CN107543810A - 一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，属于食品安全检测领域。本发明包括：卡那霉素适配体包被PCR管，双链DNA结构的形成，卡那霉素的检测以及荧光信号的测定。本发明借助于卡那霉素适配体与卡那霉素特异性的识别与结合，从而使得与适配体部分互补的DNA序列解离下来，以未解离的互补DNA分子为模板进行不对称PCR扩增，扩增出银纳米簇模板DNA序列，从而形成大量的能够发射荧光的银纳米簇。根据卡那霉素浓度与荧光信号强度之间的对应关系，从而实现对卡那霉素的检测。本发明方法灵敏度高、检测限低、操作方便、检测成本低廉，是一种理想的卡那霉素检测方法。
Description
技术领域
一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，属于食品安全检测领域。
背景技术
抗生素在治疗感染性疾病方面发挥着重要的作用，但由于抗生素的滥用，已经广泛应用到动物的疾病治疗，导致动物性食品抗生素残留问题凸显。人食用了抗生素残留的动物食品，残留的抗生素会在人体内积累，致使人体内产生耐药菌株或大量蓄积引起毒害作用。卡那霉素是一种由卡那链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素，被广泛用于治疗家畜等由金黄色葡萄球菌好额结核杆菌所致的各种疾病，卡那霉素的积累会引起脑神经、听觉以及肾脏的损害，因此，针对该类药物在食品中的残留，许多国家和机构都规定了明确的最大残留限量（MRL s）。欧盟药品评价局（EMEA）规定肉中最大残留限量为100μg/kg，牛奶中为150μg/kg，牛奶中卡那霉素的过量残留，已经成为国内外普遍关注的食品安全问题之一。
目前检测卡那霉素的多种多样，常用的检测方法包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）等仪器检测方法，仪器方法准确可靠，但样品前处理繁琐，仪器价格昂贵；基于抗原抗体的免疫学检测方法操作简单方便，但抗体制备周期长，制备过程复杂，因此新的生物识别分子和新的检测方法的开发成为亟待解决的问题。核酸适配体（aptamer）是近年来发展起来的一类单链寡核苷酸，能够与生物分子进行高亲和性高特异性的结合，并且具有稳定性好、易于体外合成、重复使用、易于修饰等优点，不需要动物免疫，在生物检测领域发挥着越来越重要的作用。
纳米技术是20世纪80年代后兴起的一个高新技术，主要是针对尺寸为1-100nm之间的分子世界的一门技术，基于此尺寸的系统有着独特的化学性质和物理性质，如表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应。将纳米技术引入生物传感器，促进了新型生物传感器的开发。近年来，以DNA为模板合成的银纳米簇引起了广泛的关注，这种银纳米簇呈现出较强的荧光信号，因此在生物传感领域发挥着重要的作用，与荧光染料和量子点相比，这种银纳米簇更易于合成，具有更好的光学物理特性和小尺寸效应。
本发明借助于卡那霉素适配体与卡那霉素特异性的识别与结合，从而使得与适配体部分互补的DNA序列解离下来，以未解离的互补DNA分子为模板进行不对称PCR扩增，其中含量较多的一条引物的末端连接有一段与银纳米簇模板互补的DNA序列，从而使得扩增后的单链DNA分子包含银纳米簇模板DNA序列，银纳米簇模板DNA序列为：5’-CCCACCCACCCTCCCA-3’。因此，以扩增后的DNA为模板，可以形成大量的银纳米簇，并且卡那霉素含量越多，未解离下的用于PCR扩增的模板DNA分子越少，从而扩增出的包含银纳米簇模板的单链DNA分子越少，形成的银纳米簇含量越低，荧光信号越弱，即卡那霉素的浓度与荧光信号强度呈负相关。根据两者之间的关系建立标准曲线，从而间接检测卡那霉素的含量。
发明内容
要解决的技术问题：目前卡那霉素的常用检测方法主要是基于仪器的检测方法，这种方法仪器昂贵，样品前处理复杂，限制了其广泛应用；免疫学方法依赖于抗体的特性，而抗体的制备周期长，制备过程复杂。
技术方案：一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，包括如下步骤：
（1）卡那霉素适配体包被PCR管
将PCR管用50μL 1%的戊二醛溶液在37℃孵育4h，然后将孵育好的PCR管用超纯水进行洗涤3次，以除去未结合的戊二醛溶液；将链霉亲和素用碳酸盐缓冲液进行稀释，将稀释后的浓度为2-6ng/mL的链霉亲和素作为包被液加入到戊二醛处理的PCR管中，每管50μL，将其置于37℃孵育2h，再用洗液洗涤3次后，在37℃条件下用封闭液封闭裸露的PCR管位点2h，然后用洗液洗涤干净；将生物素修饰的卡那霉素适配体DNA用pH 7.4 的0.01M磷酸盐缓冲液进行稀释，稀释后的浓度为0.5-2nM的适配体DNA溶液50μL加入到包被有亲和素的PCR管中，在37℃孵育1h后，用洗液洗涤3次以除去未结合的DNA分子，从而得到包被好卡那霉素适配体的PCR管。
卡那霉素适配体：5’-biotin-AAAAATGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’。
（2）双链DNA结构的形成
将用TE缓冲液稀释的与卡那霉素3’端部分互补的浓度为4nM的DNA序列加入到步骤（1）包被好的PCR管中，每管50μL，在37℃条件下反应30-60min后，用洗液洗涤3次以除去未结合的DNA片段。
部分互补DNA：5’-CCATGGCTCAGGTCAGTCCGTTCGAATCGCCTAAGCCGTAGG
TCGGCTTA-3’。
（3）卡那霉素的检测以及荧光信号的测定
用结合缓冲液将起始浓度为100ng/mL的卡那霉素按10倍梯度稀释7个浓度，然后每个浓度取50μL分别加入到步骤（2）制备好的PCR管中，在37℃条件下反应40min，使卡那霉素与适配体充分结合，然后用洗液洗涤3次，洗涤后的PCR管用于后续荧光信号的产生与检测。
在40μL 1×PCR缓冲液中分别加入2.5μL引物DNA1和引物DNA2，引物DNA1和引物DNA2的终浓度分别为100nM和2nM，然后加入5μL 10U的TaqDNA聚合酶，使得反应体系总体积为50μL；将其在PCR仪上进行扩增，扩增条件为：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火和延伸30s，总共为15-30个循环。
向反应后的PCR管中加入AgNO3溶液使得其终浓度为10mM，然后再加入NaBH4溶液使得其终浓度为10mM，室温下避光振荡反应3h，测定反应后溶液的荧光光谱；根据卡那霉素浓度和荧光峰值的对应关系，从而实现对卡那霉素的检测。
引物DNA1：5’-TAAGCCGACCTACGG-3’。
引物DNA2：5’-TGGGAGGGTGGGTGGG-CCATGGCTCAGGTCA-3’。
本发明所述的测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法所用的碳酸盐缓冲液为pH9.6的0.01M的碳酸盐缓冲液。
本发明所述的测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法步骤（1）中链霉亲和素的包被浓度为3ng/mL。
本发明所述的测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法中所用的封闭液为1%的明胶。
本发明所述的测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法步骤（1）中适配体DNA的包被浓度为1nM。
本发明所述的测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法中所用的洗液为含有0.02%Tween20的pH 7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液。
本发明所述的测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法步骤（2）中双链DNA结合的反应时间为40min。
本发明所述的测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法步骤（3）中结合缓冲液为含有1mM MgCl2的pH 7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液。
本发明所述的测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法扩增反应的循环数为25个循环。
有益效果：本发明借助于卡那霉素适配体与卡那霉素特异性的识别与结合，从而使得与适配体部分互补的DNA序列解离下来，以未解离的互补DNA分子为模板进行不对称PCR扩增，其中含量较多的一条引物的末端连接有一段与银纳米簇模板互补的DNA序列，从而使得扩增后的单链DNA分子包含银纳米簇模板DNA序列。以扩增后的DNA为模板，可以形成大量的能够发射荧光的银纳米簇，并且卡那霉素含量越多，未解离下的用于PCR扩增的模板DNA分子越少，从而扩增出的包含银纳米簇模板DNA的单链DNA分子越少，形成的银纳米簇含量越低，荧光信号越弱，即卡那霉素的浓度与荧光信号的强度呈负相关。以卡那霉素浓度为横坐标，荧光信号强度为纵坐标建立标准曲线，从而间接检测卡那霉素的含量。
附图说明
图1不同浓度卡那霉素的荧光光谱。
图2卡那霉素检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，包括如下步骤：
（1）卡那霉素适配体包被PCR管
将PCR管用50μL 1%的戊二醛溶液在37℃孵育4h，然后将孵育好的PCR管用超纯水进行洗涤3次，以除去未结合的戊二醛溶液；将链霉亲和素用pH9.6的0.01M碳酸盐缓冲液进行稀释，将稀释后的浓度为3ng/mL的链霉亲和素作为包被液加入到戊二醛处理的PCR管中，每管50μL，将其置于37℃孵育2h，再用洗液洗涤3次后，在37℃条件下用1%的明胶封闭裸露的PCR管位点2h，然后用洗液洗涤干净；将生物素修饰的卡那霉素适配体DNA用pH 7.4 的0.01M磷酸盐缓冲液进行稀释，稀释后的浓度为1nM的适配体DNA溶液50μL加入到包被有亲和素的PCR管中，在37℃孵育1h后，用洗液洗涤3次以除去未结合的DNA分子，从而得到包被好卡那霉素适配体的PCR管。
卡那霉素适配体：5’-biotin-AAAAATGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’。
（2）双链DNA结构的形成
将用TE缓冲液稀释的与卡那霉素3’端部分互补的浓度为4nM的DNA序列加入到步骤（1）包被好的PCR管中，每管50μL，在37℃条件下反应40min后，用洗液洗涤3次以除去未结合的DNA片段。
部分互补DNA：5’-CCATGGCTCAGGTCAGTCCGTTCGAATCGCCTAAGCCGTAGG
TCGGCTTA-3’。
（3）卡那霉素的检测以及荧光信号的测定
用结合缓冲液将起始浓度为100ng/mL的卡那霉素按10倍梯度稀释7个浓度，然后每个浓度取50μL分别加入到步骤（2）制备好的PCR管中，在37℃条件下反应40min，使卡那霉素与适配体充分结合，然后用洗液洗涤3次，洗涤后的PCR管用于后续荧光信号的产生与检测。
在40μL 1×PCR缓冲液中分别加入2.5μL引物DNA1和引物DNA2，引物DNA1和引物DNA2的终浓度分别为100nM和2nM，然后加入5μL 10U的TaqDNA聚合酶，使得反应体系总体积为50μL；将其在PCR仪上进行扩增，扩增条件为：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火和延伸30s，总共为25个循环。
引物DNA1：5’-TAAGCCGACCTACGG-3’。
引物DNA2：5’-TGGGAGGGTGGGTGGG-CCATGGCTCAGGTCA-3’。
向反应后的PCR管中加入AgNO3溶液使得其终浓度为10mM，然后再加入NaBH4溶液使得其终浓度为10mM，室温下避光振荡反应3h，测定反应后溶液的荧光光谱；以卡那霉素浓度为横坐标，荧光信号强度为纵坐标建立标准曲线，通过计算得出卡那霉素卡的检测限为0.048pg/mL。
（4）添加回收实验
在阴性牛奶样本中，分别添加不同浓度的卡那霉素测定添加回收结果，在0.1、10、15、60、120、250、350pg/mL的添加浓度下，赭曲霉毒素A的回收范围在92.5%-97.4%之间，从而说明此方法可以用于实际样本中卡那霉素的检测。
Claims (9)
1.一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
卡那霉素适配体包被PCR管
将PCR管用50μL 1%的戊二醛溶液在37℃孵育4h，然后将孵育好的PCR管用超纯水进行洗涤3次，以除去未结合的戊二醛溶液；将链霉亲和素用碳酸盐缓冲液进行稀释，将稀释后的浓度为2-6ng/mL的链霉亲和素作为包被液加入到戊二醛处理的PCR管中，每管50μL，将其置于37℃孵育2h，再用洗液洗涤3次后，在37℃条件下用封闭液封闭裸露的PCR管位点2h，然后用洗液洗涤干净；将生物素修饰的卡那霉素适配体DNA用pH 7.4 的0.01M磷酸盐缓冲液进行稀释，稀释后的浓度为0.5-2nM的适配体DNA溶液50μL加入到包被有亲和素的PCR管中，在37℃孵育1h后，用洗液洗涤3次以除去未结合的DNA分子，从而得到包被好卡那霉素适配体的PCR管；
卡那霉素适配体：5’-biotin-AAAAATGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’；
双链DNA结构的形成
将用TE缓冲液稀释的与卡那霉素3’端部分互补的浓度为4nM的DNA序列加入到步骤（1）包被好的PCR管中，每管50μL，在37℃条件下反应30-60min后，用洗液洗涤3次以除去未结合的DNA片段；
部分互补DNA：5’-CCATGGCTCAGGTCAGTCCGTTCGAATCGCCTAAGCCGTAGGTCGG
CTTA-3’；
卡那霉素的检测以及荧光信号的测定
用结合缓冲液将起始浓度为100ng/mL的卡那霉素按10倍梯度稀释7个浓度，然后每个浓度取50μL分别加入到步骤（2）制备好的PCR管中，在37℃条件下反应40min，使卡那霉素与适配体充分结合，然后用洗液洗涤3次，洗涤后的PCR管用于后续荧光信号的产生与检测；
在40μL 1×PCR缓冲液中分别加入2.5μL引物DNA1和引物DNA2，引物DNA1和引物DNA2的终浓度分别为100nM和2nM，然后加入5μL 10U的TaqDNA聚合酶，使得反应体系总体积为50μL；将其在PCR仪上进行扩增，扩增条件为：95℃预变性30s，然后95℃变性 5s、60℃退火和延伸 30s，总共为15-30个循环；
向反应后的PCR管中加入AgNO3溶液使得其终浓度为10mM，然后再加入NaBH4溶液使得其终浓度为10mM，室温下避光振荡反应3h，测定反应后溶液的荧光光谱；根据卡那霉素浓度和荧光峰值的对应关系，从而实现对卡那霉素的检测；
引物DNA1：5’-TAAGCCGACCTACGG-3’；
引物DNA2：5’-TGGGAGGGTGGGTGGG-CCATGGCTCAGGTCA-3’。
2.根据权利要求1所述的一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，其特征在于所述的碳酸盐缓冲液为pH9.6的0.01M的碳酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，其特征在于所述的步骤（1）中链霉亲和素的包被浓度为3ng/mL。
4.根据权利要求1所述的一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，其特征在于所述的封闭液为1%的明胶。
5.根据权利要求1所述的一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，其特征在于所述的步骤（1）中适配体DNA的包被浓度为1nM。
6.根据权利要求1所述的一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，其特征在于所述的洗液为含有0.02%Tween20的pH 7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1所述的一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，其特征在于所述的步骤（2）中双链DNA结合的反应时间为40min。
8.根据权利要求1所述的一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，其特征在于所述的结合缓冲液为含有1mM MgCl2的pH 7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求1所述的一种测定卡那霉素的超灵敏荧光传感器的检测方法，其特征在于所述的扩增反应的循环数为25个循环。
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