BRPI0913954A2 - Composições adjuvantes - Google Patents

Abstract

processo de preparação de uma composição imunogênica e de vacina, composição imunogênica e de vacina, bem como uso das mesmas, vacina de coccidiose aviária e método de diferenciação de um animal naturalmente infectado com bvdv de um animal vacinado. a presente invenção refere-se às formulações adjuvantes compreendendo várias combinações de triterpenoides, esteróis, imunomoduladores, polímeros, e estimuladores de th2; a métodos para produção das composições adjuvantes; e ao uso das formulações adjuvantes nas composições imunogênicas e de vacina com diferentes antígenos. a presente invenção ainda refere-se ao uso das formulações no tratamento de animais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E DE VACINA, COMPO- SIÇÃO IMUNOGÊNICA E DE VACINA, BEM COMO USOS DAS MESMAS, VACI-

NA DE COCCIDIOSE AVIÁRIA E MÉTODO DE DIFERENCIAÇÃO DE UM ANIMAL —NATURALMENTE INFECTADO COM BVDV DE UM ANIMAL VACINADO". Antecedentes da Invenção ' Campo da Invenção A presente invenção refere-se geralmente a novas formulações adju- | vantes para intensificara resposta imune a antígenos para uso em composições imunogênicas e de vacina, sem produção de efeitos colaterais tóxicos ou indesejá- Y veis no paciente. Esta invenção também refere-se aos processos de preparação e uso das composições adjuvantes, imunogênicas, e de vacina.

ã História e Descrição da Arte Relacionada Infecções bacterianas, virais, e parasitárias são frequentes em huma- nose animais. Doenças causadas por estes agentes infecciosos são frequente- mente resistentes à terapia farmacêutica antimicrobiana, não deixando nenhum . mecanismo eficaz de tratamento. Por conseguinte, um processo de vacinologia é cada vez mais usado para controlar doença infecciosa. Um patógeno infeccioso integral pode ser produzido adequadamente para uso em uma formulação de vaci- na depois de inativação química ou manipulação genética apropriada. Alternativa- mente, uma subunidade de proteína do patógeno pode ser expressa em um siste- ma de expressão recombinante e purificada para uso em uma formulação de vaci- na. As vacinas podem ser produzidas mais eficazes por inclusão de um adjuvante apropriado na composição.

Há também um interesse aumentado no uso de um processo de vaci- nologia para tratamento de câncer em animais e humanos. Este processo terapêu- tico para o tratamento de câncer envolve vacinação de pacientes com câncer com uma vacina compreendendo um antígeno específico por tumor e um adjuvante. No entanto, nenhuma das muitas vacinas de câncer desta natureza em desenvolvimen- tofoiaprovada por autoridades reguladoras. As vacinas não demonstraram reduzir os tumores, uma medida padrão de uma eficácia de fármaco de câncer.

O termo 'adjuvante' geralmente refere-se a qualquer material

Y" 2 | o que aumente a resposta imune humoral ou celular a um antígeno. Os adju- vantes são usados para realizar dois objetivos: Eles retardam a liberação de antígenos do sítio de injeção, e eles estimulam o sistema imune. As vacinas tradicionais são geralmente compostas de uma preparação bruta de micro- organismos patogênicos inativados ou mortos ou vivos modificados. As im- purezas associadas com estas culturas de microorganismos patológicos po- dem agir como um adjuvante para intensificar a resposta imune. No entanto, a imunidade evocada por vacinas que usam preparações homogêneas de microorganismos patológicos ou subunidades de proteína purificada como antígenos é frequentemente fraca. A adição de certos materiais exógenos tais como um adjuvante por esse motivo torna-se necessária. Além disso, as vacinas sintéticas e de subunidade são caras para produzir. A adição de um adjuvante pode permitir o uso de uma dose menor de antígeno para es- O timular uma resposta imune similar, desse modo reduzindo o custo de pro- | 15 duçãoda vacina, Desta forma, a eficácia de alguns agentes medicinais inje- a táveis pode ser significantemente aumentada quando o agente é combinado com um adjuvante.

Muitos fatores devem ser levados em consideração na seleção de um adjuvante. Um adjuvante deve causar uma taxa relativamente lenta de liberaçãoe absorção do antígeno de uma maneira eficiente com efeitos tóxicos, alergênicos, irritantes mínimos, e outros indesejáveis ao hospedeiro, Para ser desejável, um adjuvante deve ser não virucida, biodegradável, ca- paz de criar consistentemente um alto nível de imunidade, capaz de estimu- lação de proteção cruzada, compatível com múltiplos antígenos, eficaz em múltiplas espécies, não tóxico, e seguro para o hospedeiro (por exemplo, nenhuma reação do sítio de injeção), Outras características desejáveis de um adjuvante são que ele é capaz de micro-dosagem, é econômico em do- se, possuí excelente estabilidade de prateleira, é receptivo à secagem, pode ser produzido sem óleo, pode existir como ou um sólido ou um líquido, é iso- tônico, é facilmente produzido, e é barato para produzir. Finalmente, é al- tamente desejável para um adjuvante ser configurável a fim de induzir ou uma resposta imune humoral ou celular ou ambas, dependendo dos reque- [E

. + 3 - rimentos do cenário de vacinação. No entanto, o número de adjuvantes que podem alcançar os requerimentos acima é limitado.

' A escolha de um adjuvante depende das necessidades para a vacina, que ele seja um aumento na magnitude ou função da resposta de anticorpo, um aumento na resposta imune mediada por célula, uma indução de imunidade mucosa, ou uma redução na dose de antígeno. Vários adju- vantes foram propostos, no entanto, nenhum demonstrou ser idealmente adequado para todas as vacinas, O primeiro adjuvante relatado na literatura foi Adjuvante Completo de Freund (FCA) que contém uma emulsão de água | 10 emóleoe extratos de micobactéria. Infelizmente, o FCA é parcamente tole- rado e ele pode causar inflamação sem controle. Desde a descoberta do FCA mais de 80 anos atrás, esforços foram produzidos para reduzir os efei- tos colaterais indesejáveis de adjuvantes. o Alguns outros materiais que foram usados como adjuvantes in- cluem óxidos metálicos (por exemplo, hidróxido de alumínio), alume, quela- " tos inorgânicos de sais, gelatinas, vários óleos do tipo parafina, resinas sin- tetizadas, alginatos, compostos de mucoide e polissacarídeo, caseinatos, e substâncias derivadas do sangue tais como coágulos de sangue de fibrina. Embora estes materiais sejam geralmente eficazes na estimulação do siste- maimune, nenhum foi constatado ser totalmente satisfatório devido aos efei- tos adversos no hospedeiro (por exemplo, produção de abcessos estéreis, lesão de órgão, carcinogenicosidade, ou respostas alergênicas) ou proprie- dades farmacêuticas indesejáveis (por exemplo, dispersão rápida ou contro- le fraco da dispersão do sítio de injeção, ou tumefação do material).

Óleos sintetizados e derivados de petróleo foram usados como adjuvantes porque eles exibem dispersão relativamente lenta no corpo, mas eles podem ser indesejáveis quando eles frequentemente são quebrados em hidrocarbonetos aromáticos, que podem ser carcinogênicos. Além disso, algumas destas substâncias foram constatadas serem capazes de produção de abcessos estéreis e podem nunca serem completamente eliminadas pelo corpo. Óleos quando apropriadamente selecionados e formulados em con- centrações adequadas podem ser relativamente seguros e não tóxicos.

* + 4 + As saponinas obtidas de casca da árvore Sul-americana Quillaja saponaria foram usadas como adjuvantes durante algum tempo.

Veja La- Ú caille-Dubois, M and Wagner H. (A review of biological and pharmacological activíties of saponins.

Phytomedicine vol 2 pp 363-386. 1996). Muitas das vacinasde veterinária em uso hoje contêm Quil A, que é à fração de saponi- na da casca da árvore Sul-americana Quillaja saponaria molina.

Além disso, o fracionamento de Quil A produziu subfrações, incluindo QS-7, 08-17, QS- 18, e QS-21. (Veja Patente dos Estados Unidos No. 5.057.540) O uso de saponinas como adjuvantes é associado com várias desvantagens.

As saponinas são solúveis e desta forma estimulam uma resposta imune não específica.

A meta da vacinologia, no entanto, é estimu- lar uma resposta alvejada a um antígeno específico ou antígenos.

As sapo- ninas possuem uma forte afinidade por colesterol.

Elas formam um comple- . xo com o colesterol encontrado nas membranas da célula causando hemóli- | | 15 sedacélula, Elas também demonstraram causar necrose no sítio de injeção " e serem difíceis de formularem-se em estruturas particuladas.

Quando usa- das em vacinas contendo vírus envelopados vivos modificados, as saponi- nas rompem o envelope viral e desse modo inativam os antígenos virais.

Para superar as propriedades hemolíticas e virucidas de Quil A, elafoicombinada com colesterol e fosfolipídeos, que formam uma estrutura específica conhecida como um complexo imunoestimulador (ISCOM) ou ma- triz de ISCOM (ISCOMATRIX). Veja Ozel M., e outros; J.

Ultrastruc. and Mo- lec.

Struc.

Re 102, 240-248 (1989). Os ISCOMs, quando combinados com um antígeno, geralmente induzem uma resposta de célula T citotóxica Th1. Noentanto, embora grandemente reduzindo as propriedades hemolíticas de Quil A, a combinação de Quil A com colesterol não os elimina completamen- te.

Outra limitação de ISCOMs é que um antígeno de proteina deve possuir domínios hidrofóbicos grandes o bastante para interagir com o ISCOM a fim de serem incorporados em um ISCOM.

Uma proteínia que é altamente hi- —drofílica não pode ser incorporada em um ISCOM.

Finalmente, ISCOMs po- dem estimular uma reação autoimune indesejável no paciente, Os imunomoduladores foram usados como adjuvantes, com e-

j a

- xemplos incluindo brometo de amônio de dioctadecila de dimetila (daqui em diante, "DDA"), e avirdina.

O DDA é um composto de amônio quatemário Ú lipofílico (amina) com duas cadeias de alquila de 18 carbonos e dois grupos metila ligados a uma molécula de amônio quaternário positivamente carre- 5 —gadacom um peso molecular de 631. Seu uso como um adjuvante foi des- coberto por Gall, (Immunol.

V. 11, Pp. 369, 1966). O DDA é relatado estimular fortes respostas imunes mediadas por célula, e também demonstrou induzir respostas imunes humorais.

Muitos papéis foram publicados mostrando efi- cácia de DDA como um adjuvante para antígenos de proteína, haptenos, tumores, vírus, protozoários e bactérias. (Veja Korsholm, K S., e outros, Im- munology, vol. 121, pp. 216-226, 2007.) À maior parte dos estudos têm sido desempenhado em animais de laboratório, embora apenas alguns tenham sido realizados em animais maiores tais como frangos (Veja Katz, D., e ou- tros FEMS Immunol! Med Microbiol.

Vol 7(4):303-313, 1993.), porcos, e gado.

ODDAé eficaz na indução de uma reação de hipersensíibilidade do tipo re- tardada (DTH) em ambos os animais de laboratório e grandes animais.

No entanto, ele é parcamente solúvel em água.

Os polímeros também foram usados como adjuvantes, com e- xemplos incluindo dietil-aminoetila (DEAE)-dextrana, polietileno glicol, e áci- do poliacrílico (por exemplo, CARBOPOLº). O polissacarídeo DEAE- dextrana é conhecido na técnica como um adjuvante muito forte.

No entan- to, ele tem sido associado com reatogenicidade inaceitável.

Os polímeros de CARBOPOLº são polímeros de ácido acrílico reticulado com éteres de polialquenila ou glicol de divinila.

O CARBOPOLS foi usado em várias vaci- —nas,masseuusocomo um adjuvante não foi provado.

Alguns adjuvantes demonstraram estimular uma resposta de Th2, com exemplos incluindo hidroacetato de N-(2-Desóxi-2-L-leucilamino-b- D-glicopiranosil)-N-octadecildodecanocilamida, também conhecido pelo nome comercial Bay R1005º quando em sua forma de acetato, e alumínio.

O Bay —R1005º em combinação com vacinas de vírus purificado ou vacinas de su- punidade levam a produção aumentada de anticorpo em Patundongos de- safiados por vírus.

Os testes pré-clinicos em outras espécies animais (por-

| o TT SÓ-)6IINAÁ5A AAA AAA“Ô“Ca ““C“ ” n a ..i1 mM n o o asaa5 aaa“ | * > 6 . co, carneiro, cavalo) produziram resultados comparáveis com respeito à pro- dução de anticorpo. O aumento na síntese de anticorpo induzido por Bay ' R1005º é especificamente dependente do antígeno e não é o resultado de ; estimulação políclonal.

Antes desta invenção, nenhuma formulação adjuvante possuía a ampla faixa de características desejáveis que um adjuvante ideal deva pos- suir. Houve um esforço para encontrar novos adjuvantes para vacinas que superariam as deficiências daqueles convencionais. Em particular, uma formulação adjuvante que obtém respostas imunes humorais e mediadas por célula potentes a uma ampla faixa de antígenos em humanos e animais, e ainda é desprovido dos efeitos colaterais e dificuldades de formulação dos adjuvantes convencionais, é altamente desejável.

Sumário da Invenção Esta invenção refere-se a novas composições adjuvantes, imu- nogênicas, e de vacina. Em particular, esta invenção refere-se a formula- - ções adjuvantes compreendendo estimuladores de Th1, imunomoduladores, polímeros, e estimuladores de Th2. Esta invenção também refere-se às composições imunogênicas e de vacina compreendendo tais formulações adjuvantes e um ou mais antígenos, assim como processos de preparo das composições adjuvantes e de vacina.

Em uma modalidade, as composições adjuvantes compreendem uma combinação de uma saponina, um esterol, e um composto de amônio quaternário. Em uma modalidade, a combinação adjuvante compreende Quil A, colesterol, e DDA.

Em outra modalidade, as composições adjuvantes compreen- dem uma combinação de uma saponina, um esterol, um composto de amô- nio quaternário, e um polímero. Em uma modalidade, a combinação adju- vante é Quil A, colesterol, DDA, e ácido poliacrílico.

Em outra modalidade, as composições adjuvantes compreen- dem uma combinação de uma saponina, um esterol, um composto de amô- nio quaternário, um polímero, e glicolipídeo. Em uma modalidade, a combi- nação adjuvante é Quil A, colesterol, DDA, ácido poliacrílico, e Bay R1005º.

SB S A“ .,.Ú MM ">>>" oi| .es nr ii O + 7 ' Em uma modalidade, uma composição imunogênica compreen- dendo uma formulação adjuvante e uma quantidade imunologicamente efi- , caz de um antígeno, em que a formulação adjuvante compreende uma sa- ponina, um esterol, um composto de amônio quaternário, e um polímero, é preparada pelo processo compreendendo a) preparo de uma composição do antígeno em um tampão, b) adição da saponina à composição da etapa a; c) adição do esterol à composição da etapa b; d) adição do composto de amônio quaternário à composição da etapac, e) adição do polímero à composição da etapa d.

Em uma modalidade deste processo, a saponina é Quil A, o es- terol é colesterol, o composto de amônio quaternário é DDA, e o polímero é . ácido poliacrílico. | 15 Em uma modalidade, uma vacina compreendendo uma formula- 4 ção adjuvante e uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno, em que a formulação adjuvante compreende uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaternário, um polímero, e um glicolipídeo são prepa- rados pelo processo compreendendo a) preparo de uma composição do antígeno em um tampão, b) adição da saponina à composição da etapa a; c) adição do esterol à composição da etapa b; d) adição do composto de amônio quaternário à composição da etapa c, e) adição do polímero à composição da etapa d, e 1) adição do glicolipídeo à composição da etapa e.

Em uma modalidade deste processo, a saponina é Quil A, o es- terol é colesterol, o composto de amônio quaternário é DDA, o polímero é ácido poliacrílico, e o glicolipídeo é Bay R1005º.

Foi constatado que as composições adjuvantes relatadas aqui possuem propriedades surpreendentes e inesperadas além do que esperarí- amos de tal combinação.

Foi surpreendentemente constatado que a propri-

s + 8 : edade virucida de Quil A/colesterol é eliminada nestas. composições adju- vantes. Elas são adequadas como um diluente para antígenos virais vivos : modificados liofiizados. As composições adjuvantes descritas aqui são con- figuráveis para obter uma resposta imune extremamente potente direcionada ouauma resposta imune mediada por célula, uma resposta imune humoral, ou ambas. Adicionalmente, as reações do sítio de injeção podem ser larga- mente evitadas pelo uso destas formulações adjuvantes, A reatogenicidade é menor do que aquela de vários dos componentes individuais que compre- endem os adjuvantes de combinação. Além disso, estas formulações adju- vantes fornecem capacidade de armazenagem de longa duração.

Os requerentes descobriram que estas novas composições ad- juvantes são altamente imunogênicas quando combinadas com um ou mais de vários antígenos diferentes sobre uma ampla faixa de espécies. Elas po- , dem ser usadas com um ou mais antígenos virais, bacterianos, parasitários, de proteína recombinante, e de peptídeo sintético, e combinações dos mes- í mos. As novas composições adjuvantes de vacina podem ser usadas em vacinas terapêuticas para tratar câncer.

A presente invenção por esse motivo fornece composições adju- vantes, imunogênicas, e de vacina. Adicionalmente são fornecidos proces- sos para a produção das composições. Também é fornecido seu uso no tratamento de doença. Também é fornecido seu uso no preparo de um me- dicamento para tratamento de um paciente contra a doença, particularmente contra as doenças descritas abaixo. Também é fornecido seu uso no prepa- ro de um medicamento para prevenção ou redução da doença em um paci- ente Além disso, é fornecido seu uso no preparo de um medicamento para tratamento de um felino contra infecção causada pelo vírus de leucemia felina, para tratamento de um aviário contra coccidiose aviária, para trata- mento de um bovino contra as doenças causadas por Escherichia coli, para tratamento de um bovino contra as doenças causadas pelo vírus de diarreia viral bovina, para tratamento de um suíno contra as doenças causadas por Hiopneumonia de micoplasma, para tratamento de um felino contra as doen-

peca sda CITIlllil22sMSM SS" fÂÉseaÔfMúêrASÊAsAASeRNSsº ““MpPooemm MN SO 12229. 5 2". “ 8 : ças causadas pelo vírus de influenza felina, um paciente contra câncer, para tratamento de um canino contra as doenças causadas pelo coronavírus ca- í nino, para tratamento de um bovino contra as doenças causadas pelo rotaví- rus bovino, e para tratamento de um canino para doenças causadas pelo vírusde influenza canina. Também é fornecido o uso de adjuvantes como uma vacina marcadora para auxiliar na identificação de animais que foram vacinados. Também é fornecido o uso de CpG para intensificar os efeitos dos adjuvantes. Breve Descrição da Figura A figura 1 representa um ciclo de gel através de ensaio de radio- imunoprecipitação mostrando as diferenças de perfil de anticorpo entre pro- teínas NS2/3 e proteinas E2 do Vírus BVD. O grupo tratado por PreZent À mostra uma resposta de anticorpo a ambas as proteínas NS2/3 e as proteí- : nas E2 embora os grupos tratado por QCDC e QCDCR demonstraram uma resposta de anticorpo a apenas proteina E2 e não às proteínas NS2/3, ã Descrição Detalhada da Invenção Definições "Cerca de" ou "aproximadamente," quando usado com relação a uma variável numérica mensurável, refere-se ao valor indicado da variável e atodos os valores da variável que estão dentro do erro experimental do va- lor indicado (por exemplo, dentro do intervalo de confiança de 95% para a média) ou dentro de 10 porcento do valor indicado, qualquer que seja maior, a não ser que cerca de seja usado em referência aos intervalos de tempo em semanas onde "cerca de 3 semanas," é 17 a 25 dias, e cerca de 2 a cer- cade4semanas é 10 a40 dias.

"Adjuvante" quer dizer qualquer substância que aumente a res- posta imune humoral ou celular a um antígeno. Adjuvantes são geralmente usados para realizar dois objetivos: A liberação lenta de antígenos do sítio de injeção, e a estimulação do sistema imune.

"Alquila" refere-se a porções de hidrocarboneto saturado tanto linear quanto ramíficado. | "Amina" refere-se a um composto químico contendo nitrogênio.

OO 24A«——2»« MA QCÂDUOUÇA«—p—<.«—<..ÚppPAAAÇ.S5Ç—A—.———t rr ——.. .. :. - .. e. Ôô> 9 5 529 CCN )“ ú PAUS." ;“”íIO.»A0?!“;“-5o:s PDoi2ô“ %iéme o 0"slCC“) ” ln “é ii” i WC CU ?S" o ""P so ?.. . ' 10 & Aminas são um grupo de compostos derivados de amônia por substituição de grupos de hidrocarboneto pelos átomos de hidrogênio. "Amina quaterná- Í ria" refere-se a um composto com base em amônio com quatro grupos de hidrocarboneto.

"Anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulina que po- de ligar-se a um antígeno específico como o resultado de uma resposta imu- ne a este antígeno. As imunoglobulinas são proteínas de soro compostas de cadeias de polipeptídeo "leves" e "pesadas" possuindo regiões "constantes" e "variáveis" e são divididas em classes (por exemplo, IgA, lgD, 1gE, 1g9G, e IgM) com base na composição das regiões constantes.

"Antígeno" ou "imunógeno" refere-se a qualquer substância que estimule uma resposta imune. O termo inclui bactérias, vírus, ou parasitas mortos, inativados, atenuados, ou vivos modificados. O termo antígeno : também inclui polinucleotídeos, polipeptídeos, proteinas recombinantes, peptídeos sintéticos, extrato de proteína, células (inclusão de células de tu- | z mor), tecidos, polissacarídeos, ou lipídeos, ou fragmentos dos mesmos, indi- | vidualmente ou em qualquer combinação dos mesmos. O termo antígeno também inclui anticorpos, tais como anticorpos anti-idiótipo ou fragmentos dos mesmos, e a mimótopos de peptídeo sintético que podem imitar um an- tigenoou determinante (epitopo) antigênico.

"Bacterina" quer dizer uma suspensão de uma ou mais bactérias mortas que podem ser usadas como um componente de uma vacina ou composição imunogênica.

"Tampão" quer dizer um sistema quimico que previne mudança na concentração de outra substância química, por exemplo, doador de pró- ton e sistemas aceptores servem como tampões prevenindo mudanças mar- cadas na concentração de fon de hidrogênio (pH). Um exemplo adicional de um tampão é uma solução contendo uma mistura de um ácido fraco e seu sal (base conjugada) ou uma base fraca e seu sal (ácido conjugado).

"Resposta imune celular" ou "resposta imune mediada por célu- la" é aquela mediada por linfócitos T ou outros leucócitos ou ambos, e inclui a produção de citocinas, quimiocina e moléculas similares produzidas por

| : . n : células T ativadas, leucócitos, ou ambos. "Colesterol" refere-se a uma substância cristalina branca com : uma fórmula química de Ca;H,.sOH. Ele é um álcool de hidrocarboneto cícli- co, que é classificado como um lipídeo. Ele é insolúvel em água, mas solú- velemváriossolventes orgânicos.

"Hipersensibilidade do tipo retardada (DTH)" refere-se a uma resposta inflamatória que se desenvolve- 24 a 72 horas depois da exposição a um antígeno que o sistema imune reconhece como estranho, Este tipo de resposta imune envolve principalmente células T em vez de anticorpos (que são produzidos por células B).

"Dose" refere-se a uma vacina ou composição imunogênica da- da a um paciente. Uma "primeira dose" ou "vacina de preparação" refere-se à dose de tal composição dada no Dia 0. Uma "segunda dose" ou uma "ter- , ceira dose" ou uma "dose anual" refere-se a uma quantidade de tal composi- ção dada subsequente à primeira dose, que pode ser ou pode não ser a : mesma vacina ou composição imunogênica como a primeira dose.

"Emulsificante" quer dizer uma substância usada para produzir uma emulsão mais estável.

"Emulsão" quer dizer uma composição de dois líquidos imiscí- veis nos quais pequenas gotas de um líquido são suspensas em uma fase contínua do outro líquido.

"Ésteres" referem-se a qualquer de uma classe de compostos orgânicos correspondentes aos sais inorgânicos, que são formados de uma reação de condensação na qual uma molécula de um ácido orgânico une-se comuma molécula de álcool com eliminação de uma molécula de água.

"Excipiente" refere-se a qualquer componente de uma vacina que não seja um antígeno.

"Homogenização" refere-se a um processo de mistura de um ou mais componentes, ou similares ou dissimílares, em uma mistura uniforme.

"Resposta imune humoral" refere-se àquela que é mediada por anticorpos, "Hidrofóbicos" quer dizer insolúveis em água, não facilmente ab-

SO o * 12 : sorvendo umidade, ou sendo adversamente afetados por água; ou incompa- tíveis com água ou possuindo pouca afinidade por ela. , "Resposta imune" em um paciente refere-se ao desenvolvimento de uma resposta imune humoral, uma resposta imune celular, ou uma res- posta imune humoral e uma celular a um antígeno. As respostas imunes podem geralmente ser determinadas usando imuncensaios padrões e en- saios de neutralização, que são conhecidos na técnica.

"Quantidade imunologicamente protetora" ou "quantidade imuno- logicamente eficaz" ou "quantidade eficaz para produzir uma resposta imu- ne"deum antígeno é uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imu- nogênica no recipiente. A resposta imunogênica pode ser suficiente para propósitos de diagnóstico ou outro teste, ou pode ser adequada para preve- nir sinais ou sintomas de doença, inclusão de efeitos de saúde adversos ou . complicações dos mesmos, causados por infecção com um agente de doen- ça Ou imunidade humoral ou imunidade mediada por célula ou ambas po- º dem ser induzidas. A resposta imunogênica de um animal a uma composi- ção imunogênica pode ser avaliada, por exemplo, indiretamente através de medição de títulos de anticorpo, ensaios de proliferação de linfócito, ou dire- tamente através de monitoramento de sinais e sintomas depois do desafio com cepa do tipo silvestre, enquanto que a imunidade protetora conferida por uma vacina pode ser avaliada através de medição de, por exemplo, re- dução nos sinais clínicos tais como mortalidade, morbidade, número de tem- peratura, condição física total, e saúde total e desempenho do paciente. À resposta imune pode compreender, sem limitação, indução de imunidade celulare/ou humoral.

"Imunogênica" quer dizer evocando uma resposta imune ou an- tigênica. Desta forma uma composição imunogênica seria qualquer compo- sição que induz uma resposta imune.

"Imunoestimulação de complexo" ou ISCOM refere-se a uma es- trutura específica que é formada quando Quil A é combinado com colesterol € fosfolipídeos.

"Molécula imunoestimuladora" refere-se a uma molécula que ge-

+ 13 , ra uma resposta imune.

"Lipídeos" refere-se a qualquer de um grupo de compostos or- ' gânicos, incluíndo as gorduras, óleos, ceras, esteróis, e triglicerídeos, que são insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos não polares, são oleosos ao toque, e juntos com carboidratos e proteinas constituem o material estrutural principal de células vivas.

"Lipofílico" quer dizer mostrando uma atração marcada a, ou so- lubilidade em, lipídeos.

"Lipossoma" refere-se a uma partícula esférica microscópica formada por uma bicamada de lipídeo encerrando um compartimento aquo- so, usado medicinalmente para transportar um fármaco, antígeno, vacina, enzima, ou outra substância às células alvejadas no corpo.

"Agente medicinal" refere-se a qualquer agente que é útil na : prevenção, cura, ou melhora da doença, ou a prevenção de alguma condi- çãoou ocorrência fisiológica.

: “Administração parenteral" refere-se à introdução de uma subs- tância, tal como uma vacina, em um corpo de paciente através de ou por meio de uma rotina que não inclui o trato digestivo. A administração paren- teral inclui administração subcutânea, intramuscular, transcutânea, intradér- mica, intraperitoneal, intraocular, e intravenosa.

"Farmaceuticamente aceitável" refere-se às substâncias, que es- tão dentro do escopo do diagnóstico médico seguro, adequadas para uso em contato com os tecidos de pacientes sem toxicidade, irritação, resposta alérgica indevida, e similaressimilares, comensuráveis com uma relação be- —nefíciopara risco razoável, e eficazes para seu uso pretendido.

"Reatogenicidade" refere-se aos efeitos colaterais produzidos em um paciente em resposta à administração de uma composição adjuvan- te, uma imunogênica, ou uma de vacina, Pode ocorrer no sítio de adminis- tração, e é geralmente avaliada em termos do desenvolvimento de vários sintomas. Estes sintomas podem incluir inflamação, vermelhidão, e absces- so. Ela é também avaliada em termos de ocorrência, duração, e severidade. Uma reação "fraca", por exemplo, envolveria tumefação que é apenas detec- |

“ . 14 . tável por palpitação e não pelos olhos, ou seria de curta duração. Uma rea- ção mais severa seria, por exemplo, aquela que é visível ao olho ou é de , duração mais longa.

"Temperatura Ambiente" quer dizer uma temperatura de 18 a 25 ºC "Saponina" refere-se a um grupo de glicosideos tensoativos de origem vegetal compostos de uma região hidrofílica (geralmente várias ca- deias de açúcar) em associação com uma região hidrofóbica de estrutura ou esteroide ou triterpenoide, "Esteroides" refere-se a qualquer de um grupo de compostos or- gânicos pertencente à classe bioquímica de lipídeos, que são facilmente so- lúveis em solventes orgânicos e ligeiramente solúveis em água. Os esteroi- des compreendem um sistema de 4 anéis fundidos de três anéis de ciclo- hexano (seis carbonos) fundidos mais um quarto anel de ciclopentano (cin- cocarbonos).

« "Esteróis" refere-se aos compostos em animais que são biologi- camente produzidos de precursores de terpenoide, Eles compreendem uma estrutura de anel de esteroide, possuindo um grupo hidroxila (OH), geral- mente ligado ao carbono-3. A cadeia de hidrocarboneto do substituinte de ácido graxo varia em comprimento, geralmente de 16 a 20 átomos de carbo- no, e pode ser saturado ou insaturado. Esteróis comumente contêm uma ou mais ligações duplas na estrutura de anel e também uma variedade de subs- tituintes ligados aos anéis. Esteróis e seus ésteres de ácido graxo são es- sencialmente insolúveis em água.

"Paciente" refere-se a qualquer animal para o qual a administra- ção de uma composição adjuvante é desejada. Ele inclui mamíferos e não mamíferos, incluindo primatas, criação de gado, animais de estimação, ani- mais de teste de laboratório, animais silvestres cativos, aves (incluindo em ovos), répteis, e peixe. Desta forma, este termo inclui, mas não é limitado a macacos, humanos, suíno; gado, carneiro, cabras, equinos, camundongos, ratos, cobaias, hamsters, coelhos, felinos, caninos, frangos, perus, patos, outras aves domésticas, rãs, e lagartos.

a. + 15 , "TCIDso" refere-se a "dose infecciosa de cultura de tecido" e é definida como aquela diluição de um vírus requerida para infectar 50% de ' uma dada batelada de culturas celulares inoculadas. Vários processos po- dem ser usados para calcular TCIDso, incluindo o processo de Spearman- Karberqueé utilizado ao longo desta especificação. Para uma descrição do processo de Spearman-Karber, veja B.W. Mahy & H.O. Kangro, Virology Me- thods Manual, p. 25-46 (1996). : "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantida- de de um antígeno ou vacina que induziria uma resposta imune em um paci- ente recebendo o antígeno ou vacina que é adequado para prevenir ou re- duzir sinais ou sintomas de doença, incluindo efeitos de saúde adversos ou complicações dos mesmos, causados por infecção com um patógeno, tal como um vírus ou uma bactéria. Imunidade humoral ou imunidade mediada , por célula ou ambas as imunidade humoral e mediada por célula podem ser induzidas. A resposta imunogênica de um animal a uma vacina pode ser 2 avaliada, por exemplo, indiretamente através de medição de títulos de anti- corpo, ensaios de proliferação de linfócito, ou diretamente através de monito- ramento de sinais e sintomas depois do desafio com cepa do tipo silvestre.

A imunidade protetora conferida por uma vacina pode ser avaliada através de medição de, por exemplo, redução nos sinais clínicos tais como mortali- dade, morbidade, número de temperatura, condição física total, e saúde total e desempenho do paciente. A quantidade de uma vacina que é terapeuti- camente eficaz pode variar dependendo do adjuvante particular usado, o antígeno particular usado, ou à condição do paciente, e pode ser determina- da por aquele versado na técnica.

"Tratar" refere-se a prevenir um distúrbio, condição, ou doença ao qual tal termo aplica-se, ou a prevenir ou reduzir um ou mais sintomas de tal distúrbio, condição, ou doença.

"Tratamento" refere-se ao ato de "tratar" tal como definido acima.

"Triterpenoides" refere-se a uma grande e diversa classe de mo- léculas orgânicas de ocorrência natural, derivadas de seis unidades de iso- preno (2-metil-1,3-butadieno) de cinco carbonos, que podem ser agrupadas

. e modificadas em milhares de maneiras. A maior parte são estruturas multi- cíclicas que diferem uma da outra em grupos funcionais e em seus esquele- Ú tos de carbono básico. Estas moléculas podem ser encontradas em todas as classes de coisas vivas.

"Vacina" refere-se a uma composição que incluí um antígeno, tal como definido aqui. A administração da vacina a um paciente resulta em uma resposta imune, geralmente contra uma ou mais doenças específicas. A quantidade de uma vacina que é terapeuticamente eficaz pode variar de- pendendo do antígeno particular usado, ou da condição do paciente, e pode serdeterminada por aquele versado na técnica.

Componentes das Composições Triterpenoides e CpGs Os triterpenoides adequados para uso nas composições adju- : vantes podem vir de muitas fontes, ou derivados de planta ou equivalentes sintéticos, incluíndo, mas não limitado a, Quíillaja saponaria, tomatina, extra- 3 tos de ginseng, cogumelos, e um glicosídeo alcaloide estruturalmente similar às saponinas esteroidais. Desta forma, os triterpenoides adequados para uso nas composições adjuvantes incluem saponinas, esqualeno, e lanoste- rol. A quantidade de triterpenoides adequados para uso nas composições adjuvantes depende da natureza do triterpenoide usado. No entanto, eles são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de

5.000 ug por dose. Eles também são usados em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 4.000 ug por dose, cerca de 1 ug a cerca de 3.000 ug por dose, cerca de 1 ug a cerca de 2.000 ug por dose, e cerca de 1 ug a cerca —de1.000 ug pordose, Eles são também usados em uma quantidade de cer- ca de 5 ug a cerca de 750 ug por dose, cerca de 5 ug a cerca de 500 ug por dose, cerca de 5 ug a cerca de 200 ug por dose, cerca de 5 ug a cerca de 100 ug por dose, cerca de 15 ug a cerca de 100 ug por dose, e em uma quantidade de cerca de 30 ug a cerca de 75 ug por dose.

Se uma saponina é usada, as composições adjuvantes geral- mente contêm uma fração de saponina imunologicamente ativa da casca de Quíiltaja saponaria. A saponina pode ser, por exemplo, Quil A ou outra pre- CNO, O CC A ra

: paração de saponina purificada ou parcialmente purificada, que pode ser obtida comercialmente. Desta forma, extratos de saponina podem ser usa- ' dos como misturas ou componentes individuais purificados tais como QS-7, QS-17, 0S-18, e 08-21. Em uma modalidade, a Quil A é pelo menos 85% puro Em outrasmodalidades, a Quil A é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% puro.

CpG ODNs são uma classe recentemente descrita de agentes farmacoterapêuticos que são caracterizados pela presença de um dinucleo- tídeo CG não metilado em contextos de base-sequência específica (motif CpG).(Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy e COPD, Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, que é incorporado aqui através de referência) Estes motivos CpG não são vistos em DNA eu- cariótico, no qual dinucleotídeos CG são suprimidos e, quando presentes, . geralmente metilados, mas estão presentes em DNA bacteriano ao qual eles conferem propriedades imunoestimuladoras. Estas propriedades imunoes- . timuladoras incluem indução de uma resposta do tipo Th1 com liberação proeminente de IFN-Á, 11-12, e IL-18. CpG ODNs (18 a 24 pb de compri- mento) possuem propriedades imunomodulatórias similares ao DNA bacteri- ano. As proteínas da superfície celular podem absorver estas moléculas com resultados variáveis, No entanto, com um veículo tal como QCDC, QCDCR e outras combinações citadas dentro desta patente, as proprieda- des de imunomodulação e absorção do CpG são significantemente intensifi- cadas.

A quantidade de CpG para uso nas composições adjuvantes de- pende da natureza do CpG usado e das espécies pretendidas. No entanto, eles são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 20 mg por dose. Eles também são usados em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 10 mg por dose, cerca de 1 ug a cerca de 5 mg por dose, cerca de 1 ug a cerca de 4 mg por dose, cerca de 1 ug a cerca de 3 mg por —dose,cercade 1 png acerca de 2 mg por dose, e cerca de 1 1g a cerca de 1 mg por dose. Eles são também usados em uma quantidade de cerca de 5 ug a cerca de 750 ug por dose, cerca de 5 ug a cerca de 500 ug por dose,

q) ? SAMÔÔÉE” —EE,t AMHU%1T)) A PAP % ô1=2 ess? 212 2A)] ]" o 18 : cerca de 5 ug à cerca de 200 pg por dose, cerca de 5 ug a cerca de 100 ug por dose, 10 ug a cerca de 100 ug por dose, cerca de 15 ug a cerca de 100 ' ug por dose, e em uma quantidade de cerca de 30 ug a cerca de 75 ug por dose. Esteróis Esteróis adequados para uso nas composições adjuvantes in- cluem Br-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol, e colesterol. Es- tes esteróis são bem conhecidos na técnica e podem ser adquiridos comer- cialmente. Por exemplo, colesterol é descrito no Índice de Merck, 12th Ed., p 369, A quantidade de esteróis adequados para uso nas composições ad- juvantes depende da natureza do esterol usado. No entanto, eles são ge- ralmente usados em uma quantidade de cerca de 1 ug a cerca de 5.000 ug por dose. Eles também são usados em uma quantidade de cerca de 1 ug à : cerca de 4.000 ug por dose, cerca de 1 ug a cerca de 3.000 ug por dose, cercade 1 4uga cerca de 2.000 ug por dose, e cerca de 1 ug a cerca de . 1.000 ug por dose. Eles são também usados em uma quantidade de cerca de 5 ug a cerca de 750 ug por dose, cerca de 5 ug a cerca de 500 ug por dose, cerca de 5 ug a cerca de 200 ug por dose, cerca de 5 ug a cerca de 100 ug por dose, cerca de 15 ug a cerca de 100 ug por dose, e cerca de 30 pugacercade?7S5 ug pordose.

Imunomoduladores As composições adjuvantes podem além disso incluir um ou mais agentes imunomodulatórios tais como, por exemplo, compostos de amônio quaternário (por exemplo, DDA), e interleucinas, interferons, ou ou- tras citocinas. Estes materiais podem ser adquiridos comercialmente. A quantidade de um imunomodulador adequado para uso nas composições adjuvantes depende da natureza do imunomodulador usado e do paciente. No entanto, eles são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 1 Hg a cerca de 5.000 ug por dose. Eles também são usados em uma quanti- dade de cerca de 1 ug acerca de 4.000 ug por dose, cerca de 1 ug a cerca de 3.000 ug por dose, cerca de 1 ug a cerca de 2.000 ug por dose, e cerca de 1 ug à cerca de 1.000 ug por dose. Eles são também usados em uma o | % + : 19 . quantidade de cerca de 5 ug a cerca de 750 ug por dose, cerca de 5 ug a cerca de 500 ug por dose, cerca de 5 ug a cerca de 200 ug por dose, cerca ' de 5 ug a cerca de 100 ug por dose, cerca de 15 ug a cerca de 100 ug por dose, e em uma quantidade de cerca de 30 ug a cerca de 75 ug por dose.

Paraum exemplo específico, as composições adjuvantes contendo DDA podem ser preparadas por mistura simplesmente de uma solução de antíge- no com uma solução frescamente preparada de DDA.

Polímeros As composições adjuvantes podem, além disso, incluir um ou mais polímeros tais como, por exemplo, DEAE Dextrana, polietileno glicol, e ácido poliacrílico e ácido polimetacrílico (por exemplo, CARBOPOL9). Tal material pode ser adquirido comercialmente.

A quantidade de polímeros adequados para uso nas composições adjuvantes depende da natureza dos polímeros usados.

No entanto, eles são geralmente usados em uma quanti- dade de cerca de 0,0001% volume para volume (v/v) a cerca de 75% viv. s Em outras modalidades, eles são usados em uma quantidade de cerca de 0,001% v/v a cerca de 50% v/v, de cerca de 0,005% v/v a cerca de 25% v/v, de cerca de 0,01% v/v a cerca de 10% v/v, de cerca de 0,05% v/v a cerca de 2% vv, e de cerca de 0,1% v/v a cerca de 0,75% vív.

Em outra modalidade, elessão usados em uma quantidade de cerca de 0,02 v/v a cerca de 0,4% vv.

DEAE-dextrana pode possuir um tamanho molecular na faixa de 50.000 Da a 5.000.000 Da, ou ela pode estar na faixa de 500.000 Da a 2.000.000 Da.

Tal material pode ser adquirido comercialmente ou preparado de dex- trana.

Outro exemplo específico é ácido poliacrílico (por exemplo, os polímeros de CARBOPOLº), que possui um peso equivalente médio de 76. Eles são produzidos de partículas de polímero primário de cerca de 0,2 a 6,0 miícrons de diâmetro médio.

Os polímeros de CARBOPOLº* dilatam-se em água até 1000 vezes seu volume original e dez vezes seu diâmetro original para formar um gel quando exposto a um ambiente de pH maior do que o pKa de grupo carboxilato, Em um pH maior do que o pKa de grupo carboxi- lato, os grupos carboxilato ionizam-se resultando em repulsão entre as car-

. gas negativas, que adiciona-se à tumefação do polímero.

Estimulantes de Th2 . " As composições adjuvantes podem, além disso, incluir um ou mais estimulantes de Th2 tais como, por exemplo, Bay R1005º e alumínio.

A quantidade de estimulantes de Th2 adequados para uso nas composições adjuvantes depende da natureza do estimulante de Th2 usado.

No entanto, eles são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 0,01 mg a cer- ca de 10 mg por dose.

Em outras modalidades, eles são usados em uma quantidade de cerca de 0,05 mg a cerca de 7,5 mg por dose, de cerca de 0,1 mgacercade5mg por dose, de cerca de 0,5 mg a cerca de 2.5 mg por do- se, e de 1 mg a cerca de 2 mg por dose.

Um exemplo específico é Bay R1005º, um glicolipideo com o nome químico "acetato de N-(2-desóxi-2-L- leucilamino-B-D-glicopiranosil)-N-octadecildodecanamida." Ele pode ser sin- . tetizado de acordo com o procedimento encontrado em Lockhoff, 0. (Angew.

Chem.

Int.

Ed.

Engl. 30:1611-1620; 1991). É recomendado que ele seja ar- « mazenado em 2 a 8ºC em um recipiente hermético.

Suas propriedades químicas ou físicas são que ele é ligeiramente higroscópico, não forma poli- morfos, é quimicamente estável no ar e leve em temperaturas até 50ºC e em solventes aquosos em pH 2 a 12 em temperatura ambiente.

Ele é uma mo- lécula anfiflica que forma micelas em solução aquosa.

Antígenos e Doenças As composições adjuvantes podem conter um ou mais antíge- nos.

O antígeno pode ser qualquer de uma ampla variedade de substâncias capazes de produzir uma resposta imune desejada em um paciente.

Ainda que Quil A sozinha seja virucida, Quil A é desintoxicada com a adição de colesterol quando formando micelas helicoidais (veja Patente dos Estados Unidos Número 7.122.191). As composições adjuvantes descritos aqui fo- ram constatadas serem não virucidas, e não hemolíticas ou membranolíti- cas.

Desta forma, os antígenos usados com estas composições adjuvantes — podem serum ou mais de vírus (inativados, atenuados, e vivos modificados), bactérias, parasitas, nucleotídeos, polinucleotídeos, peptídeos, polipepti- deos, proteínas recombinantes, peptídeos sintéticos, extrato de proteína,

. células (inclusão de células de tumor), tecidos, polissacarídeos, carboidra- tos, ácidos graxos, ácido teicóico, peptidoglicanos, lipídeos, ou glicolipídeos, ' individualmente ou em qualquer combinação dos mesmos.

Os antígenos usados com os adjuvantes da invenção também incluem fragmentos imunogênicos de nucleotídeos, polinucleotídeos, peptí- deos, polipeptídeos, que podem ser isolados dos organismos referidos aqui. As cepas virais vivas, vivas modificadas, e atenuadas que não causam doença em um paciente foram isoladas em forma não virulenta ou foram atenuadas usando processos bem conhecidos na técnica, incluindo inoculação em série em uma linhagem de células adequada ou exposição à luz ultravioleta ou um mutagênico químico. As cepas virais inativadas ou mortas são aquelas que foram inativadas através de processos conhecidos âquele versado na técnica, incluindo tratamento com formalina, betaproprio- : lactona (BPL), etilenoimina binária (BEI), esterilização, radiação, aquecimen- to, ou outros tais processos.

: Dois ou mais antigenos podem ser combinados para produzir uma composição polivalente que pode protegêr um paciente contra uma ampla variedade de doenças causadas pelos patógenos. Atualmente, os fabricantes comerciais de vacinas, assim como usuários finais, preferem produtos de vacina polivalente. Embora adjuvantes convencionais sejam frequentemente limitados na variedade de antígenos com os quais eles po- dem ser eficazmente usados (ou monovalentemente ou polivalentemente), os adjuvantes descritos aqui podem ser usados eficazmente com uma ampla faixa de antígenos, ambos monovalentemente e polivalentemente. Desta forma,os antígenos descritos aqui podem ser combinados em uma compo- sição única compreendendo os adjuvantes descritos aqui.

Alguns exemplos de bactérias que podem ser usados como an- tígenos com as composições adjuvantes incluem, mas não são limitados a, espécies Aceinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruíanus, Actinoba- cílluspleuropneumoniae, Aeromonas hydrophila, Alicyciobacillus acidocalda- rius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearoutrosmophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Bordefella bronchiseptica, Bur-

NS NS + ' 22 . kholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia psit- ' taci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila spp., Chromobactéria viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Ehrlichia canis, Es- cheríchia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Helicobacter suis, Lawsonia intracelularis, Legionella pneumophilia, Moraxelisa sp.

My- cobactrium bovis, Micoplasemae hyopneumonia, Micoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Odoribacter denticanis, Pas- feurella (Mannheimia) haemolytica, Pasteurella multocida, Photorhabdus lu- minescens, Porphyromonas gulae, Porphyromonas gingivalis, Porphyromo- nas salivosa, Propionibactéria acnes, Proteus vulgaris, Pseudomnas wiscon- sinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseu- domonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, . Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psyechrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Ricketísia rickettsia, Salmo- é nella typhimurium, Salmonella bongori, Salmonella entéricoa, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraseuis, Salmonella new- port, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphlyoccocus aureus, Staph- yloccoccus epidermidis, Staphylococeus hyicus, Streptomyces albus, Strep- tomyces cinnamoneus, Sireptococcus suis, Streptomyces exfoliates, Strep- tomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio chole- rae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Trepo- nema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium, e Leptospira, tais como os patógenos conhecidos Leptospira ca- nicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno,Leptospira interro- gans, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, e Leptospira bra- tislava, e combinações dos mesmos.

Ambos os vírus inativados e vírus vivos atenuados podem ser usados nas composições adjuvantes, Alguns exemplos de vírus que podem ser usados como antígenos incluem, mas não são limitados a, Herpesvírus aviário, Herpesviroses bovinas, Herpesviroses caninas, Herpesviroses equi-

" 23 : nas, vírus de rinotraqueite viral felino, vírus da doença de Marek, herpesviro- ses ovinas, Herpesviroses porcinas, Vírus da pseudoraiva, Paramixoviroses ' aviárias, vírus sincicial respiratório bovino, Vírus da cinomose canina, Vírus da parainfluenza canina, adenovírus canino, parvovírus canino, Vírus 3 da Parainfluenza Bovina, Parainfluenza 3 ovina, Vírus de Rinderpest, Vírus da doença de border, Vírus de diarreia viral bovina (BVDV), BVDV Tipo |, BVDV Tipo !l, Vírus da febre suína clássica, Vírus da Leucose aviária, Vírus da - munodeficiência bovina, Vírus da leucemia bovina, Tuberculose bovina, Vi- rus da anemia infecciosa equina, Vírus da imunodeficiência felina, Vírus de leucemia felina (FelV), Vírus da Doença de Newcastle, Vírus da pneumonia progressiva ovina, Vírus do adenocarcinoma pulmonar ovino, Coronavírus canino (CCV), CCV pantrópico, Coronavírus respiratório canino, Coronavírus bovino, Calicivírus Felino, Coronavírus entérico felino, Vírus de peritonite . infecciosa felina, Vírus da diarréia epidêmica porcina, Virus da encefalomieli- te hemaglutinante porcina, Parvovírus porcino, Circovírus Porcino (PCV) Ti- . po 1, PCV Tipo II, (PRRS) Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Porcina, Vírus de gastroenterite transmissível, Coronavírus de peru, Vírus da febre efêmera bovina, Raiva, Rotovírus, Virus da estomatite vesicular, lenti- vírus, Influenza aviário, Rinoviroses, Vírus de influenza equino, Vírus de in- fluenza suíno, Vírus de influenza canina, Vírus de influenza felina, Vírus de influenza humana, Vírus da encefalite equina do oriente (EEE), Vírus da en- cefalite equina venezuelana, virus do Nilo Ocidental, vírus da encefalite e- quina ocidental, vírus da imunodeficiência humana, papilomavírus humano, vírus do herpes zoster, vírus da hepatite B, rinovírus, e vírus do sarampo, e combinações dosmesmos.

Exemplos de antígenos de peptídeo incluem Bordetella bronchi- septica p68, GnRH, IgE peptídeos, Fel d1, e antígenos de câncer, e combi- nações dos mesmos. Exemplos de outros antígenos incluem nucleotídeos, | carboidratos, lipídeos, glicolipídeos, peptídeos, ácidos graxos, e ácido teicói- co,epeptidoglicanos, e combinações dos mesmos.

Alguns exemplos de parasitas que podem ser usados como an- tígenos com as composições adjuvantes incluem, mas não são limitados a,

ri ÁA U uv uu A“ 2 º9“2“º“º“9O OA “OO A * É 24 % espécies Anaplasma, Fasciola hepatica (trematódeo do fígado), Coccidia, Eimeria spp., Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Giardia, Dirofilaria º (vermes do coração), Ancylostoma (vermes ganchos), Trypanosoma spp., Leishmania spp., Trichomonas spp., Cryptosporídium parvum, Babesia, S- chistosoma, Taenia, Strongloides, Ascaris, Trichinella, Sarcocystis, Ham- mondia, e Isopsora, e combinações dos mesmos.

Também contemplados são parasitas externos incluindo, mas não limitado a, carrapatos, incluindo Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma, e Haemaphysalis, e combinações dos mesmos.

A quantidade de antígeno usada para induzir uma resposta imu- ne variará consideravelmente dependendo do antígeno usado, do paciente, e do nível de resposta desejada, e pode ser determinado por aquele versado na técnica.

Para vacinas contendo vírus vivo modificado ou vírus atenuado, , uma quantidade terapeuticamente eficaz do antígeno geralmente varia de cercade 10? Dose Infecciosa de Cultura de Tecido (TCID)s5 a cerca de 10"º º TCIDso, inclusive.

Para muitos tais vírus, uma dose terapeuticamente eficaz está geralmente na faixa de cerca de 10º TCIDs5 a cerca de 10º TCIDso, in- clusive.

Em algumas modalidades, as faixas de doses terapeuticamente eficazes são cerca de 10º TCIDs, a cerca de 10º TCIDso, inclusive.

Em al- gum outras modalidades, as faixas de doses terapeuticamente eficazes são cerca de 10º TCIDs, a cerca de 10º TCIDso, inclusive.

Para vacinas contendo vírus inativados, uma quantidade tera- peuticamente eficaz do antígeno é geralmente pelo menos cerca de 100 uni- dades relativas por dose, e frequentemente na faixa de cerca de 1.000 a cercade 4.500 unidades relativas por dose, inclusive.

Em outras modalida- des, a quantidade terapeuticamente eficaz do antígeno está em uma faixa de cerca de 250 a cerca de 4,000 unidades relativas por dose, inclusive, de cer- ca de 500 a cerca de 3.000 unidades relativas por dose, inclusive, de cerca de 750 a cerca de 2.000 unidades relativas por dose, inclusive, ou de cerca de1.000acercade 1,500 unidades relativas por dose, inclusive.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de antígeno em vaci- nas contendo vírus inativados pode também ser medida em termos de Po-

+ 25 à tência Relativa (RP) por mL. Uma quantidade terapeuticamente eficaz está frequentemente na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 50 RP por mL, inclusive.

' Em outras modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz do antígeno está em uma faixa de cerca de 0,5 a cerca de 30 RP por mL, inclusive, de cercade1a cerca de 25 RP por mL, inclusive, de cerca de 2 a cerca de 20 RP por mL, inclusive, de cerca de 3 a cerca de 15 RP por mL, inclusive, ou de cerca de 5 a cerca de 10 RP por mL, inclusive.

Em uma modalidade, um antígeno de Fel V foi produzido da li- nhagem de células FL74-UCD-1 (Número de ATCC CRL-8012) que é persis- tentemente infectada com a cepa de vírus de leucemia felina KT-FelV-UCD-

1. A quantidade de antígeno de FelV em uma vacina pode ser medida co- mo a quantidade de proteína viral go70 por ml. Uma quantidade terapeuti- camente eficaz de antígeno de Fel.V, quando medida pela quantidade de . proteína viral go70 por mL, geralmente está na faixa de cerca de 100 a cerca de 350.000 ng/ml, inclusive. Em outra modalidade, a faixa é de cerca de " 1.000 a cerca de 300,000 ng/ml, inclusive, ou de cerca de 2.500 a cerca de

250.000 ng/ml, inclusive, ou de cerca de 4.000 a cerca de 220.000 no/ml, inclusive, ou de cerca de 5.000 a cerca de 150.000 ng/ml, inclusive, ou de cerca de 10.000 ng/ml a cerca de 100.000 ng/ml, inclusive.

O número de células para um antígeno bacteriano administrado em uma vacina varia de cerca de 1x10º a cerca de 5x10*º* colônias formando unidades (CFU) por dose, inclusive. Em outras modalidades, o número de células varia de cerca de 1x10” a 5x10"º CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x10º a 5x10*º CFU/dose, inclusive. Em ainda outras modalidades, o núme- rode células varia de cerca de 1x10º a 5x10"º CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x10º a 5x10º CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x10º a 5x10º CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x10º à 5x10º CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x10º a 5x10º CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x10º a 5x10º CFU/dose, inclusive.

O número de células para um antigeno de parasita administrado em uma vacina varia de cerca de 1x10º a cerca de 1x10"º por dose, inclusi- ve. Em outras modalidades, o número de células varia de cerca de 1xX10º a fAH FIM É CNWÍR SO oO E 2 26 * cerca de 1x10º por dose, inclusive, ou de cerca de 1x10º a cerca de 1x10º por dose, inclusive, ou de cerca de 1x10º a cerca de 1x10” por dose, inclusi- ' ve, ou de cerca de 1x10º a cerca de 1x10º por dose, inclusive.

É bem conhecido na técnica que com adjuvantes convencionais, uma quantidade substancialmente maior de vírus inativados do que vírus vivos modificados ou atenuados é necessário para estimular um nível com- parável de resposta sorológica.

No entanto, foi surpreendentemente consta- tado que com as composições adjuvantes descritas aqui, aproximadamente as mesmas quantidades de virus inativado e vírus vivo modificado estimulam níveis similares de resposta sorológica.

Além disso, quantidades menores de vírus vivo modificado, atenuado, e inativado são necessárias com os ad- juvantes descritos aqui quando comparado com adjuvantes convencionais para obter o mesmo nível de resposta sorológica.

Estas descobertas ines- : peradas demonstram conservação de recursos e redução de custo durante a preparação de composições imunogênicas e de vacina.

Para vacinas com : ampla utilidade, a produção de milhões de doses por ano é requerida, então estas economias podem ser substanciais, Excipientes Os adjuvantes aquosos fornecem certas vantagens.

Eles são geralmente fáceis de formular e administrar, e podem induzir poucas ou me- nos reações do sítio de injeção sérias.

No entanto, os adjuvantes aquosos com um antígeno tendem a dispersar-se do sítio de injeção, são depurados pelo fígado do paciente, e geram uma resposta imune não específica indese- jável.

Foi surpreendentemente constatado que as composições adjuvantes aquosas descritas aqui permanecem no sítio de injeção até que sejam bio- metabolizadas, o que ocorre durante um longo período de tempo, e forne- cem uma resposta imune alvejada.

Óleo, quando adicionado como um componente de um adjuvan- te, geralmente fornece um perfil de liberação longa e lenta.

Na presente in- venção,o óleo pode ser metabolizável ou não metabolizável.

O óleo pode ser na forma de uma emulsão de óleo em água, uma de água em óleo, ou uma de água em óleo em água. '

,» a : 27 : Óleos adequados para uso na presente invenção incluem alca- | - nos, alquenos, alquinos, e seus correspondentes ácidos e álcoois, os éteres Í e ésteres dos mesmos, e misturas dos mesmos. Os compostos individuais do óleo são compostos de hidrocarboneto leves, isto é, tais componentes possuem6 a 30 átomos de carbono. O óleo pode ser sinteticamente prepa- rado ou purificado de produtos de petróleo. A porção pode possuir uma es- trutura de cadeia linear ou ramificada. Ela pode ser totalmente saturada ou possuir um ou mais ligações duplas ou triplas. Alguns óleos não metaboli- záveis para uso na presente invenção incluem óleo mineral, óleo de parafi- na, e cicloparafinas, por exemplo.

| O termo óleo também pretende incluir "óleo mineral leve," isto é, | óleo que é similarmente obtido por destilação de petrolato, mas que possui uma gravidade específica ligeiramente menor do que óleo mineral branco. , Óleos metabolizáveis incluem óleos não tóxicos metabolizáveis. O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo ' sinteticamente preparado que pode ser metabolizado pelo corpo do paciente ao qual o adjuvante será administrado e que é não tóxico ao paciente. As fontes para óleos vegetais incluém nozes, sementes e grãos.

Uma emulsão de óleo em água fornecida pela presente invenção é composta de uma formulação de AMPHIGEN?. Esta formulação compre- ende um componente aquoso, lecitina, óleo mineral, e tensoativos. As pa- tentes descrevendo os componentes da formulação incluem US 5,084.269 e US 6.572.861.

Tipicamente, o componente de óleo da presente invenção está presente em uma quantidade de 1% a 50% em volume;ou em uma quanti- dade de 10% a 45%;o0u em uma quantidade de 20% a 40%.

Outros componentes das composições podem incluir excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como veículos, solventes, e diluentes, agentes isotônicos, agentes de tamponamento, estabilizantes, conservantes, agentes vaso-constritivos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, e similares. Veículos, solventes, e diluentes típicos incluem água, solução sa- lina, dextrose, etanol, glicerol, óleo, e similares. Os agentes isotônicos re-

+ « 28 = presentativos incluém cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, lactose, e ' similares.

Estabilizantes úteis incluem gelatina, albumina, é similares.

Tensoativos são usados para ajudar na estabilização da emut- são selecionada para agir como o veículo para o adjuvante e antígeno.

Ten- —soativos adequados para uso nas presentes invenções incluem tensoativos biologicamente compatíveis naturais e tensoativos sintéticos não naturais.

Tensoativos biologicamente compatíveis incluem compostos de fosfolipídeo ou uma mistura de fosfolipídeos.

Fosfolipídeos preferidos são fosfatidilcolinas (lecitina), tais como lecitina de soja ou ovo.

A lecitina pode ser obtida como uma mistura de fosfatíideos e triglicerídeos por lavagem com água de óleos vegetais brutos, e separação e secagem das gomas hidratadas resultantes, Um produto refinado pode ser obtido por fracionamento da mistura por fosfoli- pídeos e glicolipídeos insolúveis em acetona restantes depois de remoção dos : triglicerídeos e óleo vegetal por lavagem com acetona.

Alternativamente, a lecitina pode ser obtida de várias fontes comerciais.

Outros fosfolipídeos a- ' dequados incluem fosfatídilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina, e fosfatidiletanolamina.

Os fosfolipídeos podem ser isolados de fontes naturais ou convencionalmente sintetizadas.

Os tensoativos sintéticos não naturais adequados para uso na presente invenção incluem tensoativos não iônicos com base em sorbitano, por exemplo, tensoativos de sorbitano substituídos por ácido graxo (comerci- almente disponível sob o nome SPANº ou ARLACELS), ésteres de ácido gra- xo de sorbitol polietoxilado (TWEEN9), ésteres de polietileno glico! de ácidos graxos de fontes tais como óleo de rícino (EMULFOR9); ácido graxo polietoxi- —lado(por exemplo, ácido esteárico disponível sob o nome SIMULSOL M-53%), polímero de isooctiltenolfformaldeído polietoxilado (TYLOXAPOLO), éteres de álcool graxo de polioxietileno (BRIJ%); éteres de não fenila de polioxietileno (TRITONº N), éteres de isooctilfenila de polioxietileno (TRITONS x). Geralmente falando, o tensoativo, ou à combinação de tensoati- vos, sedois ou mais tensoativos são usados, está presente na emulsão em uma quantidade de 0,01% a 10% em volume, de preferência, 0,1% a 6,0%, mais preferivelmente 0,2% a 5,0%.

| 2 .."op"SYPalam am7“.AFP A ARAôYASEA- AH Ê A avnúáúdiâ rr VU A TA PRA CSS SS SNC SSSSÓÔÓSS ils aê ssSAANhNNWNbÀ Ab» SAN»RNeNSSSNSSSSSSS . 29 : Tal como usado aqui, "um veículo farmaceuticamente aceitável" 7 inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, ad- juvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacte- rianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes retardantes de adsorção, e similares. O(s) veículo(s) devem ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com os outros componentes das composições e não deletérios ao paciente. Tipicamente, os veículos serão estéreis e livres de pirogênio, e selecionados com base no modo de administração a ser usado. É bem co- nhecido por aquele versado na técnica que as formulações preferidas para o veículo farmaceuticamente aceitável que compreendem as composições são aqueles veículos farmacêuticos aprovados nos regulamentos aplicáveis promulgados pelo Departmento dos Estados Unidos (US) de Agricultura ou Administração de Alimentos e Fármaco dos Estados Unidos, ou agência do . governo equivalente em um país não americano. Por esse motivo, o veículo farmaceuticamente aceito para produção comercial das composições é um ' veículo que já está aprovado ou será aprovado pela agência do governo a- propriada nos Estados Unidos ou país estrangeiro.

As composições opcionalmente podem incluir diluentes líquidos, semissólidos, ou sólidos farmaceuticamente aceitáveis (isto é, estéreis ou não tóxicos) compatíveis que servem como veículos, excipientes, ou meios farmacêuticos. Diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, eta- nol, glicerol, e similares. Agentes isotônicos podem incluír cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Estabilizantes incluem albumina, entre outros.

As composições podem também conter antibióticos ou conser- vantes, incluindo, por exemplo, gentamícina, mertiolato, ou clorocresol. As várias classes de antibióticos ou conservantes das quais para selecionar são bem conhecidos ao técnico versado, Preparação das Composições —Preparaçãode Formulações Adjuvantes Um ISCOM pode ser preparado por combinação de uma saponi- na, um esterol, e um fosfolipídeo. Por exemplo, um ISCOM pode conter 5%

; a 10% em peso de Quil A, 1% a 5% de colesterol e fosfolipídeos, e a proteí- * na restante, A relação de saponina para esterol nas formulações adjuvantes ' tipicamente serão na ordem de 1:100 peso para peso (p/p) a 5:1 p/p. Em algumas modalidades, estero! em excesso está presente, em que a relação de saponina para esterol é pelo menos 1:2 p/p, ou 1:5 p/p. Pag25 LEm ou- tras modalidades, a saponina está em excesso em relação para o esterol, e uma razão de saponina para esterol de cerca de 5,1 p/p é usada. ISCOM e ISCOMATRIZ são comercialmente disponíveis de Isconova AB (Suécia).

Em algumas modalidades, o CARBOPOLº é usado em combi- naçãocom DDA em uma quantidade de pelo menos 0,1 parte em peso de CARBOPOL* por parte em peso de DDA. Em outras modalidades, pelo me- nos 0,5 parte em peso de CARBOPOLº por parte em peso de DDA é usada. Em ainda outras modalidades, pelo menos 1 parte em peso de CARBOPOL? : por parte em peso de DDA é usada. A combinação de CARBOPOLº e DDA forma um complexo por meio do que o grupo funcional de amina terciária ] DDA imunofuncionaliza os grupos laterais de ácido carboxílica no polímero. Isto permite às células imunes específicas alvejarem o antígeno e adjuvante simultaneamente e coliberar o antígeno e adjuvante junto no tempo e con- centração ideal às referidas células.

Os adjuvantes descritos aqui geralmente não requerirão qual- quer veículo específico, e serão formulados em um tampão farmaceutica- mente aceitável aquoso ou outro. Em alguns casos, as vacinas das modali- dades descritas serão apresentadas em um veículo adequado, tal como, por exemplo, lipossomas adicionais, microesferas ou partículas de antígeno en- capsuladas. O antigeno pode ser contido dentro da membrana de vesícula ou contido fora da membrana de vesícula. Geralmente, antígenos solúveis estão fora e antígenos hidrofóbicos ou lipidados estão ou contidos dentro ou fora da membrana.

As composições adjuvantes podem ser produzidas de várias formas dependendo da rotina de administração, requerimentos de armaze- nagem, e similares. Por exemplo, elas podem ser produzidas na forma de soluções ou dispersões aquosas estéreis adequadas para uso injetável, ou SS a a a a a RE PG 9 E P óCP CC O OP Qi ii

. produzidas nas formas liofiizadas usando técnicas de secagem por conge- “ lamento, secagem a vácuo, ou secagem por spray.

As composições liofili- ' zadas podem ser reconstituídas antes do uso em uma solução estabilizante, por exemplo, solução salina ou HEPES.

Desta forma, as composições adju- vantespodem ser usadas como uma forma de dosagem sólida, semissólida, ou líquida.

Os adjuvantes podem ser produzidos usando técnicas conheci- das na arte.

Por exemplo, a saponina e colesterol! podem ser misturados em um detergente adequado, seguido por uma técnica de extração de solvente para formar lipossomas ou ISCOMs.

A saponina e colesterol podem tam- bém ser combinados para formar micelas helicoidais tal como descrito na Patente dos Estados Unidos Número 7.122.191. A solução salina tamponada por fosfato (PBS) pode ser usada . como o meio de tampão aquoso; o pH do tampão pode ser neutro ou ligei- | ramente alcalino ou ligeiramente acídico.

Por conseguinte, o pH pode estar | : em uma faixa de pH 6 a 8. Um pH de cerca de 7,0 à cerca de 7,3 é comum. ' A intensidade do tampão pode ser entre 10 a 50 mM de PO, e entre 10 a 150 MM de PO,. Em um exemplo, PBS a 0,063% é usado.

O pH pode ser ajustado usando NaOH ou HCl quando necessário.

As concentrações típi- casincluem de 1Na10N de HCleiNa10Nde NaOH.

A quantidade de adjuvante usada depende do antígeno com o qual ele é usado e a dosagem de antígeno a ser aplicada.

Ela é também dependente das espécies pretendidas e da formulação desejada.

Geralmen- te, a quantidade está dentro da faixa convencionalmente usada para adju- vantes.

Por exemplo, os adjuvantes tipicamente compreendem de cerca de 1 ug a cerca de 1000 ug, inclusive, de uma dose de 1 mL.

Similarmente, os antibióticos tipicamente compreendem de cerca de 1 ug a cerca de 60 ug, inclusive, de uma dose de 1 mL.

As formulações adjuvantes podem ser homogenizadas ou micro- fluidificadas.

As formulações são submetidas a um processo de mistura pri- Mária, tipicamente por inoculação uma ou mais vezes através de um ou mais homogenizadores.

Qualquer homogenizador comercialmente disponível po- " |

2 de ser usado para este propósito, por exemplo, emulsificante Ross (Haup- . pauge, NY), homogenizador Gaulin (Everett, MA), ou Microfluídics (Novoton, MA). Em uma modalidade, as formulações são homogenizadas durante três minutos em 10.000 rpm.

A microfludificação pode ser obtida pelo uso de um microfluidificador comercial, tal como número de modelo 110Y disponível por Microfluídics, (Newton, Mass.); Modelo Gaulin 30CD (Gaulin, Inc., Eve- rett, Mass.); e Tipo 8.30H de Rainnie Minilab (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Estes microfluidificadores operam forçando os fluidos através de pequenas aberturas sob pressão elevada, de modo que duas cor- rentes de fluido interajam em altas velocidades em uma câmara de interação para formar composições com gotas de um tamanho de submícron.

Em uma modalidade, as formulações são microfluidificadas pela passagem atra- vês de uma câmara de dimensão limitante de 200 mícrons em 68,95 +/- 3,45 . MPa (10.000 +/- 500 psi). As composições adjuvantes descritas aqui podem ser ambas ' homogenizadas e microfluidifcadas.

Em uma modalidade, um antígeno é " adicionado a um tampão apropriado.

A solução é agitada, e uma saponina é lentamente adicionada à solução de antígeno.

Um estero| é em seguida len- tamente adicionado à solução de antígeno/saponina, seguido pela adição lenta de um composto de amônio quaternário à solução de antíge- no/saponina/esterol.

A composição resultante é homogenizada, e em segui- da microfluidificada.

Depois da microfluidificação, um polímero é adicionado à composição microfluidificada.

Dependendo dos componentes usados, a ordem destas etapas pode ser alterada para otimizar a preparação das com- posições.

Preparação de Composições Imunogênicas e de Vacina As composições adjuvantes descritas aqui podem ser usadas na produção de composições imunogênicas e de vacina.

Para composições de vacina ou imunogênicas, cada dose contém uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um antígeno ou antígenos que pode variar dependendo da idade e condição geral do paciente, da rotina de administração, da natureza do antígeno, e outros fatores.

As quantidades e concentrações dos outros y oo ErÁ$“ímn a a $i NZ .TA / i o .. 0. -1J“"2. . +0$ SÉ ?2-]AROOITMES A +2 >- 2 . l0 "o"! Tm 0l3]« . ana 2 anos“ "ÃA?êAES==aA2"22 Ô0D [ aA- AM Pô" ] óPSÂI] AAA A 7 “"BnARAAGAA 177%" A ]73$59% 7 A OS "A 222AÉA 33 Ns componentes nas composições de vacina ou imunogênicas podem ser ajus- . tadas para modificar as propriedades físicas e químicas da composição, e : podem facilmente ser determinadas pelo técnico versado. Um aspecto van- tajoso das composições adjuvantes é que elas são totalmente configuráveis dependendo das características desejadas da composição. Por exemplo, se uma resposta de Th1 maior é desejada, a quantidade do estimulador de Th1 pode ser aumentada. Da mesma maneira, se uma resposta de Th2 maior é desejada, a quantidade do estimulador de Th2 pode ser aumentada. Uma resposta de Th1/Th2 equilibrada pode também ser obtida. As composições —imunogênicas e de vacina podem também ser homogenizadas ou microfluíi- dificadas tal como descrito acima. Administração e Uso das Composições Administração das Composições : Os tamanhos de dose das composições tipicamente variam de cercade 1 mL a cerca de 5 mL, inclusive, dependendo do paciente e do an- í tígeno. Por exemplo, para um canino ou felino, uma dose de ceêrca de 1 mL. ' é tipicamente usada, embora em gado uma dose de cerca de 2a5mLé tipicamente usada. No entanto, estes adjuvantes também podem ser formu- lados em microdoses, em que as doses de cerca de 100 uL podem ser usa- das.

As rotinas de administração para às composições adjuvantes in- cluem parenterais, orais, oronasais, intranasais, intratraqueais, tópicas, e em ovos. Qualquer dispositivo adequado pode ser usado para administrar às composições, incluindo seringas, conta-gotas, dispositivos de injeção sem —agulh, emplastros, e similares. A rotina e dispositivo selecionados para uso dependerão da composição do adjuvante, do antígeno, e do paciente, e tais são bem conhecidos ao técnico versado.

Uso das Composições Um dos requerimentos para qualquer preparação adjuvante de vacina para uso comercial é estabelecer a estabilidade da solução adjuvante durante longos períodos de armazenagem. Fornecidas aqui são as formula- ções adjuvantes que são fáceis de produzir e estáveis durante pelo menos

. e 34 : : 18 meses. Em uma modalidade, as formulações são estáveis durante cerca : de 18 meses. Em outra modalidade, as formulações são estáveis durante entre cerca de 18 a cerca de 24 meses. Em outra modalidade, as formula- ções são estáveis durante cerca de 24 meses. Os procedimentos de teste —aceleradostambém indicam que as formulações descritas aqui são estáveis.

Um aspecto vantajoso das presentes composições adjuvantes é que elas podem ser seguramente e eficazmente administradas a uma ampla faixa de pacientes, Na técnica, é esperado que as combinações de adjuvan- tes demonstrem mais reatogenicidade do que os componentes individuais.

Noentanto, as composições descritas aqui mostram reatogenicidade diminu- ida quando comparado às composições nas quais qualquer um ou dois dos componentes são usados, embora o efeito adjuvante seja mantido, Foi tam- bém surpreendentemente constatado que as composições adjuvantes des- . critas aqui demonstram melhoras de segurança quando comparado com ou- tras composições adjuvantes.

: As composições adjuvantes descritas aqui são úteis para produ- . ção de uma resposta imune desejada em um paciente. Elas são eficazes em múltiplas espécies. Um paciente adequado é qualquer animal para o qual a administração de uma composição adjuvante é desejada. Ele inclui mamiíferose não mamíferos, incluindo primatas, criação de gado, animais de estimação, animais de teste de laboratório, animais silvestres cativos, aves (incluindo em ovos), répteis, e peixe. Desta forma, este termo inclui, mas não é limitado a macacos, humanos, suíno; gado, carneiro, cabras, equinos, camundongos, ratos, cobaias, hamsters, coelhos, felinos, caninos, frangos, perus,patos, outras aves domésticas, rãs, e lagartos.

Os adjuvantes descritos aqui podem ser usados para mostrar di- ferenciação sorológica entre animais infectados e vacinados. Desta forma, eles podem ser usados em uma vacina marcadora na qual o antígeno na vacina produz nos animais vacinados um padrão de anticorpo diferente da- queledo vírus do tipo silvestre. Uma vacina marcadora é geralmente usada junto com um teste de diagnóstico companheiro que mede a diferença nos padrões de anticorpo e demonstra que os animais foram vacinados e que os SS ”

e animais são infectados com o virus do tipo silvestre. Tal tecnologia é útil no s controle e erradicação de vírus de uma população de pacientes.

Os seguintes exemplos são apresentados como modalidades ilustrativas, mas não devem ser tomados como limitando o escopo da inven- ção Muitas mudanças, variações, modificações, e outros usos e aplicações desta invenção serão aparentes àquele versado na técnica.

EXEMPLOS Exemplo 1. Soluções de Quil A /Colesterol (QC) A Quil A (Superfos) foi dissolvida em água e uma solução de matéria-prima de 50mg/ml foi preparada. O colesterol, (Fabri Chem Inc.) foi dissolvido em etanol e uma solução de matéria-prima de 18mg/ml foi prepa- rada. A solução de matéria-prima de colesterol em seguida foi filtrada usan- do um filtro de 0,2 mícron.

. A faixa de concentrações de Quil A e Colesterol nas várias for- mulações foitão baixa quanto 1/1 ug/ml de Quil A para colesterol até tão alta ' quanto 1000/1000 ug/mL. Para preparar uma solução de matéria-prima de ' Quil A/Colesterol de 50/50 pg/mL, a solução de matéria-prima de Quil A foi diluída com água a uma concentração de 50 ug/ml.. Enquanto agitando esta solução, a solução de matéria-prima de colesterol foi lentamente adicionada auma concentração final de 50 pg/mL.

Exemplo 2. Soluções de DDA (D) Brometo de amônio de dioctadecila de dimetila (DDA; Fluka Analytical), foi dissolvido em etanol, e uma solução de matéria-prima de 18mg/ml foi preparada. A solução de matéria-prima de DDA foi filtrada usan- doumfiltrode 0,2 mícron.

Exemplo 3. Soluções de Quil A/Colestero/DDA (QCD) Uma solução de matéria-prima de Quil A/Colestero! foi prepara- da como no Exemplo 1 às concentrações desejadas. Uma solução de maté- ria-prima de DDA tal como preparado no Exemplo 2 e lentamente adicionado à soluçãode matéria-prima de Quil A/Colesterol. As soluções foram mistura- das para obter as concentrações finais desejadas. O pH da solução foi ajus- tado com NaOH ou HCl quando necessário para alcançar o pH final deseja-

o do, que geralmente estava em uma faixa de cerca de 6,9 a cerca de 7,5. , Exemplo 4. Soluções de CARBOPOLº (C). O CARBOPOLº (Noveon, Mexico) foi dissolvido em água desio- nizada e uma solução de matéria-prima a 1,5% foi preparada. Em outra mo- —dalidade, o CARBOPOLS foi dissolvido em água desionizada e uma solução de matéria-prima a 0,75% foi preparada. Exemplo 5. Soluções de DDA/CARBOPOLº (DC). Uma solução de matéria-prima de DDA foi preparada como no Exemplo 2. Uma solução de matéria-prima de CARBOPOLº a 0,75% foi pre- parada como no Exemplo 4. As soluções foram misturadas para obter as concentrações finais desejadas. Exemplo 6. Soluções de Quil A/ColesteroV/DDA/CARBOPOLº (QCDC) Uma solução de matéria-prima de Quil A/Colesterol/DDA foi pre- . parada como no Exemplo 3. Uma solução de matéria-prima de CARBO- POL? a 0,75% foi preparada como no Exemplo 4. A solução de matéria- ' prima de CARBOPOLº foi lentamente adicionada à solução de matéria- prima de Quil A/Colesterol/DDA para obter à concentração final desejada. O pH da solução foi ajustado com NaOH ou HCI para alcançar o pH final desejado, que geralmente estava em uma faixa de cerca de 6,9 a cerca de 7,5. Exemplo 7. Soluções de Bay R1005º (R) Para preparar uma solução de matéria-prima de Bay R1005º, o glicolipideo — N-(2-desóxi-2-L-leucilamino-B-D-glicopiranosil)-N-octadecildo- decanoilamida foi dissolvido em etanol (60% v/v). Tween 20 e ácido acético glacial foram em seguida adicionados. Em um exemplo, 3,49 g de N-(2- desóxi-2-L-leucilamino-B-D-glicopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida foram dissolvidos em 44,64 mL de etanol/água (60% vv). Isto foi combinado com 1,12 mL de Tween 20 e 0,88 mL de ácido acético glacial.

Exemplo 8. Quil A/Colestero/DDA/CARBOPOLº/Bay R1005º (QCDCR) So- luções Uma solução de matéria-prima de Quil A/Colestero/DDA/CAR- BOPOLº foi preparada como no Exemplo 6. Uma solução de matéria-prima

NS de Bay R1005º foi preparada como no Exemplo 7. À solução de Bay R1005º “ foi lentamente adicionada à solução de Quil A/Colestero/DDA/CARBOPOLº ' para obter a concentração final desejada.

O pH da solução foi ajustado com NaOH ou HCl quando necessário para alcançar o pH final desejado, que geralmente estava em uma faixa de cerca de 6,9 a cerca de 7,5, Exemplo 9. Soluções de DEAE Dextrana (X) Uma solução de matéria-prima de DEAE Dextrana (X) foi prepa- rada por dissolução de 200 mg/ml de DEAE Dextrana em água.

A solução pode ser autoclavada durante cerca de 20 minutos em 120º Centígrados (C). Exemplo10. Soluções de Quil A/ColesteroVDDA/DEAE (QCDX) Uma solução de matéria-prima de Quil A/Colesterol/DDA foi pre- parada de acordo com o Exemplo 3. Uma solução de matéria-prima de DE- AE foi preparada de acordo com o Exemplo 9. As soluções foram combina- . das por adição delas diretamente em um homogenizador.

A mistura empre- gaum processo de mistura flash usando uma força de cisalhamento de mais : do que 1.000 sec-1. A mistura é feita por alimentação da solução aquosa Ú diretamente na fase de óleo contendo os adjuvantes não polares e compo- nentes de antígeno e misturando até que uma mistura estável homogênea seja obtida.

Tipicamente isto pode ser um mínimo de vários minutos ou por maistempo dependendo do tamanho de partícula desejado.

Exemplo 11. Composições de Óleo (O) Uma solução de matéria-prima de óleo foi preparada por combi- nação de óleo mineral de Drakeol com Tween 85 e Span 85, aquecendo a aproximadamente 55ºC e em seguida resfriamento e filtragem estéreis.

Esta míisturadestaforma compreenderia o componente base de fase de óleo para um veículo com base em óleo, Se Colesterol e/ou DDA foi selecionado ser um imunomodulador colaborador para um destas composições, ele então também seria adicionado a esta mistura antes da filtragem, uma vez que eles são solúveis na fase de óleo.

Exemplo12. Composições de Quil A/ColesteroVDDA/DEAE/Óleo (QCDXO) Uma solução de matéria-prima de Quil A/Colestero/DDA/ DEAE foi preparada de acordo com o Exemplo 10. Uma composição de matéria-

es + $ 38 7 prima de óleo foi preparada de acordo com o Exemplo 11. As soluções e- " ram uma combinação de Quil-A, DEAE-Dextrana e água para obter a quan- ' tidade nas referidas concentrações.

Esta fase aquosa foi misturada por agi- tação continuamente da reação durante vários minutos ou por mais tempo | emtemperatura ambiente ou superior e em seguida filtrada estéril e armaze- nada para adição à fase de óleo.

A fase aquosa foi lentamente adicionada em uma mistura continuamente de fase de óleo.

Exemplo 13. Preparação de Composições Imunogênicas ou Composições Ú de Vacina Para preparar uma composição imunogênica ou composição de vacina compreendendo um antígeno e um dos adjuvantes descritos acima, o antígeno desejado foi adicionado a um tampão apropriado.

Em seguida, os componentes do adjuvante desejado foram adicionados tal como descrito . acima.

A solução resultante foi conduzida ao volume final com o tampão, Exemplo 13a.

Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, CARBOPOLº ' Para preparar uma composição imunogênica ou composição de : vacina compreendendo um antígeno, Qui! A, colesterol, DDA, e CARBO- POLº, o antígeno desejado foi adicionado a um tampão apropriado.

Uma solução de matéria-prima de Quil A foi preparada como no Exemplo 1 e len- tamente adicionada à solução de antígeno.

Uma solução de matéria-prima de colesterol foi preparada como no Exemplo 1 e foi lentamente adicionada à solução de antigeno/Quil A.

Uma solução de matéria-prima de DDA foi preparada como no Exemplo 2 e lentamente adicionada à solução de antí- geno/Quil A/colesterol.

A solução de antígeno/Quil A/colesterol/DDA foi ho- mogenizada e microfluidificada.

Uma solução de CARBOPOLº a 0,75% foi preparada como no Exemplo 4. Depois da microfluidificação, a solução de CARBOPOLSº (0,05% v/v) foi adicionada à composição microfluidificada e o pH foi ajustado com NaOH ou HCl a cerca de 6,9 a cerca de 7,5. Exemplo 13b.

Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, CARBOPOLº, Bay R1005º Para preparar uma composição imunogênica ou composição de vacina compreendendo um antígeno, Quil A, colesterol, DDA, CARBOPOLº, e Bay R1005º, o antígeno desejado foi adicionado a um tampão apropriado.

a“ t 39 o Uma solução de matéria-prima de Quil A foi preparada como no Exemplo 1 e 7 lentamente adicionada à solução de antígeno.

Uma solução de matéria- prima de colesterol foi preparada como no Exemplo 1 e foi lentamente adi- cionada à solução de antígeno/Quil A.

Uma solução de matéria-prima de DDA foipreparada como no Exemplo 2 e lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil A/colesterol.

A solução de antígeno/Quil A/colesteroVDDA foi homogenizada e microfluidificada.

Uma solução de CARBOPOLº a 0,75% foi preparada como no Exemplo 4. Depois de microfludificação, à solução de CARBOPOLº (0,05% v/v) foi adicionada à composição microflui- dificadaeopH foi ajustado com NaOH ou HCl a cerca de 6,9 a cerca de 7,5. Uma solução de matéria-prima de Bay R1005º foi preparada como no E- xemplo 7. O componente de Bay R1005º foi adicionado à fase aquosa de- pois que o DDA foi adicionado. . Exemplo 13c.

Antígeno, Qui! A, Colesterol, DDA, DEAE Dextrana Para preparar uma composição imunogênica ou composição de ' vacina compreendendo um antígeno, Quil A, colesterol, DDA, e DEAE dex- ' trana, o antígeno desejado foi adicionado a um tampão apropriado.

Uma solução de matéria-prima de Quil A foi preparada como no Exemplo 1 e len- tamente adicionada à solução de antígeno.

A composição foi homogeniza- da Uma solução de matéria-prima de colesterol foi preparada como no E- xemplo 1 e foi lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil A durante a homogenização.

Uma solução de matéria-prima de DDA foi preparada como no Exemplo 2 e lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil Alcolesterol durante a homogenização.

Uma solução de DEAE dextrana foi preparada como no Exemplo 9. Durante a homogenização, à solução de DEAE dextrana foi adicionada e a composição resultante foi conduzida ao volume final.

Exemplo 13d.

Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, DEAE Dextrana, Óleo Para preparar uma composição imunogênica ou composição de vacina compreendendo um antígeno, Quil A, colesterol, DDA, DEAE dextra- na, e Óleo, o antígeno desejado foi adicionado a um tampão apropriado.

Uma solução de matéria-prima de Quil A foi preparada como no Exemplo 1 e

. v 40 o lentamente adicionada à solução de antígeno.

A composição foi homogeni- - zada.

Uma solução de matéria-prima de colesterol foi preparada como no Exemplo 1 e foi lentamente adicionada à solução de antigeno/Quil A durante a homogenização.

Uma solução de matéria-prima de DDA foi preparada como no Exemplo 2 e lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil Alcolestero| durante a homogenização.

Uma solução de DEAE dextrana foi preparada como no Exemplo 9. Durante a homogenização, a solução de DEAE dextrana foi adicionada.

Uma composição de óleo foi preparada co- mo no Exemplo 11. Durante a homogenização, a composição de óleo foi adicionada por alimentação da fase aquosa na fase de óleo enquanto homo- genizando e a composição resultante foi conduzida ao volume final.

Exemplo 14. Vacinas de Vírus de Leucemia Felina (FelLV) Os animais foram aleatoriamente designados aos grupos de tra- : tamento usando um esquema em bloco completo aleatorizado, A Tabela 1 | mostra o esquema de estudo.

Os blocos foram baseados na data de nasci- : mento e ninhada.

Os animais foram classificados pela data de nascimento e ' em seguida ninhada.

Blocos de quatro foram usados.

Dentro de um bloco, os animais foram aleatoriamente designados ao tratamento.

Para a fase de vacinação do estudo, dois blocos consecutivos foram combinados para for- marum grupo de oito animais.

Os grupos de animais foram aleatoriamente designados a dois ambientes de modo que cada ambiente contivesse cinco grupos (10 blocos) de animais.

Dentro de um grupo de animais, os animais foram aleatoriamente designados a quatro gaiolas localizadas uma próxima da outra de modo que cada gaiola contivesse dois animais com o mesmo tratamento.

Para a fase de desafio do estudo, os animais de um ambiente de vacinação foram aleatoriamente designados a ou um ou dois ambientes de desafio.

O ambiente de vacinação selecionado para ir em dois ambientes de desafio, tinha cinco blocos aleatorizados para cada ambiente de desafio (2,5 grupos; 20 animais). O outro ambiente de desafio continha 10 blocos (6 grupos; 40 animais). Dentro de um ambiente de desafio, os animais no mesmo bloco foram aleatoriamente designados a quatro gaiolas localizadas uma próxima da outra.

. , 414 Na As vacinas para este estudo foram preparadas como no Exem- ' plo 13 exceto que uma solução de matéria-prima de CARBOPOLº a 1,5% foi usada. Especificamente, LEUKOCELLº 2 (Pfizer, Inc.) foi preparado por propagação de Fel V, subgrupos A, B, e C, em células linfoides transforma- dasporFelV. Os antígenos virais foram quimicamente inativados, combi- nados com um adjuvante estéril para intensificar a resposta imune, e emba- lados na forma líquida. Uma quantidade total de 100 mL de Produto Veteri- nário Investigacional (IVP) contendo o vírus de leucemia felina e 25 ug de Qui! A/hidróxido de alumínio (ALHYDROGELº) foi preparado. Um total de 94,5 mL de uma solução de matéria-prima de FelV a 1,106x10º ng/mL foi misturado lentamente durante 15 minutos. O pH foi ajustado a 5,9 até 6,1 com HCl a 4N ou NaOH a 18%, se necessário. Enquanto agitando, 0,5 mL de uma solução a 5,0 mg/mL de Quil A foi adicionado à solução de antígeno.

, Em seguida, 5,0 mL de ALHYDROGELº a 100% v/v foram lentamente adi- cionados. A composição foi agitada durante um mínimo de 2 horas em 4º C.

' O pH foi ajustado para entre 7,0 e 7,3 com NaOH a 18% ou HCl a 1N, quan- do necessário.

O IVP compreendendo o vírus de leucemia felina e 37,5 ug de Quil A/hidróxido de alumínio (ALHYDROGEL?) foram preparados da mesma maneira como para os 25 pg de IVP de Quil A mas 7,5 ml da solução de ma- téria-prima de Quil A foram adicionados à solução de antígeno.

Uma quantidade total de 350 mL do Produto Veterinário Investi- gacional (IVP) contendo o vírus de leucemia felina, Quil A, Colesterol, DDA, e CARBOPOLº foi preparada. Enquanto agitando 349,3 mL de uma solução de matéria-prima de FelV a 1,106x10º ng/mL, 0,14 mL de uma solução de Quil A a 50,0 mg/mL foi lentamente adicionado à solução de antígeno. Em seguida, 0,39 mL de uma solução de colesterol/etanol a 18 mg/mL foi lenta- mente adicionado. A composição foi homogenizada durante três minutos em

10.000 rpm. Um total de 0,19 mL de uma solução de DDA/etanol a 18,0 —mg/mL foi adicionado à composição enquanto agitando. Um total de 5,0 mL de uma solução de CARBOPOLº a 1,5% foi lentamente adicionado a 145,0 mL da composição de vírus de leucemia felina, Quil A, Colesterol, e DDA. O

ST ?)-.I!A Po 22 2 Cz22" PO “OOOOOOOO »/Im>'ihh Da a SS NOS A aa. . 42 , pH foi ajustado entre 7,0 e 7,3 com NaOH a 18% ou HCl à 1N, quando ne- - cessário.

Tabela 1: Esquema Experimental Grupo — de Número de da Tratamento |IVPº Animais — |Vacinação [10 fsansesama ba os ao [sc | [102 — ieuroceus22s gas ouantos an oz fio 1sc | | «sc e TO4 20 sc AlColesteroVDDA/CARBOPOL*” EESNSEEIC ENCARA | Dia do Desafio.

Tratamento. mi) Solo mes [io Ífow [2s56405105 107 194 141,140,65 [15º farsa 10 Jon [2356405 100127/190,141,148,165 [10 farsa Jo fon [2,35.0406,100,127,124, 141, 14,155] [10 [anna dio low [2366405 100,27, 134141, 148,85 “Produto Veterinário Investigacional “Misturado para conter uma potência relativa comparável à vacina de refe- rência (Lote No. 12 de Referência de Fel V) º*SC = Subcutânea “Depo-Medrol?: Dia 42 (aproximadamente 5,0 mg/kg) pela rotina intramuscu- lar *ON = Oronasal Quil A-— Colesterol = Quil A adjuvante de saponina, incorporada em partícu- las de lipídeo de colestero! CARBOPOLº = Carbômero DDA = Brometo de dimetildioctadecilamônio Todos os animais foram observados diariamente e as observa- ções foram registradas.

As temperaturas corporais foram registradas de to- dos os animais pela rotina timpânica no Dia 1 antes da primeira administra- : DD EMT O EE[[ a fa mui 5*»,<<,NiilihaAS Q&;yYFS“““QI;EPÚ” Ô““ÂÔÂúº 6? ““““ O“) O a NA r 43 "ss ção de dose de vacina e no Dia 20 antes da segunda administração de dose 7 de vacina. Uma amostra de sangue (1,0 a 2.0 mL) foi coletada de cada ani- mal por venipunção da veia jugular, no Dia 2. As doses sedativas de TELA- ZOLº (Fort Dodge Animal Health) foram administradas de acordo com o pe- so corporal (aproximadamente 5,0 mg/kg) pela rotina intramuscular a fim de minimizar o estresse animal e evitar lesão aos treinadores de animais duran- te a coleta de sangue. O sangue foi coletado em tubos de separação de soro (SST) e processado para separação de soro. O soro foi armazenado em —20ºC ou mais frio até que fosse testado, As vacinas de placebo ou FelV foram administradas aos gati- nhos pela rotina subcutânea em uma dose de 1,0 mL. A primeira vacinação foi realizada no Dia 0 e a segunda administração de vacina foi realizada no Dia 21. Todos os animais foram observados durante aproximadamente uma ; hora em seguida a primeira e segunda vacinações para reações de dor (rea- ções de estímulo) locais imediatas. As observações foram documentadas. As ' temperaturas corporais de todos os animais foram medidas pela rotina timpâ- ' nica nos Dias 1 e 2 em seguida à primeira administração de dose de vacina, e nos Dias 22 e 23 em seguida à segunda administração de dose de vacina. As reações do sítio de injeção (tumefações) foram também determinadas no Dia 1depoisda primeira vacinação e nos Dias 22 e 23 depois da segunda vacina- ção. Uma amostra de sangue (1,0 a 2,0 mL) foi coletada de cada animal por venipunção da veia jugular, no Dia 35, processada para separação de soro, E armazenada em —20ºC ou mais frio até que fosse testada.

No Dia 35, os animais foram colocados em gaiolas de isolamen- toindividual. O vírus de desafio foi Vírus de Leucemia Felina (FelV) virulen- to, cepa de Rickard, titulada em aproximadamente 10º * TCID50/mL. O mate- rial de desafio de FeLV foi descongelado e mantido em gelo úmido antes de administração. Os animais foram desafiados nos Dias 37, 40, 42, e 44, atra- vés de administração de 1,0 mL pela rotina nasal de material de desafio não diluído, Uma seringa de tuberculina de 1 mL, sem a agulha, foi enchida com o material de desafio. Cada gatinho foi administrado aproximadamente 0,5 mL por narina. No Dia 42, a administração de desafio foi desempenhada a-

A proximadamente 5 horas após a administração de DEPO-MEDROLº. Depois ” de cada dia de desafio, uma amostra do material de desafio foi retida para titulação confirmatória.

Após o desafio, uma amostra de sangue (1,0 a 2,0 mL) foi cole- tada de cada animal por venipunção da veia jugular, nos Dias 64, 85, 106, 127, 134, 141, 148, e 155. As doses sedativas de TELAZOLº (Fort Dodge) foram administradas tal como descrito acima. O sangue foi coletado em tu- bos de separação de soro (SST), processado para separação de soro, e ar- mazenado em —20ºC ou mais frio até que fosse testado. As amostras de soro foram testadas quanto a presença de antígeno p27 de Fel.V (marcador de infecção de Fel V) através de ELISA (IDEXX; Westbrook, ME). Os resul- tados finais foram avaliados pela intensidade de desenvolvimento de cor e por espectrofotômetro em uma densidade óptica de 405/490 nm. Para um , teste válido, a densidade óptica de controle positivo tinha que cair entre 0,131 e 2,999 e o controle negativo devia ter densidade óptica abaixo ou " igual a 0,0039.

: O isolamento de vírus foi desempenhado usando amostras de so- ro coletadas nos Dias 2 e 35. As amostras de soro dos Dias 127 até 155 fo- ram consideradas para avaliar a eficácia da vacina de Fel V. As amostras de —sorodo Dia 127 (semana 12), Dia 134 (semana 13), Dia 141 (semana 14), Dia 148 (semana 15) e Dia 155 (semana 16) foram testadas quanto a presença de antígeno p27 de Fel V. Um animal foi considerado persistentemente infectado se ele tivesse três ou mais resultados de teste de antígeno p27 de Fel.V posi- tivos durante os Dias 127 (semana 12) até 155 (semana 16).

As temperaturas foram analisadas usando um modelo misto de medições repetidas linear geral, e comparações de tratamento em pares fo- ram feitas entre tratamento TO01 e tratamentos T02, TO3, e TO4 em cada pon- to do tempo se o tratamento total e/ou tratamento por efeito do ponto do tempo fosse significante. Processos dos mínimos quadrados, intervalos de confiança de 95%, mínimos e máximos foram calculados para cada trata- mento em cada ponto do tempo.

As distribuições de frequência da presença de reações de estímu-

| 45 a lo foram calculadas para cada tratamento e dados de ponto do tempo foram " . coletados. As distribuições de frequência da presença de tumefações do sítio de injeção foram calculadas para cada tratamento e os dados de ponto do tempo foram coletados. As distribuições de frequência da presença de rea- çcõessistêmicas pós-vacinação foram calculadas para cada tratamento.

Reações imediatas não foram observadas em quaisquer dos grupos de tratamento durante a primeira e segunda vacinação, Reações adversas não foram observadas em quaisquer dos grupos de tratamento em aproximadamente uma hora após a primeira e segunda vacinações. Nem pirexia (temperatura corporal > 39,5ºC) nem hipotermia (temperatura corpo- ral < 37,0ºC) foi observado em quaisquer dos grupos de tratamento depois da primeira e segunda vacinações, Não houve nenhuma diferença signifi- cante na temperatura corporal média entre grupos de tratamento em qual- quer ponto do tempo (p > 0,08). As tumefações do sítio de injeção não fo- Tam observadas em quaisquer dos grupos de tratamento depois da primeira e segunda vacinações.

Os resultados finais da semana 12 à semana 16 pós-desafio in- dicaram que 16 dentre 19 animais (84%) que receberam a vacina de placebo (grupo TO1) eram persistentemente virêmicos ao Fel V. 13 dentre 19 animais (68%) no grupo TO2 foram protegidos de desafio virulento de FelV. O nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0004) comparado aos ga- tinhos vacinados com placebo. 12 dentre 19 animais (63%) no grupo TO3 foram protegidos de desafio virulento de Fel.V. O nível de proteção foi esta- tisticamente significante (p= 0,0013) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 19 dentre 20 animais (95%) no grupo TO4 foram protegidos de de- safio virulento de FelV. O nível de proteção foi estatisticamente significante (p=0,0001) comparado aos gatinhos vacinados com placebo.

Desta forma, todas as vacinas administradas aos grupos TO2, TO3 e TO4 demonstraram ser seguras em gatinhos na idade mínima quando administradas em um regime de duas doses, três semanas entre si. Adicio- nalmente, as vacinas administradas a estes grupos foram também capazes de reduzir significantemente o nível de viremia persistente de FelV em gati-

= “ 46 i : nhos na idade mínima quando administradas em um regime de duas doses, ' três semanas entre si.

Houve uma redução estatisticamente significante no estabelecimento de viremia persistente de Fel V em gatinhos nos grupos TO02, TO3 e TO4. Adicionalmente, houve uma diferença estatisticamente sig- nificante entre TO4 e os outros grupos de vacina (TO2, TO3). Foi surpreen- dente e inesperado que as vacinas contendo a nova formulação adjuvante provaram ser mais eficazes que aquelas contendo componentes adjuvantes comumente usados em gatos.

Exemplo 15. Vacinas de Vírus de Leucemia Felina Os gatinhos foram aclimatados durante dezesseis dias depois da chegada.

Os animais foram em seguida aleatoriamente designados a um ambiente, e dentro de um ambiente, foram aleatoriamente designados a tra- tamentos (1 animal por tratamento em cada ambiente). Uma amostra de . sangue (1,0 a 2,0 mL) foi coletada de cada animal por venipunção da veia ' 15 jugular no Dia de Estudo 1. As doses sedativas de TELAZOLº (Fort Dodge ' Animal Health) foram administradas de acordo com o peso corporal (aproxi- madamente 5,0 mg/kg) pela rotina intramuscular a fim de minimizar estresse | animal e evitar lesão aos treinadores de animais durante a coleta de sangue.

O sangue foi coletado nos tubos de separação de soro e processado para separação de soro, Todos os animais foram também observados diariamen- te, e observações foram registradas.

As vacinas foram preparadas como no Exemplo 13 exceto que uma solução de matéria-prima de CARBOPOLº a 1,5% foi usada.

LEUKO- CELLº 2 foi preparado por propagação de Fel V, subgrupos A, B, e C, em células linfoides transformadas por Fel.V.

Os antígenos virais foram quimi- camente inativados, combinados com um adjuvante estéril para intensificar a resposta imune, e embalados na forma líquida.

Uma quantidade total de 500,0 mL de IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma Potência Rela- tiva (RP) de 2, Quil A, Colesterol, e DDA foi preparada da seguinte maneira.

Umtotalde20,7mL de uma solução de matéria-prima de Fel V (50,0 RP/mL | onde 1 RP = 3,624 ng/mL de antígeno) foram adicionados a 478,2 mL de tampão de PBS a 0,063%. Enquanto agitando, 0,21 mL de uma solução a ss A A A O A A

O — sos ss selo . 1 20P*7.A“ 177 %I12A )“ )i“”“mm Pa r'm am e imà a 0 0 o !"?ú! ô 0. T â" “ 0 "e too 47 ' z 50,0 mg/mL de Quil A foi lentamente adicionado à solução de antígeno, Em ' seguida, 0,58 mL de uma solução de colesterol/etanol a 18 mgimL foi lenta- ' mente adicionado.

Um total de 0,29 mL de uma solução de DDA/etanol a 18,0 ma/mL foi lentamente adicionado à composição enquanto agitando.

A composição foi homogenizada durante três minutos em 10.000 rpm.

A composição foi em seguida microfluidificada por uma passagem por uma câmara de dimensão limitante de 200 mícrons em 68,95 (+ 3,45) MPa (10.000 (+ 500) psi). Enquanto agitando, 10,0 mL de uma solução de CAR- BOPOLº a 1,5% foi lentamente adicionada a 290,0 mL da composição de vírusde leucemia felina, Quil A, Colesterol, e DDA.

O pH foi ajustado a en- tre 7,0 e 7,3 com NaOH à 18% ou HCl a 1N, quando necessário.

O IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 5 foi preparado da mesma maneira como o IVP com uma RP de 2 uso de 51,7 mL : da solução de matéria-prima de Fel V e 447,2 mL de tampão de PBS a 0,063%, . 15 comasquantidades dos outros componentes permanecendo as mesmas. ' O IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 10 foi preparado da mesma maneira como o IVP com uma RP de 2 usando 93,1 mL da solução de matéria-prima de Fel V, 355,9 mL. de tampão de PBS a 0,063%, 0,19 mL da solução de Qui! A, 0,52 mL da solução de colesterol, e 0,26 mL da solução de DDA (450 mL de volume total). Em seguida, 8,3 mL de uma solu- ção de CARBOPOLº a 1,5% foram lentamente adicionados a 241.7 mL da composição de vírus de leucemia felina, Quil A, Colesterol, e DDA.

O IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 15 foi preparado da mesma maneira como o IVP com uma RP de 10 usando 139,7 mL da solução de matéria-prima de Fel V e 309,4 mL de tampão de PBS a 0,063%, com as quantidades dos outros componentes permanecendo as mesmas.

O IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 20 foi preparado da mesma maneira como o IVP com uma RP de 2 usando 206,9 mL da solução de matéria-prima de Fel.V e 292,0 mL de tampão de PBS a 0,063%, —comas quantidades dos outros componentes permanecendo às mesmas, Para administração de uma dose de 0,5 mL, 300,0 mL de IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 5, Quil A, Colesterol, OS SA |

. “ 48 o DDA, e CARBOPOL" foram preparados da seguinte maneira. Um total de ' 21,7 mL de uma solução de matéria-prima de Fel.V (35,8 RP/mL onde 1 RP = 1,864 ug/mL de antígeno) foi adicionado a 277,7 mL de tampão de PBS a 0,063%. Enquanto agitando, 0,12 mL de uma solução a 50,0 mg/mL de Quil Afoilentamente adicionado à solução de antígeno. Em seguida, 0,35 mL de uma solução de colestero!l/etanol a 18 mg/mL foi lentamente adicionado. Um total de 0,17 mL de uma solução de DDA/etanol a 18,0 mg/mL foi lentamente adicionado à composição enquanto agitando. A composição foi homogeni- zada durante três mínutos em 10.000 rpm. A composição foi em seguida mi- crofluidificada por uma passagem por uma câmara de dimensão limitante de 200 mícrons em 68,95 (+ 3,45) MPa (10.000 (+ 500) psi). Enquanto agitan- do, 3,3 mL de uma solução de CARBOPOLº a 1,5% foram lentamente adi- cionados a 96,7 mL da composição de vírus de leucemia felina, Quil A, Co- . lesterol, e DDA. O pH foi ajustado a entre 7,0 e 7,3 com NaOH a 18% ou HCl! . 15 a1N, quando necessário.

' O IVP para administração de uma dose de 1,0 mL do vírus de leucemia felina em uma RP de 5, Quil A, Colesterol, DDA, e CARBOPOLº foi preparada da mesma maneira como para a dose de 0,5 mL com as quanti- dades ajustadas apropriadamente. Uma quantidade total de 300,0 mL de IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 10 e CARBOPOLS foi preparada. Um total de 62,1 mL de uma solução de matéria-prima de Fel V (50,0 RP/mL onde 1 RP = 3,624 ug/mL de antígeno) foi adicionado a 237,9 mL de tampão de PBS a 0,063%. A composição foi homogenizada para três minutos em

10.000 rpm. A composição foi em seguida microfluidificada por uma passa- gem por uma câmara de dimensão limitante de 200 mícrons em 68,95 (+ 3,45) MPa (10.000 (+ 500) psi). Enquanto agitando, 3,3 mL de uma solução de CARBOPOL?º a 1,5% foram lentamente adicionados a 96,7 mL da com- posição de vírus de leucemia felina. O pH foi ajustado a entre 7,0 e 7,3 com NaOHa18%ouHClal1N, quando necessário. As vacinas de placebo e Fel.V (Tabela 2) foram administradas aos gatinhos pela rotina subcutânea usando uma agulha de calibre 22 x | z 1,91 cm (34”) e seringa de 3 cm? no Dia de Estudo 0 e Dia de Estudo 20. Ao : grupo de tratamento T01 foi administrada a vacina de placebo em uma dose ' de 1,0 mL. Aos grupos de tratamento TO2, TO4, TOS, TO6, TO7, TO8 e TO9 foram administradas as vacinas de FelV em uma dose de 1,0 mL. Ao grupo de tratamento TO3 foi administrada a vacina de FelV em uma dose de 0,5 mL. Ao grupo de tratamento T10 foi administrada a vacina de varíola dos canários de Fel V (Merial) pela rotina intradérmica usando um injetor de pis- tola intradérmico. Tabela 2: Esquema Experimental Grupo de | Número | Potência | Rotina de | Vacina — | Adjuvante Meios de Cultura ZeerIo E mento —| mais Ato — ção — o deConeia) |

PERES : Normal * EFE EEE : instvado — | DDA—CARBOPOLº DP fr e emo inativado | DDA-CARBOPOLº instvado —| DDA-CARBOPOLº Pr rF nero Ínativado | DDA-CARBOPOL? PEFFEgEZR inaívado | DDA-CARBOPOLº? Perri - inafvado —| DDA-CARBOPOLº PFrFFE inefvado | DDA-CARBOPOL? : PrErErT EA] nafvado Fe Emi a r 50 i z Todos os animais foram observados em seguida a primeira vaci- ' nação (Dia de Estudo 0) e segunda vacinação (Dia de Estudo 20) quanto a sinais de dor na administração de vacina de teste incluindo a vocalização, arranhão/mordida e tentativa agressiva ou de fuga.

A atitude pós-vacinação (normalou anormal) foitambém documentada.

Todos os animais foram ob- servados durante aproximadamente uma hora depois da administração de vacina no Dia de Estudo O e Dia de Estudo 20 para o desenvolvimento de reações sistêmicas adversas.

As observações foram documentadas.

Os sítios de vacinação foram apalpados, e dor no sítio de injeção, vermelhidão nosítiode injeção, tumefação do sítio de injeção e tamanho de tumefação foram registrados.

As observações foram desempenhadas nos Dias de Es- tudo 2, 5 e 9 depois da primeira vacinação, e nos Dias de Estudo 25, 28 e 32 depois da segunda vacinação.

As observações foram documentadas. . Uma amostra de sangue (1,0 a 2,0 mL) foi coletada de cada R 15 animal por venipunção da veia jugular no Dia de Estudo 32 (pré-desafio). ' Animais foram desafiados nos Dias de Estudo 34, 36, 39, e 41 através de administração de 1,0 mL pela rotina nasal de material de desafio não diluído.

Uma seringa de tuberculina de 1 mL, sem a agulha, foi enchida com o mate- rial de desafio.

A cada gatinho foi dado aproximadamente 0,5 mL por narina.

O material de desafio de FelV tinha um título médio de 10º* TCIDso/mL.

Uma amostra de sangue (1,0 a 2,0 mL) foi em seguida coletada de cada a- nimal por venipunção da veia jugular nos Dias de Estudo 61, 83, 106, 126, 133, 138, 146, e 152. Resultados - Segurança Durante a primeira (Dia de Estudo 0) vacinação, três animais no grupo de tratamento TO9 demonstraram reações do tipo estimulo imediatas.

Durante a segunda vacinação (Dia de Estudo 20), um animal do grupo de tratamento TOS, quatro do grupo de tratamento TO8, e dois do grupo de tra- tamento TOS demonstraram reações do tipo estímulo imediatas.

Durante a primeira vacinação, três animais do grupo de trata- mento TO9 demonstraram menor vocalização.

Os animais apresentando dor na primeira vacinação também apresentaram menor vocalização neste mo-

——ã a A... 222) o A?! cai ““mo eâA' > : " 51 o mento. Durante a segunda vacinação, um animal do grupo de tratamento : TO5, quatro do grupo de tratamento TO8, e dois do grupo de tratamento TO9 i demonstraram menor vocalização. Os animais apresentando dor na segun- da vacinação também apresentaram menor vocalização neste momento.

Durante a primeira vacinação, três animais no grupo de trata- mento TO9 demonstraram comportamento agressivo/tentativa de fuga. Du- rante a segunda vacinação, um animal do grupo de tratamento TOS, quatro do grupo de tratamento TO8, e dois do grupo de tratamento TO9 demonstra- ram comportamento agressivo/tentativa de fuga.

Nenhum dos grupos de tratamento apresentaram arra- nhão/mordida no sítio de injeção na primeira ou segunda vacinação. As rea- i ções do sitio de injeção não foram observadas em qualquer dos grupos de tratamento após a primeira ou segunda vacinação. Reações adversas não - foram também observadas em qualquer dos grupos de tratamento. . 15 Resultados- Eficácia Ú Todos os animais testados negativo antes da vacinação quanto Ú ao antígeno p27 de Fel V de amostras de soro coletadas no Dia 1. Todos os animais também testados negativo antes do desafio quanto ao antígeno p27 de Fel. V de amostras de soro coletadas no Dia 32.

Os resultados finais de semana 12 a semana 16 pós-desafio (Tabela 3) indicaram que 9 dentre 10 animais (90%) no grupo de tratamento TO1 (placebo) eram persistentemente virêmicos ao Fel V. Os resultados do mesmo período indicaram que 6 dentre 10 animais (60%) no grupo de trata- mento T02 foram protegidos de desafio virulento de Fel V; este nível de pro- teção não foi estatisticamente significante (p= 0,0573) comparado aos gati- nhos vacinados com placebo. Nove dentre 10 animais (90%) no grupo de tratamento T03 foram protegidos de desafio virulento de FeLV; este nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0011) comparado aos gati- i nhos vacinados com placebo. 10 dentre 10 animais (100%) no grupo de tra- tamento TO4 foram protegidos de desafio virulento de Fel V; este nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0001) comparado aos gati- nhos vacinados com placebo. 10 dentre 10 animais (100%) no grupo de tra-

2 s 52 i 2 tamento TOS foram protegidos de desafio virulento de Fel V; este nível de ' proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0001) comparado aos gati- i nhos vacinados com placebo. 7 dentre 10 animais (70%) no grupo de trata- mento TOS foram protegidos de desafio virulento de Fel V; este nível de pro- teção foi estatisticamente significante (p= 0,0198) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 10 dentre 10 animais (100%) no grupo de trata- mento T07 foram protegidos de desafio virulento de Fel V; este nível de pro- teção foi estatisticamente significante (p= 0,0001) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 8 dentre 10 animais (80%) no grupo de tratamento TO8 foram protegidos de desafio virulento de Fel V; este nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0055) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 5 dentre 10 animais (50%) no grupo de tratamento TO9 foram protegidos de desafio virulento de Fel V; este nível de proteção não foi esta- , tisticamente significante (p= 0,1409) comparado aos gatinhos vacinados com - 15 placebo.

Finalmente, 6 dentre 10 animais (60%) no grupo de tratamento T10 ] foram protegidos de desafio virulento de Fel V; este nível de proteção não foi É estatisticamente significante (p= 0,0573) comparado aos gatinhos vacinados com placebo.

Tabela 3. Sumário de Nível de Proteção tamento de Vacina Proteção tiva rd | ag | To3 50%

. Discussão As vacinas usadas nos grupos de tratamento T02, TO3, TO4, TOS e TO07 demonstraram um perfil de segurança satisfatório durante a primeira vacinação, quando nenhuma reação foi observada neste momento.

Um úni- coanimalno grupo de tratamento TO5 demonstrou uma reação imediata (dor na administração, menor vocalização e tentativa agressiva/de fuga) na se- gunda vacinação.

Este evento poderia ser associado com uma resposta exacerbada à vacinação pelo animal particular em vez de a um problema de formulação de vacina.

Todas as vacinas demonstraram um perfil de segu- rança satisfatório pós-vacinação, uma vez que nem reações locais nem eventos adversos relacionados à vacinação foram observados.

As vacinas de Fel V administradas aos grupos de tratamento TO3, TOA4, TO5, TO7 e TO8 demonstraram eficácia satisfatória, uma vez que = 80% de proteção (275% de fração preventiva) foram obtidos depois do de- safio com FelV virulento.

Que a vacina dada ao grupo TO07 forneceu 100% | de proteção é surpreendente e inesperado, quando animais neste grupo re- ceberam 25% e 33% da dose de antígeno de animais nos grupos TO4 e TOS, respectivamente.

Uma vantagem clara dos adjuvantes descritos e testados aqui é que eles permitem uma dose menor de antígeno a ser usada, embora ainda induzindo uma resposta imune totalmente protetora.

As vacinas admi- nistradas aos grupos de tratamento TO2, TO6 e TO9 demonstraram uma efi- cácia um pouco diminuída (< 80% de proteção; fração preventiva < 75%) em seguida ao desafio com FeL V virulento.

A eficácia diminuída da vacina ad- ministrada ao grupo de tratamento T02 foi possivelmente feita à presença de animais respondedores reduzidos neste grupo.

Exemplo 16. Em Vacinação de Ovo contra Eimeria em Frangos A coccidiose aviária é uma doença intestinal geralmente causa- da por protozoários do gênero Eimeria, e representa um problema mundial sério para a indústria de aves domésticas.

Os parasitas ingeridos durante a alimentação localizam-se no trato intestinal onde eles causam séria lesão aos tecidos intestinais e subjacentes.

As perdas econômicas resultantes para a indústria de aves domésticas são muito significantes, uma vez que a

———»zcccc!oaosaqcnmScC//0]LNC0/]Ô0]0SNegemcévi iiiiôtôetetecn;úíúil STUU”PNPUNOIO O: . É AEP"RAAMRN Mm O SS>Aa A P .. .eÂi“. . a. . .:j““ s. "Ôs OC" oa A AAA AÁMM CTA? nA“á┓l CO o. : 54 i , conversão alimentar e ganho de peso de ambas as aves de abate e coloca- ' doras de ovo são prejudicadas. Um resumo geral do estado da técnica, in- cluindo tentativas de vacinar contra Eimeria usando, por exemplo, proteínas de Eimeria recombinantes como antígeno é uma variedade de sistemas ad- juvantes, é descrito nas seguintes publicações, a totalidade do qual é incor- porado através de referência aqui, como se totalmente apresentado, (1) H.S, Lillehoj e outros, J. Pariísitol, 91(3), 2005, pp. 6686-673; (2) H.S. Lillehoj e ou- tros, Avian Diseases, 49 2005, 112-117; e (3) R. A. Dalloul e outros, Expert Rev. Vaccines, 5(1), 2006, pp. 143-163. O presente Exemplo é direcionado aousode novas composições de vacina que empregam componentes adju- vantes que fornecem desempenho superior no contexto de coccidiose.

Os adjuvantes altamente eficazes da presente invenção podem ser usados em combinação com material antigênico de todas as espécies de . Eimeria, incluindo extratos de proteína puríficados ou parcialmente purificados - 15 das mesmas, ou por meio de uma ou mais proteínas recombinantemente ex- ' pressas das mesmas, ou fragmentos de qualquer e todas tais proteínas, desta | forma para incluir materiais antigênicos fornecidos de Eimeria acervulina, Ei- meria ahsata, Eimeria bovis, Eimeria brunetti, Eimeria fraterculae, Eimeria maxima, Eimeria meleagrídis, Eímeria mitis, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeriastiedae, Eimeria tenella, e Eimeria zurnii, entre outros.

A vacina adjuvada da invenção pode ser fornecida contra qual- quer proteína ou macromolécula que é produzida em um ou mais pontos no ciclo de vida do protozoário, incluindo, sem limitação, oocisto (seja esporula- do ou não esporulado), esporocisto, esporozoito, esquizonte, merozoito, cé- lulas de gameta masculino ou feminino. Em um exemplo preferido, proteí- , nas que são vazadas nas fezes em quantidades significantes no estágio de oocisto são os materiais preferidos para agir como a fonte de antígeno de proteina recombinante, ou amostras parcialmente ou totalmente purificadas de tal proteína tal como purificada através de mecanismos convencionais. Exemplos adicionais de proteínas de Eimeria úteis como fontes de antígeno na formulação das presentes vacinas incluem aqueles tal como descrito por Karkhanis e outros infection and Immunity, 1991, pp. 9863-989, | gg [J/ Ai: >) anos" pr“a/ P 㺠i)=i“—o-[2 2d ma" ru:is nn r 55 i : incluindo antígenos protetores, tal como descrito neste, possuindo uma faixa 7 de massa de cerca de 20 a cerca de 30kDA.

Exemplo adicional inclui a pro- ' teína 3-1E de 23kDA de Eimeria, e a proteína Etp100, por exemplo como recuperado de E. tenella.

Os adjuvantes altamente eficazes da presente invenção podem ser usados em combinação com material antigênico de Neurospora caninum.

Adicionalmente, os adjuvantes altamente eficazes da presente invenção podem ser usados em combinação com quaisquer dos seguintes patógenos protozoários, Cryptosporidium parvum (criptosporidiose), Cyclos- pora cayetanensis (ciclosporíase), Isospora belli (isosporíase), Toxoplasma gondii (toxoplasmose), Plasmodium (malária), e Babesia spp. (babesiose), e protozoários relacionados, geralmente do grupo Apicomplexen ocasionando estas ou doenças relacionadas. : A eficácia da liberação em ovo de vacinas que contêm sistemas . 15 —adjuvantes particulares foi avaliada como segue.

Í Materiais e Processos: Ú 1. Materiais: A proteína de E. maxima recombinante (de proteína 3-1E) foi expressa em E. coli e purificada por coluna de afinidade.

A preparação bruta de macromoléculas de E. maxima de célula total (solubilizadas com deter- gente de células rompidas) foi também usada como antígeno, com este antí- geno bruto sendo referido como "EM". Em um exemplo preferido, o adjuvan- te foi tal como descrito no Exemplo 8 acima, e é preparado como fornecida de acordo com este protocolo de Exemplo (veja Página 41). Por esse moti- vo,em um exemplo típico, cada embrião receberia uma injeção no âmnio (isto é, para incluir o espaço e líquido amniótico) de cerca de 50 a cerca de 100 microlitros de solução de vacina, que, para cada 1 ML desta compreen- de: cerca de 50 ou 100 microgramas de proteina 3-1E recombinante ou ou- tras espécies de proteina, ou alternativamente, cerca de 50 ou 100 micro- gramas de extrato de "EM" de célula bruta; cerca de 20 microgramas de Qui! A; cerca de 20 microgramas de colesterol; CARBOPOL em cerca de 0,075% (v/v); cerca de 10 microgramas de DDA; e cerca de 250 microgramas de

VCQU————pppp—[D[p[pe Kd. ; [AsL!ce ss CTA, iiiicN iii IM ASS . .s “ « . mn nu "5 - R 56 o R1005, todos fomecidos em, por exemplo, PBS a 20 mM. ' Com relação à seleção da saponina para uso aqui, a seguinte in- formação adicional é instrutiva. O termo definido saponina refere-se aos gli- cosídeos derivados de planta, vários que foram estudados extensivamente quantoa suas propriedades biológicas (The Plant Glycosides, Mcllroy, R. J., Edward Arnold and co., London, 1951). As saponinas usadas mais predomi- nantemente na técnica para a produção de vacinas são aquelas derivadas | das plantas Quillaja saponaria molina, Aesculus hippocastanum ou Gyophilla struthium. Extratos da casca de Quillaja saponaria molina que são conheci- dos possuirem atividade adjuvante são conhecidos, por exemplo Quil A. Também, as frações puras de Quil A foram descritas as quais retêm ativída- de adjuvante embora sendo menos tóxicas do que Quil A, por exemplo

0821. 0821 é também descrita em Kensil e outros (1991. J. immunology vol - 146, 431437). Quando misturados com os ingredientes adjuvantes adicio- . 15 nais da presente invenção, como até aqui e daqui em diante descrito, tais ' materiais contendo saponina tornam-se materiais altamente eficazes. For- i mulações eficazes adicionais incluem aquelas que usam Escina, que foi descrito no Índice de Merck (12º ed: entrada 3737) como uma ristura de saponinas encontradas na semente da árvore de castanha-da-india, Na modalidade preferida da presente invenção, a saponina refere-se a "Quil-A" vendida nos EUA pela companhia E.M Sergeant.

Deve, além disso, ser entendido que extratos de saponina po- dem ser usados como misturas ou componentes individuais purificados des- tas, tais frações/produtos incluindo QS-7, QS-17, OS-18, e 08-21 da Com- panhia Antigenics, Massachusetts, EUA ou produtos de saponina bruta, fra- cionada ou refinada similar, e misturas dos mesmos oferecido pela Compa- nhia Isconova da Suécia. Em uma modalidade, a Quil A é pelo menos 85% pura. Em outras modalidades, a Quil A é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% pura.

2 Vacinaçãode Embrião: Ovos foram adquiridos da Incubadora Moyers, Quakertown, PA. Para imunização em ovo, ovos de abateforam em seguida incubados duran-

po. |*AÂSA E )T A a AJY9?NYP:A -A —r" 2 "p "Poa. 0) o. T: T 5, wÚ SS SSuSt*MMºÓOSSA$A$A4A5SS 57 “a te 18 dias, e examinados com luz de vela para selecionar (em 18 dias de embrionização) ovos férteis, e em seguida injetados com PBS a 20 mM e ou * adjuvante sozinho, ou adjuvante formulado com ou proteína 3-1E recombi- nante ou uma preparação de "EM". Injeções foram feitas em um injetor em ovo'"intelliject" (Avitech, Hebron, MD) de acordo com as instruções do fabri- cante. Cada ovo recebeu amostras de 100 microlitros na cavidade amniótica usando uma agulha de calibre 18 e 17,5 cm de comprimento fornecida por Avitech (Hebron, MD). As doses de 50 microlitros estão também entre aque- las operáveis na prática da presente invenção.

3. Frangos: Assim que os frangos de abate foram incubados (em torno do dia 21 a 22), eles foram transportados ao laboratório usando caixas de pape- lão de transporte de frango descartáveis (Frederick Packaging, Inc., Milwau- kee, WI) e os pintos foram em seguida alojados nas unidades de Petersime eprovidos com alimento e água à vontade.

As aves foram mantidas em gaiolas chocadeiras em uma insta- lação sem Eimeria e transferidas em grandes gaiolas pendentes em locais separados onde elas foram infectadas com oocistos vivos de Eimeria maxi- ma e mantidas lá até o término do período experimental.

4 Parasitas: A cepa USDA BARC de Eimeria maxima No.41, que foi mantida no Laboratório de Doenças Parasitárias Animais-BARC e propagada de acordo com o procedimento estabelecido no laboratório do Dr. Lillehoj, foi usada. Os oocistos frescamente produzidos da cepa de E. maxima (Beltsvil- leNo41) foram purificados por flutuação em hipoclorito de sódio a 5%, lava- dos três vezes com PBS, e a viabilidade foi enumerada por azul tripano u- sando um hemocitômetro, S. Infecção de desafio de Eimeria: As aves de sete dias de idade foram rotuladas na asa e às aves de todos os grupos experimentais exceto grupos de controle não infectados foram inoculadas esofagicamente com E. maxima usando uma agulha de inoculação, e foram em seguida colocadas nas gaiolas de coleta de oocistos.

a mB IA%SÔ-?. > . mo e. oo - SCE ao A o "oe 00 | 58 ' 6. Determinação de ganho de peso corporal: i Os pesos corporais de aves individuais foram determinados nos ' dias 0 (não infectadas), 6 e 10 dias após infecção com E. maxima.

7. Avaliação de produção de oocisto fecal: Cuidadores de animais foram instruídos de não limpar as gaio- las, e gotejamentos fecais foram coletados. Tachos de coleta foram coloca- dos sob cada gaiola durante 5 dias partindo do 6º dia após a infecção, e ma- teríais fecais foram coletados em grandes jarros plásticos (21). Os goteja- mentos fecais encharcados com água de torneira em cada jarro foram tritu- radosem um misturador com mais água (volume total é 3L), e duas amos- tras aleatórias de 40 mi foram tomadas de cada amostra e armazenadas em refrigerador até que elas fossem contadas, A fim de contar oocistos de coc- cídios, várias diluições foram produzidas inicialmente para determinar as diluições ideais para a enumeração de oocistos para cada amostra. Os 00- cistosforam contados microscopicamente usando uma câmara de contagem MeMaster usando um processo de flutuação de sacarose que foi estabeleci- do no laboratório do Dr Lillehnoj, O número total de oocistos vazados por frango foi calculado usando a fórmula: oocistos totais/ave = (contagem de oocisto x fator de diluição x volume de amostra fecal/volume da câmara de contagem)/número de aves por gaiola.

8. Coleta de amostra: Sangue foi coletado no 6º dia em seguída à data de infecção, e a resposta de anticorpo de soro foi determinada. As amostras de sangue fo- ram obtidas de aves individuais (N=4 a S/grupo), deixadas coagular 4 h em 4C, eos soros coletados. As amostras de soro foram testadas quanto a anticorpos anti-Eimeria usando ELISA. Resumidamente, as placas de mícro- título foram cobertas durante a noite com 10 pug/cavidade dos antígenos coc- cídicos recombinantes Ea3-1E, EtMIF ou EtMIC2, lavadas com PBS a 0,05% Tween, e bloqueadas com BSA de PBS a 1%. As diluições de soro (1:20, 1:40,1:80,1:160; 100 ulcavidade) foram adicionadas, incubadas com agita- ção suave contínua, lavadas, e ligados Ab detectadas com IgG anti-frango de coelho conjugado por peroxidase (Sigma) e substrato específico por pe-

EI OÃ;J NX I? Y!)I.. . ” . “ana I AP S?O» Á«â Ri “PAR ÚúS %)!XX**MENNicT CEZAR EEZZZGNEECO0CE0CCCUOLLLCLCCCCCCLLLCCCCCCC--- " : 59 : roxidase. A densidade óptica (OD) foi determinada em 450nm com uma lei- tora de microplaca (Bio-Rad, Richmond, CA). i Os tecidos de intestino foram coletados na incubadora, e em 6 e 10 dias depois disso, e testados quanto à produção de citocina (IFN-y, 11-2) —pelousode RT-PCR em tempo real, como uma medida de estimulação de Th1.

9. Síntese de cCDNA O RNA total foi extraído de IELs intestinais usando TRizol (Invi- trogen, Carisbad, CA). Cinco microgramas de RNA foram tratados com 1 0 Ude DNase|e 1,0 ul de tampão de reação a 10X (Sigma), incubados du- rante 15 min em temperatura ambiente, 1,0 ul de solução de interrupção foi adicionado para inativar a DNase |, e a mistura foi aquecida em 70ºC duran- te 10 minutos. O RNA foi transcrito em reverso usando o sistema de síntese de primeiro filamento StrataScript (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com asrecomendações do fabricante.

10. RT-PCR quantitativa Os iniciadores de oligonucleotídeo de RT-PCR quantitativa para interferon-y (IFN-y) de frango e controle de GAPDH são listados na Tabela 4. Amplificação e detecção foram realizadas usando as quantidades equivalen- tesde RNA total de ELs intestinais usando o sistema de misturadora mestre Mx3000P e Brilliant SYBR Green QPCR (Stratagene). As curvas padrões foram geradas usando RNA padrão diluído por logio e os níveis de transcri- ções individuais foram normalizados àqueles de GAPDH analisados pelo programa Q-gene. Cada análise foi desempenhado em triplicata. Para nor- malizaros níveis de RNA entre as amostras dentro de um experimento, os valores de cíclo limiar médio (Ct) para os produtos de amplificação foram calculados por reunião de valores de todas as amostras neste experimento.

« , 60 a Tabela 4. Iniciadores de oligonucleotídeo usados para RT-PCR quantitativa o de frango IFN-y e GAPDH. ' RNA alvo Sequências de iniciador Tamanho de produto de PCR (pb) GAPDH Nº de Acessão K01458 264 Dianteiro S-GGTGGTGCTAAGCGTGTTAT-S' SEQ ID Nº:1 Reverso 5-ACCTCTGTCATCTOTCCACA-S' SEQ ID Nº:2 IFN-y Nº de Acessão Y07922 259 Dianteiro S-GCTGACGGTGGACCTATTATT-3' SEQ ID Nº:3 Reverso — SGGCTITGCGCTEGATTES UU SEQIDN84 |U IL-1B Nº de Acessão Y 15006 244 Dianteiro 5 -TGGGCATCAAGGGCTACA-3' SEQ ID Nº:5 Reverso — BS TOGGGTTEGITEGTGATE-S" = SEQIDNHS ||| s 115 Nº de Acessão AF139097 243 = Dianteiro 5-TCTGTTCTTCTGTTCTGAGTGATG-3" SEQ ID Nº:7 ' | Reverso — S"AGTGATITGCTTCTGTCTITGGTA-S — SEQIDNHB |||" Baço foi coletado antes de inoculação com E. maxima e na 10º DP! (data após infecção) para ensaio de proliferação de esplenócito.

Os —baçosforam colocados em uma placa de Petri com 10 ml! de solução de sal equilibrada de Hank (HBSS) suplementada com 100 U/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina (Sigma, St.

Louís, MO). As suspensões de célula única de linfócitos de baço foram preparadas e a proliferação de linfócito foi realizada.

Em resumo, os esplenócitos foram ajustados a 5x10º ou 1x107 células/ml em meio de IMDM (Sigma) suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 100 UÚ/ml de penicilina, e 100 pó/ml de estreptomicina (Sigma), que será chamado meio de IMDM completo a 10%. Os esplenócitos (100 ul/cavidade) foram incubados em placas de fundo pla- no de 96 cavidades em 41ºC em uma incubadora umidificada (Forma, Mari- etta, OH) com COz a 5% e ar a 95% durante 48 h.

A proliferação celular foi determinada com 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-dissulfofenil)- 2H-tetrazólio, sal de monosódio (WST-8, - Kit-8º de Contagem de Células, Dojindo Molecular Technologies, Gaithersbura, MD). A densidade óptica E DD A MRNEDEE[[IT DS nl 61 . (OD) foi medida em 450 nm usando um espectrofotômetro de microplaca : (BioRad, Richmond, CA). ' | Resultados Os resultados mostraram que as aves de abatevacinadas com 100 microlitros de formulação adjuvante fisto é, 100 microlitros incluindo pro- teina 3-1E recombinante de acordo com as doses previamente definidas) ganharam cerca de um adicional de 45 a 85 gramas de peso corporal com- parado às aves não vacinadas mas infectadas com E. maxima.

As vacinas da invenção também mostraram claros efeitos na F munidade mediada por célula tal como medido por ensaios de proliferação de linfócito mitogênico: Os resultados de proliferação de linfócito de baço em 1x10” células/ml incubadas com Con A durante 48 horas mostraram que os esplenócitos de frangos infectados por E. maxima imunizados com adju- - vante Pfizer com ou sem antígeno em geral mostram níveis elevados de pro- - 15 liferação de linfócito, especialmente quando uma dose de 50 ug foi usada. Intensificação significante de produção de IL-1B, produção de IFN-+, e pro- dução de IL-15, mais particularmente no baço foi visto em seguida à admi- nistração das composições de vacina adjuvada da invenção. Em resumo, estes resultados claramente indicam o efeito do presente adjuvante na res- postade citocina e suportam seu efeito na intensificação mediada por célula em vez de resposta imune humoral.

As vacinas da invenção também mostraram claros efeitos na produção de oocisto fecal. As aves de controle não infectadas não vazam quaisquer oocistos. Em seguida à infecção de E. maxima, houveram signifi- —cantes reduções de produção de oocistos fecais nos grupos que foram trata- dos com adjuvantes Pfizer somente, As aves vacinadas em ovo com Eime- ria maxima bruta e adjuvante demonstraram muito menos produção de oo- cistos fecais comparado aos grupos inoculados com preparação de Eimeria maxima bruta somente. Grupos EM.

Deve ser notado que ainda que proteína 3-1E de E. maxima re- combinante purificada tenha sido usada na prática dos experimentos acima mencionados, o uso de antígenos Ea3-1E, EaMIF, e EtMIC2 recombinantes,

: ou singularmente ou em combinação com 3-1E, ou entre si, ou como qual- oo quer combinação de quaisquer dos mesmos, é também uma modalidade preferida da invenção, e geralmente todos os antígenos de proteina de Ei- meria são operáveis na prática da presente invenção, contanto que quando misturados com os adjuvantes da presente invenção. Exemplo 17. Avaliação de Bacterina de cepa J5 de Escherichia coli em Gado O objetivo do estudo é avaliar a resposta imunológica no gado ao antígeno de Escherichia coli (cepa J-5) quando administrado em várias novas formulações. A bacterina J5 comercial é vendida como uma vacina preventiva para mastite de coliforme em gado leiteiro é é moderadamente eficaz em sua atual formulação. Antes da vacinação, os animais foram de- terminados serem de título baixo para anticorpos a E. coli J5, com base res- pectivamente na análise de amostra de soro de sangue tomada antes da a vacinação. - 15 Gadode engorda ' As vacinas experimentais foram formuladas usando bacterina J5 i de E. coli inativada como o antigeno, e foram produzidas de acordo com o Exemplo 13 acima. Cada grupo de tratamento inicialmente continha sete animais (Tabela 5). Um grupo de tratamento recebeu solução salina (T01) e outro grupo recebeu uma vacina JS comercial (TO2 - bacterina de Escheri- chia coli de J-5 Enviracor* Pfizer). Os outros grupos de tratamento recebe- ram várias formulações contendo os adjuvantes especificados na Tabela 5. Todas as vacinações foram administradas através de injeção subcutânea nos dias de estudo O e 21. O volume de dosagem foi 5 mL.

A SOS SSIS

« + 63 i : Tabela 5. Grupos de vacina — Gado vacum para engorda

CERTO E Trata- Ani- (my) mento mais 13 7 flower fax ]so [ec | [ros 7 dfeeo fax so se | Na Tabela 5, QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para carbopol, R para R1005, X para DEAE-dextrana e O para óleo. As soluções de matéria-prima foram preparadas como nos E- = 5 xemplos1a13 acima para o seguinte: E. coli foi dada como cerca de 4a 5 - X 10º organismos por dose tal como determinado por contagem direta atra- . vés de microscopia óptica. Quil A em água em 50 mg/ml, Colesterol em eta- « —nolem 17 mg/ml, DDA em etanol em 17 mg/ml, R1005 em tampão de fosfato a 20 mM em 5 mg/ml, DEAE-dextrana em água em 200 mg/ml, agonista de TLR em tampão de TE em 20 mg/ml e Iscomatriz em água em 5,4 maiml. Os componentes individuais foram adicionados v/v nã ordem de símbolos de letra da esquerda para a direita. Por exemplo, o volume apropriado de Quil A do QCDC foi adicionado seguido por adição de colesterol, DDA e final- mente carbopol. Quando as formulações continham óleo, os componentes separados foram adicionados, misturados e em seguida emulsificados em uma mistura de óleo mineral Drakeolº 5 LT com ou Span 80 e Tween 80 (QCDO) ou Span 85 e Tween 85 (QCDXO). Drakeolº é um óleo mineral le- ve comercialmente disponível. As amostras de sangue foram coletadas nos dias de estudo 0, 21649 para teste sorológico. Os títulos de anticorpo para E. coli J5 nas amostras de soro foram determinadas por meio de ensaio ELISA indireto específico por J5. Os isotipos de anticorpo de IgG foram determinados com conjugados de anticorpo anti-bovino de cameiro (Betila Labs). Os títulos gu OOOÔAOA AA OSSOS * “ 64 : foram determinados e expressos como suas médias geométricas. o Resultados i Os resultados sorológicos do estudo são mostrados nas Tabelas 6a8. Os títulos de anticorpo elevados geralmente são associados com me- lhorproteção das vacinas.

O título de IgG específico por J5 total é mostrado na Tabela 6. Várias das formulações da presente invenção produziram títu- los muito maiores do que o produto comercial, ainda que estas formulações tivessem uma quantidade similar de antígeno J5 adicionada.

As formula- ções de QCDO, QCDX, e QCDXO foram especialmente eficazes na indução deuma boa resposta imune neste gado.

Tabela 6. Títulos de anticorpo de IgG.

Grupo de Título de IGG de média geométri- Tratamento ca a JS no dia ; ao o la fa : Co riíchia coli = QCDCR 3919651 620779 Os isotipos de anticorpo de IGG1 específico por J5 foram deter- minadas.

Estes resultados são mostrados na Tabela 7. Novamente, às for- mulações de QCDO, QCDX, e QCDXO foram especialmente eficazes na indução de uma boa resposta imune neste gado.

Estas formulações produ- ziram títulos muito elevados com até mesmo uma única vacinação do que a vacina comercial com duas injeções.

e * 65 s Tabela 7. Títulos de anticorpo de I9G1. i | Tratamento ftrica a JS no dia q] E E 1280 tos Os títulos de anticorpo de IgG2 são mostrados na Tabela 8. Es- te isotipo de anticorpo é frequentemente associado com melhor fagocitose por neutrófilos no leite e proteção para o animal. As formulações de QCDO, : 5 QCDX,e QCDXO foram especialmente eficazes na indução de uma boa - resposta imune neste gado. oe Tabela 8. Títulos de anticorpo de IgG2. e Tratamento geométrica a J5 no dia Lo |

QCDCR lts —lecoxo ===> j6so [esc lerem | Gado leiteiro As vacinas experimentais foram formuladas usando bacterina de J5dee. coli inativada como o antígeno, e foram produzidas de acordo com o Exemplo 13 acima. Cada grupo de tratamento inicialmente continha sete animais (Tabela 9). Um grupo de tratamento recebeu solução salina (T01) e outro grupo recebeu uma vacina de J5 comercial (TO02 — bacterina de Esche- richia coli de J-5 Enviracorº Pfizer). Os outros grupos de tratamento recebe-

e 3522:>AÂAOPOoRÊiO OS oil e * 66 s ram várias formulações contendo os adjuvantes especificados na Tabela 9, | O Todas as vacinações foram administradas através de injeção subcutânea nos dias de estudo O e 21. O volume de dosagem foi 5 mL.

Tabela 9: Grupos de vacina — Gado leiteiro sr CEE Tratamento | Animais im!) mo zo fsmeesa = — fo2t |so |sc | = Ee E coli, cepa J-5 acDCR 1o21 so |se | Na Tabela 9, OC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para . DDA, C para carbopol, R para R1005, X para DEAE-dextrana, T para ago- W nista de TLR (CpG-ODN), e O para óleo, As soluções de matéria-prima fo- - i ram preparadas para o seguinte; E. coli foi dada como cerca de 4a 5X 10º 7, . organismos por dose tal como determinado por contagem direta através de é 10 microscopia óptica.

Quil A em água em 50 mg/ml, Colesterol em etanol em 17 mgaíml, DDA em etanol em 17 mg/ml, R1005 em tampão de fosfato a 20 mM em 5 mg/ml, DEAE-dextrana em água em 200 mg/ml, agonista de TLR em tampão de TE em 20 mgíml.

Os componentes individuais foram adício- nados v/v na ordem de símbolos de letra da esquerda para a direita, Por exemplo, o volume apropriado de Quil A do QCDCR foi adicionado seguido por adição de colesterol, DDA e finalmente carbopol.

Quando as formula- ções continham óleo, os componentes separados foram adicionados, mistu- rados e em seguida emulsificados em uma mistura de óleo mineral Drakeol 5 LT com ou Span 80 e Tween 80 (TXO, QCDO) ou Span 85 e Tween 85. Coletade sangue As amostras de sangue foram coletadas nos dias de estudo O, 21 e 49 para teste sorológico.

Os títulos de anticorpo para E. coli J5 nas amostras de soro foram determinados por meio de ensaio ELISA indireto específico por JS.

Os isotipos de anticorpo de IgG foram determinados com | o aee mM A a AA SS gen o 67 . conjugados de anticorpo carneiro-anti-bovino (Betila Labs). Os títulos foram NS determinados e expressos como suas médias geométricas. Resultados Os resultados sorológicos do estudo são mostrados na Tabela

10. Títulos de anticorpo elevados geralmente são associados com melhor proteção de vacinas. O título de IgG específico por J5 total é mostrado na Tabela 10. Várias das formulações da invenção produziram títulos muito maiores do que o produto comercial, ainda que estas formulações tivessem uma quantidade similar de antígeno J5 adicionado. As formulações de QC- DO, TXO e QCDXO foram especialmente eficazes na indução de uma boa resposta imune neste gado. Tabela 10. Títulos de anticorpo de IgG. - tamento geométrica a J5 no dia

EE IB Eetgtoaatta 10 an no t Bacterina de Escherichia coli é 245 les mo Jens las les | Os isotipos de anticorpo de I9G1 específico por J5 foram deter- minados. Estes resultados são mostrados na Tabela 10. Novamente, as formulações de QCDO, TXO e QCDXO foram especialmente eficazes na indução de uma boa resposta imune neste gado. Estas formulações produ- ziram títulos muito elevados com até mesmo uma única vacinação do que a vacina comercial com duas injeções. Este isotipo de anticorpo é frequentemente associado com me- —lhor fagocitose por neutrófilos no leite e proteção para o animal. A formula- ção QCDXO foi especialmente eficaz na indução de uma boa resposta imu- ne neste gado.

" Exemplo 18. Vacina de Vírus de Diarréia Viral Bovina Objetivo do Estudo Este estudo comparou a segurança, eficácia e proteção cruzada de duas vacinas tipo 1 e tipo 2 do Vírus de Diarreia Viral Bovina (BVDV-1 e BVDV-2ouBVD-1/2) morto e uma vacina de extrato de BVDV-1 e -2 formu- lada com adjuvantes da invenção com um controle negativo (solução salina) e dois posítivos (uma vacina de BVDV-2 vivo modificado, é uma vacina de BVDV-1/2 morto atualmente disponível) contra um desafio com BVDV-1 em bezerros filhotes. A Tabela 11 apresenta o Esquema de Estudo.

Este estudo também mostra que os adjuvantes da invenção po- dem ser usados para distinguir os animais vacinados com as composições de vacina da presente invenção de animais naturalmente expostos ao BVDV.

Animais O gado vacum para engorda desmamado saudável de qualquer um dos sexos entre 7 e 15 meses de idade que foi seronegativo para BVDV- 1 e BVDV-2 foi usado.

Tabela 11. Esquema de Estudo Gp | Vacina Adjuvante | Dose mais desafio [76 Drs nm [me e asa fo mo der se salina oço esquerdo To2 MLVY coço esquerdo. TO3 Prezent-A inativa coço esquerdo. TO4 QCDC inativa cogo esquerdo

TOS QCDCR inativa coço esquerdo 2mL, SC pes TO6 | inativa QCDe coço esquerdo extrato QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para Carbopol?, R paraBayR1005”

|

PQ 69 “ Vacinação " Nos Dias de Estudo O e 21, os animais (N = 10/grupo) foram va- ' cinados tal como descrito na Tabela 11, O antígeno (BVDV) foi dado como

5.500 Unidades Relativas de Potência (RU) por dose fal como determinado — atravésde ensaio ELISA. Os bezerros no grupo TO1 serviram como o grupo de controle. A eles foram dados uma solução estéril de cloreto de sódio a 0,9%. Aqueles nos grupos TO2 até TO6 receberam vacinas de BVDV 1/2 experimentais com o adjuvante tal como mostrado na Tabela 11. O grupo TO2 recebeu apenas uma vacinação (Dia de Estudo 0). Eles receberam uma vacina de BVDV-2 de vírus vivo modificado (MLV) que não continha nenhum adjuvante. O grupo TO3 recebeu uma vacina de BVDV-1/2 de vírus morto contendo uma emulsão de óleo em água a 2,5% (Amphigen) e adju- vantes de Quil A/colesterol (Prezent Aº). O grupo TO4 recebeu uma vacina " de BVDV-1/2 de vírus morto contendo Quil A/colesterol, DDA, e Carbopol. O - 15 grupo TOS recebeu uma vacina de BVDV-1/2 de vírus morto contendo Quil : Afcolesterol, DDA, Carbopol, e R1005. O grupo TO6 recebeu uma vacina de extrato de título alto de BVDV-1/2 de vírus morto, contendo Quil A colestero|, DDA, e Carbopol no Dia 0, e uma vacina de extrato de título baixo similar no Dia 21. Todos os tratamentos foram administrados subcutaneamente em umadosede2 mL única nos Dias 0 e 21, com a exceção do Grupo 2.

O QCDC +/- R continha 100 ug de Quil A, 100 ug Colesterol, 50 pg DDA, e Carbopol a 0,075% e onde incluía 1.000 pg de R1005 todos por dose de 2 mL tal como previamente descrito.

Desafio No Dia 42 todos os animais foram desafiados intranasalmente com cerca de 4 mL (aproximadamente 2 mL por narina) de cepa de BVDV-1 não citopático (Cepa NY-1 ; CVB, USDA, Ames, JA) com uma concentração de 5,4 de log" TCIDs" por dose de 5 mL. Observações As observações do sítio de injeção foram registradas nos Dias de Estudo O (pré-vacinação), 1, 2, 3, 7 e 21 para o primeiro sítio de injeção (pescoço esquerdo). Observações para o segundo sítio de injeção (também e 70 s pescoço esquerdo) foram registradas nos Dias de Estudo 21 (pré- vacina- " ção), 22, 23, 24, 28 e 35. Todas as reações do sítio de injeção palpáveis l foram medidas (L x W x H, cm). Temperaturas retais foram registradas nos Dias de Estudo -1, O (pré-vacinação), 1, 2 e 3 para a vacinação primária.

As temperaturas para a vacinação de reforço foram registradas nos Dias de Es- tudo 20, 21 (pré-vacinação), 22, 23 e 24. Amostra de Sanque As amostras de sangue foram coletadas de cada animal dispo- nível usando tubos de separação de soro (SST) nos Dias de Estudo -1, 20, 34649 As amostras de sangue foram coletadas usando tubos de EDTA nos Dias de Estudo 33 até 35 (pré-desafio) e 36 até 49. As amostras de sangue foram coletadas usando tubos de preparação celular (CPT) nos Dias de Estudo 34 (pré-desafio) e 36 até 49. Resultados 2 15 A Tabela 12 mostra título de anticorpo de neutralização de soro Doo de média dos mínimos quadrados geométrica (GLSM) para o vírus de BVD 7 É pelo ensaio de hemeaglutinação no dia de estudo.

Os resultados mostram R que os adjuvantes da invenção forneceram um aumento nos títulos contra “ ambos os BVDV-1 e BVDV-2 como os progressos de estudo.

Um título acei- tável para o UDSA está acima de um título de 8. Estes dados demonstram títulos acima de 5.000 .os quais indicam forte produção de anticorpo que é capaz de deter o vírus vivo quando ele entra no animal com o potencial para infecção e doença. 7

E a 71 : Tabela 12. Título de neutralização de anticorpo de soro À : Grupo (vacina, ” BVDV.2 adjuvante) o rr EEE Dia4 Dia21 Dia 41 Dia56 Dia1 Dia21l Dia4tl Dia56 Médias GLSM GLSM GLSM Médias GLSM* GLSM' GLSN* Grupo TO1 (solu- 100 100 100 2138 100 101 101 371,98 ção salina, ne- 01) (14) (4) (115 0) (1) (1) (1268-861) nhuma) Grupo TO2 100 100 275 1327 100 214 4521 45409 (BVOV2 MV, 01) (1) (120) (145) (11) (110) (11024) (911218) nenhum) | Grupo TO3 | 100 160 3559 48649 100 640 87775 895083 (BVDV-112, (1) (16 (1181) (912048) (11) (138) (383444) (102477936) PreZent-A) Grupo TO4 100 120 1266 177217 100 871 32956 1151144 . (BVDV112, (1-1) (3) (69) (56121638 (11) (516) (54861) (409616384) . QCDC) ; Grupo TOS 692,34 100 112 1892 247787 100 530 10517,89 1 (BVDV-1/2, (152- (1-1) (13) (591) (8616889) (11) (213) (3444 46341) QCDCR) 2048) Grupo TOS 100 107 460 92295 100 243 23987 995650 (BVDV-12 ex 01) (12 (123) (2564006) (11) (17) (641448) (409655109) trato, QCDC) A Tabela 13 apresenta dados de leucopenia para dias de estudo 43 a 56. Os resultados de leucopenia no dia de estudo demonstram que a vacina de MLV (TO02) preveniu infecção por este vírus específico do desafio, Uma medida de leucopenia é um critério para licença de um produto de MLV pela USDA.

No entanto, para um vírus inativado, a leucopenia não é um critério da USDA mas como os dados sugerem, os adjuvantes da invenção tinham leucopenia em até apenas 20% dos animais visto que a maior parte das vacinas de vírus inativado possuem 100% de leucopenia.

Isto indica que os adjuvantes da invenção foram capazes de induzir uma resposta de Th forte com um antígeno inativado.

Isto é difícil de fazer e é raramente visto em produtos inativados.

“< + , 72 : Tabela 13. Leucopenia por Dia de Estudo. : o To Toe TOS i Solução —| Vivo Modifi- | TO3 TO4 TOS Extrato de Dia de estudo salina cado Prezent A | QCDC QCDCR QCDe las — lo o e dae lo da | loss — lo o e do e dao | les lo lo fo o e o less da fo da o da o | lar ds le as lo ls o de da a | las fa o e e o loeso fe o dd so | lost le o da ho lo ho | : [masa | 52 AAA ” bass = 53 2 too : asa = | 64 2 | RA FEST Ei A mise da do do lo lo o | A Tabela 14 apresenta os Títulos de Neutralização de Soro no Dia 41 (20 Dias depois da Segunda Vacinação, Pré- Desafio). O vírus vivo modificado é capaz de apenas desenvolver respostas de anticorpo ao vírus exato na vacina. Istoé visto neste Grupo, TO2 mostra proteção contra apenas BVDV-

2. No entanto, as vacinas inativadas adjuvadas de TO3 (PrezZent-A), TO4 (QCDC), e TO5 (QCDCR) geraram uma forte resposta de anticorpo precoce no início da imunidade e ao longo da fase em vida do estudo de animal para um painel sorologicamente diverso de BVDVs. Isto mostra que estes adju- vantes possuem a capacidade de fornecer a segurança e eficácia em um modelo de desafio para proteger o gado em não apenas um desafio homólo- go mas um heterólogo. |

< 1 73 | & Tabela 14. Títulos de Neutralização de Soro no Dia 41. O Proteção — Cruzada pelo Grupo de Tra- tamento de Título Sorológico, Título de Anticorpo Log 2 To6S Extrato TOI To2 TOS TO4 [TOS de Solução salina | Vivo Modificado —| PrezentA | QCDC | QCDCR | QcDC evovamão — ba as 1 dor leo los | Atividade Marcadora.

Apresentados aqui são dados que mos- : tram que os adjuvantes da invenção podem ser usados para distinguir ani- . mais vacinados com composições dé vacina da presente invenção de ani- 5 mais naturalmente expostos aO BVDV.

Isto pode ser vistos por determina- ção das diferenças de perfil de anticorpo entre produtos de gene estrutural e não estrutural do vírus.

A atividade marcadora é demonstrada pelo ciclo de gel por ensaio de radioimunoprecipitação (figura 1). Uma resposta de anti- corpo às proteínas NS2/3 e E2 do BVDV é muito pronunciada em um animal vacinado com uma vacina de MLV ou um animal naturalmente exposto à vacina inativada adjuvada de BVDV ou PreZent-A.

No entanto, os adjuvan- tes da invenção demonstraram uma resposta de anticorpo a apenas proteína E2 e não às proteínas NS2/3. Desta forma, um animal vacinado com uma vacina de BVDV inativada compreendendo adjuvantes da invenção pode ser diferenciado entre de ou um animal naturalmente infectado ou um animal vacinado de MLV ou animal vacinado de PreZent-A.

Isto seria considerado uma vacina marcadora que é valiosa para erradicação destes tipos de doen- ças em populações de animal. | x . 74 , Exemplo 19. Hiopneumonia de micoplasma em Suíno * , Antecedentes i Micoplasmal pneumonia de suíno (MPS) ou pneumonia enzoóti- ca é uma doença crônica frequente caracterizada por tosse, retardamento de crescimento, e eficiência alimentar reduzida.

O agente etiológico é M. hyop- neumoniae; no entanto, a doença de ocorrência natural frequentemente re- sulta de uma combinação de infecções bacterianas e micoplasmais.

MPS causa perda econômica considerável em todas as áreas onde o suíno é criado.

Levantamentos conduzidos em vários locais ao longo domundo indicam que lesões típicas daquelas vistas com MPS ocorrem em 30% a 80% dos suínos de peso de abate.

Porque as lesões micoplasmais podem resolver-se antes dos porcos alcançarem o peso de abate, a incidên- cia atual pode ser elevada.

A prevalência de infecção de M. hyopneumoniae - em pneumonia suína crônica foi relatada à faixa de 25% a 93%. Os porcos % 15 de todas as idades são suscetíveis ao MPS, mas a doença é mais comum no crescimento e execução do suíno. -A evidência atual indica que M. hyop- i neumoniae é transmitida por aerossol ou contato direto com secreções do trato respiratório de suíno infectado.

A transmissão de disseminação ao porco durante a lactação é possível.

Uma vez estabelecido, o MPS ocorre anoapós ano em rebanhos infectados, variando na severidade com tais fato- res ambientais como estação, ventilação, e concentração de suíno.

Objetivo do Estudo Para comparar a eficácia de vacinas de Micoplasmae hyopneu- monia formuladas com novos adjuvantes da invenção contra a eficácia de uma série experimental de uma bacterina de Micoplasmae hyopneumonia comercialmente disponível em seguida ao desafio intratraqueal com um ho- mogeneizado de pulmão de M. hyopneumoniae virulento.

Animais Sessenta e seis (66) porcos mestiços clinicamente saudáveis em aproximadamente 17 dias de idade sem uma história de doença causada por M. hyopneumoniae e PRRSV, ou vacinação contra os mesmos organismos foram usados no estudo.

Antes do embarque ao sítio de estudo, e durante 2

* dias após a chegada, os porcos foram tratados com Naxcelº intramuscular- ' . mente na pata traseira, como por direções de rótulo, para prevenir doença relacionada ao estresse tal como Streptococcus suis.

Os animais foram alo- cados para os tratamentos e engaiolados de acordo com um plano de alea- torização.

O esquema de estudo é mostrado na Tabela 15. Tabela 15. Esquema Experimental Grupo de Nº de Tratamento Vacinação Desafio Tratamento Animais homogeneizado Controle Negativo 63464- Dia O TO1 12 Intramuscular | de pulmão de 70 Dia 14 M. hyo homogeneizado DDA/Carbopol/R 1005 Dia O To2 12 Intramuscular | de pulmão de (DOR) Dia 14 z M. hyo sã homogeneizado : QAC/ DDAICarbopol Dia O TO3 12 Intramuscular | de pulmão de ' (QCDC) Dia 14 M. hyo homogeneizado QAC/DDA/Carbopol/R1005 Dia O 12 Intramuscular | de pulmão de (QCDCR) Dia 14 M. hyo homogeneizado Dia O TOS Bacterina de M. hyo 12 de pulmão de Dia 14 M. hyo lime dm de da da la | QAC é a abreviação para QuilA/colestero|, Produtos Veterinários Investigacionais (IVP) Os antígenos e Produtos Veterinários Investigacionais (IVP) são mostrados na Tabela 16. As vacinas para Grupos de Tratamento TO2, TO3, eTO4 (todos exceto TOS) foram preparadas de acordo com o Exemplo 13 por uso das concentrações de componentes mostrados na Tabela 16 abaixo.

Os componentes foram adicionados na ordem listada na tabela.

Um extensor de solução salina foi adicionado a um vaso e ho-

"e * 76 : mogenização foi iniciada e continuada ao longo do procedimento de prepa- o ração. M. hyopneumoniae inativado foi preparado de um volume misturado de 75 litros de fermentado por 800 litros de produto formulado final e foi adi- cionado a uma concentração de 0,09375 ml por dose. A Quil A foi adiciona- daãàãà concentração listada na Tabela 16. A solução de colesterol/etanol foi em seguida adicionada. A solução de DDA/etanol foi adicionada, seguido pela adição da solução de glicolipídeo de Bay R1005. O carbopol foi em seguida adicionado e a solução foi conduzida ao volume final com o exten- sor de solução salina.

A vacina para Grupo de Tratamento TO5 (Formulação de Vacina com base em Amphigen) foi o produto comercialmente disponível Respisu- reº (Pfizer, Inc).

Tabela 16. Produtos Veterinários Investigacionais (IVP' : Grupo del Nº de; , Tratamen-|Dose de Do- Volume | : to |Antigeno |Adjuvante por Dose ses Dose 22 | To1 N/A N/A 24 | 2ml Controle Negativo pec o no fo DANS cata as | om | TO2 M. hyo 24 2ml R1005 50/1000ug/dose/0,075% em p,

DEE ITO3 IM. hyo 24 | 2ml (Carbopol 100/100/50 microgramas/dose/0,075% vv) Mhyo+ QuilA/colesterol/DDA/Carbopol/| IQAC/DDA/ diluente adjuvante R1005 (100/100/50) Carbopol/R1005 [os po microgramas/dose/0,075% ? am [v/v/1000ug/dose) (Bactema ce vm tmolros — fumo famprizenasme — [alam Vacinação Os animais no grupo de tratamento NTX não foram vacinados ou desafiados. Em aproximadamente 3 semanas de idade (Dia O — pescoço direito) e 5 semanas de idade (Dia 14 — pescoço esquerdo), os animais em T01, TO2, TO3, TO4 e TO5 foram vacinados intramuscularmente, 2 mL por dose, por um indivíduo qualificado oculto ao grupo de tratamento.

: Material de Desafio o Os animais em T01 até TOS foram desafiados intratraquealmente 3 semanas em seguida à segunda vacinação (em aproximadamente 8 se- manas de idade — Dia de Estudo 35). Os animais foram desafiados com umadosede5mL de uma diluição de 1:50 em meio Friis de um homogenei- zado de pulmão congelado a 10% de cepa 11 de M. hyo (LI36). Amostra de Sanque No Dia —1 ou O (antes da 1º vacinação), Dia 13 ou 14 (antes da 2º vacinação), Dia 34 ou 35 (antes do desafio) e Dia 63 (na necropsia), as amostras de sangue (aproximadamente 5 a 10 mL em tubos separadores de soro) foram coletadas de todos os porcos e testadas quanto à sorologia de M. hyopneumoniae (ELISA - IDEXX). Peso : Todos os animais foram pesados na chegada para propósitos de ; 15 distribuição, no Dia 34 ou 35 (antes do desafio), e no Dia 62 ou 63 (antes da i necropsia). l Necropsia No Dia 63, todos os animais sobreviventes foram eutanizados de acordo com procedimentos específicos por sítio.

Os pulmões foram avalia- dos grosseiramente quanto às lesões características atribuíveis a uma infec- ção M. hyopneumoniae e foi dado um escore para as lesões atribuídas ao desafio de M. hyopneumoniae.

Os escores de lesões de pulmão foram re- gistrados como a porcentagem de lesões de pulmão para cada lobo pulmo- nar.

A porcentagem de consolidação para cada lobo (cranial esquerdo, cen- tral esquerdo, caudal esquerdo, cranial direito, central direito, caudal direito, e acessórios foram classificados como um valor atual entre O a 100%. A por- centagem para cada lobo pulmonar foi usada em uma fórmula ponderada para cálculo da porcentagem total do pulmão com lesões.

Seis (6) animais NTX foram necropsiados no Dia 34 ou 35 antes do desafio e seus pulmões classificados quanto a lesões.

Escores de Lesão Pulmonar A porcentagem de pulmão total com lesões foi calculada usando e a 78 | * a seguinte fórmula: Porcentagem de pulmão total com lesões = 100 x ((0,10 o x cranial esquerdo) + (0,10 x central esquerdo) + (0,25 x caudal esquerdo) + (0,10 x cranial direito) + (0,10 x central direito) + (0,25 x caudal direito) + (0,10 x acessórios)). A transformação da raiz quadrada de arcsina foi apli- cada à porcentagem de pulmão total com lesões antes da análise.

As le- sões de pulmão transformado foram analisadas com um modelo misto linear geral.

As combinações lineares das estimativas de parâmetro foram usadas em um contraste prioritário depois do teste para efeito de tratamento.

Pro- cessos de regressão dos mínimos quadrados transformados de uma porcen- tagem significante (P<0,10) de pulmão total com lesões, seus erros padrões, e seus intervalos de confiança de 90% foram calculados assim como os mí- nimos e máximos.

Resultados : Tal como indicado pelos resultados da Tabela 17 abaixo, os ad- juvantes da invenção desempenharam igualmente assim como o grupo de É tratamento adjuvado por óleo TO5 que continha o adjuvante Amphigenº.

Tipicamente, um escore de lesão pulmonar de sob 3 é considerado possuir eficácia conferida pelo tratamento de vacina.

As combinações dos adjuvan- tes da invenção alcançam totalmente estes critérios e QCDCR desempe- —nhouo melhorem «escore e faixa entre animais individuais. ds e LSM Faixa Dia 34 For-elsero |O o la Jocsss| Fos-resisue | as Tos [oa | N = 12 por grupo, com a exceção de TO5 onde N = 11 Exemplo 20. Vírus de Influenza Aviária Felina (FAIV) Este estudo avaliou a eficácia em gatos de uma vacina de influ-

4 ' 79 . enza usando um adjuvante da invenção por desafio com uma cepa de vírus ' de influenza aviária virulenta. Processos e Resultados Antes da vacinação, os animais foram determinados serem ne- gativos para tanto vírus e anticorpos de influenza quanto vírus de influenza, com base respectivamente nos esfregões orofaríngeos e na análise de a- mostra de sangue de soro feita antes da vacinação. | As vacinas experimentais foram formuladas usando influenza a- viária patogênica inativada e hemaglutinina purificada (HA). Cada grupo de tratamento inicialmente continha seis animais (Tabela 18). Dois grupos de tratamento receberam as vacinas de FAIV experimentais (antígeno de vaci- na TO1 era proteína H5 HA purificada; e antígeno de vacina TO2 era cepa H5N?2 inativads), um grupo de tratamento recebeu uma vacina de cepa de vírus HSN1 modificado inativado (TO3), um grupo de controle de placebo : 15 recebeu uma vacina apenas adjuvante (TO4) e um grupo de controle negati- Ú vo recebendo solução salina apenas (TO5). Todas as vacinações foram ad- ministradas através de injeção subcutânea nos dias de estudo 0 e 21. O volume de dosagem era 1 mL. Em seguida à vacinação, os animais foram observados constantemente até que eles recuperaram-se e foram capazes de sentar-se retos para assegurar que não houveram reações adversas. As observações em aproximadamente uma hora após a vacinação foram regis- tradas e qualquer outra complicação observada em seguida à vacinação ti- nha sido registrada. A composição adjuvante foi previamente descrita acima pelo e- xemplo QCDC usando Quil A (20 ug), Colesterol, (20 ug), DDA (10 ug) e Carbopol (0,05%) por dose. O antígeno é vírus integral inativado ou proteína H5 HA purificada. Os animais foram avaliados quanto às reações do sítio de inje- ção e resposta sorológica à vacina. Três animais (dois em H5N2 inativada —porTO2,eumem solução salina TOS) foram eutanizados devido à hiperoxa- lúria congênita antes do desafio. No dia de estudo 49, todos os gatos sobre- viventes foram desafiados por meio da rotina intratraqueal com cepa HSN1

O O

TT TA AA o MATA ms a ie Si rrMpsppHJ il AJ3 %3*Sl/52S2A PAAôPº+]u» ifí»à”ãÂ*ºÓÔPPMAÀÔÚC SS SS SS SR EC | 80 ” A/Vietnã/1194/04 para avaliar a eficácia dos candidatos de vacina. Os ani- :; mais foram desafiados com 5,0 mL de material contendo 10º TCIDso, que foi liberado exatamente acima da bifurcação usando um pequeno cateter que foi conduzido na traqueia usando um traqueoscópio. Os animais foram observados e testados durante cinco dias depois do desafio. No término da fase animal (dia de estudo 54), todos os animais sobreviventes foram euta- nizados e uma necropsia desempenhada em cada um. Tabela 18. Grupos de Vacina Grupo de Trata- Rotina = de mento Administra- | Dia de Vacina Dose ão Estudo Vacina de proteina de hemaglutinina ' TO1 (HA) recombinante purificada (25.600 | 1,0mL | Subcutânea | 0e21 : . HA unidades/dose; Eca To2 1,0mL | Subcutânea | 0e21 vado (25.600 HA unidades/dose) e men he eee] | TO3 1,0mL | Subceutânea | 0e21 vado (25.600 HA unidades/dose) [1ot — [mesmo -Asinameaeas — [tom | sunaemes [oezt le |

PR PA A O A PRA As amostras de sangue foram coletadas nos dias de estudo -14 pré-vacinação, O, 21 e 49 para teste sorológico. Nos dias de estudo 49 e 54, as amostras de sangue foram coletadas para teste virológico. No dia de es- tudo 42, uma amostra de sangue não escalada foi tirada de todos os animais sobreviventes para testar a função renal nos soros antes do desafio. Os esfregões orofaríngeos foram coletados de todos os animais nos dias de estudo -14, 49 antes do desafio e 50 até 54. Esfregões retais foram coletados de todos os animais nos dias de estudo 49 antes do desafio e dias 50 até 54. A coleta dos esfregões foi feita exatamente antes do desa- fio no dia de estudo 49.

ee Ú — sKã MO OZAÃA.,,.,:,;!.":5A-" a NTÁÁÃOI”PANTZÁ TIPO SAÁÍI; AP” ”)]7» AZ?” Aºiú! "oro"! Ô6) s PP eos? .n" "o .l APS“ oe" 0 CC e » 81 Durante a necropsia, todos os lobos pulmonares foram assepti- ' camente removidos, pesados e avaliados grosseiramente quanto às lesões características atribuíveis à infecção de FAIV. As porcentagens foram usa- das para identificar o nível de consolidação pulmonar. O pulmão esquerdo foifixado com formalina tamponada neutra a 10% para histopatologia. O pulmão direito foi coletado e testado quanto ao teste virológico. Além dos pulmões, uma amostra renal e quaisquer tecidos com grossa patologia foi também testada e armazenada em formalina tamponada neutra a 10% quan- to à histopatologia. Os títulos virais nas amostras de sangue, esfregões orofaríngeos e retais, e em amostras de tecido pulmonar foram determinados por meio de uma PCR TaqMan específica por HSN1. Resumidamente, o RNA foi isolado usando um sistema MagnaPure LC com o Kit de isolamento de ácido nucléi- + co total MagnaPure LC (Roche Diagnostics; Almere, The Netherlands), e . 15 vírus de influenza A foi detectado pelo uso de um ensaio de RT-PCR em ' tempo real. Os dados foram expressos como Unidades de Diluição de Con- trole (CDU). As CDU's foram determinadas de uma curva padrão produzi- das de uma matéria-prima de vírus, que foi consecutivamente diluída, com cada diluição passando por extração de ácido nucléico e amplificação de PCR TaqManda mesma maneira como amostras de teste.

Os esfregões orofaríngeos positivos de RT-PCR e amostras de tecido pulmonar foram também analisados por isolamento de vírus e titula- ção nas células renais caninas Madine Darby (MDCK). Os resultados foram expressos como doses infecciosas de cultura de tecido a 50% de logio por miíililitro ou grama de amostra (logio TCIDso/mL ou logo TCIDso/g).

As amostras de plasma foram analisadas por neutralização de vírus e por inibição de hemaglutinação. Para o ensaio de inibição de hema- glutinação (HI), uma suspensão de vírus de cepa de influenza do Vietnã 1194/04 (HSN1, classe 1) ou Indonésia 05/2005 (H5N1, classe 2) foi incuba- da com diluições em série (2 vezes) de amostra de soro pré-tratada com fil- trado de cólera (obtido de culturas de Vibrio cholerae). Subsequentemente, os eritrócitos foram adicionados às diluições e depois da incubação, a dilui-

| e s 82 ção máxima dos agentes mostrando completa inibição de hemaglutinação foi ' definida como o título de HI.

O ensaio de neutralização de vírus (VN) foi com base em uma ti- tulação de ponto final dos soros.

Resumidamente, uma quantidade constan- tede vírus foimisturada com uma diluição em série (2 vezes) de uma amos- tra de soro.

A neutralização de vírus foi lida usando células de MDCK como células indicadoras e foi visualizada por aglutinação de eritrócito.

Os títulos VN foram classificados por tomada da diluição mais alta do soro em que 50% das culturas celulares inoculadas mostraram aglutinação de eritrócito.

O pulmão esquerdo foi coletado em necropsia e fixado com for- malina tamponada neutra a 10% para histopatologia.

Depois da fixação, os tecidos foram incrustados na parafina, seções de tecido foram preparadas e tingidas com hematoxilina e eosina para exame histológico.

Descrição e : grau de mudanças patológicas observadas foram registrados. . 15 Resultados º Nenhum dos animais nos cincos grupos de tratamento mostra- ram qualquer dor ou tumefação no sítio de injeção em seguida a primeira e segunda vacinação.

Além disso, nenhuma anormalidade de pele foi regis- trada nos sítios de injeção.

Em seguida às vacinações e antes do desafio, não houve nenhuma diferença significante no nível de significância 0,1 nas temperaturas corporais entre os tratamentos através de análise de modelo misto linear.

Um animal TO1 estava febril (= 40ºC) antes da primeira vacina- ção no Dia O e durante vários dias posteriores.

Os aumentos de temperatura corporal esporádicos em animais individuais a 40ºC ou acima foram regis- trados depois de vacinações (Dias 0 e 21). Nenhuma saúde anormal rela- cionada à vacinação foi observada durante o estudo.

Três animais (dois em TO02- HSN2, e um em solução salina TO5) foram eutanizados devido à hipe- roxalúria congênita antes do desafio.

Vários animais de todos os tratamen- tos apresentados com complicações de ferimento em seguida à implantação do registrador de temperatura.

Nenhum tratamento concorrente foi adminis- trado do dia O até a conclusão do estudo.

Os animais TO1, TO2 e TO3 vacinados mostraram sinais clínicos |

« , 83 menores e nenhuma mortalidade depois do desafio comparado para contro- Ú lar animais TO4 e TOS. Em TO1, um animal mostrou depressão e esforço respiratório aumentado dois dias depois do desafio. Nenhum dos cinco ani- mais TO1 restantes mostrou qualquer saúde anormal depois do desafio. Em TO2(n=4)eTO3 (n=6), todos os animais permaneceram saudáveis em se- guida ao desafio. Em TO4 (n=6), os primeiros sinais clínicos anormais (de- pressão e esforço respiratório aumentado) foram vistos em dois animais dois dias depois do desafio. Três dias depois do desafio, todos os seis animais em TO4 estavam deprimidos e mostraram um aumento no esforço respirató- rio. Por conseguinte, dois animais tinham que ser eutanizados por razões de bem-estar. Quatro dias depois do desafio (Dia 53), um animal foi encontrado morto e os três animais TO4 restantes exibiram depressão, esforço respirató- rio aumentado, terceira protrusão de pálpebra e descarga nasal, e foram eu- " tanizados por razões de bem-estar. Em TOS (n=5), os primeiros sinais clíni- | : 15 cos anormais de depressão e esforço respiratório aumentado foram vistos : em um animal um dia depois do desafio. Dois dias depois do desafio, mais l dois animais começaram mostrar aqueles sinais. Três dias depois do desa- fio, um animal foi encontrado morto e os quatro animais restantes exibiram depressão, esforço respiratório aumentado e protrusão da terceira pálpebra.

Um animal foi subsequentemente eutanizado por razões de bem-estar. Quatro dias depois do desafio, o esforço respiratório tinha piorado em um dos três animais restantes e outro animal adicionalmente mostrou descarga nasal. Todos os três animais restantes foram eutanizados por razões de bem-estar quatro dias depois do desafio (Dia 53).

Em seguida ao desafio, temperaturas corporais médias perma- neceram abaixo de 40,0º C em animais vacinados (TO1, TO2, e TO3). As temperaturas médias de animais de controle (TO4 e TO5) elevaram a > 40,0º C partindo um dia depois do desafio. As diferenças nas temperaturas corpo- rais médias entre tratamentos foram significantes (p=0,0001) por análise de —modelo misto linear. Os dados de animal individual mostraram que em uma minoria de animais TO1, TO2 e TO3, as temperaturas corporais elevaram a 40,0ºC e acima em pontos do tempo esporádicos no Dia 53. Em TO01, dois z “ 84 animais estavam febris (faixa 40,0 a 40,1ºC) em um ponto do tempo. Em Í TO2, dois animais estavam febris (faixa 40,0 a 40,3ºC) em um e três pontos do tempo, respectivamente. Em T03, um animal estava febril (faixa 40,0 a 40,3ºC) em três pontos do tempo. Em T04 e TOS todos os animais estavam febris durante pelo menos doze horas entre os Dias 50 para 51. Os títulos de anticorpo de HI para cepas de influenza do Vietnã 1194/04 (HS5N1, classe 1) e Indonésia 05/2005 (HSN1, classe 2) foram de- terminados antes da primeira e segunda vacinação e antes do desafio. O limite mais baixo de detecção foi 5. Antes da vacinação, os títulos em todos os5 grupos de tratamento estavam abaixo do limite mais baixo de 5. Em seguida à vacinação, todos os animais vacinados (TO1, TO2, e TO03) desen- volveram títulos de anticorpo de HI acima de 5 e mostraram pelo menos um aumento de seis vezes nos títulos comparados aos valores de pré- % vacinação. Em T01 e TO03, os títulos contra Vietnã 1194/04 variaram de 20 a - 15 160 em seguida à primeira vacinação, e 140 a 960 em seguida à segunda ' : vacinação. Em TO2, os títulos contra Vietnã 1194/04 eram menores do que aqueles vistos em TO1 e TO03, variando de 5 a 30 em seguida à primeira va- cinação, e 5 a 70 em seguida à segunda vacinação. Os títulos de anticorpo de HI contra Indonésia 05/2005 foram similarem àqueles contra Vietnã 1194/04.

As amostras de plasma tiradas antes e depois do desafio foram testadas por RT-PCR em tempo real específico por HSN1 para carga viral. Todos os animais tinham amostras negativas de vírus antes do desafio. De- pois do desafio, nenhum virus foi detectado no plasma de animais TO1 e TO3. Em contraste, 25% (1 de 4) de animais TO2, 67% (4 de 6) de animais TO4 e 60% (3 de 5) de animais TOS eram positivos de vírus em plasma de- pois do desafio. As diferenças entre os tratamentos eram significantes (p=0,0247) por análise de modelo misto linear. Vazamento de vírus depois do desafio foi avaliado em amostras de esfregão de garganta por RT-PCR em tempo real e titulação de vírus, e em amostras de esfregão retal por RT-PCR em tempo real. Nenhum vaza- mento viral da garganta foi detectado em animais TO1 depois do desafio,

Em TO02, todos os quatro animais (100%) vazaram vírus em um ponto depois " do desafio. Em T03, no total de dois de seis animais (33%) vazaram vírus depois do desafio. Em TOA4, três de seis animais (50%) vazaram vírus de- pois do desafio. Em TOS, quatro de cinco animais (80%) vazaram vírus de- poisdo desafio. Nenhuma amostra foi tomada de animais TO4 e TOS cinco dias depois do desafio, uma vez que todos os animais foram mortos, por conseguinte. Para o propósito de análise estatística, no entanto, os animais que morreram ou foram eutanizados antes do último dia de estudo tiveram seus últimos resultados de teste empregados ao último dia de estudo. As amostras de garganta com um resultado positivo de RT-PCR (2 1,8 CDU) foram também usadas nos ensaios de titulação de vírus. A titu- lação de vírus confirmou que todas as amostras positivas de RT-PCR conti- nham vírus de influenza infeccioso (dados não mostrados). Os títulos de í vírus infeccioso eram menores em animais vacinados (TO02 e TO3) do que 8 15 animais de controle (TO4 e TO5). Estas diferenças foram significantes três : dias depois do desafio quando comparando TO2 ou TO3 com TOA, e três, i quatro e cinco dias depois do desafio quando comparando TO2 ou TO3 com TOS. Os títulos em animais TO2 e TO3 foram 0,5 de logio TCIDso. Os títulos vistos em TO4 variaram de 2,3 a 4,3 de logio TCIDso. Os títulos vistos em TOS variaram de 1,5a3,8 de logio TCID5o.

Vazamento em fezes tal como avaliado por esfregões retais foi detectado em todos os grupos de tratamento exceto TO2 três ou quatro dias após o desafio. As quantidades de vírus detectadas por RT-PCR eram entre 2,2 a 2,3 de logo CDU em TO01, 3,2 de logio CDU em T03, 2,0 a 2,7 de logio CDU emTO4,e2,2 de logw CDU em TO5. Não houve nenhuma diferença significante no nível de significância 0,1 entre tratamentos em qualquer dos dias depois do desafio.

A patologia de pulmão foi menos severa em animais vacinados (TO1, TO2, e TO3) do que em de controle (TO4 e TO5). Todos os animais va- —cinados apresentados com uma pneumonia broncointersticial subaguda mul- tifocal suave. Os animais de controle mostraram ou uma pneumonia bronco- intersticial subaguda moderada (dois animais TO4 e um animal TOS) ou seve-

ra (quatro animais TO4 e quatro TO5) com uma distribuição multifocal em : todos exceto dois animais de controle que (um animal TO4 e um TO05) mos- traram uma distribuição difusa. O pulmão integral foi avaliado quanto ao ní- vel de consolidação, que foi expresso em consolidação em porcentagem do tecido pulmonar total. De acordo com as descobertas de patologia pulmo- nar, a consolidação em porcentagem foi significantemente mais baixa em animais vacinados (T01, TO2, e TO3) do que em animais de controle (TO4 e TOS). A carga viral em tecido pulmonar coletada no tempo de morte ou eutanásia foi avaliada por titulação de vírus e RT-PCR de HSN1. O tecido pulmonar de animais vacinados (TO1, TO2 e T03) tinha títulos de vírus mé- dios significantemente menores do que aqueles de controles (TO4 e TOS). Não houve nenhuma diferença significante entre títulos médios no tecido à pulmonar de animais vacinados (TO1, TO2 e TO3). A análise por RT-PCR - 15 — produziuos mesmos resultados. : Em seguida ao desafio com uma cepa de influenza aviária de i HSN1 altamente patogênico, sinais clínicos incluindo febre, mortalidades, viremia, vazamento viral de garganta e em fezes, infecção viral do pulmão e patologia de pulmão, incluindo consolidação, foram observados em animais de controle que tinham recebido ou adjuvante (TO4) ou solução salina (TOS). A vacinação com proteína de H5 HA purificada (T01) preveniu vi- remia, vazamento viral da garganta, e mortalidade em seis gatos jovens em seguida ao desafio com uma cepa de influenza aviária de HSN1 altamente ' patogênico. Além disso, vacinação com proteína de H5 HA purificada (TO01) reduziu sinais clínicos, incluindo febre, carga viral em pulmão e patologia de pulmão, incluindo consolidação. A vacinação com uma cepa de H5N2 inativada (T02) preveniu sinais clínicos, vazamento viral em fezes, e mortalidade em quatro gatos jo- vens em seguida ao desafio com uma cepa de influenza aviária de HSN1 altamente patogênico. Além disso, a vacinação com a cepa de H5N2 inati- vada (T02) reduziu viremia, febre, vazamento viral da garganta, carga viral em pulmão e patologia de pulmão, incluindo consolidação.

SESREESRNNNN o 2 87 A vacinação com uma cepa de H5N1 inativada (TO3) preveniu É sinais clínicos, viremia e mortalidade em seis gatos jovens em seguida ao desafio com uma cepa de influenza aviária de HSN1 altamente patogênico.

Além disso, a vacinação com a cepa de H5N1 inativada (T03) reduziu a fe- bre, vazamento viral da garganta, carga viral em pulmão e patologia de pul- mão, incluindo consolidação.

Sumário Nenhuma reação do sítio de injeção foi observada com as vaci- nas formuladas com antígeno de HA ou inativado ou purificado com adjuvan- tede QC/DC.

As vacinas forneceram uma proteção completa de doença clínica e mortalidade em gatos vacinados, carga de vírus significantemente reduzida em sangue e tecidos, e vazamento de vírus significantemente re- duzido. 2 Exemplo 21. Câncer . 15 Antecedentes ' Este estudo foi conduzido nos ratos imunodeficientes e imuno- competentes usando células de carcinoma hepatocelular de humano e rato para gerar modelos heterotópico e ortotópico.

Animais Os ratos machos nus (Crl: NIH-mu) de 6 a 8 semanas de idade foram adquiridos de Charles River (Wilmington MA). Os ratos foram aloja- dos em pares em gaiolas micro-isoladoras de policarbonato e providos com água de osmose reversa à vontade e comida de rato padrão irradiada; toda água e palha foram autoclavados.

Os pesos corporais foram registrados duas vezes semanalmente; os animais foram mantidos durante aproxima- damente 7 semanas e eutanizados por inalação de CO, no término do expe- rimento.

O esquema experimental incorporou duas fases.

Na fase |, os ratos foram aleatorizados a dois grupos com base no seu peso corporal.

Os ratos no grupo 1 não receberam nenhuma injeção de célula de tumor, en- quanto os ratos no grupo 2 receberam injeção subcutânea de células de tu- mor.

Em três semanas em seguida à injeção de tumor, os ratos no grupo 2 foram aleatorizados (com base no tamanho de tumor e taxa tomada — veja : Tabela 19) a dois grupos para a Fase Il, um dos quais incluía dois subgru- pos: 1) controles portando não tumor que receberam solução salina (o Grupo de Controle); 2) controles portando tumor tratado com adjuvante apenas (o Grupode Tumor); e 3) pacientes portando tumor (Tratado por Tumor) dosa- do com vacina (duas injeções subcutâneas duas semanas entre si). Todos os animais foram necropsiados em 14 dias após a segunda administração de vacina. Vacina A vacina foi administrada através de injeção subcutânea em 0,2 ml! por dose. Tabela 19. Grupos de Vacina Grupo Descrição Nº de |Tipos de | Formulação | Nº de | Doseliroti t de Trata- Ani- tumor de Vaci- | na ' mento mais célula (antí- na- : geno ões Controle | Controle Nega- | 5 NA 0,63% pla-|2 0,2 m/VSC == ETF mor salina:

EET EF E veículo) | antigeno cebo PBS Tumor Dose líquida QCDCR ejo63% pla-|2 0,2 m/VSC (tratado) | homogenizada 100 ug de |ceboPBS - veículo mais antígeno HepG2 inativado QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para Carbopol?, R para Bay R1005º, PBS para solução salina tamponada por fosfato. Preparação de Vacina As vacinas foram preparadas usando Quil-A (20 ug/dose), Co- lesterol (20 ug/dose), DDA (10 ug/dose), Carbopol (0,05%) com ou sem gli- colipídeo Bay R1005º (1.000 ug/dose) e antígeno. A composição foi mistu-

O OA rada usando um homogenizador e adicionada na ordem de adição tal como ' estabelecido acima. Preparação de Antígeno As células de HepG2 (clone HB-8065) foram obtidas da Coleção de Culturado Tipo Americano (ATCC, Manassas, VA). HepG2 é uma linha- gem de células perpétuas que foi derivada do tecido de fígado de um ho- mem Caucasiano de 15 anos de idade com um carcinoma hepatocelular bem diferenciado. As células foram expandidas sob condições de cultura celular padrões, e preparadas para injeção em uma concentração de 1 x 107 células/ml em Matrigel. Cada rato foi injetado com 0,5 ml! de suspensão ce- lular, subcutaneamente no sítio da segunda teta. Medições O tamanho de tumor foi medido duas vezes semanalmente ao z longo do estudo pelo método calibrador onde volume em cm? = TI(W(mm) x - 15 W(imm)]V/2x L(mm)Y1000. Sangue foi coletado por sangria retro-orbital para medições de produto químico e biomarcador de soro. Os animais foram |i- geiramente anestesiados durante o procedimento de sangria com CO2/O,. Os pontos finais de produto químico foram analisados usando um auto anali- sador Hitachi 917 (Roche, Indianápolis, EM). Sangue terminal foi tirado sob anestesia de CO, por punção cardíaca. Os pontos finais de soro foram ava- liados usando os ensaios ELISA comerciais: Proteína Alfa-Feto (R & D Sys- tems, Minneapolis MN) e Albumina Humana (Bethyl Laboratories, Montgo- mery TX). Os animais foram eutanizados por inalação de CO>. Os tumores foram excisados, pesados e colocados em formalina para histologia.

O teste T não pareado do estudante foi usado para comparar vá- rios parâmetros entre ratos do grupo tratado e de controle. Todos os valores são expressos como média + SD, e um valor p <0,05 foi considerado ser estatisticamente significante.

Resultados As medições de peso corporal foram corrigidas por subtração do peso de tumor (com base nos dados de volume e a admissão que 1cmº=19g). Os dados foram analisados de dois modos: por grupo de tra-

aa a 'EÉIÃa-..:s:2d-c4.>? .*J%Y$ 96“ /IA2ASSÉÍA2Ô “o O2ºoPâºÓ o 90 tamento, e por animais portando tumor ou não tumor. Quando comparando ' pesos corporais em animais portando tumor a animais portando não tumor, houve uma diferença significante entre os grupos no ponto do tempo termi- nal; não houve nenhuma diferença na linha de base. Ainda que os pesos corporais não fossem significantemente diferentes quando comparando com grupo de tratamento provavelmente devido a curta duração do estudo, houve uma tendência apreciável para peso corporal diminuído em ambos os grupos portando tumor relativos aos controles e uma tendência positiva para recu- peração em animais recebendo vacina quando comparando os animais por- tando tumor recebendo veículo sem antígeno (Tabela 20). Também, houve também uma correlação razoável entre mudança em porcentagem no peso corporal duurante a duração do experimento e volume de tumor (P = 0,72) ou peso (excisado) em término (P=0,73).

2 Tabela 20. Mudança no peso corporal durante o tempo entre grupos experimen- ” 15 tais Asáreas sombreadas indicam dados quando a vacina foi administrada. | lo = an7ina [o600x163 = [450x121 — | ls —l2639:135 lareisins — oseestas — | le = lorotstão —lasossto2 — losotatsa — | : 27 96 = lasossia lomesta — lonastas |

Tamanho de tumor ' O tamanho de tumor nos ratos de controle foi comparado ao ta- manho de tumor nos ratos tratados por vacina durante um período de quatro semanas.

Ainda que nenhuma diferença estatisticamente significante fosse constatada entre grupos comparados (devido à grande variação no tamanho de tumor), houve uma forte tendência para diminuição de volume de tumor total (Tabela 21), e também peso de tumor excisado médio diminuído (Tabe- la 22) nos ratos que receberam a vacina.

Tabela 21. Mudança no tamanho de tumor entre o grupo tratado por veículo (Tumor) e grupo tratado com vacina (Tratado por tumor). As áreas sombre- adas indicam dados quando a vacina foi administrada. o = Tamanhodetamentamy == | mao | mo | Tumortatado | od aga2t | ars2o =— | colo ae | a92o0 |] agi = | | : 333148 | Tabela 22. Diferença em peso de tumor em necropsia.

Lo meo | Tumortrtado |

"ÍÊX)2 22Ê2Ê] 12222 a uúúwúúéée »uâvv wPv]LNAÓ :U%2 2292“ “““““““““,AP““AP9P9”“99,A- "ss oo COCA 92 i ' Ensaios de Soro Ú Proteína alfa-feto humana (AFP) foi medida através de ELISA em vários pontos do tempo durante o estudo. Estes dados foram usados junto com dados de peso corporal e tamanho de tumor para aleatorizar ani- mais aos grupos de tratamento. Os dados deste estudo e dados históricos indicam que AFP é apenas detectável em animais portando tumor. À com- paração de dados de AFP longitudinal no controle de tumor e grupos trata- dos indica que AFP diminuiu nos animais tratados em seguida à primeira injeção de vacina, e foi muito mais baixo em ratos tratados relativos aos con- troles portando tumor no término do estudo; 4,78 + 3,2 ng/ml em veículo tra- tado relativo a 0,97 + 2,5 ng/ml nos ratos tratados por vacina, respectiva- mente. Adicionalmente, AFP demonstrou uma correlação a tanto volume de tumor quanto peso de tumor excisado. % A albumina humana (hALB) foi medida através de ELISA em vá- s 15 rios pontos do tempo durante o estudo. Os dados deste estudo e dados his- : tóricos indicam que hALB é apenas detectável em animais portando tumor. i Comparação de dados de hALB no controle de tumor e grupos tratados indi- cam que hALB foi mais baixo em ratos tratados relativo aos controles por- tando tumor no término de estudo (dados não mostrados). Adicionalmente, —hALB, similar ao AFP, demonstraram uma correlação a tanto volume de tu- mor quanto peso de tumor excisado (dados não mostrados).

Um painel químico de soro de núcleo foi ensaiado como vários pontos do tempo ao longo do estudo. O painel incluía: AST, ALT, Colesterol, fosfatase alcalina, GGT, BUN, glicose, creatinina, bilirrubina total, proteína total, albumina, globulina e minerais Ca, P, Na, Ke Cl. Similares ao peso corporal, dados foram analisados de dois modos: por grupo de tratamento e por animais portando tumor ou não tumor. Os pontos finais apenas onde as diferenças foram observadas foram: AST, ALT e colesterol. Em ambas as comparações, não houve nenhuma diferença significante entre grupos no ponto do tempo de linha de base (dados não mostrados). Quando compa- rando os índices químicos em animais portando tumor a animais portando não tumor, houve uma diferença significante entre os grupos no ponto do ei “2SAA22++AAk€eMszseanaP !ÂÂô2mii abBirMbt2 . ÓQAM.QP.

AÂRÓ “Ó“ÃÕÚOOOOOOO OO OO OO CCC os tempo terminal com elevações em AST, ALT e colesterol nos animais por- : tando tumor (dados não mostrados). Conclusão Tomados juntos os dados demonstram que a carga de tumor foi reduzida em animais tratados com a vacina preparada contra a linhagem de células de tumor de HepG2, relativa para controlar grupo portando tumor recebendo veículo.

Exemplo 22. CpG Antecedentes Os adjuvantes descritos aqui são uma plataforma adjuvante de vacina potente que pode ser intensificada por uso de um ORN/ODN (CpG) para reforçar a resposta imune pelo uso dos adjuvantes como um sistema de liberação para o CpG. : Materiais e Métodos - 15 Camundongos C57BI/6 femininos (n=10 por grupo) com um peso corporal de cerca de 18 a 20g foram usados no estudo.

Eles foram imuniza- dos por meio de injeção intramuscular (IM) no músculo anterior tibial esquer- do com um volume total de 50ul nos dias de estudo 0, 14 e 21. Dose de reagente Uma dose da composição compreendia, em várias combina- ções, um ou mais dos seguintes componentes: Tampão: NaH2PO4.2H20 (229,32 mg/L), NaCIl (1168,00 mg/L) e Na2HPOA4 (1144,00 mg/L), dissolvidos em WFI e filtrados estéreis com um filtro de 0,1 um.

Ovalbumina (OVA - Antígeno): 10u9g CpG ODN: 10ug Colestero!: 11Ug Quil A: 1 ug DDA: 0,5 pg Carbopol: 0,0375% R1005: 50 vg

Preparação de Vacina : Tampão foi colocado em um frasco de 50 ml com barra de agita- ção e agitado em uma velocidade constante ao longo de todas as seguintes etapas.

Os componentes foram adicionados na seguinte ordem: antígeno (OVA); CPG ODN; Quil A; colesterol (gota a gota); DDA (gota a gota); Car- bopol?; e Bay R1005º.

A composição foi agitada em temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC) durante um mínimo de 30 minutos enquanto prote- gida da luz por cobertura com folha metálica.

A solução foi forçada através de uma agulha de 25G em uma seringa para quebrar quaisquer grandes par- tículas flutuantes para obter uma suspensão uniforme (turva) e transferida aos frascos de vidro estéreis para armazenagem.

Coleta de Amostra As seguintes amostras foram coletadas: + Plasma: 4 semanas depois da primeira vacinação (1 semana * 15 depoisda segunda vacinação de reforço) Linfócito T citotóxico (CTL) (6 semanas depois da primeira vaci- | nação (3 semanas depois da segunda vacinação de reforço) Secreção de citocina em sobrenadante (4 semanas depois da primeira vacinação Sobrenadante de 24 horas (IL-2, IL-4, 1L-10, TNF Sobrenadante de 72 horas (IFN-g Tetrâmero (4 semanas depois da primeira vacinação Células T produzindo citocina (6 semanas depois da primeira vacinação Os resultados são fornecidos como um escore relativo que para cada adjuvante mostra o efeito do adjuvante.

Os pontos finais são uma es- cala relativa com base na soma das respostas de T Citotóxico - Linfócito in- dividual.

Resultados e Discussão Tal como apresentado na Tabela 23, QCDCR mais OVA produ- ziu respostas de CTL mais fortes do que seus subcomponentes, no entanto respostas totais foram lentas (<20%). A combinação de QCDCR ou seus E ns RSS SS subcomponentes com CPG significantemente melhorou as respostas de CTL ' específicas por OVA.

QCDCR/CPG total mais OVA produziu a resposta de CTL mais alta, no entanto, não houve nenhuma diferença significante nas respostas entre este grupo e colesterol/CPG mais OVA (em relação de 25:1) Os sobrenadantes de cultura de esplenócitos estimulados com OVA (1 mg/ml) foram ensaiados quanto às citocinas através de ELISA.

QCDCR sozinho ou seus subcomponentes produziram apenas resposta de citocinas muito fracas.

A combinação de QCDCR ou de seus subcomponentes com secreção intensificada por CPG de IL-2 e IFN-g específico por antígeno (ci- tocinas polarizadas por Th1). QCDCR e CpG são iguais em potência para aumento de respostas imunes celulares.

A combinação dos dois mostra si- ' nergia.

Quando os subcomponentes de QCDCR foram analisados com | CpG, as combinações com Quil A produziram as melhores respostas segui- . do por inclusão de colesterol com CpG. : 15 Tabela23. Respostas de CTL Relativas | [empos =— = > jern lirng |Tetrâmero 12 [Total | | ' | [ecpe-cpesova — [15 jog | 7 16 | 66 | | |Ch+cpercrrova — [12 js as. (17 68 | [cn+cpexDesova =—| 8 jaz | 13 | 156 | 63 | |cn+cpeDerrova [160 aaa ag sa | [ercperova = [a dB Bo a as | |perrepesova — [13 jas 2 | q lar | lcrrcpesova — ——J1o jo | qn) | 8 39 | [pescpesova = jan dan | 8 | 6 36 | [epesova Ta dg gg ig, |[QCDERKOVA = 7 | 85 | 7 [1 33 | Lacperova a a | Lerzova aa 6 | [Dertova — 6 [2 1 6 [216 oa RA aa QC é a abreviação para QuilA/colesterol, Ch para colesterol, D para DDA, C para Carbopolº, R para Bay R1005º

. 7 96 Exemplo 23. Coronavírus canino (CCV) : Escopo Um modelo de murino foi empregado usando coronavírus canino (CCV) e novos adjuvantes de combinação para avaliar o desempenho de adjuvante com o dado componente antigênico. Animais Dez camundongos CF-1 por grupo de tratamento foram adminis- trados 0,2 mL subcutaneamente por animal de cada grupo de tratamento. Grupos de tratamento As formulações de teste mostradas na Tabela 24 foram prepara- das como volumes de dose de área de 1,0 mL com as concentrações dadas abaixo. Apenas 0,2 mL da vacina foi administrado a cada camundongo. Tabela 24. Formulações de Teste.

2 Concentração Adj.: F upg/2mL (exceto Carbo- : Formulações de Teste pol CCV dose

PN MP PA [6 fanscosoo do je | [6 Tauacaeseo soon eo | 7 ros do leo | [8 frooscamama front [120% | [9 | nor cama — somonvanTe% [120% | [10 Jovincoesteramrioos — — > Íroomoonooo — leo | Preparação de Vacina A preparação de vacina para os adjuvantes da invenção é des- crita nos Exemplos 1 a 13 acima. As concentrações de componentes adju-

———— A a 5932.P.;; 2 >— P-P ne í Co I â?ê?ÉÀ “é : >X9“â Á 21912220" AA?) Ó alcsciúrm—lârízíóãõ”óo; ) EIDIE)NTOÁ O 97 vantes são fornecidas na Tabela 24. Os adjuvantes foram adicionados na : ordem listada na Tabela.

Um extensor de solução salina foi adicionado a um vaso e ho- mogenização foi iniciada.

CCV inativado foi adicionado a uma concentração mostrada na Tabela 24. A Quil A foi adicionada à concentração listada na Tabela 24. O colesterol na solução de etanol foi em seguida adicionado com homogenização continuada.

A solução de DDA/etanol foi em seguida adi- cionada durante a homogenização.

A mistura foi microfluidificada em 68900 KPa (10.000 psi). O carbopol foi em seguida adicionado com mistura e o pH foi ajustado a 6,8 até 7,2. O glicolipídeo Bay R1005º foi em seguida adicio- nado com mistura.

Finalmente, a composição foi conduzida ao volume final com o extensor de solução salina.

A vacina para os grupos de tratamento recebendo os produtos A- : bISCO comercialmente disponíveis (Isconova, Suécia) foi preparada de acor- “ 15 docom as instruções do rótulo.

Os produtos ADISCO são com base nas sa- : poninas quillaja e tecnologia ISCOM usando saponinas altamente purificadas.

Método de Ensaio: a neutralização de Soro de CCV beta O soro foi inativado por calor em 56ºC durante 30 a 40 minutos.

Em uma placa estéril limpa, as diluições em série de cada um dos soros (não diluído, 2, 4,8...) foram desempenhadas por transferência de 120 ul em 120 ul de diluente.

Pelo menos duas cavidades de replicação/diluição foram usadas.

Uma diluição de 1:16 foi usada inicialmente, se necessário.

Uma matéria-prima de desafio de trabalho foi preparada por diluição de CCV vivo a um nível contendo cerca de 240 partículas de vírus em 120 ul.

Em seguida, 120 ul de cada diluição de soro foram combinados com 120 ul de solução de vírus para um total de 240 ul.

A solução foi misturada e mantida em temperatura ambiente (aproximadamente 25º) durante 30 a 60 minutos para permitir neutralização.

Em seguida, 120 ul de cada série foram transfe- ridos nas monocamadas nuas de espera das células de NLFK semeadas 7 a 12 dias anteriormente.

CPE foi avaliado 4 a 6 dias depois.

A titulação de regressão confirmou que 50 a 316 partículas de vírus atingiram cada mono- camada.

Resultados ! : Tabela 25. Neutralização de Soro | antígeno apenas Pg Rg : : | | Sumário Os efeitos combinados dos adjuvantes formulados com CCV le- vandoem conta as propriedades químicas de cada componente forneceram propriedades excelentes para uma vacina adjuvante. Os resultados sorológicos do estudo são mostrados na Tabela

25. Os títulos de anticorpo de neutralização de soro elevados geralmente são associados a melhor proteção fornecida pelas vacinas. Várias das for- mulações adjuvantes da invenção produziram títulos muito miores do que os produtos adjuvados comerciais, ainda que estas formulações tivessem uma quantidade similar de antígeno de CCV adicionada. As formulações de QCDC, QCR, DRC, QCRC, e QCDRC foram especialmente eficazes na in- dução de uma boa resposta imune nos camundongos. ! Exemplo 24. Antígeno de Rotavírus Bovino Escopo Um modelo de murino foi empregado usando Rotavírus Bovino e

CP 2 “ 0 “e 2 9) .. "o fS.. . . . 99 adjuvantes de combinação da invenção para avaliar o desempenho de adju- : vante com o dado componente antigênico. Animais Dez camundongos de CF-1 por grupo de tratamento foram ad- ministrados 0,2 mL subcutaneamente por animal para cada grupo de trata- mento. Grupos de Tratamento As formulações de teste mostradas na Tabela 26 foram prepara- das como volumes de dose de área de 2,0 mL com as concentrações dadas abaixo. Apenas 0,2 mL da vacina foi administrado para cada animal. Tabela 26. Formulações de Teste fumam anões [2] Formulações de Teste g/2mL (exceto Carbopol| B223 /dose : : O PE : PO PR PP [4 famscozo die o fecew

PS PD 6 fomacseseo — famnoo Jeca | [7 — LaumracoestecrmoR camoo — Lroroaisamozsss — jecena | [e fes ae Jeca | lo Javencoesteanos — [romano [eos | | 10 axtacosstevDDA ROSS Camapsl | 1ooronisariana mana — scene | | | 13 | auravcoesterumpA RICOS Ccarbapal | tnornorsartonom orar — Jazena | |

PR PPA Preparação de vacina Preparação de vacina para os adjuvantes da invenção é descrita nos Exemplos 1 a 13 acima. As concentrações de componentes adjuvantes são fornecidas na Tabela 26. Os adjuvantes foram adicionados na ordem ANA | listada na Tabela. ' Um extensor de solução salina foi adicionado a um vaso e ho- mogenização foi iniciada. O Rotavírus Bovino Inativado foi adicionado a uma concentração mostrada na Tabela 26. A Quil A foi adicionada na con- centração listada na Tabela 26. A solução de colesterol/etanol foi em segui- da adicionada com homogenização continuada. A solução de DDA/etano!l foi em seguida adicionada durante a homogenização. A mistura foi microfluidi- ficada em 68900 KPa (10.000 psi). Carbopol? foi em seguida adicionado com mistura e o pH foi ajustado a 6,8 até 7.2. Glicolipídeo Bay R1005º foi em seguida adicionado com mistura. Finalmente, a composição foi conduzi- da ao volume final com o extensor de solução salina. A vacina para os grupos de tratamento recebendo os produtos A- bISCO comercialmente disponíveis (Isconova, Suécia) foi preparada de acordo . com as instruções do rótulo. Os produtos ADISCO são com base nas saponi- “ 15 —nasquillaja e tecnologia ISCOM usando saponinas altamente purificadas. ' : | Resultados | i Tabela 27. Títulos de Neutralização de Soro | |

RA | Beer CR Ó QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para Carbopolº, R para Bay R1005º : Os efeitos combinados dos adjuvantes formulados com Rotaví- rus bovino e levando em conta as propriedades químicas de cada compo- nente forneceram propriedades excelentes para uma vacina adjuvante (veja Tabela27). Embora várias das formulações adjuvantes fornecessem níveis similares de títulos de anticorpo de neutralização de soro, o adjuvante de QCDCR forneceu o nível mais alto. j Exemplo 25. Vírus de Influenza Canina Escopo/Esquema de Estudo Um modelo canino foi empregado usando vírus de influenza ca- nina (CIV) e novos adjuvantes de combinação para avaliar o desempenho de adjuvante com o dado componente antigênico.

A Este estudo tinha um esquema em bloco completo aleatorizado. . 15 (veja Tabela 28). Animais foram classificados por data de nascimento para : formar blocos de tamanho 5. Dentro de um bloco, os animais foram aleato- riamente designados para tratamentos. Animais no mesmo bloco foram ale- atoriamente designados para engaiolar (gaiolas) localizados um próximo ao outro. Os animais estavam em boa saúde sem história de hipersensibilidade a vacinas comercialmente disponíveis. Os animais não receberam vacinas contra CIV.

Tabela 28. Esq de Estudo msn Ee Tratamento | Animais 191 [emo — |PRceno adiante teontalene o fame )sa = Et e). TO2 I1mL so rança de Área (pós-controle 103 Jeso —famestdeaee — o lim lso 14 fam amemédadeace — lo |im [so [15 Jato luoseemdeacoe — lo Tim [so QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para Carbopolº

O CS

« , 102 Tabela 29. Composição de Vacina [ro me [io tra Formulação dragel LV a 5% [ras | ns EmA Formulação — colesterol — DDA — carbopol (20/20/10/.075 Pa

TEA 7 Formulação — colesterol — DDA — carbopol (10/10/10/.075 : [rs | nm SITES Formulação — colesterol — DDA — carbopol (5/5/10/.075; Preparação de Vacina A preparação de vacina para os adjuvantes da invenção é des- crita nos Exemplos 1 a 13 acima. As concentrações de componentes adju- vantes são fornecidas na Tabela 29. Os adjuvantes foram adicionados na ordem listada na Tabela.

Um extensor de solução salina foi adicionado a um vaso e ho- mogenização foi iniciada. O vírus inativado de influenza canina foi adiciona- do na concentração mostrada na Tabela 29. A Quil A foi adicionada na con- —centração listada na Tabela 29. A solução de colesterol/etanol foi em segui- da adicionada com homogenização continuada. A solução de DDA/etanol foi em seguida adicionada durante a homogenização. A mistura foi microfluidi- ficada em 68900 KPa (10.000 psi). Carbopol foi em seguida adicionado com mistura e o pH foi ajustado a 6,8 até 7,2. Finalmente, a composição foi con-

103 | duzida ao volume final com o extensor de solução salina. : Teste A sorologia foi avaliada por uso de ensaio de inibição de hemoa- glutinação (HAI) por Método de Ensaio Padrão pela USDA. | — Resultados/ Sumário Apresentados na Tabela 30 são resultados sorológicos de THE nos dias 42 e 180 dos títulos médios de HAI Geo.. Tabela 30. Títulos de HAI [org | a | [tos (dose tenta) Ls a | [tos closemédia — | es | a | "o [roscoseata | 02B | 6 | : Os efeitos combinados dos adjuvantes formulados com vírus de : 10 influenza e levando em conta as propriedades químicas de cada componen- te forneceram propriedades excelentes para uma vacina adjuvante.

Títulos de anticorpo elevados geralmente são associados a me- lhor proteção de vacinas.

Geralmente, ambos o adjuvante de alumínio (T02) e os adjuvantes da invenção (TO3, TO4, e TO5) causaram um aumento nos títulos de HAI, mas a resposta causada pelos adjuvantes da invenção foi | superior com títulos elevados no dia 180 no grupo de dose alta (TO5). Os ! títulos para as doses baixas e médias dos adjuvantes da invenção foram | equivalentes àqueles da vacina contendo alumínio tradicional para influenza. | Adicionalmente, porque os adjuvantes da invenção fornecem uma resposta | imune de auxiliar 1 de T enquanto que o alumínio não, a duração da imuni- ! dade é esperada ser mais longa com um mecanismo de chamada mais rápi- do. ; | o |

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma formulação adjuvante e uma quantidade imunologicamen- te eficaz de um componente de antígeno, em que a formulação adjuvante compreende uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaterná- rio, e um polímero. '

2. Processo de preparação de uma composição imunogênica, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreen- i de: (a) preparação de uma composição do componente de antígeno em um tampão; (b) adição da saponina à composição da etapa (a); í (c) adição do esterol à composição da etapa (b); (d) adição do composto de amônio quaternário à composição da etapa(c); (e) adição do polímero à composição da etapa (d); e (f) opcionalmente, adição do estimulante de Th2 à composição da etapa (e).

3. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que com- preende uma formulação adjuvante e uma quantidade terapeuticamente efi- caz de um componente de antígeno, em que a formulação adjuvante com- preende uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaternário, e um polímero, e opcionalmente um estimulante de Th2.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracteri- zada pelo fato de que a saponina é Quil A ou uma fração purificada da mesma, o esterol é colesterol, o composto de amônio quaternário é dimetil dioctadecil brometo de amônio (DDA), e o polímero é ácido poliacrílico, e o estimulante de Th2 é um glicolipídeo.

5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, 3 oud4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um óleo.

6. Processo de preparação de uma composição de vacina, como definida na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) preparação de uma composição do componente de antígeno em um tampão; (b) adição da saponina à composição da etapa (a); (c) adição do esterol à composição da etapa (b); (d) adição do composto de amônio quaternário à composição da etapa (c); ' (e) adição do polímero à composição da etapa (d); e (f) opcionalmente, adição do estimulante de Th2 à composição da etapa (e).

7. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 6, caracterizado . pelo fato de que a saponina é Quil A ou uma fração purificada da mesma, o esterol é colesterol, o composto de amônio quaternário é dimetil dioctadecil ' brometo de amônio (DDA), e o polímero é ácido poliacrílico, e o estimulante de Th2 é um glicolipídeo.

8. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 6, caracterizado | pelo fato de que compreende ainda uma etapa de adição da composição da . etapa (e) a uma fase de óleo.

9. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de adição da composição da etapa(f)auma fase de óleo.

10. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 6, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda uma etapa compreendendo microflui- dificação da composição de etapa d.

11. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracte- rizada pelo fato de que o estimulante de Th2 é acetato de N-(2-Desóxi-2-L- leucilamino-B-D-glicopiranosil)-N-octadecildodecanamida.

12. Composição de acordo com a reivindicação 1, 3, 4 ou 5, ca- racterizada pelo fato de que o componente e antígeno compreende: (a) vírus de leucemia felina; (b) uma cepa J-5 de Escherichia coli; (c) BVDV; (d) BVDV-1 e BVDV-2;

(e) M. hyopneumonia; (9) FIV; (g) um antígeno de câncer; (h) CCV; (1) rotavírus bovino; ou (0) CIV. ' 13. Uso da composição (a), como definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tra- tamento de um felino contra infecção causada por vírus de leucemia felina.

14. Uso da composição (b), como definida na reivindicação 12, . caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tra- tamento de um bovino contra infecção causada por Escherichia coli.

' 15. Uso da composição (c) ou (d), como definida na reivindica- ção 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento paratratamento de um bovino contra infecção causada por BVDV.

Í 16. Uso da composição (e), como definida na reivindicação 12, . caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tra- tamento de um suíno contra infecção causada por M. hyopneumonia.

17. Uso da composição (f), como definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tra- tamento de um felino contra infecção causada por FIV.

18. Uso da composição (g), como definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tra- tamento de um paciente contra câncer.

19. Uso da composição (h), como definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tra- tamento de um canino contra infecção causada por CCV.

20. Uso da composição (i), como definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tra- tamento de um bovino contra infecção causada por rotavírus bovino.

21. Uso da composição (j), como definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tra-

tamento de um canino contra infecção causada por CIV.

22. Vacina de coccidiose aviária, para administração em ovo, ca- racterizada pelo fato de que compreende: (a) um adjuvante que compreende Quil A ou uma fração purifi- cadadamesma incluindo QS21, colesterol, CARBOPOL, DDA, e R1005; e (b) um antígeno de protozoário selecionado de (1) uma ou mais ' proteínas recombinantemente expressas, (2) uma ou mais proteínas ou ou- tras macromoléculas isoladas do referido protozoário através de meios con- | vencionais, e (3) extratos ou preparações de célula total do referido protozo- Áário. .

23. Método de diferenciação de um animal naturalmente infecta- do com BVDV de um animal vacinado com a composição de vacina (c) ou t (d), como definida na reivindicação 12, o referido método sendo caracteriza- do pelo fato de que compreende a obtenção de uma amostra de um animal deteste, e medição dos níveis de proteína E? e proteínas NS2/3 na referida amostra, em que a ausência de proteinas NS2/3 indica que o animal foi va- D cinado com a referida composição de vacina.

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