KR20110010817A - 신규한 면역증강 조성물 - Google Patents

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라마사미 마나르 마난
마리 캐서린 올센
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Abstract

본 발명은 트리터페노이드, 스테롤, 면역조절제, 중합체 및 Th2 자극제의 다양한 조합을 포함하는 면역증강제 제제; 면역증강 조성물의 제조 방법; 및 상이한 항원을 갖는 면역원성 조성물과 백신 조성물에서의 면역증강제 제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 동물의 치료에 있어 제제의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 면역증강 조성물{NOVEL ADJUVANT COMPOSITIONS}
본 발명은 일반적으로 대상에게 유독하거나 바람직하지 않은 부작용을 일으키지 않고 면역원성 조성물 및 백신 조성물에 이용하기 위한 항원에 대한 면역 반응 개선용 면역증강제 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역증강제, 면역원 및 백신 조성물의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
박테리아, 바이러스 및 기생충 감염은 인간과 동물에게 널러 퍼져있다. 이런 감염원으로 인한 질병은 종종 항생제 치료에 저항하여, 효과적인 치료 수단이 없을 수 있다. 결과적으로, 감염성 질병을 구제하기 위해 백신적 접근법이 점점 더 많이 사용되고 있다. 전체 감염성 병원균이, 화학적 불활성화나 적절한 유전자 조작 후에, 백신 제제에 사용하기에 적합하게 제조될 수 있다. 다르게는, 백신 제제에서 사용하기 위해 병원균의 단백질 서브유닛을 재조합 발현 시스템에서 발현시켜 정제할 수 있다. 조성물에 적절한 면역증강제를 포함시킴으로써 백신이 보다 효과적이 되게 될 수 있다.
동물과 인간의 암을 치료하기 위해 백신 접근법을 이용하는 것이 점차 흥미를 끌고 있다. 암 치료에 대한 이러한 치료 접근법은 종양-특이적 항원 및 면역증강제를 포함하는 백신을 암 환자에게 접종함을 포함한다. 그러나, 개발되고 있는 이러한 성질의 많은 암 백신중 어느 것도 규제 당국에 의해 승인되고 있지 않다. 암 치료제의 효능을 측정하는 표준 방법인 종양 축소를 나타내는 백신은 없었다.
용어 "면역증강제(adjuvant)"란 일반적으로 항원에 대한 체액 또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 의미한다. 면역증강제는 2가지 목적을 달성하기 위해 이용된다: 이들은 주입 장소로부터의 항원 방출을 느리게 하고, 면역계를 자극한다. 전통적인 백신은 일반적으로 불활성화되거나 사멸되거나 개질된 생 병원성 미생물의 조질 제제로 구성된다. 병원성 미생물의 이들 배양액과 관련된 불순물이 면역 반응을 개선시키기 위한 면역증강제로서 작용할 수 있다. 그러나, 항원으로서 병원성 미생물 또는 정제된 단백질 서브유닛의 동종 제제를 이용하는 백신에 의해 야기되는 면역성은 종종 열악하다. 따라서 면역증강제와 같은 일부 외인성 물질의 첨가가 필요하다. 또한 합성 및 서브유닛 백신은 제조비가 비싸다. 면역증강제의 첨가에 의해 유사한 면역 반응을 자극하기 위해 더 적은 양의 항원을 이용할 수 있게 하여 백신의 생산 비용을 감소시킬 수 있다. 따라서, 일부 주사가능한 의약품의 효능은 면역증강제와 조합될 경우 상당히 증가될 수 있다.
면역증강제의 선택에서는 많은 인자가 고려되어야만 한다. 아쥬방트는 독성, 알레르기 유발성, 자극성 및 숙주에 대한 다른 바람직하지 않은 효과가 최소한이면서도 효과적인 방식으로 항원이 비교적 느린 속도로 방출 및 흡수되도록 해야만 한다. 바람직하게는, 면역증강제는, 비-살바이러스성이고, 생물학적으로 분해가능하고, 높은 수준의 면역성을 일정하게 생성할 수 있고, 교차 보호를 자극할 수 있고, 여러 항원에 대해 상용성이 있고, 여러 종에서 효과적이고, 비-독성이고, 숙주에게 안전(예를 들면 주사 부위 반응이 없음)해야만 한다. 면역증강제의 다른 바람직한 특성은 마이크로-투여될 수 있고, 투여량 절감될 수 있고, 우수한 저장 안정성을 갖고, 건조될 수 있고, 오일 없이 제조될 수 있고, 고체 또는 액체 중 하나로 존재할 수 있고, 등장성이고, 쉽게 제조될 수 있고, 생산비가 저렴하다는 것이다. 최종적으로 백신접종 시나리오의 필요사항에 따라, 체액 또는 세포 면역 반응중 하나 또는 둘 모두를 유도하도록 구성될 수 있는 면역증강제가 아주 바람직하다. 그러나, 상기 필요사항을 만족할 수 있는 면역증강제의 수는 제한되어 있다.
면역증강제의 선택은 항체 반응의 크기 또는 성능을 증가시킬지, 세포 매개 면역 반응을 증가시킬지, 점액 면역성을 유도할지, 아니면 항원 양을 감소시킬지와 같은 백신에 대한 필요사항에 의존한다. 다수의 면역증강제가 제안되어왔지만, 모든 백신에 이상적으로 적합한 것은 없었다. 문헌에 처음 보고된 면역증강제는 유중수 유화액 및 마이코박테리아 추출물을 함유하는 프롱드 완전 면역증강제(Freund's Complete Adjuvant: FCA)였다. 불운하게도 FCA는 거의 허용될 수 없고, 제어되지 않는 염증을 야기할 수 있다. 80년 전에 FCA가 발견된 이래 면역증강제의 원치않는 부작용을 감소시키기 위해 많이 노력하여왔다.
면역증강제로서 사용되어온 일부 다른 물질에는 금속 산화물(예를 들면 수산화알루미늄), 알룸, 염의 무기 킬레이트, 젤라틴, 다양한 파라핀-형 오일, 합성 수지, 알지네이트, 뮤코이드 및 폴리사카라이드 화합물, 카제네이트 및 혈액-유래 물질, 예를 들면 피브린 응고물이 포함된다. 이들 물질은 면역계를 자극하는데 있어 일반적으로 효과적이지만, 숙주에서의 부작용(예를 들면 무균성 농양 생성, 기관 손상, 발암성, 또는 알레르기 반응) 또는 바람직하지 않은 약학적 성질(예를 들면 신속한 확산 또는 주사 부위로부터의 확산 제어가 나쁨, 또는 물질의 팽윤)으로 인해 어떤 것도 완전히 만족스럽지는 않은 것으로 발견되었다.
합성 오일 및 석유 유도체가 신체에서 비교적 느린 분산을 나타내므로 면역증강제로서 이용되어왔지만, 이들은 종종 발암원성일 수 있는 방향족 탄화수소로 분해되므로 바람직하지 않을 수 있다. 또한, 이들 물질의 일부는 무균성 농양을 생성할 수 있는 것으로 발견되었고, 신체에 의해 완전히 제거되지 않을 수 있다. 적절하게 선택되고 적당한 농도로 배합될 경우 오일이 비교적 안전하고 무독성일 수 있다.
남미의 나무인 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria)의 껍질에서 수득된 사포닌이 일부 기간동안 면역증강제로서 사용되어왔다. [Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386. 1996)]을 참고할 수 있다. 오늘날 사용되는 수의용 백신의 대부분은 퀼(Quil) A를 함유하고 있고, 이는 남미의 나무인 퀼라자 사포나 리아 몰리나(Quillaja saponaria molina)의 껍질에서 나온 사포닌 분획이다. 퀼 A의 추가의 분획화는 QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-21(미국 특허 제5,057,540호 참조)을 비롯한 하부 분획을 생성하였다.
면역증강제로서 사포닌의 사용은 다수의 단점을 갖고 있다. 사포닌은 가용성이고 따라서 비-특이적 면역 반응을 촉진시킬 수 있다. 그러나, 백신의 목표는 특정 항원에 대한 표적화된 반응을 자극하는 것이다. 사포닌은 콜레스테롤에 대해 강한 친화성을 갖고 있다. 이들은 세포막에서 발견되는 콜레스테롤과 착체를 형성하여 세포의 용혈을 야기한다. 이들은 또한 주사 부위에서 괴사를 야기하고 특정한 구조로 배합되기 어려운 것으로 보인다. 개질된, 엔벨롭(envelope)을 갖고 있는, 살아있는 바이러스를 함유하는 백신에서 이용되는 경우, 사포닌은 바이러스 엔벨롭을 교란하여 바이러스 항원을 불활성화시킨다.
퀼 A의 용혈성 및 살바이러스성을 극복하기 위해, 이는 콜레스테롤 및 인지질과 조합되어왔다(이는 면역자극 착체(ISCOM) 또는 ISCOM 매트릭스(ISCOMATRIX)라고 공지된 특정한 구조를 형성한다). [Ozel M., et.al.; J. Ultrastruc. and Molec. Struc. Re 102, 240-248 (1989)]를 참고할 수 있다. ISCOM은 항원과 조합되었을 때 일반적으로 Th1 세포독성 T-세포 반응을 유도한다. 그러나, 퀼 A의 용혈성이 크게 감소되었지만, 퀼 A의 콜레스테롤과의 조합이 용혈성을 완전히 없애지는 않는다. ISCOM의 다른 제한점은 단백질 항원이 ISCOM으로 혼입되기 위해 ISCOM과 상호작용할만큼 큰 소수성 도메인을 가져야만 한다는 점이다. 매우 친수성인 단백질은 ISCOM으로 혼입될 수 없다. 최종적으로 ISCOM은 대상에서 바람직하지 않은 자가면역 반응을 자극할 수 있다.
면역조절제가 면역증강제로서 사용되어왔고, 그 예는 다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드(이후로 "DDA"라 언급된다) 및 아비르딘을 포함한다. DDA는 분자량이 631이며 양전하 4차 암모늄 분자에 결합된 2개의 메틸 기 및 2개의 탄소수 18의 알킬 쇄를 갖는 친유성 4차 암모늄 화합물(아민)이다. 이를 면역증강제로서 이용하는 것은 골(Gall)([Immunol. V. 11, p. 369, 1966])에 의해 발견되었다. DDA는 강한 세포 매개 면역 반응을 자극하고, 또한 체액 면역 반응을 유도하는 것으로 보인다고 보고되어왔다. 단백질 항원, 합텐(hapten), 종양, 바이러스, 원생동물 및 박테리아에 대한 면역증강제로서의 DDA의 효능을 나타내는 많은 논문들이 발표되어왔다(예를 들면 [Korsholm, K S., et al., Immunology, vol. 121, pp. 216-226, 2007] 참조). 대부분의 연구는 실험실 동물에서 수행되었고, 닭(예를 들면 [Katz, D., et al. FEMS Immunol Med Microbiol. Vol 7(4):303-313, 1993] 참조), 돼지 및 소와 같은 더 큰 동물에서 행해진 연구는 거의 없다. DDA는 실험실 동물과 큰 동물 둘 모두에서 지연형 과민감성(DTH) 반응을 유도하는데 효과적이다. 그러나, 이는 물에 거의 용해되지 않는다.
중합체 또한 면역증강제로서 이용되어왔으며, 이의 예는 다이에틸-아미노에틸(DEAE)-덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리아크릴산(예를 들면 카보폴(CARBOPOL(등록상표)))을 포함한다. 폴리사카라이드 DEAE-덱스트란은 매우 강한 면역증강제로서 당 분야에 공지되어 있다. 그러나, 이는 허용되지 않는 반응성(reactogenicity)과 관련되어 있다. 카보폴(등록상표) 중합체는 폴리알케닐 에터 또는 다이비닐 글리콜로 가교결합된 아크릴산의 중합체이다. 카보폴은 다수의 백신에 이용되어왔지만, 이의 면역증강제로서의 용도는 입증되지 않았다.
일부 면역증강제는 Th2 반응을 자극하는 것으로 보이고, 이의 예는 N-(2-데옥시-2-L-루실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸오일아미드 하이드로아세테이트(이는 또한 아세테이트 형태일 때 상표명 베이(Bay) R1005(등록상표)로 공지되어 있다) 및 알루미늄을 포함한다. 정제된 바이러스 백신 또는 서브유닛 백신과 조합된 베이 R1005(등록상표)는 항원-공격된 마우스에서 항체 생산의 증가를 야기한다. 다른 동물 종(돼지, 양, 말)에서의 임상전 시험에서는 항체 생산에 대해 필적할만한 결과가 나왔다. 베이 R1005(등록상표)에 의해 유도된 항체 합성의 증가는 특히 항원에 의존적이고, 다클론 자극의 결과가 아니다.
본 발명 이전에, 이상적인 면역증강제가 가져야만하는 넓은 범위의 바람직한 특징을 갖는 면역증강제 제제가 없었다. 종래의 면역증강제의 단점을 극복한 새로운 백신용 면역증강제를 발견하고자 시도되어왔다. 특히, 인간 및 동물에서 광범위한 항원에 대해 강력한 세포-매개 및 체액 면역 반응을 야기하지만, 종래의 면역증강제의 부작용 및 제제화 어려움이 없는 면역증강제 제제가 매우 바람직하다.
본 발명은 신규한 면역증강제, 면역원성 및 백신 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Th1 자극제, 면역조절제, 중합체 및 Th2 자극제를 포함하는 면역증강제 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이런 아쥬방트 제제 및 하나 이상의 항원을 포함하는 면역원 및 백신 조성물, 및 또한 면역증강제 및 백신 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 아쥬방트 조성물은 사포닌, 스테롤 및 4차 암모늄 화합물의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 면역증강제 조합은 퀼 A, 콜레스테롤 및 DDA를 포함한다.
다른 실시양태에서, 아쥬방트 조성물은 사포닌, 스테롤, 4차 암모늄 화합물및 중합체의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 면역증강제 조합은 퀼 A, 콜레스테롤, DDA 및 폴리아크릴산이다.
다른 실시양태에서, 아쥬방트 조성물은 사포닌, 스테롤, 4차 암모늄 화합물,중합체 및 당지질의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 면역증강제 조합은 퀼 A, 콜레스테롤, DDA, 폴리아크릴산 및 베이 R1005(등록상표)이다.
한 실시양태에서, 면역증강제 제제 및 면역 효과량의 항원을 포함하며, 면역증강제 제제가 사포닌, 스테롤, 4차 암모늄 화합물 및 중합체를 포함하는 면역원성 조성물은 a) 완충액중의 항원의 조성물을 제조하는 단계, b) 단계 a)의 조성물에 사포닌을 첨가하는 단계, c) 단계 b)의 조성물에 스테롤을 첨가하는 단계, d) 단계 c)의 조성물에 4차 암모늄 화합물을 첨가하는 단계, e) 단계 d)의 조성물에 중합체를 첨가하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
이 방법의 한 실시양태에서, 사포닌은 퀼 A이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, 4차 암모늄 화합물은 DDA이고, 중합체는 폴리아크릴산이다.
한 실시양태에서, 면역증강제 제제 및 면역 효과량의 항원을 포함하며, 면역증강제 제제가 사포닌, 스테롤, 4차 암모늄 화합물, 중합체 및 당지질을 포함하는 백신 조성물은 a) 완충액중의 항원의 조성물을 제조하는 단계, b) 단계 a)의 조성물에 사포닌을 첨가하는 단계, c) 단계 b)의 조성물에 스테롤을 첨가하는 단계, d) 단계 c)의 조성물에 4차 암모늄 화합물을 첨가하는 단계, e) 단계 d)의 조성물에 중합체를 첨가하는 단계, f) 단계 e)의 조성물에 당지질을 첨가하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
이 방법의 한 실시양태에서, 사포닌은 퀼 A이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, 4차 암모늄 화합물은 DDA이고, 중합체는 폴리아크릴산이고, 당지질은 베이 R1005(등록상표)이다.
본원에 보고된 면역증강 조성물은 이런 조합으로부터 예상되는 것을 뛰어넘는 놀랍고도 예상치못한 성질을 갖는 것으로 발견되었다. 놀랍게도, 퀼 A/콜레스테롤의 살바이러스 성질이 이들 면역증강 조성물에서 없어진 것으로 발견되었다. 이들은 동결건조된 개질된 생 바이러스 항원용 희석제로서 적합하다. 본원에 개시된 면역증강 조성물은 세포-매개된 면역 반응 또는 체액 면역 반응중 하나 또는 둘 모두에 대해 매우 강한 면역 반응을 이끌어내도록 구성될 수 있다. 또한, 이들 면역증강제 제제를 이용함으로써 주사 부위 반응이 크게 회피될 수 있다. 반응성은 조합 면역증강제를 구성하는 개별적인 여러 구성성분보다 더 낮다. 또한 이들 면역증강제 제제는 장기간 저장 가능성을 제공한다.
본 출원인은 이들 신규한 면역증강 조성물이 넓은 범위의 종에 걸쳐 다수의 서로 다른 항원중 하나 이상과 조합되면 매우 높은 면역원성을 가짐을 발견하였다. 이들은 하나 이상의 바이러스, 박테리아, 기생충, 재조합 단백질 및 합성 펩타이드 항원 및 이의 조합과 함께 이용될 수 있다. 신규한 백신 면역증강 조성물을 암을 치료하기 위한 치료 백신에서 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 면역증강제, 면역원 및 백신 조성물을 제공한다. 또한 조성물의 제조 방법이 제공된다. 또한 질병의 치료에서의 이의 용도가 제공된다. 또한 질병, 특히 하기 개시된 질병에 대해 대상을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 이의 용도가 제공된다. 또한 대상에서 질병을 예방하거나 감소시키기 위한 약제의 제조에서의 이의 용도가 제공된다.
또한 고양이 백혈병 바이러스에 의해 야기된 감염에 대해 고양이를 치료하기 위한, 조류 콕시디아증으로부터 조류를 치료하기 위한, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)에 의해 야기된 질병으로부터 소를 치료하기 위한, 소 바이러스 설사 바이러스에 의해 야기된 질병으로부터 소를 치료하기 위한, 마이코플라스 마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumonia)에 의해 야기된 질병으로부터 돼지를 치료하기 위한, 고양이 인플루엔자 바이러스에 의해 야기된 질병으로부터 고양이를 치료하기 위한, 개 코로나바이러스에 의해 야기된 질병으로부터 개를 치료하기 위한, 소 로타바이러스에 의해 야기된 질병으로부터 소를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 이의 용도가 제공된다. 또한, 백신 접종된 동물을 확인하는데 도움을 주기 위해 마커 백신으로써의 면역증강제의 용도가 제공된다. 또한 면역증강제의 효과를 개선시키기 위한 CpG의 용도가 제공된다.
도 1은 BVD 바이러스의 E2 단백질과 NS2/3 단백질 사이의 항체 프로파일 차이를 나타내는 방사면역침전 분석이 수행된 겔을 나타낸다. PreZent A 처리된 군은 E2 단백질 및 NS2/3 단백질 둘 모두에 대한 항체 반응을 나타내지만, QCDC 및 QCDCR 처리된 군은 E2 단백질에 대해서만 항체 반응을 나타내고, NS2/3 단백질에 대해서는 항체 반응을 나타내지 않는다.
정의
측정가능한 수치 변수와 관련되어 사용될 경우 용어 "약"은 지시된 값의 실험 오차 이내(예를 들면 평균에 대한 95% 신뢰도 구간 이내) 또는 지시된 값의 10% 이내(둘 중 더 큰 쪽을 택한다)인 변수의 모든 값 및 변수의 지시된 값을 의미하고, 단 약이 주를 나타내는 시간 간격을 언급할 때 사용되는 경우 "약 3주"는 17일 내지 25일이고, 약 2 내지 4주는 10일 내지 40일이다.
"면역증강제"는 항원에 대한 체액 또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 의미한다. 면역증강제는 일반적으로 2가지 목적을 달성하기 위해 사용된다: 주사 부위로부터 항체의 방출을 느리게하는 것 및 면역계를 자극하는 것.
"알킬"은 직쇄 및 분지쇄 포화 탄화수소 잔기 둘 모두를 의미한다.
"아민"은 질소를 함유하는 화합물을 의미한다. 아민은 수소를 탄화수소 기로 치환함으로써 암모니아에서 유래된 화합물 군이다. "4차 아민"은 4개의 탄화수소 기를 갖는 화합물에 근거한 암모늄을 의미한다.
"항체"는 그 항원에 대한 면역 반응의 결과로서 특정 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 의미한다. 면역글로불린은 "불변" 및 "가변" 영역을 갖는 "경쇄" 및 "중쇄" 폴리펩타이드로 구성되고, 불변 영역의 조성에 근거하여 여러 부류(예를 들면 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)로 나누어지는 혈청 단백질이다.
"항원" 또는 "면역원"은 면역 반응을 자극하는 임의의 물질을 의미한다. 이 용어는 사멸된, 불활성화된, 약독화된 또는 개질된 생 박테리아, 바이러스 또는 기생충을 포함한다. 용어 항원은 또한 개별적인 또는 조합된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 재조합 단백질, 합성 단백질, 단백질 추출물, 세포(종양 세포 포함), 조직, 폴리사카라이드 또는 지질 또는 이의 분획을 포함한다. 용어 항원은 또한 항체, 예를 들면 항-유전형(idiotype) 항체 또는 이의 분획 및 항원 또는 항원 결정자(에피토프)를 흉내낼 수 있는 합성 펩타이드 미모토프(mimotope)를 포함한다.
"박테린"은 백신 또는 면역원성 조성물의 구성성분으로 이용될 수 있는 하나 이상의 사멸된 박테리아의 현탁액을 의미한다.
"완충액"은 다른 화학 물질의 농도 변화를 방지하는 화학적 시스템을 의미하고, 예를 들면 수소 이온 농도(pH)의 현저한 변화를 방지하는 완충제로서 작용하는 양성자 공여자 및 수용자이다. 완충액의 추가의 예는 약산 및 이의 염(공액 염기) 또는 약염기 및 이의 염(공액 산)의 혼합물을 함유하는 용액이다.
"세포 면역 반응" 또는 "세포 매개된 면역 반응"은 T-림프구 또는 다른 백혈구 또는 이들 둘 모두에 의해 매개되는 반응으로 사이토카인, 케모카인 및 활성화된 T-세포, 백혈구 또는 이들 둘 모두에 의해 생산되는 유사한 분자를 포함한다.
"콜레스테롤"은 C27H45OH의 화학 구조를 갖는 백색 결정성 물질을 의미한다. 이는 환상 탄화수소 알콜이고, 지질로서 분류된다. 이는 물에 불용성이지만, 다수의 유기 용매에서는 가용성이다.
"지연 유형 과민성(DTH)"은 면역계가 외래로서 인지하는 항원에 노출된지 24 내지 72시간 후에 전개되는 염증 반응을 의미한다. 이 유형의 면역 반응은 주로 항체(이는 B 세포에 의해 제조된다)보다는 T 세포를 포함한다.
"투여량"은 대상에게 주어진 백신 또는 면역 조성물을 의미한다. "제1 투여량" 또는 "프라이밍 백신"은 제0일에 주어진 이런 조성물의 투여를 의미한다. "제2 투여" 또는 "제3 투여" 또는 "연간 투여"는 제1 투여에 후속적으로 주어진 이런 조성물의 양을 의미하고, 이는 제1 투여와 동일한 백신 또는 면역원성 조성물일 수도 있고 아닐 수도 있다.
"유화제"는 유화액이 보다 안정적이 되게 하는 물질을 의미한다.
"유화액"은 하나의 액체의 작은 소적이 다른 액체의 연속 상에 현탁되어 있는 2개의 혼합되지 않는 액체의 조성을 의미한다.
"에스터"는 유기 산 분자가 알콜 분자와 합체되고, 물 분자가 제거되는 축합 반응으로부터 형성되는 무기 염에 상응하는 임의의 부류의 유기 화합물을 의미한다.
"부형제"는 항체가 아닌 백신의 임의의 구성성분을 의미한다.
"균질화"는 유사하거나 상이한 하나 이상의 구성성분을 균일한 혼합물로 혼합하는 과정을 의미한다.
"체액 면역 반응"은 항체에 의해 매개되는 면역 반응을 의미한다.
"소수성"은 물에 불용성이고, 수분을 쉽게 흡수하지 않거나, 또는 물에 의해 부정적인 영향을 받지 않으며, 물과 비상용성이거나 물에 대한 친화성이 거의 없음을 의미한다.
대상에서의 "면역 반응"은 항원에 대한 체액 면역 반응, 세포 면역 반응, 또는 체액 및 세포 면역 반응의 전개를 의미한다. 면역 반응은 일반적으로 당 분야에 공지되어 있는 표준 면역분석법 및 중화 분석법을 이용하여 측정된다.
항체의 "면역학적 보호양" 또는 "면역학적 효과량" 또는 "면역 반응을 생성하기에 효과적인 양"은 수용자에서 면역 반응을 야기하는데 효과적인 양이다. 면역 반응은 진단 목적 또는 다른 시험에 충분할 수 있거나, 질병 원인으로의 감염에 의해 야기되는 건강 이상 효과 또는 이의 합병증을 비롯한 질병의 징후 또는 증후를 방지하기에 적절할 수 있다. 체액 면역성 또는 세포-매개된 면역성중 하나 또는 둘 모두가 유도될 수 있다. 면역 조성물에 대한 동물의 면역 반응은 예를 들면 항체 역가의 측정, 림프구 증식 분석을 통해 간접적으로, 또는 야생형 균주를 이용한 공격후의 징후 및 증후를 모니터링함으로써 직접적으로 평가될 수 있지만, 백신에 의해 부여되는 보호 면역성은 예를 들면 사망율, 질병율, 온도 수, 전반적인 신체 상태 및 대상의 전반적인 건강 및 기능과 같은 임상 징후의 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 면역 반응은 세포 및/또는 체액 면역성의 유도를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
"면역원"은 면역 또는 항원 반응을 야기함을 의미한다. 따라서, 면역원성 조성물은 면역 반응을 야기하는 임의의 조성물이다.
"면역자극 복합체" 또는 ISCOM은 퀼 A가 콜레스테롤 및 인지질과 조합되었을 때 형성되는 특정한 구조를 의미한다.
"면역자극 분자"는 면역 반응을 생성하는 분자를 의미한다.
"지질"은 물에 불용성이지만, 비극성 유기 용매에서는 용해되고, 만지면 미끈거리고, 탄수화물 및 단백질과 함께 살아있는 세포의 주요 구성 물질을 구성하는, 지방, 오일, 왁스, 스테롤 및 트라이글리세라이드를 비롯한 유기 화합물의 임의의 군을 의미한다.
"친유성"은 지질에 대한 현저한 인력 또는 지질 중에서의 용해성을 나타냄을 의미한다.
"리포솜"은 약물, 항원, 백신, 효소 또는 다른 물질을 체내의 표적 세포로 운반하기 위해 의학적으로 이용되는, 수성 격실을 둘러싼 지질 이층에 의해 형성된 미세 구형 입자를 의미한다.
"의약"은 질병의 예방, 치료 또는 개선, 또는 일부 생리학적 상황 또는 발생의 예방에 유용한 임의의 약물을 의미한다.
"비경구 투여"는 백신과 같은 물질을 소화관을 포함하지 않는 경로를 통해 대상의 신체로 도입함을 의미한다. 비경구 투여는 피하, 근육내, 경피, 피내, 복강내, 안구내 및 정맥내 투여를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한"은 건전한 의학적 판단 범위 이내이고, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 합리적인 이익 대 위험 비가 적당하고 의도된 용도에 효과적인, 대상의 조직과 접촉하는데 사용하기에 적합한 물질을 의미한다.
"반응성(reactogenicity)"은 면역증강제, 면역원 또는 백신 조성물의 투여에 대한 반응으로 대상에서 야기되는 부작용을 의미한다. 이는 투여 부위에서 생길 수 있고, 일반적으로 다수의 증후의 전개의 측면에서 평가된다. 이들 증후는 염증 발적 및 농양을 포함할 수 있다. 이는 또한 발생, 기간 및 심각성의 측면에서 평가된다. "낮은" 반응은 예를 들면 눈으로는 보이지 않고 촉진으로만 검출될 수 있는 팽윤을 포함하거나, 또는 단기간의 반응이다. 보다 심각한 반응은 예를 들면 눈에 보이거나 좀더 긴 기간동안 생기는 반응이다.
"실온"은 18 내지 25℃의 온도를 의미한다.
"사포닌"은 스테로이드 또는 트리테페노이드 구조중 하나의 소수성 영역과 조합된 친수성 영역(일반적으로 여러 당 쇄)으로 구성된 식물 기원의 표면-활성 글리코사이드의 군이다.
"스테로이드"는 지질이라는 생화학적 부류에 속하고, 유기 용매에서 쉽게 용해되고 물에 약하게 용해되는 유기 화합물의 군의 임의의 것이다. 스테로이드는 3개의 축합된 사이클헥산(6 탄소) 고리 + 4번째 사이클로펜탄(5 탄소) 고리의 4-축합 고리 시스템을 포함한다.
"스테롤"은 터페노이드 전구체로부터 생물학적으로 생산된 동물에서의 화합물을 의미한다. 이들은 일반적으로 3번 탄소에 부착된 하이드록실(OH) 기를 갖는 스테로이드 고리 구조를 포함한다. 지방산 치환체의 탄화수소 쇄는 일반적으로 16 내지 20개 탄소 원자로서 길이가 다양하고, 포화되거나 불포화될 수 있다. 스테롤은 공통적으로 고리 구조에 하나 이상의 이중 결합을 함유하고, 또한 다양한 치환체가 고리에 결합되어 있다. 스테롤 및 이들의 지방산 에스터는 본질적으로 수 불용성이다.
"대상"이란 면역증강 조성물의 투여가 바람직한 임의의 동물을 의미한다. 이는 영장류, 가축, 반려 동물, 실험실 시험 동물, 포획된 야생 동물, 조류(알 포함), 파충류 및 어류를 비롯한 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다. 따라서, 이 용어는 원숭이, 인간, 돼지; 소, 양, 염소, 말, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 닭, 칠면조, 오리, 다른 가금류, 개구리 및 도마뱀을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
"TCID50"은 "조직 배양 감염 투여량"을 의미하고, 접종된 세포 배양액의 주어진 배치의 50%를 감염시키는데 요구되는 바이러스의 희석으로서 정의된다. TCID50을 계산하는데 있어서 본원 전반에 걸쳐 이용되는 스피어만-카버(Spearman-Karber) 방법을 비롯한 다양한 방법이 이용될 수 있다. 스피어만-카버 방법에 대해서는 [B.W. Mahy & H.O. Kangro, Virology Methods Manual, p. 25-46 (1996)]을 참조할 수 있다.
"치료 효과량"은 바이러스 또는 박테리아와 같은 병원균의 감염으로 인해 야기되는 건강 이상 효과 또는 이의 합병증을 비롯한 질병의 징후 또는 증후를 예방하거나 감소시키는데 적절한 항체 또는 백신을 수용하는 대상에서의 면역 반응을 유도하는 항체 또는 백신의 양을 의미한다. 체액 면역성 또는 세포-매개된 면역성 또는 체액 면역성과 세포-매개된 면역성 둘 모두가 유도될 수 있다. 백신에 대한 동물의 면역원 반응은 예를 들면 항체 역가, 림프구 증식 분석의 측정으로 통해 간접적으로, 또는 야생형 균주를 이용한 공격후의 징후 또는 증후를 모니터링함으로써 직접적으로 평가될 수 있다. 백신에 의해 부여되는 보호 면역성은 예를 들면 치사율, 유병율, 온도 수, 전반적인 신체 조건 및 대상의 전반적인 건강 및 기능에서의 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 치료 효과적인 백신의 양은 사용되는 특정한 면역증강제, 사용되는 특정한 항원 또는 대상의 상태에 따라 다양할 수 있고, 당 분야의 숙련자들에 의해 결정될 수 있다.
"치료"란 이런 용어가 적용되는 장애, 질환 또는 질병의 예방, 또는 이런 장애, 질환 또는 질병의 하나 이상의 증후의 예방 또는 감소를 의미한다.
"치료"란 상기 정의된 바와 같은 "치료" 행위를 의미한다.
"트리터페노이드"란 수천가지의 방식으로 개질되고 조합될 수 있는 6원 탄소인 아이소프렌 (2-메틸-1,3-부타다이엔) 유니트로부터 유래된, 자연 발생하는 유기 분자의 크고 다양한 부류를 의미한다. 대부분은 작용기 및 기본적인 탄소 골격이 서로 상이한 단환 구조이다. 이들 분자는 모든 부류의 살아있는 것에서 발견될 수 있다.
"백신"은 본원에서 정의된 바와 같은 항원을 포함하는 조성물을 의미한다. 이 백신을 대상에게 투여하면 일반적으로 하나 이상의 특정 질병에 대한 면역 반응이 생성된다. 치료 효과적인 백신의 양은 사용되는 특정한 항원, 또는 대상의 상태에 따라 다양할 수 있고, 당 분야의 숙련자들에 의해 결정될 수 있다.
조성물의 구성성분
트리터페노이드 및 CpG
면역증강 조성물에서 사용하기 위한 트리터페노이드는 퀼라자 사포나리아, 토마틴, 인삼 추출물, 버섯 및 스테로이드 사포닌과 구조적으로 유사한 알칼로이드 글리코사이드를 포함하지만 이로 한정되지 않는 식물 유래되거나 합성 등가물중 하나인 많은 공급원에서 얻어질 수 있다. 따라서, 면역증강 조성물에서 사용하기에 적합한 트리터페노이드는 사포닌, 스쿠알렌 및 라노스테롤을 포함한다. 면역증강 조성물에서 사용하기에 적합한 트리터페노이드의 양은 사용된 트리터페노이드의 성질에 달려있다. 그러나, 이들은 일반적으로 투여당 약 1㎍ 내지 약 5,000㎍의 양으로 이용된다. 이들은 또한 투여당 약 1㎍ 내지 약 4,000㎍, 투여당 약 1㎍ 내지 약 3,000㎍, 투여당 약 1㎍ 내지 약 2,000㎍, 투여당 약 1㎍ 내지 약 1,000㎍의 양으로 이용된다. 이들은 또한 투여당 약 5㎍ 내지 약 750㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 200㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 100㎍, 투여당 약 15㎍ 내지 약 100㎍, 투여당 약 30㎍ 내지 약 75㎍의 양으로 사용된다.
사포닌이 사용되는 경우, 면역증강 조성물은 일반적으로 퀼라자 사포나리 아의 나무 껍질에서 나온 면역 활성 사포닌 추출물을 함유한다. 사포닌은 예를 들면 퀼 A 또는 상업적으로 수득될 수 있는 다른 정제된 또는 부분적으로 정제된 사포닌 제제일 수 있다. 따라서, 사포닌 추출물은 혼합물 또는 QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-21과 같은 정제된 개별적인 성분으로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 퀼 A는 약 85% 이상의 순도를 갖는다. 다른 실시양태에서, 퀼 A는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 순도를 갖는다.
CpG ODN은 특정한 염기-서열 내용 중의 메틸화되지 않은 CG 다이뉴클레오타이드(CpG 모티프)의 존재를 특징으로하는 최근에 개시된 약학치료제 부류이다(본원에 참고로 혼입되어 있는 [Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232] 참조). 이들 CpG 모티프는 진핵세포 DNA에서는 보이지 않지만(진핵세포에서는 CG 다이뉴클레오타이드가 억제되고, 존재하는 경우, 일반적으로 메틸화된다), 이들이 면역자극 성질을 부여하는 박테리아 DNA에는 존재한다. 이들 면역자극 성질은 IFN-A, IL-12, 및 IL-18가 명확하게 방출되는 Th1-유형 반응의 유도를 포함한다. CpG ODN(18 내지 24bp 길이)은 박테리아 DNA와 유사한 면역조절 성질을 갖는다. 세포 표면 단백질은 다양한 결과로서 이들 분자를 포획할 수 있다. 그러나, QCDC, QCDCR 및 본원에 언급된 다른 조합과 같은 담체를 이용하여, CpG의 면역조절 성질 및 흡수가 상당히 개선된다.
면역증강 조성물 중에서 사용하기 위한 CpG의 양은 사용된 CpG의 성질 및 의도된 종에 달려있다. 그러나, 이들은 일반적으로 투여당 약 1㎍ 내지 약 20mg의 양으로 이용된다. 이들은 또한 투여당 약 1㎍ 내지 약 10mg, 투여당 약 1㎍ 내지 약 5mg, 투여당 약 1㎍ 내지 약 4mg, 투여당 약 1㎍ 내지 약 3mg, 투여당 약 1㎍ 내지 약 2mg, 투여당 약 1㎍ 내지 약 1mg의 양으로 이용된다. 이들은 또한 투여당 약 5㎍ 내지 약 750㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 200㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 100㎍, 투여당 약 10㎍ 내지 약 100㎍, 투여당 약 15㎍ 내지 약 100㎍, 및 투여당 약 30㎍ 내지 약 75㎍의 양으로 사용된다.
스테롤
면역증강 조성물에서 사용하기에 적합한 스테롤은 β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 에르고칼시페롤 및 콜레스테롤을 포함한다. 이들 스테롤은 당 분야에 잘 공지되어 있고, 상업적으로 구매될 수 있다. 예를 들면 콜레스테롤은 [Merck Index, 12th Ed., p. 369]에 개시되어 있다. 면역증강 조성물에서 사용하기에 적합한 스테롤의 양은 사용되는 스테롤의 성질에 달려있다. 그러나, 이들은 일반적으로 투여당 약 1㎍ 내지 약 5,000㎍의 양으로 이용된다. 이들은 또한 투여당 약 1㎍ 내지 약 4,000㎍, 투여당 약 1㎍ 내지 약 3,000㎍, 투여당 약 1㎍ 내지 약 2,000㎍, 투여당 약 1㎍ 내지 약 1,000㎍의 양으로 이용된다. 이들은 또한 투여당 약 5㎍ 내지 약 750㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 200㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 100㎍, 투여당 약 15㎍ 내지 약 100㎍, 투여당 약 30㎍ 내지 약 75㎍의 양으로 사용된다.
면역조절제
면역증강 조성물은 예를 들면 4차 암모늄 화합물(예를 들면 DDA), 및 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토카인과 같은 하나 이상의 면역조절제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 물질은 상업적으로 구매될 수 있다. 면역증강 조성물에서 사용하기에 적합한 면역조절제의 양은 사용되는 면역조절제의 성질 및 대상에 달려있다. 그러나, 이들은 일반적으로 투여당 약 1㎍ 내지 약 5,000㎍의 양으로 이용된다. 이들은 또한 투여당 약 1㎍ 내지 약 4,000㎍, 투여당 약 1㎍ 내지 약 3,000㎍, 투여당 약 1㎍ 내지 약 2,000㎍, 투여당 약 1㎍ 내지 약 1,000㎍의 양으로 이용된다. 이들은 또한 투여당 약 5㎍ 내지 약 750㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 200㎍, 투여당 약 5㎍ 내지 약 100㎍, 투여당 약 15㎍ 내지 약 100㎍, 투여당 약 30㎍ 내지 약 75㎍의 양으로 사용된다. 구체적인 예로서, DDA를 함유하는 면역증강 조성물은 항원 용액을 막 제조된 DDA 용액과 단순히 혼합함으로써 제조될 수 있다.
중합체
면역증강 조성물은 예를 들면 DEAE 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산(예를 들면 카보폴(등록상표))과 같은 하나 이상의 중합체를 추가로 포함할 수 있다. 이런 물질은 상업적으로 구매될 수 있다. 면역증강 조성물에서 사용하기에 적합한 중합체의 양은 사용되는 중합체의 성질에 달려있다. 그러나, 이들은 일반적으로 약 0.0001%(v/v) 내지 약 75% v/v의 양으로 이용된다. 다른 실시양태에서, 이들은 약 0.001% v/v 내지 약 50% v/v, 약 0.005% v/v 내지 약 25% v/v, 약 0.01% v/v 내지 약 10% v/v, 약 0.05% v/v 내지 약 2% v/v, 약 0.1% v/v 내지 약 0.75% v/v의 양으로 이용된다. 또다른 실시양태에서, 이들은 약 0.02% v/v 내지 약 0.4% v/v의 양으로 이용된다. DEAE-덱스트란은 50,000 Da 내지 5,000,000 Da의 범위의 분자량을 가질 수 있거나, 또는 이는 500,000 Da 내지 2,000,000 Da의 범위의 분자량을 가질 수 있다. 이런 물질은 상업적으로 구매되거나, 덱스트란으로부터 제조될 수 있다.
다른 특정한 예는 76의 평균 당량 중량을 갖는 폴리아크릴산(예를 들면 카보폴(등록상표) 중합체)이다. 이들은 평균 직경이 약 0.2 내지 6.0 마이크론인 1차 중합체 입자로부터 생산된다. 카보폴(등록상표) 중합체는 카복실레이트 기의 pKa 보다 큰 pH 환경에서 노출되면, 물에서 원래 체적의 1000배 및 원래 직경의 10배까지 팽균되어 겔을 형성한다. 카복실레이트 기의 pKa 보다 큰 pH에서, 카복실레이트 기는 이온화되어, 결과적으로 음전하끼리 반발하고, 이것이 중합체의 팽윤에 더해진다.
Th2 자극제
면역증강 조성물은 하나 이상의 Th2 자극제, 예를 들면 베이 R1005(등록상표) 및 알루미늄을 추가로 포함할 수 있다. 면역증강 조성물에 사용하기에 적합한 Th2 자극제의 양은 사용된 Th2 자극제의 성질에 달려있다. 그러나, 이들은 일반적으로 투여당 약 0.01mg 내지 약 10mg의 양으로 이용된다. 다른 실시양태에서, 이들은 투여당 약 0.05mg 내지 약 7.5mg, 투여당 약 0.1mg 내지 약 5mg, 투여당 약 0.5mg 내지 약 2.5mg, 투여당 약 1mg 내지 약 2mg의 양으로 이용된다. 특정한 예는 베이 R1005(등록상표)로서, 이는 화학명 "N-(2-데옥시-2-L-루실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아마이드 아세테이트"를 갖는 당지질이다. 이는 [Lockhoff, 0. (Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 30:1611-1620; 1991]에서 발견되는 방법에 따라 합성될 수 있다. 기밀 용기에서 2 내지 8℃에서 저장할 것이 권고된다. 이의 화학적 또는 물리적 성질은 약한 흡습성이고, 다형체를 형성하지 않고, 50℃ 이하의 온도의 공기 및 광에 화학적으로 안정하고, 주위 온도에서 pH 2 내지 12의 수성 용매에서 화학적으로 안정하다. 이는 수성 용액에서 마이셀을 형성하는 양친매성 분자이다.
항원 및 질병
면역증강 조성물은 하나 이상의 항원을 함유할 수 있다. 항원은 대상에서 바람직한 면역 반응을 생산할 수 있는 매우 다양한 물질중 임의의 것일 수 있다. 비록 퀼 A가 단독으로는 살바이러스성이지만, 콜레스테롤이 첨가되어 나선형 마이셀을 형성하면 독이 제거된다(미국 특허 제7,122,191호 참조). 본원에 개시된 면역증강 조성물은 비-살바이러스성 및 비-용혈성 또는 막파괴성인 것으로 발견되어왔다. 따라서, 이들 면역증강 조성물과 사용되는 항체는 개별적인 또는 조합된 (불활성화, 약독화 및 개질된 생) 바이러스, 박테리아, 기생충, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 재조합 단백질, 합성 펩타이드, 단백질 추출물, 세포(종양 세포 포함), 조직, 폴리사카라이드, 탄화수소, 지방산, 테이콘산(teichioc acid), 펩티도글리칸, 지질 또는 당지질중 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 면역증강제와 함께 이용되는 항원은 또한 본원에서 언급된 유기체로부터 단리될 수 있는 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드의 면역원 분획을 포함한다.
대상에서 질병을 야기하지 않는 생, 개질된-생 및 약독화된 바이러스 균주는 비-유독성 형태로 단리되어왔거나, 적합한 세포주에서의 계대 배양 또는 자외선 또는 화학적 돌연변이원에의 노출을 비롯한 당 분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 약독화되어왔다. 불활성화되거나 사멸된 바이러스 균주는 포르말린, 베타프로프리오락톤(BPL), 2원 에틸렌이민(BEI), 멸균 조사, 가열 또는 다른 이런 방법을 비롯한 당 분야의 숙련자들에게 공지된 방법에 의해 불활성화되어왔다.
2개 이상의 항원을 조합하여 병원균에 의해 야기되는 매우 다양한 질병으로부터 대상을 보호할 수 있는 다가 조성물이 생산될 수 있다. 현재, 백신의 상업적인 제조자 및 또한 최종 사용자는 다가 백신 제품을 선호한다. 종래의 면역증강제의 경우 이들이 효과적으로 사용될 수 있는 항원의 종류(1가 또는 다가중 하나)가 종종 제한되었지만, 본원에 개시된 면역증강제는 1가 및 다가 둘 모두의 넓은 범위의 항원과 함께 효과적으로 이용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 항원은 본원에 개시된 면역증강제를 포함하는 단일 조성물에 조합될 수 있다.
면역증강 조성물과 함께 항원으로서 이용될 수 있는 박테리아의 일부 예는 아세이네토박터 칼코아세티쿠스(Aceinetobacter calcoaceticus), 아세토박터 파세루이아누스(Acetobacter paseruianus), 악티노바실러스 플레우로뉴모니아에( Actinobacillus pleuropneumoniae ), 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 알리사이클로바실러스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 아르하에글로부스 풀기두스(Arhaeglobus fulgidus), 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로테모필루스(Bacillus stearothermophillus), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 테모카테눌라투스(Bacillus thermocatenulatus), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 부르콜데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 부르콜데리아 글루마에(Burkholderia glumae), 캄필로박터 콜리(Campylobacter coli), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로 박터 하이오인테스티날리스(Campylobacter hyointestinalis), 클라미디아 프시타키(Chlamydia psittaci), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미디아 종(Chlamydophila spp .), 크로모박테리움 비스코숨(Chromobacterium viscosum), 에리시펠로트릭스 루시오파티에아에(Erysipelothrix rhusiopathieae), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 에흘리치아 카니스(Ehrlichia canis), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 하에모필루스 인플루 엔자에(Haemophilus influenzae), 하에모필루스 솜누스( Haemophilus somnus ), 헬리코박터 수이스(Helicobacter suis), 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 모라셀사 종(Moraxellsa sp .), 마이코박테라움 보비스(Mycobactrium bovis), 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae), 마이코플라즈마 마이코이데스 아종 마이코이데스 LC(Mycoplasma mycoides subsp . mycoides LC), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 오도리박터 덴티카니스(Odoribacter denticanis), 파스퇴렐라 ( 만헤이미아 ) 하에몰리티카( Pasteurella ( Mannheimia ) haemolytica ), 파스퇴렐라 물토시다( Pasteurella multocida ), 포토하브두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens), 포르피로모나스 굴라에(Porphyromonas gulae), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 포르피로모나스 살리보사( Porphyromonas salivosa), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 슈도모나스 위스콘시넨시스(Pseudomnas wisconsinensis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레센스 C9(Pseudomonas fluorescens C9), 슈도모나스 플루오레슨스 SIKW1(Pseudomonas fluorescens SIKW1), 슈도모나스 프라기( Pseudomonas fragi), 슈도모나스 루테올라(Pseudomonas luteola), 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 종 B11-1(Pseudomonas sp B11-1), 알칼리게스 유트로푸스(Alcaliges eutrophus ), 사이크로박터 임모빌리스(Psychrobacter immobilis), 리케치아 프로와제키(Rickettsia prowazekii), 리케 치아 리케치아(Rickettsia rickettsia), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 봉고리(Salmonella bongori), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 살모넬라 더블린(Salmonella dublin), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라세우이스(Salmonella choleraseuis), 살모넬라 뉴포트(Salmonella newport), 세라티아 마르케센스(Serratia marcescens), 스피르리나 플라텐시스(Spirlina platensis), 스태필로 코커스 오레우스(Staphlyoccocus aureus), 스태필로코커스 에피더미디스(Staphyloccoccus epidermidis), 스태필로코커스 히이쿠스(Staphylococcus hyicus), 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 시나모네우스(Streptomyces cinnamoneus), 스트렙토마이세스 수이스(Streptococcus suis), 스트렙토마이세스 엑스폴리아테스(Streptomyces exfoliates), 스트렙토마이 세스 스카비에스(Streptomyces scabies), 설폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius), 시에코키스티스 종(Syechocystis sp .), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 트레포네마 미누툼(Treponema minutum), 트레포네마 파게데니스(Treponema phagedenis), 트레포네마 레프린겐스(Treponema refringens), 트레포네마 빈센티(Treponema vincentii), 트레포네마 팔라디움(Treponema palladium) 및 렙토스피라 종(Leptospira 종), 예를 들면 공지된 병원성 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그리포티포 사(Leptospira grippotyposa), 렙토스피라 하르드조(Leptospira hardjo), 렙토스피라 보르그페테 르세니 하이드조 - 보비스(Leptospira borgpetersenii hardjo - bovis), 렙토스피라 보르그페테르세니 하이드조 -프라지트노(Leptospira borgpetersenii hardjo -prajitno), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 렙토스피라 익테로하에모하기아에(Leptospira icterohaemorrhagiae), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona) 및 렙토스피라 브라티슬라바(Leptospira bratislava) 및 이의 조합을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
불활성화된 바이러스와 약독화된 생 바이러스 둘 모두 면역증강 조성물에 이용될 수 있다. 항원으로 사용될 수 있는 바이러스의 일부 예는 조류 허피스바이러스, 소의 허피스바이러스, 개의 허피스바이러스, 말의 허피스마이러스, 고양이의 바이러스성 전염성 기관지염 바이러스, 마렉(Marek)병 바이러스, 양의 허피스바이러스, 돼지의 허피스바이러스, 위광견병 바이러스, 조류의 파라믹소바이러스, 소의 호흡기 세포융합 바이러스, 개의 디스템퍼 바이러스, 개의 파라인풀루엔자 바이러스, 개의 아데노바이러스, 개의 파르보바이러스, 소의 파라인플루엔자 바이러스 3, 양의 파라인플루엔자 3, 우역 바이러스, 보더 병 바이러스, 소의 바이러스성 설사 바이러스(BVDV), BVDV I형, BVDV II형, 전형적인 돼지 열 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 소의 면역결핍 바이러스, 소의 백혈병 바이러스, 소의 결핵, 말의 감염성 빈혈 바이러스, 고양이의 면역결핍 바이러스, 고양이의 백혈병 바이러스(FeLV), 뉴캐슬병 바이러스, 양의 진행성 폐렴 바이러스, 양의 폐 선암 바이러스, 개의 코로나바이러스(CCV), 범열대성 CCV, 개의 호흡기 코로나바이러스, 소의 코로나바이러스, 코양이의 칼리시바이러스, 고양이의 장 코로나바이러스, 고양이의 감염성 복막염 바이러스, 돼지의 유행성 설사 바이러스, 돼지의 혈구응집성 뇌척수염 바이러스, 돼지의 파르보바이러스, 돼지의 시르코바이러스(PCV) I형, PCV II형, 돼지의 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 칠면조 코로나바이러스, 소의 소유행열 바이러스, 광견병, 로토바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 렌티바이러스, 조류 인플루엔자, 리노바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 개 인플루엔자 바이러스, 고양이 인플루엔자 바이러스, 인간 인플루엔자 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스(EEE), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, B형 간염 바이러스, 리노바이러스 및 홍역 바이러스 및 이의 조합을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
펩타이드 항원의 예는 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) p68, GnRH, IgE 펩타이드, Fel d1 및 종양 항원, 및 이의 조합을 포함한다. 다른 항원의 예는 뉴클레오타이드, 탄화수소, 지질, 당지질, 펩타이드, 지방산, 테이콘산 및 펩티도글리칸 및 이의 조합을 포함한다.
면역증강 조성물과 함께 항원으로 사용될 수 있는 기생충의 일부 예는 아나플라스마, 파스키올라 헤파티카(간 디스토마), 콕시디아, 에이메리아 종, 네오스포라 카니눔, 톡소플라스마 곤디, 지아디아, 심장사상충, 십이지장충, 트리파노소마 종, 레쉬마니아 종, 트리코모나스 종, 크립토스포리디움 파르붐, 바베시아, 스키스토소마, 타에니아, 스토론길로이데스, 아스카리스, 트리키넬라, 사르코시스티스, 하몬디아 및 이소프소라, 및 이의 조합을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 또한 익소데스, 리피세팔루스, 데르마켄토르, 암블리오마, 부필루스, 하이알로마 및 하에마피살리스 종 및 이의 조합을 비롯한 진드기를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
면역 반응을 유도하기 위해 이용되는 항원의 양은 사용되는 항원, 대상, 바람직한 반응 수준에 따라 상당히 다양할 것이고, 당 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 개질된 생 바이러스 또는 약독화된 바이러스를 함유하는 백신의 경우, 항원의 치료 효과량은 일반적으로 약 102 조직 배양 감염 투여량(TCID)50 내지 약 1010 TCID50의 범위이다. 많은 이런 바이러스의 경우, 치료 효과 투여량은 일반적으로 약 102 TCID50 내지 약 108 TCID50의 범위이다. 일부 실시양태에서, 치료 효과 투여량은 일반적으로 약 103 TCID50 내지 약 106 TCID50의 범위이다. 일부 다른 실시양태에서, 치료 효과 투여량은 일반적으로 약 104 TCID50 내지 약 105 TCID50의 범위이다.
불활성화된 바이러스를 함유하는 백신의 경우, 항원의 치료 효과량은 일반적으로 투여량당 약 100 상대 유닛 이상이고, 종종 투여량당 약 1,000 내지 약 4,500 상대 유닛의 범위이다. 다른 실시양태에서, 항원의 치료 효과량은 일반적으로 투여량당 약 250 내지 약 4,000 상대 유닛, 투여량당 약 500 내지 약 3,000 상대 유닛, 투여량당 약 750 내지 약 2,000 상대 유닛, 투여량당 약 1,000 내지 약 1,500 상대 유닛의 범위이다.
불활성화된 바이러스를 함유하는 백신 중의 항원의 치료 효과량은 또한 mL 당 상대 효능(RP)의 측면에서 측정될 수 있다. 치료 효과량은 종종 mL 당 약 0.1 내지 약 50RP의 범위이다. 다른 실시양태에서, 항원의 치료 효과량은 mL 당 약 0.5 내지 약 30RP, mL 당 약 1 내지 약 25RP, mL 당 약 2 내지 약 20RP, mL 당 약 3 내지 약 15RP, mL 당 약 5 내지 약 10RP의 범위이다.
한 실시양태에서, FeLV 항원은 KT-FeLV-UCD-1 고양이 백혈병 바이러스 균주로 지속적 감염된 FL74-UCD-1 세포주 (ATCC 번호 CRL-8012)로부터 생산된다. 백신중의 FeLV 항원의 양은 mL당 gp70 바이러스 단백질의 양으로 측정될 수 있다. mL당 gp70 바이러스 단백질의 양으로 측정하였을 때, 치료 효과량의 FeLV 항원은 약 100 내지 약 350,000ng/ml의 범위이다. 다른 실시양태에서, 범위는 약 1,000 내지 약 300,000ng/ml, 또는 약 2,500 내지 약 250,000ng/ml, 또는 약 4,000 내지 약 220,000ng/ml, 또는 약 5,000 내지 약 150,000ng/ml, 또는 약 10,000 내지 약 100,000ng/ml이다.
백신에 투여되는 박테리아 항원을 위한 세포의 수는 투여당 약 1X106 내지 약 5X105 콜로니 형성 단위(CFU)의 범위이다. 다른 실시양태에서는, 세포의 수가 약 1X107 내지 약 5X1010 CFU/투여, 또는 약 1X108 내지 약 5X1010 CFU/투여의 범위이다. 또다른 실시양태에서는, 세포의 수가 약 1X102 내지 약 5X1010 CFU/투여, 또는 약 1X104 내지 약 5X109 CFU/투여, 또는 약 1X105 내지 약 5X109 CFU/투여, 또는 약 1X106 내지 약 5X109 CFU/투여, 또는 약 1X106 내지 약 5X108 CFU/투여, 또는 약 1X107 내지 약 5X109 CFU/투여의 범위이다.
백신에 투여되는 기생충 항원에 대한 세포의 수는 투여당 약 1X102 내지 약 1X1010의 범위이다. 다른 실시양태에서, 세포의 수는 투여당 약 1X103 내지 약 1X109, 또는 투여당 약 1X104 내지 약 1X108, 투여당 약 1X105 내지 약 1X107, 또는 약 1X106 내지 약 1X108의 범위이다.
종래의 면역증강제를 이용하면 필적할만한 수준의 혈청 반응을 자극하기 위해 개질된 생 또는 약독화된 바이러스에 비해 상당히 더 많은 양의 불활성화된 바이러스가 필요하다. 그러나, 놀랍게도, 본원에 개시된 면역증강 조성물을 이용하면 대락 동일한 양의 불활성화된 바이러스 및 개질된 생 바이러스가 유사한 수준의 혈청 반응을 자극할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 동일한 수준의 혈청 반응을 달성하기 위해 종래의 면역증강제와 비교하였을 때, 본원에 개시된 면역증강제를 이용하면 더 적은 양의 개질된 생, 약독화된 및 불활성화된 바이러스가 요구된다. 이들 예상치못한 발견은 면역원 및 백신 조성물의 제조동안 공급원의 보존 및 비용 감소를 입증한다. 넓은 용도를 갖는 백신의 경우, 매년 수백만회의 투여량이 제조될 것이 요구되므로, 이러한 절감은 상당할 수 있다.
부형제
수성 면역증강제는 일부 이점을 제공한다. 이들은 일반적으로 배합 및 투여하기 용이하고, 거의 없거나 적은 심각한 주사 부위 반응을 야기할 수 있다. 그러나, 주사 부위로부터 확산되는 경향이 있는 항원을 갖는 수성 면역증강제는 대상의 간에 의해 제거되고, 바람직하지 않은 비-특이적 면역 반응을 생성한다. 놀랍게도, 본원에 개시된 수성 면역증강제 조성물은 생물대사(이는 오랜 기간동안 일어난다)될 때까지 주사 부위에 남아있어서 표적화된 면역 반응을 제공하는 것으로 발견되었다.
면역증강제의 구성성분으로 첨가될 경우, 오일은 일반적으로 길고 느린 방출 프로파일을 제공한다. 본 발명에서, 오일은 물질대사될 수 있거나 물질대사될 수 없을 수 있다. 오일은 수중유, 유중수 또는 수중유중수 유화액의 형태일 수 있다.
본 발명에서 이용하기에 적합한 오일은 알칸, 알켄, 알킨 및 이의 상응하는 산 및 알콜, 에터 및 에스터 및 이의 혼합물을 포함한다. 오일의 개별적인 화합물은 가벼운 탄화수소 화합물이고, 즉, 이런 성분은 6 내지 30개의 탄소 원자를 갖는다. 오일은 합성 제조되거나 석유 제품으로부터 정제된다. 잔기는 직쇄 또는 분지쇄 구조를 가질 수 있다. 이는 완전히 포화되거나, 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 가질 수 있다. 본 발명에서 이용하기 위한 일부 비-물질대사가능한 오일에는 예를 들면 광유, 파라핀 오일 및 사이클로파라핀이 포함된다.
용어 오일은 또한 "가벼운 광유", 즉 광유의 증류에 의해 유사하게 수득되지만, 백색 광유에 비해 약간 더 낮은 비중을 갖는 오일을 포함하고자 한다.
물질대사가능한 오일은 물질대사가능한 비독성 오일을 포함한다. 오일은 면역증강제가 투여되는 대상의 신체에 의해 물질대사될 수 있고 대상에게 비독성인 임의의 식물성 오일, 어유, 동물성 오일 또는 합성 제조된 오일일 수 있다. 식물성 오일의 공급원은 견과류, 종자 및 곡류를 포함한다.
본 발명에 의해 제공되는 수중유 유화액은 암피겐(AMPHIGEN: 등록상표) 제제로 구성된다. 이 제제는 수성 성분, 레시틴, 광유 및 계면활성제를 포함한다. 제제의 구성성분을 개시하고 있는 특허로는 미국 특허 제5,084,269호 및 제6,572,861호가 포함된다.
전형적으로, 본 발명의 오일 구성성분은 1체적% 내지 50체적%의 양, 또는 10체적% 내지 45체적%의 양, 또는 20체적% 내지 40체적%의 양으로 존재한다.
조성물의 다른 구성성분은 약학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들면 담체, 용매 및 희석제, 등장화제, 완충제, 안정화제, 방부제, 혈관수축제, 항균제, 항진균제 등을 포함할 수 있다. 전형적인 담체, 용매 및 희석제는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤, 오일 등을 포함한다. 대표적인 등장화제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 락토스 등을 포함한다. 유용한 안정화제는 젤라틴, 알부민 등을 포함한다.
계면활성제를 이용하여 면역증강제 및 항원을 위한 담체로서 작용하도록 선택된 유화액의 안정화를 돕는다. 본 발명에서 이용하기에 적합한 계면활성제는 천연 생물학적 상용성 계면활성제 및 비-천연 합성 계면활성제를 포함한다. 생물학적 상용성 계면활성제는 인지질 화합물 또는 인지질의 혼합물을 포함한다. 바람직한 인지질은 포스파티딜콜린(레시틴), 예를 들면 대두 또는 달걀 레시틴이다. 레시틴은 조질의 식물성 오일을 수-세척하고, 생성된 수화된 검을 분리 및 건조시킴으로써 포스파타이드와 트라이글리세라이드의 혼합물로서 수득된다. 정제된 제품은 아세톤 세척에 의해 트라이글리세라이드 및 식물성 오일을 제거한 후 남아있는 아세톤 불용성 인지질 및 당지질의 혼합물을 분획화함으로써 수득될 수 있다. 다르게는, 레시틴은 다양한 상업적인 공급원으로부터 수득될 수 있다. 다른 적합한 인지질은 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 카디오리핀 및 포스파티딜에탄올아민을 포함한다. 인지질은 천연 공급원으로부터 단리되거나 통상적으로 합성될 수 있다.
본 발명에서 이용하기에 적합한 비-천연 합성 계면활성제는 소르비탄계 비-이온성 계면활성제, 예를 들면 지방산 치환된 소르비탄 계면활성제(상표명 스팬(SPAN: 등록상표) 또는 아르라셀(ARLACEL: 등록상표)), 폴리에톡실화된 소르비톨의 지방산 에스터(트윈(TWEEN: 등록상표)), 피마자유와 같은 공급원에서 나온 지방산의 폴리에틸렌 글리콜 에스터(에물포(EMULFOR: 등록상표)); 폴리에톡실화된 지방산(예를 들면 상표명 시물솔(SIMULSOL) M-53(등록상표)로 이용가능한 스테아르산), 폴리에톡실화된 아이소옥틸페놀/포름알데하이드 중합체(타이록사폴(TYLOXAPOL: 등록상표)), 폴리옥시에틸렌 패티 알콜 에터(브리즈(BRIJ: 등록상표)); 폴리옥시에틸렌 논페닐 에터(트리톤(TRITON: 등록상표) N), 폴리옥시에틸렌 아이소옥틸페닐 에터(트리톤(등록상표) X)를 포함한다.
일반적으로, 계면활성제, 또는 2개 이상의 계면활성제가 이용되는 경우 계면활성제의 조합은 0.01체적% 내지 10체적%, 바람직하게는 0.1체적% 내지 6.0체적%, 보다 바람직하게는 0.2체적% 내지 5.0체적%의 양으로 유화액에 존재한다.
본원에서 이용되는 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 면역증강제, 안정화제, 희석제, 방부제, 항균제, 항진균제, 등장화제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 담체는 조성물의 다른 구성성분과 상용성이어야하고 대상에게 해롭지 않다는 측면에서 "허용가능"해야만 한다. 전형적으로, 담체는 멸균되거나, 무-발열원이고, 사용되는 투여 방식에 근거하여 선택될 것이다. 당 분야의 숙련자들은 조성물을 구성하는 약학적으로 허용가능한 담체에 바람직한 제제가 미국의 농무부 또는 미국 식품의약품국 또는 미국이 아닌 국가의 등가의 정부 기관에 의해 공표되는 적용가능한 규제에서 승인된 약학적 담체임을 잘 알고 있다. 따라서, 조성물의 상업적 생산을 위한 약학적으로 허용가능한 담체는 이미 승인된 것이거나, 미국 또는 외국에서의 적절한 기관에 의해 승인될 담체이다.
조성물은 선택적으로 약학 비히클, 부형제 또는 매질로서 작용하는 상용성 약학적으로 허용가능한(즉, 멸균 또는 비-독성) 액체, 반고체 또는 고체 희석제를 포함할 수 있다. 희석제는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 다른 것들 중에서도 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정화제는 다른 것들 중에서도 알부민을 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한 예를 들면 젠타마이신, 메티올레이트 또는 클로로크레졸을 비롯한 항생제 또는 방부제를 함유할 수 있다. 선택될 수 있는 다양한 종류의 항생제 또는 방부제가 당분야의 숙련자들에게 잘 공지되어 있다.
조성물의 제조
면역증강 제제의 제조
사포닌, 스테롤 및 인지질을 조합함으로써 ISCOM을 제조할 수 있다. 예를 들면, ISCOM은 5 내지 10중량%의 퀼 A, 1 내지 5%의 콜레스테롤 및 인지질을 함유하고 나머지는 단백질일 수 있다. 면역증강 제제에서 사포닌 대 스테롤의 비는 전형적으로 1:100 w/w 내지 5:1 w/w 정도일 것이다. 일부 실시양태에서는, 사포닌 대 스테롤의 비가 1:2 w/w 이상, 또는 1:5 w/w 이상인 과량의 스테롤이 존재한다. 다른 실시양태에서는, 사포닌이 스테롤에 비해 과량이고, 약 5:1 w/w의 사포닌 대 스테롤의 비가 이용된다. ISCOM 및 ISCOMATRIX가 이스코노바(Isconova) AB(스웨덴)에서 상업적으로 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 카보폴(CARBOPOL: 등록상표)이 DDA의 중량부당 0.1중량부 이상의 카보폴(등록상표)의 양으로 DDA와 조합되어 이용된다. 다른 실시양태에서, DDA의 중량당 0.5중량부 이상의 카보폴(등록상표)이 이용된다. 또다른 실시양태에서, DDA의 중량부당 1중량부 이상의 카보폴(등록상표)이 이용된다. 카보폴(등록상표)와 DDA의 조합은 복합체를 형성하고, 이에 의해 DDA 3차 아민 작용기는 중합체 상의 카복실산 측쇄 기를 면역작용화시킨다. 이는 특정한 면역 세포가 항원과 면역증강제를 동시에 목표로하게 하고, 항원과 면역증강제를 최적의 시간 및 농도에서 상기 세포로 동시에 전달하도록 한다.
본원에 개시된 면역증강제는 일반적으로 임의의 특이적 담체를 요구하지 않고, 수성 또는 다른 약학적으로 허용가능한 완충액에서 배합될 것이다. 일부 사례에서, 개시된 실시양태의 백신은 적합한 비히클, 예를 들면 추가의 리포솜, 미세구 또는 캡슐화된 항원 입자 내에 존재할 것이다. 항체는 소낭 막 이내에 함유될 수 있거나, 소낭 막 외부에 함유될 수 있다. 일반적으로, 가용성 항원이 외부에 존재하고, 소수성 또는 지질화된 항원은 막의 내부 또는 외부에 함유된다.
면역증강 조성물은 투여 경로, 저장 요구성 등에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들면 이들은 주사가능한 용도에 적합한 멸균된 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결건조, 진공건조, 또는 분무건조 기법을 이용하여 동결건조된 형태로 제조될 수 있다. 동결건조된 조성물은 멸균 용액, 예를 들면 염수 또는 HEPES에서 사용하기 전에 재구성될 수 있다. 따라서, 면역증강 조성물은 고형, 반고형 또는 액체 투여 형태로서 이용될 수 있다.
면역증강제는 당 분야에 공지된 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면 사포닌과 콜레스테롤은 적합한 세제에서 혼합된 후, 용매 추출 기법에 의해 리포솜 또는 ISCOM을 형성할 수 있다. 사포닌과 콜레스테롤은 또한 조합되어 미국 특허 제7,122,191호에 개시된 바와 같은 나선 마이셀을 형성할 수 있다.
포스페이트 완충된 염수(PBS)는 수성 완충 매질로서 이용될 수 있고; 완충제의 pH는 중성 또는 약알칼리성 또는 약산성일 수 있다. 따라서, pH는 pH 6 내지 8의 범위일 수 있다. 약 7.0 내지 약 7.3의 pH가 흔하다. 완충제의 강도는 10 내지 50mM PO4 및 10 내지 150mM PO4일 수 있다. 한 예에서, 0.063%의 PBS가 이용된다. pH는 NaOH 또는 HCl을 이용하여 필요에 따라 조절될 수 있다. 전형적인 농도는 1N 내지 10N HCl 및 1N 내지 10N NaOH를 포함한다.
사용된 면역증강제의 양은 사용되는 항원 및 적용되는 항원 투여량에 달려있다. 이는 또한 의도되는 종 및 바람직한 제제에 의존한다. 일반적으로 양은 면역증강제에 대해 통상적으로 이용되는 범위 이내이다. 예를 들면 면역증강제는 전형적으로 1mL의 투여당 약 1㎍ 내지 약 1000㎍을 포함한다. 유사하게, 항생제는 전형적으로 1mL의 투여당 약 1㎍ 내지 약 60㎍을 포함한다.
면역증강 제제는 균질화되거나 미세유체화될 수 있다. 제제는 전형적으로 하나 이상의 균질화기를 통해 1회 이상 통과시킴으로서 1차 블렌딩 과정에 가해진다. 로스(Ross) 유화기(뉴욕주 마우파우즈(Hauppauge)), 가울린(Gaulin) 균질화기(매사추세츠주 에버레트(Everett)) 또는 마이크로플루딕스(Microfluidics)(매사추세츠주 뉴튼(Newton))과 같은 임의의 상업적으로 이용가능한 균질화기를 이 목적으로 이용할 수 있다. 한 실시양태에서, 배합물은 10,000rpm에서 3분동안 균질화된다. 미세유화는 상업적인 미세유화기, 예를 들면 마이크로플루이딕스(매사추세츠주 뉴톤)의 모델 번호 11OY; 가울린 모델 30CD(가울린 인코포레이티드, 매사추세츠주 에버레트) 및 라이니 미니랩(Rainnie Minilab) 유형 8.30H(위스콘신주 허드슨 소재의 미로 아토마이저 푸드 앤드 다이어리 인코포레이티드(Miro Atomizer Food and Dairy, Inc.))를 이용하여 미세유체화를 달성할 수 있다. 이들 미세유체화기는 2개의 유체 스트림이 상호작용 챔버에서 고속으로 상호작용하여 마이크론 이하 크기의 소적을 갖는 조성물을 형성하도록 하여, 액체가 고압 하에서 작은 구멍을 통해 빠져나가게 함으로써 작동된다. 한 실시양태에서, 제제는 10,000 ± 500 psi에서 200 마이크론 제한 치수 챔버를 통해 통과됨으로써 미세유체화된다.
본원에 개시된 면역증강 조성물은 균질화되고 미세유체화될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원이 적절한 완충액에 첨가된다. 용액이 교반되고, 사포닌이 항원 용액에 서서히 첨가된다. 그런 다음, 스테롤을 항원/사포닌 용액에 서서히 첨가한 후, 4차 암모늄 화합물을 항원/사포닌/스테롤 용액에 서서히 첨가한다. 생성된 조성물을 균질화시킨 후 미세유체화시킨다. 미세유체화 후, 중합체를 미세유체화된 조성물에 첨가한다. 사용되는 구성성분에 따라, 조성물의 제조가 최적화되도록 이들 단계의 순서가 변화될 수 있다.
면역원 및 백신 조성물의 제조
본원에 개시된 면역증강 조성물을 면역원 및 백신 조성물의 제조에서 이용할 수 있다. 백신 또는 면역원성 조성물의 경우, 각각의 투여량은 치료효과량의 항원을 함유하고, 이는 대상의 연령 및 일반적인 상태, 투여 경로, 항원의 성질 및 다른 인자에 따라 다양할 수 있다. 백신 또는 면역원성 조성물 중의 다른 구성성분의 양 및 농도는 조성물의 물리적 및 화학적 성질을 변화시키도록 조절될 수 있고, 당 분야의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 면역증강 조성물의 유리한 특징은 이들이 조성물의 바람직한 특징에 따라 전적으로 구성가능하다는 점이다. 예를 들면 더 큰 Th1 반응이 바람직하면, Th1 자극제의 양이 증가될 수 있다. 유사하게, 더 큰 Th2 반응이 바람직하면, Th2 자극제의 양이 증가될 수 있다. 균형잡힌 Th1/Th2 반응이 또한 달성될 수 있다. 면역원 및 백신 조성물은 또한 상기 개시된 바와 같이 균질화 또는 미세유체화될 수 있다.
조성물의 투여 및 용도
조성물의 투여
조성물의 투여 크기는 전형적으로 약 1mL 내지 약 5mL의 범위이고, 대상 및 항원에 달려있다. 예를 들면 개 또는 고양이의 경우, 약 1mL의 투여가 전형적으로 이용되고, 소에서는 약 2 내지 5mL의 투여가 전형적으로 이용된다. 그러나, 이들 면역증강제는 또한 미세투여량으로 배합될 수 있고, 여기서는 약 100㎕의 투여량이 사용될 수 있다.
면역증강 조성물을 위한 투여 경로는 비경구, 경구, 구개 비강, 기관지내, 국소 및 난내(in ova)를 포함한다. 주사기, 점적기, 바늘이 없는 주사 디바이스, 패치 등을 비롯한 임의의 적합한 디바이스를 이용하여 조성물을 투여할 수 있다. 사용하기 위해 선택되는 경로 및 디바이스는 면역증강제의 조성, 항원 및 대상에 달려있고, 이런 것들은 당분야의 숙련자에게 잘 공지되어 있다.
조성물의 용도
상업적인 용도를 위한 임의의 백신 면역증강 제제에 대한 요구사항중 하나는 장기간 보관을 위한 면역증강 용액의 안정성을 확보하는 것이다. 제조하기 쉽고, 18달 이상동안 안정한 면역증강 제제가 본원에서 제공된다. 한 실시양태에서는 제제가 약 18달동안 안정하다. 다른 실시양태에서는, 제제가 약 18달 내지 약 24달동안 안정하다. 다른 실시양태에서는 제제가 약 24달동안 안정하다. 가속화된 시험 방법은 또한 본원에 개시된 제제가 안정함을 나타낸다.
본 발명의 면역증강 조성물의 유리한 특징은 이들이 넓은 범위의 대상에게 안전하고 효과적으로 투여될 수 있다는 점이다. 당 업계에서는, 면역증강제의 조합이 개별적인 성분에 비해 더 많은 반응성을 나타낼 것으로 예상된다. 그러나, 성분중 임의의 1 또는 2개가 이용된 조성물과 비교하였을 때, 본원에 개시된 조성물은 면역증강 효과를 유지하면서도 감소된 반응성을 보여주었다. 또한, 놀랍게도 다른 면역증강 조성물과 비교하였을 때 본원에 개시된 면역증강 조성물이 안전성 개선을 나타내는 것으로 발견되었다.
본원에 개시된 면역증강 조성물은 대상에서 바람직한 면역 반응을 생성하는데 유용하다. 이들은 여러 종에서 유효하다. 적합한 대상은 면역증강 조성물의 투여가 바람직한 임의의 동물이다. 이는 영장류, 가축, 반려 동물, 실험실 시험 동물, 포획된 야생 동물, 조류(알 포함), 파충류 및 어류를 비롯한 포유동물 및 비-포유동물을 포함한다. 따라서, 이 용어는 원숭이, 인간, 돼지; 소, 양, 염소, 말, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 닭, 칠면조, 오리, 다른 가금류, 개구리 및 도마뱀을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
본원에 개시된 면역증강제를 이용하여 감염된 동물과 백신접종된 동물 사이의 혈청학적 차이를 보여줄 수 있다. 따라서, 이들은 백신중의 항원이 백신접종된 동물에서 야생형 바이러스와는 다른 항체 패턴을 야기하는 마커 백신으로 이용될 수 있다. 마커 백신은 일반적으로 항체 패턴에서의 차이를 측정하고 어떤 동물이 백신접종되었고, 어떤 동물이 야생형 바이러스에 감염되었는지를 결정하기 위한 동반 진단 시험과 함께 사용된다. 이런 기법은 대상 모집단에서 나온 바이러스의 구제 및 박멸에 유용하다.
하기 실시예는 예시적인 양태로서 제시되지만, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 발명의 많은 변화, 변형, 개질 및 다른 용도 및 적용이 당 분야의 숙련자들에게 명확할 것이다.
실시예
실시예 1: 퀼 A/콜레스테롤( QC ) 용액
퀼 A(슈퍼포스)를 물에 용해시키고, 50mg/ml의 저장 용액을 제조하였다. 콜레스테롤(패브리 켐 인코포레이티드(Fabri Chem Inc.))을 에탄올에 용해시키고, 18mg/ml의 저장 용액을 제조하였다. 그런 다음, 콜레스테롤 저장 용액을 0.2마이크론 필터를 이용하여 여과하였다.
다양한 제제에서 퀼 A 및 콜레스테롤 농도의 범위는 1/1 ㎍/ml 정도로 낮은 퀼 A 내지 1000/1000 ㎍/ml 정도의 높은 콜레스테롤까지이다. 50/50㎍/ml의 퀼 A/콜레스테롤 저장 용액을 제조하기 위해서, 퀼 A 저장 용액은 50㎍/ml의 농도까지 물로 희석되었다. 이 용액을 교반하면서, 콜레스테롤 저장 용액을 50㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다.
실시예 2: DDA (D) 용액
다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드(DDA; 플루카 애널리티컬(Fluka Analytical))를 에탄올에 용해시키고, 18mg/ml 저장 용액을 제조하였다. DDA 저장 용액을 0.2 마이크론 필터를 이용하여 여과하였다.
실시예 3: 퀼 A/콜레스테롤/ DDA ( QCD ) 용액
실시예 1에서와 같이 퀼 A/콜레스테롤 저장 용액을 바람직한 농도로 제조하였다. DDA 저장 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하고, 퀼 A/콜레스테롤 저장 용액으로 서서히 첨가하였다. 용액을 혼합하여 바람직한 최종 농도를 달성하였다. 바람직한 최종 pH(이는 일반적으로 약 6.9 내지 약 7.5의 범위이다)를 달성하는데 요구되는 만큼의 NaOH 또는 HCl을 이용하여 용액의 pH를 조절하였다.
실시예 4: 카보폴 (등록상표) (C) 용액
카보폴(등록상표)(멕시코 소재의 노베온(Noveon))을 탈이온수에 용해시키고, 1.5% 저장 용액을 제조하였다. 다른 실시양태에서, 카보폴(등록상표)를 탈이온수에 용해시키고, 0.75% 저장 용액을 제조하였다.
실시예 5: DDA / 카보폴 (등록상표) ( DC ) 용액
DDA 저장 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하였다. 0.75% 카보폴(등록상표) 저장 용액을 실시예 4에서와 같이 제조하였다. 용액을 혼합하여 바람직한 최종 농도를 달성하였다.
실시예 6: 퀼 A/콜레스테롤/ DDA / 카보폴 (등록상표)( QCDC ) 용액
퀼 A/콜레스테롤/DDA 저장 용액을 실시예 3에서와 같이 제조하였다. 0.75% 카보폴(등록상표) 저장 용액을 실시예 4에서와 같이 제조하였다. 바람직한 최종 농도가 달성되도록 카보폴(등록상표) 저장 용액을 퀼 A/콜레스테롤/DDA 저장 용액에 서서히 첨가하였다. 바람직한 최종 pH에 도달하도록 용액의 pH를 NaOH 또는 HCl로 조절하였고, 이는 일반적으로 약 6.9 내지 약 7.5의 범위이었다.
실시예 7: 베이 R1005 (등록상표)(R) 용액
베이 R1005(등록상표) 저장 용액을 제조하기 위해, 당지질인 N-(2-데옥시-2-L-루실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸오일아미드를 에탄올(60% v/v)에 용해시켰다. 그런 다음, 트윈 20 및 빙초산을 첨가하였다. 한 예에서, 3.49g의 N-(2-데옥시-2-L-루실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸오일아미드를 44.64mL의 에탄올/물(60% v/v)에 용해시켰다. 이를 1.12mL의 트윈 20 및 0.68mL의 빙초산과 조합하였다.
실시예 8: 퀼 A/콜레스테롤/ DDA / 카바폴 (등록상표)/ 베이 R1005 ( QCDCR ) 용액
퀼 A/콜레스테롤/DDA/카바폴(등록상표) 저장 용액을 실시예 6에 개시된 바와 같이 제조하였다. 베이 R1005(등록상표) 저장 용액을 실시예 7에 개시된 바와 같이 제조하였다. 베이 R1005(등록상표) 용액을 퀼 A/콜레스테롤/DDA/카바폴(등록상표) 용액에 서서히 첨가하여 바람직한 최종 농도를 달성하였다. 바람직한 최종 pH(이는 일반적으로 약 6.9 내지 약 7.5의 범위이다)에 도달하는데 필요한 만큼의 NaOH 또는 HCl을 이용하여 용액의 pH를 조절하였다.
실시예 9: DEAE 덱스트란 용액(X)
200mg/ml의 DEAE 덱스트란을 물에 용해시킴으로써 DEAE 덱스트란 (X) 저장 용액을 제조하였다. 용액을 120℃에서 약 20분동안 오토클레이브에서 처리할 수 있다.
실시예 10: 퀼 A/콜레스테롤/ DDA / DEAE 용액( QCDX )
퀼 A/콜레스테롤/DDA 저장 용액을 실시예 3에 따라 준비하였다. DEAE 저장 용액을 실시예 9에 따라 제조하였다. 이들을 균질화기에 직접 첨가함으로써 용액들을 조합하였다. 혼합은 1,000초-1 초과의 전단력을 이용하는 플래시 블렌딩 방법을 이용하였다. 수용액을 비극성 면역증강제 및 항원 구성성분을 함유하는 오일 상에 직접 공급하고, 균일한 안정한 혼합물이 달성될 때까지 블렌딩함으로써 혼합하였다. 전형적으로, 이는 바람직한 입자 크기에 따라 최소한 몇분 또는 그보다 오래일 수 있다.
실시예 11: 오일 조성물(O)
드라케올(Drakeol) 광유를 트윈 85 및 스팬 85와 조합하고, 약 55℃까지 가열한 후, 냉각시키고, 멸균여과함으로써 오일 저장 용액을 제조하였다. 따라서, 이 혼합물은 오일계 담체를 위한 오일 상 베이스 성분을 구성할 것이다. 콜레스테롤 및/또는 DDA가 이들 조성물중 하나를 위한 협동 면역조절제로서 선택되는 경우, 이들이 오일 상에 가용성이기 때문에 이는 또한 여과전에 이 혼합물에 첨가될 것이다.
실시예 12: 퀼 A/콜레스테롤/ DDA / DEAE /오일 조성물( QCDXO )
퀼 A/콜레스테롤/DDA/DEAE 저장 용액을 실시예 10에 따라 제조하였다. 오일 저장 조성물을 실시예 11에 따라 제조하였다. 용액은 상기 농도에서의 양을 달성하기 위한 퀼-A, DEAE-덱스트란 및 물의 조합이었다. 실온 또는 그 이상의 온도에서 몇분 또는 그 이상동안 반응물을 연속적으로 교반함으로써 이 수성 상을 혼합한 후, 멸균 여과하고 오일 상에 첨가하기 위해 저장하였다. 수성 상을 연속적으로 혼합되는 오일 상에 서서히 첨가하였다.
실시예 13: 면역원성 조성물 또는 백신 조성물의 제조
상기 개시된 바와 같은 면역증강제중 하나 및 항원을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 제조하기 위해, 바람직한 항원을 적절한 완충액에 첨가하였다. 그런 다음, 바람직한 면역증강제의 구성성분을 상기 개시된 바와 같이 첨가하였다. 생성된 용액을 완충액을 이용하여 최종 체적이 되게 하였다.
실시예 13a: 항원, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA , 카보폴 (등록상표)
항원, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA 및 카보폴(등록상표)을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 제조하기 위해, 바람직한 항원을 적절한 완충액에 첨가하였다. 퀼 A 저장 용액을 실시예 1에서와 같이 제조하고, 항원 용액에 서서히 첨가하였다. 콜레스테롤 저장 용액을 실시예 1에서와 같이 제조하고, 항원/퀼 A 용액에 서서히 첨가하였다. DDA 저장 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하고, 항원/퀼 A/콜레스테롤 용액에 서서히 첨가하였다. 항원/퀼 A/콜레스테롤/DDA 용액을 균질화하고 미세유체화하였다. 0.75% 카보폴(등록상표) 용액을 실시예 4에서와 같이 제조하였다. 미세유체화후, 카보폴(등록상표) 용액(0.05% v/v)을 미세유체화된 조성물에 첨가하고, NaOH 또는 HCl을 이용하여 pH를 약 6.9 내지 약 7.5로 조절하였다.
실시예 13b: 항원, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA , 카보폴 (등록상표), 베이 R1005(등록상표)
항원, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA, 카보폴(등록상표) 및 베이 R1005를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 제조하기 위해, 바람직한 항원을 적절한 완충액에 첨가하였다. 퀼 A 저장 용액을 실시예 1에서와 같이 제조하고, 항원 용액에 서서히 첨가하였다. 콜레스테롤 저장 용액을 실시예 1에서와 같이 제조하고, 항원/퀼 A 용액에 서서히 첨가하였다. DDA 저장 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하고, 항원/퀼 A/콜레스테롤 용액에 서서히 첨가하였다. 항원/퀼 A/콜레스테롤/DDA 용액을 균질화하고 미세유체화하였다. 0.75% 카보폴(등록상표) 용액을 실시예 4에서와 같이 제조하였다. 미세유체화후, 카보폴(등록상표) 용액(0.05% v/v)을 미세유체화된 조성물에 첨가하고, NaOH 또는 HCl을 이용하여 pH를 약 6.9 내지 약 7.5로 조절하였다. 베이 R1005(등록상표) 저장 용액을 실시예 7에서와 같이 제조하였다. DDA를 첨가한 후 베이 R1005(등록상표) 성분을 수성 상에 첨가하였다.
실시예 13c: 항원, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA , DEAE 덱스트란
항원, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA 및 DEAE 덱스트란을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 제조하기 위해, 바람직한 항원을 적절한 완충액에 첨가하였다. 퀼 A 저장 용액을 실시예 1에서와 같이 제조하고, 항원 용액에 서서히 첨가하였다. 조성물을 균질화시켰다. 콜레스테롤 저장 용액을 실시예 1에서와 같이 제조하고, 균질화동안 항원/퀼 A 용액에 서서히 첨가하였다. DDA 저장 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하고, 균질화동안 항원/퀼 A/콜레스테롤 용액에 서서히 첨가하였다. DEAE 덱스트란 용액을 실시예 9에서와 같이 제조하였다. 균질화동안, DEAE 덱스트란 용액을 첨가하고, 생성된 조성물이 최종 체적이 되게 하였다.
실시예 13d: 항원, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA , DEAE 덱스트란 , 오일
항원, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA, DEAE 덱스트란 및 오일을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 제조하기 위해, 바람직한 항원을 적절한 완충액에 첨가하였다. 퀼 A 저장 용액을 실시예 1에서와 같이 제조하고, 항원 용액에 서서히 첨가하였다. 조성물을 균질화시켰다. 콜레스테롤 저장 용액을 실시예 1에서와 같이 제조하고, 균질화동안 항원/퀼 A 용액에 서서히 첨가하였다. DDA 저장 용액을 실시예 2에서와 같이 제조하고, 균질화동안 항원/퀼 A/콜레스테롤 용액에 서서히 첨가하였다. DEAE 덱스트란 용액을 실시예 9에서와 같이 제조하였다. 균질화동안, DEAE 덱스트란 용액을 첨가하였다. 오일 조성물을 실시예 11에서와 같이 제조하였다. 균질화동안, 수성 상을 오일 상으로 균질화하면서 첨가함으로써 오일 조성물이 첨가되고, 생성된 조성물이 최종 체적이 되게 하였다.
실시예 14: 고양이 백혈병 바이러스( FeLV ) 백신
무작위 경쟁 블록 디자인을 이용하여 동물을 처리 군으로 무작위 할당하였다. 표 1은 연구 디자인을 나타낸다. 블록은 출생일과 한배 새끼에 근거한다. 동물을 출생일로 분류한 후, 한배 새끼로 분류하였다. 4개의 블록을 이용하였다. 블록 이내에서, 동물을 처리군에 무작위 할당하였다. 연구의 백신 상의 경우, 2개의 연속적인 블록을 조합하여 8마리의 동물 군을 형성하였다. 각각의 방이 동물들의 5개 군(10블록)을 함유하도록 동물 군들을 2개의 방으로 무작위 할당하였다. 동물 군 이내에서, 각각의 우리에 동일한 처리를 받는 2마리의 동물이 들어있도록 서로 가까이 위치한 4개의 우리에 동물을 무작위 할당하였다. 연구의 항원공격 상의 경우, 하나의 백신 실에서 나온 동물을 하나 또는 두개의 항원공격 실중 하나에 무작위 할당하였다. 2개의 항원공격 실로 가도록 선택된 백신 실은 각각의 항원공격 실에 대해 무작위화된 5개의 블록을 가졌다(2.5개 군; 20마리). 다른 항원공격 실은 10개의 블록(5개 군; 40마리의 동물)을 함유한다. 항원공격 실 이내에서, 동일한 블록의 동물을 서로 가까이 위치한 4개의 우리에 무작위 할당하였다.
1.5% 카보폴(등록상표) 저장 용액을 이용한 점을 제외하고는, 실시예 13에 개시된 바와 같이 이 연구를 위한 백신을 제조하였다. 특히, FeLV-형질전환된 림프구 세포에서 FeLV 아군 A, B 및 C를 증식시킴으로써 루코셀(LEUKOCELL)(등록상표) 2(화이자 인코포레이티드(Pfizer Inc.))를 제조하였다. 바이러스 항원을 화학적으로 불활성화시키고, 멸균 면역증강제와 조합하여 면역 반응을 개선시키고, 액체 형태로 포장하였다. 고양이 백혈병 바이러스 및 25㎍의 퀼 A/수산화 알루미늄(알하이드로겔(ALHYDROGEL: 등록상표))를 함유하는 총 100mL 양의 수의학 조사 제품(Investigational Veterinary Product: IVP)을 제조하였다. 총 94.5mL의 1.106x105 ng/ml의 FeLV 저장 용액을 15분동안 서서히 혼합하였다. 4N HCl 또는 18% NaOH를 필요에 따라 이용하여 pH를 5.9 내지 6.1로 조절하였다. 교반하면서, 5.0mg/mL의 퀼 A 용액중 0.5ml를 항원 용액에 첨가하였다. 그런 다음, 5.0mL의 100% 알하이드로겔(등록상표)을 서서히 첨가하였다. 조성물을 최소 2시간동안 4℃에서 교반하였다. 18% NaOH 또는 1N HCl을 이용하여 pH를 필요에 따라 7.0 내지 7.3으로 조절하였다.
고양이 백혈병 바이러스 및 37.5㎍의 퀼 A/수산화알루미늄(알하이드로겔: 등록상표)를 함유하는 IVP를 25㎍ 퀼 A IVP와 동일한 방식으로 제조하였지만, 7.5ml의 퀼 A 저장 용액을 항원 용액에 첨가하였다.
고양이 백혈병 바이러스, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA 및 카보폴(등록상표)을 함유하는 총 350ml의 수의학 조사 제품(IVP)을 제조하였다. 교반하면서, 349.3mL의 1.106x105ng/mL FeLV 저장 용액, 0.14mL의 퀼 A의 50.0mg/mL 용액을 항원 용액에 서서히 첨가하였다. 그런 다음, 0.39mL의 18 mg/mL의 콜레스테롤/에탄올 용액을 서서히 첨가하였다. 조성물을 10,000rpm에서 3분동안 균질화시켰다. 총 0.19mL의 18.0mg/mL DDA/에탄올 용액을 교반하면서 조성물에 첨가하였다. 총 5.0mL의 1.5% 카보폴(등록상표) 용액을 145.0mL의 고양이 백혈병 바이러스, 퀼 A, 콜레스테롤 및 DDA 조성물에 서서히 첨가하였다. 18% NaOH 또는 1N HCl을 필요한만큼 이용하여 pH를 7.0 내지 7.3으로 조절하였다.
[표 1]
실험 디자인
Figure pct00001
a: 수의학 조사 제품
b: 기준 백신(FeLV 참조 롯트 번호 12)에 필적할만한 상대 효능을 갖도록 블렌딩됨;
c: SC = 피하
d: 데포-메드롤(Depo-Medrol: 등록상표): 근육내 경로에 의해 제42일(약 5.0mg/kg)
e: ON: 구개비강
퀼 A - 콜레스테롤: 콜레스테롤의 액체 입자에 혼입된 사포닌 면역증강제 퀼 A.
카보폴(등록상표): 카보머
DDA: 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드
모든 동물은 매일 관찰되었고, 관찰 내용을 기록하였다. 제1 백신 투여 이전의 제-1일 및 제2 백신 투여 이전의 제20일에 고막 경로로 모든 동물의 체온을 기록하였다. 경정맥 정맥의 정맥 천자에 의해 각각의 동물로부터 혈액 시료(1.0 내지 2.0mL)를 제-2일에 수집하였다. 혈액 수집동안 동물의 스트레스를 최소화시키고 동물 취급자에 의한 손상을 피하기 위해, 텔라졸(TELAZOL: 등록상표)(포트 돗지 애니믈 헬쓰(Fort Dodge Animal Health))의 진정 투여량을 근육내 경로에 의해 체중(약 5.0mg/kg)에 따라 투여하였다. 혈청 분리 튜브(SST)에 혈액을 수집하고, 혈청 분리를 위해 가공하였다. 시험할 때까지 혈청을 -20℃ 또는 그보다 낮은 온도에서 보관하였다.
1.0ml의 투여량을 피하 경로에 의해 위약 또는 FeLV 백신을 새끼 고양이에게 투여하였다. 제1 백신접종은 제0일에 수행되었고, 제2 백신 투여는 제21일에 수행되었다. 즉각적인 국소 통증 반응(격통 반응)에 대해 제1 및 제2 백신접종한 후 약 1시간동안 모든 동물을 관찰하였다. 관찰 내용을 기록하였다. 모든 동물의 체온을 제1 백신 투여량 투여 후 제1일 및 제2일 및 제2 백신 투여량 투여후 제22일 및 제23일에 고막 경로로 측정하였다. 주사 부위 반응(팽윤)을 또한 제1 백신접종 후 제1일에 및 제2 백신접종 후 제22일 및 제23일에 측정하였다. 제35일에 경정맥 정맥의 정맥 천자에 의해 혈액 시료(1.0 내지 2.0mL)를 각각의 동물로부터 수집하고, 혈청 분리를 위해 가공하고, 시험할 때까지 혈청을 -20℃ 또는 그보다 낮은 온도에서 보관하였다.
제35일에, 동물을 개별적인 격리 우리에 두었다. 항원공격 바이러스는 유독성 고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 리차드(Richard) 균주였고, 약 106.1 TCID50/mL으로 적정되었다. FeLV 항원공격 물질을 해동하고, 투여 전에 습한 얼음에 유지시켰다. 1.0mL의 희석되지 않은 항원공격 물질을 비강 경로로 투여함으로써 동물을 제37일, 제40일, 제42일 및 제44일에 항원공격하였다. 바늘이 없는 1mL의 투베르쿨린 주사기에 항원공격 물질을 채웠다. 각각의 새끼 고양이에게 콧구멍당 약 0.5mL를 투여하였다. 제42일에, 데포-메드롤(등록상표)을 투여한지 약 5시간 후에 항원공격 투여를 수행하였다. 각각의 항원공격일 후에, 항원공격 물질의 시료를 확인 적정을 위해 보유하였다.
항원공격 후, 제64일, 제85일, 제106일, 제127일, 제134일, 제141일, 제148일 및 제155일에 경정맥 정맥의 정맥 천자에 의해 각각의 동물로부터 혈액 시료(1.0 내지 2.0mL)를 수집하였다. 상기 개시된 바와 같은 진정 투여량의 텔라졸(TELAZOL: 등록상표)(포트 돗지)을 투여하였다. 혈청 분리 튜브(SST)에 혈액을 수집하고, 혈청 분리를 위해 가공하고, 시험할 때까지 혈청을 -20℃ 또는 그보다 낮은 온도에서 보관하였다. ELISA(IDEXX: 메인주 웨스트브룩)에 의해 FeLV p27 항원(FeLV 감염의 마커)의 존재에 대해 혈청 시료를 시험하였다. 최종 결과는 색 전개의 강도, 및 405/490nm의 광학 밀도에서의 분광학에 의해 평가되었다. 유효 시험의 경우, 양의 대조군 광학 밀도는 0.131 내지 2.999 이내이어야만 하고, 음의 대조군의 광학 밀도는 0.0039 이하이어야만 한다.
제-2일 및 제35일에 수집된 혈청 시료를 이용하여 바이러스 단리를 수행하였다. 제127일 내지 제155일의 혈청 시료가 FeLV 백신 효능을 평가하기 위해 고려되었다. 제127일(제12주), 제134일(제13주), 제141일(제14주), 제148일(제15주) 및 제115일(제16주)의 혈청 시료를 FeLV p27 항원의 존재에 대해 시험하였다. 제127일(제12주) 내지 제155일(제16주) 사이에 3개 이상의 양성 FeLV p27 항원 시험 결과를 갖는다면 동물이 영속적으로 감염된 것으로 간주하였다.
일반적인 선형 반복 측정 혼합 모델을 이용하여 온도를 분석하였고, 전체 처리 및/또는 시점 효과에서의 처리가 유의하다면, 각각의 시점에서 T01 처리와 T02, T03 및 T04 처리 사이를 페어와이즈(pair-wise) 처리 비교하였다. 최소 자승 평균, 95% 신뢰도 구간, 최소값 및 최대값을 각각의 시험에서의 각각의 처리에 대해 계산하였다.
격통 반응의 존재의 빈도 분포를 각각의 처리에 대해 계산하고, 시점 자료를 수집하였다. 주사 부위 팽윤의 존재의 빈도 분포를 각각의 처리에 대해 계산하고, 시점 자료를 수집하였다. 백신접종후 전신 반응의 존재의 빈도 분포를 각 처리에 대해 계산하였다.
제1 및 제2 백신 접종동안 임의의 처리군에서 즉각적인 반응이 관찰되지 않았다. 제1 및 제2 백신을 접종한지 약 1시간 후에 임의의 처리군에서 부작용이 관찰되지 않았다. 제1 및 제2 백신 접종후 발열(39.5℃ 이상의 체온) 또는 저체온증(37.0℃ 이하의 체온)이 관찰되지 않았다. 임의의 시점에서 처리군 사이에 체온 평균에서 유의한 차이는 없었다(p>0.08). 제1 및 제2 백신 접종후 임의의 처리군에서 주사 부위 팽윤이 관찰되지 않았다.
항원공격후 제12주 내지 제16주의 최종 결과는 위약 백신이 접종된 19마리의 동물(T01 군)중 16마리(84%)가 FeLV에 대해 영속적으로 바이러스혈증임을 나타내었다. T02 군에서는 19마리의 동물중 13마리(68%)가 FeLV 유독성 항원공격으로부터 보호되었다. 보호 수준은 위약이 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하다(p=0.0004). T03 군의 19마리 중 12마리(63%)가 FeLV 유독성 항원공격으로부터 보호되었다. 보호 수준은 위약이 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하다(p=0.0013). T04 군의 20마리 중 19마리(95%)가 FeLV 유독성 항원공격으로부터 보호되었다. 보호 수준은 위약이 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하다(p=0.0001).
따라서, T02, T03 및 T04 군에 투여된 백신은 모두 3주 간격으로 2회 투여하는 투약 계획으로 투여되었을 때 최소 연령의 새끼 고양이에게서 안전한 것으로 입증되었다. 또한, 이들 군에 투여된 백신은 또한 3주 간격으로 2회 투여하는 투약 계획으로 투여되었을 때 최소 연령의 새끼 고양이에게서 FeLV 영속성 바이러스혈증의 수준을 상당히 감소시킬 수 있었다. T02, T03 및 T04 군의 새끼 고양이에서 FeLV 영속성 바이러스혈증의 확립은 통계학적으로 유의하게 감소되었다. 또한, T04와 다른 백신 군(T02, T03) 사이에는 통계학적으로 유의한 차이가 있었다. 놀랍고 예상치 못하게도, 새로운 면역증강 제제를 함유한 백신이 고양이에서 흔히 사용되는 면역증강 성분을 함유한 것들에 비해 보다 효과적인 것으로 입증되었다.
실시예 15: 고양이 백혈병 바이러스 백신
새끼 고양이를 도착한 후 16일동안 적응시켰다. 그런 다음, 동물을 방으로 무작위로 할당하고, 방 내에서, 무작위로 처리에 대해 할당하였다(각각의 방에서 처리당 1마리의 동물). 제-1일의 연구 일에 경정맥 정맥의 정맥천자에 의해 각각의 동물로부터 혈액 시료(1.0 내지 2.0mL)를 수집하였다. 혈액 수집동안 동물의 스트레스를 최소화시키고 동물 취급자에 의한 손상을 피하기 위해, 텔라졸(TELAZOL: 등록상표)(포트 돗지 애미믈 헬쓰(Fort Dodge Animal Health))의 진정 투여량을 근육내 경로에 의해 체중(약 5.0mg/kg)에 따라 투여하였다. 혈청 분리 튜브(SST)에 혈액을 수집하고, 혈청 분리를 위해 가공하였다. 모든 동물을 또한 매일 관찰하였고, 관찰 내용을 기록하였다.
1.5% 카보폴(등록상표) 저장 용액을 이용한 점을 제외하고는 실시예 13에 따라 백신을 제조하였다. FeLV-형질전환된 림프구 세포에서 FeLV 아군 A, B 및 C를 증식시킴으로써 류코셀(등록상표) 2를 제조하였다. 바이러스 항원을 화학적으로 불활성화시키고, 면역 반응을 개선시키기 위해 멸균 면역증강제와 조합하고, 액체 형태로 포장하였다. 2의 상대 효능(RP)의 고양이 백혈병 바이러스, 퀼 A , 콜레스테롤 및 DDA를 함유하는 총 500.0mL의 양의 IVP를 하기 방식으로 제조하였다.
총 20.7mL의 FeLV 저장 용액(50.0 RP/mL, 여기서 1RP = 3,624ng/mL의 항원)을 478.2mL의 0.063% PBS 완충액에 첨가하였다. 교반하면서 0.21mL의 50.0mg/mL의 퀼 A 용액을 항원 용액에 서서히 첨가하였다. 그런 다음, 0.58mL의 18mg/mL 콜레스테롤/에탄올 용액을 서서히 첨가하였다. 교반하면서 총 0.29mL의 18.0mg/mL DDA/에탄올 용액을 조성물에 서서히 첨가하였다. 10,000rpm에서 3분동안 조성물을 균질화시켰다. 그런 다음 10,000(+500)psi에서 200마이크론 제한 치수 챔버를 통해 1회 통과시킴으로써 조성물을 미세유체화시켰다. 교반하면서, 10.0mL의 1.5% 카보폴(등록상표) 용액을 290.0mL의 고양이 백혈병 바이러스, 퀼 A, 콜레스테롤 및 DDA 조성물에 서서히 첨가하였다. 필요에 따라 18% NaOH 또는 1N HCl을 이용하여 pH를 7.0 내지 7.3으로 조절하였다.
51.7mL의 FeLV 저장 용액 및 447.2mL의 0.063% PBS 완충액을 이용하고, 다른 구성 성분들의 양은 동일하게 함으로써 2의 RP를 갖는 IVP와 동일한 방식으로 5의 RP를 갖는 고양이 백혈병 바이러스를 함유하는 IVP를 제조하였다.
93.1mL의 FeLV 저장 용액, 355.9mL의 0.063% PBS 완충액, 0.19mL의 퀼 A 용액, 0.52mL의 콜레스테롤 용액 및 0.26mL의 DDA 용액(총 450mL 체적)을 이용하여 2의 RP를 갖는 IVP와 동일한 방식으로 10의 RP를 갖는 고양이 백혈병 바이러스를 함유하는 IVP를 제조하였다. 그런 다음, 8.3mL의 1.5% 카보폴(등록상표) 용액을 241.7mL의 고양이 백혈병 바이러스, 퀼 A, 콜레스테롤 및 DDA 조성물에 서서히 첨가하였다.
139.7mL의 FeLV 저장 용액 및 309.4mL의 0.063% PBS 완충액을 이용하고, 다른 구성 성분들의 양은 동일하게 함으로써 10의 RP를 갖는 IVP와 동일한 방식으로 15의 RP를 갖는 고양이 백혈병 바이러스를 함유하는 IVP를 제조하였다.
206.9mL의 FeLV 저장 용액 및 292.0mL의 0.063% PBS 완충액을 이용하고, 다른 구성 성분들의 양은 동일하게 함으로써 2의 RP를 갖는 IVP와 동일한 방식으로 20의 RP를 갖는 고양이 백혈병 바이러스를 함유하는 IVP를 제조하였다.
0.5mL의 투여량을 투여하기 위해서, 5의 RP를 갖는 고양이 백혈병 바이러스, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA 및 카보폴(등록상표)을 함유하는 IVP 300mL를 하기 방식으로 제조하였다. 총 21.7mL의 FeLV 저장 용액(35.8 RP/mL, 여기서 1 RP = 1,864㎍/mL의 항원)을 277.7mL의 0.063% PBS 완충액에 첨가하였다. 교반하면서, 0.12mL의 50.0mg/mL의 퀼 A 용액을 항원 용액에 서서히 첨가하였다. 그런 다음, 0.35mL의 18mg/mL 콜레스테롤/에탄올 용액을 서서히 첨가하였다. 총 0.17mL의 18.0mg/mL DDA/에탄올 용액을 교반하면서 조성물에 서서히 첨가하였다. 10,000rpm에서 3분동안 조성물을 균질화시켰다. 그런 다음 10,000(+500)psi에서 200마이크론 제한 치수 챔버를 통해 1회 통과시킴으로써 조성물을 미세유체화시켰다. 교반하면서, 3.3mL의 1.5% 카보폴(등록상표) 용액을 96.7mL의 고양이 백혈병 바이러스 조성물에 조심스럽게 첨가하였다. 필요에 따라 18% NaOH 또는 1N HCl을 이용하여 pH를 7.0 내지 7.3으로 조절하였다.
0.5ml 투여량과 동일한 방식으로 양을 적절히 조절하여 5의 RP의 고양이 백혈병 바이러스, 퀼 A, 콜레스테롤, DDA 및 카보폴(등록상표)의 1.0mL 투여량을 투여하기 위한 IVP를 제조하였다.
10의 RP의 고양이 백혈병 바이러스 및 카보폴(등록상표)를 함유하는 총양 300.0mL의 IVP를 제조하였다. 총 62.1mL의 FeLV 저장 용액(50.0 RP/mL, 여기서 1 RP = 3.624㎍/mL의 항원)을 237.9mL의 0.063% PBS 완충액에 첨가하였다. 10,000rpm에서 3분동안 조성물을 균질화하였다. 그런 다음 10,000(+500)psi에서 200마이크론 제한 치수 챔버를 통해 1회 통과시킴으로써 조성물을 미세유체화시켰다. 교반하면서, 3.3mL의 1.5% 카보폴(등록상표) 용액을 96.7mL의 고양이 백혈병 바이러스 조성물에 첨가하였다. 필요에 따라 18% NaOH 또는 1N HCl을 이용하여 pH를 7.0 내지 7.3으로 조절하였다.
22 게이지 x 3/4인치 바늘 및 3cc 주사기를 이용하여 제0일의 연구일 및 제20일의 연구일에 피하 경로로 위약 및 FeLV 백신(표 2)을 새끼 고양이에게 투여하였다. 처리군 T01에게 1.0mL 투여량으로 위약 백신을 투여하였다. 처리군 T02, T04, T05, T06, T07, T08 및 T09에게 1.0mL의 투여량으로 FeLV 백신을 투여하였다. 처리군 T03에게 0.5mL의 투여량으로 FeLV 백신을 투여하였다. 피내 총 주입기(gun injector)를 이용하여 피내 경로로 처리군 T10에게 FeLV 카나리폭스 백신(메리얼(Merial))을 투여하였다.
[표 2]
실험 디자인
Figure pct00002
울기, 긁기/물기 및 공격적 또는 탈출 시도를 비롯한 시험 백신 투여시 통증의 증후에 대해 제1 백신접종(제0일) 및 제2 백신접종(제20일) 후에 모든 동물을 관찰하였다. 백신접종후 태도(정상 또는 비정상)를 또한 기록하였다. 부정적인 전신 반응의 전개에 대해 제0일 및 제20일에 백신을 접종한 후 약 1시간동안 모든 동물을 관찰하였다. 관찰 결과를 기록하였다. 백신 접종 부위를 촉진하고, 주사 부위의 통증, 주사 부위의 발적, 주사 부위 팽윤 및 팽윤 크기를 기록하였다. 제1 백신 접종 후 제2 연구일, 제5 연구일 및 제9 연구일, 및 제2 백신 접종후 제25 연구일, 제28 연구일 및 제32 연구일에 관찰을 수행하였다. 관찰 결과를 기록하였다.
제32 연구일(항원공격 전)에 경정맥 정맥의 정맥 천자에 의해 혈액 시료(1.0 내지 2.0mL)를 각각의 동물로부터 수집하였다. 희석되지 않은 항원공격 물질을 비강 경로에 의해 1.0mL 투여함으로써 제34 연구일, 제36 연구일, 제39 연구일 및 제41 연구일에 동물을 항원공격하였다. 주사 바늘이 없는 1mL 튜베르쿨린 주사기를 항원공격 물질로 채웠다. 각각의 새끼 고양이에게 콧구멍당 약 0.5ml를 투여하였다. FeLV 항원공격 물질은 106.1 TCID50/mL의 평균 역가를 가졌다. 그런 다음, 혈액 시료(1.0 내지 2.0mL)를 제61 연구일, 제83 연구일, 제106 연구일, 제126 연구일, 제133 연구일, 제138 연구일, 제146 연구일 및 제152 연구일에 경정맥 정맥의 정맥 천자에 의해 각각의 동물로부터 수집하였다.
결과 - 안전성
제1 (제0 연구일) 백신 접종동안, 처리군 T09에서의 3마리의 동물은 즉각적인 격통 유형 반응을 나타내었다. 제2 백신 접종(제20 연구일)동안, 처리군 T05에서의 1마리의 동물, 처리군 T08에서의 4마리의 동물, 및 처리군 T09에서의 2마리의 동물이 즉각적인 격통 유형 반응을 나타내었다.
제1 백신접종동안, 처리군 T09에서의 3마리의 동물이 작은 소리를 내었다. 제1 백신접종시 통증을 나타내는 동물은 또한 그때 작은 소리를 내었다. 제2 백신접종동안, 처리군 T05에서의 1마리의 동물, 처리군 T08에서의 4마리의 동물, 및 처리군 T09에서의 2마리의 동물이 작은 소리를 내었다. 제2 백신접종동안 통증을 나타내는 동물은 또한 그때 작은 소리를 내었다.
제1 백신접종동안, 처리군 T09에서의 3마리의 동물은 공격적인 행동/탈출 시도를 나타내었다. 제2 백신접종동안, 처리군 T05에서의 1마리의 동물, 처리군 T08에서의 4마리의 동물 및 처리군 T09에서의 2마리의 동물은 공격적인 행동/탈출 시도를 나타내었다.
제1 또는 제2 백신 접종시 주사 부위를 긁거나/무는 처리군의 동물은 없었다. 제1 또는 제2 백신접종 후의 임의의 처리군에서 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다. 또한 어떤 처리군에서도 부작용이 관찰되지 않았다.
결과 - 효능
제-1일에 수집된 혈청 시료로부터 나온 FeLV p27 항원에 대해 백신접종 전에는 모든 동물이 음성으로 시험되었다. 모든 동물은 또한 제32일에 수집된 혈청 시료에서 나온 FeLV p27 항원에 대한 항원공격 이전에 음성으로 시험되었다.
항원공격후 제12주 내지 제16주의 최종 결과(표 3)는 처리군 T01(위약)에서 10마리의 동물중 9마리(90%)가 FeLV에 대해 영속적 바이러스혈증이었음을 나타내었다. 동일한 기간에서 나온 결과는 처리군 T02에서 10마리의 동물중 6마리(60%)가 FeLV 악성 항원공격으로부터 보호되었음을 나타내었다; 이 보호 수준은 위약 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하지 않다(p=0.0573). 처리군 T03에서 10마리의 동물중 9마리(90%)가 FeLV 악성 항원공격으로부터 보호되었고, 이 보호 수준은 위약 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하였다(p=0.0011). 처리군 T04에서 10마리의 동물중 10마리(100%)가 FeLV 악성 항원공격으로부터 보호되었고, 이 보호 수준은 위약 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하였다(p=0.0001). 처리군 T05에서 10마리의 동물중 10마리(100%)가 FeLV 악성 항원공격으로부터 보호되었고, 이 보호 수준은 위약 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하였다(p=0.0001). 처리군 T06에서 10마리의 동물중 7마리(70%)가 FeLV 악성 항원공격으로부터 보호되었고, 이 보호 수준은 위약 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하였다(p=0.0198). 처리군 T07에서 10마리의 동물중 10마리(100%)가 FeLV 악성 항원공격으로부터 보호되었고, 이 보호 수준은 위약 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하였다(p=0.0001). 처리군 T08에서 10마리의 동물중 8마리(80%)가 FeLV 악성 항원공격으로부터 보호되었고, 이 보호 수준은 위약 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하였다(p=0.0055). 처리군 T09에서 10마리의 동물중 5마리(50%)가 FeLV 악성 항원공격으로부터 보호되었고, 이 보호 수준은 위약 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하지 않았다(p=0.1409). 최종적으로, 처리군 T10에서 10마리의 동물중 6마리(60%)가 FeLV 악성 항원공격으로부터 보호되었고, 이 보호 수준은 위약 접종된 새끼 고양이와 비교하였을 때 통계적으로 유의하지 않았다(p=0.0573).
[표 3]
보호 수준의 요약
Figure pct00003
논의
처리군 T02, T03, T04, T06 및 T07에서 이용된 백신은, 그때에 아무 반응도 관찰되지 않았기 때문에, 첫번째 백신접종 동안 만족스러운 안전성 프로파일을 나타내었다. 처리군 T05에서의 1마리의 동물은 제2 백신 접종에서 즉각적인 반응(투여시 통증, 작은 소리 및 공격성/탈출 시도)을 나타내었다. 이 사건은 백신 제형 문제보다는 특정한 동물을 위한 백신 접종의 악화 반응과 관련될 수 있다. 백신 접종과 관련된 국소 반응 또는 부작용이 관찰되지 않았기 때문에, 모든 백신 접종은 백신접종후 만족스러운 안전성 프로파일을 나타내었다.
유독성 FeLV로 항원공격당한 후에 80% 이상의 보호(75% 이상의 예방 비율)가 달성되었기 때문에, 처리군 T03, T04, T05, T07 및 T08에 투여된 FeLV 백신은 만족스러운 효능을 입증하였다. 처리군 T07에 주어진 백신이 100% 보호를 제공한다는 점은, 그 군의 동물이 T04군 및 T05군의 동물의 항원 투여량의 각각 25% 및 33%를 받았다는 점을 고려하면, 놀랍고도 예상치 못한 일이다. 본원에서 개시되고 시험된 면역증강제의 명확한 이점은 이들이 완전 보호 면역 반응을 여전히 유도하면서도 더 작은 투여량의 항원이 사용되는 것을 허용한다는 점이다. 처리군 T02, T06 및 T09에 투여된 백신은 유독성 FeLV를 이용한 항원공격후 다소 감소된 효능(80% 미만의 보호; 75% 미만의 예방 비율)을 나타내었다. 처리군 T02에 투여된 백신의 감소된 효능은 아마도 그 군에 낮은 반응자 동물이 존재하기 때문이었다.
실시예 16: 닭에서 아이메리아에 대한 난내 백신접종
조류 콕시디아증은 에이메리아(Eimeria) 속의 원생동물에 의해 일반적으로 야기되는 조류 콕시디아증이고, 가금류 산업에서 심각한 세계적인 문제점을 나타낸다. 먹이를 먹는 동안 섭취된 기생충은 내장관에 국소화되어 내장관에서 내장 및 하부 조직에 심각한 손상을 야기한다. 불고기용 영계 및 산란계 둘 모두의 사료 전환율 및 체중 증가가 손상되기 때문에, 가금류 산업에 미치는 경제적 손실은 매우 상당하다. 예를 들면 항체로서의 재조합 에이메리아 단백질 및 다양한 면역증강제 시스템을 이용하는 에이메리아에 대한 예방접종 시도를 비롯한 당 분야의 기술의 일반적인 요약은 하기 문헌에 개시된 바와 같고, 이들 모두는 당 분야에 참고로 혼입되어 있다: (1) [H.S. Lillehoj et al., J. Parisitol , 91(3), 2005, pp. 666-673]; (2) [H.S. Lillehoj et al., Avian Diseases, 49 2005, 112-117]; 및 (3) [R. A. Dalloul et al., Expert Rev. Vaccines, 5(1), 2006, pp.143-163]. 본 발명의 실시예는 콕시디아증의 측면에서 우수한 성능을 제공하는 면역증강제 성분을 이용한 신규한 백신 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 매우 효과적인 면역증강제는 정제되거나 부분적으로 정제된 추출물을 비롯한 모든 에이메리아 종에서 나온 항원 물질과 조합되어 사용될 수 있거나, 이의 하나 이상의 재조합 발현된 단백질, 또는 임의의 및 모든 이런 단백질의 분획과 조합되어 사용될 수 있고, 따라서 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina), 에이메리아 아사타(Eimeria ahsata), 에이메리아 보비스(Eimeria bovis), 에이메리아 브루네티(Eimeria brunetti), 에이메리아 프라터르쿨라에(Eimeria fraterculae), 에이메리아 맥시마(Eimeria maxima ), 에이메리아 멜레아그리디스(Eimeria meleagridis), 에이메리아 미티스(Eimeria mitis), 에이메리아 네카트릭스(Eimeria necatrix ), 에이메리아 프라에콕스 ( Eimeria praecox ), 에이메 리아 스티에다에(Eimeria stiedae ), 에이메리아 테넬라 ( Eimeria tenella ) 및 에이메리아 주르니(Eimeria zurnii) 등에서 제공된 항원 물질을 포함한다.
본 발명의 항원증강된 백신은 접합자(포자를 형성했거나 포자를 형성하지 않았거나 간에), 포자낭, 종충, 분열체, 낭충, 수컷 또는 암컷 생식 세포를 포함하지만 이로 한정되지 않는 원생동물의 생명 주기중 하나 이상의 시점에서 생성되는 임의의 단백질 또는 거대 분자에 대해 제공될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 접합자 상태에서 상당한 양이 변으로 발산되는 단백질이 재조합 단백질 항체, 또는 종래의 방식으로 정제된 이런 단백질의 부분적으로 또는 완전히 정제된 시료의 공급원으로서 작용하는 바람직한 물질이다.
본 발명의 백신의 제제에서 항원의 공급원으로써 유용한 에이메리아 단백질의 추가의 예는 약 20 내지 약 30kDa의 질량 범위를 갖는 본원에 개시된 바와 같은 보호 항원을 비롯한 [Karkhanis et al. Infection and Immunity, 1991, pp. 983-989]에 개시된 것들을 포함한다. 추가의 예는 에이메리아 23kDA 3-1E 단백질, 및 예를 들면 이. 테넬라(E. Tenella)에서 회수된 Etp100 단백질을 포함한다.
본 발명의 매우 효과적인 면역증강제는 뉴로스포라 카니늄(Neurospora caninum)에서 나온 항원 물질과 조합되어 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 매우 효과적인 면역증강제는 하기 원생동물 병원균중 임의의 것과 조합되어 사용될 수 있다: 크립토스포리듐 파르붐(Cryptosporidium parvum)(크립토스포리디움증), 사이클로스포라 카이에타넨시스(Cyclospora cayetanensis)(원포자충증), 아이소스포라 벨리(Isospora belli)(포자충증), 톡소 플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)(톡소플라즈마증), 플라스모디움(Plasmodium )(말라리아) 및 바베시아 종(Babesia spp.)(바베스열원충증) 및 일반적으로 이들 또는 관련된 질병을 야기하는 아피콤플렉센(Apicomplexen) 군인 관련된 원생동물.
특정한 면역증강제를 함유하는 백신의 난내 전달법의 효율은 다음과 같이 평가되었다.
재료 및 방법:
1. 재료:
재조합 이. 맥시마 단백질(단백질 3-1E의)을 이. 콜라이에서 발현시키고, 친화성 컬럼 정제하였다. 전체 세포 이. 맥시마 거대분자(파괴된 세포에서 나온 계면활성제로 용해됨)의 조질 제제를 또한 항원으로서 이용하고, 이 조질 항원은 "EM"으로 언급된다. 바람직한 예에서, 면역증강제는 상기 실시예 8에 개시된 바와 같고, 그 실시예의 프로토콜에 제공된 바와 같이 제조된다. 따라서, 전형적인 실시예에서, 각각의 배아에게 약 50 내지 약 100㎕의 백신 용액(이는, 각각의 1mL의 경우, 약 50 또는 100㎍의 재조합 3-1E 단백질 또는 다른 단백질 종을 포함한다), 또는 다르게는 약 50 또는 100㎍의 조질 세포 "EM" 추출물; 약 20㎍의 퀼 A; 약 20㎍의 콜레스테롤; 약 0.075%(v/v)의 카보폴; 약 10㎍의 DDA; 및 약 250㎍의 R1005(이들 모두는 예를 들면 20mM PBS에서 제공된다)가 양막(즉, 양수 및 공간을 포함)으로 주사된다.
본원에서 사용하기 위한 사포닌의 선택과 간련하여, 하기 추가의 정보가 유익하다. 정의된 용어인 사포닌은 식물 유래된 글리코사이드를 의미하고, 이의 다수는 이들의 생물학적 성질에 대해 광범위하게 연구되어 왔다([The Plant Glycosides, McIlroy, R. J., Edward Arnold and co., London, 1951]). 백신 생산 분야에서 가장 주로 사용된 사포닌은 식물 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria molina ), 아에스쿨루스 히포카스타눔 ( Aesculus hippocastanum) 또는 지 오필라 스트루티움(Gyophilla struthium)에서 유래된 것들이다. 면역증강제 활성을 갖고 있는 것으로 공지된 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무 껍질 추출액은 예를 들면 퀼 A로 공지되어 있다. 면역증강제 활성을 유지하지만 퀼 A에 비해 독성이 더 적은 퀼 A의 순수 분획 또한 QS21로 알려져 있다. QS21은 또한 [Kensil et al., 1991. J. Immunology vol 146, 431-437]에 개시되어 있다. 본원에 그리고 이후에 개시된 바와 같은 본 발명의 추가의 면역증강제 성분과 혼합되면, 이런 사포닌-함유 물질은 매우 효과적인 물질이 된다. 추가의 효과적인 배합물은 마로니에 나무의 씨앗에서 생기는 사포닌의 혼합물로서 메르크 인덱스(12판, 표제어 3737)에 개시된 에스신(Escin)을 이용하는 것들을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, "퀼-A"로서 언급되는 사포닌은 미국에서 이.엠 서전트 캄파니(E.M Sergeant company)에 의해 시판된다.
또한 사포닌 추출물이 혼합물 또는 이로부터 정제된 개별적인 정제, 예를 들면 미국 매사추세츠 주 소재의 안티제닉스 캄파니(Antigenics Comapny)의 QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-21, 또는 스웨덴의 이스코노바 캄파니(Isconova Comapny)의 유사한 조질의 분획화되거나 정련된 사포닌 제품 및 이의 혼합물을 비롯한 이런 분획/제품으로서 이용될 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 한 실시양태에서, 퀼 A는 85% 이상 순수하다. 다른 실시양태에서, 퀼 A는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 순수하다.
2. 배아 백신접종:
달걀을 펜실바니아주 쿼커타운 소재의 모이어스 해처리(Moyers Hatchery)에서 구입하였다. 난내 면역의 경우, 불고기용 영계 달걀을 18일동안 배양하고, 수정된 난(배 발생 18일에)을 선택하기 위해 촛불에 비추어 살핀 후, 20mM의 PBS와 함께 면역증강제 단독, 또는 재조합 3-1E 단백질 또는 "EM" 제제중 하나와 배합된 면역증강제와 함께 주입하였다. 주입은 제조자의 지시에 따라 난 주입기(메릴랜드 주 헤브론 소재의 아비텍(Avitech))에서 "인텔리젝트(Intelliject)" 상에서 이루어졌다. 각각의 달걀에 100㎕의 시료를 17.5cm 길이의 아비텍(메릴랜드 주 헤브론 소재)의 18 게이지 주사기를 이용하여 양막 공간에 주입하였다. 본 발명의 실시에서 또한 50㎕ 투여량이 사용가능하다.
3. 닭:
불고기용 영계 닭이 부화하자 마자(약 21일 내지 약 22일), 이들을 일회용 닭 수송 상자(위스콘신주 밀워키 소재의 프레드릭 패키징 인코포레이티드(Frederick Packaging, Inc.))를 이용하여 실험실로 옮긴 후, 닭을 피터사임(Petersime) 유니트에 수용하고, 먹이와 물을 임의로 제공하였다.
닭들을 에이메리아가 없는 시설의 인공부화기 펜에 유지시키고, 에이메리아 막스마의 살아있는 접합자로 감염시킬 여러 곳의 큰 매달린 우리로 옮기고, 실험 기간이 끝날 때까지 거기에 두었다.
4. 기생충:
에이메리아 맥시마 #41의 USDA BARC 균주(이는 동물 기생충 질병 실험실-BARC에서 유지되었으며 릴레호즈(Lillehoj) 박사의 실험실에서의 확립된 방법에 따라 증식되었다)를 이용하였다. 이. 맥시마(벨츠빌(Beltsville #41)의 균주에서 나온 막 생성된 접합자를 5% 차아염소산나트륨 상에 띄워서 세정하고, PBS로 3회 세척하고, 혈구 계산기를 이용하여 트립판 블루에 의해 생활성을 평가하였다.
5. 에이메리아 항원공격 감염:
7일된 닭의 날개에 택을 붙이고, 감염되지 않은 대조군을 제외한 모든 실험군의 닭을 접종 주사기를 이용하여 이. 맥시마로 식도 접종시킨 후, 접합자 수집 우리에 두었다.
6. 체중 증가 측정
개별적인 닭의 체중을 제0일(감염되지 않음), 이. 맥시마를 이용하여 감염한후 제6일 및 제10일에 측정하였다.
7. 변 접합자 생산의 측정
동물 관리자는 우리를 청소하지 않고, 떨어진 변을 수집하도록 지시를 받았다. 감염시킨 후 제6일부터 시작하여 5일간 각각의 우리 아래에 수집 팬을 두고, 변 물질을 큰 플라스틱 병(2L)에 수집하였다. 각각의 병에서 수도물로 함침시킨 변 적하물에 물을 더 부어서(총 체적은 3L이다) 블렌더에서 갈고, 2개의 40mL 무작위 시료를 각 시료에서 취하고, 계수할 때까지 냉장고에서 보관하였다. 콕시디아증 접합자의 수를 세기 위해서, 먼저 각각의 시료를 위한 접합자의 계산을 위해 최적의 희석을 결정하였다. 릴레호즈 박사의 실험실에서 확립한 슈크로스 부유 방법을 이용한 맥마스터(McMaster) 계수실을 이용하여 접합자를 현미경으로 계산하였다. 닭 한마리당 퍼진 접합자의 총 수를 다음과 같은 식을 이용하여 계산하였다: 총 접합자/닭 = (접합자 수 x 희석 인자 x 변 시료 체적/계수실 체적)/우리당 닭의 수.
8. 시료 수집
감염일 후의 제6일에 혈액을 수집하고, 혈청 항체 반응을 측정하였다. 혈액 시료를 개별적인 닭(N: 4 내지 5/군)으로부터 수집하고, 4℃에서 4시간동안 응고되게 하고, 혈청을 수집하였다. 혈청 시료를 ELISA를 이용한 항-에이메리아 항체에 대해 시험하였다. 간략하게, 마이크로타이터 플레이트를 10㎍/웰의 재조합 콕시디아증 항원 Ea3-1E, EtMIF 또는 EtMIC2로 하룻밤동안 코팅하고, PBS-0.05% 트윈으로 세척하고, PBS 1% BSA로 블록킹하였다. 혈청 희석액(1:20, 1:40, 1:80, 1:160; 100㎕/웰)을 첨가하고, 연속적으로 부드럽게 교반하면서 항온처리하고, 세척하고, 결합된 Ab를 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 토끼 항-닭 IgG(시그마) 및 퍼옥시다제-특이적 기질을 이용하여 검출하였다. 광학 밀도(OD)를 450nm에서 마이크로플레이트 판독기(캘리포니아주 리치몬드 소재의 바이오-래드)를 이용하여 측정하였다.
부화시, 부화후 제6일 및 제10일에 내장 조직을 수집하고, Th1 자극의 측정치로서 실시간 RT-PCR을 이용하여 사이토카인(IFN-γ, IL-2) 생산에 대해 시험하였다.
9. cDNA 합성
트라이졸(TRIzol)(캘리포니아주 칼스배그 소재의 인비트로겐(Invitrogen))을 이용하여 내장 IEL로부터 총 RNA를 추출하였다. 5㎍의 RNA를 1.0U의 I형 DNA 분해효소 및 1.0㎕의 10X 반응 완충액(시그마)으로 처리하고, 실온에서 15분동안 항온처리하고, 1.0㎕의 중지 용액을 첨가하여 I형 DNA 분해효소를 불활성화시키고, 혼합물을 70℃에서 10분간 가열하였다. 제조자의 추천에 따라 스트라타스크립트(StrataScript) 제1 나선 합성 시스템(캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진)을 이용하여 RNA를 역전사하였다.
10. 정량적 RT - PCT
닭 인터페론-γ(IFN-γ) 및 GAPDH 대조군을 위한 정량적 RT-PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 표 4에 열거되어 있다. 증식 및 검출은 Mx3000P 시스템 및 브릴리언트(Brilliant) SYBR 그린 QPCR 마스터 믹스(스트라타진)를 이용한 내장 IEL에서 나온 총 RNA의 등가 양을 이용하여 수행되었다. log10 희석된 표준 RNA를 이용하여 표준 곡선을 생성하고, 개별적인 전사물의 수준을 Q-유전자 프로그램에 의해 분석된 GAPDH의 수준에 대해 정상화시켰다. 각각의 분석은 3중으로 행해졌다. 실험 내의 시료 사이의 RNA 수준을 정상화하기 위해, 그 실험의 모든 시료에서 나온 값을 모아서 증폭 생성물에 대한 평균 문턱값 사이클(Ct) 값을 계산하였다.
[표 4]
닭 IFN-γ 및 GAPDH의 정량적 RT-PCR에 이용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머
Figure pct00004
비장 림프구 증식 분석을 위해 이. 맥시마로 접종하기 전 및 감염후(DPI) 제10일에 비장을 수집하였다. 비장을 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(시그마, 미주리주 세인트 루이스 소재)이 보충된 행크의 균형잡힌 염 용액(HBSS) 10ml가 있는 페트리 디쉬에 놓았다. 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 제조하고, 림프구 증식을 수행하였다. 간략하게, 비장 림프구를 10% 우태 혈청(FBS)(유타주 로간 소재의 하이클론(Hyclone)), 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(시그마)으로 보충된 IMDM 배지(시그마)(이는 10% 완전 IMEM 배지라 불린다)중의 5x106 또는 1x107 세포/ml로 조절하였다. 비장 림프구(100㎕/웰)를 5% CO2 및 95% 공기가 있는 습한 인큐베이터(오하이오주 마리에타 소재의 포르마(Forma))에서 41℃에서 48시간동안 96웰 평판 플레이트에서 배양하였다. 2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-다이설포페닐)-2H-테트라졸륨, 일나트륨 염(WST-8, 셀 카운팅 키트-8(등록상표), 메릴랜드주 가이터스버그 소재의 도진도 몰레큘라 테크놀로지스(Dojindo Molecular Technologies))을 이용하여 세포 증식을 측정하였다. 광학 밀도(OD)를 마이클로플레이트 분광계(바이오래드, 캘리포니아주 리치몬드 소재)를 이용하여 450nm에서 측정하였다.
결과
결과는, 100㎕의 면역증강 제제(즉, 이전에 정의된 투여량에 따라 재조합 3-1E 단백질을 포함한 100㎕)로 백신접종된 불고기용 영계가 백신접종되지 않고 이. 맥시마로 감염된 닭에 비해 추가로 약 45 내지 85g의 체중이 증가되었음을 나타내었다.
본 발명의 백신은 또한 유사분열성 림프구 증식 분석법에 의해 측정하였을 때 세포-매개된 면역성에 대해 명확한 효과를 나타내었다: 콘 A(Con A)와 함께 48시간동안 항온배양된 1x107 세포/ml에서의 비장 림프구 증식 결과는, 특히 50㎍의 투여량을 이용하였을 때, 항체가 있거나 없는 화이자 면역증강제로 면역된 이. 맥시마 감염된 닭에서 나온 비장 림프구가 일반적으로 더 높은 수준의 림프구 증식을 보여준다는 것을 나타내었다. 가장 특히 비장에서의 IL-1B 생산, IFN-γ 생산 및 IL-15 생산의 상당한 개선이 본 발명의 면역증강된 백신 조성물의 투여 후에 나타났다. 요약하자면, 이들 결과는 본 발명의 면역증강제가 사이토카인 반응에 미치는 효과를 나타내고, 체액 면역 반응이 아니라 세포-매개된 면역 반응을 개선시키는데 있어 이의 효과를 지지한다.
본 발명의 백신은 또한 변의 접합자 생산량에 미치는 명확한 효과를 보여주었다. 감염되지 않은 대조군 닭은 임의의 접합자를 퍼트리지 않았다. 이. 맥시마 감염 후, 화이자 면역증강제 단독으로 처리된 군에서 변 접합자 생산량이 상당히 감소되었다. 조질 에이메리아 맥시마 및 면역증강제로 난내 백신접종된 새는 조질 에이메리아 맥시마 제제 단독으로 접종된 군, EM 군에 비해 훨씬 더 적은 변 접합자 생산량을 나타내었다.
비록 정제된 재조합 이. 맥시마 단백질 3-1E가 전술된 실험의 실시에 사용되어 왔지만, 단일한 재조합 Ea3-1E, EaMIF 및 EtMIC2 항원, 또는 3-1E와 또는 서로 조합된 재조합 Ea3-1E, EaMIF 및 EtMIC2 항원의 이용이 또한 본 발명의 바람직한 실시양태이고, 일반적으로 모든 에이메리아 단백질 항원은 이들이 본 발명의 면역증강제와 혼합되는 한 본 발명의 실시에서 작용가능하다.
실시예 17: 소에서 에스케리치아 콜리 J5 균주의 평가
본 연구의 목적은 다양한 신규 제제에서 투여되었을 때 에스케리치아 콜리(J-5 균주) 항원에 대한 소의 면역 반응을 평가하는 것이다. 상업적인 J5 박테린은 젖소에서 콜리폼 유방염(coliform mastitis)에 대한 예방 백신으로 판매되고 있고, 이의 현재의 제제에서 어느 정도 효과적이다. 백신 접종 이전에, 동물들은 백신 접종 이전에 실시된 개별적인 혈청 혈액 시료 분석에 근거하여 이. 콜라이 J5에 대해 낮은 역가를 갖고 있는 것으로 측정되었다.
육우
항원으로서 불활성화된 이. 콜라이 J5 박테린을 이용하여 실험 백신을 배합하였고, 상기 실시예 13에 따라 제조하였다. 각각의 처리군은 초기에 7마리의 동물(표 5)을 함유하였다. 하나의 처리군에는 염수(T01)를, 다른 군에는 상업적인 J5 백신(T05 - 엔바이라코(Enviracor)TM 화이자 J-5 에스케리치아 콜리 박테린)을 주었다. 다른 처리군에는 표 5에서 규정된 면역증강제를 함유하는 다양한 제제를 주었다. 모든 백신 접종은 제0일 및 제21일에 피하 주사로 투여하였다. 투여 체적은 5mL였다.
[표 5]
백신 군 - 육우
Figure pct00005
표 5에서, QC는 퀼 A/콜레스테롤의 약자이고, D는 DDA의 약자이고, C는 카보폴의 약자이고, R은 R1005의 약자이고, X는 DEAE-덱스트란의 약자이고, O는 오일의 약자이다.
저장 용액을 하기에 대해 상기 실시예 1 내지 13에 개시된 바와 같이 제조하였다: 이. 콜라이는 광 현미경에 의해 직접 계수하였을 때 투여량당 약 4 내지 5x109 유기체로서 제공되었다. 물 중의 퀼 A는 50mg/ml, 에탄올중의 콜레스테롤은 17mg/ml, 에탄올 중의 DDA는 17mg/ml, 20mM 포스페이트 완충액중의 R1005는 5mg/ml, 물 중의 DEAE-덱스트란은 200mg/ml, TE 완충액 중의 TLR 작용제는 20mg/ml이고, 물 중의 이스코매트릭스는 5.4mg/ml였다. 개별적인 성분을 왼쪽부터 오른쪽의 글자 순서대로 v/v로 첨가하였다. 예를 들면 QCDC의 경우, 적절한 체적의 퀼 A를 첨가한 후, 콜레스테롤, DDA 및 최종적으로 카보폴을 첨가하였다. 제제가 오일을 함유하는 경우, 개별적인 성분을 첨가 혼합한 후, 스팬 80 및 트윈 80중 하나와 드라케올(Drakeol, 등록상표) 5LT 광유의 혼합물(QCDO), 또는 트윈 85 및 트윈 85와 드라케올 5LT 광유의 혼합물(QCDXO)에 유화시켰다. 드라케올(등록상표)은 상업적으로 이용가능한 가벼운 광유이다.
혈청 시험을 위해 혈액 시료를 제0 연구일, 제21 연구일 및 제49 연구일에 수집하였다. 혈청 시료중의 이. 콜라이 J5에 대한 항체 역가를 J5 특이적, 간접적 ELISA 분석법을 이용하여 측정하였다. IgG 항체 아이소타입을 양-항-소 항체 컨쥬게이트(베틸 랩스(Bethyl Labs))를 이용하여 측정하였다. 역가를 측정하고, 기하 평균으로 표현하였다.
결과
연구의 혈청 결과를 표 6 내지 9에 도시한다. 더 높은 항체 역가는 일반적으로 더 좋은 백신의 보호와 관련되어 있다. 총 J5-특이적 IgG 역가가 표 6에 도시되어 있다. 본 발명의 여러 제제는, 유사한 양의 J5 항체가 첨가되어 있는 상업적인 제품에 비해 훨씬 더 높은 역가를 생성한다. 이들 소에서 우수한 면역 반응을 유도하는데 있어 QCDO, QCDX 및 QCDXO 제제가 특히 유효하다.
[표 6]
IgG 항체 역가
Figure pct00006
J5-특이적 IgG1 항체 아이소타입을 측정하였다. 이들 결과가 표 7에 도시되어 있다. 또다시, QCDO, QCDX 및 QCDXO 제제가 이들 소에서 우수한 면역 반응을 유도하는데 있어 특히 효과적이었다. 이들 제제는 단일 백신접종된 경우에조차 2회 주입된 상업적인 백신에 비해 훨씬 더 높은 역가를 나타내었다.
[표 7]
IgG1 항체 역가
Figure pct00007
IgG2 항체 역가는 표 8에 도시되어 있다. 이 항체 아이소타입은 종종 우유 중의 호중구에 의한 더 좋은 식균작용 및 동물에 대한 보호와 관련되어 있다. QCDO, QCDX 및 QCDXO 제제는 이들 소에서 우수한 면역 반응을 유도하는데 특히 효과적이었다.
[표 8]
IgG 항체 역가
Figure pct00008
젖소
실험 백신을 항체로서 불활성화된 이. 콜라이 J5 박테린을 이용하여 배합하고, 상기 실시예 13에 따라 제조하였다. 각각의 처리군은 초기에는 7마리의 동물을 함유하였다(표 9). 하나의 처리군에는 염수(T01)를 투여하고, 다른 처리군에는 상업적인 J5 백신(T02 - 엔비라코르(Enviracor: 상표명): 화이자 J-5 에스케리치아 콜리 박테린)을 투여하였다. 다른 처리군에는 표 9에 특정된 면역증강제를 함유하는 다양한 제제를 투여하였다. 모든 백신은 제0 및 제21 연구일에 피하 주사에 의해 투여되었다. 투여 체적은 5ml였다.
[표 9]
백신 군 - 젖소
Figure pct00009
표 9에서, QC는 퀼 A/콜레스테롤의 약자이고, D는 DDA의 약자이고, C는 카보폴의 약자이고, R은 R1005의 약자이고, X는 DEAE-덱스트란의 약자이고, T는 TLR 작용제(CpG-ODN)의 약자이고, O는 오일의 약자이다. 저장 용액을 다음과 같이 제조하였다: 이. 콜라이는 광 현미경에 의해 직접 계수하였을 때 투여량당 약 4x109 내지 5x109 유기체로서 제공되었다. 물 중의 퀼 A는 50mg/ml, 에탄올중의 콜레스테롤은 17mg/ml, 에탄올 중의 DDA는 17mg/ml, 20mM 포스페이트 완충액중의 R1005는 5mg/ml, 물 중의 DEAE-덱스트란은 200mg/ml, TE 완충액 중의 TLR 작용제는 20mg/ml였다. 개별적인 성분을 왼쪽부터 오른쪽의 글자 순서대로 v/v로 첨가하였다. 예를 들면 QCDCR의 경우, 적절한 체적의 퀼 A를 첨가한 후, 콜레스테롤, DDA 및 최종적으로 카보폴을 첨가하였다. 제제가 오일을 함유하는 경우, 개별적인 성분을 혼합 첨가한 후, 스팬 80 및 트윈 80중 하나와 드라케올(Drakeol, 등록상표) 5LT 광유의 혼합물(TXO, QCDO), 또는 트윈 85 및 트윈 85와 드라케올 5LT 광유의 혼합물(QCDO)에 유화시켰다.
혈액 수집
혈청 시험을 위해 혈액 시료를 제0 연구일, 제21 연구일 및 제49 연구일에 수집하였다. 혈청 시료중의 이. 콜라이 J5에 대한 항체 역가를 J5 특이적, 간접적 ELISA 분석법을 이용하여 측정하였다. IgG 항체 아이소타입을 양-항-소 항체 컨쥬게이트(베틸 랩스)를 이용하여 측정하였다. 역가를 측정하고, 기하 평균으로 표현하였다.
결과
연구의 혈청 결과를 표 10에 도시한다. 더 높은 항체 역가는 일반적으로 더 좋은 백신의 보호와 관련되어 있다. 총 J5-특이적 IgG 역가가 표 10에 도시되어 있다. 본 발명의 여러 제제는, 유사한 양의 J5 항체가 첨가되어 있는 상업적인 제품에 비해 훨씬 더 높은 역가를 생성한다. 이들 소에서 우수한 면역 반응을 유도하는데 있어 QCDO, TXO 및 QCDXO 제제가 특히 유효하다.
[표 10]
IgG 항체 역가
Figure pct00010
J5-특이적 IgG1 항체 아이소타입을 측정하였다. 이들 결과를 표 10에 나타내었다. 또다시, QCDO, TXO 및 QCDXO 제제들이 이들 소에서 우수한 면역 반응을 유도하는데 특히 효과적이다. 이들 제제는 2회 주사된 상업적인 백신에 비해 단일 접종한 경우에조차 훨씬 더 높은 역가를 나타내었다.
이 항체 아이소타입은 종종 더 좋은 우유중의 호중구에 의한 식균작용 및 동물을 위한 보호와 관련되어 있다. 특히 QCDXO 제제가 이들 소에서의 우수한 면역 반응을 유도하는데 유효하다.
실시예 18: 소의 바이러스성 설사 바이러스 백신
연구 목적
본 연구는 실험을 당하지 않은 송아지에서 BVDV-1을 이용한 항원공격에 대한 하나의 음성(염수) 및 2개의 양성 대조군(개질된 생 BVDV-2 백신 및 현재 이용가능한 사멸된 BVDV-1/2 백신)을 갖는 본 발명의 면역증강제와 배합된 2가지의 사멸된 소의 바이러스성 설사 바이러스 1형 및 2형(BVDV-1 및 BVDV-2 또는 BVD-1/2) 백신 및 하나의 BVDV-1 및 -2 추출물 백신의 안전성, 효능 및 교차 보호를 비교하였다. 표 11은 연구 디자인을 나타낸다.
본 연구는 또한 본 발명의 면역증강제가 본 발명의 백신 조성물로 접종된 동물을 BVDV에 자연적으로 노출된 동물로부터 구별하기 위해 이용될 수 있음을 보여주었다.
동물
BVDV-1 및 BVDV-2에 대해 혈청음성인 7달 내지 15달된 건강한 젖을 뗀 육우(숫소 또는 암소)를 이용하였다.
[표 11]
연구 디자인
Figure pct00011
백신 접종
제0 및 제21 연구일에, 동물(N = 10/군)에게 표 11에 개시된 바와 같이 백신을 접종하였다. ELISA 분석법으로 측정시 투여당 5,500 상대 효능 단위(RU)로서 항원(BVDV)을 투여하였다. T01 군의 송아지를 대조군으로 이용하였다. 이들에게는 0.9%의 염화나트륨 멸균 용액을 투여하였다. T02 내지 T06 군의 송아지에게는 표 11에 도시된 바와 같은 면역증강제를 갖는 실험 BVDV 1/2 백신을 투여하였다. T02 군에게는 단 한가지의 백신(제 0 연구일)을 투여하였다. 이들에게는 면역증강제를 함유하지 않는 개질된 생 바이러스(MLV) BVDV-2 백신을 투여하였다. T03 군에는 2.5% 수중유 유화액(암피겐) 및 퀼 A/콜레스테롤 면역증강제(PreZent A(등록상표))를 함유하는 사멸된 바이러스 BVDV-1/2 백신을 투여하였다. T04 군에는 퀼 A/콜레스테롤, DDA 및 카보폴을 함유하는 사멸된 바이러스 BVDV-1/2 백신을 투여하였다. T05 군에는 퀼 A/콜레스테롤, DDA, 카보폴 및 R1005를 함유하는 사멸된 바이러스 BVDV-1/2 백신을 투여하였다. T06 군에는 제0일에 퀼 A/콜레스테롤, DDA 및 카보폴을 함유하는 사멸된 바이러스 BVDV-1/2, 고-역가 추출물 백신을 투여하고, 제21일에는 유사한 낮은 역가 추출물 백신을 투여하였다. 모든 처리군을 제0일 및 제21일에 단일 2mL 투여량을 피하 투여하고, 제2군만 예외이다.
QCDC ± R은 100㎍의 퀼 A, 100㎍의 콜레스테롤, 50㎍의 DDA 및 0.075%의 카보폴을 함유하였고, 이는 이전에 개시된 바와 같이 2mL 투여량당 1,000㎍의 R1005를 포함하였다.
항원공격
제42일에, 모든 동물에게 5ml 투여량당 5.4 log10 TCID50의 농도로 약 4mL(콧구멍당 약 2mL)의 비병원성 BVDV-1 균주(균주 NY-1; CVB, USDA, 아이오와주 아메스 소재)를 비강내 항원공격하였다.
관찰
제 1 주사 부위(왼쪽 목)의 경우 제 0(백신 접종 전), 제1, 제2, 제3, 제7 및 제21 연구일에 주사 부위 관찰을 기록하였다. 제 2 주사 부위(또한 왼쪽 목)에 대한 관찰을 제21(백신 접종 전), 제22, 제23, 제24, 제28 및 제35 연구일에 기록하였다. 모든 손으로 촉진되는 주사 부위 반응을 측정하였다(LxWxH, cm). 1차 백신접종에 대해 제-1, 제0(백신 접종 전), 제1, 제2 및 제3 연구일에 직장 온도를 기록하였다. 부스터 백신접종에 대한 온도를 제20, 제21(백신 접종 전), 제22, 제23 및 제24 연구일에 기록하였다.
혈액 시료 채취
제-1, 제20, 제34 및 제49 연구일에 혈청 분리관(SST)을 이용하여 각각의 이용가능한 동물로부터 혈액 시료를 수집하였다. 제33 연구일 내지 제35 연구일(항원공격 전) 및 제36 연구일 내지 제49 연구일에 EDTA 튜브를 이용하여 혈액 시료를 수집하였다. 제34 연구일(항원공격 전) 및 제36 연구일 내지 제49 연구일에 세포 준비 튜브(CPT)를 이용하여 혈액 시료를 수집하였다.
결과
표 12는 연구일에 혈구응집 분석에 의해 BVD 바이러스에 대한 항체 역가를 중화시키는 기하 최소 평균 자승(GLSM: least squares mean)을 나타낸다. 결과는 연구가 진행됨에 따라 본 발명의 면역증강제가 BVDV-1 및 BVDV-2 둘 모두에 대한 역가의 증가를 제공한다는 것으로 보여준다. UDSA에 대한 허용가능한 역가는 8 초과의 역가이다. 이들 자료는 5,000 초과의 역가를 입증하고, 이는 감염 및 질병 가능성이 있는 동물에게 들어갔을 때 살아있는 바이러스를 중단시킬 수 있는 강한 항체 생산을 나타낸다.
[표 12]
혈청 항체 중화 역가
Figure pct00012
표 13은 제43 내지 제56 연구일에 대한 백혈구감소 자료를 나타낸다. 연구일의 백혈구 감소 결과는 MLV 백신(T02)이 그 특정 바이러스의 항원공격에 의한 감염을 예방하였음을 입증한다. 백혈구감소 측정치는 USDA가 MLV 제품을 승인하는 척도이다. 그러나, 불활성화된 바이러스의 경우 백혈구감소는 USDA에 의한 척도가 아니지만, 자료는 대부분의 불활성화된 바이러스 백신이 100% 백혈구감소를 나타내는 동물에서 본 발명의 면역증강제가 단지 20%의 동물에서만 백혈구감소를 나타내었음을 보여준다. 이는 본 발명의 면역증강제가 불활성화된 항원을 이용하여 강한 Th1 반응을 구동할 수 있었음을 나타낸다. 이는 매우 어렵고 불활성화된 제품에서는 거의 일어나지 않는 현상이다.
[표 13]
연구일에서의 백혈구감소
Figure pct00013
표 14는 제41일(제2 백신 접종한지 20일 후, 항원공격 전)에서의 혈청 중화 역가를 나타낸다. 개질된 생 바이러스는 백신중의 정확한 바이러스에 대한 항체 반응을 전개할 수 있을 뿐이다. 이는 BVDV-2에 대해서만 보호를 나타내는 T02군에서 나타난다. 그러나, T03(PreZent-A), T04(QCDC) 및 T05(QCDCR) 면역증강된 불활성화된 백신은 혈청학적으로 다양한 BVDV 패널에 대해 면역 개시시에 초기에 그리고 동물 연구의 라이프 상에 걸쳐서 강한 항체 반응을 생성하였다. 이는 이들 면역증강제가 동종 항원공격뿐만 아니라 이종 항원공격에서 소를 보호하기위한 항원공격 모델에서 안전성 및 효능을 제공하는 능력을 갖고 있음을 보여준다.
[표 14]
제41일에서의 혈청 중화 역가
Figure pct00014
마커 활성: 본 발명의 면역증강제가 BVDV에 자연적으로 노출된 동물로부터 본 발명의 백신 조성물로 백신 접종된 동물을 구별하는데 이용될 수 있음을 보여주는 자료가 본원에 제시되어 있다. 이는 바이러스의 구조 유전자 생성물과 비-구조 유전자 생성물 사이의 항체 프로파일 차이를 측정함으로써 알 수 있다. 마커 활성은 방사성면역침전 분석법에 의한 겔에 의해 입증된다(도 1). BVDV의 NS2/3 및 E2 단백질에 대한 항체 반응은 MLV 백신으로 접종된 동물, 또는 BVDV에 자연적으로 노출된 동물 또는 PreZent-A 면역증강된 불활성화된 백신으로 접종된 동물에서 매우 명확하다. 그러나, 본 발명의 면역증강제는 E2 단백질에 대해서만 항체 반응을 나타내었고, NS2/3 단백질에 대해서는 항체 반응을 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명의 면역증강제를 포함하는 불활성화된 BVDV 백신으로 접종된 동물은 자연적으로 감염된 동물, 또는 MLV 백신접종된 동물 또는 PreZent-A 백신접종된 동물중 하나와 구별될 수 있다. 이는 동물 모집단에서 이들 유형의 질병의 근절에 소중한 마커-백신으로 간주될 것이다.
실시예 19: 돼지에서의 마이코플라스마 유행성 폐렴
배경
돼지의 마이코플라스마 유행성 폐렴(MPS) 또는 유행성 폐렴은 기침, 성장 지연 및 감소된 사료 효율을 특징으로 하는 널리 퍼져있는 만성 질환이다. 병인학적 원인은 엠. 하이오뉴모니아에이지만, 자연적으로 발생하는 질병은 종종 박테리아와 마이코플라즈마 감염의 조합으로 인해 생겨난다.
MPS는 돼지를 키우는 모든 지역에서 상당한 경제적 손실을 야기한다. 전세계의 다양한 곳에서 수행된 조사는 돼지의 도축시 체중의 30% 내지 80%에서 MPS가 있는 것으로 보이는 이들의 전형적인 병변이 발생한다는 것을 나타낸다. 마이코플라즈마 병변은 돼지가 도축시 체중에 도달하기 전에 분해될 수 있기 때문에, 실제 빈도는 더 높을 수 있다. 만성 돼지 폐렴에서 엠. 하이오뉴모니아에의 보급율은 25% 내지 93%의 범위로 보고되어왔다. 모든 연령의 돼지가 MPS에 걸리기 쉽지만, 질병은 성장기 돼지 및 마무리 돼지에서 가장 흔하다. 현재의 증거는 엠. 하이오 뉴모니아에가 공기에 의해 또는 감염된 돼지의 호흡기 관 분비물에 직접 접촉함으로써 전달되는 것으로 나타났다. 젖을 먹이는 동안 암퇘지로부터 돼지로의 전달이 가능하다. 일단 확립되면, MPS는 감염된 무리에서 매년 발생하고, 그의 심각성은 계절, 통기 및 돼지의 집중도와 같은 환경적 인자에 따라 변화된다.
연구 목적
독성 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 폐 균질화물을 이용한 기관지내 항원공격후 상업적으로 이용가능한 엠. 하이오뉴모니아에의 실험 시리즈의 효과에 대해 본 발명의 신규한 면역증강제와 배합된 엠. 하이오뉴모니아에 백신의 효능을 비교하고자 한다.
동물
엠. 하이오뉴모니아에 및 PRRSV에 의해 야기된 질병 병력이 없거나, 또는 동일한 미생물에 대해 백신 접종된 약 17일된 66마리의 임상적으로 건강한 교배종 돼지를 연구에 이용하였다. 연구소로 선적하기 전, 및 도착한 후 2일 동안, 스트렙 토코코스 수이스와 같은 스트레스 관련된 질병을 예방하기 위해 라벨의 지시에 따라 돼지의 뒷다리에 낙셀(Naxcel: 등록상표)을 근육내 투여하였다. 동물을 무작위 계획에 따라 처리군과 축사에 할당하였다. 연구 디자인은 표 15에 나타나 있다.
[표 15]
실험 디자인
Figure pct00015
수의학 조사 제품( IVP )
항원 및 수의학 조사 제품(IVP)이 표 16에 나타나 있다. 처리군 T02, T03 및 T04에 대한 백신(모두 T05 제외)을 하기 표 16에 도시된 농도의 성분을 이용하여 실시예 13에 따라 제조하였다. 성분을 표에 열거된 순서대로 첨가하였다.
염수 증량제를 용기에 첨가하고, 균질화를 개시하고, 제조 과정동안 계속 균질화시켰다. 불활성화된 엠. 하이오뉴모니아에를 800리터의 최종 배합된 제품당 75리터의 발효물의 블렌딩된 체적으로부터 제조하고, 투여당 0.09375ml의 농도로 첨가하였다. 퀼 A를 표 16에 열거된 농도로 첨가하였다. 그런 다음, 콜레스테롤/에탄올 용액을 첨가하였다. DDA/에탄올 용액을 첨가한 후, 베이 R1005 당지질 용액을 첨가하였다. 그런 다음, 카보폴을 첨가하고, 염수 증량제를 이용하여 용액이 최종 체적이 되게 하였다.
처리군 T05(암피젠(Amphigen)에 근거한 백신 제제)에 대한 백신은 상업적으로 이용가능한 제품인 레스피슈어(Respisure: 등록상표)(화이자 인코포레이티드)였다.
[표 16]
수의학 조사 제품(IVP)
Figure pct00016
백신접종
NTX 처리군의 동물은 백신접종되거나 항원공격되지 않았다. 처리군을 알지 못하는 적임자가 T01, T02, T03, T04 및 T05 군의 약 3주된 동물(제0일, 오른쪽 목) 및 제5주된 동물(제14일, 왼쪽 목)에게 투여당 2mL를 근육내 백신접종하였다.
항원공격 물질
T01 내지 T05군의 동물을 제2 백신접종한지 3주후에 기관내 항원공격하였다(약 8주 - 제35 연구일). 엠. 하이오뉴모니아에 균주 11(LI36)의 10% 동결된 폐 균질물을 프리스(Friis) 매질에 1:50 희석시킨 5mL 투여량으로 동물을 항원공격하였다.
혈액 시료 채취
제-1일 또는 제0일(제1 백신접종 전), 제13일 또는 제14일(제2 백신접종 전), 제34일 또는 제35일(항원공격 전) 및 제63일(부검시), 혈액 시료(혈청 분리 관에서 약 5 내지 10ml)를 모든 돼지로부터 수집하였고, 엠. 하이오뉴모니아에 혈청학에 대해 시험하였다(ELISA-IDEXX).
체중
할당 목적으로 모든 동물을 도착시, 제34일 또는 제35일(항원공격 전) 및 제62일 또는 제63일(부검 전)에 체중을 재었다
부검
제63일에, 모든 살아있는 동물을 장소 특정적 방법에 따라 안락사시켰다. 엠. 하이오뉴모니아에 감염이 원인인 특징적 병변에 대해 폐를 전체적으로 평가하였고, 엠. 하이오뉴모니아에 항원공격이 원인인 병변에 대해 점수를 매겼다. 폐 병변 점수를 각각의 폐 엽에 대한 폐 병변의 %로서 기록하였다. 각각의 엽(왼쪽 두개골, 왼쪽 중간, 왼쪽 꼬리, 오른쪽 두개골, 오른쪽 중간, 오른쪽 꼬리 및 부속물을 0 내지 100%의 실제값으로 점수를 매겼다. 각각의 폐엽의 %를 병변이 있는 폐의 총 %를 계산하기 위한 가중 식에서 이용하였다. 항원공격전의 제34일 또는 제35일에 6마리의 NTX 동물을 부검하여 폐를 병변에 대해 점수를 매겼다.
폐 병변 점수
병변이 있는 전체 폐의 %를 하기 식을 이용하여 계산하였다: 병변이 있는 전체 폐의 % = 100 X {(0.10x 왼쪽 두개골) + (0.10x 왼쪽 중간) + (0.25x 왼쪽 꼬리) + (0.10x 오른쪽 두개골) + (0.10x 오른쪽 중간) + (0.25x 오른쪽 꼬리) + (0.1x 부속물)}. 분석하기 전에 병변이 있는 전체 폐의 %에 아크사인 제곱근 변환을 적용하였다. 일반적인 선형 혼합 모델을 이용하여 변환된 폐 병변을 분석하였다. 처리 효과를 시험한 후 선험적 대조에 변수 평가의 선형 조합을 이용하였다. 병변이 있는 전체 폐의 유의한(P≤0.10) %의 역 변환된 제곱 자승 평균, 이의 표준 편차 및 이의 90% 신뢰도 간격, 및 또한 최저치 및 최고치를 계산하였다.
결과
하기 표 17의 결과에 나타난 바와 같이, 본 발명의 면역증강제는 면역증강제인 암피겐(등록상표)를 함유한 오일 면역증강된 처리군 T05와 동일하게 작용하였다. 전형적으로 3 미만의 폐 병변 점수가 백신 처리에 의해 부여된 효능을 갖는 것으로 간주된다. 본 발명의 면역증강제의 조합은 모두 이 기준을 만족하고 QCDCR이 개별적인 동물들 중에서 가장 좋은 점수와 범위로 작용하였다.
[표 17]
병변을 갖는 폐의 %
Figure pct00017
실시예 20: 고양이 조류 인플루엔자 바이러스( FAIV )
본 연구에서는 독성 조류 인플루엔자 바이러스 균주를 이용한 항원공격에 의한 본 발명의 면역증강제를 이용한 인플루엔자 바이러스의 효능을 고양이에서 평가하였다.
방법 및 결과
백신접종 전에, 동물은 백신접종 전에 취한 인두중앙부를 문지른 면봉 및 혈청 혈액 시료에 각각 근거하여 인플루엔자 바이러스와 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 둘 모두에 대해 음성인 것으로 측정되었다.
불활성화된 병원성 조류 인플루엔자와 정제된 헤마글루티닌(HA)을 이용하여 실험 백신을 배합하였다. 각각의 처리군은 초기에는 6마리의 동물을 함유하였다(표 18). 2개의 처리군에는 실험 FAIV 백신(T01 백신 항체는 정제된 H5 HA 단백질이고; T02 백신 항체는 불활성화된 H5N2 균주였다)을 투여하고, 하나의 처리군에는 불활성화된 개질된 H5N1 바이러스 균주 백신을 투여하고(T03), 하나의 위약 대조군에는 면역증강제만 있는 백신을 투여하고(T04), 하나의 음성 대조군에는 염수만을 투여하였다(T05). 모든 백신을 제0 연구일 및 제21 연구일에 피하 주사로 투여하였다. 투여 체적은 1mL였다. 백신접종후, 동물들을 회수할 때까지 지속적으로 관찰하였고, 부작용이 없음을 보증하기 위해 똑바로 앉을 수 있었다. 백신접종 후 약 1시간에서의 관찰 내용을 기록하고, 백신접종 후 관찰된 임의의 다른 합병증을 기록하였다.
면역증강제 조성물은 상기 실시예에서 전술된 바와 같은 투여당 퀼 A(20㎍), 콜레스테롤(20㎍), DDA(10㎍) 및 카보폴(0.05%)을 이용한 QCDC였다. 항원은 불활성화된 전체 바이러스 또는 정제된 H5 HA 단백질이다.
백신에 대한 주사 부위 반응 및 혈청 반응에 대해 동물을 평가하였다. 3마리의 동물(T02-불활성화된 H5N2 중의 2마리, 및 T05-염수 중의 1마리)를 항원공격하기 전에 선천적 고수산뇨증으로 인해 안락사시켰다. 제49 연구일에, 모든 살아있는 고양이를 균주 H5N1 A/베트남/1194/04를 이용한 기관지내 경로를 통해 항원공격하여 백신 후보자의 효능을 평가하였다. 동물을 105 TCID50을 함유한 5.0mL의 물질로 항원공격하고, 이는 기관경을 이용하여 기관지로 도입되는 작은 카테터를 이용하여 분기 바로 위로 방출된다. 항원공격 후 5일동안 동물을 관찰하고 시료를 채취하였다. 동물 상 말기(제54 연구일)에, 모든 살아있는 동물을 안락사시키고, 각각 부검하였다.
[표 18]
백신 군
Figure pct00018
백신 접종하기 전 제-14 연구일, 제0, 제21 및 제49 연구일에 혈청 시험을 위해 혈액 시료를 수집하였다. 제49 및 제54 연구일에, 혈액 시료를 바이러스 시험을 위해 수집하였다. 제42 연구일에, 예정에 없던 혈액 시료를 모든 살아있는 동물에게서 채취하여 항원공격 전에 혈청에 미치는 신장 기능을 검사하였다.
인두중앙부를 문지른 면봉을 항원공격전 제-14 연구일, 제49 연구일 및 제50 내지 제54 연구일에 모든 동물로부터 수집하였다. 직장 면봉을 항원공격전 제49 연구일 및 제50 내지 제54 연구일에 모든 동물로부터 수집하였다. 제49 연구일에 항원공격 직전에 면봉을 수집하였다.
부검하는 동안, 모든 폐엽을 무균 제거하고, 칭량하고, FAIV 감염에 기인한 특징적 병변에 대해 전체적으로 평가하였다. %를 이용하여 폐 경화 정도를 확인하였다. 조직병리학을 위해 왼쪽 폐를 10% 중성-완충된 포르말린으로 고정시켰다. 바이러스 시험을 위해 오른쪽 폐를 수집하여 시료를 채취하였다. 폐에 추가하여 전반적인 건강이상이 있는 신장 시료 및 임의의 조직을 또한 시료 채취하고, 조직병리학을 위해 10% 중성-완충된 포르말린에 저장하였다.
H5N1-특이적 택맨(TaqMan) PCR을 이용하여 혈액 시료, 인두 중앙부 면봉, 직장 면봉 및 폐 조직 시료에서의 바이러스 역가를 측정하였다. 간략하게, 마그나퓨어(MagnaPure) LC 전체 핵산 단리 키트(로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics); 네덜란드 알미르 소재)가 있는 마그나퓨어 LC 시스템을 이용하여 RNA를 단리하고, 실시간 RT-PCR 분석법을 이용하여 인플루엔자 A 바이러스를 측정하였다. 자료를 제어 희석 유니트(CDU: Control Dilution Unit)로서 표현하였다. CDU를 바이러스 저장액에서 생성된 표준 곡선으로부터 측정하고, 바이러스 저장액을 연속적으로 희석시키고, 각각의 희석액을 시험 시료와 동일한 방식으로 핵산 추출하고 택맨 PCR 증폭시켰다.
RT-PCR 양성 인두 중앙부 면봉 및 폐 조직 시료를 또한 매딘 다비 개 신장(MDCK) 세포 상에서 바이러스 단리 및 적정에 의해 분석하였다. 결과를 시료 1ml 또는 1g 당 log10 50% 조직 배양 감염 투여량으로서 표현하였다(log10 TCID50/ml 또는 log10 TCID50/g).
바이러스 중화 및 혈구 응집 억제에 의해 혈장 시료를 분석하였다. 혈구 응집 억제(HI) 분석의 경우, 인플루엔자 균주 베트남 1194/04 (H5N1, 클레이드(clade) 1) 또는 인도네시아 05/2005 (H5N1, 클레이드 2)의 현탁액을 콜레라필트레이트(비브리오 콜레라에 배양액에서 수득)으로 전처리된 혈청 시료의 순차(2배) 희석액과 함께 배양하였다. 후속적으로, 적혈구를 희석액에 첨가하고, 배양후 혈구 응집의 완전 억제를 나타내는 시약의 최대 희석을 HI의 역가로서 정의하였다.
바이러스 중화(VN) 분석은 혈청의 종말점 적정에 근거한다. 간략하게, 일정한 양의 바이러스가 혈청 시료의 연속(2배) 희석물과 함께 혼합되었다. 바이러스 중화는 지시자 세포로서 MDCK 세포를 이용하여 판독되고 적혈구 응집에 의해 가시화되었다. 접종된 세포 배양액의 50%가 적혈구 응집을 나타내는 혈청의 가장 높은 희석비를 취하여 VN 적정의 점수를 매겼다.
부검시 왼쪽 폐를 수집하고 조직병리학을 위해 10% 중성-완충된 포르말린으로 고정시켰다. 조직학 조사를 위해, 고정 후, 조직을 파라핀에 매립시키고, 조직 절편을 준비하고, 헤마톡실린 및 에오신을 이용하여 염색하였다. 관찰된 병리학적 변화에 대한 설명 및 정도를 기록하였다.
결과
5개 처리군의 동물중 어느 것도 제1 및 제2 백신접종 후 주사 부위에서의 임의의 팽윤 또는 통증을 나타내지 않았다. 또한, 주사 부위에서의 피부 이상도 기록되지 않았다. 백신접종 후, 항원공격 전에, 선형 혼합 모델 분석에 의한 처리들 사이에 체온에서 0.1 유의 수준에서의 유의한 차이는 없었다. 1마리의 T01 동물은 제0일의 제1 백신접종 이전 및 이후 며칠동안 열이 있었다(40℃ 초과). 개별적인 동물에서 40℃까지의 산발성 체온 증가가 백신접종 이후(제0일 및 제21일)에 기록되었다. 백신접종과 관련하여 비정상적인 건강 상태는 연구 기간동안 관찰되지 않았다. 항원공격 이전에 선천적인 고수산뇨증으로 인해 3마리의 동물(T02- H5N2의 2마리 및 T05-염수의 1마리)을 안락사시켰다. 모든 처리군에서 여러마리의 동물이 체온 기록기의 이식후 상처 합병증을 나타내었다. 제0일부터 연구가 종료될 때까지 동시 발생되는 처리를 투여하지 않았다.
백신접종된 T01, T02 및 T03 동물은 대조군인 T04 및 T05 동물에 비해 항원공격 후 더 적은 임상 증후를 나타내고, 죽은 동물이 없었다. T01에서는, 한마리의 동물이 항원공격 이후에 증가된 호흡 노력과 우울증을 나타내었다. T01의 나머지 다섯마리중 어느 것도 항원공격후 임의의 비정상적인 건강 상태를 나타내지 않았다. T02(n=4) 및 T03(n=6)에서, 모든 동물은 항원공격후 건강한 상태를 유지하였다. T04(n=6)에서는, 항원공격한지 2일 후에 두마리의 동물에서 첫번째의 비정상적인 임상 징후(우울증 및 증가된 호흡 노력)가 나타났다. 항원공격한지 3일 후에는, T04의 6마리 동물 모두가 우울해했고, 증가된 호흡 노력을 나타내었다. 결론적으로, 복지 이유로 인해 2마리의 동물을 안락사시켜야 했다. 항원공격한지 4일 후(제53일), 1마리의 동물은 죽은 상태로 발견되었고, 나머지 3마리의 T04 동물은 우울증, 증가된 호흡 노력, 제3 눈꺼풀 돌출 및 비강 분비물을 나타내었고, 복지 이유로 안락사시켰다. T05(n=5)에서, 우울증과 증가된 호흡 노력의 첫번째 이상 임상 징후는 항원공격한지 하루 후에 1마리의 동물에서 발견되었다. 항원공격한지 2일 후, 2마리 이상의 동물이 이들 신호를 나타내기 시작했다. 항원공격한지 3일 후, 1마리의 동물이 죽은 상태로 발견되었고, 나머지 4마리의 동물이 우울증, 증가된 호흡 노력 및 제3 눈꺼풀 돌출을 나타내었다. 후속적으로 1마리의 동물을 복지 이유로 안락사시켰다. 항원공격한지 4일 후, 남아있는 3마리의 동물중 한마리에서 호흡 노력이 악화되었고, 나머지 동물은 추가로 비강 분비물을 나타내었다. 모든 3마리의 남아있는 동물을 항원공격한지 4일 후(제53일)에 복지 이유로 안락사시켰다.
항원공격 후, 백신접종된 동물(T01, T02 및 T03)에서 평균 체온은 40.0℃ 미만으로 유지되었다. 대조군 동물(T04 및 T05)에서의 평균 체온은 항원공격한지 하루 후부터 시작하여 40.0℃ 이상으로 증가하였다. 처리군들 사이의 평균 체온의 차이는 선형 혼합 모델 분석에 의해 유의하였다(p=0.0001). 개별적인 동물 자료는 제53일의 산발적인 시점에서 T01, T02 및 T03 동물중 소수에서 체온이 40.0℃ 이상으로 증가하였음을 나타낸다. T01에서, 2마리의 동물은 1회 열이 났다(40.0 내지 40.1℃). T02에서 2마리의 동물이 각각 1회 및 3회 열이 났다(40.0 내지 40.3℃). T03에서, 1마리의 동물은 3회 열이 났다(40.0 내지 40.3℃). T04 및 T05에서, 모든 동물은 제50일과 제51일 사이의 12시간 이상동안 열이 났다.
제1 및 제2 백신접종 이전 및 항원공격 이후에, 인플루엔자 균주 베트남 1194/04(H5N1, 클레이드 1) 및 인도네시아 05/2005(H5N1, 클레이드 2)에 대한 HI 항체 적정을 측정하였다. 검출 하한은 5였다. 백신접종 이전에, 모든 5가지의 처리군의 역가는 5의 하한보다 낮았다. 백신접종 후, 모든 백신접종된(T01, T02 및 T03) 동물은 5 초과의 HI 항체 역가를 전개하였고, 백신접종 이전의 값에 비해 6배 이상 증가된 역가를 나타내었다. T01 및 T03에서, 베트남 1194/04에 대한 역가는 제1 백신접종후 20 내지 160의 범위이고, 제2 백신접종후에는 140 내지 960의 범위이다. T02에서, 베트남 1194/04에 대한 역가는 T01 및 T03에 대한 것보다 낮았고, 제1 백신접종 후에는 5 내지 30의 범위이고, 제2 백신접종후에는 5 내지 70의 범위이다. 인도네시아 05/2005에 대한 HI 항체 역가는 베트남 1194/04에 대한 항체 역가와 유사하였다.
항원공격 전과 후에 취한 혈장 시료를 바이러스 부하에 대해 H5N1-특이적 실시간 RT-PCR에 의해 시험하였다. 모든 동물은 항원공격 이전에는 바이러스 음성 시료를 가졌다. 항원공격 후에는, T01 및 T03 동물의 혈장에서는 바이러스가 검출되지 않았다. 이와는 대조적으로, T02 동물의 25%(4마리중 1마리), T04 동물의 67%(6마리중 4마리) 및 T05 동물의 60%(5마리중 3마리)는 항원공격 후 혈장에서 바이러스 양성이었다. 처리들 사이의 차이는 선형 혼합 모델 분석에 의해 유의하였다(p=0.0247).
항원공격후의 바이러스 발산을 실시간 RT-PCR 및 바이러스 적정에 의해 목 면봉 시료에서, 그리고, 실시간 RT-PCR에 의해 직장 면봉 시료에서 평가하였다. 목에서의 바이러스 발산은 항원공격후 T01 동물에서 검출되지 않았다. T02에서는, 모든 4마리의 동물(100%)이 항원공격후 1회 바이러스를 발산하였다. T03에서는, 6마리의 동물중 총 2마리(33%)가 항원공격후 바이러스를 발산하였다. T04에서는, 6마리의 동물중 총 3마리(50%)가 항원공격후 바이러스를 발산하였다. T05에서는, 6마리의 동물중 4마리(80%)가 항원공격후 바이러스를 발산하였다. 항원공격한지 5일 후, T04 및 T05의 모든 동물이 죽었기 때문에, T04 및 T05 동물에서는 시료를 취하지 않았다. 그러나, 통계학적 분석 목적으로, 죽거나 최종 연구일 이전에 안락사시킨 동물의 최종 시험 결과를 연구 마지막 날까지 갖고갔다.
RT-PCR 양성 결과(1.8 이상의 CDU)를 갖는 목 시료를 또한 바이러스 역가 분석에 이용하였다. 바이러스 역가는 모든 RT-PCR 양성 시료가 감염성 인플루엔자 바이러스를 함유하였음을 확인시켰다(자료는 도시되지 않음). 감염성 바이러스 역가는 대조군 동물(T04 및 T05)에 비해 백신접종된 동물(T02 및 T03)에서 더 낮았다. 이들 차이는 T02 또는 T03을 T04와 비교하였을 때 항원공격한지 3일 후에 유의하였고, T02 또는 T03을 T05와 비교하였을 때에는 항원공격한지 3일, 4일 및 5일 후에 유의하였다. T02 및 T03 동물에서의 역가는 0.5 log10TCID50이었다. T04에서 나타난 역가는 2.3 내지 4.3 log10TCID50이었다. T05에서 나타난 역가는 1.5 내지 3.8 log10TCID50이었다.
직장 면봉에 의해 평가된 변에서의 발산은 항원공격한지 3일 또는 4일 후의 T02를 제외한 모든 처리군에서 검출되었다. RT-PCR에 의해 검출된 바이러스의 양은 T01에서는 2.2 내지 2.3 log10CDU이었고, T03에서는 3.2 log10CDU이었고, T04에서는 2.0 내지 2.7 log10CDU이었고, T05에서는 2.2 log10CDU이었다. 항원공격 후의 임의의 날에서 처리군들 사이에서 0.1의 유의 수준에서의 유의한 차이가 없었다.
폐 건강 이상은 대조군 동물(T04 및 T05)에 비해 백신접종된 동물(T01, T02 및 T03)에서 덜 심각하였다. 모든 백신접종된 동물은 가벼운, 다초점의 아급성 합포체(bronchointerstitial) 폐렴을 나타냈다. 대조군 동물은, 확산 분포를 나타냈던 2마리의 대조군 동물(한마리의 T04 동물 및 한마리의 T05 동물)을 제외하고는, 다초점 분포를 갖는 가벼운(2마리의 T04 동물 및 1마리의 T05 동물) 또는 심각한(4마리의 T04 및 4마리의 T05 동물) 아급성 합포체 폐렴을 나타내었다. 전체 폐 조직의 폐 경화%로 표현된 폐 경화 정도에 대해 전체 폐를 평가하였다. 폐 병리학 발견과 일치하게, 폐 경화 %는 대조군 동물(T04 및 T05)에 비해 백신접종된 동물(T01, T02 및 T03)에서 상당히 더 낮았다.
사망 또는 안락사 시점에서 수집된 폐 조직에서의 바이러스 부하를 바이러스 역가 및 H5N1 RT-PCR에 의해 평가하였다. 백신접종된 동물(T01, T02 및 T03)에서 나온 폐 조직은 대조군(T04 및 T05)에서 나온 것에 비해 상당히 더 낮은 평균 바이러스 역가를 가졌다. 백신접종된 동물(T01, T02 및 T03)에서 나온 폐 조직에서 평균 역가 사이에는 유의한 차이가 없었다. RT-PCR에 의한 분석이 동일한 결과를 나타내었다.
매우 병원성인 H5N1 조류 인플루엔자 균주를 이용한 항원공격 이후, 열, 치사, 바이러스혈증, 목과 변에서의 바이러스 발산, 폐의 바이러스 감염, 및 폐 경화를 비롯한 폐 병리학을 포함하는 임상 징후가 면역증강제가 투여된 대조군 동물(T04) 또는 염수가 투여된 대조군 동물(T05)에서 관찰되었다.
정제된 H5 HA 단백질을 이용한 백신접종(T01)은 매우 병원성인 H5N1 조류 인플루엔자 균주를 이용한 항원공격 후 6마리의 어린 고양이에서의 바이러스혈증, 목에서의 바이러스 발산 및 치사를 방지하였다. 또한, 정제된 H5 HA 단백질(T01)을 이용한 백신접종(T01)은 열, 폐의 바이러스 부하, 경화를 비롯한 폐 건강 이상을 포함한 임상 징후를 감소시켰다.
불활성화된 H5N2 균주를 이용한 백신접종(T02)은 고 병원성 H5N1 조류 인플루엔자 균주를 이용한 항원공격 후, 4마리의 어린 고양이에게서 임상 징후, 변에서의 바이러스 발산 및 치사를 방지하였다. 또한, 불활성화된 H5N2 균주를 이용한 백신접종(T02)은 바이러스 혈증, 열, 목에서의 바이러스 발산, 폐의 바이러스 부하 및 경화를 비롯한 폐 건강 이상를 감소시켰다.
불활성화된 H5N1 균주(T03)를 이용한 백신 접종은 고 병원성 H5N1 조류 인플루엔자 균주를 이용한 항원공격후 6마리의 어린 고양이에서 임상 징후, 바이러스혈증 및 치사를 방지하였다. 또한, 불활성화된 H5N1 균주(T03)를 이용한 백신 접종은 열, 목으로부터의 바이러스 발산, 폐에서의 바이러스 부하, 및 폐 경화를 비롯한 폐 건강 이상을 감소시켰다.
요약
불활성화된 HA 항원 또는 정제된 HA 항원중 하나와 QC/DC 면역증강제를 이용하여 배합된 백신을 이용하였을 때 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다. 백신은 백신접종된 고양이에게 임상 질병 및 치사의 완전한 보호, 혈액과 조직의 상당히 감소된 바이러스 부하 및 상당히 감소된 바이러스 발산을 제공하였다.
실시예 21: 암
배경
본 연구는 이소성 및 동소성 모델을 생성하기 위해 인간과 래트의 간세포 암종 세포를 이용한 면역결핍 및 면역적격 래트에서 수행되었다.
동물
6 내지 8주된 누드(Crl: NIH-rnu) 수컷 래트를 찰스 리버(Charlse River)(매사추세츠주 윌밍턴 소재)에서 구입하였다. 래트를 폴리카보네이트 마이크로-격리 우리에 쌍으로 넣고, 역삼투수 및 방사선 조사한 표준 래트 먹이를 임의로 제공하였다; 모든 물과 깔집은 오토클레이브 처리하였다. 체중을 매주 2회 기록하고; 동물을 약 7주동안 유지시키고, 실험 끝에 CO2 흡입시켜 안락사시켰다.
실험 디자인은 2개의 상을 혼입한다. 제I상에서, 래트를 체중에 따라 2개의 군으로 임의 추출하였다. 제1군의 래트에게는 암 세포를 주입하지 않았고, 제2군의 래트에는 종양 세포를 피하 주입하였다. 종양을 주입한지 3주 후에, 제2군의 래트를 II상을 위해 2개의 군으로 임의 추출하였고(종양 크기 및 흡수 속도 기준: 표 19 참조), 이중 하나는 다음과 같은 2개의 아군을 포함하였다: 1) 염수가 투여된 비-종양 보유 대조군(대조군); 2) 단지 면역증강제로 처리된 종양 보유 대조군(종양 군) 및 3) 백신이 투여(2주 간격을 두고 2회의 피하 주사)된 종양 보유 대상(종양 처리군). 모든 동물을 제2 백신 투여한 후 14일째에 부검하였다.
백신
투여당 0.2ml를 피하 주사하여 백신을 투여하였다.
[표 19]
백신 군
Figure pct00019
백신 제제
백신은 당지질인 베이 R1005(등록상표)(1,000㎍/투여) 및 항원이 있거나 없이, 퀼-A(20㎍/투여), 콜레스테롤(20㎍/투여), DDA(10㎍/투여), 카보폴(0.05%)를 이용하여 제조되었다. 균질화기를 이용하여 조성물을 블렌딩하고, 상기 언급된 첨가 순서로 첨가하였다.
항원 제제
HepG2 세포(클론 HB-8065)를 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 버지니아주 매나사스 소재)에서 수득하였다. HepG2는 잘 분화된 간세포 암종을 갖는 15살 백인 남아의 간 조직으로부터 유래된 영구 세포주이다. 세포를 표준 세포 배양 조건하에서 확장시키고, 매트리겔 중의 1x107 세포/ml의 농도로 주사를 위해 준비하였다. 각각의 래트에 0.5ml의 세포 현탁액을 두번째 젖꼭지 부위에 피하 주사하였다.
측정
캘리퍼 방법으로 연구 기간동안 매주 2회 종양 크기를 측정하였고, 여기서 체적(cm3)은 {[(W(mm) x W(mm)]/2 x L(mm)}/1000이었다. 혈청 화학 및 바이오마커 측정을 위해 안와 후방 채혈에 의해 혈액을 수집하였다. 채혈 과정동안 CO2/O2로 동물을 가볍게 마취시켰다. 히타치(Hitachi) 917 자동 분석기(로슈, 인디아나주 인디아나폴리스 소재)를 이용하여 화학적 종말점을 분석하였다. 심장 천공에 의해 CO2 마취하에서 말단 혈액(terminal blood)을 취하였다. 하기의 상업적인 ELISA 분석을 이용하여 혈청 종말점을 평가하였다: 알파-페토 프로테인(Alpha-Feto Protein)(R & D 시스템스, 미네소타주 미네아폴리스 소재) 및 인간 알부민(베틸 래보레이토리즈, 텍사스주 몽고메리). CO2 흡입시켜서 동물을 마취시켰다. 종양을 절제하고, 칭량하고, 병리학을 위해 포르말린에 두었다.
스튜던츠 독립표본(unpaired) t-검정을 이용하여 처리된 래트와 대조군 래트 사이의 다양한 변수를 비교하였다. 모든 값은 평균 ± SD로서 표현되고, 0.05 미만의 p 값이 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다.
결과
종양 중양(체적 자료 및 1cm3이 1g이란 추정에 근거함)을 빼서 체중 측정치를 보정하였다. 자료를 2가지 방식으로 분석하였다: 처리군의 경우 및 종양 또는 비-종양 보유 동물. 종양 보유 동물의 체중을 비-종양 보유 동물과 비교할 때, 종말 점에서 군들 사이에 상당한 차이가 있었고, 기저선에는 차이가 없었다. 아마도 연구 기간이 짧기 때문에 처리군과 비교하였을 때 체중이 유의하게 차이가 나지 않았음에도 불구하고, 대조군에 비해 종양 보유 군 둘 모두에서 체중이 감소되는 인지될만한 경향이 있었고, 항원이 없는 비히클이 투여된 종양 보유 동물과 비교하였을 때 백신 접종된 동물에서 회복되는 긍정적인 경향이 있었다(표 20). 또한, 실험 기간 동안의 체중의 변화%와 종양 체적(r2 = 0.72) 또는 종말시의 중량(절제된)(r2 = 0.73) 사이에 적당한 상관성이 있었다.
[표 20]
실험 군 사이의 시간 경과에 따른 체중의 변화. 빗금친 부분은 백신이 투여된 날짜를 나타낸다
Figure pct00020
종양 크기
4주의 기간에 걸쳐 대조군의 종양 크기를 백신 처리된 래트의 종양 크기와 비교하였다. 비록 (종양 크기의 편차가 크기 때문에) 비교된 군들 사이에서 통계학적으로 유의한 차이는 발견되지 않지만, 전체 종양 체적이 감소하는 강향 경향이 있었고(표 21), 또한 백신이 투여된 래트에서 절제된 평균 종양 중량이 감소되는 강한 경향이 있었다(표 22).
[표 21]
비히클 처리된 군(종양)과 백신으로 처리된 군(종양 처리군) 사이의 종양 크기의 변화. 빗금친 부분은 백신이 투여된 날짜를 나타낸다
Figure pct00021
[표 22]
부검시 종양 중량의 차이
Figure pct00022
혈청 분석
인간의 알파-페토 단백질(AFP)을 연구 기간동안 다양한 시점에서 ELISA에 의해 측정하였다. 이들 자료를 체중 및 종양 크기 자료와 함께 이용하여 동물을 처리군으로 임의 배정하였다. 이 연구에서 나온 자료와 병력 자료는 AFP가 종양 보유 동물에서만 검출가능함을 나타낸다. 종양 대조군 및 처리군에서 길이방향 AFP 자료를 비교하면 AFP가 제1 백신 주사후에 처리된 동물에서 감소되고, 연구 종료시에 종양 보유 대조군에 비해 처리된 래트에서 훨씬 더 낮다(비히클 처리된 군에서는 4.78±3.2ng/ml인 반면, 백신 처리된 래트에서는 0.97±2.5ng/ml임)는 것을 나타낸다. 또한, AFP는 종양 체적과 절제된 종양 중량 둘 모두에 대한 연관성을 입증하였다.
인간 알부민(hALB)은 연구 기간동안 다양한 시점에서 ELISA에 의해 측정되었다. 이 연구에서의 자료 및 병력 자료는 hALB가 종양 보유 동물에서만 검출됨을 나타낸다. 종양 대조군과 처리군에서의 hALB 자료의 비교는 hALB가 연구 말기에 종양 보유 대조군에 비해 처리된 래트에서 더 낮다는 것을 나타낸다(자료는 도시되지 않음). 또한, hALB는 AFP와 유사하게, 종양 체적과 절제된 종양 중량 둘 모두에 대한 연관성을 나타내었다(자료는 도시되지 않음).
중심 혈청 화학 패널을 연구 기간에 걸친 다양한 시점에서 분석하였다. 패널은 AST, ALT, 콜레스테롤, 알칼린 포스파타제, GGT, BUN, 글루코스, 크레아티닌, 총 빌리루빈, 총 단백질, 알부민, 글로불린 및 무기질 Ca, P, Na, K 및 Cl을 포함한다. 체중과 유사하게, 자료를 다음과 같은 2가지 방식으로 분석하였다: 처리군 기준, 및 종양 보유 동물 또는 비-종양 보유 동물. 차이가 관찰된 유일한 종말점은 AST, ALT 및 콜레스테롤이었다. 둘 모두의 비교에 의해, 기저선 시점에서 군들 사이에는 유의한 차이가 없었다(자료는 도시되지 않음). 종양 보유 동물의 화학 지수를 비-종양 보유 동물과 비교하면, 종양 보유 동물에서 AST, ALT 및 콜레스테롤이 상승되는 종말 시점이 군들 사이에 상당한 차이가 있었다(자료는 도시되지 않음).
결론
우리의 자료를 함께 살펴보면, 비히클이 투여된 대조군 종양-보유군에 비해, HepG2 종양 세포주에 대해 준비된 백신으로 처리된 동물에서 종양 부담이 감소되었음이 입증되었다.
실시예 22: CpG
배경
본원에 개시된 면역증강제는 CpG에 대한 전달 시스템으로서 면역증강제를 이용함으로써 면역 반응을 부스팅하기 위해 ORN/ODN(CpG)를 이용함으로써 개션될 수 있는 강력한 백신 면역증강제 플랫폼(platform)이다.
재료 및 방법
약 18 내지 20g의 체중을 갖는 암컷 C57B1/6 마우스(1개 군당 10마리)를 본 연구에 이용하였다. 제0, 제14 및 제21 연구일에 총 체적 50㎕를 왼쪽 경골근 전반 근육에 근육내(IM) 주사함으로써 이들을 면역시켰다.
시약 투여량
다양한 조합의 투여 조성물은 하기 성분중 하나 이상을 포함한다:
완충액: WFI에 용해되고 0.1 ㎛ 멸균 필터로 여과된 NaH2PO4·2H20(229.32 mg/L), NaCl (1168.00 mg/L) 및 Na2HPO4(1144.00 mg/L).
오브알부민(OVA - 항원): 10㎍
CpG ODN: 10㎍
콜레스테롤: 1㎍
퀼 A: 1㎍
DDA: 0.5㎍
카보폴: 0.0375%
R1005: 50㎍
백신 제제
완충액을 교반 막대가 있는 50ml 플라스크에 넣고 모든 후속 단계 내내 일정한 속도로 교반하였다. 성분들을 다음 순서로 첨가하였다: 항원(OVA); CPG ODN; 퀼 A; 콜레스케롤(적가식); DDA (적가식); 카보폴(등록상표) 및 베이 R1005(등록상표). 조성물을 최소 30분동안 실온(약 25℃)에서 교반하고, 이동한 호일로 싸서 빛으로부터 보호하였다. 균일한(탁한) 현탁액을 수득하기 위해 임의의 큰 부유 입자가 파괴되도록 25G 바늘을 통해 용액을 주사기로 빨아 당기고, 저장을 위해 멸균 유리 바이얼에 옮겼다.
시료 수집
하기 시료를 수집하였다:
혈장: 1차 백신접종한 지 4주 후(2차 부스터 백신 접종한 지 1주 후)
세포독성 T 림프구(CTL)(1차 백신 접종한 지 6주 후(2차 부스터 백신 접종한 지 3주 후))
상층액에서의 사이토카인 분비(1차 백신접종한 지 4주 후)
24시간 상층액(IL-2, IL-4, IL-10, TNF)
72시간 상층액(IFN-g)
사량체(1차 백신접종한 지 4주 후)
사이토카인 생산 T 세포(1차 백신접종한 지 6주 후)
결과를 면역증강제의 효과를 나타내는 각각의 면역증강제에 대한 상대적인 점수로서 제공하였다. 종말점은 개별적인 세포독성 T-림프구 반응의 합에 근가한 상대적인 규모이다.
결과 및 논의
표 23에 제공된 바와 같이, QCDCR + OVA는 그의 하위 구성성분에 비해 더 강한 CTL 반응을 생성하지만, 전반적인 반응은 낮았다(20% 미만). QCDCR 또는 이의 하위 구성요소와 CpG와의 조합이 가장 높은 CTL 반응을 생성하지만, 이 군과 콜레스테롤/CpG + OVA(25:1의 비에서) 사이에는 반응에 있어 유의한 차이가 없었다. OVA(1mg/ml)로 자극된 비장 림프구에서 나온 배양 상층액을 ELISA에 의해 사이토카인에 대해 분석하였다. QCDCR 단독 또는 이의 하위 구성성분은 단지 매우 약한 사이토카인 반응만을 생성하였다. QCDCR 또는 이의 하위 구성성분의 CpG와의 조합은 항원 특이적 IL-2 및 IFN-g(Th1-편향된 사이토카인)의 분비를 증가시켰다. QCDCR 및 CpG는 세포 면역 반응을 증대시키기 위한 능력에 있어 동일하다. 2개의 조합은 상승효과를 나타낸다. QCDCR의 하위 구성성분을 CpG와 함께 분석하였을 때, 퀼 A와의 조합이 가장 좋은 반응을 생성하였고, 그 뒤를 CpG와 콜레스테롤의 조합이 따랐다.
[표 23]
상대적인 CTL 반응
Figure pct00023
실시예 23: 개 코로나바이러스( CCV )
범위
개 코로나바이러스(CCV) 및 신규한 조합 면역증강제를 이용하고 설치류 모델을 이용하여 주어진 항원 성분에 대한 면역증강제의 작용을 평가하였다.
동물
처리군 당 10마리의 CF-1 마우스에게 각각의 처리군의 동물 1마리당 0.2ml를 피하 투여하였다.
처리군
표 24에 도시된 시험 제제는 하기에 주어진 농도를 갖는 1.0ml의 필드 투여 체적으로서 제조되었다. 단지 0.2ml의 백신을 각각의 마우스에 투여하였다.
[표 24]
시험 제제
Figure pct00024
백신 제조
본 발명의 면역증강제를 위한 백신 제조는 상기 실시예 1 내지 13에 개시되어 있다. 면역증강제 성분의 농도는 표 24에 제공되어 있다. 면역증강제는 표에 열거된 순서로 첨가되었다.
염수 증량제를 용기에 첨가하고, 균질화를 개시하였다. 불활성화된 CCV를 표 24에 도시된 농도로 첨가하였다. 퀼 A를 표 24에 도시된 농도로 첨가하였다. 그럼 다음, 에탄올 중의 콜레스테롤 용액을 계속 균질화하면서 첨가하였다. 그런 다음 균질화하는 동안 DDA/에탄올 용액을 첨가하였다. 혼합물을 10,000psi에서 미세유체화하였다. 그런 다음, 혼합하면서 카보폴을 첨가하고, pH를 6.8 내지 7.2로 조절하였다. 그런 다음, 베이 R1005(등록상표) 당지질을 혼합하면서 첨가하였다. 최종적으로 염수 증량제를 이용하여 조성물이 최종 체적이 되게 하였다.
상업적으로 이용가능한 AbISCO 제품(이스코노바(Isconoa), 스웨덴)이 투여되는 처리군용 백신을 라벨의 지시에 따라 제조하였다. AbISCO 제품은 퀼라자 사포닌 및 매우 정제된 사포닌을 이용하는 ISCOM 기법에 근거한다.
분석 방법: 베타 CCV 혈청 중화
56℃에서 30 내지 40분동안 혈청을 열 불활성화시켰다. 깨끗한 멸균 플레이트에서, 120㎕를 120㎕ 희석제에 가함으로써 각각의 혈청을 연속 희석시켰다(희석되지 않음, 2배 희석, 4배 희석, 8배 희석...). 최소한 2벌의 웰/희석을 이용하였다. 필요한 경우, 처음에 1:16의 희석을 이용하였다. 살아있는 생 CCV를 120㎕에 약 240개의 바이러스 입자를 함유하는 수준으로 희석시킴으로써 작업 항원공격 저장액을 제조하였다. 그런 다음, 총 240㎕의 경우, 120㎕의 각각의 혈청 희석액을 120㎕의 바이러스 용액과 조합하였다. 용액을 혼합하고, 실온(약 25℃)에서 30분 내지 60분동안 중화되도록 유지시켰다. 그런 다음, 120㎕의 각각의 연속적인 희석물을 7 내지 12일 전에 심어둔 NLFK 세포의 대기 네이키드(naked) 단층으로 옮겼다. CPE를 4 내지 6일 후에 분석하였다. 역 적정은 50 내지 316개의 바이러스 입자가 각각의 단층을 맞추었음을 확인하였다.
결과
[표 25]
혈청 중화
Figure pct00025
요약
각각의 성분의 화학적 성질을 고려하여 CCV와 함께 배합된 면역증강제의 조합 효과는 백신 면역증강제에 대한 탁월한 성질을 제공하였다.
연구의 혈청학 결과가 표 25에 도시되어 있다. 더 높은 혈청 중화 항체 역가는 일반적으로 백신에 의해 제공된 더 좋은 보호와 관련되어 있다. 본 발명의 여러 면역증강제 제제는, 심지어 이들 제제가 유사한 양의 첨가된 CCV 항원을 갖고 있는 경우에 조차, 시판되는 면역증강된 제품에 비해 훨씬 더 높은 역가를 생성하였다. QCDC, QCR, DRC, QCRC 및 QCDRC 제제가 마우스에서 우수한 면역 반응을 유도하는데 특히 효과적이었다.
실시예 24: 소의 로타바이러스 항원
범위
소의 로타바이러스 및 본 발명의 조합 면역증강제를 이용하고 설치류 모델을 이용하여 주어진 항원 성분에 대한 면역증강제의 성능을 평가하였다.
동물
처리군 당 10마리의 CF-1 마우스에게 각각의 처리군의 동물 1마리당 0.2ml를 피하 투여하였다.
처리군
표 26에 도시된 시험 제제는 하기에 주어진 농도를 갖는 2.0ml의 필드 투여 체적으로서 제조되었다. 단지 0.2ml의 백신을 각각의 마우스에 투여하였다.
[표 26]
시험 제제
Figure pct00026
백신 제조
본 발명의 면역증강제를 위한 백신 제조는 상기 실시예 1 내지 13에 개시되어 있다. 면역증강제 성분의 농도는 표 26에 제공되어 있다. 면역증강제는 표에 열거된 순서로 첨가되었다.
염수 증량제를 용기에 첨가하고, 균질화를 개시하였다. 불활성화된 소 로타바이러스를 표 26에 도시된 농도로 첨가하였다. 퀼 A를 표 26에 도시된 농도로 첨가하였다. 그럼 다음, 콜레스테롤/에탄올 용액을 계속 균질화하면서 첨가하였다. 그런 다음 균질화하는 동안 DDA/에탄올 용액을 첨가하였다. 혼합물을 10,000psi에서 미세유체화하였다. 그런 다음, 혼합하면서 카보폴을 첨가하고, pH를 6.8 내지 7.2로 조절하였다. 그런 다음, 베이 R1005(등록상표) 당지질을 혼합하면서 첨가하였다. 최종적으로 염수 증량제를 이용하여 조성물이 최종 체적이 되게 하였다.
상업적으로 이용가능한 AbISCO 제품(이스코노바(Isconoa), 스웨덴)이 투여되는 처리군용 백신을 라벨의 지시에 따라 제조하였다. AbISCO 제품은 퀼라자 사포닌 및 매우 정제된 사포닌을 이용하는 ISCOM 기법에 근거한다.
결과
[표 27]
혈청 중화 역가
Figure pct00027
각각의 성분의 화학적 성질을 고려하여 소 로타바이러스와 함께 배합된 면역증강제의 조합된 효과는 백신 면역증강제에 대한 우수한 성질을 제공하였다(표 27 참조).
여러 면역증강제 제제가 유사한 수준의 혈청 중화 항체 역가를 제공하였지만, QCDCR 면역증강제가 가장 높은 수준을 제공하였다.
실시예 25: 개 인플루엔자 바이러스
범위/연구 디자인
개 모델을 이용하고 개 인플루엔자 바이러스(CIV) 및 신규한 조합 면역증강제를 이용하여 주어진 항원 성분에 대한 면역증강제의 성능을 평가하였다.
본 연구는 무작위 완전 블록 디자인을 가졌다(표 28 참고). 동물을 출생일로 분류하여 5개 크기의 블록을 형성하였다. 블록 이내에서 동물을 무작위로 처리군에 할당하였다. 동일한 블록의 동물을 서로 가까이 위치한 우리에 무작위 할당하였다. 동물은 상업적으로 시판되는 백신에 대한 과민감성 이력이 없는 건강한 상태였다. 동물은 CIV에 대한 백신이 접종되지 않았다.
[표 28]
연구 디자인
Figure pct00028
[표 29]
백신 조성
백신 제조
본 발명의 면역증강제를 위한 백신 제조는 상기 실시예 1 내지 13에 개시되어 있다. 면역증강제 성분의 농도는 표 29에 제공되어 있다. 면역증강제는 표에 열거된 순서로 첨가되었다.
염수 증량제를 용기에 첨가하고, 균질화를 개시하였다. 불활성화된 개 인플루엔자 바이러스를 표 29에 도시된 농도로 첨가하였다. 퀼 A를 표 29에 도시된 농도로 첨가하였다. 그럼 다음, 콜레스테롤/에탄올 용액을 계속 균질화하면서 첨가하였다. 그런 다음 균질화하는 동안 DDA/에탄올 용액을 첨가하였다. 혼합물을 10,000psi에서 미세유체화하였다. 그런 다음, 혼합하면서 카보폴을 첨가하고, pH를 6.8 내지 7.2로 조절하였다. 최종적으로 염수 증량제를 이용하여 조성물이 최종 체적이 되게 하였다.
시험
USDA에 따른 표준 분석 방법에 의해 혈구 응집 억제(HAI) 분석을 이용하여 혈청학을 평가하였다.
결과/요약
제42일 및 제180일의 HAI 기하 평균 역가로서의 THE 혈청학 결과가 표 30에 제시되어 있다.
[표 30]
HAI 역가
Figure pct00030
각각의 성분의 화학적 성질을 고려하여 인플루엔자 바이러스와 배합된 면역증강제의 조합된 효과는 백신 면역증강제에 대해 탁월한 성질을 제공하였다.
더 높은 항체 역가는 일반적으로 더 우수한 백신 보호와 관련되어 있다. 일반적으로 알루미늄 면역증강제(T02)와 본 발명의 면역증강제(T03, T04 및 T05)는 HAI 역가를 상승시키지만, 본 발명의 면역증강제에 의해 야기된 반응이 더 우수하였고, 고 용량 군(T05)에서 제180일에서의 역가가 더 높았다. 본 발명의 면역증강제의 저 용량 및 중간 용량에 대한 역가는 종래의 인플루엔자용 알루미늄-함유 백신과 등가였다. 또한, 본 발명의 면역증강제가 1형 T 헬퍼(helper) 면역 반응을 제공하는 반면, 알루미늄은 이를 제공하지 않기 때문에, 면역의 지속 기간이 더 길고 더 빠른 소환 기작을 가질 것으로 예상된다.
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. <120> NOVEL ADJUVANT COMPOSITIONS <130> PC33245A <140> PCT/IB2009/052724 <141> 2009-06-24 <150> US 61/076,232 <151> 2008-06-27 <150> US 61/214,557 <151> 2009-04-24 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggtggtgcta agcgtgttat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acctctgtca tctctccaca 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agctgacggt ggacctatta tt 22 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggctttgcgc tggattc 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgggcatcaa gggctaca 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcgggttggt tggtgatg 18 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tctgttcttc tgttctgagt gatg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agtgatttgc ttctgtcttt ggta 24

Claims (90)

  1. 사포닌, 스테롤, 4차 암모늄 화합물 및 중합체를 포함하는 면역증강제 배합물, 및 면역 효과량의 항원 성분을 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    사포닌이 투여당 약 1㎍ 내지 약 5,000㎍의 양으로 존재하고, 스테롤이 투여당 약 1㎍ 내지 약 5,000㎍의 양으로 존재하고, 4차 암모늄 화합물이 투여당 약 1㎍ 내지 약 5,000㎍의 양으로 존재하고, 중합체가 투여당 약 0.0001%(v/v) 내지 약 75%(v/v)의 양으로 존재하는 면역원성 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    사포닌이 퀼 A 또는 이의 정제된 분획이고, 스테롤이 콜레스테롤이고, 4차 암모늄 화합물이 다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드(DDA)이고, 중합체가 폴리아크릴산인 면역원성 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    Th2 자극제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    Th2 자극제가 당지질인 면역원성 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    Th2 자극제가 N-(2-데옥시-2-L-루실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아미드 아세테이트인 면역원성 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    당지질이 투여당 약 0.01mg 내지 약 10mg의 양으로 존재하는 면역원성 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    항원 성분이 불활성화된 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  9. a) 완충액중의 항원 성분의 조성물을 제조하는 단계,
    b) 단계 a)의 조성물에 사포닌을 첨가하는 단계,
    c) 단계 b)의 조성물에 스테롤을 첨가하는 단계,
    d) 단계 c)의 조성물에 4차 암모늄 화합물을 첨가하는 단계,
    e) 단계 d)의 조성물에 중합체를 첨가하는 단계
    를 포함하는, 제 1 항의 면역원성 조성물의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    사포닌이 퀼 A 또는 이의 정제된 분획이고, 스테롤이 콜레스테롤이고, 4차 암모늄 화합물이 DDA이고, 중합체가 폴리아크릴산인 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    단계 a)의 조성물을 균질화시키고, 단계 a) 내지 d) 각각 동안 계속 균질화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    단계 d)의 조성물을 미세유체화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    단계 e)의 조성물에 Th2 자극제를 추가하는 단계 f)를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    Th2 자극제가 당지질인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    Th2 자극제가 N-(2-데옥시-2-L-루실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아미드 아세테이트인 방법.
  16. 사포닌, 스테롤, 4차 암모늄 화합물 및 중합체를 포함하는 면역증강 배합물, 및 치료 효과량의 항원 성분을 포함하는 백신 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    사포닌이 투여당 약 1㎍ 내지 약 5,000㎍의 양으로 존재하고, 스테롤이 투여당 약 1㎍ 내지 약 5,000㎍의 양으로 존재하고, 4차 암모늄 화합물이 투여당 약 1㎍ 내지 약 5,000㎍의 양으로 존재하고, 중합체가 투여당 약 0.0001%(v/v) 내지 약 75%(v/v)의 양으로 존재하는 백신 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서,
    사포닌이 퀼 A 또는 이의 정제된 분획이고, 스테롤이 콜레스테롤이고, 4차 암모늄 화합물이 DDA이고, 중합체가 폴리아크릴산인 백신 조성물.
  19. 제 16 항에 있어서,
    Th2 자극제를 추가로 포함하는 백신 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    Th2 자극제가 당지질인 백신 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    Th2 자극제가 N-(2-데옥시-2-L-루실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아미드 아세테이트인 백신 조성물.
  22. 제 20 항에 있어서,
    당지질이 투여당 약 0.01mg 내지 약 10mg의 양으로 존재하는 백신 조성물.
  23. 제 16 항에 있어서,
    항원 성분이 불활성화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물.
  24. a) 완충액중의 항원 성분의 조성물을 제조하는 단계,
    b) 단계 a)의 조성물에 사포닌을 첨가하는 단계,
    c) 단계 b)의 조성물에 스테롤을 첨가하는 단계,
    d) 단계 c)의 조성물에 4차 암모늄 화합물을 첨가하는 단계,
    e) 단계 d)의 조성물에 중합체를 첨가하는 단계
    를 포함하는, 제 16 항의 백신 조성물의 제조 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    사포닌이 퀼 A 또는 이의 정제된 분획이고, 스테롤이 콜레스테롤이고, 4차 암모늄 화합물이 DDA이고, 중합체가 폴리아크릴산인 방법.
  26. 제 24 항에 있어서,
    단계 a)의 조성물을 균질화시키고, 단계 a) 내지 d) 각각 동안 계속 균질화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    단계 d)의 조성물을 미세유체화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서,
    단계 e)의 조성물에 Th2 자극제를 추가하는 단계 f)를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    Th2 자극제가 당지질인 방법.
  30. 제 28 항에 있어서,
    Th2 자극제가 N-(2-데옥시-2-L-루실아미노-β-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데칸아미드 아세테이트인 방법.
  31. 제 1 항에 있어서,
    오일을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  32. 제 16 항에 있어서,
    오일을 추가로 포함하는 백신 조성물.
  33. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 고양이 백혈병 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  34. 제 9 항 내지 제 15 항 및 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 고양이 백혈병 바이러스를 포함하는 방법.
  35. 제 16 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 고양이 백혈병 바이러스를 포함하는 백신 조성물.
  36. 제 35 항에 있어서,
    고양이 백혈병 바이러스가 약 100ng/ml 내지 약 350,000ng/ml의 양으로 존재하는 백신 조성물.
  37. 제 1 항에 있어서,
    항원 성분이 KT-FeLV-UCD-1 고양이 백혈병 바이러스 균주로 영속적으로 감염된 FL-74 세포주에 의해 생성되는 gp70을 포함하는 백신 조성물.
  38. 제 35 항의 백신 조성물을 고양이에게 투여함을 포함하는 고양이 백혈병 바이러스에 의해 야기된 감염으로부터 고양이를 치료하는 방법.
  39. 고양이 백혈병 바이러스에 의해 야기된 감염으로부터 고양이를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제 35 항의 백신의 용도.
  40. (a) 퀼 A, 또는 QS21을 비롯한 이의 정제된 분획, 콜레스테롤, 카보폴(CARBOPOL), DDA 및 R1005를 포함하는 면역증강제; 및
    (b) (1) 하나 이상의 재조합 발현된 단백질, (2) 종래의 수단에 의해 원생동물로부터 단리된 하나 이상의 단백질 또는 다른 거대분자, 및 (3) 원생동물의 전체 세포 추출물 또는 제제에서 선택되는 원생동물 항원
    을 포함하는, 난내(in ovo) 투여용 조류 콕시디아증 백신.
  41. 제 1 항 내지 제 7 항 및 제 31 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) J-5 균주 박테린을 포함하는 면역원성 조성물.
  42. 제 9 항 내지 제 15 항 및 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 에스케리치아 콜리 J-5 균주 박테린을 포함하는 방법.
  43. 제 16 항 내지 제 22 항 및 제 32 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 에스케리치아 콜리 J-5 균주 박테린을 포함하는 백신 조성물.
  44. 제 43 항의 백신 조성물을 소에게 투여함을 포함하는, 에스케리치아 콜리에 의해 야기되는 감염으로부터 소를 치료하는 방법.
  45. 에스케리치아 콜리에 의한 감염으로부터 소를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한, 제 43 항의 백신 조성물의 용도.
  46. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 소의 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)를 포함하는 면역원성 조성물.
  47. 제 46 항에 있어서,
    항원 성분이 BVDV I형(BVDV-1) 및 BVDV 2형(BVDV-2)을 포함하는 면역원성 조성물.
  48. 제 9 항 내지 제 15 항 및 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 BVDV를 포함하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서,
    항원 성분이 BVDV-1 및 BVDV-2를 포함하는 방법.
  50. 제 16 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 BVDV를 포함하는 백신 조성물.
  51. 제 50 항에 있어서,
    항원 성분이 BVDV-1 및 BVDV-2를 포함하는 백신 조성물.
  52. 제 50 항 또는 제 51 항의 백신 조성물을 소에게 투여함을 포함하는, BVDV에 의해 야기되는 감염에 대해 소를 치료하는 방법.
  53. BVDV에 의한 감염으로부터 소를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한, 제 50 항 또는 제 51 항의 백신 조성물의 용도.
  54. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 마이코플라스마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumonia)를 포함하는 면역원성 조성물.
  55. 제 9 항 내지 제 15 항 및 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 마이코플라스마 하이오뉴모니아를 포함하는 방법.
  56. 제 16 항 내지 제 22 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 마이코플라스마 하이오뉴모니아를 포함하는 백신 조성물.
  57. 제 56 항의 백신 조성물을 돼지에 투여함을 포함하는 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 의한 감염으로부터 돼지를 치료하는 방법.
  58. 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 의한 감염으로부터 돼지를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제 56 항의 백신 조성물의 용도.
  59. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 고양이 인플루엔자 바이러스(FIV)를 포함하는 면역원성 조성물.
  60. 제 9 항 내지 제 15 항 및 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 FIV를 포함하는 방법.
  61. 제 16 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 FIV를 포함하는 백신 조성물.
  62. 제 61 항의 백신 조성물을 고양이에게 투여함을 포함하는, FIV에 의해 야기되는 감염으로부터 고양이를 치료하는 방법.
  63. FIV에 의해 야기되는 감염으로부터 고양이를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제 61 항의 백신 조성물의 용도.
  64. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 암 항원을 포함하는 면역원성 조성물.
  65. 제 9 항 내지 제 15 항 및 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 암 항원을 포함하는 방법.
  66. 제 16 항 내지 제 22 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 암 항원을 포함하는 백신 조성물.
  67. 제 66 항의 백신 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 암으로부터 대상을 치료하는 방법.
  68. 암으로부터 대상을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제 66 항의 백신 조성물의 용도.
  69. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    ORN/ODN을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  70. 제 69 항에 있어서,
    ORN/ODN이 CpG인 면역원성 조성물.
  71. 제 9 항 내지 제 15 항 및 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    ORN/ODN을 단계 a)의 조성물에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  72. 제 71 항에 있어서,
    ORN/ODN이 CpG인 방법.
  73. 제 16 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서,
    ORN/ODN을 추가로 포함하는 백신 조성물.
  74. 제 73 항에 있어서,
    ORN/ODN이 CpG인 백신 조성물.
  75. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 개 코로나바이러스(CCV)를 포함하는 면역원성 조성물.
  76. 제 9 항 내지 제 15 항 및 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 CCV를 포함하는 방법.
  77. 제 16 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 CCV를 포함하는 백신 조성물.
  78. 제 77 항의 백신 조성물을 개에 투여함을 포함하는, CCV에 의해 야기되는 감염으로부터 개를 치료하는 방법.
  79. CCV에 의해 야기되는 감염으로부터 개를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제 77 항의 백신 조성물의 용도.
  80. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원이 소 로타바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  81. 제 9 항 내지 제 15 항 및 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 소 로타바이러스를 포함하는 방법.
  82. 제 16 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 소 로타바이러스를 포함하는 백신 조성물.
  83. 제 82 항의 백신 조성물을 소에 투여함을 포함하는 소 로타바이러스에 의해 야기된 감염으로부터 소를 치료하는 방법.
  84. 소 로타바이러스에 의해 야기된 감염으로부터 소를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제 82 항의 백신 조성물의 용도.
  85. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 개 인플루엔자 바이러스(CIV)를 포함하는 면역원성 조성물.
  86. 제 9 항 내지 제 15 항 및 제 24 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 CIV를 포함하는 방법.
  87. 제 16 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서,
    항원 성분이 CIV를 포함하는 백신 조성물.
  88. 제 87 항의 백신 조성물을 개에 투여함을 포함하는 CIV에 의해 야기된 감염으로부터 개를 치료하는 방법.
  89. CIV에 의해 야기된 감염으로부터 개를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제 87 항의 백신 조성물의 용도.
  90. 시험 동물로부터 시료를 수득하는 단계, 및
    시료에서 E2 단백질 및 NS2/3 단백질의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하며, NS2/3 단백질이 없는 것이 동물이 상기 백신 조성물로 백신접종된 것임을 나타내는, 제 50 항 또는 제 51 항의 백신 조성물로 백신접종된 동물로부터 BVDV로 자연 감염된 동물을 구별하는 방법.
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