CN104177451A - 非天然双功能糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种式I的非天然双功能糖9-AzSiaDAz和/或式Ⅱ的非天然双功能糖9-AzSiaNAl及其制备方法与应用。所述非天然双功能糖9-AzSiaDAz和9-AzSiaNAl能够作为探针用于细胞标记。单一的功能团无法实现糖与糖结合蛋白之间相互作用的高通量、实时的捕捉和进行双色成像。而本发明所开发的含有正交反应基团和光交联基团的双功能非天然糖探针，在不需要对蛋白进行修饰的条件下，通过UV光照使得糖蛋白共价交联在非天然双功能糖上，再通过亲和捕获纯化出蛋白。本发明所开发的含有两个不同正交反应基团的双功能非天然糖探针，可以通过发生两步Click反应进行双色成像。

Description

非天然双功能糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化学糖生物学领域，尤其涉及非天然双功能糖的合成及其在细胞表面标记中的应用。

背景技术

唾液酸具有重要的生物学功能，在抗炎、抗肿瘤、抗病毒治疗等方面发挥着极为重要的作用，但是由于传统的生化手段及基因技术的局限性，人们对唾液酸在细胞层面的研究相对滞后。近年来，通过糖的生物代谢途径引入化学探针的策略备受科学家们的青睐。其以化学生物学方法为切入点，通过对非天然基团的设计可以在细胞表面引入生物正交反应基团，并通过生物正交反应在活细胞条件下引入探针分子，进而在活细胞的生理条件下从分子水平揭示特定糖基化功能的机理。唾液酸的N-Acetyl和9号位可以进行化学修饰，而唾液酸的生物合成前体ManNAc（N-乙酰-D-甘露糖胺）的N-Acetyl类似物也可通过代谢途径转化为相应的唾液酸表达在细胞表面。这些修饰基团包括正交反应基团以及光交联基团等，其中叠氮和端炔为最重要的两个生物正交反应基团。这两个基团可以进行点击化学、Staudinger Ligation等生物正交反应，从而偶联上一系列探针。含有diazirine（双吖丙啶）等光交联基团的非天然糖探针最近也被发展出来用于捕获蛋白与唾液酸之间的相互作用。但是这种仅含有一个基团的非天然糖无法实现糖与糖结合蛋白之间相互作用的高通量、实时的捕捉，也无法实现高通量无偏差地分离鉴定糖结合蛋白的问题。

基于在唾液酸N-Acetyl（N-乙酰基）上和9号位上均有成功修饰的非天然糖探针，可以在这两个位置同时引入不同的基团，如在这两个位置同时引入两个不同的生物正交反应基团，就可以通过生物正交反应引入两个具有不同颜色的荧光分子，用于双色成像；还可以分别引入一个生物正交反应基团和一个光交联基团，同时进行成像和富集提纯。这些双功能修饰在研究聚糖－聚糖、聚糖－蛋白相互作用中有重要的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种式I所示的非天然双功能糖9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaDAz）

所述式I的非天然双功能糖可以通过下述方法制备：

步骤一在避光的反应容器中加入N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸（SiaDAz）和甲醇，然后向其中加入三氟乙酸使其反应，反应完成后浓缩、洗涤、分离，制得式Ⅲ的N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（1-MeSiaDAz），结构式如下：

步骤二冰浴及惰性气体保护下，将步骤一制备的式Ⅲ的N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（1-MeSiaDAz）溶于干燥吡啶，搅拌，然后向其中加入对甲基苯磺酰氯，搅拌，经浓缩、分离，制得式Ⅳ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（9-Ts-1-MeSiaDAz）：

步骤三将步骤二制得的Ⅳ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（9-Ts-1-MeSiaDAz）与叠氮化钠一起溶于丙酮和水，加热回流，经浓缩、分离即得所述式I的9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaDAz）。

其中，上述方法中，所有的反应步骤均需在避光的条件下进行。步骤一至步骤三中均以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂过色谱柱分离残余物。

本发明还提供一种式Ⅱ所示的非天然双功能糖9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaNAl）

所述式Ⅱ的非天然双功能糖通过下述方法制备：

步骤一在反应容器中加入N-(4-炔基)戊酰神经氨酸（SiaNAl）、甲醇和三氟乙酸，搅拌，浓缩，制得式Ⅴ的N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（1-MeSiaNAl）

步骤二冰浴及惰性气体保护下将步骤一制得的式Ⅴ的N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（1-MeSiaDAz）溶于干燥吡啶，搅拌，向其中加入对甲基苯磺酰氯，搅拌，经浓缩、分离，制得式Ⅵ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（9-Ts-1-MeSiaNAl）

步骤三将步骤二制得的式Ⅵ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯（9-Ts-1-MeSiaNAl）和叠氮化钠一起溶于丙酮和水，加热回流，浓缩、分离即得所述式Ⅱ的9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaNAl）。

其中，上述方法中，步骤一至步骤三中均以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂过色谱柱分离残余物。

本发明还提供上述两种非天然双功能糖作为探针在细胞标记中的应用。

本发明还提供一种应用上述的9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaDAz）实现对糖的结合蛋白捕捉的方法，包含步骤：

步骤一采用含有上述非天然双功能糖9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸的培养基培养细胞；

步骤二通过UV光照，实现对细胞内和细胞膜上与唾液酸相互作用的蛋白质的光交联；

步骤三应用唾液酸苷酶从唾液酸上切掉细胞裂解液中唾液酸修饰的蛋白质；

步骤四通过所述非天然双功能糖的生物正交反应，使非天然唾液酸上叠氮与带有炔基的生物素反应，生物素则与亲和素结合，实现对与糖相互作用蛋白质的捕捉；

步骤五通过胶内酶切和液相色谱-二级质谱鉴定捕捉的蛋白。

本发明还提供一种应用上述的9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaNAl）实现双色成像的方法，包含步骤：

步骤一采用含有非天然双功能糖9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸（9-AzSiaNAl）的培养基培养细胞；

步骤二将洗净的细胞与DBCO-Alexa Fluor488进行标记反应；

步骤三用TECP溶液淬灭细胞上未反应叠氮基团；

步骤四向细胞加入预混叠氮荧光647探针的PBS反应液进行荧光标记；

步骤五共聚焦荧光显微镜成像。

本发明通过提供上述的非天然双功能糖，提供一种研究糖与蛋白之间相互作用的新方法。通过光交联高通量的捕获与糖相互作用的蛋白质，对仪器设备要求不高，并且双吖丙啶是高效的光交联基团，并已经被证明可以用于非天然糖代谢标记。而生物正交反应基团可以作为蛋白富集的标签，其相比于蛋白融合标签，具有尺寸小、特异性高等优势。在不需要对蛋白进行修饰的条件下，通过UV光照使得糖蛋白共价交联在非天然双功能糖上，再通过亲和捕获纯化出蛋白。这种方法拓展了非天然糖代谢标记的功能，在研究糖与蛋白之间相互作用中有重要的应用。

单一的功能团无法实现糖与糖结合蛋白之间相互作用的高通量、实时的捕捉。而本发明所开发的含有正交反应基团和光交联基团的双功能非天然糖探针，发展了研究蛋白质和糖相互作用的化学生物学新方法，解决和改进了目前无法实现高通量无偏差地分离鉴定糖结合蛋白的问题。同时，针对单功能非天然糖无法双色成像的问题，本发明所开发的含有两个不同正交反应基团双功能非天然糖探针，可以通过生物正交反应引入两个具有不同颜色的荧光分子，用于双色成像。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1A为非天然双功能糖9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）和9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）及对照9-AzSia（9-叠氮神经氨酸）在CHO细胞表面的表达效率。

图1B为非天然糖9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）和9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）及对照9-AzSia（9-叠氮神经氨酸）的时间表达效率。

图2是用DBCO-F545标记细胞表面的叠氮基团，然后用Azido F488在Cu催化条件下与炔基发生click反应的结果。

图3是细胞裂解液和富集后的Western blot检验结果。

具体实施方式

本发明使用非天然双功能糖实现对糖的结合蛋白进行研究。通过将所合成的双功能非天然糖探针（以9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）为例）代谢进入细胞中，通过365nm UV光照，实现对细胞内和细胞膜上与唾液酸相互作用的蛋白质的光交联；然后应用唾液酸苷酶从唾液酸上切掉细胞裂解液中所有唾液酸修饰的蛋白质；接着通过生物正交反应，如铜离子催化的叠氮-炔基环加成反应(CuAAC Reaction)使非天然唾液酸上叠氮与带有炔基的生物素反应，生物素则与亲和素Beads结合，实现对与糖相互作用蛋白质的捕捉；最后通过胶内酶切和液相色谱-二级质谱鉴定捕捉的蛋白。

试验材料的说明

化学试剂均购自百灵威或阿法埃莎。Sulfo-DBCO-Biotin（或者Al-PEG4-Biotin）购自Click Chemistry Tools(Scottsdale,AZ,USA).AlexaFluor488-链霉亲和素和Alexa Fluor647-链霉亲和素购自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。HeLa和Daudi细胞购自协和细胞中心。SiaDAz为N-(4-双吖丙啶)戊酰神经氨酸；SiaNAl为N-(4-炔基)戊酰神经氨酸；Az为叠氮基团；Me为甲基；Ts为对甲苯磺酰基。

细胞培养

Hela细胞培养在添加10%FBS100单位/mL青霉素10μg/mL链霉素DMEM培养基；Daudi细胞培养于10%FBS100单位/mL青霉素10μg/mL链霉素RPMI-1640培养基。所有细胞在37°C培养于水饱和培养箱并供给5%CO₂。

实施例19-AzSiaDAz（N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）的合成

以SiaDAz（N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）为起始原料经三步合成，且所有的反应均需在避光的条件下进行。

第一步，在铝箔包裹的反应容器中加入1.38g SiaDAz（N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）、50mL甲醇和0.5mL三氟乙酸，室温搅拌12h，浓缩，残余物以二氯甲烷和甲醇(体积比4:1)为洗脱剂过色谱柱分离，得977mg1-MeSiaDAz（N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）。

1-MeSiaDAz（N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）的表征数据如下：¹H NMR(500MHz,D₂O)δ1.05(s,3H),1.73-1.78(m,2H),1.94(dd,J=12.0,12.5Hz,1H),2.22-2.27(m,2H),2.34(dd,J=4.5,13.0Hz,1H),3.62-3.67(m,2H),3.75-3.77(m,1H),3.86-3.88(m,4H),3.94-3.98(app t,1H),4.08-4.12(m,2H).¹³C NMR(125MHz,D₂O)δ18.6,26.2,29.5,30.3,38.8,52.0,53.5,63.2,66.6,68.3,70.2,70.4,95.4,171.4,175.9.HRMS(ESI):Calcdfor C₁₅H₂₆N₃O₉[M+H]⁺392.1663,found392.1663。

第二步，冰浴及氮气保护下将754mg1-MeSiaDAz（N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）溶于20mL干燥吡啶，在搅拌下向其中加入457mg对甲基苯磺酰氯，室温搅拌12h，浓缩，残余物以二氯甲烷和甲醇(体积比9:1)为洗脱剂过色谱柱分离，得650mg9-Ts-1-MeSiaDAz（9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）。

9-Ts-1-MeSiaDAz（9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）的表征数据如下：¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ1.00(s,3H),1.66-1.70(m,2H),1.86(dd,J=11.5,13.0Hz,1H),2.08-2.20(m,3H),2.47(s,3H),3.50(dd,J=1.5,9.5Hz,1H),3.70-3.78(m,4H),3.83-3.86(m,1H),3.92(d,J=1.5Hz),3.94-4.06(m,2H),4.27(dd,J=2.0,10.0Hz,1H),7.43(d,J=8.0Hz,2H),7.78(d,J=8.0Hz,2H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)δ19.7,21.6,26.4,31.2,31.3,40.7,49.0,53.2,54.2,67.6,69.2,69.8,71.8,73.7,96.6,129.1,131.0,134.2,146.4,171.6,176.4.HRMS(ESI):Calcd for C₂₂H₃₂N₃O₁₁S[M+H]⁺546.1752,found546.1765。

最后将所得的650mg9-Ts-1-MeSiaDAz（9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）和390mg叠氮化钠溶于30mL丙酮和10mL水，加热回流12h，浓缩，残余物以二氯甲烷和甲醇(体积比1:1)为洗脱剂过色谱柱分离，得381mg9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）。

9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）的表征数据如下：¹H NMR(500MHz,D₂O)δ1.02(s,3H),1.70-1.83(m,3H),2.18-2.24(m,3H),3.45(dd,J=7.5,16.5Hz,1H),3.59(dd,J=3.5,16.5Hz,1H),3.67(d,J=11.0Hz,1H),3.90-3.95(m,2H),3.98-4.02(m,2H).¹³C NMR(125MHz,D₂O)δ18.6,26.3,29.6,30.4,39.5,52.2,53.7,67.1,68.8,69.2,70.1,96.6,175.9,176.7.HRMS(ESI):Calcd for C₁₄H₂₂N₆O₈Na[M+Na]⁺425.1391,found425.1399。

实施例29-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）的合成

以SiaNAl（N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）为起始原料经三步反应合成。

第一步，在反应容器中加入1.80g SiaNAl（N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）、50ml甲醇和0.5ml三氟乙酸，室温搅拌12h，浓缩，残余物以二氯甲烷和甲醇(体积比4:1)为洗脱剂过色谱柱分离，得1.41g1-MeSiaNAl（N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）。

1-MeSiaNAl（N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）的表征数据如下：¹H NMR(500MHz,D₂O)δ1.94(dd,J=11.5,12.5Hz,1H),2.35(dd,J=5.0,13.0Hz,1H),2.43(br,1H),2.53-2.56(m,4H),3.62(dd,J=6.5,12.0Hz,1H),3.69(d,J=9.0Hz,1H),3.74-3.77(m,1H),3.85-3.88(m,4H),3.96-4.00(app t,1H),4.08-4.12(m,2H).¹³C NMR(125MHz,D₂O)δ14.5,34.7,38.7,52.1,53.5,63.2,66.5,68.3,70.2,70.4,83.5,95.4,171.4,175.4.HRMS(ESI):Calcd for C₁₄H₂₂NO₉[M+H]⁺362.1445,found362.1448。

第二步，冰浴及氮气保护下将1.41g1-MeSiaNAl（N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）溶于30mL干燥吡啶，在搅拌下向其中加入880mg对甲基苯磺酰氯，室温搅拌12h，浓缩，残余物以二氯甲烷和甲醇(体积比9:1)为洗脱剂过色谱柱分离，得1.40g9-Ts-1-MeSiaNAl（9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）。

9-Ts-1-MeSiaNAl（9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯)的表征数据如下：¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ1.86(dd,J=11.5,12.5Hz,1H),2.19(dd,J=5.0,13.0Hz,1H),2.30(br,1H),2.45-2.47(m,7H),3.56(dd,J=1.5,9.5Hz,1H),3.74-3.76(m,4H),3.91-3.92(m,1H),3.94(d,J=1.5Hz,1H),4.00-4.04(m,2H),4.25(dd,J=2.5,10Hz,1H),7.43(d,J=8.0Hz,2H),7.79(d,J=8.0Hz,2H).¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)δ15.7,21.6,36.0,40.7,49.0,53.2,54.3,67.6,69.2,69.7,70.9,71.8,73.6,83.6,96.6,129.1,131.0,134.1,146.4,171.6,175.9.HRMS(ESI):Calcd for C₂₂H₃₀NO₁₁S[M+H]⁺516.1534,found516.1536。

最后将所得的1.40g9-Ts-1-MeSiaNAl（9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）和880mg叠氮化钠溶于30mL丙酮和10mL水，加热回流12h，浓缩，残余物以二氯甲烷和甲醇(体积比1:1)为洗脱剂过色谱柱分离，得672mg9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）。

9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）的表征数据如下：¹HNMR(500MHz,D₂O)δ1.86(dd,J=11.5,12.5Hz,1H),2.24(dd,J=5.0,12.5Hz,1H),2.45(br,1H),2.53-2.57(m,4H),3.38(dd,J=6.0,13.0Hz,1H),3.62(dd,J=2.0,13.0Hz,1H),3.68(d,J=9.5Hz,1H),3.93-3.99(m,2H),4.02-4.07(m,2H).¹³C NMR(125MHz,D₂O)δ14.6,34.8,39.5,52.3,53.9,67.2,69.0,69.2,70.0,83.1,96.4,175.4,176.7.HRMS(ESI):Calcd forC₁₄H₂₀N₄O₈Na[M+Na]⁺395.1173,found395.1180。

实施例3非天然双功能糖修饰到细胞表面

在浓度梯度表达实验中使用含0mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM和3mM的非天然双功能糖9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）或者9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）的培养基培养细胞，以单功能非天然糖9AzSia（9-叠氮神经氨酸）为对照24h后非天然双功能糖就被表达到细胞表面。在时间表达实验中，3mM的9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）和9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）和9-AzSia（9-叠氮神经氨酸）在0h、4h、8h、12h、16h、20h和24h加入细胞培养基中，所有的细胞被收集，用PBS清洗后，让细胞与sulfo-DBCO-Biotin进行click反应检测细胞表面是否含有叠氮基团，用修饰有F647的streptavidin与biotin反应，再用流式细胞仪进行定量分析。具体实验步骤如下：

1.接种CHO细胞到6孔细胞培养板里面，浓度为2x10⁵cells/mL，生长24h后，加入非天然糖。对于浓度梯度表达测试，在培养基中加入0mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM和3mM的非天然双功能糖9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）、9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）或者9-AzSia（9-叠氮神经氨酸），培养24h让非天然糖代谢整合。对于时间梯度的表达测试，在0h、4h、8h、12h、16h、20h和24h前加入3mM9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）、9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）或者9-AzSia（9-叠氮神经氨酸）。

2.代谢整合后，用PBS润洗后再用0.25%Trypsin-EDTA消化下细胞，用全培养基中和后分散在96孔V-型组织培养板中，用800g离心收集细胞，再用含有1％FBS的PBS润洗细胞3次。

3.用sulfo-DBCO-biotin标记细胞表面叠氮基团。把润洗好的细胞重新分散在100μL的含有50μM sulfo-DBCO-biotin的PBS里面，在室温反应30min后，离心细胞并用含有1％FBS的PBS润洗细胞3次。

4.用Streptavidin-Alexa Fluor647标记细胞表面。把细胞重新悬在含有1%FBS，2μg/mL Streptavidin-Alexa Fluor647的PBS里面避光在冰上反应30min后，离心细胞并用含有1％FBS的PBS润洗细胞3次。

5.把细胞悬在400μL的FACS buffer中用BD C6流式细胞仪收集数据。

具体结果请参照图1A和图1B，其中图1A为非天然双功能糖9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）和9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）及对照9-AzSia（9-叠氮神经氨酸）在CHO细胞表面的表达效率，图1B为非天然糖9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）和9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）及对照9-AzSia（9-叠氮神经氨酸）的时间表达效率。从图1A和图1B中可以看出非天然双功能糖的标记效率随非天然双功能糖浓度的升高而升高，随着表达时间的延长，表达量也上升，到20h时平衡，也就是说其标记效率具有浓度和时间依赖性，这说明非天然糖可以被代谢整合到细胞的糖链中，且非天然双功能糖的标记效率与单功能糖的标记效率相当，这说明在N-Acetyl上和9号位同时引入两个不同的官能团时并不会影响它们在细胞表面的表达量。

实施例4双色成像（9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸），叠氮和炔基），细胞系（HeLa）

叠氮和端炔是最重要的两个生物正交反应基团，这两个基团可以进行点击化学、Staudinger Ligation等生物正交反应，从而偶联上一系列探针。相对于以前的仅可用于单色成像的非天然糖探针，本申请向唾液酸引入两个不同生物正交反应基团通过生物正交反应引入两个具有不同颜色的荧光分子，用于双色成像。

含3mM9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）、SiaNAl（N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）和9AzSia（9-叠氮神经氨酸）/SiaNAl（N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）混合物的培养基在培养箱中37°C培养HeLa细胞，24h后用磷酸缓冲溶液（PBS，pH=7.4）洗3次洗掉未进入细胞的非天然糖。用DBCO-F545标记细胞表面的叠氮基团，然后用Azido F488在Cu催化条件下与炔基发生click反应。具体反应步骤如下：

1.在培养的Hela细胞的培养基中分别加入1mM9AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸），9AzSia（9-叠氮神经氨酸）或SiaNAl（N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）非天然糖；

2.24h后，用含有1%FBS的PBS溶液洗细胞，3次；

3.将洗净的细胞与50μM DBCO-Alexa Fluor488(溶于含0.5%FBS溶液中)在室温孵育30min进行标记反应；

4.反应完成后，用含1%FBS的PBS溶液洗细胞3次并用50mMTECP溶液淬灭细胞上未反应叠氮基团10min；

5.1%FBS的PBS溶液洗细胞3次；

6.向细胞加入预混叠氮荧光647探针的PBS反应液(含0.5%FBS,50μM叠氮荧光488探针，2.5mM抗坏血酸钠，BTTAA:CuSO₄=300μM:50μM)室温反应5min，然后用2μL50mM铜离子络合剂BCS终止反应；

7.细胞与5μg/mL Hoechest33342在暗处冰上共孵育10min；

8.用1%FBS的PBS溶液洗细胞3次；

9.共聚焦荧光显微镜成像。

结果请参照图2：由图可以看出，当用DBCO-F488标记细胞表面的叠氮基团时，细胞表面标记上绿色荧光（箭头1）；当用Azido F647在Cu催化条件下与炔基发生click反应时，细胞表面标记上红色荧光（箭头2），merge一下呈现黄色，说明叠氮和炔基在同一个糖上。这也说明9-AzSiaNAl（9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸）可用于细胞表面的双色成像。

实施例5糖与蛋白之间相互作用（9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸），叠氮和diazirine），细胞系（Daudi）

含有diazirine等光交联基团的非天然糖探针最近也被发展出来用于捕获蛋白与唾液酸之间的相互作用。相对于以前的单一的功能团无法实现糖与糖结合蛋白之间相互作用的高通量、实时的捕捉的缺点，本发明使用含有正交反应基团和光交联基团的双功能非天然糖探针，不仅可发展研究蛋白质和糖相互作用的化学生物学新方法，还可解决和改进目前无法实现高通量无偏差地分离鉴定糖结合蛋白的问题。

含2mM的9-AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸）的培养基在培养箱中37°C培养Daudi细胞，24h后用磷酸缓冲溶液（PBS，pH=7.4）洗3次洗掉未进入细胞的非天然糖。然后对其进行紫外照射，接着细胞被裂解，再与alkyne-biotin（生物素-炔基）反应，最后通过链霉亲和素树脂富集起来，利用CD22的抗体，做Western blot检验。具体反应步骤如下：

紫外交联：

1.在培养的Daudi细胞的培养基中分别加入2mM9AzSiaDAz（9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸），SiaDAz（N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸），或者Sia（神经氨酸）非天然糖避光培养24h；

2.600g离心5min收集细胞，10mL/次PBS洗细胞，共3次；

3.将各细胞样品均分两组重悬于6孔板中置于冰上，其中一组用于UV交联，对该组样品进行20W365nm UV照射20min，样品与UV光源距离小于2cm；另一组对照样品不光照；

4.600g离心5min收集细胞，10mL PBS洗细胞1次，再次离心弃上清；

5.用冰上预冷的RIPA裂解液(1%Nonidet P40，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，50mM三乙醇胺pH7.4，150mM NaCl，1×Pierce的无EDTA的蛋白酶抑制剂混合试剂)对收集的细胞进行裂解，冰上放置20min；

6.细胞裂解液于14000g离心5min，去掉不溶的细胞碎片沉淀物，应用Pierce的BCA试剂盒测定蛋白浓度。

光交联的糖结合蛋白质的分离与富集

1.将对上述各组样品裂解液蛋白质浓度调整至0.6mg/mL，在510μL体系中加入100μM生物素-炔基探针，预混的BTTAA:CuSO₄=500μM:250μM，2.5mM抗坏血酸钠在IKA MS3振荡器25°C反应1h；

2.加入150μL预冷的三氯乙酸-丙酮(1:1)溶液冰上孵育30min，5900g离心4分钟沉淀蛋白质，并反复用预冷500μL丙酮洗涤沉淀2次，去除未反应生物素-炔基探针；

3.去尽上清，向蛋白质沉淀加入1.0mL含1.2%SDS的PBS溶液，超声30s，80°C加热5min重溶蛋白质，然后加入5mL PBS溶液稀释蛋白溶液；

4.向稀释的蛋白质样品溶液中加入50μL链霉亲和素树脂，室温翻转孵育1.5h，用以富集生物素标记的糖蛋白；

5.1300g离心3min，去上清，用10mL含0.2%SDS的PBS溶液洗富集了生物素标记的糖蛋白的链霉亲和素树脂，共洗2次；

6.10mL PBS洗生物素标记的糖蛋白的链霉亲和素树脂，共5次；

7.1300g离心3min，弃上清，加40μL2X SDS-PAGE上样缓冲液95°C加热5min，5000g离心收集上清液。

蛋白质杂交分析：

1.上述上清样品于8%或10%浓度胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，接着将蛋白转移至PVDF膜(Millipore)；

2.用含5%脱脂牛奶的TBST溶液(50mM Tris-HCl150mM NaCl0.05%吐温-20，pH7.5)的封闭液室温封闭转移有蛋白质的PVDF膜；

3.TBST洗膜3次，5min/次；

4.将封闭后PVDF膜与兔CD22抗体(Abcam，1:1000稀释于封闭液)4°C孵育12h至18h；

5.TBST洗膜3次，5min/次；

6.将上述PVDF膜与山羊抗兔-辣根过氧化物酶二抗(SZGB-BIO,1:1000稀释于封闭液)室温孵育1h；

7.膜TBST洗PVDF膜4次，10min/次；

8.应用超敏化学发光液显色。

具体试验结果请见图3，左右分别是细胞裂解液和富集后的结果。从图中可以看出，在实验组光照的条件下，CD22条带上方还有一条条带，这是紫外光照后部分CD22发生多聚的结果。β-actin是细胞骨架蛋白，Anti-β-actin条带强度接近，表明每个条带检验的蛋白质含量基本相同。这一数据证明了紫外照射下唾液酸结合蛋白CD22发生了光交联，且能够通过双标唾液酸类似物实现富集。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (10)

1.一种式I所示的非天然双功能糖9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸

2.一种权利要求1所述的非天然双功能糖的制备方法，其特征在于，包含步骤：

步骤一在避光的反应容器中加入N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸和甲醇，然后向其中加入三氟乙酸使其反应，反应完成后浓缩、洗涤、分离，制得式Ⅲ的N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯：

步骤二冰浴及惰性气体保护下，将步骤一制备的式Ⅲ的N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯溶于干燥吡啶，搅拌，然后向其中加入对甲基苯磺酰氯，搅拌，经浓缩、分离，制得式Ⅳ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯：

步骤三将步骤二制得的式Ⅳ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸-1-甲酯与叠氮化钠一起溶于丙酮和水，加热回流，经浓缩、分离即得所述式I的9-叠氮-N-(4-双吖丙啶)戊酰基神经氨酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所有的反应步骤均需在避光的条件下进行。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一至步骤三中均以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂过色谱柱分离残余物。

5.一种式Ⅱ所示的非天然双功能糖9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸

6.一种权利要求5所述的非天然双功能糖的制备方法，其特征在于，包含步骤：

步骤一在反应容器中加入N-(4-炔基)戊酰神经氨酸、甲醇和三氟乙酸，搅拌，浓缩，制得式Ⅴ的N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯：

步骤二冰浴及惰性气体保护下将步骤一制得的式Ⅴ的N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯）溶于干燥吡啶，搅拌，向其中加入对甲基苯磺酰氯，搅拌，经浓缩、分离，制得式Ⅵ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯：

步骤三将步骤二制得的式Ⅵ的9-对甲苯磺酰基-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸-1-甲酯和叠氮化钠一起溶于丙酮和水，加热回流，浓缩、分离即得所述式Ⅱ的9-叠氮-N-(4-炔基)戊酰基神经氨酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤一至步骤三中均以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂过色谱柱分离残余物。

8.权利要求1和/或5所述的非天然双功能糖作为探针在细胞标记中的应用。

9.一种应用权利要求1所述的非天然双功能糖实现对糖的结合蛋白捕捉的方法，其特征在于，包含步骤：

步骤一采用含有权利要求1所述的非天然双功能糖的培养基培养细胞；

步骤二通过UV光照，实现对细胞内和细胞膜上与唾液酸相互作用的蛋白质的光交联；

步骤三应用唾液酸苷酶从唾液酸上切掉细胞裂解液中唾液酸修饰的蛋白质；

步骤四通过非天然双功能糖的生物正交反应，使非天然唾液酸上叠氮与带有炔基的生物素反应，生物素则与亲和素结合，实现对与糖相互作用蛋白质的捕捉；

步骤五通过胶内酶切和液相色谱-二级质谱鉴定捕捉的蛋白。

10.一种应用权利要求5所述的非天然双功能糖实现双色成像，其特征在于，包含步骤：

步骤一采用含有权利要求5所述的非天然双功能糖的培养基培养细胞；

步骤二将洗净的细胞与DBCO-Alexa Fluor488进行标记反应；

步骤三用TECP溶液淬灭细胞上未反应叠氮基团；

步骤四向细胞加入预混叠氮荧光647探针的PBS反应液进行荧光标记；

步骤五共聚焦荧光显微镜成像。