KR101536318B1 - Ｅｇｆｒ 유전자의 다형(多型) 검출용 프로브, 증폭용 프라이머 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

EGFR 유전자에 대해서, 다른 다형(多型)을, 간편하고 또한 우수한 신뢰성으로 판별 가능한 다형 검출용 프로브, 증폭용 프라이머 및 그 용도를 제공한다.
하기 P1, P3, P5∼P7 및 P15∼P18에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를, 다형 검출용 프로브로서 사용한다.
(P1) 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 251∼261을 포함하는 11∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 251에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드
(P3) 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼261을 포함하는 5∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 257에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드
(P5) 서열번호 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 104∼112를 포함하는 9∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 112에 상동적인 염기가 티민이고, 염기번호 104에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드
(P6) 서열번호 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 104∼119를 포함하는 16∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 119의 염기가 G 이외의 염기로 치환되어 있고, 염기번호 104에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드
(P7) 서열번호 3에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 136∼145를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 145에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드
(P15)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 259∼264를 포함하는 6∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이며, 상기 염기보다 3’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드
(P16)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼262을 포함하는 5∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이며, 상기 염기보다 5’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드
(P17)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 249∼264을 포함하는 16∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 상기 염기보다 5’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드
(P18)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼264을 포함하는 8∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 상기 염기보다 3’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

Description

ＥＧＦＲ 유전자의 다형(多型) 검출용 프로브, 증폭용 프라이머 및 그 용도{PROBE FOR DETECTION OF POLYMORPHISM IN EGFR GENE, AMPLIFICATION PRIMER, AND USE THEREOF}

본 출원은 2010년 10월 29일에 출원된 일본국 출원 특원2010-244643을 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시된 모두를 여기에 도입한다.

본 발명은 EGFR 유전자의 다형 검출용 프로브, 증폭용 프라이머 및 그 용도에 관한 것이다.

상피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor : EGFR)는, 상피 성장 인자(EGF)의 티로신키나아제형 수용체이다. EGFR은 많은 고형암에서 고빈도로 발현하고, 그 과잉 발현은 암의 악성도나 예후와 관련함이 알려져 있다. 그래서, 예를 들면 EGFR의 티로신키나아제 저해제(EGFR-TKI)인 게피티닙(gefitinib) 등이, 암치료 약으로서 사용되고 있다. 그러나, 환자 중에는, 게피티닙에 의한 종상 축소 효과가 향상하는 경우가 있으면, 게피티닙에 내성을 나타내어, 치료 효과를 얻을 수 없는 경우도 있다. 그리고, 근래 이와 같은 약제에 대한 감수성이, EGFR의 변이와 관련하는 것이 분명해지고 있다(PLoS Medicine, 2005년, Vol.2, No.3, p.225-235, 및 Journal of Clinical Oncology, 2005년, Vol.23, No.11, p.2513-2520).

상기 변이는, 예를 들면 EGFR의 790번째 및 858번째에 있어서의 치환 변이, EGFR 유전자의 엑손19에 있어서의 결실 변이 등이 알려져 있다(PLoS Medicine, 2005년, Vol.2, No.3, p.225-235, 및 Journal of Clinical Oncology, 2005년, Vol.23, No.11, p.2513-2520). 상기 790번째에 있어서의 변이는, EGFR의 790번째의 아미노산인 트레오닌(T)이 메티오닌(M)으로 치환된 변이이며, 서열번호 21에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서는, 347번째의 염기 시토신(c)이 티민(t)으로 치환되어 있다. 상기 858번째에 있어서의 변이는, EGFR의 858번째의 아미노산인 류신(L)이 아르기닌(R)으로 치환된 변이이며, 서열번호 1에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서는, 261번째의 염기 티민(t)이 구아닌(g)으로 치환되어 있다. 상기 EGFR 유전자의 엑손 19에 있어서의 결실 변이는, 상기 엑손 19에 있어서, 연속한 수 염기∼수십 염기가 결실한 변이이며, 서열번호 2에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서는, 예를 들면 112∼164번째의 염기 중 어느 것이 결실해 있다. 따라서, EGFR 유전자에 있어서의, 이 변이의 유무(다형)를 검출하면, 치료 전에, 게피티닙에 대한 감수성을 평가할 수 있기 때문에, 보다 효율적인 테일러 메이드 암치료가 가능해진다.

다른 한편, 유전자의 다형을 검출하는 방법은, 다양한 방법이 보고되고 있어, 예를 들면 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)법 등을 들 수 있다.

그러나, 상기 PCR-RFLP법은, 수고가 들고 증폭 산물이 비산(飛散)하여, 2회째의 다른 반응에 혼입할 우려가 있다. 이와 같은 문제로부터, 다형의 검출을 자동화하기 어렵다는 문제도 있다.

이와 같은 문제로부터, 근래 유전자 다형의 검출 방법으로서, 융해 곡선 분석(Tm 분석)을 이용한 검출이 행해지고 있다. 이는, 검출 목적의 유전자 다형을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용하여, 검출 시료의 표적 1본쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성시켜, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하여 온도 상승에 수반하는 하이브리드의 해리(융해)를 흡광도 등의 시그널 측정에 의해 검출하고, 이 검출 결과에 의거하여 Tm값을 결정함으로써 목적 다형의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 목적 다형을 포함하는 검출 대상 서열과 그에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 1본쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일하면, 표적 DNA에 목적 다형이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값보다 낮으면, 표적 DNA에 목적 다형이 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.

「Tm값」이란, 2본쇄 핵산이 해리하는 온도(해리 온도 : Tm)로, 일반적으로 260㎚에 있어서의 흡광도가, 흡광도 전(全)상승분의 50％에 달했을 때의 온도로 정의된다. 즉, 2본쇄 핵산, 예를 들면 2본쇄 DNA를 함유하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이는, 2본쇄 DNA에 있어서의 양쇄간의 수소 결합이 가열에 의해 풀려, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 따라 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. Tm값은 이 현상에 의거하여 설정된다.

그러나, 이와 같은 Tm 해석을 이용한 검출 방법은, 적어도 1염기의 차이를 Tm값에 의해 판단하기 때문에, 복수의 유전자 다형을 가질 경우에는, 1개의 샘플을 해석하는 데에도 매우 많은 노력을 수반한다.

이와 같은 이유에서, EGFR 유전자의 다형의 검출은, 예를 들면 상기 질환의 치료법의 선택에 있어서 매우 중요하다. 그래서, 본 발명은 EGFR 유전자에 대해서, 1염기가 다른 다형을, 간편하고 또한 우수한 신뢰성으로 판별 가능한 다형 검출용 프로브 및 다형 검출 방법의 제공을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 다형 검출용 프로브는, EGFR의 유전자 변이를 검출하는 것이 가능한 프로브로서, 하기 P1, P3, P5∼P7 및 P15∼P18에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

(P1) 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 251∼261을 포함하는 11∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 251에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P3) 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼261을 포함하는 5∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 257에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P5) 서열번호 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 104∼112를 포함하는 9∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 112에 상동적인 염기가 티민이고, 염기번호 104에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P6) 서열번호 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 104∼119를 포함하는 16∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 119의 염기가 G 이외의 염기로 치환되어 있고, 염기번호 104에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P7) 서열번호 3에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 136∼145를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 145에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P15)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 259∼264를 포함하는 6∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이며, 상기 염기보다 3’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼262을 포함하는 5∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이며, 상기 염기보다 5’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P17)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 249∼264을 포함하는 16∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 상기 염기보다 5’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P18)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼264을 포함하는 8∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 상기 염기보다 3’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

본 발명의 다형 검출 방법은, EGFR 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 본 발명의 프로브를 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 판정 방법은, 본 발명의 방법에 의해 EGFR 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 공정, 및 다형의 유무에 의거하여 EGFR-TKI에 대한 내성 또는 약효를 판정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 EGFR-TKI에 대한 내성 또는 EGFR-TKI의 약효의 판정 방법이다.

본 발명의 키트는, EGFR 유전자에 있어서의 다형을 검출하기 위한 시약 키트로서, 본 발명의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 프라이머는, EGFR의 유전자 변이를 검출하는 것이 가능한 프라이머로서, 하기 P8∼13에서 선택되는 다형 검출용 프라이머이다.

(P8) 233번째의 염기 C를 3’ 말단으로 하여 서열번호 1에 상동적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

(P9) 284번째의 염기 G에 상보적인 염기 C를 3’ 말단으로 하여 서열번호 1에 상보적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

(P10) 290번째의 염기 G에 상보적인 염기 C를 3’ 말단으로 하여 서열번호 1에 상보적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

(P11) 95번째의 염기 G를 3’ 말단으로 하여 서열번호 2에 상동적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

(P12) 73번째의 염기 C를 3’ 말단으로 하여 서열번호 2에 상동적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

(P13) 155번째의 염기 G에 상보적인 염기 C를 3’ 말단으로 하여 서열번호 2에 상보적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

본 발명의 다형 검출 방법에 의하면, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용함으로써, 예를 들면 EGFR 유전자의 다형을, 간편하고 또한 우수한 신뢰성으로 판별할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 시료 중에, 목적의 다형이 야생형인 EGFR 유전자와 변이형인 EGFR 유전자가 공존해 있을 경우에도, 야생형과 변이형의 다형을, 간편하고 또한 우수한 신뢰성으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머에 의하면, 예를 들면 EGFR 유전자의 다형을 포함하는 영역을 특이적으로 증폭할 수 있다. 이와 같이 본 발명에 의하면, EGFR 유전자의 다형을, 간편하고 또한 우수한 신뢰성으로 증폭 및 판별할 수 있으므로, 예를 들면 검출 결과를, 상술한 바와 같은 질환의 치료법의 선택 등에 반영할 수 있다. 예를 들면 게피니팁 등의 EGFR-TKI에 대한 내성 또는 약효를 판정할 수 있다. 또한, 본 발명은 예를 들면 의료 분야에 상관없이, 생화학 등의 넓은 분야에서의 EGFR 유전자의 다형 검출에 적용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 3은 본 발명의 실시예 4에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 4는 본 발명의 실시예 5-1에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 5는 본 발명의 실시예 5-2에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 6은 본 발명의 실시예 5-3에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 7은 비교예 1에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 8은 비교예 2에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 9는 실시예 3-1에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 10은 실시예 3-2에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 11은 실시예 3-3에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.
도 12는 비교예 3에서의 반응액의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프.

본 발명에 있어서 유전자의 다형이란, 예를 들면 변이에 의해 생긴, 하나 또는 복수의 유전자좌에 있어서의 다양성을 말한다. 상기 변이는, 예를 들면 치환, 결실, 삽입 및 부가를 들 수 있다.

EGFR 유전자로서 서열번호 1, 2 및 21에 나타내는 부분 서열은, 예를 들면, 각각 이하에 나타내는 GenBank 액세션 No.에 등록되어 있다.

(서열번호 1)

NT_033968

4848624∼4849033번째의 염기서열

(서열번호 2)

NT_033968.6

4831717번째∼4832003번째의 염기서열

(서열번호 21)

NG_007726

167001번째∼168020번째의 염기서열

본 발명에 있어서, EGFR 유전자에 있어서의 검출 목적의 다형이란, 예를 들면 이하의 다형이다.

서열번호 1에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서 261번째의 염기(k)의 다형

서열번호 2에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서 104∼133번째 중 적어도 어느 하나의 염기의 다형

서열번호 2에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서 130∼164번째의 염기 중 적어도 어느 하나의 다형

서열번호 21에 나타내는 EGFR 유전자의 부분 서열에 있어서 347번째의 염기(y)의 다형

이하, 서열번호 1의 상기 다형을 「EGFR 엑손 21 858 다형」이라 하고, 서열번호 2의 상기 다형을 「EGFR 엑손 19 다형」이라 하며, 서열번호 21의 상기 다형을 「EGFR790 다형」이라고 한다. 상기 다형은, 각각 야생형, 변이형이 존재한다. 상기 각 다형에 대해서, 야생형의 EGFR 유전자를 야생형 유전자, 변이형의 EGFR 유전자를 변이형 유전자라고 한다.

상기 서열번호 1에 있어서의 261번째의 염기(k)의 다형은, 야생형이 티민(t)이며, 변이형이 구아닌(g)이다. 야생형의 경우 EGFR의 858번째의 아미노산은 류신(L)이 되고, 변이형의 경우 EGFR의 858번째의 아미노산은 아르기닌(R)이 된다.

본 발명에 있어서, 「EGFR 엑손 21 L858R」이라는 표현은, EGFR 유전자의 엑손 21에 있어서의 변이로서, 코돈 858에 있어서의 변이가 아미노산으로서 류신으로부터 아르기닌으로의 변이인 것을 의미한다. 또한 본 발명에 있어서, 「EGFR 엑손 21의 변이형」이라는 표현은, 「EGFR 엑손 21 L858R」을 의미한다. 본 발명에 있어서의 EGFR 엑손 21의 염기서열은, GenBank 액세션 No.NT_033968에 있어서의 4848624∼4849033번째를 의미하고, EGFR 엑손 21 L858R의 변이는, GenBank 액세션 No.NT_033968에 있어서 나타내는 염기서열의 4848884번째의 염기가 「T(티민)」으로부터 「G(구아닌)」으로의 변이를 말한다.

상기 서열번호 2의 104∼164번째의 염기의 다형은, 예를 들면 하기 표 1에 나타내는 다형을 들 수 있다(Journal of Clinical Oncology, 2005년, Vol.23, No.11, p.2513-2520 참조). 하기 표 1에서 다형 1은 야생형이다. 하기 다형 1의 염기서열은, 서열번호 2에 있어서의 104∼164번째의 올리고뉴클레오티드에 대응한다. 하기 표 1에서 다형 2∼18은, 서열번호 2의 112∼164번째의 영역에서, 적어도 어느 하나의 염기가 결실한 변이형(엑손 19 결실 변이)이다. 그 중에서도, 하기 다형 2∼17은, 서열번호 2의 122∼132번째의 영역에서, 적어도 어느 하나의 염기가 결실해 있으며, 구체적으로는, 상기 112∼140번째의 영역에서, 복수의 염기가 결실한 변이형이다. 하기 다형 18은, 서열번호 2의 137∼151번째의 염기가 결실한 변이형이다. 하기 표 1의 다형 2∼18에 있어서 「-」는, 다형 1에 대응하는 부위의 염기가 결실해 있는 것을 나타낸다.

[표 1]

EGFR 유전자에 있어서, 상기 2개소의 다형 중 적어도 하나가 상술한 바와 같은 변이형이면, 예를 들면 게피니팁 등의 EGFR-TKI에 대한 내성이 높을 가능성이 있다고 판단할 수 있다.

상기 서열번호 21의 347번째의 염기(y)는, 야생형이 시토신(c)이며, 이 경우, EGFR의 790번째의 아미노산은 트레오닌(T)이 된다. 변이형은 티민(t)이며, 이 경우, EGFR의 790번째의 아미노산은 메티오닌(M)이 된다. EGFR 유전자에 있어서, 이 다형이 상술한 바와 같은 변이형이면, 예를 들면 게피니팁 등의 EGFR-TKI에 내성을 나타낼 가능성이 있다고 판단할 수 있다.

본 발명에 있어서, 「상동성을 갖는 서열」은, 특정한 염기서열에 대하여, 예를 들면 80% 이상의 상동성을 갖는 서열이 바람직하다. 상기 상동성은, 예를 들면 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 100%이다. 즉, 본 발명에 있어서, 상동성을 갖는 서열은, 상기 특정의 염기서열로 이루어지는 서열(상동성 100%)이어도 되고, 상기 특정의 염기서열에 대해서, 1염기 이상이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 서열(예를 들면 상동성이 80% 이상 100% 미만)이어도 되다 (이하, 마찬가지). 상술한 상기 다형이 발생하는 부위, 즉, 센스쇄에 있어서의 부위 및 그에 상보적인 안티 센스쇄에 있어서의 부위를 「검출 부위」라 하고, 상기 검출 부위를 포함하여, 상기 다형 검출용 프로브가 하이브리다이즈 가능한 영역을 「하이브리다이즈 영역 또는 검출 서열」이라고 한다. 상기 검출 부위가 야생형인 검출 서열을 「야생형 검출 서열」, 검출 부위가 변이형인 검출 서열을 「변이형 검출 서열」이라고도 한다.

본 발명에 있어서, 상기 EGFR858 다형(t／g)을 검출하기 위한 프로브를 「EGFR858용 프로브」, 상기 엑손 19 다형을 검출하기 위한 프로브를 「엑손 19용 프로브」, 상기 EGFR790 다형(c／t)을 검출하기 위한 프로브를 「EGFR790용 프로브」라고도 한다. 또한, 상기 검출 서열에 있어서, 상기 변이형 검출 서열보다, 상기 야생형 검출 서열에 대하여, 보다 강하게 하이브리다이즈하는 프로브를, 「야생형 프로브」라고 한다. 한편, 상기 검출 서열에 있어서, 상기 야생형 검출 서열보다, 상기 변이형 검출 서열에 대하여, 보다 강하게 하이브리다이즈하는 프로브를, 「변이형 프로브」라고 한다. 「하이브리다이즈하는 세기」는, 예를 들면 Tm값의 관계, 구체적으로는, 프로브와 야생형 검출 서열의 Tm값 및 상기 프로브와 변이형 검출 서열의 Tm값에 대해서, 양 Tm값의 고저의 관계에 의해 나타낼 수 있다. 즉, 상기 야생형 프로브는, 예를 들면 야생형 검출 서열과의 Tm값이, 변이형 검출 서열과의 Tm값보다, 높은 값을 나타내는 프로브이다. 한편, 상기 변이형 프로브는, 변이형 검출 서열의 Tm값이, 야생형 검출 서열과의 Tm값보다, 높은 값을 나타내는 프로브이다.

상기 높은 값을 나타냄이란, 예를 들면 각 Tm값에 있어서의 피크의 다름이 검출 가능하면 되고, 구체적으로는, 상기 각 Tm값의 차이가 3℃ 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 4℃ 이상이고, 더 바람직하게는 5℃ 이상이며, 상기 각 Tm값의 차의 상한은 하등 제한되지 않고, 예를 들면 30℃이다.

본 발명에 있어서, EGFR 유전자에 있어서의 증폭 영역은, 예를 들면 EGFR 유전자의 센스쇄에 있어서의 영역이어도 되고, 그에 대응하는 안티 센스쇄에 있어서의 영역이어도 되며, 양쪽이어도 된다.

본 발명에 있어서, 염기서열의 말단이란, 염기서열의 5’측 및 3’측의 가장 끝의 염기를 의미한다. 또한 5’ 말단 영역이란, 염기서열의 5’ 말단으로부터 수 염기의 영역이며, 3’ 말단 영역이란, 염기서열의 3’ 말단으로부터 수 염기의 영역이다. 상기 수 염기란, 예를 들면 말단으로부터 1 염기∼10 염기이다. 본 발명에 있어서, 염기서열의 말단으로부터 Z번째의 염기(Z는 양의 정수)란, 말단의 염기를 1번째로 한 순번이다.

<다형 검출용 프로브>

(1) EGFR858용 프로브

본 발명의 다형 검출용 프로브는, 상술한 바와 같이, EGFR 엑손21 L858R의 유전자 변이를 검출하는 것이 가능한 프로브로서, 하기 P1, P3 및 P15∼P18 중 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

(P1) 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 251∼261을 포함하는 11∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 251에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P3) 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼261을 포함하는 5∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 257에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P15)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 259∼264을 포함하는 6∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이며, 상기 염기보다 3’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼262을 포함하는 5∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이며, 상기 염기보다 5’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P17)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 249∼264을 포함하는 16∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 상기 염기보다 5’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P18)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼264을 포함하는 8∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 상기 염기보다 3’측에 위치하는 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

상기 P1, P3 및 P15∼P18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 상기 EGFR858 다형(t／g)을 검출하기 위한 프로브, 즉, 상기 EGFR858용 프로브이다. 이들 프로브는, 예를 들면 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 261번째의 염기의 치환 변이의 유무를 검출하기 위한 프로브이다.

상기 P1, P3 및 P15∼P18의 각 올리고뉴클레오티는, 예를 들면 EGFR 유전자의 센스쇄와 상보적이며, 상기 센스쇄와의 하이브리다이제이션에 의해, 상기 다형을 확인할 수 있다. 상기 P1의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 서열번호 1의 261번째의 염기(t 또는 g)에 상보적인(대응하는) 염기는 아데닌(a) 또는 시토신(c)이다. 상기 P1의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 염기가 아데닌(a)인 올리고뉴클레오티드를, 「P1-wt」라고도 하고, 상기 염기가 시토신(c)인 올리고뉴클레오티드를, 「P1-mt」라고도 한다. 상기 P1-wt는, EGFR858 변이형의 검출 서열보다, EGFR858 야생형의 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈하기 때문에, EGFR858용 야생형 프로브라고 할 수 있다. 상기 P1-mt는, EGFR858 야생형의 검출 서열보다, EGFR858 변이형의 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈하기 때문에, EGFR858용 변이형 프로브라고 할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드가, 상기 EGFR 유전자의 검출 서열 중, EGFR858 야생형의 검출 서열 또는 EGFR858 변이형의 검출 서열 중 어느 것과 강하게 하이브리다이즈하는지에 따라, EGFR 유전자의 다형을 검출할 수 있다.

상기 P3의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 EGFR 유전자의 센스쇄와 상보적이며, 상기 센스쇄와의 하이브리다이제이션에 의해, 상기 다형을 확인할 수 있다. 상기 P3의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 서열번호 1의 261번째(t 또는 g)에 상보적인(대응하는) 염기는 아데닌(a) 또는 시토신(c)이다. 상기 P3의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 염기가 아데닌(a)인 올리고뉴클레오티드를, 「P3-wt」라고도 하고, 상기 염기가 시토신(c)인 올리고뉴클레오티드를, 「P3-mt」라고도 한다. 상기 P3-wt는, EGFR858 변이형의 검출 서열보다, EGFR858 야생형의 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈하기 때문에, EGFR858용 야생형 프로브라고 할 수 있다. 상기 상기 P3-mt는, EGFR858 야생형의 검출 서열보다, EGFR858 변이형의 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈하기 때문에 EGFR858용 변이형 프로브라고 할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드가, EGFR 유전자의 검출 서열 중, EGFR858 야생형의 검출 서열 또는 EGFR858 변이형의 검출 서열 중 어느 것과 강하게 하이브리다이즈하는지에 따라, EGFR 유전자의 다형을 검출할 수 있다.

상기 P1의 올리고뉴클레오티드(3T-EGFR-858-R2)는, 상술한 바와 같이 11∼50 염기 길이이고, 바람직하게는 11∼40 염기 길이이며, 보다 바람직하게는 11∼30 염기 길이이며, 더 바람직하게는, 12∼20 염기 길이이다. 상기 P3의 올리고뉴클레오티드(3T-EGFR-858-R1)는, 상술한 바와 같이 5∼50 염기 길이이고, 바람직하게는 10∼40 염기 길이이며, 보다 바람직하게는 10∼30 염기 길이이고, 더 바람직하게는 12∼20 염기 길이이다.

상기 각 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표지 물질로 표지화되는 부위는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 5’ 말단 영역 또는 3’ 말단 영역인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5’ 말단 또는 3’ 말단이다. 또한 후술하는 바와 같이, 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표지 물질로 표지화되는 염기는, 예를 들면 시토신(c) 또는 구아닌(g)인 것이 바람직하다. 상기 표지 물질은, 예를 들면 염기를 직접 표지화해도 되고, 상기 염기를 포함하는 뉴클레오티드 잔기(殘基)의 어느 부위를 표지함으로써, 상기 염기를 간접적으로 표지화해도 된다.

상기 P1의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 251에 상보적인(대응하는) 염기를, 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖는 것이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서의 「염기번호 251에 상보적인(대응하는) 염기」란, 상기 올리고뉴클레오티드와 서열번호 1의 염기서열을 얼라인먼트했을 때에, 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 251번째의 염기(g)에 상보적인 염기(c)를 의미한다. 구체적으로, 염기번호 251에 상보적인 염기는, P1의 올리고뉴클레오티드에 있어서 c로 나타난다.

상기 P1의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 251에 상보적인 염기를 5’ 말단에 갖는 것이 바람직하다.

상기 P1-mt는, 예를 들면 서열번호 7에 나타내는 올리고뉴클레오티드, 상기 P1-wt는, 예를 들면 서열번호 8에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

5’-ttggcccgcccaaaatc-3’(서열번호 7)(3T-EGFR-858-R2)

5’-ttggccagcccaaaatc-3’(서열번호 8)

상기 P3의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 257에 상보적인(대응하는) 염기를 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖는 것이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서의 「염기번호 257에 상보적인(대응하는) 염기」란, 상기 올리고뉴클레오티드와 서열번호 1의 염기서열을 얼라인먼트했을 때에, 서열번호 1의 염기서열에 있어서의 257번째의 염기(g)에 상보적인 염기(c)를 의미한다. 구체적으로, 염기번호 257에 상보적인 염기는, P3의 올리고뉴클레오티드에 있어서 c로 나타난다.

상기 P3은, 예를 들면 서열번호 12∼14에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있고, 상기 P3-mt는, 예를 들면 서열번호 9∼11에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

5’-cagtttggccagccc-3’(서열번호 12)

5’-ctgtttggccagccc-3’(서열번호 13)

5’-ccgtttggccagccc-3’(서열번호 14)

5’-cagtttggcccgccc-3’(서열번호 9)(3T-EGFR-858-R1)

5’-ctgtttggcccgccc-3’(서열번호 10)

5’-ccgtttggcccgccc-3’(서열번호 11)

상기 P15의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 하기 P15-1∼P15-5의 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

(P15-1)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 235∼264을 포함하는 30∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 235에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P15-2)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 239∼264을 포함하는 26∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 239에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P15-3)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 244∼264을 포함하는 21∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 244에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P15-4)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼264을 포함하는 7∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 258에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P15-5)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 259∼264을 포함하는 6∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 259에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

상기 P16의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 하기 P16-1∼P16-10의 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

(P16-1)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼263을 포함하는 6∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 263에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16-2)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼262을 포함하는 5∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 262에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16-3)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼271을 포함하는 14∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 271에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16-4)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼274을 포함하는 17∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 274에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16-5)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼275을 포함하는 18∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 275에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16-6)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼276을 포함하는 19∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 276에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16-7)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼278을 포함하는 21∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이며, 염기번호 278에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16-8)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼280을 포함하는 23∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 280에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16-9)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼281을 포함하는 24∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이며, 염기번호 281에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P16-10)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 258∼284을 포함하는 27∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 284에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

상기 P17의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 하기 P17-1∼P17-4의 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

(P17-1)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 236∼264을 포함하는 29∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이고, 염기번호 236에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P17-2)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 241∼264을 포함하는 24∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이고, 염기번호 241에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P17-3)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 247∼264을 포함하는 18∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이고, 염기번호 247에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P17-4)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 249∼264을 포함하는 16∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이고, 염기번호 249에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

상기 P18의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 하기 P18-1∼P18-5의 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

(P18-1)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼264을 포함하는 8∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 염기번호 264에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P18-2)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼265을 포함하는 9∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 염기번호 265에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P18-3)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼269을 포함하는 13∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 염기번호 269에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P18-4)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼272을 포함하는 16∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 염기번호 272에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P18-5)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼279을 포함하는 23∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 상동적인 염기가 티민 또는 구아닌이며, 염기번호 279에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

본 발명의 EGFR858용 프로브는, 예를 들면 프로브의 양단의 염기가 시토신이며, 상기 양 시토신이 형광 표지되어 있는 프로브여도 된다. 이러한 프로브는, 예를 들면 하기 P19의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

(P19)서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 257∼274을 포함하는 18∼50 염기 길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 261에 대응하는 염기가 아데닌 또는 시토신이고, 염기번호 257에 대응하는 염기 및 염기번호 274에 대응하는 염기가 시토신이며, 상기 양 시토신이 형광 표지로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

본 발명에 있어서, (P1), (P3), (P15), (P16), (P19)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 상기 각 올리고뉴클레오티드의 상보쇄와 엄격한 조건(stringent condition) 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드라도 된다. 상기 하이브리다이즈는, 예를 들면 각종 하이브리다이제이션 어세이(hibridization assay)에 의해 검출할 수 있다. 상기 하이브리다이제이션 어세이 및 엄격한 조건은, 예를 들면 샘브룩(Sambrook) 외 편저「몰레큘라 클로닝: 어 래버러토리 매뉴얼 제2판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.)」[(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 등에 기재되어 있는 방법 및 조건을 채용할 수 있다.

상기 P15∼P19의 올리고뉴클레오티드는, 특히 표시하지 않는 한, 예를 들면 상기 P1 및 P3의 각 올리고뉴클레오티드에 관한 설명 등을 원용할 수 있다. 예를 들면 각 올리고뉴클레오티드에 있어서의 표지화 부위는, 상술한 바와 같이 시토신 잔기가 바람직하고, 상기 P15, P16 및 P19는, 예를 들면 서열번호 1에 있어서의 구아닌에 대응하는 시토신 잔기가 바람직하며, 상기 P17 및 P18은, 예를 들면 서열번호 1에 있어서의 시토신 잔기가 바람직하다.

P15의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이의 하한은 6 염기 길이이며, 바람직하게는 16 염기 길이이다.

P16의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이의 하한은 5 염기 길이이며, 바람직하게는 6 염기 길이이며, 더 바람직하게는 18 염기 길이이다.

P17의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이의 하한은 16 염기 길이이며, 바람직하게는 20 염기 길이이다.

P18의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이의 하한은 8 염기 길이이며, 바람직하게는 20 염기 길이이다.

상기 P15∼P19의 각 올리고뉴클레오티드의 염기 길이의 상한은, 예를 들면 40 염기 길이이며, 바람직하게는 30 염기 길이이다.

상기 P15∼P19의 올리고뉴클레오티드에 대해서, 이하에, 각각의 서열의 구체예를 든다. 하기 서열에 있어서, 목적의 다형 부위에 대응하는 염기는, 예를 들면 야생형이어도 변이형이어도 된다. 구체적으로, 상기 P15, P16 및 P19는, 예를 들면 서열에 있어서, 상기 염기를 m(a 또는 c)으로 나타낼 수 있고, 상기 P17 및 P18은, 예를 들면 서열에 있어서, 상기 염기를 k(t 또는 g)로 나타낼 수 있다. 또, 본 발명은, 이들 서열에는 제한되지 않는다.

P15-1(서열번호72)

5'-gccCgcccaaaatctgtgatcttgacatgc-3'(3T-EGFR-858-R4)

P15-2(서열번호73)

5'-gccCgcccaaaatctgtgatcttgac-3'(3T-EGFR-858-R5)

P15-3(서열번호74)

5'-tggccCgcccaaaatctgtgatc-3'(3T-EGFR-858-R6)

P15-4(서열번호75)

5'-agcagtttggccCgcc-3'(3T-EGFR-858-R7)

P15-5(서열번호76)

5'-acccagcagtttggccCgc-3'(3T-EGFR-858-R8)

P16-1(서열번호77)

5'-ccCgcccaaaatctgtga-3'(3T-EGFR-858-R9)

P16-2(서열번호78)

5'-cCgcccaaaatctgtgat-3'(3T-EGFR-858-R10)

P16-3(서열번호79)

5'-cagtttggccCgcccaaaatct-3'(3T-EGFR-858-R11)

P16-4(서열번호80)

5'-cagcagtttggccCgcccaaaa-3'(3T-EGFR-858-R12)

P16-5(서열번호81)

5'-ccagcagtttggccCgcccaaaa-3'(3T-EGFR-858-R13)

P16-6(서열번호82)

5'-cccagcagtttggccCgcccaaaa-3'(3T-EGFR-858-R14)

P16-7(서열번호83)

5'-cacccagcagtttggccCgcccaa-3'(3T-EGFR-858-R15)

P16-8(서열번호84)

5'-cgcacccagcagtttggccCgccc-3'(3T-EGFR-858-R16)

P16-9(서열번호85)

5'-ccgcacccagcagtttggccCgcc-3'(3T-EGFR-858-R17)

P16-10(서열번호86)

5'-cttccgcacccagcagtttggccCgcc-3'(3T-EGFR-858-R18)

P17-1(서열번호89)

5'-catgtcaagatcacagattttgggcGggc-3'(5T-EGFR-858-F1)

P17-2(서열번호90)

5'-caagatcacagattttgggcGggc-3'(5T-EGFR-858-F2)

P17-3(서열번호91)

5'-cacagattttgggcGggccaaa-3'(5T-EGFR-858-F3)

P17-4(서열번호92)

5'-cagattttgggcGggccaaa-3'(5T-EGFR-858-F4)

P18-1(서열번호94)

5'-atcacagattttgggcGggc-3'(3T-EGFR-858-F6)

P18-2(서열번호95)

5'-atcacagattttgggcGggcc-3'(3T-EGFR-858-F7)

P18-3(서열번호96)

5'-attttgggcGggccaaac-3'(3T-EGFR-858-F8)

P18-4(서열번호97)

5'-attttgggcGggccaaacTgc-3'(3T-EGFR-858-F9)

P18-5(서열번호98)

5'-ggcGggccaaacTgctgggtgc-3'(3T-EGFR-858-F10)

P19-1(서열번호88)

5'-cagcagtttggccCgccc-3'(35T-EGFR-858-R21)

(2) 엑손 19용 프로브

본 발명의 엑손 19용 프로브는, 상술한 바와 같이, EGFR 엑손19 결실의 유전자 변이를 검출하는 것이 가능한 프로브로서, 하기 P5∼P7에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

(P5) 서열번호 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 104∼112를 포함하는 9∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 112에 상동적인 염기가 티민이고, 염기번호 104에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P6) 서열번호 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 104∼119를 포함하는 9∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 119의 염기가 G 이외의 염기로 치환되어 있고, 염기번호 104에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

(P7) 서열번호 3에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호 136∼145를 포함하는 10∼50 염기 길이의 염기서열에 상동성을 갖는 서열을 갖고, 염기번호 145에 상동적인 염기가 시토신이며, 상기 시토신이 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드

상기 P5∼P7의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 상기 엑손 19 다형을 검출하기 위한 프로브, 즉, 상기 엑손 19용 프로브이다.

상기 P5∼P7의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 EGFR 유전자의 안티 센스쇄와 상보적이며, 상기 안티 센스쇄와의 하이브리다이제이션에 의해, 상기 다형을 확인할 수 있다.

상기 P5의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 2의 104∼112번째의 염기가 야생형일 경우, 상기 염기가 결실 변이한 변이형인 경우보다도, 상기 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈한다. 따라서, 상기 P5의 올리고뉴클레오티드가, 상기 EGFR 유전자의 검출 서열 중, 상기 야생형 또는 변이형 중 어느 것에 대하여, 보다 강하게 하이브리다이즈하는지에 따라, EGFR 유전자의 엑손 19 다형, 즉, 엑손 19 야생형(상기 표 1의 다형 1)인지, 엑손 19 변이형(상기 표 1의 다형 2∼17)인지를 검출할 수 있다. 이하, 상기 P5의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브를, 엑손 19용 야생형 프로브라고 한다.

상기 P6의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 2의 104∼119번째의 염기가 야생형일 경우, 119번째의 염기를 제외하고 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈한다. 따라서, P6의 올리고뉴클레오티드가, 상기 EGFR 유전자의 검출 서열에 대해, 보다 강하게 하이브리다이즈하는지 여부에 따라, EGFR 유전자의 엑손 19 다형, 즉, 엑손 19 야생형(상기 표 1의 다형 1)인지, 엑손 19 변이형(상기 표 1의 다형 2∼15 및 17)인지를 검출할 수 있다. 이하, 상기 P6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브를, 엑손 19용 변이형(sub) 프로브라고 한다.

상기 P7의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 2의 137∼151번째의 염기가 결실 변이한 변이형일 경우, 상기 염기가 결실 변이하지 않은 야생형인 경우보다도, 상기 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈한다. 따라서, P7의 올리고뉴클레오티드가, 상기 EGFR 유전자의 검출 서열 중, 상기 야생형 또는 변이형 중 어느 것에 대하여, 보다 강하게 하이브리다이즈하는지 여부에 따라, EGFR 유전자의 엑손 19 다형, 즉, 엑손 19 야생형(상기 표 1의 다형 1)인지, 엑손 19 변이형(상기 표 1의 다형 18)인지를 검출할 수 있다. 이하, P7의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브를, 엑손 19용 변이형(del) 프로브라고 한다.

상기 P5의 올리고뉴클레오티드(5FL-EGFR-EX19-F2)는, 상술한 바와 같이 9∼50 염기 길이이고, 바람직하게는 20∼40 염기 길이이며, 보다 바람직하게는 25∼35 염기 길이이고, 더 바람직하게는 10∼30 염기 길이이다. 상기 P6의 올리고뉴클레오티드(5T-EGFR-EX19-No19-F2-3)는, 상술한 바와 같이 9∼50 염기 길이이고, 바람직하게는 20∼40 염기 길이이며, 보다 바람직하게는 25∼35 염기 길이이고, 더 바람직하게는 10∼30 염기 길이이다. 상기 P7의 올리고뉴클레오티드(3T-EGFR-EX19-No18-F1)는, 상술한 바와 같이 10∼50 염기 길이이고, 바람직하게는 10∼30 염기 길이이며, 보다 바람직하게는 12∼30 염기 길이이고, 더 바람직하게는 15∼20 염기 길이이다.

상기 각 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표지 물질로 표지화되는 부위는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 5’ 말단 영역 또는 3’ 말단 영역인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5’ 말단 또는 3’ 말단이다. 또한, 후술하는 바와 같이, 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 표지 물질로 표지화되는 염기는, 예를 들면 시토신(c) 또는 구아닌(g)인 것이 바람직하다. 상기 표지 물질은, 예를 들면 염기를 직접 표지화해도 되고, 상기 염기를 포함하는 뉴클레오티드 잔기의 어느 부위를 표지함으로써, 상기 염기를 간접적으로 표지화해도 된다.

상기 P5의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 104에 상동적인 염기를 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖는 것이 바람직하고, 상기 P6의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 104에 상동적인 염기를 5’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖는 것이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서의 「염기번호 104에 상동적인 염기」란, 서열번호 2의 염기서열에 있어서의 104번째의 염기(c)에 상동적인 염기(c)를 의미한다. 구체적으로, 염기번호 104에 상동적인 염기는, P5 및 P6의 올리고뉴클레오티드에 있어서 c로 나타난다. 상기 P7의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 145에 상동적인 염기를 3’ 말단으로부터 세어 1∼3번째의 위치에 갖는 것이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서의 「염기번호 145에 상동적인 염기」란, 서열번호 3의 염기서열에 있어서의 145번째의 염기(c)에 상동적인 염기(c)를 의미한다. 구체적으로, 염기번호 145에 상동적인 염기는, P7의 올리고뉴클레오티드에 있어서 c로 나타난다.

상기 P5의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 104에 상동적인 염기를 5’ 말단에 갖는 것이 바람직하고, 상기 P6의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 104에 상동적인 염기를 5’ 말단에 갖는 것이 바람직하며, 상기 P7의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호 145에 상동적인 염기를 3’ 말단에 갖는 것이 바람직하다.

상기 P5의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 5에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

5’-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3’(서열번호 5)(5FL-EGFR-EX19-F2)

상기 P6의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 4에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

5’-cccgtcgctatcaagtaattaagagaagcaaca-3’(서열번호 4)(5T-EGFR-EX19-No19-F2-3)

상기 P7의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 6에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

5’-agcaacaaaggaaatc-3’(서열번호 6)(3T-EGFR-EX19-No18-F1)

본 발명에 있어서, (P1), (P3), (P5)∼(P7) 및 (P15)∼(P19)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 상기 각 올리고뉴클레오티드의 상보쇄와 엄격한 조건(stringent condition) 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드라도 된다. 상기 하이브리다이즈는, 예를 들면 각종 하이브리다이제이션에 어세이에 의해 검출할 수 있다. 상기 하이브리다이제이션 어세이 및 엄격한 조건은, 예를 들면 샘브룩(Sambrook) 외 편저「몰레큘라 클로닝: 어 래버러토리 매뉴얼 제3판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed.)」[(Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)] 등에 기재되어 있는 방법 및 조건을 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 P1, P3, P5∼P7 및 P15∼P19의 올리고뉴클레오티드는, 상술한 바와 같이, 예시 열거한 상기 서열 중 어느 것에 상동성을 갖는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드여도 된다. 상기 상동성은, 예를 들면 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 100%이다. 본 발명의 프로브는, 예를 들면 상기 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브이어도 되고, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브이어도 된다.

상기 프로브는, 예를 들면 천연 염기로 구성되어도 되고, 비천연 핵산으로 구성되어도 된다. 상기 천연 핵산은, 예를 들면 DNA 또는 RNA를 들 수 있다. 상기 비천연 핵산은, 예를 들면 Bridged Nucleic Acid(BNA: LNA(Locked Nucleic Acid)라고도 한다) 등의 가교화 핵산, 또는 PNA(펩티드 핵산) 등을 들 수 있다. 상기 프로브는, 예를 들면 상기 비천연 핵산으로 구성됨으로써 검출 대상서열에 대하여 하이브리다이즈하는 능력을 향상할 수 있기 때문에, 예를 들면 프로브의 서열을 짧게 설계할 수 있다. 상기 LNA로 구성되는 프로브와 상기 검출 대상서열과의 Tm값의 예측은, 예를 들면 EXIQON사의 홈페이지(http://www.exiqon.com/oligo-tools) 등에서 계산할 수 있다.

상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 상기 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는 것을 들 수 있다. 또한, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 상기 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는 것을 들 수 있다.

상기 형광 색소는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 형광단 등의 형광 물질 등을 들 수 있다. 상기 형광 색소는, 예를 들면 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있고, 시판의 형광 색소는, 예를 들면 Pacific Blue(등록상표, 몰레큘라 프로브사제), BODIPY FL(등록상표, 몰레큘라 프로브사제), FluorePrime(상품명, 애머샴 파머시아사제), Fluoredite(상품명, 밀리포어사제), FAM(등록상표, ABI사제), Cy3 및 Cy5(상품명, 애머샴 파머시아사제), TAMRA(등록상표, 몰레큘라 프로브사제) 등을 들 수 있다. 상기 형광 색소의 검출 조건은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 사용하는 형광 색소의 종류에 의해 적절히 결정할 수 있지만, 예를 들면 Pacific Blue는, 검출 파장 450∼480㎚, TAMRA는 검출 파장 585∼700㎚, BODIPY FL은 검출 파장 515∼555㎚에서 검출할 수 있다. 이와 같은 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용하면, 예를 들면 시그널로서 형광을 검출하고, 시그널값으로서 형광 강도를 측정함으로써, 형광 강도의 변동으로부터, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.

다형 검출용 프로브에는, 표지가 달려 있는 표지화 프로브인 것이 검출의 효율성의 관점에서 바람직하다. 표지화 프로브에 있어서의 표지 물질의 구체예로서는, 예를 들면 형광 색소 및 형광단을 들 수 있다. 상기 표지화 프로브의 구체예로서는, 예를 들면 형광 색소로 표지되어, 단독으로 형광을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예를 들면 소광)하는 프로브가 바람직하다.

이와 같은 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로 형광 소광 프로브라고 불린다. 그 중에서도 상기 프로브는, 올리고뉴클레오티드의 3’ 영역(예를 들면 3’ 말단) 혹은 5’ 영역(예를 들면 5’ 말단)의 염기가 형광 색소로 표지화되어 있는 것이 바람직하고, 표지화되는 상기 염기는 시토신(C)인 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 표지화 프로브가 하이브리다이즈하는 검출 목적 서열에 있어서, 상기 표지화 프로브의 말단 염기 C와 쌍을 이루는 염기 혹은 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1∼3 염기 떨어진 염기가 구아닌(G)이 되도록, 상기 표지화 프로브의 염기서열을 설계하는 것이 바람직하다. 이와 같은 프로브는, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라고 불리며, 소위 QProbe(등록상표)로서 알려져 있다. 이와 같은 구아닌 소광 프로브가 검출 목적 서열에 하이브리다이즈하면, 형광 색소로 표지화된 말단의 C가, 상기 검출 목적 서열에 있어서의 G에 가까워짐으로써, 상기 형광 색소의 발광이 약해진다(형광 강도가 감소한다)는 현상을 나타낸다. 이와 같은 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 또한 상기 표지 물질은, 예를 들면 통상, 뉴클레오티드의 인산기에 결합할 수 있다.

본 발명의 프로브는, 예를 들면 3’ 말단에 인산기가 부가되어도 된다. 변이의 유무를 검출하는 DNA(표적 DNA)는, PCR 등의 유전자 증폭법에 의해 조제할 수 있고, 이때, 본 발명의 프로브를 유전자 증폭 반응의 반응액 중에 공존시킬 수 있다. 이와 같은 경우에, 프로브의 3’ 말단에 인산기를 부가시켜 두면, 프로브 자체가 유전자 증폭 반응에 의해 신장하는 것을 충분히 방지할 수 있다. 또한 3’ 말단에 상술한 바와 같은 표지 물질을 부가함으로써도, 같은 효과를 얻을 수 있다.

또한, QProbe를 사용한 검출 방법 이외에도, 공지의 검출 양식을 적용해도 된다. 이와 같은 검출 양식은, Taq-man Probe법 또는 RFLP법 등을 들 수 있다.

상기 형광 색소는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있고, 시판의 형광 색소는, 예를 들면 BODIPY FL(상표, 몰레큘라 프로브사제), FluorePrime(상품명, 애머샴 파머시아사제), Fluoredite(상품명, 밀리포어사제), FAM(ABI사제), Cy3 및 Cy5(애머샴 파머시아사제), TAMRA(몰레큘라 프로브사제) 등을 들 수 있다. 복수의 프로브에 사용하는 형광 색소의 조합은, 예를 들면 다른 조건으로 검출할 수 있으면 되며, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 Pacific Blue(검출 파장 450∼480㎚), TAMRA(검출 파장 585∼700㎚) 및 BODIPY FL(검출 파장 515∼555㎚)의 조합 등을 들 수 있다.

<다형 검출 방법>

본 발명의 다형 검출 방법은, EGFR 유전자의 다형을 검출하는 방법으로, 상기 검출 서열과 하이브리다이즈하는 프로브를 사용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다형 검출 방법은, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용하는 것이 특징으로, 그 밖의 구성이나 조건 등은, 이하의 기재에 제한되지 않는다. 본 발명은, 예를 들면 의료 분야의 외, 진단 및 치료 방법을 제외하는 분야에 있어서의 EGFR 유전자의 다형 검출에 적용할 수 있다.

본 발명의 다형 검출 방법은, 예를 들면 하기 (A)공정 및 (B)공정을 포함한다.

(A) 상기 다형을 검출하는 피검 핵산과 본 발명의 다형 검출용 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 변화시켜, 상기 피검 핵산과 상기 다형 검출용 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정

(B) 상기 온도 변화에 수반하는 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 피검 핵산에 있어서의 상기 다형을 결정하는 공정

상기 (A)공정에 있어서, 상기 본 발명의 다형 검출용 프로브는, 예를 들면 어느 1종류를 사용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다. 사용하는 상기 다형 검출용 프로브의 종류는, 예를 들면 검출 목적의 다형에 따라 적절히 결정할 수 있다.

상기 (A)공정에 있어서 사용하는 상기 다형 검출용 프로브는, 적어도 1종류가 본 발명의 다형 검출용 프로브이면 된다. 상기 프로브의 종류는, 예를 들면 EGFR 유전자에 있어서의 검출 목적의 다형에 따라, 적절히 결정할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 예를 들면 EGFR858 다형만을 검출해도 되고, 엑손 19 다형만을 검출해도 되며, 양쪽의 다형을 하나의 반응계로 검출할 수도 있다. 또한 상기 EGFR858 다형 및 엑손 19 다형 중 적어도 한쪽과, 그 밖의 다형을, 하나의 반응계로 검출하는 것도 가능하다. 상기 그 밖의 다형은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 EGFR 유전자의 EGFR790 다형 등을 들 수 있다.

상기 EGFR858 다형만을 검출할 경우, 상기 본 발명의 다형 검출용 프로브 중에서도, 상기 EGFR858용 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 EGFR858용 프로브는, 예를 들면 EGFR858용 야생형 프로브여도 되고, EGFR858용 변이형 프로브여도 되며, 양쪽을 병용해도 된다.

상기 엑손 19 다형만을 검출할 경우, 상기 본 발명의 다형 검출용 프로브 중에서도, 상기 엑손 19용 야생형 프로브, 상기 엑손 19용 변이형(sub) 프로브 및 상기 엑손 19용 변이형(del) 프로브 중 적어도 어느 1종류를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 엑손 19용 야생형 프로브를 사용함으로써, 예를 들면 엑손 19 다형이, 엑손 19 야생형(상기 다형 1)인지, 엑손 19 변이형(상기 다형 2∼다형 17)인지를 검출할 수 있고, 상기 엑손 19용 변이형(sub) 프로브를 사용함으로써, 예를 들면 엑손 19 야생형(상기 다형 1)인지, 엑손 19 변이형(상기 다형 2∼15, 17)인지를 검출할 수 있으며, 상기 엑손 19용 변이형(del) 프로브를 사용함으로써, 예를 들면 엑손 19 야생형(상기 다형 1)인지, 엑손 19 변이형(상기 다형 18)인지를 검출할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 엑손 19용 야생형 프로브, 상기 엑손 19용 변이형(sub) 프로브 및 상기 엑손 19용 변이형(del) 프로브 중 어느 것을 사용해도 되고, 상기 다형 1인지, 상기 다형 2∼18인지를 판단할 수 있으므로, 2종류 이상을 병용해도 된다. 프로브의 조합은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 P5와 P7의 조합이, 다형 1∼18의 18종류를 검출 가능하고, P6과 P7의 조합이, 다형 16을 제외하는 17종류를 검출 가능하며(P5는 자기(自己) 소광하지만, P6은 자기 소광하지 않음), P5 단독이 다형 18을 제외하는 17종류를 검출 가능하고, P6 단독이 다형 16, 18을 제외하는 16종류를 검출 가능하며(P5는 자기 소광하지만, P6은 자기 소광하지 않음), P7 단독이 다형 18만의 1종류를 검출 가능하며 바람직하다.

본 발명은 상기 EGFR858용 프로브와, 상기 엑손 19용 프로브를 병용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 프로브는, 상술한 바와 같이, 우수한 신뢰성으로 다형을 검출할 수 있기 때문에, 예를 들면 하나의 반응액에 있어서, 상기 EGFR858용 프로브와, 상기 엑손 19용 프로브를 사용해도, 상기 EGFR858 다형과, 엑손 19 다형을, 각각 특이적으로 검출 가능하다. 상기 엑손 19용 프로브는, 상술한 바와 같이, 상기 엑손 19용 야생형 프로브와, 상기 엑손 19용 변이형(sub) 프로브 및 상기 엑손 19용 변이형(del) 프로브를 병용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 예를 들면, 상기 EGFR790의 다형을 더 검출해도 되고, 상기 EGFR858의 다형 및／또는 엑손 19의 다형과 동시에 검출하는 것이 바람직하다. 「동시에 검출」이란, 예를 들면 동일한 하나의 반응계를 사용한 검출의 의미를 포함한다. 이 경우, 본 발명은 상기 양 프로브 이외에, 상기 EGFR790용 프로브를 더 병용해도 된다.

상기 EGFR790용 프로브는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 하기(P14)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브를 들 수 있다.

(P14) 염기 길이가 14∼50 염기 길이이며, 서열번호 21에 나타내는 염기서열에 있어서, 334번째의 염기(g)를 5’ 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열 또는 상기 상보적인 서열에 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지고, 347번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌 또는 아데닌이며, 334번째에 대응하는 염기가 시토신인 올리고뉴클레오티드

상기 (P14)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브는, 예를 들면 서열번호 21에 나타내는 염기서열에 있어서, 347번째의 염기의 치환 변이의 유무를 검출하기 위한 프로브이다. 상기(P14)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 EGFR 유전자의 센스쇄와 상보적이며, 상기 센스쇄와의 하이브리다이제이션에 의해, 상기 다형을 확인할 수 있다. 상기(P14)의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 서열번호 21의 347번째에 대응하는 상보적인 염기는 r로 나타나고, 상기 r은 구아닌(g) 및 아데닌(a)이다. r이 구아닌(g)인 상기 올리고뉴클레오티드는, EGFR790 변이형의 검출 서열보다, EGFR790 야생형의 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈하기 때문에, EGFR790용 야생형 프로브라고 할 수 있다. r이 아데닌(a)인 상기 올리고뉴클레오티드는, EGFR790 야생형의 검출 서열보다 EGFR790 변이형의 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈하기 때문에, EGFR790용 변이형 프로브라고 할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드가, 상기 EGFR 유전자의 검출 서열 중, EGFR790 야생형의 검출 서열 또는 EGFR790 변이형의 검출 서열 중 어느 것과 강하게 하이브리다이즈하는지에 따라, EGFR 유전자의 다형을 검출할 수 있다. 상기(P14)의 올리고뉴클레오티드는, 3’ 말단이 시토신이 된다.

상기(P14)의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 22에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있고, 이 염기서열에 있어서 r은, 상술한 바와 같다. 상기 올리고뉴클레오티드의 구체예로서는, 예를 들면 EGFR790용 변이형 프로브인, 서열번호 23에 나타내는 올리고뉴클레오티드, 및 EGFR790용 야생형 프로브인, 서열번호 24에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

5’-tgagctgcrtgatgaggtgcac-3’(서열번호 22)

5’-tgagctgcatgatgaggtgcac-3’(서열번호 23)(3T-EGFR-T790M-mt-R3)

5’-tgagctgcgtgatgaggtgcac-3’(서열번호 24)

본 발명에 있어서, 상기 P14의 올리고뉴클레오티드는, 상술한 바와 같이, 예시 열거한 상기 서열 중 어느 하나에 상동성을 갖는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드여도 된다. 상기 상동성은, 예를 들면 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 100%이다.

상기 (A)공정에 있어서, 상기 다형 검출용 프로브를 2종류 이상 병용할 경우, 예를 들면 각 프로브가 다른 표지 물질을 갖는 표지 프로브인 것이 바람직하다. 상기 다른 표지 물질은, 예를 들면 검출 조건이 다른 표지 물질을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 피검 핵산은, 1본쇄 핵산이어도 되고, 2본쇄 핵산이어도 된다. 상기 피검 핵산이 상기 2본쇄 핵산인 경우, 예를 들면 후술하는 바와 같이, 상기 (A)공정에 있어서, 상기 반응계를 가열하여, 2본쇄의 상기 피검 핵산을 해리시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 2본쇄 핵산을 1본쇄 핵산으로 해리함으로써, 예를 들면 본 발명의 다형 검출용 프로브와 상기 1본쇄 핵산이 하이브리다이즈하기 쉬워진다.

본 발명에 있어서 상기 피검 핵산은, 예를 들면 시료 중에 원래 함유되는 핵산이어도 되고, 검출 정밀도를 향상시킬 수 있으므로, 상기 핵산을 주형 핵산으로 하여, 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물이어도 된다. 상기 증폭 산물은, 예를 들면 상기 시료 중의 DNA를 주형으로 한 증폭 산물이어도 된다. 또한, 상기 피검 핵산은, 예를 들면 상기 시료 중의 토털 RNA, mRNA 등의 RNA로부터 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)에 의해 합성한 cDNA여도 되고, 상기 cDNA를 주형으로 한 증폭 산물이어도 된다. 상기 증폭 산물은, 예를 들면 상기 검출 서열을 포함하는 영역의 증폭 산물인 것이 바람직하다. 상기 검출 서열은, 상기 검출 부위로서, 예를 들면 상기 EGFR858 다형의 검출 부위만을 포함해도 되고, 상기 엑손 19 다형의 검출 부위만을 포함해도 된다. 또한, 상기 검출 부위로서, 상기 EGFR858 다형과 상기 엑손 19 다형을 포함해도 된다. 또한, 상기 검출 부위로서, 상술한 EGFR790 다형을 더 포함해도 된다.

본 발명의 다형 검출 방법은, 예를 들면 상기 피검 핵산이 상기 증폭 산물인 경우, 예를 들면, 상기 주형 핵산으로부터 상기 증폭 산물을 생성하는 공정을 더 포함해도 된다. 상기 증폭 산물의 생성 공정은, 예를 들면 상기 (A)공정에 앞서 행해도 되고, 상기 (A)공정에 있어서 행해도 된다.

상기 피검 핵산이 상기 증폭 산물인 경우, 상기 (A)공정에 있어서, 예를 들면 미리 조제한 증폭 산물을 사용하여, 본 발명의 다형 검출용 프로브와 상기 증폭 산물을 함유하는 반응계를 준비해도 되고, 본 발명의 다형 검출용 프로브의 존재 하에서, 상기 반응계에 있어서, 상기 주형 핵산으로부터 상기 증폭 산물을 생성하고, 상기 다형 검출용 프로브와 상기 증폭 산물을 함유하는 반응계를 준비해도 된다.

상기 핵산의 증폭법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)법, TMA(Transcription-Mediated Amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있고, 그 중에서도 PCR법이 바람직하다. 또한, 상기 증폭법의 조건은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

상기 주형 핵산으로부터의 상기 증폭 산물의 생성에는, 예를 들면 EGFR 유전자에 있어서의 검출 목적의 다형을 포함하는 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 프라이머에 의한 증폭 영역은 특별히 제한되지 않고, 검출 목적의 다형에 따라 적절히 설정할 수 있다. 즉, 검출 목적의 다형이 상기 EGFR858 다형인 경우, 상기 증폭 영역은, 예를 들면 상기 EGFR858 다형의 검출 부위를 포함하는 영역, 즉, 서열번호 1의 염기서열에 있어서 261번째의 염기를 포함하는 영역이 바람직하다. 구체적으로는, EGFR 유전자의 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 P1, P3 및 P15∼P19 중 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역이 바람직하다. 또한, 검출 목적의 다형이 상기 엑손 19 다형인 경우, 상기 증폭 영역은, 예를 들면 상기 엑손 19 다형의 검출 부위를 포함하는 영역, 즉, 서열번호 2의 염기서열에 있어서 112∼151번째의 염기를 포함하는 영역이 바람직하다. 구체적으로는, 서열번호 2에 나타내는 염기서열에 있어서의 P5∼P6의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3에 나타내는 염기서열에 있어서의 P7의 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가, 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역이 바람직하다. 또한, 검출 목적의 다형이 상기 EGFR858 다형 및 상기 엑손 19 다형일 경우, 상기 증폭 영역은, 예를 들면 상기 EGFR858 다형의 검출 부위를 포함하는 영역과 상기 엑손 19 다형의 검출 부위를 포함하는 영역의 2영역이어도 된다. 상기 증폭 영역은, 예를 들면 상기 EGFR790 다형의 검출 부위를 포함하는 영역을 더 포함해도 된다.

또한, 상기 프라이머의 서열은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 상기 검출 부위를 포함하는 검출 서열을 증폭할 수 있으면 되며, 상기 검출 서열 및 그 주변 서열 등에 따라, 종래 공지의 방법에 의해 적절히 설정할 수 있다. 상기 프라이머의 길이는 특별히 제한되지 않고, 일반적인 길이로 설정할 수 있으며, 예를 들면 10∼50 염기 길이를 들 수 있다.

상기 프라이머는, 예를 들면 센스쇄를 증폭하는 포워드 프라이머(이하, 「F프라이머」라고도 함) 및 안티 센스쇄를 증폭하는 리버스 프라이머(이하, 「R프라이머」라고도 함) 중 어느 한쪽을 사용할 수 있지만, 양자를 한 쌍으로 하는 프라이머 세트를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머의 일례로서, 이하에 본 발명의 프라이머를 설명한다.

EGFR 엑손21 L858R의 유전자 변이를 검출하기 위한 프라이머는, 예를 들면EGFR 유전자의 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 P1, P3 및 P15∼P19 중 적어도 1개의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 들 수 있고, 구체예로서, 하기 P8∼10에서 선택되는 다형 검출용 프라이머를 들 수 있다.

(P8) 233번째의 염기 C를 3’ 말단으로 하여 서열번호 1에 상동적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

(P9) 284번째의 염기 G에 상보적인 염기 C를 3’ 말단으로 하여 서열번호 1에 상보적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

(P10) 290번째의 염기 G에 상보적인 염기 C를 3’ 말단으로 하여 서열번호 1에 상보적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

상기 P8의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 15에 기재된 올리고뉴클레오티드를 들 수 있고, 상기 P9의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 17에 기재된 올리고뉴클레오티드를 들 수 있으며, 상기 P10의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 16에 기재된 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

5’-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3’(서열번호 15)(EGFR-L858R-F2)

5’-ttactttgcctccttctgcatggtattc-3’(서열번호 16)(EGFR-L858R-R2)

5’-gcctccttctgcatggtattctttctc-3’(서열번호 17)(EGFR-L858R-R1)

또한, EGFR 엑손19 결실의 유전자 변이를 검출하기 위한 프라이머는, 예를 들면 EGFR 유전자의 서열번호 2에 나타내는 염기서열에 있어서의 P5 및 P6 중 적어도 일방의 올리고뉴클레오티드가, 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역, 또는, 서열번호 3에 나타내는 염기서열에 있어서의 P7의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 들 수 있고, 구체예로서, 예를 들면 하기 P11∼13에서 선택되는 다형 검출용 프라이머를 들 수 있다.

(P11) 95번째의 염기 G를 3’ 말단으로 하여 서열번호 2에 상동적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

(P12) 73번째의 염기 C를 3’ 말단으로 하여 서열번호 2에 상동적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

(P13) 155번째의 염기 G에 상보적인 염기 C를 3’ 말단으로 하여 서열번호 2에 상보적인 10∼50 염기의 올리고뉴클레오티드

상기 P11의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 18에 기재된 올리고뉴클레오티드를 들 수 있고, 상기 P12의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 19에 기재된 올리고뉴클레오티드를 들 수 있으며, 상기 P13의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호 20에 기재된 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

5’-gatcccagaaggtgagaaag-3’(서열번호 18)(EGFR-EX19-F1)

5’-tctctctgtcatagggactc-3’(서열번호 19)(EGFR-EX19-F2)

5’-gaaactcacatcgaggatttc-3’(서열번호 20)(EGFR-EX19-R1)

상기 반응계에 있어서, 상기 프라이머의 첨가 농도는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 1종류의 프라이머에 대해서, 예를 들면 0.1∼4μ㏖／L이고, 바람직하게는 0.25∼1.5μ㏖／L이며, 특히 바람직하게는 0.5∼1μ㏖／L이다. 또한, F프라이머와 R프라이머를 사용할 경우, 상기 F프라이머(F)와 R프라이머(R)의 첨가 비율(몰비 F:R)은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 1:0.25∼1:4가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1:0.5∼1:2이다.

상기 (A)공정에 있어서, 상기 피검 핵산에 대한 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은 특별히 제한되지 않고, 검출 시그널을 충분히 확보할 수 있으므로 1배 이하가 바람직하다. 이때 상기 피검 핵산이란, 예를 들면 야생형 검출 서열을 포함하는 핵산과 변이형 검출 서열을 포함하는 핵산과의 합계여도 되고, 야생형 검출 서열을 포함하는 증폭산물과 변이형 검출 서열을 포함하는 증폭산물과의 합계여도 된다. 또한, 피검 핵산에 있어서, 상기 다형 검출용 프로브에 보다 강하게 하이브리다이즈하는 검출 서열을 포함하는 핵산의 비율은, 통상 불분명하지만, 결과적으로 상기 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 보다 강하게 하이브리다이즈하는 검출 서열을 포함하는 핵산(상기 검출 서열을 포함하는 증폭산물)에 대하여 20배 이하가 되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10배 이하, 더 바람직하게는 5배 이하이다. 또한, 그 하한은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 0.001배 이상이고, 바람직하게는 0.01배 이상이며, 보다 바람직하게는 0.1배 이상이다. 상기 피검 핵산에 대한 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면 2본쇄 핵산에 대한 몰비여도 되고, 1본쇄 핵산에 대한 몰비여도 된다.

상기 반응계에 있어서의 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 농도는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 1종류의 상기 다형 검출용 프로브당, 10∼1000㎚ol／L의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20∼500㎚ol／L이다.

본 발명의 다형 검출 방법을 적용하는 시료는 특별히 제한되지 않고, 생체 시료를 들 수 있다. 상기 생체 시료의 구체예는, 예를 들면 전혈, 백혈구 세포 등의 혈구, 골수, 구강 점막 등의 구강 내 세포, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 객담, 양수, 파라핀 포리 조직, 소변, 위액, 위 세정액 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 시료의 채취 방법, 상기 시료로부터의 피검 핵산의 조제 방법 등은 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다. 상기 생체 시료가 전혈인 경우, 상기 반응계에 있어서의 상기 전혈의 농도는, 예를 들면 0.01∼2체적％이고, 바람직하게는 0.05∼1.5체적％이며, 보다 바람직하게는 0.1∼1체적％이다. 또한, 상기 생체 시료가 혈청인 경우, 상기 반응계에 있어서의 상기 혈청의 농도는, 예를 들면 0.1∼20체적％이고, 바람직하게는 0.25∼15체적％이며, 보다 바람직하게는 0.5∼10체적％이다.

본 발명의 다형 검출 방법은, 상술한 바와 같은, 소위 Tm 해석(융해 곡선 해석이라고도 함)에 이용할 수 있다. 여기에서, Tm 해석에 있어서의 Tm값에 대해서 설명한다. 예를 들면 2본쇄 DNA를 함유하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이는, 2본쇄 DNA에 있어서의 양쇄간의 수소 결합이 가열에 의해 풀려, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 따라 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. 이 현상에 의거하여, 융해 온도(Tm)란, 일반적으로 흡광도가, 흡광도 전(全)상승분의 50％에 달했을 때의 온도로 정의된다.

상기 (A)공정에 있어서, 상기 피검 핵산과 상기 다형 검출용 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널의 측정은, 상술한 바와 같이, 상기 형광 색소의 시그널 측정을 행하는 것이 바람직하다. 상기 표지 프로브는, 예를 들면 단독으로 시그널을 나타내고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브, 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 상기 증폭 산물과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 상기 증폭 산물로부터 상기 프로브가 해리하면 시그널을 나타낸다. 또한, 후자의 프로브이면, 상기 증폭 산물과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 상기 증폭 산물로부터 상기 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 상기 형광 색소의 시그널을 검출함으로써, 상기 260㎚에 있어서의 흡광도 측정과 같이, 하이브리드 형성체의 융해의 진행 및 Tm값의 결정 등을 행할 수 있다. 상기 형광 색소의 시그널 검출은, 예를 들면 상기 형광 색소의 시그널에 특유의 조건으로 검출하면 되고, 상기 조건은, 예를 들면 여기 파장, 검출 파장 등을 들 수 있다. 또한, 상기 표지 프로브 그리고 상기 형광 색소에 대해서는 상술한 바와 같다.

다음으로, 본 발명의 다형 검출 방법에 대해서, 일례를 들어 설명한다. 본 예는, 본 발명의 다형 검출용 프로브로서, 형광 색소로 표지된 표지 프로브를 사용하고, 상기 다형 검출용 프로브의 존재 하에서, 주형 핵산으로부터의 증폭을 행하여, 얻어진 증폭 산물을 상기 피검 핵산으로 하는 예이다. 또한, 본 발명의 다형 검출 방법은, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용하는 것 자체가 특징으로, 그 밖의 공정이나 조건에 대해서는 하등 제한되지 않는다.

우선, 상기 생체 시료로부터 게놈 DNA를 단리한다. 상기 생체 시료로부터의 게놈 DNA의 단리는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 구체예로서는, 예를 들면 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE 헬스케어 바이오사이언스사제) 등을 사용할 수 있다.

다음으로, 단리한 게놈 DNA를 함유하는 시료에 표지 프로브를 첨가하여, 반응액을 조제한다. 상기 표지 프로브는, 예를 들면 상술한 바와 같이, QProbe(등록상표)가 바람직하다.

상기 표지 프로브는, 예를 들면 단리한 게놈 DNA를 함유하는 시료에 첨가해도 되고, 용매 중에서 게놈 DNA와 혼합해도 된다. 상기 용매는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 Tris-HCl 등의 완충액, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤을 함유하는 용매, PCR용의 반응액 등의 증폭용 반응액 등, 종래 공지의 것을 들 수 있다.

또한, 상기 표지 프로브의 첨가의 타이밍은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 증폭 반응 전, 도중 또는 후에 첨가할 수 있다. 그 중에서도, 예를 들면 첨가를 위해 상기 반응액을 외부 환경에 노출할 필요가 없고, 또한 상기 증폭 반응과 시그널값의 측정을 연속적으로 행하는 것이 가능하기 때문에, 상기 증폭 반응 전에 상기 반응액에 첨가하는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 표지 프로브는, 상술한 바와 같이, 그 3’ 말단이 표지 물질 또는 인산기로 수식되어 있는 것이 바람직하다.

계속해서, 단리한 게놈 DNA를 주형으로 하여, 상기 표지 프로브의 존재 하에서, PCR 등의 증폭법에 의해, 목적의 다형이 발생하는 검출 부위를 포함하는 서열을 증폭시킨다. 이하, 증폭법으로서 PCR을 예로 들어 본 발명을 설명하지만, 이에는 제한되지 않는다. 또한, PCR의 조건은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

구체적으로는, 상기 게놈 DNA, 상기 표지 프로브 및 상기 프라이머를 포함하는 상기 반응액을 사용하여 PCR을 행한다. 이 반응액의 조성은 특별히 제한되지 않고, 당업자라면 적절히 설정할 수 있지만, 예를 들면 상기 게놈 DNA, 상기 표지 프로브 및 상기 프라이머 외에, DNA 폴리머라제 등의 폴리머라제, 뉴클레오티드3인산, 완충액, 각종 촉매 등을 들 수 있다. 상기 반응액에 있어서의 상기 표지 프로브 및 상기 프라이머의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 각각 상술한 범위를 들 수 있다.

상기 DNA 폴리머라제는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 종래 공지의 내열성 세균 유래의 폴리머라제를 사용할 수 있다. 구체예로서는 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) 유래 DNA 폴리머라제(미국특허 제4,889,818호 및 동(同)제5,079,352호)(상품명 Taq 폴리머라제), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 91／09950)(rTth DNA polymerase), 피로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 92／9689)(Pfu DNA polymerase : Stratagenes사제), 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) 유래 폴리머라제(EP-A 455 430(상표 Vent) : New England Biolabs사제) 등이 상업적으로 입수 가능하며, 그 중에서도 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) 유래의 내열성 폴리머라제가 바람직하다.

상기 반응액에 있어서의 DNA 폴리머라제의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 1∼100U／mL이고, 바람직하게는 5∼50U／mL이며, 보다 바람직하게는 20∼40U／mL이다. 또한, DNA 폴리머라제의 활성 단위(U)는, 일반적으로 활성화 연어 정자 DNA를 주형 프라이머로 하여, 활성 측정용 반응액 중 74℃에서 30분간에 10n㏖의 전(全)뉴클레오티드를 산불용성 침전물에 도입하는 활성이 1U이다. 상기 활성 측정용 반응액의 조성은, 예를 들면 25m㏖／L TAPS buffer(pH 9.3, 25℃), 50m㏖／L KCl, 2m㏖／L MgCl₂, 1m㏖／L 머캅토에탄올, 200μ㏖／L dATP, 200μ㏖／L dGTP, 200μ㏖／L dTTP, 100μ㏖／L 「α-³²P」dCTP, 0.25mg／mL 활성화 연어 정자 DNA이다.

상기 뉴클레오티드 3인산은, 통상 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및, dTTP 또는 dUTP)를 들 수 있다. 상기 반응액 중의 dNTP의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 0.01∼1m㏖／L이고, 바람직하게는 0.05∼0.5m㏖／L이며, 보다 바람직하게는 0.1∼0.3m㏖／L이다.

상기 완충액은, 예를 들면 Tris-HCl, Tricine, MES, MOPS, HEPES, CAPS 등을 들 수 있고, 시판의 PCR용 완충액이나 시판의 PCR 키트의 완충액 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 반응액은, 헤파린, 베타인, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤 등을 더 함유해도 되고, 이들의 첨가 비율은, 예를 들면 PCR 반응을 저해하지 않는 범위에서 설정하면 된다.

상기 반응액의 전(全)체적은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 써멀 사이클러 등의 사용하는 기기 등에 따라 적절히 설정할 수 있지만, 통상 1∼500μL이고, 바람직하게는 10∼100μL이다.

다음으로 PCR을 행한다. 상기 PCR의 사이클 조건은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 (1) 피검 핵산인 2본쇄 DNA의 1본쇄 DNA로의 해리, (2) 상기 1본쇄 DNA로의 프라이머의 어닐링, (3) 폴리머라제 반응에 의한 상기 프라이머의 신장은, 각각 하기 표 2의 조건을 예시할 수 있다. 또한, 사이클수도 특별히 제한되지 않고, 하기 (1)∼(3)의 3 스텝을 1 사이클로 하여, 예를 들면 30 사이클 이상이 바람직하다. 상기 사이클수의 합계의 상한은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 100 사이클 이하, 바람직하게는 70 사이클 이하, 더 바람직하게는 50 사이클 이하이다. 각 스텝의 온도 변화는, 예를 들면 써멀 사이클러 등을 사용하여 자동적으로 제어하면 된다.

[표 2]

상기 반응액에 있어서의 표지 프로브의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 상기 표지 프로브를 10∼1000㎚ol／L의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20∼500㎚ol／L이다. 또한, 예를 들면 충분한 시그널값을 확보할 수 있으므로, 상기 반응액에 있어서, 상기 피검 핵산에 대한 상기 표지 프로브의 몰비는, 예를 들면 1배 이하가 바람직하다. 상기 피검 핵산에 대한 상기 표지 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면 2본쇄 핵산에 대한 몰비여도 되고, 1본쇄 핵산에 대한 몰비여도 된다.

다음으로, 얻어진 증폭 산물(2본쇄 DNA)의 해리, 및 해리에 의해 얻어진 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브와의 하이브리다이즈를 행한다. 이는, 예를 들면 상기 표지 프로브의 존재 하에서, 상기 반응액의 온도를 변화시킴으로써 행할 수 있다. 이 경우, 상술한 바와 같이, 미리 상기 표지 프로브를 첨가한 상기 반응액에 대해서 증폭 반응을 행한 후, 상기 반응액을 온도 변화시키는 것이 바람직하다.

상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도는, 2본쇄의 상기 증폭 산물을 1본쇄로 해리할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 85∼95℃이다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않고, 통상 1초∼10분이며, 바람직하게는 1초∼5분이다.

해리한 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브와의 하이브리다이즈는, 예를 들면 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시킴으로써 행할 수 있다. 온도 조건은 예를 들면 40∼50℃이다. 또한, 상기 온도에서의 처리 시간은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 1∼600초이다.

그리고, 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 산물과 상기 표지 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정한다. 구체적으로는, 예를 들면 상기 반응액(상기 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브와의 하이브리드 형성체)을 가열하고, 온도 상승에 수반하는 시그널값의 변동을 측정한다. 상술한 바와 같이, 구아닌 소광 프로브, 즉, 말단의 시토신(c)이 표지화된 프로브를 사용한 경우, 1본쇄 DNA와의 하이브리다이즈한 상태에서는, 형광이 감소(또는 소광)하고, 해리한 상태에서는 형광을 발한다. 따라서, 예를 들면 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드 형성체를 서서히 가열하여, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

상기 형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는 특별히 제한되지 않고, 개시 온도는, 예를 들면 실온∼85℃이고, 바람직하게는 25∼70℃이며, 종료 온도는 예를 들면 40∼105℃이다. 또한, 온도의 상승 속도는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 0.1∼20℃／초이고, 바람직하게는 0.3∼5℃／초이다.

다음으로 상기 시그널값의 변동을 해석하여 Tm값을 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터, 각 온도에 있어서의 단위 시간당 형광 강도 변화량(-d 형광 강도 증가량／dt)을 산출하여, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당 형광 강도 증가량(d 형광 강도 증가량／t)의 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 또한, 상기 표지 프로브로서, 형광 소광 프로브가 아니라, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 프로브를 사용한 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.

상기 Tm값은, 예를 들면 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http:／／www.meltcalc.com／) 등에 의해 산출할 수 있고, 또한 최근접염기대법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다.

그리고, 상기 Tm값으로부터, EGFR 유전자의 다형이, 상기 야생형인지, 상기 변이형인지를 결정한다. 상기 Tm 해석에 있어서, 야생형 프로브는, 상기 변이형 검출 서열보다 상기 야생형 검출 서열에 대하여, 강하게 하이브리다이즈한다. 이 때문에, 상기 야생형 프로브와 상기 야생형 검출 서열의 Tm값은, 상기 야생형 프로브와 상기 변이형 검출 서열의 Tm값보다 높은 값을 나타낸다. 한편, 변이형 프로브는, 상기 야생형 검출 서열보다 상기 변이형 검출 서열에 대하여 강하게 하이브리다이즈한다. 이 때문에, 상기 변이형 프로브와 상기 변이형 검출 서열의 Tm값은, 상기 변이형 프로브와 상기 야생형 검출 서열의 Tm값보다 높은 값을 나타낸다. 상기 프로브가 검출 서열에 대하여 강하게 하이브리다이즈하는 Tm값(Tm_H)과, 그 Tm값(Tm_H)보다 낮은 값에서 프로브가 검출 서열에 하이브리다이즈하는 Tm값(Tm_L)을 결정해 둠으로써, 상기 검출 서열이, 상기 야생형 다형과, 상기 변이형 다형 중 어느 것을 함유할지를 결정할 수 있다. 또한 상기 야생형 프로브가 상기 야생형 검출 서열에 대하여 강하게 하이브리다이즈하는 Tm값(Tm_H)을 결정해 둠으로써 상기 야생형 프로브를 사용하여 상기 Tm값(Tm_H)보다 낮은 Tm값(Tm_L)이 얻어진 경우에는, 상기 변이형 검출 서열인 것을 결정할 수 있다. 한편, 상기 변이형 프로브가 상기 변이형 검출 서열에 대하여 강하게 하이브리다이즈하는 Tm값(Tm_H)을 결정해 둠으로써 상기 변이형 프로브를 사용하여 상기 Tm값(Tm_H)보다 낮은 Tm값(Tm_L)이 얻어진 경우에는, 야생형 검출 서열인 것을 결정할 수 있다.

예를 들면 상기 프로브로서, 변이형 프로브를 사용한 경우, 기정(旣定)한 변이형 검출 서열과의 Tm값(Tm_H)을 나타내면, 다형은 변이형, 그 기정한 Tm값(Tm_H)보다 낮은 Tm값(Tm_L)을 나타내면, 다형은 야생형으로 판단할 수 있다. 한편, 예를 들면 상기 프로브로서, 야생형 프로브를 사용한 경우, 기정한 야생형 검출 서열과의 Tm값(Tm_H)을 나타내면, 다형은 아생형, 그 기정한 Tm값(Tm_H)보다 낮은 Tm값(Tm_L)을 나타내면, 다형은 변이형으로 판단할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서는, 상술한 바와 같이, 상기 다형 검출용 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 상승시켜(하이브리드 형성체를 가열하여), 온도 상승에 수반하는 시그널 변동을 측정하는 방법 대신에, 예를 들면 하이브리드 형성시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 다형 검출용 프로브를 포함하는 반응계의 온도를 강하시켜 하이브리드 형성체를 형성할 때에, 상기 온도 강하에 수반하는 시그널 변동을 측정해도 된다.

구체예로서, 단독으로 시그널을 나타내고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지 프로브(예를 들면 구아닌 소광 프로브)를 사용한 경우, 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브가 해리해 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면 상기 반응액의 온도를 서서히 강하시켜, 온도 하강에 수반하는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다. 다른 한편, 단독으로 시그널을 나타내지 않고, 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지 프로브를 사용한 경우, 상기 1본쇄 DNA와 상기 표지 프로브가 해리해 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지 않지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광을 발하게 된다. 따라서, 예를 들면 상기 반응액의 온도를 서서히 강하시켜, 온도 하강에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

본 발명은 상술한 바와 같이, 예를 들면 하나의 반응계에 있어서, 2종류 이상의 다형 검출용 프로브를 사용할 수 있다. 복수의 다형 검출용 프로브를 사용할 경우, 각 프로브의 첨가의 타이밍은, 예를 들면 상술과 같으며, 상기 (A)공정에 앞서, 동시에 첨가하는 것이 바람직하고, 증폭 반응을 행할 경우, 증폭 반응 전에 동시에 첨가하는 것이 바람직하다.

복수의 프로브는, 예를 들면 상기 EGFR858용 프로브와 상기 엑손 19용 프로브의 조합을 들 수 있고, 구체적으로는, 예를 들면 상기 EGFR858용 프로브와 상기 엑손 19용 야생형 프로브의 조합, 상기 EGFR858용 프로브와 상기 엑손 19용 변이형(del) 프로브의 조합, 상기 EGFR858용 프로브와 상기 엑손 19용 야생형 프로브와 상기 엑손 19용 변이형(del) 프로브의 조합을 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 예를 들면, 상기 EGFR790용 프로브를 더 조합해도 된다.

상기 EGFR858 다형 및 엑손 19 다형의 두 가지를 한 반응계로 검출할 때, 예를 들면 상기 EGFR858용 프로브와 상기 엑손 19용 프로브를 병용할 수 있다. 이때, 상기 EGFR858용 프로브와 상기 엑손 19용 프로브는, 상술한 바와 같이, 각각 다른 표지 물질을 갖는 것이 바람직하다. 그리고, 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 각 표지 물질의 측정 조건에 따라 시그널을 검출함으로써, 각각의 Tm값을 결정할 수 있다.

또한, 상기 EGFR858 다형 또는 상기 EGFR790 다형의 검출에는, 각각, 예를 들면 원하는 다형에 대해서, 상기 야생형 프로브 및 변이형 프로브를 병용할 수도 있다. 이 경우, 예를 들면 완전히 상보인 매치의 하이브리드의 Tm을 나타낸 것이, 어느 프로브인지에 의해, 상기 다형의 종류를 결정할 수도 있다. 예를 들면 다른 표지 물질을 갖는 변이형 프로브와 야생형 프로브를 사용한 경우, 변이형 프로브에 대해서, 완전히 상보인 매치 하이브리드의 Tm값을 나타내면, 다형은 변이형이라고 판단할 수 있고, 야생형 프로브에 대해서, 완전히 상보인 매치 하이브리드의 Tm값을 나타내면, 다형은 야생형이라고 판단할 수 있다.

또한, 본 발명의 다형 검출 방법은, 예를 들면 EGFR 유전자의 다형을 검출하기 위한 본 발명의 다형 검출용 프로브와, 그 밖의 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브를 병용할 수 있다. 본 발명의 다형 검출용 프로브와, 그 밖의 유전자를 검출하기 위한 프로브를 병용함으로써, 하나의 반응계에 있어서, EGFR 유전자를 포함하는 2종류 이상의 유전자의 다형을 검출할 수 있다. EGFR 유전자의 상기 그 밖의 다형은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 상술한 EGFR790 다형을 들 수 있다.

<판정 방법>

본 발명의 판정 방법은, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용한 다형 검출 방법을 행하는 것이 특징으로, 그 밖의 공정 및 조건은 하등 제한되지 않는다. 또한, 다형에 의한 EGFR-TKI에 대한 내성 또는 약효의 판정은, 예를 들면 공지의 기준에 의거하여 행할 수 있다.

<시약 키트>

본 발명의 시약 키트는, EGFR 유전자에 있어서의 다형을 검출하기 위한 시약 키트로서, 상기 본 발명의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 시약 키트는, 본 발명의 프로브를 포함하고 있으면 되고, 그 밖의 구성은 하등 제한되지 않는다. 본 발명의 시약 키트에 포함되는 본 발명의 프로브는, 1종류여도 되고 2종류 이상이어도 되며, 조합은, 예를 들면 상술한 바와 같다. 본 발명의 시약 키트는, 예를 들면, 상술한 본 발명의 프라이머를 더 포함하는 것이 바람직하고, 프라이머의 조합은 특별히 제한되지 않고, 상술한 바와 같다. 본 발명의 시약 키트는, 예를 들면, 핵산 증폭 반응에 필요한 성분, 사용 설명서 등을 더 포함해도 된다.

<프라이머 시약>

본 발명의 프라이머 시약에 있어서, 상기 본 발명의 프라이머는, 어느 1종류여도 되고, 2종류 이상을 포함해도 된다. 상기 프라이머의 종류는, 예를 들면 목적의 증폭 영역에 따라 적절히 결정할 수 있다. 상기 EGFR858 다형을 포함하는 검출 서열을 증폭할 경우에는, 상기 P8, P9 및 P10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 중 적어도 하나를 포함하는 것이 바람직하고, 특히, 상술한 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 엑손 19 다형을 포함하는 검출 서열을 증폭할 경우에는, 상기 P11, P12 및 P13의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 중 적어도 하나를 포함하는 것이 바람직하고, 특히, 상술한 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 프라이머 시약은, 예를 들면 상기 프라이머로서, 상기 P8의 올리고뉴클레오티드와, P9 또는 P10의 올리고뉴클레오티드와, P11 또는 P12의 올리고뉴클레오티드와, P13의 올리고뉴클레오티드를 포함함으로써, 상기 EGFR858 다형을 포함하는 검출 서열 및 상기 엑손 19 다형을 포함하는 검출 서열을 증폭할 수 있다. 또한, 상기 프라이머의 조합은, 상술한 바와 같이 예시할 수 있지만, 이에는 제한되지 않는다.

<다형 검출용 시약>

본 발명의 다형 검출용 시약은, EGFR 유전자의 다형을 검출하기 위한 시약으로, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서는, 상술한 본 발명의 다형 검출용 프로브를 포함하는 것이 특징으로, 그 밖의 구성이나 조건은 하등 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 다형 검출용 시약은, 예를 들면 EGFR 유전자의 다형의 검출에 사용하는 프로브 키트라고도 할 수 있다.

상기 다형 검출용 시약은, 예를 들면 상기 다형 검출용 프로브를 1종류 포함해도 되고, 2종류 이상 포함해도 되며, 검출 목적의 다형에 따라 적절히 결정할 수 있다. 상기 EGFR858 다형만을 검출할 경우에는, 예를 들면 상기 EGFR858용 프로브를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 EGFR858용 프로브는, 예를 들면 EGFR858용 야생형 프로브여도 되고, EGFR858용 변이형 프로브여도 되며, 양쪽을 포함해도 된다. 또한, 상기 엑손 19 다형만을 검출할 경우에는, 예를 들면 상기 엑손 19용 프로브를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 엑손 19용 프로브는, 예를 들면 엑손 19용 야생형 프로브, 엑손 19용 변이형(sub) 프로브, 엑손 19용 변이형(del) 프로브 중 어느 1종류여도 되고, 2종류여도 되며, 모두를 포함해도 된다. 상기 프로브의 조합은, 상술한 바와 같이 예시할 수 있지만, 이에는 제한되지 않는다.

<다형 검출용 시약 키트>

본 발명의 EGFR 유전자 다형 검출용 시약 키트는, EGFR 유전자의 다형의 검출에 사용하는 시약 키트로서, 본 발명의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 시약 키트에 있어서, 본 발명의 프로브는 1종류여도 되고 2종류 이상이어도 된다. 후자의 경우, 2종류 이상의 프로브는, 혼합된 상태로 포함되어도 되고, 별개의 시약으로서 포함되어 있어도 된다. 또한, 2종류 이상의 본 발명의 프로브가 혼합된 상태로 본 발명의 프로브 키트에 포함될 경우나, 별개의 시약으로서 포함되어 있지만, 예를 들면 사용시에 동일한 반응계로, 각 프로브와 각 검출 대상 서열의 Tm 분석을 행할 경우, 각 프로브는 별개의 형광 물질로 표지화되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같이 형광 물질의 종류를 바꿈으로써 같은 반응계여도, 각각의 프로브에 대한 검출이 가능해진다. 상기 형광 물질은, 예를 들면 검출 파장이 다른 물질인 것이 바람직하다.

또한, EGFR 유전자 다형 검출용 시약 키트는 상기 다형 부위를 포함하는 서열(프로브가 하이브리다이즈하는 영역)을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 포함하는 것이어도 된다.

[실시예]

본 발명의 실시예에 대해서 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.

[실시예 1]

야생형 플라스미드와, 변이형 플라스미드의 공존 하에서 Tm 해석을 행하여, EGFR 유전자의 EGFR858 다형을 검출했다.

상기 야생형 플라스미드 및 변이형 플라스미드로서, EGFR858 야생형 플라스미드(L858WT)와, EGFR858 변이형 플라스미드(L858R)를 준비했다. 상기 EGFR858 야생형 플라스미드(L858WT)는, EGFR 유전자의 부분 서열로서, 서열번호 1의 112번째 내지 411번째의 올리고뉴클레오티드가 삽입되어 있으며, 서열번호 1의 261번째의 염기(k)는 티민(t)이다. 상기 EGFR858 변이형 플라스미드(L858R)는, EGFR 유전자의 부분 서열로서, 서열번호 1의 112번째 내지 411번째의 올리고뉴클레오티드가 삽입되어 있으며, 서열번호 1의 261번째의 염기(k)는 구아닌(g)이다. 이들 플라스미드를, 이하에 나타내는 소정의 비율로 혼합하여, 3종류의 시료를 조제했다. 상기 시료는 1μL당, 플라스미드 250카피로 했다.

[표 3]

하기 표 4의 PCR 반응액 50μL에 대해서, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표) IS-5310, 아크레이사제)를 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 상기 PCR은 95℃에서 1분 처리한 후, 95℃ 1초 및 58℃ 15초를 1 사이클로 하여 50 사이클 반복, 또한, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리했다. 그리고, 계속하여 상기 반응액을, 온도의 상승 속도를 1℃／3초로 하여, 40℃에서 75℃로 가열해 가, 검출 파장 585∼700㎚에 있어서의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정하고, Tm 해석을 행했다.

[표 4]

상기 EGFR858용 프라이머의 서열을 이하에 나타낸다.

F프라이머(서열번호 15)(EGFR-L858R-F2)

5’-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3’

R프라이머(서열번호 16)(EGFR-L858R-R2)

5’-ttactttgcctccttctgcatggtattc-3’

상기 EGFR858용 프로브로서, 하기 서열의 EGFR858용 변이형 프로브를 사용했다. 하기 EGFR858용 변이형 프로브는, EGFR858 변이형의 EGFR 유전자의 센스쇄에 있어서의 변이형 프로브이며, 상기 서열에 있어서, 하선부의 염기가 EGFR858 변이형에 상보적인 염기이다. 상기 EGFR858용 변이형 프로브는 3’ 말단을, 형광 색소 TAMRA로 표지화했다.

EGFR용 변이형 프로브(서열번호 7)(3T-EGFR-858-R2)

5’-ttggcccgcccaaaatc-(TAMRA)-3’

이들 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1은 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 1에서 (A)는 L858WT 100％, (B)는 L858R 5％, (C)는 L858R 10％의 결과이다. 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다. 또한, L858WT와 EGFR858 변이형 프로브의 Tm값은 55℃ 부근, L858R과 EGFR858 변이형 프로브의 Tm값은 64℃ 부근이다.

도 1(A)에 나타내는 바와 같이 L858WT 100％는, L858WT의 Tm값에서만 피크가 확인되었다. 한편, 도 1(C)에 나타내는 바와 같이 10％의 변이형 플라스미드를 함유하는 L858R 10％는, L858WT의 Tm값 및 L858R의 Tm값의 양쪽에서 피크가 확인되었다. 또한 도 1(B)에 나타내는 바와 같이 변이형 플라스미드의 함유량을 5％로 저하시킨 L858R 5％에 대해서도, L858WT의 Tm값 및 L858R의 Tm값의 양쪽에서 피크가 확인되었다.

[실시예 2]

본 예에서는, 야생형 인공 핵산 및 변이형 인공 핵산의 각각에 대하여 Tm 해석을 행하여, EGFR 유전자의 EGFR858 다형을 검출했다.

하기 서열에 나타내는 서열번호 1에 있어서의 241번째∼290번째에 상동인 EGFR858 야생형 인공 핵산(EGFR-L858R(WT)-F) 및 EGFR858 변이형 인공 핵산(EGFR-L858R(MT)-F)을 조제했다. 이하의 2개의 서열에 있어서, 하선부가 서열번호 1에 있어서의 261번째의 염기에 해당한다. 각 인공 핵산을 5μ／L로 조정하여 시료로 했다.

EGFR-L858R(WT)-F(서열번호 32)

caagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaag

EGFR-L858R(MT)-F(서열번호 33)

caagatcacagattttgggcgggccaaactgctgggtgcggaagagaaag

하기 표 5의 반응액 25μL에 대해서, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표) IS-5310, 아크레이사제)를 이용하여 Tm 해석을 행했다. 상기 Tm 해석은 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리했다. 그리고, 계속하여 상기 반응액을, 온도의 상승 속도를 1℃／3초로 하여, 40℃에서 75℃로 가열해 가, 검출 파장 585∼700㎚에 있어서의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다.

[표 5]

하기 EGFR858용 변이형 프로브는, EGFR858 변이형의 EGFR 유전자의 센스쇄에 있어서의 변이형 프로브이며, 상기 서열에 있어서, 하선부의 염기가 EGFR858 변이형에 상보적인 염기이다. 상기 EGFR858용 변이형 프로브는, 3’ 말단을 형광 색소 TAMRA로 표지화했다.

EGFR858용 변이형 프로브(서열번호 9)(3T-EGFR-858-R1)

5’-cagtttggcccgccc-(TAMRA)-3’

이들 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2는 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 2에서 (A)는 EGFR-L858R(WT)-F, (B)는 EGFR-L858R(MT)-F의 결과이다. 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다. 또한, EGFR-L858R(WT)-F와 EGFR858 변이형 프로브의 Tm값은 54℃ 부근, EGFR-L858R(MT)-FL과 EGFR858 변이형 프로브의 Tm값은 66℃ 부근이다.

도 2(A)에 나타내는 바와 같이 EGFR-L858R(WT)-F는, EGFR-L858R(WT)-F의 Tm값에서만 피크가 확인되고, 도 2(B)에 나타내는 바와 같이 EGFR-L858R(MT)-F는, EGFR-L858R(MT)-F의 Tm값에서만 피크가 확인되었다.

[실시예 3]

본 예에서는, 야생형 올리고뉴클레오티드 및 변이형 올리고뉴클레오티드에 대해서 Tm 해석을 행하여, EGFR 유전자의 엑손19 다형을 검출했다. BODIPY FL의 검출 파장은 520-555㎚, TAMRA의 검출 파장은 585-700㎚로 했다.

(1) 올리고뉴클레오티드

상기 야생형 및 변이형 올리고뉴클레오티드로서, 하기 표 6에 나타내는 올리고뉴클레오티드 1∼18을 준비했다. 이들 올리고뉴클레오티드는, EGFR 유전자의 센스쇄에 상보적인 서열이다. 하기 올리고뉴클레오티드 1은 야생형 올리고뉴클레오티드로, 상기 엑손19의 다형 1을 포함하는 센스쇄의 부분 서열에 상보적이다. 하기 올리고뉴클레오티드 2∼18은 변이형 올리고뉴클레오티드로, 각각 상기 엑손19의 다형 2∼18을 포함하는 센스쇄의 부분 서열에 상보적이다. 하기 표 6에 각 올리고뉴클레오티드에 대해서, 서열번호 2의 염기서열에 있어서의 대응 영역을 나타낸다. 또한, △에 이어지는 염기서열의 범위는 결실 부위이다.

[표 6]

(2) Tm 해석

하기 표 7의 반응액 25μL에 대해서, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(등록상표) IS-5310, 아크레이사제)를 이용하여, Tm 해석을 행했다. 상기 Tm 해석은 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리했다. 그리고, 계속하여 상기 반응액을, 온도의 상승 속도를 1℃／3초로 하여, 40℃에서 75℃로 가열해 가, 각 형광 색소에 따른 검출 파장에 있어서의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 또한 네거티브 컨트롤로서, 시료 5μL 대신에, 증류수 5μL를 첨가한 반응액 25μL에 대해서, 마찬가지로 형광 강도의 변화를 측정했다.

[표 7]

(실시예 3-1)

상기 올리고뉴클레오티드 1∼18을 5μ㏖／L로 조정했다. 그리고, 상기 올리고뉴클레오티드 1이 단독인 시료 1s, 상기 올리고뉴클레오티드 1과 상기 올리고뉴클레오티드 2∼18을 체적비 1:4로 혼합한 시료 2m∼18m를 상기 반응액의 시료로서 사용했다.

상기 엑손19용 프로브로서, 하기 서열의 프로브를 사용했다. 상기 프로브는, 야생형 올리고뉴클레오티드 1과 완전하게 상보적인 서열로, 상기 프로브와 상기 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값은 74℃ 부근이다.

엑손19용 야생형 프로브(서열번호 5)(5FL-EGFR-EX19-F2)

5’-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3’

이들 결과를 도 9에 나타낸다. 도 9는 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 9에서 (A)∼(Q)는 순서대로 상기 시료 1s, 2m∼17m에 대해서 형광 색소를 검출한 결과이며, (R)은 네거티브 컨트롤의 결과이다. 각 그래프에 있어서 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다.

또한, Tm 해석의 결과로서 각 시료에 대해서 피크의 수, 각 피크의 Tm값 및 상기 각 피크의 Tm값과 상기 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값(74℃)과의 차(Δ℃)를 하기 표 8에 나타낸다. 하기 표 8 및 도 9에 나타내는 바와 같이, 야생형 올리고뉴클레오티드 1만을 함유하는 시료 1s는, 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값(74℃)에서만 피크가 확인되었다. 한편, 야생형 올리고뉴클레오티드 1 및 변이형 올리고뉴클레오티드 2∼17을 함유하는 시료 2m∼17m는, 각각 2개의 Tm값에서 피크가 확인되었다. 즉, 상기 시료 2m∼17m는 야생형 올리고뉴클레오티드 1과 엑손19용 야생형 프로브의 Tm값과, 그보다 낮은 온도의 양쪽에서 피크가 확인되었다. 또한, 변이형 올리고뉴클레오티드 18을 함유하는 시료 18에 대해서는, 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값(74℃)에서만 피크가 확인되고, 그 이외의 온도에서는 피크를 확인할 수 없었다.

[표 8]

(실시예 3-2)

상기 올리고뉴클레오티드 1∼18을 5μ㏖／L로 조정했다. 그리고, 상기 올리고뉴클레오티드 1이 단독인 시료 1s, 상기 올리고뉴클레오티드 1과 상기 올리고뉴클레오티드 2∼18을 체적비 1:4로 혼합한 시료 2m∼18m를 상기 반응액의 시료로서 사용했다.

상기 엑손19용 프로브로서, 하기 서열의 프로브를 사용했다. 상기 프로브는, 변이형 올리고뉴클레오티드 18과 완전하게 상보적인 서열로, 상기 프로브와 상기 변이형 올리고뉴클레오티드 18의 Tm값은 58℃ 부근이다.

엑손19용 변이형(del) 프로브(서열번호 6)(3T-EGFR-EX19-No18-F1)

5’-agcaacaaaggaaatc-(TAMRA)-3’

이들 결과를 도 10에 나타낸다. 도 10은 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 10에서 (A)∼(R)은, 순서대로 상기 시료 1s, 2m∼18m에 대해서 형광 색소를 검출한 결과이다. 각 그래프에 있어서, 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다.

또한, Tm 해석의 결과로서, 각 시료에 대해서 피크의 수, 각 피크의 Tm값 및 상기 각 피크의 Tm값과 상기 변이형 올리고뉴클레오티드 18의 Tm값(58℃)과의 차(Δ℃)를 하기 표 9에 나타낸다. 하기 표 9 및 도 10에 나타내는 바와 같이, 변이형 올리고뉴클레오티드 18을 함유하는 시료 18m는, 변이형 올리고뉴클레오티드 18의 Tm값(58℃)에서만 피크가 확인되었다. 한편, 야생형 올리고뉴클레오티드만을 함유하는 시료 1s는 피크가 검출되지 않았다. 또한, 변이형 올리고뉴클레오티드 18 이외의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 시료 2m∼17m는 각각 시료 18m보다 낮은 온도에서 피크가 확인되었다.

[표 9]

(실시예 3-3)

상기 올리고뉴클레오티드 1∼18을 5μ㏖／L로 조정하고, 각각을 단독으로, 상기 PCR 반응액의 시료(1s∼18s)로서 사용했다.

상기 엑손19용 프로브로서, 하기 서열의 프로브를 사용했다. 상기 프로브는, 서열번호 1에 있어서의 염기번호 119d의 염기가 t인 것을 제외하고, 야생형 올리고뉴클레오티드 1과 상보적인 서열로, 상기 프로브와 상기 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값은 67℃ 부근이다.

엑손19용 변이형(sub) 프로브(서열번호 4)(5FL-EGFR-EX19-No19-F2-3)

5’-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaagtaattaagagaagcaaca-3’

이들 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11은 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 11에서 (A)∼(Q)는 순서대로, 상기 시료 1s∼17s에 대해서 형광 색소를 검출한 결과이며, (R)은 네거티브 컨트롤의 결과이다. 각 그래프에 있어서, 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다.

Tm 해석의 결과로서, 각 시료에 대해서 피크의 수, 각 피크의 Tm값 및 상기 각 피크의 Tm값과 상기 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값(67℃)과의 차(Δ℃)를 하기 표 10에 나타낸다. 하기 표 10 및 도 11에 나타내는 바와 같이, 야생형 올리고뉴클레오티드 1만을 함유하는 시료 1s는, 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값(67℃)에서만 피크가 확인되었다. 한편, 변이형 올리고뉴클레오티드 2∼15 및 17만을 함유하는 시료 2s∼15s 및 17s는, 각각 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값보다 낮은 온도에서 피크가 확인되었다. 또한, 변이형 올리고뉴클레오티드 16 또는 18만을 함유하는 시료 16s 및 18s에 대해서는 피크를 확인할 수 없었다.

[표 10]

[비교예 3]

상기 올리고뉴클레오티드 1∼18을 5μ㏖／L로 조정하고, 각각을 단독으로, 상기 반응액의 시료 1s∼18s로서 사용했다.

상기 엑손19용 프로브로서, 하기 서열의 프로브를 사용했다. 상기 프로브는, 야생형 올리고뉴클레오티드 1과 강하게 하이브리다이즈하는 서열로, 상기 프로브와 상기 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값은 72℃ 부근이다.

엑손19용 야생형 프로브(서열번호 28)(5FL-EGFR-EX19-WT-F1)

5’-(BODIPY FL)-caaggaattaagagaagcaacatctccg-3’

이들 결과를 도 12에 나타낸다. 도 12는 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 12에서 (A)∼(R)은 순서대로, 상기 시료 1s∼18s에 대해서 형광 색소를 검출한 결과이다. 각 그래프에 있어서, 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다. 또한, Tm 해석의 결과로서, 각 시료에 대해서 가장 큰 피크의 Tm값 및 상기 피크의 Tm값과 상기 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값(72℃)과의 차(Δ℃)를 하기 표 11에 나타낸다.

도 12에 나타내는 바와 같이 시료 1s는, 야생형 올리고뉴클레오티드 1만을 함유함에도 불구하고, 피크에 숄더가 보여지기 때문에, 야생형 올리고뉴클레오티드인지 변이형 올리고뉴클레오티드인지를 판별할 수 없었다. 또한, 변이형 올리고뉴클레오티드 2∼18만을 함유하는 시료 2s∼18s에 대해서도 복수의 피크가 확인되었다. 또한, 시료 2s∼18s는 하기 표 11에 나타내는 바와 같이, 가장 큰 피크를 나타내는 Tm값이, 상기 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값과 거의 차이가 보이지 않았다.

[표 11]

[실시예 4]

본 예에서는, 야생형 플라스미드와 변이형 플라스미드의 공존 하에서, Tm 해석을 행하여, EGFR 유전자의 엑손19 다형을 검출했다.

EGFR 유전자의 부분 서열로서, 상기 표 6의 올리고뉴클레오티드가 삽입된 플라스미드를 준비했다. 구체적으로는, 상기 야생형 올리고뉴클레오티드 1이 삽입된 엑손19 야생형 플라스미드(ex19WT), 상기 변이형 올리고뉴클레오티드 2가 삽입된 엑손19 변이형 플라스미드 2(ex19mt2), 상기 변이형 올리고뉴클레오티드 4가 삽입된 엑손19 변이형 플라스미드 4(ex19mt4) 및 변이형 올리고뉴클레오티드 6이 삽입된 엑손19 변이형 플라스미드 6(ex19mt6)을 준비했다. 이들 플라스미드를, 하기 표 12에 나타내는 소정의 비율로 혼합하여, 4종류의 시료를 조제했다. 상기 시료는 1μL당, 플라스미드 250카피로 했다.

[표 12]

하기 표 13의 PCR 반응액 50μL에 대해서, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(등록상표) IS-5310, 아크레이사제)를 이용하여, 검출 파장을 520∼555㎚ 및 585∼700㎚로 한 것 이외는, 상기 실시예 1과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.

[표 13]

상기 엑손19용 프라이머의 서열을 이하에 나타낸다. 또한, 상기 엑손19용 프로브는, 상기 실시예 3의 엑손19용 야생형 프로브 및 엑손19용 변이형(del) 프로브를 사용했다.

F프라이머(서열번호 18)(EGFR-EX19-F1)

5’-gatcccagaaggtgagaaag-3’

R프라이머(서열번호 20)(EGFR-EX19-R1)

5’-gaaactcacatcgaggatttc-3’

엑손19용 야생형 프로브(서열번호 5)(5FL-EGFR-EX19-F2)

5’-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3’

엑손19용 변이형(del) 프로브(서열번호 6)(3T-EGFR-EX19-No18-F1)

5’-agcaacaaaggaaatc-(TAMRA)-3’

이들 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3은 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 3에서 (A)는 ex19WT 100％, (B)는 ex19mt2 5％, (C)는 ex19mt4 5％, (D)는 ex19mt6 5％의 결과이다. 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다. 또한, ex19WT와 엑손19용 야생형 프로브의 Tm값은 68℃ 부근이며, ex19mt2, ex19mt4 및 ex19mt6과 엑손19용 변이형(del) 프로브의 Tm값은 ex19WT와 엑손19용 변이형(del) 프로브의 Tm값보다도 낮은 온도로, 각각 51℃, 59℃, 60℃이다.

도 3(A)에 나타내는 바와 같이 ex19WT 100％는, ex19WT의 Tm값에서만 피크가 확인되었다. 한편, 도 3(B)∼(D)에 나타내는 바와 같이, 야생형 플라스미드 및 변이형 플라스미드를 함유하는 시료에서는, 2개의 Tm값에서 피크가 확인되었다. 즉, 도 3(B)∼(D)에 나타내는 바와 같이, 각각 야생형 ex19WT와 엑손19용 야생형 프로브의 Tm값과, 그보다도 낮은 온도의 양쪽에서 피크가 확인되었다. 이와 같이, 본 실시예의 F프라이머, R프라이머 및 엑손19용 프로브를 사용하면, 야생형과 변이형의 다형이 혼재할 경우에도, 야생형과 변이형을 구별하여, 엑손19 다형을 검출 가능함을 알 수 있었다.

[실시예 5]

본 예에서는, 야생형 플라스미드와 변이형 플라스미드의 공존 하에서 Tm 해석을 행하고, EGFR 유전자의 EGFR858 다형을 검출했다. Pacific Blue의 검출 파장은 445-480㎚, BODIPY FL의 검출 파장은 520-555㎚, TAMRA의 검출 파장은 585-700㎚로 했다.

(실시예 5-1)

상기 실시예 1의 3종류의 시료(L858WT 100％, L858R 5％ 및 L858R 10％)를 준비했다. 상기 시료는 1μL당, 플라스미드 250카피로 했다.

하기 표 14의 PCR 반응액 50μL에 대해서, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(등록상표) IS-5310, 아크레이사제)를 이용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 상기 PCR은 95℃에서 1분 처리한 후, 95℃ 1초 및 60℃ 30초를 1 사이클로 하여 50 사이클 반복하고, 또한, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리했다. 그리고, 계속하여 상기 반응액을, 온도의 상승 속도를 1℃／3초로 하여, 40℃에서 75℃로 가열해 가, 각 프로브의 형광 색소에 따른 검출 파장에 있어서의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정하고, Tm 해석을 행했다.

[표 14]

상기 각 F프라이머 및 R프라이머의 서열을 이하에 나타낸다.

(EGFR858용 프라이머)

F프라이머(서열번호 15)(EGFR-L858R-F2)

5’-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3’

R프라이머(서열번호 17)(EGFR-L858R-R1)

5’-gcctccttctgcatggtattctttctc-3’

(엑손19용 프라이머)

F프라이머(서열번호 19)(EGFR-EX19-F2)

5’-tctctctgtcatagggactc-3’

R프라이머(서열번호 20)(EGFR-EX19-R1)

5’-gaaactcacatcgaggatttc-3’

(EGFR790용 프라이머)

F프라이머(서열번호 25)(EGFR-T790M-F2)

5’-tccaggaagcctacgtgatggccag-3’

R프라이머(서열번호 26)(EGFR-T790M-R1)

5’-ccaatattgtctttgtgttcccggacatagtc-3’

상기 EGFR858용 프로브로서, TAMRA 대신에 Pacific Blue로 표지화한 상기 실시예 1과 같은 서열의 EGFR858용 변이형 프로브(서열번호 7)를 사용했다. 상기 엑손19용 프로브로서, 상기 실시예 3의 엑손19용 야생형 프로브(서열번호 5)를 사용했다. 또한, 상기 EGFR790용 프로브로서, 하기 서열의 프로브를 사용했다. 하기 EGFR790용 변이형 프로브는, EGFR790 변이형의 EGFR 유전자의 센스쇄에 있어서의 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈하는 프로브로, 상기 서열에 있어서 하선부의 염기가, EGFR790 변이형에 상보적인 염기이다. 상기 EGFR790용 변이형 프로브는, 3’ 말단을 형광 색소 TAMRA로 표지화했다.

EGFR858용 변이형 프로브(서열번호 7)(3PB-EGFR-858-R2)

5’-ttggcccgcccaaaatc-(Pacific Blue)-3’

엑손19용 야생형 프로브(서열번호 5)(5FL-EGFR-EX19-F2)

5’-(BODIPY FL)-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-3’

EGFR790용 변이형 프로브(서열번호 23)(3T-EGFR-790M-mt-R3)

5’-tgagctgcatgatgaggtgcac-(TAMRA)-3’

이들 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4는 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 4에서 (A)는 L858WT 100％, (B)는 L858R 5％, (C)는 L858R 10％의 결과이며, 각각 EGFR858용 변이형 프로브의 Pacific Blue를 검출한 결과이다. 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다. 또한, L858WT와 EGFR858 변이형 프로브의 Tm값은 51℃ 부근이며, L858R과 EGFR858 변이형 프로브의 Tm값은 61℃ 부근이다.

도 4(A)에 나타내는 바와 같이 L858WT 100％는, L858WT의 Tm값에서만 피크가 확인되었다. 한편, 도 4(C)에 나타내는 바와 같이 10％의 변이형 플라스미드를 함유하는 L858R 10％는, L858WT의 Tm값 및 L858R의 Tm값의 양쪽에서 피크가 확인되었다. 또한, 도 4(B)에 나타내는 바와 같이 변이형 플라스미드의 함유량을 5％로 저하시킨 L858R 5％에 대해서도, L858WT의 Tm값 및 L858R의 Tm값의 양쪽에서 피크가 확인되었다.

(실시예 5-2)

본 예에서는, 상기 시료로서 하기 3종류의 시료를 사용하여, 검출 파장을 525∼555㎚로 한 것 이외는, 상기 실시예 5-1과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행하고, EGFR 유전자의 엑손19 다형을 검출했다.

상기 시료는, 상기 실시예 4의 상기 엑손19 야생형 플라스미드(ex19WT) 및 엑손19 변이형 플라스미드 6(ex19mt6)을, 이하에 나타내는 소정의 비율로 혼합하여 조제했다. 상기 시료는 1μL당, 플라스미드 250카피로 했다.

[표 15]

이들 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5는 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 5에서 (A)는 ex19WT 100％, (B)는 ex19mt6 5％, (C)는 ex19mt6 10％의 결과이며, 각각 엑손19용 야생형 프로브의 BODIPY FL을 검출한 결과이다. 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다. 또한, ex19WT와 엑손19용 야생형 프로브의 Tm값은 68℃ 부근이며, ex19mt6과 엑손19용 야생형 프로브의 Tm값은 59℃ 부근이다.

도 5(A)에 나타내는 바와 같이 ex19WT 100％는 ex19WT의 Tm값에서만 피크가 확인되었다. 한편, 도 5(C)에 나타내는 바와 같이, 10％의 변이형 플라스미드를 함유하는 ex19mt6 10％는, ex19WT의 Tm값 및 ex19mt6의 Tm값의 양쪽에서 피크가 확인되었다. 또한, 도 5(B)에 나타내는 바와 같이, 변이형 플라스미드의 함유량을 5％로 저하시킨 ex19mt6 5％에 대해서도, ex19WT의 Tm값 및 ex19mt6의 Tm값의 양쪽에서 피크가 확인되었다.

(실시예 5-3)

본 예에서는, 상기 시료로서 하기 3종류의 시료를 사용하고, 검출 파장을 585-700㎚로 한 것 이외는, 상기 실시예 5-1과 같이 하여, PCR 및 Tm 해석을 행하고, EGFR 유전자의 EGFR790 다형을 검출했다.

상기 야생형 플라스미드 및 변이형 플라스미드로서, EGFR790 야생형 플라스미드(T790WT)와 EGFR790 변이형 플라스미드(T790M)를 준비했다. 상기 EGFR790 야생형 플라스미드(T790WT)는, EGFR 유전자의 부분 서열로서, 서열번호 21의 197번째 내지 496번째의 올리고뉴클레오티드가 삽입되어 있으며, 서열번호 21의 347번째의 염기(y)는 시토신(c)이다. 상기 EGFR790 변이형 플라스미드(T790M)는, EGFR 유전자의 부분 서열로서, 서열번호 21의 197번째 내지 496번째의 올리고뉴클레오티드가 삽입되어 있으며, 서열번호 21의 347번째의 염기(y)는 티민(t)이다. 이들 플라스미드를, 이하에 나타내는 소정의 비율로 혼합하여, 3종류의 시료를 조제했다. 상기 시료는 1μL당, 플라스미드 250카피로 했다.

[표 16]

이들 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6은 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 6에서 (A)는 T790WT 100％, (B)는 T790M 5％, (C)는 T790M 10％의 결과이며, 각각, EGFR790용 변이형 프로브의 TAMRA를 검출한 결과이다. 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다. 또한, T790WT와 EGFR790용 변이형 프로브의 Tm값은 60℃ 부근이며, T790M과 EGFR790용 변이형 프로브의 Tm값은 66℃ 부근이다.

도 6(A)에 나타내는 바와 같이 T790WT 100％는 T790WT의 Tm값에서만 피크가 확인되었다. 한편, 도 6(C)에 나타내는 바와 같이 10％의 변이형 플라스미드를 함유하는 T790M 10％는, T790WT의 Tm값 및 T790M의 Tm값의 양쪽에서 피크가 확인되었다. 또한, 도 6(B)에 나타내는 바와 같이, 변이형 플라스미드의 함유량을 5％로 저하시킨 T790M 5％에 대해서도, T790WT의 Tm값 및 T790M의 Tm값의 양쪽에서 피크가 확인되었다.

[비교예 1]

본 예에서는, 상기 EGFR858용 프로브로서, 하기 EGFR858용 야생형 프로브를 사용한 것 이외는, 상기 실시예 2와 같이 하여, EGFR 유전자의 EGFR858 다형을 검출했다.

하기 EGFR858 야생형 프로브는, EGFR858 야생형의 EGFR 유전자의 센스쇄에 있어서의 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈하는 프로브로, 상기 서열에 있어서, 하선부의 염기가 EGFR858 야생형에 상보적인 염기이다. 상기 EGFR858용 야생형 프로브는, 5’ 말단을 형광 색소 Pacific Blue로 표지화했다.

EGFR858용 야생형 프로브(서열번호 27)(5PB-EGFR858861WT-R1)

5’-(Pacific Blue)-ccagcagtttggccagc-3’

이들 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7은 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 7에서 (A)는 EGFR-L858R(WT)-F(서열번호 32), (B)는 EGFR-L858R(MT)-F(서열번호 33), (C)는 EGFR-L858R(WT)-F(서열번호 32)와 EGFR-L858R(MT)-F(서열번호 33)를 1:1의 비율로 혼합한 시료의 결과이다. 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다.

도 7(A)에 나타내는 바와 같이 L858WT 100％는, 68℃에서만 피크가 확인되고, 도 7(B)에 나타내는 바와 같이 L858R 100％는 71℃에서만 피크가 확인되었다. 그러나, 양 피크의 온도의 차는 3℃로, 그 차가 작았다. 또한, 도 7(C)에 나타내는 바와 같이 EGFR-L858R(WT)-F(서열번호 32)와 EGFR-L858R(MT)-F(서열번호 33)의 혼합 시료는 71℃이고, L858WT와 L858R의 피크가 겹쳐, 양자를 나누어 검출할 수 없었다. 이와 같이, EGFR858 야생형의 검출 피크와, EGFR858 변이형의 검출 피크가 접근하기 때문에, 예를 들면 야생형과 변이형이 혼재할 경우, 정확한 검출이 곤란하다.

[비교예 2]

본 예에서는 4종류의 시료를 사용하고, 상기 엑손19용 프로브로서, 하기 엑손19용 야생형 프로브를 사용하고, 검출 파장을 520∼555㎚로 한 것 이외는, 상기 실시예 3과 같이 하여, EGFR 유전자의 엑손19 다형을 검출했다. 또한, 상기 시료로서, 상기 실시예 3의 올리고뉴클레오티드 1, 2, 4 및 6을 5μ㏖／L로 조정하고, 상기 올리고뉴클레오티드 1 단독의 시료 1, 상기 올리고뉴클레오티드 1과 상기 올리고뉴클레오티드 2, 4 또는 6을 체적비 1:5로 혼합한, 시료 2, 시료 4 및 시료 6을 조제했다.

하기 엑손19용 야생형 프로브는, 엑손19 야생형의 EGFR 유전자의 안티 센스쇄에 있어서의 검출 서열에 강하게 하이브리다이즈하는 프로브로서, 상기 서열에 있어서, 하선부의 염기가 엑손19 야생형에 상보적인 염기이다. 상기 엑손19용 야생형 프로브는, 5’ 말단을 형광 색소 BODIPY FL로 표지화했다.

엑손19용 야생형 프로브(서열번호 28)(5FL-EGFR-EX19-WT-F1)

5’-(BODIPY FL)-caaggaattaagagaagcaacatctccg-3’

이들 결과를 도 8에 나타낸다. 도 8은 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이다. 도 8에서 상기 엑손19용 야생형 프로브를 사용한 결과이며, (A)는 시료 1, (B)는 시료 2, (C)는 시료 4, (D)는 시료 6의 검출 결과이다. 횡축은 측정시의 온도(℃)를 나타내고, 종축은 형광 강도의 변화(이하, 「형광 변화량」이라고도 함)를 나타내며, 단위는 「d 형광 강도 증가량／dt」(dF／dt)으로 했다. 또한, 올리고뉴클레오티드 1과 엑손19용 야생형 프로브의 Tm값은 71℃ 부근, 올리고뉴클레오티드 2와 엑손19용 야생형 프로브의 Tm값은 71℃ 부근, 올리고뉴클레오티드 4와 엑손19용 야생형 프로브의 Tm값은 49℃ 부근, 올리고뉴클레오티드 6과 엑손19용 야생형 프로브의 Tm값은 71℃ 부근이다.

도 8(A)에 나타내는 바와 같이, 야생형 올리고뉴클레오티드 1만을 함유하는 시료 1은, 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값에서만 피크가 확인되었다. 또한, 도 8(C)에 나타내는 바와 같이, 야생형 올리고뉴클레오티드 1 및 변이형 올리고뉴클레오티드 4를 함유하는 시료 4는, 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값과, 변이형 올리고뉴클레오티드 4의 Tm값의 양쪽에서 피크가 확인되었다. 그러나, 도 8(B) 및 (D)에 나타내는 바와 같이, 야생형 올리고뉴클레오티드 1과 변이형 올리고뉴클레오티드 2 또는 6을 함유하는 시료 2 및 6은, 야생형 올리고뉴클레오티드 1의 Tm값에서는 피크가 확인되었지만, 각 변이형 올리고뉴클레오티드의 Tm값에서는 피크가 확인되지 않았다.

[실시예6]

본 예에서는, 하기 표17에 나타내는 프로브를 사용하고, 하기 야생형 인공 핵산 및 변이형 인공 핵산의 각각에 대하여, Tm 해석을 행한 이외는, 실시예 2와 같은 방법으로, EGFR 유전자의 EGFR858 다형을 검출했다. 또, 하기 표17에 있어서, 서열번호 71 및 서열번호 87에 나타내는 프로브는, 본 발명의 프로브에는 해당하지 않는 프로브이다.

서열번호 1에 있어서의 217번째∼306번째와 상동인 EGFR858 야생형 인공 핵산(서열번호 67: EGFR-L858R (WT)-F90) 및 EGFR858 변이형 인공 핵산(서열번호 68: EGFR-L858R (MT)-F90)을 조제했다. 이하의 2개의 서열에 있어서, 하선부의 염기가 서열번호 1에 있어서의 261번째의 염기에 해당한다. 각 인공 핵산을 5μmol/L로 조제하여, 858 야생형 시료 및 858 변이형 시료로 했다.

EGFR-L858R (WT)-F90 (서열번호67)

actggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaagg

EGFR-L858R (MT)-F90 (서열번호68)

actggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggcgggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaagg

Tm 해석에 있어서, 각 프로브에 대해서, 상기 야생형 시료와의 Tm값 및 상기 변이형 시료의 Tm값을 측정하고, 그 차(ΔTm)를 산출했다. 그리고, 그 산출치로부터, 하기 평가 기준에 따라, 각 프로브가, EGFR858의 야생형 및 변이형을 판별할 수 있을지 여부를 평가했다. 이들 결과를, 하기 표17에 함께 나타낸다.

(평가 기준)

○: ΔTm이 3℃ 이상이며, 야생형과 변이형을 유효하게 판별 가능

×: ΔTm이 3℃ 미만이며, 야생형과 변이형을 유효하게 판별 불가

[표17]

상기 표17에 나타낸 바와 같이, 실시예의 각 프로브는, 야생형 시료 및 변이형 시료 중 어느 것에 대해서도, 1개의 피크가 확인되어, 상기 야생형 시료와의 Tm치보다도, 상기 변이형 시료와의 Tm치가, 3℃ 이상 높은 값을 나타냈다(ΔTm≥3℃). 한편, 비교예의 프로브는, 야생형 시료 및 변이형 시료 중 어느 것에 대해서도, 1개의 피크가 확인되었지만, ΔTm이 3℃ 미만이었다. 이로부터, 실시예의 프로브에 의하면, 예를 들면 야생형 검출 서열과 변이형 검출 서열이 공존할 때에, 양자를 유효하게 판별할 수 있음을 알았다.

[실시예7]

본 예에서는, 하기 표18에 나타내는 프로브를 사용하고, 하기 야생형 인공 핵산 및 변이형 인공 핵산의 각각에 대하여, Tm 해석을 행한 이외는, 실시예 2와 같은 방법으로, EGFR 유전자의 EGFR858 다형을 검출했다. 또, 하기 표18에 있어서, 서열번호 93에 나타내는 프로브는, 본 발명의 프로브에 해당하지 않는 프로브이다.

서열번호 1에 있어서의 217번째∼306번째에 상보적인 EGFR858 야생형 인공 핵산(서열번호 69: EGFR-L858R (WT)-R90) 및 EGFR858 변이형 인공 핵산(서열번호 70: EGFR-L858R (MT)-R90)을 조제했다. 이하의 2개의 서열에 있어서, 하선부의 염기가 서열번호 1에 있어서의 261번째의 염기에 해당한다. 각 인공 핵산을 5μmol/L로 조제하여, EGFR858 야생형 시료 및 858 변이형 시료로 했다.

EGFR-L858R (WT)-R90 (서열번호69)

ccttctgcatggtattctttctcttccgcacccagcagtttggccagcccaaaatctgtgatcttgacatgctgcggtgttttcaccagt

EGFR-L858R (MT)-R90 (서열번호70)

ccttctgcatggtattctttctcttccgcacccagcagtttggcccgcccaaaatctgtgatcttgacatgctgcggtgttttcaccagt

Tm 해석에 있어서, 각 프로브에 대해서, 상기 야생형 시료와의 Tm치 및 상기 변이형 시료와의 Tm치를 측정했다. 그리고, 상기 실시예 6과 같은 방법으로, 각 프로브를 평가했다. 이들 결과를, 하기 표18에 함께 나타낸다.

[표18]

상기 표18에 나타낸 바와 같이, 실시예의 각 프로브는, 야생형 시료 및 변이형 시료 중 어디에 대해서도, 1개의 피크가 확인되어, 상기 야생형 시료와의 Tm치보다도, 상기 변이형 시료와의 Tm치가, 3℃ 이상 높은 값을 나타냈다(ΔTm≥3℃). 한편, 비교예의 프로브는, 야생형 시료 및 변이형 시료 중 어느 것에 대해서도, 1개의 피크가 확인되었지만, ΔTm이 3℃ 미만이었다. 이로부터, 실시예의 프로브에 의하면, 예를 들면 야생형 검출 서열과 변이형 검출 서열이 공존할 때에, 양자를 유효하게 판별할 수 있음을 알았다.

이상의 실시예 1∼7 및 비교예 1∼3의 결과로부터, 이들 실시예에 있어서의 F프라이머, R프라이머 및 프로브를 사용하면, 예를 들면 야생형과 변이형의 다형이 혼재할 경우에도, 야생형과 변이형을 구별하여, EGFR 유전자의 EGFR858 다형, 엑손19 다형 및 EGFR790 다형을 검출 가능함을 알 수 있었다.

본 발명의 다형 검출 방법에 의하면, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용함으로써, 예를 들면 EGFR 유전자의 다형을, 간편하고 또한 우수한 신뢰성으로 판별할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 시료 중에, 원하는 다형이 야생형인 EGFR 유전자와 변이형인 EGFR 유전자가 공존해 있을 경우에도, 야생형과 변이형의 다형을, 간편하고 또한 우수한 신뢰성으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머에 의하면, 예를 들면 EGFR 유전자의 다형을 포함하는 영역을 특이적으로 증폭할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 의하면, EGFR 유전자의 다형을, 간편하고 또한 우수한 신뢰성으로 증폭 및 판별할 수 있으므로, 예를 들면 검출 결과를, 상술한 바와 같은 질환의 치료법의 선택 등에 반영할 수 있기 때문에, 본 발명은 의료 분야 등에 있어서 매우 유용하다고 할 수 있다. 또한, 본 발명은 예를 들면 의료 분야에 상관없이, 생화학 등의 넓은 분야에서의 EGFR 유전자의 다형 검출에 적용할 수 있다.

본 발명은 그 사상 또는 본질적 특성을 벗어나지 않고서 다른 형태로 구체화될 수 있다. 본 출원에 개시된 실시형태는 모든 점에서 제한이 아닌 기술로서 간주될 것이다. 본 발명의 범주는 상기 발명의 상세한 설명보다는 특허청구범위에 의해 정해지며, 청구항의 의미와 범위 내에서 모든 변형이 수용될 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Arkray, Inc. <120> PROBE FOR DETECTION OF POLYMORPHISM IN EGFR GENE, AMPLIFICATION PRIMER, AND USE THEREOF <130> TF11032KR <150> JP2010-244643 <151> 2010-10-29 <160> 98 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 410 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctttccattc tttggatcag tagtcactaa cgttcgccag ccataagtcc tcgacgtgga 60 gaggctcaga gcctggcatg aacatgaccc tgaattcgga tgcagagctt cttcccatga 120 tgatctgtcc ctcacagcag ggtcttctct gtttcagggc atgaactact tggaggaccg 180 tcgcttggtg caccgcgacc tggcagccag gaacgtactg gtgaaaacac cgcagcatgt 240 caagatcaca gattttgggc kggccaaacd gctgggtgcg gaagagaaag aataccatgc 300 agaaggaggc aaagtaagga ggtggcttta ggtcagccag cattttcctg acaccaggga 360 ccaggctgcc ttcccactag ctgtattgtt taacacatgc aggggaggat 410 <210> 2 <211> 287 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tcactgggca gcatgtggca ccatctcaca attgccagtt aacgtcttcc ttctctctct 60 gtcataggga ctctggatcc cagaaggtga gaaagttaaa attcccgtcg ctatcaagga 120 attaagagaa gcaacatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 180 tgctgtgtgg gggtccatgg ctctgaacct caggcccacc ttttctcatg tctggcagct 240 gctctgctct agaccctgct catctccaca tcctaaatgt tcacttt 287 <210> 3 <211> 272 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tcactgggca gcatgtggca ccatctcaca attgccagtt aacgtcttcc ttctctctct 60 gtcataggga ctctggatcc cagaaggtga gaaagttaaa attcccgtcg ctatcaagga 120 attaagagaa gcaacaaagg aaatcctcga tgtgagtttc tgctttgctg tgtgggggtc 180 catggctctg aacctcaggc ccaccttttc tcatgtctgg cagctgctct gctctagacc 240 ctgctcatct ccacatccta aatgttcact tt 272 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 4 cccgtcgcta tcaagtaatt aagagaagca aca 33 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 5 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagc 29 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 6 agcaacaaag gaaatc 16 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 7 ttggcccgcc caaaatc 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 8 ttggccagcc caaaatc 17 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 9 cagtttggcc cgccc 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 10 ctgtttggcc cgccc 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 11 ccgtttggcc cgccc 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 12 cagtttggcc agccc 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 13 ctgtttggcc agccc 15 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 14 ccgtttggcc agccc 15 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 15 aggaacgtac tggtgaaaac accgc 25 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 16 ttactttgcc tccttctgca tggtattc 28 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 gcctccttct gcatggtatt ctttctc 27 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 18 gatcccagaa ggtgagaaag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 19 tctctctgtc atagggactc 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 20 gaaactcaca tcgaggattt c 21 <210> 21 <211> 1020 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tggccactgt tgcctgggcc tctctgtcat ggggaatccc cagatgcacc caggaggggc 60 cctctcccac tgcatctgtc acttcacagc cctgcgtaaa cgtccctgtg ctaggtcttt 120 tgcaggcaca gcttttcctc catgagtacg tattttgaaa ctcaagatcg cattcatgcg 180 tcttcacctg gaaggggtcc atgtgcccct ccttctggcc accatgcgaa gccacactga 240 cgtgcctctc cctccctcca ggaagcctac gtgatggcca gcgtggacaa cccccacgtg 300 tgccgcctgc tgggcatctg cctcacctcc accgtgcagc tcatcaygca gctcatgccc 360 ttcggctgcc tcctggacta tgtccgggaa cacaaagaca atattggctc ccagtacctg 420 ctcaactggt gtgtgcagat cgcaaaggta atcagggaag ggagatacgg ggaggggaga 480 taaggagcca ggatcctcac atgcggtctg cgctcctggg atagcaagag tttgccatgg 540 ggatatgtgt gtgcgtgcat gcagcacaca cacattcctt tattttggat tcaatcaagt 600 tgatcttctt gtgcacaaat cagtgcctgt cccatctgca tgtggaaact ctcatcaatc 660 agctaccttt gaagaatttt ctctttattg agtgctcagt gtggtctgat gtctctgttc 720 ttatttctct ggaattcttt gtgaatactg tggtgatttg tagtggagaa ggaatattgc 780 ttcccccatt caggacttga taacaaggta agcaagccag gccaaggcca ggaggaccca 840 ggtgatagtg gtggagtgga gcaggtgcct tgcaggaggc ccagtgagga ggtgcaagga 900 gctgacagag ggcgcagctg ctgctgctat gtggctgggg ccttggctaa gtgtccccct 960 ttccacaggc tcgctccaga gccagggcgg ggctgagaga gcagagtggt caggtagccc 1020 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 22 tgagctgcrt gatgaggtgc ac 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 23 tgagctgcat gatgaggtgc ac 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 24 tgagctgcgt gatgaggtgc ac 22 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> foward primer <400> 25 tccaggaagc ctacgtgatg gccag 25 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <400> 26 ccaatattgt ctttgtgttc ccggacatag tc 32 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 27 ccagcagttt ggccagc 17 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 28 caaggaatta agagaagcaa catctccg 28 <210> 29 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc 60 g 61 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 cccgtcgcta tcaaaacatc tccgaaagcc aac 33 <210> 31 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 cccgtcgcta tcaagacatc tccgaaagcc aaaaggaaat cctcg 45 <210> 32 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 caagatcaca gattttgggc tggccaaact gctgggtgcg gaagagaaag 50 <210> 33 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 caagatcaca gattttgggc gggccaaact gctgggtgcg gaagagaaag 50 <210> 34 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 cccgtcgcta tcaaggaacc aacatctccg aaagccaaca aggaaatcct cg 52 <210> 35 <211> 46 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 cccgtcgcta tcaaggaatc tccgaaagcc aacaaggaaa tcctcg 46 <210> 36 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 cccgtcgcta tcaaggaatc gaaagccaac aaggaaatcc tcg 43 <210> 37 <211> 49 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 cccgtcgcta tcaaggaacc atctccgaaa gccaacaagg aaatcctcg 49 <210> 38 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 cccgtcgcta tcaaggaacc gaaagccaac aaggaaatcc tcg 43 <210> 39 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 cccgtcgcta tcaaggttcc gaaagccaac aaggaaatcc tcg 43 <210> 40 <211> 49 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 cccgtcgcta tcaaggaatc atctccgaaa gccaacaagg aaatcctcg 49 <210> 41 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 cccgtcgcta tcaaggaatc gaaagccaac aaggaaatcc tcg 43 <210> 42 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 cccgtcgcta tcaaggaaca gaaagccaac aaggaaatcc tcg 43 <210> 43 <211> 46 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 cccgtcgcta tcaaggtatc tccgaaagcc aacaaggaaa tcctcg 46 <210> 44 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 cccgtcgcta tcaaggttcc gaaagccaac aaggaaatcc tcg 43 <210> 45 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 cccgtcgcta tcaaaatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcg 44 <210> 46 <211> 46 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 cccgtcgcaa ttaagatatc tccgaaagcc aacaaggaaa tcctcg 46 <210> 47 <211> 46 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 cccgtcgcta tcaaggaaca accgaaagcc aacaaggaaa tcctcg 46 <210> 48 <211> 46 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acaaaggaaa tcctcg 46 <210> 49 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 ttccttgttg gctttcggag atgttgcttc tcttaattcc ttgatagcga cgggaatttt 60 <210> 50 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 tcgaggattt ccttgttggc tttcggagat gttttgatag cgacgggaat tttaactttc 60 <210> 51 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 tcgaggattt ccttgttggc tttcggagat gtcttgatag cgacgggaat tttaactttc 60 <210> 52 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 gatttccttg ttggctttcg gagatgttgg ttccttgata gcgacgggaa ttttaacttt 60 <210> 53 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 tcgaggattt ccttgttggc tttcggagat tccttgatag cgacgggaat tttaactttc 60 <210> 54 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 atcgaggatt tccttgttgg ctttcgattc cttgatagcg acgggaattt taactttctc 60 <210> 55 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 aggatttcct tgttggcttt cggagatggt tccttgatag cgacgggaat tttaactttc 60 <210> 56 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 catcgaggat ttccttgttg gctttcggtt ccttgatagc gacgggaatt ttaactttct 60 <210> 57 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 catcgaggat ttccttgttg gctttcggaa ccttgatagc gacgggaatt ttaactttct 60 <210> 58 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 ggatttcctt gttggctttc ggagatgatt ccttgatagc gacgggaatt ttaactttct 60 <210> 59 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 catcgaggat ttccttgttg gctttcgatt ccttgatagc gacgggaatt ttaactttct 60 <210> 60 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 catcgaggat ttccttgttg gctttctgtt ccttgatagc gacgggaatt ttaactttct 60 <210> 61 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 tcgaggattt ccttgttggc tttcggagat accttgatag cgacgggaat tttaactttc 60 <210> 62 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 acatcgagga tttccttgtt ggctttcgga accttgatag cgacgggaat tttaactttc 60 <210> 63 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 acatcgagga tttccttgtt ggctttcgga attttgatag cgacgggaat tttaactttc 60 <210> 64 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 tcgaggattt ccttgttggc tttcggagat atcttaattg cgacgggaat tttaactttc 60 <210> 65 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 tcgaggattt ccttgttggc tttcggttgt tccttgatag cgacgggaat tttaactttc 60 <210> 66 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 cgaggatttc ctttgttgct tctcttaatt ccttgatagc gacgggaatt ttaactttct 60 <210> 67 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 67 actggtgaaa acaccgcagc atgtcaagat cacagatttt gggctggcca aactgctggg 60 tgcggaagag aaagaatacc atgcagaagg 90 <210> 68 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 68 actggtgaaa acaccgcagc atgtcaagat cacagatttt gggcgggcca aactgctggg 60 tgcggaagag 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cagcagtttg gcccgcc 27 <210> 87 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 87 ctttctcttc cgcacccagc agtttggccc g 31 <210> 88 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 88 cagcagtttg gcccgccc 18 <210> 89 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 89 catgtcaaga tcacagattt tgggcgggc 29 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 90 caagatcaca gattttgggc gggc 24 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 91 cacagatttt gggcgggcca aa 22 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 92 cagattttgg gcgggccaaa 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 93 cgggccaaac tgctgggtgc 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 94 atcacagatt ttgggcgggc 20 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 95 atcacagatt ttgggcgggc c 21 <210> 96 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 96 attttgggcg ggccaaac 18 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 97 attttgggcg ggccaaactg c 21 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 98 ggcgggccaa actgctgggt gc 22

Claims (15)

1. EGFR의 유전자 변이를 검출하는 것이 가능한 프로브로서, 하기 P1, P3 및 P15 내지 P19에서 선택되는 1종 이상의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.
   (P1) 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
   (P3) 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
   (P15) 서열번호 72 내지 76으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
   (P16) 서열번호 77 내지 86으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
   (P17) 서열번호 89 내지 92로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
   (P18) 서열번호 94 내지 98로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
   (P19) 서열번호 88의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
2. 제1항에 있어서,
   상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 상기 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는, 프로브.
3. 제2항에 있어서,
   상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 상기 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는, 프로브.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 프로브가, 융해 곡선 분석용의 프로브인, 프로브.
5. EGFR 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 사용하여, EGFR 엑손 21 858 다형을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서,
   EGFR 엑손 19 다형을 검출하는 것을 더 포함하는, 방법.
7. 제6항에 있어서,
   하기 P5 내지 P7로부터 선택되는 1종 이상의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 다형 검출용 프로브를 사용하여, EGFR 엑손 19 다형을 검출하는, 방법.
   (P5) 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
   (P6) 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
   (P7) 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
8. 제5항에 있어서,
   EGFR 엑손 20 T790M의 다형을 검출하는 것을 더 포함하는, 방법.
9. 제5항에 기재된 방법에 의해 EGFR 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 공정, 및,
   다형의 유무에 기하여 EGFR-TKI에 대한 내성 또는 EGFR-TKI의 약효의 판정에 필요한 정보를 제공하는 공정을 포함하는,
   EGFR-TKI에 대한 내성 또는 EGFR-TKI의 약효의 판정에 필요한 정보를 제공하는 방법.
10. EGFR 유전자에 있어서의 다형을 검출하기 위한 시약 키트로서, EGFR 엑손 21 858 다형을 검출하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 포함하는 키트.
11. 제10항에 있어서,
    EGFR 엑손 19 다형을 검출하는 프로브를 더 포함하는, 키트.
12. 제11항에 있어서,
    상기 프로브가, 하기 P5 내지 P7로부터 선택되는 1종 이상의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 다형 검출용 프로브인, 키트.
    (P5) 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
    (P6) 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
    (P7) 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
13. 제10항에 있어서,
    EGFR 엑손 20 T790M의 다형을 검출하는 프로브를 더 포함하는, 키트.
14. 제10항에 있어서,
    EGFR 유전자의 서열번호 1에 나타내는 염기서열에 있어서의 상기 P1, P3 및 P15 내지 P19의 1종 이상의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하는, 키트.
15. 제14항에 있어서,
    상기 프라이머가, 서열번호 15 내지 20의 염기서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는, 키트.
    
    
    

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