BRPI0913954B1 - Composições de vacina e uso das mesmas - Google Patents

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Cedo Martin Bagi
Tedd Alan Childers
Paul Joseph Dominowski
Richard Lee Krebs
Ramasamy Mannar Mannan
Mary Kathryn Olsen
James Richard Thompson
Risini Dhammika Weeratna
Robert John Yancey, Jr
Shucheng Zhang
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Zoetis Services Llc
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Abstract

PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E DE VACINA, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E DE VACINA, BEM COMO USO DAS MESMAS, VACINA DE COCCIDIOSE AVIÁRIA E MÉTODO DE DIFERENCIAÇÃO DE UM ANIMAL NATURALMENTE INFECTADO COM BVDV DE UM ANIMAL VACINADO. A presente invenção refere-se às formulações adjuvantes compreendendo várias combinações de triterpenoides, esteróis, imunomoduladores, polímeros, e estimuladores de Th2; a métodos para produção das composições adjuvantes; e ao uso das formulações adjuvantes nas composições imunogênicas e de vacina com diferentes antígenos. A presente invenção ainda refere- se ao uso das formulações no tratamento de animais.

Description

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se geralmente a novas formulações adjuvantes para intensificara resposta imune a antígenos para uso em composições imunogênicas e de vacina, sem produção de efeitos colaterais tóxicos ou indesejáveis no paciente. Esta invenção também refere-se aos processos de preparação e uso das composições adjuvantes, imunogênicas, e de vacina.
História e Descrição da Arte Relacionada
[0002] Infecções bacterianas, virais, e parasitárias são frequentes em humanos e animais. Doenças causadas por estes agentes infecciosos são frequentemente resistentes à terapia farmacêutica antimicrobiana, não deixando nenhum mecanismo eficaz de tratamento. Por conseguinte, um processo de vacinologia é cada vez mais usado para controlar doença infecciosa. Um patógeno infeccioso integral pode ser produzido adequadamente para uso em uma formulação de vacina depois de inativação química ou manipulação genética apropriada. Alternativamente, uma subunidade de proteína do patógeno pode ser expressa em um sistema de expressão recombinante e purificada para uso em uma formulação de vacina. As vacinas podem ser produzidas mais eficazes por inclusão de um adjuvante apropriado na composição.
[0003] Há também um interesse aumentado no uso de um processo de vacinologia para tratamento de câncer em animais e humanos. Este processo terapêutico para o tratamento de câncer envolve vacinação de pacientes com câncer com uma vacina compreendendo um antígeno específico por tumor e um adjuvante. No entanto, nenhuma das muitas vacinas de câncer desta natureza em desenvolvimento foi aprovada por autoridades reguladoras. As vacinas não demonstraram reduzir os tumores, uma medida padrão de uma eficácia de fármaco de câncer.
[0004] O termo 'adjuvante' geralmente refere-se a qualquer material que aumente a resposta imune humoral ou celular a um antígeno. Os adjuvantes são usados para realizar dois objetivos: Eles retardam a liberação de antígenos do sítio de injeção, e eles estimulam o sistema imune. As vacinas tradicionais são geralmente compostas de uma preparação bruta de microrganismos patogênicos inativados ou mortos ou vivos modificados. As impurezas associadas com estas culturas de microrganismos patológicos podem agir como um adjuvante para intensificar a resposta imune. No entanto, a imunidade evocada por vacinas que usam preparações homogêneas de microrganismos patológicos ou subunidades de proteína purificada como antígenos é frequentemente fraca. A adição de certos materiais exógenos tais como um adjuvante por esse motivo torna-se necessária. Além disso, as vacinas sintéticas e de subunidade são caras para produzir. A adição de um adjuvante pode permitir o uso de uma dose menor de antígeno para estimular uma resposta imune similar, desse modo reduzindo o custo de produção da vacina. Desta forma, a eficácia de alguns agentes medicinais injetáveis pode ser significantemente aumentada quando o agente é combinado com um adjuvante.
[0005] Muitos fatores devem ser levados em consideração na seleção de um adjuvante. Um adjuvante deve causar uma taxa relativamente lenta de liberação e absorção do antígeno de uma maneira eficiente com efeitos tóxicos, alergênicos, irritantes mínimos, e outros indesejáveis ao hospedeiro. Para ser desejável, um adjuvante deve ser não virucida, biodegradável, capaz de criar consistentemente um alto nível de imunidade, capaz de estimulação de proteção cruzada, compatível com múltiplos antígenos, eficaz em múltiplas espécies, não tóxico, e seguro para o hospedeiro (por exemplo, nenhuma reação do sítio de injeção). Outras características desejáveis de um adjuvante são que ele é capaz de micro-dosagem, é econômico em dose, possui excelente estabilidade de prateleira, é receptivo à secagem, pode ser produzido sem óleo, pode existir como ou um sólido ou um líquido, é isotônico, é facilmente produzido, e é barato para produzir. Finalmente, é altamente desejável para um adjuvante ser configurável a fim de induzir ou uma resposta imune humoral ou celular ou ambas, dependendo dos requerimentos do cenário de vacinação. No entanto, o número de adjuvantes que podem alcançar os requerimentos acima é limitado.
[0006] A escolha de um adjuvante depende das necessidades para a vacina que ele seja um aumento na magnitude ou função da resposta de anticorpo, um aumento na resposta imune mediada por célula, uma indução de imunidade mucosa, ou uma redução na dose de antígeno. Vários adjuvantes foram propostos, no entanto, nenhum demonstrou ser idealmente adequado para todas as vacinas. O primeiro adjuvante relatado na literatura foi Adjuvante Completo de Freund (FCA) que contém uma emulsão de água em óleo e extratos de micobactéria. Infelizmente, o FCA é parcamente tolerado e ele pode causar inflamação sem controle. Desde a descoberta do FCA mais de 80 anos atrás, esforços foram produzidos para reduzir os efeitos colaterais indesejáveis de adjuvantes.
[0007] Alguns outros materiais que foram usados como adjuvantes incluem óxidos metálicos (por exemplo, hidróxido de alumínio), alume, quelatos inorgânicos de sais, gelatinas, vários óleos do tipo parafina, resinas sintetizadas, alginatos, compostos de mucoide e polissacarídeo, caseinatos, e substâncias derivadas do sangue tais como coágulos de sangue de fibrina. Embora estes materiais sejam geralmente eficazes na estimulação do sistema imune, nenhum foi constatado ser totalmente satisfatório devido aos efeitos adversos no hospedeiro (por exemplo, produção de abcessos estéreis, lesão de órgão, carcinogenicosidade, ou respostas alergênicas) ou propriedades farmacêuticas indesejáveis (por exemplo, dispersão rápida ou controle fraco da dispersão do sítio de injeção, ou tumefação do material).
[0008] Óleos sintetizados e derivados de petróleo foram usados como adjuvantes porque eles exibem dispersão relativamente lenta no corpo, mas eles podem ser indesejáveis quando eles frequentemente são quebrados em hidrocarbonetos aromáticos, que podem ser carcinogênicos. Além disso, algumas destas substâncias foram constatadas serem capazes de produção de abcessos estéreis e podem nunca serem completamente eliminadas pelo corpo. Óleos quando apropriadamente selecionados e formulados em concentrações adequadas podem ser relativamente seguros e não tóxicos.
[0009] As saponinas obtidas de casca da árvore Sul-americana Quillaja saponaria foram usadas como adjuvantes durante algum tempo. Veja Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (A review of biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363386. 1996). Muitas das vacinas de veterinária em uso hoje contêm Quil A, que é a fração de saponina da casca da árvore Sul-americana Quillaja saponaria molina. Além disso, o fracionamento de Quil A produziu subfrações, incluindo QS-7, QS-17, QS-18, e QS-21. (Veja Patente dos Estados Unidos No. 5.057.540)
[00010] O uso de saponinas como adjuvantes é associado com várias desvantagens. As saponinas são solúveis e desta forma estimulam uma resposta imune não específica. A meta da vacinologia, no entanto, é estimular uma resposta alvejada a um antígeno específico ou antígenos. As saponinas possuem uma forte afinidade por colesterol. Elas formam um complexo com o colesterol encontrado nas membranas da célula causando hemólise da célula. Elas também demonstraram causar necrose no sítio de injeção e serem difíceis de formularem-se em estruturas particuladas. Quando usadas em vacinas contendo vírus envelopados vivos modificados, as saponinas rompem o envelope viral e desse modo inativam os antígenos virais.
[00011] Para superar as propriedades hemolíticas e virucidas de Quil A, ela foi combinada com colesterol e fosfolipídeos, que formam uma estrutura específica conhecida como um complexo imunoestimulador (ISCOM) ou matriz de ISCOM (ISCOMATRIX). Veja Ozel M., e outros; J. Ultrastruc. and Molec. Struc. Re 102, 240-248 (1989). Os ISCOMs, quando combinados com um antígeno, geralmente induzem uma resposta de célula T citotóxica Th1. No entanto, embora grandemente reduzindo as propriedades hemolíticas de Quil A, a combinação de Quil A com colesterol não os elimina completamente. Outra limitação de ISCOMs é que um antígeno de proteína deve possuir domínios hidrofóbicos grandes o bastante para interagir com o ISCOM a fim de serem incorporados em um ISCOM. Uma proteína que é altamente hidrofílica não pode ser incorporada em um ISCOM. Finalmente, ISCOMs podem estimular uma reação autoimune indesejável no paciente.
[00012] Os imunomoduladores foram usados como adjuvantes, com exemplos incluindo brometo de amônio de dioctadecila de dimetila (daqui em diante, "DDA"), e avirdina. O DDA é um composto de amônio quaternário lipofílico (amina) com duas cadeias de alquila de 18 carbonos e dois grupos metila ligados a uma molécula de amônio quaternário positivamente carregada com um peso molecular de 631. Seu uso como um adjuvante foi descoberto por Gall, (Immunol. V. 11, p. 369, 1966). O DDA é relatado estimular fortes respostas imunes mediadas por célula, e também demonstrou induzir respostas imunes humorais. Muitos papéis foram publicados mostrando eficácia de DDA como um adjuvante para antígenos de proteína, haptenos, tumores, vírus, protozoários e bactérias. (Veja Korsholm, K S., e outros, Immunology, vol. 121, pp. 216-226, 2007.) A maior parte dos estudos têm sido desempenhado em animais de laboratório, embora apenas alguns tenham sido realizados em animais maiores tais como frangos (Veja Katz, D., e outros FEMS Immunol Med Microbiol. Vol 7(4):303- 313, 1993.), porcos, e gado. O DDA é eficaz na indução de uma reação de hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) em ambos os animais de laboratório e grandes animais. No entanto, ele é parcamente solúvel em água.
[00013] Os polímeros também foram usados como adjuvantes, com exemplos incluindo dietil-aminoetila (DEAE)-dextrana, polietileno glicol, e ácido poliacrílico (por exemplo, CARBOPOL®). O polissacarídeo DEAE-dextrana é conhecido na técnica como um adjuvante muito forte. No entanto, ele tem sido associado com reatogenicidade inaceitável. Os polímeros de CARBOPOL® são polímeros de ácido acrílico reticulado com éteres de polialquenila ou glicol de divinila. O CARBOPOL® foi usado em várias vacinas, mas seu uso como um adjuvante não foi provado.
[00014] Alguns adjuvantes demonstraram estimular uma resposta de Th2, com exemplos incluindo hidroacetato de N-(2-Desóxi-2-L- leucilamino-b-D-glicopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida, também conhecido pelo nome comercial Bay R1005® quando em sua forma de acetato, e alumínio. O Bay R1005® em combinação com vacinas de vírus purificado ou vacinas de subunidade levam a produção aumentada de anticorpo em camundongos desafiados por vírus. Os testes pré- clínicos em outras espécies animais (porco, carneiro, cavalo) produziram resultados comparáveis com respeito à produção de anticorpo. O aumento na síntese de anticorpo induzido por Bay R1005® é especificamente dependente do antígeno e não é o resultado de estimulação policlonal.
[00015] Antes desta invenção, nenhuma formulação adjuvante possuía a ampla faixa de características desejáveis que um adjuvante ideal deva possuir. Houve um esforço para encontrar novos adjuvantes para vacinas que superariam as deficiências daqueles convencionais. Em particular, uma formulação adjuvante que obtém respostas imunes humorais e mediadas por célula potentes a uma ampla faixa de antígenos em humanos e animais, e ainda é desprovido dos efeitos colaterais e dificuldades de formulação dos adjuvantes convencionais, é altamente desejável.
Sumário da Invenção
[00016] Esta invenção refere-se a novas composições adjuvantes, imunogênicas, e de vacina. Em particular, esta invenção refere-se a formulações adjuvantes compreendendo estimuladores de Th1, imunomoduladores, polímeros, e estimuladores de Th2. Esta invenção também refere-se às composições imunogênicas e de vacina compreendendo tais formulações adjuvantes e um ou mais antígenos, assim como processos de preparo das composições adjuvantes e de vacina.
[00017] Em uma modalidade, as composições adjuvantes compreendem uma combinação de uma saponina, um esterol, e um composto de amônio quaternário. Em uma modalidade, a combinação adjuvante compreende Quil A, colesterol e DDA.
[00018] Em outra modalidade, as composições adjuvantes compreendem uma combinação de uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaternário, e um polímero. Em uma modalidade, a combinação adjuvante é Quil A, colesterol, DDA, e ácido poliacrílico.
[00019] Em outra modalidade, as composições adjuvantes compreendem uma combinação de uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaternário, um polímero, e glicolipídeo. Em uma modalidade, a combinação adjuvante é Quil A, colesterol, DDA, ácido poliacrílico, e Bay R1005®.
[00020] Em uma modalidade, uma composição imunogênica compreendendo uma formulação adjuvante e uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno, em que a formulação adjuvante compreende uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaternário, e um polímero, é preparada pelo processo compreendendo a) preparo de uma composição do antígeno em um tampão, b) adição da saponina à composição da etapa a; c) adição do esterol à composição da etapa b; d) adição do composto de amônio quaternário à composição da etapa c, e) adição do polímero à composição da etapa d.
[00021] Em uma modalidade deste processo, a saponina é Quil A, o esterol é colesterol, o composto de amônio quaternário é DDA, e o polímero é ácido poliacrílico.
[00022] Em uma modalidade, uma vacina compreendendo uma formulação adjuvante e uma quantidade imunologicamente eficaz de um antígeno, em que a formulação adjuvante compreende uma saponina, um esterol, um composto de amônio quaternário, um polímero, e um glicolipídeo são preparados pelo processo compreendendo a) preparo de uma composição do antígeno em um tampão, b) adição da saponina à composição da etapa a; c) adição do esterol à composição da etapa b; d) adição do composto de amônio quaternário à composição da etapa c, e) adição do polímero à composição da etapa d, e f) adição do glicolipídeo à composição da etapa e.
[00023] Em uma modalidade deste processo, a saponina é Quil A, o esterol é colesterol, o composto de amônio quaternário é DDA, o polímero é ácido poliacrílico, e o glicolipídeo é Bay R1005®.
[00024] Foi constatado que as composições adjuvantes relatadas aqui possuem propriedades surpreendentes e inesperadas além do que esperaríamos de tal combinação. Foi surpreendentemente constatado que a propriedade virucida de Quil A/colesterol é eliminada nestas composições adjuvantes. Elas são adequadas como um diluente para antígenos virais vivos modificados liofilizados. As composições adjuvantes descritas aqui são configuráveis para obter uma resposta imune extremamente potente direcionada ou a uma resposta imune mediada por célula, uma resposta imune humoral, ou ambas. Adicionalmente, as reações do sítio de injeção podem ser largamente evitadas pelo uso destas formulações adjuvantes. A reatogenicidade é menor do que aquela de vários dos componentes individuais que compreendem os adjuvantes de combinação. Além disso, estas formulações adjuvantes fornecem capacidade de armazenagem de longa duração.
[00025] Os requerentes descobriram que estas novas composições adjuvantes são altamente imunogênicas quando combinadas com um ou mais de vários antígenos diferentes sobre uma ampla faixa de espécies. Elas podem ser usadas com um ou mais antígenos virais, bacterianos, parasitários, de proteína recombinante, e de peptídeo sintético, e combinações dos mesmos. As novas composições adjuvantes de vacina podem ser usadas em vacinas terapêuticas para tratar câncer.
[00026] A presente invenção por esse motivo fornece composições adjuvantes, imunogênicas, e de vacina. Adicionalmente são fornecidos processos para a produção das composições. Também é fornecido seu uso no tratamento de doença. Também é fornecido seu uso no preparo de um medicamento para tratamento de um paciente contra a doença, particularmente contra as doenças descritas abaixo. Também é fornecido seu uso no preparo de um medicamento para prevenção ou redução da doença em um paciente.
[00027] Além disso, é fornecido seu uso no preparo de um medicamento para tratamento de um felino contra infecção causada pelo vírus de leucemia felina, para tratamento de um aviário contra coccidiose aviária, para tratamento de um bovino contra as doenças causadas por Escherichia coli, para tratamento de um bovino contra as doenças causadas pelo vírus de diarreia viral bovina, para tratamento de um suíno contra as doenças causadas por Hiopneumonia de micoplasma, para tratamento de um felino contra as doenças causadas pelo vírus de influenza felina, um paciente contra câncer, para tratamento de um canino contra as doenças causadas pelo coronavírus canino, para tratamento de um bovino contra as doenças causadas pelo rotavírus bovino, e para tratamento de um canino para doenças causadas pelo vírus de influenza canina. Também é fornecido o uso de adjuvantes como uma vacina marcadora para auxiliar na identificação de animais que foram vacinados. Também é fornecido o uso de CpG para intensificar os efeitos dos adjuvantes.
Breve Descrição da Figura
[00028] A figura 1 representa um ciclo de gel através de ensaio de radioimunoprecipitação mostrando as diferenças de perfil de anticorpo entre proteínas NS2/3 e proteínas E2 do Vírus BVD. O grupo tratado por PreZent A mostra uma resposta de anticorpo a ambas as proteínas NS2/3 e as proteínas E2 embora os grupos tratados por QCDC e QCDCR demonstraram uma resposta de anticorpo a apenas proteína E2 e não às proteínas NS2/3.
Descrição Detalhada da Invenção Definições
[00029] "Cerca de" ou "aproximadamente," quando usado com relação a uma variável numérica mensurável, refere-se ao valor indicado da variável e a todos os valores da variável que estão dentro do erro experimental do valor indicado (por exemplo, dentro do intervalo de confiança de 95% para a média) ou dentro de 10 por cento do valor indicado, qualquer que seja maior, a não ser que cerca de seja usado em referência aos intervalos de tempo em semanas onde "cerca de 3 semanas," é 17 a 25 dias, e cerca de 2 a cerca de 4 semanas é 10 a 40 dias.
[00030] "Adjuvante" quer dizer qualquer substância que aumente a resposta imune humoral ou celular a um antígeno. Adjuvantes são geralmente usados para realizar dois objetivos: A liberação lenta de antígenos do sítio de injeção, e a estimulação do sistema imune.
[00031] "Alquila" refere-se a porções de hidrocarboneto saturado tanto linear quanto ramificado.
[00032] "Amina" refere-se a um composto químico contendo nitrogênio. Aminas são um grupo de compostos derivados de amônia por substituição de grupos de hidrocarboneto pelos átomos de hidrogênio. "Amina quaternária" refere-se a um composto com base em amônio com quatro grupos de hidrocarboneto.
[00033] "Anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulina que pode ligar-se a um antígeno específico como o resultado de uma resposta imune a este antígeno. As imunoglobulinas são proteínas de soro compostas de cadeias de polipeptídeo "leves" e "pesadas" possuindo regiões "constantes" e "variáveis" e são divididas em classes (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) com base na composição das regiões constantes.
[00034] "Antígeno" ou "imunógeno" refere-se a qualquer substância que estimule uma resposta imune. O termo inclui bactérias, vírus, ou parasitas mortos, inativados, atenuados, ou vivos modificados. O termo antígeno também inclui polinucleotídeos, polipeptídeos, proteínas recombinantes, peptídeos sintéticos, extrato de proteína, células (inclusão de células de tumor), tecidos, polissacarídeos, ou lipídeos, ou fragmentos dos mesmos, individualmente ou em qualquer combinação dos mesmos. O termo antígeno também inclui anticorpos, tais como anticorpos anti-idiótipo ou fragmentos dos mesmos, e a mimótopos de peptídeo sintético que podem imitar um antígeno ou determinante (epítopo) antigênico.
[00035] "Bacterina" quer dizer uma suspensão de uma ou mais bactérias mortas que podem ser usadas como um componente de uma vacina ou composição imunogênica.
[00036] "Tampão" quer dizer um sistema químico que previne mudança na concentração de outra substância química, por exemplo, doador de próton e sistemas aceptores servem como tampões prevenindo mudanças marcadas na concentração de íon de hidrogênio (pH). Um exemplo adicional de um tampão é uma solução contendo uma mistura de um ácido fraco e seu sal (base conjugada) ou uma base fraca e seu sal (ácido conjugado).
[00037] "Resposta imune celular" ou "resposta imune mediada por célula" é aquela mediada por linfócitos T ou outros leucócitos ou ambos, e inclui a produção de citocinas, quimiocina e moléculas similares produzidas por células T ativadas, leucócitos ou ambos.
[00038] "Colesterol" refere-se a uma substância cristalina branca com uma fórmula química de C27H45OH. Ele é um álcool de hidrocarboneto cíclico, que é classificado como um lipídeo. Ele é insolúvel em água, mas solúvel em vários solventes orgânicos.
[00039] "Hipersensibilidade do tipo retardada (DTH)" refere-se a uma resposta inflamatória que se desenvolve- 24 a 72 horas depois da exposição a um antígeno que o sistema imune reconhece como estranho. Este tipo de resposta imune envolve principalmente células T em vez de anticorpos (que são produzidos por células B).
[00040] "Dose" refere-se a uma vacina ou composição imunogênica dada a um paciente. Uma "primeira dose" ou "vacina de preparação" refere-se à dose de tal composição dada no Dia 0. Uma "segunda dose" ou uma "terceira dose" ou uma "dose anual" refere-se a uma quantidade de tal composição dada subsequente à primeira dose, que pode ser ou pode não ser a mesma vacina ou composição imunogênica como a primeira dose.
[00041] "Emulsificante" quer dizer uma substância usada para produzir uma emulsão mais estável.
[00042] "Emulsão" quer dizer uma composição de dois líquidos imiscíveis nos quais pequenas gotas de um líquido são suspensas em uma fase contínua do outro líquido.
[00043] "Ésteres" referem-se a qualquer de uma classe de compostos orgânicos correspondentes aos sais inorgânicos, que são formados de uma reação de condensação na qual uma molécula de um ácido orgânico une-se com uma molécula de álcool com eliminação de uma molécula de água.
[00044] "Excipiente" refere-se a qualquer componente de uma vacina que não seja um antígeno.
[00045] "Homogenização" refere-se a um processo de mistura de um ou mais componentes, ou similares ou dissimilares, em uma mistura uniforme.
[00046] "Resposta imune humoral" refere-se àquela que é mediada por anticorpos.
[00047] "Hidrofóbicos" quer dizer insolúveis em água, não facilmente absorvendo umidade, ou sendo adversamente afetados por água; ou incompatíveis com água ou possuindo pouca afinidade por ela.
[00048] "Resposta imune" em um paciente refere-se ao desenvolvimento de uma resposta imune humoral, uma resposta imune celular, ou uma resposta imune humoral e celular a um antígeno. As respostas imunes podem geralmente ser determinadas usando imunoensaios padrões e ensaios de neutralização, que são conhecidos na técnica.
[00049] "Quantidade imunologicamente protetora" ou "quantidade imunologicamente eficaz" ou "quantidade eficaz para produzir uma resposta imune" de um antígeno é uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imunogênica no recipiente. A resposta imunogênica pode ser suficiente para propósitos de diagnóstico ou outro teste, ou pode ser adequada para prevenir sinais ou sintomas de doença, inclusão de efeitos de saúde adversos ou complicações dos mesmos, causados por infecção com um agente de doença. Ou imunidade humoral ou imunidade mediada por célula ou ambas podem ser induzidas. A resposta imunogênica de um animal a uma composição imunogênica pode ser avaliada, por exemplo, indiretamente através de medição de títulos de anticorpo, ensaios de proliferação de linfócito, ou diretamente através de monitoramento de sinais e sintomas depois do desafio com cepa do tipo silvestre, enquanto que a imunidade protetora conferida por uma vacina pode ser avaliada através de medição de, por exemplo, redução nos sinais clínicos tais como mortalidade, morbidade, número de temperatura, condição física total, e saúde total e desempenho do paciente. A resposta imune pode compreender, sem limitação, indução de imunidade celular e/ou humoral.
[00050] "Imunogênica" quer dizer evocando uma resposta imune ou antigênica. Desta forma uma composição imunogênica seria qualquer composição que induz uma resposta imune.
[00051] "Imunoestimulação de complexo" ou ISCOM refere-se a uma estrutura específica que é formada quando Quil A é combinado com colesterol e fosfolipídeos.
[00052] "Molécula imunoestimuladora" refere-se a uma molécula que gera uma resposta imune.
[00053] "Lipídeos" refere-se a qualquer de um grupo de compostos orgânicos, incluindo as gorduras, óleos, ceras, esteróis, e triglicerídeos, que são insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos não polares, são oleosos ao toque, e juntos com carboidratos e proteínas constituem o material estrutural principal de células vivas.
[00054] "Lipofílico" quer dizer mostrando uma atração marcada a, ou solubilidade em lipídeos.
[00055] "Lipossoma" refere-se a uma partícula esférica microscópica formada por uma bicamada de lipídeo encerrando um compartimento aquoso, usado medicinalmente para transportar um fármaco, antígeno, vacina, enzima, ou outra substância às células alvejadas no corpo.
[00056] "Agente medicinal" refere-se a qualquer agente que é útil na prevenção, cura, ou melhora da doença, ou a prevenção de alguma condição ou ocorrência fisiológica.
[00057] "Administração parenteral" refere-se à introdução de uma substância, tal como uma vacina, em um corpo de paciente através de ou por meio de uma rotina que não inclui o trato digestivo. A administração parenteral inclui administração subcutânea, intramuscular, transcutânea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular e intravenosa.
[00058] "Farmaceuticamente aceitável" refere-se às substâncias, que estão dentro do escopo do diagnóstico médico seguro, adequadas para uso em contato com os tecidos de pacientes sem toxicidade, irritação, resposta alérgica indevida, e similares, comensuráveis com uma relação benefício para risco razoável, e eficazes para seu uso pretendido.
[00059] "Reatogenicidade" refere-se aos efeitos colaterais produzidos em um paciente em resposta à administração de uma composição adjuvante, uma imunogênica, ou uma de vacina. Pode ocorrer no sítio de administração, e é geralmente avaliada em termos do desenvolvimento de vários sintomas. Estes sintomas podem incluir inflamação, vermelhidão e abscesso. Ela é também avaliada em termos de ocorrência, duração e severidade. Uma reação "fraca", por exemplo, envolveria tumefação que é apenas detectável por palpitação e não pelos olhos, ou seria de curta duração. Uma reação mais severa seria, por exemplo, aquela que é visível ao olho ou é de duração mais longa.
[00060] "Temperatura Ambiente" quer dizer uma temperatura de 18 a 25°C.
[00061] "Saponina" refere-se a um grupo de glicosídeos tensoativos de origem vegetal compostos de uma região hidrofílica (geralmente várias cadeias de açúcar) em associação com uma região hidrofóbica de estrutura ou esteroide ou triterpenoide.
[00062] "Esteroides" refere-se a qualquer de um grupo de compostos orgânicos pertencente à classe bioquímica de lipídeos, que são facilmente solúveis em solventes orgânicos e ligeiramente solúveis em água. Os esteroides compreendem um sistema de 4 anéis fundidos de três anéis de ciclo-hexano (seis carbonos) fundidos mais um quarto anel de ciclopentano (cinco carbonos).
[00063] "Esteróis" refere-se aos compostos em animais que são biologicamente produzidos de precursores de terpenoide. Eles compreendem uma estrutura de anel de esteroide, possuindo um grupo hidroxila (OH), geralmente ligado ao carbono-3. A cadeia de hidrocarboneto do substituinte de ácido graxo varia em comprimento, geralmente de 16 a 20 átomos de carbono, e pode ser saturado ou insaturado. Esteróis comumente contêm uma ou mais ligações duplas na estrutura de anel e também uma variedade de substituintes ligados aos anéis. Esteróis e seus ésteres de ácido graxo são essencialmente insolúveis em água.
[00064] "Paciente" refere-se a qualquer animal para o qual a administração de uma composição adjuvante é desejada. Ele inclui mamíferos e não mamíferos, incluindo primatas, criação de gado, animais de estimação, animais de teste de laboratório, animais silvestres cativos, aves (incluindo em ovos), répteis, e peixe. Desta forma, este termo inclui, mas não é limitado a macacos, humanos, suíno; gado, carneiro, cabras, equinos, camundongos, ratos, cobaias, hamsters, coelhos, felinos, caninos, frangos, perus, patos, outras aves domésticas, rãs e lagartos.
[00065] "TCID50" refere-se a "dose infecciosa de cultura de tecido" e é definida como aquela diluição de um vírus requerida para infectar 50% de uma dada batelada de culturas celulares inoculadas. Vários processos podem ser usados para calcular TCID50, incluindo o processo de Spearman-Karber que é utilizado ao longo desta especificação. Para uma descrição do processo de Spearman-Karber, veja B.W. Mahy & H.O. Kangro, Virology Methods Manual, p. 25-46 (1996).
[00066] "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um antígeno ou vacina que induziria uma resposta imune em um paciente recebendo o antígeno ou vacina que é adequado para prevenir ou reduzir sinais ou sintomas de doença, incluindo efeitos de saúde adversos ou complicações dos mesmos, causados por infecção com um patógeno, tal como um vírus ou uma bactéria. Imunidade humoral ou imunidade mediada por célula ou ambas as imunidade humoral e mediada por célula podem ser induzidas. A resposta imunogênica de um animal a uma vacina pode ser avaliada, por exemplo, indiretamente através de medição de títulos de anticorpo, ensaios de proliferação de linfócito, ou diretamente através de monitoramento de sinais e sintomas depois do desafio com cepa do tipo silvestre. A imunidade protetora conferida por uma vacina pode ser avaliada através de medição de, por exemplo, redução nos sinais clínicos tais como mortalidade, morbidade, número de temperatura, condição física total, e saúde total e desempenho do paciente. A quantidade de uma vacina que é terapeuticamente eficaz pode variar dependendo do adjuvante particular usado, o antígeno particular usado, ou a condição do paciente, e pode ser determinada por aquele versado na técnica.
[00067] "Tratar" refere-se a prevenir um distúrbio, condição, ou doença ao qual tal termo aplica-se, ou a prevenir ou reduzir um ou mais sintomas de tal distúrbio, condição ou doença.
[00068] "Tratamento" refere-se ao ato de "tratar" tal como definido acima.
[00069] "Triterpenoides" refere-se a uma grande e diversa classe de moléculas orgânicas de ocorrência natural, derivadas de seis unidades de isopreno (2-metil-1,3-butadieno) de cinco carbonos, que podem ser agrupadas e modificadas em milhares de maneiras. A maior parte são estruturas multicíclicas que diferem uma da outra em grupos funcionais e em seus esqueletos de carbono básico. Estas moléculas podem ser encontradas em todas as classes de coisas vivas.
[00070] "Vacina" refere-se a uma composição que inclui um antígeno, tal como definido aqui. A administração da vacina a um paciente resulta em uma resposta imune, geralmente contra uma ou mais doenças específicas. A quantidade de uma vacina que é terapeuticamente eficaz pode variar dependendo do antígeno particular usado, ou da condição do paciente, e pode ser determinada por aquele versado na técnica.
Componentes das Composições Triterpenoides e CpGs
[00071] Os triterpenoides adequados para uso nas composições adjuvantes podem vir de muitas fontes, ou derivados de planta ou equivalentes sintéticos, incluindo, mas não limitado a Quillaja saponaria, tomatina, extratos de ginseng, cogumelos, e um glicosídeo alcaloide estruturalmente similar às saponinas esteroidais. Desta forma, os triterpenoides adequados para uso nas composições adjuvantes incluem saponinas, esqualeno e lanosterol. A quantidade de triterpenoides adequados para uso nas composições adjuvantes depende da natureza do triterpenoide usado. No entanto, eles são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 1 μg a cerca de 5.000 μg por dose. Eles também são usados em uma quantidade de cerca de 1 μg a cerca de 4.000 μg por dose, cerca de 1 μg a cerca de 3.000 μg por dose, cerca de 1 μg a cerca de 2.000 μg por dose, e cerca de 1 μg a cerca de 1.000 μg por dose. Eles são também usados em uma quantidade de cerca de 5 μg a cerca de 750 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 500 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 200 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 100 μg por dose, cerca de 15 μg a cerca de 100 μg por dose, e em uma quantidade de cerca de 30 μg a cerca de 75 μg por dose.
[00072] Se uma saponina é usada, as composições adjuvantes geralmente contêm uma fração de saponina imunologicamente ativa da casca de Quillaja saponaria. A saponina pode ser, por exemplo, Quil A ou outra preparação de saponina purificada ou parcialmente purificada, que pode ser obtida comercialmente. Desta forma, extratos de saponina podem ser usados como misturas ou componentes individuais purificados tais como QS-7, QS-17, QS-18, e QS-21. Em uma modalidade, a Quil A é pelo menos 85% puro. Em outras modalidades, a Quil A é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% puro.
[00073] CpG ODNs são uma classe recentemente descrita de agentes farmacoterapêuticos que são caracterizados pela presença de um dinucleotídeo CG não metilado em contextos de base-sequência específica (motif CpG). (Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy e COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, que é incorporado aqui através de referência). Estes motivos CpG não são vistos em DNA eucariótico, no qual dinucleotídeos CG são suprimidos e, quando presentes, geralmente metilados, mas estão presentes em DNA bacteriano ao qual eles conferem propriedades imunoestimuladoras. Estas propriedades imunoestimuladoras incluem indução de uma resposta do tipo Th1 com liberação proeminente de IFN-Á, IL-12, e IL-18. CpG ODNs (18 a 24 pb de comprimento) possuem propriedades imunomodulatórias similares ao DNA bacteriano. As proteínas da superfície celular podem absorver estas moléculas com resultados variáveis. No entanto, com um veículo tal como QCDC, QCDCR e outras combinações citadas dentro desta patente, as propriedades de imunomodulação e absorção do CpG são significantemente intensificadas.
[00074] A quantidade de CpG para uso nas composições adjuvantes depende da natureza do CpG usado e das espécies pretendidas. No entanto, eles são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 1 μg a cerca de 20 mg por dose. Eles também são usados em uma quantidade de cerca de 1 μg a cerca de 10 mg por dose, cerca de 1 μg a cerca de 5 mg por dose, cerca de 1 μg a cerca de 4 mg por dose, cerca de 1 μg a cerca de 3 mg por dose, cerca de 1 μg a cerca de 2 mg por dose, e cerca de 1 μg a cerca de 1 mg por dose. Eles são também usados em uma quantidade de cerca de 5 μg a cerca de 750 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 500 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 200 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 100 μg por dose, 10 μg a cerca de 100 μg por dose, cerca de 15 μg a cerca de 100 μg por dose, e em uma quantidade de cerca de 30 μg a cerca de 75 μg por dose. Esteróis
[00075] Esteróis adequados para uso nas composições adjuvantes incluem β-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol e colesterol. Estes esteróis são bem conhecidos na técnica e podem ser adquiridos comercialmente. Por exemplo, colesterol é descrito no Índice de Merck, 12th Ed., p. 369. A quantidade de esteróis adequados para uso nas composições adjuvantes depende da natureza do esterol usado. No entanto, eles são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 1 μg a cerca de 5.000 μg por dose. Eles também são usados em uma quantidade de cerca de 1 μg a cerca de 4.000 μg por dose, cerca de 1 μg a cerca de 3.000 μg por dose, cerca de 1 μg a cerca de 2.000 μg por dose, e cerca de 1 μg a cerca de 1.000 μg por dose. Eles são também usados em uma quantidade de cerca de 5 μg a cerca de 750 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 500 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 200 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 100 μg por dose, cerca de 15 μg a cerca de 100 μg por dose, e cerca de 30 μg a cerca de 75 μg por dose. Imunomoduladores
[00076] As composições adjuvantes podem além disso incluir um ou mais agentes imunomodulatórios tais como, por exemplo, compostos de amônio quaternário (por exemplo, DDA), e interleucinas, interferons, ou outras citocinas. Estes materiais podem ser adquiridos comercialmente. A quantidade de um imunomodulador adequado para uso nas composições adjuvantes depende da natureza do imunomodulador usado e do paciente. No entanto, eles são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 1 μg a cerca de 5.000 μg por dose. Eles também são usados em uma quantidade de cerca de 1 μg a cerca de 4.000 μg por dose, cerca de 1 μg a cerca de 3.000 μg por dose, cerca de 1 μg a cerca de 2.000 μg por dose, e cerca de 1 μg a cerca de 1.000 μg por dose. Eles são também usados em uma quantidade de cerca de 5 μg a cerca de 750 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 500 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 200 μg por dose, cerca de 5 μg a cerca de 100 μg por dose, cerca de 15 μg a cerca de 100 μg por dose, e em uma quantidade de cerca de 30 μg a cerca de 75 μg por dose. Para um exemplo específico, as composições adjuvantes contendo DDA podem ser preparadas por mistura simplesmente de uma solução de antígeno com uma solução frescamente preparada de DDA. Polímeros
[00077] As composições adjuvantes podem, além disso, incluir um ou mais polímeros tais como, por exemplo, DEAE Dextrana, polietileno glicol, e ácido poliacrílico e ácido polimetacrílico (por exemplo, CARBOPOL®). Tal material pode ser adquirido comercialmente. A quantidade de polímeros adequados para uso nas composições adjuvantes depende da natureza dos polímeros usados. No entanto, eles são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 0,0001% volume para volume (v/v) a cerca de 75% v/v. Em outras modalidades, eles são usados em uma quantidade de cerca de 0,001% v/v a cerca de 50% v/v, de cerca de 0,005% v/v a cerca de 25% v/v, de cerca de 0,01% v/v a cerca de 10% v/v, de cerca de 0,05% v/v a cerca de 2% v/v, e de cerca de 0,1% v/v a cerca de 0,75% v/v. Em outra modalidade, eles são usados em uma quantidade de cerca de 0,02 v/v a cerca de 0,4% v/v. DEAE-dextrana pode possuir um tamanho molecular na faixa de 50.000 Da a 5.000.000 Da, ou ela pode estar na faixa de 500.000 Da a 2.000.000 Da. Tal material pode ser adquirido comercialmente ou preparado de dextrana.
[00078] Outro exemplo específico é ácido poliacrílico (por exemplo, os polímeros de CARBOPOL®), que possui um peso equivalente médio de 76. Eles são produzidos de partículas de polímero primário de cerca de 0,2 a 6,0 mícrons de diâmetro médio. Os polímeros de CARBOPOL®® dilatam-se em água até 1000 vezes seu volume original e dez vezes seu diâmetro original para formar um gel quando exposto a um ambiente de pH maior do que o pKa de grupo carboxilato. Em um pH maior do que o pKa de grupo carboxilato, os grupos carboxilato ionizam-se resultando em repulsão entre as cargas negativas, que adiciona-se à tumefação do polímero. Estimulantes de Th2
[00079] As composições adjuvantes podem, além disso, incluir um ou mais estimulantes de Th2 tais como, por exemplo, Bay R1005® e alumínio. A quantidade de estimulantes de Th2 adequados para uso nas composições adjuvantes depende da natureza do estimulante de Th2 usado. No entanto, eles são geralmente usados em uma quantidade de cerca de 0,01 mg a cerca de 10 mg por dose. Em outras modalidades, eles são usados em uma quantidade de cerca de 0,05 mg a cerca de 7,5 mg por dose, de cerca de 0,1 mg a cerca de 5 mg por dose, de cerca de 0,5 mg a cerca de 2.5 mg por dose, e de 1 mg a cerca de 2 mg por dose. Um exemplo específico é Bay R1005®, um glicolipídeo com o nome químico "acetato de N-(2-des0xi-2-L-leucilamino-β-D- glicopiranosil)-N-octadecildodecanamida." Ele pode ser sintetizado de acordo com o procedimento encontrado em Lockhoff, 0. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:1611-1620; 1991). É recomendado que ele seja armazenado em 2 a 8°C em um recipiente hermético. Suas propriedades químicas ou físicas são que ele é ligeiramente higroscópico, não forma polimorfos, é quimicamente estável no ar e leve em temperaturas até 50°C e em solventes aquosos em pH 2 a 12 em temperatura ambiente. Ele é uma molécula anfifílica que forma micelas em solução aquosa. Antígenos e Doenças
[00080] As composições adjuvantes podem conter um ou mais antígenos. O antígeno pode ser qualquer de uma ampla variedade de substâncias capazes de produzir uma resposta imune desejada em um paciente. Ainda que Quil A sozinha seja virucida, Quil A é desintoxicada com a adição de colesterol quando formando micelas helicoidais (veja Patente dos Estados Unidos Número 7.122.191). As composições adjuvantes descritas aqui foram constatadas serem não virucidas, e não hemolíticas ou membranolíticas. Desta forma, os antígenos usados com estas composições adjuvantes podem ser um ou mais de vírus (inativados, atenuados, e vivos modificados), bactérias, parasitas, nucleotídeos, polinucleotídeos, peptídeos, polipeptídeos, proteínas recombinantes, peptídeos sintéticos, extrato de proteína, células (inclusão de células de tumor), tecidos, polissacarídeos, carboidratos, ácidos graxos, ácido teicóico, peptidoglicanos, lipídeos, ou glicolipídeos, individualmente ou em qualquer combinação dos mesmos.
[00081] Os antígenos usados com os adjuvantes da invenção também incluem fragmentos imunogênicos de nucleotídeos, polinucleotídeos, peptídeos, polipeptídeos, que podem ser isolados dos organismos referidos aqui.
[00082] As cepas virais vivas, vivas modificadas, e atenuadas que não causam doença em um paciente foram isoladas em forma não virulenta ou foram atenuadas usando processos bem conhecidos na técnica, incluindo inoculação em série em uma linhagem de células adequada ou exposição à luz ultravioleta ou um mutagênico químico. As cepas virais inativadas ou mortas são aquelas que foram inativadas através de processos conhecidos àquele versado na técnica, incluindo tratamento com formalina, betapropriolactona (BPL), etilenoimina binária (BEI), esterilização, radiação, aquecimento, ou outros tais processos.
[00083] Dois ou mais antígenos podem ser combinados para produzir uma composição polivalente que pode proteger um paciente contra uma ampla variedade de doenças causadas pelos patógenos. Atualmente, os fabricantes comerciais de vacinas, assim como usuários finais, preferem produtos de vacina polivalente. Embora adjuvantes convencionais sejam frequentemente limitados na variedade de antígenos com os quais eles podem ser eficazmente usados (ou monovalentemente ou polivalentemente), os adjuvantes descritos aqui podem ser usados eficazmente com uma ampla faixa de antígenos, ambos monovalentemente e polivalentemente. Desta forma, os antígenos descritos aqui podem ser combinados em uma composição única compreendendo os adjuvantes descritos aqui.
[00084] Alguns exemplos de bactérias que podem ser usados como antígenos com as composições adjuvantes incluem, mas não são limitados a, espécies Aceinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearoutrosmophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Bordetella bronchiseptica, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila spp., Chromobactéria viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Ehrlichia canis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Helicobacter suis, Lawsonia intracelularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycobactrium bovis, Mycoplasma hyopneumonia, Micoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Odoribacter denticanis, Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Pasteurella multocida, Photorhabdus luminescens, Porphyromonas gulae, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas salivosa, Propionibactéria acnes, Proteus vulgaris, Pseudomnas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhimurium, Salmonella bongori, Salmonella entéricoa, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraseuis, Salmonella newport, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphlyoccocus aureus, Staphyloccoccus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptococcus suis, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium, e Leptospira, tais como os patógenos conhecidos Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno,Leptospira interrogans, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, e Leptospira bratislava, e combinações dos mesmos.
[00085] Ambos os vírus inativados e vírus vivos atenuados podem ser usados nas composições adjuvantes. Alguns exemplos de vírus que podem ser usados como antígenos incluem, mas não são limitados a, Herpesvírus aviário, Herpesviroses bovinas, Herpesviroses caninas, Herpesviroses equinas, vírus de rinotraqueíte viral felino, vírus da doença de Marek, herpesviroses ovinas, Herpesviroses porcinas, Vírus da pseudoraiva, Paramixoviroses aviárias, vírus sincicial respiratório bovino, Vírus da cinomose canina, Vírus da parainfluenza canina, adenovírus canino, parvovírus canino, Vírus 3 da Parainfluenza Bovina, Parainfluenza 3 ovina, Vírus de Rinderpest, Vírus da doença de border, Vírus de diarreia viral bovina (BVDV), BVDV Tipo I, BVDV Tipo II, Vírus da febre suína clássica, Vírus da Leucose aviária, Vírus da imunodeficiência bovina, Vírus da leucemia bovina, Tuberculose bovina, Vírus da anemia infecciosa equina, Vírus da imunodeficiência felina, Vírus de leucemia felina (FeLV), Vírus da Doença de Newcastle, Vírus da pneumonia progressiva ovina, Vírus do adenocarcinoma pulmonar ovino, Coronavírus canino (CCV), CCV pantrópico, Coronavírus respiratório canino, Coronavírus bovino, Calicivírus Felino, Coronavírus entérico felino, Vírus de peritonite infecciosa felina, Vírus da diarréia epidêmica porcina, Vírus da encefalomielite hemaglutinante porcina, Parvovírus porcino, Circovírus Porcino (PCV) Tipo I, PCV Tipo II, (PRRS) Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Porcina, Vírus de gastroenterite transmissível, Coronavírus de peru, Vírus da febre efêmera bovina, Raiva, Rotovírus, Vírus da estomatite vesicular, lentivírus, Influenza aviário, Rinoviroses, Vírus de influenza equino, Vírus de influenza suíno, Vírus de influenza canina, Vírus de influenza felina, Vírus de influenza humana, Vírus da encefalite equina do oriente (EEE), Vírus da encefalite equina venezuelana, vírus do Nilo Ocidental, vírus da encefalite equina ocidental, vírus da imunodeficiência humana, papilomavírus humano, vírus do herpes zoster, vírus da hepatite B, rinovírus, e vírus do sarampo, e combinações dos mesmos.
[00086] Exemplos de antígenos de peptídeo incluem Bordetella bronchiseptica p68, GnRH, IgE peptídeos, Fel d1, e antígenos de câncer, e combinações dos mesmos. Exemplos de outros antígenos incluem nucleotídeos, carboidratos, lipídeos, glicolipídeos, peptídeos, ácidos graxos, e ácido teicóico, e peptideoglicanos, e combinações dos mesmos.
[00087] Alguns exemplos de parasitas que podem ser usados como antígenos com as composições adjuvantes incluem, mas não são limitados a, espécies Anaplasma, Fasciola hepatica (trematódeo do fígado), Coccidia, Eimeria spp., Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Giardia, Dirofilaria (vermes do coração), Ancylostoma (vermes ganchos), Trypanosoma spp., Leishmania spp., Trichomonas spp., Cryptosporidium parvum, Babesia, Schistosoma, Taenia, Strongloides, Ascaris, Trichinella, Sarcocystis, Hammondia, e Isopsora, e combinações dos mesmos. Também contemplados são parasitas externos incluindo, mas não limitado a carrapatos, incluindo Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma, e Haemaphysalis, e combinações dos mesmos.
[00088] A quantidade de antígeno usada para induzir uma resposta imune variará consideravelmente dependendo do antígeno usado, do paciente, e do nível de resposta desejada, e pode ser determinado por aquele versado na técnica. Para vacinas contendo vírus vivo modificado ou vírus atenuado, uma quantidade terapeuticamente eficaz do antígeno geralmente varia de cerca de 102 Dose Infecciosa de Cultura de Tecido (TCID)50 a cerca de 1010 TCID50, inclusive. Para muitos tais vírus, uma dose terapeuticamente eficaz está geralmente na faixa de cerca de 102 TCID50 a cerca de 108 TCID50, inclusive. Em algumas modalidades, as faixas de doses terapeuticamente eficazes são cerca de 103 TCID50 a cerca de 106 TCID50, inclusive. Em algumas outras modalidades, as faixas de doses terapeuticamente eficazes são cerca de 104 TCID50 a cerca de 105 TCID50, inclusive.
[00089] Para vacinas contendo vírus inativados, uma quantidade terapeuticamente eficaz do antígeno é geralmente pelo menos cerca de 100 unidades relativas por dose, e frequentemente na faixa de cerca de 1.000 a cerca de 4.500 unidades relativas por dose, inclusive. Em outras modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz do antígeno está em uma faixa de cerca de 250 a cerca de 4.000 unidades relativas por dose, inclusive, de cerca de 500 a cerca de 3.000 unidades relativas por dose, inclusive, de cerca de 750 a cerca de 2.000 unidades relativas por dose, inclusive, ou de cerca de 1.000 a cerca de 1,500 unidades relativas por dose, inclusive.
[00090] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de antígeno em vacinas contendo vírus inativados pode também ser medida em termos de Potência Relativa (RP) por mL. Uma quantidade terapeuticamente eficaz está frequentemente na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 50 RP por mL, inclusive. Em outras modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz do antígeno está em uma faixa de cerca de 0,5 a cerca de 30 RP por mL, inclusive, de cerca de 1 a cerca de 25 RP por mL, inclusive, de cerca de 2 a cerca de 20 RP por mL, inclusive, de cerca de 3 a cerca de 15 RP por mL, inclusive, ou de cerca de 5 a cerca de 10 RP por mL, inclusive.
[00091] Em uma modalidade, um antígeno de FeLV foi produzido da linhagem de células FL74-UCD-1 (Número de ATCC CRL-8012) que é persistentemente infectada com a cepa de vírus de leucemia felina KT- FeLV-UCD-1. A quantidade de antígeno de FeLV em uma vacina pode ser medida como a quantidade de proteína viral gp70 por mL. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de antígeno de FeLV, quando medida pela quantidade de proteína viral gp70 por mL, geralmente está na faixa de cerca de 100 a cerca de 350.000 ng/mL, inclusive. Em outra modalidade, a faixa é de cerca de 1.000 a cerca de 300,000 ng/mL, inclusive, ou de cerca de 2.500 a cerca de 250.000 ng/mL, inclusive, ou de cerca de 4.000 a cerca de 220.000 ng/mL, inclusive, ou de cerca de 5.000 a cerca de 150.000 ng/mL, inclusive, ou de cerca de 10.000 ng/mL a cerca de 100.000 ng/mL, inclusive.
[00092] O número de células para um antígeno bacteriano administrado em uma vacina varia de cerca de 1x106 a cerca de 5x1010 colônias formando unidades (CFU) por dose, inclusive. Em outras modalidades, o número de células varia de cerca de 1x107 a 5x1010 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x108 a 5x1010 CFU/dose, inclusive. Em ainda outras modalidades, o número de células varia de cerca de 1x102 a 5x1010 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x104 a 5x109 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x105 a 5x109 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x106 a 5x109 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x106 a 5x108 CFU/dose, inclusive, ou de cerca de 1x107 a 5x109 CFU/dose, inclusive.
[00093] O número de células para um antígeno de parasita administrado em uma vacina varia de cerca de 1x102 a cerca de 1x1010 por dose, inclusive. Em outras modalidades, o número de células varia de cerca de 1x103 a cerca de 1x109 por dose, inclusive, ou de cerca de 1x104 a cerca de 1x108 por dose, inclusive, ou de cerca de 1x105 a cerca de 1x107 por dose, inclusive, ou de cerca de 1x106 a cerca de 1x108 por dose, inclusive.
[00094] É bem conhecido na técnica que com adjuvantes convencionais, uma quantidade substancialmente maior de vírus inativados do que vírus vivos modificados ou atenuados é necessário para estimular um nível comparável de resposta sorológica. No entanto, foi surpreendentemente constatado que com as composições adjuvantes descritas aqui, aproximadamente as mesmas quantidades de vírus inativado e vírus vivo modificado estimulam níveis similares de resposta sorológica. Além disso, quantidades menores de vírus vivo modificado, atenuado, e inativado são necessárias com os adjuvantes descritos aqui quando comparado com adjuvantes convencionais para obter o mesmo nível de resposta sorológica. Estas descobertas inesperadas demonstram conservação de recursos e redução de custo durante a preparação de composições imunogênicas e de vacina. Para vacinas com ampla utilidade, a produção de milhões de doses por ano é requerida, então estas economias podem ser substanciais. Excipientes
[00095] Os adjuvantes aquosos fornecem certas vantagens. Eles são geralmente fáceis de formular e administrar, e podem induzir poucas ou menos reações do sítio de injeção sérias. No entanto, os adjuvantes aquosos com um antígeno tendem a dispersar-se do sítio de injeção, são depurados pelo fígado do paciente, e geram uma resposta imune não específica indesejável. Foi surpreendentemente constatado que as composições adjuvantes aquosas descritas aqui permanecem no sítio de injeção até que sejam biometabolizadas, o que ocorre durante um longo período de tempo, e fornecem uma resposta imune alvejada.
[00096] Óleo, quando adicionado como um componente de um adjuvante, geralmente fornece um perfil de liberação longa e lenta. Na presente invenção, o óleo pode ser metabolizável ou não metabolizável. O óleo pode ser na forma de uma emulsão de óleo em água, uma de água em óleo, ou uma de água em óleo em água.
[00097] Óleos adequados para uso na presente invenção incluem alcanos, alquenos, alquinos, e seus correspondentes ácidos e álcoois, os éteres e ésteres dos mesmos, e misturas dos mesmos. Os compostos individuais do óleo são compostos de hidrocarboneto leves, isto é, tais componentes possuem 6 a 30 átomos de carbono. O óleo pode ser sinteticamente preparado ou purificado de produtos de petróleo. A porção pode possuir uma estrutura de cadeia linear ou ramificada. Ela pode ser totalmente saturada ou possuir um ou mais ligações duplas ou triplas. Alguns óleos não metabolizáveis para uso na presente invenção incluem óleo mineral, óleo de parafina, e cicloparafinas, por exemplo.
[00098] O termo óleo também pretende incluir "óleo mineral leve," isto é, óleo que é similarmente obtido por destilação de petrolato, mas que possui uma gravidade específica ligeiramente menor do que óleo mineral branco.
[00099] Óleos metabolizáveis incluem óleos não tóxicos metabolizáveis. O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sinteticamente preparado que pode ser metabolizado pelo corpo do paciente ao qual o adjuvante será administrado e que é não tóxico ao paciente. As fontes para óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos.
[000100] Uma emulsão de óleo em água fornecida pela presente invenção é composta de uma formulação de AMPHIGEN®. Esta formulação compreende um componente aquoso, lecitina, óleo mineral, e tensoativos. As patentes descrevendo os componentes da formulação incluem US 5,084.269 e US 6.572.861.
[000101] Tipicamente, o componente de óleo da presente invenção está presente em uma quantidade de 1% a 50% em volume; ou em uma quantidade de 10% a 45%;ou em uma quantidade de 20% a 40%.
[000102] Outros componentes das composições podem incluir excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como veículos, solventes, e diluentes, agentes isotônicos, agentes de tamponamento, estabilizantes, conservantes, agentes vaso-constritivos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, e similares. Veículos, solventes, e diluentes típicos incluem água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol, óleo e similares. Os agentes isotônicos representativos incluem cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, lactose e similares. Estabilizantes úteis incluem gelatina, albumina e similares.
[000103] Tensoativos são usados para ajudar na estabilização da emulsão selecionada para agir como o veículo para o adjuvante e antígeno. Tensoativos adequados para uso nas presentes invenções incluem tensoativos biologicamente compatíveis naturais e tensoativos sintéticos não naturais. Tensoativos biologicamente compatíveis incluem compostos de fosfolipídeo ou uma mistura de fosfolipídeos. Fosfolipídeos preferidos são fosfatidilcolinas (lecitina), tais como lecitina de soja ou ovo. A lecitina pode ser obtida como uma mistura de fosfatídeos e triglicerídeos por lavagem com água de óleos vegetais brutos, e separação e secagem das gomas hidratadas resultantes. Um produto refinado pode ser obtido por fracionamento da mistura por fosfolipídeos e glicolipídeos insolúveis em acetona restantes depois de remoção dos triglicerídeos e óleo vegetal por lavagem com acetona. Alternativamente, a lecitina pode ser obtida de várias fontes comerciais. Outros fosfolipídeos adequados incluem fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina e fosfatidiletanolamina. Os fosfolipídeos podem ser isolados de fontes naturais ou convencionalmente sintetizadas.
[000104] Os tensoativos sintéticos não naturais adequados para uso na presente invenção incluem tensoativos não iônicos com base em sorbitano, por exemplo, tensoativos de sorbitano substituídos por ácido graxo (comercialmente disponível sob o nome SPAN® ou ARLACEL®), ésteres de ácido graxo de sorbitol polietoxilado (TWEEN®), ésteres de polietileno glicol de ácidos graxos de fontes tais como óleo de rícino (EMULFOR®); ácido graxo polietoxilado (por exemplo, ácido esteárico disponível sob o nome SIMULSOL M-53®), polímero de isooctilfenol/formaldeído polietoxilado (TYLOXAPOL®), éteres de álcool graxo de polioxietileno (BRIJ®); éteres de não fenila de polioxietileno (TRITON® N), éteres de isooctilfenila de polioxietileno (TRITON® X).
[000105] Geralmente falando, o tensoativo, ou a combinação de tensoativos, se dois ou mais tensoativos são usados, está presente na emulsão em uma quantidade de 0,01% a 10% em volume, de preferência, 0,1% a 6,0%, mais preferivelmente 0,2% a 5,0%.
[000106] Tal como usado aqui, "um veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes retardantes de adsorção, e similares. O(s) veículo(s) devem ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com os outros componentes das composições e não deletérios ao paciente. Tipicamente, os veículos serão estéreis e livres de pirogênio, e selecionados com base no modo de administração a ser usado. É bem conhecido por aquele versado na técnica que as formulações preferidas para o veículo farmaceuticamente aceitável que compreendem as composições são aqueles veículos farmacêuticos aprovados nos regulamentos aplicáveis promulgados pelo Departmento dos Estados Unidos (US) de Agricultura ou Administração de Alimentos e Fármaco dos Estados Unidos, ou agência do governo equivalente em um país não americano. Por esse motivo, o veículo farmaceuticamente aceito para produção comercial das composições é um veículo que já está aprovado ou será aprovado pela agência do governo apropriada nos Estados Unidos ou país estrangeiro.
[000107] As composições opcionalmente podem incluir diluentes líquidos, semissólidos, ou sólidos farmaceuticamente aceitáveis (isto é, estéreis ou não tóxicos) compatíveis que servem como veículos, excipientes, ou meios farmacêuticos. Diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e similares. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Estabilizantes incluem albumina, entre outros.
[000108] As composições podem também conter antibióticos ou conservantes, incluindo, por exemplo, gentamicina, mertiolato ou clorocresol. As várias classes de antibióticos ou conservantes das quais para selecionar são bem conhecidos ao técnico versado.
Preparação das Composições Preparação de Formulações Adjuvantes
[000109] Um ISCOM pode ser preparado por combinação de uma saponina, um esterol, e um fosfolipídeo. Por exemplo, um ISCOM pode conter 5% a 10% em peso de Quil A, 1% a 5% de colesterol e fosfolipídeos, e a proteína restante. A relação de saponina para esterol nas formulações adjuvantes tipicamente serão na ordem de 1:100 peso para peso (p/p) a 5:1 p/p. Em algumas modalidades, esterol em excesso está presente, em que a relação de saponina para esterol é pelo menos 1:2 p/p, ou 1:5 p/p. Em outras modalidades, a saponina está em excesso em relação para o esterol, e uma razão de saponina para esterol de cerca de 5,1 p/p é usada. ISCOM e ISCOMATRIZ são comercialmente disponíveis de Isconova AB (Suécia).
[000110] Em algumas modalidades, o CARBOPOL® é usado em combinação com DDA em uma quantidade de pelo menos 0,1 parte em peso de CARBOPOL® por parte em peso de DDA. Em outras modalidades, pelo menos 0,5 parte em peso de CARBOPOL® por parte em peso de DDA é usada. Em ainda outras modalidades, pelo menos 1 parte em peso de CARBOPOL® por parte em peso de DDA é usada. A combinação de CARBOPOL® e DDA forma um complexo por meio do que o grupo funcional de amina terciária DDA imunofuncionaliza os grupos laterais de ácido carboxílico no polímero. Isto permite às células imunes específicas alvejarem o antígeno e adjuvante simultaneamente e coliberar o antígeno e adjuvante junto no tempo e concentração ideal às referidas células.
[000111] Os adjuvantes descritos aqui geralmente não requererão qualquer veículo específico, e serão formulados em um tampão farmaceuticamente aceitável aquoso ou outro. Em alguns casos, as vacinas das modalidades descritas serão apresentadas em um veículo adequado, tal como, por exemplo, lipossomas adicionais, microesferas ou partículas de antígeno encapsuladas. O antígeno pode ser contido dentro da membrana de vesícula ou contido fora da membrana de vesícula. Geralmente, antígenos solúveis estão fora e antígenos hidrofóbicos ou lipidados estão ou contidos dentro ou fora da membrana.
[000112] As composições adjuvantes podem ser produzidas de várias formas dependendo da rotina de administração, requerimentos de armazenagem, e similares. Por exemplo, elas podem ser produzidas na forma de soluções ou dispersões aquosas estéreis adequadas para uso injetável, ou produzidas nas formas liofilizadas usando técnicas de secagem por congelamento, secagem a vácuo, ou secagem por spray. As composições liofilizadas podem ser reconstituídas antes do uso em uma solução estabilizante, por exemplo, solução salina ou HEPES. Desta forma, as composições adjuvantes podem ser usadas como uma forma de dosagem sólida, semissólida ou líquida.
[000113] Os adjuvantes podem ser produzidos usando técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, a saponina e colesterol podem ser misturados em um detergente adequado, seguido por uma técnica de extração de solvente para formar lipossomas ou ISCOMs. A saponina e colesterol podem também ser combinados para formar micelas helicoidais tal como descrito na Patente dos Estados Unidos Número 7.122.191.
[000114] A solução salina tamponada por fosfato (PBS) pode ser usada como o meio de tampão aquoso; o pH do tampão pode ser neutro ou ligeiramente alcalino ou ligeiramente acídico. Por conseguinte, o pH pode estar em uma faixa de pH 6 a 8. Um pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,3 é comum. A intensidade do tampão pode ser entre 10 a 50 mM de PO4 e entre 10 a 150 mM de PO4. Em um exemplo, PBS a 0,063% é usado. O pH pode ser ajustado usando NaOH ou HCl quando necessário. As concentrações típicas incluem de 1N a 10N de HCl e 1N a 10N de NaOH.
[000115] A quantidade de adjuvante usada depende do antígeno com o qual ele é usado e a dosagem de antígeno a ser aplicada. Ela é também dependente das espécies pretendidas e da formulação desejada. Geralmente, a quantidade está dentro da faixa convencionalmente usada para adjuvantes. Por exemplo, os adjuvantes tipicamente compreendem de cerca de 1 μg a cerca de 1000 μg, inclusive, de uma dose de 1 mL. Similarmente, os antibióticos tipicamente compreendem de cerca de 1 μg a cerca de 60 μg, inclusive, de uma dose de 1 mL.
[000116] As formulações adjuvantes podem ser homogenizadas ou microfluidificadas. As formulações são submetidas a um processo de mistura primária, tipicamente por inoculação uma ou mais vezes através de um ou mais homogenizadores. Qualquer homogenizador comercialmente disponível pode ser usado para este propósito, por exemplo, emulsificante Ross (Hauppauge, NY), homogenizador Gaulin (Everett, MA), ou Microfluidics (Novoton, MA). Em uma modalidade, as formulações são homogenizadas durante três minutos em 10.000 rpm. A microfludificação pode ser obtida pelo uso de um microfluidificador comercial, tal como número de modelo 11OY disponível por Microfluidics, (Newton, Mass.); Modelo Gaulin 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); e Tipo 8.30H de Rainnie Minilab (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Estes microfluidificadores operam forçando os fluidos através de pequenas aberturas sob pressão elevada, de modo que duas correntes de fluido interajam em altas velocidades em uma câmara de interação para formar composições com gotas de um tamanho de submícron. Em uma modalidade, as formulações são microfluidificadas pela passagem através de uma câmara de dimensão limitante de 200 mícrons em 68,95 +/- 3,45 MPa (10.000 +/- 500 psi).
[000117] As composições adjuvantes descritas aqui podem ser ambas homogenizadas e microfluidificadas. Em uma modalidade, um antígeno é adicionado a um tampão apropriado. A solução é agitada, e uma saponina é lentamente adicionada à solução de antígeno. Um esterol é em seguida lentamente adicionado à solução de antígeno/saponina, seguido pela adição lenta de um composto de amônio quaternário à solução de antígeno/saponina/esterol. A composição resultante é homogenizada, e em seguida microfluidificada. Depois da microfluidificação, um polímero é adicionado à composição microfluidificada. Dependendo dos componentes usados, a ordem destas etapas pode ser alterada para otimizar a preparação das composições. Preparação de Composições Imunogênicas e de Vacina
[000118] As composições adjuvantes descritas aqui podem ser usadas na produção de composições imunogênicas e de vacina. Para composições de vacina ou imunogênicas, cada dose contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antígeno ou antígenos que pode variar dependendo da idade e condição geral do paciente, da rotina de administração, da natureza do antígeno, e outros fatores. As quantidades e concentrações dos outros componentes nas composições de vacina ou imunogênicas podem ser ajustadas para modificar as propriedades físicas e químicas da composição, e podem facilmente ser determinadas pelo técnico versado. Um aspecto vantajoso das composições adjuvantes é que elas são totalmente configuráveis dependendo das características desejadas da composição. Por exemplo, se uma resposta de Th1 maior é desejada, a quantidade do estimulador de Th1 pode ser aumentada. Da mesma maneira, se uma resposta de Th2 maior é desejada, a quantidade do estimulador de Th2 pode ser aumentada. Uma resposta de Th1/Th2 equilibrada pode também ser obtida. As composições imunogênicas e de vacina podem também ser homogenizadas ou microfluidificadas tal como descrito acima. Administração e Uso das Composições Administração das Composições
[000119] Os tamanhos de dose das composições tipicamente variam de cerca de 1 mL a cerca de 5 mL, inclusive, dependendo do paciente e do antígeno. Por exemplo, para um canino ou felino, uma dose de cerca de 1 mL é tipicamente usada, embora em gado uma dose de cerca de 2 a 5 mL é tipicamente usada. No entanto, estes adjuvantes também podem ser formulados em microdoses, em que as doses de cerca de 100 μL podem ser usadas.
[000120] As rotinas de administração para as composições adjuvantes incluem parenterais, orais, oronasais, intranasais, intratraqueais, tópicas, e em ovos. Qualquer dispositivo adequado pode ser usado para administrar as composições, incluindo seringas, conta-gotas, dispositivos de injeção sem agulha, emplastros e similares. A rotina e dispositivo selecionados para uso dependerão da composição do adjuvante, do antígeno, e do paciente, e tais são bem conhecidos ao técnico versado. Uso das Composições
[000121] Um dos requerimentos para qualquer preparação adjuvante de vacina para uso comercial é estabelecer a estabilidade da solução adjuvante durante longos períodos de armazenagem. Fornecidas aqui são as formulações adjuvantes que são fáceis de produzir e estáveis durante pelo menos 18 meses. Em uma modalidade, as formulações são estáveis durante cerca de 18 meses. Em outra modalidade, as formulações são estáveis durante entre cerca de 18 a cerca de 24 meses. Em outra modalidade, as formulações são estáveis durante cerca de 24 meses. Os procedimentos de teste acelerados também indicam que as formulações descritas aqui são estáveis.
[000122] Um aspecto vantajoso das presentes composições adjuvantes é que elas podem ser seguramente e eficazmente administradas a uma ampla faixa de pacientes. Na técnica, é esperado que as combinações de adjuvantes demonstrem mais reatogenicidade do que os componentes individuais. No entanto, as composições descritas aqui mostram reatogenicidade diminuída quando comparado às composições nas quais qualquer um ou dois dos componentes são usados, embora o efeito adjuvante seja mantido. Foi também surpreendentemente constatado que as composições adjuvantes descritas aqui demonstram melhoras de segurança quando comparado com outras composições adjuvantes.
[000123] As composições adjuvantes descritas aqui são úteis para produção de uma resposta imune desejada em um paciente. Elas são eficazes em múltiplas espécies. Um paciente adequado é qualquer animal para o qual a administração de uma composição adjuvante é desejada. Ele inclui mamíferos e não mamíferos, incluindo primatas, criação de gado, animais de estimação, animais de teste de laboratório, animais silvestres cativos, aves (incluindo em ovos), répteis, e peixe. Desta forma, este termo inclui, mas não é limitado a macacos, humanos, suíno; gado, carneiro, cabras, equinos, camundongos, ratos, cobaias, hamsters, coelhos, felinos, caninos, frangos, perus, patos, outras aves domésticas, rãs e lagartos.
[000124] Os adjuvantes descritos aqui podem ser usados para mostrar diferenciação sorológica entre animais infectados e vacinados. Desta forma, eles podem ser usados em uma vacina marcadora na qual o antígeno na vacina produz nos animais vacinados um padrão de anticorpo diferente daquele do vírus do tipo silvestre. Uma vacina marcadora é geralmente usada junto com um teste de diagnóstico companheiro que mede a diferença nos padrões de anticorpo e demonstra que os animais foram vacinados e que os animais são infectados com o vírus do tipo silvestre. Tal tecnologia é útil no controle e erradicação de vírus de uma população de pacientes.
[000125] Os seguintes exemplos são apresentados como modalidades ilustrativas, mas não devem ser tomados como limitando o escopo da invenção. Muitas mudanças, variações, modificações, e outros usos e aplicações desta invenção serão aparentes àquele versado na técnica. EXEMPLOS Exemplo 1. Soluções de Quil A /Colesterol (QC)
[000126] A Quil A (Superfos) foi dissolvida em água e uma solução de matéria-prima de 50mg/mL foi preparada. O colesterol, (Fabri Chem Inc.) foi dissolvido em etanol e uma solução de matéria-prima de 18mg/mL foi preparada. A solução de matéria-prima de colesterol em seguida foi filtrada usando um filtro de 0,2 mícron.
[000127] A faixa de concentrações de Quil A e Colesterol nas várias formulações foi tão baixa quanto 1/1 ug/mL de Quil A para colesterol até tão alta quanto 1000/1000 ug/mL. Para preparar uma solução de matéria-prima de Quil A/Colesterol de 50/50 μg/mL, a solução de matéria-prima de Quil A foi diluída com água a uma concentração de 50 μg/mL. Enquanto agitando esta solução, a solução de matéria-prima de colesterol foi lentamente adicionada a uma concentração final de 50 μg/mL. Exemplo 2. Soluções de DDA (D)
[000128] Brometo de amônio de dioctadecila de dimetila (DDA; Fluka Analytical), foi dissolvido em etanol, e uma solução de matéria-prima de 18mg/mL foi preparada. A solução de matéria-prima de DDA foi filtrada usando um filtro de 0,2 mícron. Exemplo 3. Soluções de Quil A/Colesterol/DDA (QCD)
[000129] Uma solução de matéria-prima de Quil A/Colesterol foi preparada como no Exemplo 1 às concentrações desejadas. Uma solução de matéria-prima de DDA tal como preparado no Exemplo 2 e lentamente adicionado à solução de matéria-prima de Quil A/Colesterol. As soluções foram misturadas para obter as concentrações finais desejadas. O pH da solução foi ajustado com NaOH ou HCl quando necessário para alcançar o pH final desejado, que geralmente estava em uma faixa de cerca de 6,9 a cerca de 7,5. Exemplo 4. Soluções de CARBOPOL® (C).
[000130] O CARBOPOL® (Noveon, Mexico) foi dissolvido em água desionizada e uma solução de matéria-prima a 1,5% foi preparada. Em outra modalidade, o CARBOPOL® foi dissolvido em água desionizada e uma solução de matéria-prima a 0,75% foi preparada. Exemplo 5. Soluções de DDA/CARBOPOL® (DC).
[000131] Uma solução de matéria-prima de DDA foi preparada como no Exemplo 2. Uma solução de matéria-prima de CARBOPOL® a 0,75% foi preparada como no Exemplo 4. As soluções foram misturadas para obter as concentrações finais desejadas. Exemplo 6. Soluções de Quil A/Colesterol/DDA/CARBOPOL® (QCDC)
[000132] Uma solução de matéria-prima de Quil A/Colesterol/DDA foi preparada como no Exemplo 3. Uma solução de matéria-prima de CARBOPOL® a 0,75% foi preparada como no Exemplo 4. A solução de matéria-prima de CARBOPOL® foi lentamente adicionada à solução de matéria-prima de Quil A/Colesterol/DDA para obter a concentração final desejada. O pH da solução foi ajustado com NaOH ou HCl para alcançar o pH final desejado, que geralmente estava em uma faixa de cerca de 6,9 a cerca de 7,5. Exemplo 7. Soluções de Bay R1005® (R)
[000133] Para preparar uma solução de matéria-prima de Bay R1005®, o glicolipídeo N-(2-desóxi-2-L-leucilamino-e-D-glicopiranosil)- N-octadecildo-decanoilamida foi dissolvido em etanol (60% v/v). Tween 20 e ácido acético glacial foram em seguida adicionados. Em um exemplo, 3,49 g de N-(2-desóxi-2-L-leucilamino-e-D-glicopiranosil)-N- octadecildodecanoilamida foram dissolvidos em 44,64 mL de etanol/água (60% v/v). Isto foi combinado com 1,12 mL de Tween 20 e 0,68 mL de ácido acético glacial. Exemplo 8. Quil A/Colesterol/DDA/CARBOPOL®/Bay R1005® (QCDCR) Soluções
[000134] Uma solução de matéria-prima de Quil A/Colesterol/DDA/CAR-BOPOL® foi preparada como no Exemplo 6. Uma solução de matéria-prima de Bay R1005® foi preparada como no Exemplo 7. A solução de Bay R1005® foi lentamente adicionada à solução de Quil A/Colesterol/DDA/CARBOPOL® para obter a concentração final desejada. O pH da solução foi ajustado com NaOH ou HCl quando necessário para alcançar o pH final desejado, que geralmente estava em uma faixa de cerca de 6,9 a cerca de 7,5. Exemplo 9. Soluções de DEAE Dextrana (X)
[000135] Uma solução de matéria-prima de DEAE Dextrana (X) foi preparada por dissolução de 200 mg/mL de DEAE Dextrana em água. A solução pode ser autoclavada durante cerca de 20 minutos em 120° Centígrados (C). Exemplo 10. Soluções de Quil A/Colesterol/DDA/DEAE (QCDX)
[000136] Uma solução de matéria-prima de Quil A/Colesterol/DDA foi preparada de acordo com o Exemplo 3. Uma solução de matéria-prima de DEAE foi preparada de acordo com o Exemplo 9. As soluções foram combinadas por adição delas diretamente em um homogenizador. A mistura emprega um processo de mistura flash usando uma força de cisalhamento de mais do que 1.000 sec-1. A mistura é feita por alimentação da solução aquosa diretamente na fase de óleo contendo os adjuvantes não polares e componentes de antígeno e misturando até que uma mistura estável homogênea seja obtida. Tipicamente isto pode ser um mínimo de vários minutos ou por mais tempo dependendo do tamanho de partícula desejado. Exemplo 11. Composições de Óleo (O)
[000137] Uma solução de matéria-prima de óleo foi preparada por combinação de óleo mineral de Drakeol com Tween 85 e Span 85, aquecendo a aproximadamente 55°C e em seguida resfriamento e filtragem estéreis. Esta mistura desta forma compreenderia o componente base de fase de óleo para um veículo com base em óleo. Se Colesterol e/ou DDA foi selecionado ser um imunomodulador colaborador para um destas composições, ele então também seria adicionado a esta mistura antes da filtragem, uma vez que eles são solúveis na fase de óleo. Exemplo 12. Composições de Quil A/Colesterol/DDA/DEAE/Óleo (QCDXO)
[000138] Uma solução de matéria-prima de Quil A/Colesterol/DDA/ DEAE foi preparada de acordo com o Exemplo 10. Uma composição de matéria-prima de óleo foi preparada de acordo com o Exemplo 11. As soluções eram uma combinação de Quil-A, DEAE-Dextrana e água para obter a quantidade nas referidas concentrações. Esta fase aquosa foi misturada por agitação continuamente da reação durante vários minutos ou por mais tempo em temperatura ambiente ou superior e em seguida filtrada estéril e armazenada para adição à fase de óleo. A fase aquosa foi lentamente adicionada em uma mistura continuamente de fase de óleo. Exemplo 13. Preparação de Composições Imunogênicas ou Composições de Vacina
[000139] Para preparar uma composição imunogênica ou composição de vacina compreendendo um antígeno e um dos adjuvantes descritos acima, o antígeno desejado foi adicionado a um tampão apropriado. Em seguida, os componentes do adjuvante desejado foram adicionados tal como descrito acima. A solução resultante foi conduzida ao volume final com o tampão. Exemplo 13a. Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, CARBOPOL®
[000140] Para preparar uma composição imunogênica ou composição de vacina compreendendo um antígeno, Quil A, colesterol, DDA, e CARBOPOL®, o antígeno desejado foi adicionado a um tampão apropriado. Uma solução de matéria-prima de Quil A foi preparada como no Exemplo 1 e lentamente adicionada à solução de antígeno. Uma solução de matéria-prima de colesterol foi preparada como no Exemplo 1 e foi lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil A. Uma solução de matéria-prima de DDA foi preparada como no Exemplo 2 e lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil A/colesterol. A solução de antígeno/Quil A/colesterol/DDA foi homogenizada e microfluidificada. Uma solução de CARBOPOL® a 0,75% foi preparada como no Exemplo 4. Depois da microfluidificação, a solução de CARBOPOL® (0,05% v/v) foi adicionada à composição microfluidificada e o pH foi ajustado com NaOH ou HCl a cerca de 6,9 a cerca de 7,5. Exemplo 13b. Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, CARBOPOL®, Bay R1005®
[000141] Para preparar uma composição imunogênica ou composição de vacina compreendendo um antígeno, Quil A, colesterol, DDA, CARBOPOL®, e Bay R1005®, o antígeno desejado foi adicionado a um tampão apropriado. Uma solução de matéria-prima de Quil A foi preparada como no Exemplo 1 e lentamente adicionada à solução de antígeno. Uma solução de matéria-prima de colesterol foi preparada como no Exemplo 1 e foi lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil A. Uma solução de matéria-prima de DDA foi preparada como no Exemplo 2 e lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil A/colesterol. A solução de antígeno/Quil A/colesterol/DDA foi homogenizada e microfluidificada. Uma solução de CARBOPOL® a 0,75% foi preparada como no Exemplo 4. Depois de microfludificação, a solução de CARBOPOL® (0,05% v/v) foi adicionada à composição microfluidificada e o pH foi ajustado com NaOH ou HCl a cerca de 6,9 a cerca de 7,5. Uma solução de matéria-prima de Bay R1005® foi preparada como no Exemplo 7. O componente de Bay R1005® foi adicionado à fase aquosa depois que o DDA foi adicionado. Exemplo 13c. Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, DEAE Dextrana
[000142] Para preparar uma composição imunogênica ou composição de vacina compreendendo um antígeno, Quil A, colesterol, DDA, e DEAE dextrana, o antígeno desejado foi adicionado a um tampão apropriado. Uma solução de matéria-prima de Quil A foi preparada como no Exemplo 1 e lentamente adicionada à solução de antígeno. A composição foi homogenizada. Uma solução de matéria-prima de colesterol foi preparada como no Exemplo 1 e foi lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil A durante a homogenização. Uma solução de matéria-prima de DDA foi preparada como no Exemplo 2 e lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil A/colesterol durante a homogenização. Uma solução de DEAE dextrana foi preparada como no Exemplo 9. Durante a homogenização, a solução de DEAE dextrana foi adicionada e a composição resultante foi conduzida ao volume final. Exemplo 13d. Antígeno, Quil A, Colesterol, DDA, DEAE Dextrana, Óleo
[000143] Para preparar uma composição imunogênica ou composição de vacina compreendendo um antígeno, Quil A, colesterol, DDA, DEAE dextrana, e Óleo, o antígeno desejado foi adicionado a um tampão apropriado. Uma solução de matéria-prima de Quil A foi preparada como no Exemplo 1 e lentamente adicionada à solução de antígeno. A composição foi homogenizada. Uma solução de matéria-prima de colesterol foi preparada como no Exemplo 1 e foi lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil A durante a homogenização. Uma solução de matéria-prima de DDA foi preparada como no Exemplo 2 e lentamente adicionada à solução de antígeno/Quil A/colesterol durante a homogenização. Uma solução de DEAE dextrana foi preparada como no Exemplo 9. Durante a homogenização, a solução de DEAE dextrana foi adicionada. Uma composição de óleo foi preparada como no Exemplo 11. Durante a homogenização, a composição de óleo foi adicionada por alimentação da fase aquosa na fase de óleo enquanto homogenizando e a composição resultante foi conduzida ao volume final. Exemplo 14. Vacinas de Vírus de Leucemia Felina (FeLV)
[000144] Os animais foram aleatoriamente designados aos grupos de tratamento usando um esquema em bloco completo aleatorizado. A Tabela 1 mostra o esquema de estudo. Os blocos foram baseados na data de nascimento e ninhada. Os animais foram classificados pela data de nascimento e em seguida ninhada. Blocos de quatro foram usados. Dentro de um bloco, os animais foram aleatoriamente designados ao tratamento. Para a fase de vacinação do estudo, dois blocos consecutivos foram combinados para formar um grupo de oito animais. Os grupos de animais foram aleatoriamente designados a dois ambientes de modo que cada ambiente contivesse cinco grupos (10 blocos) de animais. Dentro de um grupo de animais, os animais foram aleatoriamente designados a quatro gaiolas localizadas uma próxima da outra de modo que cada gaiola contivesse dois animais com o mesmo tratamento. Para a fase de desafio do estudo, os animais de um ambiente de vacinação foram aleatoriamente designados a ou um ou dois ambientes de desafio. O ambiente de vacinação selecionado para ir em dois ambientes de desafio, tinha cinco blocos aleatorizados para cada ambiente de desafio (2,5 grupos; 20 animais). O outro ambiente de desafio continha 10 blocos (5 grupos; 40 animais). Dentro de um ambiente de desafio, os animais no mesmo bloco foram aleatoriamente designados a quatro gaiolas localizadas uma próxima da outra.
[000145] As vacinas para este estudo foram preparadas como no Exemplo 13 exceto que uma solução de matéria-prima de CARBOPOL® a 1,5% foi usada. Especificamente, LEUKOCELL® 2 (Pfizer, Inc.) foi preparado por propagação de FeLV, subgrupos A, B e C, em células linfoides transformadas por FeLV. Os antígenos virais foram quimicamente inativados, combinados com um adjuvante estéril para intensificar a resposta imune, e embalados na forma líquida. Uma quantidade total de 100 mL de Produto Veterinário Investigacional (IVP) contendo o vírus de leucemia felina e 25 μg de Quil A/hidróxido de alumínio (ALHYDROGEL®) foi preparado. Um total de 94,5 mL de uma solução de matéria-prima de FeLV a 1,106x105 ng/mL foi misturado lentamente durante 15 minutos. O pH foi ajustado a 5,9 até 6,1 com HCl a 4N ou NaOH a 18%, se necessário. Enquanto agitando, 0,5 mL de uma solução a 5,0 mg/mL de Quil A foi adicionado à solução de antígeno. Em seguida, 5,0 mL de ALHYDROGEL® a 100% v/v foram lentamente adicionados. A composição foi agitada durante um mínimo de 2 horas em 4° C. O pH foi ajustado para entre 7,0 e 7,3 com NaOH a 18% ou HCl a 1N, quando necessário.
[000146] O IVP compreendendo o vírus de leucemia felina e 37,5 μg de Quil A/hidróxido de alumínio (ALHYDROGEL®) foram preparados da mesma maneira como para os 25 μg de IVP de Quil A mas 7,5 ml da solução de matéria-prima de Quil A foram adicionados à solução de antígeno.
[000147] Uma quantidade total de 350 mL do Produto Veterinário Investigacional (IVP) contendo o vírus de leucemia felina, Quil A, Colesterol, DDA, e CARBOPOL® foi preparada. Enquanto agitando 349,3 mL de uma solução de matéria-prima de FeLV a 1,106x105 ng/mL, 0,14 mL de uma solução de Quil A a 50,0 mg/mL foi lentamente adicionado à solução de antígeno. Em seguida, 0,39 mL de uma solução de colesterol/etanol a 18 mg/mL foi lentamente adicionado. A composição foi homogenizada durante três minutos em 10.000 rpm. Um total de 0,19 mL de uma solução de DDA/etanol a 18,0 mg/mL foi adicionado à composição enquanto agitando. Um total de 5,0 mL de uma solução de CARBOPOL® a 1,5% foi lentamente adicionado a 145,0 mL da composição de vírus de leucemia felina, Quil A, Colesterol e DDA. O pH foi ajustado entre 7,0 e 7,3 com NaOH a 18% ou HCl a 1N, quando necessário. Tabela 1: Esquema Experimental
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aProduto Veterinário Investigacional bMisturado para conter uma potência relativa comparável à vacina de referência (Lote No. 12 de Referência de FeLV) cSC = Subcutânea dDepo-Medrol®: Dia 42 (aproximadamente 5,0 mg/kg) pela rotina intramuscular eON = Oronasal Quil A - Colesterol = Quil A adjuvante de saponina, incorporada em partículas de lipídeo de colesterol CARBOPOL® = Carbômero DDA = Brometo de dimetildioctadecilamônio
[000148] Todos os animais foram observados diariamente e as observações foram registradas. As temperaturas corporais foram registradas de todos os animais pela rotina timpânica no Dia 1 antes da primeira administração de dose de vacina e no Dia 20 antes da segunda administração de dose de vacina. Uma amostra de sangue (1,0 a 2,0 mL) foi coletada de cada animal por venipunção da veia jugular, no Dia 2. As doses sedativas de TELAZOL® (Fort Dodge Animal Health) foram administradas de acordo com o peso corporal (aproximadamente 5,0 mg/kg) pela rotina intramuscular a fim de minimizar o estresse animal e evitar lesão aos treinadores de animais durante a coleta de sangue. O sangue foi coletado em tubos de separação de soro (SST) e processado para separação de soro. O soro foi armazenado em -20°C ou mais frio até que fosse testado.
[000149] As vacinas de placebo ou FeLV foram administradas aos gatinhos pela rotina subcutânea em uma dose de 1,0 mL. A primeira vacinação foi realizada no Dia 0 e a segunda administração de vacina foi realizada no Dia 21. Todos os animais foram observados durante aproximadamente uma hora em seguida a primeira e segunda vacinações para reações de dor (reações de estímulo) locais imediatas. As observações foram documentadas. As temperaturas corporais de todos os animais foram medidas pela rotina timpânica nos Dias 1 e 2 em seguida à primeira administração de dose de vacina, e nos Dias 22 e 23 em seguida à segunda administração de dose de vacina. As reações do sítio de injeção (tumefações) foram também determinadas no Dia 1 depois da primeira vacinação e nos Dias 22 e 23 depois da segunda vacinação. Uma amostra de sangue (1,0 a 2,0 mL) foi coletada de cada animal por venipunção da veia jugular, no Dia 35, processada para separação de soro, e armazenada em -20°C ou mais frio até que fosse testada.
[000150] No Dia 35, os animais foram colocados em gaiolas de isolamento individual. O vírus de desafio foi Vírus de Leucemia Felina (FeLV) virulento, cepa de Rickard, titulada em aproximadamente 106.1 TCID50/mL. O material de desafio de FeLV foi descongelado e mantido em gelo úmido antes de administração. Os animais foram desafiados nos Dias 37, 40, 42, e 44, através de administração de 1,0 mL pela rotina nasal de material de desafio não diluído. Uma seringa de tuberculina de 1 mL, sem a agulha, foi enchida com o material de desafio. Cada gatinho foi administrado aproximadamente 0,5 mL por narina. No Dia 42, a administração de desafio foi desempenhada aproximadamente 5 horas após a administração de DEPO-MEDROL®. Depois de cada dia de desafio, uma amostra do material de desafio foi retida para titulação confirmatória.
[000151] Após o desafio, uma amostra de sangue (1,0 a 2,0 mL) foi coletada de cada animal por venipunção da veia jugular, nos Dias 64, 85, 106, 127, 134, 141, 148, e 155. As doses sedativas de TELAZOL® (Fort Dodge) foram administradas tal como descrito acima. O sangue foi coletado em tubos de separação de soro (SST), processado para separação de soro, e armazenado em -20°C ou mais frio até que fosse testado. As amostras de soro foram testadas quanto a presença de antígeno p27 de FeLV (marcador de infecção de FeLV) através de ELISA (IDEXX; Westbrook, ME). Os resultados finais foram avaliados pela intensidade de desenvolvimento de cor e por espectrofotômetro em uma densidade óptica de 405/490 nm. Para um teste válido, a densidade óptica de controle positivo tinha que cair entre 0,131 e 2,999 e o controle negativo devia ter densidade óptica abaixo ou igual a 0,0039.
[000152] O isolamento de vírus foi desempenhado usando amostras de soro coletadas nos Dias 2 e 35. As amostras de soro dos Dias 127 até 155 foram consideradas para avaliar a eficácia da vacina de FeLV. As amostras de soro do Dia 127 (semana 12), Dia 134 (semana 13), Dia 141 (semana 14), Dia 148 (semana 15) e Dia 155 (semana 16) foram testadas quanto a presença de antígeno p27 de FeLV. Um animal foi considerado persistentemente infectado se ele tivesse três ou mais resultados de teste de antígeno p27 de FeLV positivos durante os Dias 127 (semana 12) até 155 (semana 16).
[000153] As temperaturas foram analisadas usando um modelo misto de medições repetidas linear geral, e comparações de tratamento em pares foram feitas entre tratamento T01 e tratamentos T02, T03, e T04 em cada ponto do tempo se o tratamento total e/ou tratamento por efeito do ponto do tempo fosse significante. Processos dos mínimos quadrados, intervalos de confiança de 95%, mínimos e máximos foram calculados para cada tratamento em cada ponto do tempo.
[000154] As distribuições de frequência da presença de reações de estímulo foram calculadas para cada tratamento e dados de ponto do tempo foram coletados. As distribuições de frequência da presença de tumefações do sítio de injeção foram calculadas para cada tratamento e os dados de ponto do tempo foram coletados. As distribuições de frequência da presença de reações sistêmicas pós-vacinação foram calculadas para cada tratamento.
[000155] Reações imediatas não foram observadas em quaisquer dos grupos de tratamento durante a primeira e segunda vacinação. Reações adversas não foram observadas em quaisquer dos grupos de tratamento em aproximadamente uma hora após a primeira e segunda vacinações. Nem pirexia (temperatura corporal > 39,5°C) nem hipotermia (temperatura corporal < 37,0°C) foi observado em quaisquer dos grupos de tratamento depois da primeira e segunda vacinações. Não houve nenhuma diferença significante na temperatura corporal média entre grupos de tratamento em qualquer ponto do tempo (p > 0,08). As tumefações do sítio de injeção não foram observadas em quaisquer dos grupos de tratamento depois da primeira e segunda vacinações.
[000156] Os resultados finais da semana 12 à semana 16 pós-desafio indicaram que 16 dentre 19 animais (84%) que receberam a vacina de placebo (grupo T01) eram persistentemente virêmicos ao FeLV. 13 dentre 19 animais (68%) no grupo T02 foram protegidos de desafio virulento de FeLV. O nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0004) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 12 dentre 19 animais (63%) no grupo T03 foram protegidos de desafio virulento de FeLV. O nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0013) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 19 dentre 20 animais (95%) no grupo T04 foram protegidos de desafio virulento de FeLV. O nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0001) comparado aos gatinhos vacinados com placebo.
[000157] Desta forma, todas as vacinas administradas aos grupos T02, T03 e T04 demonstraram ser seguras em gatinhos na idade mínima quando administradas em um regime de duas doses, três semanas entre si. Adicionalmente, as vacinas administradas a estes grupos foram também capazes de reduzir significantemente o nível de viremia persistente de FeLV em gatinhos na idade mínima quando administradas em um regime de duas doses, três semanas entre si. Houve uma redução estatisticamente significante no estabelecimento de viremia persistente de FeLV em gatinhos nos grupos T02, T03 e T04. Adicionalmente, houve uma diferença estatisticamente significante entre T04 e os outros grupos de vacina (T02, T03). Foi surpreendente e inesperado que as vacinas contendo a nova formulação adjuvante provaram ser mais eficazes que aquelas contendo componentes adjuvantes comumente usados em gatos. Exemplo 15. Vacinas de Vírus de Leucemia Felina
[000158] Os gatinhos foram aclimatados durante dezesseis dias depois da chegada. Os animais foram em seguida aleatoriamente designados a um ambiente, e dentro de um ambiente, foram aleatoriamente designados a tratamentos (1 animal por tratamento em cada ambiente). Uma amostra de sangue (1,0 a 2,0 mL) foi coletada de cada animal por venipunção da veia jugular no Dia de Estudo 1. As doses sedativas de TELAZOL® (Fort Dodge Animal Health) foram administradas de acordo com o peso corporal (aproximadamente 5,0 mg/kg) pela rotina intramuscular a fim de minimizar estresse animal e evitar lesão aos treinadores de animais durante a coleta de sangue. O sangue foi coletado nos tubos de separação de soro e processado para separação de soro. Todos os animais foram também observados diariamente, e observações foram registradas.
[000159] As vacinas foram preparadas como no Exemplo 13 exceto que uma solução de matéria-prima de CARBOPOL® a 1,5% foi usada. LEUKOCELL® 2 foi preparado por propagação de FeLV, subgrupos A, B e C, em células linfoides transformadas por FeLV. Os antígenos virais foram quimicamente inativados, combinados com um adjuvante estéril para intensificar a resposta imune, e embalados na forma líquida. Uma quantidade total de 500,0 mL de IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma Potência Relativa (RP) de 2, Quil A, Colesterol, e DDA foi preparada da seguinte maneira. Um total de 20,7 mL de uma solução de matéria-prima de FeLV (50,0 RP/mL onde 1 RP = 3,624 ng/mL de antígeno) foram adicionados a 478,2 mL de tampão de PBS a 0,063%. Enquanto agitando, 0,21 mL de uma solução a 50,0 mg/mL de Quil A foi lentamente adicionado à solução de antígeno. Em seguida, 0,58 mL de uma solução de colesterol/etanol a 18 mg/mL foi lentamente adicionado. Um total de 0,29 mL de uma solução de DDA/etanol a 18,0 mg/mL foi lentamente adicionado à composição enquanto agitando. A composição foi homogenizada durante três minutos em 10.000 rpm. A composição foi em seguida microfluidificada por uma passagem por uma câmara de dimensão limitante de 200 mícrons em 68,95 (+ 3,45) MPa (10.000 (+ 500) psi). Enquanto agitando, 10,0 mL de uma solução de CARBOPOL® a 1,5% foi lentamente adicionada a 290,0 mL da composição de vírus de leucemia felina, Quil A, Colesterol e DDA. O pH foi ajustado entre 7,0 e 7,3 com NaOH a 18% ou HCl a 1N, quando necessário.
[000160] O IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 5 foi preparado da mesma maneira como o IVP com uma RP de 2 uso de 51,7 mL da solução de matéria-prima de FeLV e 447,2 mL de tampão de PBS a 0,063%, com as quantidades dos outros componentes permanecendo as mesmas.
[000161] O IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 10 foi preparado da mesma maneira como o IVP com uma RP de 2 usando 93,1 mL da solução de matéria-prima de FeLV, 355,9 mL de tampão de PBS a 0,063%, 0,19 mL da solução de Quil A, 0,52 mL da solução de colesterol, e 0,26 mL da solução de DDA (450 mL de volume total). Em seguida, 8,3 mL de uma solução de CARBOPOL® a 1,5% foram lentamente adicionados a 241,7 mL da composição de vírus de leucemia felina, Quil A, Colesterol e DDA.
[000162] O IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 15 foi preparado da mesma maneira como o IVP com uma RP de 10 usando 139,7 mL da solução de matéria-prima de FeLV e 309,4 mL de tampão de PBS a 0,063%, com as quantidades dos outros componentes permanecendo as mesmas.
[000163] O IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 20 foi preparado da mesma maneira como o IVP com uma RP de 2 usando 206,9 mL da solução de matéria-prima de FeLV e 292,0 mL de tampão de PBS a 0,063%, com as quantidades dos outros componentes permanecendo as mesmas.
[000164] Para administração de uma dose de 0,5 mL, 300,0 mL de IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 5, Quil A, Colesterol, DDA, e CARBOPOL® foram preparados da seguinte maneira. Um total de 21,7 mL de uma solução de matéria-prima de FeLV (35,8 RP/mL onde 1 RP = 1,864 μg/mL de antígeno) foi adicionado a 277,7 mL de tampão de PBS a 0,063%. Enquanto agitando, 0,12 mL de uma solução a 50,0 mg/mL de Quil A foi lentamente adicionado à solução de antígeno. Em seguida, 0,35 mL de uma solução de colesterol/etanol a 18 mg/mL foi lentamente adicionado. Um total de 0,17 mL de uma solução de DDA/etanol a 18,0 mg/mL foi lentamente adicionado à composição enquanto agitando. A composição foi homogenizada durante três minutos em 10.000 rpm. A composição foi em seguida microfluidificada por uma passagem por uma câmara de dimensão limitante de 200 mícrons em 68,95 (+ 3,45) MPa (10.000 (+ 500) psi). Enquanto agitando, 3,3 mL de uma solução de CARBOPOL® a 1,5% foram lentamente adicionados a 96,7 mL da composição de vírus de leucemia felina, Quil A, Colesterol e DDA. O pH foi ajustado entre 7,0 e 7,3 com NaOH a 18% ou HCl a 1N, quando necessário.
[000165] O IVP para administração de uma dose de 1,0 mL do vírus de leucemia felina em uma RP de 5, Quil A, Colesterol, DDA, e CARBOPOL® foi preparada da mesma maneira como para a dose de 0,5 mL com as quantidades ajustadas apropriadamente.
[000166] Uma quantidade total de 300,0 mL de IVP contendo o vírus de leucemia felina em uma RP de 10 e CARBOPOL® foi preparada. Um total de 62,1 mL de uma solução de matéria-prima de FeLV (50,0 RP/mL onde 1 RP = 3,624 μg/mL de antígeno) foi adicionado a 237,9 mL de tampão de PBS a 0,063%. A composição foi homogenizada para três minutos em 10.000 rpm. A composição foi em seguida microfluidificada por uma passagem por uma câmara de dimensão limitante de 200 mícrons em 68,95 (+ 3,45) MPa (10.000 (+ 500) psi). Enquanto agitando, 3,3 mL de uma solução de CARBOPOL® a 1,5% foram lentamente adicionados a 96,7 mL da composição de vírus de leucemia felina. O pH foi ajustado entre 7,0 e 7,3 com NaOH a 18% ou HCl a 1N, quando necessário.
[000167] As vacinas de placebo e FeLV (Tabela 2) foram administradas aos gatinhos pela rotina subcutânea usando uma agulha de calibre 22 x 1,91 cm (%”) e seringa de 3 cm3 no Dia de Estudo 0 e Dia de Estudo 20. Ao grupo de tratamento T01 foi administrada a vacina de placebo em uma dose de 1,0 mL. Aos grupos de tratamento T02, T04, T05, T06, T07, T08 e T09 foram administradas as vacinas de FeLV em uma dose de 1,0 mL. Ao grupo de tratamento T03 foi administrada a vacina de FeLV em uma dose de 0,5 mL. Ao grupo de tratamento T10 foi administrada a vacina de varíola dos canários de FeLV (Merial) pela rotina intradérmica usando um injetor de pistola intradérmico. Tabela 2: Esquema Experimental
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[000168] Todos os animais foram observados em seguida a primeira vacinação (Dia de Estudo 0) e segunda vacinação (Dia de Estudo 20) quanto a sinais de dor na administração de vacina de teste incluindo a vocalização, arranhão/mordida e tentativa agressiva ou de fuga. A atitude pós-vacinação (normal ou anormal) foi também documentada. Todos os animais foram observados durante aproximadamente uma hora depois da administração de vacina no Dia de Estudo 0 e Dia de Estudo 20 para o desenvolvimento de reações sistêmicas adversas. As observações foram documentadas. Os sítios de vacinação foram apalpados, e dor no sítio de injeção, vermelhidão no sítio de injeção, tumefação do sítio de injeção e tamanho de tumefação foram registrados. As observações foram desempenhadas nos Dias de Estudo 2, 5 e 9 depois da primeira vacinação, e nos Dias de Estudo 25, 28 e 32 depois da segunda vacinação. As observações foram documentadas.
[000169] Uma amostra de sangue (1,0 a 2,0 mL) foi coletada de cada animal por venipunção da veia jugular no Dia de Estudo 32 (pré- desafio). Animais foram desafiados nos Dias de Estudo 34, 36, 39, e 41 através de administração de 1,0 mL pela rotina nasal de material de desafio não diluído. Uma seringa de tuberculina de 1 mL, sem a agulha, foi enchida com o material de desafio. A cada gatinho foi dado aproximadamente 0,5 mL por narina. O material de desafio de FeLV tinha um título médio de 106.1 TCID50/mL. Uma amostra de sangue (1,0 a 2,0 mL) foi em seguida coletada de cada animal por venipunção da veia jugular nos Dias de Estudo 61, 83, 106, 126, 133, 138, 146, e 152. Resultados - Segurança
[000170] Durante a primeira (Dia de Estudo 0) vacinação, três animais no grupo de tratamento T09 demonstraram reações do tipo estímulo imediatas. Durante a segunda vacinação (Dia de Estudo 20), um animal do grupo de tratamento T05, quatro do grupo de tratamento T08, e dois do grupo de tratamento T09 demonstraram reações do tipo estímulo imediatas.
[000171] Durante a primeira vacinação, três animais do grupo de tratamento T09 demonstraram menor vocalização. Os animais apresentando dor na primeira vacinação também apresentaram menor vocalização neste momento. Durante a segunda vacinação, um animal do grupo de tratamento T05, quatro do grupo de tratamento T08, e dois do grupo de tratamento T09 demonstraram menor vocalização. Os animais apresentando dor na segunda vacinação também apresentaram menor vocalização neste momento.
[000172] Durante a primeira vacinação, três animais no grupo de tratamento T09 demonstraram comportamento agressivo/tentativa de fuga. Durante a segunda vacinação, um animal do grupo de tratamento T05, quatro do grupo de tratamento T08, e dois do grupo de tratamento T09 demonstraram comportamento agressivo/tentativa de fuga.
[000173] Nenhum dos grupos de tratamento apresentaram arranhão/mordida no sítio de injeção na primeira ou segunda vacinação. As reações do sítio de injeção não foram observadas em qualquer dos grupos de tratamento após a primeira ou segunda vacinação. Reações adversas não foram também observadas em qualquer dos grupos de tratamento. Resultados - Eficácia
[000174] Todos os animais testados negativos antes da vacinação quanto ao antígeno p27 de FeLV de amostras de soro coletadas no Dia 1. Todos os animais também testados negativos antes do desafio quanto ao antígeno p27 de FeLV de amostras de soro coletadas no Dia 32.
[000175] Os resultados finais de semana 12 a semana 16 pós-desafio (Tabela 3) indicaram que 9 dentre 10 animais (90%) no grupo de tratamento T01 (placebo) eram persistentemente virêmicos ao FeLV. Os resultados do mesmo período indicaram que 6 dentre 10 animais (60%) no grupo de tratamento T02 foram protegidos de desafio virulento de FeLV; este nível de proteção não foi estatisticamente significante (p= 0,0573) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. Nove dentre 10 animais (90%) no grupo de tratamento T03 foram protegidos de desafio virulento de FeLV; este nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0011) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 10 dentre 10 animais (100%) no grupo de tratamento T04 foram protegidos de desafio virulento de FeLV; este nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0001) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 10 dentre 10 animais (100%) no grupo de tratamento T05 foram protegidos de desafio virulento de FeLV; este nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0001) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 7 dentre 10 animais (70%) no grupo de tratamento T06 foram protegidos de desafio virulento de FeLV; este nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0198) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 10 dentre 10 animais (100%) no grupo de tratamento T07 foram protegidos de desafio virulento de FeLV; este nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0001) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 8 dentre 10 animais (80%) no grupo de tratamento T08 foram protegidos de desafio virulento de FeLV; este nível de proteção foi estatisticamente significante (p= 0,0055) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. 5 dentre 10 animais (50%) no grupo de tratamento T09 foram protegidos de desafio virulento de FeLV; este nível de proteção não foi estatisticamente significante (p= 0,1409) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. Finalmente, 6 dentre 10 animais (60%) no grupo de tratamento T10 foram protegidos de desafio virulento de FeLV; este nível de proteção não foi estatisticamente significante (p= 0,0573) comparado aos gatinhos vacinados com placebo. Tabela 3. Sumário de Nível de Proteção
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Discussão
[000176] As vacinas usadas nos grupos de tratamento T02, T03, T04, T06 e T07 demonstraram um perfil de segurança satisfatório durante a primeira vacinação, quando nenhuma reação foi observada neste momento. Um único animal no grupo de tratamento T05 demonstrou uma reação imediata (dor na administração, menor vocalização e tentativa agressiva/de fuga) na segunda vacinação. Este evento poderia ser associado com uma resposta exacerbada à vacinação pelo animal particular em vez de a um problema de formulação de vacina. Todas as vacinas demonstraram um perfil de segurança satisfatório pós- vacinação, uma vez que nem reações locais nem eventos adversos relacionados à vacinação foram observados.
[000177] As vacinas de FeLV administradas aos grupos de tratamento T03, T04, T05, T07 e T08 demonstraram eficácia satisfatória, uma vez que > 80% de proteção (>75% de fração preventiva) foram obtidos depois do desafio com FeLV virulento. Que a vacina dada ao grupo T07 forneceu 100% de proteção é surpreendente e inesperado, quando animais neste grupo receberam 25% e 33% da dose de antígeno de animais nos grupos T04 e T05, respectivamente. Uma vantagem clara dos adjuvantes descritos e testados aqui é que eles permitem uma dose menor de antígeno a ser usada, embora ainda induzindo uma resposta imune totalmente protetora. As vacinas administradas aos grupos de tratamento T02, T06 e T09 demonstraram uma eficácia um pouco diminuída (< 80% de proteção; fração preventiva < 75%) em seguida ao desafio com FeLV virulento. A eficácia diminuída da vacina administrada ao grupo de tratamento T02 foi possivelmente feita à presença de animais respondedores reduzidos neste grupo. Exemplo 16. Em Vacinação de Ovo contra Eimeria em Frangos
[000178] A coccidiose aviária é uma doença intestinal geralmente causada por protozoários do gênero Eimeria, e representa um problema mundial sério para a indústria de aves domésticas. Os parasitas ingeridos durante a alimentação localizam-se no trato intestinal onde eles causam séria lesão aos tecidos intestinais e subjacentes. As perdas econômicas resultantes para a indústria de aves domésticas são muito significantes, uma vez que a conversão alimentar e ganho de peso de ambas as aves de abate e colocadoras de ovo são prejudicadas. Um resumo geral do estado da técnica, incluindo tentativas de vacinar contra Eimeria usando, por exemplo, proteínas de Eimeria recombinantes como antígeno e uma variedade de sistemas adjuvantes, é descrito nas seguintes publicações, a totalidade do qual é incorporado através de referência aqui, como se totalmente apresentado, (1) H.S. Lillehoj e outros, J. Parisitol, 91(3), 2005, pp. 666673; (2) H.S. Lillehoj e outros, Avian Diseases, 49 2005, 112-117; e (3) R. A. Dalloul e outros, Expert Rev. Vaccines, 5(1), 2006, pp.143-163. O presente Exemplo é direcionado ao uso de novas composições de vacina que empregam componentes adjuvantes que fornecem desempenho superior no contexto de coccidiose.
[000179] Os adjuvantes altamente eficazes da presente invenção podem ser usados em combinação com material antigênico de todas as espécies de Eimeria, incluindo extratos de proteína purificados ou parcialmente purificados das mesmas, ou por meio de uma ou mais proteínas recombinantemente expressas das mesmas, ou fragmentos de qualquer e todas tais proteínas, desta forma para incluir materiais antigênicos fornecidos de Eimeria acervulina, Eimeria ahsata, Eimeria bovis, Eimeria brunetti, Eimeria fraterculae, Eimeria maxima, Eimeria meleagridis, Eimeria mitis, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria stiedae, Eimeria tenella, e Eimeria zurnii, entre outros.
[000180] A vacina adjuvada da invenção pode ser fornecida contra qualquer proteína ou macromolécula que é produzida em um ou mais pontos no ciclo de vida do protozoário, incluindo, sem limitação, oocisto (seja esporulado ou não esporulado), esporocisto, esporozoíto, esquizonte, merozoíto, células de gameta masculino ou feminino. Em um exemplo preferido, proteínas que são vazadas nas fezes em quantidades significantes no estágio de oocisto são os materiais preferidos para agir como a fonte de antígeno de proteína recombinante, ou amostras parcialmente ou totalmente purificadas de tal proteína tal como purificada através de mecanismos convencionais.
[000181] Exemplos adicionais de proteínas de Eimeria úteis como fontes de antígeno na formulação das presentes vacinas incluem aqueles tal como descrito por Karkhanis e outros Infection and Immunity, 1991, pp. 983-989, incluindo antígenos protetores, tal como descrito neste, possuindo uma faixa de massa de cerca de 20 a cerca de 30kDA. Exemplo adicional inclui a proteína 3-1E de 23kDA de Eimeria, e a proteína Etp100, por exemplo como recuperado de E. tenella.
[000182] Os adjuvantes altamente eficazes da presente invenção podem ser usados em combinação com material antigênico de Neurospora caninum.
[000183] Adicionalmente, os adjuvantes altamente eficazes da presente invenção podem ser usados em combinação com quaisquer dos seguintes patógenos protozoários, Cryptosporidium parvum (criptosporidiose), Cyclospora cayetanensis (ciclosporíase), Isospora belli (isosporíase), Toxoplasma gondii (toxoplasmose), Plasmodium (malária), e Babesia spp. (babesiose), e protozoários relacionados, geralmente do grupo Apicomplexo ocasionando estas ou doenças relacionadas.
[000184] A eficácia da liberação em ovo de vacinas que contêm sistemas adjuvantes particulares foi avaliada como segue. Materiais e Processos: 1. Materiais:
[000185] A proteína de E. maxima recombinante (de proteína 3-1E) foi expressa em E. coli e purificada por coluna de afinidade. A preparação bruta de macromoléculas de E. maxima de célula total (solubilizadas com detergente de células rompidas) foi também usada como antígeno, com este antígeno bruto sendo referido como "EM". Em um exemplo preferido, o adjuvante foi tal como descrito no Exemplo 8 acima, e é preparado como fornecido de acordo com este protocolo de Exemplo (veja Página 41). Por esse motivo, em um exemplo típico, cada embrião receberia uma injeção no âmnio (isto é, para incluir o espaço e líquido amniótico) de cerca de 50 a cerca de 100 microlitros de solução de vacina, que, para cada 1 ML desta compreende: cerca de 50 ou 100 microgramas de proteína 3-1E recombinante ou outras espécies de proteína, ou alternativamente, cerca de 50 ou 100 microgramas de extrato de "EM" de célula bruta; cerca de 20 microgramas de Quil A; cerca de 20 microgramas de colesterol; CARBOPOL em cerca de 0,075% (v/v); cerca de 10 microgramas de DDA; e cerca de 250 microgramas de R1005, todos fornecidos em, por exemplo, PBS a 20 mM.
[000186] Com relação à seleção da saponina para uso aqui, a seguinte informação adicional é instrutiva. O termo definido saponina refere-se aos glicosídeos derivados de planta, vários que foram estudados extensivamente quanto a suas propriedades biológicas (The Plant Glycosides, McIlroy, R. J., Edward Arnold and co., London, 1951). As saponinas usadas mais predominantemente na técnica para a produção de vacinas são aquelas derivadas das plantas Quillaja saponaria molina, Aesculus hippocastanum ou Gyophilla struthium. Extratos da casca de Quillaja saponaria molina que são conhecidos possuirem atividade adjuvante são conhecidos, por exemplo Quil A. Também, as frações puras de Quil A foram descritas as quais retêm atividade adjuvante embora sendo menos tóxicas do que Quil A, por exemplo QS21. QS21 é também descrita em Kensil e outros (1991. J. Immunology vol 146, 431-437). Quando misturados com os ingredientes adjuvantes adicionais da presente invenção, como até aqui e daqui em diante descrito, tais materiais contendo saponina tornam-se materiais altamente eficazes. Formulações eficazes adicionais incluem aquelas que usam Escina, que foi descrito no Índice de Merck (12a ed: entrada 3737) como uma mistura de saponinas encontradas na semente da árvore de castanha-da-índia. Na modalidade preferida da presente invenção, a saponina refere-se a "Quil-A" vendida nos EUA pela companhia E.M Sergeant.
[000187] Deve, além disso, ser entendido que extratos de saponina podem ser usados como misturas ou componentes individuais purificados destas, tais frações/produtos incluindo QS-7, QS-17, QS-18, e QS-21 da Companhia Antigenics, Massachusetts, EUA ou produtos de saponina bruta, fracionada ou refinada similar, e misturas dos mesmos oferecido pela Companhia Isconova da Suécia. Em uma modalidade, a Quil A é pelo menos 85% pura. Em outras modalidades, a Quil A é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% pura. 2. Vacinação de Embrião:
[000188] Ovos foram adquiridos da Incubadora Moyers, Quakertown, PA. Para imunização em ovo, ovos de abateforam em seguida incubados durante 18 dias, e examinados com luz de vela para selecionar (em 18 dias de embrionização) ovos férteis, e em seguida injetados com PBS a 20 mM e ou adjuvante sozinho, ou adjuvante formulado com ou proteína 3-1E recombinante ou uma preparação de "EM". Injeções foram feitas em um injetor em ovo "Intelliject" (Avitech, Hebron, MD) de acordo com as instruções do fabricante. Cada ovo recebeu amostras de 100 microlitros na cavidade amniótica usando uma agulha de calibre 18 e 17,5 cm de comprimento fornecida por Avitech (Hebron, MD). As doses de 50 microlitros estão também entre aquelas operáveis na prática da presente invenção. 3. Frangos:
[000189] Assim que os frangos de abate foram incubados (em torno do dia 21 a 22), eles foram transportados ao laboratório usando caixas de papelão de transporte de frango descartáveis (Frederick Packaging, Inc., Milwaukee, WI) e os pintos foram em seguida alojados nas unidades de Petersime e providos com alimento e água à vontade.
[000190] As aves foram mantidas em gaiolas chocadeiras em uma instalação sem Eimeria e transferidas em grandes gaiolas pendentes em locais separados onde elas foram infectadas com oocistos vivos de Eimeria maxima e mantidas lá até o término do período experimental. 4. Parasitas:
[000191] A cepa USDA BARC de Eimeria maxima No.41, que foi mantida no Laboratório de Doenças Parasitárias Animais-BARC e propagada de acordo com o procedimento estabelecido no laboratório do Dr. Lillehoj, foi usada. Os oocistos frescamente produzidos da cepa de E. maxima (Beltsville No.41) foram purificados por flutuação em hipoclorito de sódio a 5%, lavados três vezes com PBS, e a viabilidade foi enumerada por azul tripano usando um hemocitômetro. 5. Infecção de desafio de Eimeria:
[000192] As aves de sete dias de idade foram rotuladas na asa e as aves de todos os grupos experimentais exceto grupos de controle não infectados foram inoculadas esofagicamente com E. maxima usando uma agulha de inoculação, e foram em seguida colocadas nas gaiolas de coleta de oocistos. 6. Determinação de ganho de peso corporal:
[000193] Os pesos corporais de aves individuais foram determinados nos dias 0 (não infectadas), 6 e 10 dias após infecção com E. maxima. 7. Avaliação de produção de oocisto fecal:
[000194] Cuidadores de animais foram instruídos de não limpar as gaiolas, e gotejamentos fecais foram coletados. Tachos de coleta foram colocados sob cada gaiola durante 5 dias partindo do 6° dia após a infecção, e materiais fecais foram coletados em grandes jarros plásticos (2L). Os gotejamentos fecais encharcados com água de torneira em cada jarro foram triturados em um misturador com mais água (volume total é 3L), e duas amostras aleatórias de 40 ml foram tomadas de cada amostra e armazenadas em refrigerador até que elas fossem contadas. A fim de contar oocistos de coccídios, várias diluições foram produzidas inicialmente para determinar as diluições ideais para a enumeração de oocistos para cada amostra. Os oocistos foram contados microscopicamente usando uma câmara de contagem McMaster usando um processo de flutuação de sacarose que foi estabelecido no laboratório do Dr Lillehoj. O número total de oocistos vazados por frango foi calculado usando a fórmula: oocistos totais/ave = (contagem de oocisto x fator de diluição x volume de amostra fecal/volume da câmara de contagem)/número de aves por gaiola. 8. Coleta de amostra:
[000195] Sangue foi coletado no 6° dia em seguida à data de infecção, e a resposta de anticorpo de soro foi determinada. As amostras de sangue foram obtidas de aves individuais (N=4 a 5/grupo), deixadas coagular 4 h em 4°C, e os soros coletados. As amostras de soro foram testadas quanto a anticorpos anti-Eimeria usando ELISA. Resumidamente, as placas de microtítulo foram cobertas durante a noite com 10 μg/cavidade dos antígenos coccídicos recombinantes Ea3-1E, EtMIF ou EtMIC2, lavadas com PBS a 0,05% Tween, e bloqueadas com BSA de PBS a 1%. As diluições de soro (1:20, 1:40, 1:80, 1:160; 100 μL/cavidade) foram adicionadas, incubadas com agitação suave contínua, lavadas, e ligados Ab detectadas com IgG de coelho anti- frango conjugado por peroxidase (Sigma) e substrato específico por peroxidase. A densidade óptica (OD) foi determinada em 450nm com uma leitora de microplaca (Bio-Rad, Richmond, CA).
[000196] Os tecidos de intestino foram coletados na incubadora, e em 6 e 10 dias depois disso, e testados quanto à produção de citocina (IFN- Y, IL-2) pelo uso de RT-PCR em tempo real, como uma medida de estimulação de Th1. 9. Síntese de cDNA
[000197] O RNA total foi extraído de IELs intestinais usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cinco microgramas de RNA foram tratados com 1,0 U de DNase I e 1,0 μl de tampão de reação a 10X (Sigma), incubados durante 15 min em temperatura ambiente, 1,0 μl de solução de interrupção foi adicionado para inativar a DNase I, e a mistura foi aquecida em 70°C durante 10 minutos. O RNA foi transcrito em reverso usando o sistema de síntese de primeiro filamento StrataScript (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com as recomendações do fabricante. 10. RT-PCR quantitativa
[000198] Os iniciadores de oligonucleotídeo de RT-PCR quantitativa para interferon-Y (IFN-Y) de frango e controle de GAPDH são listados na Tabela 4. Amplificação e detecção foram realizadas usando as quantidades equivalentes de RNA total de IELs intestinais usando o sistema de mistura mestre Mx3000P e Brilliant SYBR Green QPCR (Stratagene). As curvas padrões foram geradas usando RNA padrão diluído por log10 e os níveis de transcrições individuais foram normalizados àqueles de GAPDH analisados pelo programa Q-gene. Cada análise foi desempenhado em triplicata. Para normalizar os níveis de RNA entre as amostras dentro de um experimento, os valores de ciclo limiar médio (Ct) para os produtos de amplificação foram calculados por reunião de valores de todas as amostras neste experimento. Tabela 4. Iniciadores de oligonucleotídeo usados para RT-PCR quantitativa de frango IFN-Y e GAPDH.
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[000199] Baço foi coletado antes de inoculação com E. maxima e na 10a DPI (data após infecção) para ensaio de proliferação de esplenócito. Os baços foram colocados em uma placa de Petri com 10 ml de solução de sal equilibrada de Hank (HBSS) suplementada com 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (Sigma, St. Louis, MO). As suspensões de célula única de linfócitos de baço foram preparadas e a proliferação de linfócito foi realizada. Em resumo, os esplenócitos foram ajustados a 5x106 ou 1*107 células/mL em meio de IMDM (Sigma) suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 100 U/mL de penicilina, e 100 μg/mL de estreptomicina (Sigma), que será chamado meio de IMDM completo a 10%. Os esplenócitos (100 μL/cavidade) foram incubados em placas de fundo plano de 96 cavidades em 41°C em uma incubadora umidificada (Forma, Marietta, OH) com CO2 a 5% e ar a 95% durante 48 h. A proliferação celular foi determinada com 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4- dissulfofenil)-2H-tetrazólio, sal de monosódio (WST-8, - Kit-8® de Contagem de Células, Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD). A densidade óptica (OD) foi medida em 450 nm usando um espectrofotômetro de microplaca (BioRad, Richmond, CA). Resultados
[000200] Os resultados mostraram que as aves de abate vacinadas com 100 microlitros de formulação adjuvante (isto é, 100 microlitros incluindo proteína 3-1E recombinante de acordo com as doses previamente definidas) ganharam cerca de um adicional de 45 a 85 gramas de peso corporal comparado às aves não vacinadas mas infectadas com E. maxima.
[000201] As vacinas da invenção também mostraram claros efeitos na imunidade mediada por célula tal como medido por ensaios de proliferação de linfócito mitogênico: Os resultados de proliferação de linfócito de baço em 1*107 células/mL incubadas com Con A durante 48 horas mostraram que os esplenócitos de frangos infectados por E. maxima imunizados com adjuvante Pfizer com ou sem antígeno em geral mostram níveis elevados de proliferação de linfócito, especialmente quando uma dose de 50 ug foi usada. Intensificação significante de produção de IL-1B, produção de IFN-y, e produção de IL- 15, mais particularmente no baço foi visto em seguida à administração das composições de vacina adjuvada da invenção. Em resumo, estes resultados claramente indicam o efeito do presente adjuvante na resposta de citocina e suportam seu efeito na intensificação mediada por célula em vez de resposta imune humoral.
[000202] As vacinas da invenção também mostraram claros efeitos na produção de oocisto fecal. As aves de controle não infectadas não vazam quaisquer oocistos. Em seguida à infecção de E. maxima, houveram significantes reduções de produção de oocistos fecais nos grupos que foram tratados com adjuvantes Pfizer somente. As aves vacinadas em ovo com Eimeria maxima bruta e adjuvante demonstraram muito menos produção de oocistos fecais comparado aos grupos inoculados com preparação de Eimeria maxima bruta somente. Grupos EM.
[000203] Deve ser notado que ainda que proteína 3-1E de E. maxima recombinante purificada tenha sido usada na prática dos experimentos acima mencionados, o uso de antígenos Ea3-1E, EaMIF, e EtMIC2 recombinantes, ou singularmente ou em combinação com 3-1E, ou entre si, ou como qualquer combinação de quaisquer dos mesmos, é também uma modalidade preferida da invenção, e geralmente todos os antígenos de proteína de Eimeria são operáveis na prática da presente invenção, contanto que quando misturados com os adjuvantes da presente invenção. Exemplo 17. Avaliação de Bacterina de cepa J5 de Escherichia coli em Gado
[000204] O objetivo do estudo é avaliar a resposta imunológica no gado ao antígeno de Escherichia coli (cepa J-5) quando administrado em várias novas formulações. A bacterina J5 comercial é vendida como uma vacina preventiva para mastite de coliforme em gado leiteiro e é moderadamente eficaz em sua atual formulação. Antes da vacinação, os animais foram determinados serem de título baixo para anticorpos a E. coli J5, com base respectivamente na análise de amostra de soro de sangue tomada antes da vacinação. Gado de engorda
[000205] As vacinas experimentais foram formuladas usando bacterina J5 de E. coli inativada como o antígeno, e foram produzidas de acordo com o Exemplo 13 acima. Cada grupo de tratamento inicialmente continha sete animais (Tabela 5). Um grupo de tratamento recebeu solução salina (T01) e outro grupo recebeu uma vacina J5 comercial (T02 - bacterina de Escherichia coli de J-5 Enviracor® Pfizer). Os outros grupos de tratamento receberam várias formulações contendo os adjuvantes especificados na Tabela 5. Todas as vacinações foram administradas através de injeção subcutânea nos dias de estudo 0 e 21. O volume de dosagem foi 5 mL. Tabela 5. Grupos de vacina - Gado vacum para engorda
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[000206] Na Tabela 5, QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para carbopol, R para R1005, X para DEAE-dextrana e O para óleo.
[000207] As soluções de matéria-prima foram preparadas como nos Exemplos 1 a 13 acima para o seguinte: E. coli foi dada como cerca de 4 a 5 X 109 organismos por dose tal como determinado por contagem direta através de microscopia óptica. Quil A em água em 50 mg/mL, Colesterol em etanol em 17 mg/mL, DDA em etanol em 17 mg/mL, R1005 em tampão de fosfato a 20 mM em 5 mg/mL, DEAE-dextrana em água em 200 mg/mL, agonista de TLR em tampão de TE em 20 mg/mL e Iscomatriz em água em 5,4 mg/mL. Os componentes individuais foram adicionados v/v na ordem de símbolos de letra da esquerda para a direita. Por exemplo, o volume apropriado de Quil A do QCDC foi adicionado seguido por adição de colesterol, DDA e finalmente carbopol. Quando as formulações continham óleo, os componentes separados foram adicionados, misturados e em seguida emulsificados em uma mistura de óleo mineral Drakeol® 5 LT com ou Span 80 e Tween 80 (QCDO) ou Span 85 e Tween 85 (QCDXO). Drakeol® é um óleo mineral leve comercialmente disponível.
[000208] As amostras de sangue foram coletadas nos dias de estudo 0, 21 e 49 para teste sorológico. Os títulos de anticorpo para E. coli J5 nas amostras de soro foram determinadas por meio de ensaio ELISA indireto específico por J5. Os isotipos de anticorpo de IgG foram determinados com conjugados de anticorpo anti-bovino de carneiro (Betila Labs). Os títulos foram determinados e expressos como suas médias geométricas. Resultados
[000209] Os resultados sorológicos do estudo são mostrados nas Tabelas 6 a 8. Os títulos de anticorpo elevados geralmente são associados com melhor proteção das vacinas. O título de IgG específico por J5 total é mostrado na Tabela 6. Várias das formulações da presente invenção produziram títulos muito maiores do que o produto comercial, ainda que estas formulações tivessem uma quantidade similar de antígeno J5 adicionada. As formulações de QCDO, QCDX, e QCDXO foram especialmente eficazes na indução de uma boa resposta imune neste gado. Tabela 6. Títulos de anticorpo de IgG.
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[000210] Os isotipos de anticorpo de IgG1 específico por J5 foram determinadas. Estes resultados são mostrados na Tabela 7. Novamente, as formulações de QCDO, QCDX, e QCDXO foram especialmente eficazes na indução de uma boa resposta imune neste gado. Estas formulações produziram títulos muito elevados com até mesmo uma única vacinação do que a vacina comercial com duas injeções. Tabela 7. Títulos de anticorpo de IgG1.
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[000211] Os títulos de anticorpo de IgG2 são mostrados na Tabela 8. Este isotipo de anticorpo é frequentemente associado com melhor fagocitose por neutrófilos no leite e proteção para o animal. As formulações de QCDO, QCDX, e QCDXO foram especialmente eficazes na indução de uma boa resposta imune neste gado. Tabela 8. Títulos de anticorpo de IgG2.
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Gado leiteiro
[000212] As vacinas experimentais foram formuladas usando bacterina de J5 de E. coli inativada como o antígeno, e foram produzidas de acordo com o Exemplo 13 acima. Cada grupo de tratamento inicialmente continha sete animais (Tabela 9). Um grupo de tratamento recebeu solução salina (T01) e outro grupo recebeu uma vacina de J5 comercial (T02 - bacterina de Escherichia coli de J-5 Enviracor® Pfizer). Os outros grupos de tratamento receberam várias formulações contendo os adjuvantes especificados na Tabela 9. Todas as vacinações foram administradas através de injeção subcutânea nos dias de estudo 0 e 21. O volume de dosagem foi 5 mL. Tabela 9: Grupos de vacina - Gado leiteiro
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[000213] Na Tabela 9, QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para carbopol, R para R1005, X para DEAE-dextrana, T para agonista de TLR (CpG-ODN), e O para óleo. As soluções de matéria-prima foram preparadas para o seguinte; E. coli foi dada como cerca de 4 a 5 X 109 organismos por dose tal como determinado por contagem direta através de microscopia óptica. Quil A em água em 50 mg/mL, Colesterol em etanol em 17 mg/mL, DDA em etanol em 17 mg/mL, R1005 em tampão de fosfato a 20 mM em 5 mg/mL, DEAE- dextrana em água em 200 mg/mL, agonista de TLR em tampão de TE em 20 mg/mL. Os componentes individuais foram adicionados v/v na ordem de símbolos de letra da esquerda para a direita. Por exemplo, o volume apropriado de Quil A do QCDCR foi adicionado seguido por adição de colesterol, DDA e finalmente carbopol. Quando as formulações continham óleo, os componentes separados foram adicionados, misturados e em seguida emulsificados em uma mistura de óleo mineral Drakeol 5 LT com ou Span 80 e Tween 80 (TXO, QCDO) ou Span 85 e Tween 85. Coleta de sangue
[000214] As amostras de sangue foram coletadas nos dias de estudo 0, 21 e 49 para teste sorológico. Os títulos de anticorpo para E. coli J5 nas amostras de soro foram determinados por meio de ensaio ELISA indireto específico por J5. Os isotipos de anticorpo de IgG foram determinados com conjugados de anticorpo carneiro-anti-bovino (Betila Labs). Os títulos foram determinados e expressos como suas médias geométricas. Resultados
[000215] Os resultados sorológicos do estudo são mostrados na Tabela 10. Títulos de anticorpo elevados geralmente são associados com melhor proteção de vacinas. O título de IgG específico por J5 total é mostrado na Tabela 10. Várias das formulações da invenção produziram títulos muito maiores do que o produto comercial, ainda que estas formulações tivessem uma quantidade similar de antígeno J5 adicionado. As formulações de QCDO, TXO e QCDXO foram especialmente eficazes na indução de uma boa resposta imune neste gado. Tabela 10. Títulos de anticorpo de IgG.
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[000216] Os isotipos de anticorpo de IgG1 específico por J5 foram determinados. Estes resultados são mostrados na Tabela 10. Novamente, as formulações de QCDO, TXO e QCDXO foram especialmente eficazes na indução de uma boa resposta imune neste gado. Estas formulações produziram títulos muito elevados com até mesmo uma única vacinação do que a vacina comercial com duas injeções.
[000217] Este isotipo de anticorpo é frequentemente associado com melhor fagocitose por neutrófilos no leite e proteção para o animal. A formulação QCDXO foi especialmente eficaz na indução de uma boa resposta imune neste gado. Exemplo 18. Vacina de Vírus de Diarréia Viral Bovina Objetivo do Estudo
[000218] Este estudo comparou a segurança, eficácia e proteção cruzada de duas vacinas tipo 1 e tipo 2 do Vírus de Diarreia Viral Bovina (BVDV-1 e BVDV-2 ou BVD-1/2) morto e uma vacina de extrato de BVDV-1 e -2 formulada com adjuvantes da invenção com um controle negativo (solução salina) e dois positivos (uma vacina de BVDV-2 vivo modificado, e uma vacina de BVDV-1/2 morto atualmente disponível) contra um desafio com BVDV-1 em bezerros filhotes. A Tabela 11 apresenta o Esquema de Estudo.
[000219] Este estudo também mostra que os adjuvantes da invenção podem ser usados para distinguir os animais vacinados com as composições de vacina da presente invenção de animais naturalmente expostos ao BVDV. Animais
[000220] O gado vacum para engorda desmamado saudável de qualquer um dos sexos entre 7 e 15 meses de idade que foi soronegativo para BVDV-1 e BVDV-2 foi usado. Tabela 11. Esquema de Estudo
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QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para Carbopol®, R para Bay R1005® Vacinação
[000221] Nos Dias de Estudo 0 e 21, os animais (N = 10/grupo) foram vacinados tal como descrito na Tabela 11. O antígeno (BVDV) foi dado como 5.500 Unidades Relativas de Potência (RU) por dose tal como determinado através de ensaio ELISA. Os bezerros no grupo T01 serviram como o grupo de controle. A eles foram dados uma solução estéril de cloreto de sódio a 0,9%. Aqueles nos grupos T02 até T06 receberam vacinas de BVDV 1/2 experimentais com o adjuvante tal como mostrado na Tabela 11. O grupo T02 recebeu apenas uma vacinação (Dia de Estudo 0). Eles receberam uma vacina de BVDV-2 de vírus vivo modificado (MLV) que não continha nenhum adjuvante. O grupo T03 recebeu uma vacina de BVDV-1/2 de vírus morto contendo uma emulsão de óleo em água a 2,5% (Amphigen) e adjuvantes de Quil A/colesterol (PreZent A®). O grupo T04 recebeu uma vacina de BVDV- 1/2 de vírus morto contendo Quil A/colesterol, DDA e Carbopol. O grupo T05 recebeu uma vacina de BVDV-1/2 de vírus morto contendo Quil A/colesterol, DDA, Carbopol e R1005. O grupo T06 recebeu uma vacina de extrato de título alto de BVDV-1/2 de vírus morto, contendo Quil A colesterol, DDA, e Carbopol no Dia 0, e uma vacina de extrato de título baixo similar no Dia 21. Todos os tratamentos foram administrados subcutaneamente em uma dose de 2 mL única nos Dias 0 e 21, com a exceção do Grupo 2.
[000222] O QCDC +/- R continha 100 μg de Quil A, 100 μg Colesterol, 50 μg DDA, e Carbopol a 0,075% e onde incluía 1.000 μg de R1005 todos por dose de 2 mL tal como previamente descrito. Desafio
[000223] No Dia 42 todos os animais foram desafiados intranasalmente com cerca de 4 mL (aproximadamente 2 mL por narina) de cepa de BVDV-1 não citopático (Cepa NY-1 ; CVB, USDA, Ames, IA) com uma concentração de 5,4 de log10 TCID50 por dose de 5 mL. Observações
[000224] As observações do sítio de injeção foram registradas nos Dias de Estudo 0 (pré-vacinação), 1, 2, 3, 7 e 21 para o primeiro sítio de injeção (pescoço esquerdo). Observações para o segundo sítio de injeção (também pescoço esquerdo) foram registradas nos Dias de Estudo 21 (pré- vacinação), 22, 23, 24, 28 e 35. Todas as reações do sítio de injeção palpáveis foram medidas (L x W x H, cm). Temperaturas retais foram registradas nos Dias de Estudo -1, 0 (pré-vacinação), 1, 2 e 3 para a vacinação primária. As temperaturas para a vacinação de reforço foram registradas nos Dias de Estudo 20, 21 (pré-vacinação), 22, 23 e 24. Amostra de Sangue
[000225] As amostras de sangue foram coletadas de cada animal disponível usando tubos de separação de soro (SST) nos Dias de Estudo -1, 20, 34 e 49. As amostras de sangue foram coletadas usando tubos de EDTA nos Dias de Estudo 33 até 35 (pré-desafio) e 36 até 49. As amostras de sangue foram coletadas usando tubos de preparação celular (CPT) nos Dias de Estudo 34 (pré-desafio) e 36 até 49. Resultados
[000226] A Tabela 12 mostra título de anticorpo de neutralização de soro de média dos mínimos quadrados geométrica (GLSM) para o vírus de BVD pelo ensaio de hemeaglutinação no dia de estudo. Os resultados mostram que os adjuvantes da invenção forneceram um aumento nos títulos contra ambos os BVDV-1 e BVDV-2 como os progressos de estudo. Um título aceitável para o UDSA está acima de um título de 8. Estes dados demonstram títulos acima de 5.000 os quais indicam forte produção de anticorpo que é capaz de deter o vírus vivo quando ele entra no animal com o potencial para infecção e doença. Tabela 12. Título de neutralização de anticorpo de soro
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[000227] A Tabela 13 apresenta dados de leucopenia para dias de estudo 43 a 56. Os resultados de leucopenia no dia de estudo demonstram que a vacina de MLV (T02) preveniu infecção por este vírus específico do desafio. Uma medida de leucopenia é um critério para licença de um produto de MLV pela USDA. No entanto, para um vírus inativado, a leucopenia não é um critério da USDA mas como os dados sugerem, os adjuvantes da invenção tinham leucopenia em até apenas 20% dos animais visto que a maior parte das vacinas de vírus inativado possuem 100% de leucopenia. Isto indica que os adjuvantes da invenção foram capazes de induzir uma resposta de Th1 forte com um antígeno inativado. Isto é difícil de fazer e é raramente visto em produtos inativados. Tabela 13. Leucopenia por Dia de Estudo.
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[000228] A Tabela 14 apresenta os Títulos de Neutralização de Soro no Dia 41 (20 Dias depois da Segunda Vacinação, Pré- Desafio). O vírus vivo modificado é capaz de apenas desenvolver respostas de anticorpo ao vírus exato na vacina. Isto é visto neste Grupo, T02 mostra proteção contra apenas BVDV-2. No entanto, as vacinas inativadas adjuvadas de T03 (PreZent-A), T04 (QCDC), e T05 (QCDCR) geraram uma forte resposta de anticorpo precoce no início da imunidade e ao longo da fase em vida do estudo de animal para um painel sorologicamente diverso de BVDVs. Isto mostra que estes adjuvantes possuem a capacidade de fornecer a segurança e eficácia em um modelo de desafio para proteger o gado em não apenas um desafio homólogo mas um heterólogo. Tabela 14. Títulos de Neutralização de Soro no Dia 41.
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[000229] Atividade Marcadora. Apresentados aqui são dados que mostram que os adjuvantes da invenção podem ser usados para distinguir animais vacinados com composições de vacina da presente invenção de animais naturalmente expostos ao BVDV. Isto pode ser visto por determinação das diferenças de perfil de anticorpo entre produtos de gene estrutural e não estrutural do vírus. A atividade marcadora é demonstrada pelo ciclo de gel por ensaio de radioimunoprecipitação (figura 1). Uma resposta de anticorpo às proteínas NS2/3 e E2 do BVDV é muito pronunciada em um animal vacinado com uma vacina de MLV ou um animal naturalmente exposto à vacina inativada adjuvada de BVDV ou PreZent-A. No entanto, os adjuvantes da invenção demonstraram uma resposta de anticorpo a apenas proteína E2 e não às proteínas NS2/3. Desta forma, um animal vacinado com uma vacina de BVDV inativada compreendendo adjuvantes da invenção pode ser diferenciado entre de ou um animal naturalmente infectado ou um animal vacinado de MLV ou animal vacinado de PreZent-A. Isto seria considerado uma vacina marcadora que é valiosa para erradicação destes tipos de doenças em populações de animal. Exemplo 19. Mycoplasma hyopneumonia em Suíno Antecedentes
[000230] Micoplasma pneumonia de suíno (MPS) ou pneumonia enzoótica é uma doença crônica frequente caracterizada por tosse, retardamento de crescimento, e eficiência alimentar reduzida. O agente etiológico é M. hyopneumoniae; no entanto, a doença de ocorrência natural frequentemente resulta de uma combinação de infecções bacterianas e por micoplasmas.
[000231] MPS causa perda econômica considerável em todas as áreas onde o suíno é criado. Levantamentos conduzidos em vários locais ao longo do mundo indicam que lesões típicas daquelas vistas com MPS ocorrem em 30% a 80% dos suínos de peso de abate. Porque as lesões por micoplasmas podem resolver-se antes dos porcos alcançarem o peso de abate, a incidência atual pode ser elevada. A prevalência de infecção de M. hyopneumoniae em pneumonia suína crônica foi relatada à faixa de 25% a 93%. Os porcos de todas as idades são suscetíveis ao MPS, mas a doença é mais comum no crescimento e execução do suíno. A evidência atual indica que M. hyopneumoniae é transmitida por aerossol ou contato direto com secreções do trato respiratório de suíno infectado. A transmissão de disseminação ao porco durante a lactação é possível. Uma vez estabelecido, o MPS ocorre ano após ano em rebanhos infectados, variando na severidade com tais fatores ambientais como estação, ventilação, e concentração de suíno. Objetivo do Estudo
[000232] Para comparar a eficácia de vacinas de Mycoplasma hyopneumonia formuladas com novos adjuvantes da invenção contra a eficácia de uma série experimental de uma bacterina de Mycoplasma hyopneumonia comercialmente disponível em seguida ao desafio intratraqueal com um homogeneizado de pulmão de M. hyopneumoniae virulento. Animais
[000233] Sessenta e seis (66) porcos mestiços clinicamente saudáveis em aproximadamente 17 dias de idade sem uma história de doença causada por M. hyopneumoniae e PRRSV, ou vacinação contra os mesmos organismos foram usados no estudo. Antes do embarque ao sítio de estudo, e durante 2 dias após a chegada, os porcos foram tratados com Naxcel® intramuscularmente na pata traseira, como por direções de rótulo, para prevenir doença relacionada ao estresse tal como Streptococcus suis. Os animais foram alocados para os tratamentos e engaiolados de acordo com um plano de aleatorização. O esquema de estudo é mostrado na Tabela 15. Tabela 15. Esquema Experimental
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Produtos Veterinários Investigacionais (IVP)
[000234] Os antígenos e Produtos Veterinários Investigacionais (IVP) são mostrados na Tabela 16. As vacinas para Grupos de Tratamento T02, T03, e T04 (todos exceto T05) foram preparadas de acordo com o Exemplo 13 por uso das concentrações de componentes mostrados na Tabela 16 abaixo. Os componentes foram adicionados na ordem listada na tabela.
[000235] Um extensor de solução salina foi adicionado a um vaso e homogenização foi iniciada e continuada ao longo do procedimento de preparação. M. hyopneumoniae inativado foi preparado de um volume misturado de 75 litros de fermentado por 800 litros de produto formulado final e foi adicionado a uma concentração de 0,09375 ml por dose. A Quil A foi adicionada à concentração listada na Tabela 16. A solução de colesterol/etanol foi em seguida adicionada. A solução de DDA/etanol foi adicionada, seguido pela adição da solução de glicolipídeo de Bay R1005. O carbopol foi em seguida adicionado e a solução foi conduzida ao volume final com o extensor de solução salina.
[000236] A vacina para Grupo de Tratamento T05 (Formulação de Vacina com base em Amphigen) foi o produto comercialmente disponível Respisure® (Pfizer, Inc). Tabela 16. Produtos Veterinários Investigacionais (IVP)
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Vacinação
[000237] Os animais no grupo de tratamento NTX não foram vacinados ou desafiados. Em aproximadamente 3 semanas de idade (Dia 0 - pescoço direito) e 5 semanas de idade (Dia 14 - pescoço esquerdo), os animais em T01, T02, T03, T04 e T05 foram vacinados intramuscularmente, 2 mL por dose, por um indivíduo qualificado oculto ao grupo de tratamento. Material de Desafio
[000238] Os animais em T01 até T05 foram desafiados intratraquealmente 3 semanas em seguida à segunda vacinação (em aproximadamente 8 semanas de idade - Dia de Estudo 35). Os animais foram desafiados com uma dose de 5 mL de uma diluição de 1:50 em meio Friis de um homogeneizado de pulmão congelado a 10% de cepa 11 de M. hyo (LI36). Amostra de Sangue
[000239] No Dia -1 ou 0 (antes da 1a vacinação), Dia 13 ou 14 (antes da 2a vacinação), Dia 34 ou 35 (antes do desafio) e Dia 63 (na necropsia), as amostras de sangue (aproximadamente 5 a 10 mL em tubos separadores de soro) foram coletadas de todos os porcos e testadas quanto à sorologia de M. hyopneumoniae (ELISA - IDEXX). Peso
[000240] Todos os animais foram pesados na chegada para propósitos de distribuição, no Dia 34 ou 35 (antes do desafio), e no Dia 62 ou 63 (antes da necropsia). Necropsia
[000241] No Dia 63, todos os animais sobreviventes foram eutanasiados de acordo com procedimentos específicos por sítio. Os pulmões foram avaliados grosseiramente quanto às lesões características atribuíveis a uma infecção M. hyopneumoniae e foi dado um escore para as lesões atribuídas ao desafio de M. hyopneumoniae. Os escores de lesões de pulmão foram registrados como a porcentagem de lesões de pulmão para cada lobo pulmonar. A porcentagem de consolidação para cada lobo (cranial esquerdo, central esquerdo, caudal esquerdo, cranial direito, central direito, caudal direito, e acessórios foram classificados como um valor atual entre 0 a 100%. A porcentagem para cada lobo pulmonar foi usada em uma fórmula ponderada para cálculo da porcentagem total do pulmão com lesões. Seis (6) animais NTX foram necropsiados no Dia 34 ou 35 antes do desafio e seus pulmões classificados quanto a lesões. Escores de Lesão Pulmonar
[000242] A porcentagem de pulmão total com lesões foi calculada usando a seguinte fórmula: Porcentagem de pulmão total com lesões = 100 x {(0,10 x cranial esquerdo) + (0,10 x central esquerdo) + (0,25 x caudal esquerdo) + (0,10 x cranial direito) + (0,10 x central direito) + (0,25 x caudal direito) + (0,10 x acessórios)}. A transformação da raiz quadrada de arcsina foi aplicada à porcentagem de pulmão total com lesões antes da análise. As lesões de pulmão transformado foram analisadas com um modelo misto linear geral. As combinações lineares das estimativas de parâmetro foram usadas em um contraste prioritário depois do teste para efeito de tratamento. Processos de regressão dos mínimos quadrados transformados de uma porcentagem significante (P<0,10) de pulmão total com lesões, seus erros padrões, e seus intervalos de confiança de 90% foram calculados assim como os mínimos e máximos. Resultados
[000243] Tal como indicado pelos resultados da Tabela 17 abaixo, os adjuvantes da invenção desempenharam igualmente assim como o grupo de tratamento adjuvado por óleo T05 que continha o adjuvante Amphigen®. Tipicamente, um escore de lesão pulmonar de sob 3 é considerado possuir eficácia conferida pelo tratamento de vacina. As combinações dos adjuvantes da invenção alcançam totalmente estes critérios e QCDCR desempenhou o melhor em escore e faixa entre animais individuais. Tabela 17. Porcentagem de Pulmão com Lesões
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Exemplo 20. Vírus de Influenza Aviária Felina (FAIV)
[000244] Este estudo avaliou a eficácia em gatos de uma vacina de influenza usando um adjuvante da invenção por desafio com uma cepa de vírus de influenza aviária virulenta. Processos e Resultados
[000245] Antes da vacinação, os animais foram determinados serem negativos para tanto vírus e anticorpos de influenza quanto vírus de influenza, com base respectivamente nos esfregões orofaríngeos e na análise de amostra de sangue de soro feita antes da vacinação.
[000246] As vacinas experimentais foram formuladas usando influenza aviária patogênica inativada e hemaglutinina purificada (HA). Cada grupo de tratamento inicialmente continha seis animais (Tabela 18). Dois grupos de tratamento receberam as vacinas de FAIV experimentais (antígeno de vacina T01 era proteína H5 HA purificada; e antígeno de vacina T02 era cepa H5N2 inativada), um grupo de tratamento recebeu uma vacina de cepa de vírus H5N1 modificado inativado (T03), um grupo de controle de placebo recebeu uma vacina apenas adjuvante (T04) e um grupo de controle negativo recebendo solução salina apenas (T05). Todas as vacinações foram administradas através de injeção subcutânea nos dias de estudo 0 e 21. O volume de dosagem era 1 mL. Em seguida à vacinação, os animais foram observados constantemente até que eles se recuperaram e foram capazes de sentar-se retos para assegurar que não houveram reações adversas. As observações em aproximadamente uma hora após a vacinação foram registradas e qualquer outra complicação observada em seguida à vacinação tinha sido registrada.
[000247] A composição adjuvante foi previamente descrita acima pelo exemplo QCDC usando Quil A (20 μg), Colesterol, (20 μg), DDA (10 μg) e Carbopol (0,05%) por dose. O antígeno é vírus integral inativado ou proteína H5 HA purificada.
[000248] Os animais foram avaliados quanto às reações do sítio de injeção e resposta sorológica à vacina. Três animais (dois em H5N2 inativada por T02, e um em solução salina T05) foram eutanasiados devido à hiperoxalúria congênita antes do desafio. No dia de estudo 49, todos os gatos sobreviventes foram desafiados por meio da rotina intratraqueal com cepa H5N1 A/Vietnã/1194/04 para avaliar a eficácia dos candidatos de vacina. Os animais foram desafiados com 5,0 mL de material contendo 105 TCID50, que foi liberado exatamente acima da bifurcação usando um pequeno cateter que foi conduzido na traqueia usando um traqueoscópio. Os animais foram observados e testados durante cinco dias depois do desafio. No término da fase animal (dia de estudo 54), todos os animais sobreviventes foram eutanasiados e uma necropsia desempenhada em cada um. Tabela 18. Grupos de Vacina
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[000249] As amostras de sangue foram coletadas nos dias de estudo -14 pré-vacinação, 0, 21 e 49 para teste sorológico. Nos dias de estudo 49 e 54, as amostras de sangue foram coletadas para teste virológico. No dia de estudo 42, uma amostra de sangue não escalada foi tirada de todos os animais sobreviventes para testar a função renal nos soros antes do desafio.
[000250] Os esfregões orofaríngeos foram coletados de todos os animais nos dias de estudo -14, 49 antes do desafio e 50 até 54. Esfregões retais foram coletados de todos os animais nos dias de estudo 49 antes do desafio e dias 50 até 54. A coleta dos esfregões foi feita exatamente antes do desafio no dia de estudo 49.
[000251] Durante a necropsia, todos os lobos pulmonares foram assepticamente removidos, pesados e avaliados grosseiramente quanto às lesões características atribuíveis à infecção de FAIV. As porcentagens foram usadas para identificar o nível de consolidação pulmonar. O pulmão esquerdo foi fixado com formalina tamponada neutra a 10% para histopatologia. O pulmão direito foi coletado e testado quanto ao teste virológico. Além dos pulmões, uma amostra renal e quaisquer tecidos com grossa patologia foi também testada e armazenada em formalina tamponada neutra a 10% quanto à histopatologia.
[000252] Os títulos virais nas amostras de sangue, esfregões orofaríngeos e retais, e em amostras de tecido pulmonar foram determinados por meio de uma PCR TaqMan específica por H5N1. Resumidamente, o RNA foi isolado usando um sistema MagnaPure LC com o kit de isolamento de ácido nucléico total MagnaPure LC (Roche Diagnostics; Almere, The Netherlands), e vírus de influenza A foi detectado pelo uso de um ensaio de RT-PCR em tempo real. Os dados foram expressos como Unidades de Diluição de Controle (CDU). As CDU’s foram determinadas de uma curva padrão produzidas de uma matéria-prima de vírus, que foi consecutivamente diluída, com cada diluição passando por extração de ácido nucléico e amplificação de PCR TaqMan da mesma maneira como amostras de teste.
[000253] Os esfregões orofaríngeos positivos de RT-PCR e amostras de tecido pulmonar foram também analisados por isolamento de vírus e titulação nas células renais caninas Madine Darby (MDCK). Os resultados foram expressos como doses infecciosas de cultura de tecido a 50% de log10 por mililitro ou grama de amostra (log10 TCID50/mL ou log10TCID50/g).
[000254] As amostras de plasma foram analisadas por neutralização de vírus e por inibição de hemaglutinação. Para o ensaio de inibição de hemaglutinação (HI), uma suspensão de vírus de cepa de influenza do Vietnã 1194/04 (H5N1, classe 1) ou Indonésia 05/2005 (H5N1, classe 2) foi incubada com diluições em série (2 vezes) de amostra de soro pré-tratada com filtrado de cólera (obtido de culturas de Vibrio cholerae). Subsequentemente, os eritrócitos foram adicionados às diluições e depois da incubação, a diluição máxima dos agentes mostrando completa inibição de hemaglutinação foi definida como o título de HI.
[000255] O ensaio de neutralização de vírus (VN) foi com base em uma titulação de ponto final dos soros. Resumidamente, uma quantidade constante de vírus foi misturada com uma diluição em série (2 vezes) de uma amostra de soro. A neutralização de vírus foi lida usando células de MDCK como células indicadoras e foi visualizada por aglutinação de eritrócito. Os títulos VN foram classificados por tomada da diluição mais alta do soro em que 50% das culturas celulares inoculadas mostraram aglutinação de eritrócito.
[000256] O pulmão esquerdo foi coletado em necropsia e fixado com formalina tamponada neutra a 10% para histopatologia. Depois da fixação, os tecidos foram incrustados na parafina, seções de tecido foram preparadas e tingidas com hematoxilina e eosina para exame histológico. Descrição e grau de mudanças patológicas observadas foram registrados. Resultados
[000257] Nenhum dos animais nos cincos grupos de tratamento mostraram qualquer dor ou tumefação no sítio de injeção em seguida a primeira e segunda vacinação. Além disso, nenhuma anormalidade de pele foi registrada nos sítios de injeção. Em seguida às vacinações e antes do desafio, não houve nenhuma diferença significante no nível de significância 0,1 nas temperaturas corporais entre os tratamentos através de análise de modelo misto linear. Um animal T01 estava febril (> 40°C) antes da primeira vacinação no Dia 0 e durante vários dias posteriores. Os aumentos de temperatura corporal esporádicos em animais individuais a 40°C ou acima foram registrados depois de vacinações (Dias 0 e 21). Nenhuma saúde anormal relacionada à vacinação foi observada durante o estudo. Três animais (dois em T02- H5N2, e um em solução salina T05) foram eutanasiados devido à hiperoxalúria congênita antes do desafio. Vários animais de todos os tratamentos apresentados com complicações de ferimento em seguida à implantação do registrador de temperatura. Nenhum tratamento concorrente foi administrado do dia 0 até a conclusão do estudo.
[000258] Os animais T01, T02 e T03 vacinados mostraram sinais clínicos menores e nenhuma mortalidade depois do desafio comparado para controlar animais T04 e T05. Em T01, um animal mostrou depressão e esforço respiratório aumentado dois dias depois do desafio. Nenhum dos cinco animais T01 restantes mostrou qualquer saúde anormal depois do desafio. Em T02 (n=4) e T03 (n=6), todos os animais permaneceram saudáveis em seguida ao desafio. Em T04 (n=6), os primeiros sinais clínicos anormais (depressão e esforço respiratório aumentado) foram vistos em dois animais dois dias depois do desafio. Três dias depois do desafio, todos os seis animais em T04 estavam deprimidos e mostraram um aumento no esforço respiratório. Por conseguinte, dois animais tinham que ser eutanasiados por razões de bem-estar. Quatro dias depois do desafio (Dia 53), um animal foi encontrado morto e os três animais T04 restantes exibiram depressão, esforço respiratório aumentado, terceira protrusão de pálpebra e descarga nasal, e foram eutanasiados por razões de bem-estar. Em T05 (n=5), os primeiros sinais clínicos anormais de depressão e esforço respiratório aumentado foram vistos em um animal um dia depois do desafio. Dois dias depois do desafio, mais dois animais começaram mostrar aqueles sinais. Três dias depois do desafio, um animal foi encontrado morto e os quatro animais restantes exibiram depressão, esforço respiratório aumentado e protrusão da terceira pálpebra. Um animal foi subsequentemente eutanasiado por razões de bem-estar. Quatro dias depois do desafio, o esforço respiratório tinha piorado em um dos três animais restantes e outro animal adicionalmente mostrou descarga nasal. Todos os três animais restantes foram eutanasiados por razões de bem-estar quatro dias depois do desafio (Dia 53).
[000259] Em seguida ao desafio, temperaturas corporais médias permaneceram abaixo de 40,0° C em animais vacinados (T01, T02 e T03). As temperaturas médias de animais de controle (T04 e T05) elevaram a > 40,0°C partindo um dia depois do desafio. As diferenças nas temperaturas corporais médias entre tratamentos foram significantes (p=0,0001) por análise de modelo misto linear. Os dados de animal individual mostraram que em uma minoria de animais T01, T02 e T03, as temperaturas corporais elevaram a 40,0°C e acima em pontos do tempo esporádicos no Dia 53. Em T01, dois animais estavam febris (faixa 40,0 a 40,1°C) em um ponto do tempo. Em T02, dois animais estavam febris (faixa 40,0 a 40,3°C) em um e três pontos do tempo, respectivamente. Em T03, um animal estava febril (faixa 40,0 a 40,3°C) em três pontos do tempo. Em T04 e T05 todos os animais estavam febris durante pelo menos doze horas entre os Dias 50 para 51.
[000260] Os títulos de anticorpo de HI para cepas de influenza do Vietnã 1194/04 (H5N1, classe 1) e Indonésia 05/2005 (H5N1, classe 2) foram determinados antes da primeira e segunda vacinação e antes do desafio. O limite mais baixo de detecção foi 5. Antes da vacinação, os títulos em todos os 5 grupos de tratamento estavam abaixo do limite mais baixo de 5. Em seguida à vacinação, todos os animais vacinados (T01, T02 e T03) desenvolveram títulos de anticorpo de HI acima de 5 e mostraram pelo menos um aumento de seis vezes nos títulos comparados aos valores de pré-vacinação. Em T01 e T03, os títulos contra Vietnã 1194/04 variaram de 20 a 160 em seguida à primeira vacinação, e 140 a 960 em seguida à segunda vacinação. Em T02, os títulos contra Vietnã 1194/04 eram menores do que aqueles vistos em T01 e T03, variando de 5 a 30 em seguida à primeira vacinação, e 5 a 70 em seguida à segunda vacinação. Os títulos de anticorpo de HI contra Indonésia 05/2005 foram similares àqueles contra Vietnã 1194/04.
[000261] As amostras de plasma tiradas antes e depois do desafio foram testadas por RT-PCR em tempo real específico por H5N1 para carga viral. Todos os animais tinham amostras negativas de vírus antes do desafio. Depois do desafio, nenhum vírus foi detectado no plasma de animais T01 e T03. Em contraste, 25% (1 de 4) de animais T02, 67% (4 de 6) de animais T04 e 60% (3 de 5) de animais T05 eram positivos de vírus em plasma depois do desafio. As diferenças entre os tratamentos eram significantes (p=0,0247) por análise de modelo misto linear.
[000262] Vazamento de vírus depois do desafio foi avaliado em amostras de esfregão de garganta por RT-PCR em tempo real e titulação de vírus, e em amostras de esfregão retal por RT-PCR em tempo real. Nenhum vazamento viral da garganta foi detectado em animais T01 depois do desafio. Em T02, todos os quatro animais (100%) vazaram vírus em um ponto depois do desafio. Em T03, no total de dois de seis animais (33%) vazaram vírus depois do desafio. Em T04, três de seis animais (50%) vazaram vírus depois do desafio. Em T05, quatro de cinco animais (80%) vazaram vírus depois do desafio. Nenhuma amostra foi tomada de animais T04 e T05 cinco dias depois do desafio, uma vez que todos os animais foram mortos, por conseguinte. Para o propósito de análise estatística, no entanto, os animais que morreram ou foram eutanasiados antes do último dia de estudo tiveram seus últimos resultados de teste empregados ao último dia de estudo.
[000263] As amostras de garganta com um resultado positivo de RT- PCR (> 1,8 CDU) foram também usadas nos ensaios de titulação de vírus. A titulação de vírus confirmou que todas as amostras positivas de RT-PCR continham vírus de influenza infeccioso (dados não mostrados). Os títulos de vírus infeccioso eram menores em animais vacinados (T02 e T03) do que animais de controle (T04 e T05). Estas diferenças foram significantes três dias depois do desafio quando comparando T02 ou T03 com T04, e três, quatro e cinco dias depois do desafio quando comparando T02 ou T03 com T05. Os títulos em animais T02 e T03 foram 0,5 de log10 TCID50. Os títulos vistos em T04 variaram de 2,3 a 4,3 de log10 TCID50. Os títulos vistos em T05 variaram de 1,5 a 3,8 de log10 TCID50.
[000264] Vazamento em fezes tal como avaliado por esfregões retais foi detectado em todos os grupos de tratamento exceto T02 três ou quatro dias após o desafio. As quantidades de vírus detectadas por RT- PCR eram entre 2,2 a 2,3 de log10 CDU em T01, 3,2 de log10 CDU em T03, 2,0 a 2,7 de log10 CDU em T04, e 2,2 de log10 CDU em T05. Não houve nenhuma diferença significante no nível de significância 0,1 entre tratamentos em qualquer dos dias depois do desafio.
[000265] A patologia de pulmão foi menos severa em animais vacinados (T01, T02 e T03) do que em de controle (T04 e T05). Todos os animais vacinados apresentados com uma pneumonia broncointersticial subaguda multifocal suave. Os animais de controle mostraram ou uma pneumonia broncointersticial subaguda moderada (dois animais T04 e um animal T05) ou severa (quatro animais T04 e quatro T05) com uma distribuição multifocal em todos exceto dois animais de controle que (um animal T04 e um T05) mostraram uma distribuição difusa. O pulmão integral foi avaliado quanto ao nível de consolidação, que foi expresso em consolidação em porcentagem do tecido pulmonar total. De acordo com as descobertas de patologia pulmonar, a consolidação em porcentagem foi significantemente mais baixa em animais vacinados (T01, T02 e T03) do que em animais de controle (T04 e T05).
[000266] A carga viral em tecido pulmonar coletada no tempo de morte ou eutanásia foi avaliada por titulação de vírus e RT-PCR de H5N1. O tecido pulmonar de animais vacinados (T01, T02 e T03) tinha títulos de vírus médios significantemente menores do que aqueles de controles (T04 e T05). Não houve nenhuma diferença significante entre títulos médios no tecido pulmonar de animais vacinados (T01, T02 e T03). A análise por RT-PCR produziu os mesmos resultados.
[000267] Em seguida ao desafio com uma cepa de influenza aviária de H5N1 altamente patogênico, sinais clínicos incluindo febre, mortalidades, viremia, vazamento viral de garganta e em fezes, infecção viral do pulmão e patologia de pulmão, incluindo consolidação, foram observados em animais de controle que tinham recebido ou adjuvante (T04) ou solução salina (T05).
[000268] A vacinação com proteína de H5 HA purificada (T01) preveniu viremia, vazamento viral da garganta, e mortalidade em seis gatos jovens em seguida ao desafio com uma cepa de influenza aviária de H5N1 altamente patogênico. Além disso, vacinação com proteína de H5 HA purificada (T01) reduziu sinais clínicos, incluindo febre, carga viral em pulmão e patologia de pulmão, incluindo consolidação.
[000269] A vacinação com uma cepa de H5N2 inativada (T02) preveniu sinais clínicos, vazamento viral em fezes, e mortalidade em quatro gatos jovens em seguida ao desafio com uma cepa de influenza aviária de H5N1 altamente patogênico. Além disso, a vacinação com a cepa de H5N2 inativada (T02) reduziu viremia, febre, vazamento viral da garganta, carga viral em pulmão e patologia de pulmão, incluindo consolidação.
[000270] A vacinação com uma cepa de H5N1 inativada (T03) preveniu sinais clínicos, viremia e mortalidade em seis gatos jovens em seguida ao desafio com uma cepa de influenza aviária de H5N1 altamente patogênico. Além disso, a vacinação com a cepa de H5N1 inativada (T03) reduziu a febre, vazamento viral da garganta, carga viral em pulmão e patologia de pulmão, incluindo consolidação. Sumário
[000271] Nenhuma reação do sítio de injeção foi observada com as vacinas formuladas com antígeno de HA ou inativado ou purificado com adjuvante de QC/DC. As vacinas forneceram uma proteção completa de doença clínica e mortalidade em gatos vacinados, carga de vírus significantemente reduzida em sangue e tecidos, e vazamento de vírus significantemente reduzido. Exemplo 21. Câncer Antecedentes
[000272] Este estudo foi conduzido nos ratos imunodeficientes e imunocompetentes usando células de carcinoma hepatocelular de humano e rato para gerar modelos heterotópico e ortotópico. Animais
[000273] Os ratos machos nus (Crl: NIH-rnu) de 6 a 8 semanas de idade foram adquiridos de Charles River (Wilmington MA). Os ratos foram alojados em pares em gaiolas micro-isoladoras de policarbonato e providos com água de osmose reversa à vontade e comida de rato padrão irradiada; toda água e palha foram autoclavados. Os pesos corporais foram registrados duas vezes semanalmente; os animais foram mantidos durante aproximadamente 7 semanas e eutanasiados por inalação de CO2 no término do experimento.
[000274] O esquema experimental incorporou duas fases. Na fase I, os ratos foram aleatorizados a dois grupos com base no seu peso corporal. Os ratos no grupo 1 não receberam nenhuma injeção de célula de tumor, enquanto os ratos no grupo 2 receberam injeção subcutânea de células de tumor. Em três semanas em seguida à injeção de tumor, os ratos no grupo 2 foram aleatorizados (com base no tamanho de tumor e taxa tomada - veja Tabela 19) a dois grupos para a Fase II, um dos quais incluía dois subgrupos: 1) controles portando não tumor que receberam solução salina (o Grupo de Controle); 2) controles portando tumor tratado com adjuvante apenas (o Grupo de Tumor); e 3) pacientes portando tumor (Tratado por Tumor) dosado com vacina (duas injeções subcutâneas duas semanas entre si). Todos os animais foram necropsiados em 14 dias após a segunda administração de vacina. Vacina
[000275] A vacina foi administrada através de injeção subcutânea em 0,2 ml por dose. Tabela 19. Grupos de Vacina
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[000276] QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para Carbopol®, R para Bay R1005®, PBS para solução salina tamponada por fosfato. Preparação de Vacina
[000277] As vacinas foram preparadas usando Quil-A (20 ug/dose), Colesterol (20 ug/dose), DDA (10 ug/dose), Carbopol (0,05%) com ou sem glicolipídeo Bay R1005® (1.000 ug/dose) e antígeno. A composição foi misturada usando um homogenizador e adicionada na ordem de adição tal como estabelecido acima. Preparação de Antígeno
[000278] As células de HepG2 (clone HB-8065) foram obtidas da Coleção de Cultura do Tipo Americano (ATCC, Manassas, VA). HepG2 é uma linhagem de células perpétuas que foi derivada do tecido de fígado de um homem Caucasiano de 15 anos de idade com um carcinoma hepatocelular bem diferenciado. As células foram expandidas sob condições de cultura celular padrões, e preparadas para injeção em uma concentração de 1 x 107 células/mL em Matrigel. Cada rato foi injetado com 0,5 ml de suspensão celular, subcutaneamente no sítio da segunda teta. Medições
[000279] O tamanho de tumor foi medido duas vezes semanalmente ao longo do estudo pelo método calibrador onde volume em cm3 = {[(W(mm) x W(mm)]/2 x L(mm)}/1000. Sangue foi coletado por sangria retro-orbital para medições de produto químico e biomarcador de soro. Os animais foram ligeiramente anestesiados durante o procedimento de sangria com CO2/O2. Os pontos finais de produto químico foram analisados usando um auto analisador Hitachi 917 (Roche, Indianápolis, EM). Sangue terminal foi tirado sob anestesia de CO2 por punção cardíaca. Os pontos finais de soro foram avaliados usando os ensaios ELISA comerciais: Proteína Alfa-Feto (R & D Systems, Minneapolis MN) e Albumina Humana (Bethyl Laboratories, Montgomery TX). Os animais foram eutanasiados por inalação de CO2. Os tumores foram excisados, pesados e colocados em formalina para histologia.
[000280] O teste T não pareado do estudante foi usado para comparar vários parâmetros entre ratos do grupo tratado e de controle. Todos os valores são expressos como média ± SD, e um valor p <0,05 foi considerado ser estatisticamente significante. Resultados
[000281] As medições de peso corporal foram corrigidas por subtração do peso de tumor (com base nos dados de volume e a admissão que 1 cm3 = 1 g). Os dados foram analisados de dois modos: por grupo de tratamento, e por animais portando tumor ou não tumor. Quando comparando pesos corporais em animais portando tumor a animais portando não tumor, houve uma diferença significante entre os grupos no ponto do tempo terminal; não houve nenhuma diferença na linha de base. Ainda que os pesos corporais não fossem significantemente diferentes quando comparando com grupo de tratamento provavelmente devido a curta duração do estudo, houve uma tendência apreciável para peso corporal diminuído em ambos os grupos portando tumor relativos aos controles e uma tendência positiva para recuperação em animais recebendo vacina quando comparando os animais portando tumor recebendo veículo sem antígeno (Tabela 20). Também, houve também uma correlação razoável entre mudança em porcentagem no peso corporal durante a duração do experimento e volume de tumor (r2 = 0,72) ou peso (excisado) em término (r2 = 0,73). Tabela 20. Mudança no peso corporal durante o tempo entre grupos experimentais. As áreas sombreadas indicam dados quando a vacina foi administrada.
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Tamanho de tumor
[000282] O tamanho de tumor nos ratos de controle foi comparado ao tamanho de tumor nos ratos tratados por vacina durante um período de quatro semanas. Ainda que nenhuma diferença estatisticamente significante fosse constatada entre grupos comparados (devido à grande variação no tamanho de tumor), houve uma forte tendência para diminuição de volume de tumor total (Tabela 21), e também peso de tumor excisado médio diminuído (Tabela 22) nos ratos que receberam a vacina. Tabela 21. Mudança no tamanho de tumor entre o grupo tratado por veículo (Tumor) e grupo tratado com vacina (Tratado por tumor). As áreas sombreadas indicam dados quando a vacina foi administrada.
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Tabela 22. Diferença em peso de tumor em necropsia.
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Ensaios de Soro
[000283] Proteína alfa-feto humana (AFP) foi medida através de ELISA em vários pontos do tempo durante o estudo. Estes dados foram usados junto com dados de peso corporal e tamanho de tumor para aleatorizar animais aos grupos de tratamento. Os dados deste estudo e dados históricos indicam que AFP é apenas detectável em animais portando tumor. A comparação de dados de AFP longitudinal no controle de tumor e grupos tratados indica que AFP diminuiu nos animais tratados em seguida à primeira injeção de vacina, e foi muito mais baixo em ratos tratados relativos aos controles portando tumor no término do estudo; 4,78 ± 3,2 ng/mL em veículo tratado relativo a 0,97 ± 2,5 ng/mL nos ratos tratados por vacina, respectivamente. Adicionalmente, AFP demonstrou uma correlação a tanto volume de tumor quanto peso de tumor excisado.
[000284] A albumina humana (hALB) foi medida através de ELISA em vários pontos do tempo durante o estudo. Os dados deste estudo e dados históricos indicam que hALB é apenas detectável em animais portando tumor. Comparação de dados de hALB no controle de tumor e grupos tratados indicam que hALB foi mais baixo em ratos tratados relativo aos controles portando tumor no término de estudo (dados não mostrados). Adicionalmente, hALB, similar ao AFP, demonstraram uma correlação a tanto volume de tumor quanto peso de tumor excisado (dados não mostrados).
[000285] Um painel químico de soro de núcleo foi ensaiado como vários pontos do tempo ao longo do estudo. O painel incluía: AST, ALT, Colesterol, fosfatase alcalina, GGT, BUN, glicose, creatinina, bilirrubina total, proteína total, albumina, globulina e minerais Ca, P, Na, K e Cl. Similares ao peso corporal, dados foram analisados de dois modos: por grupo de tratamento e por animais portando tumor ou não tumor. Os pontos finais apenas onde as diferenças foram observadas foram: AST, ALT e colesterol. Em ambas as comparações, não houve nenhuma diferença significante entre grupos no ponto do tempo de linha de base (dados não mostrados). Quando comparando os índices químicos em animais portando tumor a animais portando não tumor, houve uma diferença significante entre os grupos no ponto do tempo terminal com elevações em AST, ALT e colesterol nos animais portando tumor (dados não mostrados). Conclusão
[000286] Tomados juntos os dados demonstram que a carga de tumor foi reduzida em animais tratados com a vacina preparada contra a linhagem de células de tumor de HepG2, relativa para controlar grupo portando tumor recebendo veículo. Exemplo 22. CpG Antecedentes
[000287] Os adjuvantes descritos aqui são uma plataforma adjuvante de vacina potente que pode ser intensificada por uso de um ORN/ODN (CpG) para reforçar a resposta imune pelo uso dos adjuvantes como um sistema de liberação para o CpG. Materiais e Métodos
[000288] Camundongos C57Bl/6 femininos (n=10 por grupo) com um peso corporal de cerca de 18 a 20g foram usados no estudo. Eles foram imunizados por meio de injeção intramuscular (IM) no músculo anterior tibial esquerdo com um volume total de 50μl nos dias de estudo 0, 14 e 21. Dose de reagente
[000289] Uma dose da composição compreendia, em várias combinações, um ou mais dos seguintes componentes: Tampão: NaH2PO4.2H20 (229,32 mg/L), NaCl (1168,00 mg/L) e Na2HPO4 (1144,00 mg/L), dissolvidos em WFI e filtrados estéreis com um filtro de 0,1 μm. Ovalbumina (OVA - Antígeno): 10μg CpG ODN: 10μg Colesterol: 1μg Quil A: 1 μg DDA: 0,5 μg Carbopol: 0,0375% R1005: 50 μg Preparação de Vacina
[000290] Tampão foi colocado em um frasco de 50 ml com barra de agitação e agitado em uma velocidade constante ao longo de todas as seguintes etapas. Os componentes foram adicionados na seguinte ordem: antígeno (OVA); CPG ODN; Quil A; colesterol (gota a gota); DDA (gota a gota); Carbopol®; e Bay R1005®. A composição foi agitada em temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) durante um mínimo de 30 minutos enquanto protegida da luz por cobertura com folha metálica. A solução foi forçada através de uma agulha de 25G em uma seringa para quebrar quaisquer grandes partículas flutuantes para obter uma suspensão uniforme (turva) e transferida aos frascos de vidro estéreis para armazenagem. Coleta de Amostra
[000291] As seguintes amostras foram coletadas: Plasma: 4 semanas depois da primeira vacinação (1 semana depois da segunda vacinação de reforço) Linfócito T citotóxico (CTL) (6 semanas depois da primeira vacinação (3 semanas depois da segunda vacinação de reforço) Secreção de citocina em sobrenadante (4 semanas depois da primeira vacinação Sobrenadante de 24 horas (IL-2, IL-4, IL-10, TNF Sobrenadante de 72 horas (IFN-g Tetrâmero (4 semanas depois da primeira vacinação Células T produzindo citocina (6 semanas depois da primeira vacinação
[000292] Os resultados são fornecidos como um escore relativo que para cada adjuvante mostra o efeito do adjuvante. Os pontos finais são uma escala relativa com base na soma das respostas de T Citotóxico - Linfócito individual. Resultados e Discussão
[000293] Tal como apresentado na Tabela 23, QCDCR mais OVA produziu respostas de CTL mais fortes do que seus subcomponentes, no entanto respostas totais foram lentas (<20%). A combinação de QCDCR ou seus subcomponentes com CPG significantemente melhorou as respostas de CTL específicas por OVA. QCDCR/CPG total mais OVA produziu a resposta de CTL mais alta, no entanto, não houve nenhuma diferença significante nas respostas entre este grupo e colesterol/CPG mais OVA (em relação de 25:1). Os sobrenadantes de cultura de esplenócitos estimulados com OVA (1 mg/mL) foram ensaiados quanto às citocinas através de ELISA. QCDCR sozinho ou seus subcomponentes produziram apenas resposta de citocinas muito fracas. A combinação de QCDCR ou de seus subcomponentes com secreção intensificada por CPG de IL-2 e IFN-g específico por antígeno (citocinas polarizadas por Th1). QCDCR e CpG são iguais em potência para aumento de respostas imunes celulares. A combinação dos dois mostra sinergia. Quando os subcomponentes de QCDCR foram analisados com CpG, as combinações com Quil A produziram as melhores respostas seguido por inclusão de colesterol com CpG. Tabela 23. Respostas de CTL Relativas
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QC é a abreviação para QuilA/colesterol, Ch para colesterol, D para DDA, C para Carbopol®, R para Bay R1005® Exemplo 23. Coronavirus canino (CCV) Escopo
[000294] Um modelo de murino foi empregado usando coronavírus canino (CCV) e novos adjuvantes de combinação para avaliar o desempenho de adjuvante com o dado componente antigênico. Animais
[000295] Dez camundongos CF-1 por grupo de tratamento foram administrados 0,2 mL subcutaneamente por animal de cada grupo de tratamento. Grupos de tratamento
[000296] As formulações de teste mostradas na Tabela 24 foram preparadas como volumes de dose de área de 1,0 mL com as concentrações dadas abaixo. Apenas 0,2 mL da vacina foi administrado a cada camundongo. Tabela 24. Formulações de Teste.
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Preparação de Vacina
[000297] A preparação de vacina para os adjuvantes da invenção é descrita nos Exemplos 1 a 13 acima. As concentrações de componentes adjuvantes são fornecidas na Tabela 24. Os adjuvantes foram adicionados na ordem listada na Tabela.
[000298] Um extensor de solução salina foi adicionado a um vaso e homogenização foi iniciada. CCV inativado foi adicionado a uma concentração mostrada na Tabela 24. A Quil A foi adicionada à concentração listada na Tabela 24. O colesterol na solução de etanol foi em seguida adicionado com homogenização continuada. A solução de DDA/etanol foi em seguida adicionada durante a homogenização. A mistura foi microfluidificada em 68900 KPa (10.000 psi). O carbopol foi em seguida adicionado com mistura e o pH foi ajustado a 6,8 até 7,2. O glicolipídeo Bay R1005® foi em seguida adicionado com mistura. Finalmente, a composição foi conduzida ao volume final com o extensor de solução salina.
[000299] A vacina para os grupos de tratamento recebendo os produtos AblSCO comercialmente disponíveis (Isconova, Suécia) foi preparada de acordo com as instruções do rótulo. Os produtos AbISCO são com base nas saponinas quillaja e tecnologia ISCOM usando saponinas altamente purificadas. Método de Ensaio: a neutralização de Soro de CCV beta
[000300] O soro foi inativado por calor em 56°C durante 30 a 40 minutos. Em uma placa estéril limpa, as diluições em série de cada um dos soros (não diluído, 2, 4, 8...) foram desempenhadas por transferência de 120 μl em 120 μl de diluente. Pelo menos duas cavidades de replicação/diluição foram usadas. Uma diluição de 1:16 foi usada inicialmente, se necessário. Uma matéria-prima de desafio de trabalho foi preparada por diluição de CCV vivo a um nível contendo cerca de 240 partículas de vírus em 120 μl. Em seguida, 120 μl de cada diluição de soro foram combinados com 120 μl de solução de vírus para um total de 240 μl. A solução foi misturada e mantida em temperatura ambiente (aproximadamente 25°) durante 30 a 60 minutos para permitir neutralização. Em seguida, 120 μl de cada série foram transferidos nas monocamadas nuas de espera das células de NLFK semeadas 7 a 12 dias anteriormente. CPE foi avaliado 4 a 6 dias depois. A titulação de regressão confirmou que 50 a 316 partículas de vírus atingiram cada monocamada. Resultados Tabela 25. Neutralização de Soro
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Sumário
[000301] Os efeitos combinados dos adjuvantes formulados com CCV levando em conta as propriedades químicas de cada componente forneceram propriedades excelentes para uma vacina adjuvante.
[000302] Os resultados sorológicos do estudo são mostrados na Tabela 25. Os títulos de anticorpo de neutralização de soro elevados geralmente são associados a melhor proteção fornecida pelas vacinas. Várias das formulações adjuvantes da invenção produziram títulos muito maiores do que os produtos adjuvados comerciais, ainda que estas formulações tivessem uma quantidade similar de antígeno de CCV adicionada. As formulações de QCDC, QCR, DRC, QCRC, e QCDRC foram especialmente eficazes na indução de uma boa resposta imune nos camundongos. Exemplo 24. Antígeno de Rotavirus Bovino Escopo
[000303] Um modelo de murino foi empregado usando Rotavírus Bovino e adjuvantes de combinação da invenção para avaliar o desempenho de adjuvante com o dado componente antigênico. Animais
[000304] Dez camundongos de CF-1 por grupo de tratamento foram administrados 0,2 mL subcutaneamente por animal para cada grupo de tratamento. Grupos de Tratamento
[000305] As formulações de teste mostradas na Tabela 26 foram preparadas como volumes de dose de área de 2,0 mL com as concentrações dadas abaixo. Apenas 0,2 mL da vacina foi administrado para cada animal. Tabela 26. Formulações de Teste
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Preparação de vacina
[000306] Preparação de vacina para os adjuvantes da invenção é descrita nos Exemplos 1 a 13 acima. As concentrações de componentes adjuvantes são fornecidas na Tabela 26. Os adjuvantes foram adicionados na ordem listada na Tabela.
[000307] Um extensor de solução salina foi adicionado a um vaso e homogenização foi iniciada. O Rotavírus Bovino Inativado foi adicionado a uma concentração mostrada na Tabela 26. A Quil A foi adicionada na concentração listada na Tabela 26. A solução de colesterol/etanol foi em seguida adicionada com homogenização continuada. A solução de DDA/etanol foi em seguida adicionada durante a homogenização. A mistura foi microfluidificada em 68900 KPa (10.000 psi). Carbopol® foi em seguida adicionado com mistura e o pH foi ajustado a 6,8 até 7.2. Glicolipídeo Bay R1005® foi em seguida adicionado com mistura. Finalmente, a composição foi conduzida ao volume final com o extensor de solução salina.
[000308] A vacina para os grupos de tratamento recebendo os produtos AbISCO comercialmente disponíveis (Isconova, Suécia) foi preparada de acordo com as instruções do rótulo. Os produtos AbISCO são com base nas saponinas quillaja e tecnologia ISCOM usando saponinas altamente purificadas. Resultados Tabela 27. Títulos de Neutralização de Soro
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QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para Carbopol®, R para Bay R1005®
[000309] Os efeitos combinados dos adjuvantes formulados com Rotavírus bovino e levando em conta as propriedades químicas de cada componente forneceram propriedades excelentes para uma vacina adjuvante (veja Tabela 27).
[000310] Embora várias das formulações adjuvantes fornecessem níveis similares de títulos de anticorpo de neutralização de soro, o adjuvante de QCDCR forneceu o nível mais alto. Exemplo 25. Vírus de Influenza Canina Escopo/Esquema de Estudo
[000311] Um modelo canino foi empregado usando vírus de influenza canina (CIV) e novos adjuvantes de combinação para avaliar o desempenho de adjuvante com o dado componente antigênico.
[000312] Este estudo tinha um esquema em bloco completo aleatorizado. (veja Tabela 28). Animais foram classificados por data de nascimento para formar blocos de tamanho 5. Dentro de um bloco, os animais foram aleatoriamente designados para tratamentos. Animais no mesmo bloco foram aleatoriamente designados para engaiolar (gaiolas) localizados um próximo ao outro. Os animais estavam em boa saúde sem história de hipersensibilidade a vacinas comercialmente disponíveis. Os animais não receberam vacinas contra CIV. Tabela 28. Esquema de Estudo
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QC é a abreviação para QuilA/colesterol, D para DDA, C para Carbopol® Tabela 29. Composição de Vacina
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Preparação de Vacina
[000313] A preparação de vacina para os adjuvantes da invenção é descrita nos Exemplos 1 a 13 acima. As concentrações de componentes adjuvantes são fornecidas na Tabela 29. Os adjuvantes foram adicionados na ordem listada na Tabela.
[000314] Um extensor de solução salina foi adicionado a um vaso e homogenização foi iniciada. O vírus inativado de influenza canina foi adicionado na concentração mostrada na Tabela 29. A Quil A foi adicionada na concentração listada na Tabela 29. A solução de colesterol/etanol foi em seguida adicionada com homogenização continuada. A solução de DDA/etanol foi em seguida adicionada durante a homogenização. A mistura foi microfluidificada em 68900 KPa (10.000 psi). Carbopol foi em seguida adicionado com mistura e o pH foi ajustado a 6,8 até 7,2. Finalmente, a composição foi conduzida ao volume final com o extensor de solução salina. Teste
[000315] A sorologia foi avaliada por uso de ensaio de inibição de hemoaglutinação (HAI) por Método de Ensaio Padrão pela USDA. Resultados/ Sumário
[000316] Apresentados na Tabela 30 são resultados sorológicos de THE nos dias 42 e 180 dos títulos médios de HAI Geo.. Tabela 30. Títulos de HAI
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[000317] Os efeitos combinados dos adjuvantes formulados com vírus de influenza e levando em conta as propriedades químicas de cada componente forneceram propriedades excelentes para uma vacina adjuvante.
[000318] Títulos de anticorpo elevados geralmente são associados a melhor proteção de vacinas. Geralmente, ambos o adjuvante de alumínio (T02) e os adjuvantes da invenção (T03, T04 e T05) causaram um aumento nos títulos de HAI, mas a resposta causada pelos adjuvantes da invenção foi superior com títulos elevados no dia 180 no grupo de dose alta (T05). Os títulos para as doses baixas e médias dos adjuvantes da invenção foram equivalentes àqueles da vacina contendo alumínio tradicional para influenza. Adicionalmente, porque os adjuvantes da invenção fornecem uma resposta imune de auxiliar 1 de T enquanto que o alumínio não, a duração da imunidade é esperada ser mais longa com um mecanismo de chamada mais rápido.

Claims (16)

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende uma formulação adjuvante e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um componente de antígeno, em que a formulação adjuvante compreende uma saponina triterpenoide, um esterol, um composto de amônio quaternário, e um polímero ácido poliacrílico, em que o componente de antígeno compreende o Vírus da Leucemia Felina.
2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a saponina está presente em uma concentração de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg por dose, o esterol está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg por dose, o composto de amônio quaternário está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg por dose, e o polímero ácido poliacrílico está presente em uma quantidade de cerca de 0,0001% v/v a cerca de 75% v/v.
3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a saponina é Quil A ou uma fração purificada da mesma, o esterol é colesterol e composto de amônio quaternário é dimetil dioctadecil brometo de amônio (DDA).
4. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o componente de antígeno compreende ainda pelo menos um de Vírus da Imunodeficiência Felina, vírus da rinotraqueíte viral felina, calicivírus felino, coronavírus entérico felino, vírus da peritonite infecciosa felina e Chlamydia psittaci.
5. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o componente de antígeno compreende ainda o Vírus da Imunodeficiência Felina.
6. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o componente de antígeno compreende ainda pelo menos um calicivírus felino e vírus da rinotraqueíte viral felina.
7. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o componente de antígeno compreende ainda pelo menos um calicivírus felino, vírus da rinotraqueíte viral felina e Chlamydia psittaci.
8. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a formulação adjuvante consiste na saponina triterpenoide, no esterol, no composto de amônio quaternário, e no polímero ácido poliacrílico.
9. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a saponina está presente em uma concentração de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg por dose, o esterol está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg por dose, o composto de amônio quaternário está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg por dose, e o polímero ácido poliacrílico está presente em uma quantidade de cerca de 0,0001% v/v a cerca de 75% v/v.
10. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 811. , caracterizada pelo fato de que a saponina é Quil A ou uma fração purificada da mesma, o esterol é colesterol e composto de amônio quaternário é dimetil dioctadecil brometo de amônio (DDA).
11. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o componente de antígeno compreende ainda pelo menos um de Vírus da Imunodeficiência Felina, vírus da rinotraqueíte viral felina, calicivírus felino, coronavírus entérico felino, vírus da peritonite infecciosa felina e Chlamydia psittaci.
12. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o componente de antígeno compreende ainda o Vírus da Imunodeficiência Felina.
13. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o componente de antígeno compreende ainda pelo menos um calicivírus felino e vírus da rinotraqueíte viral felina.
14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o componente de antígeno compreende ainda pelo menos um calicivírus felino, vírus da rinotraqueíte viral felina e Chlamydia psittaci.
15. Uso da composição de vacina, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para prevenção de uma infecção causada por vírus de leucemia felina em um gato em necessidade do mesmo.
16. Uso da composição de vacina, como definida na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para prevenção de uma infecção causada por vírus de leucemia felina em um gato em necessidade do mesmo.
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