MX2010014026A - Composiciones adyuvantes novedosas. - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a formulaciones de adyuvante que comprenden diversas combinaciones de triterpenoides, esteroles, inmunomoduladores, polimeros y estimuladores de Th2; procedimientos para preparar las composiciones de adyuvante; y el uso de las formulaciones de adyuvante en composiciones inmunogénicas y de vacunas con diferentes antígenos; esta invención se refiere además al uso de las formulaciones en el tratamiento de animales.

Description

COMPOSICIONES ADYUVANTES NOVEDOSAS TECNICA ANTECEDENTE Esta invención se refiere de forma general a fornr uvantes novedosas para potenciar la respuesta inmunitaria a ra usar en composiciones inmunogénicas y de vacunas, sin produ cundarios tóxicos o indeseables en el sujeto. Esta invención ta iere a procedimientos de preparación y uso de las com yuvantes, inmunogénicas y de vacunas.

CAMPO TÉCNICO Las infecciones bacterianas, víricas y parasitarias e endidas entre los seres humanos los animales. Las enfe una formulación de vacuna. Puede hacerse que las vacunas S aces incluyendo un adyuvante apropiado en la composición.

También hay cada vez un mayor interés en el us rategia de vacunación para tratar el cáncer en los animales y en anos. Esta estrategia terapéutica al tratamiento del cánce unar a los pacientes de cáncer con una vacuna que comp ¡geno específico de tumor y un adyuvante. Sin embargo, ningú chas vacunas contra el cáncer de esta naturaleza que ..arrollando ha sido autorizada por las autoridades reguladoras. nostrado que las vacunas reduzcan los tumores, una medida es sficacia de los fármacos contra el cáncer.

El término 'adyuvante' generalmente se refiere a terial que aumente la respuesta inmunitaria humoral o celular ígeno. Se usan adyuvantes para lograr dos objetivos: rale ración de los antí enos a artir del sitio de in ección est genos tales como un adyuvante. Además, la producción de las éticas y de subunidades es cara. La adición de un adyuvan itir el uso de una menor dosis de antígeno para estimular una r unitaria similar, reduciendo así el coste de producción de la vac ndo el agente se combina con un adyuvante puede au ificativamente la eficacia de algunos agentes medicinales inyecta Deben considerarse muchos factores en la selecci uvante. Un adyuvante debería provocar una relativamente lenta liberación y de absorción del antígeno de forma eficaz co seables mínimos de toxicidad, alergias, irritaciones y otro seables en el huésped. Para que sea deseable, un adyuvante d viricida, ser biodegradable, ser capaz de crear de forma consi l de inmunidad alto, ser capaz de estimular una protección cru patible con antígenos múltiples, ser eficaz con múltiples especi ico y ser seguro para el huésped (por ejemplo, no provocar reac ción de vacunación. Sin embargo, el número de adyuvantes que equisitos anteriores es limitado.

La elección de un adyuvante depende de las necesida na, ya sea aumentar la magnitud o la función de la resp cuerpos, un aumento en la respuesta inmunitaria mediada por cél cción de la inmunidad en las mucosas o una reducción de la geno. Se ha presentado un número de adyuvantes, sin embargo, demostrado ser totalmente adecuado para todas las vacunas. vante que se reseñó en la bibliografía fue el adyuvante com und (FCA) que contiene una emulsión de agua en aceite y extr obacterium. Desafortunadamente, el FCA se tolera mal y puede inflamación incontrolada. Desde el descubrimiento del FCA hac años, se han estado realizando tentativas de reducir los undarios indeseados de los adyuvantes.

Algunos otros materiales que se han usado como ad cinógena o respuestas alérgicas) o propiedades farmacéuticas ind r ejemplo, dispersión rápida o control deficiente de la dispersión a de la inyección, o hinchazón del material).

Se han usado aceites sintetizados y los derivados de o adyuvantes porque muestran una dispersión relativamente le rpo, pero pueden ser indeseables ya que con frecuencia se dese do hidrocarburos aromáticos, que pueden ser carcinógenos. Ad encontrado que algunas de estas sustancias pueden producir ériles y pueden no eliminarse nunca completamente del cue ites cuando se seleccionan y se formulan de forma apr centraciones apropiadas pueden ser relativamente seguros y no t Las saponinas obtenidas de la corteza del árbol suda ///aya saponaria se han usado como adyuvantes durante algú ase Lacaille-Dubois, M y Wagner H. (A review of the biolo armacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 páginas bargo, es estimular una respuesta dirigida contra un antígeno o ecíficos. Las saponinas tienen una gran afinidad por el colesterol complejo con el colesterol que se encuentra en las membranas vocando la lisis de la célula. También se ha demostrado que rosis en el sitio de la inyección y que es difícil formularlas en ucturas particuladas. Cuando se usan en las vacunas que contie cubierta vivos, las saponinas alteran la cubierta vírica y asi ina igenos víricos.

Para superar las propiedades hemolíticas y viricidas d ha combinado con colesterol y fosfolípidos, que forman una ecífica conocida como complejo inmunoestimulador (ISCOM) OM (ISCOMATRIX). Véase Ozel M., et.al.; J. Ultrastruc. and Mol 102, 240-248 (1989). Los ISCOM, cuando se combinan con un eraimente inducen una respuesta de linfocitos T citotóxicos ibar o, aun ue reducen mucho las ro iedades hemolíticas de ominado, "DDA"), y avirdina. El DDA es un compuesto d ternario lipófilo (amina) con dos cadenas alquíltcas de 18 carbó pos metilo unidos a una molécula de amonio cuaternaria con carg un peso molecular de 631. Su uso como adyuvante fue descu ll, (Immunol. V. 11 , página 369, 1966). Se ha reseñado que ¡mula respuestas inmunitarias potentes mediadas por células, y ta demostrado que induce respuestas inmunitarias humorales, licado muchos trabajos que muestran la eficacia del DDA como a a los antígenos proteínicos, haptenos, tumores, virus, pro terias. (Véase Korsholm, K S., et al., Immunology, vol. 121 , pág 3, 2007.) La mayoría de los estudios se han realizado con ani oratorio, mientras que sólo unos pocos se han realizado en anim mdes como por ejemplo pollos (Véase Katz, D., et al. FEMS Imm ;robiol. Vol 7(4):303-313, 1993.), cerdos y ganado vacuno. El DDA a inducir una reacción de hi ersensibilidad de ti o retardado D ialquenilo o divinilglicol. Et CARBOPOL® se ha usado en un n unas, pero su uso como adyuvante no se ha demostrado.

Se ha demostrado que algunos adyuvantes estim puesta Th2, con ejemplos como hidroacetato de N-(2-d cilamino-b-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecano¡lamida, ocido con el nombre comercial Bay R1005® cuando está en tato, y aluminio. El Bay R1005® combinado con vacunas ificados o vacunas de subunidades provocan una mayor prod icuerpos en ratones expuestos a virus. Los ensayos preclínicos ecies de animales (cerdos, ovejas, caballos) proporcionaron r mparables con respecto a la producción de anticuerpos. El aum itesis de anticuerpos que indujo el Bay R1005® depende especí I antígeno y no de la estimulación policlonal.

Antes de esta invención, ninguna formulación de seía el am lio abanico de características deseables ue un ad uv BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a composiciones ad nogénicas y de vacunas novedosas. En particular, esta inve re a formulaciones adyuvantes que comprenden estimuladores nomoduladores, polímeros, y estimuladores de Th2. Esta i bién se refiere a composiciones inmunogénicas y de vacu prenden dichas formulaciones adyuvantes y uno o más antige o a procedimientos de preparar las composiciones adyuvant nas.

En una modalidad, las composiciones adyuvantes co combinación de una saponina, un esterol, y un compuesto de ernario. En una modalidad, la combinación adyuvante comprend sterol, y DDA.

En otra modalidad, las composiciones adyuvantes co En una modalidad, se prepara una composición inmu comprende una formulación de adyuvante y una unológicamente eficaz de un antígeno, en la que !a formul uvante comprende una saponina, un esterol, un compuesto d ternario, y un polímero mediante el procedimiento que comprende a) preparar una composición del antígeno en un tampón b) añadir la saponina a la composición de la etapa a; c) añadir el esterol a la composición de la etapa b; d) añadir el compuesto de amonio cuaternario a la co la etapa c, e) añadir el polímero a la composición de la etapa d.

En una modalidad de este procedimiento, la saponina esterol es colesterol, el compuesto de amonio cuaternario es ímero es poli(ácido aerifico).

En una modalidad se re ara una vacuna ue com r d) añadir el compuesto de amonio cuaternario a la co a etapa c, e) añadir el polímero a la composición de la etapa d, y f) añadir el glucolipido a la composición de la etapa e. En una modalidad de este procedimiento, la saponina sterol es colesterol, el compuesto de amonio cuaternario es mero es poli(ácido acrilico), y el glucolipido es Bay R1005®.

Se ha encontrado que las composiciones adyuvante ñan en el presente documento tienen propiedades sorpren peradas superiores a las que se podrían esperar de una combin descubierto sorprendentemente que la propiedad viricida de sterol se elimina en estas composiciones adyuvantes. Son a ÍO diluyentes para antigenos víricos vivos modificados liofiliza posiciones adyuvantes que se describen en el presente d den configurarse para que provo uen una res uesta in Los solicitantes han descubierto que estas comp uvantes novedosas son muy inmunogénicas cuando se combinan ás de un número de antígenos diferentes de una gran var ecies. Pueden usarse con uno o más antígenos víricos, ba sitarios, de proteínas recombinantes, y de péptidos sintétic binaciones. Las composiciones adyuvantes de vacunas n den usarse en vacunas terapéuticas para tratar el cáncer.

La presente invención por lo tanto proporciona comp uvantes, inmunogénicas, y de vacunas. También se pro cedimientos para la fabricación de las composiciones. Ta porciona su uso para tratar una enfermedad. También se propo para preparar un medicamento para tratar a un sujeto co rmedad, en particular contra enfermedades que se des tinuación. También se proporciona su uso para preparar un med a prevenir o reducir una enfermedad en un su eto rmedades provocadas por coronavirus canino, para tratar u tra enfermedades provocadas por rotavirus bovino, y para tratar tra enfermedades provocadas por el virus influenza canino. Ta porciona el uso de adyuvantes como vacuna marcadora para ay tificación de animales que han sido vacunados. También se pr SO de CpG para potenciar los efectos de los adyuvantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La Figura 1 representan un gel de un en ioinmunoprecipitación que muestra las diferencias en el ¡cuerpos entre las proteínas NS2/3 y las proteínas E2 del Virus po tratado con PreZent A muestra una respuesta de anticuer itra las proteínas NS2/3 como contra las proteínas E2 mientra os tratados con QCDC CDCR demo raron un l valor que se indica (por ejemplo, dentro del intervalo de confianz ra la media) o dentro del 10 por ciento del valor que se indica, yor, a no ser que se use aproximadamente para hacer ref rvalos de tiempo en semanas en los que "aproximadamente 3 de 17 a 25 días, y de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 de 10 a 40 días.

"Adyuvante" quiere decir cualquier sustancia que a puesta inmunitaria humoral o celular contra un antigeno. Los a usan generalmente para lograr dos objetivos: ralentizar la liberac tigenos a partir del sitio de inyección, y estimular el sistema inmun "Alquilo" se refiere a restos hidrocarburo saturados tan mo ramificados.

"Amina" se refiere a un compuesto químico que rógeno. Las aminas son un grupo de compuestos que se d oniaco sustitu endo los ru os hidrocarburo or los átomos de , IgD, IgE, IgG, e IgM) basándose en la composición de las stantes.

"Antígeno" o "inmunógeno" se refiere a cualquier susta mula una respuesta ¡nmunitaria. El término incluye bacterias, sitos muertos, inactivados, atenuados o vivos modificados. El geno también incluye polinucleótidos, polipéptidos, mbinantes, péptidos sintéticos, extracto de proteínas, célul uyen células tumorales), tejidos, polisacáridos, o lípidos, o sus fra forma individual o en cualquier combinación de los mismos. E geno también incluye anticuerpos, como por ejemplo anticuerp tipo o sus fragmentos, y a mimótopos peptídicos sintéticos qu ar un antígeno o determinante antigénico (epítopo).

"Bacterina" quiere decir una suspensión de una o más rtas que puede usarse como componente de una vacuna o co uno énica.

"Respuesta inmunitaria celular" o "respuesta inmunitaria células" es una mediada por linfocitos T u otros leucocitos o ye la producción de citocinas, quimiocinas y moléculas ucidas por linfocitos T, leucocitos o ambos.

"Colesterol" se refiere a una sustancia cristalina blanc ula química de C27H45OH. Es un alcohol hidrocarburado cíclic ifica como lípido. Es insoluble en agua, pero soluble en un nú lventes orgánicos.

"Hipersensibilidad de tipo retardado (DTH)" se refier uesta inflamatoria que se desarrolla de 24 a 72 horas despu osición a un antígeno que el sistema inmunitario reconoce como e tipo de respuesta inmunitaria implica principalmente a los linfocit s anticuerpos (que son producidos por los linfocitos B).

"Dosis" se refiere a una vacuna o composición inmu íinistrada a un sujeto. Una "primera dosis" o "vacuna de sensibiliz "Emulsión" quiere decir una composición de dos líq cibles en la que pequeñas gotículas de uno líquido se suspende continua de otro líquido.

"Esteres" se refiere a cualquiera de una clase de co ánicos que corresponden a las sales inorgánicas, que se forman a reacción de condensación en la que una molécula de un ácido ne a una molécula de alcohol con eliminación de una molécula d "Excipiente" se refiere a cualquier componente de un no es un antígeno.

"Homogenización" se refiere a un procedimiento de mez s componentes, ya sea similar o no similar, en forma de un orme.

"Respuesta inmunitaria humoral" se refiere a una diada por anticuerpos.

"Hidrófobo" quiere decir insoluble en agua, ue no Una "cantidad inmunológicamente protectora" o unológicamente eficaz" o "cantidad eficaz para producir una r unitaria" de un antigeno es una cantidad eficaz para inducir una r unogénica en el receptor. La respuesta inmunogénica puede ser a fines de diagnóstico u otras pruebas, o puede ser adecu venir signos o síntomas de enfermedad, que incluyen efectos ad complicaciones, provocados por la infección con un ag ermedad. Puede inducirse o una inmunidad humoral o una i diada por células o ambas. La respuesta inmunogénica de un ani posición inmunogénica puede evaluarse, por ejemplo, de forma iendo las valoraciones de anticuerpos, ensayos de prolifer citos, o directamente a través de los signos y síntomas de control la exposición a una cepa de tipo silvestre, mientras que la i tectora conferida por una vacuna puede evaluarse midiendo, por educción de los si nos clínicos, como or e em lo mortalidad, m "Complejo ¡nmunoestimulador" o ISCOM se refiere uctura específica que se forma cuando Quil A se combina con col olipidos.

"Molécula inmunoestimuladora" se refiere a una molé era una respuesta inmunitaria.

"Lípidos" se refiere a cualquiera de un grupo de co ñicos, que incluyen las grasas, aceites, ceras, esteróles y triglicér insolubles en agua pero son solubles en disolventes orgánicos no oleosos al tacto y junto con los carbohidratos y las proteínas co aterial estructural principal de las células vivas.

"Lipófilo" quiere decir que muestra una marcada atr bilidad en los lípidos.

"Liposoma" se refiere a una partícula esférica micr ada por una bicapa lipídica que incluye un compartimiento acuos en medicina ara ortar un fármaco antí eno vacuna enzim nteral incluye administración subcutánea, intramuscular, tran dérmica, intraperitoneal, intraocular e intravenosa.

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a sustan ún el criterio médico informado, son adecuadas para usar en con tejidos de sujetos sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica ind ilares, que se corresponde con una relación razonable entre b go y eficaz para el uso que se pretenda.

"Capacidad reactógena" se refiere a los efectos se ocados en un sujeto como respuesta a la administración de un a inmunógeno, o una composición de vacuna. Puede ocurrir en e iinistración, y habitualmente se evalúa en términos de desarrol ero de síntomas. Estos síntomas pueden incluir infl jecimiento y abceso. También se evalúa en términos de o ación, y gravedad. Una reacción "baja", por ejemplo, supondría in sólo uede detectarse or al itación no a sim le vista o ue "Esteroides" se refiere a cualquiera de un grupo de co nicos que pertenecen a una clase bioquímica de lípidos, lmente solubles en disolventes orgánicos y ligeramente solubles esteroides comprenden un sistema de cuatro anillos condensado íos de ciclohexano (de seis carbonos) condensados más un cua iclopentano (cinco carbonos).

"Esteróles" se refiere a compuestos en animales ducen biológicamente a partir de precursores de terpenoides. Co estructura de anillos de esteroides, que tienen un grupo hidro itualmente unido al carbono-3. La cadena de hidrocarburo del su ácidos grasos varía en longitud, habitualmente de 16 a 20 át bono, y puede ser saturada o insaturada. Los esteróles habit tienen uno o más enlaces dobles en la estructura de anillos y ta iedad de sustituyentes unidos a los anillos. Los esteróles y sus é os rasos son esencialmente insolubles en a ua.

"DOCT50" se refiere a "dosis de infección de cultivo tisu ne como aquella dilución de un virus necesaria para infectar el 50 dado de cultivos celulares inoculados. Pueden usarse edimientos para calcular la DOCT5o, que incluye el procedim arman-Karber que se utiliza en toda esta memoria descriptiva. cripción del procedimiento de Spearman-Karber, Véase B.W. Mah gro, Virology Methods Manual, páginas 25-46 (1996).

"Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una ca antígeno o vacuna que induciría una respuesta inmunitaria en recibe el antígeno o vacuna que es adecuada para prevenir o re os o síntomas de enfermedad, que incluyen efectos adversos d o sus complicaciones, provocadas por la infección con un p o por ejemplo un virus o una bacteria. Puede inducirse inmunidad munidad mediada por células o ambas inmunidad humoral y me las. La res uesta inmuno énica de un animal a una vacun se use, del antígeno particular que se use, o del estado del de ser determinado por un experto en la técnica.

"Tratar" se refiere a prevenir un trastorno, afección o en ue se aplique dicho término, o prevenir o reducir uno o más sín o trastorno, afección o enfermedad.

"Tratamiento" se refiere al acto de "tratar" como S riormente.

"Triterpenoides" se refiere a una clase grande y di léculas orgánicas naturales, derivadas de unidades de isopreno -butadieno) de cinco carbonos, que pueden ensamblarse y modif s de formas. La mayoría son estructuras multicíclicas que difiere los grupos funcionales y en sus esqueletos de carbonos básic léculas pueden encontrarse en todas las clases de organismos viv "Vacuna" se refiere a una composición que incluye un o se define en el resente documento. La administración de la Componentes De Las Composiciones Triterpenoides y CpG Los triterpenoides adecuados para usar en las comp uvantes pueden provenir de muchas fuentes, ya sean derivados uivalentes sintéticos, que incluyen pero sin limitación, Quillaja s atina, extractos de ginseng, champiñones y un glucósido de ucturalmente similar a las saponinas esteroideas. Asi, los triter cuados para usar en las composiciones adyuvantes incluyen s ualeno y lanosterol. La cantidad de triterpenoides adecuada par composiciones adyuvantes depende de la naturaleza del triterpe use. Sin embargo, generalmente se usan en una can oximadamente 1 a aproximadamente 5,000 µg por dosis. Ta n en una cantidad de aproximadamente 1 µg a aproximadamente oximadamente ^ 5 µg a aproximadamente 100 µg por dosis, tidad de aproximadamente 30 µ9 a aproximadamente 75 por d Si se usa una saponina, las composiciones ad eralmente contienen una fracción de saponina inmunológicame la corteza de Quillaja saponaria. La saponina puede ser, por eje otra preparación de saponinas purificada o parcialmente purifi de obtenerse comercialmente. Así, pueden usarse extractos de o mezclas o components individuales purificados como por ejem -17, QS-18, y QS-21. En una modalidad la Quil A tiene una pur nos 85%. En otras modalidades, la Quil A tiene una pureza de , 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%.

Los ODN con CpG son una clase de acoterapéuticos recientemente descritos que se caracteriza sencia de un dinucleótido CG no metilado en contextos espe iedades inmunomoduladoras similares al ADN bacteriano. Las la superficie celular pueden captar estas moléculas con r ables. Sin embargo, con un vehículo como por ejemplo QCDC, s combinaciones que se citan en esta patente, se ificativamente las propiedades de inmunomodulación y de capt .

La cantidad de CpG para usar en las composiciones ad ende de la naturaleza de los CpG que se usen y de las especie tendan. Sin embargo, generalmente se usan en una can ximadamente 1 µg a aproximadamente 20 mg por dosis. Ta n en una cantidad de aproximadamente 1 µ9 a aproximadamen dosis, de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 5 mg por ximadamente 1 µg a aproximadamente 4 mg por d ximadamente 1 µg a aproximadamente 3 mg por d oximadamente 100 µ9 por dosis, y en una cantidad de aproxim µ9 a aproximadamente 75 µ9 por dosis.

Esteróles Los esteróles adecuados para usar en las com uvantes incluyen ß-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergoca esterol. Estos esteróles son notorios en la técnica y pueden c ercialmente. Por ejemplo, el colesterol se describe en The Me a Ed., página 369. La cantidad de esteróles adecuada para us nposiciones adyuvantes depende de la naturaleza del esterol qu \ embargo, generalmente se usan en una cantidad de aproximad a aproximadamente 5,000 µ9 por dosis. También se usan en un aproximadamente 1 µg a aproximadamente 4,000 g por Oximadamente 1 µg a aproximadamente 3,000 µg por Inmunomoduladores Las composiciones adyuvantes además pueden inclui agentes inmunomoduladores como por ejemplo, compuestos d ernario (por ejemplo, DDA), e interleucinas, interferones, u otras s materiales pueden comprarse comercialmente. La canti nomodulador adecuado para usar en las composiciones ad nde de la naturaleza del inmunomodulador que se use y del su argo, generalmente se usan en una cantidad de aproximadament ximadamente 5,000 µg por dosis. También se usan en una can ximadamente 1 µg a aproximadamente 4,000 µg por d ximadamente 1 µg a aproximadamente 3,000 µg por d ximadamente 1 9 a aproximadamente 2,000 µg por dosi ximadamente 1 µg a aproximadamente 1 ,000 µg por dosis. Ta en una cantidad de aproximadamente 5 µg a aproximadament Polímeros Las composiciones adyuvantes además pueden incl s polímeros como por ejemplo, DEAE Dextrano, polietilengiicol, y lico) y poli(ácido metacrílico) (por ejemplo, CARBOPOL®). Dich de comprarse comercialmente. La cantidad de polímeros adecu r en las composiciones adyuvantes depende de la naturalez imeros que se usen. Sin embargo, generalmente se usan en una aproximadamente 0.0001 % en volumen por volumen ximadamente 75% v/v. En otras modalidades, se usan en una ca ximadamente 0.001 % v/v a aproximadamente 50% ximadamente 0.005% v/v a aproximadamente 25% oximadamente 0.01% v/v a aproximadamente 10% oximadamente 0.05% v/v a aproximadamente 2% v/v, oximadamente 0.1 % v/v a aproximadamente 0.75% v/v. En otra m usan en una cantidad de a roximadamente 0.02 v/v a a roxim BOPOL® se hinchan en agua hasta 1000 veces su volumen o veces su diámetro original formando un gel cuando se expon rno de pH superior al pKa del grupo carboxilato. A un pH superi rupo carboxilato, los grupos carboxilato se ionizan provocando r las cargas negativas, lo que añade a la hinchazón del polímero.

Estimulantes de Th2 Las composiciones adyuvantes pueden incluir ademá estimulantes de Th2 como por ejemplo, por ejemplo, Bay R1 inio. La cantidad de estimulantes de Th2 adecuada para usa posiciones adyuvantes depende de la naturaleza del estimulante se use. Sin embargo, generalmente se usan en una cant ximadamente 0.01 g a aproximadamente 10 mg por dosis. alidades, se usan en una cantidad de aproximadamente 0.0 ximadamente 7.5 mg por dosis, de aproximadamente 0.1 morfos, es químicamente estable en aire y luz a temperaturas de en disolventes acuosos a pH 2-12 a temperatura ambiente, écula anfífila que forma micelas en solución acuosa.

Antíqenos y enfermedades Las composiciones adyuvantes pueden contener un ígenos. El antígeno puede ser cualquiera de una amplia vari tancias capaces de producir una respuesta inmunitaria desea to. Aunque Quil A por sí solo es viricida, Quil A se desintoxica m ión de colesterol al formar micelas helicoidales (Véase la pa ados Unidos número 7, 122,191 ). Se ha encontrado que las comp uvantes que se describen en el presente documento no son vir olíticas ni membranolíticas. Así, los antígenos que se usan c posiciones adyuvantes pueden ser uno o más de virus (¡na uados, vivos modificados), bacterias, arásitos, nu tidos, polipéptidos, que pueden aislarse de los organismos a lo e referencia en el presente documento.

Las cepas vivas, vivas modificadas y atenuadas que no rmedad en un sujeto se han aislado en forma no virulenta o uadas usando procedimientos notorios en la técnica, que incluy ados en una línea celular adecuada o exposición a luz ultraviole ágeno químico. Las cepas víricas inactivadas o muertas son la inactivado mediante procedimientos conocidos por los expert ica, que incluyen el tratamiento con formalina, betapropriolacto neimina binaria (BEI), radiación esterilizante, calor u otros proce se tipo.

Pueden combinarse dos o más antígenos producie posición polivalente que puede proteger a un sujeto contra un edad de enfermedades provocadas por los patógenos. Actualm icante de vacunas comerciales, asi como los usuarios finales, re Algunos ejemplos de bacterias que pueden usar ígenos con las composiciones adyuvantes incluyen, pero sin l inetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Acti uropneumoniae, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acido aeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus ilis, Bacillus thermocatenulatus, Bordetella bronchiseptica, Bu acia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobac pylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia amydia trachomatis, Chlamydophila spp., Chromobacterium sipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Ehrlichi cherichia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, He s, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Morax cobactrium bovis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma ?sp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Odoribacter d steurella Mannheimia haemol tica Pasteurella multocida Phot onella newport, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphl us, Staphyloccoccus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Strep s, Streptomyces cinnamoneus, Streptococcus suis, Strep liates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechoc o cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Tr tum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Tr entii, Treponema palladium, and Leptospira species, such as th ogens Leptospira canteóla, Leptospira grippotyposa, Leptospir ospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii tno,Leptospira interrogans, Leptospira icterohaemorrhagiae, L ona, y Leptospira bratislava, y sus combinaciones.

En las composiciones adyuvantes pueden usarse ta tivados como virus vivos atenuados. Algunos ejemplos de vi en usarse como antígenos incluyen, pero sin limitación, her ríos, herpesvirus bovinos, her esvirus caninos, her esvirus e uin anenima infecciosa equina, virus de inmunodeficiencia felina, ernía felina (FeLV), virus de la enfermedad de Newcastle, monia progresiva ovina, virus de adenocarcinoma pulmona na virus canino (CCV), CCV pantrópico, coronavirus respiratori navirus bovino, Calicivirus felino, coronavirus entérico felino, vi tonitis infecciosa felina, virus de diarrea epidémica porcina, vi efalomielitis hemaglutinante porcina, parvovirus porcino, Circoviru V) de tipo I, PCV de tipo II, virus del síndrome reproductivo y re iño (PRRS), virus de la gastroenteritis transmisible, coronavirus S de la fiebre efímera bovina, rabia, Rotovirus, virus de la e icular, lentivirus, influenza aviaria, rhinovirus, virus influenza equi enza porcino, virus influenza canino, virus influenza felino, virus iano, virus de la encefalitis equina del este (EEE), virus de la e ina venezolano, virus del Nilo occidental, virus de la encefaliti idental, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del papiloma Algunos ejemplos de parásitos que pueden usar igenos con las composiciones adyuvantes incluyen, pero sin l plasma, Fasciola hepática (duela), Coccidia, Eimeria spp., inum, Toxoplasma gondii, Giardia, Dirofilaria (gusanos c ylostoma (tenia), Trypanosoma spp., Leishmania spp., Trichomo ptosporidium parvum, Babesia, Schistosoma, Taenia, Stro aris, Trichinella, Sarcocystis, Hammondia, e Isopsora, ibinaciones. También se contemplan los parásitos externos que o sin limitación, garrapatas, que incluyen especies de ipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophifus, Hyalo emaphysalis y sus combinaciones.

La cantidad de antígeno que se usa para inducir una unitaria variarán considerablemente dependiendo del antígeno qu sujeto, y del nivel de respuesta que se desee y puede ser determ persona de experiencia en la técnica. Para las vacunas que alidades, los intervalos de dosis terapéuticamente eficaces ximadamente 104 DOCT50 a aproximadamente 105 DOCT50, inclu Para las vacunas que contienen virus inactivados, una péuticamente eficaz del antígeno es generalmente al ximadamente 100 unidades relativas por dosis, y a menudo es rvalo desde aproximadamente 1 ,000 a aproximadamente 4,500 tivas por dosis, inclusive. En otras modalidades, la péuticamente eficaz del antígeno están en un inter ximadamente 250 a aproximadamente 4,000 unidades relativas usive, de aproximadamente 500 a aproximadamente 3,000 tivas por dosis, inclusive, de aproximadamente 750 a aproxima 0 unidades relativas por dosis, inclusive, o de aproximadament ximadamente 1 ,500 unidades relativas por dosis, inclusive.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de antígeno en contienen virus inactivao puede medirse también en términos de En una modalidad se produjo un antígeno FeLV d lar FL74-UCD-1 (número de ATCC CRL-8012) que está sistentemente con la cepa KT-FeLV-UCD-1 del virus de leucemia tidad de antígeno FeLV en una vacuna puede medirse como la proteína vírica gp70 por mi. Una cantidad terapéuticamente ígeno FeLV, cuando se mide por la cantidad de de proteína vírica generalmente está en el intervalo de aproximadamente oximadamente 350,000 ng/ml, inclusive. En otra modalidad el in aproximadamente 1 ,000 a aproximadamente 300,000 ng/ml, inclu ximadamente 2,500 a aproximadamente 250,000 ng/ml, inclus ximadamente 4,000 a aproximadamente 220,000 ng/ml, inclus oximadamente 5,000 a aproximadamente 150,000 ng/ml, inclus oximadamente 10,000 ng/ml a aproximadamente 100,000 ng/ml, i El número de células para un antígeno bacterian ninistra en una vacuna varía desde a roximadamente oximadamente 1 x106 a 5x10a UFC/dosis, inclusive, o de aproxim 07 a 5x109 UFC/dosis, inclusive.

El número de células para un antígeno parasitario ad una vacuna varía en el intervalo de aproximadamente oximadamente 1 xIO10 por dosis, inclusive. En otras modalidades, células varía en el intervalo de aproximadamente oximadamente 1 x109 por dosis, inclusive, o de aproximadament oximadamente 1 x108 por dosis, inclusive, o de aproximadament oximadamente 1 x107 por dosis, inclusive, o de aproximadament oximadamente 1 x108 por dosis, inclusive.

Es notorio en la técnica que con los adyuvantes conve necesaria una cantidad sustancialmente mayor de virus inactivad S vivos modificados o atenuados para estimular un nivel comp puesta serológica. Sin embargo, se ha encontrado sorprendente las composiciones ad uvantes ue se describen en el unas con amplia utilidad es necesario fabricar millones de dosis a a que estos ahorros pueden ser sustanciosos.

Excipientes Los adyuvantes acuosos proporcionan ciertas eralmente son fáciles de formular y de administrar y pueden indu íenos reacciones graves en el sitio de la inyección. Sin emb vantes acuosos con un antígeno tienden a difundirse desde el s cción, son aclarados por el hígado del sujeto y generan una r unitaria no especifica indeseada. Se ha encontrado sorprende las composiciones adyuvantes acuosas que se describen en el umento permanecen en el sitio de la inyección hasta etabolizan, lo que se produce durante un largo periodo de t porcionan una respuesta inmunitaria dirigida.

El aceite, cuando se añade como componente de un a os componentes tienen de 6 a 30 átomos de carbono. El acei ararse sintéticamente o purificarse a partir de productos de pe o puede tener una estructura de cadena lineal o ramificada. Pu lmente saturada o tener uno o más enlaces dobles o triples, ites no metabolizables para usar en la presente invención incluy eral, aceite de parafina y cicloparafinas, por ejemplo.

El término aceite también se pretende que incluya "aceit G?," es decir, aceite que se obtiene de forma similar por destil olato, pero que tiene una gravedad específica ligeramente men ite mineral blanco.

Los aceites metabolizables incluyen aceites metaboliz cos. El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pesca al o aceite preparado sintéticamente que puede ser metaboliza rpo del sujeto al que se administrará el adyuvante y que no es tó ujeto. Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, s Habitualmente, el componente de aceite de la presente ¡ presente en una cantidad de 1 % a 50% en volumen; o en una 0% a 45%;o en una cantidad de 20% a 40%.

Otros componentes de las composiciones puede pientes farmacéuticamente aceptables, como por ejemplo v lventes, y diluyentes, agentes isotónicos, agentes tampo bilizantes, conservantes, agentes vasoconstrictores, bacterianos, agentes antifúngicos y similares. Los vehículos, disol yentes típicos incluyen agua, solución salina, dextrosa, etanol, ite, y similares. Los agentes isotónicos representativos incluye ico, dextrosa, manitol, sorbitol, lactosa y similares. Los estabilizan uyen gelatina, albúmina y similares.

Los tensioactivos se usan para ayudar a la estabilizac lsión seleccionada para actuar como vehículo para el adyuv geno. Los tensioactivos adecuados para usar en las p lubles en acetona que permanecen después de eliminar los trigli te vegetal lavando con acetona. De forma alternativa, la lecitin nerse de diversas fuentes comerciales. Otros fosfolípidos ad yen fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fo iolipina, y fosfatidiletanolamina. Los fosfolípidos pueden aisl ites naturales o sintetizarse convencionalmente.

Los tensioactivos sintéticos no naturales adecuados para resente invención incluyen tensioactivos no iónicos con base de s ejemplo tensioactivos de sorbitana sustituidos con ácidos ponibles comercialmente con el nombre de SPAN® o ARL res de ácidos grasos de sorbitol polietoxilado (TWEEN®), és tilenglicol de ácidos grasos de fuentes como por ejemplo aceite ULFOR®); ácido graso polietoxilado (por ejemplo, ácido onible con el nombre SIMULSOL M-53®), polímero de iso toxilado/formaldehído (TYLOXAPOL®), éteres de alcoholes gr ios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estábi entes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, nicos, agentes que retrasan la adsorción y similares. El/los ve n ser "aceptables" en el sentido de ser compatibles con l ponentes de las composiciones y no ser perjudiciales para e itualmente, los vehículos serán estériles y apirógenos y se selec ndose en el modo de administración a emplear. Es bien conocid rtos en la técnica que las formulaciones preferidas para el acéuticamente aceptable que comprenden las composiciones culos farmacéuticos aprobados en las regulaciones a ulgadas por el Departamento de agricultura estadounidense es (US) Department of Agriculture) o la Agencia del medi dounidense (US Food and Drug Administraron), o agencia guber ivalente en un país diferentes de los Estados Unidos. Por lo ículo farmacéuticamente ace tado ara la roducción comercia uro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa entre ot bilizantes incluyen albúmina, entre otros.

Las composiciones también pueden contener antib servantes que incluyen, por ejemplo, gentamicina, mertiolato o cl diversas clases de antibióticos o conservantes de los que ccionarse son notorias para el experto en la técnica.

Preparación De Las Composiciones Preparación de formulaciones adyuvantes Un ISCOM puede prepararse combinando una sap ro! y un fosfolípido. Por ejemplo, un ISCOM puede contener de 5 peso de Quil A, 1 % a 5% de colesterol y fosfolípidos, y el resto de proporción entre saponina y esterol en las formulaciones aá itualmente será del orden desde 1 : 100 peso por peso (p/p) a 5: o de CARBOPOL® por parte en peso de DDA. Todavía alidades, se usa al menos 1 parte en peso de CARBOPOL® por o de DDA. La combinación de CARBOPOL® y DDA forma un com ue el grupo funcional de amina terciaria del DDA inmunofuncio os laterales de ácido carboxílico del polímero. Esto permite las inmunitarias específicas se dirijan al antígeno y al adyuvante ultánea y coadministren el antígeno y adyuvante juntos en el m centración óptimos a dichas células.

Los adyuvantes que se describen en el presente d eralmente no requerirán ningún vehículo específico y se formular pón acuoso u otro farmacéuticamente aceptable. En algunos c unas de las modalidades descritas se presentarán en un cuado, como por ejemplo, liposomas, microesferas o génicas encapsuladas adicionales. El antígeno puede estar cont embrana de las vesículas o estar contenido en el exterior de la m o o secado por pulverización. Las composiciones liofilizadas nstituirse antes de su uso para estabilizar una solución, por ción salina o HEPES. Así, las composiciones adyuvantes puede o forma farmacéutica sólida, semisólida o líquida.

Los adyuvantes pueden fabricarse usando técnicas con cnica. Por ejemplo, la saponina y el colesterol pueden mezclar rgente adecuado, seguido de una técnica de extracción con d ando liposomas o ISCOM. La saponina y el colesterol también binarse formando micelas helicoidales como se describe en la p dos Unidos número 7,122,191.

Puede usarse solución salina tamponada con fosfat o medio de tampón acuoso; el pH del tampón puede ser ramente alcalino o ligeramente ácido. Por consiguiente, el pH pu l intervalo de pH de 6 a 8. Es habitual un pH de aproximadame ximadamente 7.3. La potencia del tampón puede estar entre P0 livantes. Por ejemplo, los adyuvantes habitualmente compre ximadamente 1 pg a aproximadamente 1000 pg, inclusive, de 1 mi. De forma similar, los antibióticos habitualmente compre ximadamente 1 pg a aproximadamente 60 pg, inclusive, de una l.

Las formulaciones adyuvantes pueden homogeni rofluificarse. Las formulaciones se someten a un procedim clado primario, habitualmente pasando una o más veces a travé ás homogenizadores. Puede usarse cualquier homogenizador d ercialmente para este fin, por ejemplo, emulsionante Ross (Ha , homogenizador Gaulin (Everett, MA), o Microfluidics (Newton, modalidad, las formulaciones se homogenizan durante tres 00 rpm. La microfluidificación puede usarse mediante el us rofluidificador comercial, como por ejemplo el modelo núme onible en Microfluidics, Newton, Mass. ; Gaulin Modelo 30CD Las composiciones adyuvantes que se describen en el umento pueden estar tanto homogeneizadas como microfluidific modalidad, se añade un antígeno a un tampón apropiado. La so a, y se añade lentamente una saponina a la solución antigénica. ñade lentamente un esterol a la solución de antigeno y saponina la adición lenta de un compuesto de amonio cuaternario a la so ígeno, saponina y esterol. La composición resultante se hom pués se microfluidifica. Después de la microfluidificación, se mero a la composición microfluidificada. Dependiendo de los com se usen, puede alterarse el orden de estas etapas para op paración de las composiciones.

Preparación de composiciones inmunogénicas y de vac Las composiciones adyuvantes que se describen en el umento pueden usarse para la fabricación de comp tajosa de las composiciones adyuvantes es que son comp figurables dependiendo de las características que se desee posición. Por ejemplo, si se desea una mayor respuesta Th entarse la cantidad del estimulador de Th1. Del mismo modo, si mayor respuesta Th2, puede aumentarse la cantidad del estim . También puede lograrse una respuesta equilibrada entre JM mposiciones inmunogénicas y de vacunas también pueden homo icrofluidificarse como se describe anteriormente.

Administración Y Uso De Las Composiciones Administración de las composiciones Los tamaños de las dosis de las composiciones habi ían desde aproximadamente 1 mi a aproximadamente 5 mi, endiendo del su eto del antí eno. Por e em lo ara un cánid agujas, parches y similares. La vía y dispositivo que se selecció r dependerán de la composición del adyuvante, el antígeno, y el s son notorios para el experto en la técnica.

Uso de las composiciones Uno de los requisitos para cualquier preparación d uvante para uso comercial es establecer la estabilidad de la uvante durante los periodos de almacenamiento largos. En el umento se proporcionan formulaciones adyuvantes que son f ricar y estables durante al menos 18 meses. En una modal ulaciones son estables durante aproximadamente 18 meses, dalidad, las formulaciones son estables durante entre de aproxima a aproximadamente 24 meses. En otra modalidad las formulad bles durante aproximadamente 24 meses. Los procedimientos de eradas también indican que las formulaciones ue se describ os componentes, auqneu se mantiene el efecto adyuvante. Tarnb ontrado sorprendentemente que las composiciones adyuvante criben en el presente documento demuestran mejoras en la paradas con otras composiciones adyuvantes.

Las composiciones adyuvantes que se describen en el umento son útiles para producir una respuesta inmunitaria dese to. Son eficaces en múltiples especies. Un sujeto adecuado es al para el que se desee la administración de una composición a uye mamíferos y no mamíferos, que incluyen primates, ganado, compañía, animales de laboratorio, animales salvajes cautiv luidos los huevos), reptiles y peces. Así, este término incluye tación, monos, seres humanos, cerdos, ganado vacuno, ovejas allos, ratones, ratas, cobayas, hámsters, conejos, felinos, cánido OS, patos, otras aves de corral, ranas y lagartijas.

Pueden usarse los adyuvantes que se describen en el stre. Dicha tecnología es útil en el control y la erradicación del población sujeto.

Los siguientes ejemplos se presentan como mo rativas, pero no deberían tomarse como limitantes del alcan nción. Para los expertos en la técnica serán obvios muchos aciones, modificaciones y otros usos y aplicaciones de esta inven EJEMPLOS EJEMPLO 1 Soluciones de Quil A/Colesterol (QC) Se disolvió Quil A (Superfos) en agua y se preparó una re de 50 mg/ml. Se disolvió colesterol (Fabri Chem Inc.) en et aró una solución madre de 18 mg/ml. Se filtró después la soluci EJEMPLO 2 Soluciones de DDA (D) Se disolvió bromuro de amonio de dimetildioctadeci ka Analytical), en etanol, y se preparó una solución madre de 18 después la solución madre de DDA usando un filtro de 0.2 micró EJEMPLO 3 Soluciones de Quil A/Colesterol/DDA (QCD) Se preparó una solución madre de A Quil A/Colesterol co mplo 1 a las concentraciones deseadas. Se preparó una solución A como en el ejemplo 2 y se añadió lentamente a la solución mad olesterol. Las soluciones se mezclaron logrando las concen les deseadas. El pH de la solución se ajustó con NaOH o HCI lvió CARBOPOL® en agua desionizada y se preparó una soluci 0.75%.

EJEMPLO 5 Soluciones de DDA/CARBOPOL® (PC).

Se preparó una solución madre de DDA como en el e preparó una solución madre de CARBOPOL® al 0.75% co plo 4. Las soluciones se mezclaron logrando las concentracion eadas.

EJEMPLO 6 Soluciones Quil A/Colesterol/DDA/CARBOPOL® (QCDC) Se re aró una solución madre de Quil A/colesterol/D EJEMPLO 7 Soluciones de Bay R1005® (R) Para preparar una solución madre de Bay R1005®, el -desoxi-2-L-leucilamino-P-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoi isolvió en etanol (al 60% v/v). Se añadieron después Tween 2 tico glacial. En un ejemplo, se disolvieron 3.49 gm de N-(2-d ilamino-p-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida en 44.6 ol/agua (al 60% v/v). Esto se combinó con 1.12 mi de Tween 20 cido acético glacial.

EJEMPLO 8 Soluciones de Quil A/Colesterol/DDA/CARBOPOL®/Bay R10 (QCDCR) EJEMPLO 9 Soluciones de DEAE Dextrano (X) Se preparó una solución madre de DEAE dext lviendo 200 mg/ml de DEAE dextrano en agua. La solució clavarse durante aproximadamente 20 minutos a 120° centígrado EJEMPLO 10 Soluciones de Quil A/Colesterol/DDA/DEAE (QCDX) Se preparó una solución madre de Quil A/colesterol erdo con el ejemplo 3. Se preparó una solución madre de erdo con el ejemplo 9. Se combinaron las soluciones aña etamente dentro de un homogeneizador. El mezclado e cedimiento de mezcla ultrarrápida usando una fuerza de ciza or de 1 ,000 se "1. El mezclado se hace suministrando la solució EJEMPLO 11 Composiciones de Aceite (O) Se preparó una solución madre de aceite combinan era! Drakeol con Tween 85 y Span 85, calentando a aproxima y después enfriando y filtrando de forma estéril. Esta prendería asi el componente de base de la fase oleosa para un ado en aceite. Si el colesterol y/o el DDA se seleccionaron par unomodulador colaborador para una de estas composiciones se pués también a esta mezcla antes de filtración, dado que son sol se oleosa.

EJEMPLO 12 Composiciones de Quil A/Colesterol/DDA/PEAE/Aceite (QCD dió lentamente dentro de una fase aceitosa que se mezcla EJEMPLO 13 reparación de Composiciones Inmunogénicas o Composició Vacunas Para preparar una composición inmunogénica posición de vacunas que comprenda un antígeno y uno de los a eriormente descritos, se añadió el antígeno deseado a un opiado. Después se añadieron los componentes del adyuvante o se describe anteriormente. La solución resultante se llevó a u l con el tampón.

EJEMPLO 13a geno/Quil A. Se preparó una solución madre de DDA como en el se añadió lentamente a la solución de antígeno/Quil A/coles ción de antigeno/Quil A/colesterol se homogeneizó y microfluidi ción de CARBOPOL® al 0.75% se preparó como en el ej pués de microfluidificación, se añadió la solución de CARBOPOL a composición microfluidificada y se ajustó el pH con NaOH ximadamente 6.9 hasta aproximadamente 7.5.

EJEMPLO 13b Antígeno, Quil A, Colesterol, PDA. CARBOPOL®. Bav R100 Para preparar una composición inmunogénica posición de vacuna que comprenda un antígeno, Quil A, coleste BOPOL®, y Bay R1005®, se añadió el antígeno deseado a u piado. Se preparó una solución madre de Quil A como en el e e NaOH o HCI a aproximadamente 6.9 hasta aproximadament paró una solución madre de Bay R1005® como en el ejemplo 7. omponente de Bay R1005® a la fase acuosa después de que se A.

EJEMPLO 13c Antígeno, Quil A, Colesterol, PDA, DEAE Dextrano Para preparar una composición inmunogénica mposición de vacuna que comprenda un antígeno, Quil A, colest )EAE dextrano, el antigeno deseado se añadió a un tampón apro >paró una solución madre de Quil A como en el ejemplo 1 y itamente a la solución de antígeno. La composición se homoge jparó una solución madre de colesterol como en el ejemplo 1 y itamente a la solución de antí eno/Quil A durante la homo eneíz EJEMPLO 13d Antígeno, Quil A, Colesterol, PDA, DEAE Dextrano. Aceit Para preparar una composición inmunogénica posición de vacuna que comprenda un antigeno, Quil A, coleste AE dextrano, y aceite, se añadió el antígeno deseado a u opiado. Sé preparó una solución madre de Quil A como en el ej añadió lentamente a la solución de antígeno. La compo ogeneizó. Se preparó una solución madre de colesterol co mplo 1 y se añadió lentamente a la solución de antígeno/Quil A ogeneización. Se preparó una solución madre de DDA co mplo 2 y se añadió lentamente a la solución de antígeno/Quil A/ ante la homogeneización. Se preparó una solución de DEAE o en el ejemplo 9. Durante la homogeneización, se añadió la s AE dextrano. Se re aró una com osición de aceite o n e EJEMPLO 14 Vacunas del Virus de la Leucemia Felina (FeLV) Los animales se asignaron aleatoriamente a gr amiento usando un diseño de bloques completo distribuido toria. El cuadro 1 muestra el diseño del estudio. Los bloques se fecha de nacimiento y camada. Los animales se clasificaron por imiento y después por camada. Se usaron bloques de cuatro. Den que, los animales se asignaron aleatoriamente al tratamiento. Pa vacunación del estudio, se combinaron dos bloques consecutivos grupo de ocho animales. Los grupos de animales se atoriamente a dos habitaciones de tal forma que cada habitación o grupos (10 bloques) de animales. Dentro de un grupo de ani males se asignaron aleatoriamente a cuatro jaulas localizadas c otras de tal manera ue cada aula contenía dos animales con Se prepararon las vacunas para este estudio como en e excepto en que se usó una solución madre de CARBOPOL® ecificamente, se preparó LEUKOCELL® 2 (Pfizer, Inc.) propagan jrupos A, B, y C, en células linfoides transformadas con F ígenos virales se inactivaron químicamente, se combinaron uvante estéril para lograr la respuesta inmune, y se envasaron ida. Se preparó una cantidad total de 100 mi de Producto Vete stigación (IVP) conteniendo el virus de la leucemia felina y 25 p dróxido de aluminio (ALHYDROGEL®). Se mezcló un total de 9 solución madre de FeLV de 1.106 x 105 ng/ml lentamente d utos. El pH se ajustó a 5.9 a 6.1 con HCI 4 N o NaOH al 18 esario. Se añadieron, agitando mientras, 0.5 mi de una soluci /mi de Quil A a la solución de antígeno. Después, se añadieron le mi de ALHYDROGEL® al 100% v/v. La composición se agitó d imo de 2 horas a 4°C. El H se a ustó a entre 7.0 7.3 con NaOH ión madre de FeLV a 1.106 x 105 ng/ml, se añadieron lentamente na solución de 50.0 mg/ml de Quil A a la solución de antígeno. D adieron lentamente 0.39 mi de una solución de colesterol/etan i. La composición se homogeneizó durante tres minutos a 10, 0 ñadió un total de 0.19 mi de una solución de DDA/etanol de 18.0 mposición mientras que se agitaba. Se añadió lentamente un tot una solución de CARBOPOL® al 1.5% a 145.0 mi de la compo de la leucemia felina, Quil A, colesterol, y DDA. El pH se ajust 7.3 con NaOH al 18% o HCI 1 N, según se necesitase.

CUADRO 1 Diseño Experimental Número Fase de Vacunación Fase de Prueba upo de e IVPa AnimaDomiento Día de Dosis Día de les Vía sis Vía Vacunación (mi) Prueba 37.5 g de 37, 40, LEUKOCELL® 03 20 0, 21 1.0 SC 42d, 1.0 ON 2 Quil A/ 44 AI(OH)b 20 de LEUKOCELL® 2 Reformulada 37, 40, 04 Quil A/ 20 0, 21 1.0 SC 42d, 1.0 ON colesterol/ 44 DDA/ CARBOPOL®b aProducto Veterinario de Investigación bMezclado para contener una potencia relativa compar cuna de referencia (Lote de Referencia de FeLV n° 12) CSC = Su dDepo-Medrol®: Día 42 (aproximadamente 5.0 mg/kg) muscular eON = Oronasal Quil A - colesterol = Adyuvante de saponina Quil A, inc artículas lipídicas de colesterol is sedantes de TELAZOL® (Fort Dodge Animal Health) de acuer o corporal (aproximadamente 5.0 mg/kg) mediante la vía intramus ? de minimizar el estrés animal y para evitar daño a los manipula ales durante la recogida de sangre. La sangre se recogió en aración de suero (SST) y se procesó para separación de suero, lmacenó a -20°C o a más frió hasta someterse a ensayo.

Se administraron vacunas placebo o vacunas de FeLV la vía subcutánea a una dosis de 1.0 mi. La primera vacunación 0 en el día 0 y la segunda administración de vacuna se llevó a c 21. Todos los animales se observaron durante aproximadamente las vacunaciones primera y segunda para reacciones de d ediatas (reacciones de punzada). Se documentaron las obser temperaturas corporales de todos los animales se midieron p pánica en los días 1 y 2 tras la primera administración de dosis d LV) virulento, cepa de Rickard, valorado a aproximadame D50/ml. El material de prueba de FeLV se descongeló y se ma o húmedo de forma previa a su administración. Los animales se p eba en los días 37, 40, 42, y 44, administrando 1.0 mi por la vía erial de prueba no diluido. Se cargó una jeringuilla de tuberculina la aguja, con el material de prueba. Cada gatito se administró c fosa nasal. En el día 42, se llevó a cabo la administración d oximadamente 5 h tras la administración de DEPO-MEDROL®. cada día de prueba, se retuvo una muestra del material de pru ración confirmatoria.

Tras la prueba, se recogió una muestra de sangre (1.0 cada animal por venopunción de la vena yugular, en los días 64, , 134, 141 , 148, y 155. Se administraron las dosis sedantes de T rt Dodge) como se describe anteriormente. La sangre se recogió se aración de suero SST , se rocesó ara se aración de su Se llevó a cabo el aislamiento del virus usando mu ro recogidas en días -2 y 35. Se consideraron las muestras de 127 a 155 para evaluar la eficacia de la vacuna de FeLV. Las suero del día 127 (semana 12), del día 134 (semana 13), del ana 14), del día 148 (semana 15) y del día 155 (seman etieron a ensayo para la presencia de antígeno p27 de FeLV. U consideró infectado persistentemente si tuvo tres o más resul ba de antígeno p27 de FeLV positivos durante los días 127 (sem (semana 16).

Se analizaron las temperaturas usando un modelo idas repetidas lineales, y usando comparaciones de tratamiento os entre el tratamiento T01 y los tratamientos T02, T03, y T04 to temporal si el tratamiento general y/o el tratamiento por efecto poral fueron significativos. Se calcularon promedios de drados, intervalos de confianza del 95%, mínimos y máximos p No se observaron reacciones inmediatas en cualquier os de tratamiento durante la primera y segunda vacunación rvaron reacciones adversas en cualquiera de los grupos de trata ximadamente una hora tras las vacunaciones primera y segund rvaron ni pirexia (temperatura corporal > 39.5°C) ni hi peratura corporal < 37.0°C) en cualquiera de los grupos de tra ués de las vacunaciones primera y segunda. No hay di ificativas en la temperatura corporal promedio entre grupos de tra ualquier punto temporal (p > 0.08). No se observaron hinchazone inyección en cualquiera de los grupos de tratamiento despué naciones primera y segunda.

Los resultados finales de la semana 12 a la semana 1 ba indicaron que 16 animales por cada 19 (84%) que recibieron l ebo (grupo T01 ) eran persistentemente virémicos para FeLV. 13 cada 19 68% en el ru o T02 estaban rot id r Así, las vacunas administradas a los grupos T02, T ostraron todas ser seguras en gatitos a la edad mínima c inistraron en un régimen de dos dosis, separadas tres cionalmente, las vacunas administradas a estos grupos fueron aces de reducir significativamente el nivel de viremia persistente gatitos a la edad mínima cuando se administraron en un régime is, separadas tres semanas. Hubo una reducción estadist ificativa en el establecimiento de viremia persistente de FeLV los grupos T02, T03 y T04. Adicionalmente, hubo una adísticamente significativa entre T04 y los otros grupos de vacu ). Fue sorprendente e inesperado que las vacunas que con ulación de adyuvante novedosa demostraran ser más efic ellas que contienen componentes adyuvantes usados común os. e administraron dosis sedantes de TELAZOL® (Fort Dodge Anim acuerdo con el peso corporal (aproximadamente 5.0 mg/kg) me intramuscular con el fin de minimizar el estrés animal y para evit manipuladores de animales durante la recogida de sangre. La S ogió en tubos de separación de suero y se procesó para separ ro. Todos los animales se observaron diariamente y las observa istraron.

Se prepararon las vacunas como en el ejemplo 13 ex se usó una solución madre de CARBOPOL® al 1.5%. Se KOCELL® 2 (Pfizer, Inc.) propagando FeLV, subgrupos A, B, las linfoides transformadas con FeLV. Los antígenos virales se in micamente, se combinaron con un adyuvante estéril logrando la r íune, y se empaquetaron en forma líquida. Se preparó una cantida ).0 mi de IVP conteniendo el virus de la leucemia felina a una utos a 10,000 rpm. La composición se microfluidificó mediante u és de una cámara de dimensión limitante de 200 micrómetros a 6 447380) pascales (10,000 (+ 500) psi). Agitando mientras, se a amenté 10.0 mi de una solución de CARBOPOL® al 1.5% a 290 s de la leucemia felina, Quil A, colesterol, y composición de DDA. tó a entre 7.0 y 7.3 con NaOH al 18% o HC1 1 N, según se necesit Se preparó el IVP que contiene el virus de la leucemia RP de 5 de la misma manera que el IVP con una RP de 2 usand la solución madre de FeLV y 447.2 mi de tampón de PBS al 0.0 cantidades de los otros componentes siguiendo siendo las mismas Se preparó el IVP que contiene el virus de la leucemia RP de 5 de la misma manera que el IVP con una RP de 2 usand a solución madre de FeLV, 355.9 mi de tampón de PBS al 0.063% a solución de Quil A, 0.52 mi de la solución de colesterol, y 0.26 ición de DDA volumen Se preparó el IVP que contiene el virus de la leucemi RP de 20 de la misma manera como el IVP con una RP de .9 mi de la solución madre de FeLV y 292.0 mi de tampón d 3%, con las cantidades de los otros componentes siguiendo si mas.

Para administrar una dosis de 0.5 mi, se prepararon 30 que contiene el virus de la leucemia felina a una RP de 5, sterol, DDA, y CARBOPOL® de la siguiente manera. Se añadi 1.7 mi de una solución madre de FeLV (35.8 RP/ml donde 1 R i de antigeno) a 277.7 mi de tampón de PBS al 0.063%. ntras, se añadieron lentamente 0.12 mi de una solución de 50.0 l A a la solución de antígeno. Después, se añadieron lentament una solución de colesterol/etanol de 18 mg/ml. Se añadió lenta l de 0.17 mi de una solución de DDA/etanol de 18.0 mg posición agitando mientras. La composición se homogeneizó dur Se preparó el IVP para administrar una dosis de 1 .0 mi a leucemia felina a una RP of 5, Quil A, colesterol, DDA, y CAR la misma manera que la dosis de 0.5 mi con las ca piadamente ajustadas.

Se preparó una cantidad total de 300.0 mi de IVP conte de la leucemia felina a una RP de 10 y CARBOPOL®. Se añadi 2.1 mi de una solución madre de FeLV (50.0 RP/ml donde 1 RP i de antígeno) a 237.9 mi de tampón de PBS al 0.063%. La co homogeneizó durante tres minutos a 10,000 rpm. La compo ofluidificó mediante un paso a través de una cámara de di ante de 200 micrómetros a 68950000 (+ 3447380) pascales (1 ) psi). Agitando mientras, se añadieron lentamente 3.3 mi de una ARBOPOL® al 1 .5% a 96.7 mi del virus de la leucemia felina. tó a entre 7.0 y 7.3 con NaOH al 18% o HCI 1 N, según se necesit Se administraron vacunas placebo y vacunas de FeLV ( CUADRO 2 Diseño Experimental upo de Número Potencia Vía de Vacuna Adyuvante amiento de Relativa Vacunación Animales Objetivo T01 10 N.A. SC PBS Sin Adyuvante T02 10 5 RP se FeLV Quil A - Inactivado Colesterol DDA - CARBOPOL® T03 10 5 RP SC/0,5 mi FeLV Quil A - Inactivado Colesterol DDA - CARBOPOL® T04 10 20 RP se FeLV Quil A - Inactivado Colesterol DDA - CARBOPOL® T05 10 15 RP se FeLV Quil A - Inactivado Colesterol DDA - CARBOPOL® T06 10 10 RP se FeLV Quil A - Inactivado Colesterol DDA - CARBOPOL® ales de dolor tras el la administración de vacuna de ensayo q alización, rasguños/picaduras e intento agresivo o de escape. T umentó la actitud después de la vacunación (normal o anormal). males se observaron durante aproximadamente una hora de pués de la administración de vacuna el Día de estudio 0 y Dia para el desarrollo de reacciones sistémicas adversas. Se docume en/aciones. Los sitios de vacunación se palparon, y se registraro el sitio de inyección, enrojecimiento en el sitio de inyección, infla itio de inyección y tamaño de inflamación. Se realizaron observa s de estudio 2, 5 y 9 después de la primera vacunación, y lo udio 2, 5 y 9 después de la primera vacunación, y los días de e y 32 después de la segunda vacunación. Se documen ervaciones.

Se recogió una muestra de sangre (1.0 - 2.0 mi) de ca odiante la unción en la vena u ular el Día de estudio 32 a Resultados - Seguridad Durante la primera vacunación (Día de estudio 0), tres el grupo de tratamiento T09 demostraron reacciones inmediata dura. Durante la segunda vacunación (Día de estudio 20), un a o de tratamiento T05, cuatro del grupo de tratamiento T08, y o de tratamiento T09 demostraron reacciones inmediatas dura.

Durante la primera vacunación, tres animales del miento T09 demostraron una vocalización secundaria. Los ani entan dolor en la primera vacunación también presenta alización secundaria en ese tiempo. Durante la segunda vacun al del grupo de tratamiento T05, cuatro del grupo de tratamien del grupo de tratamiento T09 demostraron una vocalización se animales que presentan dolor en la segunda vacunación entaron una vocalización secundaria en ese tiempo. amiento tras la primera o segunda vacunación. Tampoco se o cciones adversas en ninguno de los grupos de tratamiento.

Resultados - Eficacia Todos los animales se probó que eran negativos an unación para e! antígeno FeLV p27 a partir de muestras ogidas el Día 1. También se probó que todos los animales eran es de la exposición para el antigeno FeLV p27 a partir de mu ro recogidas el Día 32.

Los resultados finales de la semana 12 a la semana 16 la exposición (cuadro 3) indicaron que 9 de 10 animales (90%) e tratamiento T01 (placebo) eran persistentemente viremicos para ultados del mismo período indicaron que 6 de 10 animales (60 po de tratamiento T02 estaban protegidos de la exposición vir / este nivel de rotección no era estadísticamente si nifica estaban protegidos de la exposición virulenta de FeLV; este ección era estadísticamente significativo (p = 0.0001 ) comparad tos vacunados con placebo. 7 de 10 animales (70%) en el miento T06 estaban protegidos de la exposición virulenta de F l de protección era estadísticamente significativo (p = 0.0198) co los gatitos vacunados con placebo. 10 de10 animales (100%) en tratamiento T07 estaban protegidos de la exposición virulenta nivel de protección era estadísticamente significativo (p = parado con los gatitos vacunados con placebo. 8 out of 10 %) en el grupo de tratamiento T08 estaban protegidos de la e lenta de FeLV; este nivel de protección era estadísticamente sig 0.0055) comparado con los gatitos vacunados con placebo. ales (50%) en el grupo de tratamiento T09 estaban protegid osición virulenta de FeLV; este nivel de protección no era estadíst ificativo = 0.1409 com arado con los atitos vacunados con CUADRO 3 Sumario del nivel de protección Discusión Las vacunas usadas en los grupos de tratamiento T02, y T07 demostraron un perfil de seguridad satisfactorio durante l unación, ya que no se observaron reacciones adversas en ese ti o animal en el grupo de tratamiento T05 demostró una reacción i or en la administración, vocalización secundaria e intento a osición con FeLV virulento. Que la vacuna proporcionada al g porcionara una protección del 100% es sorprendente e inesperad animales en ese grupo recibieron 25% y 33% de la dosis de an animales en los grupos T04 y T05, respectivamente. Una ventaj adyuvantes descritos y ensayados en el presente document miten que se use una dosis menor de antígeno, aunque se induc respuesta inmune protectora completamente. Las vacunas admi s grupos de tratamiento T02, T06 y T09 demostraron algo de dis la eficacia de protección (< 80% de protección; fracción preventiv pués de la exposición con FeLV virulento. La disminución en la e vacuna administrada al grupo de tratamiento T02 se debía probabl >resencia de pocos animales respondedores en ese grupo.

EJEMPLO 16 Vacunación en Ovo contra Eimeria en Pollos alterados. Una adición general del estado de la técnica, que in tos de vacunar contra Eimeria que usan, por ejemplo, prote ria recombinantes como antígeno y una diversidad de siste vantes, se describen en las siguientes publicaciones, todas las c rporan en el presente documento como referencia, com bleciera completamente, (1 ) H.S. Lillehoj et al. , J. Parisitol, 91 (3), - 673; (2) H.S. Lillehoj et al., Avian Diseases, 49 2005, 1 12 - 1 17; alloul et al., Expert Rev. Vaccines, 5(1 ), 2006, p.143 - 163. El enté se refiere al uso de composiciones de vacunas novedo lean componentes de adyuvantes que proporcionan un compor rior en el contexto de coccidiosis.

Los adyuvantes altamente eficaces de la presente inve den usar en combinación con el material antigénico de todas las imeria, incluyendo sus extractos de proteínas purificados o parc ficados, o mediante una o más de sus proteínas expresadas de itos en el ciclo de vida de los protozoos, que incluye sin limitació to esporulados como no esporulados), esporocisto, es uizonte, merozoito, células de gametos masculinos o femenino mplo preferido las proteínas que se desprenden en las h tidades significativas en la fase de oocisto son los materiales a que actúen como como la fuente de antigeno de proteína reco uestras parcialmente o completamente purificadas de tal proteína fica mediante medios convencionales.

Los ejemplos adicionales de proteínas de Eimeria útil ntes de antígeno en la formulación de las presentes vacunas in critas por Karkhanis et al. Infection and Immunity, 1991 , p. 9 luyendo antígenos protectores, como se describe en esos docume ien un intervalo de masa entre aproximadamente 20 y aproxim kDA. Ejemplos adicionales incluyen la proteína 3-1 E de Eimeria d i roteína Et 100 or e em lo como la recu erada de E. tenella. besia spp. (babesiosis ), y protopzoos relacionados, en general icomplexen que provoca estos o trastornos relacionados.

La eficacia de la distribución in ovo de vacunas que temas adyuvantes particulares se evalúan como sigue.

Materiales y Procedimientos 1. Materiales La proteína de E. máxima recombinante (de la proteín presó en E. coli y se purificó en columna de afinidad. La prepara macromoléculas de células enteras de E. máxima (solubiliz tergente de células rotas) también se usaron como antígeno, tígeno bruto que se lama ??". En un ejemplo preferido, el adyu mo se ha descrito en el ejemplo 8 anterior, y se prepara como se rotocolo de e em lo véase la á ina 41 . Por lo tanto en u ximadamente 10 microgramos de DDA; y aproximadame rogramos de R1005, todas proporcionadas en, por ejemplo, 20 m En relación a la selección de la saponina para uso en el umento, es instructiva la siguiente información adicional. El nido de saponina se refiere a los glicósidos derivados de erosas de las cuales se han estudiado de manera extensiva par propiedades biológicas (The Plant Glycosides, Mcllroy, R. J., old y co., Londres, 1951 ). Las saponinas usadas más predomina a técnica para la producción de vacunas son las derivadas de la llaja saponaria molina, Aesculus hippocastanum o Gyophilla strut ocen los extractos de la corteza de Quillaja saponaria molina que tienen una actividad adyuvante, por ejemplo Quil A. Tambié crito las fracciones puras de Quil A que mantienen la actividad ad son al mismo tiempo menos toxicidad que Quil A, por ejemp 21 también se describe en Kensil et al. 1991. J. Immunolo vol 1 onina se refiere a "Quil-A" vendida en los Estados Unidos por la Sergeant.

Se debe entender además que los extractos de sap den usar como mezclas o componentes individuales purificado mos tales como fracciones/productos que incluyen QS-7, QS-17, -21 de Antigenics Company, Massachusetts, Estados Unidos o saponina brutos, purificados, fraccionados o refinados similar zclas de los mismos ofrecidos por Isconova Company de Sueci dalidad la Quil A tiene al menos un 85% de pureza. En otras mod uil A tiene al menos un 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 9 , o 99% de pureza. 2. Vacunación de embriones Se compraron los huevos de Moyers Hatchery, Quakert a inmunización in ovo, después se incubaron huevos de pollo dosis de 50 microlitros también estaban entre las que pueden a práctica de la presente invención. 3. Pollos Tan pronto como los pollos de carne se e roximadamente el día 21 - 22), se llevaron al laboratorio usando ón de transporte de pollos desechables (Frederick Packagi aukee, Wl) y los pollitos se alojaron después en las unid ersime y se les proporcionó alimento y agua a voluntad.

Se mantuvieron las aves en corrales para crías alación sin Eimeria y se llevaron en jaulas suspendidas gr lizaciones separadas donde se infectaron con oocistos vivos d xima y se mantuvieron hasta que el final del período de experimen 4. Parásitos 5. Infección de exposición de Eimeria Se marcaron aves de siete días de edad en las aves y todos los grupos experimentales excepto los grupos de c etados se inocularon por vía esofágica con E. máxima usando u noculación, y después se colocaron en jaulas de recogida de oosi 6. Determinación de la ganancia de peso corporal Se determinaron los pesos corporales individuales de os días 0 (sin infectar), 6 y 10 días después de la infección con E. 7. Determinación de la producción de oocistos fecales Se instruyeron a los cuidadores de animales para li as, y se recogieron las deposiciones fecales. Una vez reco dejas se colocaron cada jaula durante 5 días a partir del día 6 de nfección, se reco ieron los materiales fecales en randes acarosa sucrque se ha establecido en el Laboratorio del Dr Lil uló el número total de oocistos desprendidos por pollo usando la istos totales /ave = (recuento de oocistos x factor de dilución x vol stra fecal / volumen de la cámara de recuento)/número de aves p 8. Recogida de muestras Se recogió muestra el día 6 después de la fecha de inf eterminó la respuesta de anticuerpo en suero. Se obtuvieron mu gre de aves individuales (N = 4 - 5/grupo), se permitió la coagulaci , y se recogió el suero. Se ensayaron muestras de suero luación de de anticuerpos anti-Eimeria usando ELISA. En res brieron placas ded microtitulación durante toda una noche ocilio de los antígenos recombinantes coccidiales Ea3-1 E, IC2, se lavaron con PBS-0.05% Tween, y se bloquearon con . Se añadieron diluciones en suero 1 :20 1 :40 1 :80 1 :1 9. Síntesis de cDNA Se extrajo el ARN de lELs intestinal usando TRIzol (I rlsbad, CA). Se trataron cinco microgramos de ARN con 1.0 U de .0 µ? de tampón de reacción 10X (Sigma), se incubó durante peratura ambiente, se añadió 1.0 µ? de de solución de deten ctivar la ADNasa I, y se calentó la mezcla a 70°C durante 10 mi scribió de manera inverse el ARN usando el sistema de si era hebra StrataScript (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerd trucciones del fabricante. 10. RT-PCR Cuantitativa Los cebadores de oligonucleótidos de la RT-PCR c a el interferón ? de pollo (IFN-?) y control GAPDH se enume dro 4. Se llevaron a cabo la amplificación y detección usando c CUADRO 4 badores de oligionucleótidos usados para la RT-PCR cuantit IFN-v y GAPDH de pollo iana de Secuencias de cebador Tamaño del p RN de PCR (bp) APDH N° de acceso K01458 264 irecto 5'-GGTGGTGCTAAGCGTGTTAT-3' SEQ ID NO:1 nverso 5'-ACCTCTGTCATCTCTCCACA-3' SEQ ID NO:2 FN-Y N° de acceso Y07922 259 irecto 5'-GCTGACGGTGGACCTATTATT-3' SEQ ID NO:3 nverso 5'-GGCTTTGCGCTGGATTC-3' SEQ ID NO:4 L-? ß N° de acceso Y 15006 244 irecto 5'-TGGGCATCAAGGGCTACA-3' SEQ ID NO:5 nverso 5'-TCGGGTTGGTTGGTGATG-3' SEQ ID NO:6 L-15 N° de acceso AF139097 243 irecto 5'-TCTGTTCTTCTGTTCTGAGTGATG-3' SEQ ID NO:7 nverso 5'-AGTGATTTGCTTCTGTCTTTGGTA-3' SEQ ID NO:8 Se recogió el bazo antes de la inoculación con E. ma DPI (fecha después de la infección) para el ensayo de prolife enocitos. Se colocaron los bazos en una placa Petri con 10 mi de sal equilibrada de Hank (HBSS) suplementada con 100 U/ml de 02 y 95% de aire durante 48 hr. Se determinó la proliferación d 2-(2-metoxi-4-nitrofenM monosódica (WST-8, Cell- Counting Kit-8®, Dojindo hnologies, Gaithersburg, MD). La Densidad Óptica (DO) se mi usando un espectrofotómetro de microplacas (BioRad, Richmond, Resultados Los resultados mostraban que las aves de engorde v 100 microlitros de formulación de adyuvante (es decir, 100 micro uyen proteína 3-1 E recombinante de acuerdo con las dosis viamente) ganaron aproximadamente 45 a 85 gramos adicionale poral en comparación con la aves no vacunadas pero infectad x/ma.

Las vacunas de la invención también mostraban efect re la inmunidad mediada por células según se midió por en vacuna con adyuvante de la invención. En resumen, estos r can claramente el efecto del presente adyuvante sobre la resp quinas y confirman su efecto sobre la potenciación de la respuest iada por células más que la humoral.

Las vacunas de la invención también mostraban claro re la producción de ooquistes fecales. Las aves de control sin i inaban ooquistes. Después de la infección por E. máxima, se p ucciones significativas en la producción de ooquistes fecales e se trataron con adyuvantes de Pfizer en solitario. Las aves vac con Eimeria máxima bruta y adyuvante demostraron una prod uistes fecales mucho menor en comparación con grupos inocul a preparación de Eimeria máxima bruta en solitario. Grupos EM.

Debería señalarse que aunque se ha usado proteí xima recombinante purificada 3-1 E en la práctica de los exp ncionados anteriormente, el uso de los antí enos Ea3-1 E, EaMIF EJEMPLO 17 valuación de Bacterina de la cepa J5 de Escherichia coli en g El objetivo del estudio es evaluar la respuesta inmunol ado a antigeno de Escherichia coli (cepa J-5) cuando se admi rsas nuevas formulaciones. La bacterina J5 comercial se co o una vacuna preventiva para mastitis por coliformes en ganado moderadamente eficaz en su actual formulación. Antes de la vac eterminó que los animales tenían un bajo título de anticuerpos . coli, basándose respectivamente en un análisis de muestras guíneo tomadas antes de la vacunación.

Ganado Bovino Se formularon vacunas experimentales usando bacteri olí inactivada como antígeno y se realizaron de acuerdo con el ej CUADRO 5 Grupos de Vacunas - Ganado Bovino upo N° de Animales Tratamiento Día Dosis ( Trat. 01 Solución salina 0, 21 5.0 Bacterina de Escherichia 02 0, 21 5.0 coli, cepa J-5 03 QCDCR 0, 21 5.0 04 QCDO 0, 21 5.0 05 QCDX 0, 21 5.0 06 QCDXO 0, 21 5.0 En el cuadro 5, QC es la abreviatura para QuilA/cole DDA, C para carbopol, R para R1005, X para DEAE-dextrano ite.

Se prepararon soluciones madre como en los ejemplo riores para lo siguiente: se administró E. coli a aproximadamen organismos por dosis según se determinó por recuento dir roscopía óptica. Quil A en agua a 50 mg/ml, colesterol en eta ml, DDA en etanol a 17 mg/ml, R1005 en tampón fosfato 20 con Span 80 y Tween 80 (QCDO) o Span 85 y Tween 85 ( eol® es un aceite mineral ligero disponible en el mercado.

Se recogieron muestras de sangre los días de estudio 0 ensayo serológico. Se determinaron los títulos de anticuerpo con oli en muestras de suero por medio de un ensayo de ELISA ecífico de J5. Se determinaron los isotipos de anticuerpo ugados de anticuerpo de oveja anti-bovino (Bethyl Labs). Se dete ítulos y se expresaron como sus medias geométricas.

Resultados Los resultados serológicos del estudio se muestran dros 6-8. Títulos más elevados de anticuerpos están gene ciados con mejor protección de vacunas. El título de IgG específi l se muestra en el cuadro 6. Varias de las formulaciones de la nción producían títulos mucho más elevados que el producto c CUADRO 6 Títulos de anticuerpo IgG Se determinaron lós isotipos de anticuerpo lgG1 específi stos resultados se muestran en el cuadro 7. De nuevo, las formul O, QCDX y QCDXO eran especialmente eficaces en la inducción na respuesta inmune en este ganado. Estas formulaciones daban ho mayores incluso con una sola vacunación que la vacuna come inyecciones.

Los títulos de anticuerpo lgG2 se muestran en el cuadro ipo de anticuerpo se asocia con frecuencia con mejor fagocitosis trófilos en la leche y protección para el animal. Las formulaciones DX y QCDXO eran especialmente eficaces en la inducción de una puesta inmune en este ganado.

CUADRO 8 Títulos de anticuerpo lgG2 Grupo de Tratamiento Media geométrica del Trat Título de lgG2 contra J5 a día 0 21 48 T01 Solución salina 199 396 396 Bacterina de Escherichia T02 280 855 3136 coii T03 QCDCR 1 1 14 1402 4966 T04 QCDO 558 1573 6250 T05 QCDX 176 3947 9899 T06 QCDXO 559 8824 87940 s las vacunaciones se administraron por inyección subcutánea studio 0 y 21. El volumen de dosificación era de 5 mi.

CUADRO 9 Grupos de vacunas - Ganado de leche upo N° de animales Tratamiento _ . , T; . Día Dosis [ 01 7 Solución salina 0, 21 5.0 „„ Bacterina de Escherichia n 02 7 t \ a 0, 21 5.0 co//, cepa J-5 03 7 QCDCR 0, 21 5.0 04 7 QCDO 0, 21 5.0 05 7 TXO 0, 21 5.0 En el cuadro 9, QC es la abreviatura de QuilA/colestero , C para carbopol, R para R1005, X para DEAE-dextrano, T para LR (CpG-ODN) y O para aceite. Se prepararon soluciones madr iente; se administró E. coli como aproximadamente 4-5 X 109 org dosis según se determinó por recuento directo por microscopí aceite mineral Drakeol 5 LT con Span 80 y Tween 80 (TXO, n 85 y Tween 85.

Recogida de sangre Se recogieron muestras de sangre los días de estudio 0 ensayo serológico. Se determinaron los títulos de anticuerpo con oli en muestras de suero por medio de un ensayo de ELISA ecífico de J5. Se determinaron los isotipos de anticuerpo de jugados de anticuerpo de oveja anti-bovino (Bethyl Labs). Se dete títulos y se expresaron como sus medias geométricas.

Resultados Los resultados serológicos del estudio se muestran en Los títulos de anticuerpos más elevados se asocian en general c tección de vacunas. El título de IgG específica de J5 total se mue CUADRO 10 Títulos de anticuerpo lqG Se determinaron los isotipos de anticuerpo lgG1 espe Estos resultados se muestran en el cuadro 10. De nu ulaciones QCDO, TXO y QCDXO eran especialmente eficac cción de una buena respuesta inmune en este ganad ulaciones proporcionaban títulos mucho mayores incluso con unación que la vacuna comercial con dos inyecciones.

Este isotipo de anticuerpo se asocia con frecuencia c EJEMPLO 18 Vacuna del virus de la diarrea viral bovina Objetivo de estudio Este estudio comparaba la seguridad, eficacia y p zada de dos vacunas muertas de virus de la diarrea viral bovin 2 (BVDV-1 y BVDV-2 o BVD-1/2) y una vacuna de extracto de B ulada con adyuvantes de la invención con un control negativo ina) y dos positivos (una vacuna viva modificada de BVDV-2 y un erta de BVDV-1/2 actualmente disponible) frente a una expos DV-1 en terneros sin tratamiento previo. El cuadro 11 presenta el udio.

Este estudio también mostraba que los adyuvant ención pueden usarse para distinguir animales vacuna Oposiciones de vacunas de la presente invención de animales CUADRO 11 Diseño de estudio QC es la abreviatura para QuilA/colesterol, D para DDA, bopol®, R para Bay R1005® recibió sólo una vacunación (Día de Estudio 0). Recibieron una v S vivo modificado (MLV) BVDV-2 que no contenía adyuvante. El g bió una vacuna de virus muerto BVDV-1/2 que contenía una en ite en agua al 2.5% (Amphigen) y adyuvantes Quil A/colesterol . El grupo T04 recibió una vacuna de virus muerto BVDV-1/2 que l A/colesterol, DDA y Carbopol. El grupo T05 recibió una vacuna rto BVDV-1/2 que contenía Quil A/colesterol, DDA, Carbopol y ?? T06 recibió una vacuna de extracto de alto título de virus mue que contenia Quil A colesterol, DDA y Carbopol el día 0 y una v acto de bajo título similar el día 21. Todos los tratami inistraron por vía subcutánea en una sola dosis de 2 mi los dí la excepción del Grupo 2.

El QCDC +/- R contenía 100 pg Quil A, 100 pg de Cole DDA y Carbopol al 0.075% e incluía 1 ,000 pg de R1005 por dosi o se ha descrito anteriormente.

Observaciones Se registraron las observaciones del sitio de inyección studio 0 (prevacunación), 1 , 2, 3, 7 y 21 para el primer sitio de i llo izquierdo). Se registraron las observaciones para el segund cción (también cuello izquierdo) los días de estudio 21 (prevac 23, 24, 28 y 35. Se midieron todas las reacciones de sitio de i ables (L x A x A, cm). Se registraron las temperaturas rectales lo dio -1 , 0 (prevacunación), 1 , 2 y 3 para la vacunación pri straron las temperaturas para la vacunación de refuerzo los dio 20, 21 (prevacunación), 22, 23 y 24.

Recogida de Muestras de Sangre Se recogieron muestras de sangre de cada animal d ndo tubos de separación de suero (SST) los días de estudio -1 , Se recogieron muestras de sangre usando tubos con EDTA lo stran que los adyuvantes de la invención proporcionaban un aur títulos contra tanto BVDV-1 como BVDV-2 a medida que a dio. Un título aceptable para la UDSA está por encima de un tít s datos demuestran títulos por encima de 5,000 que indican u ucción de anticuerpos que es capaz de detener al virus vivo cua l animal con potencial para infección y enfermedad.

CUADRO 12 Título neutralizante de anticuerpos en suero (vacuna, BVDV-1 BVDV-2 adyuvante) Día -1 Día 21 Día 41 Día 56 Día -1 Día 21 Día 41 Media MMCG M CG MMCG Medía MMCG* MMCG* O T01 1.00 1.00 1.00 21.38 1.00 1.01 1.01 ción salina, uno) ( -D (1-1) (1-1) (11-54) (1-1) (1-1) (1-1) OT02 V-2 MLV, roo 1.00 2.75 13.27 1.00 2.14 45.21 uno) (1-1) (1-1) (1-27) (1-45) (1-1) (1-10) (1-1024) o T03 35.59 ? ,? 877.75 1.00 1.60 486.49 1.00 V-1/2 Pre nt- - sición. Una medida de Ieucopenia es un criterio para aut ercialización de un producto de MLV por la USDA. Sin embargo, inactivado la ieucopenia no es un criterio para la USDA pe eren los datos los adyuvantes de la invención producían una le asta sólo el 20% de los animales mientras que la mayoría de las irus inactivados presentan una Ieucopenia del 100%. Esto indica vantes de la invención eran capaces de dirigir una respuesta T un antígeno inactivado. Esto es difícil de realizar y rara vez se ob uctos inactivados.

CUADRO 13 Leucopenia por Día de Estudio Día de estudio T01 T02 T03 T04 T05 1 Solución Vivo PreZent QCDC QCDCR QC salina Modificado A Exlr ía 43 0 0 0 0 0 ía 44 0 0 0 0 0 tra el virus exacto en la vacuna. Esto se observa en que el G stra protección sólo contra BVDV-2. Sin embargo, las vacunas in adyuvante de T03 (PreZent-A), T04 (QCDC) y T05 (QCDCR) g fuerte respuesta de anticuerpos pronto al comienzo de la inmuni la fase de vida del estudio animal contra un panel serológ rso de BVDV. Esto muestra que estos adyuvantes tenían la cap porcionar seguridad y eficacia en un modelo de exposición para p ado no sólo en una exposición homologa sino heteróloga.

CUADRO 14 Títulos de Neutralización en Suero el Día 41 ección Cruzada por lo Serológico de Grupo Tratamiento, Log 2 de o de Anticuerpo T01 T02 T03 Solución Vivo PreZent T04 T05 Salina Modificado A QCDC QCD V1 a Promedio <1 0.8 4.0 2.5 2.9 adora se demuestra por el procesamiento en gel mediante en inmunoprecipitación (Figura 1). Una respuesta de anticuerpos c ínas NS2/3 y E2 del BVDV es muy pronunciada en un animal v una vacuna de MLV o un animal expuesto de forma natural a na inactivada con adyuvante PreZent-A. Sin embargo, los adyuv vención demostraban una respuesta de anticuerpos sólo c ina E2 y no contra las proteínas NS2/3. Por lo tanto, un animal v una vacuna de BVDV inactivado que comprende adyuvante ción puede diferenciarse de un animal infectado de forma natu al vacunado con MLV o animal vacunado con PreZent-A. ideraría una vacuna marcadora que es valiosa para la erradic s tipos de enfermedades en poblaciones animales.

EJEMPLO 19 Micoplasma hyopneumonia en Suidos El MPS causa pérdidas económicas considerables en as en las que se crían cerdos. Encuestas realizadas en lizaciones por todo el mundo indica que las lesiones típicas de l ervan con MPS aparecen en el 30%-80% de los cerdos al rificio. Debido a que las lesiones micoplásmicas pueden resolve que los cerdos alcancen el peso de sacrificio, la incidencia real p or. Se ha descrito que la prevalencia de la infección pneumoniae en la neumonía crónica de suidos oscila del 2 dos de todas las edades son susceptibles a MPS, pero la enfer s común en cerdos en crecimiento y en terminación. Pruebas ican que M. hyopneumoniae se transmite por aerosol o contact secreciones del tracto respiratorio de cerdos infectados. Es smisión de cerdas a lechones durante la lactación. Una vez esta S aparece año tras año en piaras infectadas, variando en grav ores ambientales como la estación, ventilación y concentración d Animales Se usaron en el estudio sesenta y seis (66) cerdos c camente sanos a aproximadamente 17 días de edad sin una hi rmedad causada por M. hyopneumoniae y PRRSV o con va ra los mismos organismos. Antes del transporte al sitio de e nte 2 días después de su llegada, se trató a los cerdos con Nax ntramuscular en la pata trasera, siguiendo las instrucciones de la prevenir enfermedades relacionadas con el estrés tale ptococcus suis. Los animales se asignaron a tratamientos y est rdo con un plan de aleatorización. El diseño de estudio se mues ro 15.

CUADRO 15 Diseño Experimental rupo de N° de Tratamiento Vacunación Vía Productos Veterinarios de Investigación (IVP) Los antígenos y Productos Veterinarios de Investigación stran en el cuadro 16. Las vacunas para los grupos de tratami , y T04 (todos excepto T05) se prepararon de acuerdo con el ej ndo las concentraciones de componentes que se muestran en a continuación. Los componentes se añadieron en el orden enum uadro.

Se añadió un expansor plasmático de solución sali ipíente y se inició la homogeneización y se continuó durante cedimiento de preparación. Se preparó M. hyopneumoniae ina tir de un volumen mezclado de 75 litros de fermentado por 800 ducto final formulado y se añadió a una concentración de 0.093 is. Se añadió Quil A a la concentración enumerada en el cu pués se añadió solución de colesterol/etanol. Se añadió so etanol seguida de adición de la solución de glicolípido Ba CUADRO 16 Productos Veterinarios de Investigación (IVP) Vacunación Los animales en el grupo de tratamiento NTX no se vacu xpusieron. A aproximadamente 3 semanas de edad (Día 0 una dilución 1 :50 en medio de Friis de un homogeneizado gelado al 10% de la cepa 11 de M. hyo (LI36).

Recogida de Muestras de Sangre El Día -1 ó 0 (antes de la 1a vacunación), Día 13 ó 14 2a vacunación), Día 34 ó 35 (antes de la exposición) y Día ropsia), se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 5 a os separadores de suero) de todos los cerdos y se ensaya ología de M. hyopneumoniae (ELISA-IDEXX).

Peso Se pesaron todos los animales a la llegada con tribución en lotes, el Día 34 ó 35 (antes de la exposición) y el Dí tes de la necropsia). a lóbulo (craneal izquierdo, medio izquierdo, caudal izquierdo, cho, medio derecho, caudal derecho y accesorio se puntuaron r real entre 0-100%. El porcentaje para cada lóbulo pulmonar s fórmula ponderada para el cálculo del porcentaje total de pul nes. Se realizó una necropsia de seis (6) animales NTX el Día s de la exposición y se puntuaron sus pulmones para lesiones.

Puntuaciones de Lesión Pulmonar El porcentaje de pulmón total con lesiones se calculó u iente fórmula: Porcentaje de pulmón total con lesiones = 100 x eal izquierdo) + (0.10 x medio izquierdo) + (0.25 x caudal izq 0 x craneal derecho) + (0.10 x medio derecho) + (0.25 x caudal d 0 x accesorio)}. Se aplicó la transformación raíz cuadrada del arc entaje de pulmón total con lesiones antes del análisis. Las nonares transformadas se analizaron con un modelo mixto lineal Resultados Como se indica por los resultados del cuadro 17 a cont adyuvantes de la invención se comportaban igual de bien que el miento con adyuvante de aceite T05 que contenia el a phigen®. Típicamente, con una puntuación de lesión pulmonar p se considera que se ha conferido eficacia por el tratamiento de combinaciones de los adyuvantes de la invención cumplen estos CDCR se comportaba el mejor en puntuación e intervalo entre viduales.

Cuadro 17. Porcentaje de Pulmón con Lesiones Proporción Señal: Serológica Positiva MMC Intervalo (S/P) Día 34 T01 - Placebo 0.00 8.4 0-25.55 T02 - DRC 0.28 2.4 0-20.13 T03 - QCDC 0.15 2.1 0-23.18 EJEMPLO 20 Virus de la Influenza Aviar Felina (FAIV) Este estudio evaluaba la eficacia en gatos de una v enza usando un adyuvante de la invención por exposición a una S de influenza aviar virulento.

Procedimientos y Resultados Antes de la vacunación, se determinó que los anim ativos tanto para virus influenza como para anticuerpos co enza, basándose respectivamente en hisopos orofaringeos y a stras de suero sanguíneo tomadas antes de la vacunación.

Se formularon vacunas experimentales usando influe gena inactivada y hemaglutinina purificada (HA). Cada g amiento contenía inicialmente seis animales (cuadro 18). Dos g tantemente a los animales hasta que se recuperaron y eran ca arse derechos para asegurarse de que no había reacciones adve traron las observaciones a aproximadamente una hora post-vacu abría registrado cualquier otra complicación observada despu nación.

La composición de adyuvante se ha descrito pre nórmente mediante el ejemplo QCDC que usa Quil A (20 pg), C pg), DDA (10 pg) y Carbopol (0.05%) por dosis. El antígeno pleto inactivado o proteína HA H5 purificada.

Se evaluaron los animales para reacciones en el cción y respuesta serológica a la vacuna. Se eutanasiaron tres en T02-H5N2 inactivado y uno en T05-solución salina) d roxaluria congénita antes de la exposición. El día de estudio 49, t S supervivientes se expusieron por la vía intratraqueal a la ce etnam/1194/04 para evaluar la eficacia de los candidatos a vacu CUADRO 18 Grupos de Vacuna Se recogieron muestras de sangre los días de est acuñación, 0, 21 y 49 para ensayo serológico. Los días de estudi ecogieron muestras de sangre para ensayo virológico. El día d se tomó una muestra de sangre no programada de todos los nes características atribuibies a una infección por FAIV. S entajes para identificar el grado de consolidación pulmonar. El ierdo se fijó con formalina tamponada neutra al 10% para histop ulmón derecho se recogió y se obtuvieron muestras para ógico. Además de los pulmones también se tomó una muestra d lquier tejido con patología macroscópica y se almacenó en f ponada neutra al 10% para histopatología.

Se determinaron los títulos virales en muestras de pos orofaríngeos y rectales y en muestras de tejido pulmonar p na PCR TaqMan específica de H5N1. En resumen, se aisló AR istema MagnaPure LC con el kit de aislamiento de ácido nucl naPure LC (Roche Diagnostics; Almere, Países Bajos), y se d s influenza A mediante el uso de un ensayo de RT-PCR a tiempo s se expresaron como unidades de dilución de control (U rminaron las UDC a partir de una curva patrón producida a parti Se analizaron muestras de plasma por neutralización d inhibición de la hemaglutinación. Para el ensayo de inhibido aglutinación (Hl), se incubó una suspensión de virus de la enza Vietnam 1 194/04 (H5N1 , clase 1 ) o Indonesia 05/2005 (H5 on diluciones seriadas (2 veces) de muestra de suero pretrat do de cólera (obtenjdo de cultivos de Vibrio cholerae). Posterior ieron eritrocitos a las diluciones y después de la incubación, la ima de tos agentes que mostraba una inhibición complet aglutinación se definió como el título de Hl.

El ensayo de neutralización de virus (VN) se basaba ción de punto final de los sueros. En resumen, se mezcló una tante de virus con una dilución seriada (2 veces) de una mu o. Se leyó la neutralización de virus usando células MDCK com adoras y se visualizó por aglutinación de eritrocitos. Se puntú s de VN tomando la mayor dilución de suero a la que el 50 Resultados Ninguno de los animales en ios cinco grupos de tr traba dolor o hinchazón en el sitio de inyección después de la unda vacunación. Además, no se registraron anomalías en la pi s de inyección. Después de las vacunaciones y antes de la expo ia diferencias significativas al nivel de significación de 0.1 peraturas corporales entre tratamientos por análisis de mod al. Un animal de T01 estaba febril (> 40°C) antes de la primera va ía 0 y durante varios días después. Se registraron aumentos es la temperatura corporal en animales individuales hasta 40°C o s pués de las vacunaciones (Días 0 y 21 ). No se observó una salu Cionada con la vacunación durante el estudio. Tres animales (do 2, y uno en T05-solución salina) se eutanasiaron debido a hip génita antes de la exposición. Varios animales de todos los trat sentaban complicaciones de heridas después de la implant s los animales permanecieron sanos después de la exposición. E los primeros signos clínicos anormales (depresión y esfuerzo re eniado) se observaron en dos animales dos días despué osición. Tres días después de la exposición, los seis animales ban deprimidos y mostraban un aumento en el esfuerzo respirat siguiente, se tuvieron que eutanasiar dos animales por raz estar. Cuatro días después de la exposición (Día 53), se enc al muerto y los tres animales restantes de T04 presentaban d erzo respiratorio aumentado, protrusión del tercer párpado y al y se eutanasiaron por razones de bienestar. En T05 (n = 5), los os clínicos anormales de depresión y esfuerzo respiratorio aume ervaron en un animal un día después de la exposición. Dos días la exposición, dos animales más empezaron a mostrar esos sig después de la exposición, se encontró un animal muerto y l ales restantes presentaban depresión, esfuerzo respiratorio aum . Las temperaturas medias de los animales de control (T04 y aron hasta 40.0°C, comenzando un día después de la exposic encias en las temperaturas medias corporales entre tratamient ificativas (p = 0.0001) por análisis de modelo mixto lineal. Los ales individuales mostraban que en una minoría de los animales y T03, las temperaturas corporales se elevaron hasta 40.0° ma en puntos de tiempo esporádicos el Día 53. En T01 , dos ban febriles (intervalo de 40.0 a 40.1 °C) en un punto de tiempo. animales estaban febriles (intervalo de 40.0 a 40.3°C) en uno de os de tiempo, respectivamente. En T03, unos de los animale (intervalo de 40.0 a 40.3°C) en tres puntos de tiempo. En TO >s los animales estaban febriles durante al menos doce horas 50 y 51.

Los títulos de anticuerpos de Hl contra las cepas de i nam 1 194/04 (H5N1 , clase 1 ) e Indonesia 05/2005 (H5N1 , cla ués de la segunda vacunación. En T02, los títulos contra /04 eran inferiores que los observados en T01 y T03, oscilando d ués de la primera vacunación y de 5 a 70 después de la nación. Los títulos de anticuerpos de Hl contra Indonesia 05/20 lares a los observados contra Vietnam 1194/04.

Se ensayaron muestras de plasma tomadas antes y des xposición mediante RT-PCR a tiempo real específica de H5 minar la carga viral. Todos los animales tenían muestras neg antes de la exposición. Después de la exposición, no se detectó asma de animales de T01 y T03. Por el contrario, e! 25% (1 de ales de T02, 67% (4 de 6) de los animales de T04 y 60% (3 ales T05 eran positivos a virus en plasma después de la exposici ificativas diferencias entre tratamientos (p = 0.0247) por an élo mixto lineal.

Se evaluó la eliminación de virus después de la expos tomaron muestras de animales de T04 y T05 cinco días desp osición, puesto que todos los animales habían muerto para enton in de un análisis estadístico, sin embargo, los resultados del últim los animales que murieron o se eutanasiaron antes del final del e aron al último día del estudio.

También se usaron muestras de garganta con un itivo por RT-PCR (>1.8 UDC) en ensayos de titulación de lación de virus confirmó que todas las muestras positivas por tenían virus influenza infecciosa (no se muestran los datos). Los S infeccioso eran inferiores en animales vacunados (T02 y T03 males de control (T04 y T05). Estas diferencias eran significativas >pués de la exposición cuando se comparaban con T02 o T03 c >, cuatro y cinco días después de la exposición cuando se compar 03 con T05. Los títulos en animales de T02 y T03 eran de 0.5 log i títulos observados en T04 oscilaban de 2.3 a 4.3 log10 DICT50. L La patología pulmonar era menos grave en animales va , T02 y T03) que en animales de control (T04 y T05). Todos los ñados presentaban una neumonía broncointersticial subaguda Los animales de control mostraban una neumonía broncoin guda de moderada (dos animales de T04 y un animal de T05) tro animales de T04 y cuatro de T05) con una distribución multi s excepto dos animales de control que mostraban (un animal d de T05) una distribución difusa. Se evaluó el pulmón compl rminar el grado de consolidación, que se expresó en porce solidación de tejido pulmonar total. De acuerdo con los h lógicos pulmonares, el porcentaje de consolidación era significati rior en animales vacunados (T01 , T02 y T03) que en animales d y T05).

Se evaluó la carga viral en tejido pulmonar recogid ento de la muerte o eutanasia por titulación de virus y RT-PCR d pulmón y patología pulmonar incluyendo consolidación, en ani rol que habían recibido adyuvante (T04) o solución salina (T05).

La vacunación con proteína HA H5 purificada (T01 ) pr ia, la eliminación viral a partir de la garganta y la mortalidad s jóvenes después de la exposición con una cepa de influenza avi ente patógena. Además, la vacunación con proteína HA H5 p ) reducía los signos clínicos incluyendo fiebre, carga viral en p logía pulmonar, incluyendo consolidación.

La vacunación con una cepa H5N2 inactivada (T02) pre os clínicos, eliminación viral en heces y mortalidad en cuat nes después de una exposición a una cepa de influenza avi ente patógena. Además, la vacunación con la cepa H5N2 in ) reducía la viremia, fiebre, eliminación viral a partir de la gargan en pulmón y patología pulmonar, incluyendo consolidación.

La vacunación con una cepa H5N1 inactivada (T03) pre Resumen No se observaron reacciones en el sitio de inyección nas formuladas con antígeno HA inactivado o purificado con a DC. Las vacunas proporcionaron una protección completa de enf ca y mortalidad en gatos vacunados, una carga viral significati cida en sangre y tejidos y una eliminación de virus significati cida.

EJEMPLO 21 Cáncer Antecedentes Este estudio se realizó en ratas inmunodefici unocompetentes usando células de carcinoma hepatocelular hum para generar modelos heterotópicos y ortotópicos. ximadamente 7 semanas y se eutanasiaron por inhalación de CO xperimento.

El diseño experimental incorporaba dos fases. En la f ibuyeron aleatoriamente las ratas en dos grupos basándose en oral. Las ratas en el grupo 1 no recibieron inyección de células t tras que las ratas en el grupo 2 recibieron una inyección subcut las tumorales. A las tres semanas después de la inyección de t S en el grupo 2 se distribuyeron aleatoriamente (basándose en el ral y el índice de ingesta - véase el cuadro 19) en dos grupo II, incluyendo uno de los mismos dos subgrupos: 1 ) controle ban tumor que recibieron solución salina (el Grupo de Co roles que llevaban tumores tratados con adyuvante solamente ( Tumor); y 3) sujetos que llevaban tumores (Tumores ficados con vacuna (dos inyecciones subcutáneas separadas anas). Se realizó la necropsia de todos los animales a los CUADRO 19 Grupos de vacuna Tipos de Número po de Células N° de Descripción de Formulación miento Tumorales Vacunaciones Animales (Antígeno) Placebo de rol Sin Control Negativo NA PBS al mor (solución salina) 0.63% Placebo de mor Vehículo sin QCDC PBS al ículo) antigeno 0.63% Dosis liquida QCDCR y Placebo de mor homogeneizada- 100 µg de PBS al tado) vehiculo más antígeno 0.63% HepG2 inactiva do QC es la abreviatura para QuilA/colesterol, D para DDA, opol®, R para Bay R1005®, PBS para solución salina tampon Preparación de Vacuna Se prepararon vacunas usando Quil-A (20 c g/dosis), DDA (10 g/dosis), Carbopol (0.05%) con o sin glicolí casiano de 15 años de edad con un carcinoma hepatocel renciado. Las células se expandieron en condiciones de cultiv encionales y se prepararon para inyección a una concentració células/ml en Matrigel. A cada rata se le inyectaron 0.5 mi de su lar, por vía subcutánea en el sitio del segundo pezón.

Mediciones Se midió el tamaño tumoral dos veces por semana dur studio mediante el procedimiento de calibrador, donde el volume (A (mm) x A (mm)]/2 x L (mm)}/1000. Se recogió sangre por orbitario para mediciones de química sérica y biomarcado ales se anestesiaron ligeramente durante el procedimiento de CO2/O2. Se analizaron los criterios de valoración químicos u -analizador Hitachi 917 (Roche, Indianápolis, IN). Se obtuv inal bajo anestesia con C02 por punción cardiaca. Se evalu s los valores se expresaron como media ± DT y un valor de p ideraba que era estadísticamente significativo.

Resultados Se corrigieron mediciones de peso corporal restando ral (basado en los datos de volumen y en la suposición de que 1 os datos se analizaron de dos formas: por grupo de tratamien ales que llevan o no llevan tumor. Cuando se comparaban l orales en animales que llevaban tumor respecto a animales ban tumor, había una diferencia significativa entre los grupos en iempo terminal; no había diferencia en el nivel basal. Aun cu s corporales no eran significativamente diferentes cuando se co grupo de tratamiento, probablemente debido a la corta dura dio, había una tendencia apreciable hacia un peso corporal dismi os grupos que llevaban tumor respecto a los controles y una t CUADRO 20 Cambio en el peso corporal con el tiempo entre rimentales. Las áreas sombreadas indican datos cuando se a na.

Peso Corporal (g) Control Tumor Tumor Tratado 0 242.7 ± 1 1.4 260.0 ± 16.3 245.0 ± 12.1 6 263.9 ± 13.5 278.1 ± 17.5 258.6 ± 14.6 9 270.1 ± 14.0 280.6 ± 19.2 260.1 ± 15.1 13 280.6 ± 16.2 290.3 ± 20.2 262.0 ± 15.1 16 283.8 ± 15.0 289.0 ± 18.5 261.1 ± 15.3 20 292.6 ± 16.1 284.1 ± 17.3 259.2 ± 14.6 23 299.8 ± 15.6 283.2 ± 17.0 252.7 ± 14.2 27 298.7 ± 14.0 276.1 ± 15.5 259.4 ± 14.4 30 307.6 ± 15.9 274.2 ± 3.4 260.9 ± 14.5 34 317.8 ± 16.2 262.6 ± 14.6 267.8 ± 15.1 37 318.1 + 16.6 263.1 ± 15.0 268.4 + 14.8 41 323.4 ± 15.3 264.4 + 14.7 274.9 ± 15.2 44 328.5 ± 16.6 262.5 ± 14.6 278.3 ± 15.1 48 331.2 ± 17.0 263.0 ± 14.1 281.6 ± 15.0 49 330.5 17.1 262.6 ± 14.4 281.2 ± 14.3 Tamaño Tumoral CUADRO 21 Cambio en el tamaño tumoral entre el grupo tratado con or) y el grupo tratado con vacuna (Tumor tratado). La breadas indican los datos de cuando se administró vacuna.

Tamaño Tumoral (cm3) Día Tumor Tumor Tratado 6 4.6 ± 2.1 4.7 ± 2.0 9 4.9 ± 2.0 4.8 ± 1.8 13 4.6 ± 1.8 5.0 + 2.2 16 12.2 ± 2.7 12.3 ± 2.5 20 22.6 + 3.8 13.4 ± 2.6 23 33.3 ± 4.8 14.1 ± 2.8 27 34.5 ± 4.6 13.8 ± 2.8 30 35.6 ± 4.6 13.5 ± 3.4 34 37.7 ± 8.0 14.1 ± 2.9 37 38.6 ± 10.2 13.7 ± 2.3 41 44.5 ± 12.1 12.5 ± 2.1 44 52.9 ± 13.9 13.0 ± 2.1 48 61.7 ± 15.1 16.9 + 2.9 CUADRO 22 ales en grupos de tratamiento. Los datos de este estudio y l ricos indican que la AFP solo es detectable en animales que lleva omparación de los datos longitudinales de AFP en los grupos co ontrol y tratados indica que la AFP disminuía en los animales ués de la primera inyección de vacuna y era mucho menor das respecto a controles que llevan tumor al final del estudio; 4. i en tratadas con vehículo respecto a 0.97 ± 2.5 ng/ml en ratas vacuna, respectivamente. Además, la AFP demostraba una co con el volumen tumoral como con el peso de tumor extirpado.

Se midió la albúmina humana (hALB) por ELISA a os de tiempo durante el estudio. Los datos de este estudio y l ricos indican que la hALB solo es detectable en animales qu r. La comparación de los datos de hALB en los grupos con t rol y tratados indica que ia hALB era inferior en ratas tratadas re roles que llevan tumor al final del estudio (no se muestran lo miento y por animales que llevan o no llevan tumor. Los únicos valoración en los que se observaron diferencias eran: AST sterol. Para ambas comparaciones, no había diferencias sign e grupos en el punto de tiempo basal (no se muestran los datos), comparaban los índices químicos en animales que llevaban tu ales que no llevaban tumor, había una diferencia significativa os en el punto de tiempo terminal con elevaciones en AS sterol en los animales que llevaban tumor (no se muestran los dat Conclusión En su conjunto, los datos demuestran que la carga tu ucía en animales tratados con vacuna preparada contra la line oral HepG2 respecto a un grupo que llevaba tumores de co bía vehículo.

Materiales y Procedimientos Se usaron en el estudio ratones C57BI/6 hembra (n o) con un peso corporal de aproximadamente 18-20g. Se inmuniz cción intramuscular (IM) en el músculo tibial anterior izquierdo men total de 50 µ? los días de estudio 0, 14 y 21.

Dosis de Reactivo Una dosis de la composición comprendía, en binaciones, uno o más de los siguientes componentes: Tampón: NaH2P04.2H20 (229.32 mg/l), NaCI (1168.0 ?04 (1144.00 mg/l), disuelto en WFI y esterilizado por filtració de 0.1 µ??.

Ovoalbúmina (OVA-Antígeno): 10 µg CpG ODN: 10 µ Preparación de Vacuna Se colocó tampón en un matraz de 50 mi con una ación y se agitó a una velocidad constante durante todas la ientes. Los componentes se añadieron en el siguiente orden: /A); CPG ODN; Quil A; colesterol (gota a gota); DDA (gota bopol®; y Bay R1005®. La composición se agitó a temperatura racimadamente a 25°C) durante un mínimo de 30 minutos mi tegía de la luz cubriéndola con papel de aluminio. La solución s és de una aguja de 25G en una jeringa para romper cualquier nte de gran tamaño para obtener una suspensión uniforme (tur sfirió a viales de vidrio estériles para su almacenamiento.

Recogida de Muestras Se recogieron las siguientes muestras: Plasma: 4 semanas después de la vacunación de sensi Tetrámero (4 semanas después de la vacuna sibilización) Células T productoras de citoquinas (6 semanas despu nación de sensibilización) Los resultados se proporcionan como una puntuación cada adyuvante que muestra el efecto del adyuvante. Los cri ración eran una escala relativa basada" en la suma de las respu citos T citotóxicos individuales.

Resultados y Discusión Como se presenta en el cuadro 23, QCDCR m orcionaba respuestas de CTL más fuertes que sus subcompone argo las respuestas de conjunto eran bajas (<20%). La combin CR o sus subcomponentes con CPG mejoraba significativam uestas de CTL específicos de OVA. QCDCR/CPG más OVA en ncia para aumentar las respuestas inmunes celulares. La combin dos muestra sinergia. Cuando se analizaron subcomponentes de CpG, las combinaciones con Quil A dieron las mejores re uido de inclusión de colesterol con CpG.

CUADRO 23 Respuestas Relativas de CTL EJEMPLO 23 Coronavirus Canino (CCV) Ámbito Se empleó un modelo murino usando coronavirus canino S adyuvantes de combinación para evaluar el rendimiento de a l componente antigénico dado.

Animales A diez ratones CF-1 por grupo de tratamiento se les a i por vía subcutánea por animal de cada grupo de tratamiento.

Grupos de Tratamiento Las formulaciones de ensayo que se muestran en el c repararon como volúmenes de dosis de campo de 1.0 mi CUADRO 24 Formulaciones de Ensayo.

Preparación de Vacuna La preparación de vacuna para los adyuvantes de la i en los ejemplos 1-13 anteriores. Las concentraci 0000 pascales (10,000 psi). Después se añadió Carbopol con ustó el pH a 6.8 a 7.2. Se añadió después glicolípido Bay R10 a. Por último, la composición se llevó a un volumen final con el e ático de solución salina.

La vacuna para los grupos de tratamiento que reci uctos de AbISCO disponibles en el mercado (Isconova, Su araron de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta. Los prod CO están basados en saponinas del Quillay y la tecnología de do saponinas altamente purificadas.

Procedimiento de Ensayo: La neutralización sérica de C El suero se inactivo por calor a 56°C durante 30 a 40 min placa estéril limpia se realizaron diluciones seriadas de cada s , 2, 4, 8...) pasando 120 µ? a 120 µ? de diluyente. Se usaron al m ticiones de pocilios/dilución. Se usó inicialmente una dilución d 2 días antes. Se evaluó la CPE de 4 a 6 días después. La retro irmó que de 50 a 316 partículas de virus afectaban a cada monoc Resultados CUADRO 25 Neutralización Sérica Grupo de Títulos Neutralizantes en Tratamiento Suero Solución salina 2 Antigeno solo 64 AblSCO-100 256 AblSCO-200 23 AblSCO-300 1 1 Quil-A/Colesterol 315 R 512 RC 11 DRC 630 QCR 1024 QCDC 630 QCRC 724 QCDRC 1448 formulaciones adyuvantes de la invención producían título ores que los productos con adyuvante comerciales, aun cuan utaciones tenían una cantidad similar de antígeno de CCV aña ulaciones QCDC, QCR, DRC, QCRC y QCDRC eran espe aces en la inducción de una buena respuesta inmune en los raton EJEMPLO 24 Antigeno de Rotavirus Bovino Ámbito Se empleó un modelo murino usando Rotavirus uvantes de combinación de la invención para evaluar el rendi uvante con el componente antigénico dado.

Animales CUADRO 26 Formulaciones de Ensayo Preparación de Vacuna La preparación de vacuna etanol se añadió después durante la homogeneización. La me fluidificó a 68950000 paséales (10,000 psi). Después se opol® con mezcla y el pH se ajustó a 6.8 a 7.2. Se añadió d ípido Bay R1005® con mezcla. Por último, la composición se lle en final con el expansor plasmático de solución salina.

La vacuna para los grupos de tratamiento que recib uctos de AbISCO disponibles en el mercado (Isconova, Sue aró de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta. Los produ CO están basados en saponinas de Quillay y tecnología de do saponinas altamente purificadas.

Resultados CUADRO 27 Títulos de Neutralización en Suero Formulaciones de Títulos Neutralizantes en QC es la abreviatura para QuilA/colesterol, D para DDA opol®, R para Bay R1005® Los efectos combinados de los adyuvantes formula virus Bovino y teniendo en cuenta las propiedades químicas ponente han proporcionado propiedades excelentes para un adyu na (véase el cuadro 27).

Aunque varias de las formulaciones adyuvantes propor les similares de títulos de anticuerpos neutralizantes en S vante QCDCR proporcionaba el mayor nivel.

EJEMPLO 25 Virus Influenza Canino Ámbito/Diseño de Estudio Se empleó un modelo canino usando virus influenza cani sensibilidad a vacunas disponibles en el mercado. Los ani ían recibido vacunas contra CIV.

CUADRO 28 Diseño de Estudio QC es la abreviatura para QuilA/colesterol, D para DDA bopol® CUADRO 29 Composición de Vacuna 01 Adyuvante placebo, control negativo Preparación de Vacuna La preparación de vacuna para los adyuvantes de la i describe en los ejemplos 1-13 anteriores. Las concentracione ponentes adyuvantes se proporcionan en el cuadro 29. Se a uvantes en el orden enumerado en el cuadro.

Se añadió un expansor plasmático de solución sali ¡píente y se inició la homogeneización. Se añadió virus influenz tivado a una concentración que se muestra en el cuadro 29. S l A a la concentración enumerada en el cuadro 29. La sol sterol/etanol se añadió después con homogeneización cont ción de DDA/etanol se añadió después durante la homogeneiz zcla se microfluidificó a 68950000 pascales (10,000 psi). De dió Carbopol con mezcla y se ajustó el pH a 6.8 a 7.2. Por posición se llevó a un volumen final con el expansor plas ción salina.

CUADRO 30 Títulos de HAI Los efectos combinados de los adyuvantes formulados enza y teniendo en cuenta las propiedades químicas de cada co proporcionado excelentes propiedades para un adyuvante de vac Títulos de anticuerpo mayores se asocian generalm or protección de vacunas. Generalmente, tanto el adyuvante de 2) como los adyuvantes de la invención (T03, T04, y T05) cau ento en los títulos de HAI pero la respuesta causada por los ad la invención era superior con títulos mayores a día 180 en el gru

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1. - Una composición inmunogénica que comprend lación de adyuvante y una cantidad inmunológicamente eficaz ónente antigénico, en la que la formulación de adyuvante com aponina, un esterol, un compuesto de amonio cuaternario y un pol 2. - La composición inmunogénica de conformidad dicación 1 , caracterizada además porque la saponina está pres antidad de aproximadamente 1 µ9 a aproximadamente 5,000 , el esterol está presente en una cantidad de aproximadamente imadamente 5,000 µg por dosis, el compuesto de amonio cua resente en una cantidad de aproximadamente 1 µg a aproximad µg por dosis y el polímero está presente en una canti A.- La composición inmunogénica de conformidad dicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalm ulante de Th2. 5. - La composición inmunogénica de conformidad dicación 4 , caracterizada además porque el estimulante de Th lípido. 6. - La composición inmunogénica de conformidad dicación 5, caracterizada además porque el estimulante de to de A/-(2-desoxi-2-L-Ieucilamino^-D-glucopira ecildodecanamida. 7 - La composición inmunogénica de conformidad dicación 5t caracterizada además porque el glicolípido está pres cantidad de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 10 . 8.- La composición inmunogénica de conformidad posición de la etapa c; e) añadir el polímero a la composición de 10. - El procedimiento de conformidad con la reivindic cterizado además porque la saponina es Quil A o una fracción p misma, el esterol es colesterol, el compuesto de amonio cuate y el polímero es ácido poliacrílico. 1 1 . - El procedimiento de conformidad con la reivindic cterizado además porque comprende adicionalmente una e ogeneización de la composición de la etapa a y la continuaci ogeneización durante cada una de las etapas a a d. 12. - El procedimiento de conformidad con la reivindica cterizado además porque comprende adicionalmente una et prende microfluidificar la composición de la etapa d. 13. - El procedimiento de conformidad con la reivindic cterizado además porque comprende adicionalmente una eta ponente antigénico, en la que la formulación de adyuvante co saponina, un esterol, un compuesto de amonio cuaternario y un p 17. - La composición de vacuna de conformidad indicación 16, caracterizada además porque la saponina . está pre cantidad de aproximadamente 1 µ9 a aproximadamente 5,00 is, el esterol está presente en una cantidad de aproximadament ximadamente 5,000 µg por dosis, el compuesto de amonio cu presente en una cantidad de aproximadamente 1 µg a aproxima 0 µg por dosis y el polímero está presente en una can ximadamente el 0.0001 % v/v a aproximadamente el 75% v/v. 18. - La composición de vacuna de conformidad indicación 16, caracterizada además porque la saponina es Quil ción purificada de la misma, el esterol es colesterol, el comp nio cuaternario es DDA y el polímero es ácido poliacrílico. 19. - La composición de vacuna de conformidad tato de A/-(2-desoxi-2-L-leucilamino^-D-glucopira decildodecanamida. 22. - La composición de vacuna de conformidad ndicación 20, caracterizada además porque el glicolípido está pre cantidad de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 1 is. 23. - La composición de vacuna de conformidad ndicación 16, caracterizada además porque dicho componente a prende un virus inactivado. 24. - Un procedimiento de preparación de una compo una como la que se reclama en la reivindicación 16, que comp arar una composición del componente antigénico en un tampón; aponina a la composición de la etapa a; c) añadir el est posición de la etapa b; d) añadir el compuesto de amonio cuater posición de la etapa c; e) añadir el polímero a la composición de ogeneización de la composición de la etapa a y la continuaci ogeneización durante cada una de las etapas a a d. 27. - El procedimiento de conformidad con la reivindic cterizado además porque comprende adicionalmente una et prende microfluidificar la composición de la etapa d. 28. - El procedimiento de conformidad con la reivindic cterizado además porque comprende adicionalmente una eta ión a la composición de la etapa e, un estimulante de Th2. 29. - El procedimiento de conformidad con la reivindic cterizado además porque el estimulante de Th2 es un glicolípido. 30. - El procedimiento de conformidad con la reivindic cterizado además porque el estimulante de Th2 es acetato oxi-2-L-leucilamino- -D-glucopiranosil)-/V-octadecildodecanamida. 31. - La composición inmunogénica de conformidad indicación 1 , caracterizada además porque comprende adicional 34. - El procedimiento de conformidad con cualquiera ndicaciones 9 a 15 y cualquiera de las reivindicaciones 2 cterizado además porque el componente antigénico comprende leucemia felina. 35. - La composición de vacuna de cualquiera de conf la reivindicaciones 16 a 23, caracterizada además porque el com énico comprende el virus de la leucemia felina. 36. - La composición de vacuna de conformidad ndicación 35, caracterizada además porque el virus de la leuce . presente en una cantidad de aproximadamente 100 ximadamente 350,000 ng/ml, ambos inclusive. 37. - La composición inmunogénica de conformidad ndicación 1 , caracterizada además porque el componente a prende gp70 producida por una línea celular FL-74 persiste ctada con la cepa del virus de la leucemia felina KT-FeLV-UCD-1. romoléculas aisladas a partir de dicho protozoo por encionales y (3) extractos celulares completos o preparaciones zoo. 40. - La composición inmunogénica de conformid uiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 31 , caracterizada además p ponente antigénico comprende una bacterina de la cepa erichia col i. 41. - El procedimiento de conformidad con cualquiera ndicaciones 9 a 15 y cualquiera de las reivindicaciones 2 cterizado además porque el componente antigénico compre erina de la cepa J-5 de Escherichia coli. 42. - La composición de vacuna de conformidad con CU las reivindicaciones 16 a 22 y 32, caracterizada además p ponente antigénico comprende una bacterina de la cepa erichia coli. 45. - La composición inmunogénica de conformidad ndicación 44, caracterizada además porque el componente a prende BVDV tipo 1 (BVDV-1 ) y BVDV tipo 2 (BVDV-2). 46. - El procedimiento de conformidad con cualquiera ndicaciones 9 a 15 y cualquiera de las reivindicaciones 2 eterizado además porque el componente antigénico comprende B 47. - El procedimiento de conformidad con la reivindica eterizado además porque el componente antigénico comprende B V-2. 48. - La composición de vacuna de conformidad con C s reivindicaciones 16 a 23, caracterizada además porque el com énico comprende BVDV. 49. - La composición de vacuna de conformidad ndicación 48, caracterizada además porque el componente a prende BVDV-1 y BVDV-2. 52. - El procedimiento de conformidad con cualquiera ndicaciones 9 a 15 y cualquiera de las reivindicaciones 2 cterizado además porque el componente antigénico co opneumonia. 53. - La composición de vacuna de conformidad con c as reivindicaciones 16 a 22, caracterizada además porque el co énico comprende M.hyopneumonia. 54. - El uso de una composición de vacuna como la ama en la reivindicación 53, en la preparación de un medicame r a un suido frente a una infección causada por M.hyopneumonia. 55. - La composición inmunogénica de conformid lquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además p ponente antigénico comprende el virus de la influenza felina (FIV). 56. - El procedimiento de conformidad con cualquier indicaciones 9 a 15 y cualquiera de las reivindicaciones 2 59. - La composición inmunogénica de conformid quiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada además p ponente antigénico comprende un antígeno de cáncer. 60. - El procedimiento de conformidad con cualquiera ndicaciones 9 a 15 y cualquiera de las reivindicaciones 2 eterizado además porque el componente antigénico compre eno de cáncer. 61. - La composición de vacuna de conformidad con cu s reivindicaciones 16 a 22, caracterizada además porque el com énico comprende un antígeno de cáncer. 62. - El uso de una composición de vacuna como la ma en la reivindicación 61 , en la preparación de un medicame r a un sujeto frente a un cáncer. 63. - La composición inmunogénica de conformid quiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además 66. - El procedimiento de conformidad con la reivindic cterizado además porque el ORN/ODN es CpG. 67. - La composición de vacuna de conformidad con c las reivindicaciones 16 a 23, caracterizada además porque co ionalmente un ORN/ODN. 68. - La composición de vacuna de conformidad indicación 67, caracterizada además porque el ORN/ODN es CpG 69. - La composición inmunogénica de conformi lquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además p ponente antigénico comprende un coronavirus canino (CCV). 70. - El procedimiento de conformidad con cualquier indicaciones 9 a 15 y cualquiera de las reivindicaciones 2 cterizado además porque el componente antigénico comprende 71. - La composición de vacuna de conformidad con c as reivindicaciones 16 a 23, caracterizada además porque el co 74. - El procedimiento de conformidad con cualquiera ndicaciones 9 a 15 y cualquiera de las reivindicaciones 2 cterizado además porque el componente antigénico compr virus bovino. 75. - La composición de vacuna de conformidad con c as reivindicaciones 16 a 23, caracterizada además porque el co énico comprende un rotavirus bovino. 76. - El uso de una composición de vacuna como la ma en la reivindicación 75, en la preparación de un medicame r a un bovino frente a una infección causada por un rotavirus bovi 77. - La composición inmunogénica de conformid lquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además p ponente antigénico comprende un virus influenza canino (CIV). 78. - El procedimiento de conformidad con cualquier ndicaciones 9 a 15 y cualquiera de las reivindicaciones 2 81.- Un procedimiento de diferenciación de un animal i orma natural con BVDV de un animal vacunado con una compo na como la que se reclama en la reivindicación 48 ó 49, compr o procedimiento obtener una muestra de un animal de ensayo y les de proteína E2 y proteínas NS2/3 en dicha muestra, en encia de proteínas NS2/3 indica que el animal se vacunó c posición de vacuna.