ES2269749T3 - Vacuna a base de un analogo de beta-amiloide y de un epitope de celula t. - Google Patents
Vacuna a base de un analogo de beta-amiloide y de un epitope de celula t. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un inmunógeno que a) es un poliaminoácido que incorpora en la misma molécula una fracción sustancial de epítopes de células B de APP y/o Aa de manera que el poliaminoácido reacciona hasta el mismo grado que lo hace la APP o Aa con un suero policlonal inducido contra APP o Aa, y al menos un epítope T auxiliar extraño (epítope TH), y que contiene al menos un epítope TH extraño y una secuencia rota de APP o Aa de manera que el poliaminoácido no incluye ninguna subsecuencia de la SEQ ID Nº: 2 que se une de manera productiva a als moléculas de clase II de MHC que inicia una respuesta de célula T; o b) es un conjugado que comprende una estructura central de polihidroxipolímero al que está acoplado un poliamino ácido como se ha definido en a); o c) es un conjugado que comprende una estructura central de polihidroxipolímero al que está acoplado separadamente 1) el al menos un epítope TH extraño y 2) una secuencia rota de APP o Aa como se ha definido en a); o d) es un ácido nucleico que codifica el poliaminoácido como se ha definido en a); o e) es un microorganismo no patógeno o virus que lleva un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el poliaminoácido como se ha definido en a), En la preparación de una preparación farmacéutica que contiene el inmunógeno para el tratamiento, prevención o mejora en un animal de la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades caracterizadas por la deposición de amiloide.
Description
Vacuna a base de un análogo de
\beta-amiloide y de un epítope de célula T.
La presente invención se refiere a mejoras en
terapia y prevención de la enfermedad de Alzheimer (AD) y otras
enfermedades caracterizadas por deposición de amiloides, por ejemplo
caracterizadas por depósitos de amiloides en el sistema nervioso
central (SNC). Más específicamente, la presente invención
proporciona medios para permitir un procedimiento para regular hacia
abajo (no deseado) depósitos de amiloide permitiendo la producción
de anticuerpos contra una proteína relevante (APP o A\beta) o
componentes de la misma en sujetos que sufren de o en peligro de
sufrir enfermedades que tienen una patología que implica deposición
de amiloides. La invención también proporciona los polipéptidos
modificados como tal. También comprendida por la presente invención
están fragmentos de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos
modificados así como vectores que incorporan estos fragmentos de
ácidos nucleicos y células hospedadoras y líneas celulares
transformadas con ellos. Finalmente la presente invención también
proporciona un nuevo tipo de inmunógeno de péptido conjugado.
La amiloidosis es la deposición extracelular de
fibrilas proteicas insolubles que conduce a daño y enfermedad del
tejido (Pepys, 1996; Tan y col., 1995; Kelly, 1996). Las fibrilas se
forman cuando las proteínas y péptidos normalmente solubles se
autosocian de una manera anormal (Kelly, 1997).
El amiloide está asociado a enfermedades graves
que incluyen amiloidosis sistémica, AD, diabetes de comienzo en la
madurez, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, demencia
frontotemporal y las encefalopatías espongiformes transmisibles
relacionadas con priones (enfermedad de kuru y Creutzfeldt - Jacob
en seres humanos y cenurosis ovina y BSE en ovejas y ganado vacuno,
respectivamente) y la formación de placa amiloide en por ejemplo
enfermedad de Alzheimer parece estar estrechamente asociada a la
progresión de enfermedad humana. En modelos animales la
sobreexpresión, o la expresión de formas modificadas, de proteínas
encontradas en depósitos, como la proteína
\beta-amiloide, se ha mostrado que induce diversos
síntomas de enfermedad, por ejemplo, síntomas de tipo Alzheimer. No
existe ningún tratamiento específico para la deposición de amiloide
y estas enfermedades son usualmente fatales.
Las subunidades de fibrilas amiloides pueden ser
de tipo salvaje, proteínas variantes o truncadas, y fibrilas
similares se pueden formar in vitro a partir de oligopéptidos
y proteínas desnaturalizadas (Bradbury y col., 1960; Filshie y
col., 1964; Burke y Rougvie, 1972). La naturaleza del componente
polipeptídico de las fibrilas define el carácter de la amiloidosis.
A pesar de las grandes diferencias en tamaño, la estructura y
función nativa de las proteínas amiloides, todas las fibrilas
amiloides son de longitud indeterminada, no ramificadas, de 70 a
120\ring{A} de diámetro, y muestran tinción característica con
Rojo Congo (Pepys, 1996). Son características de una estructura
\beta transversal (Pauling y Corey, 1951) en al que la cadena
polipeptídica está organizada en hojas \beta. Aunque las proteínas
amiloides tienen estructuras precursoras muy diferentes, todas
pueden experimentar una conversión estructural, quizás junto con una
ruta similar, a una forma con plegamiento desigual que es el bloque
de construcción del protofilamento de la hélice de las hojas
\beta.
Este patrón de fibra distintivo condujo a las
amiloidosis que se llaman las \beta-fibrilosis
(Glenner, 1980a, b), y la proteína de fibrilas de la AD se denominó
la proteína \beta antes de que se conociera su estructura
secundaria (Glener y Wong, 1984). El patrón de difracción
transversal \beta característico, junto con la apariencia de las
fibrilas y las propiedades de tinción son ahora los sellos
diagnósticos aceptados de amiloide, y sugieren que las fibrilas,
aunque formadas a partir de precursores proteicos completamente
diferentes, comparten un grado de similitud estructural y comprenden
una superfamilia estructural, independientemente de la naturaleza de
sus proteínas precursoras (Sunde M, Serpell LC, Bartlam M, Fraser
PE, Pepys MB, Blake CCFJ Mol Biol 31 de octubre de 1997; 273 (3):
729 - 739).
Una de las enfermedades más extendidas y bien
conocidas en las que los depósitos de amiloides en el sistema
nervioso central se sugieren que tienen un papel central en la
progresión de la enfermedad es la AD.
La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno
cerebral irreversible, progresivo que se produce gradualmente y da
como resultado pérdida de memoria, cambios conductuales y de
personalidad, y deterioro de las capacidades mentales. Estas
pérdidas están relacionadas con la muerte de las células del cerebro
y la interrupción de las conexiones entre ellas. El curso de esta
enfermedad varía entre personas, como hace la velocidad de
deterioro. De promedio, las pacientes de AD viven 8 a 10 años
después de que se diagnostican, aunque la enfermedad puede durar
hasta 20 años.
La AD avanza por fases, desde falta de memoria
temprana, suave hasta una pérdida grave de función mental. Esta
pérdida se conoce como demencia. En la mayoría de las personas con
AD, los primeros síntomas aparecen después de la edad de los 60,
pero comienzos más tempranos no son infrecuentes. Los síntomas más
tempranos a menudo incluyen pérdida de memoria reciente, juicio
defectuoso, y cambios en personalidad. A menudo, las personas en las
fases iniciales de AD piensan menos claramente y olvidan los nombres
de personas familiares y objetos comunes. Más tarde en al
enfermedad, pueden olvidar cómo hacer incluso tareas sencillas.
Eventualmente, las personas con AD pierden toda la capacidad de
razonar y se hacen dependientes de otra persona para su cuidado cada
día. Por último, la enfermedad se hace tan debilitante que los
pacientes están postrados y probablemente desarrollan otra
enfermedad e infecciones. Lo más común, las personas con AD mueren
de neumonía.
Aunque el riesgo de desarrollar AD aumenta con
la edad, los síntomas de AD y demencia no son una parte del
envejecimiento normal. La AD y otros trastornos de demencia están
provocados por enfermedades que afectan al cerebro. En el
envejecimiento normal, las células nerviosas en el cerebro no se
pierden en grandes números. Por el contrario, la AD, altera sus
procesos claves: comunicación de células nerviosas, metabolismo, y
reparación. Esta alteración por último provoca que muchas células
nerviosas paren de funcionar, pierden conexiones con otras células
nerviosas, y mueren.
Al principio, la AD destruye neuronas en partes
del cerebro que controlan la memoria, especialmente en el hipocampo
y estructuras relacionadas. Como las células nerviosas en el
hipocampo dejan de funcionar correctamente, la memoria a corto plazo
falla, y a menudo, una capacidad de la persona que hace tareas
fáciles y familiares comienza a decaer. La AD también ataca al
cortex cerebral, particularmente las áreas responsables de lenguaje
y razonamiento. Eventualmente, están implicadas muchas otras áreas
del cerebro, todas estas regiones del cerebro se atrofian
(contracción), y el paciente de AD llega a estar postrado,
abandonado, totalmente imposibilitado, e insensible al mundo
exterior (fuente; National Institute on Aging Progress Report on
Alzheimer's Disease, 1999).
La AD es la causa más común de demencia entre
personas de 65 años de edad y mayor. Presenta un problema de salud
importante debido a su enorme impacto sobre individuos, familias, el
sistema de cuidado de salud, y sociedad como un conjunto. Los
científicos estiman que hasta 4 millones de personas actualmente
padecen la enfermedad, y la frecuencia se dobla cada 5 años por
encima de los 65 años de edad. También se estima que aproximadamente
360.000 nuevos casos (incidencia) se producirán cada año, aunque
este número se incrementará a medida que la población envejece
(Brookmeyer y col., 1998).
La AD supone un gravamen económico pesado en la
sociedad. Un estudio reciente en Los Estados Unidos estimaba que el
coste anual de cuidado para un paciente es 18.418 dólares para un
paciente con la AD suave, 30.096 dólares para un paciente con AD
moderada, y 36.132 dólares para un paciente con Ad grave. El coste
nacional anual de cuidado para los pacientes con la AD en los
Estados Unidos se estima que es ligeramente superior a los 50.000
millones de dólares (Leon y col., 1998).
Aproximadamente 4 millones de americanos son
mayores de 85 años, y en la mayoría de los países industrializados,
este grupo de edad es uno de los segmentos de crecimiento más rápido
de la población. Se estima que este grupo ascenderá a cerca de 8,5
millones el año 2030 en los Estados Unidos; algunos expertos que
estudian las tendencias de población sugieren que el número podría
ser incluso mayor. Cuanto más viven las personas, el número de
personas afectadas por estas enfermedades de envejecimiento,
incluyendo la AD, continuarán creciendo. Por ejemplo, algunos
estudios muestran cerca de la mitad de todas las personas de 85 años
y mayores tienen alguna forma de demencia. (National Institute on
Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Las estructuras anormales en el cerebro son los
sellos de la AD: placas amiloides de ovillos neurofibrilares (NFT).
Las placas son depósitos densos, insolubles en gran medida de
material proteico y celular fuera y alrededor de las neuronas del
cerebro. Los ovillos son fibras retorcidas insolubles que se
acumulan en las neuronas interiores.
Existen dos tipos de AD: AD familiar (FAD), que
sigue un cierto patrón de herencia, y AD esporádica, donde no se
observa ningún patrón obvio de herencia. Debido a las diferencias en
al edad de comienzo, la AD se describe adicionalmente como comienzo
temprano (produciéndose en personas menores de 65 años) o de
comienzo tardío (produciéndose en los de 65 años o mayores). La AD
de comienzo temprano es raro (aproximadamente 10 por ciento de los
casos) y generalmente afecta a personas con edades entre 30 y 60.
Algunas formas de AD de comienzo temprano son hereditarias y se
desarrollan en familias. La AD de comienzo temprano también a menudo
progresa más rápido que la forma más común, de comienzo tardío.
Todas las FAD hasta ahora tienen un comienzo
temprano, y como mucho el 50 por ciento de los casos de FAD se sabe
ahora que están provocadas por defectos en tres genes localizados en
tres cromosomas diferentes. Éstos son mutaciones en el gen APP sobre
el cromosoma 21; mutaciones en un gen sobre el cromosoma 14, llamado
presenilina 1; y mutaciones en un gen sobre el cromosoma 1, llamado
presenilina 2. Sin embargo, todavía no existe evidencia de que
cualquiera de estas mutaciones juegan un papel importante en la
forma más común, esporádica o no familiar de la AD de comienzo
tardío. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's
Disease, 1999).
\newpage
En la AD, las placas amiloides se desarrollan
primero en áreas del cerebro usadas para memoria y otras funciones
cognitivas. Constan de depósitos insolubles en gran medida de
amiloide beta (de aquí en adelante denominado A \beta) - un
fragmento de proteína precursora amiloide (APP, la secuencia de
aminoácidos que se establece en la SEC ID Nº 2) - entremezclado con
partes de neuronas y con células no nerviosas tales como microglía y
astrositos. No se sabe si las propias placas amiloides constituyen
la causa principal de la AD o si son un subproducto del proceso de
la AD. Ciertamente, cambios en la proteína APP puede provocar la AD,
como se muestra en la forma heredada de la AD provocada por
mutaciones en el gen APP, y la formación de la placa A\beta parece
que está estrechamente asociada a la progresión de la enfermedad
humana (Lippa C. F. y col., 1998).
La APP es una de las muchas proteínas que están
asociadas con las membranas celulares. Después de que está hecha, la
APP se llega a embeber en las membranas celulares nerviosas,
parcialmente en el interior y parcialmente en el exterior de la
célula. Recientes estudios que usan ratones transgénicos demuestran
que la APP parece que juega un papel importante en el crecimiento y
supervivencia de neuronas. Por ejemplo, ciertas formas y cantidades
de la APP pueden proteger neuronas contra tanto daño a corto como
largo plazo y pueden hacer que las neuronas dañadas sean capaces de
repararse mejor ellas mismas y ayudar a partes de neuronas a crecer
después de la lesión cerebral.
Mientras que la APP está embebida en al membrana
celular, las proteasas actúan en sitios particulares en la APP,
escindiéndose en fragmentos de proteínas. Otra proteasa ayuda a
escindir la APP para formar A\beta, y otra proteasa escinde la APP
en la mitad del fragmento amiloide de manera que no se pueda formar
A\beta. La A \beta formada es de dos longitudes diferentes, una
más corta de 40 (ó 41) aminoácidos A\beta que es relativamente
soluble y se agrega lentamente, y una ligeramente más larga, de 42
aminoácidos A\beta "pegajosa" que rápidamente forma grumos
insolubles. Mientras que la A\beta se está formando, no se sabe
exactamente cómo se mueve a través o alrededor de células nerviosas.
En las fases finales de este proceso, la A\beta "pegajosa" se
agrega en largos filamentos en el exterior de al célula, junto con
fragmentos de neuronas muertas y moribundas y la microglía y
astrocitos, forma las placas que son características de la AD en el
tejido cerebral.
Existe alguna evidencia de que las mutaciones en
la APP se obtienen más probablemente que la A\beta se recortarán
fuera del precursor de la APP, de este modo provocando o bien más
A\beta total o relativamente más de la forma "pegajosa" a
preparar. También parece que las mutaciones en al presenilina puede
contribuir a la degeneración de neuronas en al menos dos formas:
modificando la producción de más o desencadenando la muerte de
células más directamente. Otros investigadores sugieren que las
presenilinas 1 y 2 pueden estar implicadas en al aceleración de la
marcha de la apoptosis.
Se espera que a medida que la enfermedad
progresa, se formarán más y más placas, llenando más y más el
cerebro. Los estudios sugieren que puede ser que la A\beta se
agregue y desagregue al mismo tiempo, de un modo de equilibrio
dinámico. Esto eleva la esperanza de que pueda ser posible romper
las placas incluso después de que se formen. (National Institute on
Aging Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999).
Se cree que la A\beta es tóxica para las
neuronas. En estudios de cultivos de tejidos, los investigadores
observaron un incremento en la muerte de células neuronales del
hipocampo modificadas por ingeniería genética para sobreexpresan
formas mutadas de APP humana comparadas con neuronas que
sobreexpresan la APP humana normal (Luo y col., 1999).
Además, la sobreexpresión o la expresión de
formas modificadas de la proteína A\beta se ha demostrado en
modelos animales que induce síntomas de tipo Alzheimer, (Hsiao K. y
col., 1998).
Dado que la generación de A\beta se
incrementa, su agregación en placas, y la neurotoxicidad resultante
puede conducir a la AD, es de interés terapéutico investigar
condiciones bajo las que la agregación de A\beta en placas podría
ralentizarse o incluso bloquearse.
La mutaciones en la presenilina 1
(S-180) son responsables de casi el 50% de todos los
casos de AD familiar de comienzo temprano (FAD). Alrededor de 30
mutaciones se han identificado que dan lugar a la AD. El comienzo de
la AD varía con las mutaciones. Las mutaciones en la presenilina 2
son responsables de una parte mucho más pequeña de los casos de FAD,
pero es todavía un factor significante. Se sabe ahora si las
presenilinas están implicadas en AD no familiar esporádica. La
función de las presenilinas no se conoce, pero parece que están
implicadas en el procesamiento de APP para proporcionar
A\beta-42 (la forma más pegajosa más larga del
péptido, SEC ID Nº 2, residuos 673 - 714), ya que los pacientes de
AD con mutaciones de presenilina tienen niveles incrementados de
este péptido. No está claro si la presenilinas también tienen un
papel en la provocación de la generación de NFT. Algo sugiere que
las presenilinas podrían tener un papel más directo en la
degeneración de neuronas y muerte de neuronas. La presenilina 1 se
localiza en el cromosoma 14 mientras que la presenilina 2 esta
ligada al cromosoma 1. Si una persona alberga una versión mutada de
solo uno de estos genes él o ella es casi cierto que desarrolla la
AD de comienzo temprano.
Existe cierta incertidumbre de si la presenilina
1 es idéntica a la secretasa gama hipotética implicada en el
procesamiento de APP (Naruse y col., 1998).
La apolipoproteína E está usualmente asociada a
colesterol, pero también se encuentra en placas y ovillos de los
cerebros de la AD. Mientras que los alelos 1 - 3 no parece que estén
implicadas en la AD existe una correlación significativa entre la
presencia del alelo APOE-e4 y desarrollo de la AD
tardía (Strittmatter y col., 1993). Es, sin embargo, un factor de
riesgo y no una causa directa como es el caso para la presenilina y
las mutaciones de APP y no se limita a la AD familiar.
Las formas en los que la proteína de ApoE e4 de
aumentar la probabilidad de desarrollar la AD no se conocen con
certeza, pero una posible teoría es que facilita la acumulación de
A\beta y esto contribuye a ralentizar la edad de aparición de la
AD, o la presencia o ausencia de alelos de APOE particular puede
afectar la forma en que las neuronas responden a la lesión. (Buttini
y col., 1999).
También la Apo A1 se ha mostrado que es
amiloigénica. La apo A1 intacta puede ella misma formar fibrilas de
tipo amiloide in vitro que son rojo congo positivas (Am J.
Pathol 147 (2): 238 - 244 (agosto de 1995), Wisniewski T, Golabek
AA, Kida E, Wisniewiski KE, Frangione B).
Parecen existir resultados contradictorios que
indican que existe un efecto positivo del alelo
APOE-34 en la disminución de síntomas de pérdida
mental, comparado con otros alelos (Stern, Brandt, 1997, Annals of
Neurology 41).
Este segundo sello de la AD consta de
colecciones anormales de hebras retorcidas encontradas en el
interior de las células nerviosas. El componente principal de los
ovillos es una forma de una proteína llamada tau (t). En el sistema
nervioso central, las proteínas tau se conocen mejor por su
capacidad de unirse y ayudar a estabilizar los microtúbulos, que
son un constituyente de la estructura de soporte interno, o
esqueleto de las células. Sin embargo, en la AD la tau se cambia
químicamente, y esta tau alterada no puede estabilizar más los
microtúbulos, provocando que se desintegren. Este colapso del
sistema de transporte puede al principio dar como resultado
malfunciones en la comunicación entre células nerviosas y puede más
tarde conducir a la muerte de neuronas.
En la AD, la tau químicamente alterada se
retuerce en dos hebras de filamentos helicoidales apareados de tau
que se enrollan entre sí. Estos filamentos son la principal
sustancia encontrada en los ovillos neurofibrilares. En un estudio
reciente, los investigadores encontraron cambios neurofibrilares en
menos de 6% de las neuronas en una parte particular del hipocampo en
cerebros sanos, en más del 43 por ciento de estas neuronas de las
personas que murieron con AD suave, y en 71 por ciento de estas
neuronas de personas que murieron con AD grave. Cuando se estudió
la pérdida de neuronas, se encontró una progresión similar.
Evidencia de este tipo soporta la idea de que la formación de
ovillos y al pérdida de neuronas progresa junto con el curso de la
AD. (National Institute on Aging Progress Report on Alzheimer's
Disease, 1999).
Varias enfermedades neurodegenerativas,
distintas de la AD, se caracterizan por la agregación de tau en
filamentos insolubles en neuronas y glia, conduciendo a disfunción y
muerte. Muy recientemente, varios grupos de investigadores, que
estuvieron estudiando familias con una variedad de demencias
hereditarias distintas de AD, encontraron las primeras mutaciones en
el gen tau sobre el cromosoma 17 (Clark y col., 1998; Hutton y col.,
1998; Poorkaj y col., 1998; Spillantini y col., 1998). En estas
familias, las mutaciones en el gen tau provocan muerte celular
neuronal y demencia. Estos trastornos que comparten algunas
características con la AD pero difieren en varios respectos
importantes, se llaman colectivamente "demencia frontotemporal y
parkinsonismo ligado al cromosoma 17" (FTDP-17).
Son enfermedades tales como enfermedad de Parkinson, algunas formas
de esclerosis lateral amiotrófica (ALS), degeneración corticobasal,
parálisis supranuclear progresiva, y enfermedad de Pick, y todas
están caracterizadas por la agregación anormal de la proteína
tau.
Existen importantes paralelismos entre la AD y
otras enfermedades neurológicas, incluyendo enfermedades de priones
(tales como kuru, enfermedad de Creutzfeld - Jacob y encefalitis
espongiforme bovina), enfermedad de Parkinson, enfermedad de
Huntington, y demencia frontotemporal. Todo implica depósitos de
proteínas anormales en el cerebro. La AD y enfermedades de priones
provocan demencia y muerte, y ambas están asociadas con la formación
de fibrilas amiloides insolubles, pero de proteínas de membrana que
son diferentes entre sí.
Los científicos que estudian la enfermedad de
Parkinson, el segundo trastorno neurodegenerativo más común después
de AD, descubrieron el primer gen ligado a la enfermedad. Este gen
codifica una proteína llamada sinucleína, que, de manera
desconcertante, también se encontró en las placas amiloides de los
cerebros de pacientes de AD (Lavedan C, 1998, Genome Res. 8 (9): 871
- 80). Los investigadores también descubrieron que defectos
genéticos en la enfermedad de Huntington, otro trastorno
neurodegenerativo progresivo que provoca demencia, provocan que la
proteína de Huntington forme fibrilas insolubles muy similares a las
fibrilas A\beta de la AD y las fibrilas proteicas de la enfermedad
de priones, (Scherzinger E, y col., 1999, PNAS Estados Unidos 96
(8): 4604 - 9):
Los científicos también han descubierto un gen
novedoso, que cuando muta, es responsable de la demencia familiar
británica (FBD), una enfermedad heredada rara que provoca
trastornos de movimiento graves y demencia progresiva similar a la
observada en la AD. En un análisis bioquímico de las fibrilas
amiloides encontradas en las placas de FBD, se encontró un único
péptido llamado ABri (Vidal y col., 1999). Una mutación en un punto
particular junto con este gen da como resultado la producción de una
proteína Bri más larga que la normal. El péptido ABri, que es una
forma recortada del extremo mutado de la proteína Bri se deposita
como fibrilas amiloides. Estas placas se piensa que conducen a la
disfunción neuronal y demencia que caracteriza FBD.
El sistema inmune normalmente tomará parte en la
eliminación de proteína extraña y partículas proteináceas en el
organismo pero los depósitos asociados a las enfermedades
anteriormente mencionadas constaban principalmente de auto -
proteínas, por lo tanto haciendo que el papel del sistema inmune en
el control de estas enfermedades sea menos obvio. Además, los
depósitos se localizan en un compartimiento (el SNC) separado
normalmente del sistema inmune, sugiriendo ambos hechos que
cualquier vacuna o planteamiento inmunoterapéutico sea ineficaz.
Sin embargo, los científicos recientemente han
intentado inmunizar ratones con una vacuna compuesta de A\beta
humana heteróloga y una sustancia conocida que excita el sistema
inmune (Schenk y col., 1999 y el documento WO 99/27944). La vacuna
se ensayó en un modelo de ratón transgénico parcial de la AD con un
gen mutado humano para la APP insertada en el ADN del ratón. El
ratón produjo la proteína APP modificada y desarrolló placas
amiloides a medida que envejecían. Este modelo de ratón se usó para
ensayar si la vacunación contra la APP humana transgénica modificada
tenía un efecto en la aparición de placas. En un primer experimento,
a un grupo de ratones transgénicos se proporcionaron inyecciones
mensuales de la vacuna comenzando a las 6 semanas de edad y
terminando a los 11 meses. Un segundo grupo de ratones transgénicos
no recibió ninguna inyección y sirvió como grupo control. A los 13
meses de edad, los ratones en el grupo control tenían placas que
cubren el 2 a 6 por ciento de sus cerebros. Por el contrario, los
ratones inmunizados no tenían virtualmente placas.
En un segundo experimento, los investigadores
comenzaron las inyecciones a los 11 meses, cuando algunas placas ya
se habían desarrollado. Durante un período de 7 meses, los ratones
transgénicos control tenían un incremento de 17 veces en la cantidad
de placa en sus cerebros, mientras que los que recibieron la vacuna
tenían un 99 por ciento de disminución comparado con los ratones
transgénicos control de 18 meses. En algunos ratones, alguno de los
depósitos de placas preexistentes parecían haberse eliminado por el
tratamiento. También se encontró otro daño asociado a placas, tal
como inflamación y procesos de células nerviosas anormales,
disminuyendo como resultado de la inmunización.
Lo mencionado anteriormente es de esta manera un
estudio preliminar en ratones y por ejemplo, los científicos
necesitan encontrar si los ratones vacunados permanecen sanos en
otros respectos y si la memoria de los vacunados permanece normal.
Además, debido a que el modelo de ratón no es una representación
completa de la AD (los animales no desarrollan ovillos
neurofibrilares ni ninguna de sus neuronas muere), estudios
adicionales serán necesarios para determinar si los seres humanos
tienen una reacción similar o diferente de los ratones. Otra
cuestión a considerar es que el procedimiento puede quizás
"curar" la deposición amiloide pero no detiene el desarrollo de
la demencia.
Cuestiones técnicas presentan también desafíos
importantes. Por ejemplo, es improbable que sea incluso imposible,
usando esta tecnología, crear una vacuna que permita que los seres
humanos induzca anticuerpos contra sus propias proteínas. Así
numerosas cuestiones de seguridad y eficacia necesitarán ser
resueltos antes de que se pueda considerar cualquier ensayo en seres
humanos.
El trabajo de Schenk y col., muestra de esta
manera que si era posible generar una respuesta inmune fuerte hacia
las auto - proteínas en los depósitos proteináceos en el sistema
nervioso central tal como las placas formadas en la AD, es posible
prevenir tanto la formación de los depósitos como posiblemente
también eliminar las placas ya formadas.
Recientemente, ensayos clínicos que usan las
vacunas de A\beta descritas anteriormente se han terminado debido
a efectos adversos: un número de los sujetos vacunados desarrollaron
encefalitis crónica que se puede deber a una autoinmunidad no
controlada contra A\beta en el SNC.
El objeto de la presente invención es
proporcionar terapias novedosas contra afecciones caracterizadas por
la deposición de amiloide, tal como la AD. Un objeto adicional de la
presente invención es desarrollar una autovacuna contra amiloide,
con el fin de obtener un tratamiento novedoso para la AD y para
otros trastornos patológicos que implican deposición de
amiloide.
\newpage
En esta memoria descriptiva se describe el uso
de una tecnología de autovacunación para generar fuertes respuestas
inmunes contra o bien la APP y A\beta. También se describe la
preparación de tales vacunas para la prevención, posible cura o
alivio de los síntomas de tales enfermedades asociados con depósitos
de amiloide.
De este modo, en su alcance más amplio y más
general, la presente invención se refiere al uso de un inmunógeno,
que
- a)
- es un poliaminoácido que incorpora en la misma molécula una fracción sustancial de epítopes de células B de APP y/o A\beta de manera que el poliaminoácido reacciona hasta el mismo grado que lo hace la APP o A\beta con un suero policlonal inducido contra APP o A\beta, y al menos un epítope T auxiliar extraño (epítope T_{H}), y que contiene al menos un epítope T_{H} extraño y una secuencia rota de APP o A\beta de manera que el poliaminoácido no incluye ninguna subsecuencia de la SEQ ID Nº: 2 que se une de manera productiva a las moléculas de clase II de MHC que inicia una respuesta de célula T; o
- b)
- es un conjugado que comprende una estructura central de polihidroxipolímero al que está acoplado un poliaminoacido como se ha definido en a); o
- c)
- es un conjugado que comprende una estructura central de polihidroxipolímero al que está acoplado separadamente 1) el al menos un epítope T_{H} extraño y 2) una secuencia rota de APP o A\beta como se ha definido en a); o
- d)
- es un ácido nucleico que codifica el poliaminoácido como se ha definido en a); o
- e)
- es un microorganismo no patógeno o virus que lleva un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el poliaminoácido como se ha definido en a),
en la preparación de una preparación
farmacéutica que contiene el inmunógeno para el tratamiento,
prevención o mejora en un animal de la enfermedad de Alzheimer u
otras enfermedades caracterizadas por la deposición de amiloide.
El presente cesionario ha presentado previamente
una solicitud de patente internacional referida a estrategias de
vacunación segura contra polipéptidos amiloidogénicos tales como APP
y A\beta, véase el documento 01/62284. Esta solicitud no contiene
detalles con relación a los análogos útiles mencionados
anteriormente de APP y A\beta.
La invención también se refiere a APP y A\beta
así como a fragmentos de ácidos nucleicos que codifican un
subconjunto de éstos. También las composiciones inmunógenas que
comprenden los análogos o fragmentos de ácidos nucleicos son parte
de la invención.
Fig. 1: Muestra esquemática de variantes Autovac
derivadas de la proteína precursora amiloide con el propósito de
generar respuestas de anticuerpo contra la proteína A\beta
A\beta-43 (o C-100). La APP se
muestra esquemáticamente en la parte superior de las figuras y las
construcciones esquemáticas restantes muestran que los epítopes P2 y
P30 de modelo están sustituidos o insertados en diversos
truncamientos de la APP. En la figura, el patrón negro indica la
secuencia señal de APP, los rasgos verticales oscuros son el dominio
transmembrana de la APP, los rasgos verticales claros son el dominio
intracelular de la APP, los rasgos de trazo grueso cruzado indican
el epítope P30, y los rasgos de trazo cruzado fino indican el
epítope P2. La casilla de línea rellena indica
A\beta-42/43 y la casilla de línea rellena y la
casilla de línea de puntos juntas indican C-100.
"Abeta" designa A\beta.
Fig. 2: Muestra esquemática de una realización
de la síntesis de conjugados inmunógenos generalmente aplicables. El
péptido A (cualquier secuencia antigénica, por ejemplo una secuencia
de A\beta descrita en esta memoria descriptiva) y el péptido B
(una secuencia de aminoácidos que incluye un epítope auxiliar T
extraño se sintetizan y se mezclan. Después de eso se ponen en
contacto con un polihidroxipolímero activado adecuado, los péptidos
A y B se unen mediante el grupo de activación en una relación que
corresponde a la relación inicial entre estas dos sustancias en la
mezcla de péptidos. Véase el ejemplo 4 para detalles.
En lo que se describe a continuación un número
de términos usados en la presente memoria descriptiva y
reivindicaciones se definirán y explicarán en detalle con el fin de
clarificar los límites y confines de la invención.
Los términos "amiloide" y "proteína
amiloide" que se usan indistintamente en esta memoria descriptiva
denotan una clase de fibrilas no ramificadas proteináceas de
longitud indeterminada. Las fibrilas amiloides muestran tinción
característica con rojo Congo y comparten una estructura transversal
\beta en la que la cadena polipeptídica está organizada en hojas
\beta. El amiloide generalmente se deriva de proteínas
amiloidogénicas que tienen estructuras precursoras muy diferentes
pero que todas pueden experimentar una conversión estructural a una
forma mal plegada que es el bloque de construcción del
protofilamento de hélice de hoja \beta. Normalmente, el diámetro
de las fibrilas amiloides varía entre aproximadamente 70 y
aproximadamente 120 \ring{A}.
El término "proteína amiloidogénica"
pretende indicar un polipéptido que está implicado en al formación
de depósitos de amiloides, siendo o bien parte de los depósitos como
tal c siendo parte de la ruta biosintética que conduce a la
formación de los depósitos. Por lo tanto, los ejemplos de proteínas
amiloidogénicas son APP y A\beta, pero también las proteínas
implicadas en el metabolismo de éstas pueden ser proteínas
amiloidogénicas. En esta memoria descriptiva se describen en detalle
un número de polipéptidos amiloidogénicos.
Un "polipéptido amiloide" en esta memoria
descriptiva pretende indicar polipéptidos que comprenden la
secuencia de aminoácidos de las proteínas amiloidogénicas descritas
ene esta memoria descriptiva derivadas de mamíferos humanos u otros
(o truncamientos de los mismos que comparten una cantidad
sustanciadle epítopes de células B con una proteína amiloidogénica
intacta) - por lo tanto un polipéptido amiloidogénico puede por
ejemplo, comprender partes sustanciales de un precursor para el
polipéptido amiloidogénico (en el caso de A\beta, un posible
polipéptido amiloide podría ser derivado de la APP). También las
formas no glucosiladas de polipéptidos amiloidogénicos que se
preparan en el sistema procariótico están incluidas dentro de los
límites del término como son las formas que tienen patrones de
glucosilación debido al uso de por ejemplo, levaduras u otros
sistemas de expresión eucarióticos no mamíferos. Sin embargo, se
debe observar que cuando se usa el término "un polipéptido
amiloidogénico" se pretende que el polipéptido en cuestión sea
normalmente no inmunógeno cuando se presenta al animal a tratar. En
otras palabras, el polipéptido amiloidogénico es una auto - proteína
o es un análogo de tal auto - proteína que normalmente no dará lugar
a una respuesta inmune contra el amiloidogénico del animal en
cuestión.
Un "análogo" es una molécula derivada de
APP o de A\beta que incorpora uno o varios cambios en su
estructura molecular. Tal cambio puede, por ejemplo, estar en la
forma de fusión de poliaminoácidos de APP o A\beta a una pareja de
fusión adecuada (es decir, un cambio en la estructura primaria que
implica exclusivamente adiciones en terminal C- y/o N de residuos de
aminoácidos) y/o pueden estar en forma de inserciones y/o
supresiones y/o sustituciones en la secuencia del aminoácido del
polipéptido. También abarcadas por el término están las moléculas
derivadas de APP o de A\beta, véase la descripción más delante de
las modificaciones de APP o A\beta. En algunos casos el análogo se
puede construir de manera que sea menos capaz o incluso incapaz de
generar anticuerpos contra la proteína (s) precursora (s) del
amiloide normal (es), por lo tanto evitando la interferencia no
deseada con la forma no agregada (fisiológicamente normal) del
polipéptido que es un precursor de la proteína amiloide.
Se debe observar que el uso como una vacuna en
un ser humano de un xeno - análogo (por ejemplo, un análogo canino o
porcino) de una APP o A\beta se puede imaginar que produce la
inmunidad deseada contra APP o A\beta. Tal uso de un xeno -
análogo para inmunización también se considera parte de la
invención.
El término "polipéptido" en el presente
contexto pretende significar tanto péptidos cortos de entre 2 y 10
residuos de aminoácidos, oligopéptidos de entre 11 y 100 restos de
aminoácidos, como polipéptidos de más de 100 restos de aminoácidos.
Además el término también pretende incluir proteínas, es decir
biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido;
cuando comprendiendo al menos dos polipéptidos, estos pueden formar
complejos, estar unidos covalentemente, o pueden estar unidos no
covalentemente. El (los) polipéptido (s) en una proteína se puede
glucosilar y/o lipidar y/o comprender grupos prostéticos. También el
término "poliaminoácido" es un equivalente al término
"polipéptido".
Los términos "linfocito T" y "célula
T" se usarán indistintamente para linfocitos de origen tímico que
son responsables de diversas respuestas inmunes mediadas por células
así como para actividad auxiliar en la respuesta inmune humoral. Del
mismo modo, los términos "linfocito B" y "célula B" se
usarán indistintamente para linfocitos que producen anticuerpos.
El término "subsecuencia" significa
cualquier tramo de al menos 3 aminoácidos o, cuando sea relevante,
de al menos 3 nucleótidos, derivados directamente de una secuencia
de aminoácidos amiloide de origen natural, respectivamente.
El término "animal" en el presente contexto
en general propone denotar una especie animal (preferiblemente
mamífero), tal como Homo sapiens, Canis domesticus, etc, y no
un único animal. Sin embargo, el término también denota una
población de tal especie animal, ya que es importante que los
individuos inmunizados de acuerdo con el procedimiento de la
invención alberguen todos sustancialmente el mismo polipéptido
amiloidogénico que permite inmunización de los animales con el (los)
mismo (s) inmunógeno (s). Si, por ejemplo, existen variantes del
polipéptido amiloidogénico en diferente población humana puede ser
necesaria usar imunógenos diferentes en estas poblaciones diferentes
con el fin de ser capaz de romper la autotolerancia hacia el
polipéptido amiloidogénico en cada población de una manera óptima.
Será evidente para la persona experta que un animal en el presente
contexto es un ser vivo que tiene un sistema inmune. Se prefiere que
el animal sea un vertebrado tal como un animal.
Por el término "regulación hacia abajo in
vivo de APP o A\beta" se entiende en esta memoria
descriptiva la reducción en el organismo vivo de la cantidad total
de proteína amiloide depositada (o amiloide como tal) del tipo
relevante. La regulación hacia abajo se puede obtener por medio de
varios mecanismos: de éstos, la simple interferencia con amiloide
mediante la unión de anticuerpo para prevenir la falsa agregación es
la más sencilla. Sin embargo, también está dentro del alcance de la
presente invención que el la unión a anticuerpo de cómo resultado la
eliminación del amiloide por células depuradoras (tal como
macrofágos y otras células fagocíticas) y que los anticuerpos
interfieren con otros polipéptidos amiloidogénicos que conducen a la
formación de amiloide. Una posibilidad adicional es que los
anticuerpos se unan a A\beta en el exterior del SNC, retirando por
lo tanto de manera eficaz A\beta del SNC mediante un principio de
acción de masas simple.
La expresión "efectuando la presentación… al
sistema inmune" pretende denotar que el sistema inmune del animal
se somete a una estimulación inmunógena de una manera controlada.
Como será evidente a partir de la descripción a continuación, tal
estimulación del sistema inmune se poseed efectuar en un número de
formas de las que la más importante son vacunación con
"farmacinas" (es decir, una vacuna que se administra para
tratar o mejorar una enfermedad en curso) o vacunación de
"farmacina" de ácido nucleico. El resultado importante para
lograrlo es que las células competentes inmunes en el animal se
confronten con el antígeno de una manera inmunológicamente eficaz,
mientras que el modo preciso de lograr este resultado es de menos
importancia para la idea de invención que subyace la presente
invención.
El término "cantidad inmunológicamente
eficaz" tiene su significado usual en la técnica, es decir, una
cantidad de un inmunógeno, que es capaz de inducir una respuesta
inmune que engrana agentes patógenos que comparten características
inmunológicas con el inmunógeno.
Cuando se usa la expresión de que el polipéptido
amiloidogénico se ha "modificado" quiere significar en esta
memoria descriptiva una modificación química del polipéptido, que
constituye la estructura central del polipéptido amiloidogénico.
Tal modificación puede, por ejemplo, ser la derivatización por
ejemplo, alquilación) de ciertos restos de aminoácidos en la
secuencia del polipéptido amiloidogénico, pero como se apreciará a
partir de la descripción más adelante, las modificaciones preferidas
comprenden cambios de la estructura primaria de la secuencia de
aminoácidos.
Cuando se describe "autotolerancia hacia APP o
A\beta" se entiende que ya que el polipéptido es una auto -
proteína en la población a vacunar, individuos normales en la
población no montan una respuesta inmune contra el polipéptido
amiloidogénico; sin embargo, no se puede excluir que los individuos
ocasionales en una población animal podría ser capaz de producir
anticuerpos contra polipéptido amiloidogénico nativo, por ejemplo,
como parte de un trastorno autoinmune. De cualquier forma, un animal
no solamente será autotolerante hacia su propia APP o A\beta, pero
no se puede excluir que los análogos derivados de otra especie
animal o de una población que tiene un fenotipo diferente también se
toleraría por dicho animal.
Un "epítope de células T extraño" (o:
"epítope de linfocitos T extraño") es un péptido que es capaz
de unirse a una molécula de MHC y que estimula las células T en una
especie animal. Los epítopes de células T extraños en la invención
son epítopes "promiscuos", es decir que se unen a una fracción
sustancial de una clase particular de moléculas de MHC en una
especie o población animal. Solamente se conocen un número muy
limitado de tales epítopes de células T promiscuos, y se describirán
en detalle más adelante. Los epítopes de células T promiscuos
también se denominan epítopes de células "universales". Se debe
observar que con el fin de que los inmunógenos que se usan de
acuerdo con la presente invención sean eficaces en una fracción de
de una población animal tanto como sea posible, puede ser necesario
1) insertar varios epítopes de las células T extraños en el mismo
análogo o 2) preparar varios análogos en los que cada análogo tiene
insertado un epítope promiscuo diferente. Se debe observar que el
concepto de epítopes de células T extraños también abarca el uso de
epítopes de células T crípticos, es decir, epítopes que se derivan
de una auto - proteína y que solamente ejerce un comportamiento
inmunógeno cuando existe en forma aislada sin ser parte de la auto -
proteína en cuestión.
Un "epítope de linfocitos auxiliares T
extraño" (un epítope T_{H} extraño) es un epítope de células T
extraño, que une una molécula de clase II de MHC y se puede
presentar sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno
(APC) unida a la molécula de clase II de MHC.
Una "parte funcional" de una
(bio)molécula en el presente contexto pretende significar la
parte de la molécula que es responsable de al menos uno de los
efectos bioquímicos o fisiológicos ejercidos por la molécula. Se
sabe bien en la técnica que muchas enzimas y otras moléculas
efectoras tienen un sitio activo que es responsable de los efectos
ejercidos por la molécula en cuestión. Otras partes de la molécula
pueden servir como un propósito estabilizador o potenciador de
solubilidad y por lo tanto puede excluirse si estos propósitos no
son de relevancia en el contexto de una cierta realización de la
presente invención. Por ejemplo es posible usar ciertas citoquinas
como un resto modificador en una APP o A\beta (véase la
descripción detallada más adelante), y en tal caso, la cuestión de
estabilidad puede ser irrelevante ya que el acoplamiento a APP o
A\beta puede proporcionar la estabilidad necesaria.
El término "adyuvante" tiene su significado
usual en al técnica de la tecnología de vacuna, es decir, una
sustancia o una composición de material que es 1) no en sí mismo
capaz de montar una respuesta inmune específica contra el inmunógeno
de la vacuna, pero que es 2) no obstante capaz de potenciar la
respuesta inmune contra el inmunógeno. O en otras palabras,
vacunación con el adyuvante solo no proporciona una respuesta inmune
o puede no dar lugar a una respuesta inmune contra el inmunógeno,
pero la vacunación combinada con inmunógeno y adyuvante induce una
respuesta inmune contra el inmunógeno que es más fuerte que el
inducido por el inmunógeno solo.
\newpage
"Dirección" de una molécula pretende
denotar en el presente contexto la situación en la que una molécula
tras la introducción en el animal aparece preferentemente en cierto
(s) tejido (s) o estará preferiblemente asociada a ciertas células o
tipos de células. El efecto se puede lograr de un número de formas
que incluye formulación de la molécula en composición que facilita
la dirección o mediante la introducción en la molécula de grupos,
que facilitan la dirección. Estos asuntos se discutirán en detalle
más adelante.
"Estimulación del sistema inmune" significa
que una sustancia o composición de material muestra un efecto
general, no específico inmunoestimulador. Un número de adyuvantes y
adyuvantes supuestos (tal como ciertas citoquinas) comparten la
capacidad de estimular el sistema inmune. El resultado de usar un
agente inmunoestimulador es un aumento de "vigilancia" del
sistema inmune que significa que la inmunización simultánea o
posterior con un inmunógeno induce una respuesta inmune
significativamente más eficaz comparada con el uso aislado del
inmunógeno.
"Unión productiva" significa la unión de un
péptido a la molécula de MHC (Clase I o II) de manera que sea capaz
de estimular las células T que se acoplan a una célula que presentan
el péptido unido a la molécula de MHC. Por ejemplo, un péptido unido
a una molécula de Clase II de MHC en la superficie de un APC se dice
que se une de manera productiva si esta APC estimulará una célula
T_{H} que se une al complejo péptido - Clase II de MHC.
El análogo usado como inmunógeno en el uso de la
invención es una molécula de APP o A\beta modificada en la que
está presente al menos un cambio en la secuencia de aminoácidos de
APP o A\beta, ya que las posibilidades de obtener la ruptura
importante total de autotolerancia se facilita en gran medida de esa
forma - es decir, por ejemplo, evidente a partir de los resultados
presentados en el ejemplo 2 comparativo en esta memoria descriptiva,
cuando la inmunización con la A\beta de tipo salvaje se compara
con la inmunización con una molécula variante de A\beta. Se ha
mostrado (en Dalum I y col., 1996, J. Immunol. 157: 4796 - 4804) que
los linfocitos B potencialmente auto - reactivos que reconocen las
auto - proteínas están fisiológicamente presentes en individuos
normales. Sin embargo, con el fin de que estos linfocitos B se
induzcan para que se produzcan realmente anticuerpos reactivos con
las auto - proteínas relevantes, se necesita asistencia de los
linfocitos auxiliares T que producen citoquinas (células T_{H} o
linfocitos T_{H}). Normalmente esta ayuda no se proporciona debido
a que los linfocitos T en general no reconocen los epítopes de las
células T derivadas de auto proteínas cuando se presentan por las
células presentadoras de antígeno (APCs). Sin embargo,
proporcionando un elemento de "extrañeza" en una auto -
proteína (es decir, introduciendo una modificación inmunológicamente
significativa), las células T que reconocen el elemento extraño se
activan tras reconocer el epítope extraño sobre un APC (tal como,
inicialmente, una célula mononuclear). Los linfocitos B
policlonales (que también son APCs) capaces de reconocer auto -
epítopes sobre la auto - proteína modificada también internaliza el
antígeno y posteriormente presenta el (los) epítope (s) de las
células T extraño (s) de los mismos, y los linfocitos T activados
posteriormente proporcionan ayuda de las citoquinas a estos
linfocitos B policlonales auto - reactivos. Ya que los anticuerpos
producidos por estos linfocitos B policlonales son reactivos con
diferentes epítopes sobre el polipéptido modificado, incluyendo
aquellos que también están presentes en el polipéptido nativo, se
induce una reacción cruzada de anticuerpo con la auto - proteína no
modificada. En conclusión, los linfocitos T pueden conducir a actuar
como si la población de los linfocitos B policlonales hayan
reconocido un antígeno extraño enteramente, mientras que de hecho
solamente el (los) epítope (s) insertado (s) es / son extraño (s)
para el huésped. De esta forma, se inducen los anticuerpos capaces
de reaccionar de manera cruzada con los auto - antígenos no
modificados.
Se conocen en la técnica varias formas de
modificar un auto - antígeno peptídico con el fin de obtener la
rotura de autotolerancia. Por lo tanto, de acuerdo con la invención,
la modificación puede incluir que
- -
- al menos un primer resto se introduce que efectúa la dirección de la molécula modificada a una célula presentadora de antígenos (APC), y/o
- -
- al menos un segundo resto se introduce que estimula el sistema inmune, y/o
- -
- al menos un tercer resto se introduce que optimiza la presentación del polipéptido amiloidogénico modificado al sistema inmune
Sin embargo, todas estas modificaciones se deben
llevar a cabo mientras se mantiene una fracción sustancial de los
epítopes de los linfocitos B originales en la APP o A\beta, ya que
por lo tanto se potencia el reconocimiento de los linfocitos B de la
molécula nativa.
En una realización preferida, los grupos
secundarios (en la forma de epítopes de las células T extraños o el
primer, segundo y tercer resto mencionado anteriormente) están
covalente o no covalentemente introducidos. Esto significa que los
tramos de los residuos de aminoácidos derivados de la APP o A\beta
se derivaticen sin alterar la secuencia primaria de aminoácidos, o
al menos sin introducir cambios en los enlaces peptídicos entre los
aminoácidos individuales en la cadena.
Una realización alternativa, y preferida utiliza
la sustitución de aminoácidos y/o supresión y/o adición (que se
puede efectuar por medios recombinantes o por medio de síntesis de
péptidos. Una versión especialmente preferida se esta realización es
la técnica descrita en el documento WO 95/05849, que describe un
procedimiento para regular hacia abajo las auto - proteínas
inmunizando con análogos de las auto - proteínas en las que un
número de secuencias de aminoácidos se ha sustituido con un número
correspondiente de secuencia (s) de aminoácidos que comprende cada
una un epítope de células T inmunodominante extraño, mientras que al
mismo tiempo mantiene la estructura terciaria global de la auto -
proteína en el análogo. Para los propósitos de la presente
invención, es sin embargo suficiente si la modificación (sea una
inserción, adición, supersigno sustitución) da lugar a un epítope
de células T extraño y al mismo tiempo preserva un número sustancial
de epítopes de células B en APP o A\beta. Sin embargo, con el fin
de obtener máxima eficacia de la respuesta inmune inducida, se
prefiere que la estructura terciaria global de APP o A\beta se
mantenga en la molécula modificada.
En algunos casos se prefiere que la APP o
A\beta o fragmentos de los mismos estén mutados. Especialmente
preferidas son variantes de sustitución en las que la metionina en
la posición 35 en A\beta - 43 está sustituida, preferiblemente con
leucina o isoleucina, o simplemente suprimida. Los análogos
especialmente preferidos contienen una única metionina que está
localizada en el extremo C, o bien porque es de origen natural en el
polipéptido amiloidogénico o epítope T_{H} extraño, o porque se ha
insertado o añadido. Por lo tanto, también se prefiere que la parte
del análogo que incluye el epítope T_{H} extraño esté sin
metionina, excepto de la posible localización C - terminal de una
metionina.
La principal razón para retirar todo excepto una
metionina es que llega a ser posible preparar de manera recombinante
análogos multiméricos que se pueden posteriormente escindir mediante
cianogenbromuro para dejar los análogos individuales. La ventaja
es, que la producción recombinante de llega a facilitar de esta
manera.
De hecho, en general se prefiere que todos los
análogos de APP o A\beta que se usan de acuerdo con la presente
invención comparten la característica de incluir solamente una sola
metionina que está posicionada en el aminoácido C - terminal en el
análogo y que otra metionina en o bien el polipéptido amiloidogénico
o el epítope T_{H} extraño están suprimidos o sustituidos por otro
aminoácido.
Una mutación interesante adicional es una
supresión o sustitución de de la fenilalanina en la posición 19 en
A\beta - 43, y se prefiere especialmente que la mutación sea una
sustitución de de este residuo de fenilalanina con una prolina.
Otros poliaminoácidos interesantes a usar en los
análogos son partes truncadas de la proteína A\beta - 43. Esto
también se puede emplear en análogos inmunógenos de acuerdo con la
presente invención. Se prefieren especialmente los truncados
A\beta (1 - 42), v (1 - 40), A\beta (1 - 39), A\beta (1 - 35),
A\beta (1 - 34), A\beta (1 - 28), A\beta (1 - 12), A\beta (1
- 5), A\beta (13 - 28), A\beta (13 - 35), A\beta (17 - 28),
A\beta (25 - 35), A\beta (35 - 40), A\beta (36 - 42) y
A\beta (35 - 42) (donde los números entre paréntesis indican los
tramos de aminoácidos de A\beta - 43 que constituye en fragmento
relevante - A\beta (35 - 40) es por ejemplo idéntico a los
aminoácidos 706 - 711 en la SEQ ID Nº: 2). Todas estas variantes con
las partes truncadas de A\beta - 43 se puede hacer con los
fragmentos A\beta descritos en esta memoria descriptiva, en
particular con las variantes 9, 10, 11, 12 y 13 mencionadas en el
ejemplo 1.
La siguiente fórmula describe las construcciones
moleculares generalmente cubiertas por la invención:
(I)(MOD_{1}) _{s1}
(amiloide _{e1}) _{n1} (MOD_{2}) _{s2} (amiloide _{e2}) _{n2} ...
(MOD_{x}) _{sx} (amiloide _{ex})
_{nx}
donde amiloide _{e1} - amiloide
_{ex} son x epítope de células B que contienen subsecuencias de
APP o A\beta que son independientemente idénticos o no idénticos y
que pueden contener o no contener grupos secundarios extraños, x es
un número entero \geq 3, n1 - nx son x números enteros \geq 0
(al menos uno es \geq 1), MOD_{1} - MOD_{x} don x
modificaciones introducidos entre los epítopes de células B
preservados, y s_{1} - s_{x} son x números enteros \geq 0 (al
menos uno es \geq 1 si no se introducen grupos secundarios en las
secuencias de amiloide _{ex}). De este modo, dadas las
restricciones funcionales generales sobre la inmunogenicidad de las
construcciones, la invención permite toda clase de permutaciones de
la secuencia original de la APP o A\beta, y todas las clases de
modificaciones en ella. De este modo, se incluyen en la invención
APP o A\beta obtenidas por omisión de partes de la secuencia que
por ejemplo muestran efectos adversos in vivo u omisión de
partes que son normalmente intracelulares y de este modo puede dar
lugar a reacciones inmunológicas
indeseadas.
Una versión preferida de las construcciones
esquematizadas anteriormente son, cuando son aplicables, aquellas en
las que el epítope de las células B que contiene la subsecuencia de
una proteína amiloide no se expone extracelularmente en el
polipéptido precursor de la que se deriva el amiloide. Realizando
tal elección de los epítopes amiloides, se asegura que los
anticuerpos no se generan de manera que fueran reactivos con las
células que producen el precursor amiloide y por lo tanto la
respuesta inmune que se genera se limita a una respuesta inmune
contra los depósitos amiloides no deseados. Una selección similar
puede, cuando es aplicable, hacerse para otros polipéptidos
amiloidogénicos aparte de amiloide. Por ejemplo, en estos casos,
será factible inducir inmunidad contra epítopes del polipéptido
amiloidogénico que solamente están expuestos a la fase extracelular
cuando están libres de cualquier acoplamiento a las células a partir
de las que se producen.
El mantenimiento de una fracción sustancial de
los epítopes de las células B o incluso la estructura terciaria
global de una proteína que se somete a modificación como se describe
en esta memoria descriptiva se puede lograr de varias formas. Una es
simplemente preparar un antisuero policlonal dirigido contra el
polipéptido amiloidogénico (por ejemplo, un antisuero preparado en
un conejo) y después de esto usar este antisuero como un reactivo de
ensayo (por ejemplo, en un ELISA competitivo) contra las proteínas
modificadas que se producen. Las versiones modificadas (análogos)
que reaccionan en la misma medida con el antisuero como lo hacen la
APP o A\beta se debe considerar que tiene la misma estructura
terciaria global que la APP o A\beta mientras que los análogos que
muestran una reactividad limitada (pero todavía significativa y
específica) con tal antisuero se consideran que tienen mantenida una
fracción sustancial de los epítopes de células B.
Como alternativa, una selección de anticuerpos
monoclonales reactivos con distintos epítopes sobre la APP o
A\beta se puede preparar y usar como un panel de ensayo. Este
planteamiento tiene la ventaja de permitir 1) un mapeo de los
epítopes de la APP o A\beta y 2) un mapeo de los epítopes que se
mantienen en los análogos preparados.
Por supuesto, un tercer planteamiento sería
resolver la estructura tridimensional de la APP o A\beta o de un
truncameinto biológicamente activo del mismo (véase anteriormente) y
comparar ésta con la estructura tridimensional resuelta de los
análogos preparados. La estructura tridimensional se puede resolver
mediante la ayuda de estudios de difracción de rayos X y
espectroscopía de RMN. Información adicional con relación a la
estructura terciaria se puede en alguna medida obtener a partir de
estudios de dicroísmo circular que tienen la ventaja de requerir
solamente el polipéptido en forma pura (mientras que la difracción
de rayos X requiere la provisión de polipéptido cristalizado y RMN
requiere la provisión de variantes isotópicas del polipéptido) con
el fin de proporcionar información útil sobre la estructura
terciaria de una molécula dada. Sin embargo, últimamente la
difracción de rayos X y/o RMN son necesarias para obtener datos
concluyentes ya que el dicroísmo circular solamente puede
proporcionar evidencia indirecta de estructura tridimensional
correcta mediante la información de elementos de estructura
secundaria.
Una realización preferida de la invención
utiliza presentaciones múltiples de epítopes de linfocitos B de APP
o A\beta (es decir, la fórmula I en la que al menos un epítope de
células B está presente en dos posiciones). Este efecto se puede
lograr de formas diversas, por ejemplo, simplemente preparando la
fusión de polipéptidos que comprende la estructura (polipéptido
derivado de APP o A\beta)_{m}, en la que m es un número
entero \geq 2 y después introducir las modificaciones descritas en
esta memoria descriptiva en al menos una de las secuencias de APP o
A\beta. Se prefiere que las modificaciones introducidas incluyan
al menos una duplicación de un epítope de linfocitos B y/o la
introducción de un hapteno. Estas realizaciones que incluyen
presentaciones múltiples se epítopes seleccionados se prefieren
especialmente en situaciones en las que solamente partes secundarias
del polipéptido amiloidogénico son útiles como constituyentes en un
agente de vacuna.
Como se ha mencionado anteriormente, la
introducción de un epítope de células T extraño se puede lograr
mediante la introducción de al menos una inserción, adición,
supresión, o sustitución de aminoácidos. Por supuesto, la situación
normal será la introducción de más de un cambio en la secuencia de
aminoácidos (por ejemplo, inserción de o sustitución por un epítope
de células T) pero el objetivo importante a alcanzar es que el
análogo, cuando se procese por una célula presentadora de antígenos
(APC), dará lugar a tal epítope de células T extraño
inmunodominantes que se presenta en el contexto de una molécula de
clase II de MCH sobre la superficie de la APC. De este modo, si la
secuencia de aminoácidos del polipéptido amiloidogénico en
posiciones apropiadas comprende un número de residuos de
aminoácidos que se pueden encontrar en un epítope T_{H} extraño se
puede lograr proporcionando los restantes aminoácidos del epítope
extraño por medio de inserción, adición, supresión y sustitución de
aminoácidos. En otras palabras, no es necesario introducir un
epítope T_{H} completo mediante inserción o sustitución con el fin
de realizar el propósito de la presente invención.
Se prefiere que el número de inserciones,
supresiones, sustituciones o adiciones de aminoácidos sea al menos
2, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, y 25 inserciones, sustituciones, adiciones o
supresiones. Se prefiere además que el número de inserciones,
sustituciones, adiciones, o supresiones de aminoácidos no exceda de
150, tal como mucho 100, como mucho 90, como mucho 80, y como mucho
70. Se prefiere especialmente que el número de sustituciones,
inserciones, supresiones, o adiciones no exceda de 60, y en
particular el número no exceda de 50 o incluso 40. Lo más preferido
es un número de no más de 30. Con respecto a las adiciones de
aminoácidos, se debe observar que ésta, cuando la construcción
resultante está en la forma de un polipéptido de fusión, es a menudo
considerablemente mayor que 150.
Las realizaciones preferidas de la invención
incluyen modificación introduciendo al menos un epítope de células T
inmunodominantes extraño. Se entenderá que la cuestión de dominancia
inmune de un epítope de células T depende de la especie animal en
cuestión. Como se usa en esta memoria descriptiva, el término
"inmunodominancia" simplemente se refiere a epítopes que en el
individuo/población vacunado o/a da lugar a una respuesta inmune
significativa, pero es un hecho bien conocido que un epítope de
células T que es inmunodominante en un individuo/población no es
necesariamente inmunodominante en otro individuo de la misma
especie, incluso aunque pueda ser capaz de unir las moléculas
MHC-II en el último individuo. Por lo tanto, para
los propósitos de la presente invención, un epítope de células T
dominante inmune es un epítope de células T que será eficaz
proporcionando ayuda de células T cuando está presente en un
antígeno. Típicamente, los epítopes de células T dominantes inmunes
tienen como característica inherente que sustancialmente siempre se
presentarán unidas a una molécula de clase II de MHC,
independientemente del polipéptido en el que aparecen.
Otro punto importante es el asunto de
restricción de MHC de epítopes de células T. En general, los
epítopes de células T de origen natural son MCH restringidos, es
decir, ciertos péptidos que constituyen un epítope de células T se
unirán eficazmente a un subconjunto de moléculas de clase II de MHC.
Esto a su vez tiene el efecto de que en la mayoría de los casos el
uso de un epítope de células T específico dará como resultado un
componente de vacuna que solamente es eficaz en una fracción de la
población, y dependiendo del tamaño de esa fracción, puede ser
necesario incluir más epítopes de células T en la misma molécula, o
como alternativa preparar una vacuna de componentes múltiples en la
que los componentes son variantes de APP o A\beta que se
distinguen entre sí por la naturaleza del epítope de células T
introducido.
Si la restricción de MHC de las células T usadas
es completamente desconocida (por ejemplo en una situación en al que
el animal vacunado tiene una composición de MHC poco definida), la
fracción de la población cubierta por una composición de vacuna
específica se puede determinar mediante la siguiente fórmula
(II)f_{población} = 1 -
\prod\limits^{n}_{i=1}
(1-p_{i})
en la que p_{i} es la frecuencia
en la población de contestadores al epítope de células T extraño
presentes en al composición de vacuna, y n es el número total de
epítopes de células T extraños en la composición e vacuna. De este
modo, una composición de vacuna que contiene 3 epítopes de células T
extraños que tienen frecuencias de respuesta en la población de 0,8,
0,7, y 0,6 respectivamente,
proporcionaría
1 - 0.2 x 0,3 x 0,4 =
0,976
es decir 97,6 por ciento de la
población montará estadísticamente una respuesta mediada por
MHC-II a la
vacuna.
La fórmula anterior no se aplica en situaciones
en las que se conoce un patrón de restricción de MHC más o menos
preciso de los péptidos usados. Si, por ejemplo, un cierto péptido
solamente se une a las moléculas de MHC - II humanas codificadas por
alelos de HLA - DR DR1, DR3, DR5, y DR7, después el uso de este
péptido junto con otro péptido que une las moléculas de MHC - II
restantes codificadas por los alelos HLA - DR realizarán el 100% de
cobertura en al población en cuestión. De manera similar, si el
segundo péptido solamente une DR3 y DR5, la adición de este péptido
no incrementará la cobertura en todos. Si se basa el cálculo de
respuesta de población puramente sobre restricción de MHC de
epítopes de células T en la vacuna, la fracción de la población
cubierta por una composición de vacuna específica se puede
determinar mediante la fórmula siguiente:
(III)f_{población} = 1 -
\prod\limits ^{3}_{j=1} (1 - \varphi
_{j})^{2}
en la que \varphi_{j} es la
suma de frecuencias en la población de haplotipos alélicos que
codifican las moléculas de MHC que unen cualquiera de los epítopes
de las células T en la vacuna y que pertenecen al jº de los 3 loci
de HLA (DP, DR y DQ); en la práctica, primero se determina las
moléculas que reconocerán cada epítope de las células T en la
vacuna y después de esto se enumeran por tipo (DR, DR y DQ) -
después, las frecuencias individuales de los diferentes haplotipos
alélicos enumerados se suman para cada tipo, produciendo por lo
tanto \varphi_{1}, \varphi_{2}, y
\varphi_{3}.
Puede ocurrir que el valor de p_{i} en la
fórmula (II) exceda el valor teórico correspondiente
\pi_{i}:
(IV)\pi _{i} =
1 - \prod\limits ^{3}_{j=1} (1 -
v_{j})^{2}
en la que v_{j} es la suma de
frecuencias en la población de haplotipo alélico que codifica las
moléculas de MHC que unen el iº epítope de células T en la vacuna y
que pertenecen al jº de los 3 loci de HLA (DP, DR y DQ). Esto
significa que en 1-p_{i} de la población es una
frecuencia de contestadores de f _{residual\_i} = (i - p_{i}) /
(1 - p_{i}). Por lo tanto, la fórmula III se puede ajustar de
manera que produzca la fórmula
V:
(V)f_{población} = 1 -
\prod\limits^{3}_{j=1} (1 - \varphi _{j})^{2} + \left(1 -
\prod\limits^{n}_{j=1} (1 –
f_{residual\_i})\right)
en la que el término 1 - \varphi
_{residual-i} se fija en cero si es negativo. Se
debe observar que la fórmula V requiere que todos los epítopes se
hayan mapeado para haplotipos contra conjuntos idénticos de
haplotipos.
Por lo tanto, cuando se seleccionan epítopes de
células T a introducir en el análogo, es importante incluir todo el
conocimiento de los epítopes que sea disponible: 1) la frecuencia de
contestadores en al población de cada epítope, 2) datos de
restricción de MHC, y 3) frecuencia en la población de los
haplotipos relevantes.
Existe un número de epítopes de células T
"promiscuos" de origen natural que son activos en una gran
proporción de individuos de una especie animal o una población
animal y éstos de introducen preferiblemente en la vacuna reduciendo
por lo tanto la necesidad de un número muy grande de análogos
diferentes en la misma vacuna.
\newpage
El epítope promiscuo puede de acuerdo con la
invención ser un epítope de células T humano de origen natural tal
como epítopes de toxoide de tétanos (por ejemplo, los epítopes P2 y
P30), toxoide de difteria, hemaglutinina de virus de influencia
(HA), y antígeno CS de P. falciparum.
Con los años, se han identificado un número de
otros epítopes de células T promiscuos. Especialmente péptidos
capaces de unir una gran proporción de moléculas de HLA - DR
codificadas por los alelos diferentes HLA - DR se han identificado
y éstos son todos los epítopes de células T posibles a introducir en
los análogos usados de acuerdo con la presente invención. Véanse
también los epítopes descritos en las siguientes referencias:
documento WO 98/23635 (Frazer IH y col., de cesión común a la
Universidad de Queensland); Southwood S y col., 1998, J. Immunol.
160: 3363 - 3373; Sinigaglia F y col., 1988, Nature 336: 778 - 780;
Chicz RM y col., 1993, J. Exp. Med 178: 27 - 47; Hammer J y col.,
1993, Cell 74: 197 - 203; y Falk K y col., 1994, Immunogenetics 39:
239 - 242. La última referencia también se refiere a ligandos de HLA
- DQ y DP. Todos los epítopes enumerados en estas 5 referencias son
relevantes como epítopes naturales candidatos a usar en la presente
invención, como son epítopes que comparten motivos comunes con
éstos.
Como alternativa, el epítope puede ser un
epítope de células T que es capaz de unir una gran proporción de
moléculas de clase II de MHC. En este contexto los péptidos de
epítopes DR pan ("PADRE") descritos en el documento WO 95/07707
y en el artículo correspondiente de Alexander J y col., 1994,
Immunity 1: 751 - 761 son candidatos interesantes para epítopes a
usar de acuerdo con la presente invención. Se debe observar que los
péptidos PADRE más eficaces descritos en estos artículos llevan
aminoácidos D en los extremos C y N con el fin de mejorar la
estabilidad cuando se administran. Sin embargo, la presente
invención principalmente ayuda a la incorporación de los epítopes
relevantes como parte del polipéptido amiloidogénico que después de
deben descomponer enzimáticamente en el interior del compartimiento
lisosomal de los APCs para permitir la presentación posterior en el
contexto de una molécula de MHC - II y por lo tanto no es
conveniente incorporar aminoácidos D en los epítopes usados en al
presente invención.
Un péptido PADRE especialmente preferido es el
que tiene la secuencia de aminoácidos AKFVAAWTLKAAA [SEQ ID NO: 17]
o una subsecuencia inmunológicamente eficaz de la misma. Éste, y
otros epítopes que tienen la misma falta de restricción de MHC son
epítopes de células T preferidos que deberían estar presente en los
análogos usados en el procedimiento de la invención. Tales epítopes
super promiscuos permitirán las realizaciones más sencillas de la
invención en las que solamente un único polipéptido amiloidogénico
modificado se presenta al sistema inmune de animal vacunado.
Como se ha mencionado anteriormente, la
modificación del polipéptido amiloidogénico también puede incluir la
introducción de un primer resto que dirige el polipéptido
amiloidogénico modificado a una APC o un linfocito B. Por ejemplo,
el primer resto puede ser un agente de unión específica para un
antígeno de superficie específico de APC. Muchos de tales antígenos
de superficie específico se conocen en la técnica. Por ejemplo, el
resto puede ser un carbohidrato para el que existe un receptor del
linfocito B o la APC (por ejemplo, manan o manosa). Como
alternativa, el segundo resto puede ser un hapteno. También se puede
usar un fragmento de anticuerpo que reconoce específicamente una
molécula de superficie sobre las APC o linfocitos como un primer
resto (la molécula de superficie puede por ejemplo ser un receptor
FC\gamma de macrófagos y monocitos, tales como FC\gammaRIo, como
alternativa cualquier otro marcador específico de superficie tal
como CD40 o CTLA-4). Se debe observar que todas
estas moléculas de dirección ejemplar se pueden usar como parte de
un adyuvante también, véase más adelante.
Como alternativa o suplemento a la dirección del
polipéptido amiloidogénico modificado a un cierto tipo de célula con
el fin de lograr una respuesta inmune potenciada, es posible
incrementar el nivel de sensibilidad del sistema inmune incluyendo
el segundo resto anteriormente mencionado que estimula el sistema
inmune. Los ejemplos típicos de tales segundos restos son
citoquinas, y proteínas de choque térmico o chaperonas moleculares,
así como partes eficaces de las mismas.
Las citoquinas adecuadas a usar de acuerdo con
la invención son aquellas que normalmente también funcionan como
adyuvantes en una composición de vacuna, es decir, por ejemplo,
interferón \gamma (IFN-\gamma), interleuquina 1
(IL - 1), interleuquina 2 (IL - 2), interleuquina 4 (IL - 4),
interleuquina 6 (IL - 6), interleuquina 12 (IL - 12), interleuquina
13 (IL - 13), interleuquina 15 (IL - 15), y factor estimulante de
colonia de granulocitos - macrófagos (GM - CSF); como alternativa,
la parte funcional de la molécula de citoquinas puede ser suficiente
como el segundo resto. Con respecto al uso de tales citoquinas como
sustancias adyuvantes, véase, la descripción más adelante.
De acuerdo con la invención, las proteínas de
choque térmico adecuadas o chaperonas usadas como el segundo resto
pueden ser HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (también conocida como gp96,
véase Wearsch, PA y col., 1998, Biochemistry 37: 5709 - 19), y CRT
(calrreticuina).
Como alternativa, el segundo resto puede ser una
toxina, tal como listeriolicina (LLO), lípido A y enterotoxina lábil
al calor. También, un número de derivados micobacterianos tales como
MDP (muramil dipéptido), CFA (adyuvante de Freund completo) y los
diésteres de trehalosa TDM y TDE son posibilidades interesantes.
También la posibilidad de introducir un tercer
resto que potencia la presentación del polipéptido amiloidogénico
modificado al sistema inmune es una realización importante de la
invención. La técnica ha mostrado varios ejemplos de este principio.
Por ejemplo, se sabe que el anclaje de lipidación de palmitoílo en
la proteína de Borrelia burgdorferi OspA se puede utilizar
para proporcionar polipéptidos auto - adyuvantes (véase, por
ejemplo, el documento WO 96/40718) parece que las proteínas
lipidadas forman estructuras de tipo micela con un núcleo que
consta de las partes de anclaje de lipidación de los polipéptidos y
las partes restantes de la molécula saliente de los mismos, dando
como resultado múltiples presentaciones de los determinantes
antigénicos. Por lo tanto, el uso de éste y planteamientos
relacionados que usan anclajes de lipidación diferentes (por
ejemplo, un grupo miristilo, un grupo miristilo, un grupo farnesilo,
un grupo geranilo - geranilo, un anclaje de GPI, y un grupo
N-acil diglicérido) son realizaciones preferidas de
la invención, ya que especialmente la provisión de tal anclaje de
lipidación en una proteína producida recombinantemente es
justamente sencilla y solamente requiere el uso de por ejemplo, una
secuencia de señal de origen natural como un agente de fusión para
el polipéptido amiloidogénico modificado. Otra posibilidad es el uso
del fragmento C3d de factor C3 complementario o el propio Ce (véase
Dempsey y col., 1996, Science 271, 348 - 350 y Lou y Kohler, 1998,
Nature Biotechnology 16, 458 - 462).
Una realización alternativa de la invención que
también da como resultado la presentación preferida de copias
múltiples (por ejemplo al menos 2) de las regiones epitópicas
importantes del polipéptido amiloidogénico al sistema inmune es el
acoplamiento covalente del v, subsecuencia o variantes del mismo a
ciertas moléculas. Por ejemplo, se pueden usar polímeros, por
ejemplo, carbohidratos tales como dextrano, véase, por ejemplo, Lees
A y col., 1994, Vaccine 12: 1160 - 1166; Lees A y col, 1990, J.
Immunol. 145: 3594 - 3600, pero también manosa y manan son
alternativas útiles. Las proteína de membrana integral de por
ejemplo E. coli. y otras bacterias son también útiles agentes
de conjugación. Las moléculas vehículo tradicionales tales como
hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH), toxoide de tétanos,
toxoide de difteria, y albúmina sérica bovina (BSA) también se
prefieren y son útiles agentes de conjugación.
Las realizaciones preferidas de acoplamiento de
acoplamiento covalente del material derivado de APP o A\beta a
polihidroxipolímeros tal como carbohidratos implican el uso de al
menos un péptido derivado de APP o A\beta y al menos un epítope
auxiliar T extraño que se acoplan de manera separadla
polihidroxipolímero (es decir, el epítope auxiliar T extraño y la
secuencia de aminoácidos derivada de APP o A\beta no está
condensados entre sí sino mejor unido al polihidroxipolímero que
después sirve como una estructura central del vehículo). De nuevo,
tal realización es la más preferida cuando el epítope de células C
que lleva las regiones de los péptidos derivados de la APP o
A\beta están constituidas por tramos cortos de péptidos - esto es
porque este planteamiento es una forma muy conveniente de lograr
presentaciones múltiples de epítopes seleccionados en el agente
inmunógeno resultante. Sin embargo, también es posible simplificar
los análogos acoplados ya descritos en esta memoria descriptiva a la
estructura central del polihidroxipolímero, es decir, que el
material derivado de la APP o A\beta no está unido a la
estructura central de manera separada de los epítopes T_{H}.
Se prefiere especialmente que el acoplamiento
del epítope auxiliar T extraño y el (poli) péptido derivado de APP o
A\beta es por medio de un enlace amida que se puede escindir
mediante una peptidasa. Esta estrategia tiene el efecto que APC será
capaz de recoger el conjugado y al mismo tiempo será capaz de
procesar el conjugado y posteriormente presentar el epítope de
células T en un contexto de clase II de MHC.
Una forma de lograr el acoplamiento de péptidos
(tanto el péptido derivado de APP o A\beta de interés como el
epítope extraño) es activar un polihidroxipolímero adecuado con
grupos tresil (trifluoroetilsulfonilo) u otros grupos de activación
adecuados tales como maleimido, cloroformiato de
p-nitrofenilo (para activación de grupos OH y
formación de un enlace de péptidos entre péptido y
polihidroxipolímero), y tosil (p-toluensulfonilo).
Por ejemplo, es posible preparar polisacáridos activados como se
describe en el documento WO 00/05316 y US 5.874.469 y acoplar éstos
a péptidos derivados de APP o A\beta o poliaminoácidos así como a
epítopes de células T preparados mediante técnicas de síntesis de
péptidos de fase sólida o líquida convencionales. El producto
resultante consta de una estructura central de polihidoxipolímero
(por ejemplo, una estructura central de dextrano) que tiene, unido a
él mediante su extremo C o mediante otros restos de nitrógeno
disponibles, poliaminoácidos derivados de APP o A\beta y de
epítopes de células T extraños. Si se desea, es posible sintetizar
los péptidos de APP o A\beta de manera que protejan todos los
grupos amino excepto el que está en el extremo N, posteriormente se
acoplan a los péptidos protegidos resultantes al resto de dextrano
trefilado, y finalmente desproteger el conjugado resultante. Un
ejemplo específico de este planteamiento se describe en los ejemplos
más adelante.
En lugar de usar las moléculas de polisacáridos
solubles en agua como se indica en los documentos WO 00/05316 y US
5.874.469, es posible igualmente utilizar moléculas de polisacáridos
reticuladas, por lo tanto obteniendo un conjugado de partículas
entre polipéptidos y polisacáridos - esto se cree que conduce a una
presentación mejorada para el sistema inmune del polipéptido, ya que
se alcanzan los objetivos, a saber obtener un efecto de depósito
local cuando se inyecta el conjugado y para obtener partículas que
son dianas atractivas para las APC. El planteamiento de uso de tales
sistemas de partículas también se detalla en los ejemplos.
Las consideraciones que son la base de áreas
elegidas de introducción de modificaciones en APP o A\beta son a)
preservación de epítopes de células T conocidos y predichos, b)
preservación reestructura terciaria, c) anulación de epítopes de
células B presentes en las "células productoras" etc. De
cualquier forma, como se ha descrito anteriormente, es medianamente
fácil seleccionar un conjunto de moléculas amiliodogénicas
modificadas que se han sometido todas a la introducción de un
epítope de células T en diferentes localizaciones.
\newpage
Ya que las realizaciones más preferidas de la
presente invención implican la regulación hacia debajo de A\beta
humano, se prefiere por lo tanto que el polipéptido de APP o
A\beta descrito anteriormente sea un polipéptido de A\beta
humano. En esta realización, se prefiere especialmente que el
polipéptido de APP o A\beta se haya modificado sustituyendo al
menos una secuencia de aminoácidos en la SEQ ID Nº: 2 con al menos
una secuencia de aminoácidos de longitud igual o diferente y que
contiene un epítope T_{H} extraño. Los ejemplos de APP y A\beta
amiloidogénicas modificadas se muestran esquemáticamente en la
figura 1 que usa los epítopes P2 y P30 como ejemplos. La razón
fundamental de tales construcciones se describe en detalle en el
ejemplo.
Más específicamente, un T_{H} que contiene (o
que completa) la secuencia de aminoácidos que se introduce en la SEQ
ID Nº: 2 se puede introducir en cualquier aminoácido en la SEQ ID
Nº: 2. Es decir, la introducción es posible después de cualesquiera
aminoácidos 1 - 770, pero preferiblemente después de cualesquiera
aminoácidos 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681,
682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694,
695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707,
708, 709, 710, 711, 712, 713, y 714 en la SEQ ID Nº: 2. Esto se
puede combinar con la supresión de cualesquiera o todos los
aminoácidos 1 - 671, o cualesquiera o todos los aminoácidos 715 -
770. Además, cuando se utiliza la técnica de sustitución,
cualesquiera de los aminoácidos 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677,
678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690,
691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703,
704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, y 714 en la SEQ ID
Nº: 2 se puede suprimir en combinación con la introducción.
De acuerdo con la invención, los análogos no
incluyen ninguna subsecuencia de la SEQ ID Nº: 2 que se une de
manera productiva a las moléculas de clase II de MHC que comienzan
una respuesta de células T.
La razón fundamental de tal estrategia para el
diseño del inmonógeno que se acopla al sistema inmune para inducir
por ejemplo una respuesta inmune anti - A\beta es la siguiente: se
ha observado que cuando la inmunización con proteínas antólogas
abundantes tales como A\beta formulada en un adyuvante que es
suficientemente fuerte para romper la tolerancia del cuerpo hacia la
proteína antóloga, existe un peligro de que en algunos individuos
vacunados la respuesta inmune inducida no se pueda discontinuar
simplemente discontinuando la inmunización. Esto se debe a que la
respuesta inmune en tales individuos está lo más probablemente
dirigida por un epítope T_{H} nativo de la proteína antóloga, y
esto tiene el efecto adverso de que la propia proteína de los
individuos vacunados serán capaces de funcionar como un agente
inmunizante en sí mismo: de este modo se ha establecido una
condición autoinmune.
El uso de los epítopes T_{H} extraños tienen
el mejor conocimiento de los inventores nunca se ha observado que
produce este efecto, debido a que la respuesta autoinmune se dirige
por un epítope T_{H} extraño, y se ha demostrado repetidamente por
los inventores que la respuesta inmune inducida invocada por la
tecnología preferida de hecho disminuye después de la
discontinuación de las inmunizaciones. Sin embargo, en teoría puede
suceder en unos pocos individuos que la respuesta inmune estuviera
también dirigida por un epítope T_{H} autólogo de la autoproteína
relevante que inmuniza contra) - esto es especialmente relevante
cuando se considera que las auto - proteínas son relativamente
abundantes, tal como A\beta, mientras que otras auto - proteínas
terapéuticamente relevantes solamente están presentes localmente o
en cantidades así de bajas en el cuerpo, ese "efecto de auto -
inmunización" no es una posibilidad. Una forma muy sencilla de
evitar esto es por lo tanto evitar en conjunto la inclusión en el
inmunógeno de secuencias de péptidos que podrían servir como
epítopes T_{H} (y ya que los péptidos más cortos que
aproximadamente 9 aminoácidos no pueden servir como epítopes
T_{H}, el uso de fragmentos más cortos es un planteamiento simple
y factible). Por lo tanto, esta realización de la invención también
sirve para asegurar que el inmunógeno no incluye las secuencias de
péptidos de APP o A\beta dianas que podrían servir como
"epítopes T_{H} autoestimulantes" que incluyen secuencias
que solamente contienen sustituciones conservadoras en una secuencia
de la proteína diana que pudiera de otra manera funcionar como un
epítope T_{H}.
Las realizaciones preferidas de la presentación
del sistema inmune de los análogos de la APP o A\beta implican el
uso de un péptido quimérico que comprende al menos un péptido
derivado de APP o A\beta, que no se une de manera productiva a
las moléculas de clase II de MHC, y al menos un epítope auxiliar T
extraño. Es especialmente ventajoso si el análogo inmunógeno es uno,
en el que la secuencia de aminoácidos que comprende uno o más
epítopes de células B se representan o bien como una secuencia
continua o como una secuencia que incluye inserciones, en los que
las inserciones comprenden epítopes auxiliares T extraños.
De nuevo, tal realización es la más preferida
cuando el epítope de células B adecuado que lleva regiones de la APP
o A\beta están constituidas por tramos cortos de péptidos que no
serían capaces de unirse de manera productiva a una molécula de
clase II de MHC. El epítope o epítopes de células B seleccionados
del polipéptido amiloidogénico debe comprender por lo tanto como
mucho 9 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID Nº: 2. Se prefieren
péptidos más cortos, tales como los que tienen como mucho 8, 7, 6,
5, 4, ó 3 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos
del polipéptido amiloidogénico.
Se prefiere que el análogo comprenda al menos
una subsecuencia de la SEQ ID Nº: 2 de manera que cada una de tal al
menos una subsecuencia independientemente consta de tramos de
aminoácidos de la APP o A\beta seleccionada entre el grupo
constituido por 9 aminoácidos consecutivos, 8 aminoácidos
consecutivos, 7 aminoácidos consecutivos, 6 aminoácidos
consecutivos, 5 aminoácidos consecutivos, 4 aminoácidos
consecutivos, y 3 aminoácidos consecutivos.
Se prefiere especialmente que los aminoácidos
consecutivos comiencen en el residuo de un aminoácido seleccionado
entre el grupo constituido por 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678,
679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691,
692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704,
705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, y 714 en la SEQ ID Nº:
2.
Cuando se efectúa la presentación del
polipéptido amiloidogénico o el v modificado a un sistema inmune de
animales por medio de la administración del mismo al animal, la
formulación del polipéptido sigue los principios generalmente
reconocidos en la técnica.
La preparación de vacunas que contienen
secuencias de péptidos como ingredientes activos se entiende bien
generalmente en la técnica, como se ejemplifica por las patentes de
Estados Unidos 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230;
4.596.792; y 4.578.770, todas incorporadas en esta memoria
descriptiva como referencia. Típicamente, tales vacunas se preparan
como inyectables o bien como soluciones o suspensiones líquidas;
también se pueden preparar formas adecuadas sólidas para solución
en, o suspensión en, líquido antes de inyección. La preparación
también puede estar emulsionada. El ingrediente inmunógeno activo a
menudo se mezcla con excipientes que son farmacéuticamente
aceptables y compatibles que son farmacéuticamente aceptables y
compatibles con e ingrediente activo. Tales excipientes son, por
ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o
similares, y las combinaciones de los mismos. Además, si se desea,
la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares
tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de
tamponación de pH, o adyuvantes que potencian la eficacia de las
vacunas, véase la descripción detallada de adyuvantes más
adelante.
Las vacunas se administran convencionalmente por
vía parenteral, por inyección, por ejemplo, o bien por vía
subcutánea, por vía intracutánea, por vía intradérmica, por vía
subdérmica o por vía intramuscular. Las formulaciones adicionales
que son adecuadas para otros modos de administración incluyen
supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales, bucales,
sublinguales, intraperitoneales, intravaginales, anales, epidurales,
espinales, e intracraneales. Para supositorios, los ligantes y
vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo,
polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios se pueden
formar a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el
intervalo de 0,5% a 10%, preferiblemente 1 - 2%. Las formulaciones
orales incluyen tales excipientes normalmente empleados como, por
ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón,
estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de
magnesio, y similares. Estas composiciones toman la forma de
soluciones suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas,
formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10 - 95%
de ingrediente activo, preferiblemente 25 - 70%. Para las
formulaciones orales, la toxina de cólera es un agente de
formulación interesante (y también un posible agente de
conjugación).
Los polipéptidos se pueden formular en la vacuna
como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables
incluyen sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino
libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales
como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos
orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y
similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres
también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por
ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y
tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina,
2-etilamino etanol, histidina, procaína, y
similares.
Las vacunas se administran de una manera
compatible con la formulación de dosificación, y de tal manera como
será terapéuticamente eficaz e inmunogénica. La cantidad a
administrar depende del sujeto a tratar, incluyendo, por ejemplo, la
capacidad del sistema inmune del individuo para montar una respuesta
inmune, y el grado de protección deseado. Los intervalos de
dosificación adecuados son del orden varios cientos de microgramos
de ingrediente activo por vacunación con un intervalo preferido de
entre 0,1 \mug a 2.000 \mug (incluso no obstante se contemplan
cantidades mayores en el intervalo 1 - 10 mg), tales como en el
intervalo de entre aproximadamente 0,5 \mug y 1000 \mug,
preferiblemente en el intervalo de entre 1 \mug y 500 y
especialmente en el intervalo de entre aproximadamente 10 \mug y
100 \mug. Los regímenes adecuados para la administración adicional
e inyecciones de dosis de recuerdo están también disponibles pero de
tipifican mediante la administración inicial seguida de
inoculaciones posteriores u otras administraciones.
La manera de aplicación puede variar
ampliamente. Cualquiera de los procedimientos convencionales para la
administración de una vacuna son aplicables. Éstos incluyen
aplicación oral sobre una base sólida fisiológicamente aceptable o
en una dispersión fisiológicamente aceptable, por vía parenteral,
por inyección o similares. La dosificación de la vacuna dependerá de
la vía de administración y variará de acuerdo con la edad de la
persona a vacunar y la formulación del antígeno.
Algunos de los polipéptidos de la vacuna son
suficientemente inmunógenos en una vacuna, pero para alguno de los
otros la respuesta inmune se potenciará si la vacuna además
comprende una sustancia adyuvante.
Se conocen diversos procedimientos de lograr
efecto adyuvante para la vacuna. Los principios y procedimientos
generales se detallan en "The Theory and Practical Application of
Adyuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart - Tull (ed.), John Wiley
& sons Ltd, ISBN 0 - 471 - 95170 - 6, y también en "Vaccines:
New Generation Immunological Adyuvants", 1995, Gregoriadis G y
col., (eds), Plenum Press, Nueva York, ISBN 0 - 306 - 45283 - 9.
Se prefiere especialmente usar un adyuvante que
se pueda demostrar que facilita la rotura de la autotolerancia a
autoantígenos; de hecho, es esencial en los casos en los que se usa
el polipéptido amiloidogénico no modificado como el ingrediente
activo en la autovacuna. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes
adecuados se seleccionan entre el grupo constituido por adyuvante de
dirección inmune; un adyuvante modulador inmune tal como una toxina,
y un derivado micobacteriano; una formulación oleosa; una matriz de
complejo inmunoestimulante (matriz ISCOM); una partícula; DDA;
adyuvantes de aluminio; adyuvantes de ADN;
\gamma-inulina; y un adyuvante de encapsulación.
En general se debe observarque las descripciones anteriores que se
refieren a los compuestos y agentes útiles como primer, segundo y
tercer restos en los análogos también se refieren mutatis
mutandi a su uso en el adyuvante de una vacuna de la
invención.
La aplicación de adyuvantes incluyen el uso de
agentes tales como hidróxido o fosfato de aluminio (alum), usado
comúnmente como solución al 0,05 a 0,1 por ciento en solución salina
tamponada, mezcal con polímeros sintéticos de azúcares (por ejemplo
Carbopol®) usado como solución al 0,25 por ciento, agregación de la
proteína en la vacuna mediante tratamiento por calor con
temperaturas que varían entre 70ºC y 101ºC durante períodos de 30
segundos a 2 minutos respectivamente y también son posibles
agregación por medio de agentes de reticulación. La agregación
mediante reactivación con anticuerpos tratados con pepsina
(fragmentos Fab) a albúmina, mezcla con células bacterianas tales
como C. parvum o endotoxinas o componentes de
lipopolisacáridos de bacterias gram - negativas, también se pueden
usar emulsión en vehículos oleosos fisiológicamente aceptables tal
como monooletato de manida (Aracel A) o emulsión con solución al 20
por ciento de un perfluorocarbono (Fluosol - DA) usado como
sustituto de bloque. También se prefiere la mezcla con aceites tales
como escualeno e IFA.
De acuerdo con la invención el DDA (bromuro de
dimetildioctadecilamonio) es un candidato interesante para un
adyuvante como es ADN y \gamma-inulina, pero
también adyuvantes completo e incompleto de freund así como
saponinas de quillaja tal como QuilA y QS21 son interesantes
como RIBI. Las posibilidades adicionales son monofosforil lípido A
(MPL), los anteriormente mencionados C3 y C3d, muramil dipéptido
(MDP).
Las formulaciones de liposomas también se sabe
que confieren efectos adyuvantes, y por lo tanto se prefieren
adyuvantes de liposomas de acuerdo con la invención.
También los adyuvantes de tipo de matriz de
complejo inmunoestimulante (matriz ISCOM®) son elecciones preferidas
de acuerdo con la invención, especialmente ya que se ha mostrado que
este tipo de adyuvantes son capaces de regular hacia arriba la
expresión de clase II de MHC por APCs. La matriz ISCOM® consta de
(fraccionada opcionalmente) saponinas (triterpenoides) de
Quillaja saponaria, colesterol, y fosfolípido. Cuando se
mezcla con la proteína inmunogénica, la formulación particulada
resultante es la que se conoce como una partícula de ISCOM donde la
saponina construye 60 - 70% p/p, el colesterol y fosfolípido 10 -
15% p/p, y la proteína 10 - 15% p/p. Los detalles relativos a la
composición y uso de complejos inmunoestimulantes se pueden, por
ejemplo, encontrar en los libros de texto anteriormente mencionados
que tratan de adyuvantes, pero también Morein B y col., 1995, Clin.
Immunother. 3: 461 - 475 así como Barr IG y Mitchell GF, 1996,
Immunol. and Cell Biol. 74: 8 - 25 proporcionan instrucciones útiles
para la preparación de complejos inmunoestimulantes completos.
Otra posibilidad altamente interesante (y así,
preferida) de lograr efecto adyuvante es emplear la técnica descrita
en Gosselin y col., 1992. En resumen, la presentación de un antígeno
relevante tal como un antígeno de la presente invención se puede
potenciar conjugando el antígeno de anticuerpos (o fragmentos de
anticuerpos de unión a antígeno) contra los receptores de Fc\gamma
sobre monocitos/macrófagos. Específicamente conjugados entre
antígeno y anti-Fc\gammaRI se han demostrado que
potencian la inmunogenicidad para los propósitos de vacunación.
Otras posibilidades implican el uso de las
moléculas de dirección y modulación inmune /entre otros citoquinas)
mencionadas anteriormente como candidatos para el primer y segundo
restos en las versiones modificaciones de polipéptidos
amiloidogénicos. A este respecto, también son posibilidades
inductores sintéticos de citoquinas como poli I:C.
Los derivados micobacterianos adecuados se
seleccionan entre el grupo constituido por muramil dipéptido,
adyuvante completo de Freund, RIBI, y un diéster de trehalosa tal
como TMD y TDE.
Los adyuvantes de dirección inmunes adecuados se
seleccionan entre el grupo constituido por ligando CD40 y
anticuerpos CD40 o específicamente fragmentos de unión de los mismos
(véase la descripción anterior), manosa, un fragmento Fab, y
CTLA-4.
Los adyuvantes poliméricos adecuados se
seleccionan entre el grupo constituido por un carbohidrato tal como
dextrano, PEG, almidón, manan, y manosa; un polímero plástico tal
como; y látex tal como perlas de látex.
Todavía otra forma interesante de modulación de
una respuesta inmune es incluir el inmunógeno (opcionalmente junto
con adyuvantes y portadores y vehículos farmacéuticamente
aceptables) en un "nódulo linfático virtual" (VLN) (un
dispositivo patentado médico desarrollado por ImmunoTherapy, Inc.,
360 Lexington Avenue, Nueva York, NY 10017 - 6501). El VLN (en un
dispositivo tubular delgado) imita la estructura y función de un
nódulo linfático. La inserción de un VLN bajo la piel crea un sitio
de inflamación estéril con un gran aumento de citoquinas y
quimioquinas. Las células T y B así como las APC responden
rápidamente a las señales de peligro, se dirigen al sitio inflamado
y se acumulan en el interior de la matriz porosa del VLN. Se sabe
que la dosis de antígeno necesaria requiere montar una respuesta
inmune a un antígeno se reduce cuando se usa el VLN y esa protección
inmune conferida por la vacunación usando una inmunización
convencional superior usando Ribi como un adyuvante. La tecnología,
se describe entre otros brevemente en Gelber C y col., 1998,
"Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to
Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Devide Designated
the Virtual Lymph Node", en "From the laboratory to the Clinic,
Book of Abstracts, 12 - 15 de octubre de 1998, Seascape Resort,
Aptos, California".
La formulación en micropartículas de vacunas se
ha mostrado en muchos casos que incrementa la inmunogenicidad de
antígenos proteicos y por lo tanto es otra realización preferida de
la invención. Las micropartículas están hechas o bien como co -
formulaciones de antígeno con un polímero, un lípido, un
carbohidrato u otras moléculas adecuadas para fabricar las
partículas, o las micropartículas pueden ser partículas homogéneas
constituidas solamente por el propio antígeno.
Los ejemplos de micropartículas a base de
polímero son partículas a base de PLGA y PVP (Gupta, R. K. y col.,
1998) donde el polímero y el antígeno se condensan en una partícula
sólida. Las partículas a base de lípidos se pueden fabricar como
micelas del lípido (también llamados liposomas) que atrapan el
antígeno dentro de la micela (Pietrobon, P. J. 1995). Las
partículas a base de carbohidratos se fabrican típicamente de un
carbohidrato degradable adecuado tal como almidón o quitosan. El
carbohidrato y el antígeno se mezclan y condensan en partículas en
un proceso similar al usado para partículas de polímero (Kas, H. S.
y col., 1997).
Las partículas constituidas solamente por el
antígeno se pueden fabricar mediante diversas técnicas de
pulverización y secado por congelación. Especialmente adecuadas para
los propósitos de la presente invención es la tecnología de fluido
super crítico que se usa para fabricar partículas muy uniformes de
tamaño controlado (York, P. 1999 y Shekunov, B. y col., 1999).
Se espera que la vacuna se deba administrar 1 -
6 veces al año, al como 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 6 veces al año a un
individuo en necesidad del mismo. Se ha mostrado previamente que la
inmunidad de memoria inducida por el uso de las autovacunas
preferidas de acuerdo con la invención no es permanente, y por lo
tanto el sistema inmune necesita ser periódicamente estimulado con
el polipéptido amiloidogénico o polipéptidos amiloidogénicos
modificados.
Debido a la variación genética, individuos
diferentes pueden reaccionar con respuestas inmunes de intensidad
variable al mismo polipéptido. Por lo tanto, la vacuna de acuerdo
con la invención puede comprender varios polipéptidos diferentes con
el fin de incrementar la respuesta inmune, véase también la
descripción anterior referente a la elección de introducciones de
epítopes de células TR extraños. La vacuna puede comprender dos o
más polipéptidos, donde todos los polipéptidos son como se han
definido anteriormente.
La vacuna puede por lo tanto comprender 3 - 20
polipéptidos diferentes modificados o no modificados, tales como 3 -
10 polipéptidos diferentes.
Como una alternativa a la administración clásica
de una vacuna a base de péptidos, la tecnología de vacunación de
ácidos nucleicos (también conocida como "inmunización de ácidos
nucleicos", "inmunización genética", e "inmunización
génica") ofrece un número de características atractivas.
Primero, en contraste con el planteamiento de
vacuna tradicional, la vacunación de ácido nucleico no requiere
producción a gran escala consumidora de recursos del agente
inmunógeno (por ejemplo, en la forma de fermentación a escala
industrial de microorganismos que producen polipéptidos
amiloidogénicos modificados). Además, no existe necesidad de
purificación por dispositivo y esquemas de replegamiento para el
inmunógeno. Y finalmente, ya que la vacunación de ácidos nucleicos
se basa en el aparato bioquímica del individuo vacunado con el fin
de producir el producto de expresión del ácido nucleico introducido,
el procedimiento post - traduccional óptimo del producto de
expresión se espera que se produzca, esto es especialmente
importante en el caso de autovacunación, ya que, como se ha
mencionado anteriormente, una fracción significativa de los epítopes
de células B originales se debe preservar en la molécula modificada,
y ya que los epítopes de células B en principio se pueden constituir
por partes de cualquier (bio)molécula (por ejemplo,
carbohidrato, lípido, proteína, etc.). Por lo tanto, los patrones
de glucosilación y lipidación nativa del inmunógeno puede muy bien
ser de importancia para la inmunización global y esto se asegura
mejor teniendo el huésped que produce el inmunógeno.
Por lo tanto, un uso preferido de la invención
permite la presentación del polipéptido amiloidogénico modificado al
sistema inmune introduciendo ácido (s) nucleico (s) que codifica (n)
el polipéptido amiloidogénico modificado e las células del animal y
obteniendo por lo tanto la expresión in vivo por las células
de (de los) ácido (s) nucleico (s) introducido (s).
En esta realización, el ácido nucleico
introducido es preferiblemente ADN que puede estar en la forma de
ADN desnudo, ADN formulado con lípidos cargados o no cargados, ADN
formulados en liposomas, ADN incluido en un vector viral, ADN
formulado con una proteína o polipéptido que facilita la
transfección, ADN formulado con una proteína o polipéptido de
dirección, ADN formulado con agentes que precipitan calcio, ADN
acoplado a una molécula vehículo inerte, ADN encapsulado en un
polímero, por ejemplo, en PLGA (véase, la tecnología de
microencapsulación descrita en el documento 98/31398) o en quitina o
quitosan, y ADN formulado con un adyuvante. En el contexto se
observa que prácticamente todas las consideraciones que pertenecen
al uso de adyuvante en la formulación de vacuna tradicional se
aplican para la formulación de vacunas de ADN. Por lo tanto, todas
las descripciones en esta memoria descriptiva que se refieren al uso
de adyuvantes en el contexto de las vacunas a base de polipéptidos
se aplican mutatis mutandi a su uso en la tecnología de
vacunación de ácidos nucleicos.
Como para las vías de administración y esquemas
de administración de las vacunas a base de polipéptido que se han
detallado anteriormente, éstas son también aplicables a las vacunas
de de ácido nucleico de la invención y todas las descripciones
anteriores pertenecen a vías de administración y esquemas de
administración para aplicar mutatis mutandis a ácidos
nucleicos. A esto se debe añadir que las vacunas de ácidos nucleicos
se pueden administrar adecuadamente por vía intravenosa y por vía
intraarterial. Además, se sabe bien en la técnica que las vacunas de
ácido nucleico se pueden administrar mediante el uso de una llamada
pistola de genes, y por lo tanto éste y modos equivalentes de
administración se consideran como parte de la presente invención.
Finalmente, también el uso de un VLN en la administración de ácidos
nucleicos se ha reseñado que produce buenos resultados, y por lo
tanto este modo particular de administración se prefiere de modo
particular.
Además el (los) ácido (s) nucleico (s) usado (s)
como agente de inmunización pueden contener regiones que codifican
el 1º, 2º y/o 3º resto, por ejemplo, en la forma de sustancias
inmunomoduladoras descritas anteriormente tales como las citoquinas
descritas como adyuvantes útiles. Una versión preferida se esta
realización comprende el tener al región codificadora para el
análogo y al región codificadora para el inmunomodulador en
diferentes marcos de lectura o al menos bajo el control de
promotores diferentes. Por lo tanto se evita que el análogo o
epítope se produzca como un agente de fusión para el modulador. Como
alternativa, se pueden usar dos fragmentos de nucleótidos distintos,
pero éste se prefiere menos debido a la ventaja de asegurar la co -
expresión cuando tienen ambas regiones codificadoras incluidas en
la misma molécula.
De acuerdo con lo anterior, la invención se
refiere a una composición para inducir la producción de anticuerpos
contra APP o A\beta, comprendiendo al composición
- -
- un fragmento de ácido nucleico o un vector de la invención (véase la descripción de vectores más adelante), y
- -
- un vehículo farmacéutica e inmunológicamente aceptable y/o vehículo y/o adyuvante como se ha descrito anteriormente.
En circunstancias normales, el ácido nucleico
que codifica variantes en la forma de un vector en el que la
expresión está bajo el control de un promotor viral. Para
descripciones más detalladas de vectores de acuerdo con la
invención, véase, la descripción más adelante. También,
descripciones detalladas con relación a la formulación y uso de
vacunas de ácido nucleico están disponibles, véase Donnelly JJ y
col., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617 - 648 y Donnelly JJ y col.,
1997, Life Sciences 60: 163 - 172.
Una tercera alternativa para efectuar la
presentación del polipéptido amiloidogénico modificado al sistema
inmune es el uso de tecnología de vacuna viva. En la vacunación
viva, la presentación al sistema inmune se efectúa mediante la
administración, al animal, de un microorganismo no patogénico que se
ha transformado con un fragmento de ácido nucleico que codifica un
polipéptido amiloidogénico modificado o con un vector que incorpora
tal fragmento de ácido nucleico. El fragmento no patogénico puede
ser cualquier cepa bacteriana atenuada adecuada (atenuada por medio
de subcultivo o por medio de la eliminación de productos de
expresión patogénica mediante tecnología de ADN recombinante), por
ejemplo, Mycobacteriun bovis BCG., Streptococcus spp.
no patogénico., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae,
Shigella, etc. Las revisiones con relación a la preparación de
vacunas vivas establecidas en la técnica se pueden, por ejemplo,
encontrar en Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492 - 1496 y Walter PD,
1992, Vaccine 10: 977 - 990. Para detalles acerca de los fragmentos
de ácidos nucleicos y vectores usados en tales vacunas vivas, véase
la descripción más adelante.
Como una alternativa a las vacunas vivas
bacterianas, el fragmento de ácido nucleico de la invención descrita
más adelante se pueden un vector de vacuna viral no virulento tal
como una cepa de vaccinia o cualquier otro pox virus adecuado.
Normalmente, el microorganismo o virus no
patogénico, se administra solamente una vez al animal, pero en
ciertos casos, puede ser necesario administrar el microorganismo más
de una vez en toda la vida con el fin de mantener inmunidad
protectora. Incluso se contempla que los esquemas de inmunización
como los detallados anteriormente para la vacunación de polipéptidos
será útil cuando se usan vacunas de virus o vivas.
Como alternativa, la vacunación viva o de virus
se vacuna con la vacunación previa o posterior de polipéptidos y/o
ácidos nucleicos. Por ejemplo, es posible efectuar inmunización
primaria con una vacuna viva o de virus seguida de inmunizaciones de
recuerdo posteriores usando el planteamiento de polipéptidos o de
ácidos nucleicos.
El microorganismo o virus se puede transformar
con ácido (s) nucleicos (s) que contienen regiones que codifican el
1º, 2º y/o 3º restos, por ejemplo, en la forma de las sustancias
inmunomoduladoras descritas anteriormente tales como las citoquinas
descritas como adyuvantes útiles. Una versión preferida de esta
realización abarca el tener la región codificadora para el análogo y
la región codificadora para el inmunomodulador en diferentes fases
de lectura o al menos bajo el control de diferentes promotores. Por
lo tanto se evita que el análogo o epítopes se produzcan como
agentes de fusión al inmunomodulador. Como alternativa, se pueden
usar dos fragmentos de nucleótidos distintos como agentes de
transformación. De hecho, el tener el 1º y/o 2º y/o 3º restos en la
misma fase de lectura puede proporcionar como tal producto de
expresión, un análogo de la invención, y tal realización se prefiere
especialmente de acuerdo con la presente invención.
Como se apreciará a partir de la descripción
anterior, la provisión de la invención permite el control de las
enfermedades caracterizadas por depósitos amiloides. En este
contexto, la AD es la diana clave para el procedimiento de la
invención pero también otras enfermedades caracterizadas por
depósitos amiloides son posibles dianas. Por lo tanto, una diana
importante para la invención es tratar y/o prevenir y/o mejorar la
AD u otras enfermedades caracterizadas por deposición de amiloides,
que comprende la regulación hacia debajo de APP o A\beta a tal
grado que la cantidad de amiloide disminuye significativamente.
Se prefiere especialmente que la reducción en
amiloide de cómo resultado una inversión del equilibrio entre
formación amiloide y degradación/eliminación amiloide, es decir, que
la velocidad de degradación/eliminación de amiloide lleve a exceder
la velocidad de formación de amiloide. Controlando cuidadosamente el
número e impacto inmunológico de inmunizaciones del individuo en
necesidad de las mismas y será posible obtener un equilibrio con el
tiempo que da como resultado una reducción neta de depósitos de
amiloide sin tener excesivos efectos adversos.
Como alternativa, si en un individuo no es
posible eliminar o reducir la existencia de depósitos de amiloide la
invención permite una reducción clínicamente significativa en la
formación de nuevo amiloide, por lo tanto prolongando
significativamente el tiempo donde la afección patológica no es
debilitante. Debe ser posible controlar la velocidad de depósito de
amiloide o bien midiendo la concentración en suero de amiloide (que
se cree que está en equilibrio con el material depositado)), o
usando barrido por tomografía de emisión de positrones (PET), véase
Small GW, y col., 1996, Ann N Y Acad Sci 802: 70 - 78.
Otras enfermedades y afecciones en las que los
medios y usos actuales se pueden usar en el tratamiento o mejoría de
una forma análoga se han mencionado anteriormente en los
"antecedentes de la invención" (amiloidosis sistémica,
diabetes de comienzo en la madurez, enfermedad de parkinson,
enfermedad de Huntington, demencia frontotemporal y las
encefalopatías espongiformes transmisibles relacionadas con priones)
o se enumeran más adelante en la sección de encabezamiento "otras
enfermedades causadas por amiloides y proteínas asociadas a
ellas".
Como será evidente a partir de lo anterior, la
presente invención se basa en el concepto de inmunizar individuos
contra el antígeno amiloidogénico con el fin de obtener una cantidad
reducida de depósitos de de amiloides relacionados con la patología.
La forma preferida de obtener tal inmunización es usar versiones
modificadas del polipéptido amiloidogénico, proporcionando por lo
tanto moléculas que no se han descrito previamente en la
técnica.
Se cree que los análogos descritos en esta
memoria descriptiva son inventivas por derecho propio, y por lo
tanto una parte importante de la invención pertenece a un análogo
como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, cualquier
descripción presentada en esta memoria descriptiva que pertenece a
APP o A\beta modificadas son relevantes para los propósitos de
descripción de análogos amiloidogénicos de la invención, y
cualquiera de tales descripciones se aplica mutatis mutandi a
la descripción de estos análogos.
Se debe observar que las moléculas
amiloidogénicas modificadas comprenden modificaciones que dan como
resultado un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al
menos 70% con una proteína amiloidogénica o con una subsecuencia de
la misma de al menos 10 aminoácidos de longitud. Se prefieren
identidades de secuencia mayores, por ejemplo, al menos 75% o
incluso al menos 80, 85, 90, 0 95%. La identidad de secuencia para
proteínas y ácidos nucleicos se pueden calcular como N_{ref} -
N_{dif}) . 100/N_{ref}, en la que N_{dif} es el número total
de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando están
alineadas y en la que N_{ref} es el número de residuos en una de
las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá
una identidad de secuencia de 75% con la secuencia AATCAATC
(N_{dif} = 2 y N_{ref} = 8).
La invención también pertenece a composiciones
útiles en ejercitar el procedimiento de la invención. Por lo tanto
la invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende
una cantidad inmunológicamente eficaz de un análogo como se ha
descrito anteriormente, dicha composición comprende adicionalmente
un diluyente y/o vehículo y/o excipiente farmacéutica e
inmunológicamente aceptable y opcionalmente un adyuvante. En otras
palabras, esta parte de la invención se refiere a formulaciones de
polipéptido amiloidogénico modificado, esencialmente como se ha
descrito anteriormente. La elección de adyuvantes, portadores y
vehículos, está de acuerdo con la línea que se ha descrito
anteriormente cuando se menciona la formulación de polipéptido
amiloidogénico modificado y no modificado para uso en el
procedimiento de la invención para la regulación hacia debajo de APP
o A\beta.
Los polipéptidos se preparan de acuerdo con
procedimientos bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos más
largos se preparan normalmente por medio de la tecnología génica
recombinante que incluye la introducción de una secuencia de ácido
nucleico que codifica el análogo en un vector adecuado,
transformación de una célula hospedadora adecuada con el vector,
expresión por la célula hospedadora de la secuencia de ácido
nucleico, recuperación del producto de expresión de las células
hospedadoras o su sobrenadante en cultivo, y posterior purificación
y modificación adicional opcional, por ejemplo, replegamiento o
derivatización.
Se preparan preferiblemente péptidos más cortos
por medio de técnicas bien conocidas de síntesis de péptidos en fase
líquida. Sin embargo, recientes avances en esta tecnología han hecho
posible la producción de polipéptidos de longitud completa y
proteínas por estos medios, y por lo tanto está también dentro del
alcance de la presente invención para preparar las construcciones
largas por medios sintéticos.
Se apreciará a partir de la descripción anterior
que los polipéptidos amiloidogénicos modificados se pueden preparar
mediante tecnología génica recombinante pero también por medio de
síntesis o semisíntesis química; las últimas dos opciones son
especialmente relevantes cuando la modificación consiste en
acoplamiento a moléculas no proteináceas tales como polímeros de
carbohidrato y de hecho también cuando la modificación comprende la
adición de cadenas laterales o grupos laterales a una cadena de
péptidos derivada de APP o A\beta.
Para el propósito de tecnología génica
recombinante, y de hecho también para el propósito de inmunización
de ácido nucleico, los fragmentos de ácido nucleico que codifican
polipéptido amiloidogénico modificado son productos químicos
importantes. Por lo tanto, una parte importante de la invención
pertenece a un fragmento de ácido nucleico que codifica un análogo
de polipéptido amiloidogénico, es decir un polipéptido derivado de
APP o A\beta que o bien comprende la secuencia natural a la que se
ha añadido o insertado una gente de fusión o, preferiblemente un
polipéptido derivado de APP o A\beta en el que se ha introducido
un epítope de células T extraño mediante la inserción y/o adición,
preferiblemente mediante sustitución y/o supresión. Los fragmentos
de ácido nucleico de la invención son o bien fragmentos de ADN o
ARN.
Los fragmentos de ácido nucleico de la invención
normalmente se insertarán en vectores adecuados para formar vectores
de clonación o expresión que llevan fragmentos de ácido nucleico de
la invención; tales vectores novedosos son también parte de la
invención. Detalles concernientes a la construcción de estos
vectores de la invención se describirán en el contexto de células y
microorganismos transformadas más adelante. Los vectores, pueden,
dependiendo del propósito y tipo de aplicación, estar en la forma de
plásmidos, fagos, cósmicos, minicromosomas, o virus, sino también
ADN desnudo que solamente se expresa transitoriamente en ciertas
células en un vector importante. Los vectores de clonación y
expresión preferidos de la invención son capaces de replicación
autónoma, permitiendo por lo tanto altos números de copias para el
propósito de expresión de alto nivel o replicación de alto nivel
para la clonación superior.
El esquema general de un vector de la invención
comprende las siguientes características en la dirección 5'
\rightarrow 3' y en enlace operable: un promotor para dirigir la
expresión del fragmento de ácido nucleico de la invención,
opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un
péptido guía que permite la secreción (a la fase extracelular o,
cuando sea aplicable, en el periplasma) de o integración en la
membrana del fragmento polipeptídico, el fragmento de ácido nucleico
de la invención, y opcionalmente una secuencia de ácido nucleico
que codifica un terminador. Cuando se opera con vectores de
expresión en cepas productoras de líneas celulares es para el
propósitos de estabilidad genética de la célula transformada
preferida que el vector cuando se introduce en una célula
hospedadora se integre en el genoma de la célula hospedadora. En
contraste, cuando se trabaja con vectores a usar para efectuar la
expresión in vivo en un animal (es decir, cuando se usa el
vector en vacunación de ADN) es por razones de seguridad preferidas
que el vector es incapaz de integrarse en el genoma de la célula
hospedadora; típicamente, se usan ADN desnudo o vectores virales no
integrantes, cuyas elecciones se conocen por los expertos en la
técnica.
Los vectores de la invención se usan para
transformar células hospedadoras para que produzcan el polipéptido
amiloidogénico modificado de la invención. Tales células
transformadas, que también son parte de la invención, pueden ser
células o líneas celulares cultivadas usadas para la propagación de
fragmentos y vectores de ácidos nucleicos de la invención, o se usan
para producción recombinante de los polipéptidos amiloidogénicos de
la invención. Como alternativa, las células transformadas pueden ser
cepas de vacuna viva en las que el fragmento de ácido nucleico (una
copia única o múltiple) se han insertado de manera que efectúa la
secreción o integración en la membrana bacteriana o pared celular
del polipéptido amiloidogénico modificado.
Las células transformadas preferidas de la
invención son microorganismos tales como bacterias (tales como las
especies Escherichia [por ejemplo E. coli], Bacillus,
por ejemplo, Bacillus subtilis], Salmonella, o
Mycobacterium [preferiblemente no patogénico, por ejemplo,
M. bovis BCG]), levaduras (tales como Saccharomyces
cerevisiae), y protozoos. Como alternativa, las células
transformadas se derivan de un organismo multicelular tal como
hongo, una célula de insecto, un célula vegetal, o una célula de
mamífero. Las más preferidas son células derivadas de un ser humano,
véase, la descripción de líneas celulares y vectores más adelante.
Recientes resultados han mostrado gran promesa en el uso de una
línea celular de Drosophila melanogaster comercialmente
disponible (la línea celular Schneider 2 (S_{2}) y sistema de
vector disponible de Invitrogen) para la producción recombinante de
polipéptidos en el laboratorios de los solicitantes, y por lo tanto
este sistema de expresión se prefiere particularmente.
Para los propósitos de clonación y/o expresión
optimizada se prefiere que la célula transformada sea capaz de
replicar el fragmento de ácido nucleico de la invención. Las células
que expresan el fragmento de ácido nucleico son realizaciones útiles
preferidas de la invención; se pueden usar para la preparación a
pequeña escala o gran escala del polipéptido amiloidogénico
modificado o, en el caso de bacterias no patogénicas, como
constituyentes de vacuna en una vacuna viva.
Cuando se producen las moléculas de la invención
por medio de células transformadas, es conveniente, aunque lejos de
los esencial, que el producto de expresión o bien se exporte en el
medio de cultivo o se lleve sobre la superficie de la célula
transformada.
Cuando una célula productora eficaz se ha
identificado, se prefiere, en su propia base, establecer una línea
celular estable que lleva el vector de la invención y que expresa el
fragmento de ácido nucleico que codifica el polipéptido
amiloidogénico modificado. Preferiblemente, esta línea celular
estable secreta o lleva el análogo de la invención, facilitando por
lo tanto la purificación del mismo.
En general, los vectores plásmidos que contienen
replicón y secuencias de control que se derivan de especies
compatibles con la célula hospedadora se usan junto con los
hospedadores. El vector ordinariamente lleva un sitio de
replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de
proporcionar selección fenotípica en las células transformadas. Por
ejemplo, E. coli se transforma típicamente usando pBR322, un
derivado plásmido de la especie E. coli (véase, por ejemplo,
Bolivar y col., 1977). El plásmido pBR322 contiene genes para
resistencia a ampicilina y tetraciclina y se este modo proporciona
medios fáciles para identificar células transformadas. El plásmido
pBR, u otros plásmido o fago microbiano también debe contener, o
estar modificado para contener, promotores que se pueden usar por
los microorganismos procarióticos para expresión.
Los promotores más comúnmente usados en
construcciones de ADN recombinante incluyen la
B-lactamasa (penicilinasa) y sistemas de promoción
de lactosa (Chang y col., 1978; Itakura y col., 1977; Goeddel y
col., 1979; EP-A-0 036 776).
Mientras éstos son los más comúnmente usados, otros promotores
microbianos se han descubierto y utilizado, y se han publicado los
detalles relativos a sus secuencias de nucleótidos, permitiendo que
un trabajador experto les ligue funcionalmente con vectores de
plásmidos (Siebwenlist y col., 1980). Ciertos genes de procariotas
se pueden expresar eficazmente en E. coli a partir de sus
propias secuencias promotoras, evitando la necesidad de adición de
otro promotor mediante medios artificiales.
Además de procariotas, también se pueden usar
microbios eucarióticos, tales como cultivos de levaduras, y por lo
tanto el promotor debe ser capaz de dirigir la expresión.
Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero es el
microorganismo más comúnmente usado entre los microorganismos
eucarióticos, aunque numerosas otras cepa están comercialmente
disponibles. Para la expresión en Saccharomyces, se usa, por
ejemplo, comúnmente el plásmido YRp7 (Stinchcomb y col., 1979;
Kingsman y col., 1979; Tschemper y col., 1980). Este plásmido ya
contiene el gen trpl que proporciona un marcador de selección para
una cepa mutante de levaduras que carece de la capacidad de
desarrollarse en triptófano por ejemplo ATCC Nº 44076 o
PEP4-1 (Jones, 1977). La presencia de la lesión de
trpl como una característica del genoma de la célula hospedadora de
levadura entonces proporciona un ambiente eficaz para detectar la
transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.
Las secuencias promotoras adecuadas en vectores
de levaduras incluyen los promotores para la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzman y col., 1980) u
otras enzimas glucolíticas (Hess y col., 1968; Holland y col.,
1978), tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructo
quinasa, glucosa-6-fosfato
isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato
quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y
glucoquinasa. En la construcción de plás midos de expresión
adecuados, las secuencias de terminación asociadas a estos genes
también están ligados en el extremo 3' del vector de expresión de la
secuencia deseada a expresar que proporciona poliadenilación del
ARNm y terminación.
Otros promotores, que tienen la ventaja
adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento
son la región promotora para la alcohol deshidrogenasa 2,
isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas al
metabolismo de nitrógeno, y la gliceraldehído-3
fosfato deshidrogenasa anteriormente mencionada, y las enzimas
responsables para la utilización maltosa y galactosa. Es adecuado
cualquier vector plásmido que contiene un promotor compatible de
levadura, origen de secuencias de replicación y terminación.
Además de los microorganismos, también se pueden
usar como huéspedes cultivos de células derivados de organismos
multicelulares. En principio, cualquiera de tales cultivos celulares
es operativo, si es de cultivo vertebrado o invertebrado. Sin
embargo, ha sido de mayor interés en células de vertebrados, y la
propagación de vertebrado en cultivo (cultivo de tejidos) ha llegado
a ser un procedimiento rutinario en los años recientes (Tissue
Culture, 1973). Los ejemplos de tales líneas de células hospedadoras
útiles son las células VERO y HeLa, líneas de células de ovario de
hámster chino, y células W138, BHK, COS-7 293,
Spodoptera frugiperda (SF) (comercialmente disponibles como
sistemas de expresión completa a partir de, entre otros, Protein
Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, Estados Unidos y
de Invitrogen), y líneas de células MDCK. En la presente invención,
una línea celular especialmente preferida es S_{2} disponible de
Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Netherlands.
Los vectores de expresión para tales células
incluyen ordinariamente (si es necesario) un origen de replicación,
un promotor localizado en frente del gen a expresar, junto con
cualquier sitio de unión a ribosoma necesario, sitios de ayuste de
ARN, sitio de poliadenilación, y secuencias terminadoras
transcripcionales.
Para uso en células de mamíferos, las funciones
de control sobre los vectores de expresión se proporcionan a menudo
por material viral. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados se
derivan de polioma, Adenovirus 2, y los más frecuentemente Virus de
simio 40 (SV40). Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40
son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente
del virus como un fragmento que también contiene el origen viral
SV40 de replicación (Fiers y col., 1978). También se pueden usar
fragmentos de SV40 menores o mayores, con tal que se incluya la
secuencia de aproximadamente 250 pared de bases que se extiende
entre el sitio HindIII hacia el sitio BgII localizado
en el origen viral de replicación. Además, también es posible, y a
menudo deseable, utilizar secuencias promotoras o de control, con
tal que tales secuencias de control sean compatibles con los
sistemas de células hospedadoras.
Un origen de replicación se puede proporcionar o
bien mediante construcción del vector que incluye un Orión exógeno,
tal como se puede derivar de SV40 u otro virus (por ejemplo,
Polioma, Adeno, VSV, BPV) o se puede proporcionar por el mecanismo
de replicación cromosómica de la célula hospedadora. Si el vector
está integrado en el cromosoma de la célula hospedadora, lo último
es a menudo suficiente.
Será evidente para los expertos en la técnica
que no todas las variantes o modificaciones posibles de polipéptidos
amiloidogénicos de origen natural tendrán la capacidad de generar
anticuerpos en un animal que son de reacción cruzada con la forma
natural. Sin embargo, no es difícil establecer un rastreo
convencional eficaz para moléculas amiloidogénicas que cumplirán los
requerimientos mínimos para la reactividad inmunológica descrita en
esta memoria descriptiva. Por lo tanto, un procedimiento para la
identificación de un polipéptido amiloidogénico modificado que es
capaz de incluir anticuerpos contra polipéptido amiloidogénico no
modificado en una especie animal en la que el polipéptido
amiloidogénico no modificado es una autoproteína (no inmunogénica),
comprendiendo el procedimiento
- -
- preparar, mediante las técnicas de síntesis de péptidos o de ingeniería genética, un conjunto de polipéptidos amiloidogénicos modificados en los que los aminoácidos se han añadido a, insertados en, suprimidos de, o sustituidos en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido amiloidogénico de la especie animal dando lugar por lo tanto a secuencias de aminoácidos en el conjunto que comprende epítopes de células T que son extraños a la especie animal, o preparando un conjunto de fragmentos de ácidos nucleicos que codifican el conjunto de polipéptidos amiloidogénicos modificados mutuamente distintos,
- -
- ensayar miembros del conjunto de polipéptidos amiloidogénicos modificados o fragmentos de ácidos nucleicos por su capacidad de inducir la producción de anticuerpos por la especie animal contra la APP o A\beta no modificada, e
- -
- identificar y opcionalmente aislar el (los) miembro (s) del conjunto de polipéptidos amiloidogénicos modificados que significativamente induce la producción de anticuerpos contra polipéptido amiloidogénico no modificado en la especie o identificar y opcionalmente aislar los productos de expresión de polipéptidos codificados por miembros del conjunto de fragmentos de ácidos nucleicos que significativamente induce la producción de anticuerpos contra APP o A\beta no modificada en la especie animal.
En este contexto, el "conjunto de polipéptidos
amiloidogénicos modificados mutuamente distintos"es una colección
de polipéptidos amiloidogénicos modificados no idénticos que, por
ejemplo, se han seleccionado en base de los criterios descritos
anteriormente (por ejemplo, en combinación con estudios de patrones
de dicroísmo circular, espectro de RMN, y/o de difracción de rayos
X). El conjunto puede consistir en solamente unos pocos miembros
pero se contempla que el conjunto pueda contener varios cientos de
miembros.
El ensayo de miembros del conjunto se puede por
último realizar in vivo, pero se pueden aplicar numerosos
ensayos in vitro que estrechan el número de moléculas
modificadas que servirán el propósito de la invención.
Ya que el objetivo de introducción de los
epítopes de células T extraños es soportar la respuesta de células B
por el auxiliar de las células T, un prerrequisito es que la
proliferación de las células T esté inducido por el polipéptido
amiloidogénico modificado. La proliferación de las células T se
puede ensayar mediante ensayos de proliferación normalizados in
vitro. En resumen, una muestra enriquecida por células T se
obtiene a partir de un sujeto y posteriormente se mantiene en
cultivo. El cultivo de las células T se pone en contacto con las APC
del sujeto que han tomado previamente la molécula modificada y
procesado para presentar sus epítopes de células T. La proliferación
de células T se controla y se compara con un control adecuado (por
ejemplo, células T en cultivo puestas en contacto con las APC que se
han procesado intactas, polipéptido amiloidogénico nativo). Como
alternativa, la proliferación se puede medir determinando la
concentración de citoquinas relevantes liberadas por las células T
en respuesta a su reconocimiento de células T extrañas.
Habiendo hecho altamente probable que al menos
un polipéptido amiloidogénico modificado es cualquier tipo de
conjunto capaz de inducir la producción de anticuerpo contra APP o
A\beta, es posible preparar una composición inmunogénica que
comprende al menos un polipéptido amiloidogénico modificado que es
capaz de de inducir anticuerpos contra APP o A\beta no modificada
en una especie animal en la que APP o A\beta no modificada es una
autoproteína, comprendiendo el procedimiento la mezcla del (de los)
miembro (s) del conjunto que induce significativamente la producción
de anticuerpos en la especie animal que son reactivos con la APP o
A\beta con un vehículo y/o diluyente y/o excipiente farmacéutica o
inmunológicamente aceptable, opcionalmente en combinación con al
menos un adyuvante farmacéutica e inmunológicamente aceptable.
Los ensayos descritos anteriormente de conjuntos
de polipéptidos se llevan convenientemente a cabo inicialmente
preparando un número de secuencias de vectores o de ácidos nucleicos
mutuamente distintos de la invención, insertando éstos en vectores
de expresión, transformando células hospedadoras adecuadas (o
animales hospedadores) con los vectores, y efectuando la expresión
de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención. A estas
etapas pueden seguir el aislamiento de los productos de expresión.
Se prefiere que las secuencias de ácido nucleico y/o vectores se
preparen mediante procedimientos que comprenden ejercitar una
técnica de amplificación molecular tal como PCR o mediante la
síntesis de ácidos nucleicos.
Además de las proteínas muy a menudo asociadas a
APP, ApoE4 y Tau de Alzheimer, existe una larga lista de otras
proteínas que de algunas maneras han estado unidas a AD, o bien
mediante su presencia directa en placas u ovillos de cerebros de AD
o mediante su asociación genética aparente con un incremento del
riesgo de desarrollar AD. La mayoría, si no todos estos antígenos
están juntos con la A\beta, APP, presenilina y ApoE4 anteriormente
descritas, proteínas dianas putativas en cierta realización de la
presente invención. Estas dianas putativas se describen ya
completamente en el documento WO 01/62284. Por lo tanto, estas
dianas putativas solamente se mencionarán brevemente en esta memoria
descriptiva, mientras que una descripción minuciosa de antecedentes
se puede encontrar en el documento WO 01/62282.
Alfa1-antiquimiotripsina (ACT);
Alfa2-macroglobulina; ABAD (alcohol deshidrogenasa
de unión a A\beta-péptido); APLP1 y -2 (precuersor
de amiloide de tipo proteína 1 y -2); AMY117; Bax;
Bcl-2; Bleomicin hidrolasa; BRI/ABRI; Cromogranina
A; Clusterin/apoJ; proteína de unión a CRF (factor de liberación de
corticotropina); EDTF (factor tóxico derivado de endotelio); Heparan
sulfato proteoglicanos; proteína - 2 mediadora de la respuesta de
colapsina humana; Huntingtin (proteína de la enfermedad de
Huntington); ICAM-I; IL-6; antígeno
CD68 asociado a lisosomas; P21 ras; PLC-delta 1
(fosfolipasa C isoenzima delta 1); componente sérico
P-amiloide (SAP); Sinaptofisina; Sinucleína
(alfa-sinucleína o NACP); y TGF-b1
(factor b1 de factor de crecimiento transformador).
Los medios y procedimientos descritos
actualmente para la regulación hacia debajo de APP o A\beta se
pueden combinar con terapias, por ejemplo, inmunoterapia específica
activa, contra cualquiera de estos polipéptidos amiloidogénicos
diferentes.
Aparte de la enfermedad de Alzheimer, también la
angiopatía amiloide cerebral es una enfermedad que sería una diana
adecuada para la tecnología descrita actualmente.
Se contempla que la mayoría de los
procedimientos para inmunizar contra APP o A\beta se debe
restringir a la qinmunización que da lugar a anticuerpos que
reaccionan de manera cruzada con la APP o A\beta. No obstante, en
algunos casos será de interés para inducir inmunidad celular en la
forma de respuestas de CTL contra células que presentan epítopes de
Clase I de MCH a partir de polipéptidos amiloidogénicos - esto puede
ser un expediente en aquellos casos en los que la reducción en el
número de células que producen APP o A\beta no constituyen un
efecto adverso grave. En tales casos cuando se desean las respuestas
de CTL se prefiere utilizar las enseñanzas del documento WO 00/20027
del solicitante.
Las moléculas que comprenden un epítope auxiliar
T y péptidos de APP o A\beta que representan o incluyen epítopes
de células B unidos de manera covalente a la molécula de polímeros
no inmunógenos que actúan como un vehículo, por ejemplo un
poli-hidroxipolímero activado multivalente,
funcionará, como se ha mencionado anteriormente como una molécula
de vacuna que solamente contiene las partes inmunológicamente
relevantes, se pueden obtener, y son realizaciones interesantes en
las variantes d y e descritas anteriormente. Se pueden usar los
epítopes promiscuos o también llamados auxiliares T si por ejemplo
la diana para la vacuna es un autoantígeno tal como APP o A\beta.
Además, los elementos que potencian la respuesta inmunológica se
podría también acoplar al vehículo y por lo tanto actuar como un
adyuvante. Tales elementos podrían ser manosa, tuftsina, muramil
dipéptido, motivos de CpG etc. En ese caso, la formulación de
adyuvantes posterior del producto de vacuna pudiera ser innecesaria
y el producto se podría administrar en agua o solución salina
pura.
Acoplando los epítopes de células T citotóxicas
(CTL) junto con los epítopes auxiliares T también será posible
generar específico de CTL para el antígeno a partir del que el
epítope de CTL se deriva. Los elementos que promueven la captación
del producto al citosol, tal como manosa, del APC, por ejemplo un
macrófago, también se podría acoplar al vehículo junto con la CTL- y
epítope auxiliar T y potencian la respuesta de CTL.
La relación de epítopes de células B y epítopes
auxiliares T (P2 y P30) en el producto final se puede variar
variando la concentración de estos péptidos en al etapa de síntesis.
Como se ha mencionado anteriormente, la molécula inmunógena se puede
etiquetar con, por ejemplo, manosa, tuftsin, motivos CpG u otras
sustancias estimulantes inmunes (descritas en esta memoria
descriptiva) mediante la adición de éstas, si es necesario usando
por ejemplo derivados aminados de las sustancias, al tampón
carbonato en la etapa de síntesis.
Si un polihidroxipolímero activado insoluble se
usa para combinar los péptidos que contienen el epítope de células B
de APP o A\beta y epítopes auxiliares T puede, como se ha
mencionado anteriormente realizarse como una síntesis de fase sólida
y el producto final se puede recoger y purificarse mediante lavado y
filtración. Los elementos a acoplar a un polihidroxipolímero
activado de tresilo (péptidos, etiquetas, etc) se pueden añadir al
polihidroxipolímero a bajo pH, por ejemplo, pH 4 - 5, y se permite
que se distribuye de manera igual en el "gel" mediante difusión
pasiva. Posteriormente, el pH se puede incrementar hasta pH 9 - 10
para comenzar la reacción de los grupos amino primarios en los
péptidos y etiquetas a los grupos tresilo en el polihidroxipolímero.
Después de acoplar los péptidos y por ejemplo los elementos de
estimulación inmune el gel se muele para formar partículas de tamaño
adecuado para inmunización.
Por lo tanto tal inmunógeno comprende
- a)
- al menos una primera secuencia de aminoácidos derivada de APP o A\beta, como se ha descrito anteriormente, y
- b)
- al menos una segunda secuencia de aminoácidos que incluye un epítope de células T auxiliares T,
en el que cada uno de al menos la primera y al
menos la segunda secuencias de aminoácidos están acopladas a un
vehículo polihidroxipolimérico activado farmacéuticamente
aceptable.
Con el fin de que las secuencias de aminoácidos
se acoplen al polihidroxipolímero es normalmente necesario
"activar" el polihidroxipolímero con un grupo reactivo adecuado
que puede formar el enlace necesario a la secuencias de
aminoácidos.
El término "polihidroxipolímero" pretende
que tenga el mismo significado que en el documento WO 00/05316, es
decir el polihidroxipolímero puede tener exactamente las mismas
características que se enseñan específicamente en esa solicitud. Por
lo tanto, el polihidroxipolímero puede ser soluble o insoluble en
agua (requiriendo de esta manera diferentes etapas de síntesis
durante la preparación del inmunógeno). El polihidroxipolímero se
puede seleccionar entre compuestos polihidroxipoliméricos de origen
natural y compuestos polihidroxi sintéticos.
Los polihidroxipolímeros específicos y
sintéticos son polisacáridos seleccionados entre acetan,
amilopectina, goma agar - agar, azarosa, alginatos, goma arábiga,
carregenano, celulosa, ciclodextrinas, dextrano, furcelaran,
galactomanan, gelatina, gatti, glucano, glicógeno, guar, Baraya,
konjac/A, goma de semilla de acacia falsa, manan, pectina, pisillo,
pululan, almidón, tamarina, tragacanto, xantano, xilano, y
xiloglucano. El dextrano se prefiere especialmente.
Sin embargo, el polihidroxipolímero también se
puede seleccionar entre poli (etilenimina) (PEI) altamente
ramificada, tetratienilen vinileno, Kevalr (largas cadenas de
poli-parafenil tereftalamida), poli (uretanos), poli
(siloxanos), polidiemtilsiloxano, silicona, poli (metil metacrilato)
(PMMA), polo (alcohol vinílico), poli (vinil pirrolidona), poli
(2-hidroxi etil metacrilato), poli
(N-vinil pirrolidona), poli (alcohol vinílico), poli
(ácido crílico), politetrafluoroetileno (PTFE), poli archilamida,
poli (etilen-co-vinil acetato), poli
(etilen glicol) y derivados, poli (ácido metacrílico), poliactidas
(PLA), poliglicolidas (PGA), poli
(lactida-coglicolidas) (PLGA), polianhídridos, y
poliortoésteres.
El peso molecular medio (peso) del
polihidroxipolímero en cuestión (es decir antes de activación) es
típicamente al menos 1.000, tal como al menos 2.000, preferiblemente
en el intervalo de 2.500 - 2.000.000, más preferiblemente en el
intervalo de 3.000 - 1.000.000, en particular en el intervalo de
5.000 - 500.000. En los ejemplos se ha mostrado que los
polihidroxipolímeros que tienen un peso molecular medio en el
intervalo de 10.000 - 200.000 son particularmente ventajosos.
El polihidroxipolímero es preferiblemente
soluble en agua hasta un grado de al menos 10 mg/ml, preferiblemente
al menos 25 mg/ml, tal como al menos 50 mg/ml, en particular al
menos 100 mg/ml, tal como al menos 150 mg/ml a temperatura ambiente.
Se sabe que el dextrano, incluso cuando se activa como se ha
descrito anteriormente, cumple con los requerimientos con respecto a
la solubilidad en agua.
Para alguno de los polihidroxipolímeros más
interesantes, la relación entre grupos C (átomos de carbono) y OH
(grupos hidroxi) de los polihidroxipolímeros inactivados (es decir,
el polihidroxipolímero nativo antes de la activación) está en el
intervalo de 1,3 a 2,5, tal como 1,5 - 2,3, preferiblemente 1,6 -
2,1, en particular 1,85 - 2,05. Sin estar unido a ninguna teoría
específica, se cree que tal como la relación C/OH del
polihidroxipolímero inactivado representa un nivel altamente
ventajoso de hidrofilicidad. El alcohol polivinílico y polisacáridos
son ejemplos de polihidroxipolímeros que cumplen con este
requerimiento. Se cree que la relación anteriormente mencionada debe
ser aproximadamente la misma para el polihidroxipolímero activado
como la relación de activación debe ser bastante baja.
El término "vehículo de
polihidroxipolímero" pretende significar la parte del inmunógeno
que lleva las secuencias de aminoácidos. Como regla general, el
vehículo de polihidroxipolímero tiene sus límites exteriores cuando
las secuencias de aminoácidos se pueden escindir medianteuna
peptidasa, por ejemplo, en una célula presentadora de antígeno que
procesa el inmunógeno. Por lo tanto, el vehículo de
polihidroxipolímero puede ser el polihidroxipolímero con un grupo de
activación, donde el enlace entre el grupo de activación y la
secuencia de aminoácidos se puede escindir por una peptidasa en una
APC, o el vehículo de polihidroxipolímero puede ser un
polihidroxipolímero con grupo de activación y por ejemplo, un
engarce tal como un único aminoácido o un número de aminoácidos D,
donde la última parte del engarce puede unirse a las secuencias de
aminoácidos y escindirse por una peptidasa en la APC.
Como se mencionado anteriormente, los
polihidroxipolímeros llevan grupos funcionales (grupos de
activación), que facilitan el anclaje de péptidos al vehículo. Un
amplio intervalo de grupso funcionales aplicables se conocen en la
técnica, por ejemplo grupos tresil (trifluoroetilsulfonilo),
maleimido, cloroformiato de p-nitrofenilo,
cianogenbromuro, tosil (p-toluensulfonilo), triflil
(trifluorometanosulfonilo), pentafluorobencenosulfonilo, y vinil
sulfona. Los ejemplso preferidos de grupos funcionales dentro de la
presente invención son grupos tresilo, maleimido, tosilo, triflilo,
pentafluorobencenosulfonilo, cloroformiato de
p-nitrofenilo, y vinilsulfonilo, entre los que los
grupos tresilo, maleimido, y tosilo son particularmente
relevantes.
Los polihidroxipolímeros activados por tresilo
se pueden preparar usando cloruro de tresilo como se describe para
activación de dextrano en el ejemplo 1 en el documento WO 00/05316 o
como se ha descrito en Gregorius y col., J. Immunol. Meth. 181
(1995) 65 - 73.
Los polihidroxipolímeros activados por maleimido
se pueden preparar usando isocianato de
p-maleimidofenilo como se describe para activación
de dextrano en el ejemplo 3 del documento WO 00/05316. Como
alternativa, los grupos maleimido se pueden introducir en un
polihidroxipolímero , tal como dextrano, mediante derivatización de
un polihidroxipolímero activado por tresilo (tal como dextrano
activado por tresilo (TAD)) con un compuesto de diamina
(generalmente
H_{2}N-C_{n}H_{2n}-NH_{2},
donde n es 1 - 20, preferiblemente 1 - 8, por ejemplo
1,3-diaminopropano, en exceso y posteriormente se
hace reaccionar los grupos amino introducidos en TAD con reactivos
tales como 4-(N-
maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
de succinimidilo (SMCC), 4-(N-
maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
de sulfa-succinimidilo (sulfo-SMCC),
4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo
(SMP), 4-(p-maleimidofenil)butirato de
sulfa-succinimidilo (sulfa-SMP),
N-\gamma-maleimidobutiriloxi-succinimida
éster (GMBS) o
N-\gamma-maleimidobutiriloxi-sulfosuccinimida
éster. Aunque los diferentes reactivos y vías para la activación da
como resultad formalmente productos activados de maleimida
ligeramente diferentes con respecto a la unión entre la
funcionalidad de maleimida y el resto del grupo hidroxi precursor
sobre el que se realiza la activación, todas y cada una se
consideran como "polihidroxipolímeros activados por
maleimida".
Los polihidroxipolímeros activados por tosilo se
pueden preparar usando cloruro de tosilo como se describe para
activación de dextrano en el ejemplo 2 en el documento WO 00/05316.
Los polímeros activados por triflilo y pentafluorobencenosulfonilo
se preparan como los análogos activados por tosilo o tresilo, por
ejemplo usando los cloruros de ácido correspondientes.
El polihidroxipolímero activado por
cianogenbromuro se puede preparar haciendo reaccionar el
polihidroxipolímero con cianogenbromuro usando procedimientos
convencionales. Los grupos funcionales son normalmente ésteres de
cianatos con dos grupos hidroxi del polihidroxipolímero.
El grado de activación se puede expresar como la
relación entre los grupos hidroxi libres y grupos de activación (es
decir, grupos hidroxi funcionarizados), Se cree que una relación
entre los grupos hidroxi libres del polihidroxipolímero y los
grupos de activación deben estar entre 250:1 y 4:1 con el fin de
obtener un equilibrio ventajoso entre al hidrofilicidad y la
reactividad del polihidroxipolímero. Preferiblemente la relación
está entre 100:1 y 6:1, más preferiblemente entre 60:1 y 8:1, en
particular entre 40:1 y 10:1.
Los políhidroxipolímeros especialmente
interesantes para uso en el procedimiento para producir el
inmunógeno generalmente aplicable de acuerdo con la invención son
polisacáridos activados por tresilo, tosilo y maleimido,
especialmente dextrano activado por tresilo (TAD), dextrano activado
por tosilo (TosAD), y dextrano activado por maleimido (MAD).
Se prefiere que el enlace entre el vehículo de
polihidroxipolímero y las secuencias de aminoácidos unidas a él se
pueden escindir pos una peptidasa, por ejemplo, como una peptidasa
activa en el procesamiento de antígenos en una APC. Se prefiere por
lo tanto que al menos la primera y al menos la segunda secuencias de
aminoácidos cada una de ellas proporcione el resto de nitrógeno de
sus enlace amida respectivo.
El vehículo de polihidroxipolímero puede estar
sustancialmente libre de residuos de aminoácidos, que necesitan que
el grupo de activación proporcione parte de un enlace que se puede
escindir por peptidasa, pero como se ha mencioando anteriormente, el
vehículo también puede incluir simplemente un espaciador que incluye
al menos un aminoácido L. No obstante, al menos la primera y al
menos la segunda secuencias de aminoácidos están normalmente unidas
a la versión activada del polihidroxipolímero mediante el nitrógeno
en el extremo N de la secuencia de aminoácidos.
El inmunógeno generalmente aplicable descrito
anteriormente de la presente invención se puede usar en
procedimientos de inmunización esencialmente como se describe en
esta memoria descriptiva para las vacunas de polipéptidos. Esto es,
todas las descripciones que se refieren a dosificaciones, modo de
administración y formulación de vacunas de polipéptidos para regular
hacia abajo los polipéptidos amiloidogénicos descritos en esta
memoria descriptiva que aplican mutatis mutandi a los
inmunógenos generalmente aplicables.
\newpage
Como se ha descrito anteriormente, una
realización preferida de la presente invención supone el uso de
variantes de polipéptidos amiloidogénicos que son incapaces de de
proporcionar epítopes T_{H} auto - derivados que pueden dirigir
una respuesta inmune contra el polipéptido amiloidogénico.
Sin embargo, los presentes inventores creen que
esta estrategia para diseñar vacunas anti propias, es una tecnología
aplicable que es inventiva por derecho propio. Se debe probar
especialmente en los casos en los que el auto autógeno que se busca
regule hacia debajo de manera lo suficientemente abundante en el
cuerpo de manera que sea posible que pueda producirse la
autoestimulación de una respuesta inmune. Por lo tanto, todas las
descripciones anteriores de esta realización en la medida en que se
refiere a la provisión de una respuesta inmune anti propia contra
APP o A\beta aplivca mutatis mutandi para inmunización
contra otros polipéptidos, especialmente aquellos que están
presentes en cantidades suficientes para ellos para mantener la
respuesta inmune en la forma de una afección autoinmune no
controlada debido a que los epítopes T_{H} autólogos del auto -
polipéptido relevante dirigen la respuesta inmune.
Ejemplo 1
Comparativo
El hecho de que los ratones con inactivación de
la proteína A\beta no muestren ninguna anormalidad o efectos
secundarios adversos, sugieren que la eliminación o reducción de las
cantidades de A\beta serán seguras, Zheng H. (1996).
Los experimentos publicados en los que se
inmunizan animales transgénicos contra la proteína A\beta humana
transgénica sugieren que era posible romper la autotolerancia,
regulación hacia debajo de A\beta se podría obtener mediante
anticuerpos auto - reactivos. Estos experimentos sugieren
adicionalmente que tal regulación hacia debajo de A\beta
potencialmente prevendrían ambos la formación de placas, e incluso
eliminar las placas de A\beta ya formadas del cerebro, véase
Schenk y col., (1999). Pero, tradicionalmente no es posible generar
anticuerpos contra las autoproteínas.
Los datos publicados no proporcionan los medios
para romper la autotolerancia verdadera hacia las verdaderas
autoproteínas. Ni los datos proporcionan los medios información
sobre cómo asegurar que la reacción inmune se dirige solamente a
predominantemente hacia los depósitos de A\beta, y no hacia la
proteína precursora de A\beta unida a la membrana celular, si esto
se considera necesario. Una respuesta inmune generada usando la
tecnología existente presumiblemente generaría una respuesta inmune
hacia las autoproteínas de una forma no regulada de manera que se
puede generar auto - reactividad tan indeseada y excesiva hacia
partes de la proteína A\beta. Por lo tanto, usando estrategias de
inmunización existentes lo más probablemente será incapaz de generar
fuertes respuestas inmunes hacia autoproteínas y además serán
inseguras debido a la potencial fuerte reactividad cruzada hacia la
APP unida a membranas que esté presente en un gran número de células
en el SNC.
La presente invención proporciona los medios de
generar de manera eficaz una fuerte respuesta inmune regulada hacia
las autoproteínas verdaderas que potencialmente podrían formar
placas y provocar enfermedad grave en el SNC o en otros
compartimientos del cuerpo. Una vacuna terapéutica de proteína
A\beta humana segura y eficaz se desarrollará usando esta
tecnología para el tratamiento de la AD.
A la luz de esto, es posible anticipar que la
AD, una enfermedad predicha que lesiona el sistema de atención
sanitaria en el siglo siguiente, se podría curar, o las vacunas
descritas podrían al menos constituir un planteamiento terapéutico
eficaz para el tratamiento de los síntomas y progresión de esta
enfermedad. Esta técnica representa un planteamiento inmunológico
completamente nuevo para bloquear la deposición de amiloides en al
AD y otras enfermedades neurológicas también.
En la siguiente tabla, se indican 35
construcciones contempladas. Todas las posiciones proporcionadas en
la tabla son relativas a la metionina de partida de la
APP(primer aminoácido en la SEC ID Nº 2) e incluyen el
aminoácido tanto de inicio como de final, por ejemplo, el fragmento
de 672 - 714 incluye tanto el aminoácido 672 como el 714. Las
posiciones de inicio como de final para P2 y P30 indican que el
epítope sustituye una parte del fragmento de la APP en las
posiciones indicadas (ambas posiciones incluidas en la sustitución)
- en la mayoría de las construcciones, los epítopes introducidos
sustituyen un fragmento de la longitud del epítope. Los asteriscos
en al tabla tienen el siguiente significado:
*) Solamente una posición para P2 y P30 indica
que el epítope se ha insertado en el derivado de la APP en la
posición indicada (el epítope comienza en el aminoácido adyacente C
- terminalmente a la posición proporcionada).
**) La construcción 34 contiene tres fragmentos
de APP idénticos separados por P30 y P2, respectivamente.
***) La construcción 35 contiene nueve
fragmentos de APP idénticos separados por epítopes P30 y P2
alternativos.
\newpage
La parte de APP contra la que es más interesante
generar una respuesta es el péptido del núcleo de la A\beta de 43
aminoácidos (A\beta - 43, correspondiente a la SEC ID Nº 2,
residuos 672 - 714) que es el principal constituyente de las placas
amiloides en los cerebros de la AD. este fragmento de la APP es
parte de todas las construcciones enumeradas anteriormente.
Las variantes 1 y 2 comprenden una porción de la
corriente hacia arriba de la APP de la A\beta - 43 en la que se
han situado los epítopes P2 y P30 modelos. Todas las variantes a y 3
- 8 comprenden el fragmento C-100 que se mostrado
que es neurotóxico - el fragmento C-100 corresponde
a los residuos de aminoácidos 714 - 770 de la SEC ID Nº 2. En las
variantes 3 - 5 los epítopes sustituyen una parte del fragmento
C-100 mientras que las variantes 6 - 8 se han
insertado en C-100.
Las variantes 9 - 35 contienen solamente la
proteína del núcleo A\beta-43. En las variantes 9
- 13, P2 y P30 se condensan a cualquier extremo de
A\beta-43; en 14 - 21 P2 y P30 sustituye parte de
A\beta-43; en 22 - 33 P2 y P30 se insertan en
A\beta-43; 34 contiene tres fragmentos idénticos
A\beta-43 espaciados por P30 y P2,
respectivamente; 35 contiene 9 repeticiones
A\beta-43 espaciadas por los epítopes P2 y P30
alternativos.
Las partes truncadas de la proteína
A\beta-43 descritas anteriormente también se
pueden emplear en los análogos inmunógenos de acuerdo con la
presente invención. Especialmente preferidos son los truncados
A\beta (1-42), A\beta (1-40),
A\beta (1-39), A\beta (1-35),
A\beta (1-34), A\beta (1-34),
A\beta (1-28), A\beta (1-12),
A\beta (1- 5), A\beta (13-28), A\beta
(13-28), A\beta (13-35), A\beta
(17-28), A\beta (25-35), A\beta
(35-40), A\beta (36-42) y A\beta
(35-42) (donde los números entre paréntesis indican
los tramos de aminoácidos de A\beta-43 que
constituyen el fragmento relevante - A\beta
(35-40) es por ejemplo idéntico a los aminoácidos
706 - 711 en la SEQ ID Nº 2). Todas estas variantes con partes
truncadas de A\beta-43 se pueden hacer con los
fragmentos A\beta descritos en esta memoria descriptiva, en
particular con las variantes 9, 10, 11, 12, y 13.
En algunos casos se prefiere que el
A\beta-43 o fragmentos del mismo están mutados.
Especialmente preferidas son las variantes de sustitución donde la
metionina en la posición 35 en A\beta-43 se han
sustituido, preferiblemente con leucina o isoleucina, o simplemente
suprimida. Los análogos especialmente preferidos contienen una sola
metionina que se localiza en el extremo C, o bien porque es de
origen natural en el polipéptido amiloiodogénico o epítope T_{H}
extraño, o debido a que se ha insertado o añadido. Por lo tanto,
también se prefiere que la parte del análogo que incluye el epítope
T_{H} extraño esté libre de metionina, excepto de la posible
localización C-terminal posible de una
metionina.
De hecho, en general se prefiere que todos los
análogos de APP o A\beta que se usan de acuerdo con la presente
invención comparten las caractaerísticas de incluir solamente una
sola metionina que se posiciona como el aminoácido
C-terminal en el análogo y que otras metioninas en o
bien el polipéptido amiloidogénico o el epítope T_{H} extraño
están suprimidos o sustituidos por otro aminoácido.
Una mutación interesante adicional es una
supresión o sustitución de la fenilalanina en al posición 19 en
A\beta-43, y se prefiere especialmente que la
mutación sea una sustitución de este residuo de fenilalanina con una
prolina.
La siguiente tabla expone un grupo de
construcciones especialmente preferidas que operan con truncados o
mutaciones de A\beta-43:
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
En esta tabla, el segmento A\beta usado en la
molécula se indica por números de aminoácidos con relación al aa 1
de la molécula (1 - 42/43), es decir, 1 - 28 significa que el
fragmento 1 - 28 de (1 - 42/43), es decir 1 - 28 significa que el
fragmento 1 - 28 de A\beta (1-42/43) se usa en la
molécula. Si se usan dos o más segmentos diferentes, ambos se
indican en la tabla, es decir, 1 - 12 (a) + 13 - 28 (b) significa
que tanto el fragmento 1 - 12 como el fragmento 13 - 28 de A\beta
(1 - 42/43) se usan en la molécula.
También, si está presente el mismo segmento en
más de una copia en al construcción se indica en la tabla, es decir,
1 - 12 (x 3) muestra que el fragmento 1 - 12 de A\beta (1 - 42/43)
está presente en tres copias de la construcción.
Además, la posición del segmento A\beta en la
molécula se muestra mediante posiciones de aminoácidos con relación
al primer aminoácido de la molécula, es decir, 29 - 42 muestra que
el segmento de A\beta en cuestión se posiciona entre el aminoácido
22 y el aminoácido 49 en la molécula, ambas posiciones incluidas.
Las posiciones de los epítopes P2 y P30 se indican de manera
equivalente. Si dos o más fragmentos de A\beta diferentes se usan
en la molécula, se muestran todas sus posiciones, es decir, 1 - 12
(a) + 49 - 64 (b) significa que el fragmento (a) está posicionado
entre el aa 1 - 12 en la molécula y fragmento (b) de aa 49 - 64.
Además, si se presenta más de una copia del
mismo fragmento en la molécula, las posiciones para todas las copias
se muestran, es decir 1 - 12, 34 - 45, 61 - 72 muestra que las tres
copias del fragmento de A\beta se coloquen entre la posición 1 -
12, 34 - 45 y 61 - 72, respectivamente, en la molécula.
Finalmente, la indicación de la longitud total
de cada molécula incluye tanto el (los) fragmento (s) A\beta como
los epítopes P2 y P30.
La variante 42 contiene dos sustituciones de
aminoácidos en las posiciones 19 (phe a pro) y 35 (met a lys) como
se indica en la columna que muestra los fragmentos A\beta.
Véase la figura 1 y la tabla anterior para
detalles sobre puntos particulares para la introducción de los
epítopes de células T extraños.
Un tipo adicional de construcción se prefiere
especialmente. Ya que un objetivo de la presente invención es evitar
la destrucción de las células que producen APP mientras que se desea
la eliminación de la A\beta, parece factible preparar
construcciones de autovacunas que comprenden solamente partes de la
A\beta que no se exponen a la fase extracelular cuando está
presente en la APP. De este modo, tales construcciones necesitarían
contener al menos un epítope de células B derivados del fragmento de
aminoácidos definidos por los aminoácidos 700 - 714 en la SEC ID Nº
2. Ya que tal fragmento de polipéptido corto se predice que es
solamente débilmente inmunógeno se prefiere que tal construcción de
autovacuna conste de varias copias del epítope de células B, por
ejemplo en la forma de una construcción que tiene la estructura
mostrada en la fórmula I en la descripción deseada de la presente
invención, véase anteriormente. En esa versión de fórmula I, los
términos amiloide_{el} - amiloide_{ex} son x epítope de células
B que contienen secuencias de aminoácidos derivadas de los
aminoácidos 700 - 714 de la SEC ID Nº 2. Una alternativa preferida
es la posibilidad anteriormente detallada de acoplamiento del
polipéptido amiloidogénico y el epítope de auxiliares T extraño
mediante un enlace amidaa una molécula vehículo de polisacárido - de
esta forma presentaciones múltiples del epítope "débil"
constituido por los aminoácidos 700 - 714 de la SEC ID Nº 2 se hace
posible, y se hace también posible seleccionar una relación óptima
entre los epítopes de las células B y de las células T.
Ejemplo Comparativo
2
Construcción del ADN que codifica
hAB43+-34. El gen hAB43+-34 se construyó en varias etapas.
Primero se generó un fragmento de PCR con los cebadores ME nº 801
(SEC ID Nº 10) y ME nº 802 (SEC ID Nº 11) usando el cebador ME nº
800 (SEC ID Nº 9) como molde. ME nº 800 codifica el fragmento
abeta-43 humano con codones optimizados de E.
coli. ME nº 801 y 802 añade sitios de restricción apropiados al
fragmento.
El fragmento de PCR se purificó, se digirió con
NcoI y HindIII, se purificó de nuevo y se clonó en un vector de
expresión de E. coli pET28b+ digerido y purificado por NcoI -
HindIII. El plásmido resultante que codifica A\beta humano de tipo
salvaje se llama pAB1.
En la siguiente etapa el epítope de auxiliares
T, P2, se añade al extremo C de la molécula. El cebador ME nº 806
(SEC ID Nº 12) contiene la secuencia que codifícale epítope P2, de
este modo generando una fusión de P2 y Abeta- 43 mediante la
reacción de PCR.
La clonación se realizó preparando un fragmento
de PCR con los cebadores ME nº 178 (SEC ID Nº 8) y ME nº 806 usando
pAB1 como molde. El fragmento se purificó, se digirió con NcoI e
HindIII, se purificó otra vez y se clonó en un vector pET28b+
digerido y purificado por NcoI - HindIII. El plásmido resultante que
codifica A\beta humano de tipo salvaje se llama pAB2.
De manera análoga, se preparó otro plásmido
alojando la secuencia que codifica A\beta-43 con
otro epítope de auxiliares T, P30, añadido al extremo N. Esto se
hizo preparando un fragmento de PCR con los cebadores ME nº 105 (SEC
ID Nº 7) y ME nº 807 (SEC ID Nº 13) usando pAB1 como molde.
El fragmento se purificó, se digirió con NcoI e
HindIII, se purificó otra vez y se clonó en un vector pET28b+
digerido y purificado por NcoI - HindIII. El plásmido resultante que
codifica A\beta humano de tipo salvaje se llama pAB3.
En la tercera etapa, se añade una segunda
repetición de A\beta-43 de manera C terminal al
epítope P2 del plásmido pA42 mediante el cebador ME nº 809 (SEC ID
Nº 14). ME nº 809 al mismo tiempo crea un sitio BamHI inmediatamente
después de la repetición A\beta-43. Un fragmento
de PCR se proparó con los cebadores ME nº 178 y ME n1 809 usando
pAB2 como molde. El fragmento se digirió con NcoI e HindIII, se
purificó y se clonó en un vector pET28b+ digerido y purificado por
NcoI - HindIII. El plásmido resultante que codifica A\beta humano
de tipo salvaje se llama pAB4.
Finalmente, el epítope P30 - secuencia de
repetición A\beta-43 de pAB43 se clonó en el
plásmido pAB4. Esto se realizó preparando un fragmento de PCR con
los cebadores ME nº 811 (SEC ID Nº 16) y ME nº 105 usando pAB3 como
molde. El fragmento se purificó y se usó como cebador en una PCR
posterior con ME nº 810 (SEC ID Nº 15) usando pAB43 como molde. El
fragmento resultante se purificó, se digirió con BamHI y
HindIII y se clonó en el plásmido pAB4 purificado y digerido
por BamHI y HindIII. El plásmido resultante pAB5, codifica la
molécula hAB43+-34.
Todos los procedimientos de PCR y clonación se
realizaron esencialmente como describen Sambrook, J., Fritsch, E. F.
y Maniatis, T. 1989 "Molecular Cloning: a laboratory manual".
2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.
Para todos los procedimientos de clonación, se
usaron células K-12 de E. coli, cepa
Top-10 F' (Stratagene, Estados unidos). El vector
pET28b+se compró a Novagen, Estados Unidos. Todos los cebadores se
sintetizaron en DNA Technology, Dinamarca.
Expresión y purificación de hAB43+-34. La
proteína hAB43+-34 codificada por pAB5 se expresó en células
BL21-Gold de E. coli (Novagen) como describen
los proveedores del sistema de pET28b+ (Novagen).
La proteína hAB43+-34 expresada se purificó a
más de 85% de pureza lavando de cuerpos de inclusión seguido de
cromatografía de intercambio catiónico usando una estación de
trabajo de puridficación BioCad (PerSeptive Biosystems, Estados
Unidos) en presencia de urea 6 M. La urea se retiró después mediante
diálisis por etapas contra una solución que contenía cantidades
decrecientes de urea. El tampón final era Tris 10 mM, pH 8,5.
Estudio de inmunización. Ratones
transgénicos para APP humana (proteían presursoar de Alzheimer) se
usaron para este estudio. Estos ratones, llamados TgRND8, expresan
una forma mutada de APP que da como resultado alta concentración de
A\beta-40 y A\beta-42 en
cerebros de ratones (Janus, C. y col.).
Los ratones (8 - 10 ratones por grupo) se
inmunizaron con o bien Abeta- 42 (SEC ID Nº 2, residuos 673 - 714,
sintetizada por medio de una estrategia Fmoc convencional) o la
variante hAB43+-34 (construcción 34 en la tabla del ejemplo 1,
producido recombinantemente) cuatro veces a intervalos de dos
semanas. Las dosis eran o bien 100 mg para A\beta o 50 mg para
hAB43+-34. Se extrajo sangre de los ratones el día 43 (después de
tres inyecciones) y después del día 52 (después de cuatro
inyecciones) y se usaron los sueros para determinar el nivel de
valoraciones específicas de
anti-A\beta-42 usando un ELISA de
A\beta-42 directo.
La siguiente tabla muestra las valoraciones
medias relativas de anti- Abeta-42
Inmunógeno | Día 43 (después de 3 inmunizaciones) | Día 52 (después de 4 inmunizaciones) |
A\beta-42 | 4000 | 3000 |
hAB43+-34 | 16000 | 23000 |
Como es evidente, las valoraciones de
anticuerpos obtenidas cuando se inmunizan con la variante hAB43+-34
A\beta son aproximadamente 4 veces y 7,5 veces mayores después de
e y 4 inmunizaciones, respectivamente, que las valoraciones
obtenidas cuando se usa la A\beta-42 de tipo
salvaje como inmunógeno. Este hecho se pone adicionalmente en
perspectiva, cuando se considera el hecho de que la cantidad de
variante usada para inmunización era solamente 50% de la cantidad de
secuencia de tipo salvaje usada para inmunización.
Ejemplo Comparativo
3
Introducción. Una vacuna conjugada
tradicional consta de un poli (péptido) acoplado a una proteína
vehículo. El péptido contiene el (los) epítope (s) de células B y la
proteína vehículo proporciona epítope (s) de células T. Sin
embargo, la mayoría de la proteína vehículo será normalmente
irrelevante como fuente para epítopes auxiliares T, ya que solamente
una parte minorizaría de las secuencias totales contiene los
epítopes auxiliares T relevantes. Tales epítopes se pueden definir y
sintetizar como péptidos de por ejemplo 12 - 15 aminoácidos. Si
estos péptidos están unidos covalentemente a los péptidos que
contienen los epítopes de células B, por ejemplo, mediante un
polihidroxipolímero activado, se puede obtener una molécula de
vacuna que solamente contiene las partes relevantes. Además es
posible proporcionar un conjugado de vacuna que contiene una
relación optimizada entre epítopes de células B y células T.
Síntesis del
poli-hidroxipolímero activado. Los
poli-hidroxipolímeros tales como dextrano, almidón,
azarosa, etc. se pueden activar con cloruro de 2,2,2-
trifluoroetanosulfonilo (cloruro de tresilo), o bien por medio de
una síntesis homogénea (dextrano) disuelto en
N-metilpirrolidinona (NMP) o mediante una síntesis
heterogénea (almidón, azarosa, dextrano reticulado) en por ejemplo,
acetona.
Se añaden 225 ml de N-metil
pirrolidinona seca (NMP) en condiciones secas a dextrano secado por
congelación, soluble en agua (4,5 g, 83 mmoles), calidad clínica, PM
(medio) 78.000) en un matraz de fondo redondo de 500 ml provisto de
de un imán para agitar. El matraz se coloca en un baño de aceite de
60ºC con agitación magnética. Cuando el dextrano se disuelve el
matraz se retira inmediatamente del baño de aceite y la temperatura
en el baño se reduce hasta 40ºC. El matraz se coloca en el baño de
aceite, todavía con agitación magnética, y se añade cloruro de
tresilo (2,764 ml, 25 mmoles) gota a gota. Se retira el matraz del
baño de aceite y se agita durante 1 hora a temperatura ambiente. El
producto dextrano activado por tresilo, TAD) se precipita en 1200 ml
de etanol frío (99,9%). Se decanta el sobrenadante y el precipitado
se recoge en tubos de polipropileno de 50 ml en una centrífuga a
2000 rpm. El precipitado se disuelve en 50 ml de ácido acético al
0,5%, se dializa 2 veces contra 5000 ml de ácido acético al 0,5% y
se seca por congelación. TAD se puede almacenar como un polvo
secado por congelación a -20ºC.
Un poli-hidroxipolímero
insoluble, tal como azarosa o dextrano reticulado puede ser activado
por tresilo preparando una suspensión del
poli-hidroxipolímero en por ejemplo, acetona y
realizar la síntesis como una síntesis de fase sólida. El
poli-hidroxipolímero se puede recoger mediante
filtración. Los procedimientos adecuados se reseñan en por ejemplo,
Nilsson K y Mosbach K (1987), Methods in Enzymology 135, p. 67, y en
Hermansson GT y col. (1992), en "Immobilized Affinity Ligand
Techniques", Academis Press, Inc., p. 87.
Síntesis de las vacunas de copolímeros del
péptido A beta. TAD (10 mg) se disuelve en 100 \mul de
H_{2}O y se añaden 1000 ml de tampón carbonato, pH 9,6, que
contiene 5 mg de A\beta-42 (SEQ ID Nº: 2, residuos
673 - 714), 2,5 mg de P2 (SEQ ID Nº: 4) y 2,5 mg de P30 (SEQ ID Nº:
6). El A\beta-42 y los péptidos P2 y P30 todos
contienen grupos de lisina protegidos: éstos están en la forma de
grupos de lisina protegidos por
1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etil
(Dde). Los péptidos se preparan mediante una estrategia de Fmoc
convencional, donde el Fmoc-Lys
(Boc)-OH convencional se ha sustituido con
Fmoc-Lys (Dde)-OH (obtenido de
Novabiochem, nº de catálogo
04-12-1121), es decir, los grupos
\varepsilon-amino en lisina se protege con Dde en
lugar de Boc.
El valor de pH se mide y se ajusta hasta 9,6
usando HCl 1 M. Después de 2,5 horas a temperatura ambiente, se
añade hidracina de una solución al 80% hasta una concentración de
hidracina final de 8% y la solución se incuba durante otros 30
minutos a temperatura ambiente y después de esto se seca
inmediatamente por congelación. El producto secado por congelación
se disuelve en H_{2}O y se dializa de manera extensa contra
H_{2}O antes del secado final por congelación.
La relación entre epítopes de células B
(A\beta) y epítopes de auxiliares T (P2 y P30) en el producto
final se puede variar usando diferentes concentraciones de estos
péptidos en la etapa de síntesis. Además, el producto final se puede
marcar con, por ejemplo, manosa (de manera que se dirija el
conjugado a APC) añadiendo la manosa aminada al tampón carbonato en
la etapa de síntesis.
Si se usa un
poli-hidroxipolímero activado insoluble para
combinar los péptidos que contienen el epítope de células B y los
epítopes de auxiliares T, el acoplamiento al polímero se puede
realizar como una síntesis de fase sólida y el producto final se
recoge y se purifica mediante lavado y filtración.
Como se ha mencionado en la descripción general,
el planteamiento descrito actualmente para preparar una vacuna a
base de péptidos se puede aplicar a cualquier otro antígeno de
polipéptido donde sería conveniente preparar una vacuna peptídica
puramente sintética y donde el antígeno polipeptídico en cuestión
proporciona una inmunogenicidad suficiente en un solo péptido:
Ejemplo Comparativo
4
TAD (10 mg) se disuelve en 100 \mul de
H_{2}O y se añaden 1000 ml de tampón carbonato, pH 9,6, que
contiene 1 - 5 mg de péptido A (cualquier péptido inmunógeno de
interés), 1 - 5 mg de P2 (epítope P2 de toxoide de difteria) y 1 - 5
mg de P30 (epítope P30 de toxoide de difteria). El valor de pH se
mide y se ajusta hasta pH 9,6 usando HCl 0,1 M.
Después de 2,5 horas a temperatura ambiente la
solución se seca inmediatamente después por congelación. El producto
secado por congelación se disuelve en H_{2}O y se dializa de
manera extensa contra H_{2}O o se desala sobre una columna de
filtración por gel antes del secado final por congelación. En caso
de que los péptidos tengan lisina en la secuencia la
\varepsilon-amina en la cadena lateral de lisina
se debe proteger mediante Dde usando el derivado
Fmoc-Lys (Dde)-OH en la síntesis
(Gregorius y Theisen 2001, presentado). Después del acoplamiento,
se añade hidracina de una solución al 80% hasta uan concentración
final entre 1 - 20% y la solución se incuba durante otros 30 minutos
a temperatura ambiente, se seca por congelación inmediatamente
después y se dializa de manera extensa contra H_{2}O o se desala
sobre una columna de filtración por gel antes del secado final por
congelación. El principio de expone de forma esquemática en la Fig.
2.
Tales inmunógenos han sido utilizados por los
inventores con un corto fragmento C-terminal de la
proteína de Borrelia burgdorferi OspC como "péptido A" y
un epítope de toxoide de difteria (P2 o P30) como un péptido B. Los
resultados de los estudios de inmunización con este antígeno
revelaron que solamente el inmunógeno de la invención que incluye el
fragmento OIPC y un epítope de difteria extraño que se empareja con
el haplotipo de MHC de los ratones vacunados eran capaces de inducir
anticuerpos reactivos con OIPC en estos ratones. En contraste, una
molécula que contiene solamente el péptido OIPC era incapaz de
inducir la producción de anticuerpos y lo mismo era verdad para una
mezcla de 2 inmunógenos en la que uno contenía la OspC y el otro el
epítope. Por lo tanto se concluye que la inclusión en el mismo
vehículo polihidroxipolímero es superior, si no esencial, con el fin
de inducir la producción de anticuerpos contra un hapteno peptídico
corto como OspC.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (2313)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2098) .. (2169)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nucleótidos que codifican región
transmembrana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2014) .. (2313)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nucleótidos que codifican
C-100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2016) .. (2144)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Abeta 42/43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2014) .. (2142)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Abeta 42/43
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 770
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium tetani
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN que codifica el epítope P2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium tetani
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
Ile Thr Glu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium tetani
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN que codifica el epítope P30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.3cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium tetani
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg
Val Pro Lys Val Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Ala Ser His Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaactcagct tcctttcggg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagatctcgat cccgcgaaat t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccggccatg gatgcagaat tccgtcacga c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccggaagct tctaggtcgc gataacaaca ccgccaacc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggaagatg cagagttccg tcacgactcc
\hfill30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgccggatc cttcaacaac ttcaccgtta gcttc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de unión de HLA DR
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Lys Phe Val Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (37)
1. Uso de un inmunógeno que
- a)
- es un poliaminoácido que incorpora en la misma molécula una fracción sustancial de epítopes de células B de APP y/o A\beta de manera que el poliaminoácido reacciona hasta el mismo grado que lo hace la APP o A\beta con un suero policlonal inducido contra APP o A\beta, y al menos un epítope T auxiliar extraño (epítope T_{H}), y que contiene al menos un epítope T_{H} extraño y una secuencia rota de APP o A\beta de manera que el poliaminoácido no incluye ninguna subsecuencia de la SEQ ID Nº: 2 que se une de manera productiva a las moléculas de clase II de MHC que inicia una respuesta de célula T; o
- b)
- es un conjugado que comprende una estructura central de polihidroxipolímero al que está acoplado un poliamino ácido como se ha definido en a); o
- c)
- es un conjugado que comprende una estructura central de polihidroxipolímero al que está acoplado separadamente 1) el al menos un epítope T_{H} extraño y 2) una secuencia rota de APP o A\beta como se ha definido en a); o
- d)
- es un ácido nucleico que codifica el poliaminoácido como se ha definido en a); o
- e)
- es un microorganismo no patógeno o virus que lleva un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el poliaminoácido como se ha definido en a),
En la preparación de una preparación
farmacéutica que contiene el inmunógeno para el tratamiento,
prevención o mejora en un animal de la enfermedad de Alzheimer u
otras enfermedades caracterizadas por la deposición de
amiloide.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el poliaminoácido o conjugado incluye
- -
- al menos un primer resto que efectúa la dirección del poliaminoácido a una célula presentadora de antígenos (APC), o un linfocito B, y/o
- -
- al menos un segundo resto se introduce que estimula el sistema inmune, y/o
- -
- al menos un tercer resto que optimiza la presentación del poliaminoácido al sistema inmune.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación
2, en el que el primero y/o el segundo y/o el tercer resto
está/están unido (s) como grupos laterales, mediante unión covalente
o no covalente a grupos químicos adecuados en la APP, o secuencia de
A\beta.
4. El uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el poliaminoácido o
conjugado comprende un polipéptido de fusión.
5. El uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el poliaminoácido o
conjugado incluye una duplicación de al menos un epítope de células
B de APP o A\beta y/o una introducción de un
hapteno.
hapteno.
6. El uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el epítope de células T
extraño es inmunodominante en el animal.
7. El uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el epítope de células T
es promiscuo, tal como un epítope de células T que se selecciona
entre un epítope de células T promiscuo y una secuencia artificial
de péptidos de unión de MHC-II.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación
7, en el que el epítope de células T natural se selecciona entre un
epítope de toxoide de tétanos tal como P2 o P30, un epítope de
toxoide de difteria, un epítope de hemaglutinina de virus de
influenza, y un epítope CS de P. falciparum.
9. El uso de acuerdo a una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el poliaminoácido o
conjugado comprende epítopes de células B que no están expuestos s
la fase extracelular cuando está presente en una forma unida a
células del polipéptido precursor de A\beta.
10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que el poliaminoácido o conjugado
carece de al menos un epítope de células B que se expone a la fase
extracelular cuando está presente en una forma unida a células del
polipéptido precursor de A\beta.
\newpage
11. El uso de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el poliaminoácido o
conjugado comprende como mucho 9 aminoácidos consecutivos de la SEQ
ID Nº: 2, tal como como mucho 8, como mucho 7, como mucho 6, como
mucho 5, como mucho 4, y como mucho 3 aminoácidos consecutivos.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11,
en el que el poliaminoácido o conjugado comprende al menos una
subsecuencia de la SEQ ID Nº: 2 de manera que cada una de tal al
menos una subsecuencia de la SEQ ID Nº: 2 consta independientemente
de tramos de aminoácidos seleccionados entre el grupo de aminoácidos
de la SEQ ID Nº: 2, 8 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID Nº 2, 7
aminoácidos consecutivos de la SEQ ID Nº 2, 6 aminoácidos
consecutivos de la SEQ ID Nº 2, 5 aminoácidos consecutivos de la SEQ
ID Nº 2, 4 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID Nº 2, y 3
aminoácidos consecutivos de la SEQ ID Nº 2,.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 11
ó 12 , en el que los aminoácidos consecutivos comienzan en un
residuo de aminoácidos seleccionado entre el grupo constituido por
el residuo 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682,
683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695,
696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708,
709, 710, 711, 712, 713, y 714.
14. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que al menos dos copias del
poliaminoácido o conjugado están unidos covalentemente o no
covalentemente a una molécula vehículo capaz de efectuar la
presentación de copias múltiples de determinantes antígenos.
15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, variantes b) o c), en el que el
poliamino ácido y el epítope en el que el análogo comprende la
secuencia de aminoácidos T_{H} están unidos al polihidroxipolímero
mediante un enlace amida.
16. El uso de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, variantes b) o c), en el que el
polihidroxipolímero es un polisacárido.
17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el poliamino ácido o
conjugado se ha formulado con un adyuvante que facilita la rotura de
autotolerancia a autoantígenos.
18. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el tratamiento, prevención o
mejora supone la administración de una cantidad eficaz del poliamino
ácido o conjugado al animal mediante una vía seleccionada entre la
vía parenteral tal como las vías intracutánea, la subcutánea, y la
intramuscular; la vía peritoneal, la vía oral; la vía bucal; la vía
sublingual; la vía epidural; la vía espinal; la vía anal; y la vía
intracraneal.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18,
en el que la cantidad eficaz está entre 0,5 \mug y 2000 \mug del
poliamino ácido o conjugado.
20. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 13, en el que el tratamiento, prevención o
mejora supone la introducción de ácido (s) nucleico (s) que codifica
(n) el poliamino ácido o conjugado en las células de animal y
obteniendo por lo tanto la expresión in vivo mediante las
células del (de los) ácido (s) nucleico (s) introducido (s).
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
e el que el (los) ácido (s) nucleico (s) introducido (s) se
seleccio-
na (n) entre ADN desnudo, ADN formulado con lípidos cargados o no cargados, ADN formulado en liposomas, ADN incluido en un vector viral, ADN formulado con una proteína o polipéptido que facilita la transfección, ADN formulado con una proteína o polipéptido de dirección, ADN formulado con agentes precipitantes de calcio, ADN acoplado a una molécula vehículo inerte, ADN encapsulado en quitina o quitosan, y ADN formulado con un adyuvante.
na (n) entre ADN desnudo, ADN formulado con lípidos cargados o no cargados, ADN formulado en liposomas, ADN incluido en un vector viral, ADN formulado con una proteína o polipéptido que facilita la transfección, ADN formulado con una proteína o polipéptido de dirección, ADN formulado con agentes precipitantes de calcio, ADN acoplado a una molécula vehículo inerte, ADN encapsulado en quitina o quitosan, y ADN formulado con un adyuvante.
22. El uso de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones 18 - 21, en el que el tratamiento, prevención o
mejora supone al menos una administración/introducción al año, tal
como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 6, y al menos 12
administraciones/introducciones.
23. El uso de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el tratamiento, prevención o
mejora supone que APP o A\beta está regulada hacia abajo hasta tal
grado que la cantidad total de amiloide disminuye o que la
velocidad de formación de amiloide se reduce con significación
crítica.
24. Un poliamino ácido o conjugado que se
deriva de una APP o A\beta animal en el que se introduce una
modificación que tiene como resultado la inmunización del animal con
el poliamino ácido o conjugado induce la producción de anticuerpos
contra la APP o A\beta autóloga del animal, y en el que el
poliamino ácido o conjugado es como se ha definido en cualquiera de
las reivindicaciones 1 - 16.
25. Una composición inmunogénica que comprende
una cantidad inmunogénicamente eficaz de un poliamino ácido o
conjugado de acuerdo con la reivindicación 24, comprendiendo
adicionalmente la composición un portador y/o vehículo y
opcionalmente un adyuvante farmacéutica e inmunológicamente
aceptable.
26. Un fragmento de ácido nucleico que codifica
un poliamino ácido o conjugado de acuerdo con la reivindicación
24.
27. Un vector que lleva el fragmento de ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 26, tal como un vector que
es capaz de replicación autónoma.
28. El vector de acuerdo con al reivindicación
27 que se selecciona entre el grupo constituido por un plásmido, un
fago, un cósmido, un minicromosoma, y un virus.
29. El vector de acuerdo con la reivindicación
27 ó 28, que comprende, en la dirección 5' \rightarrow 3' y en
enlace operable, un promotor para dirigir la expresión del fragmento
de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 26, opcionalmente
una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido guía que
permite la secreción de o integración en la membrana del fragmento
polipeptídico, el fragmento de ácido nucleico de la invención, de
acuerdo con al reivindicación 26, y opcionalmente un terminador.
30. El vector de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 27 - 29 que, cuando se introducen una célula
hospedadora, es capaz o incapaz de integrase en el genoma de la
célula hospedadora.
31. El vector de acuerdo con la reivindicación
29 ó 30, en el que el promotor dirige la expresión en una célula
eucariótica y/o en una célula procariótica.
32. Una célula transformada que lleva el vector
de una cualquiera de las reivindicaciones 27 - 31, tal como una
célula transformada que es capaz de replicar el fragmento de ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 26.
33. La célula transformada de acuerdo con la
reivindicación 32, que es un microorganismo seleccionado entre una
bacteria, una levadura, un protozoo, o una célula derivada de un
organismo multicelular seleccionado entre un hongo, una célula de
insecto tal como una célula S_{2} o SF, una célula vegetal, y una
célula de mamífero.
34. La célula transformada de acuerdo con la
reivindicación 32 ó 33, que expresa el fragmento de ácido nucleico
de acuerdo con la reivindicación 27, tal como una célula
transformada, que secreta o lleva sobre su superficie, el análogo de
acuerdo con la reivindicación 24.
35. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 - 13, variante e), en el que el tratamiento,
prevención, o mejora supone la administración de un microorganismo o
virus no patógeno que lleva un fragmento de ácido nucleico que
codifica y expresa el poliamino ácido o conjugado.
36. Una composición para inducir la producción
de anticuerpos contra amiloide, comprendiendo la composición
- -
- un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 26 o un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 - 31, y
- -
- un portador y/o vehículo y/o adyuvante farmacéutica e inmunológicamente aceptable.
37. Una línea celular estable que lleva el
vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 - 31
y que expresa el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 26, y que opcionalmente secreta o lleva el poliamino
ácido o conjugado de acuerdo con la reivindicación 24 sobre su
superficie.
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