。 長期間にわたって安定させるためには、ＴｔＤＮＡボリメレースを一種ないしそ れ以上の非イオン性ポリマー性の変性剤の入ったバッファー内に保存する。この ような変性剤としては分子量が１００から２５０．０００ダルトン位、好ましく は４．０００から２００．０００ダルトンくらいでｐＨが３．５から９．５、好 ましくは４から８．５（らいて酵素を安定化させるものが一般に使われている。 このような変性剤は１９８３年ＭＣ出版社（１７５Ｒｏｃｋ　Ｒｏａｄ。 Ｇｌｅｎ　Ｒｏｃｋ、ＮＪ（ＵＳＡ）ＭｃＣｕｔｈｅｏｎ部門より出版されたＭ ｃＣｕｔ−ｈｅｏｎ’ｓ　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　＆　ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ 北米版の２９５−２９８ページに特集が組まれている、ここにすべて参考書類と して付属しである。変性剤は以下のようなグループから選ぶのが良い、エトキシ 化脂肪酸アルコールエーテル、ラウリルエーテル、エトキシ化アルキルフェノー ル、オクチルフェノキ′シボリエトキシエタノール複合物、オキシエチル化直鎖 アルコールあるいはオキシプロピル化直鎖アルコール、ポリエチレングリコール モノオレート複合物、ポリソルベート複合物、フェノリック脂肪酸アルコールエ ーテルなと。さらに推奨するものとして、Ｔｗｅｅｎ　２０、ポリオキシエチル 化（２０）ソルビタンモノラウリエート（ＩｃＩ　Ａｍｅｒｉｃａｓ社、Ｗｉ　 １ｍｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、　Ｅ、　）とＮＰ４０、エトキンル化アルキルフェノ ール（ノニル）　（ＢＡＳＦ　Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ社Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、　 ＮＪ　）がある。 本発明のＴ　ｔ　ＤＮＡボリメレースは、この酵素の活性が必要あるいは望まれ るような目的にたいして使用することが可能である。特にこの酵素はＰＣＲとし て良く知られている核酸の増幅反応を触媒する。この核酸のシーケンスを増幅さ せるプロセスは米国特許第４．６８３．２０２号、これは参考として付随しであ る。ＰＣＲ核酸増幅法は、核酸あるいは核酸の混合物中の少なくとも一種以上の 核酸配列を増幅して二本ＭＤＮＡを作り出す方法である。 わかりやすくするために、以下で述へるプロトコルでは、増幅される特定のシー ケンスとは二本鎖核酸であるとする。しかしながら、この方法は、ｍＲＮＡのよ うな一本鎖核酸を増幅するにも同様に有効な方法である、ただ最終的な産物は二 本鎖ＤＮＡであるが。−重鎖核酸の増幅では、最初のステップはその相補鎖の合 成て（２つの増幅用プライマーのうちの１つがこの目的で使われる）、続いてい かに述へる二本鎖核酸の増幅過程が連続して行なわれる。 この増幅の過程は以下のステップから構成される：（ａ）各々の核酸鎖と、４種 のヌクレオシド３リン酸と、各々の核酸鎖の特定の増幅させるシーケンスに対す るオリゴヌクレオチドブライマーとを接触させる過程で、ここでそれぞれのプラ イマーは特定のシーケンスに対して十分相補性をもっていて、プライマーより伸 長産物が合成され、伸長産物かその相補鎖より離れると、次に別のプライマーか らの伸長産物合成の鋳型となり、ここで接触とは各々のプライマーとそれの相補 鎖かハイブリダイゼーションを行ないえるような温度であって、（ｂ）各々の核 酸鎖と′Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｊｌｕｓ由来のＤＮＡポリメレース とを、同時にあるいはステップ（ａ）のあとで、接触させ各々の核酸鎖の特定の シーケンスに相補的なプライマー伸長産物を４種のヌクレオシド３リン酸の組み 合わせで産生し： （Ｃ）ステップ（ｂ）の混合物を、各々の核酸鎖に相補的なプライマーからの伸 長産物すなわち増幅されるシーケンスを合成するように酵素活性を高めるために 、有効な温度に有効な時間、ただし各々の伸長産物が鋳型績より離れてしまうほ どの高温にはせず、保って、：（ｄ）ステップ（Ｃ）の混合物を、鋳型績とその 伸長産物とが離れて一本鎖分子となるように十分な時間十分な温度で、ただし酵 素が不可逆的に変性を起こさないほどの温度で、加熱し： （ｅ）ステップ（ｄ）の混合物を、プライマーとステップ（ｃｌ）の−重鎖分子 とがハイブリダイゼーションを形成するのに必要な温度に必要な時間冷却し：（ ｆ）ステップ（ｅ）の混合物を、ステップ（ｄ）でつくられた鋳型績に相補的な プライマーからの伸長産物すなわち増幅されるシーケンスを合成するように酵素 活性を高めるために、有効な温度に有効な時間、ただし各々の伸長産物か鋳型績 より離れてしまうほどの高温にはせず、保つ。ステップ（ｅ）　、（ｆ）にある 有効な温度、時間とは同じ値であって、したかってステップ（ｅ）　、（ｆ）は 同時に行なえるものである。ステップ（ｄ）−（ｆ）は必要とされる増幅レベル に達するまで反復して行なわれる。 増幅反応は、シーケンスのわかっている特定の核酸を大量に増殖させるだけでな く、存在することはわかっているが、まだ完全に明らかになっていない核酸シー ケンスを増やすのに有効である。特定の核酸の両端のシーケンスのある程度の塩 基配列が、ある程度の正確さてわかっていれば、各々の核酸鎖の目的のシーケン スで必要な位置にハイブリダイズする２本のプライマーが用意できて、プライマ ーからの伸長産物が合成され、その伸長産物が鋳型績より分離すると別のプライ マーからの伸長産物の鋳型績となって決められた長さの核酸シーケンスとなる。 シーケンス両端の塩基配列に関する情報が多いほと、ターゲットとなる核酸に対 する特異性は増加し反応の効率も高くなる。いずれにしても、増幅すべきシーケ ンスの最初のコピー（復製物）は得られるので、核酸シーケンスは精製あるいは ある一定の分子量が必要されることはない。一般的に、増幅反応は反応ステップ 数に応じて指数的に産生ずる連鎖反応であり、その反応は最低１つの特定の核酸 シーケンスが与えられ、（ａ）その両端のシーケンスの情報かそれとハイブリダ イズするプライマーを合成するにじゅうぶんな程度わかっていて、（ｂ）その連 鎖反応を開始するための小量の核酸があって引き起こされる。連鎖反応の産生物 は、その両端に使用した特異的プライマーの構造を反映したシーケンスを持った 特定の二本鎖核酸である。 反応開始における核酸としては、その核酸が含まれているものあるいは含まれて いると思われるものであれば、精製されていても精製されていなくても構わない 。増幅するための核酸は任意の材料が使用可能で、例えばプラスミドｐＢＲ３２ ２や、クローン化したＤＮＡ、ＲＮＡ、バクテリア、酵母、ウィルス、微生物、 より高等な植物、動物なと任意の原材料からのＤＮＡ、ＲＮＡから得ることがで きる。ＤＮＡ、′ＲＮＡは血液あるいは絨毛、羊水細胞などの組織から種々の技 術を用いて抽出することも可能である。これについては、Ｍａｎｉａｔｉｓらの ５ｕｐｒａ　２８０−２８１頁を参照されたい。このようにこの過程はＤＮＡあ るいはメツセンジャーＲＮＡをふくむＲＮＡを取り扱うもので、ＤＮＡ、ＲＮＡ は一本鎖あるいは二本鎖いずれの構造でも良い。あるいはＤＮＡ−ＲＮＡのハイ ブリッドでも利用可能である。これらの任意の核酸がミックスされたものでも増 幅反応によって核酸が産生される（プライマーは同じであっても、異なってもよ い）。 増幅される特定の核酸配列は、出発材料のほんの一部分であっても良いし、最初 からある一定の量、出発材料金部であっても良い。 増幅されるシーケンスは反応開始時精製された形である必要はなく、混合物中小 量あればよく、全ヒトＤＮＡ中のベータグロビン遺伝子（Ｓａｉｋｉ　ら、１９ ８５年５ｃｉｅｎｃｅ　、　２３０巻、１５３０−１５３４ページ）やある微生 物の一部分の核酸配列でその微生物か生物材料中に極く一部しか含まれていない ような場合が例にあげられる。細胞は低張バッファーに浮遊させ９０−１００° Ｃの熱処理を、細胞が溶解し細胞内成分が一様にとけるまで（普通１−１５分） 行なうことによって、直接に増幅反応に使用できる。熱処理の後、増幅反応のた めの試薬を直接細胞溶解液中に加える。反応開始時の核酸は目的の核酸配列以外 のものが加わっていても構わない。増幅反応は一種の核酸シーケンスを大量に増 幅させるだけでなく、同じ核酸上あるいは別の核酸にのっている一種以上の異な った核酸シーケンスを同時に増幅させることも可能である。 ＰＣＲ反応ではプライマーが重要な役割を担っている。 “プライマー″という語はこの増幅反応の記述においては一つ以上のプライマー の集まりを指すこととし、とくに増幅される核酸断片の端部に関する情報に曖昧 さがあるとき適応される。例えば、核酸シーケンスが蛋白シーケンスの情報より 類推されるような場合、ＤＮＡ遺伝子コードの縮退によるすへての可能性のコド ンの組み合わせをふくむプライマーのセットを各々の鎖に使うことを指す。これ らのセントのうちの一つが目的の核酸ノーケンスの端部と十分なホモロジーを持 っていれば、このプライマーの増幅反応で有効に働くことになる。 更に適当な数の異なったプライマーを使えば、数種の核酸シーケンスが、最初の 反応開始液中の核酸あるいは核酸のミンクスされたものから増幅されてくる。例 えば、２種類の異なった核酸シーケンスを増幅させようとすれば、４つのプライ マーを使用すれば良い。このようにして、２種票の異なった核酸シーケンスがこ の方法で指数的に産生される。 より反応の特異性を増すために、あるシーケンス内の特定のシーケンスを、一定 の反応サイクル後に増幅することも行なわれ、すなわち少なくとも１回以上の反 応サイクルを行なった後、増幅させるべき内部シーケンス（最初の増幅反応での 端部のシーケンスとは異なる）に相補的なプライマーの組を加えて行なわれる。 このようなプライマーは任意の反応のステージで加えても良く、その結果より短 い増幅断片か産生される。これとは別に、府に使用したプライマーとオーバーラ ツプする部分をもつか５′端では非相補的なシーケンスを持つプライマーを使用 した場合は、より長い断片が増幅されてくる。 プライマーはまた、増幅反応をインビトロ変異導入法（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕ ｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に応用するときも重要な役割を果たす。使われるプライマ ーが完全にオリジナルの鋳型と相補性を持っていないとき、増幅反応でできる産 物は、鋳型ではなくプライマーのシーケンスを含んでいて従って、ｉｎ　ｖｉｔ ｒｏの変異が導入されたことになる。この先のサイクルになると、ミスマツチを おこしたブライミング反応はもはや起きないので、導入された変異が効率を下げ ることなく増幅されてくる。上述したＤＮＡシーケンスを変えるプロセスは、プ ライマーを変えることによって、変わったＤＮＡシーケンスにだいし繰り返し行 なって、さらにＤＮＡシーケンスに変更を加えることができる。このようにして 、一連の変異シーケンスを、それぞれ新たな変更を加えることによって、一つ前 のプロセスと比べると微小な変化だかもとのＤＮＡシーケンスとくらへると大き な違いとなるように、段階的に作り出すことができる。 プライマーは、増幅、させる鎖に対する相補性をある程度含んでいれば、一部分 に非相補性の部分を含んでいてもよいので、ほかの育益な応用も達成できる。例 えば、鋳型鎖とは非相補的な塩基配列（プロモータ、リンカ−、コーディング配 列など）をプライマーの片方あるいは両方の５′端に加えて、増幅反応で生産物 にそのシーケンスを付は加えることができる。伸長プライマーを加えた後、十分 な反応サイクルをおこなって、非相補的な挿入配列をもった新しい鋳型を必要な 量つくることができる。 この結果、簡単な方法で比較的短時間に（２時間あるいはそれ以内）、組み合わ された断片を大量に作ることができる。 オリゴヌクレオタイトプライマーは適当な方法を用いて用意することができるが 、たとえば前述したようなフすスフオトリエステル、フオスフオダイエステル法 や、あるいはそれを自動化した方法で作られる。自動化した方法の一つとして、 ジエチルフオスフォアミダイトを材料として、合成する方法がＢｅａｕｃａｇｅ ら、１９８１年Ｔｅｔ−ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２２巻、１８５９− １８６２ページに記載されている。また、改良した固相支持体を使ってオリゴヌ クレオタイドを合成する方法が米国特許第４，４５８、０６６号に発表されてい る。またプライマーは生物材料より分離することもできる（制限酵素消化による 断片など） どのようなプライマーを使うにしろ、反応液中にはＰＣＲ反応か起きるために鋳 型が入っていなくてはならない、というのは特定のシーケンスは、その特定のシ ーケンスを含む核酸を鋳型として増幅されてくるからである。 最初のステップでは各々の核酸鎖が４種のヌクレオシド３リン酸と増幅されるそ れぞれの核酸鎖に対するオリゴヌクレオタイドプライマーとの接触が起こる。も し増幅されてくる核酸がＤＮＡであるならば、ヌクレオシド３リン酸は普通ｄＡ ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰであるが、種々の誘導体もこの反応で使用 可能である。 ヌクレオシド３リン酸の濃度は広い範囲にわたって選べる。普通、５０−２００ μＭ各ｄＮＴＰ濃度が増幅反応として選ばれ、Ｉ　−３ｍＭ　ＭｇＣ１，が反応 の効率と制度を上げるためにバッファー・に加えられる。しかしなからＤＮＡシ ーケンスのような場合はｄＮＴｐＨ度は１−２０μＭが望ましい場合もある。 ターゲットとなる核酸鎖は、さらに核酸を合成する際の鋳型として働く。この合 成は適した方法によって行なえるが、普通緩衝化した水性の溶液中で行なわれ、 ＰＨは７−９か好ましいが、約８付近か最も望ましい。合成を行なうにはモル数 過剰のくクローン化した核酸の場合１０００：１＝プライマー、テンプレート、 遺伝子核酸の場合１０’：１＝プライマー：テンプレート）２つのオリゴヌクレ オタイトプライマーを鋳型類が含まれているバッファー中に加える。実際には、 加えるプライマー量は、増幅されるシーケンスが種々の長い核酸のミックスされ たもののなかにあるような場合は鋳型類にくらベモル数過剰とする。反応を効率 良く進めるには大モル数過剰とするのか望ましい。 鋳型、プライマー、ヌクレオシド３リン酸の混合物は、増幅あるいは検出する核 酸が一本鎖か二本鎖かによって、それぞれ処理される。もし核酸が一本鎖である ならば熱変性のステップは必要でなく、反応液はプライマーと鋳型とがハイブリ ダイズ・−ジョンを形成するような温度条件にされる。この温度とは普通３５− ６５°Ｃあるいはそれ以上であるが、３７−６０°Ｃ位が好ましく、有効な時間 は普通２．３秒から５分であるが３０秒から１分が望ましい。ＴｔｈＤＮＡポリ メレースではハイブリダイゼーション温度は４５−５８°Ｃて行なわれ、１５ｍ ｅｒあるいはそれ以上の長さのプライマーがハイブリダイゼーションの正確さを あげるために使われる。より短いプライマーを使う際には、ハイブリダイゼーシ ョン温度を、より低くする必要がある。もとの−重鎖核酸の相補鎖を合成するに は、適当なバッファー、ｄＮＴＰ、１種以上のプライマーにＴｔｈＤＮＡボリメ レースを加えればよい。適当な１種のプライマーが加えられると、−重鎖核酸に 相補的なプライマー伸長物ができ、核酸鎖とハイブリダイズして同じ長さあるい は異なったながさのデュプレックスを形成しくプライマーが鋳嬰鎖のとこにハイ ブリダイズしたかによるが）、つぎに前述したように２本の分離した、互いに相 補的な一本鎖となる。変法として、２ないしそれ以上のプライマー（ひとつを、 他のプライマーからの伸長産物を鋳型として、プライム合成用に使用する）を− 重鎖核酸に加えて反応を行なうこともできる。 もし核酸中に２つの鎖が含まれているとき、すなわちターゲットが二本鎖か、タ ーゲットが一本鎖で二回目の増幅反応の時、核酸鎖はプライマーとのハイブリダ イゼーションに先立って、そのＭｉ（ストランド）の分離（セパレーション）を 行なわなければならない。このストランドセパレーションは、物理的、化学的あ るいは酵素的な方法を含む任意の適切な変性方法で行なえる。核酸の鎖を分離す る物理的な方法の一つで薦められる方法は、核酸を加熱して完全に（９９％以上 ）変性させる方法である。熱変性の典型的な方法は、核酸のサイズ構成によるが 、温度は９０−＋０５°Ｃ１時間は２．３秒から５分かけて行なう。有効な変性 温度は９０−１００″Ｃで１０秒から３分か望ましい。ストランドセパレーショ ンは、ヘリカーゼとしてしられる酵素群あるいはリポＡＴＰの存在下でヘリカー ゼ活性をしめしＤＮＡを変性するＲｅｃＡによっても行なうことか可能である。 ヘリカーゼによるストランドセパレ−ションの最適な反応条件はＫｕｈｎＨｏｆ ｆｍａｎｎ−ＢｅｒＩ４ｎｇ、１９７８年、Ｃ３Ｈ−Ｑｕａｎｔｉｔａｊｖｅ　 Ｂｊｏ−１ｏｇｙ、４３巻、６３ページに記載されていて、ＲｅｃＡを使った技 術はＲａｄｄ’ｉｎｇ　、１９８２年Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６巻、４０５−４３ ７ページにレビューとして記載されている。 変性されてできた２本の相補鎖は長さが等しい場合と等しくない場合がある。 二本鎖核酸か熱で変性されると、反応液はプライマーとそれに対する相補的な鋳 型類がハイブリダイズするような温度まで冷却される。この温度とは、試薬にも よるが、普通３５−６５°Ｃあるいはそれ以上であるが、３７−６０°Ｃ位が好 ましく、有効な時間は普通３０秒から５分であるが、１分から３分が望ましい。 実際は、単に温度を９５°Ｃから３７°Ｃ付近まで下げる間にハイブリダイゼー ションが起こる。 核酸が一本鎖か二本鎖いずれでも、Ｔｈｅｒｔｎｕｓ　ｔｈｅｒｍａｐ−ｈｉｌ ｕｓ由来のＤＮＡポリメレースを、変性ステップ、温度を下げているとき、ある いはハイブリダイゼーションを促進しているとき、いずれのときにも反応液に加 えることができる。耐熱性ＴｔｈＤＮＡボリメレースは反応液にいっても加える ことが可能であるが、厳しい条件で（ｓｔｒｉ−ｎｇｅｎｔ）でハイブリダイゼ ーションをさせるに必要な温度より低い温度に反応液があるときはボリメレース を加えないほうが、非特異的な増幅反応を防止できる。ハイブリダイゼーション 後、反応液は、酵素がプライマーとテンプレートのハイブリダイズしたものから 伸長物を合成する酵素活性を促進し最適にするような温度に上げられて、その温 度に維持される。温度はそれぞれの核酸鎖に相補的なプライマーからの伸長産物 が合成されるような温度でなくてはならないが、それぞれの伸長産物がその相補 鎖より変性されて離れてしまうほど高い温度であってはならない（即ち、温度は 普通８０−９０℃よりは低い）。 使われる核酸によるが、合成反応に対する有効な温度は４０−８０℃で、５０− ７５°Ｃが好ましい温度である。 Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＤＮＡボリメレースでは、６５− ７５°Ｃがより望ましい。この合成に必要とされる時間は０．５−４０分あるい はそれ以上であるが、それは温度、核酸の長さ、酵素、核酸混合物の複雑さに主 に依存する。 伸長に要する時間は普通３０秒から３分である。もし核酸長が長ければ、相補鎖 の合成にはより長い時間が必要となる。 新たに合成された鎖と相補鎖は二重鎖分子を形成し、次の増幅過程で使われるこ とになる。次のステップで、二本鎖分子の鎖は、変性させるに十分な温度と時間 で、しかし耐熱性酵素を不可逆的に変性あるいは失活させるほとの高温、長時間 でなく、熱変性され、分けられる。 鋳壓鎖の変性後、プライマーと相補的な一本鎖分子（鋳型）とのハイブリダイゼ ーションが進むような温度に、前述したように下げられる。 ハイブリダイゼーションのステップの後、あるいはハイブリダイゼーションのス テップと同時に、新たに合成、された鎖と、ちとからある鎖の両方を鋳型として 使って、プライマー伸長物を合成できるに耐熱性酵素の活性が促進するように温 度を調節する。温度は前述したように、伸長産物がその相補鎖より変性されて離 れてしまうほど高い温度であってはならない。このような場合、同時に反応を起 こさせるステ′ツブでは、５０−７０℃の温度範囲が適当である。 加熱と冷却のステップ中には、ｌサイクルのストランドセパレーション、ハイブ リダイゼーション、伸長産物の合成が含まれていて、特定の核酸シーケンスを目 的の量まで増やすまで繰り返すことができる。制限を与えるのは、プライマー、 耐熱性酵素、ヌクレオシド３リン酸の量である。普通、１５から３０サイクルが 行なわれる。 増幅したＤＮＡを診断の目的に検出しようとするなら、必要とするサイクル数は サンプルの性質に依存する。例えば、増幅されるサンプルが精製されたものであ れば、サイクル数は少なくてすむ。もしサンプルが核酸の混合物であるならば、 検出に必要なシグナルをえるにはより多くのサイクル数を必要とする。一般的な 増幅および検出には約１５回のサイクルを繰り返す。増幅されたシーケンスを、 標識したシーケンス特異的なプローブで検出し、ヒトの遺伝子ＤＮＡが増幅のタ ーゲットの場合、明瞭なシグナルを検出可能な、すなわちバックグラウンドノイ ズが検出の妨げとならないためには１５−３０回のサイクルの反復が必要である 。 ヌクレオタイド、プライマー、耐熱性酵素は反応開始時に加えられれば、消費さ れたり、酵素が不可逆的に変性したり失活しないかぎり、更に加える必要はなく 、もしそのような場合は、反応を続けるためにポリメレースあるいは他の試薬を 加えればよい。しかしながら、各ステップでそのような材料を加えても、それほ ど反応を進めるわけではない。適当な数の反応サイクルが実行され、必要な量の 特定の核酸シーケンスが産生されれば、反応は普通に行なわれている方法、すな わちＥＤＴＡ、フェノール、ＳＤＳ、クロロホルムなどを加えて酵素を失活させ るか、反応の成分を分けることによって、停止する。 実現したものの一つとして、反応溶液を、温度が一定のレベルで一定の時間割面 するようにプログラム化して、温度循環を行なう方法がある。この目的のための 機械として、増幅反応を自動的に行なう機械がＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｎ＋ｅｒＣｅ ｔＵＳ社によって開発、販売されている。この装置でＰＣＲを行なうための詳細 なインストラクションは装置を購入すると入手できる。 Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメレースは、ポリメレース連鎖反応による核酸シーケンスの 増幅が有用な様々な反応を実行するに際して、非常に有用である。増幅反応は特 定の核酸シーケンスをクローン化して適当な発現ベクターに挿入するのに利用さ れ、米国特許第４．８００．１５９号に記載されている。ベクターは標準的な組 換ＤＮＡ技術によって適当な宿主に形質転換されシーケンスに対応する遺伝子産 物の生産が行なわれる。このようなりローニングには、平滑末端ライゲーション によって直接ベクターに連結させる方法と、制限酵素を使ってプライマー内のサ イトを切断して行なう方法がある。他の、Ｔ、ｔｈ　ＤＮＡポリメレースに適し た方法としては、米国特許第４，６８３．１９４号、４．６８３．１９５号４． ６８３．２０２号、欧州特許公報第２２９，７０１号、２３７，３６２号、２５ ８．０１７号に記載・されており、参考として付けである。さらに本出願の酵素 は非対称Ｐ　ＣＲ（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎｄｎｄ　Ｅｒ１ｉｃｈ　、　１９８８ 年、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。 ８５巻、７６５２−７６５６ページ、参考として付けである）、反転Ｐ　ＣＲ（ Ｏｃｈｍａｎら、１９８８年Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２０巻、６２１ページ、参考 として付けである）、ＤＮＡシーケンシング（Ｉｎｎｓら、１９８８年Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５巻、９４３６−９４４０ページ、ＭａＣｏｎ 　Ｉ　ａｇｕｅら、１９８８年、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、、１６巻（ ２０号）、９８６９ページ）に有用である。Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメレースはまた 逆転写酵素活性を持っている。 いかに示す例は、単に説明するために提示しているもので、本発明の出願範囲に 制限を加えようとしているものではない。これらの例の中で使われている用語は 特に断わりがないかぎり、パーセントは固体の場合は重量パーセント、溶液の場 合は体積パーセント、温度は摂氏である。 例１ Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＤＮＡボリメレースの精製本例で は、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓよりＴｔｈ　ＤＮＡボリメレース を分離することについて述べている。７ｔｈ　ＤＮＡボリメレースは、精製の各 段階で、ＬａｗｙｅｒらにＪ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、１９８９年、２６４巻（１１号）６４２７−６４３７に、Ｔａｑボリ メレースについて記載されている方法にしたがってその活性のアッセイを行なっ た。この文献は参考文献としてつけである。 定型的には、このアッセイは以下の粗性からなる反応混合液中で行なわれる。： 　２５　ｍＭ　ＴＡＰＳ−ＨＣＩ　、ｐＨ９，５（２０°Ｃ）　：　５０ｍＭ　 ＫＣＩ；　２ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ；　１ｍＭβメルカプトエタノール：２００μＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ：］］ＯＯμＭα−２２Ｐ−ｄＣＴＰ（０，０ ３−０，０７ｕ　Ｃｉ／ｎｍｏｌ）　；　Ｉ　２．５　ｔｔ　ｇサケ精子ＤＮＡ 　；およびポリメレース。反応は希釈液中の酵素を入れて開始し、７４°Ｃて行 なわれる（希釈液の粗性はＩ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、　ｐＨ８，０， ５０ｍＭＫＣｌ、０．　ｌ　ｍ１ｉｌ　ＥＤＴＡ　、’　Ｉ　ｍｇ／　ｍ１滅菌 ゼラチン、０．５％ＮＰ−４０，０，５％ＴＷＥＥＮ２０．１ｍＭβメルカプト エタノール）。１０分間の反応後、６０　ｍＭ　ＥＤＴＡを１０μｍ加えて、反 応を停止する。遠心後、５０μｌの反応液を、ＩＭＩの５０　ａ　ｇ／ｌｌｌ１ ．２　ｔｎＭ　ＥＤＴＡ溶液中に移す（０°Ｃ）。等量（Ｉ　Ｍｌ）の２０％Ｔ ＣＡ溶液と２％ピロリン酸ナトリウム液を加え混ぜる。混合液を０°Ｃで１５− ２０分反応させ、ワットマンＣＦ／Ｃフィルターで濾過し５％丁ＣＡ溶液と１％ ピロリン酸ナトリウム混合液で十分に洗い（５ｍｌｘＳ回）、さらに９５％冷エ タノールで洗う。フィルターを乾燥後放射能活性を計測する。 バックグランド（酵素なして行なった反応）は通常最初に加えた放射活性の０． ００１％から０．０１％以内である。 ユニットの計算のため、スタンダードとして５０−２５０　ｐｍｏｌの３２Ｐ　 ｄＣＴＰをスポットする。１ユニツトは７４°Ｃ３０分の反応で１０ｎｍｏｌの ｄＣＴＰが取り込まれたときｌユニットとする。ユニットは次式に従って計算す る。 ｄＣＴＰの比活性（ｃｐｍ／ｐｍｏ　Ｉ）酵素活性は反応特開と完全に比例関係 にあるわけではない。精製した酵素の場合、３０分のアッセイでは１０分のアッ セイの２．５倍の活性を示す。 約２０２ｇの凍結したＴｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓの８８８株（Ａ ＴＣＣ，２７，６３４）を１００ｍ１の３　Ｘ　ＴＥ−ＤＴＴバッファー（１５ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、　ｐＨ７，５，３ｍＭＥＤＴＡ、３　ｍＭＤＴ Ｔ、　、２．４　ｔｎＭ　ＰＭＳＦ　（ＰＭＳＦは１４４ｍＭ濃度てＤＭＦに溶 解したストック溶液より使用））で溶かし、ブレンダーで低速でホモジエナイズ する。全ての操作はことわらないかぎりＯ″Ｃ−４°Ｃで行なう。ガラス器具は 全て乾熱滅菌し、精製に使う溶液はオートクレーブ可能なものは全てオートクレ ーブする。溶解した細胞はＡｍ１ｎｃｏ　Ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｃ ｅｌｌ　（１８，０００ｐｓｉ　）で溶菌し、等量の２．４　ｍＭ　Ｐ’ＭＳＦ を含むＬ　Ｘ　ＴＥ−ＤＴＴバッファーで希釈し、次に、粘性が低下するまで超 音波処理で行なう（了りコツト１／３．８０％出力、１０分間、デユーティ−サ イクル５０％）。ライゼートを２．４　ｍＭ　ＰＭＳＦを含むＩＸＴＥ−ＤＴＴ バッファーで湿重量の５．５倍となるように希釈する。得られた分画、分画Ｉ　 （Ｌ　１００ｍ１）には、１５．６　ｇの蛋白が含まれていて活性は４６．８× １０４ユニツトであった。 ０．２Ｍ　（２９，ｏ７ｇ）となるように硫安を加え、氷上で３０分攪拌した。 硫安を加えることで沈殿が形成されるが、この沈殿はのちにのべるＰＥＴ沈殿操 作まで取り除かないでおく。硫安を加えることにより粗溶液中でポリメレースと ＤＮＡが結合すること及びボリメレートと他の蛋白間でのイオン相互作用を減少 させる。精製操作を迅速に行なうこと（フェニール−セファロースカラムにサン プルをのせ、流出すること）と、蛋白分解酵素阻止剤（２，４ｍＭ　ＰＭＳＦ） をくわえることはＤＮＡポリメレースの蛋白分解を防ぐうえて重要である。さら に良い結果を望むなら、硫安沈殿後、沈殿物を遠心で除く装置の前に、大部分の 核酸を取り除くためにボリミンＰ　（ＢＯＨより購入）沈殿操作を行なうのがよ い。同様に、ボリミンＰ／硫安ベレットのうえの柔らかい、粘凋なベレットもこ れには核酸を含んでいないので、画分］Ｉに含めて構わない。アガロースゲル電 気泳動とエチジウムブロマイド染色によって、ボリミンＰ上清には、大分子量の ＤＮＡ、ＲＮＡは９０％以上除かれていることがわかる。粘凋なペレットをくわ えた場合は、その蛋白量が増した分、フェニール−セファロースカラムを、後述 するより１０％程度のスケールアップするのが望ましい。 経験的に、０．２％ボリミンＰ（ポリエチレニミン、ＰＥ１）沈殿中には全核酸 の９０％以上が沈殿している。 ボリミンＰ　（ｐＨ７，５）を０．２％となるようにゆっくりと加え（１０％Ｐ Ｅ１２２ｍ１）スラリーを氷上でゆっくり攪拌し、３０．０００ｇ４°Ｃで４５ 分遠心する。９２０ｍ１の上清をすてたのち、ＰＥＴベレット上の柔らかい、粘 凋なベレットを再度遠心する。粘凋物を１８６．０００ｇ２°Ｃで１時間遠心す ると４０ｍ１の上溝と非常に大きなゼラチン状のペレットが得られる。このベレ ット中には画分Ｉて見られる活性の２％以下が認められ、１．９６ｇあるいは画 分Ｉの１２．５％の蛋白が含まれている。上溝を回収しく画分ＩＩ、９６０ｍ１ ）ここには１０．５　［ｉの蛋白と４２．６Ｘ１０’ユニツトの活性か認められ た。 画分］

【を３．２　Ｘ６．５　ａｍ　（５？ｎｌ）のフェニール−セファロース ＣＬ−４Ｂカラム（ロット番号Ｍｈｏ　２５４７、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ より購入）（０，２Ｍ硫安、０．５　ｍＭ　ＤＴＴを含むＴＥバッファーで平衡 化）にのせ８０　ａｌｌ／　ｈｒ　（１０ｍｌ／ｃｍ２／ｈｒ）で流した。レジ ンは全て推奨されている方法にしたがって平衡化、再生した。カラムを同じバッ ファー２４０ｍ１で洗ったのち（Ａ２８０がベースラインにおちるまで）、２２ ０ｍ１の０．５　ｍＭ　ＤＴＴを含むＴＥバッファー（硫安は含まない）てあら いＴｔｈボリメレース以外の蛋白を外した。次にカラムを２７０ｒｎｌの２０％ エチレングリコール（０，５０１Ｍ　ＤＴＴ、　ＴＥバッファー）で洗ってその 他の混入蛋白を洗い、２Ｍ尿素を含む２０％エチレングリコール（０，５ｍＭ　 ＤＴＴ、　ＴＥバッファー）洗って、ボリメレース活性を流出させた。ポリメレ ニス活性を示す画分（５ｍｌ）を回収した。Ｃ画分ＩＬＩａ、８４＋ｎｌ）。活 性試験でフロースルー画分と洗いだし百分を調べた結果、カラムのキャパシティ を越えた場合、のせたボリメレース活性の５０％程度しかカラムに結合しなかっ たことがわかった。カラムのキャパシティを越えないようにするために、より大 きいカラム（最低２倍以上の）を使用すべきである。同じ程度の活性を持ったフ ロースルー画分と洗いだし百分を回収し、（画分［１ｂ、６８５ｍ１）　、０． ２Ｍ硫安濃度に調製後、平衡化、再生したかラムに再度かけた。 ポリミンＰを含む両分（フェニール−セファロースカラムのフロースルー画分） ちゅうの低レベルのポリメレース活性の定量は１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ存在化、比 存在化両条件で行なうへきである。ＥＤＴＡが存在することで、ボリミンＰに結 合しているヌクレオチド基質による放射活性のバックグランドの上昇を是正でき る可能性があるからである。 前述したように、Ｔ′ｔ　ｈボリメレース活性は２Ｍ尿素と共に流出されてくる 。（画分１　［Ｉａ）。画分１［ｂを再度）エニールーセファロースカラムにか けている間、この２Ｍ尿素流出画分はヘバリンセファロースローディングバソフ ァーで透析し、尿素に長時間さらさないようにすべきである（カルバミル化をふ せぐため）。透析画分［［１ａには４２％の活性を示しく１７９．２１３ユニツ ト）、３．５％の蛋白が存在しく３５１１％ｇ）　、したがって精製度は１２倍 であった。回収したフロースルー画分と２Ｍ尿素流出画分中にはカラムにかけた 量の４２．６％（１８１，５５５ユニツト）の活性と４０．８％（４，１１０ｍ ｇ）の蛋白が、結合しなかったＴｔｈポリメレース（画分１１ｂ）として見られ た。最初のバッファーで平衡化、再生したカラムに画分１１ｂを再度かけた。 両分［ｒｂを、フェニール−セファロースカラムに１１時間７８ｍ１の速度での せた。カラムを２７０＋ｎｌの０．２Ｍ硫安、０．５　ｍＭ　ＤＴＴ、をふくむ Ｔ卜＜ソファ−で洗い、次に１７０ｍ１の０．５　ｍＭ　ＤＴＴを含むＴＥバッ ファー（硫安を含まず）で洗い、最後に２６０ｍ１の２０％エチレングリコール 、０．５　ｍＭＤＴＴを含むＴＥバッファーで洗った。Ｔｔｈボリメレースを再 度、２０％エチレングリコール、０．５　ｍＭＤＴＴ、２ＭＩｒ＜素を含むＴＥ バッファーで流出させた。このボリメレース活性を含む両分（４，３ｍ１）を回 収した。 （画分目ｒｂ） ２Ｍ尿素流出画分（画分［ｒｌｂ）にはカラムにのせたうちの、８７％の活性が 認められ（■５９．１３２ユニツ））、８．３％の蛋白が含まれていた、したが って精製度は９．７倍であった。 画分１［１ｂ　（１１６，４ｍｌ）は、０．１５１　ＫＣＩ濃度に調節され画分 ［１ｒａと共に回収され、５０ＷＭトリス、ｐＨ７，５，０、１ｍＭ　ＥＤＴＡ 　、　０．２％Ｔｗｅｅｎ　２０．０．５　ｍＭ　ＤＴＴｌｏ、　１５Ｍ　ＫＣ Ｉで活性を保ったまま透析し、４°Ｃにて、貯留した。 この画分［ｒ［（２４３１！１１）の中には特異的あるいは非特異的なＴｔｈエ ンドヌクレース、エキソヌクレースのかなりの量の混入を認めた。この合わせた 画分１１［には３２６．００９ユニツトの活性と７２５１１ｇの蛋白が存在して いた。 画分［Ｈを２．２　ｘ　Ｉ　２ｃｔｒｒ　（４５ｍｌ＞ヘパリンセファロ−，２ ，ＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢより購入）にのせ、０．１５ Ｍ　ＫＣＩ　、５０＋ｗＭトリス、ｐＨ７，５，０，Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０． ２％Ｔｗｅｅｎ　２０．０．５　ｍＭ　ＤＴ’Ｔで４５　ｍｌ／ｈｒの速度で平 衡化した。のせたうち全ての活性がカラムに捕捉された。カラムは最初１７５ｍ １の同じバッファーで洗われ（吸光度Ａ２１゜かベースラインに落ちるまで）、 次に６７０ｍ１の１５０−７５０ｍＭ　ＫＣ；線形濃度勾配バッファーで流出し た。０．３１−０．３５５ｍＭ　ＫＣＩ濃度勾配部に流出されてきた画分（５， ２５ｍｌ）を回収した（画分ＩＶ、１４９　ｍｌ）　。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメレ ースは０．３３Ｍ　ＫＣＩ濃度の流出ピークを示すが、同様にＴｔｈ　ＤＮＡポ リメレースは０．３３ＭＫＣｌｌ１度でＴｔｈ　ＨＢ８１　ｘンドヌクレース（ Ｔａｑ　［エンドヌクレース〔ＴｃｃＡ）とイソシゾマーの関係）と共に流出さ れてくる。 画分（ＶはアミコンＹＭ３０メンプランで約１０倍に濃縮され、続いて２５ｍＭ ）リス、ｐＨ７，５，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２％Ｔｗｅｅｎ　２０．０． ５　ｍＭ　ＤＴＴ、Ｉ　ＯＯｒｎＭ　ＫＣＩバッファーで透析を行なった。透析 ちゅうに形成された沈殿物は遠心によって取り除いた。（１２，０００ｇ、１０ 分、４”Ｃ）が活性は失われなかった。ヘパリンセファロースカラムを含むこれ ら一連′のステップで２７倍の濃縮度すなわちヘパリンセファロースカラムにの せたうちの９５％の活性をリカバーすることができた。 Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメレースはそのシーケンスがＴａｑ　ＤＮＡボリメレースと ８８％の一致（９３％の類似性）を示すにもかかわらず、これら蛋白間の１０％ の違いがフォスフォセルロースによる精製の特性に重大な差を生しさせている。 Ｔａｑ　ＤＮＡポリメレースでは、ｐＨ７，５のトリスバッファーてカラムの流 出を行なうと、フすスフｔセルロースより０．２ＭＫＣｌのときに流出してきて 、混在するエンドヌクレースは０．６−０．８１　ＫＣＩの濃度で流出してくる のに対し、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメレースと混在するエンドヌクレースはフォスフ オセルロース力ラムては容易に分離しえない。Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメレースは約 ０．４５１　ＫＣＩの濃度ピーク付近に流出されるのに対し、Ｔｔｈエンドヌク レースは０．５８Ｍ　ＫＣＩ　１１度ピークで流出される。アフィゲルブルー（ Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）はＴｔｈ　ＤＮＡポリメレースと７ ｔｈエンドヌクレースを分離するのに前動なレジンである。アフィゲルブルー− は塩基結合サイトを有する酵素をアフィニティ精製するために用いられる色素結 合レジンである。 画分［Ｖ）遠心後の上滑（１６，８ｍ１）　ヲ、１．６Ｘ１０ｃｍ（２０ｍｌ） アフィゲルブルーカラム（２５ｍＭ）リス、ｐＨ７，５、Ｏ，ｆ　ｍＭ　ＥＤＴ Ａ　、　０．２％Ｔｗｅｅｎ　２０．０．５　ｍＭ　ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＫＣ Ｉバッファーで平衡化）　ｉ：　２０　Ｉ！ｌｌ／ｈｒの速度でのせた。カラム にかけたＴｔｈ　ＤＮＡボリメレース活性の全てがレジンに結合した。カラムを ３０ｍ１の同じバッファーで洗ったのも（吸光度Ａ、。がベースラインに落ちる まで）−３００ｍｌのＯ，ＩＭ　−０，５１ＫＣＩ線形勾配濃度のバッファーで 流出した。０．２８−０．４５５１ＫＣＩ　！反間に流出した両分（３，０５ｍ ｌ）で二本鎖あるいは一重鎖ＤＮＡエンドヌクレース混入のないことを確かめた 、すなわち５−２０ユニツトのＴｔｈ　ＤＮＡボリメレース活性と６００ｎｇ共 役閉環プラスミドｐＬｓＧ］あるいは８５０ｎｇＭ　ｌ　３ｍｐｌ　８一本ＭＤ ＮＡを６０°Ｃて１時間間から１１時間反応させ、特異的あるいは非特異的なり ＮＡ断片の低分子化がないことを確がめた。ＫＣＩ　１１度勾配を加えルト、Ｔ ｉｈ　Ｉ）ＮＡボ＋））Ｌ、−４１，１約０．３５Ｍ　ＫＣＩ付近にややひろが ったピークで流出され、エンドヌクレースは０５ＭＫＣｌ以上の濃度で流出され てくる。アフィゲルブルーカラムをＯ，１５Ｍ　ＫＣＩで洗い、０．１５Ｍ　− ０，６Ｍ　ＫＣＩの濃度勾配バグファーで流出を行なうとより良い分離が行なえ るであろう。 ５Ｏ３−ＰＡＧＥ泳動パターンにもとすいて、二通りのプールを行なった。画分 Ｖａはピーク画分（６１ｍｌ）から、画分ｖｂはその両脇の画分から（７２，５ ｍ１）プールした。画分Ｖａには２２．２ＸｌＯ’ユニツトの活性と蛋白で５． ５　ｍｇか、画分ｖｂには、５．２　Ｘ　］　０’　ユニットの酵素活性と蛋白 が３．５　ｍｇ含まれていた。それぞれの回収物は別々にＹＭ３０メンプランで 濃縮、透析濾過された。画分ｖｂはアミコンＹＭ３０メンプランで約１０倍に濃 縮され５０　ｍｌＪ　ＮａＣ１を含むＣＭ−トリスアクリルバッフｙ−（２５ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０，０，５ｍＭＤＴＴ　、Ｏ，Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ 　、０．２％Ｔｗｅｅｎ　２０　）で透析した。 透析中に形成された沈殿物は再度遠心して取り除いたが（＋２．０００ｇ、１０ 分、４°Ｃ）わずかな活性を失ったにすぎず（２％以下）１．４倍の精製度が得 られた。上溝、（８，６ｍｌ、５．　ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｑ”　ユニット活性、２．３ 　ｍｇ蛋白）をＩ　ｘ３．８ｃｍ（３ｍｌ）　ＣＭ　−トリスアクリルカラム（ ＣＭ−トリスアクリルバッファーで平衡化）に３　ｍｌ／ｈｒの速度でかけた。 カラムにのせた活性は全てカラムに捕捉された。カラムを１７ｍ１の同しバッフ ァーで洗ったのち５０ｍ１の０．０５−０．７Ｍ　ＮａＣｌの線形段階状の濃度 勾配バッファーで流出を行なった。０．ｌ７５−０．２５Ｍａ度で流出された両 分（Ｉ　ｍｌ）を、画分Ｖａと共にプールする前に５ＤＳ−ＰＡＧＥｔ気泳動で の解析を行なった。ＴｔｈＤＮＡボリメレース活性は０．２１　Ｍ　ＮａＣ１濃 度に鋭いピークを持って流出されてきた。この画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動 解析より、ポリメレースは高度に濃縮されているがなお３５ＫＤａ、２５　ＫＤ ａ、ｌ　８　ＫＤａ付近に混在するバンドが認められた。画分Ｖ（１１，４ｍ１ ）、画分Ｖａと画分ｖｂをＣＭ−トリスアクリルカラム処理したピーク画分をミ ックスしたもの、を５０　ｍＭ　ＮａＣ１ｗｏ含むＣＭ−トリスアクリルバッフ ァーで透析した。形成した沈殿物は遠心によって取り除いたが（１２，０００’ ｇ　、Ｉ　０分、４℃）活性はほとんど失われなかった。沈殿物には０．９１ｍ ｇの蛋白と（約２０％）、２，２２７ユニツトの活性か認められた（１％以下） 。 得られた上溝（１２，８ａ＋１．５．１８ｒｎｇ蛋白、２４．８Ｘ１０４ユニツ ト活性）を１．６ｘ６０ｃｍ（１２ｍ１）のＣＭ−トリスアクリルカラム（５０ ｍＭ　ＮａＣｌを含むＣＭ−トリスアクリルバッファーで平衡化）　１２ｍｌ／ ｈｒでのせた。 カラムを２０ｍ１の同じバッファーで洗ったのち、２７ｍ１の１００　ｍＭ　Ｎ ａＣ１を含むＣＭ−トリスアクリルバッファーで洗った。フロースルー画分には ポリメレース活性は検出されなかった。技術上の問題より（カラムアダプターの 破損）＋００−４００ｍ００−４Ｏ０線形濃度勾配をかけたとき、４００ｍＭ　 ＮａＣｌ　１１度ですぐに流出か始まった。 カラムにのせたうちの２８％の活性（１９，４Ｘ１０４ユニツト、４９Ｂ蛋白） を回収し、同じ大きさのＣＭ−トリスアクリルカラムに再度かけた。 カラムにのせる画分（３５ｍｌ）を、５０ｍＭ　ＮａＣ１濃度に調製した結果、 ２．７倍希釈された。カラムを３３１１１１の同しバッファーで洗ったのち、１ ８０ｍ１（７）５０−４００ｍＭＮａＣｌ線形濃度勾配バッファーで流出した。 ０．１６−０．２Ｍ　ＮａＣ１濃度に流出されてきた画分（１，４ｍｌ）をセン トリコン３０メンブレンで２．５×ストレージバツフアー（５０ｄトリス、ｐＨ ７，５，０，２５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、２．５　ｄ　ＤＴＴ、　０゜５％Ｔｗｅｅ ｎ　２０　（（ピアース社、Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ乃濃縮、透析濾過を行な った。７ｔｈ　ＤＮＡポリメレース活性は０，１８３　Ｍ　ＮａＣ１ｍ度に流出 ピークを示したが、トライアルにくらへ若干早く流出されてきた。Ｔａｑ　ＤＮ Ａボリメレース活性の場合は、ＣＭ−）リスアクリルカラムに同じ酢酸ナトリウ ムパンファーｐ）１５．０で流出すると、０．１９−０．２０５　Ｍ　ＮａＣ１ 濃度に流出されてくる。濃縮、透析濾過を行なったサンプルは１．５倍の８０％ グリセロール（フィッノヤー社、スペクトル分析グレード、オートクレーブ滅菌 ）で希釈後、−２０”Ｃに保存し、それぞれの両分の５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ電気泳 動による解析を行なった。Ｔｔｈ　ＤＮＡボリメレースを含む画分は５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥｔ気泳動による解析で約８５−９０％の純度であった。主要なバンドは約 ９０ＫＤａ蛋白として泳動されていたが、若干の混入物のバンドもあった。実際 、観察された分子量約９０ＫＤａと計算による分子量９４ＫＤａ（遺伝子配列よ り）の差は、泳動ゲル内の異常な移動によるか、精製過程での分解によるものと 考えられる。それぞれの画分の染色のパターンは同じであり、全ての画分を一つ にまとめた（画分■１．２１．５　ｍｌ） 画分■１を更に アミコンＹＭ３０メンブレンで２．５×ストレージバツフアー中で濃縮、透析濾 過を行なった。このとき容積は７［＋１１で、内２ｍｌをアミノ酸成分と配列の 解析に使用した。 残りの６．８　ｍｌを１．６　ｍｌに濃縮し８０％グリセロール２．４ｍｌで希 釈した。最終産′物（４ｍｌ）中には、蛋白が２．１７［ｌＩｇ、活性が１６２ ．７８９ユニツト（３４，８％産出）で、比活性は７５．０１８ユニット／ｍｇ 蛋白であった。精製の各ステップの結果をテーブルにして次に示す。 本例ては、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｌｌｌｏｐｈｉｌＬＩｓのＴｔｈ　ＤＮＡボ リメレースＩ　（Ｔｔｈ　Ｐｏｌ　ｌ遺伝子クローニングのすすめかた、方法に ついてのへる。Ｔ、　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＤＮＡポリメレース■（Ｔａｑ　Ｐ ｏｌ　Ｉ　）遺伝子からＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をプローブとしてＴｔｈ　Ｐ ｏｌ　［遺伝子の制限酵素認識サイトとそれをはさむ領域についてジェノミック ＤＮＡプロットを行なった。Ｔａｑ　Ｐｏｌ　ｌ遺伝子特異的なプライマーを使 ってＴｔｈ　Ｐａｌ　ｌ遺伝子のＰＣＲ増輻増幅なうと、ＴｔｈＰｏｌ　ｌ遺伝 子についてより詳しい＃Ｉ限酵素認識サイトと核酸配列の情報か得られた。この 情報にもとすいて、Ｔｔｈ　Ｐｏｌ　ｌ遺伝子をブ′ラスミドｐＢｓ＋３＋（ス トラタジーン社、このプラスミドはＢＳＭＩ３＋としてもしられている）に２段 階でクローニングした。 Ａ、プローブの用意 ４ｐ１類の標識プローブを、Ｔ、　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＤＮＡとビオチン化ｄ ＵＴＰ　（ビオチン−１１−ｄＵＴＰ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのＰＣＲでつくり、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｍｏ ｐｈｉｌｕｓ　ＤＮＡのサザンプロットのプローブとして使用した。 プローブＡはＣＭＯ７とＥＫＩ９４から作り、Ｔａｑ　Ｐａ１Ｊ遺伝子５′端の −２３０から＋２０７塩基部の４３８ｂｐを覆う。プローブＢはＭＫ１３８とＭ Ｋ１２４から作り、Ｔａｑ　Ｐａｌ　ｌ遺伝子のＨｉｎｄ／ｒ目サイトをまたか って＋５５５から＋８７９をおおう３５５ｂｐ長のプローブである。プローブＣ はＡＩＫＩ４３とＭＫ１３１から作り、Ｔａｑ　Ｐｏｆ　ｌ遺伝子のテンプレー ト−プライマー結合部位のコーディング配列とＢａｍ旧サイトの＋１３１３から ＋１８１９をおおう５７９ｂｐ長のプローブである。プローブＤはＭＫ１３０と ＭＫＩ５１から作り、Ｔａｑ　Ｐｏｌ　ｌ遺伝子の３′端＋２１０８から＋３３ ８４塩基部をおおう４７３ｂｐ長のプローブである。 これらプローブを作成するのに使用したプライマーの配列を以下に示す。 Ｍに５１　５’−Ｔ罠ふχαスαスｍαコズπＴａｑ　Ｐｏｌ　ｌ遺伝子の配列 はＬａｗｙｅｒらの論文および米国特許出願第１４３．４４１号、１９８８年１ 月１２日出願、で発表されていて、両者とも参考資料として付けられている。 プローブはおのおの以下の粗性からなる１００μｌの反応混合液で作制された。 １０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、　ｐＨ９，０（ｐＨは混合液中のビオチン化 ｄＵＴＰのｐＨと中和するように９．０に設定されている。ビオチン化ｄＵＴＰ はＩ　００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、ｐＨ７゜４内に溶解）　、５０ｍＭ　 ＫＣＩ、１．０　［１１Ｍ　ＭｇＣｌ２．１００μｌｉ／ｍｇゼラチン、２ユニ ツト　Ｔａｑ　Ｐａｌ　Ｉ　ＣＰｅｒｋＩｎ７ＥＩｒｎｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社より 市販）、５０ＭＭｄＡＴＰ、５０　ｕＭ　ｄＣＴＰ、５０ＭＭｄＧＴＰ、３７． ５　ｕＭ　ｄＴＴＰ、１２．５　ｕＭ　ｂｉｏｔｉｎ　−１１−ｄＴＵＰ、５０ 　ｐｍｏｌ各ブライプライマーび鋳型ＤＮＡ、鋳型ＤＮＡは同しプライマーを使 って２５サイクルのＰＣＲ産物を１００倍希釈したものの１μｌを用いていて、 このときの反応混合液は次の粗性からなっている；、ＩＯ［１１Ｍ　Ｔｒｉｓ　 −ＨＣｌ　、　ｐＨ８，３，５０ＩｎＭＫＣＩ、１．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２ ００μＭ各ｄＮＴＰ、　Ｍ　ｂｉｏｔｉｎ　−１１−ｄＵＴＰはふくまず、１、 　ＯｎｇのＴａｑ　ＤＮＡは３分間ボイルして氷上で冷やして用いた。ＰＣＲは Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒＣｅｔｕｓ社のサーマルサイクラ−を使用した。プロ ーブを作製するために、プローブとテンプレート以下の１５回のサイクルで作っ た１９８°Ｃまで１分４５秒で到達、９８°Ｃで１５秒（チューブ内の温度は９ ６．５°Ｃ）、５５℃まで４５秒で到達、５５°Ｃて２０秒、４５秒で７２１０ で到　達、７２℃で３０秒、そして最後のサイクル終了後７２℃で５分間反応を 行なった。 Ｌａｗｙｅｒらが記述しているように、プローブとハイブリダイズしたジェノミ ックＤＮＡを分離し、Ｍａｎｉａｔｉｓの記述にしたがってサザンプロットを行 なったがニトロセルロースフィルタのかわりにＭＳ［Ｍａｇｎａｇｒａｐｈ”ナ イロンメンブランフィルターを用い、ＤＮＡの固定も熱固定の替わりに紫外線固 定を行なった。（口Ｖ、　５ｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ”　１８００、Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ社より販売）フィルタープロットは４２℃２時間で以下の粗性の溶液 中でプレハイブリダ′イゼーションを行なった：５×５ＳＰＥ、ｓ　ｘ　テ：／ ハ／ｌ／　）溶液、０．５　％Ｓ　Ｄ　Ｓ、５％デキストランサルフェート、１ ５０μｇ／ｍｌキャリアーＤＮＡ、５０％フォルマミド。フィルタープロットに 対するプローブのハイブリダイゼーションは同じ溶液中に１゜ｎｇ／ｌｌ１ｌの プローブを入れて４２　”ＣＩ晩で行なった。ハイブリダイゼーション後、メン ブランフィルタ−を洗って、結合していないプローブを取り除いた。 ４種類のプローブはそれぞれＴｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡ とハイブリダイズした。Ｔｔｈ　Ｐａｌ　ｒ遺伝子領域の制限酵素切断地図は７ ｔｈ　ＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔｌ、Ｂａｍ旧、Ｓａｃ［Ｉ　、Ａｓｐ　７１８で それぞれ切断してサザンプロットをおこない作製した。さらにＴｔｈ　ＤＮＡ　 ｊｉ−Ｈｉｎｄｒｌｌ／Ａｓｐ　７１８、Ｈｉｄｌｌｌ／ＢｓｔＥ［［、Ｈｉｎ ｄ［ＩＩ／Ｎｈｅｌ、ＢａｍＨＩ／Ａｓｐ　７１８、ＢａｍＨＩ／ＢｓｔＥＩ［ 、ＢａｍＨＩ／５ｐｈｌ　ＢａｍＨ［／Ｎｈｅ［の組み合わせで二重消化を行な い、そのサザンプロットを行なった。 この結果、Ｔｔｈ　Ｐｏｌ　ｌ遺伝子のクローニングに利用する制限酵素地図の 作製が行なえた。 Ｂ、　Ｔｔｈ　Ｐａｌ　ｌ遺伝子のテンプレート−プライマー結合部位のＰＣＲ 増輻 増幅ｈ遺伝子ＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ　Ｐａｌ　ｌ遺伝子のテンプレート− プライマー結合部位をコードする領域に一致するプライマーを使って、一連のＰ ＣＲ増幅反応を行なった。数種のプライマーをさまざまな組み合わせでＰＣＲ反 応に用い、Ｔａｑ　Ｐｏｌ　［遺伝子の２９３−１８９１塩基に相当するＴａｑ 　Ｐｏ１ｌ遺伝子の種々の領域を増幅しようと試みた。１つのプライマーの組み 合わせ、ＭＫ１４３とＭＫＩ３１が増幅物を合成した。 増幅反応は１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ　５ｐＨ８，３，５０ｍＭＫＣｌ、１ 、５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、２ユニツトＴａｑ　Ｐｏｔ　Ｉ　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ １ｍｅｒＣｅｔｕｓ社より市販）、２００μＭ各ｄＮＴＰ、ｌｏｇ熱変性Ｔｔｈ 　ＤＮＡ、５０ｐＩＩＩＯ１各プライマーちゅうで行なわれた。 増幅は前述したのと同じ熱サイクルプログラムを２５回行ない、ＰＣＲ産物はポ リアクリルアミドゲルで解析した。 満足のい（増幅ができなかったプライマーの多くは、のちにシーケンスされたＴ ｔｈ　Ｐｏｌ　ｌ遺伝子と比較した結果多くのミスマツチを持っていたり、ある いはプライマーの３′端に戦略上の、ミスマツチがあった。プライマーＭＫ１４ ３はＴｔｈ　Ｐａｌ　ｌ遺伝子と比較し３つのミスマツチかあったがそれは５′ 端にあって続く１５ベースは一致していた。プライマーＭＫ１３１は２つのミス マツチがあったが、そのミスマツチはプライマーのなかほどにあった。 プライマーＭＫＩ　４３／ＭＫ＋　３１による７ｔｈ遺伝子からの増幅物は、ポ リアクリルアミドゲルで泳動するとＴａｑ遺伝子を鋳型とした反応でつくられた ものと同し移動度を示した。ＴａｑとＴｔｈ遺伝子からの増幅物の制限酵素地図 を作製すると、ＢａｍＨＩ　、５ａｃｌ、　Ｘｈｏｌに関しては同しであったか 、Ｓａｃ［ｌ　、Ｐｓｔ［では異なっていた。プライマーＭＫＩ　４３／ＭＫＩ 　３１によるＴｔｈ遺伝子からの増幅物はさらに同しプライマーを使いＧｙｌ　 １ｎｅｓｔｅｎとＥｈ　ｌ　ｉ　ｃｈの］９８８年Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８５巻（２０号）７６５２−７６５６あるいはＩｎ 旧ｓらの】９８８年Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５ 巻（２０号）９４３６−９４４０に記載している非対称ＰＣＲ法を用いてＤＮＡ のシーケンス解析を行なった。 Ｃ，Ｔｔｈ　Ｐｏｌ　ｌ遺伝子５′端のクローニングサザンプロット法およびＰ ＣＲ法の解析によりＴｔｈＰｏｔ　ｌ遺伝子クローニングを２ステツプで進める 方法を開発した。７ｔｈ　ＤＮＡの約３Ｋｂ長のＨ１口ｄｌｌ＋断片がプローブ Ａ、Ｂ、ＣとはハイブリダイズしてプローブＤとはハイブリダイズしなかったこ とからこのａＫｂ長の旧ｎｄ（（１断片Ｂａｍｔ（ｒ認識サイトを含んでいて、 この遺伝子の５′端のクローニングに有用であることがわかった。 Ｔｔｈ　Ｐｏｔ　［遺伝子５′端のクローニングのため、Ｈｉｎｄｌｌ＋消化７ ｔｈ　ＤＮＡを０５インチ円筒ゲルで泳動中に５分毎に２５０μｌずつ分画化し て、約３Ｋｂの長さの断片をゲルより流出させて回収した。プローブとのドツト プロットの結果この分画には目的とするＤＮＡ断片が含まれていた。このＤＮＡ 断片をＢａｍＨＩ制限酵素て消化したのち、小生小腸アルカリフｔスファターゼ （Ｃ■ＡＰ）処理を行なった。ＣＴＡＰはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ社より入手し、指定の方法で使用した。これらの実験で使用した制限酵素、 Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメレース、ライゲースの酵素はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　、８ｉｏ１ａｂｓ　％ＢｏｅｒＩｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ａｓｐ７ １８　）　、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｃｓｐ　４５　；　Ａｓｕ［のイソシゾマー）よ り入手でき、指定の方法で用いる。 プラスミドｐ　Ｂ　Ｓ　１３　＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より入手）同様にｆ ｆ１Ｊ限こうそＢａｍＨＩ　と旧ｎｄｌｌｌで消化し、つぎにＢａｍＨ［消化Ｃ ＩＡＰ処理３Ｋｂ長旧ｎｄＩＩｆ　Ｋ片とライゲーション反応を行なった。ライ ゲーション反応後の混合液をＨａｎａｈａｎらの方法にしたがって、大腸菌Ｅ、 　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株ＤＧ９８　（ｔｈｉ−Ｌ　ｅｎｄＡＩ、　ｈｓｄＲｌ　 ７．１ａｃｌＱ　、　１ａｃＺΔＭ１５　、　ｐｒｏＣ：：ＴｎＩ　Ｏ、５ｕｐ Ｅ４　４／Ｆ　’　、　１ａｃＺ　６Ｍ１５　、ｐｒｏＣ＋、：登録番号３９， ７６８としてＡＴＣＣより入手可能）の形質転換に用いた。アンピシリン耐性形 質転換体（ＡｍｐＲ）から、Ｘ−ｇａｌ寒天プレート上で青色示さないコロニー を選択し、形質転換細胞のＤＮＡと３２Ｆ標識した（γ−３２Ｐ−ＡＴＰによる リン酸化反応）プライマーＭＫ　Ｉ　４３でハイブリダイゼーションを行なった 。 （Ｗｏｏｄらの１９８２年Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ７９巻５６６１によるレプリカブレーティング法とレプリカされた細胞の溶 解法したがって）。１つのコロニーがプラスミドを含んでいて、それをｐＢＳＭ ：Ｔｔｈ５’　と命名した。これは約２．５．Ｋ　ｂ長のＨｊｎｄｌｆｌ−Ｒａ ｍ）ＩＩ制限酵素断片がｐＢｓＩ３÷の旧ｎｄ　［Ｉ　［−ＢａｍＨＩ断片と連 結してできたものである。 Ｄ、　Ｔｔｈ　Ｐｏｌ　ｌ遺伝子３′端のクローニングＴｔｈ　Ｐｏｌ　［遺伝 子の３′端をプラスミドｐＢＳＭ：Ｔｔｈ５に挿入しベクターｐＢＳＭニアｔｈ を作製した、これには完全なＴｔｈ　Ｐｏｌ　［遺伝子コーディング配列を含ん でいる。サザンプロットおよびＤＮＡシーケンス解析によりＴｔｈ遺伝子の１２ Ｋｂ長のＢａｍＨＩ断片はＡｓｐ７１８で切断されて５．６Ｋｂ長断片がつくら れそれはプローブＤとハイブリダイズする（この断片はプローブＣともハイブリ ダイズするはずである）　、　５．６　Ｋｂ　ＢａｍＨｒ　−Ａｓｐ７１８制限 酵素断片を作り出すＢａｍＨＩサイトはプラスミドｐＢＳＭ：Ｔｔｈ５’作製に 用いられた２、　５　Ｋｂ　Ｈｉｎｄ［ｌ［−ＢａｍＨ［をつくりだすＢａｍＨ ｒサイトと同一のものであることもわかっていた。 Ｔｔｈ　ＤＮＡはＢａｍＨ［て完全消化され、前述した方法でサイズによって分 画し、１２Ｋｂ長を含む画分を同定し集めた。ビオチン化したプローブＤとＣと のドツトプロットでハイブリダイズする画分を回収しＡｓｐ７１８で消化し、Ｃ ＩＡＰ処理を行ない、ＢａｍＨＩ　−Ａｓｐ７１８で消化したプラスミドｐＢＳ Ｍ：Ｔｔｈ５’　とライゲーション反応を行なった。連結されたＤＮＡは大腸菌 Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２株ＤＧＩＯＩ（ｔｈｉ　−Ｌ　ｅｎｄＡｌ　、　ｈｓｄ Ｒｌ　７．１ａｃｌＱ　、　ＩａｃＺΔＭ１５、ｐｒｏＣ：：Ｔｎ　Ｉ　Ｏ）の 形質転換を行なった。 アンピシリン耐性形質転換体（ＡｍｐＲ）より上述した方法で３２−Ｐ標識した プライマーＭＫ　１３２を用いプラスミドを含む形質転換体を得、ｐＢＳＭ：Ｔ ｔｈと名付けた。これには５．６．Ｋｂ　ＢａｍＨ［−Ａｓｐ７１８断片と２゜ ５　Ｋｂ　Ｈｉｎｄ［Ｉ［−Ｂａｍ旧断片が正規の向きで配列し完全なＴｔｈ　 Ｐａｌ　Ｉ遺伝子を構成していた。オリゴヌクレオタイドＭＫＩ３２のシーケン スは完全にＴｔｈ　Ｐｏｌ　Ｉ遺伝子と一致していた。プローブとハイブリダイ ズするコロニーで制限酵素消化により予想される断片が生じるいくかのコロニー を選んでＩ　ＰＴＧで誘導を行ない、Ｔａｑ　Ｐａ１ｌに対するポリクローナル 抗体で、誘導をおこったサンプルと誘導を行なわなかったサンプルのウェスタン ブロッティングを行ないＩＰＴＧによって発現が誘導される蛋白はＴａｑ　Ｐｏ ｌ　［とおなじ分子量であった。（約９４ＫＤａ）このうちの１つのコロニーを ＡＴＣＣへ登録したので承認番号ＡＴＣＣ６８１９５で入手が可能である。 この株を維持するに際しては、プラスミドＤＮＡの逸失をふせぐためアンピシリ ンを使用し続けるべきである。 ＡＴＣＣ６８１９５はしたがって非形質転換体ＤＧＩＯＩ細胞を得るために使用 することが可能である。 例３ プラスミドｐＬＳＧ２１の構築 ３′非コーデイング領域（“下流”）配列をけすると大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ内で 組換Ｔｈｅｒａ＋ｕｓ　ＤＮＡボリメレースの発現か増強されることが報告され ている。ｐＢｓＭ　：　Ｔｔｈを８ｓｔＥ［ｒとＫｐ口【で二重消化を行ない、 ４１１のｄＮＴＰ存在下てクレノー酵素による修復を行なったのち、分子間内の ライゲーション反応がおこるのに適した希釈した条件でライゲーション反応をさ せると３′非コーディング領域配列がけずられたＴｔｈ　ＤＮＡボリメレースが 作られる。制限酵素ＢｓｔＥＩＩはプラスミドｐＢＳＭ　：　ＴｔｈのＴｔｈ　 ＤＮＡポリメレース３′非コーディング領域内を切断し、Ｋρｎｌはベクターの ポリリンカー領域を切断する。 上の欠失を行ない作られたプラスミドをプラスミドｐｌＳＧ２１と命名した。欠 失操作によって制限酵素Ｂｅ５ｔＥ［［サイトはなくなった。しかしながら、プ ラスミドｐｔ、ｓｃ　２ＩはプラスミドｐＢｓＭ：Ｔｔｈで形質転換した大腸菌 宿主細胞で発現しているＴｔｈ　ＤＮＡボリメレース量をさらに増強させるわけ ではなかった。 例　４ プラスミドｐＬＳＧ２２、ｐＬＳＧ２３、ｐＬｓＧ２４の構築Ｔｔｈ　Ｐｏ１ｒ 遺伝子にはその５′端、３′端に都合の良い制限酵素のサイトがない。このよう な制限酵素サイトは多くの種類の発現ベクターを構築するうえで役立つ。更に、 ５′端のコドンは高度にＧＣに富んだ配列で、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ内で発現およ び蛋白の翻訳を効率的に開始するのを阻止する作用がある。オリゴヌクレオタイ ドを使った、サイトダイレクテッドミュータジエネシス（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃ ｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法によりＴｔｈ　Ｐｏ１ｌ遺伝子のコーディ ングノーケンス内および、５′３′非コーデイング領域内、に多くの有用な変更 を加えることができる。 プラスミドｐＢｓＩａ＋の誘導体、すなわちｐＢｓｌＪ：Ｔｔｈは、Ｌａｗｙｅ ｒらおよびプラスミドｐＢＳ　Ｉ　ａ＋の供給社であるＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社 のプロトコルにしたがって、一本ＭＤＮＡのかたちで取り出すことができる。プ ラスミドｐＢＳＩ３＋およびプラスミドｐＢｓＩａ＋の誘導体の一本鎖ＤＮＡを 作り出すには、プラスミドで形質転換されている宿主細胞をヘルパーファージ（ Ｒ４０８なと）で感染させて、ファージＤＮＡが生産されるような条件で培養を 行えば良い。ファージＤＮＡを回収すれば目的の一本鎖ＤＮＡと小量のへルバー ファージ由来のファージＤＮＡが得られる。目的の一本鎖ＤＮＡは、そのサイズ の違いより、電気流出法などでヘルパーファージＤＮＡを取り除くことができる 。 次に示すプラスミドの構築を行なうについて、ｐＢＳＭΔＰｖｕｌ［の使用が便 利である。ｐＢＳＭΔＰｖｕ［［はｐＢＳＩ３＋より３８２ｂｐのＰｖｕｌｆ断 片を欠失させたものである。サイトダイレクテッドミュータジエネシスの本ＭＤ ＮＡｐＢＳＭ：Ｔｔｈ　（アルイハ他（７）　ｐ　Ｂ　Ｓ　ｌ　３　＋誘導体） と二本鎖Ｐｖｕｒ［消化プラスミドｐＢＳＭΔＰ　ｖｕＩＩを分子比１−２．５ 　（ｐＢｓＭ：Ｔｔｈ／ｐ　Ｂ　Ｓ　ＭΔＰ　ｖｕ［）でクレノーバッファー中 で３分間沸騰させてアニーリングを行ない、さらに６５°Ｃで５分間インキュベ ートする＝（２）ミューチージョンを導入したオリゴヌクレオチドを燐酸化し、 オリゴヌクレオチドを９５℃Ｉ分で熱変性後、分子量５−１の割合でギャップ形 成デュプレックスにくわえて７５°Ｃに保ち、ギャップ形成デュプレックスとア ニーリングを行なう。：（３）この反応ミックスチュアを７５°Ｃ２分間インキ ュベートし室温まで徐々に冷却する。、（４）このアニールしたミックスチュア を４種のｄＮＴＰ　（各２０ＯμＭ）存在下でフレノウ酵素で３７°ＣＩ５分間 伸張させ、次に４０μＭ　ＡＴＰとライゲースを加える。この反応物をＥ、ｃｏ ］ｉ　Ｋ１２　ＤＧＩ０１株の形質転換に使用する。 アンピシリン耐性株を適当なプライマーでスクリーニングする。プラスミドＤＮ Ａを保持していて、プローブとハイブリダイズする′コロニーをＲ６６培地（０ ，６％牛肉抽出物、０．６％酵母抽出物、２％ペプトン、０．５％ＮａＣ１，４ ０ｍＭ　ＫＰＯ４、ｐＨ７，２，０，２％ブドウ糖、１００μｇ／ｍｌ了ンビシ リン）３ｍｌに入れて、３７℃８時間インキュベートし、ＢｒｉｎｂｏｉｍとＤ ｏｌｙの方法にしたがって、プラスミドＤＮＡを調製して使用する。得られたプ ラスミドＤＮＡは制限酵素消化とンーケンシングを行なって、目的とするプラス ミドが得られたか確認する。 Ａ、プラスミドｐＬＳＧ２２の構築 オリゴヌクレオチドＤＧ！２２を用いて、前述の方法でＴｔｈ　Ｐａｌ　Ｉ遺伝 子コーディングシーケンスのＴＧＡストップコドンの下流にεｃｏＲＶ　、　Ｂ ｇｌ［Ｉ制限酵素認識サイトをプラスミドｐＢｓＭ：Ｔｔｈ内に変異を加えて作 り出し、オリゴヌクレオチドＤＧ１２３でブローブハイブリダイゼーションによ ってかくにんした。これらオリゴヌクレオチドのシーケンスは下の通りである。 得られたプラスミドはｐＬＳＧ２２と命名した。 Ｂ、プラスミドｐＬＳＧ２３の構築 プラスミドｐ［，５Ｇ２２に変異を導入して、Ｔｔｈ　Ｐｏｌ　Ｉ遺伝子コーデ ィングシーケンスのＡＴＧスタートコドン部にＢｓｔＸｒ　、Ａｓｅｉ（Ｃｓｐ ４５１）制限酵素認識サイトを導入した。 これに加え、コドン２．３及び５−７をアミノ酸残基を替えないようによりＡＴ に富んだシーケンスとなるように変異させた。変異生成に用いたオリゴヌクレオ チドＤＧ１８９は次に示す。 得られたプラスミドをｐＬＳＧ２３　＆命名した。プラスミドｐＬＳＧ２３を持 った形質転換体は、アンピシリン耐性の形質（Ａ［ＤｌｌＲ）およびオリゴヌク レオチドＤ０１１８とのハイブリダイゼーションによって同定した。オリゴヌク レオチドＤ０１１８は次の通りである。 ＤＧ１１８　５　’　ＴＧＧＴＡＡＣＡＴＡＧＣＴＴＣＣＡＴ　３’Ｃ，プラス ミドｐＬＳＧ２４の構築 プラスミドｐＬＳＧ２２に変異を導入して、Ｔｔｈ　Ｐｏｌ　Ｉ遺伝子コーディ ングシーケンスのＡＴＧスタートコドン部にＢｓｔＸＩ　、　Ｎｄｅｌ制限酵素 認識サイトを導入した。これに加え、コドン２．３及び５−７をアミノ酸残基を 替えないようによりＡＴに富んだシーケンスとなるように変異させた。変異生成 に用いたオリゴヌクレオチドＤＧ１９０は次に示す。 得られたプラスミドをｐＬＳＧ２４と命名した。プラスミドｐＬＳＧ２４を持っ た形質転換体は、アンピシリン耐性の形質（ＡｍｐＲ）およびオ・リボヌクレオ チドＤ０１１ｇとのハイブリダイゼーションによって同定した。 例　５ プラスミドｐＬＳＧ２７およびｐＬＳＧ２８の構築Ａ、プラスミドｐＢＳＭ：Ｔ ｔｈΔ５ｔｕｌ／ＨｉｎｄｆＪ［の構築プラスミドＰＬＳＧ２７、ｐＬＳＧ２８ は一部が欠失したＴｔｈＰｏｌ　Ｉ遺伝子を発現させるためのベクターである。 欠失１；！Ｔｔｈ　Ｐｏｌ　Ｉ遺伝子コーディングシーケンスのアミン末端より 約８０コドンをけずってつくられた。二〇ベクターを構築するため、最初プラス ミドｐＢｓＭ：Ｔｔｈ　５　’を制限酵素５ｔｕｌと旧ｎｄｌ［［で完全消化さ れた。消化後、プラスミドは４種のｄＮＴＰ存在下でクレノー酵素処理され、次 にライゲーション反応によって環状プラスミドに戻された。 この処理で、Ｔｔｈ　Ｐａｌ　Ｉ遺伝子の５′非コーデイング領域からコドン７ ８まで（Ｓｔｕ［サイトはコドン７７−７９にまたがっている）欠失された。ｐ ８５Ｍ：Ｔｔｈ　５　’はまたＴ【ｈＰｏｌｌ遺伝子コーディングシーケンスの ３′端の部分を欠失している。得られたプラスミドをｐＢＳＭ：ＴｔｈΔ５ｔｕ ｆＢ、プラスミドρＬＳＧ２５の構築。 プラスミドｐＢＳＭ：ＴｔｈΔＳｔｕ［／Ｈｉｎｄ［ｒ［に、オリゴヌクレオチ ドＤＧＩ９１を用いて、前述の方法で変異を導入しプラスミドｐＬＳＧ２５を作 った。プラスミドｐ［、ＳＧ２５では、一部が欠失したＴｔｈ　Ｐｏｌ　Ｉ遺伝 子を、ｌａｃプロモータより発現するように、その位置を変えている。更に、Ｉ ａｃＺαコーディングシーケンスをけずり、Ａｓｅｌ制限酵素認識サイトをＡＴ Ｇスタートコドンに作製した。変異を導入するオリゴヌクレオチドＤＧ１９１は 次の通りのシーＣＣＴＣＣＣＣＧ　ＣＣＴＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＴＡＡ　ＴＴＴ ＧＧＴＣＴＣＣＴＧ　ＴＧ　ＴＧＡＡＡ　ＴＴＧＴＴＡ　ＴＣ−３′ プラスミドｐＬＳＧ２５を持った形質転換体は、アンピシリン耐性の形質（Ａｍ ｐＲ）およびオリゴヌクレオチドＤＧ１９３とのハイブリダイゼーションによっ て同定した。 オリゴヌクレオチドＤＧ　１９３は次の通りである。 ＤＧ１９３５’　−ＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧ−３’Ｃ，プラプラスミ ドｓｃ２６　ｔｈ構築。 プラスミド１ｌＬｓＧ２６の構築は、ｐＬＳＧ２５と同様にＤＧ＋９１の代わり にＤＧ１９２を変異導入のリンカ−として用いて行なった。ＤＣ＋９２のシーケ ンスは次の通りである。 ＤＧ１９２５’　− ＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＴＧＴＡＧＧＣＣＡ　ＴＡ　ＴＧ　ＴＴＴＧＧＴＣＴＣ ＣＴＧ　ＴＧＴＧＡＡＡ　ＴＴＧＴＴＡ　ＴＣ−３′ プラスミドｐＬＳＧ２６は、プラスミドｐＬＳＧ２５でＡＴＧスタートコドンに 作製したＡｓｅ［制限酵素認識サイトがＮｄｅｌサイトである以外はプラスミド ｐＬＳＧ２５と同じである。 プラスミドｐＬｓＧ２６を持った形質転換体は、アンピシリン耐性の形質（Ａｍ ｐＲ）およびオリゴヌクレオチドＤＧＩ９３とのハイブリダイゼーションによっ て同定した。 Ｄ、プラスミドｐＬＳＧ２７とプラスミドｐＬＳＧ２８の最終構築 前述したように、ｐＢｓＭ：Ｔｔｈ　５　’はＴｔｈ　Ｐａｌ　Ｉ遺伝子コーデ ィングシーケンスの３′端の部分を欠失しているので、プラスミドｐＬＳＧ２５ とプラスミドｐＬＳＧ２６も同様にこの部分のシーケンスを欠いている。Ｔｔｈ 　Ｐｏｌ　Ｉ遺伝子コープインゲン−ケン・スの３′端の部分をプラスミドｐＬ ＳＧ２５とプラスミドｐＬＳＧ２ａ内に正しいリーディングフレームで入れるた めに、それぞれのプラスミドをＢａｍＨ［。 ＥｃｏＲ［で完全に消化した。次にプラスミドｐＬＳＧ２５のＢａｍＨ［−Ｅｃ ｏＲ［断片の大きい断片とプラスミドｐＬＳＧ２２の約１、２　Ｋ　ｂ　Ｂａｍ Ｈ［−ＥｃｏＲ［断片とをライゲーションさせてｐｃ。 ５Ｇ２７を作った。プラスミドｐＬＳＧ２２の約１．２　Ｋ　ｂ　ＢａｒｎＨｌ −ＥｃｏＲ［断片にはＴｔｈ　Ｐａｌ　Ｉ遺伝子コーディングシーケンスの３′ 端の部分が含まれている。同じようにして、プラスミドｐＬＳＧ２６をＢａ１ｎ 旧、ＥｃｏＲ［で完全消化しプラスミドｐＬＳＧ２２の約１．２　Ｋ　ｂ　Ｂａ ｍＨｒ−ＥｃｏＲｒ断片とをライゲーションさせてｐｌ、Ｓ６２８を作った。プ ラスミドｐｔ、ｓｃ　２７とプラスミドｐＬＳＧ２８の大腸菌内での、活性をも った欠失型’ｒｔｈ　Ｐｏｔ　Ｉ酵素の発現量は低かった。 例　６ プラスミドｐＬＳＧ２９からｐＬＳＧ３４までの構築ｐＢｓＭ：Ｔｔｈ　５、ρ ＬＳＧ２１　％　ｐＬＳＧ２２、ｐＬＳＧ２３、Ｉ）ＬＳＧ　２４、ｐＬＳＧ２ ７、ｐＬＳＧ２８は大腸菌内でＴｔｈ　Ｐｏｌ　Ｉ酵素活ｌａｃプロモータより 強力なブロモ―りを使用することで、Ｔｔｈ　Ｐｏｌ　Ｉ酵素活性の発現のレベ ルを上げることが期待できるのは、技術界では良く知られたことである。有名な 強力なプロモータの１つは、ラムダファージ由来のＰＬプロモータである。更に より高いレベルの発現あるいはより効率的な産生は、Ｔｔｈ　Ｐｏｌ　Ｉ酵素発 現ベクターのリポソーム結合サイト、転写終了シーケンス、複ａＳ始点（あるい は、それに関係したエレメント）に変更を加えることによって可能である。本例 てはＴｔｈ　Ｐａｌ　Ｉ酵素発現のため、発現ベクター内にどのようにしてラム ダＰＬプロモータ、バクテリオファージエフ遺伝子ＩＯ、ラムダ遺伝子のＮリポ ソーム結合サイトを配置したかを示した。 Ａ１発現ベクターｐＤＧ１６０およびｐＤＧ１６１の構築 プラスミドｐＤＧ１６０は以下の性質を備えたλＰＬクローニング用および発現 ベクターである。ラムダＰＬプロモータ、ラムダ遺伝子のＮリポソーム結合サイ ト（米国特許第４．７１１．’８４５号を参照されたい。参考書類として付ＩＥ ）を持つ、ポリリンカー内にクローニングされたシーケンスがラムダＰ　Ｌ　− Ｎ　ｏ−の制御のもとて発現できるように制限酵素認識配列サイトポリリンカー を配置している、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓの転写終結配列 （米国特許第４，６６６．８４８号を参照されたい。参考書類として付属）を持 つ。プラスミドｐＤＧ１６０はまた変異ＲＮＡ　ＩＩ遺伝子を存し、このプラス ミドをコピー数に対して温度感受性としている（米国特許第４，６３１、２５７ 号を参照）。これらのエレメントは共同で働いて、プラスミドｐＤＧ　Ｉ　６０ を非常に育用で強力な発現ベクターとしている。３０−３２°Ｃでは、このプラ スミドのコピー数は低く、温度感受性のλリプレッサー遺伝子（ＣＩ　８５７な ど）を持っている宿主細胞内では、ＰＬプロモータは機能していない。３７−４ １°Ｃではプラスミドのコピー数は２５−５０倍となり、Ｃｒ８５７リブレソサ ーは不活性化し、ＰＬプロモータか機能するようになる。ブラスソドｐＤＧＩ６ ０はアンピシリン耐性マーカ（ＡｍｐＲ）を持っている。プラスミドｐＤＣ；１ ６１はプラスミドｐＤＧ　Ｉ　６０と同じであるが、アンピシリン耐性マーカー （ＡｍｐＲ）の代わりにテトラサイクリン耐性マーカ（ＴｅｔＲ）を持っている 。 このようにして、プラスミドｐＤＧ　１６０とプラスミドｐＤＧ１６１はＣｏ１ Ｅ［ｃａｐ　”ベクター内に、ＡｍｐＲ，ＴｅｔＲマーカー、ラムダＰＬプロモ ータ、ラムダ遺伝子のＮリポソーム結合サイト、ポリリンカー、ＢＴ　ｃｒｙ　 ＰＲＥ（ＢＴポジティブ　レトロウィルス調節エレメント、米国特許第４．６６ ６．８４８号）をもった発現ベクターである。これらのプラスミドは、前述した プラスミドと合成二本鎖オリゴヌクレオタイドＤＧ３１．ＤＧ３２から構築され た。ＤＧ３１／ＤＧ３２合成二本鎖オリゴヌクレオタイドはその５′端に旧ｎｄ 　ＩＩＩの突出末端を持ち、続いてＳａｃ　ｒ、Ｎｃｏ　Ｉ、Ｋｐｎ［／Ａｓｐ ７１８、Ｘｍａｌ／Ｓｍａｒサイトがあり３′端にＢａｍ旧の突出末端を持つ。 この二本鎖リンカ−のシーケンスを下′に示す。　。 この二本鎖リンカ−とプラスミドｐＦＣ５４，ｔをプラスミドｐＤＧ］６０の構 築に用いた。 プラスミドｐＦＣ５４，ｔは５．９６Ｋｂ長のプラスミドで米国特許第４．６６ ６．８４８号に発表されていて、承認番号ＡＴＣＣ３９７８９でＡＴＣＣより入 手可能な大腸菌、プロファージλＮＪａｚｃ［８５７をもったＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ １２株ＤＧ９５を宿主として利用可能であり、旧ｎｄ　ｌｆｔとＢａｍＨＩて消 化したのち、分離したベクター断片を、分子数で５倍以上の脱リン酸化したＤＧ ３１／Ｄ０３２合成二本鎖とライゲーションを行なった。 ライゲーション後、ＤＮＡをＸｂａ　［で消化しくベクターｐＦＣ５４，ｔ　Ｄ ＮＡ断片を不活化するため）　Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２株ＤＧ　ｌ　１６　（ＡＴＣ Ｃ５３，６０６）をアンピンリン耐性株にするために用いた。コロニーのス：７ 　’Ｊ　−ニングは制限酵素消化を行なってｄｅｓ−ａｌａ−ｓｅｒ　１２５１ Ｌ−２変異蛋白シーケンスがなくなりＤＧ３１／ＤＧ３２ポリリンカーンーケン スが生じたものを選んだ。アンピシリン耐性株のひとつのプラスミド（ｐＤＣ； 　１６０と命名した）のポリリンカ一部分のシーケンス決定を行なって、望んだ 構築が達成されていることを確認した。 プラスミドｐ　ＡＷ７４０　ＣＨＢ　（承認番号ＡＴＣＣ６７，６０５としてＡ ＴＣＣより大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２ＤＧ１１６として入手可能）はＢａｍ Ｈｌ　、　Ｈｉｎｄ　［Ｉ［サイトのなくなったテトラサイクリン耐性遺伝子の 供給源として使われるが、これにはＣｏ１Ｅｌ　ｃａｐ　”ベクター内にラムダ ＰＬプロモータ、ラムダ遺伝子のＮリポソーム結合サイト、ＢＴ　ｃｒｙＰＲＥ を持っているが、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩとＢａｍＨＩで完全に消化され、４．ｌ９Ｋ ｂのベクター断片をアガロース電気泳動で精製した。精製したベクターＤＮＡ断 片は分子数で５倍以上の脱リン酸化したＤＧ３１／Ｄ０３２合成二本鎖とライゲ ーションを行なった。大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　Ｄ０１１６株をこのＤＮＡ で形質転換し、４．２　Ｋ　ｂプラスミド内持つものをテトラサイクリン耐性の コロニーから選択した。いくつかの形質転換体をさらに制限酵素消化あるいはサ ンが一法によるシーケンス決定を行なって、スクリーニングを行なった。いくつ かの形質転換体は望んだシーケンスを持つプラスミドを含んでいて、そのプラス ミドをｐＤＧＩ６１と命名した。 Ｂ９発現プラスミドｐＤＧＩ６４からｐＤＧ　１８１までの構築 Ｔｔｈの発現を容易にし、翻訳開始の効率をあげるためにｐＤＧ１６０とｐＤＧ １６１のラムダＰＬプロモータ、ラムダ遺伝子のＮリポソーム結合サイト（ＲＢ 　Ｓ）に変更を加えた。この変更のため、プラスミドｐＩ）ｃ　１６０とｐＤＧ １６１をＢｓｐＭ［［とＳａｃ　［で消化し、短い合成リンカ−でプラスミド内 のＢｓｐＭ［ｌ−５ａｃ［断片部をこの合成リンカ−で置き換えた。ここで使用 したいくつかの二本鎖リンカ−は異なった構造と性質を持ったものである。合成 二本鎖ＤＧ　ｌ　０６／ＤＧ　Ｉ　Ｏ７はバクテリオファージエフ遺伝子１０の ＲＢＳとＡＴＧスタートコドン内に制限酵素Ｎｄｅ　ｌサイトをコートするよう になっていて、次の構造となっている。 合成二本鎖ＤＧ１０ｇ／ＤＣ＋０９は修飾されたＴ７遺伝子１０ｃ７）ＲＢＳと ＡＴＧスタートコドン内に制限酵素Ａｓｅ　ｌサイトをコードするようになって いて、次の構造となっている。 合成二本鎖ＤＧＩ　１０／ＤＧＩ　＋　１はλＮ１６．とＡＴＧスタートコドン 内に制限酵素Ｎｄｅｌサイトをコードするようになっていて、次の構造となって いる。 合成二本鎖ＤＧ１１２／ＤＧ＋１’３はλＮ　＊　ｅ　ｓとＡＴＧスタートコド ン内に制限酵素Ａｓｅ［サイトをコードするようになっていて、次の構造となっ ている。 これらの合成二本鎖とＢｓｐＭＩｒ−Ｓａｃｌで消化したプラスミドｐＤＧＩ６ ０とｐＤＧｌ　６１をしたのテーブルの組み合わせでライゲーションし、プラス ミドｐＤＧ１６４からｐＤＧ＋７１まで作成した。 ｐＤＧＩ６０　ＤＧ１０６／ＤＧ１０７　ｐＤＧ＋６４ｐＤＧＩ６０　ＤＧＩ０ ８／ＤＧＩ０９　ｐＤＧＩ６６ｐＤＧＩ６０　ＤＧＩＩＯ／ＤＧＩＩＩ　ρＤＧ １６８ｐＤＧ］６０　ＤＧＩＩ２／ＤＧ１１３　ｐＤＧ＋７０ｐＤＧＩ６１　Ｄ Ｇ１０６／ＤＧ１０７　ｐＤＧ１６５ｐＤＧＩ６１　ＤＧ］０８／ＤＧ１０９　 ｐＤＧ１６７ｐＤＧ１６］　ＤＧＩＩＯ／ＤＧＩＩＩ　ｐＤＧ＋６９ｐＤＧ１６ １　ＤＧ１１２／ＤＧ１１３　ｐＤＧ１７１これらのプラスミドは、プラスミド ｐＤＧ　ｌ　６０とｐＤＧ１６１と共にＴｔｈ　Ｐｏ１ｌ遺伝子コーデイングシ ーケンスに挿入する前にさらに修飾を加えて、プラスミドｐＤＧ１７２からｐＤ ＧＩ８１まで作成した。 この修飾により、プラスミドｐＤＧ１６０とｐＤＧ１６１およびプラスミドｐＤ Ｇ１６４からｐＤＧ　＋　７１までのＣｓｐ　４５１　（Ａｓｕ［ｒ　）制限酵 素認識サイトが破壊された。本発明中の多くのベクターはＴｔｈ　Ｐｏ１ｌ遺伝 子コ−ディングシーケンスの５′端にＣｓｐ　４５１　（Ａｓｕｌ＋　）制限酵 素認識サイトを持っている。これらのＣｓｐ　４５１欠失ベクターは制限酵素Ｃ ｓｐ　４５１　（Ａｓｕ［Ｉ　）で作成した断片のクローニングベクターとして 有用である。Ｃｓｐ　４５１はプラスミドのコリシンＩＮＮ遺伝子内にありＣｓ ｐ　４５１で消化して、４種のｄＮＴＰ存在下で、クレノー酵素により平滑末端 二本ｌＤＮＡとして、ライゲーションして再び環状プラスミドにして、Ｃｓｐ　 ４５１サイトを削った。 得られたプラスミドをｐＤＧｌ７２がらｐＤＧ　１８１と命名し次のテーブルに 示す。 出発プラスミド　Ｃ５ｐ４５１部位除去後の命名ｐＤＧ１６０　ｐＤＧ１７２ ｐＤＧｌ　６１　ｐＤＧｌ　７３ ｐＤＧ＋６４　、　ｐＤＧ１７４ ｐＤＧ＋６５　ｐＤＧＩ７５ ｐＤＧＩ６６　、　ｐＤＧ１７６ ｐＤＧ１６７　ｐＤＧ１７７ ｐＤＧ１６８　ｐＤＧＩ７８ ｐＤＧＩ　６９　ｐＤＧｌ　７９ ｐＤＧ＋７０　ｐＤＧｌ８゜ ｐＤＧｌ　７１　ｐＤＧＩ　８１ ｐＤＧ１７２からｐＤＧｌ８１は次に、本発明のＴｔｈＰｏｌｌ遺伝子がλＰＬ プロモータの制御の下で発現するためのベクターの作成に使われた。 Ｃ，Ｔｔｈ　Ｐｏｌ【発現ベクターｐ［，５Ｇ２９からｐ［，５Ｇ３６まての構 築 Ｔｔｈ　Ｐｏ１ｒ遺伝子を発現ベクターｐＤＧ１７２からｐＤＧｌ８１内にクロ ーニングすればＴｔｈ’　Ｐｏｌ［発現ベクターを作成することかできる。いく つかのプラスミドの構築を次のテーブルに示す。 制限フラグメント ｐＤＧｌ７４　ｐＬＳＧ２８のＮｄｅ　［−Ｂａｍ　Ｈ［ｐＬＳＧ３５制限フラ グメント ｐＤＧｌ７５　ｐＬＳＧ２４のＮｄｅ　［−Ｂａｍ　Ｈ［ｐＬＳＧ３２制限フラ グメント ｐＤＧｌ７７　ｐＬＳＧ２３のＡｓｅ　Ｉ−Ｂａｍ　）ＩＩ　ｐＬＳＧ２９制限 フラグメント ｐＤＧｌ７８　ｐＬＳＧ２４のＮｄｅ　［−Ｂａｎ　Ｈ［ｐＬＳＧ３３制限フラ グメント ｐＤＧｌ７８　ｐＬＳＧ２８のＮｄｅ　ｌ−Ｂａｍ　ＩＩ　ｐＬＳＧ３６制限フ ラグメント ｐｉ）ＧＩ７９　ｐＬＳＧ２４のＮｄｅ　Ｉ−Ｂａｍ　）ＩＩ　ｐＬＳＧ３４制 限フラグメント ｐＤＧｌ８１　ｐＬＳＧ２３のＡｓｅ　［−Ｒａｍ　）ＩＩ　ｐＬｓＧ３０制限 フラグメント 発現ベクターｐＬＳＧ２９からｐＬＳＧ３６までを大腸菌Ｋ１２株ＤＧ１１６に 導入し、Ｔｔｈ　Ｐｏ１ｌ遺伝子が発現するような条件で培養した。すべての形 質転換体はほぼ同程度のポリメレース活性を産生したが、Ｔ７ＲＢＳをもつベク ターに比べ、ＮＲＢＳを持つベクターのほうが若干産生が多いようであった。λ ＰＬプロモータを持っベクターもＴｔｈ　Ｐｏｌ［を産生しそのレベルはＩａｃ ブロモータヲ持つ発現ベクターよりすくなくとも１オーダー高かった。 例　７ 大腸菌での組換Ｔｔｈ　Ｐｏ１ｌ活性の産生λＰＬプロモータを持つＴｔｈ　Ｐ ｏ１１発現プラスミドを持つ大腸菌Ｋ１２株ＤＧ　１１６　（ＡＴＣＣ５３，６ ０６）を、０．５％ブドウ糖、１０μｇ／ｍｌチアミン、０．２５％（Ｗ／Ｖ） 　Ｄｉｆｃｏ社カゼイシカゼインシリン（１００μｇ／＋ｎｌ）あるいはテトラ サイクリン（１００μｇ／ｍｌ）の入ったＢｏｎｎｅｒ−Ｖｏｇｅｌ最小塩培地 で３２°Ｃで培養した。 細胞は吸光度Ａ、。。が０．８に達したところでλＰＬプロモータを抑制するた め（ｃ１８５７リブレツサを不活性化）温度を３７°Ｃに変えベクタープラスミ ドのＣｏ１Ｅｌ　ｃ。 ｐ゛のコピー数を増加させた。３７°Ｃで増殖後６時間から９時間後、細胞を回 収し、遠心してペレットを一７０℃に保存した。 別の方法として、大腸菌Ｋ１２株ＫＢ２　（ＡＴＣＣ５３，０７５）をｔｒｐ（ トリプトファン）プロモータ／オペレータの制御の下でＴｔｈ　Ｐｏ１ｌを発現 するプラスミドを導入して、その大腸菌、を０．５％ブドウ糖、５μｇ／ｍｌ） リブトファン、１０μｇ１０＋１チアミン、０．２５％（Ｗ／Ｖ）　Ｄｉｆｃｏ 社カゼイシカゼインシリン（１００μｇ／ｌ）あるいはテトラサイクリン（１０ ０μｇ／ｍｌ）の入ったＢｏｎｎｅｒ−Ｖｏｇｅ　ｌ最小塩培地で３２°Ｃて培 養し、吸光度Ａ、。。が３．０に達するまで培養する方法もある。細胞はこのあ と前述した方法で回収する。 細胞のベレットは５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５１ｍＭεＤＴＡ、 　２．４　ｍＭ　ＰＭＳＦ　、　０．５　ｕ　ｇ／ｍｌリュウペブチンでＯｌＤ 、か５からｌＯとなるように再浮遊させ超音波で細胞を溶解する。超音波処理し た抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけクーマシー染色あるいはラビット抗Ｔａｑボ リメレース抗体によるウェスタン免疫プロッティング法で解析した。 ウェスタン免疫プロッティング法により、Ｔｔｈ発現プラスミドを導入された細 胞で約９４ＫＤａのＴｔｈＤＮＡボリメレースか顕著に合成されていることがわ かった。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した細胞蛋白のクーマシー染色でも、細胞中で約９４Ｋ Ｄａの新たなポリペプチドが誘導発現されていることがわかった。・最終的に、 高温下での活性のアッセイにより顕著な量の組換ＴｔｈＤＮＡボリメレースが大 腸菌で産生されていることが確かめられた。 例　８ ＴｔｈＤＮＡポリメレースによるＰＣＲ反応反応例示された、約１．２５ユニツ トの精製したＴｔｈ　ＤＮＡボリメレースをつかって、ｒｔｈ遺伝子内にコード されているＴｔｈのｒＲＮＡシーケンスの増幅を行なった。反応液の容積は５０ μｍで、反応ミックスには５０ｐＨ０１のプライマーＤＧ７３．１０’からｌＯ コピーのＴ抽遺伝子（約２Ｘ１０’遺伝子コピー／ｎ　ｇＤＮＡ）　、５０μｍ ｏｌのブライ７−ＤＣ７４，２００μＭ各ｄＮＴＰ、２　ｍＭ　ＭｇＣｌ、。 １　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＫＣｌ、　１　００ｕ ｇ／ｍｌゼラチン（入れなくてもよい）か入っている。 反応はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社のＤ　Ｎ　Ａ　Ｔｈｅｒｍａｌ 　Ｃｙｃｅｒで行なった。９６°Ｃ１５秒、５０°Ｃ３０秒、７５°Ｃ３０秒を １サイクルとして２５−３０サイクル行なった。 ２０サイクルの反応でゲルのエチヂウムブロマイド染色でかすかなバンドが認め られ、３０サイクルではエチヂウムブロマイド染色したゲルを紫外線で照らして 生産物をはっきりと見ることができた。 ＴｔｈＤＮＡボリメレースのユニット数が少ないときは（０，３１ユニッ１−１ ５０μＩ）小量の非特異的な産物が作られていた。また、１ａｕｒｅｔｈ　−１ ２のような非イオン性の界面活性を反応混合液中に最終濃度１％となるように加 えておくと、ＰＣＲ産物が増える。 プライマーＤＧ７３とプライマーＤＧ７４を下に示すＤＧ７３　５　’　ＴＡＣ ＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣ３’ＤＧ７４　５　’　ＡＧＧＡＧＧＴＧ ＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡ　３　’／　要　約　書 ’　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉＬ、ｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ１活性 を３　コードする組換体ＤＮＡ配列を組換体ベクターの構築及：び活性を産生ず る形質転換宿主細胞の作製につかった。 ！！−Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ１は分 子量６　約９４ＫＤａの蛋白で、ポリメラーゼ　チェーン　リア力　クションと して知られているＤＮＡ増幅反応に特に有用である。 声 国際調査報告 一一一一−＾−−ｈａ　ＰＣＴ／ＩＪＳ　９０１０７６３９国際調査報告 Ｓ＾　４３９２９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼＩ活性を コードする組換体ＤＮＡ配列 ２．プラスミドｐＢＳＭ：Ｔｔｈより分離される請求の範囲第１項のＤＮＡ配列 ３．アミノ末端よりカルボキシ末端までのアミノ酸配列 【配列があります】 をコードする請求の範囲第１項のＤＮＡ配列４． 【配列があります】 である請求の範囲第３項のＤＮＡ配列 ５．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする組換ＤＮＡ配列 であって、この蛋白は請求の範囲第３項のＴｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ ｌｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列によってコードされる隣接 するアミノ酸配列９種のうち少なくとも５種で１００％ホモロジーであるアミノ 酸配列を含んでいて、隣接するアミノ酸配列９種はコドングループ２３８−２４ ６、２４１−２４９、３３５−３４３、３３６−３４４、３３７−３４５、３３ ８−３４６、３３９−３４７より選択されたものである組換ＤＮＡ配列 ６．耐熱性ポリメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする組換ＤＮＡ配列であっ て、この蛋白は請求の範囲第３項のＴｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ 　ＤＮＡポリメラーゼをコードする配列の第２２５−２３０番目のコドンにより コードされる隣接する６種のアミノ酸配列のうち少なくとも４種と１００％ホモ ロジーであるアミノ酸配列を含んでいる組換ＤＮＡ配列 ７．請求の範囲第１項のＤＮＡ配列からなる組換ＤＮＡベクター ８．プラスミドｐＢＳＭ：Ｔｔｈ、ｐＬＳＧ２１、ｐＬＳＧ２２、ｐＬＳＧ２３ 、ｐＬＳＧ２４、ｐＬＳＧ２７、ｐＬＳＧ２８、ｐＬＳＧ２９、ｐＬＳＧ３０、 ｐＬＳＧ３１、ｐＬＳＧ３２、ｐＬＳＧ３３、ｐＬＳＧ３４、ｐＬＳＧ３５、及 びｐＬＳＧ３６からなる群から選択される請求の範囲第７項の組換ＤＮＡ配列 ９．プラスミドｐＢＳＭ：Ｔｔｈである請求の範囲第８項の組換ＤＮＡ配列 １０．プラスミドｐＢＳＭ：Ｔｔｈ５′、ｐＢＳＭ：ＴｔｈΔＳｔｕｌ／Ｈｉｎ ｄＩｉｉ、ｐＬＳＧ２５およびｐＬＳＧ２６からなる群から選択される組換ＤＮ Ａベクター １１．請求の範囲第７項のベクターを用いて形質転換された組換宿主細胞 １２．大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉである請求の範囲第１１項の宿主細胞 １３．プラスミドｐＢＳＭ：Ｔｔｈ、ｐＬＳＧ２１、ｐＬＳＧ２２、ｐＬＳＧ２ ３、ｐＬＳＧ２４、ｐＬＳＧ２７、ｐＬＳＧ２８、ｐＬＳＧ２９、ＰＬＳＧ３０ 、ｐＬＳＧ３１、ｐＬＳＧ３２、ｐＬＳＧ３３、ｐＬＳＧ３４、ｐＬＳＧ３５、 およびｐＬＳＧ３６からなる群より選別されたベクターを用いて形質転換された 請求の範囲第１２項の組換宿主細胞 １４．Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１，２／ｐＢＭ：Ｔｔｈである請求の範囲第１２項の組 換宿主細胞 １５．Ｔｈｅｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼＩをＴ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞より精製する方法であって、（ａ）前述の細胞よ り細胞粗抽出物を調整し、（ｂ）ポリメラーゼが抽出物中の核酸より解離するよ うに抽出物のイオン強度を調整し、 （ｃ）抽出物を疎水反応クロマトグラフィにかけ、（ｄ）抽出物をＤＮＡ結合蛋 白アフィニティークロマトグラフィにかけ、 （ｅ）抽出物をヌクレオチド結合蛋白アフィニティークロマトグラフィにかけ、 そして （ｆ）抽出物を陰イオン交換、陽イオン交換、およびハイドロキシアパタイトク ロマトグラフィからなる群より選別されたクロマトグラフィにかけることからな る方法