CN111876412A - 一种荧光适配体探针及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种荧光适配体探针及其检测方法和应用，属于生物检测分析技术领域。本发明设计一种具有发夹结构开关的荧光适配体探针，使适配体的部分序列和发夹探针的粘性末端互补结合，在最大程度上固定了适配体和发夹探针的结构，还可以当靶标存在时便于适配体的解离。同时运用双荧光修饰的两种适配体探针对卡那霉素进行检测，在无需酶催化的繁琐步骤下即可实现信号放大，检测时间短，成本低，检测灵敏度高，因此具有良好的实际推广应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物检测分析技术领域，具体涉及一种荧光适配体探针及其检测方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
卡那霉素(Kana)是由卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)分离得到的氨基糖苷类抗生素。因见效快、易溶于水且抗菌性强，常用于治疗病菌引起的严重感染。Kana常用做兽药或饲料添加剂，若养殖人员在喂养动物过程中毫不节制的加入抗生素，会导致在动物体内残存，被人们食用后对身体产生强烈的副作用。随着人们意识的不断提高，不少国家和地区都对Kana的最大残留量做出限定。欧盟规定Kana在可食用组织和牛奶中的最大残留限量：肉 100μg/kg，肝600μg/kg，肾2500μg/kg，牛奶150μg/kg。我国也严格规定了乳制品中Kana的最大残留量为200ng/mL。
TTC法、ELISA、电化学等是检测Kana常用的传统方法，给检测体系注入活力的同时存在众多不足。因此，寻找一种简单、快速和选择性检测Kana非常有必要。适配体是一种短的单链DNA或RNA分子，从随机序列核酸组合文库中通过指数式富集配体系统进化技术筛选得到。适配体有许多优点如稳定性好、价格低、易修饰、序列设计灵活多变、并具有对高亲和力目标的特殊识别能力，因此已经成为一种非常具有吸引力的生物分子识别元件。此外，基于适配体与靶标结合时会产生构象变化的特点，适配体常用做探针在生物传感器中。在利用适配体进行探针构建时，由于适配体及其互补链均为寡核苷酸，具有内在的柔韧性，序列过长其自身弯曲折叠形成不稳定构象，不利于靶标的识别以及互补双链的形成。另外，荧光标记的信号放大无需酶催化等繁琐步骤，具有操作简单、反应时间短等优点。但对于常见的适配体荧光探针，一个目标通常只能触发一个信号，且易产生较高背景信号。发明人发现，这种方法存在背景信号高、灵敏度低等缺点。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供荧光适配体探针及其检测方法和应用。针对过长序列不利于靶标的识别以及互补双链的形成问题，本发明设计了一种结构固定的发夹探针，使适配体的部分序列和发夹探针的粘性末端互补结合，相较于常用的互补方式而言，更容易使其与适配体互补结合，降低了信号背景的干扰。同时，减少适配体与发夹探针的互补碱基对数，有助于适配体从互补序列解离与靶标的结合。另一方面，针对一个目标通常只能触发一个信号，本发明采用了双荧光修饰的方法，即在发夹序列和互补序列的两端同时修饰荧光基团和猝灭基团，相较于单荧光修饰，提高了检测的灵敏度。本发明设计一种具有发夹结构开关的荧光适配体探针，使适配体和发夹探针结合互补，在最大程度上固定了适配体和互补序列的结构，同时运用双荧光修饰的两种适配体探针对Kana进行检测，在无需酶催化的繁琐步骤下即可实现信号放大，检测时间短，成本低，检测灵敏度高。基于上述研究结果，从而完成本发明。
本发明的技术方案为：
本发明的第一方面，提供一种荧光适配体探针，所述荧光适配体探针至少包括荧光修饰发夹探针、适配体和发夹互补序列；
其中，所述荧光修饰发夹探针为双端修饰，且与适配体具有互补区域，二者可自组装形成发夹结构；
所述发夹互补序列修饰有猝灭基团，且能使得荧光修饰发夹探针打开并与其发生互补，从而产生荧光猝灭。
其中，所述适配体为待测物对应的适配体。
所述待测物可以为卡那霉素。
当所述待测物为卡那霉素时，
所述荧光修饰发夹探针核苷酸序列为5’-ACC AGC CGT TTT TTC GGC TGG TCCTCA ACC CCC A-3’(SEQ ID NO.1)；
所述适配体核苷酸序列为5’-TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3’(SEQ ID NO.2)；
所述发夹互补序列核苷酸序列为如下1)-3)中任意一种或多种：
1)5’-TGG GGG TTG AGG ACC AGC CGT TTT T-3’(SEQ ID NO.3)；
2)5’-TGG GGG TTG AGG ACC AGC CGT TTT TTT T-3’(SEQ ID NO.4)；
3)5’-TGG GGG TTG AGG ACC AGC CGA AAA AAC GGC TGG T-3’(SEQ ID NO.5)。
本发明的又一具体实施方式中，所述发夹互补序列核苷酸序列如 SEQ ID NO.5所示。当双猝灭基团修饰发夹互补序列的核苷酸序列为 SEQ ID NO.5时，能够与双荧光修饰发夹完全互补，此时荧光猝灭程度最大。
本发明的第二个方面，提供上述荧光适配体探针在检测卡那霉素中的应用。
本发明的第三个方面，提供一种检测待测样品中卡那霉素的方法，所述方法包括：
将双端荧光修饰发夹探针与适配体充分结合后加入待测样品进行孵育，然后加入发夹互补序列进行反应。
所述待测样品包括但不限于食品，如蔬菜、水果、肉制品和乳制品等。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
1)上述技术方案设计了一种结构固定发夹探针，使适配体的部分序列和发夹探针的粘性末端互补结合，在最大程度上固定了适配体和发夹探针的结构，不仅避免了序列过长时，由于自身的柔韧性以及盘曲折叠导致的与适配体结合不充分的问题，还可以当靶标存在时便于适配体的解离。
2)上述技术方案本实验采用了双荧光修饰的方法，即在发夹序列和发夹互补序列的两端同时修饰荧光基团和猝灭基团，相较于单荧光修饰，提高了检测的灵敏度。同时该方法设计简单加入Kana后可实现快速检测，因此具有良好的实际推广应用之价值。
说明书附图
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明基于荧光适配体探针快速检测Kana的原理图；
图2为本发明实施例中单荧光修饰的适配体探针在不同体系的荧光光谱图；
图3为本发明实施例中荧光修饰条件的优化；其中，A为荧光光谱图；B为柱状图；
图4为本发明实施例中序列R长度的优化图；
图5为本发明实施例中适配体与FAM-HP互补时间的优化图；
图6为本发明实施例中适配体与Kana孵育时间的优化图；
图7为本发明实施例中体系猝灭时间的优化图；
图8为本发明实施例中Mg离子浓度的优化图；
图9为本发明实施例中对双、单荧光适配体探针检测Kana的研究；其中，A为双荧光适配体探针的荧光光谱图；B为双荧光适配体探针标准曲线图；C为单荧光适配体探针的荧光光谱图；D为单荧光适配体探针的标准曲线图；
图10为本发明实施例中基于荧光适配体探针对抗生素的特异性评价。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个典型实施方式中，提供一种荧光适配体探针，所述荧光适配体探针至少包括荧光修饰发夹探针、适配体和发夹互补序列；
其中，所述荧光修饰发夹探针为双端修饰，且与适配体具有互补区域，二者可自组装形成发夹结构；
所述发夹互补序列修饰有猝灭基团，且能使得荧光修饰发夹探针打开并与其发生互补，从而产生荧光猝灭。
其中，所述适配体为待测物对应的适配体。
在本发明的又一具体实施方式中，所述双荧光修饰发夹探针(即在发夹探针核苷酸序列5’端和3’端均修饰有荧光基团)进行检测，并用单荧光修饰发夹探针做对比。双荧光修饰的适配体探针其信背比和灵敏度显著优于单荧光修饰的适配体探针，所述荧光修饰发夹探针为双荧光修饰发夹探针；本发明中，对荧光基团不做限制，在一个具体实施例中，所述荧光基团为FAM。
在本发明的又一具体实施方式中，所述发夹互补序列为双猝灭基团修饰发夹互补序列(即在发夹互补序列5’端和3’端均修饰有猝灭基团)进行检测，并用单猝灭基团修饰发夹做对比；所述发夹互补序列为双猝灭基团修饰发夹互补序列；本发明中，对猝灭基团不做限制，在一个具体实施例中，所述猝灭基团为BHQ2。
在本发明的又一个具体实施方式中，所述待测物为卡那霉素。
当所述待测物为卡那霉素时，
所述荧光修饰发夹探针核苷酸序列为5’-ACC AGC CGT TTT TTC GGC TGG TCCTCA ACC CCC A-3’(SEQ ID NO.1)；
所述适配体核苷酸序列为5’-TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3’(SEQ ID NO.2)；
所述发夹互补序列核苷酸序列为如下1)-3)中任意一种或多种：
1)5’-TGG GGG TTG AGG ACC AGC CGT TTT T-3’(SEQ ID NO.3)；
2)5’-TGG GGG TTG AGG ACC AGC CGT TTT TTT T-3’(SEQ ID NO.4)；
3)5’-TGG GGG TTG AGG ACC AGC CGA AAA AAC GGC TGG T-3’(SEQ ID NO.5)；
本发明的又一具体实施方式中，所述发夹互补序列核苷酸序列如 SEQ ID NO.5所示。当双猝灭基团修饰发夹互补序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.5时，能够与双荧光修饰发夹探针完全互补，此时荧光猝灭程度最大。
在本发明的又一具体实施方式中，提供上述荧光适配体探针在检测卡那霉素中的应用。
在本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测待测样品中卡那霉素的方法，所述方法包括：
将荧光修饰发夹探针与适配体充分结合后加入待测样品进行孵育，然后加入发夹互补序列进行反应。
其中，所述荧光修饰发夹探针与适配体充分结合具体条件为：在 15～25℃反应5～20min，优选为20℃反应10min；当反应10min后，荧光修饰发夹探针即与适配体基本达到充分结合，因此选择10min 作为荧光修饰发夹探针与适配体互补的最佳反应时间。
孵育具体时间控制为5～20min；当孵育至10min后，待测样品中的卡那霉素即和适配体基本结合完全，经试验验证，此后荧光比值趋于平缓，因此优选控制孵育时间为10min；
加入发夹互补序列进行反应具体时间控制为1～10min；当反应5 min后，荧光值即保持平稳，达到最大猝灭程度，因此优选为5min。
在所述检测方法中，反应体系优选在含有Mg2+的缓冲溶液中进行，所述Mg2+浓度为10～30mM，经试验验证，当Mg2+浓度为10mM 时，荧光差值明显最高，因此选择缓冲溶液中含有10mM的Mg2+作为反应体系的最佳缓冲溶液。
所述检测方法还包括将上述反应后的溶液进行荧光测定。
所述荧光测定具体方法包括：调节检测装置(如分光光度计)的激发波长及荧光范围分别为495nm、510～600nm进行荧光测定。
所述待测样品包括但不限于食品，如蔬菜、水果、肉制品和乳制品等。
本发明基于荧光适配体探针快速检测卡那霉素的原理如图1所示，首先，适配体与修饰有双荧光的序列FAM-HP自组装形成发夹结构，此时荧光值高。当卡那霉素加入后，适配体会与靶标特异性结合，发夹FAM-HP解离，修饰BHQ2的R-34序列引发发夹FAM-HP 打开并与之互补结合，基于FRET原理，使荧光猝灭。此方法降低体系中的背景信号，同时灵敏度较传统的单荧光修饰方法而言有所提高，实现了对卡那霉素的检测。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
1.试验材料与方法
1.1试剂
表1主要材料与试剂
表2核苷酸序列表
注：表中斜体部分为适配体与FAM-HP的互补区域。画横线部分为三种不同的发夹互补序列不同之处。实验所用的核苷酸序列均由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。
实验中所配置的溶液及浓度如下：
缓冲溶液：配制四种分别含有0、10、20、30mM的Mg2+缓冲溶液。分别称取0、0.0203、0.0406、0.0609g的六水合氯化镁固体粉末，以及0.1211g的Tris-Base固体粉末，调节pH值为7.8，定容至10mL。灭菌后4℃备用。
适配体、FAM-HP、R-34等所有序列：分别用超纯水稀释到100 μM，分装并标号、-20℃备用。待使用时分别将其用缓冲溶液稀释至 1μM，95℃热激5min。
Kana储备液(1mM)：准确称取0.0582g的Kana固体粉末，加入100mL超纯水溶解。
1.2仪器
表3主要仪器与设备
1.3荧光适配体探针的构建
荧光适配体探针是由适配体Kana-APT、双荧光发夹探针 FAM-HP以及发夹互补序列R-34构成。首先，适配体Kana-APT与双荧光发夹探针FAM-HP互补结合形成特定的发夹构象，相较于两条普通的互补序列而言，互补链的发夹结构更容易使适配体与其互补结合。Kana加入后与适配体Kana-APT结合，使发夹结构FAM-HP 解离，接着加入发夹互补序列R-34后与游离在溶液中的FAM-HP互补，基于FRET原理，产生荧光猝灭。
1.4荧光适配体探针检测卡那霉素
取10μL、1μM的FAM-HP于1.5mL避光EP管中，加入10μL、 1μM的Kana-APT和20μL的缓冲液，放入20℃的恒温水浴锅中反应10min，使二者充分结合；加入50μL不同浓度的Kana溶液(6、 18、58、583、2.92×103、5.83×103、1.16×104、2.92×104、4.64×104、 5.83×104μg/L)，孵育10min；最后加入10μL的R-34，待5min 后将反应液放入石英比色皿中。设定F-7000分光光度计的激发波长为495nm，发射范围为500～600nm，激发和发射狭缝宽度均设为5nm，进行荧光测定。最后以荧光差值F0-Fi为纵坐标绘制标准曲线，其中F0为无Kana加入的空白对照荧光值，Fi则是加入不同浓度Kana 后在521nm处的荧光值。
1.5荧光适配体探针的特异性验证
分别将50μL 5.83×102μg/L的Kana及50μL 5.83×103μg/L类似物：CAP、OTC、庆大霉素(Gentamicin，GEN)、链霉素(Streptomycin， SM)和四环素(Tetracycline，TET)加入到Kana-APT与FAM-HP 互补形成的发夹中振荡混匀，反应10min，接着加入R-34，恒温孵育后，使用F-7000荧光分光光度计测定。
1.6检测牛奶样品中的卡那霉素
将购买的纯牛奶取2mL用超纯水稀释至原体积的5倍，接着滴加10％的三氯乙酸调至pH值为4.6，使牛奶中的蛋白质变性产生沉淀。12000r/min离心25min后，用0.22μm滤膜过滤取上清液即为最终样品。在牛奶样品中加入不同浓度的Kana并按1.4步骤进行检测。
2.结果与讨论
2.1实验的可行性分析
为了验证该实验的可行性，单荧光修饰的发夹序列f-HP需要分别与适配体以及r-34形成特定结构，通过荧光分光光度计测定，如图 2所示，f-HP与适配体互补形成特定的发夹结构，此时的荧光强度高 (A曲线)；再加入Kana之后，Kana与适配体特异性结合，f-HP呈游离状态，荧光强度略微改变(B曲线)。当体系中再加入r-34时， f-HP与r-34互补结合，基于FRET原理，产生荧光猝灭(D曲线)；当Kana不存在时，加入r-34后，荧光强度有所下降，此时可能是小部分f-HP没有与适配体形成发夹构象，游离在溶液中，与后加入的 r-34互补产生荧光猝灭(C曲线)。而体系中仅存在f-HP与r-34时，二者互补结合产生荧光猝灭，此时荧光强度最低(E曲线)。因此，经上述实验的验证，表明该检测机理的正确性。
2.2实验条件的优化
为了获得荧光适配体探针检测Kana的最佳反应条件，对荧光修饰条件、序列R的碱基长度、Mg2+浓度、体系反应时间等条件进行了优化。
2.2.1荧光修饰条件的优化
利用单、双荧光适配体探针对Kana进行检测，其中双荧光较单荧光在3’端多修饰的一个相同的荧光基团。图3A所示，两种方法都是在加入Kana后荧光强度明显降低。同时，结合图3B，对比单、双荧光修饰的两种探针(I、II)在有无Kana时的荧光强度之差，明显发现双荧光修饰的适配体探针用于Kana检测时的荧光差值明显高于单荧光。F、F0分别为有无目标物加入时521nm处的荧光值，双荧光修饰的适配体探针用于检测时信背比(F0-F)/F高于单荧光适配体探针。因此，选用双荧光修饰的适配体探针进行后续的实验。
3.2.2猝灭序列R长度的优化
为了使FAM-HP与BHQ2修饰的猝灭序列R互补结合后的荧光差值达到最大对R序列的长度进行了优化。R-25和R-28为FAM-HP 的部分互补序列、R-34为FAM-HP的完全互补序列，这三种方式均能与FAM-HP产生荧光猝灭。其中R-28比R-25序列多三个T碱基，当与双荧光修饰的FAM-HP互补时，引发FAM-HP互补碱基对打开，从而R序列3’端多出来的多个T碱基与FAM-HP 5’端游离的发夹环部靠近，产生荧光猝灭。通过图4所示，对比不同的R序列(R-25、R-28、R-34)在有无Kana时候的荧光强度值显示，R-34的效果最佳，即在与FAM-HP完全互补时能很好地结合，此时荧光猝灭程度最大。因此，选择R-34作为FAM-HP的互补序列。
2.2.3适配体与发夹序列互补时间的优化
对BHQ2修饰的R互补序列进行优化后，紧接着又对适配体与发夹序列FAM-HP互补时间进行优化。将FAM-HP、Kana适配体和 Tris-HCl缓冲液置于1.5mL的EP管中，用漩涡混合器震荡均匀，分别孵育(0、5、10、15、20min)后，加入缓冲溶液和R-34。每组均做三次平行实验，通过测定孵育0min的荧光强度F0和其他孵育时间的荧光强度F，计算荧光强度F/F0。图5表明，荧光比值在0～10min 内随着时间增加而增大，在10min之后趋于平稳。这是由于在初始加入Kana适配体与FAM-HP时，形成的发夹结构较少，两者大多呈游离状态，R-34会与游离的FAM-HP结合产生荧光值的降低；随着时间的增加，Kana适配体与FAM-HP形成的发夹结构逐渐增多，游离的FAM-HP减少，因此在加入R-34后对荧光不会造成影响。所以孵育时间越长产生的发夹结构越多，荧光值也就越高。故选10min 为适配体与FAM-HP互补的最优时间。
2.2.4适配体与卡那霉素孵育时间的优化
Kana与适配体的结合是实验中重要的一部分。共设置五组对照实验，对适配体与Kana的孵育时间进行优化。向FAM-HP与Kana形成的发夹结构中，加入50μL的Kana，分别孵育0、5、10、15、20min 后，加入10μL、1μM的R-34，待孵育5min后测量荧光值，并绘制孵育时间与荧光比值F/F0的曲线图。结果如图6所示，随着时间的增加，荧光比值逐渐降低，这是由于起初加入Kana时，适配体与Kana 特异性结合形成的复合物较少，游离的FAM-HP也较低，因此R-34 的加入不会导致荧光的明显降低；随着时间的增加，越来越多的Kana 与适配体特异性结合，在加入R-34后，大量的游离FAM-HP与R-34 互补产生荧光猝灭。Kana与适配体反应10min以后，荧光比值趋于平缓。因此，适配体与Kana的最佳孵育时间为10min。
2.2.5猝灭时间的优化
此外，对FAM-HP与R-34互补产生的荧光猝灭时间进行优化。首先，向含有FAM-HP、Kana-APT及Kana的反应液中加入R-34，振荡混匀，反应时间分别为0、2、4、6、8、10min，记录下在不同猝灭时间时的荧光值。结果如图7所示，随着时间的增加，在0～5min 时荧光值呈现显著的下降，这是由于随着时间的增加，FAM-HP与 R-34产生的互补序列越多，基于FRET原理，互补序列产生荧光猝灭，荧光值就越低。5min后荧光值保持平稳，FAM-HP与R-34达到最大猝灭程度。因此FAM-HP与R-34猝灭的最佳时间是5min。
2.2.6 Mg2+浓度的优化
本实验优化了四种含有不同Mg2+浓度(0mM、10mM、20mM、 30mM)的1×缓冲液，具体见2.1。首先，用四种缓冲液分别稀释适配体、FAM-HP、R-34序列至1μM，同种缓冲液为一组。测定在四种不同的缓冲溶液下，有无Kana时的荧光值，每组进行三次重复实验后绘制折线图。图8显示四种不同的缓冲溶液加与不加Kana所对应的荧光强度。实验研究表明，加入合适浓度的Mg2+可以更好的实现序列之间的互补结合，进而产生荧光值的降低，最终Mg2+浓度为 10mM时，荧光差值明显最高，因此选择缓冲溶液中含有10mM的 Mg2+作为反应体系的最佳缓冲溶液。
2.3卡那霉素测定的线性范围
根据上述的优化结果，对荧光适配体探针检测Kana的灵敏度进行验证。为了更进一步研究双荧光修饰的适配体探针的放大效果，对这两种适配体探针同时进行测定。在最优条件下，加入配制好的不同浓度的Kana(6、18、58、583、2.92×103、5.83×103、1.16×104、2.92×104、 4.64×104、5.83×104μg/L)反应后进行线性范围的测定。如图9A、C所示，单、双荧光修饰的适配体探针都是随着加入Kana浓度的逐渐增高，荧光差值逐渐降低。运用双荧光修饰的适配体探针进行检测，图9B、D展示，双荧光适配体探针用于检测，当Kana浓度在5.83～5.83×103μg/L时，对数值与荧光差值呈线性关系为y＝13.296 lgx+44.022；单荧光适配体探针用于检测，当Kana浓度在 58～1.16×104μg/L时，Kana浓度与荧光差值呈线性关系为 y＝10.378x+1.454，通过信噪比来计算双、单荧光修饰的适配体探针检测Kana的最低检出限分别为3.49μg/L和21.57μg/L。最终实验得出，与传统的单荧光标记的荧光探针相比，双荧光标记的荧光适配体探针可以显著的提高检测的灵敏度。
2.4特异性评价
为了研究该荧光适配体探针检测Kana的特异性，分别选用CAP、 GEN、OTC、SM、TET五种类似物进行抗干扰实验，将上述类似物及Kana按2.5的步骤进行操作，并用荧光分光光度计测定其荧光值。结果如图9，横坐标为不同类似物，纵坐标为加入类似物后测得荧光强度，由图可知，当向体系中加入这五种抗生素类似物时，荧光差值明显低于加入Kana的荧光差值，且对比变化明显，这是因为只有Kana 才能与适配体特异性结合，使发夹结构解离，进而与R-34互补，产生荧光猝灭，使荧光有明显的降低。而其他抗生素不能与Kana适配体结合，所以荧光差值变化不明显。因此，本实验对Kana的测定具有良好的特异性。
2.5牛奶样品中的回收率
加入不同浓度的Kana(18、292、583μg/L)至处理后的牛奶样品中，根据2.6的操作进行样品处理，并运用荧光适配体传感器进行 Kana的测定。见表4，回收率在95.3％～105.1％之间，相对标准偏差为1.27％～3.02％，表明该方法进行Kana的检测具有良好的准确性和稳定性。
表4基于荧光适配体探针检测牛奶中Kana的加标回收率
为了对该检测方法进行客观的分析，选用了三种不同的Kana检测方法与本方法进行比较。见表5，通过对不同方法的线性范围、检测时间、检测限进行总结。这几种检测方法都低于国家规定的标准，荧光探针的灵敏度相较于电化学方法及比色法略微逊色，但在检测样品时时间短、成本低、简单方便且可提前配制好发夹结构，待加入 Kana后仅需15min便可准确测得。
表5本方法与其它方法的比较
本发明构建了一种用双FAM荧光修饰的荧光适配体探针，基于 FRET原理，实现对牛奶中Kana的快速检测。在实验中，首先对比了单、双荧光修饰的两种探针在有无Kana加入时的荧光差值，发现双荧光比单荧光修饰的适配体探针用于检测时灵敏度进明显提高，并进一步优化了R序列的长度、缓冲溶液中Mg2+浓度、双荧光修饰的发夹序列FAM-HP与Kana-APT孵育时间、Kana与适配体孵育时间、 FAM-HP与R-34猝灭时间等相关条件，提高了检测的灵敏度。运用双荧光适配体探针经过一系列优化实验得出，在5.83～5.83×103μg/L 时，Kana浓度与荧光差值呈线性关系，检测限为3.49μg/L。灵敏度相较于单荧光适配体探针的检测方法明显提高。用于实际牛奶样品中检测，回收率在95.3％～105.1％，具有良好的准确性和稳定性。由于无需使用大型仪器设备，该平台以低成本、高效率、简便等优点在农产品检测领域有巨大的潜力。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
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<400> 3
tgggggttga ggaccagccg ttttt 25
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tgggggttga ggaccagccg tttttttt 28
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tgggggttga ggaccagccg aaaaaacggc tggt 34
Claims (10)
1.一种荧光适配体探针，其特征在于，所述荧光适配体探针至少包括荧光修饰发夹探针、适配体和发夹互补序列；
所述荧光修饰发夹探针与适配体具有互补区域，二者自组装形成发夹结构；
所述发夹互补序列修饰有猝灭基团，且能使得荧光修饰发夹探针打开并与其发生互补，从而产生荧光猝灭；
所述适配体为待测物对应的适配体。
2.如权利要求1所述的荧光适配体探针，其特征在于，所述荧光修饰发夹探针为双荧光修饰发夹探针或单荧光修饰发夹探针。
3.如权利要求1所述的荧光适配体探针，其特征在于，所述发夹互补序列为双猝灭基团修饰发夹互补序列或单猝灭基团修饰发夹互补序列。
4.如权利要求1所述的荧光适配体探针，其特征在于，所述待测物为卡那霉素；优选的，
当所述待测物为卡那霉素时，
所述荧光修饰发夹探针核苷酸序列为5’-ACC AGC CGT TTT TTC GGC TGG TCC TCAACC CCC A-3’(SEQ ID NO.1)；
所述适配体核苷酸序列为5’-TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3’(SEQ ID NO.2)；
所述发夹互补序列核苷酸序列为如下1)-3)中任意一种或多种：
1)5’-TGG GGG TTG AGG ACC AGC CGT TTT T-3’(SEQ ID NO.3)；
2)5’-TGG GGG TTG AGG ACC AGC CGT TTT TTT T-3’(SEQ ID NO.4)；
3)5’-TGG GGG TTG AGG ACC AGC CGA AAA AAC GGC TGG T-3’(SEQ ID NO.5)。
5.权利要求1-4任一项所述荧光适配体探针在检测卡那霉素中的应用。
6.一种基于权利要求1-4任一项所述荧光适配体探针检测待测样品中卡那霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：
将荧光修饰发夹探针与适配体充分结合后加入待测样品进行孵育，然后加入发夹互补序列进行反应。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光修饰发夹探针与适配体充分结合具体条件为：在15～25℃反应5-20min，优选为20℃反应10min；或，
孵育具体时间控制为5～20min；优选控制孵育时间为10min；或，
加入发夹互补序列进行反应具体时间控制为1～10min；优选为5min。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，反应体系在含有Mg2+的缓冲溶液中进行；优选的，所述Mg2+浓度为10～30mM；进一步优选的，Mg2+浓度为10mM。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测方法还包括将反应后的溶液进行荧光测定；
优选的，所述荧光测定具体方法包括：调节检测装置的激发波长及荧光范围分别为495nm、510～600nm进行荧光测定。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括食品，所述食品包括蔬菜、水果、肉制品和乳制品。
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