CN108548800B - 一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒及检测方法，利用免疫技术，在样品垫上修饰带有荧光标记的卡那霉素的DNA，在反应膜上修饰卡那霉素特异性适配体DNA。将含不同浓度的卡那霉素的样品与样品垫上的适配体结合形成复合物，复合物随着溶液的流动被检测线上的DNA捕获，形成荧光标记DNA‑卡那霉素‑DNA，然后通过荧光检测方法进行检测。本发明的试剂盒和方法具有灵敏度高、特异性高、成本低、操作简单、检测时间短、储存简单、保质期长、适合各种单位使用的优点。
Description
技术领域
本发明属于食品检验领域，具体涉及一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒及检测方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高，动物源食品中的药物残留日益受到国际社会的重视。卡那霉素是一种被广泛使用的氨基糖苷类抗生素，主要通过与细菌的30S核糖体RNA相互作用抑制其蛋白质合成而起到杀菌作用，对常见的致病菌，如大肠杆菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性菌有很强的抑制作用。由于价格低廉且抗菌性广，卡那霉素作为兽药被广泛使用，但由于操作不当或监管不力，实际生产中，卡那霉素被滥用或在饲料中被过量使用，造成其在动物源性食品中存在残留。过量的卡那霉素给人体带来的副作用包括肾毒性、造血系统毒性、过敏性等。卡那霉素对婴幼儿有很强的耳毒性，会导致婴幼儿耳蜗细胞凋亡，严重者会导致听力丧失，同时也影响牛奶及乳制品的出口贸易。
目前，常见的卡那霉素检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用技术、微生物检测法以及酶联免疫吸附测定法等，尽管这些方法能够灵敏检测食品中的卡那霉素，但由于所用仪器昂贵，耗时较长，且操作繁琐，限制了其实际应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒及检测方法，解决了上述背景技术中的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒，包括试纸条和缓冲液；
所述试纸条包括底板和底板上依次连接的样品垫、反应膜和吸水垫；所述反应膜上设有以卡那霉素特异性适配体DNA修饰的检测线和控制线，所述检测线设置于控制线与样品垫之间，所述特异性适配体DNA序列如SEQ ID NO 01所示(5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’)；所述样品垫上修饰有荧光标记DNA，其序列如SEQ ID NO 01所示(5’-C6-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’)，所述荧光标记DNA在5’端修饰有荧光基团；
所述缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；
所述缓冲液A为pH＝4.1～5.0的10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；所述缓冲液B为0.8～1.2mM EDTA、0.8～1.2M NaCl和质量浓度0.05％～0.1％Tween-20的8～12mM PBS(pH7.2～7.6)缓冲液；所述PBS组成为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。
在本发明一较佳实施例中，所述荧光标记DNA浓度为8～12μM，体积为8～12μL。
在本发明一较佳实施例中，所述特异性适配体DNA为以卡那霉素为模板合成的DNA片段，所述DNA片段溶液浓度为75～85μM，体积为0.4～0.8μL。
在本发明一较佳实施例中，所述检测线和控制线为与试纸条长边相垂直的条带状，所述控制线设置于靠近吸水垫的一侧，所述检测线设置于控制线与样品垫之间，所述检测线与控制线间距0.3～0.5cm。
本发明还提供了一种食品中卡那霉素残留量的检测方法，采用上述的试剂盒，包括如下步骤：
(1)样品预处理：将液体食品样品离心处理后，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释上清液10～20倍，得到待检样品液；
(2)加样：将试纸条的样品垫与待检样品液接触，平放试剂盒，使待待检样品液由样品垫端向吸水垫端流动，静止3～5分钟；
(3)荧光检测：将试纸条进行荧光检测，检测时的激发波长为490～495nm，发射波长为515～520nm；
(4)分析：检测结果包括阳性、阴性和无效，检验人员依据检测结果可判定卡那霉素残留量是否超标；
①阳性：当检测线显示出绿色条带，而控制线显色，判为阳性，用“+”表示；
②阴性：当检测线显示出绿色条带，而控制线不显色，判为阴性，用“-”表示；
③无效：当检测线不显示出绿色条带，则无论控制线是否显示出绿色条带，试纸均失效。
在本发明一较佳实施例中，所述步骤(2)将试纸条插入待检样品液中，控制插入部分在样品垫的1/3。
在本发明一较佳实施例中，所述步骤(2)取100～200μL待检样品液滴加于试纸条的样品垫顶端。
在本发明一较佳实施例中，所述步骤(1)～(4)前包括步骤(0)：试剂盒的制备：
①试纸条的制备：取底板一块，在底板上依次黏贴样品垫、反应膜、吸水垫，样品垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；所述反应膜上设有以卡那霉素特异性适配体DNA修饰的检测线和控制线，所述检测线设置于控制线与样品垫之间，所述特异性适配体DNA序列如SEQ IDNO 01所示；所述样品垫上修饰有荧光标记DNA，其序列如SEQ ID NO 01所示；所述检测线和控制线为与试纸条长边相垂直的条带状，所述控制线设置于靠近吸水垫的一侧，所述检测线设置于控制线与样品垫之间，所述检测线与控制线间距0.3～0.5cm；
②缓冲液的配制：所述缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；
所述缓冲液A为pH＝4.1～5.0的10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；所述缓冲液B为0.8～1.2mM EDTA、0.8～1.2M NaCl和质量浓度0.05％～0.1％Tween-20的8～12mM PBS(pH7.2～7.6)缓冲液；所述PBS组成为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。
在本发明一较佳实施例中，所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述反应膜上荧光标记DNA浓度为8～12μM，体积为8～12μL；所述特异性适配体DNA为以卡那霉素为模板合成的DNA片段，所述DNA片段溶液浓度为75～85μM，体积为0.4～0.8μL
本发明具有如下有益效果：
本发明的核酸适配体可与靶标卡那霉素通过产生空间结构匹配的高亲和力而特异性结合。核酸适配体是一段人工合成的单链寡糖核苷酸片段，通常是一段DNA或RNA，可与多种目标物如离子、蛋白质、抗生素甚至很多细胞特异性结合。因其具有制备简便、特异性好、稳定性好、亲和性高等优点，在分析检测、临床诊断和治疗以及生化分离等方面拥有广泛的应用前景。
本发明的试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性高、成本低、操作简单、检测时间短、储存简单、保质期长、适合各种单位使用的优点。其中，高特异性的卡那霉素DNA，保证了检测结果的可靠性；将特异性适配体DNA和荧光标记DNA修饰在试纸条上，能够使特异性适配体DNA和标记DNA与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试剂盒检测卡那霉素的方法，简便、快速、直观、准确，成本低，易推广使用。
附图说明
图1为本发明试纸条结构示意图。
图2为本发明免疫反应机理图。
图3为本发明试剂盒对卡那霉素特异性选择示意图。
图4为本发明试剂盒检测结果示意图，其中T表示检测线，C表示控制线。
具体实施方式
请查阅图1-4，本实施例的一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒，包括试纸条和缓冲液；
所述试纸条包括底板6和底板6上依次连接的样品垫3、反应膜2和吸水垫1；所述反应膜2上设有以卡那霉素特异性适配体DNA修饰的检测线4和控制线5，所述检测线4设置于控制线5与样品垫3之间；所述特异性适配体DNA为以卡那霉素为模板合成的DNA片段，所述DNA片段溶液浓度为80μM，体积为0.6μL；所述特异性适配体DNA序列如SEQ ID NO 01所示(5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’)；所述样品垫3上修饰有荧光标记DNA，所述荧光标记DNA浓度为10μM，体积为10μL，其序列如SEQ ID NO 01所示(5’-C6-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’)，所述荧光标记DNA的5’端修饰有C6的荧光基团，购置于生工生物工程(上海)股份有限公司；
所述缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B：
所述缓冲液A为pH＝4.1～5.0的10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液组成为磷酸氢二钠和柠檬酸；所述缓冲液B为1mM EDTA、1M NaCl和质量浓度0.05％～0.1％Tween-20的10mM PBS(pH 7.4)缓冲液；所述PBS组成为氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠。
一种食品中卡那霉素残留量的检测方法，采用上述试剂盒，包括如下步骤：
(0)试剂盒的制备：
①试纸条的制备：取底板6一块，在底板6上依次黏贴样品垫3、反应膜2、吸水垫1，样品垫3的末端与反应膜2相连，反应膜2的末端与吸水垫1相连，样品垫3的始端与底板6的始端对齐，吸水垫1的末端与底板6的末端对齐；所述反应膜2上设有以卡那霉素特异性适配体DNA修饰的检测线4和控制线5，所述检测线4设置于控制线5与样品垫3之间，所述特异性适配体DNA序列如SEQ ID NO 01所示；所述样品垫3上修饰有荧光标记DNA，其序列如SEQ IDNO 01所示；所述检测线4和控制线5为与试纸条长边相垂直的条带状，所述控制线5设置于靠近吸水垫1的一侧，所述检测线4设置于控制线5与样品垫3之间，所述检测线4与控制线5间距0.4cm；
所述底板6为PVC底板；样品垫3为玻璃纤维膜；反应膜2为硝酸纤维素膜；吸水垫1为吸水纸。
②缓冲液的配制：所述缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；
所述缓冲液A为pH＝4.1～5.0的10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，所述缓冲液A为pH＝4.1～5.0的10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；所述缓冲液B为1.0mM EDTA、1.0M NaCl和质量浓度0.05％～0.1％Tween-20的10mM PBS(pH 7.4)缓冲液；所述PBS组成为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。。
(1)样品预处理：将牛奶样品离心处理后，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释上清液10～20倍，得到待检样品液；
(2)加样：取取200μL待检样品液滴加在样品垫3的顶端，平放试剂盒，使待待检样品液由样品垫3端向吸水垫1端流动，静止3～5分钟；
(3)荧光检测：将试纸条进行荧光检测，检测时的激发波长为492nm，发射波长为518nm；
(4)分析：检测结果包括阳性、阴性和无效，检验人员依据检测结果可判定卡那霉素残留量是否超标；
①阳性：当检测线4显示出绿色条带，而控制线5显色，判为阳性，用“+”表示；
②阴性：当检测线4显示出绿色条带，而控制线5不显色，判为阴性，用“-”表示；
③无效：当检测线4不显示出绿色条带，则无论控制线5是否显示出绿色条带，试纸均失效。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒及检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tgggggttga ggctaagccg a 21
Claims (9)
1.一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒，包括试纸条和缓冲液，其特征在于：
所述试纸条包括底板和底板上依次连接的样品垫、反应膜和吸水垫；所述反应膜上设有以卡那霉素特异性适配体DNA修饰的检测线和控制线，所述检测线设置于控制线与样品垫之间，所述特异性适配体DNA序列如SEQ ID NO 01所示；所述样品垫上修饰有荧光标记DNA，其序列如SEQ ID NO 01所示，所述荧光标记DNA在5’端修饰有荧光基团；
所述缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；
所述缓冲液A为pH＝4.1～5.0的10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
所述缓冲液B为0.8～1.2mM EDTA、0.8～1.2M NaCl和质量浓度0.05％～0.1％Tween-20的8～12mM PBS缓冲液，所述缓冲液B的pH 7.2～7.6；所述PBS组成为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。
2.根据权利要求1所述的一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒，其特征在于：所述荧光标记DNA浓度为8～12μM，体积为8～12μL。
3.根据权利要求1所述的一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒，其特征在于：所述特异性适配体DNA为以卡那霉素为模板合成的DNA片段，所述DNA片段溶液浓度为75～85μM，体积为0.4～0.8μL。
4.根据权利要求1所述的一种检测食品中卡那霉素残留量的试剂盒，其特征在于：所述检测线和控制线为与试纸条长边相垂直的条带状，所述控制线设置于靠近吸水垫的一侧，所述检测线设置于控制线与样品垫之间，所述检测线与控制线间距0.3～0.5cm。
5.一种食品中卡那霉素残留量的检测方法，采用所述权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品预处理：将液体食品样品离心处理后，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶液稀释上清液10～20倍，得到待检样品液；
(2)加样：将试纸条的样品垫与待检样品液接触，平放试剂盒，使待待检样品液由样品垫端向吸水垫端流动，静止3～5分钟；
(3)荧光检测：将试纸条进行荧光检测，检测时的激发波长为490～495nm，发射波长为515～520nm；
(4)分析：检测结果包括阳性、阴性和无效，检验人员依据检测结果可判定卡那霉素残留量是否超标；
①阳性：当检测线显示出绿色条带，而控制线显色，判为阳性，用“+”表示；
②阴性：当检测线显示出绿色条带，而控制线不显色，判为阴性，用“-”表示；
③无效：当检测线不显示出绿色条带，则无论控制线是否显示出绿色条带，试纸均失效。
6.根据权利要求5所述的一种食品中卡那霉素残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)将试纸条插入待检样品液中，控制插入部分在样品垫的1/3。
7.根据权利要求5所述的一种食品中卡那霉素残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)取100～200μL待检样品液滴加于试纸条的样品垫顶端。
8.根据权利要求5所述的一种食品中卡那霉素残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)～(4)前包括步骤(0)：试剂盒的制备：
①试纸条的制备：取底板一块，在底板上依次黏贴样品垫、反应膜、吸水垫，样品垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；所述反应膜上设有以卡那霉素特异性适配体DNA修饰的检测线和控制线，所述检测线设置于控制线与样品垫之间，所述特异性适配体DNA序列如SEQ ID NO01所示；所述样品垫上修饰有荧光标记DNA，其序列如SEQ ID NO 01所示；所述检测线和控制线为与试纸条长边相垂直的条带状，所述控制线设置于靠近吸水垫的一侧，所述检测线设置于控制线与样品垫之间，所述检测线与控制线间距0.3～0.5cm；
②缓冲液的配制：所述缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；
所述缓冲液A为pH＝4.1～5.0的10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
所述缓冲液B为0.8～1.2mM EDTA、0.8～1.2M NaCl和质量浓度0.05％～0.1％Tween-20的8～12mM PBS缓冲液，所述缓冲液B的pH 7.2～7.6；所述PBS组成为氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。
9.根据权利要求8所述的一种食品中卡那霉素残留量的检测方法，其特征在于：所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述反应膜上荧光标记DNA浓度为8～12μM，体积为8～12μL；所述特异性适配体DNA为以卡那霉素为模板合成的DNA片段，所述DNA片段溶液浓度为75～85μM，体积为0.4～0.8μL。
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